BR112020008974A2 - conjugados de ligante-fármaco como substratos para clivagem seletiva pela atividade de exopeptidase da catepsina b - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a conjugados de ligante-fármaco para o tratamento da doença. Em particular, a presente invenção refere-se a conjugados de ligante-fármaco compreendendo um sistema ligante, que é seletivamente reconhecido e clivado pela atividade da exopeptidase (isto é, carboxidipeptidase) de catepsina B, resultando na liberação intracelular melhorada de um fármaco a uma célula alvo. A presente invenção também se refere aos conjugados de ligante-fármaco para a liberação intracelular de agentes citotóxicos em células tumorais.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CON- JUGADOS DE LIGANTE-FÁRMACO COMO SUBSTRATOS PARA
CLIVAGEM SELETIVA PELA ATIVIDADE DE EXOPEPTIDASE DA CATEPSINA B". DESCRIÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a conjugados de ligante- fármaco (LDCs) para o tratamento de doenças. Em particular, a pre- sente invenção se refere a conjugados de ligante-fármaco compreen- dendo um sistema ligante, o qual é seletivamente reconhecido e cliva- do pela atividade da exopeptidase (isto é, carboxidipeptidase) de ca- tepsina B, resultando em liberação melhorada de um fármaco a uma célula alvo. A presente invenção também se refere a conjugados de ligante-fármaco compreendendo um sistema ligante, o qual permite a liberação de múltiplos fármacos, resultando na eficácia melhorada. Em alguns aspectos, a presente invenção se refere a conjugados de ligan- te-fármaco, os quais alcançam uma alta carga de fármaco (por exem- plo, alta razão de fármaco-anticorpo) resultando assim em eficácia significativamente melhorada. Em alguns aspectos, a presente inven- ção também se refere a conjugados de ligante-fármaco para a libera- ção intracelular de fármacos citotóxicos a células tumorais ou células de câncer.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Recentemente, uma grande parte de interesse envolveu o uso de sistemas de liberação de fármaco desencadeados pela enzima tais como conjugados de anticorpo-fármaco (ADCs) para a liberação direcionada de agentes citotóxicos a células tumorais. Os conjugados de anticorpo-fármaco geralmente consistem de três componentes: um anticorpo (por exemplo, um anticorpo monoclonal) que direciona um antígeno altamente expressado em células tumorais, um agente cito- tóxico (algumas vezes chamado “toxina” ou “carga útil”), e um sistema ligante que pode liberar o agente citotóxico (carga útil) a partir do anti- corpo mediante a internalização em células de câncer. De forma ideal, conjugados de anticorpo-fármaco devem reter as propriedades farma- cocinéticas e funcionais favoráveis dos anticorpos, permanecer intac- tas e não tóxicas na circulação sistêmica (sangue), e se tornarem ati- vas no sítio alvo com o fármaco liberado em quantidade suficiente para matar a célula alvo. Sendo assim, um dos maiores desafios no desen- volvimento de conjugados de anticorpo-fármaco representa o design de sistemas ligantes para a conjugação e anticorpo e fármaco, os quais são não tóxicos e estáveis na circulação sistêmica, mas que são, todavia, capazes de liberar o fármaco dentro da célula alvo em quanti- dade suficiente em uma taxa satisfatória.
[003] Um grande número de sistemas ligantes foi desenvolvido para a liberação intracelular específica de fármacos citotóxicos. Exis- tem duas famílias principais de ligantes: cliváveis e não cliváveis. Os ligantes cliváveis geralmente utilizam uma propriedade inerente da cé- lula alvo, por exemplo uma célula tumoral, para liberar o fármaco sele- tivamente (por exemplo, um agente citotóxico) a partir do conjugado, a saber (1) sensibilidade da protease (sistemas de liberação desenca- deados pela enzima), (2) sensibilidade do pH, ou (3) sensibilidade da glutationa. Os ligantes não cliváveis geralmente dependem da degra- dação completa do anticorpo depois da internalização do conjugado na célula alvo. Um exemplo de conjugado de anticorpo-fármaco usando um ligante não clivável é o conjugado de maitansina anticorpo (anti- ErbB2) anti-HER2 trastuzumab-emtansina (T-DM1 ou Kadcyla , Lo- ® Russo et al. Clin. Cancer Res. 2011, 17, 6437-6447).
[004] Os ligantes peptídicos também foram propostos já que eles combinam boa estabilidade na circulação sistêmica com rápida libera- ção intracelular do fármaco por enzimas específicas. Em particular, os ligantes peptídicos compreendendo um dipeptídeo de valina-citrulina
(Val-Cit) como substrato para clivagem intracelular pela Catepsina B (Cat B) foram descritos (Lu et al. Int. J. Mol. Sci.2016, 17, 561-582; Jain et al. Pharm. Res.2015, 32(11), 3526– 3540; Dubowchik et al. Bi- oconj. Chem. 2002, 13, 855-859). Cat B é uma protease cisteína lipos- somal implicada em um número de processos fisiológicos, que diferem de outras proteases de cisteína na qual ela possui atividade de endo- peptidase e também atividade de exopeptidase, significando que ela pode remover as unidades dipeptídicas dos terminais C de proteínas e peptídeos (Turk et al. Biochim. Biophys. Acta 2012, 1824(1), 68-88). Deste modo, a atividade de exopeptidase de Cat B é uma atividade de carboxidipeptidase.
[005] Tipicamente, a clivagem enzimática de um conjugado (por exemplo por Cat B) libera o anticorpo e um conjugado de ligante- fármaco no sítio alvo. O ligante deve, por sua vez, permitir a rápida liberação do fármaco do conjugado ligante-fármaco. Sendo assim, os espaçadores “auto-imolativos” entre o ligante e o fármaco foram pro- postos para melhorar a taxa de liberação de fármaco depois da cliva- gem enzimática. Os espaçadores auto-imolativos podem geralmente liberar um fármaco, por exemplo um fármaco citotóxico, através de mecanismos baseados na eliminação ou ciclização.
[006] Um exemplo de um sistema ligante compreendendo um es- paçador autoimuloativo é o ligante para-amino benziloxicarbonila (PABC) conforme usado, por exemplo no conjugado bremtuximab- vedotin Adcetris (Younes et al. N. Engl. J. Med. 2010, 363, 1812-1821; ® Jain et al. Pharm. Res. 2015, 32(11), 3526–3540). O sistema ligante PABC conforme usado em conjugados de anticorpo-fármaco utiliza um ligante dipeptídico Val-Cit-PABC sensível à protease, que pode ser reconhecido e clivado por Catepsina B. Uma porção de maleimidoca- proila é tipicamente usada para ligar a unidade ligante ao anticorpo e serve como um espaçador entre o fármaco e o anticorpo para evitar conflitos estéricos no reconhecimento de substrato por catepsina B. Depois da clivagem enzimática da ligação amida citrulina-PABC, o fármaco substituído por PABC resultante, por exemplo monometil au- ristatina E (MMAE) espontaneamente sofre uma 1,6-eliminação que libera o fármaco livre (por exemplo, MMAE) como o produto.
[007] No entanto, a eficácia do sistema ligante PABC para liberar um fármaco a uma célula alvo pode ser limitada devido à lenta libera- ção de fármaco intracelular e a estabilidade limitada da porção Val-Cit- PABC no plasma (Dorywalska et al. Mol. Cancer Ther.2016, 15(5), 958-970).
[008] Além disso, os estudos in vivo indicam que as propriedades farmacocinéticas (PK) (por exemplo distribuição, depuração hepática) de conjugados baseados em Val-Cit-PABC dependem do número de moléculas de fármaco ligadas à porção de anticorpo (Strop et al. Chem. & Biol. 2013, 20, 161-167). Sendo assim, um parâmetro impor- tante de conjugados de anticorpo-fármaco é a razão de fármaco- anticorpo (DAR) (ou (carga útil) do fármaco se referindo ao número médio de molécula(s) de fármaco ligadas a uma porção de anticorpo. O valor de DAR não afeta apenas a eficácia, mas também as proprie- dades PK e a toxicidade dos conjugados. Em particular, um alto valor de DAR (isto é, alta carga útil de fármaco) foi associado com proprie- dades PK reduzidas e/ou maior toxicidade devido à agregação das moléculas de conjugado e/ou clivagem prematura.
[009] Para superar estes problemas, foi proposto empregar sis- temas ligantes hidrofílicos contendo grupos sulfonato negativamente carregados, grupos de polietileno glicol ou grupos pirofosfato diéster de modo a reduzir a agregação de conjugados. Da mesma forma, a publicação internacional WO 2015/123679 A1 divulga conjugados hi- drofílicos de anticorpo-fármaco baseados na combinação de um ligan- te hidrofílico com um fármaco hidrofílico tal como uma auristatina qui-
micamente modificada com um aminoácido hidrofílico, por exemplo Thr. Entende-se que os conjugados hidrofílicos da publicação interna- cional WO 2015/123679 A1 exibem boas propriedades PK em um mo- delo in vivo. No entanto, a eficácia dos sistemas ligantes hidrofílicos, por exemplo, conforme divulgados na publicação internacional WO 2015/123679 A1 podem ser limitados devido à clivagem enzimática não específica, lenta liberação de fármaco intracelular e/ou aprisiona- mento lisossômico aumentado.
[0010] Além disso, o alcance de altos valores de DAR (alta carga útil de fármaco) está frequentemente limitado pela tendência aumenta- da pela agregação de ADCs, fatores estéricos (por exemplo, se origi- nando de múltiplos sítios de ligação) ou falta de estabilidade sistêmica.
[0011] Existe assim uma necessidade por novos compostos com- preendendo um sistema ligante, que é estável na circulação sistêmica e pode rapidamente liberar e entregar um fármaco em uma célula alvo.
[0012] É, portanto, um objetivo da presente invenção prover com- postos compreendendo um sistema ligante que é estável na circulação sistêmica e permite a rápida liberação e entrega de um fármaco a uma célula alvo de uma forma não marcada. É um objetivo adicional da presente invenção prover composições farmacêuticas compreendendo os referidos compostos.
[0013] É ainda um outro objetivo da presente invenção prover compostos compreendendo um sistema ligante que é estável na circu- lação sistêmica e, ao mesmo tempo, ser capaz de liberar múltiplas mo- léculas de fármaco (por exemplo, múltiplas cargas úteis), em que as moléculas de fármaco individuais podem ser as mesmas ou diferentes.
[0014] Um objetivo adicional da presente invenção é prover com- postos ou composições que possam ser usados em métodos de tra- tamento ou prevenção de um câncer, uma doença autoimune e/ou uma doença infecciosa.
SUMÁRIO DA PRESENTE INVENÇÃO
[0015] A presente invenção provê um novo sistema ligante clivá- vel, que pode ser usado em conjugados de ligante-fármaco. O sistema ligante é caracterizado por uma unidade dipeptídica C-terminal que carrega um fármaco ou um grupo vetor em uma cadeia lateral do mesmo. A unidade dipeptídica C-terminal age como substrato altamen- te específico para a atividade exopeptidase (isto é, carboxidipeptidase) de catepsina B, resultando em clivagem intracelular melhorada e libe- ração do fármaco. O sistema ligante é estável e permite a liberação de múltiplas moléculas de fármaco (por exemplo, múltiplas cargas úteis), em que as moléculas de fármaco individuais podem ser as mesmas ou diferentes, resultando em eficácia melhorada. O sistema ligante tam- bém permite alcançar uma alta carga útil de fármaco (por exemplo, alto DAR) resultando assim na eficácia significativamente melhorada.
