EA034046B1 - Олигопептидные пролекарства с фосфоноацетильной кэпирующей группой - Google Patents

Олигопептидные пролекарства с фосфоноацетильной кэпирующей группой Download PDF

Info

Publication number
EA034046B1
EA034046B1 EA201590863A EA201590863A EA034046B1 EA 034046 B1 EA034046 B1 EA 034046B1 EA 201590863 A EA201590863 A EA 201590863A EA 201590863 A EA201590863 A EA 201590863A EA 034046 B1 EA034046 B1 EA 034046B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
prodrug
dox
drug
seq
phac
Prior art date
Application number
EA201590863A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201590863A1 (ru
Inventor
Андрэ Труэ
Original Assignee
Кобиорес Нв
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Кобиорес Нв filed Critical Кобиорес Нв
Publication of EA201590863A1 publication Critical patent/EA201590863A1/ru
Publication of EA034046B1 publication Critical patent/EA034046B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/475—Quinolines; Isoquinolines having an indole ring, e.g. yohimbine, reserpine, strychnine, vinblastine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/537—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines spiro-condensed or forming part of bridged ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/67—Enzyme prodrug therapy, e.g. gene directed enzyme drug therapy [GDEPT] or VDEPT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)

Abstract

В изобретении предложены олигопептидные пролекарства с фосфоноацетильной кэпирующей группой, которые предназначены для лечения рака. В частности, предложено пролекарство или его фармацевтически приемлемая соль, при этом указанное пролекарство имеет общую структуру: [C-OP]-D, где C представляет собой кэпирующую фосфоноацетильную группу; OP представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO: 1), TSGP (SEQ ID NO: 4) или KLGP (SEQ ID NO: 6); D представляет собой противоопухолевое лекарственное средство; х представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у = 1; у представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1. Также предложена фармацевтическая композиция, содержащее указанное пролекарство, применение указанного пролекарства для лечения рака, способы получения указанного пролекарства, способ выбора пролекарства-кандидата и набор для направленной доставки в опухоль.

