CN108283720B - 同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药及其制备方法与应用 - Google Patents

同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开的一种同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药及其制备方法与应用；前药(CPT‑ss‑PBYP‑hyd‑DOX)‑b‑PEEP可以在水溶液中自组装形成前药纳米粒子。疏水性药物喜树碱、阿霉素和含炔丙基的聚磷酸酯链段（PBYP）形成纳米粒子的核；亲水性乙基聚磷酸酯（PEEP）链段形成纳米粒子的外壳，起到稳定纳米粒子的作用；在谷胱甘肽条件下可发生二硫键氧化还原断裂，在酸性环境下腙键断裂，胶束被破坏，从而快速地释放出聚集在纳米粒子内部的疏水性抗癌药物。这类同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药具有“酸/还原”敏感性、生物相容和生物可降解性，并改善了抗肿瘤药物的亲水性，因而可以用作刺激敏感性抗肿瘤前药。

Description

同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药及其制备方法与应用。
背景技术
多种药物的组合治疗可以提高对癌症的治疗效果，因为这种治疗方法可以有效地克服肿瘤细胞的多药耐药性。喜树碱（CPT）和阿霉素（DOX）是一组常见的组合药，它们都是拓扑异构酶的抑制剂。喜树碱和阿霉素分别作用于拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ，两种药的组合使用可以有效地促进细胞凋亡、阻碍细胞增殖，适当的比例时还可以达到协同治疗的效果。但是，这两种药物的缺点均表现为水溶性差、血液不稳定且对正常组织的毒副作用大，在临床上很难应用。传统的药物组合策略旨在通过最大量的给药，以达到最大化的治疗效果，并不同时重视药物的给药量和调度，以达到协同治疗的目的。因此，研究不同药物的组合治疗，择出较优的比例，以减少药物的使用量同时达到相同或更好的治疗效果，现已成为癌症治疗的热点，具有重要的发展前景和现实意义。
与传统的药物释放体系相比，刺激响应性的药物载体具有一定的优点。表现为在特定的肿瘤环境刺激作用下，可以快速释放出所包载或者键合的药物，达到有效治疗的目的。这些刺激作用包括：pH值，光强，离子浓度，氧化还原介质等。根据药物的释放机制可以将其分为四大类：酶解、被动水解、pH响应以及还原响应性。
在现有技术中，尽管已有一些关于喜树碱与阿霉素前药的报道，以及用于协同治疗肿瘤，但是，两种药物同时与聚合物键合，作为协同治疗的聚合物前药的报道并不多见，因此需要研发新的体系用于两种药物同时与聚合物键合；采用的聚合物应当具有良好的生物相容性和生物可降解性、良好的肿瘤微环境的刺激响应性，并且考虑到多种药剂治疗可在疾病细胞调节不同的信号通路，最大限度地提高治疗效果（即达到协同作用），并且可能克服耐药机制。同时，为了改善喜树碱和阿霉素的水溶性、增加其稳定性、降低毒副作用，需要寻求在细胞环境中具有响应性键合基团，使喜树碱和阿霉素同时键合到聚合物分子中，使聚合物前药在肿瘤部位作用时能及时有效地释放两种药物。
发明内容
本发明的目的是，提供一种同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药，具有“酸/还原”双敏感性，该喜树碱-阿霉素-聚磷酸酯前药具有良好的生物相容性和抑制肿瘤细胞增殖的能力，可用作制备抗癌药物。
为达到上述目的，本发明的总体构思是：以主链含有喜树碱、侧链含有炔基的聚磷酸酯与含叠氮端基及腙键修饰的阿霉素衍生物为原料，以无水N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，通过“点击”化学法，制备获得主链末端含喜树碱、侧链键合阿霉素的聚磷酸酯高分子前药，即同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药。具体为首先分别合成主链含有喜树碱、侧链含有炔基的聚磷酸酯和含叠氮端基及腙键修饰的阿霉素衍生物，通过炔基与叠氮基的“点击”化学反应，获得同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药。由于喜树碱衍生物分子中含有二硫键和醇羟基，其羟基可引发功能性环状磷酸酯单体聚合；阿霉素衍生物含叠氮基和腙键，因此，获得“酸/还原”双敏感的喜树碱-阿霉素-聚磷酸酯前药。
本发明具体的技术方案为：一种同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药，由下列化学结构式表达：
Figure 940319DEST_PATH_IMAGE001
式中，x为1～68，m为28～68，n为33～80；Hyd代表腙键。上述前药的缩写为：(CPT-ss-PBYP-hyd-DOX)-b-PEEP。