[0016] A presente invenção assim se refere a um composto repre- sentado pela fórmula geral (I) ou (I'):
[0017] em que, nas fórmulas (I) e (I'),
[0018] W representa a partir de uma porção representado pela fórmula que segue (III):
[0019] em que
[0020] W1 representa uma porção derivada de um fármaco que difere de um fármaco nativo apenas em virtude da ligação covalente a Dxx conforme mostrada na fórmula (III), caso o fármaco seja um análogo de auristatina, o análogo de auristatina é auristatina Phe (AF), auristatina Cit (ACit), auristatina Arg (AArg), auristatina Lys (ALys), au- ristatina Orn (AOrn), auristatina ácido 2,3-diamino-propiônico (ADab)
ou auristatina ácido 2,4-diamino-butírico (ADap), preferivelmente AF; ou
[0021] W1 representa uma porção derivada de um fármaco com a condição de que W1 não seja um análogo de auristatina;
[0022] Dxx representa uma única ligação covalente ou um ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, preferivelmente um ami- noácido selecionado a partir de Phe, Val, Tyr, homo-Phe e Ala, pre- ferivelmente Phe ou Val, em que a única ligação covalente ou ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica é opcionalmente ligada à porção W1 através de uma porção divalente selecionada a partir de maleimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila e deriva- dos dos mesmos, preferivelmente através de um derivado de ma- leimida divalente;
[0023] Dyy representa uma única ligação covalente, Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, preferivelmente um ami- noácido selecionado a partir de Arg, Lys, Citrulina (Cit), Ornitina (Orn), ácido 2,3-diamino-propiônico (Dap), ácido 2,4-diamino-butírico (Dab), mais preferivelmente Arg ou Cit;
[0024] com a condição de que se Dxx for um aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, Dyy é Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, e se Dxx for uma ligação covalente única, Dyy é uma ligação covalente única, Phe ou um aminoácido com uma cadeia lateral básica, preferivelmente Arg ou Cit;
[0025] e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx na fórmula (I) ou o N-terminal de Ayy na fórmula (I');
[0026] ou W representa uma porção peptídica representada pela fórmula (Ia), (Ia') ou (Ib):
[0027] em que, nas fórmulas (Ia) e (Ia'),
[0028] A'yy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, fenilglicina (Phg), Met, Val, His, Lys, Arg, Cit, ácido 2- amino-butírico (Abu), Orn, com a condição de que A'yy na fórmula (Ia') não é um aminoácido na configuração (D);
[0029] D1 representa uma porção derivada de um fármaco;
[0030] m é um número inteiro de 1 a 10;
[0031] se m=1, então A'xx representa um aminoácido trifuncional tal como um aminoácido dicarboxílico ou um diaminoácido carboxílico com a condição de que A'xx na fórmula (Ia) não seja um aminoácido na configuração (D), D2 representa uma porção derivada de um fár- maco, opcionalmente uma porção derivada do mesmo fármaco que D1;
[0032] se m for maior do que 1, então cada D2 é independente- mente selecionado a partir de um átomo de hidrogênio e porções derivadas de um fármaco, em que múltiplas porções D2 podem ser as mesmas ou diferentes com a condição de que pelo menos um D2 não seja um átomo de hidrogênio, se D2 for um átomo de hidrogênio então A'xx representa um aminoácido com a condição de que A'xx na fórmu- la (Ia) não seja um aminoácido na configuração (D), se D2 for uma porção derivada de um fármaco, então A'xx representa um amino tri- funcional com a condição de que A'xx na fórmula (Ia) não seja um aminoácido na configuração (D);
[0033] e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx ou Ayy;
[0034] em que, na fórmula (Ib),
[0035] A'yy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Met, Val, His, Lys, Arg, Cit, Abu, Orn;
[0036] D1 representa uma porção derivada de um fármaco;
[0037] m é um número inteiro de 1 a 10;
[0038] se m=1, então A'xx representa um aminoácido trifuncional selecionado a partir de Glu, ácido α-amino adípico (Aaa), Dap, Dab, Ser, Thr, homo-serina (homo-Ser), homo-treonina (homo-Thr) e ácido amino-malônico (Ama) com a condição de que A'xx não seja um ami- noácido na configuração (D); D2 representa uma porção derivada de um fármaco, opcionalmente uma porção derivada do mesmo fármaco que D1, Cxx representa uma única ligação covalente a menos que A'xx seja Ama, se A'xx for Ama, Cxx representa (L)- ou (D)-Pro, ou um N-metil aminoácido tal como sarcosina (Sar), o N-terminal de Cxx se liga a uma extremidade carboxila de Ama e o C-terminal de Cxx se liga a uma porção D2;
[0039] se m for maior do que 1, então cada D2 é independente- mente selecionado a partir de um átomo de hidrogênio e porções derivadas de um fármaco, em que múltiplas porções D2 podem ser as mesmas ou diferentes com a condição de que pelo menos um D2 não seja um átomo de hidrogênio, se D2 for um átomo de hidrogênio então A'xx representa um aminoácido com a condição de que A'xx não es- teja na configuração (D) e Cxx represente uma única ligação covalen- te, se D2 for uma porção derivada de um fármaco então A'xx represen- ta um aminoácido selecionado a partir de Glu, Aaa, Dap, Dab, Ser, Thr, homo-Ser, Homo-Thr e Ama com a condição de que A'xx não seja um aminoácido na configuração (D), Cxx representa uma única ligação covalente a menos que A'xx seja Ama, se A'xx for Ama, Cxx represen- ta (L)- ou (D)-Pro, ou um N-metil aminoácido tal como Sar em que o N- terminal de Cxx se liga a uma extremidade carboxila de Ama e o C-terminal de Cxx se liga à porção D2;
[0040] e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx ou Ayy;
[0041] Axx representa um aminoácido trifuncional tal como um ácido amino-dicarboxílico ou um ácido diamino-carboxílico; com a condição de que Axx na fórmula (I) não seja um aminoácido na config- uração (D);
[0042] Ayy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Fenilglicina (Phg), Met, Val, His, Lys, Arg, Cit, ácido 2- amino-butírico (Abu), Orn, Ser, Thr, Leu e Ile; ou Ayy na fórmula (I) representa um aminoácido selecionado a partir de homo-tirosina (ho- mo-Tyr), homo-fenilalanina (homo-Phe), beta-fenilalanina (beta-Phe) e beta-homo-fenilalanina (beta-homo-Phe), Tyr(OR1) e homo-Tyr(OR1) em que R1 é –(CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número inteiro de 2 a 24; com a con- dição de que Ayy na fórmula (I') não seja um aminoácido na configura- ção (D);
[0043] T é uma porção sendo representada pela fórmula que se- gue (Ia1):
[0044] em que, na fórmula (Ia1),
[0045] S representa um grupo contendo um ou mais átomos se- lecionado a partir de carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre;
[0046] V representa uma porção derivada de um grupo vetor ca- paz de interagir com uma célula alvo;
[0047] n é um número inteiro de 1 a 10;
[0048] Rx é um átomo ou grupo que está opcionalmente presente para saturar uma valência livre de S, caso presente;
[0049] e a linha quebrada indica ligação covalente à cadeia lateral de Axx; se n for maior do que 1, cada linha quebrada representa uma ligação covalente a um grupo separado, individual de fórmula (I) ou fórmula (I'), em que múltiplos grupos de fórmula (I) ou fórmula (I') po- dem ser os mesmos ou diferentes; se n for maior do que 1, cada S pode ser o mesmo ou diferente;
[0050] Z representa um grupo covalentemente ligado ao C- terminal de Ayy ou Axx selecionado a partir de –OH, -N(H)(R), em que R representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila, um grupo cicloalquila ou um grupo aromático; e um agente marcador tal como um derivado de cumarina.
[0051] A presente invenção ainda se refere a um composto repre- sentado pela fórmula geral (II), (II') ou (IIa):
[0052] em que,
[0053] D representa uma porção derivada de um fármaco; caso o*p>1 um ou mais D's podem ser hidrogênio ou um grupo solubilizante tal como –(CH2CH2O)n1-R2 em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número inteiro de 2 a 24, com a condição de que pelo menos um D represente uma porção derivada de um fár- maco;
[0054] Bxx nas fórmulas (II) e (II') representa Phe, um aminoácido trifuncional tal como um ácido amino-dicarboxílico ou um ácido dia- mino-carboxílico, preferivelmente selecionado a partir de Glu, Asp, Aaa, Lys, Dap, Dab, Ser, Thr, homo-Ser e homo-Thr; com a condição de que Bxx na fórmula (II) não seja um aminoácido na configuração (D);
[0055] Bxx na fórmula (IIa) representa um aminoácido carboxílico (isto é um aminoácido tendo um grupo de ácido carboxílico na sua cadeia lateral) tal como Ama, Glu, Aaa, Apa ou um aminoácido trifun- cional selecionado a partir de Dap, Dab, Ser, Thr, Lys, Orn, homoLys, homoSer e homoThr; com a condição de que Bxx não seja um ami- noácido na configuração (D); Cxx representa uma única ligação cova- lente a menos que Bxx seja Ama, caso Bxx for Ama, Cxx representa (L)- ou (D)-Pro, ou um N-metil aminoácido tal como Sar, o N-terminal de Cxx se liga a uma extremidade carboxila de Ama e o C-terminal de Cxx se liga à porção D;
[0056] Naqueles casos onde Bxx nas fórmulas (II), (II') e (IIa) carregam um hidrogênio como grupo D, Bxx também pode ser qualquer outro aminoácido, com a condição de que Bxx nas fórmulas (II) e (IIa) não seja um aminoácido na configuração (D);
[0057] Byy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Val, His, Lys, Abu, Met, Cit, Orn, Ser, Thr, Leu, Ile, Arg e Tyr(OR1) em que R1 é –(CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número inteiro de 2 a 24; ou Byy nas fórmulas (II) e (IIa) representa um aminoácido selecionado a partir de homo-Tyr, homo-Tyr(OR1), homo-Phe, beta-Phe e beta- homo-Phe; com a condição de que Byy na fórmula (II') não seja um aminoácido na configuração (D) e com a condição de que se o*p>1,
apenas o Byy C-terminal nas fórmulas (II) e (IIa) possa representar um aminoácido selecionado a partir de homo-Phe, beta-Phe e beta-homo- Phe;
[0058] Bxx1 representa uma única ligação covalente ou um ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica;
[0059] Bxx2 representa um aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica ou básica; S e V são conforme definidos na fórmula (I) ou (I');
[0060] Z é covalentemente ligado ao C-terminal de Byy e repre- senta um grupo selecionado a partir de -OH; -N(H)(R), em que R rep- resenta um átomo de hidrogênio, um grupo alquila, um grupo cicloal- quila ou um grupo aromático; e um agente marcador; e
[0061] o e p cada independentemente é um número inteiro de 1 a 10; caso p não for maior do que 1, Bxx1 não é um aminoácido na con- figuração (D); caso p for maior do que 1 e/ou o for maior do que 1, então cada D pode ser independentemente selecionado a partir de porções derivadas de um fármaco.
[0062] A presente invenção também se refere a um composto con- forme descrito anteriormente ou composição do mesmo para uso em um método de tratamento ou prevenção de um câncer, uma doença autoimune e/ou uma doença infecciosa.