Description

Область техники
Настоящее изобретение относится к области олигопептидных пролекарств с фосфоноацетильной копирующей группой, которые предназначены для лечения рака. Селективность этих пролекарств требует присутствия (олиго)пептидного фрагмента и/или защитной копирующей группы для обеспечения стабильности пролекарства в крови. Также настоящее изобретение, в частности, относится к отдельному олигопептидному фрагменту ALGP и содержащим его пролекарствам. В частности, настоящее изобретение также относится к кэпирующей группе фосфоноацетил и пролекарствам, содержащим указанную кэпирующую группу.
Уровень техники
Терапия рака на сегодняшний день остается одной из основных проблем медицины. Справиться с указанной проблемой позволит только комбинированный терапевтический подход. Он будет включать операцию, классическую хемотоксичную химиотерапию, молекулярно-нацеленные лекарственные средства и иммунотерапию.
Основной проблемой при использовании хемотоксических лекарственных средств является селективность в отношении раковых клеток, приводящая к ограничению дозы и угрожающим жизни токсическим побочным эффектам. Наиболее распространенной острой токсичностью является миелотоксичность, приводящая к тяжелой лейкопении и тромбоцитопении. Некоторые из наиболее часто используемых лекарственных средств также имеют более специфичную токсичность. Доксорубицин (Dox), антрациклиновое лекарственное средство является одним из 17 таких хемотоксических лекарственных средств, которое вызывает, помимо тяжелой миелотоксичности, тяжелую кардиотоксичность. Эти токсичности ограничивают его применение сверх суммарной дозы в 500 мг/м2.
Подходами, используемыми для увеличения опухолеспецифичности препарата, являются конъюгирование с (i) распознающей опухоль молекулой (например, лигандом рецептора, см., например, Safavy et al. 1999 - J Med Chem 42,4919-4924) или с (ii) пептидом, который расщепляется преимущественно в непосредственной близости от опухолевых клеток посредством протеаз, преимущественно секретируемых или вырабатываемых опухолевыми клетками.
Разработаны опухолеспецифичные олигопептидные пролекарства, такие как пролекарства доксорубицина. В отличие от предыдущих исследований, эти пептидные пролекарства были разработаны таким образом, чтобы быть непроницаемыми для клеточных мембран, оставаться стабильными в крови при расщеплении до активного лекарственного средства посредством пептидаз, высвобождаемых во внеклеточное пространство солидных опухолей. Эти активирующие пептидазы необязательно являются опухолеспецифичными, но могут увеличить селективность лекарственного средства до той степени, что эти пептиды сверхсекретируются во внеклеточном пространстве солидных опухолей и играют важную роль в инвазии раковых клеток и метастазировании. Оригинальность этого подхода состоит в том, что он нацелен не на один хорошо известный фермент, а на всю ферментативную активность, которая, как обнаружено, обеспечивается веществами, экскретируемыми опухолевыми клетками человека, поддерживаемыми в культуре. В качестве пролекарства-кандидата был выбран Ы-сукцинил-бета-аланилШ-лейцилШаланилШ-лейцилдоксорубицин (Suc-β ALAL-dox) (Fernandez et al. 2001, J Med Chem 44:3750-3). По сравнению с неконъюгированным доксорубицином данное проликарство является менее токсичным примерно в 5 раз для мышей и примерно в 3 раза для собак. Было доказано, что хроническое лечение посредством Suc-lALAL-dox было значительно менее кардиотоксичным, чем лечение посредством Dox, при дозах, которые были до 8 раз выше (для крыс). Улучшенная активность Suc-flAF-AL-dox по сравнению с Dox наблюдалась в нескольких моделях на ксенотрансплантатах опухолей (Dubois et al. 2002, Cancer Res 62:2327-31; Ravel et al. 2008, Clin Cancer Res 14:1258-65). Позже, в среде, кондиционированной опухолевыми клетками, и в опухолевых клетках, были идентифицированы два фермента, CD10 (неприлизин, или кала-антиген) и тимет-олигопептидаза (ТОР), которые являются активаторами Suc-β ALAL-dox (Pan et al. 2003, Cancer Res 63:5526-31; Dubois et al. 2006, Eur J Cancer 42:3049-56), но в процесс активации также могут быть включены и другие неидентифицированные протеазы.
Клинические исследования Suc-lALAL-dox фазы I были инициированы биофармацевтической компанией DIATOS SA. Миелотоксичность возникала при дозах, в три раза более высоких по сравнению с Dox. О связанных с лекарственным средством тяжелых нежелательных сердечных явлениях не сообщалось, даже при очень высоких суммарных дозах (2750 мг/м2). Клиническая польза наблюдалась для 59% исследованных пациентов (Delord et al, неопубликовано).
Основное ограничение для Suc-lALAL-dox заключается в том, что в качестве существенного токсического эффекта остается лейкопения и что экспериментально более высокая противоопухолевая активность могла бы наблюдаться только за счет все еще существенной миелотоксичности. Полагают, что такая миелотоксичность возникает из-за чувствительности пептидного фрагмента Suc-β ALAL-dox к гидролизу посредством ферментов, присутствующих в нормальных тканях.
В WO 02/100353 конкретно раскрыты химиотерапевтические пролекарства, разработанные таким образом, что они содержат олигопептид из 3-6 аминокислот, расщепляемый посредством CD10. В WO 02/00263 раскрыты пролекарства с олигопептидом из 3 аминокислот, расщепляемым посредством ТОР и
- 1 034046 по меньшей мере 1 пролекарство с аминокислотным олигопептидом (Leu-Ala-Gly), не расщепляемым посредством CD10. В WO 00/33888 и WO 01/95945 раскрыты пролекарства с олигопептидом из 4-20 аминокислот, содержащим не кодируемую генетически аминокислоту в фиксированном положении, где указанный олигопептид может расщепляться посредством ТОР. В WO 01/95945 сообщается, что по меньшей мере 1 пролекарство с олигопептидом β Ala-Leu-Tyr-Leu является устойчивым к протеолитическому действию CD10. В WO 01/95943 раскрыты пролекарства с олигопептидом из 3-4 аминокислот, содержащим фиксированный изолейцин, где указанный олигопептид предпочтительно устойчив к ТОР; при этом информация по чувствительности или устойчивости к CD10 не приведена. Более общая концепция пролекарства, состоящего из лекарственного средства, связанного с олигопептидом (из по меньшей мере 2 аминокислот), который связан с концевой группой, раскрыта в WO 96/05863 и далее была развита в WO 01/91798.
Другие конъюгаты полимерных лекарственных средств, в которых нелекарственный фрагмент содержит по меньшей мере водорастворимый полимер и пептид (содержащий 4-5 природных или неприродных аминокислот), селективно расщепляемые под действием матриксных металлопротеиназ (MMPs), раскрыты в WO 02/07770. Публикация WO 03/094972 сфокусирована на противоопухолевых пролекарствах, активируемых посредством белка активации фибробластов человека (FAPa); указанное пролекарство содержит олигопептид из 4-9 аминокислот с циклической аминокислотой в фиксированном положении. В WO 99/28345 раскрыто пролекарства, которые могут быть протеолитически расщеплены посредством простатспецифического антигена в олигопептиде из менее 10 аминокислот, присутствующем в пролекарстве.
В WO 97/34927 были обнаружены расщепляемые посредством FAPa пролекарства: Ala-Pro-7амино-4-трифторметилкумарин и Lys-Pro-7-амино-4-трифторметилкумарин. Публикация WO 00/71571 сфокусирована на расщепляемых посредством FAPa пролекарствах, для которых были проведены некоторые дополнительные экспериментальные исследования в отношении протеолитической чувствительности к CD26 (дипептидилпептидаза IV), которая считается нежелательной ввиду относительного избытка CD26 также и в незлокачественных клетках.
Другие пролекарства, активируемые посредством FAPa, включают промеллитиновый токсин (LeBeau et al. 2009, Mol Cancer Ther 8, 1378-1386), доксорубицин (Huang et al. 2011, J Drug Target 19, 487496), тапсигаргин (Brennen et al. 2012, J Natl Cancer Inst 104, 1320-1334) и пролекарства, содержащие олигопептид из 4-9 аминокислот с циклической аминокислотой в фиксированном положении (WO 03/094972).
В WO 01/68145 раскрыты расщепляемые посредством ММР, но устойчивые к неприлизину (CD10) пролекарства доксорубицина (см. пример 1001 указанной публикации), содержащий олигопептид из 3-8 аминокислот. Разработаны чувствительные к металлопротеиназе и плазмину пролекарства доксорубицина, а также конъюгаты CNGRC-пептида с доксорубицином (Hu et al. 2010, Bioorg Med Chem Lett 20, 853856; Chakravarty et al. 1983, J Med Chem 26, 638-644; Devy et al. 2004, FASEB J 18, 565-567; Vanhensbergen et al. 2002, Biochem Pharmacol 63, 897-908).
В WO97/12624, WO97/14416, WO98/10651, WO98/18493 и WO99/02175 раскрыты пептидсодержащие пролекарства, в которых пептид отщепляется посредством простатспецифического антигена (PSA).
Общим для всех приведенных выше пролекарств является наличие защитного или кэпирующего фрагмента, как правило, ковалентно связанного с N-концевой стороной олигопептида, где указанный фрагмент повышает стабильность пролекарства и/или способствует предотвращению интернализации пролекарства в клетки, такие как клетки-мишени. Такие защитные или кэпирующие фрагменты включают неприродные аминокислотные, β-аланильные или -сукцинильные группы (например, WO 96/05863, US 5,962,216). Другие стабилизирующие защитные или кэпирующие фрагменты включают дигликолевую кислоту, малеиновую кислоту, пироглутаминовую кислоту, глутаровую кислоту (например, WO 00/33888), карбоновую кислоту, адипиновую кислоту, фталевую кислоту, фумаровую кислоту, нафталиндикарбоновую кислоту, 1,8-нафтилдикарбоновую кислоту, аконитовую кислоту, карбоксикоричную кислоту, триазолдикарбоновую кислоту, бутандисульфоновую кислоту, полиэтиленгликоль (PEG) или его аналоги (например, WO 01/95945), уксусную кислоту, 1- или 2-нафтилкарбоновую кислоту, глюконовую кислоту, 4-карбоксифенилбороновую кислоту, полиэтиленгликолевую кислоту, нипекотиновую кислоту и изонипекотиновую кислоту (например, WO 02/00263, WO 02/100353), сукцинилированный полэтиленгликоль (например, WO 01/91798). Новый тип защитного или кэпирующего фрагмента, представляющий собой 1,2,3,4-циклобутантетракарбоновую кислоту, введен в WO 2008/120098. Защитным или кэпирующим фрагментом в WO 02/07770 может быть полиглутаминовая кислота, карбоксилированные декстраны, карбоксилированный полиэтиленгликоль или полимер на основе гидроксипролилметакриламида или №(2-гидроксипролил)метакрилоиламида.
Краткое описание изобретения
Пролекарства согласно настоящему изобретению имеют общую структуру: [Cx-OP]y-D, где С представляет собой кэпирующую группу, при этом указанная кэпирующая группа С представляет собой фосфоноацетильную группу;
- 2 034046
ОР представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO: 1), TSGP (SEQ ID NO: 4) или KLGP (SEQ ID NO: 6);
D представляет собой противоопухолевое лекарственное средство;
х представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у = 1;
у представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1; и причем связь между С и ОР и связь между ОР и D являются непосредственными или осуществляются посредством линкера или спейсерной группы;
при этом, если у больше 1, множество фрагментов ОР индивидуально связаны друг с другом непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы и/или индивидуально связаны с D непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы, и при этом по меньшей мере 1 ОР содержит кэпирующую группу С;
или его фармацевтически приемлемая соль.
В частности, олигопептидный фрагмент в вышеуказанной структуре представляет собой тетрапептидный фрагмент, имеющий последовательность Ala-Leu-Gly-Pro (3-буквенный код), также обозначенную как ALGP (1-буквенный код; SEQ ID NO:1); и/или кэпирующая группа С в вышеуказанной структуре представляет собой фосфоноацетильную группу, и/или лекарственное средство в вышеуказанной структуре представляет собой доксорубицин (далее также обозначенный как DOX или Dox). В качестве альтернативы, структура тетрапептида представляет собой TSGP (SEQ ID NO:4) или KLGP (SEQ ID NO:6). Соответственно, в одном из вариантов реализации настоящего изобретения структура тетрапептида в вышеуказанной общей структуре выбрана из группы, состоящей из ALGP (SEQ ID NO:1), TSGP (SEQ ID NO:4), KLGP (SEQ ID NO:6). В частности, тетрапептид в указанной выше структуре выбран из ALGP (SEQ ID NO:1) или KLGP (SEQ ID NO:6); в еще более частном варианте тетрапептид в указанной выше структуре представляет собой ALGP (1-буквенный код; SEQ ID NO:1). В случае наличия указанный линкер или спейсерная группа в вышеуказанных пролекарствах или их солях может представлять собой самоустраняющийся линкер или спейсерную группу.
Фармацевтически приемлемые соли вышеукзанного(ых) пролекарства(пролекарств) также являются частью настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим одно из вышеуказанных пролекарств или их солей, или их комбинацию, и по меньшей мере один из растворителя, разбавителя или носителя.
Настоящее изобретение включает вышеуказанное пролекарство или его соль, или вышеуказанную композицию, содержащую пролекарство или его соль, для применения для лечения рака. Способы лечения рака также являются частью настоящего изобретения, и указанные способы включают введение субъекту, имеющему рак, указанного пролекарства, или его соли, или указанной композиции, причем указанное введение приводит к лечению указанного рака. В частности, эффективные количества указанного пролекарства, или его соли, или указанной фармацевтической композиции не вызывают тяжелой лейкопении или токсичности для сердца.
В частности, предложено пролекарство, имеющее общую структуру: [Cx-OP]y-D, где С представляет собой кэпирующую группу, при этом указанная кэпирующая группа С представляет собой фосфоноацетильную группу;
ОР представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO: 1), TSGP (SEQ ID NO: 4) или KLGP (SEQ ID NO: 6);
D представляет собой лекарственное средство;
х представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у = 1;
у представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1; и причем связь между С и ОР и связь между ОР и D являются непосредственными или осуществляются посредством линкера или спейсерной группы;
при этом если у больше 1, множество фрагментов ОР индивидуально связаны друг с другом непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы и/или индивидуально связаны с D непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы, и при этом по меньшей мере 1 ОР содержит кэпирующую группу С; или его фармацевтически приемлемая соль, причём указанное пролекарство предназначено для высвобождения лекарственного средства D в непосредственной близости к опухоли или опухоль-ассоциированным клеткам.
Способы получения вышеуказанных пролекарств являются частью настоящего изобретения, и указанные способы включают стадии:
(i) обеспечения лекарственного средства;
(ii) связывания указанного лекарственного средства с кэпированным олигопептидным фрагментом с получением пролекарства; и (iii) очистки указанного пролекарства, полученного на стадии (ii);
где указанный олигопептидный фрагмент представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO: 1), TSGP (SEQ ID NO: 4) или KLGP (SEQ ID NO: 6), или (i) обеспечения лекарственного средства;
- 3 034046 (ii) связывания указанного лекарственного средства с олигопептидным фрагментом с последующим связыванием копирующей группы с олигопептидным фрагментом с получением пролекарства; и (iii) очистки пролекарства, полученного на стадии (ii);
где указанный олигопептидный фрагмент представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO: 1), TSGP (SEQ ID NO: 4) или KLGP (SEQ ID NO: 6).
Настоящее изобретение также включает способы получения и скрининга (выбора) пролекарствкандидатов, таких как пролекарства-кандидаты, имеющие общую структуру: [Cx-OP]y-D, где С представляет собой копирующую группу, при этом указанная копирующая группа С представляет собой фосфоноацетильную группу;
ОР представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO: 1), TSGP (SEQ ID NO: 4) или KLGP (SEQ ID NO: 6);
D представляет собой лекарственное средство;
х представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у = 1;
у представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1; и причем связь между С и ОР и связь между ОР и D являются непосредственными или осуществляются посредством линкера или спейсерной группы;
при этом если у больше 1, множество фрагментов ОР индивидуально связаны друг с другом непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы и/или индивидуально связаны с D непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы, причём по меньшей мере 1 ОР содержит кэпирующую группу С; где указанный способ включает стадии:
(i) обеспечения лекарственного средства D;
(ii) конъюгирования указанного лекарственного средства D с [Сх-ОР]у с получением пролекарства [Cx-OP]y-D;
(iii) приведения каждого из лекарственного средства D и указанного пролекарства [Cx-OP]y-D, независимо в контакт с культивируемыми in vitro клетками;
(iv) определения цитотоксичности лекарственного средства D и указанного пролекарства [Cx-OP]yD;
(v) идентификации по данным (iv) пролекарства [Cx-OP]y-D с цитотоксической активностью, сопоставимой с цитотоксической активностью лекарственного средства D; и (vi) выбора пролекарства [Cx-OP]y-D, идентифицированного на стадии (v), в качестве пролекарства-кандидата.
В любом из вышеуказанных способов скрининга указанное лекарственное средство D может быть выбрано из группы, состоящей из майтансина, гелданамицина, паклитаксела, доцетаксела, камптотецина, винбластина, винкристина, виндезина, метотрексата, аминоптерина, амрубицина или производного любого из них.
В соответствии с настоящим изобретением указанное лекарственное средство D может быть выбрано из группы, включающей доксорубицин, даунорубицин, амрубицин, винбластин, винкристин, калихеамицин, этопозид, этопозида фосфат, CC-1065, дуокармицин, KW 20 2189, метотрексат, метоптерин, аминоптерин, дихлорметотрексат, доцетаксел, паклитаксел, эпотилон, комбретастатин, комбретастатина A4 фосфат, доластатин 10, доластатин 11, доластатин 15, топотекан, камптотецин, митомицин C, порфиромицин, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, флударабин, тамоксифен, цитозинарабинозид, аденозинарабинозид, колхицин, галихондрин B, цисплатин, карбоплатин, митомицин C, блеомицин, мелфалан, хлорохин, циклоспорин A или майтансин.
В вышеуказанных способах и в случае наличия указанные линкер или спейсерная группа могут представлять собой самоустраняющиеся линкер или спейскрную группу.
Настоящее изобретение также относится к наборам, например, для направленной доставки в опухоль, содержащим емкость, содержащую вышеописанное пролекарство или его соль или содержащую композицию, содержащую такое пролекарство или его соль.
Описание графических материалов
Фиг. 1. Влияние конъюгатов PhAc-пептид-Dox на массу тела нормальных мышей OF-1 (n=4). Лекарственные средства или контроли вводили внутривенным (в.в.) путем в 0-й день. Мыши получали постоянный объем (10 мкл/г) либо физиологического раствора (-·-), либо различных дозированных растворов: PhAc-ALAL-Dox 80 мкмоль/кг (-▲-) и 160 мкмоль/кг (-х-); PhAc-ALGP-Dox в количестве 240 мкмоль/кг (-*-) и 320 мкмоль/кг (-о-). Результаты представлены в виде изменения средней массы тела.
Фиг. 2. Исследование эффективности PhAc-ALGP-Dox в сравнении со свободным доксорубицином на бестимусных мышах NMRI с ксенотрансплантатами карциномы толстой кишки человека LS174T. Лекарственные средства или контроли вводили в.в. путем в 0-й день и на 7-й день. Мыши получали постоянный объем (10 мкл/г) либо физиологического раствора (-·-;-◦-), либо различных дозированных растворов: PhAc-ALGP-Dox 140 мкмоль/кг (-▲-) и 160 мкмоль/кг (-х-); Dox 15 мкмоль/кг (-♦-). Результаты представлены в виде изменения средней массы тела и объема опухоли ± стандартную ошибку среднего (SEM) (n=4).
- 4 034046
Фиг. 3. Исследование эффективности PhAc-ALGP-Dox в сравнении со свободным доксорубицином на бестимусных мышах NMRI с ксенотрансплантатами МХ-1 карциномы молочной железы человека. Лекарственные средства или контроли вводили в.в. путем в 0-й, 3-й, 6-й и 9-й дни. Мыши получали постоянный объем (10 мкл/г) либо физиологического раствора (-•-), либо различных дозированных растворов: PhAc-ALGP-Dox 100 мкмоль/кг (*-); и Dox 8 мкмоль/кг (--). Результаты представлены в виде изменения средней массы тела и объема опухоли ± SEM (n=4).
Фиг. 4. Оценка времени для концентраций в плазме (А, В) и концентрации в сердечной ткани (С, D) доксорубицина или PhAc-ALGP-Dox и его метаболитов после в.в. болюсной инъекции самкам мышей OF-1 дикого типа в дозе 86,2 мкмоль/кг. Результаты представлены в виде средней концентрации ± стандартное отклонение (SD) (n=3).
Фиг. 5. Токсичность PhAc-ALGP-Dox и доксорубицина для клеток in vitro в отношении клеток Cor.At® (кардиомиоциты, полученные из эмбриональных стволовых клеток мыши). В качестве неспецифичного контроля проводили также тест на инактивированных фибробластах эмбрионов мышей (MEF). Клетки культивировали в течение 48 ч в присутствии лекарственных средств, и проводили тест со связыванием нейтрального красного для определения жизнеспособности клеток. Результаты представлены в виде кривых цитотоксичности. Значения IC50 рассчитывали по кривым цитотоксичности с применением программного обеспечения Prism GraphPad 5.0.
Фиг. 6. PhAc-ALGP-Dox вводили в увеличивающихся концентрациях (15, 35, 50, 100, 200, 300, 460, 620 мкмоль/кг) путем внутривенной инъекции бестимусным мышам NMRI с ксенотрансплантатами карциномы толстой кишки LoVo (3 мыши на группу). Через 24 ч мышей умерщвляли, и собирали опухоли. Концентрации доксорубицина в опухолях определяли путем анализа посредством ВЭЖХ после экстракции. Результаты представлены в виде средней концентрации доксорубицина в опухоли (пмоль/мг белка) ± SD.
Фиг. 7. Исследование токсичности PhAc-ALGP-Dox после одной и множества внутрибрюшинных (в.б.) инъекций на мышах OF-1. Животных лечили посредством PhAc-ALGP-Dox различных схем лечения: в количестве 56 мкмоль/кг 5х (Q1D5 -*-); в количестве 28 мкмоль/кг 10х (2Q1D5 --); в количестве 560 мкмоль/кг 1х (-ЖЖЖ-);в количестве 112 мкмоль/кг 5х (Q1D5 - ▲-); в количестве 56 мкмоль/кг 10х (2Q1D5 -х-).
Фиг. 8. Изменение во времени концентрации PhAc-ALGP-Dox и его метаболитов (A) или доксорубицина (B) после внутрибрюшинной инъекции самкам мышей OF-1 дикого типа при эквимолярной дозе 92 мкмоль/кг. Результаты представлены в виде средней концентрации ± SD (n=3).
Фиг. 9. Исследование эффективности PhAc-ALGP-Dox в сравнении со свободным доксорубицином на бестимусных мышах NMRI с ксенотрансплантатами карциномы толстой кишки человека LoVo. Лекарственные средства или контроли вводили в.б. путем дважды в день в течение пяти последовательных дней (стрелки). Мыши получали постоянный объем (10 мкл/г) либо физиологического раствора (-·-), либо различных дозированных растворов: PhAc-ALGP-Dox 25 мкмоль/кг (*), 35 мкмоль/кг (◦) и 50 мкмоль/кг (+); Dox 0,5 мкмоль/кг(·), 1 мкмоль/кг (▲) и 2 мкмоль/кг (х). Результаты отражают изменение средней массы тела и объема опухоли ± SEM (n=4). ** Статистическое отличие с р<0,05 от Dox 2 мкмоль/кг (t-критерий Манна-Уитни, программное обеспечение Graph Pad Prism 5.0).
Фиг. 10. Исследование эффективности PhAc-ALGP-Dox в сравнении со свободным доксорубицином на бестимусных мышах NMRI с ксенотрансплантатами карциномы молочной железы человека МХ1. Лекарственные средства или контроли вводили в.б. путем дважды в день в течение пяти последовательных дней (стрелки). Лечение повторяли с 72-часовым интервалом между двумя циклами. Мыши получали постоянный объем (10 мкл/г) либо физиологического раствора (·), либо различных дозированных растворов: PhAc-ALGP-Dox 50 мкмоль/кг (◦), Dox 1 мкмоль/кг () и 1.5 мкмоль/кг (▲). Результаты отражают изменение средней массы тела и объема опухоли ± SEM (n=6). f = умершая мышь.
Фиг. 11. Оценка эффективности PhAc-ALGP-Dox в сравнении с доксорубицином на модели легочной метастазирующей меланомы B16-F10. На графике слева представлены количества меланина в метастазах легких на 14-й день после инъекции опухолевых клеток B16F10. На графике справа приведены кривые выживаемости.
Фиг. 12. Оценка лейкопенического эффекта PhAc-ALGP-Dox в сравнении с доксорубицином. Мыши CD1 дважды в день получали внутрибрюшинные инъекции PhAc-ALGP-Dox 35 мкмоль/кг (·) или доксорубицина 3,5 мкмоль/кг () в течение пяти последовательных дней. Записывали изменение массы тела мышей (A). Собирали кровь из хвостовой вены в пробирки Microvettes с гепарином (Starsted) на 4-й, 11-й и 15-й дни после начала лечения. Проводили подсчет периферических белых кровяных телец (WBC) с использованием гематологического анализатора SCILvet abc (B). Увеличение или уменьшение WBC выражали в виде процента по отношению к WBC в 0-й день (100 %) для каждой мыши. На кривых приведено изменение средних процентных значений.
Фиг. 13. Оценка хронической кардиотоксичности PhAc-ALGP-Dox на мышах CD-1. Животные получали 10 внутривенных инъекций (стрелки) физиологического раствора (·); доксорубицина 6,9 мкмоль/кг () или PhAc-ALGP-Dox в количестве 13,8 (▲), 27,6 (х), 55,2 (*) и 82,8 мкмоль/кг (◦). Резуль- 5 034046 таты представлены в виде изменения средней относительной массы тела (%). f= умершая мышь.
Фиг. 14. Оценка противоопухолевого действия PhAc-ALGP-dox на мышах SCID с ортотопическими опухолями толстой кишки человека НСТ116. Мышам SCID вводили ортотопически (в слепую кишку) клетки опухоли толстой кишки человека НСТ116. Одну группу лечили физиологическим раствором, а группу 2 и 3 получали 10 внутрибрюшинных инъекций (2Q1D5) по 35 и 50 мкмоль/кг PhAc-ALGPдоксорубицина. Массу первичных опухолей записывали на 34-й день после инокуляции клеток.
Фиг. 15. Оценка антиметастатического эффекта (в печени) PhAc-ALGP-dox на мышах SCID с ортотопическими опухолями толстой кишки человека НСТ116. Мышам SCID вводили ортотопически (в слепую кишку) опухолевые клетки толстой кишки человека НСТ116. Одну группу лечили солевым раствором, а группы 2 и 3 получали 10 внутрибрюшинных инъекций (2Q1D5) по 35 и 50 мкмоль/кг PhAcALGP-доксорубицина. Записывали данные по метастазам в печени на 34-й день после инокуляции клеток.
Фи. 16. Действие PhAc-ALGP на модели с ксенотрансплантатом UZLX-STS3. UZLX-STS3 представляет собой ксенотрансплантат ткани, полученной у пациента, которому поставлен диагноз дедифференцированная липосаркома (DDLPS). В процессе выполнения пассажей, в опухолях, выделенных из мышей, обнаружили те же морфологические и молекулярные признаки, что и в исходной биопсии, взятой у пациента при хирургической операции (то есть амплификация гена MDM2, иммуноположительные клетки в отношении MDM2). В предыдущих ксенотрансплантатах, не полученных путем перфузии, данная опухолевая модель саркомы была совершенно устойчива к свободному доксорубицину, который давали в его максимально переносимой дозе.
Мышам в общем количестве 24 штуки билатерально трансплантировали UZLX-STS3 (ксенотрансплантаты ткани, пассаж 10). Животных случайным образом распределяли на три различные группы: контрольную группу (физиологический раствор; -•-); группу PhAc-ALGP-доксорубицина (суммарная доза
1,20 ммоль/кг; --) и группу доксорубицина (суммарная доза 0,03 ммоль/кг; -▲-). Лекарственные средства вводили внутрибрюшинно в течение 7 дней путем непрерывного высвобождения через осмотрический насос Alzet® при скорости доставки 0,5 мл/ч в течение 7 дней. Эксперимент продолжали 21 день (7 дней лечения + 14 дней наблюдения). Оценивали объем опухоли и массу тела мыши на исходном уровне и далее три раза в неделю до конца каждого эксперимента. Через 21 день мышей умерщвляли. Объем опухоли записывали 3 раза в неделю путем измерения посредством 3-мерного штангенциркуля. Данные представлены в виде среднего из относительных объемов опухолей на группу ± стандартное отклонение.
Сравнение объемов опухоли на нулевой день и объемов на последний день экспериментов проводили посредством парного критерия соответствия Вилкоксона. Сравнения между различными группами проводили с использованием критерия Манна-Уитни (относительные объемы опухолей, гистологическая оценка). Р < 0,05 считали статистически значимым. Для всех расчетов использовали программное обеспечение STATISTICA (StatSoft, версия 12.0).
Фиг. 17. Изменение относительной массы тела животных в эксперименте приведено на фиг. 16. Данные представлены в виде средней относительной массы тела мышей в каждой группе ± стандартное отклонение. Пунктирные линии обозначают значения сравнения для линии мышей nu/nu NMRI. PhAcALGP-доксорубицин (--); Dox (-▲-) и физиологический раствор (-•-).
Фиг. 18. Изменение общего количества белых кровяных телец (103/мкл) у животных в эксперименте приведено на фиг. 16. Данные представлены в виде среднего количества белых кровяных телец у мышей в каждой группе ± стандартное отклонение. Пунктирные линии обозначают значения сравнения для линии мышей nu/nu NMRI. PhAc-ALGP-доксорубицин (--); Dox (-▲-) и физиологический раствор (-•-). Общее количество белых кровяных телец определяли с использованием мультипараметрического автоматизированного гематологического анализатора CELL-DYN 3500 с оптимизацией по параметрам крови мышей (Abott Diagnostics, Division, IL, США).
Фиг. 19. Изменение общего количества нейтрофилов (103/мкл) у животных в эксперименте приведено на фиг. 16. Данные представлены в виде среднего количества нейтрофилов у мышей в каждой группе ± стандартное отклонение. Пунктирные линии обозначают значения сравнения для линии мышей nu/nu NMRI. PhAc-ALGP-доксорубицин (--); Dox (-▲-) и физиологический раствор (-•-). Количество нейтрофилов определяли с использованием мультипараметрического автоматизированного гематологического анализатора CELL-DYN 3500 с оптимизацией по параметрам крови мышей (Abort Diagnostics, Division, IL, США).
Подробное описание изобретения
В целом, в настоящем изобретении описаны новые пролекарственные соединения терапевтических агентов, в частности пролекарства, содержащие противоопухолевый терапевтический агент, демонстрирующие улучшенные терапевтические свойства. Указанные улучшенные терапевтические свойства включают в себя сниженную токсичность и повышенную эффективность. В частности, указанные пролекарства демонстрируют высокую специфичность действия, сниженную токсичность, улучшенную стабильность в сыворотке и крови, и соответствующий терапевтический агент не перемещается в клеткимишени, пока пролекарство не будет окончательно активировано (активация может включать в себя не
- 6 034046 сколько стадий) посредством (а) связанного(ых) с клетками-мишенями фермента(ов), таких как внеклеточные пептидазы, высвобождвющиеся из клеток-мишеней, или таких ферментов, которые связанны с внеклеточной поверхностью клеток-мишеней. Целевые клетки включают раковые клетки, а также стромальные опухолевые клетки. Пролекарственные соединения согласно настоящему изобретению представляют собой пролекарства терапевтического агента, в которых терапевтический агент непосредственно или опосредовано связан с олигопептидом, который, в свою очередь, связан со стабилизирующей кэпирующей группой.
В общем, пролекарства согласно настоящему изобретению имеют следующую общую структуру: [Cx-OP]y-D, где С представляет собой кэпирующую группу;
ОР представляет собой олигопептидный фрагмент;
D представляет собой лекарственное средство;
х представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у = 1;
у представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у больше 1, то по меньшей мере 1 ОР содержит кэпирующую группу; и причем связь между С и ОР и связь между ОР и D являются непосредственными или осуществляются посредством линкера или спейсерной группы, и при этом если у больше 1, множество фрагментов ОР индивидуально связаны друг с другом непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы, где один из фрагментов ОР связан непосредственно, посредством линкера или посредством спейсерной группы с D. Другими словами, множество фрагментов ОР могут быть связаны друг с другом с образованием линейной или разветвленной структуры, которая связана с D посредством одного из фрагментов ОР в указанной линейной или разветвленной структуре. В качестве альтернативы, каждый из множества фрагментов ОР индивидуально связан с D непосредственно, посредством линкера или посредством спейсерной группы. Настоящее изобретение включает промежуточную группировку, где каждый из нескольких фрагментов из множества фрагментов ОР индивидуально связаны с D непосредственное, посредством линкера или посредством спейсерной группы, и где несколько из множества фрагментов ОР сами индивидуально связаны друг с другом, как описано выше, с образованием линейной или разветвленной структурой, в которой один из фрагментов ОР связан непосредственно, посредством линкера или посредством спейсерной группы с D; или предложена их фармацевтически приемлемая соль.
Для ясности, но не в качестве исчерпывающего варианта, если у =2, в общую структуру включены следующие пролекарства: C-OP-D-OP-C; C-OP-OP-D и C-OP-D-OP. Кэпирующая группа С, таким образом, может присутствовать (посредством непосредственной или опосредованной связи, как описано выше) в одном или более олигопептидных фрагментах ОР в случае пролекарственного соединения/молекулы, содержащих множество олигопептидных фрагментов ОР.
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения олигопептидный фрагмент представляет собой пептид, минимальная длина которого составляет 4 последовательных аминокислоты (тетрапептид), а максимальная длина составляет 8 аминокислот (то есть пептид, имеющий длину 4, 5, 6, 7 или 8 последовательных аминокислот), и который содержит пролин на карбоксиконце, где указанный пролин связан непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы с лекарственным средством D. Без ограничения, изобретатели предполагают, что данный олигопептидный фрагмент отщепляется/ удаляется из лекарственного средства D посредством двустадийного способа, где на первой стадии указанное пролекарство превращают в промежуточное соединение дипептид-лекарственное средство, а на второй стадии превращают указанное промежуточное соединение дипептид-лекарственное средство в свободное лекарство D. В частном варианте реализации настоящего изобретения дипептид, присутствующий в промежуточном соединении дипептид-лекарственное средство, имеет последовательность глицинпролин (GP), аланин-пролин (AP) или лизин-пролин (KP). Таким образом, задачей настоящего изобретения является обеспечение пролекарств, имеющих вышеуказанную общую формулу, где OP представляет собой пептид, минимальная длина которого составляет 4 последовательных аминокислоты (тетрапептид), а максимальная длина составляет 8 аминокислот (то есть пептид, имеющий длину 4, 5, 6, 7 или 8 последовательных аминокислот), который содержит на карбоксиконце пролин, включая дипептид, выбранный из группы, состоящей из глицина-пролина (GP), аланина-пролина (AP) и лизина-пролина (KP), где пролин указанного пролинсодержащего дипептида связан непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы с лекарственным средством D.
В частности, олигопептидный фрагмент в вышеуказанной структуре представляет собой тетрапептидный фрагмент, имеющий последовательность Ala-Leu-Gly-Pro (3-буквенный код), также обозначенную как ALGP (1-буквенный код; SEQ ID NO:1); или Ala-Leu-Ala-Leu (3-буквенный код), также обозначенную как ALAL (1-буквенный код; SEQ ID NO:2), и/или кэпирующая группа С в вышеуказанной структуре представляет собой фосфоноацетильную группу, и/или лекарственное средство в вышеуказанной структуре представляет собой доксорубицин (далее также обозначенную как DOX или Dox). В качестве альтернативы, структура тетрапептида представляет собой ALAP (SEQ ID NO:3), TSGP (SEQ ID NO:4), TSAP (SEQ ID NO:5), KLGP (SEQ ID NO:6), KLAP (SEQ ID NO:7), ALKP (SEQ ID NO:8), TSKP (SEQ ID NO:9) или KLKP (SEQ ID NO:10). Соответственно, в одном из вариантов реализации настояще- 7 034046 го изобретения структура тетрапептида в указанной выше структуре выбрана из группы, состоящей из ALGP (SEQ ID NO:1), ALAP (SEQ ID NO:3), TSGP (SEQ ID NO:4), TSAP (SEQ ID NO:5), KLGP (SEQ ID NO:6), KLAP (SEQ ID NO:7), ALKP (SEQ ID NO:8), TSKP (SEQ ID NO:9) и KLKP (SEQ ID NO:10). В частности, тетрапептид в указанной выше структуре выбран из ALGP (SEQ ID NO:1) или KLGP (SEQ ID NO:6); в еще более частном варианте тетрапептид в указанной выше структуре представляет собой ALGP (1-буквенный код; SEQ ID NO:1). В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения лекарственное средство (D) в указанной выше структуре представляет собой доксорубицин или его фармацевтически приемлемую соль.
В частности, пролекарство может иметь структуру Соединения I (см. пример 3.1) или может представлять собой его фармацевтически приемлемую соль. Копирующая группа фосфоноацетил обеспечивает преимущества, заключающиеся в том, что ее наличие позволяет избежать использования неприродных аминокислот на терминальном конце олигопептида. Если лекарственное средство D представляет собой доксорубицин, фосфоноацетил в качестве копирующей группы С имеет дополнительное преимущество, заключающееся в обеспечении отрицательного заряда, который важен для того, чтобы избежать агрегации олигопептидных производных доксорубицина. В целом, стабильность пролекарства согласно настоящему изобретению может быть определена таким образом, что при инкубировании пролекарства в крови человека в течение более 2 ч должно образовываться менее 10% расщепленных производных.