上述技术方案中，喜树碱通过二硫键基团与聚磷酸酯主链键合，阿霉素通过腙键与聚磷酸酯侧基键合，腙键化学结构式为=N-NH-；同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药在结构上含有的疏水性炔丙基聚磷酸酯（PBYP）链段及键合的喜树碱、阿霉素部分，在水相介质中，用于形成前药胶束的内核；而亲水性乙基聚磷酸酯（PEEP）部分在内核的外层，形成胶束的外壳，起到稳定胶束的作用。在谷胱甘肽条件下可发生二硫键氧化还原，释放出喜树碱；在肿瘤细胞的酸性环境下，腙键断裂，释放出阿霉素；最终，前药胶束被破坏，从而快速地释放出聚集在胶束内部的疏水性抗癌药物喜树碱和阿霉素。
优选的技术方案中，同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药的数均分子量为1.11×104～2.64×104 g/mol。
本发明还公开了上述同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药的制备方法，包括以下步骤：
（1）以喜树碱二硫醇化合物（CPT-ss-OH）为引发剂，在辛酸亚锡存在下，通过连续开环聚合BYP、EOP，获得主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯，称为CPT-ss-PBYP-b-PEEP无规共聚物；
（2）惰性气体气氛条件下，在“点击”化学反应催化剂和配体的存在下，以主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯与含叠氮端基及腙键修饰的阿霉素（DOX）衍生物为原料，以无水N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，通过“点击”化学法，制备同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药。
本发明还公开了主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯的制备方法，包括以下步骤：
（1）以喜树碱二硫醇化合物（CPT-ss-OH）为引发剂，在辛酸亚锡存在下，通过连续开环聚合BYP、EOP，获得主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯。
本发明公开了同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药纳米粒子及其制备方法，包括以下步骤：
（1）以喜树碱二硫醇化合物为引发剂，在辛酸亚锡存在下，通过连续开环聚合BYP、EOP，获得主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯；
（2）惰性气体气氛条件下，在“点击”化学反应催化剂和配体的存在下，以主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯与含叠氮端基及腙键修饰的阿霉素衍生物为原料，以无水N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，通过“点击”化学法，制备同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药；
（3）将同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药与二甲亚砜（DMSO）、水混合搅拌3～6小时，得到同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药纳米粒子。
本发明中，所述喜树碱二硫醇化合物的化学结构式为：
，缩写为：CPT-ss-OH；
所述含炔基的环状磷酸酯单体BYP的化学结构为：
Figure 527211DEST_PATH_IMAGE003
所述水溶性聚磷酸酯（PEEP）的单体EOP化学结构为：
所述主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯的化学结构式为：
Figure 799110DEST_PATH_IMAGE005
缩写为：CPT-ss-PBYP-b-PEEP
PBYP:PEEP（m∶n）的摩尔比为1∶(1～2.85)；
所述含叠氮端基及腙键修饰的阿霉素（DOX）衍生物的结构式为：
Figure 434622DEST_PATH_IMAGE006
上述技术方案中，所述喜树碱二硫醇化合物、BYP、EOP的摩尔比为1∶（20～30）:（30～50）。
上述技术方案中，连续开环聚合的温度为30℃，时间为12 h。
上述技术方案中，主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯与含叠氮端基及腙键修饰的阿霉素衍生物、“点击”化学反应催化剂、配体的摩尔比为1∶9∶9∶18；“点击”化学反应催化剂和配体的摩尔比为1∶（2～4）。
上述技术方案中，惰性气体为氩气；“点击”化学反应的温度为25℃～45℃，反应的时间为20 h～40 h。
上述技术方案中，“点击”化学反应催化剂选自氯化亚铜或溴化亚铜；配体选自：联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种。