[0063] A presente invenção em particular inclui as seguintes modalidades (“itens”):
[0064] 1. Um composto representado pela fórmula geral (I) ou (I'):
[0065] em que, nas fórmulas (I) e (I'),
[0066] W representa uma porção representado pela seguinte fór- mula (III):
[0067] em que
[0068] W1 representa uma porção derivada de um fármaco que difere de um fármaco nativo apenas em virtude da ligação covalente a Dxx conforme mostrado na fórmula (III), se o fármaco for um análogo de auristatina, a auristatina é auristatina Phe (AF), auristatina Cit (ACit), auristatina Arg (AArg), auristatina Lys (ALys), auristatina Orn (AOrn), auristatina Dab (ADab) or auristatina Dap (ADap), preferivel- mente AF;
[0069] Dxx representa uma única ligação covalente ou um ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, preferivelmente um ami- noácido selecionado a partir de Phe, Val, Tyr, homo-Phe e Ala, pre- ferivelmente Phe ou Val, em que a única ligação covalente ou ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica está opcionalmente liga- do à porção W1 através de uma porção divalente selecionada a partir de maleimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila, e derivados dos mesmos, preferivelmente através de um derivado de maleimida divalente;
[0070] Dyy representa uma única ligação covalente, Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, preferivelmente um ami- noácido selecionado a partir de Arg, Lys, Citrulina (Cit), Ornitina (Orn), ácido 2,3-diamino-propiônico (Dap), ácido 2,4-diamino-butírico (Dab), mais preferivelmente Arg ou Cit;
[0071] com a condição de que se Dxx for um aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, Dyy é Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, e se Dxx for uma ligação covalente única, Dyy é uma ligação covalente única, Phe ou um aminoácido com uma cadeia lateral básica, preferivelmente Arg ou Cit;
[0072] e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx na fórmula (I) ou o N-terminal de Ayy na fórmula (I');
[0073] Axx representa um aminoácido trifuncional tal como um ácido amino-dicarboxílico ou um ácido diamino-carboxílico; com a condição de que Axx na fórmula (I) não seja um aminoácido na config- uração (D);
[0074] Ayy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Fenilglicina (Phg), Met, Val, His, Lys, Arg, Cit, ácido 2- amino-butírico (Abu), Orn, Ser, Thr, Leu e Ile; ou Ayy na fórmula (I) representa um aminoácido selecionado a partir de homo-tirosina (ho- mo-Tyr), homo-fenilalanina (homo-Phe), beta-fenilalanina (beta-Phe) e beta-homo-fenilalanina (beta-homo-Phe), Tyr(OR1) e homo-Tyr(OR1) em que R1 é –(CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número inteiro de 2 a 24; com a con- dição de que Ayy na fórmula (I') não seja um aminoácido na configura- ção (D);
[0075] T é uma porção sendo representada pela fórmula que se- gue (Ia1):
[0076] em que, na fórmula (Ia1),
[0077] S representa um grupo contendo um ou mais átomos se- lecionado a partir de carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre;
[0078] V representa uma porção derivada de um grupo vetor ca- paz de interagir com uma célula alvo;
[0079] n é um número inteiro de 1 a 10;
[0080] Rx é um átomo ou grupo que está opcionalmente presente para saturar uma valência livre de S, caso presente;
[0081] e a linha quebrada indica ligação covalente à cadeia lateral de Axx; se n for maior do que 1, cada linha quebrada representa uma ligação covalente a um indivíduo, grupo separado de fórmula (I) ou fórmula (I'), em que múltiplos grupos de fórmula (I) ou fórmula (I') po-
dem ser os mesmos ou diferentes; se n for maior do que 1, cada S pode ser o mesmo ou diferente;
[0082] Z representa um grupo covalentemente ligado ao C- terminal de Ayy ou Axx selecionado a partir de –OH; -N(H)(R), em que R representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila, um grupo cicloalquila ou um grupo aromático; e um agente marcador tal como um derivado de cumarina.
[0083] 2. Um composto representado pela fórmula geral (I) ou (I'):
[0084] em que, nas fórmulas (I) e (I'),
[0085] W representa uma porção representada pela fórmula que segue (III):
[0086] em que
[0087] W1 representa uma porção derivada de um fármaco com a condição de que W1 não seja um análogo de auristatina;
[0088] Dxx representa uma única ligação covalente ou um ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, preferivelmente um ami- noácido selecionado a partir de Phe, Val, Tyr, homo-Phe e Ala, mais preferivelmente Phe ou Val, em que a única ligação covalente ou ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica está opcionalmente liga- do à porção W1 através de uma porção divalente selecionada a partir de maleimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila, e derivados dos mesmos, preferivelmente através de um derivado de maleimida divalente;
[0089] Dyy representa uma única ligação covalente, Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, preferivelmente um ami-
noácido selecionado a partir de Arg, Lys, Cit, Orn, Dap e Dab, mais preferivelmente Arg ou Cit;
[0090] com a condição de que se Dxx for um aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, Dyy é Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, e se Dxx for uma ligação covalente única, Dyy é uma ligação covalente única, Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, preferivelmente Arg ou Cit;
[0091] e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx na fórmula (I), ou o N-terminal de Ayy na fórmula (I');
[0092] Axx representa um aminoácido trifuncional tal como um ácido amino-dicarboxílico ou um ácido diamino-carboxílico; com a condição de que Axx na fórmula (I) não seja um aminoácido na config- uração (D);
[0093] Ayy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Met, Val, His, Lys, Arg, Cit, Abu, Orn, Ser, Thr, Leu e Ile; ou Ayy na fórmula (I) representa um aminoácido selecionado a partir de homo-Tyr, homo-Phe, beta-Phe e beta-homo-Phe), Tyr(OR1) e homo-Tyr(OR1) em que R1 é –(CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número inteiro de 2 a 24; com a condição de que Ayy na fórmula (I') não seja um ami- noácido na configuração (D);
[0094] T é uma porção sendo representada pela fórmula que se- gue (Ia1):
[0095] em que, na fórmula (Ia1),
[0096] S representa um grupo contendo um ou mais átomos se- lecionado a partir de carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre;
[0097] V representa uma porção derivada de um grupo vetor ca- paz de interagir com uma célula alvo;
[0098] n é um número inteiro de 1 a 10;
[0099] Rx é um átomo ou grupo que está opcionalmente presente para saturar uma valência livre de S, caso presente;
[00100] e a linha quebrada indica ligação covalente à cadeia lateral de Axx; se n for maior do que 1, cada linha quebrada representa uma ligação covalente a um grupo individual, separado de fórmula (I) ou fórmula (I'), em que múltiplos grupos de fórmula (I) ou fórmula (I') po- dem ser os mesmos ou diferentes; se n for maior do que 1, cada S pode ser o mesmo ou diferente;
[00101] Z representa um grupo covalentemente ligado ao C- terminal de Ayy ou Axx selecionado a partir de –OH; -N(H)(R), em que R representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila, um grupo cicloalquila ou um grupo aromático; e um agente marcador tal como um derivado de cumarina.
[00102] 3. Um composto representado pela fórmula geral (I) ou (I'):
[00103] em que, nas fórmulas (I) e (I'),
[00104] W representa uma porção peptídica representada pela fór- mula (Ia), (Ia') ou (Ib):
[00105] em que, nas fórmulas (Ia) e (Ia'),
[00106] A'yy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Met, Val, His, Lys, Arg, Cit, Abu, Orn, com a con- dição de que A'yy na fórmula (Ia') não seja um aminoácido na configu-
ração (D);
[00107] D1 representa uma porção derivada de um fármaco;
[00108] m é um número inteiro de 1 a 10;
[00109] se m=1, então A'xx representa um aminoácido trifuncional tal como um ácido amino dicarboxílico ou um ácido diamino carboxílico com a condição de que A'xx na fórmula (Ia) não seja um aminoácido na configuração (D), D2 representa uma porção derivada de um fárma- co, opcionalmente uma porção derivada do mesmo fármaco que D1;
[00110] se m for maior do que 1, então cada D2 é independente- mente selecionado a partir de um átomo de hidrogênio e porções derivadas de um fármaco, em que múltiplas porções D2 podem ser as mesmas ou diferentes com a condição de que pelo menos um D2 não seja um átomo de hidrogênio, se D2 for um átomo de hidrogênio então A'xx representa um aminoácido com a condição de que A'xx na fórmu- la (Ia) não seja um aminoácido na configuração (D), se D2 for uma por- ção derivada de um fármaco, então A'xx representa um amino trifun- cional com a condição de que A'xx na fórmula (Ia) não seja um ami- noácido na configuração (D);
[00111] e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx ou Ayy;
[00112] em que, na fórmula (Ib),
[00113] A'yy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Met, Val, His, Lys, Arg, Cit, Abu, Orn;
[00114] D1 representa uma porção derivada de um fármaco;
[00115] m é um número inteiro de 1 a 10;
[00116] se m=1, então A'xx representa um aminoácido trifuncional selecionado a partir de Glu, ácido α-amino adípico (Aaa), Dap, Dab, Ser, Thr, homo-serina (homo-Ser), homo-treonina (homo-Thr) e ácido amino-malônico (Ama) com a condição de que A'xx não seja um ami- noácido na configuração (D); D2 representa uma porção derivada de um fármaco, opcionalmente uma porção derivada do mesmo fármaco que D1, Cxx representa uma única ligação covalente a menos que A'xx seja Ama, se A'xx for Ama, Cxx representa (L)- ou (D)-Pro, ou um N- metil aminoácido tal como sarcosina (Sar), o N-terminal de Cxx se liga a uma extremidade carboxila de Ama e o C-terminal de Cxx se liga a uma porção D2;
[00117] se m for maior do que 1, então cada D2 é independente- mente selecionado a partir de um átomo de hidrogênio e porções derivadas de um fármaco, em que múltiplas porções D2 podem ser as mesmas ou diferentes com a condição de que pelo menos um D2 não seja um átomo de hidrogênio, se D2 for um átomo de hidrogênio então A'xx representa um aminoácido com a condição de que A'xx não es- teja na configuração (D) e Cxx represente uma única ligação covalen- te, se D2 for uma porção derivada de um fármaco então A'xx represen- ta um aminoácido selecionado a partir de Glu, Aaa, Dap, Dab, Ser, Thr, homo-Ser, Homo-Thr e Ama com a condição de que A'xx não seja um aminoácido na configuração (D), Cxx represente uma única ligação covalente a menos que A'xx seja Ama, se A'xx for Ama, Cxx represen- ta (L)- ou (D)-Pro, ou um N-metil aminoácido tal como Sar em que o N- terminal de Cxx se liga a uma extremidade carboxila e o C-terminal de Cxx se liga à porção D2;
[00118] e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx ou Ayy;
[00119] Axx representa um aminoácido trifuncional tal como um ácido amino-dicarboxílico ou um ácido diamino-carboxílico; com a condição de que Axx na fórmula (I) não seja um aminoácido na config-
uração (D);
[00120] Ayy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Met, Val, His, Lys, Arg, Cit, Abu, Orn, Ser, Thr, Leu e Ile; ou Ayy na fórmula (I) representa um aminoácido selecionado a partir de homo-Tyr, homo-Phe, beta-Phe e beta-homo-Phe, Tyr(OR1) e homo-Tyr(OR1) em que R1 é –(CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número inteiro de 2 a 24; com a condição de que Ayy na fórmula (I') não seja um aminoácido na configuração (D);
[00121] T é uma porção sendo representada pela fórmula que se- gue (Ia1):
[00122] em que, na fórmula (Ia1),
[00123] S representa um grupo contendo um ou mais átomos se- lecionado a partir de carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre;
[00124] V representa uma porção derivada de um grupo vetor ca- paz de interagir com uma célula alvo;
[00125] n é um número inteiro de 1 a 10;
[00126] Rx é um átomo ou grupo que está opcionalmente presente para saturar uma valência livre de S, caso presente;
[00127] e a linha quebrada indica ligação covalente à cadeia lateral de Axx; se n for maior do que 1, cada linha quebrada representa uma ligação covalente a um grupo individual, separado de fórmula (I) ou fórmula (I'), em que múltiplos grupos de fórmula (I) ou fórmula (I') po- dem ser os mesmos ou diferentes; se n for maior do que 1, cada S pode ser o mesmo ou diferente;
[00128] Z representa um grupo covalentemente ligado ao C- terminal de Ayy ou Axx selecionado a partir de –OH; -N(H)(R), em que R representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila, um grupo cicloalquila ou um grupo aromático; e um agente marcador tal como um derivado de cumarina.
