CN117320756A - 用于靶向癌干细胞的方法和结合分拣蛋白的缀合化合物 - Google Patents

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CN117320756A
CN117320756A CN202280030621.7A CN202280030621A CN117320756A CN 117320756 A CN117320756 A CN 117320756A CN 202280030621 A CN202280030621 A CN 202280030621A CN 117320756 A CN117320756 A CN 117320756A
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cancer
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R·贝利沃
M·德梅勒
B·阿纳比
C·查菲
A·拉罗克
J-C·柯里
A·兹格海布
C·马索莱斯
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Theratechnologies Inc
Transfert Plus SC
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Theratechnologies Inc
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Abstract

本申请涉及包含抗肿瘤剂(例如，化疗剂)与靶向表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)的肽化合物缀合的缀合物在诸实施方案中用于治疗标准抗肿瘤疗法难治的与存在表达分拣蛋白的CSC相关的预后不良癌和用于预防或治疗癌复发或再发的方法和用途。

Description

用于靶向癌干细胞的方法和结合分拣蛋白的缀合化合物
相关申请的交叉引用
本发明要求2021年2月26日提交的美国临时专利申请系列号63/200,284和2021年11月16日提交的美国临时专利申请系列号63/264,105的权益，所述文献通过引用方式并入本文作为参考。
序列表
本申请含有计算机可读取形式的序列表，所述序列表名为“G11718-00423_SeqList_ST25.txt”，于2022年2月24日创建并且具有约17kB大小。该计算机可读取形式通过引用方式并入本文作为参考。
技术领域
本公开总体上涉及肿瘤学领域，并且更具体地涉及靶向癌干细胞(cancer stemcells，CSC)的化合物和方法及其用途。
背景技术
根据最近的一份世界卫生组织报告，2012年八百二十万名患者死于癌症。癌症因此是发展中国家和发达国家中持续增长的健康问题。还已经估计年度癌症病例数将在下两个十年内增加。癌症的常见总体治疗是手术、内分泌疗法、化疗、免疫疗法和放疗。
归因于全部这些治疗，癌症发生率已经在女性中稳定并且最近数年(2006-2015)期间在男性中略降，并且癌症死亡率(2007-2016)也下降。但是，传统的癌症治疗方法仅对一些恶性肿瘤有效。癌症治疗失败的主要原因是转移、再发、异质性、抵抗化疗和放疗及逃避免疫监视。近来，现有的全部癌症治疗重点在于肿瘤减体积，而没有靶向肿瘤中最危险的细胞：癌干细胞(CSC)。CSC是癌细胞遍及身体扩散、肿瘤生长、癌抵抗化疗和治疗或手术摘除后肿瘤再发的原因，尤其借助CSC停滞于G0期的能力，产生新肿瘤所致。因为现行治疗并不靶向CSC群体，故它们往往导致耐药性肿瘤出现及癌持续扩散。因此，CSC可以视为最有前景的癌症治疗靶。
因此需求形成治疗癌症和更具体地与CSC相关的癌症的策略，例如旨在克服肿瘤对癌症疗法的抵抗性，并且防止/治疗癌复发及在癌症患者中改善存活。
本说明书涉及许多文件，所述文件的内容通过引用的方式完整并入本文作为参考。
发明概述
本发明公开了用于靶向癌干细胞的产品(例如，化合物)及其方法与用途，以及相关的用途。
在多个方面和实施方案中，本公开提供以下项：
1.一种用于治疗受试者中包含表达分拣蛋白(Sortilin)的癌干细胞(CSC)的癌的方法，包括向受试者施用有效量的缀合化合物或其可药用盐，其中缀合化合物具有式A-(B)n，其中
A是30个或更少残基的肽化合物，所述肽化合物包含与式(I)-(XIII)的序列之一具有至少60％序列同一性的氨基酸序列：
X1X2X3X4X5GVX6AKAGVX7NX8FKSESY(I)(SEQ ID NO：1)
(X9)nGVX10AKAGVX11NX12FKSESY(II)(SEQ ID NO：2)
YKX13LRRX14APRWDX15PLRDPALRX16X17L(III)(SEQ ID NO：3)
YKX18LRR(X19)NPLRDPALRX20X21L(IV)(SEQ ID NO：4)
IKLSGGVQAKAGVINMDKSESM(V)(SEQ ID NO：5)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESY(VI)(SEQ ID NO：6)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESYK(VII)(SEQ ID NO：7)
GVQAKAGVINMFKSESY(VIII)(SEQ ID NO：8)
GVRAKAGVRNMFKSESY(IX)(SEQ ID NO：9)
GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY(X)(SEQ ID NO：10)
YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL(XI)(SEQ ID NO：11)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRQLL(XII)(SEQ ID NO：12)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRPLL(XIII)(SEQ ID NO：13)
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X18和X19独立地选自任何氨基酸：
X16、X17、X20和X21独立地选自Q、P、Y、I和L；
n是0、1、2、3、4或5：
当X9存在多于一次时，所述X9每者独立地选自任何氨基酸；
当X19存在多于一次时，所述X19每者独立地选自任何氨基酸，
任选地，肽化合物为环状，
B是至少一种抗肿瘤剂，其中B直接或经接头连接于A。
2.项1的方法，其中肽化合物具有与式(I)-(XIII)的序列之一具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
3.项1或2的方法，其中肽化合物包含式(I)-(XIII)的序列之一，并且还在其氨基末端和/或羧基末端包含1至3个额外的氨基酸。
4.项3的方法，其中肽化合物在其氨基末端和/或羧基末端包含半胱氨酸残基。
5.项1的方法，其中肽化合物由式(I)所代表并且具有由SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
6.项1的方法，其中肽化合物由式(III)所代表并且具有由SEQ ID NO：3或4的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
7.项1的方法，其中肽化合物由式(V)所代表并且具有由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
8.项1的方法，其中肽化合物由式(VI)所代表并且具有由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
9.项1的方法，其中肽化合物由式(VII)所代表并且具有由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
10.项1的方法，其中肽化合物由式(VIII)所代表并且具有由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
11.项1的方法，其中肽化合物由式(IX)所代表并且具有由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
12.项1的方法，其中肽化合物由式(X)所代表并且具有由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
13.项1的方法，其中肽化合物由式(XI)所代表并且具有由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
14.项1的方法，其中肽化合物由式(XII)所代表并且具有由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
15.项1的方法，其中肽化合物由式(XIII)所代表并且具有由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
16.根据项1至15中任一者的方法，其中肽化合物在其氨基末端和/或羧基末端包含至少一个修饰基团。
17.项16的方法，其中至少一个修饰基团是乙酰基或琥珀酰基。
18.项1的方法，其中肽化合物由式(XXXVIII)、(XXXIX)、(XL)、(XLI)或(XLII)所代表：
乙酰基-GVRAKAGVRNMFKSESY(XXXVIII)(SEQ ID NO：14)
乙酰基-GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY(XXXIX)(SEQ ID NO：15)
乙酰基-YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL(XL)(SEQ ID NO：16)
乙酰基-YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRQLL(XLI)(SEQ ID NO：17)
乙酰基-YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRPLL(XLII)(SEQ ID NO：18)。
19.根据项1至18中任一者的方法，其中B在所述肽化合物的游离胺处、所述肽化合物的N端位置处、所述肽化合物的游离SH处和/或所述肽化合物的游离羧基处连接于A。
20.根据项1至19中任一者的方法，其中B经接头连接于A。
21.根据项1至20中任一者的方法，其中缀合物为式(LIII)或(LIV)所代表：
GVRAK(Z1)AGVRN(Nle)FK(Z2)SESY(LIII)(SEQ ID NO：23)；
乙酰基-GVRAK(Z1)AGVRN(Nle)FK(Z2)SESY(LIV)(SEQ ID NO：24)；
其中Z1和Z2各自独立地是与赖氨酸(K)残基接合的抗肿瘤剂。
22.根据项1至21中任一者的方法，其中抗肿瘤剂是放射性核素或化疗剂。
23.项22的方法，其中化疗剂是紫杉烷(taxane)。
24.项23的方法，其中化疗剂是多西他赛(docetaxel)。
25.用于预防或治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的癌复发或再发的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的项1至24任一者中定义的缀合物或其盐。
26.一种用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的预后不良癌的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的项1至24任一者中定义的缀合物或其盐。
27.用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的不可切除性、化疗耐药性和抗放射治疗性癌的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的项1至24任一者中定义的缀合物或其盐。
28.根据项1至27中任一者的方法，其中CSC表达至少一种多药耐药(multidrugresistance，MDR)蛋白。
29.项28的方法，其中CSC表达MDR1和/或ABCB5。
30.根据项1至29中任一者的方法，其中癌是乳腺癌、泌尿生殖系统癌、胰腺癌、肺癌、甲状腺癌、肾癌、胃肠道癌、神经内分泌肿瘤、皮肤癌、脑癌和白血病。
31.项30的方法，其中泌尿生殖系统癌是卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌或睾丸癌。
32.项30的方法，其中乳腺癌是浸润性导管癌(IDC)或三阴性乳腺癌(TNBC)。
33.项30的方法，其中肾癌是肾细胞癌(RCC)。
34.项30的方法，其中胃肠道癌是结直肠癌。
35.项30的方法，其中皮肤癌是黑素瘤。
36.项30的方法，其中脑癌是胶质瘤。
37.项30的方法，其中白血病是B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)。
38.项30的方法，其中癌是乳腺癌、卵巢癌或胰腺癌。
39.根据项1至38中任一者的方法，其中施用缀合物或其盐抑制CSC在受试者中迁移。
40.根据项1至39中任一者的方法，其中方法还包括施用一种或多种额外的活性剂或疗法至受试者。
41.项40的方法，其中一种或多种额外的活性剂或疗法包括放疗、手术、化疗剂、免疫疗法、检查点抑制剂和/或基于细胞的疗法。
42.在项1至24任一者中所述的缀合物或其盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中包含表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)的癌。
43.在项1至24任一者中所述的缀合物或其盐用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的癌复发或再发。
44.在项1至24任一者中所述的缀合物或其盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的预后不良癌。
45.在项1至24任一者中所述的缀合物或其盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的不可切除性、化疗耐药性和抗放射治疗性癌。
46.在项1至24任一者中所述的缀合物或其盐的用途，用于治疗受试者中包含表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)的癌。
47.在项1至24任一者中所述的缀合物或其盐的用途，用于预防或治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的癌复发或再发。
48.在项1至24任一者中所述的缀合物或其盐的用途，用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的预后不良癌。
49.在项1至24任一者中所述的缀合物或其盐的用途，用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的不可切除性、化疗耐药性和抗放射治疗性癌。
50.项42至49中任一者的用途，其中CSC表达至少一种多药耐药(MDR)蛋白。
51.项50的用途，其中CSC表达MDR1和/或ABCB5。
52.项42至51中任一者的用途，其中癌是乳腺癌、泌尿生殖系统癌、胰腺癌、肺癌、甲状腺癌、肾癌、胃肠道癌、神经内分泌肿瘤、皮肤癌、脑癌和白血病。
53.项52的用途，其中泌尿生殖系统癌是卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌或睾丸癌。
54.项52的用途，其中乳腺癌是浸润性导管癌(IDC)或三阴性乳腺癌(TNBC)。
55.项52的用途，其中肾癌是肾细胞癌(RCC)。
56.项52的用途，其中胃肠道癌是结直肠癌。
57.项52的用途，其中皮肤癌是黑素瘤。
58.项52的用途，其中脑癌是胶质瘤。
59.项52的用途，其中白血病是B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)。
60.项52的用途，其中癌是乳腺癌、卵巢癌或胰腺癌。
61.项42至60中任一者的用途，其中药物抑制CSC在受试者中迁移。
62.项42至61中任一者的用途，其中药物与一种或多种额外的活性剂或疗法使用。
63.项62的用途，其中一种或多种额外的活性剂或疗法包括放疗、手术、化疗剂、免疫疗法、检查点抑制剂和/或基于细胞的疗法。
64.如项1至24中任一者所所述的缀合物或其盐，用于治疗受试者中包含表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)的癌。
65.如项1至24中任一者所所述的缀合物或其盐，用于预防或治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的癌复发或再发。
66.如项1至24中任一者所所述的缀合物或其盐，用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的预后不良癌。
67.如项1至24中任一者所所述的缀合物或其盐，用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的不可切除性、化疗耐药性和抗放射治疗性癌。
68.根据项64至67中任一者使用的缀合物或其盐，其中CSC表达至少一种多药耐药(MDR)蛋白。
69.根据项68使用的缀合物或其盐，其中CSC表达MDR1和/或ABCB5。
70.根据项65至69中任一者使用的缀合物或其盐，其中癌是乳腺癌、泌尿生殖系统癌、胰腺癌、肺癌、甲状腺癌、肾癌、胃肠道癌、神经内分泌肿瘤、皮肤癌、脑癌和白血病。
71.根据项70使用的缀合物或其盐，其中泌尿生殖系统癌是卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌或睾丸癌。
72.根据项70使用的缀合物或其盐，其中乳腺癌是浸润性导管癌(IDC)或三阴性乳腺癌(TNBC)。
73.根据项70使用的缀合物或其盐，其中肾癌是肾细胞癌(RCC)。
74.根据项70使用的缀合物或其盐，其中胃肠道癌是结直肠癌。
75.根据项70使用的缀合物或其盐，其中皮肤癌是黑素瘤。
76.根据项70使用的缀合物或其盐，其中脑癌是胶质瘤。