“点击”化学反应是一种新型、简单、高效、快速的合成方法，这种方法具有以下显著特点：(1) 所用原料和试剂容易获得；(2) 反应条件简单；(3) 产率高；(4) 立体选择性好；(5) 产物净化技术简单；(6) 产物稳定性好。众多的优点使得“点击”化学反应在高分子化学、材料修饰、生物医学等领域得到广泛应用。至今还没有关于通过点击化学，同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药，具有pH和还原敏感键合基团的结构报道。
进一步的技术方案完成后，对产物进行提纯处理，所述纯化过程包括以下步骤：
同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药的纯化：在反应结束后用超纯水透析48～96 h，透析时采用截留分子量为3500 Da的透析袋；最后，将透析袋中所得到的红色透明液体冷冻干燥，获得深红色固体产物，即为同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药。
本发明公开的同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药，具有两亲性。可以在水溶液中自组装形成前药胶束，为纳米粒子，疏水性药物喜树碱、阿霉素和炔丙基聚磷酸酯（PBYP）链段形成胶束的核；亲水性乙基聚磷酸酯（PEEP）链段形成胶束的外壳，起到稳定胶束的作用；在谷胱甘肽条件下可发生二硫键氧化还原，在酸性环境下腙键断裂，纳米粒子被破坏，从而快速地释放出聚集在胶束内部的疏水性抗癌药物喜树碱和阿霉素。因此，本发明进一步请求保护上述同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药及其纳米粒子在制备刺激响应性抗癌药物中的应用。
由于上述方案的实施，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、本发明首次采用含二硫键和羟基修饰的喜树碱衍生物作为引发剂，引发功能性磷酸酯单体开环聚合，获得良好生物相容性、生物可降解的喜树碱-聚磷酸酯前药。再通过腙键和叠氮基修饰的阿霉素与聚磷酸酯侧基上的炔基发生点击化学反应，获得同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药。
2、本发明提供的同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药(CPT-ss-PBYP- hyd-DOX)-b-PEEP可以在水溶液中自组装形成前药纳米粒子，增加两种药物的水溶性，提高前药的血液循环时间；当前药纳米粒子到达肿瘤或病变组织时，在谷胱甘肽作用下，二硫键断裂；在酸性环境下，腙键断裂，纳米粒子被破坏，从而快速释放出抗癌药物，增加了药物的利用率与靶向性，在癌症的治疗方面，具有潜在的应用价值。
3、本发明提供的同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药基于前药既有“酸/还原”双敏感性，又有协同释放两种药物的联合治疗作用。与原药喜树碱和阿霉素相比，同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药具有良好的水溶性、生物可降解性、贮存稳定性和靶向性，大大增加了其应用价值。
4、本发明提供的同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药(CPT-ss-PBYP- hyd-DOX)-b-PEEP结构合理明确，对药物的键合效率高，合成条件不苛刻，制备容易，提纯方便，适合工业化生产。
附图说明
图1为本发明引发剂喜树碱二硫醇CPT-ss-OH的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿；
图2为本发明含腙键和叠氮基修饰的阿霉素衍生物的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿；
图3为阿霉素盐酸盐和含腙键及叠氮基修饰的阿霉素衍生物的红外谱图；
图4为实施例一的末端含喜树碱的聚磷酸酯CPT-ss-PBYP30-b-PEEP80的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿；
图5为实施例二的CPT-ss-PBYP28-b-PEEP33的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿；
图6为实施例三的CPT-ss-PBYP68-b-PEEP53的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿；
图 7为实施例四的 (CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿；
图 8 为CPT、CPT-ss-OH、(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33的高效液相色谱分析结果，表明聚合物前药成功合成；
图9为实施例四中同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33在pH 7.4缓冲溶液中自组装形成纳米粒子的动态光散射曲线和透射电镜照片；