[00129] 4. O composto de qualquer um dos itens 1 a 3, em que pelo menos um de Axx e Ayy é definido como a seguir:
[00130] Axx representa um aminoácido selecionado a partir de Glu, ácido 2-amino-pimélico (Apa), Aaa, Dap, Dab, Lys, Orn, Ser, Ama, e homo-lisina (homo-Lys), preferivelmente um aminoácido selecionado a partir de Dap, Dab, Lys, Orn e homo-Lys;
[00131] Ayy na fórmula (I) representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, homo-Phe, Ala, Trp, Phg, Leu, Val, Tyr, homo-Tyr, Tyr(OR1) e homo-Tyr(OR1) em que R1 é –(CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número in- teiro de 2 a 24, preferivelmente Phe, homo-Phe, Tyr, homo-Tyr, Tyr(OR1) ou homo-Tyr(OR1), mais preferivelmente Phe ou Tyr;
[00132] Ayy na fórmula (I') representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, homo-Phe, Ala, Trp, Phg, Leu, Val, Tyr e Ser, preferiv- elmente Phe, home-Phe ou Ser, mais preferivelmente Phe ou Ser.
[00133] 5. O composto do item 3 ou 4, em que pelo menos um de A'xx, A'yy e m é definido como a seguir:
[00134] A'xx nas fórmulas (Ia) e (Ia') representa um aminoácido se- lecionado a partir de Dap, Dap, Lys, Orn e homo-Lys, preferivelmente Lys;
[00135] A'yy nas fórmulas (Ia), (Ia') e (Ib) representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Phg e Tyr, preferivelmente Phe ou Tyr;
[00136] m é um número inteiro de 1 a 4.
[00137] 6. Um composto representado por uma das seguintes for- mulas gerais (II), (II') e (IIa):
[00138] em que,
[00139] D representa uma porção derivada de um fármaco; se o*p > 1 um ou mais D's podem ser hidrogênio ou um grupo solubilizante tal como –(CH2CH2O)n1- R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número inteiro de 2 a 24, com a condição de que pelo menos um D represente uma porção derivada de um fárma- co;
[00140] Bxx nas fórmulas (II) e (II') representa um aminoácido tri- funcional tal como um ácido amino-dicarboxílico ou um ácido diamino- carboxílico; com a condição de que Bxx na fórmula (II) não seja um aminoácido na configuração (D);
[00141] Bxx na fórmula (IIa) representa um ácido amino carboxílico tal como Ama, Glu, Aaa, Apa ou um aminoácido trifuncional seleciona- do a partir de Dap, Dab, Ser, Thr, Lys, Orn, homoLys, homoSer e ho- moThr; com a condição de que Bxx não seja um aminoácido na con- figuração (D); Cxx representa uma única ligação covalente a menos que Bxx seja Ama; se Bxx for Ama, Cxx representa (L)- ou (D)-Pro, ou um N-metil aminoácido tal como Sar, o N-terminal de Cxx se liga a uma extremidade carboxila de Ama e o C-terminal de Cxx se liga à porção D;
[00142] naqueles casos onde Bxx nas fórmulas (II), (II') e (IIa) carrega um hidrogênio como grupo D, Bxx pode ser qualquer outro aminoácido, com a condição de que Bxx nas fórmulas (II) e (IIa) não seja um aminoácido na configuração (D);
[00143] Byy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, homo-Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Val, His, Lys, Abu, Met, Cit, Orn, Ser, Thr, Leu, Ile, Arg and Tyr(OR1) em que R1 é –(CH2CH2O)n1- R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número inteiro de 2 a 24; ou Byy nas fórmulas (II) e (IIa) representa um aminoácido selecionado a partir de homo-Tyr, homo-Tyr(OR1), homo- Phe, beta-Phe e beta-homo-Phe; com a condição de que Byy na fór- mula (II') não seja um aminoácido na configuração (D) e com a con- dição de que se o*p>1, apenas o Byy C-terminal nas fórmulas (II) e (IIa) pode representar um aminoácido selecionado a partir de beta-Phe e beta-homo-Phe;
[00144] Bxx1 representa uma única ligação covalente ou um ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica ou básica;
[00145] Bxx2 representa um aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica ou básica;
[00146] S e V são conforme definidos no item 1;
[00147] Z é covalentemente ligado ao C-terminal de Byy nas fórmu- las (II) e (IIa) e o C-terminal de Bxx na fórmula (II'), e representa um grupo selecionado a partir de -OH; -N(H)(R), R sendo conforme definido no item 1; e um agente marcador; e
[00148] o e p cada independentemente é um número inteiro de 1 a 10, se p for maior do que 1, Bxx1 não é um aminoácido na configura- ção (D); se p for maior do que 1 e/ou se o for maior do que 1, então cada D pode ser independentemente selecionado a partir de porções derivadas de um fármaco.
[00149] 7. O composto do item 6, em que pelo menos um de Bxx1,
Bxx2, Bxx, Byy, o e p é conforme definido a seguir:
[00150] Bxx1 representa uma única ligação covalente ou um ami- noácido selecionado a partir de Phe, homo-Phe, Phg, Val, Ser, Tyr, Ala, Leu, Ile; preferivelmente um aminoácido selecionado a partir de Phe, homo-Phe, Tyr e Val, mais preferivelmente Phe, homo-Phe ou Tyr;
[00151] Bxx2 representa um aminoácido selecionado a partir de Arg, Lys, Cit, Val, Leu, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Phg e Phe; preferivelmente um aminoácido selecionado a partir de Arg, Lys, Cit e Phe, mais pre- ferivelmente Arg ou Cit;
[00152] Bxx nas fórmulas (II) e (II') representa um aminoácido se- lecionado a partir de Dap, Dab, Lys, Orn, Ser, Glu, Ama, Thr, Tyr, Aaa, homo-Ser e homo-Thr; preferivelmente Lys ou Dab, mais preferivel- mente Lys;
[00153] Byy representa Cit, Phe, homo-Phe, Ser, Trp, Tyr ou Tyr(OR1) em que R1 é –(CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número inteiro de 2 a 24, preferivelmente Phe, Tyr ou Tyr(OR1); se o*p>1, Byy representa pre- ferivelmente Tyr ou Tyr(OR1); e
[00154] o e p cada independentemente é um número inteiro de 1 a
4.
[00155] 8. O composto de qualquer um dos itens 1 a 7, em que nas fórmulas (Ia1), (II), (II') e (IIa),
[00156] S representa um grupo divalente selecionado a partir de um grupo alquileno divalente, um grupo alquenileno divalente, um grupo alquinileno divalente e um óxido de polialquileno divalente;
[00157] preferivelmente um grupo divalente tendo a fórmula – (CH2)q-Azz5-, ou -(OCH2CH2)q-Azz5-; em que q é um número inteiro de 1 a 50; e Azz5 está ausente, ou representa um grupo solubilizante pre- ferivelmente selecionado a partir de um aminoácido tal como Arg ou
(D)-Arg e um grupo divalente contendo um grupo amônio, um grupo sulfato, um grupo sulfonato ou um grupo pirofosfato diéster.
[00158] 9. O composto de qualquer um dos itens 1 a 8, em que nas fórmulas (Ia1), (II), (II') e (IIa),
[00159] S representa um grupo divalente tendo a fórmula -(CH2)q- Azz5-Y-, ou um grupo divalente tendo a fórmula -(OCH2CH2)q-Azz5-Y-;
[00160] em que Y representa uma porção divalente covalentemente ligada ao C-terminal de Azz5 e à porção V; se Azz5 estiver ausente, Y é covalentemente ligado ao grupo alquila ou grupo de óxido de po- lietileno e à porção V; Y é derivado de um composto selecionado a partir de maleimidas, triazóis, especialmente 1,2,3-triazol, hidrazonas, grupos contendo carbonila, e derivados dos mesmos, preferivelmente a partir de maleimidas e derivados dos mesmos; q é um número inteiro de 1 a 50; e Azz5 é conforme definido no item 8.
[00161] 10. O composto do item 1, 2 ou 3, em que o composto de fórmula (I) e fórmula (Ia) é selecionado a partir de W1-Arg-Lys(T)-Phe- Z, W1-Arg-Lys(T)-homoPhe-Z, W1-Cit-Lys(T)-Phe-Z, W1-Cit-Lys(T)-Tyr- Z, W1-Cit-Lys(T)-homoTyr-Z, W1-Lys(T)-Phe-Z, W1-Lys(T)-Tyr-Z, W1- Lys(T)-homoTyr-Z, W1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-Phe-Z, W1-Mal-Phe-Cit- Lys(T)-Tyr-Z, W1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-homoTyr-Z, W1-Mal-Phe-Lys- Lys(T)-Phe-Z, W1-Mal-homoPhe-Arg-Lys(T)-Phe-Z, W1-Mal-homoPhe- Cit-Lys(T)-Tyr-Z, W1-Mal-homoPhe-Cit-Lys(T)-Tyr(OR1)-Z com R1 – (CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número inteiro de 2 a 24 por exemplo 12, W1-Mal-Cit- Lys(T)-Tyr-Z, W1-Mal-Cit-Lys(T)-homoTyr-Z, W1-Mal-Arg-Lys(T)- homoTyr-Z, W1-Cit-(Lys(D2)-Phe)m-Lys(T)-Phe-Z, W1-Cit-(Lys(D2)- Phe)m-Lys(T)-homoTyr-Z, W1-Cit-(Lys(D2)-Phe)m-Lys(T)-Tyr(OR1)-Z com R1 –(CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número inteiro de 2 a 24 por exemplo 12, W1- (Lys(D2)-Phe)m-Lys(T)-Phe-Z, W1-Phe-(Phe-Lys(D2))m-Lys(T)-Tyr-Z,
W1-(Phe-Lys(D2))m-Lys(T)-Tyr-Z, W1-Phe-(Phe-Lys(D2))m-Lys(T)- homoTyr-Z e W1-Arg-(Phe-Lys(D2))m-Lys(T)- Tyr(OR1)-Z;
[00162] e o composto de fórmula (I') é selecionado a partir de W1- Arg-Phe-Lys(T)-Z, W1-Arg-Ser-Lys(T)-Z, W1-Cit-Phe-Lys(T)-Z, W1-Cit- Ser-Lys(T)-Z, W1-Cit-homoPhe-Lys(T)-Z, W1-Phe-Lys(T)-Z, W1-Ser- Lys(T)-Z, W1-Mal-Phe-Cit-Phe-Lys(T)-Z, W1-Mal-homoPhe-Cit-Phe- Lys(T)-Z, W1-Mal-Phe-Arg-Phe-Lys(T)-Z, W1-Mal-Cit-Phe-Lys(T)-Z, W1- Mal-Phe-Ser-Lys(T)-Z, W1-Mal-Ala-Phe-Lys(T)-Z, W1-Mal-Cit-Ser- Lys(T)-Z e W1-Mal-Arg-homoPhe-Lys(T)-Z.