77.根据项70使用的缀合物或其盐，其中白血病是B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)。
78.根据项70使用的缀合物或其盐，其中癌是乳腺癌、卵巢癌或胰腺癌。
79.根据项64至78中任一者使用的缀合物或其盐，其中缀合物或其盐抑制CSC在受试者中迁移。
380.根据项64至79中任一者使用的缀合物或其盐，其中缀合物或其盐与一种或多种额外的活性剂或疗法使用。
81.根据项80的缀合物或其盐，其中一种或多种额外的活性剂或疗法包括放疗、手术、化疗剂、免疫疗法、检查点抑制剂和/或基于细胞的疗法。
本公开的其他目的、优点和特征将在参考附图阅读仅以举例方式给出的其具体实施方案的以下非限制性说明时更显而易见。
附图简述
在附图中：
图1A描述一幅显示人乳腺三阴性MDA-MB-231肿瘤细胞和乳腺癌干细胞(hBCSC)表达分拣蛋白(SORT1)的蛋白质印迹图像。将人三阴性BCSC和MDA-MB-231/1uc细胞匀浆(20μg蛋白质)在聚丙烯酰胺凝胶上分离并电转移至PVDF膜。用两种不同的抗体(SORT1#1：BDbiosciences，SORT1#2：Abeam)在膜上通过蛋白质印迹法检测分拣蛋白。
图1B是显示TH19P01-Alexa Fluor 488被hBCSC内化的曲线。使kBCSC暴露于添加了200nM荧光标记的TH19P01或仅溶媒的培养基。将细胞温育2小时、洗涤和胰蛋白酶消化后，通过流式细胞术测量包含于细胞内部的荧光。显示的数据代表均值±SEM，n＝3，每一实验重复进行两次。通过t检验进行统计比较，将p＜0.05设定为显著性。三个星号表示p＜0.001。
图2A和图2B是显示在分拣蛋白配体(图2A)存在下和siRNA介导的SORT1沉默时(图2B)TH19P01-Alexa Fluor 488被hBCSC内化的图。图2A：对照数据涉及在TH19P01-AlexaFluor 488存在下无任何竞争性配体时孵育的细胞。还在额外存在以下分拣蛋白配体时进行了荧光标记的TH19P01的摄取：10μM神经降压肽(NT)、50μM非荧光TH19P01或1nM颗粒蛋白前体(PGRN)。数据用单因素方差分析比较，随后比照对照荧光进行Tukey多重比较检验；将p＜0.05设定为显著性。显示的数据代表均值±SEM，n＝3次分析，每一实验重复进行两次。二个星号表示p＜0.01，并且三个星号表示p＜0.001。图2B：将细胞与siRNA预孵育，之后与荧光肽孵育；使用的二种siRNA是乱序对照siRNA(siScr)和针对人分拣蛋白mRNA的siRNA(siSORT1)。用双侧t检验评估统计显著性，显著性预设在p＜0.05。二个星号指示p＜0.01。显示的数据代表均值±SD，n＝2。
图2C是显示在TH19P01、颗粒蛋白前体(PGRN)，KBP201、神经降压肽(NT)和半胱氨酸肽(添加了N末端或C末端半胱氨酸的TH19P01)存在下TH19P01-Alexa488被hOvCSC摄取的图。hOvCSC暴露于已经添加了DMSO中200nM荧光标记的TH19P01、单独DMSO(溶媒)或DMSO中200nM TH19P01以及竞争性配体(10μM神经降压肽[NT]、50μM无荧光TH19P01、50μM TH20P01或1nM颗粒蛋白前体[PGRN])的培养基。将细胞温育2小时、洗涤和胰蛋白酶消化后，通过流式细胞术测量包含于细胞内部的荧光。与单独溶媒相关的荧光反映体系的背景荧光。显示的数据代表均值±SEM，n＝2，每一实验重复进行两次。如所示，将摄入抑制作用与同TH19P01-AlexaTM488单独孵育的细胞比较。
图2D：将细胞与siRNA预孵育，之后与荧光肽孵育；使用的二种siRNA是乱序对照siRNA(siScr)和针对人分拣蛋白mRNA的siRNA(siSORT1)。显示的数据代表均值±SEM，n＝1。
图3描述了载玻片的图像，所述载玻片携载用溶媒(对照，DMSO)、多西他赛或TH1902处理后的hBCSC。进行刮划(伤口愈合)测定法以评估hBCSC的迁移能力。将携载细胞的载玻片刮划，用溶媒(DMSO)、2μM多西他赛或1μM TH1902处理(多西他赛含量等同于多西他赛处理)2小时。随后将细胞在新鲜的完全培养基中漂洗并孵育。在刮划后0、24和48小时处按40X放大率获得图像。显示了一个代表性实验(n＝3)。
图4A是显示用溶媒(对照，DMSO)、多西他赛或TH1902处理后的hBCSC中随时间推移的总凋亡情况的图。将hBCSC在含有溶媒(DMSO)、4μM多西他赛或2μM TH1902的培养基中处理2小时并且随后在完全培养基中孵育22小时、48小时或72小时。通过收获细胞并且然后经膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶(PI)染色之后进行流式细胞术，确定凋亡程度。从3个不同实验获得数据并且表示为均值+/-SEM；使用单因素方差分析连同Dunnett多重比较检验进行统计分析(对于TH1902和对照情况之间的差异，*表示P＜0.05并且***表示p＜0.001)。
图4B描述了用溶媒(对照，DMSO)、多西他赛或TH1902处理后的hBCSC的共聚焦显微图像。将hBCSC在含有溶媒(DMSO)、4μM多西他赛或2μM TH1902的培养基中处理2小时并且随后在完全培养基中孵育48小时。将处理的细胞固定并且将DNA用DAPI染色，之后用共聚焦显微术成像。箭头指示核片段化的示例。
图4C-D是用溶媒(对照，DMSO)、多西他赛或TH1902处理后，经抗α-微管蛋白抗体染色的hBCSC的共聚焦显微图像。hBCSC如上文对图4B所述处理。在固定和经抗α-微管蛋白抗体免疫染色后评估多西他赛和TH1902对已处理细胞中微管蛋白的影响。随后使用共聚焦显微术使细胞可视化。来自每种条件的代表性照片展示为堆叠的平面(n＝1)。图4D对应于图4C中所显示但以单一焦平面(细胞中部)表现的样品。
图5A-D是显示多西他赛或TH1902影响hBCSC和MDA-MB-231/luc肿瘤细胞的G2/M细胞周期停滞的流式细胞术图(图5A和图5C)和柱状图(图5B和图5D)。将hBCSC和MDA-MB-231/luc细胞用溶媒(DMSO)、4μM多西他赛或2μM TH1902处理2小时，随后在新鲜的完全培养基中孵育22小时或48小时。使用FxCycleTM PI/RNA酶染色液通过流式细胞术分析每个细胞系的DNA含量。该实验重复至少三次并且图5A中显示hBCSC的代表性数据，图5C中显示MDA-MB-231/luc细胞的代表性数据。图5A：显示不同处理下G2/M期hBCSC的百分数的代表性流式细胞术采集图。图5B：显示在各种处理后处于G2/M细胞周期相的hBCSC的相对频率的图(x倍于对照)。数据表示为来自3个不同实验的均值+/-SEM，并且使用单因素方差分析连同Dunnett多重比较检验进行统计分析(对于TH1902和对照情况之间的差异，***表示p＜0.001)。图5C：显示不同处理下G2/M期MDA-MB-231/luc细胞的百分数的代表性流式细胞术采集图。图5D：显示在各种处理后处于G2/M细胞周期相的MDA-MB-231/luc细胞的相对频率的图(x倍于对照)。数据表示为来自2个不同实验的均值+/-SEM。
图6A描述显示MDA-MB-231/Luc细胞、hBCSC细胞和犬MDCK-MDR1细胞中MDR1(akaP-gp，ABCB1)蛋白和ABCB5蛋白的表达水平的蛋白质印迹图像。来自MDA-MB-231/Luc细胞、hBCSC细胞和犬MDCK-MDR1细胞的匀浆(20μg蛋白质)在聚丙烯酰胺凝胶上分离并电转移至PVDF膜。通过蛋白质印迹法在膜上用特异性抗体检测MDR1和ABCB5。对于图6B-D，将hBCSC细胞预孵育30min±10μM CsA(n＝4)或10μM PSC-833(n＝3)。随后将细胞与溶媒(对照，DMSO)、4μM多西他赛或2μM TH1902孵育2小时。培养基随后更换为含有或缺少10μM CsA或PSC-833的新鲜培养基。将细胞孵育22小时，之后用FxCycleTM PI/RNA酶染色液染色，随后借助流式细胞术分析。显示的值代表来自至少3个不同实验的均值±SEM并且使用Bonferroni多重比较检验进行统计分析(**p＜0.01，***p＜0.001)。图6B：每种条件的代表性流式细胞术采集图。图6C：代表用多西他赛处理后G2/M期hBCSC的相对频率的图。图6D：代表用TH1902处理后G2/M期hBCSC的相对频率的图。
图7A是显示(随同或不随同基质胶(Matrigel))植入hBCSC后小鼠中肿瘤随时间推移进展的图。在免疫缺陷小鼠中皮下注射103个来自人TNBC的癌干细胞样细胞并且监测肿瘤体积达23至28天。
图7B是显示随MatrigelTM植入人卵巢癌干细胞(hOvCSC)后小鼠中肿瘤随时间推移进展的图。在免疫缺陷小鼠中皮下注射103个来自人卵巢癌的癌干细胞样细胞并且监测肿瘤体积达23至28天。
图7C是显示随MatrigeltM植入人胰腺癌干细胞(hPCSC)后小鼠中肿瘤随时间推移进展的图。在免疫缺陷小鼠中皮下注射103个来自人胰腺癌的癌干细胞样细胞并且监测肿瘤体积达23至28天。
图7D是显示人乳腺CSC、人胰腺CSC和人卵巢CSC表达多药耐药蛋白ABCB5和PgP及分拣蛋白(胞内)的蛋白质印迹。
图7E是显示人胰腺CSC和卵巢CSC表达Pgp和分拣蛋白的蛋白质印迹。使用β-肌动蛋白的表达作为对照。
图8A-C显示在施用多西他赛或TH1902后小鼠中hBCSC异种移植物的生长。图8A：在免疫缺陷小鼠皮下植入hBCSC异种移植物后第2天，动物开始接受每周施用一次溶媒或含有3.75mg/kg(对应于1/4的最大耐受剂量(MTD))多西他赛(多西他赛1/4)、15mg/kg多西他赛(对应于MTD)(多西他赛)、8.75mg/kgTH1902(等同于1/4的多西他赛MTD)(TH19021/4)和35mg/kg TH1902(等同于多西他赛MTD)(TH1902)的溶媒。按定期间隔时间手工测量肿瘤大小，旨在监测供试品施用对肿瘤生长的影响。符号代表均值±SEM，n＝6。注意在15mg/kg多西他赛曲线和8.75mg/kg TH1902曲线之间存在事实上的重叠。横坐标下方展示的符号指处理发生的天数。还注意，多西他赛(15mg/kg)仅施用三次，因为这个组合的量匹配小鼠中多西他赛的MTD。图8B：用多西他赛或TH1902处理后的肿瘤体积比较。通过计算处理首日和实验末日之间肿瘤大小的变化，在不同的hBCSC处理之间进行统计比较。通过单因素方差分析比较这些大小并且使用Dunnett多重比较检验，与每种处理相关的肿瘤大小均值与溶媒处理动物的肿瘤大小比较，p＜0.05作为预设显著性水平。沿横坐标列出的处理确定随括号里列出的所用浓度(mg/kg)一起列出。ns：不显著，*P＜0.05，****P＜0.0001，n＝6。图8C是显示图8A所述的研究中小鼠体重随时间推移变化的图。例行记录小鼠体重并将其视为发病率的粗略估计值。数据在此显示为动物在处理伊始体重的百分数。符号代表均值±SEM，n＝6只小鼠/组。横坐标下方展示的符号指示处理发生的天数。
图9A-C显示多西他赛和渐增性TH1902剂量对小鼠中hBCSC异种移植物生长的影响。图9A：在免疫缺陷小鼠(n＝6只小鼠/组)皮下植入hBCSC异种移植物后第3天，动物开始接受每周施用一次溶媒或含有15mg/kg多西他赛(对应于MTD)(多西他赛)、35mg/kg TH1902(等同于多西他赛MTD)(TH1902 1当量)、43.75mg/kgTH1902(等同于1.25多西他赛MTD)(TH1902 1.25当量)和52.5mg/kg TH1902(等同于1.5多西他赛MTD)(TH1902 1.5当量)的溶媒。按定期间隔时间手工测量肿瘤大小，旨在监测供试品施用对肿瘤生长的影响。符号代表均值±SEM。横坐标下方展示的符号指处理发生的天数。图9B：用多西他赛或TH1902处理后的肿瘤体积比较。通过计算处理首日和实验末日之间肿瘤大小的变化，在不同的hBCSC处理之间进行统计性比较。通过单因素方差分析比较这些大小并且使用Dunnett多重比较检验，与每种处理相关的肿瘤大小均值与溶媒处理动物的肿瘤大小比较，p＜0.05作为预设显著性水平。沿横坐标列出的处理确定随括号里列出的所用浓度(mg/kg)一起列出。单因素方差分析Turkey多重比较检验分析。ns：不显著，*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.0001，n＝6只/组，例外是TH1902 52.5mg/kg n＝5只。图9C是显示图9A所述的研究中小鼠体重随时间推移变化的图。例行记录小鼠体重并将其视为发病率的粗略估计值。数据在此显示为动物在处理伊始体重的百分数。符号代表均值±SEM，n＝6只小鼠/组。横坐标下方展示的符号指示处理发生的天数。
图10A-C显示多西他赛和渐增性TH1902剂量对小鼠中hOvCSC异种移植物生长的影响。图10A：裸鼠(n＝5至6只小鼠/组)皮下植入hOvCSC异异种移植物后第3天，动物开始接受每周施用一次溶媒或含有15mg/kg多西他赛(对应于MTD)(多西他赛)、35mg/kgTH1902(等同于多西他赛MTD)(TH1902 1当量)、43.75mg/kg TH1902(等同于1.25多西他赛MTD)(TH19021.25当量)和52.5mg/kg TH1902(等同于1.5多西他赛MTD)(TH1902 1.5当量)的溶媒。按定期间隔时间手工测量肿瘤大小，旨在监测供试品施用对肿瘤生长的影响。符号代表均值±SEM。横坐标下方展示的符号指处理发生的天数。图10B：用多西他赛或TH1902处理后的肿瘤体积比较。通过计算处理首日和实验末日之间肿瘤大小的变化，在不同的hOvCSC处理之间进行统计比较。通过单因素方差分析比较这些大小并且使用Dunnett多重比较检验，同每种处理相关的肿瘤大小均值与溶媒处理动物的肿瘤大小比较，p＜0.05作为预设显著性水平。沿横坐标列出的处理确定随括号里列出的所用浓度(mg/kg)一起列出。单因素方差分析Turkey多重比较检验分析。***P＜0.001，****P＜0.0001。图10C是显示图10A所述的研究中小鼠体重随时间推移变化的图。例行记录小鼠体重并将其视为发病率的粗略估计值。数据在此显示为动物在处理伊始体重的百分数。符号代表均值±SEM，n＝5或6只小鼠/组。横坐标下方展示的符号指示处理发生的天数。
图11A和11B显示单用或组合使用的多西他赛、紫杉醇、TH1902或卡铂对小鼠中hOvCSC异种移植物生长的影响。随同和不随同腹膜内注射卡铂，将多西他赛、TH1902或紫杉醇静脉内施用至携带hOCSC异种移植物的小鼠组。图11A是显示肿瘤随时间推移生长的图。横坐标下方展示的圆圈指示施用处理的天。符号代表均值±SEM，n＝全部组均6只。图11B是显示处理后比较肿瘤大小的图。在第18天(实验最终日)测量全部动物的肿瘤大小并且在接受不同处理的组之间比较这些大小。使用单因素方差分析随后Tukey’s多重比较检验进行统计比较，统计显著性预设在p＜0.05。*指p＜0.05，**指p＜0.01，***指p＜0.001并且****指p＜0.0001。n＝全部组均为6只。箱末端代表数据集的上半部分和下半部分的中位值，并且箱须显示每个集合的最小值和最大值。箱内部垂线标记该集合的中位值。图中未标记的成对比较为统计不显著。
发明详述
除非本文另外说明或与语境明显矛盾，否则使用术语“一个”和“一种”和“该”和相似指称在描述该技术的语境下(尤其在以下权利要求的语境下)解释为涵盖单数和复数。
除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。
除非本文另外说明或除非与语境明显矛盾，否则本文所述的全部方法可以按任何合适的顺序进行。
除非另外声明，否则本文中提供的任何和全部实施例或示例性措辞(“例如”、“如”)的使用仅意在更好地说明要求保护的技术的实施方案而不进行范围的限制。
本说明书中的语言均不应解释为表示任何未要求保护的要素对实施要求保护的技术的实施方案为必需。
本文中，术语“约”具有其普通含义。术语“约”用来表示某个值包括正在用来测定该值的装置或方法的内在误差变异，或涵盖接近于所述值的值，例如在所述值(或值范围)的10％以内。
除非本文中另外说明，否则本文中对值范围的描述仅意在作为单独指称落入该范围内的每个独立值的简化方法，并且将每个独立值如同本文中单独提到的那样并入本说明书中。范围内的多个值的全部子集还如同本文中单独提到它们那样并入本说明书中。
在根据马库什群组或备选列表描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开因此还对马库什群组或备选列表的任何单个成员或成员子群组进行描述。
除非另外具体定义，否则本文所用的全部技术术语和科学术语应当理解为具有如本领域(例如，干细胞生物学、细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学领域内)普通技术人员共同理解的相同含义。
除非另外说明，否则本公开中利用的重组蛋白技术、细胞培养技术和免疫技术是本领域技术人员熟知的标准程序。这类种技术在作为来源的以下文献中全面描述和解释，如J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989)，T.A.Brown(编者)，Essential Molecular Biology：APractical Approach，第1卷和第2卷，IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编者)，DNA Cloning：A Practical Approach，第1-4卷，IRL Press(1995年和1996年)，以及F.M.Ausubel等人(编者)，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括至今的全部更新)，Ed Harlow和David Lane(编者)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory，(1988)，和J.E.Coligan等人(编者)Current Protocols in Immunology，JohnWiley&Sons(包括至今的全部更新)。
本文中描述了靶向癌干细胞(CSC)的产品和方法及其用途。CSC通过它们能够停滞于G0期的能力，与癌复发、转移、多药耐药性和抗辐射性相关，从而产生新肿瘤。实体瘤包含增殖能力可变的在不同发育阶段具有不同表型特征的异质性细胞群体。已经定义CSC为癌微环境和生态位(niche)中的癌细胞小亚群，这些小亚群建立独家能够自我更新和形成包含肿瘤的异质性癌细胞谱系的自持性细胞贮备。高水平循环性癌干细胞样细胞(cCSC)已经与乳腺癌患者中肿瘤对化疗反应率低劣以及总体生存率和无进展生存率较低相关(Lee，CH等人，BMC Cancer 19，1167(2019))。类似地，诊断时干细胞频率高与急性髓样白血病(AML)患者中化疗疗效较低和复发及转而生存率较低相关(van Rhenen等人，Clin CancerRes.2005Sep 15；11(18)：6520-7；Witte KE等人，Pediatr Hematol Oncol.2011Mar；28(2)：91-9)。高频率的CSC与黑素瘤中转移可能性更高和预后更差相关(Civenni等人，Cancer Res.2011年4月15日；71(8)：3098-109)。