图10为实施例六中同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33形成的聚合物前药纳米粒子在pH 7.4 和5.0的缓冲溶液中的粒径变化曲线；
图11为实施例六中同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33形成的聚合物前药纳米粒子在不同浓度谷胱甘肽介质中的粒径变化曲线；
图 12 为实施例七中同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33在pH7.4介质中，不同GSH浓度下的累积释放曲线；
图 13 为实施例七中同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33在不同pH值介质中的累积释放曲线；
图14为实施例八中同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33与裸药喜树碱的抑制肿瘤细胞HeLa和HepG2增殖性能测试；
图15为实施例八中同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33与裸药阿霉素的抑制肿瘤细胞HeLa和HepG2增殖性能测试。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述：
本发明中，所述喜树碱二硫醇引发剂的化学结构式为：
Figure 701655DEST_PATH_IMAGE002
，缩写为：CPT-ss-OH；图1为其核磁谱图；
所述含炔基的环状磷酸酯单体BYP的化学结构为：
所述水溶性聚磷酸酯（PEEP）的单体EOP化学结构为：
所述主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯的化学结构式为：
Figure 375847DEST_PATH_IMAGE008
缩写为：CPT-ss-PBYP-b-PEEP
所述含叠氮端基及腙键修饰的阿霉素（DOX）衍生物的结构式为：
Figure 130176DEST_PATH_IMAGE006
图2为其核磁谱图，图3为其红外谱图，其中A为阿霉素，B为含叠氮端基及腙键修饰的阿霉素。
实施例一：无规共聚物CPT-ss-PBYP30-b-PEEP80 的合成（1:20:50）
以喜树碱二硫醇化合物（CPT-ss-OH）为引发剂、辛酸亚锡为催化剂，通过“一锅法”连续开环聚合BYP、EOP，获得CPT-ss-PBYP-b-PEEP 无规共聚物，制备过程在无水无氧条件下进行。实验所用注射器及针头在120℃烘箱中烘5 h，反应前取出置于保干器中冷却。将干净的安瓿瓶（预先装入磁力搅拌转子）在120℃烘箱中烘5 h左右，取出后用乳胶管与真空泵相连，边抽真空边充入高纯氩气，反复操作三次以除去瓶中水分和氧气。在安瓿瓶中用干燥的玻璃注射器依次加入喜树碱二硫醇化合物（CPT-ss-OH）（0.185 g, 0.35 mmol）、BYP（1.251 g, 7.1 mmol）、EOP （2.645 g，17.5mmol）和10 mL 无水 CH2Cl2，搅拌溶解10 min；Sn(Oct)2（0.141 g, 0.35 mmol）溶于0.2 mL 的甲苯中并快速注射入安瓿瓶内催化反应进行。在30℃的油浴中反应12 h，反应结束后，终止反应，旋转蒸发除掉大部分溶剂CH2Cl2后，溶液变粘稠后用冰无水乙醚/无水甲醇（10:1）混合溶液作为沉淀剂，有沉淀析出，抽滤得到聚合物；将得到样品溶于CH2Cl2中再次纯化，重复上述操作，将聚合物在真空烘箱中干燥12h，得到淡黄色粘稠液体产物主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯CPT-ss-PBYP30-b-PEEP80（2.265 g, 产率: 65%），图4为其核磁共振氢谱谱图。
实施例二：无规共聚物CPT-ss-PBYP28-b-PEEP33 的合成
以喜树碱二硫醇化合物（CPT-ss-OH）为引发剂、辛酸亚锡为催化剂，通过“一锅法”连续开环聚合BYP、EOP，获得CPT-ss-PBYP-b-PEEP 无规共聚物。制备过程在无水无氧条件下进行。实验所用注射器及针头在120℃烘箱中烘5 h，反应前取出置于保干器中冷却。将干净的安瓿瓶（预先装入磁力搅拌转子）在120℃烘箱中烘5 h左右，取出后用乳胶管与真空泵相连，边抽真空边充入高纯氩气，反复操作三次以除去瓶中水分和氧气；在安瓿瓶中用干燥的玻璃注射器依次加入喜树碱二硫醇化合物（CPT-ss-OH）（0.189 g, 0.35 mmol）、BYP（1.249 g, 7.1 mmol）、EOP （1.567 g，10.5 mmol）和10 mL 无水 CH2Cl2，搅拌溶解10 min；Sn(Oct)2（0.139 g, 0.35 mmol）溶于0.2 mL 的甲苯中并快速注射入安瓿瓶内催化反应进行；在30℃的油浴中反应12 h，反应结束后，终止反应，旋转蒸发除掉大部分溶剂CH2Cl2后，溶液变粘稠后用冰无水乙醚/无水甲醇（10:1）混合溶液作为沉淀剂，有沉淀析出，抽滤得到聚合物；将得到样品溶于CH2Cl2中再次纯化，重复上述操作，将聚合物在真空烘箱中干燥12h，得到淡黄色粘稠液体产物主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯CPT-ss-PBYP28-b-PEEP33（1.521 g, 产率: 51%），图5为其核磁共振氢谱谱图。