[00163] em que W1, T, Z, D2 e m têm os mesmos significados con- forme especificado no item 1, 2 ou 3; e Z é preferivelmente –OH.
[00164] 11. O composto do item 6 que é selecionado a partir de V- S-Phe-Arg-Phe-Lys(D)-Ser-Lys(D)-Z, V-S-Phe-Arg-(Phe-Lys(D))o-Z, V- S-Phe-Arg-(Ser-Lys(D))o-Z, V-S-Phe-Arg-(Tyr(OR1)-Lys(D))o-Z, V-S- Phe-Arg-(Phe-Lys(D))o-Phe-Tyr(OR1)-Z; preferivelmente V-S-Phe-Arg- Phe-Lys(D)-Ser-Lys(D)-Z, V-S-Phe-Arg-(Phe-Lys(D))o-Z ou V-S-Phe- Arg-(Ser-Lys(D))o-Z; mais preferivelmente V-S-Phe-Arg-(Phe-Lys(D))o-
Z
[00165] em que V, S, D, Z e o têm os mesmos significados con- forme especificado no item 6; e Z é preferivelmente -OH.
[00166] 12. O composto de qualquer um dos itens 1 a 11, em que cada porção derivada de um fármaco é independentemente seleciona- da a partir de: (i) agentes antineoplásicos incluindo agentes alquilantes, alcaloides tais como taxanos e maitansinoides, antimetabólitos, tera- pias endócrinas, inibidores de cinase; (ii) agentes imunomoduladores tais como imunoestimu- lantes e imunossupressores; (iii) agentes anti-infecciosos incluindo fármacos antibacteri- anos, fármacos antimicóticos e fármacos antivirais;
radioisótopos e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00167] 13. O composto de qualquer um dos itens 1 to 12, em que cada porção derivada de um fármaco é independentemente derivada de amanitina, duocarmicina, auristatina, maitansina, tubulisina, caliqueamicina, camptotecina, SN-38, taxol, daunomicina, vinblastina, doxorrubicina, metotrexato, pirrolobenzodiazepina, ou radioisótopos e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00168] 14. O composto de qualquer um dos itens 3, 4, 8, 9, 10, 12 e 13, em que cada porção D1 é independentemente representada pela fórmula a seguir (III):
[00169] em que
[00170] W1 representa uma porção derivada de amanitina, duocar- micina, auristatina, maitansina, tubulisina, caliqueamicina, camp- totecina, SN-38, taxol, daunomicina, vinblastina, doxorrubicina, meto- trexato, pirrolobenzodiazepina, ou radioisótopos e/ou sais farmaceuti- camente aceitáveis dos mesmos;
[00171] Dxx representa uma única ligação covalente ou um ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, preferivelmente um ami- noácido selecionado a partir de Phe, homo-Phe, Val e Ala, em que a única ligação covalente ou aminoácido tendo uma cadeia lateral hidro- fóbica é opcionalmente ligada à porção W1 através de uma porção di- valente selecionada a partir de maleimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila, e derivados dos mesmos, preferivelmente através de um derivado de maleimida divalente;
[00172] Dyy representa uma única ligação covalente, Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, preferivelmente um ami- noácido selecionado a partir de Arg, Lys, Cit, Orn, Dap e Dab, mais preferivelmente Arg ou Cit;
[00173] com a condição de que se Dxx é um aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, Dyy é Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, e se Dxx for uma ligação covalente única, Dyy é uma ligação covalente única, Phe ou um aminoácido com uma cadeia lateral básica, preferivelmente Arg ou Cit;
[00174] e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx na fórmula (I), o N-terminal de Ayy na fórmula (I'), o N-terminal de A'xx nas fórmulas (Ia) e (Ib), ou o N-terminal A'yy na fórmula (Ia').
[00175] 15. O composto de qualquer um dos itens 3 a 14, em que cada porção D2 e D é independentemente representada pela fórmula que segue (IIIa):
[00176] em que
[00177] W2 representa uma porção derivada de amanitina, duocar- micina, auristatina, maitansina, tubulisina, caliqueamicina, camp- totecina, SN-38, taxol, daunomicina, vinblastina, doxorrubicina, meto- trexato, pirrolobenzodiazepina, ou radioisótopos e/ou sais farmaceuti- camente aceitáveis dos mesmos;
[00178] Exx representa uma única ligação covalente ou uma porção divalente selecionada a partir de maleimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila, aminoácidos, porções dipeptídicas e derivados dos mesmos, preferivelmente um derivado de maleimida divalente;
[00179] e a linha quebrada indica ligação covalente à cadeia lateral de A'xx nas fórmulas (Ia) e (Ia'), a cadeia lateral de A'xx ou C-terminal de Cxx caso presente na fórmula (Ib), a cadeia lateral de Bxx nas fór- mulas (II) e (II'), a cadeia lateral de Bxx ou C-terminal de Cxx caso presente na fórmula (IIa).
[00180] 16. O composto de qualquer um dos itens 1 a 15, em que V representa uma porção derivada de um grupo vetor selecionado a par- tir de anticorpos, fragmentos de anticorpo, proteínas, peptídeos e moléculas não peptídicas;
[00181] preferivelmente um anticorpo ou fragmento de anticorpo tal como um anticorpo de cadeia única, um anticorpo monoclonal, um an- ticorpo monoclonal de cadeia única, um fragmento de anticorpo mono- clonal, um anticorpo quimérico, um fragmento de anticorpo quimérico, um anticorpo de domínio ou fragmento do mesmo, uma citocina, um hormônio, um fator de crescimento, um fator estimulante de colônias, um neurotransmissor ou uma molécula de transporte de nutrientes.
[00182] 17. O composto de qualquer um dos itens 1 a 16, em que
[00183] V representa uma porção derivada de um grupo vetor ca- paz de interagir com uma célula alvo, em que a célula alvo é selecion- ada a partir de células tumorais, células infectadas por vírus, células infectadas por micro-organismos, células infectadas por parasitas, células envolvidas em doenças autoimunes, células ativadas, células mieloides, células linfoides, melanócitos e agentes infecciosos inclu- indo bactérias, vírus, micobactérias, fungos;
[00184] preferivelmente a célula alvo é selecionada a partir de célu- las de linfoma, células de mieloma, células de câncer renal, células de câncer de mama, células de câncer próstata, células de câncer ovari- ano, células de câncer colorretal, células de câncer gástrico, células de câncer escamoso, células de câncer de pulmão de células pequenas, células de câncer testicular, e quaisquer células crescendo e se divid- indo em um ritmo desregulado e acelerado para causar cânceres.
[00185] 18. Composição compreendendo uma quantidade terapeu- ticamente eficaz do composto de qualquer um dos itens 1 a 17 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um ou mais componen- tes selecionados a partir de um veículo, um diluente e outros excip- ientes.
[00186] 19. O composto ou composição de qualquer um dos itens 1 a 18 para uso em um método de tratamento ou prevenção de um câncer, uma doença autoimune e/ou uma doença infecciosa.
[00187] 20. O composto ou composição para uso do item 19, em que no método de tratamento ou prevenção de um câncer, uma doen- ça autoimune e/ou uma doença infecciosa, o composto ou composição é administrado de forma concomitante com, antes ou depois de um ou mais agentes terapêuticos ou terapias tais como agentes quimioterápi- cos, terapia com radiação, agentes imunoterápicos, agentes para dis- túrbios imunes, agentes anti-infecciosos ou outros compostos de fór- mula (I)/(I') ou (II)/(II')/(IIa).
[00188] 21. Método para tratar ou prevenir um câncer, uma doença autoimune e/ou uma doença infecciosa, em que uma quantidade tera- peuticamente eficaz do composto ou composição de qualquer um dos itens 1 a 18 é administrada a um paciente que necessita do mesmo.
[00189] Em alguns outros aspectos, a presente invenção inclui as seguintes modalidades (“itens”):
[00190] 1. Um composto representado pela fórmula geral (I) ou (I'):
[00191] em que, nas fórmulas (I) e (I'),
[00192] W representa uma porção D1 derivada de um fármaco; ou uma porção peptídica representada pela fórmula (Ia), (Ia') ou (Ib):
[00193] em que, nas fórmulas (Ia) e (Ia'),
[00194] A'yy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Fenilglicina (Phg), Met, Val, His, Lys, Arg, Citrulina (Cit),
ácido 2-amino-butírico (Abu), Ornitina (Orn), com a condição de que A'yy na fórmula (Ia') não seja um aminoácido na configuração (D);
[00195] D1 representa uma porção derivada de um fármaco;
[00196] m é um número inteiro de 1 a 10;
[00197] se m=1, então A'xx representa um aminoácido trifuncional tal como um ácido amino dicarboxílico ou um ácido diamino carboxílico com a condição de que A'xx na fórmula (Ia) não seja um aminoácido na configuração (D), D2 representa uma porção derivada de um fárma- co, opcionalmente uma porção derivada do mesmo fármaco que D1;
[00198] se m for maior do que 1, então cada D2 é independente- mente selecionado a partir de um átomo de hidrogênio e porções derivadas de um fármaco, em que múltiplas porções D2 podem ser as mesmas ou diferentes com a condição de que pelo menos um D2 não seja um átomo de hidrogênio, se D2 for um átomo de hidrogênio então A'xx representa um aminoácido com a condição de que A'xx na fórmu- la (Ia) não seja um aminoácido na configuração (D), se D2 for uma por- ção derivada de um fármaco, então A'xx representa um amino trifun- cional com a condição de que A'xx na fórmula (Ia) não seja um ami- noácido na configuração (D);
[00199] e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx ou Ayy;
[00200] em que, na fórmula (Ib),
[00201] A'yy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Met, Val, His, Lys, Arg, Cit, Abu, Orn;
[00202] D1 representa uma porção derivada de um fármaco;
[00203] m é um número inteiro de 1 a 10;
[00204] se m=1, então A'xx representa um aminoácido trifuncional selecionado a partir de Glu, ácido α-amino adípico (Aaa), ácido 2,3- diamino-propiônico (Dap), ácido 2,4-diamino-butírico (Dab), Ser, Thr, homosserina (homoSer), homotreonina (homoThr) e ácido amino- malônico (Ama) com a condição de que A'xx não seja um aminoácido na configuração (D); D2 representa uma porção derivada de um fárma- co, opcionalmente uma porção derivada do mesmo fármaco que D1, Cxx representa uma única ligação covalente a menos que A'xx seja Ama, se A'xx for Ama, Cxx representa (L)- ou (D)-Pro, ou um ácido N- metil amino ácido tal como sarcosina (Sar), o N-terminal de Cxx se liga a uma extremidade carboxila de Ama e o C-terminal de Cxx se liga a uma porção D2;
[00205] se m for maior do que 1, então cada D2 é independente- mente selecionado a partir de um átomo de hidrogênio e porções derivadas de um fármaco, em que múltiplas porções D2 podem ser as mesmas ou diferentes com a condição de que pelo menos um D2 não seja um átomo de hidrogênio, se D2 for um átomo de hidrogênio então A'xx representa um aminoácido com a condição de que A'xx não es- teja na configuração (D) e Cxx representa uma única ligação covalen- te, se D2 for uma porção derivada de um fármaco então A'xx represen- ta um aminoácido selecionado a partir de Glu, Aaa, Dap, Dab, Ser, Thr, homoSer, HomoThr e Ama com a condição de que A'xx não seja um aminoácido na configuração (D), Cxx representa uma única ligação covalente a menos que A'xx seja Ama, se A'xx for Ama, Cxx represen- ta (L)- ou (D)-Pro, ou um ácido N-metil aminoácido tal como Sar,o N- terminal de Cxx se liga a uma extremidade carboxila de Ama e o C-terminal de Cxx se liga à porção D2;
[00206] e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx ou Ayy;
[00207] Axx representa um aminoácido trifuncional tal como um ácido amino-dicarboxílico ou um ácido diamino-carboxílico; com a condição de que Axx na fórmula (I) não seja um aminoácido na config- uração (D);
[00208] Ayy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Met, Val, His, Lys, Arg, Cit, Abu, Orn, Ser, Thr, Leu e Ile; ou Ayy na fórmula (I) representa um aminoácido selecionado a partir de homo-Phe, beta-Phe e beta-homo-Phe; com a condição de que Ayy na fórmula (I') não seja um aminoácido na configuração (D);
[00209] T é uma porção sendo representada pela fórmula que se- gue (Ia1):
[00210] em que, na fórmula (Ia1),
[00211] S representa um grupo contendo um ou mais átomos se- lecionados a partir de carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre;
[00212] V representa uma porção derivada de um grupo vetor ca- paz de interagir com uma célula alvo;
[00213] n é um número inteiro de 1 a 10;
[00214] Rx é um átomo ou grupo que está opcionalmente presente para saturar uma valência livre de S, caso presente;
[00215] e a linha quebrada indica ligação covalente à cadeia lateral de Axx; se n for maior do que 1, cada linha quebrada representa uma ligação covalente a um grupo individual, separado de fórmula (I) ou fórmula (I'), em que múltiplos grupos de fórmula (I) ou fórmula (I') po- dem ser os mesmos ou diferentes; se n for maior do que 1, cada S pode ser o mesmo ou diferente;
[00216] Z representa um grupo covalentemente ligado ao C- terminal de Ayy ou Axx selecionado a partir de –OH; -N(H)(R), em que R representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila, um grupo cicloalquila ou um grupo aromático; e um agente marcador tal como um derivado de cumarina.