本文呈现的结果显示三阴性人乳腺癌干细胞(hBCSC)表达分拣蛋白受体，并且显示这类细胞因表达多药耐药蛋白如MDR1和ABCB5而抵抗单用多西他赛处理，但对与允许分拣蛋白介导hBCSC摄取多西他赛的肽化合物缀合的多西他赛敏感。还显示缀合物在侵袭性三阴性乳腺癌(TNBC)小鼠模型中防止癌复发。由于CSC与癌复发、转移、多药耐药性和抗辐射性相关，这些结果提供证据：包含缀合至肽化合物的抗肿瘤剂(例如，化疗剂)的缀合物可以用于治疗标准抗肿瘤疗法难治的预后不良癌，并且可以预防或治疗癌复发或再发，所述肽化合物靶向表达分拣蛋白的CSC。
因此，在一个方面，本公开提供一种用于治疗受试者中包含表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)的癌的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文中所述的缀合化合物或其可药用盐。本公开还提供本文中所述的缀合化合物或其可药用盐的用途，用于治疗受试者中包含表达分拣蛋白的CSC的癌，或用于制造或制备药物，所述药物用于治疗受试者中包含表达分拣蛋白的CSC的癌。本公开还提供本文中所述的缀合化合物或其可药用盐用于治疗受试者中包含表达分拣蛋白的CSC的癌。
在另一个方面，本公开提供一种用于减少或消除癌症患者中表达分拣蛋白的CSC的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文中所述的缀合化合物或其可药用盐。本公开还提供本文中所述的缀合化合物或其可药用盐的用途，用于减少或消除癌症患者中表达分拣蛋白的CSC，或用于制造或制备药物，所述药物用于减少或消除癌症患者中表达分拣蛋白的CSC。本公开还提供本文中所述的缀合化合物或其可药用盐用于减少或消除癌症患者中表达分拣蛋白的CSC。
在另一个方面，本公开提供一种用于预防或治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的CSC相关的癌复发或再发的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文中所述的缀合化合物或其可药用盐。本公开还提供本文中所述的缀合化合物或其可药用盐的用途，用于预防或治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的CSC相关的癌复发或再发或用于制造或制备药物，所述药物用于预防或治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的CSC相关的癌复发或再发。本公开还提供本文中所述的缀合化合物或其可药用盐用于预防或治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的CSC相关的癌复发或再发。在一个实施方案中，该缀合化合物或其盐防止癌复发或再发。在一个实施方案中，该缀合化合物或其盐减少癌复发或再发。在一个实施方案中，该缀合化合物或其盐治疗癌复发或再发(即，治疗复发性癌)。
本公开还提供一种用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的预后不良癌的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文中所述的缀合化合物或其可药用盐。本公开还提供本文中所述的缀合化合物或其可药用盐的用途，用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的预后不良癌，或用于制造或制备药物，所述药物用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的预后不良癌。本公开还提供本文中所述的缀合化合物或其可药用盐用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的预后不良癌。
在另一个方面，本公开还提供一种用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的不可切除性、化疗耐药性和抗放射治疗性癌的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文中所述的缀合化合物或其可药用盐。本公开还提供本文中所述的缀合化合物或其可药用盐的用途，用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的不可切除性、化疗耐药性和抗放射治疗性癌，或用于制造或制备药物，所述药物用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的不可切除性、化疗耐药性和抗放射治疗性癌。本公开还提供本文中所述的缀合化合物或其可药用盐用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的不可切除性、化疗耐药性和抗放射治疗性癌。
如本文所用的术语“分拣蛋白”或“分拣蛋白受体”指由SORT1基因编码的神经元1型膜糖蛋白，属于受体的液泡蛋白分选10蛋白(Vps10)家族。分拣蛋白(也称作神经降压肽受体3；UniProtKB登录号Q99523)在众多癌(例如包括卵巢癌、乳腺、结肠癌和前列腺癌)中表达或过量表达。编码的前原蛋白(残基34-831，残基1-33对应于信号肽)在氨基酸77后经弗林蛋白酶(或其他同源性蛋白酶)蛋白酶解加工，以产生分子量约100-110kDa的成熟受体(残基78-831)。本文提到的分拣蛋白的氨基酸残基对应于全长形式中(即，UniProtKB登记号Q99523)的位置。
如本文所用的术语“癌干细胞”(CSC)指在实体瘤或血液癌中存在的癌细胞亚群体，所述亚群体驱动肿瘤起始并且拥有与正常干细胞相关、尤其与自我更新和分化成多个肿瘤细胞类型的能力相关的特征。已经显示CSC表现出对化疗抵抗(多药耐药)和放疗抵抗，并且与癌复发和转移相关。癌干细胞涵盖表达某些标志物的细胞。下表1中示出了各种类型癌中CSC标志物的实例(参见，例如，Walcher等人，“Cancer Stem Cells-Origins andBiomarkers：Perspectives for Targeted Personalized Therapies(癌干细胞-起源和生物标志物：靶向性个性化疗法的前瞻)”，Front Immunol.2020；11：1280；Suster等人，“Presence and role of stem cells in ovarian cancer(卵巢癌中干细胞的存在和作用)”，World J Stem Cells.2019Jul 26；11(7)：383-397)。
表1：不同癌类型中CSC标志物的实例
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也已知CSC表达或过量表达多药耐药(MDR)蛋白(MRP)。MRP是一组名为ATP结合盒(ABC)转运蛋白的蛋白质的C家族成员，该组蛋白质使用ATP驱动的能量逆浓度梯度外排种类广泛的抗癌药物。最常见的MRP是ABC亚家族C成员1(ABCC1/MRP1)、ABC亚家族C成员2(ABCC2/MRP2)、ABC亚家族C成员3(ABCC3/MRP3)、ABC亚家族C成员4(ABCC4/MRP4)、ABC亚家族C成员5(ABCC5/MRP5)、ABC亚家族C成员6(ABCC6/MRP6)、ABC亚家族C成员10(ABCC10/MRP7)、ABC亚家族C成员11(ABCC11/MRP8)、ABC亚家族C成员12(ABCC12/MRP9)、ABC亚家族B成员1(ABCB1、也称作P-糖蛋白(P-gp))、ABC亚家族B成员5(ABCB5)和ABC亚家族G成员2(ABCG2)。
因此，在一个实施方案中，本文中所述的方法和用途旨在抑制CSC的生长和/或杀伤之，所述CSC表达在表1中所列的一种或多种标志物和/或一种或多种MRP如上文所列MRP中的一者或多者。在一个实施方案中，CSC表达以下至少一种标志物：CD133、CD44、SSEA3/4、ALDH和Oct4。在一个实施方案中，CSC表达CD133和/或CD44。在一个实施方案中，CSC表达CD133、CD44、SSEA3/4和Oct4。在一个实施方案中，CSC表达巢蛋白、Sox2、Nanog、cKit和/或Lin28。在另一个实施方案中，CSC表达ABCB5。在另一个实施方案中，CSC表达ABCB5和P-gp。在又一个实施方案中，CSC表达CD133和ABCB5。
如本文所用的术语“分拣蛋白阳性癌干细胞”(或“表达分拣蛋白的癌干细胞”)指一种CSC群体，其中至少一部分(例如，至少5、10、20、30、40、50、60、70、80或90％)的CSC表达或过量表达天然的分拣蛋白受体。在一个实施方案中，分拣蛋白阳性CSC是乳腺CSC(例如，来自浸润性导管癌(IDC)、三阴性乳腺癌(TNBC)的CSC)、泌尿生殖系统CSC(例如，来自卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌、睾丸癌、尿路上皮癌或宫颈癌的CSC)、头颈CSC、胰腺CSC、肺CSC、甲状腺CSC、肾CSC(例如，来自肾细胞癌(RCC)的CSC)、胃肠道CSC(例如，来自结直肠癌、胃癌的CSC)、神经内分泌CSC(来自NET如类癌(carcinoid)的CSC)、皮肤CSC(来自黑素瘤的CSC)、脑CSC(例如，胶质瘤CSC)、神经母细胞瘤CSC和白血病CSC(例如，来自B细胞慢性淋巴细胞白血病B-CLL的CSC)(例如参见Mol Cell Proteomics.2005Dec；4(12)：1920-32，http：//www.proteinatlas.org的人类蛋白质图集)。在一个实施方案中，分拣蛋白阳性CSC是乳腺CSC，例如TNBC CSC(例如，三阴性IDC CSC)。在另一个实施方案中，分拣蛋白阳性CSC是泌尿生殖系统CSC。在又一个实施方案中，泌尿生殖系统CSC是卵巢CSC。在另一个实施方案中，泌尿生殖系统CSC是前列腺CSC。在另一个实施方案中，分拣蛋白阳性CSC是肺CSC。在另一个实施方案中，分拣蛋白阳性CSC是胰腺CSC。在另一个实施方案中，分拣蛋白阳性CSC是结直肠CSC。在另一个实施方案中，分拣蛋白阳性CSC是皮肤CSC，例如黑素瘤CSC。
因此，在实施方案中，包含表达分拣蛋白的CSC的癌是乳腺癌(例如，浸润性导管癌(IDC)、三阴性乳腺癌(TNBC))、泌尿生殖系统癌(例如，卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌、睾丸癌、尿路上皮癌、宫颈癌)、头颈癌、胰腺癌、肺癌、甲状腺癌、肾癌(例如，肾细胞癌(RCC))、胃肠道癌(例如，结直肠癌、胃癌)、神经内分泌肿瘤(NET，如类癌)、皮肤癌(黑素瘤)、脑癌(例如，胶质瘤)、神经母细胞瘤、和白血病(例如，B细胞慢性淋巴细胞白血病，B-CLL)(例如，参见Mol Cell Proteomics.2005年12月；4(12)：1920-32，http：//www.proteinat1as.org的人类蛋白质图集)。在一个实施方案中，包含表达分拣蛋白的CSC的癌是乳腺癌，例如TNBC(例如，三阴性IDC)。在另一个实施方案中，包含表达分拣蛋白的CSC的癌是泌尿生殖系统癌。在又一个实施方案中，泌尿生殖系统癌是卵巢癌。在另一个实施方案中，泌尿生殖系统癌是前列腺癌。在另一个实施方案中，包含表达分拣蛋白的CSC的癌是肺癌。在另一个实施方案中，包含表达分拣蛋白的CSC的癌是胰腺癌。在另一个实施方案中，包含表达分拣蛋白的CSC的癌是结直肠癌。在另一个实施方案中，包含表达分拣蛋白的CSC的癌是皮肤癌，例如黑素瘤。
在一个实施方案中，癌症是复发性癌。术语“癌再发(cancer recurrence)”和“癌复发(cancer relapse)”可以在本文互换使用，并且指在治疗后及在期间不能检出癌的一段时间后癌复返。除非另外陈述，它意指在一段无病情时间后癌症再出现。
如本文所用的术语“预后不良癌”指给定癌症的亚型，相对于同一癌症的其他亚型，所述亚型与生存率(例如，5年或10年生存率)较低相关。预后不良癌通常与癌亚型的特定特征相关，例如存在某些突变、染色体异常等，所述特定特征使得这些癌亚型更抵抗治疗。不良预后还与在较晚期诊断的癌症相关(例如，存在远端转移)。另外，如上文所示，已经显示CSC高频率与几种癌症中治疗应答不良和存活率较低相关。例如，对于乳腺癌而言，三阴性乳腺癌(TNBC)视为一种预后不良乳腺癌，因为相对于其他的乳腺癌亚型，它与5年相对生存率较低相关。另外，高水平循环性癌干细胞样细胞(cCSC)已经与乳腺癌患者中肿瘤对化疗反应率低劣以及总体生存率和无进展生存率较低相关(Lee，CH等人，BMC Cancer 19，1167(2019))。对于卵巢癌，相对于卵巢间质肿瘤和生殖细胞瘤，浸润性卵巢上皮癌和输卵管癌通常与5年相对生存率较低相关。胰腺癌的5年总生存率十分低(约3％)，这部分地因为超过半数患者诊断时处于晚期。III/IV期胰腺癌的诊断(存在远端转移)与预后非常不良相关。类似地，对于前列腺癌，IV期诊断(存在远端转移)与不良预后相关(相比I-III期诊断时生存率至少80-85％，IV期诊断时5年相对生存率小于30％)。对于肺癌，小细胞肺癌与预后特别不良相关，尤其诊断处于晚期时(例如，存在区域转移或远端转移)。诊断处于晚期(例如，存在远端转移)的非小细胞肺癌还与不良预后相关。在结直肠癌中，黏液腺癌(以存在丰富胞外黏蛋白为特征)已经与化疗应答降低和预后不良相关。腹膜累及和BRAF突变也构成结直肠癌预后不良标志物。对于肾癌，相比乳头状RCC，透明细胞RCC与结局更差(例如，5年相对生存率较低)相关。在皮肤癌中，肿瘤较稠密、淋巴结受累和诊断处于晚期(例如，存在区域转移或远端转移)与黑素瘤中生存率较低相关。巢蛋白和CD133表达已经与黑素瘤和胶质瘤的不良结局相关。
在一个实施方案中，预后不良癌是III/IV期癌。在一个实施方案中，预后不良癌是III期癌。在一个实施方案中，预后不良癌是IV期癌。在另一个实施方案中，预后不良癌是CSC数目或频率高的癌，即，CSC数目或频率高于相同类型癌症(例如，卵巢癌、乳腺癌)中平均CSC数目或频率的癌。在一个实施方案中，CSC数目或频率比相同癌症类型中平均CSC数目或频率高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(2倍)、200％(3倍)、300％(4倍)或400％(5倍)。
在一个实施方案中，预后不良癌是具有小于60％的5年相对生存率的癌症。在一个实施方案中，预后不良癌是具有小于50％的5年相对生存率的癌症。在一个实施方案中，预后不良癌是具有小于40％的5年相对生存率的癌症。在一个实施方案中，预后不良癌是具有小于30％的5年相对生存率的癌症。在一个实施方案中，预后不良癌是具有小于20％的5年相对生存率的癌症。在一个实施方案中，预后不良癌是具有小于10％的5年相对生存率的癌症。在一个实施方案中，预后不良癌是具有小于5％的5年相对生存率的癌症。
适于本文公开方法和用途的缀合物是这样的缀合物，其包含与能够结合分拣蛋白并且被CSC内化的物质缀合的抗肿瘤剂(例如，化疗剂)，从而向CSC递送抗肿瘤剂。在一个实施方案中，缀合物(或缀合化合物)是如PCT公开号WO/2017/088058、WO/2018/213928和WO/2020/037434中所述的抗肿瘤剂-肽化合物缀合物。
在一个实施方案中，缀合化合物是式A-(B)n，其中
A是具有与式(I)-(XIII)的序列之一具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的肽化合物：
X1X2X3X4X5GVX6AKAGVX7NX8FKSESY(I)(SEQ ID NO：1)
(X9)nGVX10AKAGVX11NX12FKSESY(II)(SEQ ID NO：2)
YkX13LRRX14APRWDX15PLRDPALRX16X17L(III)(SEQ ID NO：3)
YKX18LRR(X19)NPLRDPALRX20X21L(IV)(SEQ ID NO：4)
IKLSGGVQAKAGVINMDKSESM(V)(SEQ ID NO：5)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESY(VI)(SEQ ID NO：6)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESYK(VII)(SEQ ID NO：7)
GVQAKAGVINMFKSESY(VIII)(SEQ ID NO：8)
GVRAKAGVRNMFKSESY(IX)(SEQ ID NO：9)
GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY(X)(SEQ ID NO：10)
YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL(XI)(SEQ ID NO：11)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRQLL(XII)(SEQ ID NO：12)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRPLL(XIII)(SEQ ID NO：13)
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X18和X19独立地选自任何氨基酸；X16、X17、X20和X21独立地选自Q、P、Y、I和L；n是从1至10的整数，例如1、2、3、4或5；当X9存在多于一次时，所述X9每者独立地选自任何氨基酸；当X19存在多于一次时，所述X9每者独立地选自任何氨基酸，任选地肽化合物为环状，并且其中肽化合物与分拣蛋白结合。
B是至少一种抗肿瘤剂，其中B直接地或经接头、任选地在所述肽化合物的游离胺处、所述肽化合物的N端位置处、所述肽化合物的游离-SH处或所述肽化合物的游离羧基处连接于A，
或其可药用盐。
术语“氨基酸”指本领域技术人员已知的常见天然(遗传编码的)或合成性氨基酸及其常见衍生物。当适用于氨基酸时，“标准”或“蛋白原的(proteinogenic)”指遗传编码的处于天然构型的20种氨基酸。类似地，当应用于氨基酸时，“非标准”、“非天然”或“不常见”指非天然、罕见或合成的氨基酸的广泛选择，如Hunt，S.在Chemistry and Biochemistryof the Amino Acids，Barrett，G.C.编著，Chapman and Hall：New York，1985中描述的那些。非标准氨基酸的一些例子包括非α氨基酸和D-氨基酸。在一个实施方案中，肽化合物仅包含天然氨基酸。在另一个实施方案中，肽化合物包含一种或多种非天然或合成性氨基酸，如D-氨基酸。