Вне зависимости от вышеприведенных определений копирующей группы C, олигопептидного фрагмента OP и лекарственного средства, данные определения не ограничивают настоящее изобретение, и другие комбинации также предусмотрены настоящим изобретением. Данные комбинации включают любые OP и/или D с копирующей группой C, представляющей собой фосфоноацетильную группу. Другие комбинации включают любую C (любую копирующую группу, известную в данной области) и/или любое D с олигопептидным фрагментом OP, представляющим собой тетрапептидный фрагмент, имеющий последовательность Ala-Leu-Gly-Pro (3-буквенный код) или Ala-Leu-Ala-Leu (3-буквенный код), или ALGP (1-буквенный код; SEQ ID NO:1) или ALAL (1-буквенный код; SEQ ID NO:2). В качестве альтернативы, структура тетрапептида представляет собой ALAP (SEQ ID NO:3), TSGP (SEQ ID NO:4), TSAP (SEQ ID NO:5), KLGP (SEQ ID NO:6), KLAP (SEQ ID NO:7), ALKP (SEQ ID NO:8), TSKP (SEQ ID NO:9) или KLKP (SEQ ID NO:10). В другом альтернативном варианте структура тетрапептида представляет собой ALGP (SEQ ID NO:1), ALAP (SEQ ID NO:3), TSGP (SEQ ID NO:4), TSAP (SEQ ID NO:5), KLGP (SEQ ID NO:6), KLAP (SEQ ID NO:7), ALKP (SEQ ID NO:8), TSKP (SEQ ID NO:9) или KLKP (SEQ ID NO:10). В частности, тетрапептид в указанной выше структуре выбран из ALGP (SEQ ID NO:1) или KLGP (SEQ ID NO:6); в еще более частном варианте тетрапептид в указанной выше структуре представляет собой ALGP (1-буквенный код; SEQ ID NO: 1).
В зависимости от структуры/химической формулы лекарственного средства, 1 или более олигопептидных фрагментов согласно настоящему изобретению, из которых по меньшей мере один из них копирован, могут быть связаны с лекарственным средством. Олигопептидные фрагменты могут сами образовывать линейную или разветвленную структуру, связанную с лекарственным средством или, в качестве альтернативы, каждый из множества олигопептидных фрагментов индивидуально связан с лекарственным средством.
Копирующая группа или защитный или копирующий фрагмент связаны с олигопептидным фрагментом пролекарства и повышают растворимость и/или стабильность пролекарства (например, в крови животного, млекопитающего, человека или субъекта, которому вводят пролекарство) и/или способствует предотвращению интернализации пролекарства в клетку, такую как клетка-мишень.
Связь между копирующей группой и олигопептидом и/или между олигопептидом и терапевтическим агентом или лекарственным средством может быть непосредственной, например, через N-концевую аминогруппу олигопептида, или через C-концевую карбоксильную группу олигопептида, или через боковую цепь одной из аминокислот в олигопептиде.
В качестве альтернативы, указанная связь может быть обосредованной, например, путем введения линкера или спейсерной группы между олигопептидом OP и лекарственным средством D. В случае цитотоксических соединений, таких как доксорубицин, содержащий свободную аминогруппу (NH2), линкер между D и OP сам по себе не требуется, так как ферментативное расщепление амидной связи между D и OP обеспечивает наличие свободной КН2-группы в цитотоксичном лекарственном средстве.
Однако большинство цитотоксических лекарственных средств D против рака не содержит какойлибо свободной NH2-группы, и данные лекарственные средства не могут быть самостоятельно связаны с OP амидной связью. Введение NH2-группы в указанные молекулы может уменьшить или подавить их цитотоксическую активность. Для таких лекарственных средств в качестве линкера между лекарственным средством D и олигопептидом OP может быть использована самоуничтожающаяся (или самоустраняющаяся, самовыводящаяся, самолизирующася или самоуходящая) спейсерная группа или спейсер. OP связан с самоуничтожающимся спейсером амидной связью, чувствительной к внеклеточным ферментам, способным активировать пролекарство. После расщепления амидной связи между OP и спейсером, самоуничтожающийся спейсер самостоятельно отщепляется от лекарственного средства, оставляя его недериватизированным, то есть оставляя его в его исходной активной форме. Самоуничтожающиеся спейсе
- 8 034046 ры включают парааминобензоилоксикарбонильные фрагменты, которые способны присоединять группы -ОН, -СООН, - NH или -SH лекарственного средства с одной стороны к карбоксиконцевой группе пептида с другой стороны. Данный тип линкера представляет собой электронно-каскадный спейсер. Показано, что такая связь поддается расщеплению посредством пептидаз. После расщепления амидной связи ОРспейсер ароматический амин самоустраняющегося спейсера становится электрондонором, что приводит к вытеснению и высвобождению свободного лекарственного средства и СО2 (Carl et al. 1981, J Med Chem 24, 479-480; Chakravarty et al. 1983, J Med Chem 26, 638-644; de Groot et al. 1999, J Med Chem 42, 52775283, King et al. 2002, J Med Chem 45,4336-4343). В некоторых патентах и заявках на патенты описаны другие самоуничтожающиеся/самоустраняющиеся спейсеры, такие как гетероциклические спейсеры, высвобождающие лекарственное средство от нацеливающего лиганда, такого как антитело (например, US 6,214,345; US 2003/0130189; US 2003/0096743; US 6,759,509; US 2004/0052793; US 6,218,519; US 6,835,807; US 6,268,488; US 2004/0018194; WO 98/13059; US 2004/0052793; US 6,677,435; US 5,621,002; US 2004/0121940; WO 2004/032828, US 2009/0041791).
Примеры других, необязательно самоустраняемых, линкерных или спейсерных групп включают аминокапроновую кислоту, гидразидную группу, сложноэфирную группу, группу простого эфира и сульфгидрильную группу. Линкер или спейсерная группа, описанные выше, между кэпирующей группой и олигопептидом и/или между олигопептидом и терапевтическим агентом могут быть предпочтительными по таким причинам, как: (I) в качестве разделителя из пространственных соображений, чтобы облегчить ферментативное высвобождение аминокислоты, связанной с терапевтическим агентом, или другие стадии ферментативной активации; (II) чтобы обеспечить надлежащую химию присоединения между различными фрагментами пролекарства (и, таким образом, обеспечить гибкость в отношении соединения любого возможного лекарственного средства и/или кэпирующего фрагмента с олигопептидом согласно настоящему изобретению); (III) чтобы улучшить процесс синтеза для получения пролекарственного конъюгата (например, путем предварительной дериватизации терапевтического агента или олигопептида посредством линкерной группы перед конъюгированием для повышения выхода или специфичности); (IV) чтобы улучшить физические свойства пролекарства; или (v) чтобы обеспечить дополнительный механизм внутриклеточного высвобождения лекарственного средства. Независимо от типа связи, непосредственного или опосредованного, связь должна: (1) не нарушать или несущественно нарушать функциональность олигопептидного фрагмента, то есть не должна существенно нарушать ни способность к протеолитическому расщеплению посредством TOP, ни устойчивость к протеолитическому расщеплению посредством CD1 и (2) сохранять стабильность соединения в крови. Определение функциональности кэпированного олигопептидного фрагмента в пролекарстве может быть проведено легко и простым способом, например, как описано в последующем разделе Примеры. Такое тестирование не будет чрезмерно обременительным для специалиста.
Фраза фармацевтически приемлемая(ые) соль(соли) при использовании в настоящем документе означает те соли соединений согласно настоящему изобретению, которые являются безопасными и эффективными для предполагаемого медицинского применения и которые обладают необходимой биологической активностью. Фармацевтически приемлемые соли включают соли кислотных или основных групп, присутствующих в соединениях согласно настоящему изобретению. Подходящие соли включают, но не ограничиваются ими, соли алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия, цинка и диэтаноламина. Обзор фармацевтически приемлемых солей см., например, в источниках Berge et al. 1977 (J. Pharm. Sci. 66, 1-19) или Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (P. H. Stahl, C.G. Wermuth (Eds.), August 2002), включенных в настоящее описание посредством ссылки.
Лекарственное средство или терапевтический агент, конъюгированные с олигопептидом согласно настоящему изобретению могут быть подходящими для применения для лечения рака (например, путем проявления цитотоксической или антиангиогенной активности), воспалительного заболевания или некоторых других медицинских состояний. Лекарственное средство или терапевтический агент, конъюгированные с олигопептидом согласно настоящему изобретению, могут представлять собой любое лекарственное средство или терапевтический агент, способные проникать в клетку-мишень. Таким образом, терапевтический агент может быть выбран из числа классов соединений, включающих, антибиотики, алкилирующие агенты, антипролиферативные агенты, тубулинсвязывающие агенты, алкалоиды барвинка, ендиины, подофиллотоксины или производные подофиллотоксинов, лекарственные средства семейства птеридина, таксаны, антрациклины, доластатины, ингибиторы топоизомеразы, химиотерапевтические агенты с координационными комплексами с платиной и майтансиноиды. В более частном варианте указанное лекарственное средство или терапевтический агент может представлять собой одно из следующих соединений, или его производное, или аналог: доксорубицин, даунорубицин, амрубицин, винбластин, винкристин, калихеамицин, этопозид, этопозида фосфат, CC-1065, дуокармицин, KW 20 2189, метотрексат, метоптерин, аминоптерин, дихлорметотрексат, доцетаксел, паклитаксел, эпитиолон, комбретастатин, комбретастатина A4 фосфат, доластатин 10, доластатин 11, доластатин 15, топотекан, камптотецин, митомицин C, порфиромицин, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, флударабин, тамоксифен, цитозинарабинозид, аденозин-арабинозид, колхицин, галихондрин B, цисплатин, карбоплатин, митомицин C, блеомицин, мелфалан, хлорохин, циклоспорин A и майтансин. Под производным подразумевают соединение, кото
- 9 034046 рое образуется в результате реакции целевого соединения с другим химическим фрагментом (отличным от олигопептидного фрагмента, связанного непосредственно или опосредованно с соединением) и которое включает в себя фармацевтически приемлемую соль, кислоту, основание или сложный эфир указанного соединения. Другие терапевтические агенты или лекарственные средства включают в себя: виндезин, винорелбин, 10-деацетилтаксол, 7-эпитаксол, баккатин III, 7-ксилозилтаксол, изотаксел, ифосфамид, хлораминофен, прокарбазин, хлорамбуцил, тиофосфорамид, бусульфан, дакарбазин (DT1C), гелданамицин, нитрозомочевины, эстрамустин, BCNU, CCNU, фотемустин, стрепотнигрин, оксалиплатин, метотрексат, аминоптерин, ралтитрексед, гемцитабин, кладрибин, клофарабин, пентостатин, гидроксимочевины, иринотекан, топотекан, 9-диметиламинометилгидроксикамптотецина гидрохлорид, тенипозид, амсакрин; митоксантрон; L-канаванин, ТНР-адриамицин, идарубицин, рубидазон, пирарубицин, зорубицин, акларубицин, эпиадриамицин (4'-эпи-адриамицин или эпирубицин), митоксантрон, блеомицины, актиномицины, в том числе актиномицин D, стрептозотоцин, калихеамицин; L-аспарагиназу; гормоны; чистые ингибиторы ароматазы; андрогены, ингибиторы протеасом; ингибиторы фарнезилтрансферазы (FTI); эпотилоны; дискодермолид; фостриецин; ингибиторы тирозинкиназ, такие как STI 571 (иматиниба мезилат); ингибиторы рецепторов тирозинкиназ, такие как эрлотиниб, сорафениб, вандетаниб, канертиниб, PKI 166, гефитиниб, сунитиниб, лапатиниб, EKB-569; ингибиторы Bcr-Abl-киназы, такие как дазатиниб, нилотиниб, иматиниб; ингибиторы киназы Aurora, такие как VX-680, CYC116, РНА-739358, SU-6668, JNJ-7706621, MLN8054, AZD-1152, РНА-680632; ингибиторы CDK, такие как флавопиродол, селициклиб, Е7070, BMS-387032; ингибиторы МЕК, такие как PD184352, U-0126; ингибиторы mTOR, такие как CCI-779 или АР23573; ингибиторы кинезина - белка веретена, такие как испинесиб или МК-0731; ингибиторы RAF/MEK, такие как сорафениб, CHIR-265, PLX-4032, CI-1040, PD0325901 или ARRY-142886; бриостатин; L-779450; LY333531; эндостатины; HSP 90-связующий агент гелданамицин, макроциклические полиэфиры, такие как галихондрин В, эрибулин. Для ряда соединений, включенных в вышеприведенный список, более подробное экспериментальное руководство приведено в данном описании в примере 16. К лекарственным средствам, отличным от доксорубицина, охваченным настоящем изобретением, настоящим изобретением охвачен амрубицин, который является аналогом антрациклина со свободной МН2-группой (Hanada et al. 1998, Jpn J Cancer Res 89, 1229-1238), который может быть связан с кэпированным олигопептидом, таким как PhAc-ALGP, тем же способом, который используется для доксорубицина. Добавление (а) полиэтиленгликолевой(ых) группы (групп) к аминогруппе олигопептидного фрагмента) может быть произведено для того, чтобы увеличить период полужизни пролекарства в соответствии с изобретением в кровотоке после введения млекопитающему. Добавление (а) полиэтиленгликолевой(ых) группы (групп) также может играть роль блокирующего агента.
Пролекарство или его соль согласно настоящему изобретению может дополнительно присутствовать в композиции, содержащей, кроме пролекарства или его соли любого из подходящего растворителя (способного солюбилизировать пролекарство до желаемой степени), разбавитель (способный разбавлять концентрированное пролекарство до желаемой степени) или носитель (любое соединение, способное поглощать, прикреплять или инкорпорировать пролекарство и затем высвобождать в любом количестве пролекарство во внеклеточный компартмент тела субъекта). Указанная композиция может в качестве альтернативы содержать множество (то есть более 1) пролекарств или его солей или любую их комбинацию (например, пролекарство 1 + его соль, пролекарство 1 + пролекарство 2, пролекарство 1 + его соль + пролекарство 2 и т. д.) В частности, указанный растворитель, разбавители или носитель являются фармацевтически приемлемыми, то есть приемлемыми для введения субъекту, подлежащего лечению композицией согласно настоящему изобретению. В помощь для разработки фармацевтически приемлемой композиции, может быть, например Фармакопея. Композиция может быть приготовлена таким образом, что она подходит для любого пути введения, включая внутричерепное, внутриспинное, энтеральное и парентеральное введение. Схема, по которой вводят пролекарство, может отличаться, например, в зависимости от наличия или отсутствия кэпирующей группы, в зависимости от состава, в зависимости от общего физического состояния субъекта, подлежащего лечению, и, например, в зависимости от решения лечащего врача.
Пролекарство, или его соль согласно настоящему изобретению, или содержащая их композиция, особенно подходит для лечения заболевания, которое поддается лечению высвобождаемым лекарственным средством. Особый интерес представляет собой рак или опухоли, такие как солидные опухоли. Рак включает, например, рак молочной железы, колоректальный рак, рак печени, рак легких, такой как мелкоклеточный рак, немелкоклеточный рак, рак бронхов, рак предстательной железы, рак яичников, рак головного мозга и рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак головы и шеи, рак желудка, рака мочевого пузыря, неходжкинскую лимфому, меланомы, лейкозы, нейробластомы и глиобластомы. Субъект, подлежащий лечению посредством пролекарства согласно настоящему изобретению, может представлять собой любое млекопитающее, нуждающееся в таком лечении, в частности это может человек. Лечение может привести к регрессии заболевания (например, с точки зрения уменьшения объема опухоли или опухолевой массы и метастазов), снижению прогрессирования заболевания по сравнению с ожидаемым прогрессированием заболевания или к стабилизации заболевания, то есть ни регрессии, ни прогрессирования заболевания. Всё это благоприятные результаты лечения. В частности, эффективные ко- 10 034046 личества указанного пролекарства или его соли, или указанной композиции, не вызывают сильную лейкопению или токсичность для сердца/кардиотоксичность. Возможное определение тяжелой человеческой лейкопении представляет собой определенная по критериям ВОЗ лейкопения класса 3 (1000-1900 лейкоцитов/мл) или класса 4 (менее 1000 лейкоцитов/мл).
Также предусмотрено включение противоракового пролекарства (или его соли) согласно настоящему изобретению в комбинированной терапии. Это может быть лечение с комбинацией способов химиотерапии, то есть применение противоракового пролекарства (или его соли) с другими видами лечения против рака, такими как лучевая терапия (либо посредством прямого облучения, либо посредством введения меченого изотопом антитела или фрагмента антитела) или хирургии. Это также может быть в комбинированной химиотерапии, то есть лечении пациента множеством различных лекарственных средств, где указанные лекарственные средства предпочтительно различаются по механизму их действия и их побочным эффектам. Обычно в такой комбинированной химиотерапии лекарственные средства вводят одновременно. Преимуществом комбинированной химиотерапии является минимизация возможности развития устойчивости к какому-либо одному агенту. Еще одно преимущество может состоять в том, что каждое из отдельных лекарственных средств может быть применено в более низкой дозе с обеспечением тем самым снижения общей токсичности.
Пролекарство или его соль согласно настоящему изобретению, или композиция, содержащая такое пролекарство или соль, таким образом, могут быть применены для лечения заболевания (например, рака), в виде монотерапии или в составе лечения комбинацией химиотерапевтических агентов или лечения к комбинацией способов химиотерапии. В более общем варианте по отношению к комбинированной химиотерапии, пролекарство против рака (или его соль) согласно настоящему изобретению может быть объединено с одним или более алкилирующим(и) противоопухолевым(и) агентом(амии), и/или одним или более антиметаболитом(ами), и/или один или более агентом(ами) против микротрубочек, и/или одним или более ингибитором(ами) топоизомеразы, и/или одним или более цитотоксическим(и) антибиотиком(ами), и/или одним или более биологического(их) агента(ов) против рака (например, антителами), где один или более из них, когда это применимо, также может представлять собой пролекарство(а) (или ее соль) согласно настоящему изобретению.
Лекарственное средство доксорубицин (также известно под торговыми названиями Адриамицин или Рубекс) обычно используется для лечения нескольких типов рака, таких как некоторые лейкозы и лимфома Ходжкина, а также рак мочевого пузыря, молочной железы, желудка, легких, яичников, щитовидной железы, саркомы мягких тканей, множественной миеломы и других. Доксорубицин также применяют в различных видах комбинированной терапии. Доксорубицинсодержащие виды терапии включают АС или СА (Адриамицин, циклофосфамид), ТАС (Таксотер, AC), ABVD (Адриамицин, блеомицин, винбластин, дакарбазин), ВЕАСОРР (блеомицин, этопозид, Адриамицин (доксорубицин), циклофосфамид, Онковин (винкристин), прокарбазин, преднизон), CHOP (циклофосфамид, Адриамицин, винкристин, преднизолон), FAC или CAF (5-фторурацил, Адриамицин, циклофосфамид), MVAC (метотрексат, винкристин, адриамицин, цисплатин), CAV (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин) и CAVE (CAV, этопозид), CVAD (циклофосфамид, винкристин, адриамицин, дексаметазон), DT-PACE (дексаметазон, талидомид, цисплатин или платинол, адриамицин, циклофосфамид, этопозид), m-BACOD (метотрексат, блеомицин, адриамицин, циклофосфамид, винкристин, дексаметазон), МАСОР-В (метотрексат, лейковорин, адриамицин, циклофосфамид, винкристин, преднизон, блеомицин), Pro-MACE-МОРР (метотрексат, адриамицин, циклофосфамид, этопозид, мехлорэтамин, винкристин, прокарбазин, преднизон), ProMACE-CytaBOM (преднизон, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид, цитарабин, блеомицин, винкристин, метотрексат, лейковорин), Станфорд V (Stanford V) (доксорубицин, мехлорэтамин, блеомицин, винбластин, винкристин, этопозид, преднизолон), DD-4A (винкристин, актиномицин, доксорубицин), VAD (винкристин, доксорубицин, дексаметазон), Режим I (Regimen I) (винкристин, доксорубицин, этопозид, циклофосфамид) и VAPEC-B (винкристин, доксорубицин, преднизон, этопозид, циклофосфамид, блеомицин). Кроме доксорубицин содержащих комбинированных видов химиотерапии существует множество других комбинированных видов химиотерапии, таких как ВЕР (блеомицин, этопозид, платиносодержащий агент (цисплатин (Платинол))), САРОХ или XELOX (капецитабин, оксалиплатин), CBV (циклофосфамид, кармустин, этопозид), FOLFIRI (фторурацил, лейковорин, иринотекан), FOLFIRINOX (фторурацил, лейковорин, иринотекан, оксалиплатин), FOLFOX (фторурацил, лейковорин, оксалиплатин), ЕС (эпирубицин, циклофосфамид), ICE (ифосфамид, карбоплатин, этопозид (VP-16)) и IFL (иринотекан, лейковорин, фторурацил). Комбинация доксорубицина с сиролимусом (рапамицином) была раскрыта Верделом и др. (Wendel et al), 2004 (Nature 428, 332-337), для лечения Akt-положительных лимфом у мышей. В любом из этих видов комбинированной терапии любое из лекарственных средств может быть замещено пролекарством (или его солью) согласно настоящему изобретению.
Также дополнительно можно предусмотреть виды комбинированной терапии, включающие пролекарство против рака (или его соль) согласно настоящему изобретению (либо отдельно, либо как часть лечения комбинацией химиотерапевтических агентов или как часть лечения с комбинацией способов терапии) и соединения, отличные от цитостатиков. Такие другие соединения включают любое соединение, одобренное для лечения рака или разрабатываемое для лечения рака. В частности, такие другие со- 11 034046 единения включают моноклональные антитела, такие как алемтузумаб (хронический лимфоцитарный лейкоз), бевацизумаб (колоректальный рак), цетуксимаб (колоректальный рак, рак головы и шеи), деносумаб (метастазы солидных опухолей в костях), гемтузумаб (острый миелобластный лейкоз), ипилимумаб (меланома), офатумумаб (хронический лимфоцитарный лейкоз), панитумумаб (колоректальный рак), ритуксимаб (неходжкинская лимфома), тозитумомаб (неходжкинская лимфома) и трастузумаб (рак молочной железы). Другие антитела включают, например, абаговомаб (рак яичников), адекатумумаб (рак простаты и рак молочной железы), афутузумаб (лимфома), аматуксимаб, аполизумаб (гематологический рак), блинатумомаб, циксутумумаб (солидные опухоли), дацетузумаб (гематологический рак), элотузумаб (множественная миелома), фарлетузумаб (рак яичников), интетумумаб (солидные опухоли), Матузумаб (колоректальный рак, рак легких и рак желудка), онартузумаб, парсатузумаб, притумумаб (рак головного мозга), тремелимумаб, ублитуксимаб, велтузумаб (неходжкинская лимфома), вотумумаб (колоректальные опухоли), затуксимаб и антитела против плацентарного фактора роста, такие как описано в WO 2006/099698. Примеры таких видов комбинированной терапии включают, например, CHOP-R (CHOP (см. выше)+ ритуксимаб), ICE-R (ICE (см. выше) + ритуксимаб), R-FCM (ритуксимаб, флударабин, циклофосфамид, митоксантрон) и ТСН (Паклитаксел (Таксол), карбоплатин, трастузумаб).
Примеры алкилирующих противоопухолевых агентов включают азотсодержащие мустанды (например, мехлорэтамин, циклофосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, ифосфамид и бусульфан), нитрозомочевины (например №нитрозо-Н-метилмочевина (MNU), кармустин (BCNU), ломустин (CCNU), семустин (MeCCNU), фотемустин и стрептозотоцин), тетразины (например, дакарбазин, митозоломид и темозоломид), азиридины (например тиотепа, митомицин и диазиквон (AZQ)), цисплатины и производные (например, цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин) и неклассические алкилирующие агенты (например, прокарбазин и гексаметилмеламин).
Подтипы антиметаболитов включают антифолаты (например, метотрексат и пеметрексед), фторпиримидины (например, фторурацил, капецитабин и тегафур/урацил), аналоги дезоксинуклеозидов (например, цитарабин, гемцитабин, децитабин, Видаза, флударабин, неларабин, кладрибин, клофарабин и пентостатин) и тиопурины (например, тиогуанин и меркаптопурин).
Агенты против микротрубочек включают подтипы алкалоидов барвинка (например, винкристин, винбластин, винорелбин, виндезин и винфлунин) и подтипы таксана (например, паклитаксел и доцетаксел). Другие агенты против микротрубочек включают подофиллотоксин.
Ингибиторы топоизомеразы включают ингибиторы топоизомеразы I (например, иринотекан, топотекан и камптотецин) и ингибиторы топоизомеразы II (например, этопозид, доксорубицин, митоксантрон, тенипозид, новобиоцин, мербарон и акларубицин).
Цитотоксические антибиотики включают антрациклины (доксорубицин, даунорубицин, эпирубицин, идарубицин, пирарубицин, акларубицин и митоксантрон) и другие лекарственные средства, включая актиномицин, блеомицин, пликамицин и митомицин.
Любое пролекарство против рака (или его соль) согласно настоящему изобретению может (либо отдельно, либо уже как часть лечения комбинацией химиотерапевтических агентов или как часть лечения с комбинацией способов терапии) быть дополнительно включено в терапию ферментативным пролекарством, нацеленным на антитело (ADEPT, англ.: antibody directed enzyme prodrug therapy), которая включает применение ассоциированных с раком моноклональных антител, которые связаны с ферментом, активирующим лекарственное средство. Последующее системное введение нетоксичного агента приводит к превращению его в токсичное лекарственное средство и в результате к цитотоксическому эффекту, который может быть направлен на злокачественные клетки (Bagshawe et al. (1995) Tumor Targeting 1, 17-29.)
Кроме того, любое пролекарство против рака (или его соль) согласно настоящему изобретению может (либо отдельно, либо уже как часть лечения комбинацией химиотерапевтических агентов или как часть лечения с комбинацией способов терапии) быть комбинировано с одним или более агентом(ами), способным(и) обращать устойчивость (мульти)лекарственного средства ((M)DR обратителем(ями) или (M)DR обращающим(и) агентом(ами)), которая может возникнуть во время химиотерапии. Такие агенты включают, например, лоперамид (Zhou et al. 2011, Cancer Invest 30, 119-125). Другая такая комбинация включает помещение пролекарства в наночастицы, такие как наночастицы оксида железа (Kievit et al. 2011, J Control Release 152, 76-83) или липосомы. Примеры лекарственных средств, помещенных в липосомы, включают доксорубицин (липосомы с доксорубицин HCl, также известные под торговыми наименованиями Доксил (Doxil), Каеликс (Caelyx) или Миоцет (Myocet)), даунорубицин (известный под торговым наименованием ДауноКсом (DaunoXome)) и паклитаксел (Garcion et al. 2006, Mol Cancer Ther 5, 1710-1722).
Пролекарство или его соль согласно настоящему изобретению, или композиция, содержащая такое пролекарство или соль, таким образом, могут быть применены для лечения заболевания (например, рака), в виде монотерапии или как часть лечения с применением комбинации химиотерапевтических агентов или лечения с комбинацией способов химиотерапии. Любое из таких видов лечения может дополнительно быть комбинировано с лечением, включающим агент, обращающий устойчивость к лекарственным средствам.
Настоящее изобретение также относится к способам получения пролекарств согласно настоящему
- 12 034046 изобретению, где указанные способы включают стадии:
(i) получения лекарственного средства;
(ii) связывания лекарственного средства с фосфоноацетил-кэпированным олигопептидным фрагментом с получением пролекарства; или, в качестве альтернативы, (ii') связывания лекарственного средства с олигопептидным фрагментом с последующим связыванием фосфоноацетильной кэпирующей группы с олигопептидным фрагментом с получением пролекарства; и (iii) очистки пролекарства, полученного на стадии (ii) или (ii').
Как описано выше, указанное связывание олигопептидного фрагмента с лекарственным средством и/или кэпирующей группой может быть непосредственным или опосредованным, осуществляемым посредством линкера или спейсерной группы, такой как самоуничтожающийся или самоустраняющийся спейсер. Стратегия очистки пролекарства, очевидно, будет зависеть от природы лекарственного средства и/или кэпирующей группы. Специалист сможет разработать подходящую стратегию очистки для любого возможного пролекарства согласно настоящему изобретению, выбирая из множества доступных способов очистки.
Не ограничиваясь какой-либо теорией или объяснением, картина, вырисовывающаяся исходя из примеров, описанных в настоящем документе, такова, что для конкретного пролекарства согласно настоящему изобретению, содержащего пептид ALGP (SEQ ID NO:1) в качестве OP-фрагмента и доксорубицин в качестве лекарственного средства D, активацию пролекарства осуществляют в несколько стадий. Поскольку такое пролекарство стабильно в крови и плазме, при инкубировании в присутствии опухолевых клеток LS-174T оно превращается в смесь доксорубицина (Dox), GP-Dox и LGP-Dox. Последний процесс может быть на первой стадии имитирован in vitro посредством протеаз, таких как CD10 (с получением LGP-Dox, который может быть превращен в GP-Dox посредством обычных лейцинаминопептидаз) и ТОР (с получением GP-Dox). Первая фаза активации ALGP-доксорубицина управляется посредством предпочтительной активности CD10 и ТОР вблизи опухолей по сравнению с их меньшим избытком в непатологических внеклеточных компартментах и тканях. Вторая стадия, превращение GP-Dox в Dox, может управляться дипептидилпролилпептидазами. Два представителя этого класса представляют интерес в области лечения рака: DPIV, также известная как CD26, и FAP, или белок активации фибробластов. Известно, что все эти протеазы ассоциированы с опухолевыми клетками или опухолевыми стромальными клетками, как описано далее. Такая многостадийная активация пролекарства согласно настоящему изобретению увеличивает специфичности и уменьшает нежелательные побочные эффекты (такие как лейкопения и токсичность для сердца) по сравнению с действием аналогичных пролекарств, активируемых в одну стадию. Примером последних является сукцинил-βALAL-доксорубицин, который легко превращается посредством, например, CD10, в L-Dox, который может входить в клетку самостоятельно (Pan et al. 2003, Cancer Res 63, 5526-5531). Подход с множеством стадий активации позволил получить пролекарство PhAc-ALGP-доксорубицин, которое примерно от 20 до 40 раз менее токсично, чем доксорубицин в зависимости от способа (в.в. или в.б.) введения и от 6 до 14 раз менее токсично, чем сукцинил-β-ALALдоксорубицин. PhAc-ALGP-доксорубицин лишен хронической кумулятивной кардиотоксичности и не вызывает лейкопению и лимфопению.
Он более активен, чем доксорубицин, в отношении ксенотрансплантатов опухолей человека (включая саркому) в отношении ортопической карциномы толстой кишки. Пролекарства согласно настоящему изобретению, таким образом, дополнительно характеризуются тем, что они подлежат активации, in vitro или in vivo, по меньшей мере в две стадии, то есть в процессе, включающем по меньшей мере два существенных протеолитических расщепления посредством по меньшей мере двух различных протеаз. Существенное протеолитическое расщепление в настоящем документе означает расщепление, которое ассоциировано с опухолью или опухолеассоциированными клетками, такими как ее строма, то есть специфично возникающее в непосредственной близости к опухолевым или опухолеассоциированным клеткам. Эндопептидазы CD10 и ТОР CD10 представляет собой нейтральную эндопептидазу/цинк-зависимую поверхностную металлопептидазу, которая расщепляет небольшие пептиды с аминоконца гидрофобных аминокислот. Кроме присутствия в нормальных клетках, таких как B-клетки и клетки эпителия легкого, толстой кишки и почки, она присутствует во многих типах опухолей (Ravel et al. 2008, Clin Cancer Res 14, 1258-1265), таких как рак поджелудочной железы (Notohara et al. 2000, Am J Surg Pathol 24, 13611371), гепатоцеллюлярная карцинома (Karabork et al. 2010, Pathol Res Pract 206, 572-577), меланома (Velazquez et al. 2007, J Transl Med 5, 2), рак предстательной железы (Song et al. 2004, Prostate 58, 394-405), мелкоклеточные карциномы легких (Shipp et al. 1991, Proc Natl Acad Sci USA 88, 10662-10666), карцинома почки, саркома эндометрия и рабдомиосаркома (Chu et al. 2000, Am J Clin Pathol 113, 374-382). CD10 экспрессируется приблизительно в половине сарком мягких тканей (гистиоцитомах, фибросаркомах, рабдомиосаркомах, лейомиосаркомах, липосаркомах, злокачественных опухолях оболочек периферических нервов; Deniz et al. 2012, Pathol Res Pract 208, 281-285). Что даже более интересно и похоже на стромальное распределение FAP, CD10 обнаружена в стромальных клетках колоректальных карцином (Hirano et al. 2012, Pathol Int 62,600-611), рака молочной железы (Desmedt et al. 2012, Clin Cancer Res 18,
- 13 034046
1004-1014; Marketsov et al. 20, 84-89), эндокринных опухолей поджелудочной железы (Deschamps et al.
2006, Hum Path 37, 802-808), карциномы желудка (Huang et al. 2005, Jpn J Clin Oncol 35, 245-250) и базальноклеточной карциномы (Yada et al. 2004, Am J Dermatopathol 26, 463-473).
TOP (тимет-олигопептидаза) представляет собой тиолзависимую основную цитоплазматическую металлоэндопротеазу, распространенную во многих типах тканей и клеток. Она может достигать местоположения за пределами клетки, как благодаря секреции данного растворимого фермента, так и путем присоединения к плазматической мембране. Он распространена во многих типах тканей и клеток. ТОР участвует в нейроэндокринной сигнализации и во внеклеточном метаболизме нейропептидов (Corie et al. 2002, Endocrine Rev 23, 647-664). Она участвует в метаболизме протеасом (Saric et al. 2004, J Biol Chem 45, 46723-46732). TOP участвует в обработке нейропептидов в простате и при раке предстательной железы (Swanson et al. 2004, Protein Pept Lett 5, 471-478) и обнаружена в средах, кондиционируемых опухолевыми клетками. Она также может высвобождаться из поврежденных или некрозированных клеток. Ее активность уменьшается в средах к кислородом и увеличивается в бескислородных средах, которые очень часто характерны для солидных опухолей. ТОР экспрессируется на поверхности эндотелиальных клеток и играет роль в метаболизме вазоактивных пептидов (Norman et al. 2003, Am J Physiol Heart Circ Physiol 284, H1978-1984; Shivakumar et al. 2005, Cell Biochem Funct 23, 195-204). Top обнаруживается посредством иммунного окрашивания в 113 из 147 саркомах молочной железы как в опухолевых, так и в стромальных клетках. Она экспрессирована как в карциноме, так и в стромальных клетках в 88 биопсиях из 98 (Ravel et al. 2008, Clin Cancer Res 14, 1258-1265). TOP отвечает за внеклеточную активацию сукцинил-β-ALAL-доксорубицина и PhAc-ALGP-доксорубицина (Dubois et al. 2006, Eur J Cancer 17, 30493056). Дипептидилпролилпептидазы DPIV (CD26) и FAP DPIV представляет собой дипептидилпролилпептидазу, обладающую широким спектром активности, и охватывает большое число физиологических субстратов. Она экспрессируется в эпителиальных клетках большого числа органов. Она экспрессируется в тимусе, селезенке и лимфатических узлах, а также в лимфоцитах. DPIV связывается с коллагеном и фибронектином в экспериментальных условиях (Loster et al. 1995, Biochem Biophys Res Commun 217, 341). Она повышающее регулируется в опухолевых Т-клеточных злокачественных новообразованиях (Dang et al. 2002, Histol Histopathol 17, 1213-1226) и в различных аденокарциномах, таких как гепатоцеллюлярная карцинома (Stecca et al. 1997, J Hepatol 27, 997-945), карцинома щитовидной железы (Tanaka et al. 1995, Int J Cancer 64, 326-331), в менингиомах (Yu et al. 2010, FEBS Journal 277, 1126-1144; Stremenoova et al. 2010, Int J Oncology 36, 351-358), в аденокарциномах пищевода (Goscinski et al. 2008, APMIS 116, 823-831), в аденокарциномах легких (Asada et al. 1993, Histopathology 23, 265-270) и в опухолях костей и мягких тканей (Dohi et al. 2009,Histopathology 4, 432-440). DPIV экспрессируется в раковых стволовых клетках колоректального рака человека и мезомелиомах человека (Pang et al. 2010, Cell Stem Cell 6, 603-615; Yamazaki et al. 2012, Biochem Biophys Res Commun 419, 529-536).