[00217] 2. O composto do item 1, em que pelo menos um de Axx, Ayy, A'xx, A'yy e m é definido como a seguir:
[00218] Axx representa um aminoácido selecionado a partir de Glu, ácido 2-amino-pimélico (Apa), Aaa, Dap, Dab, Lys, Orn, Ser, Ama e homolisina (homoLys), preferivelmente um aminoácido selecionado a partir de Dap, Dab, Lys, Orn e homoLys;
[00219] Ayy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Phg e Tyr, preferivelmente Phe, Phg ou Trp, mais preferivel- mente Phe ou Phg;
[00220] A'xx na fórmula (Ia) representa um aminoácido selecionado a partir de Dap, Dap, Lys, Orn e homoLys;
[00221] A'yy nas fórmulas (Ia) ou (Ib) representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Phg e Tyr, preferivelmente Phe, Phg ou Trp, mais preferivelmente Phe ou Phg;
[00222] m é um número inteiro de 1 a 4.
[00223] 3. Um composto representado por uma das seguintes fór- mulas gerais (II), (II') e (IIa):
[00224] em que,
[00225] D representa uma porção derivada de um fármaco; se o*p>1 um ou mais D's podem ser hidrogênio com a condição de que pelo menos um D representa uma porção derivada de um fármaco;
[00226] Bxx nas fórmulas (II) e (II') representa um aminoácido tri- funcional tal como um ácido amino-dicarboxílico ou um ácido diamino- carboxílico; com a condição de que Bxx na fórmula (II) não seja um aminoácido na configuração (D);
[00227] Bxx nas fórmulas (IIa) representa um ácido amino car- boxílico tal como Ama, Glu, Aaa, Apa ou um aminoácido trifuncional selecionado a partir de Dap, Dab, Ser, Thr, Lys, Orn, homoLys, ho- moSer e homoThr; com a condição de que Bxx não seja um ami- noácido na configuração (D); Cxx representa uma única ligação cova- lente a menos que Bxx seja Ama; se Bxx é Ama, Cxx representa (L)- ou (D)-Pro, ou um N-metil aminoácido tal como Sar, o N-terminal de Cxx se liga a uma extremidade carboxila de Ama e o C-terminal de Cxx se liga à porção D;
[00228] naqueles casos onde Bxx nas fórmulas (II), (II') e (IIa) carrega um hidrogênio como grupo D, Bxx também pode ser qualquer outro aminoácido, com a condição de que Bxx nas fórmulas (II) e (IIa) não seja um aminoácido na configuração (D);
[00229] Byy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Val, His, Lys, Abu, Met, Cit, Orn, Ser, Thr, Leu, Ile e Arg; ou Byy nas fórmulas (II) e (IIa) representa um aminoácido se- lecionado a partir de homo-Phe, beta-Phe e beta-homo-Phe; com a condição de que Byy na fórmula (II') não seja um aminoácido na con- figuração (D) e com a condição de que se o*p>1, apenas o C-terminal Byy nas fórmulas (II) e (IIa) possa representar um aminoácido selecio- nado a partir de homo-Phe, beta-Phe e beta-homo-Phe;
[00230] Bxx1 representa uma única ligação covalente ou um ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica ou básica;
[00231] Bxx2 representa um aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica ou básica;
[00232] S e V são conforme definidos no item 1;
[00233] Z é covalentemente ligado ao C-terminal de Byy nas fórmu- las (II) e (IIa) e o C-terminal de Bxx na fórmula (II'), e representa um grupo selecionado a partir de -OH; -N(H)(R), R sendo conforme definido no item 1; e um agente marcador; e
[00234] o e p cada independentemente é um número inteiro de 1 a 10, se p for maior do que 1, Bxx1 não é um aminoácido na configura- ção (D); se p for maior do que 1 e/ou se o for maior do que 1, então cada D pode ser independentemente selecionado a partir de porções derivadas a partir de um fármaco.
[00235] 4. O composto do item 3, em que pelo menos um de Bxx1, Bxx2, Bxx, Byy, o e p é definido como a seguir:
[00236] Bxx1 representa uma única ligação covalente ou um ami- noácido selecionado a partir de Phe, Phg, Val, Ser, Tyr, Ala, Leu, Ile; preferivelmente um aminoácido selecionado a partir de Phe, Phg, Tyr e Val, mais preferivelmente Phe, Phg ou Tyr;
[00237] Bxx2 representa um aminoácido selecionado a partir de Arg, Lys, Cit, Val, Leu, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Phg e Phe; preferivelmente um aminoácido selecionado a partir de Arg, Lys, Cit e Phe;
[00238] Bxx nas fórmulas (II) e (II') representa um aminoácido se- lecionado a partir de Dap, Dab, Lys, Orn, Ser, Glu, Ama, Thr, Aaa, homoSer e homoThr; preferivelmente Lys ou Dab;
[00239] Byy representa Phe, Phg ou Trp, preferivelmente Phe ou Phg; e
[00240] o e p cada independentemente é um número inteiro de 1 a
4.
[00241] 5. O composto de qualquer um dos itens 1 a 4, em que nas fórmulas (Ia1), (II), (II') e (IIa),
[00242] S representa um grupo divalente selecionado a partir de um grupo alquileno divalente, um grupo alquenileno divalente, um grupo alquinileno divalente e um óxido de polialquileno divalente;
[00243] preferivelmente um grupo divalente tendo a fórmula – (CH2)q-Azz5-, ou -(OCH2CH2)q-Azz5-; em que q é um número inteiro de 1 a 50; e Azz5 está ausente, ou representa um grupo solubilizante pre- ferivelmente selecionado a partir de um aminoácido tal como Arg e um grupo divalente contend um grupo amônio ou um grupo sulfato.
[00244] 6. O composto de qualquer um dos itens 1 a 5, em que nas fórmulas (Ia1), (II), (II') e (IIa),
[00245] S representa um grupo divalente tendo a fórmula -(CH2)q- Azz5-Y-, ou um grupo divalente tendo a fórmula -(OCH2CH2)q-Azz5-Y-;
[00246] em que Y representa uma porção divalente covalentemente ligada ao C-terminal de Azz5 e à porção V; se Azz5 estiver ausente, Y é covalentemente ligado ao grupo alquila ou grupo de óxido de po- lietileno e à porção V; Y é derivado a partir de um composto selecio- nado a partir de maleimidas, triazóis, especialmente 1,2,3-triazol, hidrazonas, grupos contendo carbonila, e derivados dos mesmos, pre- ferivelmente a partir de maleimidas e derivados dos mesmos; q é um número inteiro de 1 a 50; e Azz5 é conforme definido no item 5.
[00247] 7. O composto do item 1, que é selecionado a partir de:
[00248] em que W, V, D1 e D2 têm os mesmos significados con- forme especificado no item 1.
[00249] 8. O composto do item 3, que é selecionado a partir de:
[00250] em que V e D têm os mesmos significados conforme es- pecificado no item 4.
[00251] 9. O composto de qualquer um dos itens 1 a 8, em que ca- da porção derivada de um fármaco é independentemente selecionada a partir de: (i) agentes antineoplásicos incluindo agentes alquilantes, alcaloides tais como taxanos e maitansinoides, antimetabólitos, tera- pias endócrinas, inibidores de cinase; (ii) agentes imunomoduladores tais como imunoestimu- lantes e imunossupressores; (iii) agentes anti-infecciosos incluindo fármacos antibacteri- anos, fármacos antimitóticos, fármacos antimicobacterianos e fárma- cos antivirais; radioisótopos e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00252] 10. O composto de qualquer um dos itens 1 a 9, em que cada porção derivada de um fármaco é independentemente derivada a partir de duocarmicina, auristatina, maitansina, tubulisina, caliqueami- cina, camptotecina, SN-38, taxol, daunomicina, vinblastina, doxorrubi- cina, metotrexato, pirrolobenzodiazepina, ou radioisótopos e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00253] 11. O composto de qualquer um dos itens 1, 2, 5, 6, 7, 9 e 10, em que cada porção D1 é independentemente representada pela fórmula que segue (III):
[00254] em que
[00255] W1 representa uma porção derivada de duocarmicina, auri- statina, maitansina, tubulisina, caliqueamicina, camptotecina, SN-38, taxol, daunomicina, vinblastina, doxorrubicina, metotrexato, pirroloben- zodiazepina, ou radioisótopos e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos;
[00256] Dxx representa uma única ligação covalente, um ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, preferivelmente um ami- noácido selecionado a partir de Phe, Val e Ala, ou um aminoácido ten- do uma cadeia lateral hidrofóbica que é ligado à porção W1 através de uma porção divalente selecionada a partir de maleimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila, e derivados dos mesmos, pre- ferivelmente através de um derivado de maleimida divalente;
[00257] Dyy representa uma única ligação covalente ou um ami- noácido tendo uma cadeia lateral básica, preferivelmente um ami- noácido selecionado a partir de Arg, Lys, Phe, Cit, Orn, Dap e Dab, mais preferivelmente Arg ou Cit;
[00258] e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx na fórmula (I), o N-terminal de Ayy na fórmula (I'), o N-terminal de A'xx nas fórmulas (Ia) e (Ib), ou o N-terminal A'yy na fórmula (Ia').