如本文所用的表述“序列同一性”指二个多肽序列或二个核酸序列之间的序列同一性百分数。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，出于最佳比较目的对齐所述序列(例如，可以在第一个氨基酸序列或核酸序列中引入空位以便与第二个氨基酸序列或核酸序列最佳对齐)。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。在第一序列中的位置由第二序列中在对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分数随这些序列共有的相同位置变化而变化。(即，同一性％＝相同的重叠位置个数/位置总数x 100％)。在一个实施方案中，这两个序列具有相同的长度。使用数学算法，也可以实现两个序列之间同一性百分数的确定。可以用例如设置成评分-50、字长度＝3的XBLAST程序参数进行BLAST蛋白质检索，以获得与本公开的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为出于比较目的获得空位比对结果，可以利用空位BLAST。可选地，PSI-BLAST可以用来执行检测分子之间远缘关系(Id.)的迭代检索。当使用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见，例如，NCBI网站)。用来比较序列的数学算法的另一个优选的非限制性例子是是Myers和Miller 1988，CABIOS 4：11-17的算法。这种算法并入了ALIGN程序(2.0版)，后者是GCG序列比对软件包的部分。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12和空位罚分4。可以使用与上文所述那些技术相似的技术，在允许或不允许空位的情况下确定两个序列之间的同一性百分数。在计算同一性百分数中，一般仅计数精确匹配。
表述“可药用”意指相容于治疗受试者如动物或人。本文中还提供本文所述缀合化合物的可药用盐。表达“可药用盐”意指适于或相容于治疗受试者如动物或人的酸加成盐或碱加成盐。如本文所用的表述“可药用酸加成盐”意指本公开的任何化合物或其中间体中任一者的任何无毒有机或无机盐。形成合适盐的示意性无机酸包括氢氯酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及金属盐如正磷酸一氢钠和硫酸氢钾。形成合适盐的示意性有机酸包括单羧酸、二羧酸和三羧酸如羟乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、延胡索酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸和水杨酸，以及磺酸如对甲苯磺酸和甲磺酸。可以形成单酸盐或二酸盐，并且这类盐可以以水合、溶剂化或基本上无水形式存在。从总体上看，本公开的化合物的酸加成盐更可溶于水和各种亲水有机溶剂中，并且相比它们的游离碱形式，通常显示出更高的熔点。选择适宜的盐是本领域技术人员已知的。其他非可药用盐例如草酸盐可以例如用于分离本公开的化合物、用于实验室用途或用于后续转化成可药用酸加成盐。如本文所用的表述“可药用碱加成盐”意指本公开的任何化合物或其中间体中任一者的任何无毒有机或无机碱加成盐。可以形成碱加成盐的本公开酸性化合物包括例如其中CO2H是官能团的化合物。形成合适盐的示意性无机碱包括氢氧化锂、钠、钾、钙、镁或钡。形成合适盐的示意性有机碱包括脂族、脂环或芳族有机胺如甲胺、三甲胺和甲基吡啶(picoline)或氨。选择适宜的盐是本领域技术人员已知的。其他非可药用碱加成盐可以例如用于分离本公开的化合物或缀合化合物、用于实验室用途或用于后续转化成可药用酸加成盐。
在一个实施方案中，肽化合物包含式(I)-(XIII)中任一者的序列或由其组成。在实施方案中，肽化合物包含50、45、40、35、30、25或20个或更少的氨基酸。
在实施方案中，肽化合物具有与式(I)或SEQ ID NO：1所代表的肽化合物具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中肽化合物与分拣蛋白结合。
在实施方案中，肽化合物具有与式(II)或SEQ ID NO：2所代表的肽化合物具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中肽化合物与分拣蛋白结合。
在实施方案中，肽化合物具有与式(III)或SEQ ID NO：3所代表的肽化合物具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中肽化合物与分拣蛋白结合。
在实施方案中，肽化合物具有与式(IV)或SEQ ID NO：4所代表的肽化合物具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中肽化合物与分拣蛋白结合。
在实施方案中，肽化合物具有与式(V)或SEQ ID NO：5所代表的肽化合物具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中肽化合物与分拣蛋白结合。
在实施方案中，肽化合物具有与式(VI)或SEQ ID NO：6所代表的肽化合物具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中肽化合物与分拣蛋白结合。
在实施方案中，肽化合物具有与式(VII)或SEQ ID NO：7所代表的肽化合物具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中肽化合物与分拣蛋白结合。
在实施方案中，肽化合物具有与式(VIII)或SEQ ID No：8所代表的肽化合物具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中肽化合物与分拣蛋白结合。
在实施方案中，肽化合物具有与式(IX)或SEQ ID No：9所代表的肽化合物具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中肽化合物与分拣蛋白结合。
在实施方案中，肽化合物具有与式(X)或SEQ ID NO：10所代表的肽化合物具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中肽化合物与分拣蛋白结合。
在实施方案中，肽化合物具有与式(XI)或SEQ ID NO：11所代表的肽化合物具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中肽化合物与分拣蛋白结合。
在实施方案中，肽化合物具有与式(XII)或SEQ ID NO：12所代表的肽化合物具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中肽化合物与分拣蛋白结合。
在实施方案中，肽化合物具有与式(XIII)或SEQ ID NO：13所代表的肽化合物具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中肽化合物与分拣蛋白结合。
在一个实施方案中，肽化合物包含30、25或20个或更少残基并且包含序列GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY(SEQ ID NO：10)。在另一个实施方案中，肽化合物包含30、25或20个或更少残基并且包含序列GVRAKAGVRN(Nle)FKSESYC(SEQ ID NO：31)。
在一个实施方案中，至少一个修饰基团在N末端和/或C末端与所述肽化合物连接。在一个实施方案中，肽化合物在N末端包含修饰基团。在一个实施方案中，肽化合物在C末端包含修饰基团。这类修饰基团可以用于保护肽化合物免受修饰或降解(例如，蛋白酶降解)。在一个实施方案中，氨基端修饰基团是C1-C16或C3-C16酰基(直链或支链、饱和或不饱和)，在又一个实施方案中，饱和的C1-C6酰基(直链或支链)或不饱和C3-C6酰基(直链或支链)。在又一个实施方案中，氨基端修饰基团是乙酰基(CH3-CO-，Ac)或琥珀酰基(CO-CH2-CH2-CO-)。羧基端修饰基团可以例如是与羧基连接的羟胺基(NHOH)，即(-C(＝O)-NHOH)；或是与羧基连接的胺，即(-C(＝O)-NRR’)，所述胺是伯胺、仲胺或叔胺，并且优选地，所述胺是优选地为一个至十个碳的脂族胺，如甲胺、异丁胺、异戊酰胺或环己胺、芳族胺或芳基烷基胺，如苯胺，萘胺、苄胺、肉桂胺或苯乙胺，优选的胺是-NH2。
在一个实施方案中，琥珀酰基与肽化合物连接。例如，肽化合物具有序列：琥珀酰基-IKLSGGVQAKAGVINMFKSESY，所述序列对应于SEQ ID NO：6并且具有在N末端处与其连接的琥珀酰基。
在一个实施方案中，乙酰基与肽化合物连接。例如，肽化合物具有序列：乙酰基-GVRAKAGVRNMFKSESY(SEQ ID NO：14)。例如，肽化合物具有序列：乙酰基-GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY(SEQ ID NO：15)。例如，肽化合物具有序列：乙酰基-YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL(SEQ ID NO：16)。例如，肽化合物具有序列：乙酰基-YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRQLL(SEQ IDNO：17)。例如，肽化合物具有序列：乙酰基-YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRPLL(SEQ ID NO：18)。
在一个实施方案中，可以在C末端和/或N末端通过添加一个或多个(例如，1至5或1至3个)氨基酸残基修饰肽化合物，旨在于肽末端获得或增加优先性结合位点。例如，该氨基酸可以是半胱氨酸。例如，该氨基酸可以是赖氨酸。例如，该氨基酸可以是添加在肽C末端的半胱氨酸。在一个实施方案中，通过添加半胱氨酸于肽C末端处修饰肽化合物。在一个具体实施方案中，肽化合物具有因在C末端添加半胱氨酸残基受到修饰的分别对应于SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：15的序列：GVRAKAGVRN(Nle)FKSESYC(SEQ ID NO：31)或乙酰基-GVRAKAGVRN(Nle)FKSESYC(SEQ ID NO：32)，。
缀合化合物可以包含例如1至10个或1至5个(例如，1、2，3或4个)与之连接的抗肿瘤剂的分子。抗肿瘤剂的这些分子可以相同或不同，例如，2、3，4种或更多种不同的抗肿瘤剂可以与肽化合物连接。抗肿瘤剂借助至少一个共价键、至少一个原子或至少一个接头与肽化合物连接。在一个实施方案中，至少2个分子的抗肿瘤剂连接至A。在一个实施方案中，所述至少两个分子是相同抗肿瘤剂(例如，化疗剂)的分子。
抗肿瘤剂可以是有能力抑制生长和/或杀伤肿瘤细胞的任何化合物并且例如包括小分子、肽、蛋白质、寡核苷酸(例如，siRNA、shRNA)、放射性核素剂、抗体、以及药物递送系统，包括载有治疗性抗肿瘤剂的纳米粒子、脂质体、纳米管、石墨烯粒子。
在一个实施方案中，抗肿瘤剂是化疗剂。术语“化疗剂”涉及杀伤肿瘤细胞和/或抑制其增殖/生长的药剂。化疗剂的实例包括烷化剂类(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺、二氯甲二乙胺、苯丁酸氮芥、美法仑、达卡巴嗪、亚硝基脲类、替莫唑胺、卡莫司汀、罗莫司汀、链脲佐菌素、白消安、丙卡巴肼)、蒽环类(例如，柔红霉素(Daunorubicin)、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊柔比星(Valrubicin))、细胞骨架干扰剂类(例如，紫杉烷类如紫杉醇、多西他赛、紫杉醇白蛋白(Abraxane)、泰索帝、卡巴他赛(Cabazitaxel))、组蛋白脱乙酰酶抑制剂(例如，伏立诺他(Vorinostat)、罗米地辛)、拓扑异构酶I抑制剂类(例如，伊立替康、拓扑替康)、拓扑异构酶II抑制剂类(例如，依托泊苷、替尼泊苷、Tafluposide)、激酶抑制剂类(例如，硼替佐米、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、威罗菲尼、Vismodegib、达沙替尼、尼洛替尼、奥斯替尼、克唑替尼、达拉菲尼、威罗菲尼、曲美替尼、依鲁替尼)、核苷酸类似物和前体类似物类(例如，阿扎胞苷(Azacitidine)、硫唑嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、去氧氟尿苷、氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、羟基脲、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、硫鸟嘌呤(Tioguanine))、肽抗生素类(例如，博来霉素、放线菌素D)、铂基药物(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂)、维甲酸(维甲酸(Tretinoin)、阿利维甲酸、蓓萨罗丁)、有丝分裂抑制剂类如长春花生物碱类和衍生物(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、毒素类如类美登素(Maytansinoid)、澳瑞司他汀、刺孢霉素、鹅膏毒素或鹅膏蕈碱，以及具有抗肿瘤特性的天然植物化学物质如姜黄素，生物碱类(例如，绿原酸、可可碱、茶碱)、花青苷类(例如，矢车菊素、锦葵色素、类胡萝卜素类(β-胡萝卜素、叶黄素、番茄红素)、香豆雌烷类、黄烷-3-醇类、类黄酮类(例如，表儿茶素、橙皮素、异鼠李素、山柰酚、杨梅黄酮、柚皮苷、川陈皮素、原花色素、槲皮素、芦丁、桔皮素)、羟基肉桂酸类(例如，菊苣酸、香豆素、阿魏酸、莨菪亭)、异黄酮(例如，黄豆苷元、染料木黄酮)、木脂素(例如，水飞蓟素)、单萜类(例如，香叶醇、苧烯)、有机硫化物类(例如，大蒜素、谷胱甘肽、吲哚-3-甲醇、异硫氰酸酯类、莱菔硫烷)、虎刺醛、地高辛(Digoxin)、植酸、酚酸(例如，辣椒碱、鞣花酸、没食子酸、迷迭香酸、鞣酸)、植物甾醇类(例如，β-谷甾醇)、皂素类、茋类(Stylbene)(例如，紫檀芪、白藜芦醇)、三萜类(例如，乌苏酸)、叶黄素类(例如，虾青素、β-隐黄素)和单酚类(例如，羟基酪醇)。
在另一个实施方案中，抗肿瘤剂是抗体或其抗原结合片段，所述抗体识别由肿瘤细胞和更具体地由CSC表达的抗原。
在一个实施方案中，B在所述肽化合物赖氨酸残基的游离胺处、任选地经接头连接于A，或在所述肽化合物的N端位置、任选地经接头连接于A。
在一个实施方案中，B经接头、任选地可切割接头连接于A。
如本文所用的术语“接头”意指将本文公开的肽化合物与至少一种治疗剂连接的化学结构。接头可以在肽化合物上的不同官能团处连接于肽化合物。例如，接头可以在伯胺(胺(-NH2))处连接于肽化合物：这种胺基团存在于每个多肽链的N末端(称作α-胺)和赖氨酸(Lys，K)残基的侧链中(称作ε-胺)。例如，接头可以在羧基(-COOH)处连接于肽化合物：这种羧基基团存在于每个多肽链的C末端处及天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)的侧链中。例如，接头可以在硫氢基(-SH)连接于肽化合物：这种硫氢基基团存在于半胱氨酸(Cys，C)的侧链中。经常，作为蛋白质二级或三级结构的部分，多个半胱氨酸借助二硫键(-S-S-)在它们的侧链之间连接。这些二硫键必须还原成硫氢基，以使得它们可用于被大部分类型的反应基交联。例如，接头可以在羰基(-CHO)处连接于肽化合物：酮或醛基可以在糖蛋白中通过用偏高碘酸钠氧化多糖翻译后修饰(糖基化)来产生。
下表总结了一些用于标准化学缀合的主要接头的反应性类型和化学基团：
例如，可以使用同双官能交联剂和异双官能交联剂。例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)是一种在短间隔臂的任意端具有相同胺-反应性NHS-酯基的同双官能交联剂。例如，磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)是一种在环己烷间隔臂的一个末端处具有胺-反应性磺基-NHS-酯基并且在其对侧末端具有硫氢基反应性马来酰亚胺基的异双官能交联剂。这允许依次、两步骤缀合程序。在市售同双官能交联剂当中有：BSOCOES(双(2-[琥珀酰亚胺氧基羰基氧基]乙基)砜)；DPDPB(1，4-二-(3’-[2吡啶基二硫代]-丙酰氨基)丁烷)；DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)；DST(二琥珀酰亚胺酒石酸酯)；磺基DST(磺基二琥珀酰亚胺基酒石酸酯)；DSP(二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯))；DTSSP(3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺丙酸酯))；EGS(乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯))；和BASED(可碘化的二硫化双-[4-叠氮基水杨酰氨基]-乙基))。
可以通过多种接头，例如，硫氢基基、氨基(胺)或任何适当的反应基缀合肽化合物。接头可以是共价键。接头基团可以包含柔性臂，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碳原子。
示例性接头包括但不限于吡啶二硫化物、硫代磺酸酯、乙烯基磺酸酯、异氰酸酯、酰亚胺酯、二嗪、肼、硫醇、羧酸、多重肽接头和乙炔。备选地，可以使用的其他接头包括BS3[双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯](其是靶向可及伯胺的同双官能N-羟琥珀酰亚胺酯)、NHS/EDC(N-羟琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(NHS/EDC允许伯胺基与羧基缀合)、磺基-EMCS([N-ε-马来酰亚胺己酸]酰肼(磺基-EMCS是对硫氢基和氨基有反应性的异双官能反应基)、酰肼(大部分蛋白质含有暴露的糖类，且酰肼是将羧基与伯胺连接的有用试剂)。