实施例三：无规共聚物CPT-ss-PBYP68-b-PEEP53 的合成
以喜树碱二硫醇化合物（CPT-ss-OH）为引发剂、辛酸亚锡为催化剂，通过“一锅法”连续开环聚合BYP、EOP，获得CPT-ss-PBYP-b-PEEP 无规共聚物。制备过程在无水无氧条件下进行，实验所用注射器及针头在120℃烘箱中烘5 h，反应前取出置于保干器中冷却。将干净的安瓿瓶（预先装入磁力搅拌转子）在120℃烘箱中烘5 h左右，取出后用乳胶管与真空泵相连，边抽真空边充入高纯氩气，反复操作三次以除去瓶中水分和氧气。在安瓿瓶中用干燥的玻璃注射器依次加入喜树碱二硫醇化合物（CPT-ss-OH）（0.189 g, 0.35 mmol）、BYP（1.873 g, 10.5 mmol）、EOP （2.623 g，17.5mmol）和10 mL 无水 CH2Cl2，搅拌溶解10 min。Sn(Oct)2（0.14 g, 0.35 mmol）溶于0.2 mL 的甲苯中并快速注射入安瓿瓶内催化反应进行；在30℃的油浴中反应12 h，反应结束后，终止反应，旋转蒸发除掉大部分溶剂CH2Cl2后，溶液变粘稠后用冰无水乙醚/无水甲醇（10:1）混合溶液作为沉淀剂，有沉淀析出，抽滤得到聚合物；将得到样品溶于CH2Cl2中再次纯化，重复上述操作，将聚合物在真空烘箱中干燥12h，得到淡黄色粘稠液体产物主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯CPT-ss-PBYP68-b-PEEP53（2.670 g, 产率: 57%），图6为其核磁谱图。结合图4-6可以看出，本发明的制备方法具有可控、重复性优异的优点。
实施例四：同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33的合成
通过CPT-ss-PBYP28-b-PEEP33和含叠氮端基及腙键修饰的阿霉素（N3-hyd-Dox）进行Cu（I）催化的叠氮基和炔基的“点击”化学反应（Click环加成反应）。其合成步骤如下：称取 CPT-ss-PBYP28-b-PEEP33（0.796 g，0.04 mmol，炔基）和DOX-hyd-N3（0.278 g，0.398mmol，叠氮基）溶于10 mL无水 DMF 加入 50 mL 的支管瓶中；接着快速称取CuBr（0.101g,0.398 mmol）和 PEDETA（0.232 mg, 0.794 mmol）加入支管瓶中，通入高纯氮气再抽真空，重复充放气三次，在45℃油浴中搅拌反应24小时；反应结束后，打开瓶塞使之接触空气终止反应，聚合物混合溶液用250 mL CH2Cl2 稀释，过中性三氧化二铝柱子除去溶液中的铜盐；收集过柱后的溶液，旋转蒸发，将浓缩液在冰的无水乙醚中沉淀；得到的粗产物用少量DMF溶解后装入截留分子量为3500 Da的透析袋中在二次水中透析两天，再冷冻干燥，得到同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33（0.926 g, 产率: 86.3%）。附图7为(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33的核磁共振氢谱谱图。高效液相色谱分析结果表明，成功合成该聚合物前药（如图8所示），其中，PBYP链段的炔基平均键合9个DOX衍生物，即x为9。
实施例五：采用直接溶解法制备聚合物前药胶束
将50.0 mg聚合物前药(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33加入到50 mL的单口圆底烧瓶中，加入6 mL DMSO，搅拌4 h，使聚合物完全溶解，随后使用微量注射器加入30 mL的二次水，注射速度保持在3 mL/h。待滴加完成后继续搅拌4小时，促使聚合物前药进行自组装，从而得到浓度为1.39 mg·mL-1的胶束溶液。附图9为(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33在超纯水中自组装形成的胶束的动态光散射曲线（A）和透射电镜照片（B）；如附图9（B）所示，聚合物前药在水溶液中自组装形成胶束结构，附图9（A）为对应胶束粒径的动态光散射测试曲线图，可以看出聚合物前药胶束平均粒径约为90 nm。
实施例六：pH/还原条件下(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33的粒径变化
具有pH/还原双重刺激响应，为了验证这一点，利用DLS观察不同条件下(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33的粒径变化。具体操作如下：取两份5 mL (CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33溶液，一份将溶液pH调至5.0，另一份加入16 mg的GSH形成10 mM的GSH溶液，室温搅拌，每隔一段时间去测试纳米粒子的粒径，观察粒径变化(测试结果见图10、图11)。在pH 7.4的介质中，聚合物前药纳米粒子经历24小时，粒径分布几乎无变化（图10），而在pH5.0的介质中，随着时间延长，粒径分布明显变化，表明聚合物前药纳米粒子中的腙键在酸性介质中断裂，引起粒子聚集，造成粒径分布变宽，从而证明具有pH响应性；在10 mM谷胱甘肽介质中，随时间延长，粒径分布变宽（图11），这是由于聚合物前药纳米粒子中的二硫键断裂，证明聚合物前药具有还原敏感性。