[00259] 12. O composto de qualquer um dos itens 1 a 11, em que cada porção D2 e D é independentemente representada pela fórmula que segue (IIIa):
[00260] em que
[00261] W2 representa uma porção derivada de duocarmicina, auri- statina, maitansina, tubulisina, caliqueamicina, camptotecina, SN-38, taxol, daunomicina, vinblastina, doxorrubicina, metotrexato, pirroloben- zodiazepina ou radioisótopos e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos;
[00262] Exx representa uma única ligação covalente ou uma porção divalente selecionado a partir de maleimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila, aminoácidos, porções dipeptídicas e derivados dos mesmos, preferivelmente um derivado de maleimida;
[00263] e a linha quebrada indica ligação covalente à cadeia lateral de A'xx nas fórmulas (Ia) e (Ia'), a cadeia lateral de A'xx ou C-terminal de Cxx caso presente na fórmula (Ib), a cadeia lateral de Bxx nas fór- mulas (II) e (II'), a cadeia lateral de Bxx ou C-terminal de Cxx caso presente na fórmula (IIa).
[00264] 13. O composto de qualquer um dos itens 1 a 12, em que V representa uma porção derivada de um grupo vetor selecionado a par- tir de anticorpos, fragmentos de anticorpo, proteínas, peptídeos e moléculas não peptídicas;
[00265] preferivelmente um anticorpo ou um fragmento de anticorpo tal como um anticorpo de cadeia única, um anticorpo monoclonal, um anticorpo monoclonal de cadeia única, um fragmento de anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um fragmento de anticorpo qui- mérico, um anticorpo de domínio ou fragmento do mesmo, uma citocina, um hormônio, um fator de crescimento, um fator estimulante de colônia, um neurotransmissor ou uma molécula de transporte de nutrientes.
[00266] 14. O composto de qualquer um dos itens 1 a 13, em que
[00267] V representa uma porção derivada de um grupo vetor ca- paz de interagir com uma célula alvo, em que a célula alvo está se- lecionada a partir de células tumorais, células infectadas por vírus, células infectadas por micro-organismos, células infectadas por parasi- tas, células envolvidas em doenças autoimunes, células ativadas, célu- las mieloides, células linfoides, melanócitos, e agentes infecciosos in- cluindo bactérias, vírus, micobactérias, fungos;
[00268] preferivelmente a célula alvo está selecionada a partir de células de linfoma, células de mieloma, células de câncer renal, célu-
las de câncer de mama, células de câncer de próstata, células de câncer ovariano, células de câncer colorretal, células de câncer gástri- co, células de câncer escamoso, células de câncer de pulmão de célu- las pequenas, células de câncer testicular e qualquer célula crescendo e se dividindo em um ritmo desregulado e acelerado para causar cân- ceres.
[00269] 15. Composição compreendendo uma quantidade terapeu- ticamente eficaz do composto de qualquer um dos itens 1 a 14 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um ou mais componen- tes selecionados a partir de um veículo, um diluente e outros excip- ientes.
[00270] 16. O composto ou composição de qualquer um dos itens 1 a 15 para uso em um método de tratamento ou prevenção de um câncer, uma doença autoimune e/ou uma doença infecciosa.
[00271] 17. O composto ou composição para uso do item 16, em que no método de tratamento ou prevenção de um câncer, uma doen- ça autoimune e/ou uma doença infecciosa, O composto ou com- posição é administrado de forma concomitante com, antes ou depois de um ou mais outros agentes terapêuticos ou terapias tais como agentes quimioterápicos, terapia com radiação, agentes imunoterápi- cos, agentes para distúrbios autoimunes, agentes anti-infecciosos ou outros compostos de fórmula (I)/(I') ou (II)/(II')/(IIa).
[00272] 18. Método para tratar ou prevenir um câncer, uma doença autoimune e/ou uma doença infecciosa, em que uma quantidade tera- peuticamente eficaz do composto ou composição de qualquer um dos itens 1 a 15 é administrada a um paciente que necessita do mesmo.
FIGURAS
[00273] Figura 1 – (a) O mecanismo de liberação do fármaco in- duzido por Exo-Cat-B a partir de um composto de fórmula (I), em que W representa uma porção representada pela fórmula (III) ou uma por-
ção peptídica representada pela fórmula(Ia), (Ia') ou (Ib), e T é uma porção de fórmula (Ia1) com n=1. A clivagem de exo-Cat B intracelular no N-terminal do dipeptídeo Axx-Ayy libera o fármaco livre na célula alvo. De acordo com esta modalidade, a clivagem enzimática e a liber- ação de fármaco ocorrem simultaneamente. (b) o mecanismo de liber- ação de fármaco induzido por Exo-Cat B a partir de um composto de fórmula (I), em que W representa uma porção representada pela fór- mula (III), e T é uma porção de fórmula (Ia1) com n=1. A clivagem de exo-Cat B intracelular no N-terminal do dipeptídeo Axx-Ayy libera o fármaco modificado W1-Dxx-Dyy, em que W1 é fármaco derivado de um fármaco native apenas em virtude da ligação covalente a Dxx, na célula alvo.
[00274] Figura 2 – O mecanismo de liberação do fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir de um composto de fórmula (I'), em que W rep- resenta uma porção representada pela fórmula (III) ou uma porção peptídica representada pela fórmula (Ia), (Ia') ou (Ib), e T é uma porção de fórmula (Ia1) com n=1. A clivagem de exo-Cat B intracelular no N- terminal de dipeptídeo Ayy-Axx libera o fármaco livre na célula alvo. De acordo com esta modalidade, a clivagem enzimática e a liberação de fármaco ocorrem simultaneamente.
[00275] Figura 3 – O mecanismo de liberação do fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir de um composto de fórmula (I) ou fórmula (I'), em que W representa uma porção representada pela fórmula (III) ou uma porção peptídica representada pela fórmula (Ia), (Ia') ou (Ib) e T é uma porção de fórmula (Ia1) com n=4. A clivagem de exo-Cat B in- tracelular no N-terminal de cada dipeptídeo C-terminal Axx-Ayy de fórmula (I) ou cada dipeptídeo C-terminal Ayy-Axx de fórmula (I') libera o(s) fármaco(s) livre(s) na célula alvo. De acordo com esta modali- dade, a múltipla clivagem enzimática e a liberação de fármaco(s) ocor- rem simultaneamente.
[00276] Figura 4 – O mecanismo de liberação do fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir de um composto de fórmula (I) em que W repre- senta uma porção peptídica tendo a fórmula (Ia) com m=1 e T é uma porção de fórmula (Ia1) com n=1. A clivagem de exo-Cat B intracelular no N-terminal de Axx-Ayy e A'xx-A'yy libera porção D1 e A'xx(D2)-A'yy. De acordo com esta modalidade, a clivagem enzimática e a liberação de D1 e A'xx(D2)-A'yy ocorrem simultaneamente. De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção, A'xx(D2)-A'yy pode sofrer aminólise intramolecular (isto é, formação de anel com 5 ou 6 mem- bros), hidrólise catalisada por enzima ou ácido, ou formação de dice- topiperazina (DKP) para liberar D2.
[00277] Figura 5 – O mecanismo de liberação do fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir de um composto de fórmula (I) em que W repre- senta uma porção peptídica tendo a fórmula (Ia) com m≥1 e T repre- senta uma porção de fórmula (Ia1) com n=1. A clivagem de exo-Cat B intracelular no N-terminal de Axx-Ayy e a sequencial clivagem de exo- Cat B de cada unidade A'xx-A'yy libera a porção D1 e porções m A'xx(D2)-A'yy. De acordo com uma modalidade da presente invenção, uma ou mais porções A'xx(D2)-A'yy podem sofrer aminólise intramo- lecular ou hidrólise para liberar D2.
[00278] Figura 6 – O mecanismo de liberação do fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir de um composto de fórmula (I') em que W rep- resenta uma porção peptídica tendo a fórmula (Ia) com m=1 e T é uma porção de fórmula (Ia1) com n=1. A clivagem de exo-Cat B intracelular no N-terminal de Ayy-Axx e A'xx-A'yy libera D1 e A'xx(D2)-A'yy. De acordo com uma modalidade da presente invenção, a porção A'xx(D2)- A'yy pode sofrer aminólise intramolecular ou hidrólise para liberar D2.
[00279] Figura 7 – O mecanismo de liberação do fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir de um composto de fórmula (I') em que W rep- resenta uma porção peptídica tendo a fórmula (Ia) com m≥1 e T repre-
senta uma porção de fórmula (Ia1) com n=1. A clivagem de exo-Cat B intracelular no N-terminal de Ayy-Axx e a clivagem sequencial de exo- Cat B de cada A'xx-A'yy libera D1 e porções m A'xx(D2)-A'yy. De acor- do com uma modalidade da presente invenção, uma ou mais porções A'xx(D2)-A'yy podem sofrer aminólise intramolecular ou hidrólise para liberar D2.
[00280] Figura 8 – O mecanismo de liberação do fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir de um composto de fórmula (II). A clivagem de exo-Cat B intracelular no N-terminal de cada peptídeo Bxx-Byy libera V-S-Bxx1-Bxx2 e as porções Bxx(D)-Byy-OH, que podem sofrer aminólise intramolecular ou hidrólise para liberar as porções D.
[00281] Figura 9 – O mecanismo de liberação do fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir de um composto de fórmula (I') em que D repre- senta uma porção derivada de maitansina (DMR), and T representa uma porção de fórmula (Ia1) com n=1, no qual S é –(OCH2CH2)q com q=4 (PEG4). Dyy na Figura 9 representa um aminoácido selecionado a partir de Arg, Lys, Cit e Phe. De acordo com esta modalidade, a clivagem enzimática induzida por Cat B no N-terminal de Axx libera o fármaco na célula alvo.
[00282] Figura 10 – Desenho esquemático ilustrando o uso de LDCs em diagnóstico. A clivagem induzida por Cat B no C-terminal da sonda fluorescente de 7-amino-4-metilcumarina (AMC) permite monito- rar a liberação do fármaco na célula alvo.
[00283] Figuras 11-17 – Desenhos esquemáticos mostrando a preparação sintética de compostos 1-7 (compostos de fórmula (I) ou (I')). Figura 11: preparação de composto 1, isto é AF-Arg-Lys(PEG4- Mal-Cys-Ac)-Phe-OH (composto de fórmula (I) com n=1, W=AF-Arg, W1=AF, Dxx=ligação única, Dyy=Arg, T=PEG4-Mal-Cys-Ac, Axx=Lys, Ayy=Phe and Z=OH). Figura 12: preparação de composto 2, isto é AF-Arg-Lys(PEG4-Mal)-Phe-OH (composto de fórmula (I) com n=1,
W=AF-Arg, W1=AF, Dxx=ligação única, Dyy=Arg, Axx=Lys, Ayy=Phe e Z=OH; “Mal” representa um derivado de maleimida para a ligação ao vetor). Figura 13: preparação de composto 3, isto é AF-Arg-Phe- Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-OH (composto de fórmula (I') com n=1, W=AF- Arg, W1=AF, Dxx=ligação única, Dyy=Arg, T=PEG4-Mal-Cys-Ac, Axx=Lys, Ayy=Phe and Z=OH). Figura 14: preparação de composto 4, isto é AF-Arg-Phe-Lys(PEG4-Mal)-OH (composto de fórmula (I') com n=1, W=AF-Arg, W1=AF, Dxx=ligação única, Dyy=Arg, Axx=Lys, Ayy=Phe e Z=OH; “Mal” representa um derivado de maleimida para a ligação ao vetor). Figura 15: preparação de composto 5, isto é DM1- Mal-Phe-Lys-Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-Phe-OH (composto de fórmula (I) com n=1, W1=DM1, Dxx=Mal-Phe, Dyy=Lys, T=PEG4-Mal-Cys-Ac, Axx=Lys, Ayy=Phe e Z=OH). Figura 16: preparação de composto 6, isto é DM1-Mal-Phe-Cit-Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-Phe-OH (composto de fórmula (I) com n=1, W1=DM1, Dxx=Mal-Phe, Dyy=Cit, T=PEG4-Mal- Cys-Ac, Axx=Lys, Ayy=Phe e Z=OH). Figura 17: preparação de com- posto 7, isto é DM1-Mal-Phe-Cit-Phe-Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-OH (composto de fórmula (I') com n=1, W1=DM1, Dxx=Mal-Phe, Dyy=Cit, T=PEG4-Mal-Cys-Ac, Axx=Lys, Ayy=Phe e Z=OH).