为了形成共价键，可以使用广泛种类的活性羧基(例如，酯)作为化学反应基，其中羟基部分在修饰肽化合物所要求的水平为生理可接受的。具体试剂包括例如N-羟琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基-硫代琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、马来酰亚胺-苯甲酰基-琥珀酰亚胺(MBS)、γ-马来酰亚胺-丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、马来酰亚胺丙酸(MPA)、马来酰亚胺己酸(MHA)和马来酰亚胺十一烷酸(MUA)。
伯胺是NHS酯的主要靶；NHS酯与伯胺反应以形成共价酰胺键。在蛋白质N末端和赖氨酸的ε-胺上存在的可及性α-胺基与NHS酯反应。因此，本文中公开的缀合化合物可以包含这样的接头，其具有NHS酯与肽化合物的N末端氨基或赖氨酸的ε-胺缀合。当NHS酯与伯胺反应，释放N-羟琥珀酰亚胺时，酰胺键形成。含有反应基的琥珀酰亚胺可以更简单地称作琥珀酰亚胺基。在一些实施方案中，肽化合物上的官能团是巯基并且化学反应基是含马来酰亚胺的基团如γ-马来酰亚胺-丁基酰胺(GMBA或MPA)。这类含马来酰亚胺的基团可以在本文中称作maleido基。
胺至胺接头包括NHS酯、酰亚胺酯和其他，下文列出其实例。
接头也可以是硫氢基至硫氢基接头，如下文所列的马来酰亚胺类和吡啶基二硫醇类。
接头可以是胺至硫氢基接头，其包括NHS酯/马来酰亚胺化合物。下文提供这些化合物的实例。
接头可以与氨基和非选择性实体反应。这类接头包括NHS酯/芳基叠氮化物和NHS酯/二氮丙啶接头，下文列出其示例。
示例性胺至羧基接头包括碳二亚胺化合物(例如，DCC(N，N-二环己基碳二亚胺)和EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺))。示例性硫氢基至非选择性接头包括吡啶基二硫醇/芳基叠氮化物化合物(例如，APDP((N-[4-(p-叠氮基-水杨酰氨基)丁基]-3’-(2’-吡啶基二硫代)丙酰胺))。示例性硫氢基至糖接头包括马来酰亚胺/酰肼化合物(例如、BMPH(N-[β-马来酰亚胺丙酸]酰肼)、EMCH([N-ε-马来酰亚胺己酸]酰肼)、MPBH 4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸酰肼)和KMUH(N-[κ-马来酰亚胺十一烷酸]酰肼))和吡啶基二硫醇/酰肼化合物(例如，PDPH(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基酰肼))。示例性碳水化合物至非选择性接头包括酰肼/芳基叠氮化物化合物(例如，ABH(对-叠氮基苯甲酰基酰肼))。示例性羟基至硫氢基接头包括异氰酸酯/马来酰亚胺化合物(例如，(N-[对马来酰亚胺苯基]异氰酸酯))。示例性胺至DNA接头包括NHS酯/补骨脂素化合物(例如，SPB(琥珀酰亚胺基-[4-(补骨烯-8-基氧基)]-丁酸酯))。
为了在缀合肽化合物中产生复杂度不同的分支点，接头可以有能力连接3-7个实体。
TMEA和TSAT通过它们的马来酰亚胺基与硫氢基反应。THPP的羟基和羧基可以与伯胺或仲胺反应。其他可用的接头符合于式Y＝C＝N-Q-A-C(O)-Z，其中Q是同芳或杂芳环系统；A是单键或未取代或取代的二价C1-30桥接基团，Y是O或S；并且Z是Cl、Br、I、N3、N-琥珀酰亚胺基氧基、咪唑基，1-苯并三唑基氧基、其中Ar是缺电子活化性芳基的OAr、或其中R是-A-Q-N＝C＝Y或C4-20叔烷基的OC(O)R(参见美国专利号4,680,338)。
其他可用的接头具有式其中R1是H、C1-6烷基、C2-6链烯基、C6-12芳基或芳烷基或与二价有机-O-、-S-或/>偶联的这些基团，其中R’是C1-6烷基、连接部分(linking moiety)；R2是H、C1-12烷基、C6-12芳基或C6-12芳烷基，R3是/> 或另一个能够使毗邻氮的孤对电子移位的化学结构并且R4是能够使R3连接至肽化合物的侧挂反应基(参见例如美国专利号5,306,809)。
接头可以包含至少一个氨基酸残基并且可以是至少或约2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、30、40或50个氨基酸残基的肽。在接头是单个氨基酸残基情况下，它可以是任何天然存在或非天然存在的氨基酸(例如，Gly或Cys)。在接头是短肽的情况下，它可以是富甘氨酸肽(其倾向于柔性)如具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n的肽，其中n是从1至6的整数(包含1至6)(参见美国专利号7,271,149)或富丝氨酸肽接头(参见美国专利号5,525,491)。富丝氨酸肽接头包括式[X-X-X-X-Gly]y(SEQ ID NO：19)的那些，其中多达二个X是Thr，剩余X是Ser，并且y是大于1的整数，例如1至5(包含1至5)(例如，[Ser-Ser-Ser-Ser-Gly]y(SEQ IDNO：20)，其中y是大于1的整数，例如从1至5)。其他接头包括刚性接头(例如，PAPAP(SEQ IDNO：21)和(PT)nP，其中n是2、3、4、5、6或7)和α-螺旋接头(例如，A(EAAAK)nA(SEQ ID NO：22)，其中n是1、2、3、4或5)。
接头可以是脂族接头(例如，具有连接多肽的酰胺键和连接治疗剂的酯键)。在使用脂族接头的情况下，它可以在长度(例如，C1-C20、C1-C12、C1-C6)和其包含的化学部分(例如，氨基或氨基甲酸酯)方面变动。
合适的氨基酸接头的实例是琥珀酸、Lys、Glu和Asp，或二肽如Gly-Lys。当接头是琥珀酸时，其一个羧基可以与氨基酸的氨基残基形成酰胺键，并且其另一个羧基可以例如与肽或取代基的氨基形成酰胺键。当接头是Lys、Glu或Asp时，其一个羧基可以与氨基酸的氨基残基形成酰胺键，并且其氨基可以例如与取代基的羧基形成酰胺键。当使用Lys作为接头时，又一个接头可以插入Lys的ε-氨基和取代基之间。这又一个接头可以是琥珀酸，其可以与Lys的ε-氨基及与取代基中存在的氨基形成酰胺键。在一个实施方案中，这又一个接头是Glu或Asp(例如，其与Lys的ε-氨基形成酰胺键并且与取代基中存在的羧基形成另一个酰胺键)，即，取代基是Nε-酰化的赖氨酸残基。
接头也可以是分枝多肽。示例性分枝肽接头在美国专利号6,759,509中描述。
接头可以提供可切割键(例如，硫酯键)或不可切割键(例如，马来酰亚胺键)。例如，细胞毒性蛋白可以与接头结合，所述接头与多肽中的赖氨酸残基处和多肽的氨基端处存在的修饰的游离胺反应。因此，可用于本发明缀合化合物中的接头可以包括与缀合于治疗剂部分的多肽或经修饰多肽上的伯胺反应的基团。更具体，接头可以选自单氟环辛炔(MFCO)、双环并[6.1.0]壬炔(BCN)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)、马来酰亚胺与二苯并环辛炔酯(DBCO酯)。给定接头中的可用环辛炔类包括OCT、ALO、MOFO、DIFO、DIBO、BARAC、DIBAC和DIMAC。
接头可以包含柔性臂，例如，短臂(＜2个碳的链)、中等大小臂(2-5个碳的链)或长臂(3-6个碳的链)。
点击化学(click chemistry)也可以用于肽上缀合(DBCO接头、TCO接头、四嗪接头、叠氮化物接头和炔接头)。这些接头家族可以对胺基、羧基和硫氢基反应。另外，这些接头也可以生物素酰化、聚乙二醇化、用荧光成像染料修饰或磷酰亚胺化以便掺入寡核苷酸序列上。
在一个实施方案中，抗肿瘤剂-肽化合物缀合物由式(LIII)或(LIV)所代表：
GVRAK(Z1)AGVRN(Nle)FK(Z2)SESY(LIII)(SEQ ID NO：23)；
乙酰基-GVRAK(Z1)AGVRN(Nle)FK(Z2)SESY(LIV)(SEQ ID NO：24)；
其中Z1和Z2各自独立地是与赖氨酸(K)残基连接的抗肿瘤剂(例如，化疗剂)。
在一个实施方案中，缀合化合物是：GVRAK(姜黄素)AGVRN(Nle)FK(姜黄素)SESY-式(XIV)(SEQ ID NO：25)，所述式包含具有SEQ ID NO：10的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的姜黄素分子；或YK(姜黄素)SLRRK(姜黄素)APRWDAPLRDPALRQLL式(XV)(SEQID NO：26)，所述式包含具有SEQ ID NO：11的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的姜黄素分子。
在一个实施方案中，缀合化合物是：乙酰基-GVRAK(姜黄素)AGVRN(Nle)FK(姜黄素)SESY-式(XVI)(SEQ ID NO：27)，所述式包含具有SEQ ID NO：15的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的姜黄素分子；或乙酰基-YK(姜黄素)SLRRK(姜黄素)APRWDAPLRDPALRQLL-式(XVII)(SEQ ID NO：28)，所述式包含具有SEQ ID NO：16的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的姜黄素分子。
在一个实施方案中，缀合化合物是GVRAK(多西他赛)AGVRN(Nle)FK(多西他赛)SESY-式(XIX)(SEQ ID NO：29)，所述式包含具有SEQ ID NO：10的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的多西他赛分子。
在另一个实施方案中，缀合化合物是乙酰基-GVRAK(多西他赛)AGVRN(Nle)FK(多西他赛)SESY式(XXIII)(SEQ ID NO：30)，所述式包含具有SEQ ID NO：15的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的多西他赛分子。
在一个实施方案中，缀合化合物是GVRAK(多柔比星)AGVRN(Nle)FK(多柔比星)SESY-式(XXVI)(SEQ ID NO：33)，所述式包含具有SEQ ID NO：10的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的多柔比星分子。
在另一个实施方案中，缀合化合物是乙酰基GVRAK(多柔比星)AGVRN(Nle)FK(多柔比星)SESY-式(XXVIII)(SEQ ID NO：34)，所述式包含具有SEQ ID NO：15的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的多柔比星分子。
在一个实施方案中，缀合化合物是GVRAKAGVRN(Nle)FKSESYC(阿多柔比星)-式(LI)(SEQ ID NO：35)，所述式包含具有SEQ ID NO：31的肽化合物，其中半胱氨酸残基具有与其连接的阿多柔比星分子，或包含具有SEQ ID NO：10的肽化合物，其中将半胱氨酸残基添加至所述肽化合物的C末端，并且其中该半胱氨酸残基具有与其连接的阿多柔比星分子。
在一个实施方案中，缀合化合物是乙酰基-GVRAKAGVRN(Nle)FKSESYC(阿多柔比星)-式(LII)(SEQ ID NO：36)，所述式包含具有SEQ ID NO：32的肽化合物，其中半胱氨酸残基具有与其连接的阿多柔比星分子，或包含具有SEQ ID NO：15的肽化合物，其中将半胱氨酸残基添加至所述肽化合物的C末端，并且其中半胱氨酸残基具有与其连接的阿多柔比星分子。
在一个实施方案中，缀合物以前药形式施用。如本文所用的术语“前药”指已知化合物或组合物的活性形式的衍生物，其中当施用至受试者时所述衍生物逐渐转化成活性形式以产生更好的治疗反应和/或降低的毒性水平。从总体上看，前药将是本文公开的化合物的功能性衍生物，所述功能性衍生物轻易地可体内转化成化合物，所述化合物理论上衍生自该功能性衍生物。前药包括但不限于酰基酯、碳酸酯、磷酸酯和氨基甲酸酯。这些组为示例性且非穷尽性，并且本领域技术人员可能制备前药的其他已知变体。前药可以例如与可获得的羟基、硫醇、氨基或羧基形成。例如，本公开缀合物中可获得的OH和/或NH2可以使用活化的酸在碱存在下并且任选地在惰性溶剂(例如吡啶中的酰基氯)中酰化。一些已经作为前药利用的常见酯是苯基酯、脂族(C1-C24)酯、酰氧基甲基酯、氨基甲酸酯和氨基酸酯。在某些情况下，本公开化合物的前药是这样的前药，其中所述前药化合物中的羟基和/或氨基作为可能在体内转化成羟基和/或氨基的基团被掩蔽。选择和制备合适前药的常规方法例如在“Design of Prodrugs”H.Bundgaard编著，Elsevier，1985中描述。
缀合物的共价修饰涵盖于本公开的范围内。共价修饰包括使缀合物的已靶向氨基酸残基跟能够与缀合物的选定侧链或N端残基或C端残基反应的有机衍化剂(organicderivatizing agent)反应。其他修饰包括谷氨酰胺酰残基和天冬酰胺酰残基分别地脱酰胺化成相应的谷氨酰残基和天冬氨酰残基；脯氨酸和赖氨酸的羟化；丝氨酰残基或苏氨酰残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，第79-86页(1983))。本公开范围内涵盖的缀合物的其他类型共价修饰包括使缀合物连接至蛋白质(例如，白蛋白)或至非蛋白质聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇，或聚氧化烯类，这可以例如增加缀合物的体内半寿期。
在一个实施方案中，将本文公开的缀合化合物或其可药用盐制剂成药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物还包含可药用载体或赋形剂。这类组合物可以按制药领域熟知的方式，通过具有合适纯度的缀合化合物与一种或多种任选的可药用载体或赋形剂混合来制备(参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，编者Loyd V Allen，Jr，2012，第22版，Pharmaceutical Press；Handbook of Pharmaceutical Excipients，编者Rowe等人，2012，第7版，Pharmaceutical Press)。载体/赋形剂可以适于通过任何常规的施用途径施用缀合化合物，例如，口服、静脉内、肠胃外的、皮下、肌内、颅内、眶内、眼药、心室内、囊内、椎管内、鞘内、硬膜外、脑池内、腹膜内、鼻内或肺部(例如，气溶胶)施用。在一个实施方案中，载体/赋形剂适应于通过静脉内或皮下途径施用缀合化合物或其盐。在一个实施方案中，载体/赋形剂适应于通过静脉内途径施用缀合化合物。在另一个实施方案中，载体/赋形剂适应于通过皮下途径施用缀合化合物或其盐。在另一个实施方案中，载体/赋形剂适应于通过口服途径施用缀合化合物或其盐。
如本文所用的“赋形剂”具有其本领域的正常含义并且是本身不是活性成分(药物)的任何成分。赋形剂例如包括粘结剂、润滑剂、稀释剂、填料、增稠剂、崩解剂、增塑剂、包衣、阻隔层制剂、润滑剂、稳定剂、释放延迟剂和其他组分。如本文所用的“可药用赋形剂”指不干扰有效成分的生物学活性效度及对受试者无毒的任何赋形剂，即，其是对受试者无毒的赋形剂类型和/或以对受试者无毒的量使用。赋形剂为本领域熟知，并且本发明的系统不在这些方面受限。在某些实施方案中，组合物可以包含赋形剂如一种或多种粘结剂(粘合剂)、增稠剂、表面活性剂、稀释剂、释放延迟剂、着色剂、芳香剂、填料、崩解剂/溶出促进剂、润滑剂、增塑剂、二氧化硅助流剂、抗结块剂、抗粘剂、稳定剂、抗静电剂、溶胀剂及其任意组合。如技术人员将认识到，单一赋形剂可以同时满足多于两种功能，例如，可以既充当粘合剂，又充当增稠剂。如技术人员还将认识到这些术语并不必然互斥。可注射用制剂的常用赋形剂的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及其组合。在许多情况下，将优选在组成上包括等渗剂例如糖；多元醇如甘露醇、山梨醇；或氯化钠。可药用物质的额外实例是增加保质期或效度的润湿剂或辅助物质，如乳化剂、防腐剂或缓冲剂。
缀合物的待施用精确量/剂量将根据诸因素变动，如涉及的具体癌细胞和具体癌疾病；癌疾病的累及程度或严重程度；癌症患者的体格大小、年龄和总体健康状况；个体患者的反应；施用的具体化合物；所施用制品的生物利用率特征；选择的施用方案；缀合物是否单独施用或联合其他药剂施用；缀合物的药效动力学特征及其施用模式和途径；和医师或作为本领域技术人员通过使用已知技术和通过观察类似条件下所获得的结果将轻易确定的其他有关特征。将缀合物/组合物适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。优选地，在体外确定剂量-反应曲线、并且然后在人类中检验之前在可用的动物模型中确定剂量-反应曲线是可取的。本公开对缀合物和包含所述缀合物的组合物提供剂量。例如，取决于疾病类型和严重程度，每kg(mg/kg)体重每日约1μg/kg至1000mg。进一步地，有效剂量可以是0.5mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg/25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg，并且可以按25mg/kg增量增加到多达1000mg/kg，或可以在前述值的任何二者之间。取决于上文提到的因素，常见的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于病状，治疗将维持直至对疾病症状的所需抑制作用出现为止。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进展情况。