FAP представляет собой дипептидилэкзопептидазу с очень узкой специфичностью, ограниченной дипептидами глицин-пролин, аланин-пролин и лизин-пролин и также коллагеназой типа I. Тем не менее, она может функционировать как эндопептидаза (Siew lai et al. 2007, Bioconj Chem 18, 1245-1250). FAP отсутствует в нормальных тканях взрослых, таких как эпителиальные, мезенхимальные; нервных и лимфоидных клетках, таких как лимфоциты. Она отсутствует в незлокачественных опухолях. Что более важно, она повышающее регулируется не в самих опухолевых клетках, а в реактивных фибробластных, стромальных и ангиогенных клетках, присутствующих в эпителиальных опухолях или опухолях типа саркомы за исключением саркомы Юинга (Yu et al. 2010, FEBS Journal 277, 1126-1144; Brennen et al. 2012, Mol Cancer Ther 11, 257-269). Она играет важную роль в раке толстой кишки (Leonard et al. 2007, Clin Cancer Res 13, 1736-1741), меланоме (Fazakas et al. 2011, PLoS one 6, e20758; Artym et al. 2002, Carcinogenesis 23, 1593-1601), раке поджелудочной железы (Hyung-Ok et al. 2011, BMC Cancer 11, 245; Min et al. 2012, World J Gastroenterol 28, 840-846), раке желудочно-кишечного тракта (Zhi et al. 2010, J Exp Clin Cancer Res 29, 66; Mori et al. 2004, Oncology 67, 411-419), немелкоклеточном раке легкого (Bremnes et al. 2011, J Thorac Oncol 1, 209-217), глиоме (Menlein 2011, Biol Chem 392, 199-207), видах рака кожи (Huber et al. 2006, J Cut Pathol 2, 145-155), карциноме шейки матки (Jin et al. 2003, Anticancer Res 4, 1950198), карциноме щитовидной железы (Nocolini et al. 2011, Biochem Pharmacol 7, 778-780), карциноме прямой кишки (Saaigusa et al. 2011, Int J Oncol 3, 655-663), карциноме пищевода (Goscinski et al. 2008, Ultrastruct Pathol 3, 89-96), в раке молочной железы (Huang et al. 2011, Clin Exp Metatstasis 6, 567-579), и в опухолях кости и мягких тканей (Dohi et al. 2009, Histopathology 4, 432-440). Реактивные стромальные клетки опухолевых клеток важны для роста опухолевых клеток, а также для обеспечения их инвазивных и ангиогенных способностей (Santos et al. 2009, J Clin Invest 119, 3613-3625; Cheng et al. 2002, Cancer Res 62, 4767-4772; Huang et al. 2004, Cancer Res 64, 2712-2716).
На основании представленных примеров (см., например, пример 16), может быть предусмотрено несколько способов скрининга пролекарств-кандидатов согласно настоящему изобретению. Такие способы включают способы скрининга пролекарств-кандидатов, имеющих следующую структуру:
[Cx-OP]y-D, где C представляет собой кэпирующую группу;
OP представляет собой пептид, минимальная длина которого составляет 4 последовательных ами- 14 034046 нокислоты (тетрапептид), а максимальная длина составляет 8 аминокислот (то есть пептид, имеющий длину 4, 5, 6, 7 или 8 последовательных аминокислот), который содержит на карбоксиконце пролин, включая дипептид, выбранный из группы, состоящей из глицина-пролина (GP), аланина-пролина (AP), и лизина-пролина (KP);
D представляет собой лекарственное средство;
х представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у = 1;
у представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у больше 1, то по меньшей мере 1 OP содержит котирующую группу; и причем связь между С и OP и связь между OP и D являются непосредственной или осуществляются посредством линкера или спейсерной группы, такой как самоуничтожающаяся или самоустраняющаяся спейсерная группа, и при этом если у больше 1, множество фрагментов OP индивидуально связаны друг с другом непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы и/или индивидуально связаны с D непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы; и где указанный способ скрининга включает стадии: (i) получения лекарственного средства D;
(ii) конъюгирования указанного лекарственного средства D с дипептидом GP, АР или KP с получением GP-D, AP-D или KP-D в качестве промежуточного пролекарства дипептид-лекарственное средство;
(iii) приведения каждого из лекарственного средства D и указанного промежуточного пролекарства дипептид-лекарственное средство GP-D, AP-D или KP-D независимо в контакт с культивируемыми in vitro клетками;
(iv) определения цитотоксичности лекарственного средства D и промежуточного пролекарства дипептид-лекарственное средство GP-D, AP-D или KP-D;
(v) идентификации по данным (iv) промежуточного пролекарства дипептид-лекарственное средство GP-D, AP-D или KP-D с цитотоксической активностью, сопоставимой с цитотоксической активностью лекарственного средства D; и (vi) выбора [Cx-OP]y-D, соответствующего промежуточному пролекарству дипептид-лекарственное средство GP-D, AP-D или KP-D, идентифицированному на стадии (v), в качестве пролекарствакандидата.
В вышеуказанном способе термин соответствующего следует понимать таким образом, что выбранное пролекарство-кандидат [Cx-OP]y-D содержит то же лекарственное средство D, которое присутствует в промежуточном пролекарстве дипептид-лекарственное средство GP-D, AP-D или KP-D, которое, как установлено, имеет цитотоксическую активность, сопоставимую с цитотоксической активностью лекарственного средства D. Необязательно, лекарственное средство D соединено с олигопептидным фрагментом OP таким же образом, как оно соединено с дипептидом GP, АР или КР в промежуточном пролекарстве дипептид-лекарственное средство GP-D, AP-D или KP-D. Другими словами, положительный результат стадии (v) по идентификации промежуточного пролекарства дипептид-лекарственное средство GP-D, AP-D или KP-D является показательным или позволяет предсказать положительный результат в отношении пролекарства-кандидата [Cx-OP]y-D, где OP представляет собой пептид, минимальная длина которого составляет 4 последовательных аминокислоты (тетрапептид), а максимальная длина составляет 8 аминокислот (то есть пептид, имеющий длину 4, 5, 6, 7 или 8 последовательных аминокислот), и который содержит на карбоксиконце пролин, включая дипептид, выбранный из группы, состоящей из глицина-пролина (GP), аланина-пролина (AP) и лизина-пролина (KP). Такая экстраполяция является оправденной ввиду большого количества результатов, описанных в настоящем документе, полученных для доксорубицина в качестве пролекарства D. Если промежуточное пролекарство дипептидлекарственное средство GP-D, AP-D или KP-D имеет цитотоксическую активность, сопоставимую с цитотоксической активностью лекарственного средства D, это является хорошим признаком успешной активации такого пролекарства с получением свободного лекарственного средства D культивируемыми клетками. Культивируемые клетки, используемые при данном типе скрининга, могут представлять собой, например, культивируемую линию опухолевых клеток.
В частном варианте реализации настоящего изобретения пептид OP в вышеуказанной общей структуре представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO:1), ALAP (SEQ ID NO:3), TSGP (SEQ ID NO:4), TSAP (SEQ ID NO:5), KLGP (SEQ ID NO:6), KLAP (SEQ ID NO:7), ALKP (SEQ ID NO:8), TSKP (SEQ ID NO:9) или KLKP (SEQ ID NO:10). Таким образом, в указанном варианте реализации настоящего изобретения предложены способы скрининга пролекарств-кандидатов, имеющих общую структуру:
[Cx-OP]y-D, где C представляет собой кэпирующую группу;
OP представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO:1), ALAP (SEQ ID NO:3), TSGP (SEQ ID NO:4), TSAP (SEQ ID NO:5), KLGP (SEQ ID NO:6), KLAP (SEQ ID NO:7), ALKP (SEQ ID NO:8), TSKP (SEQ ID NO:9) или KLKP (SEQ ID NO: 10); в частности, OP представляет собой тетрапептид ALGP (SEQ ID NO: 1); D представляет собой лекарственное средство;
х представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у = 1;
у представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у больше 1, то по мень- 15 034046 шей мере 1 OP содержит копирующую группу; и причем связь между C и OP и связь между OP и D являются непосредственными или осуществляются посредством линкера или спейсерной группы, такой как самоуничтожающаяся или самоустраняющаяся спейсерная группа, и при этом если у больше 1, множество фрагментов OP индивидуально связаны друг с другом непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы и/или индивидуально связаны с D непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы; и где указанный способ скрининга включает стадии:
(i) получения лекарственного средства D;
(ii) конъюгирования указанного лекарственного средства D с дипептидом GP, AP или KP с получением GP-D, AP-D или KP-D в качестве промежуточного пролекарства дипептид-лекарственное средство;
(iii) приведения каждого из лекарственного средства D и указанного промежуточного пролекарства дипептид-лекарственное средство GP-D, AP-D или KP-D независимо в контакт с культивируемыми in vitro клетками;
(iv) определения цитотоксичности лекарственного средства D и промежуточного пролекарства дипептид-лекарственное средство GP-D, AP-D или KP-D;
(v) идентификации по данным (iv) промежуточного пролекарства дипептид-лекарственное средство GP-D, AP-D или KP-D с цитотоксической активностью, сопоставимой с цитотоксической активностью лекарственного средства D; и (vi) выбора [Cx-OP]y-D, соответствующего промежуточному пролекарству дипептид-лекарственное средство GP-D, AP-D или KP-D, идентифицированному на стадии (v), в качестве пролекарствакандидата.
В качестве альтернативы, указанные способы представляют собой способы скрининга пролекарствкандидатов, имеющих общую структуру:
[Cx-OP]y-D, где C представляет собой кэпирующую группу;
OP представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO:1), ALAP (SEQ ID NO:3), TSGP (SEQ ID NO:4), TSAP (SEQ ID NO:5), KLGP (SEQ ID NO:6), KLAP (SEQ ID NO:7), ALKP (SEQ ID NO:8), TSKP (SEQ ID NO:9) или KLKP (SEQ ID NO: 10); в частности, OP представляет собой тетрапептид ALGP (SEQ ID NO: 1); D представляет собой лекарственное средство;
х представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у = 1;
у представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у больше 1, то по меньшей мере 1 OP содержит кэпирующую группу; и причем связь между C и OP и связь между OP и D являются непосредственными или осуществляются посредством линкера или спейсерной группы, такой как самоуничтожающийся или самоустраняющийся спейсер, и при этом если у больше 1, множество фрагментов OP индивидуально связаны друг с другом непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы и/или индивидуально связаны с D непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы; где указанный способ включает стадии:
(i) получения лекарственного средства D;
(ii) конъюгирования указанного лекарственного средства D с [Cx-OP]y с получением пролекарства [Cx-OP]y-D; (iii) приведения каждого из лекарственного средства D и пролекарства [Cx-OP]y-D независимо в контакт с культивируемыми in vitro клетками;
(iv) определения цитотоксичности лекарственного средства D и пролекарства [Cx-OP]y-D; (v) идентификации по данным (iv) пролекарства [Cx-OP]y-D с цитотоксической активностью, сопоставимой с цитотоксической активностью лекарственного средства D; и (vi) выбора [Cx-OP]y-D, идентифицированного на стадии (v), в качестве пролекарства-кандидата.
В вышеуказанных способах скрининга термин сопоставимая цитотоксическая активность следует понимать таким образом, что пролекарство после контакта с культивируемыми in vitro клетками (такими как культивируемые опухолевые клетки), проявляет по меньшей мере 50% или по меньшей мере от 50 до 99% (например, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 99%) цитотоксической активности, проявляемой свободным лекарственным средством, приведенным в контакт с теми же культивируемыми in vitro клетками в тех же условиях.
Согласно другой альтернативе указанные способы представляют собой способы скрининга пролекарств-кандидатов, имеющих общую структуру:
[Cx-OP]y-D, где C представляет собой кэпирующую группу;
OP представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO:1), ALAP (SEQ ID NO:3), TSGP (SEQ ID NO:4), TSAP (SEQ ID NO:5), KLGP (SEQ ID NO:6), KLAP (SEQ ID NO:7), ALKP (SEQ ID NO:8), TSKP (SEQ ID NO:9) или KLKP (SEQ ID NO: 10); в частности, OP представляет собой тетрапептид ALGP (SEQ ID NO: 1);
- 16 034046
D представляет собой лекарственное средство;
х представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у =1;
у представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у больше 1, то по меньшей мере 1 OP содержит копирующую группу; и причем связь между C и OP и связь между OP и D являются непосредственными или осуществляются посредством линкера или спейсерной группы, такой как самоуничтожающийся или самоустраняющийся спейсер, и при этом если у больше 1, множество фрагментов OP индивидуально связаны друг с другом непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы и/или индивидуально связаны с D непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы; где указанный способ включает стадии: (i) получения лекарственного средства D;
(ii) конъюгирования указанного лекарственного средства D с [СХ-ОР]У с получением пролекарства [Cx-OP]y-D;
(iii) приведения пролекарства [Cx-OP]y-D в контакт с культивируемыми in vitro клетками в течение 5 ч при 37°С;
(iv) определения конверсии пролекарства [Cx-OP]y-D в свободное лекарственное средство D;
(v) идентификации по данным (iv) пролекарства [Cx-OP]y-D, которое по меньшей мере на 50% превратилось в D; и (vi) выбора [Cx-OP]y-D, идентифицированного на стадии (v), в качестве пролекарства-кандидата.
Согласно другой альтернативе указанные способы представляют собой способы скрининга пролекарств-кандидатов, имеющих общую структуру:
[Cx-OP]y-D, где C представляет собой кэпирующую группу;
OP представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO:1), ALAP (SEQ ID NO:3), TSGP (SEQ ID NO:4), TSAP (SEQ ID NO:5), KLGP (SEQ ID NO:6), KLAP (SEQ ID NO:7), ALKP (SEQ ID NO:8), TSKP (SEQ ID NO:9) или KLKP (SEQ ID NO: 10); в частности, OP представляет собой тетрапептид ALGP (SEQ ID NO: 1);
D представляет собой лекарственное средство;
х представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у =1;
у представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у больше 1, то по меньшей мере 1 OP содержит кэпирующую группу; и причем связь между С и OP и связь между OP и D являются непосредственными или осуществляются посредством линкера или спейсерной группы, такой как самоуничтожающийся или самоустраняющийся спейсер, и при этом если у больше 1, множество фрагментов OP индивидуально связаны друг с другом непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы и/или индивидуально связаны с D непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы; где указанный способ включает стадии:
(i) получения лекарственного средства D;
(ii) конъюгирования указанного лекарственного средства D с дипептидом GP, АР или KP с получением промежуточного пролекарства GP-D, AP-D или KP-D дипептид-лекарственное средство;
(iii) приведение указанного промежуточного пролекарства дипептид-лекарственное средство GP-D в течение 3 ч при 37°С в контакт с выделенными пептидазами FAP и/или DPIV;
(iv) определение степени превращения промежуточного пролекарства дипептид-лекарственное средство GP-D, AP-D или KP-D в свободное лекарственное средство D;
(v) идентификации по данным (iv) промежуточного пролекарства дипептид-лекарственное средство GP-D, AP-D или KP-D, которое по меньшей мере на 50% превратилось в D; и (vi) выбора [Cx-OP]y-D, соответствующего промежуточному пролекарству дипептид-лекарственное средство GP-D, AP-D или KP-D, идентифицированному на стадии (v), в качестве пролекарствакандидата.
В вышеуказанном способе термин соответствующего следует понимать таким образом, что выбранное пролекарство-кандидат [Cx-OP]y-D содержит то же лекарственно средство D, которое присутствует в пролекарстве GP-D, которое, как установлено, превращается по меньшей мере на 50% в D в определенных условиях. Необязательно, лекарственное средство D связано с олигопептидным фрагментом ОР таким же образом, как оно соединено с дипептидом GP в пролекарстве GP-D. Другими словами, положительный результат стадии (v) по идентификации пролекарства GP-D является показательным или позволяет предсказать положительный результат в отношении пролекарства-кандидата [Cx-OP]y-D, где OP представляет собой пептид ALGP. Такая экстраполяция является оправденной ввиду большого количества результатов, описанных в настоящем документе, полученных для доксорубицина в качестве пролекарства D.
Также способы, предусмотренные настоящим изобретением, включают способы скрининга пролекарств-кандидатов, имеющих общую структуру:
[Cx-OP]y-D,
- 17 034046 где C представляет собой копирующую группу;
OP представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO:1), ALAP (SEQ ID NO:3), TSGP (SEQ ID NO:4), TSAP (SEQ ID NO:5), KLGP (SEQ ID NO:6), KLAP (SEQ ID NO:7),
ALKP (SEQ ID NO:8), TSKP (SEQ ID NO:9) или KLKP (SEQ ID NO:10); в частности, OP представляет собой тетрапептид ALGP (SEQ ID NO: 1); D представляет собой лекарственное средство;
х представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у = 1;
у представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у больше 1, то по меньшей мере 1 OP содержит копирующую группу; и причем связь между С и OP и связь между OP и D являются непосредственными или осуществляются посредством линкера или спейсерной группы, такой как самоуничтожающийся или самоустраняемый спейсер, и при этом если у больше 1, множество фрагментов OP индивидуально связаны друг с другом непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы и/или индивидуально связаны с D непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы; где указанный способ включает стадии:
(i) получения лекарственного средства D;
(ii) конъюгирования указанного лекарственного средства D с [Cx-OP]y с получением пролекарства [Cx-OP]y-D; (iii) приведения пролекарства [Cx-OP]y-D в течение 3-24 ч при 37°С в контакт с выделенными пептидазами CD10 и/или ТОР и с выделенными пептидазами FAP и/или
DPIV;
(iv) определения конверсии пролекарства |C,-OP|y-D в свободное лекарственное средство D; (v) идентификации по данным (iv) пролекарства [Cx-OP]y-D, которое по меньшей мере на 50% превратилось в D; и (vi) выбора [Cx-OP]y-D, идентифицированного на стадии (v), в качестве пролекарства-кандидата.
В любом из вышеуказанных способов скрининга, относящихся к превращению пролекарства GP-D или пролекарства [Cx-OP]y-D в лекарственное средство D, процент превращения, используемый для выбора пролекарства-кандидата в общем составляет от по меньшей мере 50 до 100% (например, по меньшей мере 50%, например, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 99%).
В любом из вышеуказанных альтернативных способах скрининга указанная кэпирующая группа С может представлять собой фосфоноацетильную группу. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения OP в любом из вышеуказанных способов скрининга представляет собой пептид, минимальная длина которого составляет 4 последовательных аминокислоты (тетрапептид), а максимальная длина составляет 8 аминокислот (то есть пептид, имеющий длину 4, 5, 6, 7 или 8 последовательных аминокислот), и который содержит на карбоксиконце пролин, включая дипептид, выбранный из группы, состоящей из глицина-пролина (GP), аланина-пролина (AP) и лизина-пролина (KP); в более частном варианте тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO:1), ALAP (SEQ ID NO:3), TSGP (SEQ ID NO:4), TSAP (SEQ ID NO:5), KLGP (SEQ ID NO:6), KLAP (SEQ ID NO:7), ALKP (SEQ ID NO:8), TSKP (SEQ ID NO:9) или KLKP (SEQ ID NO:10); в еще более частном варианте OP представляет собой тетрапептид ALGP (SEQ ID NO: 1).
В любом из указанных выше альтернативных способов скрининга указанное лекарственное средство D может быть выбрано из группы, состоящей из доксорубицина, майтансина, гелданамицина, паклитаксела, доцетаксела, камптотецина, винбластина, винкристина, виндезина, метотрексата, аминоптерина, амрубицина или производного любого из них.
Настоящее изобретение также относится к наборам, содержащим емкость, содержащую пролекарство или его соль согласно настоящему изобретению или содержащий композицию, содержащую такое пролекарство или его соль. Такой набор может дополнительно содержать, в той же емкости (содержащей пролекарство или его соль согласно настоящему изобретению) или в одной или более отдельных емкостей, одно или более дополнительных лекарственных средств против рака, таких как антитела или их фрагменты (например, как описано выше). В качестве альтернативы, или в дополнение, такой набор может дополнительно содержать, в той же емкости (содержащей пролекарство или его соль согласно настоящему изобретению) или в одной или более отдельных емкостей, один или более агентов, обращающих устойчивость к лекарственным средствам. Другие необязательные компоненты такого набора включают один или более диагностических агентов, способных определять успешность терапии, включающей пролекарство или его соль согласно настоящему изобретению; инструкции по применению; одну или более емкостей со стерильными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или разбавителями; одну или более емкостей с агентами для ADEPT-терапии и т. д.
Содержание всех ссылок, приведенных выше и далее, полностью включено посредством ссылки.
Примеры
Пример 1. Синтез N-кэпированных пептидных пролекарственных соединений 1. Синтез Fmocпептид-ОН.
1.1. Синтез Fmoc-ALAL-OH.
- 18 034046
Обеспечивали набухание смолы Fmoc-Leu-Wang (5 г, 1 экв.) в диметилформамиде (20 мл) в течение 30 мин. Удаляли флуоренилметилоксикарбонильную (Fmoc) группу путем обработки пиперидином (4 мл) в диметилформамиде (16 мл) в течение 3 мин, затем смолу фильтровали, после этого проводили такую же обработку в течение 3 и 7 мин. Смолу трижды промывали диметилформамидом (20 мл). FmocAla-OH (2 экв.) и 2-(6-хлор-1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат (2 экв.) солюбилизировали в диметилформамиде (20 мл), и добавляли N.N-диизопропилэтиламин (4 экв.). Полученную смесь предварительно активировали в течение 6 мин и добавляли к смоле. Далее смолу встряхивали в течение 60 мин и трижды промывали диметилформамидом (20 мл). Группу Fmoc удаляли путем обработки пиперидином (4 мл) в диметилформамиде (16 мл) в течение 3 мин, затем смолу фильтровали. Такую обработку повторяли дважды в течение 3 и 7 мин. Смолы трижды промывали диметилформамидом (20 мл). Этот же протокол повторяли для Fmoc-лейцин-ОН (2 экв.) и Fmoc-аланин-ОН (2экв.).
После последнего присоединения смолу трижды промывали поочередно диметилформамидом (20 мл) и дихлорметаном (20 мл) и сушили. Полученный Fmoc-пептид отщепляли от смолы посредством раствора трифторуксусной кислоты/триизопропилсилан/вода (95:2,5:2,5 об./об./об.) (20 мл) в течение 2 часов. Растворитель упаривали. Полученный продукт осаждали в воде и фильтровали. Полученный Fmoc-пептид сушили посредством лиофилизации. MS (ES+): 609.3 [МН]+; чистота: 90% (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
1.2. Синтез Fmoc-ALG-OH.
Получение проводили согласно описанию, приведенному в разделе 1.1, начиная со смолы FmocGly-Wang вместо смолы Fmoc-Leu-Wang и с добавлением Fmoc-Leu и Fmoc-Ala. МС (ЭР+): 482,2 [МН]+; чистота: 92 % (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
1.3. Синтез Fmoc-ALPF-OH.
Получение проводили согласно описанию, приведенному в разделе 1.1, начиная со смолы FmocPhe-Wang вместо смолы Fmoc-Leu-Wang и с добавлением Fmoc-Pro, Fmoc-Leu и Fmoc-Ala. МС (ЭР+): 669 [МН]+; чистота: 98 % (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
1.4. Синтез Fmoc-ALAF-OH.
Получение проводили согласно описанию, приведенному в разделе 1.3, начиная со смолы FmocPhe-Wang и с добавлением Fmoc-Ala; Fmoc-Leu и Fmoc-Ala. МС (ЭР+): 643 [МН]+; чистота: 90% (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
1.5. Синтез Fmoc-AIG-OH.
Получение проводили согласно описанию, приведенному в разделе 1.1, начиная со смолы FmocGly-Wang вместо смолы Fmoc-Leu-Wang и с добавлением Fmoc-Ile и Fmoc-Ala. МС (ЭР+): 482,5 [МН]+; чистота: 60 % (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
1.6. Синтез Fmoc-KLG-OH.
Получение проводили согласно описанию, приведенному в разделе 1.1, начиная со смолы FmocGly-Wang вместо смолы Fmoc-Leu-Wang и с добавлением Fmoc-Leu и Fmoc-Lys (IvDde). МС (ЭР+): 744 [МН]+.
1.7. Синтез Fmoc-GPG-OH.
Получение проводили согласно описанию, приведенному в разделе 1.1, начиная со смолы FmocGly-Wang вместо смолы Fmoc-Leu-Wang и с добавлением Fmoc-Pro и Fmoc-Gly. МС (ЭР+): 452 [МН]+.
2.Синтез конъюгатов пептид-доксорубицин.
2.1. Синтез NH2-ALAL-доксорубицина.
Доксорубицин (1 экв.) солюбилизировали в диметилформамиде (10 мл). К полученному доксорубицину добавляли раствор Fmoc-ALAL-OH (1,2 экв.) в диметилформамиде (2 мл), и доводили рН до 8 посредством Ν,Ν-диизопропилэтиламина. Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре (КТ), и добавляли 2-(6-хлор-1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат (1.2 экв.) в диметилформамиде (2 мл). Проверяли рН раствора, и повторно доводили его до 8-8,5. Раствор перемешивали при комнатной температуре и контролировали посредством ВЭЖХ. Если реакция была завершена, группу Fmoc удаляли путем обработки пиперидином (10% конечного объема) в течение 5 мин при КТ, и добавляли 10%-й лактатный буфер с рН 3 при 0°С. Полученную смесь помещали на колонку YMC. Полученный продукт выделяли посредством МеОН, и растворитель упаривали. Полученный ALALдоксорубицин очищали посредством полупрепаративной ВЭЖХ (колонка Luna, C18). МС (ES+): 912 [МН]+; чистота: 95% (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
2.2. Синтез NH2-Pro-доксорубицина и NH2-Gly-Pro-доксорубицина.
Доксорубицин (1 экв.) солюбилизировали в диметилформамиде (10 мл). К полученному доксорубицину добавляли раствор Fmoc-Proline-OH (1,2 экв.) в диметилформамиде (2 мл), и доводили рН до 8-8,5 посредством Ν,Ν-диизопропилэтиламина. Полученный раствор перемешивали при КТ, и добавляли 2-(6хлор-1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат (1,2 экв.) в диметилформамиде (2 мл). Проверяли рН раствора, и повторно доводили его до 8-8,5. Раствор перемешивали при комнатной температуре и контролировали посредством ВЭЖХ. Если реакция была завершена, группу Fmoc удаляли путем обработки пиперидином (10% конечного объема) в течение 5 мин при КТ, и добавляли 10%-й лак- 19 034046 татный буфер с рН 3 при 0°С. Полученную смесь помещали на колонку YMC. Полученный продукт выделяли посредством МеОН, и растворитель упаривали. Полученный Pro-доксорубицин очищали посредством полупрепаративной ВЭЖХ (колонка Luna, C18). Этому же протоколу следовали для Fmoc-GlycineOH (1,2 экв.). P-Dox: МС (ЭР+): 641 [МН]+; чистота: 99% (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
GP-Dox: МС (ЭР+): 698 [МН]+; чистота: 99% (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
2.3. Синтез конъюгата NH2-ALGP-доксорубицин.
Pro-доксорубицин (1 экв.) солюбилизировали в диметилформамиде (10 мл). К полученному доксорубицину добавляли раствор Fmoc-ALG-OH (1,2 экв.) в диметилформамиде (2 мл), доводили рН до 8 посредством ^^диизопропилэтиламина. Раствор перемешивали при КТ, и добавляли 2-(6-хлор-Шбензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат (1,2 экв.) в диметилформамиде (2 мл). Проверяли рН раствора, и повторно доводили его до 8-8,5.
Раствор перемешивали при комнатной температуре и контролировали посредством ВЭЖХ. Если реакция была завершена, группу Fmoc удаляли путем обработки пиперидином (10% конечного объема) в течение 5 мин при КТ, и добавляли 10%-й лактатный буфер с рН 3 при 0°С. Полученную смесь помещали на колонку YMC. Полученный продукт выделяли посредством МеОН, и растворитель упаривали. ALGP-доксорубицин очищали посредством полупрепаративной ВЭЖХ (колонка Luna, C18). МС (ЭР+): 882 [МН]+; чистота: 99% (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
2.4. Синтез NH2-ALPF-доксорубицина.
Получение проводили согласно описанию, приведенному в разделе 2.1, с использованием FmocALPF-OH вместо Fmoc-ALAL-OH. МС (ЭР+): 971[МН]+; чистота: 97% (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
2.5. Синтез NH2-ALAF-доксорубицина.
Получение проводили согласно описанию, приведенному в разделе 2.1, с использованием FmocALAF-OH вместо Fmoc-ALAL-OH. МС (ЭР+): 947[МН]+ чистота: 96% (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
2.6. Синтез NH2-AIGP-доксорубицина.
Получение проводили согласно описанию, приведенному в разделе 2.1, с использованием FmocAIGP-OH вместо Fmoc-ALAL-OH.
2.7. Синтез NH2-GPGP-доксорубицина.
Получение проводили согласно описанию, приведенному в разделе 2.1, с использованием FmocGPGP-OH вместо Fmoc-ALAL-OH.
3. Синтез PhAc-пептид-доксорубицина.
3.1. Синтез PhAc-ALGP-доксорубицина
Соединение I
NH2-ALGP-Dox (1 экв.) солюбилизировали в диметилформамиде (10 мл). К полученному пептиддоксорубицину добавляли раствор фосфонуксусной кислоты (2.5 экв.) в диметилформамиде (2 мл), и доводили рН до 8 посредством ^^диизопропилэтиламина. Раствор перемешивали при КТ, и добавляли 2-(6-хлор-Ш-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат (2 экв.) в диметилформамиде (2 мл). Проверяли рН раствора, и повторно доводили его до 8-8,5. Раствор перемешивали при комнатной температуре и контролировали посредством ВЭЖХ. Если реакция была завершена, смесь осаждали диэтиловым эфиром и фильтровали. Полученный продукт выделяли посредством МеОН, и растворитель упаривали. PhAc-ALGP-доксорубицин очищали посредством полупрепаративной ВЭЖХ (колонка Luna, C18). МС (ЭР+): 1004.4 [МН]+; чистота: 99% (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
3.2. Синтез PhAc-ALAL-доксорубицина
- 20 034046
NH2-ALAL-Dox (1 экв.) солюбилизировали в диметилформамиде (10 мл). К указанному пептиддоксорубицину добавляли раствор фосфонуксусной кислоты (2.5 экв.) в диметилформамиде (2 мл), и доводили рН до 8 посредством МХ-диизонронилэтиламина. Раствор перемешивали при КТ, и добавляли 2-(6-хлор-1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат (2 экв.) в диметилформамиде (2 мл). Проверяли рН раствора, и повторно доводили его до 8-8,5. Раствор перемешивали при комнатной температуре и контролировали посредством ВЭЖХ. Если реакция была завершена, смесь осаждали диэтиловым эфиром и фильтровали. Продукт выделяли посредством МеОН, и упаривали растворитель.
PhAc-ALAL-доксорубицин очищали посредством полупрепаративной ВЭЖХ (колонка Luna, C18). МС (ЭР+): 1034 [МН]+; чистота: 99% (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
3.3. Синтез PhAc-ALPF-доксорубицина
Соединение III
Получение проводили согласно описанию, приведенному в разделе 3.2, с использованием NH2ALPF-Dox вместо NH2-ALAL-Dox. МС (ЭР+): 1094 [МН]+; чистота: 92% (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
3.4. Синтез PhAc-ALAF-доксорубицина
Соединение IV
Получение проводили согласно описанию, приведенному в разделе 3.2, с использованием NH2ALAF-Dox вместо NH2-ALAL-Dox. МС (ЭР+): 1068[МН]+; чистота: 97% (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
3.5. Синтез PhAc-DLGP-доксорубицина.
PhAc-D(Dmab)LGP-доксорубицин получали согласно описанию, приведенному в разделе 3.2, с использованием NH2- D(Dmab)LGP-Dox вместо NH2-ALAL-Dox. Защитную группу Dmab, также известную как 4-{№[1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбутил]амино}бензил, удаляли посредством 2%-го гидразина гидрата в течение 5 мин при комнатной температуре. Добавляли 10%-й лактатный буфер с рН 3 при 0°С, и полученную смесь помещали на колонку YMC. Полученный продукт выделяли посредством МеОН, и растворитель упаривали. Полученный PhAc-DLGP-доксорубицин очищали посредством полупрепаративной ВЭЖХ (колонка Luna, C18). МС (ЭР+): 1048,3 [МН]+; чистота: 99 % (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
3.6. Синтез PhAc-TSGP-доксорубицина.
PhAc-T(Dmab)SGP-доксорубицин получали согласно описанию, приведенному в разделе 3.2, с использованием NH2-T(Dmab)SGP-Dox вместо NH2-ALAL-Dox. Защитную группу Dmab удаляли 2%-го посредством гидразингидрата в течение 5 мин при комнатной температуре. Добавляли 10%-й лактатный буфер с рН 3 при 0°С, и полученную смесь помещали на колонку YMC. Полученный продукт выделяли посредством МеОН, и растворитель упаривали. Полученный PhAc-TSGP-доксорубицин очищали посредством полупрепаративной ВЭЖХ (колонка Luna, C18). МС (ЭР): 1008,3 [МН]+; чистота: 99 % (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
3.7. Синтез PhAc-AIGP-доксорубицин.
Получение проводили согласно описанию, приведенному в разделе 3.2, с использованием NH2AIGP-Dox вместо NH2-ALAL-Dox. МС (ЭР+): 1004,3[МН]+; чистота: 99% (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
3.8. Синтез PhAc-KLGP-доксорубицин.
PhAc-K(IvDde)LGP-доксорубицин получали согласно описанию, приведенному в разделе 3.2, с использованием NH2-K(IvDde)LGP-Dox вместо NH2-ALAL-Dox. Защитную группу IvDde удаляли посредством 2%-го гидразина гидрата в течение 5 мин при комнатной температуре. Добавляли 10%-й лактатный буфер с рН 3 при 0°С, и полученную смесь помещали на колонку YMC. Полученный продукт выделяли посредством МеОН, и растворитель упаривали. Полученный PhAc-KLGP-доксорубицин очищали
- 21 034046 посредством полупрепаративной ВЭЖХ (колонка Luna, C18). МС (ЭР+): 1061 [МН]+; чистота: 91,5% (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм).
3.9. Синтез PhAc-GPGP-доксорубицина.
Получение проводили согласно описанию, приведенному в разделе 3.2, с использованием NH2GPGP-Dox вместо NH2-ALAL-Dox. МС (ЭР+): 974,9[МН]+; чистота: 98% (определена посредством ВЭЖХ при 214 нм). Для синтеза PhAc-TSGP-доксорубицина и PhAc-KLGP-доксорубицина использовали мето дики синтеза, аналогичные описанным выше.
4. Синтез сукцинил-βALAL-доксорубицина и сукцинил-eALPF-доксорубицина
Сукцинил-βALAL-доксорубицин
Сукцинил-eALPF-доксорубицин.
Сукцинил-eALAL-доксорубицин и сукцинил-eALPF-доксорубицин получали согласно описанию, ранее приведенному в источнике Fernandez AM et al., J. Med. Chem., 44:3750-3753 (2001).
Приммер 2. Оценка стабильности N-кэпированных пептидных пролекарств в крови и плазме in vitro.
Методика.
Кровь и плазму человека, полученные от здоровых доноров, в цитратном буфере (рН 7, Innovative Research) использовали для оценки стабильности конъюгатов лекарственных средств, кэпированных фосфоноацетилом (PhAc-ALAL-Dox, PhAc-ALPF-Dox, PhAc-ALAF-Dox, PhAc-ALGP-Dox, PhAc-DLGPDox и PhAc-KLGP-Dox) по сравнению со стабильностью известного пролекарственного конъюгата сукцинил-eALAL-Dox.
Конъюгаты лекарственного средства (50 мкМ) смешивали с плазмой человека и инкубировали в течение 5 часов при 37°С в водяной бане. Через 0, 1, 3 или 5 часов отбирали пятьдесят мкл образцов, и незамедлительно проводили экстракцию: к 50 мкл образцов добавляли 150 мкл ацетонитрила. Образцы перемешивали на устройстве типа вортекс и центрифугировали в течение 10 мин при 13 000 об/мин при комнатной температуре. Супернатант собирали. Образцы обрабатывали буфером путем добавления 200 мМ формиатного буфера с рН 4,5 (1 об. супернатанта образца + 3 об. буфера), после чего подвергали анализу посредством ВЭЖХ (флуоресцентное детектирование возбуждение=235 нм, эмиссия=560 нм).
Результаты.
Аналогично Suc-eALAL-Dox, было показано, что все протестированные кэпированные конъюгаты стабильны в плазме и крови человека. Через 5 часов инкубирования при 37°С в присутствии крови или плазмы в тестируемых образцах было обнаружено 10% или менее метаболических производных конъюгатов доксорубицина (исключение: PhAc-ALAL-Dox, из которого было получено 15% метаболитов в крови; данные обобщены в таблицах 1 и 2).
Таблица 1
Соединения % метаболитов, высвобожденных после 5 часов инкубирования при 37°С в крови человека в цитратном буфере общий % метаболитов
Dox L-dox AL-Dox GP-dox F-Dox P-Dox
Snc-βΑΙ .Al .-Dox 2 6 1 - - - 9
PhAc-ALAL-Dox 9 6 0 - - - 15
PhAc-ALPF-Dox 4 - 1 - 5
PhAc-ALAF-Dox 5 - 5 - 10
PhAc-ALGP-Dox 6 3 - 0 9
PhAc-DLGP-Dox 2 0 - 2 4
PhAc-KLGP-Dox 2 1 - 0 8
LGP-Dox 71 8
GP-Dox 71
- 22 034046
Таблица 2
Соединения % метаболитов, высвобожденных через 5 часов инкубирования при 37°С в плазме человека в цитратном буфере (рН7)
Dox L-dox AL-Dox GP-dox F-Dox P-Dox общий % метаболитов
Suc-βΑΕ AL-Dox <1 2 0 - - - 2
PhAc-ALAL-Dox <1 2 0 - - - 2
PhAc-ALPF-Dox 0 - 0 - 0
PhAc-ALAF-Dox 0 - 2 - 2
PhAc-ALGP-Dox 2 0 - 0 2
PhAc-DLGP-D ox 2 0 - 1 3
PhAc-GPGP-Dox 6 0 - 0 6
PhAc-TSGP-Dox 4 4 - 0 8
LGP-Dox 63 2
GP-Dox 50
Пример 3. Оценка ферментативной активации N-кэпированных пептидных пролекарств in vitro.
1. Методика.
1.1. Исследование реактивации в присутствии пептидаз, секретируемых опухолевыми клетками
Субконфлюэнтные культуры опухолевых клеток LS-174T дважды промывали фосфатно-солевым буферным раствором, и добавляли свежую питательную среду (DMEM-F12 без фенолового красного), содержащую 0,02% бычьего сывороточного альбумина (100 мкл/см2). Через 24 часа инкубирования кондиционированную среду собирали, центрифугировали в течение 10 мин при 300 g, обрабатывали буфером 1 М Tris-HCl, pH 7,4 (1 объем буфера + 19 объемов среды) и концентрировали в 20 раз путем ультрацентрифугирования (пороговая отсечка 10 кДа). Лекарственные соединения (50 мкМ) инкубировали в течение 0, 1, 3 или 5 часов при 37°С в присутствии свежеприготовленной среды, кондиционированной опухолевыми клетками LS174T. В каждой временной точке отбирали по пятьдесят мкл образца, и проводили обработку, как описано выше для плазмы человека.
1.2. Исследование реактивации в присутствии очищенных ферментов (TOP. CD10. CD26. FAP).
CD10 (рекомбинантный человеческий неприлизин, R&D systems, номер по каталогу 1182-ZN) разбавляли до концентрации 20 нМ в 0,1 М MES с рН 6,5 с добавкой 0,2 мг/мл BSA. ТОР (рекомбинантную человеческую тимет-олигопептидазу, R&D systems, номер по каталогу 3439-ZN) разбавляли до концентрации 10 нМ в растворе 50 мМ Tris-HCl с рН 7,4/ 0,5 М NaCl/ 0,1 М DTT. CD26 и FAP разбавляли до концентрации 1 мкг/мл в буфере Tris-HCl с рН 7,5. Реакции инициировали путем добавления 50 мкМ каждого соединения к растворам ферментов (1 об. раствора фермента + 1 об. 100 мкМ раствора лекарственного средства). Образцы инкубировали в течение 0, 1 или 3 ч при 37°С в водяной бане в присутствии очищенных ферментов. В каждой временной точке отбирали по пятьдесят мкл образца, и проводили обработку, как описано выше для плазмы человека. Параллельно тестировали активацию Suc-PALAL-dox для сравнения.