实施例七：体外药物释放行为的研究
采用透析法评估(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33的体外药物释放能力。具体操作如下：取5 mL (CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33转移至透析袋（MWCO 7000 Da）中，密封后浸入装有20 mL不同条件缓冲液的离心管中。将离心管转移至恒温水槽中持续恒温（37℃）震荡。每隔一定时间从离心管中取出5 mL释放液用于监测其药物释放行为，同时补加5 mL对应的缓冲溶液使其总体积保持不变。采用荧光分光光度计检测释放液中DOX的荧光强度，其中，激发波长设为480 nm，发射波长扫描范围在520-620 nm，狭缝宽度设为10nm，电压设为700 V，根据DOX荧光发射浓度标准曲线得到释放液中的DOX浓度。图12表示在pH 7.4介质中，不同GSH浓度下DOX的累积释放曲线；图13表示不同pH值介质中DOX的累积释放曲线。
累积药物释放率（Er）根据公式计算：
Figure 677308DEST_PATH_IMAGE009
其中：
Figure 200693DEST_PATH_IMAGE010
表示置换的释放液的体积，
Figure 692854DEST_PATH_IMAGE011
代表释放液总体积，代表第i次吸取的释放液中DOX浓度，m drug代表载药纳米粒子中总的DOX质量，n代表总的吸液次数；所有实验均一式三份，且都避光进行。
实施例八 聚合物前药的细胞毒性测试
采用常规的四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）来检测聚合物前药(CPT-ss-PBYP28-hyd-DOX)-b-PEEP33抑制宫颈癌细胞（HeLa）和人肝肿瘤细胞(HepG2) 增殖的能力。首先把HeLa（或者HepG2）细胞接种到含培养基dulbecco’s modified eagle medium（DMEM）的96孔培养皿上，其中培养基由10%热灭活性胎牛血清（fetal bovine serum,FBS），1%青霉素（penicillin）和链霉素（streptomycin）组成。将其放置于37℃，5% CO2条件下培养12 h后加入不同浓度的纳米粒子溶液继续培养48 h或72 h。在培养皿的每个小孔中加入25 mL的MTT溶液（5 mg mL-1），培养了4 h后吸走上清液并加入150mL的DMSO去溶解形成的甲瓒晶体。采用酶标仪（Bio-Rad 680）检测每个孔在570 nm处的吸光度（Opticaldensity, OD）。细胞相对存活率根据如下公式计算：细胞相对存活率 (%) = (ODTest/ODControl) ´100。式中，ODTest为待测样品孔中溶液的吸光度测量值，ODControl无待测样品孔中溶液的吸光度测量值。每个浓度的样品进行五组平行实验，每个样品测试三次，测试结果见图14、图15，观察喜树碱药物浓度变化以及观察阿霉素药物浓度变化。
本发明高分子前药的聚合物载体具有良好的生物相容性和生物可降解性，聚磷酸酯的结构与核酸和磷壁酸的结构类似，其主链的五价磷具有较强的可修饰性，有利于在聚磷酸酯侧链引入功能化的基团；此外人类细胞内存在磷酸二酯酶I，可以加速聚磷酸酯降解，因此，聚磷酸酯具有良好的生物相容性、侧链可修饰性以及生物可降解性，在生物医药领域有十分重要的意义。本发明的前药在水溶液中可以组装成前药纳米粒子，并稳定存在。在酸性条件下，酸敏感性基团或链段会发生断裂使聚合物前药纳米粒子被破坏，从而可以将其聚集在纳米粒子内部的药物快速地释放出来。将二硫键作为药物和聚合物的键合基团，可以在前药纳米粒子进入肿瘤细胞后，在谷胱甘肽作用下，二硫键断裂，释放出原药。

Claims (9)

1.一种同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药，其特征在于，由下列化学结构式表达：
Figure 401531DEST_PATH_IMAGE002
式中，x为1～68，m为28～68，n为33～80；hyd代表腙键。
2.根据权利要求1所述同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药，其特征在于：所述同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药的数均分子量为1.11×104～2.64×104 g/mol。
3.根据权利要求1所述同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药，其特征在于，所述同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药的制备方法包括以下步骤：惰性气体气氛条件下，在“点击”化学反应催化剂和配体的存在下，以主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯与含叠氮端基及腙键修饰的阿霉素衍生物为原料，以无水N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，通过“点击”化学法，制备同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药；