本文所述的缀合化合物或其盐或包含其的组合物可以与一种或多种额外的活性剂或疗法(放疗、手术、疫苗等)联合使用，用于治疗靶向的疾病或用于管理靶向的疾病/病症的一种或多种症状(例如，镇痛药、抗恶心药等)。在一个实施方案中，本文所述的缀合化合物与一个或多个化疗剂、免疫疗法、检查点抑制剂、基于细胞的疗法等联合使用。适合与本文所述的缀合物联合使用的示例化疗剂包括但不限于长春花生物碱类、破坏微管形成的药剂(如秋水仙碱及其衍生物)、抗血管生成药、治疗性抗体、EGFR导引剂、酪氨酸激酶导引剂(如酪氨酸激酶抑制剂)、过渡金属络合物、蛋白酶体抑制剂、抗代谢物(如核苷类似物)、烷基化剂、基于铂剂的药剂、蒽环类抗生素、拓扑异构酶抑制剂、大环内酯类、维甲酸(如全反式维甲酸或其衍生物)；格尔德霉素或其衍生物(如17-AAG)和本领域公认的其他癌症治疗剂。在一些实施方案中，与本文所述的缀合物联合使用的化疗剂包括以下一者或多者：阿霉素、秋水仙碱、环磷酰胺、放线菌素D、博来霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、丝裂霉素、氨甲喋呤、米托蒽醌、氟尿嘧啶、卡铂、卡莫司汀(BCNU)、甲基-CCNU、顺铂、依托泊苷、干扰素、喜树碱及其衍生物、苯芥胆甾醇、紫杉烷及其衍生物(例如，紫杉酚、紫杉醇及其衍生物、紫杉特尔(taxotere)及其衍生物、等)、托泊替康、长春碱、长春新碱、他莫昔芬、哌泊舒凡、nab-5404、nab-5800、nab-5801、伊立替康、HKP、奥他赛(Ortataxel)、吉西他滨、奥沙利铂、长春瑞滨、/>卡培他滨、/>拉帕替尼、索拉非尼、厄洛替尼、爱必妥、其衍生物等。在一个实施方案中，本文所述的缀合化合物或包含前者的组合物与EGFR或酪氨酸激酶导引剂，例如EGFR抑制剂(RTK抑制剂)联合使用。本文所述的缀合化合物或其盐或包含前者的组合物也可以与一种或多种治疗性抗体或抗体片段(例如，用于治疗肿瘤的治疗性抗体或抗体片段)联合使用。用于治疗癌症的抗体示例包括靶向以下者的抗体：CD52(例如，阿伦珠单抗(Alemtuzumab))、VEGF/VEGFR(例如，贝伐单抗、雷莫芦单抗)、EGFR(例如，西妥昔单抗、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、帕尼单抗)、CD38(例如，达雷木单抗(Daratumumab)、艾萨妥昔单抗(Isatuximab))、RANKL(例如，地诺单抗(Denosumab))、GD2(例如，地努妥昔单抗(Dinutuximab)、那昔妥单抗(Naxitamab-gqgk))、SLAMF7(例如，依洛珠单抗(Elotuzumab))、HER2(例如，玛格妥昔单抗(Margetuximab-cmkb)、帕妥珠单抗)、CCR4(例如，莫格利珠单抗(Mogamulizumab))、CD20(阿托珠单抗、奥法木单抗(Ofatumumab)、利妥昔单抗)、BCMA(例如，特立妥单抗(Teclistamab))、CD19(例如，他法西他单抗(Tafasitamab))、CTLA-4(例如，曲美木单抗(Tremelimumab))、LAG-3(例如，瑞拉利单抗(Relatlimab))、PD-1(例如，替雷利珠单抗(Tislelizumab)、派安普利单抗(Penpulimab)、信迪利单抗(Sintilimab)、托瑞帕利单抗(Toripalimab)、瑞弗利单抗(Retifanlimab)、多塔利单抗(Dostarlimab))、PD-L1(例如，德瓦鲁单抗(Durvalumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、阿特朱单抗)、EpCAM(例如，泊洛妥珠单抗(Oportuzumab)、依决洛单抗)、Nectin-4(例如，恩诺单抗(Enfortumab))、CD79b(例如，泊洛妥珠)。
活性剂的组合和/或包含其的组合物可以按常规剂型(例如，依次、同时地、在不同时间)施用或共施用。共施用在本发明的上下文中指在协调的治疗期间施用多于一种治疗剂以实现改善的临床结局。这种共施用也可以是共同延伸，即，在重叠时间段期间出现。例如，第一药物(例如，本文所述的缀合化合物)可以在施用第二活性剂(例如，化疗剂或免疫治疗)之前、同期、在其之前和之后、或在其后施用至患者。在一个实施方案中，诸药剂可以在单一组合物中合并/配制并且因此在相同时间施用。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”指哺乳动物，如啮齿类、猫、犬和灵长类。优选地，根据本公开的受试者或患者是人。
实施例
本公开通过以下非限制性实施例以进一步详细说明。
实施例1：材料和方法
试剂：TH19P01(GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY，SEQ ID NO：10)和TH1902(乙酰基-GVRAK(多西他赛)AGVRN(Nle)FK(多西他赛)SESY，SEQ ID NO：30)如先前所述合成(PCT公开号WO2017/088058)。通过以下方式修饰TH19P01肽合成了TH19P01-Alexa FluorTM 488：添加半胱氨酸至C端残基(TH19P01-CtermCys)以允许连接Alexa FluorTM 488标签。TH19P01-CtermCys以浓度2.5mg/ml溶解于15％乙腈/甲酸(0.1％)中。将按10mg/ml浓度溶解于DMSO中的AlexaFluorTM 488C5-马来酰亚胺(Invitrogen，#A10254)添加至TH19P01-CtermCys溶液(比率：1mg荧光探针/5mg肽)。这个比率含有过量肽，旨在充分缀合溶液中的荧光探针。用0.1N NaOH调节混合物的pH至5。通过UPLC-MS(在pH 5约5-10分钟)跟踪反应至完成，随后使用30RPC树脂连同A)水中0.1％甲酸和B)ACN中0.1％甲酸，在AKTA纯化仪上通过制备级HPLC纯化AlexaFluor 488TM标记的TH19P01肽(TH19P01-Alexa Fluor 488)。测试良好级分，汇集并冻干。TH19P01-Alexa 488是黄色粉末，避光储存于-20℃直至使用。多西他赛购自Tecoland Inc。
肿瘤细胞系：三阴性人乳腺癌干细胞(hBCSC)购自Celprogen(San Pedro，目录号36102-29)。人三阴性乳腺癌(TNBC)衍生的MDA-MB-231/Luc(上皮乳腺腺癌)细胞获自CellBiolabs Inc.(San Diego，目录号AKR-231)。犬肾上皮MDCK-MDR1细胞由Amanda Yancy博士(AstraZeneca Pharmaceuticals，LP，Wilmington DE，USA)提供(Cancer ChemotherPharmacol(2005)56：173-181)。
细胞系和细胞培养：含血清(#M36102-29S)的人乳腺癌干细胞完全生长培养基(#M36102-29S)和非分化培养基(#M36102-29US)，以及它们相应的人乳腺癌干细胞培养物胞外扩增(#E36102-29-T75)或非分化(#U36102-29-T75)基质预包被的T75瓶获自Celprogen。DMEM培养基(Wisent，#319-005-CL)、100x非必需氨基酸(NEAA；HycloneTM Laboratories；GEHealthcare Life Sciences，#30238.01)和胎牛血清(FBS；Thermo Fisher Scientific，Inc.；#12483-020)用于培养MDA-MB-231/luc细胞。高葡萄糖DMEM来自Wisent(St-BrunoQC，#319-020-CL)。人三阴性人乳腺癌干细胞(hBCSC，目录号36102-29，标志物CD133、CD44、SSEA3/4和Oct4阳性)、人卵巢癌干细胞(hOvCSC，目录号36113-40，标志物CD44、CD133、SSEA3/4、Oct4、Sox2、Nanog、cKit、巢蛋白和Lin28阳性)和人胰腺癌干细胞(hPCSC，目录号36115-42，标志物CD133、CD44、SSEA3/4、Oct4和巢蛋白阳性)购自Celprogen(Torrance，CA)。将细胞在37℃于增湿气氛(5％CO2)下培育为贴壁单层。在补充有10％FBS连同1X NEAA的DMEM中培养MDA-MB-231/luc细胞。在补充有1X NEAA溶液和10％FBS的高葡萄糖DMEM中培育MDCK-MDR1细胞。将hBCSC、hOvCSC和hPCSCS在其适宜的生长培养基和非分化培养基连同血清中，根据提供商的说明(Celprogen)，使用相应的扩增和非分化基质预包被的T75瓶培育。
对于实验使用，通过胰蛋白酶(Wisent，#325-042-CL)处理5-10分钟使细胞从培养瓶脱离，随后稀释10倍并且通过添加完全培养基来中和。在细胞的台盼蓝(0.4％，ThermoFisher Scientific，#15250061)拒染法后，通过血细胞计数板(HausserScientific，#3200)人工评估细胞计数。
用TH19P01-Alexa Fluor TM488评估胞内荧光：将hBCSC在12孔板中的完全培养基中培育24小时。在一些实验中，将细胞用HBSS(无苯酚)洗涤并在HBSS中200nM Alexa FluorTM488标记的TH19P01存在或不存在下连同过量未标记的TH19P01(50μM)、神经降压肽(10μM)(Ambiopharm；North Augusta，SC；#APi1260)或颗粒蛋白前体(1nM)(Sigma-Aldrich；Oakville，ON；#K110517-L1)一同(或其缺少时)孵育。在另一个实验中，将siScrambled转染的或siSORT1转染的细胞用HBSS洗涤并在HBSS中存在或不存在200nM Alexa Fluor TM488标记的TH19P01下孵育。对于这两个类型的实验，在37℃孵育2小时后，将细胞用HBSS洗涤，经胰蛋白酶消化，再次洗涤并且使用C6 AccuriTM流式细胞仪(BD Biosciences，SanJose，CA)在FL1通道中评估荧光。
分拣蛋白沉默：使用LipofectamineTM 2000(ThermoFisher Scientific，Burlington，ON)，将hBCSC用100nM乱序siRNA序列(AllStar阴性对照siRNA，1027281)或针对SORT1 mRNA生成的人siRNA(Hs_SORT_5FlexiTube siRNA：SI03115168；Qiagen，Valencia，CA)瞬时转染24小时。
供试品抑制hBCSC迁移：使用刮划(伤口愈合)测定法，实施细胞迁移实验。将细胞(2.8x105个细胞/孔)铺种在6孔板中24小时并且随后使用p200无菌吸头刮划。将细胞用无血清培养基洗涤以移除脱离的细胞，随后用含有溶媒(DMSO)、2μM多西他赛或1μM TH1902的无血清培养基处理2小时。将细胞用完全培养基漂洗并且在新鲜的完全培养基中孵育48小时。在刮划后0、24和48小时用倒置显微镜采集图像。
通过流式细胞术评估hBCSC凋亡：根据生产商的说明，使用凋亡检测试剂盒(BDPharmingen，Mississauga ON)进行膜联蛋白V/PI染色。简而言之，将hBCSC(1.3x105个细胞/孔)接种在12孔板中24小时。将细胞在血清衍生的培养基中用溶媒(DMSO)、4μM多西他赛或2μM TH1902处理2小时。将细胞用完全培养基洗涤并且在新鲜的完全培养基中孵育22、48和72小时。最终收获细胞，使其重悬于100μl 1X含5μL膜联蛋白V-FITC的结合缓冲液和5μLPI的染色液中。将细胞在室温避光温育15分钟，之后用流式细胞术分析。测量凋亡程度，随后使用BD AccuriTM C6软件分析。
多西他赛和TH1902对微管蛋白聚合的影响：将hBCSC在预包被的18mm显微镜盖玻片(Celprogen，#E36102-29-CS18)上培育至80％汇合度，用PBS漂洗并且在37℃暴露于含溶媒(DMSO)、4μM多西他赛或2μM TH1902的无血清培养基。在孵育2小时后，将细胞用完全培养基漂洗并且在新鲜的完全培养基中孵育48小时。随后将细胞用PHEM缓冲液(60mM Pipes、25mM HEPES、10mM EGTA和2mM MgCl2，pH 6.9)洗涤并且用4％多聚甲醛固定15分钟，随后用PHEM缓冲液中的1％TritonTM X-100透化5分钟并再次用PHEM缓冲液洗涤。将细胞在含有10％正常山羊血清和0.05％TritonTM的PBS(2.6mM KCl、1.4mM KH2PO4、136.9mM NaCl和6.5mM Na2HPO4·7H2O；pH 7.2)中封闭并且随后与1∶2000稀释于洗涤缓冲液(含5％正常山羊血清和0.025％Triton的PBS)中的抗α-微管蛋白单克隆一抗(克隆B-5-1-2，Sigma-Aldrich；#T5168)孵育1小时。将细胞用洗涤缓冲液洗涤并且与Alexa FluorTM 488缀合的山羊抗小鼠第二抗体(1∶1000；Invitrogen；#A-11001)孵育1小时，用稀释的封闭缓冲液洗涤，用DAPI(PBS中2μg/ml，Invitrogen；#D1306)染色3分钟，在洗涤封闭缓冲液中再次洗涤并且使用ProlongTM Gold抗褪色试剂(Invitrogen、P36934)封装到载玻片上。细胞图片最终借助共聚焦显微术(Nikon A1)数字化并且使用NIH ImageJTM 1.4.21版软件分析。用于AlexaFluorTM 488的激发波长和发射波长分别是488nm和525nm；用于DAPI的激发波长和发射波长分别是404nm和450nm。
用供试品处理hBCSC后的细胞周期分析：将hBCSC细胞(2.8x105个细胞/孔)和MDA-MB-231/luc细胞(2.3x105个细胞/孔)在处理之前一天接种于6孔板中。为了测试多西他赛和TH1902对细胞周期时相的影响，将hBCSC细胞和MDA-MB-231/luc细胞在无血清培养基中用溶媒(DMSO)、4μM多西他赛或2μM TH1902(等摩尔的多西他赛)处理2小时，用完全培养基漂洗并且在新鲜的完全培养基中孵育22小时和48小时。对于采用P-gp抑制剂的实验，将hBCSC首先在无血清培养基中用溶媒(DMSO)或10μM环孢菌素A或PSC-833(P-gp抑制剂)预处理30分钟。接着，将细胞用4μM多西他赛或2μM TH1902在P-gp抑制剂持续存在或不存在下处理2小时，之后漂洗和在新鲜的完全培养基中P-gp抑制剂持续存在或不存在下孵育。随后孵育细胞22小时和48小时。在两种测定法中，孵育后，将细胞用胰蛋白酶脱离，用冰冷的70％EtOH固定并且保持在4℃过夜。将细胞用PBS洗涤一次，之后，将它们在室温用FxCycleTM PI/RNA酶染色液(Thermo Scientific，Waltham，MA；#F10797)染色30分钟。最后使用BDAccuriTM C6 Sampler流式细胞仪对细胞进行细胞周期分析。
通过蛋白质印迹法检测MDR蛋白：将细胞在补充有来自Calbiochem的完全蛋白酶抑制剂混合物(San Diego，CA)的裂解缓冲液(1％SDS)中匀浆。将细胞在室温温育30分钟，每5分钟涡旋混合。随后在超声破碎器(Sonics，型号：Vibra CellTM VC130)上按80％振幅每次3秒3个循环超声处理细胞并且在4℃以15,000g离心10分钟。使用微量BCA蛋白质测定法(Thermo Fisher Scientific，#23235)对蛋白质定量。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离等量的蛋白质(20μg)。随后将蛋白质电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜并在室温使用含0.1％TweenTM-20的Tris-缓冲盐水(150mM NaCl、20mM Tris-HCl，pH 7.5)(TBST)中5％脱脂干乳封闭1小时。将膜在TBST中洗涤并与含3％BSA和0.05％NaN3的TBST中稀释的抗α-Pgp一抗(1μg/ml，Thermo Fisher Scientific#MA1-26528)、抗ABCB5一抗(1∶1,000，NovusBiologicals Centennial，CO，#NBP1-77687)、抗分拣蛋白一抗(鼠mAb(1∶1,000，BDBiosciences，San Jose CA)或兔多克隆Ab(1μg/ml，Abcam，Cambridge MA))孵育过夜。将膜在TBST中洗涤并在室温与含5％脱脂干乳的TBST中，与辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠或抗兔IgG(1/5000稀释度，Jackson Immunoresearch West Grove PA)孵育1小时。将膜在TBST中再次洗涤并且使用增强型化学发光法(Amersham Biosciences，Baie d’Urfé，QC)检测信号。
体内评估多西他赛和TH1902抗肿瘤功效：在异氟烷浅麻醉下通过向NCG三重免疫缺陷性雌性小鼠(Charles River，Saint-Constant QC)的右胁皮下接种103个重悬于100μL含50％MatrigelTM的HBSS中的hBCSC细胞、hOvCSC细胞和hPCSC细胞，建立肿瘤异种移植物。在植入hBCSC或hOvCSCS后三天，通过静脉内快速浓注溶媒(10％聚山梨醇酯-80、5％右旋糖、0.04％甲酸，pH 4.3)、多西他赛(15mg/kg(这种试剂的MTD)或3.75mg/kg(这种试剂的1/4MTD)，溶解于5％右旋糖、3.3％乙醇、1.7％TweenTM-80中)或溶解于溶媒中的TH1902(35mg/kg或8.75mg/kg)，小鼠开始接受每周处理一次。注意TH1902和多西他赛二者浓度含有等摩尔量的多西他赛，这归因于每个TH1902分子有两个多西他赛部分。使用以电子卡尺取得的二维量值，测量肿瘤生长，并且根据以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝π/6×长度×宽度2。每周三次以精度10mg测量动物体重。
统计分析：在图注和相应文本中描述使用的各个统计检验。全部统计分析均使用Prism软件8.3.1版(GraphPad，San Diego CA)进行。
实施例2：荧光标记的TH19P01被hBCSC内化
通过蛋白质印迹分析法评价hBCSC细胞和MDA-MB-231/luc细胞中分拣蛋白的表达(参见图1A)。结果显示，两个细胞系均含有可测量水平的分拣蛋白。hBCSC暴露于单独的溶媒或含200nM荧光肽TH19P01-Alexa FluorTM 488的溶媒两小时。溶媒处理的细胞中所见荧光的水平是所用设备中测量的单独细胞的背景荧光的估计。细胞对TH19P01-Alexa FluorTM488的暴露产生了数量级高于背景荧光并且因此轻易可见的荧光信号(参见图1B)。
实施例3：TH19P01内化受分拣蛋白配体和在分拣蛋白沉默时抑制
为了显示hBCSC对TH19P01-Alexa FluorTM 488的内化由分拣蛋白介导，在过多量的几种已知分拣蛋白配体存在或不存在时使细胞反复暴露于该荧光肽，以确定这些物质是否能够与该肽竞争内化过程。图2A显示神经降压肽(NT)，TH19P01和颗粒蛋白前体(PGRN)对荧光肽向hBCSC中内化的影响。全部三个竞争性试剂均造成胞内荧光显著(p＜0.01)减少约半数，这表明荧光肽内化已经明显减少。通过在乱序siRNA(siScr)或人分拣蛋白特异性siRNA(siSORT1)存在下预孵育hBCSC，为这个结果提供后续确认。后者引起暴露于TH19P01-Alexa FluorTM 488后胞内荧光的量减少77％，这再次表明分拣蛋白参与hBCSC中这种荧光肽的内化。在hOvCSC中获得类似结果(图2C和图2D)，但是在hOvCSC与人分拣蛋白特异性siRNA(siSORT1)预孵育之后暴露于TH19P01-Alexa Fluor 488之后的胞内荧光量减少得较不明显(37％)(图2D)，提示卵巢CSC中对于TH19P01-Alexa FluorTM 488可能的备选性分拣蛋白非依赖性内化机制。