1.3. Результаты.
Результаты исследования реактивации конъюгатов N-кэпированный пептид-доксорубицин in vitro представлены в табл. 3.
Suc-PALAL-Dox расщепляли посредством CD10 с высвобождением 73% L-Dox. Напротив, PhAcALAL-Dox неэффективно расщеплялся посредством CD10. Через 3 ч инкубирования в присутствии фермента высвобождалось менее 5% L-Dox. В данном примере замена сукцинила-β А- кэпирующей группой фосфоноацетил ингибирует взаимодействие пептид-фермент. PhAc-ALAF-Dox умеренно расщеплялся посредством CD10 с получением F-Dox. Замена пептидного фрагмента ALAF на ALPF ингибирует расщепление посредством CD10, какую бы кэпирующую группу не использовали. PhAc-ALGP-Dox расщепляется посредством указанного фермента с получением LGP-Dox (через 3 часа инкубирования при 37°С высвобождалось 25% метаболита). PhAc-AIGP-Dox расщепляется посредством CD10 с получением IGPDox (18% гидролиза через 3 ч инкубирования). PhAc-DLGP-Dox и PhAc-GPGP-Dox, PhAc-KLGP-Dox и PhAc-TSGP-Dox либо не активировались, либо очень ненамного активировались посредством CD10.
ТОР гидролизует Suc-eALAL-Dox и PhAc-ALAL-Dox с высвобождением 64 и 44% AL-Dox, соответственно. Ни одно из производных ALAF-Dox и ALPF-Dox не расщеплялось посредством ТОР.
ТОР активирует PhAc-ALGP-Dox, PhAc-KLGP-Dox и PhAc-TSGP-Dox с получением GP-Dox (через 3 ч инкубирования в присутствии данного фермента было обнаружено 72, 31 и 38% метаболитов).
PhAc-DLGP-Dox, PhAc-GPGP-Dox PhAc-AIGP-Dox не расщеплялись посредством ТОР.
Чувствительность кэпированных тетрапептидных Dox-пролекарств к ТОР и CD10 не противоречит их стабильности в крови. Большинство пептидаз крови представляют собой экзопротеазы, для которых указанные кэпированные тетрапептидные Dox-пролекарства недоступны в качестве субстратов. Тем не менее, ТОР и CD10 представляют собой эндопротеазы, на которые присутствие кэпирующей группы не влияет.
Suc-eALAL-Dox и PhAc-ALAL-Dox активируются ферментами, секретируемыми опухолевыми
- 23 034046 клетками, с высвобождением L-Dox и в меньшей степени AL-Dox и Dox. PhAc-ALAF-Dox, PhAc-ALPFDox и Suc-β ALPF-Dox все активировались с получением F-Dox посредством ферментов, секретируемых опухолевыми клетками. PhAc-ALGP-Dox гидролизуется в присутствии среды, кондиционированной опухолевыми клетками, с получением GP-Dox и Dox (через 5 ч обнаружено 56 и 24% всех метаболитов, соответственно), причем после активации PhAc-KLGP-Dox и PhAc-TSGP-Dox обнаружен в основном GPDox. PhAc-DLGP-Dox, PhAc-AIGP-Dox и PhAc-GPGP-Dox не активировались в присутствии пептидаз, секретируемых опухолевыми клетками LS1747.
Между защитными группами PhAc- и Suc-β A- для всех производных ALAL-Dox и ALPF-Dox значительных различий не было показано.
В данных экспериментах соединения PhAc-ALAL-Dox и PhAc-ALGP-Dox лучше расщепляются ферментами, секретируемыми опухолевыми клетками, и указанные соединения были выбраны для дальнейшего анализа in vivo.
Ни CD26, ни FAP не гидролизовали ни PhAc-ALGP-Dox, ни Suc-β ALAL-Dox, ни LGP-Dox, что согласуется с тем, что данные ферменты являются экзопротеазами/дипептидилпролинпротеиназами. Тем не менее, GP-Dox, является хорошим субстратом как для CD26 (97% превращения в Dox после 3 ч инкубирования при 37°С), так и FAP (62% превращения в Dox после 3 ч инкубирования при 37°С).
Культивированные опухолевые клетки способны превращать PhAc-ALGP-Dox в GP-Dox, LGP-Dox в Dox и GP-Dox в Dox, что показывает наличие CD10 и/или TOP (PhAc-ALGP-Dox в LGP-Dox или GPDox), с одной стороны, и наличие CD26 и/или FAP (GP-Dox в Dox), с другой стороны. Это также подтверждает, что двустадийный процесс активации пролекарства протекает полностью за пределами клетки, то есть внутриклеточная (лизосомальная) обработка не требуется. Этот вывод противоположен выводу для L-Dox (высвобождаемому из Suc-pALAL-Dox), который интернализируется и далее гидролизуется с получением Dox внутри клетки.
Таблица 3
Соединения CD10 10 нМ % метаболитов, высвобожденных через 3 ч TOP 5hM % метаболитов, высвобожденных через 3 ч LS174T CM20xcc % метаболитов, высвобожденных через 5 ч
Suc-βΑΤ AL-Dox + 73 ± 17 L-Dox + 64 ± 10 AL-Dox + 65 ±17 Dox ±AL-Dox ±L-Dox
Suc-3ALPF-Dox - F-Dox - 0 + 17±2 F-Dox
PhAc-ALAL- Dox - <5 L-Dox + 44 ±6 AL-Dox + 65 ±19 Dox ±AL- Dox±L-Dox
PhAc-ALPF-Dox - 0 <5 F-Dox + 11 ±6 F-Dox
PhAc-ALAF-Dox + 24± 5 F-Dox+LAF- Dox <5 F-Dox + 32 ± 15 F-Dox
PhAc-ALGP-Dox + 25 ±4 LGP-Dox + 72 ±14 GP-Dox + 81 ±31 Dox±GPDox±LGP- Dox
PhAc-DLGP-Dox . 0 . 0 . 0
PhAc-AIGP-Dox + 18 ± 3 IGP-Dox GP-Dox 3 ±3 Dox±GPDox±IGP-Dox
PhAc-KLGP-Dox LGP-Dox + 31 ±5 GP-Dox + 39 ± 13 Dox±GP-Dox
PhAc-GPGP-Dox - 0 - 0 - 0
PhAc-TSGP-Dox - 0 + 38±2 GP-Dox + 35 ± 18 Dox±GP-Dox
LGP-Dox - - + Dox (23%) ± GP-Dox (77%)
GP-Dox Dox (28%)
* обнаружено менее 5% метаболитов.
Далее чувствительность GP-Dox (высвобождаемого из PhAc-ALGP-Dox посредством ТОР) в качестве субстрата к активности пролилпептидаз была протестирована более подробно для двух таких ферментов, CD26 (синоним DPIV) и FAP выступают в качестве потенциально важных факторов для химиотерапии рака. CD26 (1 мкг/мл) или FAP не гидролизовали ни PhAc-ALGP-Dox, ни LGP-Dox (эффективно высвобождалися из PhAc-ALGP-Dox посредством ТОР), ни Suc-β ALAL-Dox. Тем не менее, было показано, что GP-Dox является хорошим субстратом для CD26 и FAP и расщеплялся с получением Dox (97% превращения посредством CD26; 62% превращения посредством FAP). Важно отметить, что в данном случае специфичность PhAc-ALGP-Dox к раковым клеткам увеличивалась. ТОР задействована в процессе активации пролекарств Suc-eALAL-Dox или PhAc-ALAL-Dox (с высвобождением AL-Dox) и PhAcALGP-Dox (с высвобождением GP-Dox). Несмотря на то, что AL-Dox в общем чувствителен к превраще
- 24 034046 нию в L-Dox и Dox путем секретируемых клетками пептидаз (и при этом L-Dox автоматически гидролизуется внутри клеток с получением Dox), GP-Dox, вероятно, чувствителен к пептидазам, преимущественно высвобождаемым опухолевыми клетками, таким как CD26 и FAP. Это различие в чувствительности и различие между ферментами, задействованными в активации GP-Dox с получением Dox (по сравнению с активацией AL-Dox с получением Dox), вероятно, приводят к различиям в токсичности и активности, например, PhAc-ALGP-Dox, с одной стороны, и Suc-3ALAL-Dox или PhAc-ALAL-Dox, с другой стороны. На основании изложенного и как описано в следующем примере, была оценена токсичность PhAc-ALGP-Dox in vivo в сравнении с PhAc-ALAL-Dox.
Пример 4. Оценка токсичности конъюгатов PhAc-ALGP-Dox и PhAc-ALAL-Dox in vivo после одной или множества внутривенных инъекций мышам.
Методика.
PhAc-ALAL-Dox и PhAc-ALGP-Dox растворяли в физиологическом растворе. Соединения вводили путем внутривенной болюсной инъекции в латеральную хвостовую вену мышей OF-1 (10 мкл/г). Токсичность in vivo оценивали путем мониторинга массы тела.
Результаты.
Результаты, представленные на фиг. 1, демонстрируют высокую токсичность PhAc-ALAL-Dox в количестве 160 мкмоль/кг. В группе, получавшей лечение посредством PhAc-ALAL-Dox в количестве 80 мкмоль/кг, значительного снижения массы тела не наблюдалось. Инъекция PhAc-ALGP-Dox в дозах 240 и 320 мкмоль/кг хорошо переносилась. Умеренное снижение массы тела с максимумом в 15% на 28-й день было зафиксировано в группе, получавшей 240 мкмоль/кг PhAc-ALGP-Dox, при этом была показана его меньшая токсичность по сравнению с PhAc-ALAL-Dox. Инъекция PhAc-ALGP-Dox в количестве 320 мкмоль/кг вызывала значительное снижение массы тела, и одна мышь была найдена мертвой на 12-й день. Эти данные показывают, что максимальная переносимая доза (MTD, англ.: maximum tolerated dose) PhAc-ALGP-Dox после одной в.в. болюсной инъекции составляет от 240 до 320 мкмоль/кг. Токсичность Dox изменяется от 30 и 40 мкмоль/кг, что показывает, что после одной внутривенной инъекции пролекарство PhAc-ALGP-Dox по меньшей мере в 6 раз менее токсично.
Пример 5. Исследование эффективности PhAc-ALGP-Dox после повторных в.в. болюсных инъекций на моделях с ксенотрансплантатом опухоли человека на бестимусных мышах.
Методика.
Противоопухолевую активность доксорубицина и PhAc-ALGP-Dox исследовали на моделях на бестимусных мышах (nude/nude NMRI) с эктопическими ксенотрансплантатами карциномы толстой кишки человека LS174Т или карциномы молочной железы человека МХ-1.
Опухоли LS174T и МХ-1 прививали путем подкожной имплантации клеток (с введением 3х106 и 107 клеток, соответственно) в правый бок 6-недельных самок бестимусных мышей NMRI (Harlan). Лечение начинали, когда размер опухолей достигал 150-200 мм3 (рассчитывали по следующей формуле: [длина х ширина2]/2). В день первой инъекции животные были рандомизированно разделены на группы по 4 животных. Доксорубицин и PhAc-ALGP-Dox растворяли в физиологическом растворе. Доставку соединений осуществляли посредством внутривенной (в.в.) болюсной инъекции в латеральную хвостовую вену в объеме 10 мкл/г. В ходе эксперимента клинические признаки, массу тела и объем опухоли контролировали два раза в неделю. Результаты представлены в виде изменения среднего объема опухоли в зависимости от времени. В качестве меры эффективности лечения применяли оптимальные значения Т/С (отношение среднего объема опухоли у мышей, получавших лечение, к таковому у контрольных мышей). Оптимальное Т/С в % отражает максимальное достигнутое ингибирование роста опухоли (TGI, англ.: tumor growth inhibition) (TGI = 100-(T/C х 100)).
Результаты.
Как показано на фиг. 2, PhAc-ALGP-Dox вводили дважды (один раз в неделю) в.в. путем в дозах 140 мкмоль/кг и 160 мкмоль/кг бестимусным мышам с подкожно имплантированными опухолями LS174T (карциномы толстой кишки). Их массу тела и размер опухоли регистрировали в течение 28 дней и сравнивали с группами животных, получавших Dox (15 мкмоль/кг) и NaCl. Значительная и сходная противоопухолевая активность наблюдалась во всех группах, получавших лекарственные средства (табл. 4).
Эти данные также подтверждают более низкую токсичность PhAc-ALGP-Dox, так как в дозах 140 мкмоль/кг и 160 мкмоль/кг снижение массы тела (максимум на 10%) было сопоставимо со снижением массы, вызванным Dox в 9 раз меньшей дозе.
Таблица 4. Ингибирование роста опухоли. Средний относительный объем опухоли (RTV, англ.: relative tumor volume) и стандартное отклонение (SD) рассчитывали для каждой группы в конце исследования. Эффективность лекарственных средств выражали как процент ингибирования роста опухоли (% TGI), рассчитанный с применением уравнения 100-(Т/С х 100), где Т представляет собой средний RTV у мышей с опухолью, получавших лечение, а С представляет собой средний RTV в контрольной группе.
- 25 034046
Соединение PhAc-ALGP-Dox PhAc-ALGP-Dox Доксорубицин
Доза 140 мкмоль/кг 160 мкмоль/кг 15 мкмоль/кг
TGI [% (день)] 79 (28) 81 (28) 55 (28)
В другом эксперименте PhAc-ALGP-Dox вводили в.в. путем четыре раза (в 0-й, 3-й, 6-й и 9-й дни) в дозе 100 мкмоль/кг бестимусным мышам с подкожно имплантированными опухолями МХ-1 (карциномы молочной железы). Их массу тела и размер опухоли регистрировали в течение 29 дней и сравнивали с группами животных, получавших Dox (8 мкмоль/кг) и NaCl. Для 2 исследованных лекарственных средств не наблюдалось значительного снижения массы тела и наблюдалась сходная значительная противоопухолевая активность (ингибирование роста опухоли > 60 %) (фиг. 3 и табл. 5).
Таблица 5. Ингибирование роста опухоли. Средний RTV рассчитывали для каждой группы в конце исследования. Эффективность лекарственных средств выражали как процент ингибирования роста опухоли (% TGI), рассчитанный с применением уравнения 100-(Т/С х 100), где Т представляет собой средний RTV у мышей с опухолью, получавших лечение, а С представляет собой средний RTV в контрольной группе.
Соединение PhAc-ALGP-Dox Доксорубицин
Доза 100 мкмоль/кг 8 мкмоль/кг
TGI [% (день)] 60 (29) 65 (29)
Пример 6. Фармакокинетический анализ и количественное определение в тканях PhAc-ALGP-Dox и его метаболитов после однократной в.в. болюсной инъекции мышам в сравнении с эквимолярной дозой доксорубицина.
Методика.
Фармакокинетические исследования распределения в тканях проводили на мышах OF-1. Доксорубицин и PhAc-ALGP-Dox растворяли в физиологическом растворе в дозе 8,62 мМ и вводили мышам в.в. путем в латеральную хвостовую вену (10 мкл/г). В разные моменты времени после введения лекарственных средств (5 мин, 30 мин, 1 ч, 4 ч, 7 ч, 16 ч и 24 ч) 3 мышей из каждой группы умерщвляли путем смещения шейных позвонков и собирали кровь и ткани сердца. Сердца разрезали и тщательно промывали фосфатном-солевым буфером (для удаления крови из полости сердца), сушили на бумаге и замораживали в жидком азоте. Их хранили до проведения анализа. Образцы крови центрифугировали (10 мин, 2000 g, 4°С) для отделения фракции плазмы, которую хранили для анализа. Сердца гомогенизировали в 1,5 мл воды с применением гомогенизатора Ultra-Turrax. Концентрацию белка измеряли методом количественного определения белка microBCA (Pierce). Количественное определение препаратов в тканях проводили посредством ВЭЖХ после экстракции: 150 мкл ацетонитрила добавляли к 50 мкл образцов. Образцы перемешивали на устройстве типа вортекс и центрифугировали в течение 10 мин при 13000 об/мин при комнатной температуре. Супернатант отбирали. Образцы забуферивали добавлением 200 мМ формиатного буфера с рН 4,5 (1 объем супернатанта образца + 3 объема буфера) перед анализом посредством ВЭЖХ (детекция флуоресценции при длине волны возбуждения 235 нм и регистрации эмиссии на 560 нм).
Результаты.
Доксорубицин и PhAc-ALGP-Dox вводили путем в.в. болюсной инъекции в эквимолярной дозе, составляющей 86,2 мкмоль/кг, самкам мышей OF-1 дикого типа. Изменение концентрации лекарственных средств и их метаболитов в плазме и сердечной ткани определяли путем анализа посредством ВЭЖХ. Примерно 90 % концентрации лекарственных средств в плазме удалялись в течение первых пяти мин после инъекции Dox или PhAc-ALGP-Dox (фиг. 4А и В). Менее чем 1 % PhAc-ALGP-Dox подвергались быстрому гидролизу до LGP-Dox, GP-Dox и Dox. Эти метаболиты больше не обнаруживались через 1 час. Величина площади под кривой зависимости концентрации от времени (AUC) в плазме для доксорубицина после инъекции доксорубицина была в 63 раза выше, чем после инъекции PhAc-ALGP-Dox (табл. 6).
Поскольку сердце представляет собой мишень для опасного токсического действия доксорубицина, проводили определение концентрации свободного лекарственного средства в сердечной ткани. Также определяли AUC в сердечной ткани для доксорубицина после введения доксорубицина и AUC в сердечной ткани для Dox, GP-Dox и PhAc-ALGP-Dox после введения PhAc-ALGP-Dox (табл. 6). AUC в сердечной ткани для Dox после введения PhAc-ALGP-Dox была в 25 раз ниже, чем после введения Dox в эквимолярной дозе. С учетом клинического кардиотоксического эффекта Dox AUC эти результаты убедительно показывают, что PhAc-ALGP-Dox должен быть значительно менее кардиотоксичным, чем доксорубицин.
Таблица 6. Значения фармакокинетического параметра AUC для PhAc-ALGP-Dox и его метаболитов по сравнению с доксорубицином в сердечной ткани после однократной в.в. болюсной инъекции мышам OF-1 в дозе 86,2 мкмоль/кг.
- 26 034046
AUC (площадь под кривой зависимости концентрации от времени) Dox PhAc-ALGP-Dox
Dox GP-Dox PhAc-ALGP-Dox
Плазма (мкМ-ч) 63 1 1 97
Сердце (пмоль-ч/мг белка) 5863 235 И 23
Пример 7. Анализ цитотоксичности PhAc-ALGP-Dox на кардиомиоцитах in vitro.
Анализ кардиотоксичности in vitro проводили на подходящей и предсказательной модели in vitro для скрининга на кардиологическую безопасность в процессе начальной оптимизации соединенийпрототипов с применением кардиомиоцитов, полученных из эмбриональных стволовых клеток мыши (Cor.At®, Axiogenesis (Germany)). Кардиомиоциты Cor.At® обеспечивают стандартизированную, однородную и воспроизводимую клеточную систему для классификации кардио-цитотоксического потенциала соединений in vitro. После инкубации с исследуемыми соединениями применяли тест на поглощение красителя нейтрального красного для определения эффектов, непосредственно влияющих на жизнеспособность и целостность клеток сердца по сравнению с неспецифическими эталонными клетками, например, фибробластами эмбрионов мышей (MEF).
Результаты.
Кардиомиоциты Cor.At инкубировали в присутствии возрастающих концентраций PhAc-ALGP-Dox или доксорубицина. Жизнеспособность клеток определяли через 48 ч с применением теста на поглощение красителя нейтрального красного. Фибробласты эмбрионов мышей (MEF) применяли в качестве контрольных клеток для отличия специфической кардиотоксичности от общей цитотоксичности. Кривая зависимости доза-эффект для PhAc-ALGP-Dox (фиг. 5) показывала наличие умеренного токсического действия исключительно на кардиомиоциты Cor.At при наибольшей исследуемой концентрации (20 мкг/мл). При этой концентрации действие на MEF было менее выраженным (жизнеспособность 81% по сравнению с жизнеспособностью 37%). В случае MEF не была достигнута концентрация IC50 для этого соединения. При всех меньших исследованных концентрациях PhAc-ALGP-Dox не демонстрировал какого-либо токсического эффекта. Кривая зависимости доза-эффект для доксорубицина показывала тяжелое токсическое действие на кардиомиоциты Cor.At, как и на MEF, при двух наибольших исследуемых концентрациях (20 мкг/мл и 2 мкг/мл). В концентрации 0,2 мкг/мл это соединение демонстрировало умеренное токсическое действие на кардиомиоциты Cor.At, но лишь незначительное действие на MEF (жизнеспособность кардиомиоцитов Cor.At 67% по сравнению с жизнеспособностью MEF 89%). Несмотря на то, что действие на кардиомиоциты Cor.At лишь немного превышало таковое на MEF, полагают, что соединение проявляет кардиотоксический эффект, который может быть замаскирован общим цитотоксическим эффектом.
Как показано на фиг. 5, это исследование демонстрирует, что PhAc-ALGP-Dox является в от 40 до 50 раз менее цитотоксичным, чем Dox, по отношению к кардиомиоцитам Cor.At®.
Пример 8. Оценка активации PhAc-ALGP-Dox в месте локализации опухоли после однократной в.в. болюсной инъекции бестимусным мышам с ксенотрансплантатами карциномы толстой кишки LoVo.
Методика.
Активацию PhAc-ALGP-Dox в опухоли оценивали на бестимусных мышах (nude/nude NMRI) с эктопическими ксенотрансплантатами карциномы толстой кишки человека LoVo. Опухоли LoVo прививали путем подкожной имплантации клеток (107 клеток) в правый бок 6-недельных самок бестимусных мышей NMRI (Harlan). Лекарственные средства или контроли вводили через четыре недели после подкожной имплантации ксенотрансплантатов. В день инъекции животные были рандомизированно разделены на группы по 4 животных. Конъюгат PhAc-ALGP-Dox растворяли в физиологическом растворе в возрастающих дозах (1,5, 3,5, 5, 10, 20, 30, 46, и 62 мМ). Доставку конъюгатов осуществляли посредством внутривенной (в.в.) болюсной инъекции в латеральную хвостовую вену в объеме 10 мкл/г. Через двадцать четыре часа после инъекции мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков, и опухоли собирали, промывали в фосфатно-солевом буфере и гомогенизировали. Экстракцию лекарственных средств из гомогенатов опухолей проводили с применением ацетонитрила, и количество присутствующего в опухолях доксорубицина определяли путем анализа посредством ВЭЖХ.
Результаты.
Представленные на фиг. 6 результаты показывают, что концентрация Dox в опухолях возрастала с увеличением вводимой дозы PhAc-ALGP-Dox, выходя на плато при значении 200 мкмоль/кг. Результаты этого примера указывают на то, что ограниченная скорость активации пролекарства и доступность в месте локализации опухоли может зависеть от максимальной ферментативной активности, достигаемой при взаимодействии с PhAc-ALGP-Dox.
Пример 9. Оценка токсичности PhAc-ALGP-Dox in vivo после однократной и многократных внутрибрюшинных инъекций мышам.
Методика.
PhAc-ALGP-Dox растворяли в физиологическом растворе и вводили посредством однократной или многократных внутрибрюшинных (в.б.) инъекций в латеральную хвостовую вену мышей OF-1 (10 мкл/г).
- 27 034046
PhAc-ALGP-Dox вводили в близких суммарных дозах, составляющих 280 и 560 мкмоль/кг, в соответствии с различными схемами введения: однократная в.б. инъекция; 5 последовательных ежедневных в.б.
инъекций в дозах 56 и 112 мкмоль/кг или инъекции два раза в день в течение пяти последовательных дней в дозах 28 и 56 мкмоль/кг. Токсичность in vivo оценивали путем мониторинга массы тела.
Результаты.
Независимо от схемы введения снижение массы тела не было зарегистрировано в группах животных, получивших суммарную дозу PhAc-ALGP-Dox, составляющую 280 мкмоль/кг (фиг. 7). Исследование токсичности PhAc-ALGP-Dox после однократной в.б. инъекции в дозе 280 мкмоль/кг проводили отдельно, результаты на фигуре 7 не показаны. Доза 560 мкмоль/кг, введенная посредством однократной в.б. инъекции, была очень токсичной. Животные потеряли 25 % массы тела за одну неделю и были умерщвлены. Результаты явно указывают на то, что фракционирование дозы на многократные инъекции снижало токсичность. Пять последовательных ежедневных в.б. инъекций PhAc-ALGP-Dox в дозе 112 мкмоль/кг также вызывали значительное снижение массы тела с максимальным значением 22,5 % на 11й день, но с последующей фазой восстановления. Снижения массы тела не наблюдалось в группе, получившей 10 в.б. инъекций (два раза в день в течение пяти последовательных дней) PhAc-ALGP-Dox в дозе 56 мкмоль/кг. Учитывая тот факт, что максимальная переносимая доза доксорубицина, вводимая в соответствии с таким же режимом, составляет 3 мкмоль/кг, PhAc-ALGP-доксорубицин является в этих условиях примерно в 15 раз менее токсичным.
Пример 10. Фармакокинетический анализ и количественное определение в тканях PhAc-ALGP-Dox и его метаболитов после однократной внутрибрюшинной инъекции мышам в сравнении с эквимолярной дозой доксорубицина.
Методика.
Фармакокинетические исследования распределения в тканях проводили на мышах OF-1. Доксорубицин и PhAc-ALGP-Dox растворяли в физиологическом растворе в дозе 9,2 мМ и вводили мышам внутрибрюшинно (10 мкл/г, 6 мышей в каждой группе). В разные моменты времени после введения лекарственных средств (5 мин, 30 мин, 1 ч, 4 ч и 24 ч) собирали образцы крови из латеральной хвостовой вены трех мышей в микропробирки с ЭДТА (Starsted). Через 24 ч 3 мышей из каждой группы умерщвляли путем смещения шейных позвонков и собирали сердца. Последние разрезали и тщательно промывали фосфатном-солевым буфером (для удаления крови из полости сердца), сушили на бумаге и замораживали в жидком азоте. Их хранили до проведения анализа. Сердца гомогенизировали в 1,5 мл воды с применением гомогенизатора Ultra-Turrax. Концентрацию белка измеряли методом количественного определения белка microBCA (Pierce). Количественное определение лекарственных средств в ткани проводили посредством ВЭЖХ после экстракции: 150 мкл ацетонитрила добавляли к 50 мкл образцов. Образцы перемешивали на устройстве типа вортекс и центрифугировали в течение 10 мин при 13000 об/мин при комнатной температуре. Супернатант отбирали. Образцы забуферивали добавлением 200 мМ формиатного буфера с рН 4,5 (1 объем супернатанта образца + 3 объема буфера) перед анализом посредством ВЭЖХ (детекция флуоресценции при длине волны возбуждения 235 нм и регистрации эмиссии на 560 нм).
Результаты.
Фармакокинетические свойства PhAc-ALGP-Dox в крови оценивали после внутрибрюшинной (в.б.) инъекции мышам OF-1. Небольшая процентная доля (примерно 1%) от введенной дозы достигала компартмента крови за первые пять мин после в.б. инъекции PhAc-ALGP-Dox в дозе 92 мкмоль/кг. Концентрация пролекарства в крови оставалась стабильной в течение одного часа и впоследствии снижалась. Конъюгат больше не обнаруживался через 4 ч (фиг. 8А). Значения AUC составляли 44,2 мкМ-ч и 3,6 мкМ-ч для PhAc-ALGP-Dox и Dox, соответственно. Представленные на фиг. 8В результаты показывают фармакокинетические свойства доксорубицина в крови для его эквимолярной дозы. Небольшая процентная доля (примерно 2,5%) от введенной дозы достигала компартмента крови за первые пять мин после инъекции. Концентрация Dox в крови быстро уменьшалась в течение одного часа до очень низкой концентрации, которая оставалась стабильной не более 24 ч после инъекции. Значение AUC для доксорубицина составляло 70,3 мкМ-ч.
Концентрацию доксорубицина в сердечной ткани измеряли через 24 ч после в.б. инъекции PhAcALGP-Dox или доксорубицина в эквимолярных дозах. Приведенные в табл. 7 результаты показывают, что доксорубицин накапливался в 19 раз меньше после внутрибрюшинной инъекции PhAc-ALGP-Dox в дозе 92 мкмоль/кг, чем после инъекции доксорубицина в эквимолярной дозе.
Таблица 7. Сердечная концентрация Dox in vivo после внутрибрюшинной инъекции Dox и PhAcALGP-Dox в дозе 92 мкмоль/кг. Мышей умерщвляли через 24 ч после введения лекарственных средств и сердца собирали. Концентрацию лекарственных средств определяли путем анализа посредством ВЭЖХ после экстракции из гомогенатов тканей. Результаты представлены в пмоль/мг белка ± SD (концентрации лекарственных средств и белка корректировали с учетом крови, оставшейся в тканях сердца).
- 28 034046
Вид лечения Концентрация Dox в сердце через 24 ч, пмоль/мг белка
Dox 92 мкмоль/кг 253 ± 60
PhAc-ALGP-Dox 92 мкмоль/кг 13 ± 3
Пример 11. Оценка эффективности PhAc-ALGP-Dox in vivo после повторных внутрибрюшинных инъекций на моделях с ксенотрансплантатом опухоли человека на бестимусных мышах.
Методика.
Эффективность PhAc-ALGP-Dox оценивали на бестимусных мышах (nude/nude NMRI) с эктопическими ксенотрансплантатами карциномы толстой кишки человека LoVo или карциномы молочной железы человека МХ-1 по сравнению со свободным доксорубицином. Опухоли прививали путем подкожной имплантации клеток (107 клеток) в правый бок 6-недельных самок бестимусных мышей NMRI (Harlan). Лекарственные средства вводили, когда размер опухолей достигал 150-200 мм3 (измеряли с помощью калипера и рассчитывали по следующей формуле: [длина х ширина2]/2). Животные были рандомизированно разделены на группы по 4-6 животных. Доксорубицин и PhAc-ALGP-Dox растворяли в физиологическом растворе. Доставку соединений осуществляли посредством болюсной внутрибрюшинной (в.б.) инъекции в объеме 10 мкл/г. В ходе эксперимента клинические признаки, массу тела и объем опухоли контролировали два раза в неделю. Результаты представлены в виде изменения среднего объема опухоли в зависимости от времени. В качестве меры эффективности лечения применяли оптимальные значения Т/С (отношение среднего объема опухоли у мышей, получавших лечение, к таковому у контрольных мышей) и TGD (задержка роста опухоли до достижения объема 1000 мм3, англ.: tumor growth delay). Оптимальное Т/С в % отражает максимальное достигнутое ингибирование роста опухоли (TGI) (TGI = 100(Т/С х 100)). Статистический анализ проводили на 22-й день с применением t-критерия Манна-Уитни, программное обеспечение Graph Pad Prism 5.0.
Результаты.
Мыши с ксенотрансплантатами LoVo получали два раза в день (с интервалом 5-6 ч) в течение 5 последовательных дней (2Q1D5, всего 10 инъекций) внутрибрюшинные инъекции физиологического раствора или доксорубицина в дозах 0,5, 1 и 2 мкмоль/кг или PhAc-ALGP-Dox в дозах 25, 35 и 50 мкмоль/кг. Регистрировали и сравнивали массу тела животных и размеры опухолей (фиг. 9). Измерения размера опухолей в группах, получавших NaCl и доксорубицин, прекращали при возникновении некроза опухолей. В этом эксперименте не было зарегистрировано значительного снижения массы тела. PhAc-ALGPDox вызывал дозозависимый противоопухолевый эффект и увеличение задержки роста опухоли (таблица 8). Умеренное ингибирование роста опухоли наблюдали в группе, получавшей доксорубицин в дозе 2 мкмоль/кг, тогда как никакой противоопухолевой активности не наблюдалось при дозах 0,5 и 1 мкмоль/кг. На 22-й день противоопухолевый эффект был статистически выше для дозы 50 мкмоль/кг PhAc-ALGP-Dox по сравнению с 2 мкмоль/кг Dox при значениях TGI, составляющих 65 и 45%, соответственно. Абсолютную задержку роста, вызванную каждым видом лечения, рассчитывали как время в днях, в течение которого опухоли у мышей, получавших лечение, вырастали в размере от 190 до 1000 мм3, минус время в днях, в течение которого опухоли у мышей, получавших переносящую среду, достигали такого же размера. Схема лечения с введением 50 мкмоль/кг PhAc-ALGP-Dox приводила к задержке роста, составляющей 17 дней, тогда как наибольшая доза свободного доксорубицина 2 мкмоль/кг вызывала задержку роста, составляющую лишь 6 дней.
Таблица 8. Ингибирование роста опухоли и задержка роста опухоли. Эффективность лекарственных средств выражена в процентном ингибировании роста опухоли (% TGI), рассчитанном по уравнению 100-(Т/С х 100), где Т представляет собой средний относительный объем опухоли (RTV) у мышей с опухолью, получавших лечение, а С представляет собой средний RTV в контрольной группе. Абсолютную задержку роста (TGD), вызванную каждым видом лечения, рассчитывали как время в днях, в течение которого опухоли у мышей, получавших лечение, вырастали в размере от 190 до 1000 мм3, минус время в днях, в течение которого опухоли у мышей, получавших переносящую среду, достигали такого же размера.
Соединение PhAc-ALGP-Dox Доксорубицин
Доза (мкмоль/кг) 25 35 50 0,5 1 2
TGI [% (день)] 32 (22) 60 (22) 65 (22) 5(22) нет 45 (22)
TGD [дни] 5 13 17 1 0 6
В другом аналогичном исследовании (фиг. 10) лекарственные средства или контроли вводили в течение 2 последовательных недель (2Q1D5 х 2W; всего 20 инъекций). В этом случае результаты явно указывают на лучшую эффективность и более низкую токсичность PhAc-ALGP-Dox по сравнению с доксорубицином. В группах, получавших PhAc-ALGP-Dox, не наблюдалось значительного снижения массы тела (максимальное значение 13 % на 9-й день в группе, получавшей 50 мкмоль/кг PhAc-ALGP-Dox). Однако дозозависимая токсичность была обнаружена в группах, получавших доксорубицин. Дозы 1,5 и 2 мкмоль/кг были очень токсичными и вызывали значительное снижение массы тела и гибель животных. Доза 1 мкмоль/кг была немного менее токсичной, но превышала MTD, поскольку наблюдалось непре- 29 034046 рывное снижение массы тела (максимальное значение 15% на 29-й день), и одна мышь была найдена мертвой на 29-й день. В этой дозе доксорубицин обладал очень низкой активностью при значении TGI, составляющем 44% на 29-й день. Наибольшая эффективность была получена для 50 мкмоль/кг PhAcALGP-Dox при значении TGI, составляющем 73 % на 29-й день, и значительной TGD, составляющей 22 дня (табл. 9).
Таблица 9. Ингибирование роста опухоли и задержка роста опухоли. Эффективность лекарственных средств выражена в процентном ингибировании роста опухоли (% TGI), рассчитанном по уравнению 100-(Т/С х 100), где Т представляет собой средний RTV у мышей с опухолью, получавших лечение, а С представляет собой средний RTV в контрольной группе. Абсолютную задержку роста (TGD), вызванную каждым видом лечения, рассчитывали как время в днях, в течение которого опухоли у мышей, получавших лечение, вырастали в размере от 190 до 1000 мм3, минус время в днях, в течение которого опухоли у мышей, получавших переносящую среду, достигали такого же размера.
Соединение PhAc-ALGP-D ох Доксорубицин
Доза (мкмоль/кг) 25 35 50 1 1,5 2
TGI [% (день)] 54(29), п=5 53(29), п=5 73(29), п=5 44(29), п=4 65(29), п=1 -
TGD [дни] 9 9 22 5 9 -
Мыши с ксенотрансплантатами МХ-1 получали с интервалом 72 ч 2 цикла в.б. инъекций длительностью 1 неделя каждый с введением 2 раза в день PhAc-ALGP-Dox в дозе 50 мкмоль/кг или доксорубицина в дозе 1 мкмоль/кг или 1,5 мкмоль/кг (2Q1D5 х 2W; всего 20 инъекций). Доксорубицин в дозе 1,5 мкмоль/кг был очень токсичным и вызывал значительное снижение массы тела и гибель животных. Для доксорубицина в дозе 1 мкмоль/кг (MTD) и для 50 мкмоль/кг PhAc-ALGP-Dox не было зарегистрировано значительного снижения массы тела. Представленные на фиг. 11 результаты показывают, что PhAcALGP-Dox в дозе 50 мкмоль/кг значительно ингибировал рост опухоли и обладал улучшенной эффективностью по сравнению с дозой 1 мкмоль/кг доксорубицина (MTD). В конце исследования (на 35-й день) значения процентного ингибирования роста опухоли составляли 76 и 44% для PhAc-ALGP-Dox или для доксорубицина, соответственно (табл. 10). В этом исследовании во всех группах наблюдался некроз опухоли (мышей с некрозом опухоли выводили из исследования).
Эти эксперименты подтверждают, что PhAc-ALGP-Dox характеризуется в 25-50 раз меньшей токсичностью по сравнению с доксорубицином.
Таблица 10. Ингибирование роста опухоли и задержка роста опухоли. Эффективность лекарственных средств выражена в процентном ингибировании роста опухоли (% TGI), рассчитанном по уравнению 100-(Т/С х 100), где Т представляет собой средний RTV у мышей с опухолью, получавших лечение, а С представляет собой средний RTV в контрольной группе.
Соединение PhAc-ALGP-Dox Доксорубицин
Доза (мкмоль/кг) 50 1 1,5
TGI [% (день)] 76 (35), п=4 44 (35), п=3 Не определено
Пример 12. Оценка эффективности PhAc-ALGP-Dox после повторных внутрибрюшинных инъекций на модели легочной метастазирующей меланомы B16-F10 на мышах.
Методика.
Эффективность PhAc-ALGP-Dox исследовали на хорошо описанной модели легочной метастазирующей меланомы B16-F10. Для этой цели клетки меланомы мыши B16-F10 в количестве 5х107 вводили в латеральную вену мышам C57BL6. Лечение начинали через три дня после инъекции клеток. Животные получали два раза в день (с интервалом 5-6 ч) в течение 5 последовательных дней внутрибрюшинные инъекции (всего 10 инъекций/мышь) физиологического раствора или доксорубицина в дозах 2 и 3,5 мкмоль/кг или PhAc-ALGP-Dox в дозе 50 мкмоль/кг. Пять мышей из каждой группы умерщвляли на 14-й день после инъекции клеток. Легкие собирали и обрабатывали для количественного определения меланина (Molecular Pharmacology, 74: 1576-1586, 2008). Выживаемость определяли путем наблюдения состояния остальных мышей.
Результаты.
PhAc-ALGP-Dox значительно ингибировал образование легочных метастазов и увеличивал выживаемость мышей по сравнению с группами, получавшими NaCl и доксорубицин (фиг. 12). На 14-й день количество меланина в гомогенате легких составляло 501 мг/мл в контрольной группе, 183 и 53 мг/мл в группах, получавших 2 и 3,5 мкмоль/кг доксорубицина, и 16 мг/мл в группе, получавшей 50 мкмоль/кг PhAc-ALGP-Dox. Медиана выживаемости составляла 20, 24, 28 и 36 дней в группах, получавших NaCl, 2 и 3,5 мкмоль/кг доксорубицина или 50 мкмоль/кг PhAc-ALGP-Dox, соответственно.
Пример 13. Оценка эффективности PhAc-ALGP-Dox in vivo после повторных внутрибрюшинных инъекций на ортотопической модели карциномы толстой кишки НСТ116 на мышах.
Методика.
Клетки НСТ116 вводили подкожно мышам SCID. После прививания ксенотрансплантатов последние вырезали и ортотопически имплантировали в слепую кишку других у-облученных самок мышей SCID с применением микрохирургических методов. На 12-й день после инъекции опухолевых клеток
- 30 034046 мыши были рандомизированы в четыре группы по 16 животных. Они получали в течение 5 последовательных дней 2 ежедневные внутрибрюшинные инъекции физиологического раствора, доксорубицина в дозе 2 мкмоль/кг и PhAc-ALGP-Dox в дозах 35 и 50 мкмоль/кг, соответственно. На 34-й день после инъекции клеток рака толстой кишки в слепую кишку животных умерщвляли, подсчитывали количество метастазов с помощью микроскопа и взвешивали первичные опухоли.
Результаты.
Результаты представлены на фигурах 15 и 16. Доксорубицин в дозе 2 мкмоль/кг оказался слишком токсичным для мышей SCID, и все животные умерли в течение 10 дней. PhAc-ALGP-Dox также был более токсичным для этих мышей по сравнению с другими исследованными моделями с ксенотрансплантатами опухолей на животных, и 12 мышей выжили в течение 34 дней при дозе 35 мкмоль/кг, а 9 мышей выжили в группе, получавшей 50 мкмоль/кг.
Контрольная группа характеризовалась средней массой первичной опухоли, составляющей 0,88 г с SD = 0,41. Вторая группа, получавшая 30 мкмоль/кг PhAc-ALGP-Dox, имела массу первичной опухоли, составляющую 0,69 г с SD = 0,25, тогда как группа, получавшая 50 мкмоль/кг PhAc-ALGP-Dox, демонстрировала значительное снижение массы опухоли при результате 0,44 г с SD = 0,10.
Количество печеночных метастазов составляло, соответственно, 20 (SD = 33) и 24 (SD = 26) для контрольной группы и группы, получавшей 30 мкмоль/кг PhAc-ALGP-Dox. Эффект PhAc-ALGP-Dox в дозе 50 мкмоль/кг был очень значительным при среднем количестве метастазов 1,78 с SD = 2,9.
Несмотря на то, что PhAc-ALGP-Dox не был полностью лишен токсичности, это пролекарство можно оставить по меньшей мере для лечения/предотвращения метастазов (например, печеночных метастазов карциномы толстой кишки), если оно не будет эффективным против самой первичной опухоли (например, карциномы толстой кишки) в нетоксичных концентрациях.
Пример 14. Оценка PhAc-ALGP-Dox-индуцированной лейкопении в сравнении с доксорубицином.