所述主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯的化学结构式为：
所述含叠氮端基及腙键修饰的阿霉素衍生物的结构式为：
Figure 629567DEST_PATH_IMAGE005
。
4.根据权利要求3所述同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药，其特征在于：所述惰性气体为氩气；所述“点击”化学反应催化剂选自氯化亚铜或溴化亚铜；所述配体选自联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种；所述“点击”化学反应的温度为25℃～45℃，反应时间为20 h～40 h。
5.根据权利要求3所述同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药，其特征在于：首先以喜树碱二硫醇化合物为引发剂，在辛酸亚锡存在下，通过连续开环聚合BYP、EOP，获得主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯；再将主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯与含叠氮端基及腙键修饰的阿霉素衍生物反应，获得同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药；
所述喜树碱二硫醇化合物的化学结构式为：
Figure 572247DEST_PATH_IMAGE006
所述BYP的化学结构为：
Figure 121040DEST_PATH_IMAGE007
所述EOP的化学结构为：
Figure 740240DEST_PATH_IMAGE008
。
6.主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯的制备方法，包括以下步骤：以喜树碱二硫醇化合物为引发剂，在辛酸亚锡存在下，通过连续开环聚合BYP、EOP，获得主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯；
所述喜树碱二硫醇化合物的化学结构式为：
所述BYP的化学结构为：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
所述EOP的化学结构为：
。
7.同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药纳米粒子，其特征在于，所述同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
（1）以喜树碱二硫醇化合物为引发剂，在辛酸亚锡存在下，通过连续开环聚合BYP、EOP，获得主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯；
（2）惰性气体气氛条件下，在“点击”化学反应催化剂和配体的存在下，以主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯与含叠氮端基及腙键修饰的阿霉素衍生物为原料，以无水N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，通过“点击”化学法，制备同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药；
（3）将同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药与二甲亚砜、水混合搅拌3～6小时，得到同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药纳米粒子；
所述喜树碱二硫醇化合物的化学结构式为：
Figure 268490DEST_PATH_IMAGE006
所述BYP的化学结构为：
Figure 671790DEST_PATH_IMAGE009
所述EOP的化学结构为：
Figure 212624DEST_PATH_IMAGE010
所述主链含喜树碱、侧链含炔基的聚磷酸酯的化学结构式为：
Figure 701374DEST_PATH_IMAGE004
所述含叠氮端基及腙键修饰的阿霉素衍生物的结构式为：
Figure 235123DEST_PATH_IMAGE005
。
8.权利要求1或2所述同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药在制备刺激响应性抗癌药物中的应用。
9.权利要求7所述同时键合喜树碱和阿霉素的聚磷酸酯前药纳米粒子在制备刺激响应性抗癌药物中的应用。
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