实施例4：hBCSC迁移受多西他赛或TH1902抑制
一个标准的细胞迁移测量法是刮划测定法，其中将贴附有培养的肿瘤细胞的载玻片的一个区域刮尽细胞，并且监测肿瘤细胞对该区域的后续再定居。如图3显示，初始移除细胞导致特定区域清空细胞。在移除细胞后24小时，含溶媒的培养基处理的已清空区域以及用含2μM多西他赛的培养基处理的那些区域已经被彻底地再定居并且不再能够区分裸露的区域。相反，已经用TH1902处理的区域保持实际上没有hBCSC至少48小时。这显示TH1902抑制hBCSC迁移。
实施例5：通过多西他赛或TH1902诱导hBCSC凋亡
使hBCSC暴露于TH1902或多西他赛，以观察它们是否能够诱导凋亡。在图4A中显而易见的是，TH1902在这些细胞中早至处理后22小时引起凋亡大幅增长，凋亡在接下来50小时期间继续增长，而多西他赛处理的细胞中的凋亡不可与对照细胞中所见的凋亡区分。依据处理后48小时处TH1902处理的许多细胞中出现片段化胞核确认了这个结果(参见图4B)，片段化胞核在溶媒处理或多西他赛处理的细胞中见不到。在处理后48小时处还检查细胞形态。如在图4C和图4C中可以见到，用TH1902或多西他赛处理hBCSC造成截然不同于溶媒处理细胞的可见形态变化。另外，通过微管蛋白标记法观察到的细胞膨大和微管再组织存在于多西他赛处理的一些细胞中，但在TH1902处理的细胞中更明显。细胞毒药物如多西他赛扰动微管已知导致细胞凋亡。
实施例6：在hBCSC细胞vs.MDA-MB-231/luc细胞中，比较多西他赛和TH1902对G2/M期停滞的诱导
图5A-B中报告的结果显示在hBCSC中，TH1902诱导G2/M细胞周期停滞明显增加，但多西他赛并非如此。在MDA-MB-231细胞中，TH1902和多西他赛引起相似的G2/M细胞周期停滞增加，尽管增加的影响变明显的时间有差异，在TH1902处理(但不是用多西他赛处理)的MDA-MB-231细胞中22小时处检测到某种G2/M细胞周期停滞(图5D，左小图)。这些结果与实施例5中报告的凋亡诱导实验结果一致，提供令人信服的证据：TH1902有能力在已知抵抗标准细胞毒药物如多西他赛处理的hBCSC中诱导细胞周期停滞和凋亡。
实施例7：多药耐药性(MDR)抑制物存在下在hBCSC细胞中比较多西他赛和TH1902对G2/M期停滞的诱导
为了进一步研究多西他赛和TH1902对凋亡的诱导，在MDR蛋白的抑制剂存在下使用这些化合物处理hBCSC。MDR蛋白介导广泛种类的药物从肿瘤细胞排出(并且已知限制多西他赛蓄积)，是化疗耐药性背后的主导因素之一。如图6A中所示，hBCSC比其中借助转染过量表达人蛋白质的犬细胞系MDCK-MDR1表达更高水平的MDR1(P-gp)。另外，还显示hBCSC表达高水平的蛋白质ABCB5(图6A)，一种与MDR1有关的多药物外排蛋白。因此，这些细胞为研究MDR蛋白在抵抗多西他赛诱导凋亡方面的参与情况提供了良好模型。
在多西他赛处理和TH1902处理之间比较G2/M期hBCSC细胞的比例时(图6C和图6D)，注意到的首个差异是TH1902造成G2/M期细胞的比例强烈增长，但多西他赛并非如此(与图5A-D中报告的结果一致)。多药物外排蛋白的二种抑制剂CsA和PCC-831不影响TH1902在hBCSC中诱导G2/M细胞周期停滞的能力。相反，在CsA或PCC-831存在下，多西他赛影响G2/M细胞周期停滞，这类似于随TH1902所见情况。这些结果显示：hBCSC表达的MDR蛋白的外排活性赋予多西他赛耐药性，但TH1902的细胞毒性不受这些蛋白质的存在影响，因此提供证据：靶向分拣蛋白的TH1902和其他基于肽的缀合物可以用于抑制表达或过量表达MDR蛋白的CSC生长。
实施例8：施用TH1902阻止了MDA-MB-231/萤光素酶异种移植的小鼠模型中癌复发
随后使用TNBC的MDA-MB-231/萤光素酶异种移植小鼠模型，评估用多西他赛或TH1902处理是否可能防止癌复发。已经报道MDA-MB-231肿瘤细胞具有带癌干细胞(CSC)样特性的细胞(Sleeboom等人，Int J Mol Sci.2018Oct；19(10)：3047；Ghanbari等人，Int.J.Morphol.，34(4)：1197-1202，2016)。在第0、第7、第14和第21天用溶媒(对照)、多西他赛或TH1902处理具有MDA-MB-231/萤光素酶肿瘤异种移植物的小鼠并且评估肿瘤生长直到第74天。发现虽然用多西他赛处理和用TH1902处理均在施用期间及其后不久导致肿瘤生长减少，但仅TH1902处理才在更晚的时间点防止癌复发。在TH1902处理组中在第74天不能检出残余肿瘤，而在多西他赛处理组中观察到肿瘤复现。这些结果提供证据：TH1902导致MDA-MB-231肿瘤异种移植物中包括CSC在内的全部肿瘤细胞消除，但多西他赛并非如此，并且因此防止因这些细胞的持久性所致的癌复发。
实施例9：施用TH1902减少了异种移植的小鼠模型中乳腺CSC肿瘤、
卵巢CSC肿瘤和胰腺CSC肿瘤的生长
接下来测试TH1902是否能够在体内抑制源自CSC的人肿瘤生长。图7A-C中展示的结果显示：皮下注射来自人TNBC癌(HBCSC，图7A)、卵巢癌(HOvCSC，图7B)和胰腺癌(HPCSC，图7C)的癌干细胞样细胞在免疫缺陷小鼠中导致肿瘤生长。如图7D和图7E中所示，HBCSC、HOvCSC和HPCSC均表达多药耐药蛋白ABCB5和P-gp(MDR1)以及分拣蛋白。
图8A-B、图9A-B和图10A-B中展示的结果显示，按等同于1、1.25或1.5个多西他赛MTD的剂量施用的TH1902导致显著抑制源自乳腺CSC、卵巢CSC和胰腺CSC的肿瘤生长。相反，在施用所述多西他赛MTD(15mg/kg)后测量不到肿瘤生长显著减少。另外，TH1902施用不影响或最小影响动物体重，这与施用多西他赛相反，多西他赛一般与5-10％体重减轻相关，即便在这些小鼠中肿瘤质量增加(图8C、9C和10C)。
实施例10：卵巢CSC肿瘤生长受联合化疗处理抑制
将携带卵巢hOCSC异种移植物的小鼠用溶媒、多西他赛、紫杉醇(paclitaxel)、TH1902或卡铂处理，并且向其他组的小鼠施用与多西他赛、紫杉醇或TH1902联合的卡铂。为了最小化因联合处理所致的副作用风险，减少用于每种药物的剂量至以下水平：多西他赛10mg/kg：TH1902 23mg/kg(等同于多西他赛剂量)；紫杉醇10mg/kg；卡铂40mg/kg(未改变)。
多西他赛的肿瘤生长抑制作用再次明确地次于TH1902(参见图11A和图11B)。紫杉醇和卡铂各自显示实际上等同于用多西他赛所见的肿瘤生长抑制水平。施用与卡铂组合的任一种紫杉烷引起肿瘤生长抑制作用小幅增加。TH1902的抑制作用比任一种紫杉烷大得多(具有或不具有卡铂情况下)并且该抑制作用因与卡铂组合施用而略微增加。单独TH1902所致的肿瘤生长抑制程度如此重大，从而与卡铂联合施用的作用难以测量。
虽然本发明已经在上文借助其具体实施方案加以描述，但可以修改它，而不脱离如所附权利要求限定的主题发明的精神和本质。在权利要求中，措词“包含”作为开放式术语使用，基本上等同于短语“包括但不限于”。除非上下文另行明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括对应的复数提及。
序列表
<110> 瑟瑞技术公司
特拉斯福特普拉斯公司
<120> 用于靶向癌干细胞的方法和结合分拣蛋白的缀合化合物
<130> G11718-00423
<150> US 63/200,284
<151> 2021-02-26
<150> US 63/264,105
<151> 2021-11-16
<160> 36
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 位置1至5处的Xaa可以是任何氨基酸
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<223> 位置21处的Xaa可以是Gln、Pro、Tyr、Ile或Leu
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Ala Leu Arg Xaa Xaa Leu
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Tyr
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成肽
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Asp Pro Ala Leu Arg Gln Leu Leu
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<211> 24
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 12
Tyr Lys Ser Leu Arg Arg Lys Ala Pro Arg Trp Asp Ala Tyr Leu Arg
1 5 10 15
Asp Pro Ala Leu Arg Gln Leu Leu
20
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
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Tyr Lys Ser Leu Arg Arg Lys Ala Pro Arg Trp Asp Ala Tyr Leu Arg
1 5 10 15
Asp Pro Ala Leu Arg Pro Leu Leu
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 14
Gly Val Arg Ala Lys Ala Gly Val Arg Asn Met Phe Lys Ser Glu Ser
1 5 10 15
Tyr
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Nle
<400> 15
Gly Val Arg Ala Lys Ala Gly Val Arg Asn Xaa Phe Lys Ser Glu Ser
1 5 10 15
Tyr
<210> 16
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 16
Tyr Lys Ser Leu Arg Arg Lys Ala Pro Arg Trp Asp Ala Pro Leu Arg
1 5 10 15
Asp Pro Ala Leu Arg Gln Leu Leu
20
<210> 17
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 17
Tyr Lys Ser Leu Arg Arg Lys Ala Pro Arg Trp Asp Ala Tyr Leu Arg
1 5 10 15
Asp Pro Ala Leu Arg Gln Leu Leu
20
<210> 18
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Tyr Lys Ser Leu Arg Arg Lys Ala Pro Arg Trp Asp Ala Tyr Leu Arg
1 5 10 15
Asp Pro Ala Leu Arg Pro Leu Leu
20
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的接头
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Thr或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(4)
<223> 位置1至4处的Xaa不超过两者是Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Thr或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Thr或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Thr或Ser
<400> 19
Xaa Xaa Xaa Xaa Gly
1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的接头
<400> 20
Ser Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的接头
<400> 21
Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的接头
<400> 22
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的缀合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 抗肿瘤药接合至Lys的侧链
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 抗肿瘤药接合至Lys的侧链
<400> 23
Gly Val Arg Ala Lys Ala Gly Val Arg Asn Xaa Phe Lys Ser Glu Ser
1 5 10 15
Tyr
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的缀合物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 抗肿瘤药接合至Lys的侧链
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 抗肿瘤药接合至Lys的侧链
<400> 24
Gly Val Arg Ala Lys Ala Gly Val Arg Asn Xaa Phe Lys Ser Glu Ser
1 5 10 15
Tyr
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的缀合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 香豆素分子连接至Lys的侧链
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 香豆素分子连接至Lys的侧链
<400> 25
Gly Val Arg Ala Lys Ala Gly Val Arg Asn Xaa Phe Lys Ser Glu Ser
1 5 10 15
Tyr
<210> 26
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的缀合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 香豆素分子连接至Lys的侧链
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 香豆素分子连接至Lys的侧链
<400> 26
Tyr Lys Ser Leu Arg Arg Lys Ala Pro Arg Trp Asp Ala Pro Leu Arg
1 5 10 15
Asp Pro Ala Leu Arg Gln Leu Leu
20
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的缀合物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 香豆素分子连接至Lys的侧链
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 香豆素分子连接至Lys的侧链
<400> 27
Gly Val Arg Ala Lys Ala Gly Val Arg Asn Xaa Phe Lys Ser Glu Ser
1 5 10 15
Tyr
<210> 28
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的缀合物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 香豆素分子连接至Lys的侧链
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 香豆素分子连接至Lys的侧链
<400> 28
Tyr Lys Ser Leu Arg Arg Lys Ala Pro Arg Trp Asp Ala Pro Leu Arg
1 5 10 15
Asp Pro Ala Leu Arg Gln Leu Leu
20
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的缀合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 多西他赛分子连接至Lys的侧链
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 多西他赛分子连接至Lys的侧链
<400> 29
Gly Val Arg Ala Lys Ala Gly Val Arg Asn Xaa Phe Lys Ser Glu Ser
1 5 10 15
Tyr
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的缀合物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 多西他赛分子连接至Lys的侧链
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 多西他赛分子连接至Lys的侧链
<400> 30
Gly Val Arg Ala Lys Ala Gly Val Arg Asn Xaa Phe Lys Ser Glu Ser
1 5 10 15
Tyr
<210> 31
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Nle
<400> 31
Gly Val Arg Ala Lys Ala Gly Val Arg Asn Xaa Phe Lys Ser Glu Ser
1 5 10 15
Tyr Cys
<210> 32