Лейкопенические эффекты PhAc-ALGP-Dox (35 мкмоль/кг в.б.) и доксорубицина (3,5 мкмоль/кг в.б.) сравнивали в двух независимых экспериментах. Мыши CD1 получали два раза в день внутрибрюшинные инъекции лекарственных средств в течение пяти последовательных дней (всего 10 инъекций/мышь; 2x5 животных в каждой группе). Регистрировали изменение массы тела мышей. Собирали кровь из хвостовой вены в пробирки Microvettes с ЭДТА (Starsted) на 4-й, 11-й и 15-й дни после начала лечения. Проводили подсчет белых кровяных телец (WBC) с применением гематологического анализатора SCILvet abc. Увеличение или уменьшение WBC выражали в виде процента по отношению к WBC в 0-й день (100 %) для каждой мыши. На фиг. 13 представлены объединенные результаты двух исследований.
На фиг. 13А приведены средние значения и SD, отражающие изменение массы тела в двух группах, а на фиг. 13В - изменение количества белых кровяных телец в виде процента по отношению к WBC в 0-й день для каждой мыши. Эти результаты явно указывают на отсутствие токсичности в.б. дозы 35 мкмоль/кг PhAc-ALGP-Dox по сравнению с доксорубицином, введенным в 10 раз меньшей дозе. В группе, получавшей PhAc-ALGP-Dox, не наблюдалось лейкопенического эффекта и снижения массы тела. С другой стороны, в группе, получавшей доксорубицин, одна мышь была найдена мертвой на 11-й день, а также 3 мыши - на 15-й день. Доксорубицин вызывал умеренную или тяжелую лейкопению (в среднем 43 % WBC на 15-й день) и снижение массы тела (в среднем - 15% на 15-й день).
Пример 15. Оценка PhAc-ALGP-Dox-индуцированной хронической кардиотоксичности.
Методика.
Хроническую кардиотоксичность PhAc-ALGP-Dox оценивали морфологически на мышах, как описано ранее Бертазолли и др. (Bertazzoli et al), 1979 (Cancer Treat Rep 63, 1877-1883). Самки белых мышей CD1 получали внутривенную болюсную инъекцию в хвостовую вену в объеме 10 мкл/г (6 мышей в каждой группе). Соединения вводили два раза в неделю, десять раз. Животных не подвергали лечению в течение 2 недель между первыми четырьмя инъекциями и шестью последними инъекциями для восстановления подавленной деятельности костного мозга. Величины лечебных доз PhAc-ALGP-Dox составляли: 13,8; 27,6; 55,2 и 82,8 мкмоль/кг. Доксорубицин в дозе 6,9 мкмоль/кг применяли в качестве эталона. Через три недели после последней инъекции животных вводили в глубокий наркоз путем внутрибрюшинной инъекции нембутала (50 мг/кг) и обескровливали. Сердца аккуратно собирали, промывали 9% NaCl и фиксировали в 10% растворе формальдегида. Образцы обрабатывали для гистопатологического анализа (CITox Lab, France). Сердца обрезали, заливали парафином, готовили срезы толщиной 4 мкм и окрашивали гематоксилин-эозином перед микроскопическим исследованием. В ходе эксперимента массу тела контролировали перед каждой инъекцией или один раз в неделю.
Результаты.
В группах, получавших PhAc-ALGP-Dox, снижения массы тела не наблюдалось (фиг. 14). В конце лечения животные, получавшие доксорубицин, демонстрировали признаки слабости и пониженную двигательную активность. Умеренное снижение массы тела было зарегистрировано в группе, получавшей доксорубицин, с максимальным значением 8% на момент умерщвления.
Результаты микроскопической оценки кардиотоксичности представлены в табл. 11. Одна мышь из группы, получавшей доксорубицин, не была использована для микроскопического исследования вслед- 31 034046 ствие преждевременной смерти (на 17-й день). У всех мышей, получавших 6,9 мкмоль/кг доксорубицина, присутствовали микроскопические изменения сердца. Наблюдалась минимальная или небольшая вакуолизация миокарда, характеризующаяся наличием мелких прозрачных цитоплазматических вакуолей в мышечных волокнах, рассредоточенных в желудочках, перегородке и предсердиях. Ядра клеток мышечных волокон в желудочках и перегородке были увеличены у 3 мышей из 5. Кроме того, присутствовали атрофия и/или повреждения предсердного миокарда, особенно с левой стороны. Атрофия мышечных волокон предсердий и воспалительный инфильтрат были обнаружены у 4 мышей из 5, наряду с фибриновыми тромбами у 3 мышей из 5. У одной из этих мышей также присутствовали дегенерация/некроз мышечных волокон. Введение PhAc-ALGP-Dox не вызывало каких-либо патологических изменений сердца по данным микроскопического исследования при любых величинах дозы (т.е. вплоть до дозы, в 12 раз превышающей дозу доксорубицина).
Таблица 11. Микроскопическая оценка PhAc-ALGP-Dox-индуцированной хронической кардиотоксичности на мышах в сравнении с доксорубицином
Лечение NaCl Доксорубицин PhAc-ALGP-Dox
Доза (мкмоль/кг) 0 6,9 13,8 27,6 55,2 82,8
Количество мышей 6 5 6 6 6 6
Вакуолизация, мышечные волокна 0 5 0 0 0 0
Степень 1 0 4 0 0 0 0
Степень 2 0 1 0 0 0 0
Образование тромбов; предсердие 0 3 0 0 0 0
Степень 1 0 3 0 0 0 0
Атрофия; мышечные волокна 0 4 0 0 0 0
Степень 1 0 1 0 0 0 0
Степень 2 0 3 0 0 0 0
Дегенерация/некроз; миокард 0 1 0 0 0 0
Степень 1 0 1 0 0 0 0
Инфильтрация; сумма клеток 0 4 0 0 0 0
Степень 1 0 4 0 0 0 0
Увеличение ядер; мышечные волокна 0 3 0 0 0 0
Степень 1 0 3 0 0 0 0
Общий вывод: максимальная переносимая доза PhAc-ALGP-Dox, в зависимости от различных схем лечения и способа введения, была в от 6 до 16 раз менее токсичной, чем доза Dox, и значительно более активной на трех экспериментальных моделях опухоли (ксенотрансплантатах LS174T и МХ-1 и модели легочной метастазирующей меланомы В16). PhAc-ALGP-Dox не вызывал лейкопению в активных дозах и не демонстрировал кумулятивной кардиотоксичности на модели на мышах в дозе, эквивалентной 12кратной MTD для доксорубицина.
Пример 16. Синтез и оценка других токсичных соединений, конъюгированных с PhAc-ALGP.
1. PhAc-ALGP-майтансин.
Майтансин представляет собой высокоактивное соединение, нацеленное на микротрубочки, которое вызывает задержку митоза и убивает опухолевые клетки в субнаномолярных концентрациях. Тем не менее, его побочные эффекты и отсутствие специфичности к опухолям являются препятствием для его успешного клинического применения. Он подавляет сборку микротрубочек, вызывая разборку микротрубочек и нарушает митоз. Майтансин демонстрирует цитотоксичность в отношении многих линий опухолевых клеток и демонстрирует примерно в 100 раз более высокую цитотоксичность, чем алкалоиды барвинка и примерно в 1000 раз более высокую цитотоксичность, чем доксорубицин.
В клинических испытаниях токсичность в отношении желудочно-кишечного тракта и центральной нервной системы служили ограничителями дозы, тогда как миелосуппрессия была нечастой. При оценке в качестве монотерапии, майтансин не смог показать существенного ответа у пациентов с различными типами рака.
На нижеприведенной фигуре изображен майтансин:
о д
ΗΝ Ο
О
Майтансин может быть конъюгирован с PhAc-ALGP посредством самоустраняемого спейсера, реагирующего с его свободной группой -NH или ОН. Майтансин коммерчески доступен (например, в компании Medkoo Biosciences; Xuzkou Kaiyide Chemical Co).
- 32 034046
2. PhAc-ALGP-гелданамицин.
Гелданамицин и его производные представляют собой семейство бензохиноновых ансамицинов, антибиотиков, исходно выделенных на основании их слабой антибиотической активности, для которых впоследствии была показана сильная противоопухолевая активность. Гелданамицин индуцирует, по сравнению с их нормальными клеточными аналогами, предпочтительное разложение белков, которые являются мутированными в опухолевых клетках, таких как v-src, bcr-abl и р53. Данный эффект опосредован Hsp90. Несмотря на его высокий противоопухолевый потенциал, гелданамицин в качестве противоопухолевого агента имеет несколько значительных недостатков, что привело к разработке аналогов гелданамицина, в частности аналогов, содержащих замещение по положению 17.
о
природный гелданамицин
гелданамицин, дериватизированный по 17му положению с получением 17AAG
В результате дериватизации гелданамицина по указанному положению получают 17AAG (17(аллиламино)-17-деметоксигелданамицин), который имеет меньшую токсичность in vivo, чем гелданамицин. Даже несмотря на то, что аффинность Hsp90 к 17AAG меньше, чем к гелданамицину, 17AAG и гелданамицин обеспечивают биологические эффекты в злокачественных клетках в аналогичных или одинаковых концентрациях. Гелданамицин с высокой аффинностью связывается с АТФ-связывающим карманом Hsp90. Hsp90 представляет собой распространенный молекулярный шаперон, имеющий критическое значение для укладки, сборки и активности нескольких мутированных и сверхэкспрессированных сигнальных белков, которые способствуют росту и/или выживанию опухолевых клеток. Связывание гелданамицина с Hsp90 вызывает дестабилизацию и разложение его мишени. Бюрке и др. (Burke et al.), 2009 (Bioorg Med Chem Lett 19, 2650-2653), описали методику связывания гелданамицина с антителами посредством линкера, расщепляемого лизосомальными ферментами. Данный линкер включает (самоуничтожающющийся) фрагмент валин-аланин-п-аминобензиламино для обеспечения связывания с аминогруппой гелданамицина, с одной стороны, и со свободной аминогруппой антитела, с другой стороны. Такая же методика связывания может быть использована для получения PhAc-ALGP-гелданамицина, но после замещения в линкере дипептида валина-аланин на тетрапептид аланин-лейцин-глицин-пролин. Гелданамицин коммерчески доступен (например, в Calbiochem, Fermentec Biosciences, AG ScientificPaclitaxel).
3. PhAc-ALGP-паклитаксел и PhAc-доцетаксел.
Таксаны представляют собой дитерпены, продуцируемые растениями Taxus. Они включают в себя паклитаксел (таксол) и доцетаксел (таксотер, см. фигуру ниже).
Паклитаксел или таксол
Паклитаксел представляет собой одно из нескольких действующих на цитоскелет лекарственных средств, мишенью которых является тубулин. Клетки, лечение которых производят с помощью паклитаксела, имеют дефекты, относящиеся к митотической сборке веретена, сегрегации хромосом и делению клеток. Паклитаксел стабилизирует полимер микротрубочек полимер, защищая его от деполимеризации, и тем самым блокирует митоз. Последние исследования показали, что подавление динамики происходит при более низких концентрациях, чем те, которые необходимы для блокирования митоза. При более высоких терапевтических концентрациях паклитаксел, как представляется, подавляет отсоединение микро- 33 034046 трубочек от центросом, процесс, в норме активируемый во время митоза. Паклитаксел одобрен для лечения рака яичников, рака молочной железы, рака легких и саркомы Капоши. Общие побочные эффекты включают тошноту и рвоту, снижение аппетита и гематологическую токсичность, такую как нейтропения, анемия и тромбоцитопения, хотя некоторые побочные эффекты связаны с используемым вспомогательным веществом, Кремофор EL (Cremophor EL), полиоксиэтилированным касторовым маслом. Доцетаксел или таксотер отличается от паклитаксела в двух положениях своей химической структуры. Это содержит гидроксильную функциональную группу при углероде в положении 10 (где паклитаксел содержит ацетатную эфирную группу), и на фенилпропионатной боковой цепи содержится третбутилкарбаматный эфир вместо бензиламида в паклитакселе. Замена функциональной группы при углероде в положении 10 обеспечивает то, что доцетаксел сильнее растворим в воде, чем паклитаксел. Гидроксильная группа при углероде в положении 2 остается без изменений.
доцетаксел или таксотер
Паклитаксел связывали с антителами посредством простой реакции (Guillemard & Saragovi 2001; Cancer Res 61, 694-699). Паклитаксел дериватизировали путем взаимодействия глутарового альдегида с получением 2'-глутарилпаклитаксела, содержащего расщепляемую сложноэфирную связь. Далее 2'глутарил-паклитаксел активировали путем удаления гидроксильной группы посредством карбодиимида и связывали с антителом непосредственно через его аминогруппу с образованием пептидной связи. Эта методика был недавно использована (Garcia et al Oncogene 2012; doi: 10.1038/onc.2012.283) для связывания таксола с моноклональным антителом против герцептина. Результаты экспериментов показывают, что конъюгат активен в экспериментальных опухолях, что в свою очередь показывает, что лекарственное средство высвобождается in vivo.
Паклитаксел также конъюгировали с антителами после сукцинилирования паклитаксела по положению 2' и связывания с антителами посредством амидной связи (Safavy et al. 2003; Bioconj Chem 14, 302-310).
Похожие методы использовали для конъюгирования активированного 2'-глутарил- или 2'сукцинилпаклитаксела с тетрапептидом PhAc-ALGP; в качестве альтернативы, использовали самоуничтожающийся спейсер, присоединенный по карбоксильной группе сукцинилпаклитаксела. Разумно ожидать высвобождение таксола из конъюгата PhAc-ALGP-паклитаксел in vivo, конечно, принимая во внимание, что тетрапептид является гораздо меньшей стерический преградой, чем антитела. Стабильность сукцинилсвязанного конъюгата пролекарства в крови может стать проблемой, учитывая эфирную природу сукцинильной группы паклитаксела. Поэтому может быть предпочтительным использовать самоуничтожающуюся группу между углеродом в положении 2' и тетрапептидом. Эти методы конъюгирования могут быть также применены к доцетакселу с учетом неизмененного углерода в положении 2'. Паклитаксел коммерчески доступен (например, в Hulang Pharmaceutical, Tradelndia).
4. PhAc-ALGP-камптотецин.
Камптотецин (СРТ; структура приведена ниже) представляет собой цитотоксический хинолиновый алкалоид, который ингибирует фермент ДНК-топоизомеразу I (Topol). СРТ показал заметную противо раковую активность в предварительных клинических испытаниях, но ему присущи недостатки, заключающиеся в низкой растворимости и (сильной) нежелательной реакции на данное лекарственное средство. Из-за этих недостатков химики, специализирующиеся на синтезе и соединениях для медицины, разработали многочисленные способы синтеза камптотецина и его различных производных. В настоящее время были одобрены и используются в химиотерапии рака два аналога СРТ: топотекан и иринотекан.
Исследования показали, что замещение в положении 7, 9, 10 и 11 может иметь положительный эффект на активность СРТ и его физические свойства, например активность и метаболическую стабильность. Расширение лактонового кольца одним метиленовым звеном также повышает возможности СРТ, как и гомокамптотецина. При замещении в положении 12 и 14 образуются неактивные производные.
- 34 034046
Бюрке и др. (Burke et al.), 2009 (Bioconjug Chem 20, 1242-1250), описали конструкцию и синтез конъюгатов антител и аналогов камптотецина. 7-Бутил-10-аминокамптотецин и 7-бутил-9-амино-10,11метилендиоксикамптотецин являются в 10-1000- раз более активными, чем камптотецин и могут быть связаны с антителами посредством пептидного линкера с самоустраняющимся спейсером, высвобождая лекарственные средства в присутствии лизосомальных ферментов. Для получения конъюшата камптотецина или его производного с PhAc-ALGP возможно применение аналогичной методики. Камптотецин коммерчески доступен (например, в Calbiochem, Seeboo Dhakhwa).
5. PhAc-ALGP-винбластин и PhAc-ALGP-винкристин.
Винбластин (структура изображена ниже) представляет собой направленное против микротрубочек лекарственное средство, применяемое для лечения некоторых видов рака, включая лимфому Ходжкина, немелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, рак головы и шеи и рак яичек. Он также используется для лечения гистиоцитоза клеток Лангерганса. Винбластина традиционно получают из растения Catharanthus roseus, также известного как винка розовая или мадагаскарский барвинок. Он образуется в растении путем соединения алкалоидов катарантина и виндолина.
ОН
/
В очень низких концентрациях он подавляет динамику микротрубочек, а в более высоких концентрациях он снижает массу полимеров микротрубочек. Распространенными побочными эффектами является низкое число белых и красных кровяных телец в крови, и временно может снижаться количество тромбоцитов.
Винкристин является близким аналогом, отличающимся от винбластина только наличием СНО вместо СН3 при N1. Несмотря на то, что винкристин очень похож на винбластин по структуре, он имеет другие терапевтические показания, а также вызывает очень серьезный побочный эффект. Основными показаниями для его применения являются неходжкинская лимфома, острый лимфобластный лейкоз, и он показан для лечения нефробластомы (опухоли Вильмса, опухоль почек, наиболее часто встречающаяся у маленьких детей). Основными побочными эффектами винкристина являются периферическая нейропатия, гипонатриемия, запор и потеря волос. Периферическая нейропатия может быть тяжелой и может быть причиной того, чтобы избегать, уменьшить или прекратить применение винкристина.
Конъюгаты PhAc-ALGP-винбластин или -винкристин могут быть получены путем связывания дезацетилвинбластина или -винкристина посредством самоуничтожающегося спейсера, присоединенного по их углеродному атому C4.
Кандакури и др. (Kandukuri et al.), 1985 (J Med Chem 28, 1079-1088), разработали способ синтеза аминокислотных производных винбластина, в которых используется амидная связь с боковой цепью на карбоксильном конце аминокислоты. Данную связь получали путем смешанной ангидридной конденсации ^-деацетилвинбластина и N-малеоиламинокислот; винбластин-малеоилы C4 аминокислот также конъюгировали с лактозаминированным сывороточным альбумином, и было показано, что они активны в отношении карциномы HepG2 (Rao et al. 1989; Anticancer Res 9, 973-979). Логически такая же методика применима к винкристину. Конъюгирование винбластина или винкристина с PhAc-ALGP также можно обеспечить с помощью этого метода. Последние конъюгаты имеют лучший профиль безопасности, чем неконъюгированный винбластин или винкристин, при сохранении противораковой активности. Винбластин коммерчески доступен (например, в Medkoo Biosciences), также как и винкристин (например, в Tocris Bioscience, Medkoo Biosciences).
6. PhAc-ALGP-метотрексат и PhAc-ALGP-аминоптерин.
Метотрексат представляет собой антиметаболит и антифолатное лекарственное средство. Его применяют для лечения рака и аутоиммунных заболеваний.
- 35 034046
Сходство в структуре дигидрофолиевой кислоты (вверху) и метотрексата (внизу) предполагает, что метотрексат является конкурентным ингибитором дигидрофолиевой кислоты.
Метотрексат был первоначально разработан для химиотерапии, и его продолжают использовать для химиотерапии либо отдельно, либо в сочетании с другими агентами. Он эффективен для лечения ряда раковых заболеваний, включающих: рак молочной железы, рак головы и шеи, лейкоз, лимфому, новообразования легких, остеосаркому, новообразования мочевого пузыря и трофобластные новообразования. Наиболее распространенные нежелательные эффекты включают: язвенный стоматит, низкое содержание белых кровяных телец в крови и, следовательно, предрасположенность к инфекции, тошнота, боль в животе, усталость, лихорадка, головокружение и острую пневмонию.
Метотрексат, как полагают, действует на рак и ревматоидный артрит двумя различными путями. В случае рака, метотрексат аллостерически ингибирует дигидрофолатредуктазу (DHFR), фермент, который участвует в синтезе тетрафолата. Сродство метотрексата по отношению к DHFR примерно в 1000 раз больше, чем у фолата. DHFR катализирует превращение дигидрофолата в активный тетрагидрофолат. Метотрексат, следовательно, ингибирует синтез ДНК, РНК, тимидилатов и белков. В случае лечения ревматоидного артрита, ингибирование DHFR не считается основным механизмом, в то время как основными механизмами считаются ингибирование ферментов, участвующих в метаболизме пуринов, приводящее к накоплению аденозина, или ингибирование активации Т-клеток и подавление экспрессии молекулы межклеточной адгезии Т-клетками.
Умемото и др. (Umemoto et al.), 1989 (Int J Cancer 43, 677-684), описали способ связывания метотрексата через свободную карбоксильную группу с антителами посредством линкера Ala-Leu-Ala-Leu. Данный способ может быть аналогичным образом применен для связывания метотрексата с пептидом PhAcALGP и будет обеспечивать восстановление свободной карбоксильной группы после ферментативного расщепления. Производные по альфа-карбоксилатной группе являются относительно неактивными и нетоксичными in vitro, поскольку свободная альфа-карбоксилатная группа необходима для связывания метотрексата с DHFR.
Также были получены потенциальные пролекарства метотрексата, в которых 2-аминогруппа ацилирована альфа-аминокислотами (Smal et al. 1995; Biochemical Pharmacology 49, 567-574). Эти аминоацильные производные по 2-NH2 птеридинового кольца метотрексата. Важно отметить, что производное 2лейцилметотрексат быстро расщепляется и активируется в присутствии сыворотки, что иллюстрирует чувствительность к сывороточным экзопротеазам. Это делает правдоподобным то, что конъюгат PhAcALGP-метотрексат демонстрирует опухолеспецифичность противораковую активность. Связывание метотрексата с PhAc-ALGP производят посредством вышеописанной методики. Метотрексат является коммерчески доступным (например, CF Pharma Ltd, Yaskika Pharmaceuticals).
Аминоптерин (4-аминоптероевая кислота), 4-аминоаналог фолиевой кислоты, представляет собой антинеопластическое лекарственное средство с иммунодепрессивными свойствами. Аминоптерин представляет собой синтетическое производное птерина. Аминоптерин функционирует в качестве ингибитора ферментов путем конкуренции за фолатсвязывающий сайт фермента дигидрофолатредуктазы. Структура аминоптерина очень похожа на структуру метотрексата и он тоже содержит 2-NH2 при его птеридиновом фрагменте. Аминоптерин был разработан до метотрексата, и его заменили последним в 1950-е изза того, что его токсичность была больше, чем можно было ожидать от его большей активности. Большая эффективность была недавно подтверждена для лечения острого лейкоза (Cole et al. 2005; Clin Cancer Res 11, 8089-8096). Конъюгат PhAc-ALGP-аминоптерин может быть синтезирован способами, описанными для PhAc-ALGP-метотрексата, и повышенная специфичность данной противораковой активности в отношении опухолевых клеток аналогичным образом оправдана. Аминоптерин коммерчески доступен (например, в компании Cameo Chemicals, Sigma Aldrich).
7. PhAc-ALGP-Амрубицин.
Амрубицин (структура изображена ниже) представляет собой синтетический аналог антрациклина третьего поколения, который продемонстрировал существенную клиническую эффективность при лечении мелкоклеточного рака легкого. Амрубицин является мощным ингибитором топоизомеразы II и изучается в качестве монотерапии и в комбинации с протоивораковыми терапиями в отношении различных солидных опухолей, в том числе опухолей легких и молочной железы. Амрубицин был отнесен FDA к категории орфанных лекарственных средств.
.ОН 'ОН
Амрубицин представляет собой антрациклин, имеющий структурные отличия от доксорубицина. Тем не менее, он содержит NH2-группу при его тетрациклиновом кольце. Побочные эффекты аналогичны побочным эффектам доксорубицина, и они представляют собой такие эффекты как нейтропения и
- 36 034046 тромбоцитопения. О хронической кардиотоксичности в качестве возможного побочного эффекта ничего не известно. Как указано для доксорубицина, конъюгирование PhAc-ALGP с данным антрациклином применимо. Наличие PhAc-ALGP увеличивает селективность противораковой активности амрубицина в отношении опухолевых клеток. Амрубицин коммерчески доступен (например, в компании Medkoo Biosciences, Santa Cruz Biotech).
8. Общие стадии тестирования конъюгатов PhAc-ALGP-цитотоксичное соединение in vitro и in vivo.
Синтез производных будет основан на способах, в целом описанных выше и более подробно описанных в ссылочных публикациях, указанных для каждого цитотоксического соединения.
На первой стадии дипептид GP конъюгируют с цитотоксическим соединением, и разработана аналитическая методика для обнаружения и/или количественного определения конъюгата GPцитотоксичное соединение, цитотоксичного соединения и промежуточных соединений между ними. Такая методология может включать одну или более из спектрофотометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), масс-спектрометрии (MS), комбинированных ВЭЖХ и МС, ЯМР и MALDITOF (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация - время прохождения) или даже СЭЖХМС/МС (сверхэффективная жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией).
Очищенный конъюгат GP-цитотоксичное соединение тестируют in vitro в биологической системе для подтверждения его цитотоксичности. Для конъюгатов GP-цитотоксичное соединение с подтвержденной токсичностью осуществляют синтез полного конъюгата PhAc-ALGP-цитотоксичное соединение, и разработана аналитическая методика для обнаружения и/или количественного определения конъюгата PhAc-ALGP-цитотоксичное соединение, цитотоксичного соединения и промежуточных соединений между ними.
Несмотря на то, химический синтез и разработка аналитической методики, как ожидается, будет рутинной, может быть желательно изучить возможные модификации первоначально предусмотренного способа синтеза или разработать новый способ синтеза, такой как, например, способ синтеза с повышением выхода и/или чистоты конъюгата пептид-лекарственное средство.
9. Стадии исследования in vitro.
9.1. Биологическое исследование in vitro GP-конъюгата цитотоксичного соединения.
Цитотоксическая активность исходного соединения (неконъюгированного, исходного лекарственного средства) и его конъюгированного производного (GP-лекарственного средства) будет исследована на клеточных линиях in vitro. Клеточные линии будут представлять собой по меньшей мере некоторые из упомянутых в указанных публикациях, приведенных выше в настоящем тексте для каждого из цитотоксических соединений. Необходимо проводить анализы в зависимости от концентрации лекарственного средства и времени инкубации. GP-лекарственное средство должно быть намного менее активным, чем исходное лекарственное средство, после коротких периодов инкубации. С увеличением времени инкубации эта разница может становиться менее значительной вследствие повышенного гидролиза GP-лекарственного средства под действием экзопротеаз, присутствующих в сыворотке, которая является частью инкубационной среды. В этом случае присутствие экзопротеаз в сыворотке может быть подтверждено, если это возможно, путем инкубации GP-лекарственного средства в бессывороточной инкубационной среде.
Более важным, однако, является анализ цитотоксичности GP-лекарственного средства до и после предварительной инкубации с очищенными пролилпептидазами FAP и/или DPIV. По аналогии с GPдоксорубицином, действие пролилпептидаз FAP и/или DPIV на GP-лекарственное средство должно значительно увеличивать цитотоксичность за счет высвобождения свободного лекарственного средства. Если результаты этого анализа положительны, выполняют синтез PhAc-ALGP-лекарственного средства. Если результаты отрицательны, это может являться следствием недоступности для ферментов связи пролин-лекарственное средство. Решение этой проблемы может заключаться во введении спейсера с доступной концевой МН2-группой между пролином и фрагментом лекарственного средства при условии, что такое производное сохраняет свой первоначальный цитотоксический эффект. Другим возможным решением будет введение самоуничтожающегося спейсера, который возвращает исходное лекарственное средство после гидролиза связи между конъюгатом лекарственное средство-спейсер и пролином. Один из возможных спейсеров этого типа представляет собой РАВС или РАВ (парааминобензилоксикарбонил), соединяющий фрагмент лекарственного средства с лигандом в конъюгате. Фрагмент линкера содержит пептидную последовательность, которая является субстратом для внеклеточного фермента, например, FAP, расщепляющего пептид по амидной связи. Пептид дополнительно содержит самоуничтожающийся фрагмент, который соединяет лекарственное средство и белковую последовательность пептида. При отщеплении пептидной последовательности под действием внутриклеточного фермента самоуничтожающийся фрагмент самостоятельно отщепляется от фрагмента лекарственного средства таким образом, что фрагмент лекарственного средства находится в недериватизированной и активной форме.
9.2. Биологическое исследование in vitro PhAc-ALGP-конъюгата цитотоксичного соединения.
После получения удовлетворяющего требованиям GP-пролекарства проводят анализ биологических свойств in vitro для соответствующего PhAc-ALGP-конъюгата цитотоксичного соединения. Этот анализ включает оценку in vitro цитотоксического действия на клетки первоначального неконъюгированного
- 37 034046 исходного лекарственного средства и его конъюгированного эквивалента-пролекарства. Сравнивают кривые зависимости доза-эффект для лекарственного средства и пролекарства. Ожидают, что пролекарство будет проявлять цитотоксичность, сопоставимую с таковой для неконъюгированного лекарственного средства.
Альтернативный эксперимент включает инкубацию PhAc-ALGP-пролекарства с очищенными CD10 и ТОР и анализ конверсии в GP-пролекарство; после одновременной инкубации PhAc-ALGPпролекарства с CD10, TOP, FAP и DPIV может быть проведен анализ степени конверсии PhAc-ALGPпролекарства в свободное лекарственное средство. Значительно высокие уровни конверсии в GPпролекарство и свободное лекарственное средство, соответственно, свидетельствуют о наличии цитотоксического эффекта PhAc-ALGP-пролекарства в клеточном/опухолевом окружении.
Обе описанные выше методологии также могут быть объединены: цитотоксичность по отношению к культивируемым in vitro клеткам продукта реакции PhAc-ALGP-пролекарства с очищенными CD10 и ТОР или PhAc-ALGP-пролекарства с CD10, TOP, FAP и DPIV или обоих продуктов можно сравнивать с цитотоксичностью свободного лекарственного средства.
9.3. Фармакодинамический анализ GP-конъюгатов цитотоксичного соединения и PhAc-ALGPконъюгатов цитотоксичного соединения in vitro.
Исследуют внутриклеточное поглощение (интенсивность поглощения) пролекарства до и после предварительной инкубации с протеазами, как описано выше. Для достижения этой цели может потребоваться введение подходящей метки в лекарственное средство и пролекарство (см. далее).
10. Стадии исследования in vivo PhAc-ALGP-конъюгата цитотоксичного соединения.
10.1. Определение максимально переносимой дозы (MTD).
В исследованиях in vivo сначала определяют MTD конъюгата пролекарства путем измерения снижения массы тела мышей, которым вводят возрастающие дозы пролекарства. Эти результаты сравнивают с MTD свободного цитотоксичного лекарственного средства. MTD определяют как дозу, которая вызывает снижение массы не более чем на 20 % от первоначальной массы животных.
На начальном этапе пролекарство и свободное лекарственное средство вводят в.в. путем 2 раза с интервалом 1 неделя, по возможности повторяют один или большее число раз. Исходя из описанного в настоящей заявке опыта с пролекарством доксорубицина, активация пролекарства in vivo может быть очень низкой (медленной). В этом случае MTD определяют на нормальных мышах и мышах с ксенотрансплантатами опухолей человека после в.б. инъекций дважды в день 2 раза по 5 дней. Альтернативно, возможна медленная инфузия пролекарств с применением осмотических или других программируемых мининасосов.
Влияние пролекарств на количество белых кровяных телец сравнивают с влиянием свободного лекарственного средства.
10.2. Химиотерапевтическая активность на иммунодефицитных мышах с привитыми опухолями человека.
Выбирают одну или две различные модели с ксенотрансплантатами опухолей человека на основании опубликованных данных, полученных для неконъюгированного/свободного цитотоксичного соединения. Пролекарство и свободное лекарственное средство вводят в.б. путем и определяют MTD, как описано выше. Массу тела и объем опухоли измеряют каждые два дня и сравнивают с результатами, полученными для свободного исходного лекарственного средства в его MTD.
Эту процедуру можно повторять на других типах опухолей человека, таких как лейкозы человека, на ортотопических ксенотрансплантатах опухолей человека на мышах SCID. Кроме наблюдения цитотоксического действия пролекарства и лекарственного средства на первичную опухоль, может быть определено влияние на метастазы.
10.3. Фармакокинетический анализ, распределение в опухоли и тканях PhAc-ALGP-конъюгатов цитотоксичного соединения.
За исключением, наверное, флуоресцентного лекарственного средства, такого как амрубицин, фармакокинетические исследования распределения в тканях лекарственного средства и пролекарства могут потребовать введения подходящей метки в лекарственное средство и пролекарство для достижения достаточной чувствительности для химических аналитических способов определения. Один тип метки представляет собой радиоактивную метку; соединения могут, например, быть помечены радиоактивным изотопом путем обмена на тритий или неосинтеза с применением С-14 меченных предшественников. Введение метки должны быть таким, что метка, или метка сохраняется в метаболитах пролекарства. Исследуют фармакокинетические параметры в плазме, а также накопление в опухоли конъюгированного лекарственного средства и его метаболитов в сочетании с распределением в органах и тканях.
Пример 17. Эффективность PhAc-ALGP-доксорубицина in vivo на модели с ксенотрансплантатом саркомы мягких тканей UZLX-STS3.
Из результатов эксперимента, представленных на фиг. 16-19, могут быть установлены несколько интересных свойств PhAc-ALGP-dox.
Объем опухоли.
В этом эксперименте эффект связывания доксорубицина с пептидом ALGP оценивали путем иссле- 38 034046 дования его активности в отношении устойчивой к доксорубицину липосаркомы. Настоящие результаты демонстрируют, что связывание доксорубицина с ALGP приводило к более высокой допустимой экспериментальной дозе. В связи с этим, даже в экспериментальной химиотерапии ксенотрансплантата устойчивой к доксорубицину саркомы PhAc-ALGP-dox был способен ограничивать рост ксенотрансплантата указанной устойчивой к доксорубицину липосаркомы. В этом исследовании группы мышей (n = 4 в обеих группах), в которых каждая мышь имела две опухоли, обрабатывали соответственно физиологическим раствором (контрольная группа), обрабатывали доксорубицином (группа, получавшая доксорубицин) и обрабатывали PhAc-ALGP-dox (группа, получавшая PhAc-ALGP-dox). Между 0-м днем и 21-м днем лечения как в контрольной (n = 7), так и в получавшей доксорубицин (n = 8) группах мышей с опухолями наблюдали постоянный рост объема опухоли до 258% (р = 0,018) и 246% (р = 0,012), соответственно. С другой стороны, мыши с опухолью, получавшие PhAc-ALGP-dox, обнаруживали стабилизацию объема опухоли на уровне 105% (фиг. 16). Задержка роста объема опухоли у мышей, получавших PhAcALGP-dox (n = 6), была статистически значимой на 21-й день по сравнению с контрольной группой (р = 0,003) или с группой, получавшей доксорубицин (р = 0,002).
Наблюдаемый эффект PhAc-ALGP-dox может отчасти быть объяснен непрерывным 7-дневным введением лекарственного средства через мининасос.
Второе и представляющее больший интерес объяснение заключается в вероятно более интенсивном высвобождении доксорубицина в строме опухоли, чем после введения свободного доксорубицина (который можно вводить лишь в значительно меньшей дозе).
Цитостатическиое и цитотоксическое действие высвобожденного доксорубицина на стромальные клетки может, в свою очередь, сильно влиять на рост раковых клеток. Это действие на стромальные клетки также может объяснить стабилизирующее влияние на объем опухолей в течение 21 дня без уменьшения их объема. Продолженное наблюдение после 21-го дня, возможно в сочетании с повторным введением с применением, например, различных переносящих сред, влияющих на высвобождение активного лекарственного средства, может синергически приводить к уменьшению объема опухоли (после разрушения всех опухолевых стромальных клеток).
Масса тела.
В течение всего эксперимента осуществляли мониторинг массы тела и общего состояния мышей. Подробный график, отображающий изменение массы тела, представлен на фиг. 17 (контрольная группа: n = 4; группа, получавшая PhAc-ALGP-dox: n = 3; группа, получавшая доксорубицин: n = 4). Не наблюдалось серьезных побочных эффектов, и в целом масса тела животных не падала ниже допустимого значения (снижение массы во время лечения на 20% по отношению к исходной массе тела). Одна мышь из группы, получавшей PhAc-ALGP-dox, была умерщвлена по этическим причинам на 13 день (масса тела 79,8%, истощение животного с 11 -го дня, во время вскрытия был обнаружен ограниченный асцит в брюшной полости, вероятно, из-за инфекции вследствие хирургической имплантации мининасоса).
Подсчет общего количества белых кровяных телец и подсчет общего количества нейтрофилов.
Существенных изменений общего количества белых кровяных телец и нейтрофилов у мышей, получавших PhAc-ALGP-dox, по сравнению с контрольными животными или животными, получавшими доксорубицин (фигуры 18 и 19, соответственно; контрольная группа: n = 4; группа, получавшая PhAcALGP-dox: n = 3; группа, получавшая доксорубицин: n = 4) не наблюдалось. Нейтропения представляет собой один из наиболее значимых токсических побочных эффектов от лечения свободным доксорубицином. Таким образом, неизмененное количество нейтрофилов через 21 день после введения PhAc-ALGPдоксорубицина в дозе, в 40 раз превышающей дозу свободного доксорубицина, является с клинической точки зрения весьма перспективным новым экспериментальным результатом.

Claims (13)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Пролекарство, имеющее общую структуру:
    [Cx-0P]y-D, где C представляет собой кэпирующую группу, при этом указанная кэпирующая группа C представляет собой фосфоноацетильную группу;
    OP представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO: 1), TSGP (SEQ ID NO: 4) или KLGP (SEQ ID NO: 6);
    D представляет собой противоопухолевое лекарственное средство;
    х представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у=1;
    у представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1; и причем связь между C и OP и связь между OP и D являются непосредственными или осуществляются посредством линкера или спейсерной группы;
    при этом, если у больше 1, множество фрагментов ОР индивидуально связаны друг с другом непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы и/или индивидуально связаны с D непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы, и при этом по меньшей мере 1 OP содержит кэпирующую группу C;
    - 39 034046 или его фармацевтически приемлемая соль.
  2. 2. Пролекарство или его соль по п.1, где указанное лекарственное средство D представляет собой доксорубицин, даунорубицин, амрубицин, винбластин, винкристин, калихеамицин, этопозид, этопозида фосфат, CC-1065, дуокармицин, KW 20 2189, метотрексат, метоптерин, аминоптерин, дихлорметотрексат, доцетаксел, паклитаксел, эпотилон, комбретастатин, комбретастатина А4 фосфат, доластатин 10, доластатин 11, доластатин 15, топотекан, камптотецин, митомицин C, порфиромицин, 5-фторурацил, 6меркаптопурин, флударабин, тамоксифен, цитозинарабинозид, аденозинарабинозид, колхицин, галихондрин B, цисплатин, карбоплатин, митомицин C, блеомицин, мелфалан, хлорохин, циклоспорин A или майтансин.
  3. 3. Пролекарство или его соль по любому из пп.1-2, где указанное лекарственное средство D пегилировано.
  4. 4. Пролекарство или его соль по любому из пп.1-3, где указанное пролекарство представляет собой соединение I
  5. 5. Фармацевтическая композиция, содержащая пролекарство или его соль по любому из пп.1-4.
  6. 6. Применение пролекарства или его соли по любому из пп.1-4 для лечения рака.
  7. 7. Способ получения пролекарства по любому из пп.1-4, включающий стадии:
    (i) обеспечения лекарственного средства;
    (ii) связывания указанного лекарственного средства с кэпированным олигопептидным фрагментом с получением пролекарства; и (iii) очистки указанного пролекарства, полученного на стадии (ii);
    где указанный олигопептидный фрагмент представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO: 1), TSGP (SEQ ID NO: 4) или KLGP (SEQ ID NO: 6).
  8. 8. Способ получения пролекарства по любому из пп.1-4, включающий стадии:
    (i) обеспечения лекарственного средства;
    (ii) связывания указанного лекарственного средства с олигопептидным фрагментом с последующим связыванием кэпирующей группы с олигопептидным фрагментом с получением пролекарства; и (iii) очистки пролекарства, полученного на стадии (ii);
    где указанный олигопептидный фрагмент представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO: 1), TSGP (SEQ ID NO: 4) или KLGP (SEQ ID NO: 6).
  9. 9. Способ выбора пролекарства-кандидата, имеющего общую структуру:
    [Cx-OP]y-D, где C представляет собой кэпирующую группу, при этом указанная кэпирующая группа C представляет собой фосфоноацетильную группу;
    OP представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO: 1), TSGP (SEQ ID NO: 4) или KLGP (SEQ ID NO: 6);
    D представляет собой лекарственное средство;
    х представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у=1;
    у представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1; и причем связь между C и OP и связь между OP и D являются непосредственными или осуществляются посредством линкера или спейсерной группы;
    при этом, если у больше 1, множество фрагментов OP индивидуально связаны друг с другом непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы и/или индивидуально связаны с D непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы, причём по меньшей мере 1 OP содержит кэпирующую группу C;
    где указанный способ включает стадии:
    (i) обеспечения лекарственного средства D;
    (ii) конъюгирования указанного лекарственного средства D с [Cx-OP]y с получением пролекарства [Cx-OP]y-D;
    (iii) приведения каждого из лекарственного средства D и указанного пролекарства [^-OP]y-D независимо в контакт с культивируемыми in vitro клетками; (iv) определения цитотоксичности лекарственного средства D и указанного пролекарства [Cx-OP]yD;
    (v) идентификации по данным (iv) пролекарства [Cx-OP]y-D с цитотоксической активностью, сопоставимой с цитотоксической активностью лекарственного средства D; и (vi) выбора пролекарства [Cx-OP]y-D, идентифицированного на стадии (v), в качестве пролекарства
    - 40 034046 кандидата.
  10. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанное лекарственное средство D представляет собой доксорубицин, даунорубицин, амрубицин, винбластин, винкристин, калихеамицин, этопозид, этопозида фосфат, CC-1065, дуокармицин, KW 20 2189, метотрексат, метоптерин, аминоптерин, дихлорметотрексат, доцетаксел, паклитаксел, эпотилон, комбретастатин, комбретастатина А4 фосфат, доластатин 10, доластатин 11, доластатин 15, топотекан, камптотецин, митомицин C, порфиромицин, 5-фторурацил, 6меркаптопурин, флударабин, тамоксифен, цитозинарабинозид, аденозинарабинозид, колхицин, галихондрин B, цисплатин, карбоплатин, митомицин C, блеомицин, мелфалан, хлорохин, циклоспорин A или майтансин.
  11. 11. Набор для направленной доставки в опухоль, содержащий емкость, содержащую пролекарство или его соль по любому из пп.1-4 или композицию по п.5.
  12. 12. Пролекарство, имеющее общую структуру:
    [Cx-OP]y-D, где C представляет собой кэпирующую группу, при этом указанная кэпирующая группа C представляет собой фосфоноацетильную группу;
    OP представляет собой тетрапептид, имеющий последовательность ALGP (SEQ ID NO: 1), TSGP (SEQ ID NO: 4) или KLGP (SEQ ID NO: 6);
    D представляет собой лекарственное средство;
    х представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1, если у=1;
    у представляет собой целое число, составляющее по меньшей мере 1; и причем связь между C и OP и связь между OP и D являются непосредственными или осуществляются посредством линкера или спейсерной группы;
    при этом, если у больше 1, множество фрагментов OP индивидуально связаны друг с другом непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы и/или индивидуально связаны с D непосредственно или посредством линкера или спейсерной группы, и при этом по меньшей мере 1 OP содержит кэпирующую группу C;
    или его фармацевтически приемлемая соль, причём указанное пролекарство предназначено для высвобождения лекарственного средства D в непосредственной близости к опухоли или опухолеассоциированным клеткам.
  13. 13. Пролекарство или его соль по п.12, где указанное лекарственное средство D представляет собой доксорубицин, даунорубицин, амрубицин, винбластин, винкристин, калихеамицин, этопозид, этопозида фосфат, CC-1065, дуокармицин, KW 20 2189, метотрексат, метоптерин, аминоптерин, дихлорметотрексат, доцетаксел, паклитаксел, эпотилон, комбретастатин, комбретастатина A4 фосфат, доластатин 10, доластатин 11, доластатин 15, топотекан, камптотецин, митомицин C, порфиромицин, 5-фторурацил, 6меркаптопурин, флударабин, тамоксифен, цитозинарабинозид, аденозинарабинозид, колхицин, галихондрин B, цисплатин, карбоплатин, митомицин C, блеомицин, мелфалан, хлорохин, циклоспорин A или майтансин.
EA201590863A 2012-12-28 2013-12-27 Олигопептидные пролекарства с фосфоноацетильной кэпирующей группой EA034046B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261746621P 2012-12-28 2012-12-28
PCT/EP2013/078034 WO2014102312A2 (en) 2012-12-28 2013-12-27 Minimally toxic prodrugs