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Nle
<400> 32
Gly Val Arg Ala Lys Ala Gly Val Arg Asn Xaa Phe Lys Ser Glu Ser
1 5 10 15
Tyr Cys
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的缀合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 多柔比星分子连接至Lys的侧链
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 多柔比星分子连接至Lys的侧链
<400> 33
Gly Val Arg Ala Lys Ala Gly Val Arg Asn Xaa Phe Lys Ser Glu Ser
1 5 10 15
Tyr
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的缀合物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 多柔比星分子连接至Lys的侧链
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 多柔比星分子连接至Lys的侧链
<400> 34
Gly Val Arg Ala Lys Ala Gly Val Arg Asn Xaa Phe Lys Ser Glu Ser
1 5 10 15
Tyr
<210> 35
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的缀合物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> 阿多柔比星分子连接至Cys残基的侧链
<400> 35
Gly Val Arg Ala Lys Ala Gly Val Arg Asn Xaa Phe Lys Ser Glu Ser
1 5 10 15
Tyr Cys
<210> 36
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的缀合物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> 阿多柔比星分子连接至Cys的侧链
<400> 36
Gly Val Arg Ala Lys Ala Gly Val Arg Asn Xaa Phe Lys Ser Glu Ser
1 5 10 15
Tyr Cys

Claims (77)

1.用于治疗受试者中包含表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)的癌的方法，包括向受试者施用有效量的缀合化合物或其可药用盐，其中缀合化合物具有式A-(B)n，其中
A是30个或更少残基的肽化合物，所述肽化合物包含与式(I)-(XIII)的序列之一具有至少60％序列同一性的氨基酸序列：
X1X2X3X4X5GVX6AKAGVX7NX8FKSESY (I)(SEQ ID NO：1)
(X9)nGVX10AKAGVX11NX12FKSESY (II)(SEQ ID NO：2)
YKX13LRRX14APRWDX15PLRDPALRX16X17L (III)(SEQ ID NO：3)
YKX18LRR(X19)NPLRDPALRX20X21L (IV)(SEQ ID NO：4)
IKLSGGVQAKAGVINMDKSESM (V)(SEQ ID NO：5)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESY (VI)(SEQ ID NO：6)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESYK (VII)(SEQ ID NO：7)
GVQAKAGVINMFKSESY (VIII)(SEQ ID NO：8)
GVRAKAGVRNMFKSESY (IX)(SEQ ID NO：9)
GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY (X)(SEQ ID NO：10)
YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL (XI)(SEQ ID NO：11)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRQLL (XII)(SEQ ID NO：12)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRPLL (XIII)(SEQ ID NO：13)
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X18和X19独立地选自任何氨基酸；
X16、X17、X20和X21独立地选自Q、P、Y、I和L；
n是0、1、2、3、4或5；
当X9存在多于一次时，所述X9每者独立地选自任何氨基酸；
当X19存在多于一次时，所述X19每者独立地选自任何氨基酸，
任选地，肽化合物为环状，
B是至少一种抗肿瘤剂，其中B直接或经接头连接于A。
2.根据权利要求1所述的方法，其中肽化合物包含与式(I)-(XIII)的序列之一具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中肽化合物包含式(I)-(XIII)的序列之一，并且还在其氨基末端和/或羧基末端包含1至3个额外的氨基酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其中肽化合物在其氨基末端和/或羧基末端包含半胱氨酸残基。
5.根据权利要求1所述的方法，其中肽化合物由式(I)所代表并且具有由SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其中肽化合物由式(III)所代表并且具有由SEQ ID NO：3或4的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的方法，其中肽化合物由式(V)所代表并且具有由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的方法，其中肽化合物由式(VI)所代表并且具有由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的方法，其中肽化合物由式(VII)所代表并且具有由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的方法，其中肽化合物由式(VIII)所代表并且具有由SEQ IDNO：8的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的方法，其中肽化合物由式(IX)所代表并且具有由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
12.根据权利要求1所述的方法，其中肽化合物由式(X)所代表并且具有由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
13.根据权利要求1所述的方法，其中肽化合物由式(XI)所代表并且具有由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
14.根据权利要求1所述的方法，其中肽化合物由式(XII)所代表并且具有由SEQ IDNO：12的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
15.根据权利要求1所述的方法，其中肽化合物由式(XIII)所代表并且具有由SEQ IDNO：13的氨基酸序列组成的氨基酸序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中肽化合物在其氨基末端和/或羧基末端包含至少一个修饰基团。
17.根据权利要求16所述的方法，其中至少一个修饰基团是乙酰基或琥珀酰基。
18.根据权利要求1所述的方法，其中肽化合物由式(XXXVIII)、(XXXIX)、(XL)、(XLI)或(XLII)所代表：
乙酰基-GVRAKAGVRNMFKSESY (XXXVIII)(SEQ ID NO：14)
乙酰基-GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY (XXXIX)(SEQ ID NO：15)
乙酰基-YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL (XL)(SEQ ID NO：16)
乙酰基-YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRQLL (XLI)(SEQ ID NO：17)
乙酰基-YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRPLL (XLII)(SEQ ID NO：18)。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中B在所述肽化合物的游离胺处、所述肽化合物的N端位置处、所述肽化合物的游离-SH处和/或所述肽化合物的游离羧基处连接于A。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中B经接头连接于A。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中缀合物由式(LIII)或(LIV)所代表：
GVRAK(Z1)AGVRN(Nle)FK(Z2)SESY (LIII)(SEQ ID NO：23)；
乙酰基-GVRAK(Z1)AGVRN(Nle)FK(Z2)SESY (LIV)(SEQ ID NO：24)；
其中Z1和Z2各自独立地是与赖氨酸(K)残基连接的抗肿瘤剂。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中抗肿瘤剂是放射性核素或化疗剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其中化疗剂是紫杉烷。
24.根据权利要求23所述的方法，其中化疗剂是多西他赛。
25.用于预防或治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的癌复发或再发的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求1至24中任一项所述的缀合物或其盐。
26.用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的预后不良癌的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求1至24中任一项所述的缀合物或其盐。
27.用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的不可切除性、化疗耐药性和抗放射治疗性癌的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求1至24中任一项所述的缀合物或其盐。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中CSC表达至少一种多药耐药(MDR)蛋白。
29.根据权利要求28所述的方法，其中CSC表达MDR1和/或ABCB5。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中癌是乳腺癌、泌尿生殖系统癌、胰腺癌、肺癌、甲状腺癌、肾癌、胃肠道癌、神经内分泌肿瘤、神经母细胞瘤、皮肤癌、脑癌和白血病。
31.根据权利要求30所述的方法，其中泌尿生殖系统癌是卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌或睾丸癌。
32.根据权利要求30所述的方法，其中乳腺癌是浸润性导管癌(IDC)或三阴性乳腺癌(TNBC)。
33.根据权利要求30所述的方法，其中肾癌是肾细胞癌(RCC)。
34.根据权利要求30所述的方法，其中胃肠道癌是结直肠癌。
35.根据权利要求30所述的方法，其中皮肤癌是黑素瘤。
36.根据权利要求30所述的方法，其中脑癌是胶质瘤。
37.根据权利要求30所述的方法，其中白血病是B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)。
38.根据权利要求30所述的方法，其中癌是乳腺癌、卵巢癌或胰腺癌。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中施用缀合物或其盐抑制CSC在受试者中迁移。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中该方法还包括施用一种或多种额外的活性剂或疗法至受试者。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述一种或多种额外的活性剂或疗法包含放疗、手术、化疗剂、免疫疗法、检查点抑制剂和/或基于细胞的疗法。
42.权利要求1至24中任一项所述的缀合物或其盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中包含表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)的癌。
43.权利要求1至24中任一项所述的缀合物或其盐用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的癌复发或再发。
44.权利要求1至24中任一项所述的缀合物或其盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的预后不良癌。
45.权利要求1至24中任一项所述的缀合物或其盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的不可切除性、化疗耐药性和抗放射治疗性癌。
46.根据权利要求42至45中任一项所述的用途，其中CSC表达至少一种多药耐药(MDR)蛋白。
47.根据权利要求46所述的用途，其中CSC表达MDR1和/或ABCB5。
48.根据权利要求42至47中任一项所述的用途，其中癌是乳腺癌、泌尿生殖系统癌、胰腺癌、肺癌、甲状腺癌、肾癌、胃肠道癌、神经内分泌肿瘤、神经母细胞瘤、皮肤癌、脑癌和白血病。
49.根据权利要求48所述的用途，其中泌尿生殖系统癌是卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌或睾丸癌。
50.根据权利要求48所述的用途，其中乳腺癌是浸润性导管癌(IDC)或三阴性乳腺癌(TNBC)。
51.根据权利要求48所述的用途，其中肾癌是肾细胞癌(RCC)。
52.根据权利要求48所述的用途，其中胃肠道癌是结直肠癌。
53.根据权利要求48所述的用途，其中皮肤癌是黑素瘤。
54.根据权利要求48所述的用途，其中脑癌是胶质瘤。
55.根据权利要求48所述的用途，其中白血病是B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)。
56.根据权利要求48所述的用途，其中癌是乳腺癌、卵巢癌或胰腺癌。
57.根据权利要求42至56中任一项所述的用途，其中所述药物抑制CSC在受试者中迁移。
58.根据权利要求42至57中任一项所述的用途，其中所述药物与一种或多种额外的活性剂或疗法使用。
59.根据权利要求58所述的用途，其中一种或多种额外的活性剂或疗法包括放疗、手术、化疗剂、免疫疗法、检查点抑制剂和/或基于细胞的疗法。
60.根据权利要求1至24中任一项所述的缀合物或其盐，用于治疗受试者中包含表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)的癌。
61.根据权利要求1至24中任一项所述的缀合物或其盐，用于预防或治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的癌复发或再发。
62.根据权利要求1至24中任一项所述的缀合物或其盐，用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的预后不良癌。
63.根据权利要求1至24中任一项所述的缀合物或其盐，用于治疗受试者中与存在表达分拣蛋白的癌干细胞(CSC)相关的不可切除性、化疗耐药性和抗放射治疗性癌。
64.根据权利要求60至63中任一项所述用途的缀合物或其盐，其中CSC表达至少一种多药耐药(MDR)蛋白。
65.根据权利要求64所述用途的缀合物或其盐，其中CSC表达MDR1和/或ABCB5。
66.根据权利要求61至65中任一项所述用途的缀合物或其盐，其中癌是乳腺癌、泌尿生殖系统癌、胰腺癌、肺癌、甲状腺癌、肾癌、胃肠道癌、神经内分泌肿瘤、神经母细胞瘤、皮肤癌、脑癌和白血病。
67.根据权利要求66所述用途的缀合物或其盐，其中泌尿生殖系统癌是卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌或睾丸癌。
68.根据权利要求66所述用途的缀合物或其盐，其中乳腺癌是浸润性导管癌(IDC)或三阴性乳腺癌(TNBC)。
69.根据权利要求66所述用途的缀合物或其盐，其中肾癌是肾细胞癌(RCC)。
70.根据权利要求66所述用途的缀合物或其盐，其中胃肠道癌是结直肠癌。
71.根据权利要求66所述用途的缀合物或其盐，其中皮肤癌是黑素瘤。
72.根据权利要求66所述用途的缀合物或其盐，其中脑癌是胶质瘤。
73.根据权利要求66所述用途的缀合物或其盐，其中白血病是B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)。
74.根据权利要求66所述用途的缀合物或其盐，其中癌是乳腺癌、卵巢癌或胰腺癌。
75.根据权利要求60至74中任一项所述用途的缀合物或其盐，其中所述缀合物或其盐抑制CSC在受试者中迁移。
76.根据权利要求60至75中任一项所述用途的缀合物或其盐，其中所述缀合物或其盐用于与一种或多种额外的活性剂或疗法使用。
77.根据权利要求76所述的缀合物或其盐，其中一种或多种额外的活性剂或疗法包含放疗、手术、化疗剂、免疫疗法、检查点抑制剂和/或基于细胞的疗法。
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