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201590863A1 EA201590863A1 (ru) 2015-11-30
EA034046B1 true EA034046B1 (ru) 2019-12-23

Family

ID=49955306

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201590863A EA034046B1 (ru) 2012-12-28 2013-12-27 Олигопептидные пролекарства с фосфоноацетильной кэпирующей группой

Country Status (12)

Country Link
US (4) US10076576B2 (ru)
EP (1) EP2938360B1 (ru)
JP (3) JP6523965B2 (ru)
CN (2) CN104884091B (ru)
AU (1) AU2013369261B2 (ru)
CA (1) CA2896337C (ru)
DK (1) DK2938360T3 (ru)
EA (1) EA034046B1 (ru)
ES (1) ES2759999T3 (ru)
HK (1) HK1210043A1 (ru)
PL (1) PL2938360T3 (ru)
WO (1) WO2014102312A2 (ru)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2938360T3 (pl) 2012-12-28 2020-05-18 Cobiores Nv Minimalnie toksyczne proleki
US20140364368A1 (en) * 2013-06-06 2014-12-11 Massachusetts Institute Of Technology Stimulus responsive nanocomplexes and methods of use thereof
EP4299134A3 (en) 2014-06-13 2024-03-27 Bach Biosciences, LLC Fap-activated therapeutic agents, and uses related thereto
US9737556B2 (en) 2014-06-13 2017-08-22 Trustees Of Tufts College FAP-activated therapeutic agents, and uses related thereto
JP7224583B2 (ja) 2018-01-29 2023-02-20 日本メナード化粧品株式会社 ガレクチン－９産生促進剤
CN109456390B (zh) * 2018-12-27 2021-11-16 西华师范大学 一种人工合成多肽h-473及其应用
WO2022043256A1 (en) 2020-08-23 2022-03-03 Cobiores Nv Synergistic combinations of anticancer drugs linked to a tetrapeptidic moiety and immunotherapeutic agents
AU2021405744A1 (en) 2020-12-22 2023-08-03 Cobiores Nv Compounds comprising a tetrapeptidic moiety
CN112940248B (zh) * 2021-02-04 2023-07-18 西安交通大学 一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子及其制备方法
WO2022167664A1 (en) 2021-02-07 2022-08-11 Cobiores Nv Compounds comprising a tetrapeptidic moiety

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995029691A1 (en) * 1994-04-28 1995-11-09 Georgia Tech Research Corporation Proline phosphonate derivatives
WO1997034927A1 (en) * 1996-03-18 1997-09-25 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated dimeric fibroblast activation protein alpha, and uses thereof
WO2000033888A2 (en) * 1998-12-11 2000-06-15 Coulter Pharmaceutical, Inc. Prodrug compounds and process for preparation thereof
WO2000071571A2 (en) * 1999-05-14 2000-11-30 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Fap-activated anti-tumor compounds
WO2002038590A1 (en) * 2000-11-10 2002-05-16 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Fap-alpha-activated anti-tumor compounds
US20030138432A1 (en) * 1999-11-15 2003-07-24 Drug Innovation & Design, Inc. Selective cellular targeting: multifunctional delivery vehicles, multifunctional prodrugs, use as antineoplastic drugs
WO2003064454A1 (en) * 2002-01-30 2003-08-07 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co Kg Fap-activated anti-tumor compounds
US20060281897A1 (en) * 2003-08-22 2006-12-14 Andre Trouet Potentialization of the activation of high molecular weight prodrugs
WO2008116053A2 (en) * 2007-03-20 2008-09-25 Trustees Of Tufts College Fap-activated chemotherapeutic compounds, and methods of use thereof
WO2008120098A2 (en) * 2007-04-03 2008-10-09 Diatos Peptide prodrugs
WO2008142513A2 (en) * 2007-05-18 2008-11-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Phosphate-modified oligonucleotide analogs with immunostimulatory activity

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7425541B2 (en) 1998-12-11 2008-09-16 Medarex, Inc. Enzyme-cleavable prodrug compounds
US7399869B2 (en) 2005-05-19 2008-07-15 Genentech, Inc. Fibroblast activation protein inhibitor compounds and methods
WO2008015597A1 (en) * 2006-08-04 2008-02-07 Firmenich Sa Keto-esters as flavoring ingredients
ITTO20060852A1 (it) * 2006-11-30 2008-06-01 Univ Degli Studi Torino Peptidi metastasi-specifici e loro applicazioni diagnostiche e terapeutiche
PL2938360T3 (pl) 2012-12-28 2020-05-18 Cobiores Nv Minimalnie toksyczne proleki

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995029691A1 (en) * 1994-04-28 1995-11-09 Georgia Tech Research Corporation Proline phosphonate derivatives
WO1997034927A1 (en) * 1996-03-18 1997-09-25 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated dimeric fibroblast activation protein alpha, and uses thereof
WO2000033888A2 (en) * 1998-12-11 2000-06-15 Coulter Pharmaceutical, Inc. Prodrug compounds and process for preparation thereof
WO2000071571A2 (en) * 1999-05-14 2000-11-30 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Fap-activated anti-tumor compounds
US20030138432A1 (en) * 1999-11-15 2003-07-24 Drug Innovation & Design, Inc. Selective cellular targeting: multifunctional delivery vehicles, multifunctional prodrugs, use as antineoplastic drugs
WO2002038590A1 (en) * 2000-11-10 2002-05-16 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Fap-alpha-activated anti-tumor compounds
WO2003064454A1 (en) * 2002-01-30 2003-08-07 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co Kg Fap-activated anti-tumor compounds
US20060281897A1 (en) * 2003-08-22 2006-12-14 Andre Trouet Potentialization of the activation of high molecular weight prodrugs
WO2008116053A2 (en) * 2007-03-20 2008-09-25 Trustees Of Tufts College Fap-activated chemotherapeutic compounds, and methods of use thereof
WO2008120098A2 (en) * 2007-04-03 2008-10-09 Diatos Peptide prodrugs
WO2008142513A2 (en) * 2007-05-18 2008-11-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Phosphate-modified oligonucleotide analogs with immunostimulatory activity

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANIEL GIGOT, MICHEL PENNINCKX: "New compounds: Peptide derivatives of the antitumor agentN-phosphonoacetyl-l-aspartic acid", JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY AND AMERICAN PHARMACEUTICAL ASSOCIATION, vol. 73, no. 2, 1 February 1984 (1984-02-01), pages 275 - 277, XP055124353, ISSN: 00223549, DOI: 10.1002/jps.2600730237 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104884091A (zh) 2015-09-02
WO2014102312A2 (en) 2014-07-03
AU2013369261A1 (en) 2015-06-11
EP2938360A2 (en) 2015-11-04
HK1210043A1 (en) 2016-04-15
CN113476616A (zh) 2021-10-08
DK2938360T3 (da) 2019-11-25
US20160058880A1 (en) 2016-03-03
US10076576B2 (en) 2018-09-18
US20240123074A1 (en) 2024-04-18
PL2938360T3 (pl) 2020-05-18
ES2759999T3 (es) 2020-05-12
US20190175740A1 (en) 2019-06-13
US20200215196A1 (en) 2020-07-09
CA2896337A1 (en) 2014-07-03
JP2019055966A (ja) 2019-04-11
CA2896337C (en) 2022-08-23
JP2021073242A (ja) 2021-05-13
JP2016509586A (ja) 2016-03-31
JP6523965B2 (ja) 2019-06-05
WO2014102312A3 (en) 2014-08-21
US10583194B2 (en) 2020-03-10
EP2938360B1 (en) 2019-09-11
CN104884091B (zh) 2021-07-20
AU2013369261B2 (en) 2018-08-09
EA201590863A1 (ru) 2015-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240123074A1 (en) Minimally toxic prodrugs
KR102422174B1 (ko) 악성 종양 표적 펩티드
JP2003518000A (ja) プロドラッグ化合物およびその調製方法
JPH10508291A (ja) 化合物、製剤用組成物及びこれらを含む診断装置とこれらの利用
US10100083B2 (en) Leukemia stem cell targeting ligands and methods of use
KR20200088402A (ko) 카텝신 b의 엑소펩티다제 활성에 의한 선택적인 절단의 기질로서 리간드-약물-접합체
JP7436710B2 (ja) 新規のヌクレオリン－結合ペプチド及びその用途
US20240299562A1 (en) Compounds comprising a tetrapeptidic moiety
CN111233975A (zh) 可靶向整合素的多肽mn及其在制备肿瘤靶向药物中的应用
WO2022167664A1 (en) Compounds comprising a tetrapeptidic moiety
Allred Development of a Lung Cancer Targeting Peptide for Imaging and Drug Delivery
WO2024215985A1 (en) Compositions and methods for an antibody drug conjugate directed to a non-cell surface therapeutic target
CN117320756A (zh) 用于靶向癌干细胞的方法和结合分拣蛋白的缀合化合物

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): KG TM