[00284] Figuras 18-28 – Desenhos esquemáticos mostrando a preparação sintética de compostos 8-18 (compostos de fórmula (II)). Figura 18: preparação de composto 8, isto é Arg-PEG4-Phe-Arg- Glu(Sar-OCPT)-Phe-OH (composto de fórmula (IIa) com o=1 e p=1, D=CPT, V=Arg, S=PEG4, Bxx=Glu, Byy=Phe, Bxx1=Phe, Bxx2=Arg, Cxx=Sar e Z=OH). Figura 19: preparação de composto 9, isto é Arg- PEG4-Phe-Arg-Dap(CO-CPT)-Phe-OH (composto de fórmula (II) com o=1 e p=1, D=CPT, V=Arg, S=PEG4, Bxx=Dap, Byy=Phe, Bxx1=Phe, Bxx2=Arg e Z=OH). Figura 20: preparação de composto 10, isto é Arg-PEG4-Phe-Arg-Dab(CO-CPT)-Phe-OH (composto de fórmula (II) com o=1 e p=1, D=CPT, V=Arg, S=PEG4, Bxx=Dab, Byy=Phe,
Bxx1=Phe, Bxx2=Arg e Z=OH). Figura 21: preparação de composto 11, isto é Arg-PEG4-Phe-Arg-Ser(CO-CPT)-Phe-OH (composto de fórmula (II) com o=1 e p=1, D=CPT, V=Arg, S=PEG4, Bxx=Ser, Byy=Phe, Bxx1=Phe, Bxx2=Arg e Z=OH). Figura 22: preparação de composto 12, isto é Ac-Cys-Mal-PEG4-Phe-Lys-Lys(Mal-DM1)-Phe-OH (composto de fórmula (II) com o=1 e p=1, D=DM1-Mal, V=Ac-Cys-Mal, S=PEG4, Bxx=Lys, Byy=Phe, Bxx1=Phe, Bxx2=Lys e Z=OH). Figura 23: preparação de composto 13, isto é Ac-Cys-Mal-PEG4-Phe-Lys- Lys(AF)-Phe-OH (composto de fórmula (II) com o=1 e p=1, D=AF, V=Ac-Cys-Mal, S=PEG4, Bxx=Lys, Byy=Phe, Bxx1=Phe, Bxx2=Lys e Z=OH).
[00285] Figura 24: preparação de composto 14, isto é Mal-PEG4- Phe-Lys-Lys(AF)-Phe-OH (composto de fórmula (II) com o=1 e p=1, D=AF, S=Mal-PEG4, Bxx=Lys, Byy=Phe, Bxx1=Phe, Bxx2=Lys e Z=OH; “Mal” representa um derivado de maleimida para a ligação ao vetor). Figura 25: preparação de composto 15, isto é Arg-PEG4-Phe-Arg- Glu(Sar-OCPT)-Arg-OH (composto de fórmula (IIa) com o=1 e p=1, D=CPT, V=Arg, S=PEG4, Bxx=Glu, Byy=Arg, Bxx1=Phe, Bxx2=Arg, Cxx=Sar e Z=OH). Figura 26: preparação de composto de referência 16, isto é Arg-PEG4-Phe-Arg-Glu(Sar-OCPT)-Arg-Phe-Arg-OH. Figura 27: preparação de composto 17, isto é Arg-PEG4-Phe-Arg-[Glu(Sar- OCPT)-Arg]2-OH (composto de fórmula (IIa) com o=2 e p=1, D=CPT, V=Arg, S=PEG4, Bxx=Glu, Byy=Arg, Bxx1=Phe, Bxx2=Arg, Cxx=Sar e Z=OH). Figura 28: preparação de composto 18, isto é Arg-PEG4- [Phe-Arg-Glu(Sar-OCPT)-Arg]2-OH (composto de fórmula (IIa) com o=1 e p=2, D=CPT, V=Arg, S=PEG4, Bxx=Glu, Byy=Arg, Bxx1=Phe, Bxx2=Arg, Cxx=Sar e Z=OH).
[00286] Figura 29 – Estudo de liberação de fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir do composto 1 isto é AF-Arg-Lys(PEG4-Mal-Cys- Ac)-Phe-OH (fórmula (I)). A clivagem do composto 1 liberou quantita-
tivamente a porção farmacologicamente ativa de AF-Arg (t1/2 = 1,5 min).
[00287] Figura 30 – Estudo de liberação de fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir do composto 3, isto é AF-Arg-Phe-Lys(PEG4-Mal- Cys-Ac)-OH (fórmula (I')). A clivagem do composto 3 liberou quantita- tivamente a porção farmacologicamente ativa de AF-Arg (t1/2 = 1,4 min).
[00288] Figura 31 – Estudo de liberação de fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir do composto 5, isto é DM1-Mal-Phe-Lys-Lys(PEG4- Mal-Cys-Ac)-Phe-OH (fórmula (I)). A clivagem do composto 5 liberou quantitativamente a porção farmacologicamente ativa de DM1-Mal- Phe-Lys (t1/2 = 0,59 min).
[00289] Figura 32 – Estudo de liberação de fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir do composto 12, isto é Ac-Cys-Mal-PEG4-Phe-Lys- Lys(Mal-DM1)-Phe-OH (fórmula (II)). A clivagem do composto 12 li- berou a porção farmacologicamente ativa de Lys(Mal-DM1)-Phe (t1/2 = 1,53 min).
[00290] Figura 33 – Estudo de liberação de fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir do composto 17, isto é Arg-PEG4-Phe-Arg-[Glu(Sar- CPT)-Phe]2-OH (fórmula (II)). A clivagem dipeptídica C-terminal do composto17 resulta na formação temporária de intermediário Arg- PEG4-Phe-Arg-(Glu(Sar-CPT)-Phe-OH (compound 8) o qual, por sua vez, é clivado por Cat B para liberar um segundo Glu(Sar-CPT)-Phe- OH, que libera camptotecina através da hidrólise de éster (CPT).
[00291] Figura 34 – Estudo de liberação de fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir do composto 18, isto é Arg-PEG4-[Phe-Arg-Glu(Sar- CPT)-Arg]2-OH (fórmula (II)). A clivagem sequencial do composto 18 resulta na formação temporária de intermediários Arg-PEG4-Phe-Arg- (Glu(Sar-CPT)-Arg-Phe-Arg-OH (composto 16) e Arg-PEG4-Phe-Arg- (Glu(Sar-CPT)-Arg-OH (composto 15), o qual por sua vez é clivado por
Cat B para liberar um segundo Glu(Sar-CPT)-Arg-OH. Subse- quentemente, CPT nativo é liberado através da hidrólise de éster.
[00292] Figura 35 – Estudo da atividade de citotoxicidade dos com- postos AF e AF-Arg em linhagens celulares que expressam ErbB2 SK-BR-3 e SK-OV-3 em tempo de incubação de 120h (exemplo 9). Traço superior: razão de sobrevivência de SK-OV-3 (%) depois de 120h de incubação com concentrações decrescentes de AF ou AF-Arg (diluição log) (duas rodadas; IC50(AFrun1)=100,2 nM, IC50(AFrun2)=145,2 nM; IC50(AF-Argrun1)=146,7 nM, IC50(AF-Argrun2)=204,7 nM). Traço infe- rior: tempo de sobrevivência de SK-BR-3 (%) depois de 120h de incu- bação com concentrações decrescentes de AF ou AF-Arg (diluição log)(duas rodadas; IC50(AFrun1)=18,82 nM, IC50(AFrun2)=21,75 nM; IC50(AF-Argrun1)=20,9 nM, IC50(AF-Argrun2)=24,92 nM).
[00293] Figuras 36-41 – Desenhos esquemáticos mostrando a preparação sintética de compostos 19-24 (compostos de fórmula (I)/(I')). Figura 36: preparação de composto 19, isto é AF-Cit- Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-Phe-OH (composto de fórmula (I)/(III) com W1=AF, Dxx=ligação única, Dyy=Cit, T=PEG4-Mal-Cys-Ac, Axx=Lys, Ayy=Phe and Z=OH). Figura 37: preparação de composto 20, isto é ACit-Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-Phe-OH (composto de fórmula (I)/(III) com W1=ACit, Dxx=Dyy=ligação única, T=PEG4-Mal-Cys-Ac, Axx=Lys, Ayy=Phe e Z=OH). Figura 38: preparação de composto 21, isto é ACit-Phe-Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-OH (composto de fórmula (I')/(III) com W1=ACit, Dxx=ligação única, Dyy=Phe, T=PEG4-Mal-Cys-Ac, Axx=Lys, Ayy=Phe e Z=OH). Figura 39: preparação de composto 22, isto é DM1-Mcc-Phe-Cit-Lys(PEG5-Ma-Cys-Ac)-Tyr-OH (composto de fórmula (I)/(III) com W1=DM1, Dxx=Mcc-Phe, Dyy=Cit, T=PEG5-Ma- Cys-Ac, Axx=Lys, Ayy=Tyr and Z=OH). Figura 40: preparação de composto 23, isto é DM1-Mcc-Cit-Lys(PEG5-Ma-Cys-Ac)-Tyr-OH (composto de fórmula (I)/(III) com W1=DM1, Dxx=ligação única,
Dyy=Cit, T=PEG5-Ma-Cys-Ac, Axx=Lys, Ayy=Tyr e Z=OH). Figura 41: preparação de composto 24, isto é DM1-Mcc-Phe-Lys(PEG5-Ma-Cys- Ac)-Tyr-OH (composto de fórmula (I)/(III) com W1=DM1, Dxx=Mcc- ligação única, Dyy=Phe, T=PEG5-Ma-Cys-Ac, Axx=Lys, Ayy=Tyr e Z=OH).
[00294] Figuras 42-45 – Desenhos esquemáticos mostrando a preparação sintética de compostos 25-28 (compostos de fórmula (II)/(II')). Figura 42: preparação de composto 25, isto é Ac-Cys-Ma- PEG5-Phe-Cit-Lys(Mcc-DM1)-Cit-OH (composto de fórmula (II) com o=1 e p=1, D=DM1-Mcc, V=Ac-Cys-Ma, S=PEG5, Bxx=Lys, Byy=Cit, Bxx1=Phe, Bxx2=Cit e Z=OH). Figura 43: preparação de composto 26, isto é Ma-PEG5-Phe-Cit-Lys(Mcc-DM1)-Cit-OH (composto de fórmula (II) com o=1 e p=1, D=DM1-Mcc, S=PEG5, Bxx=Lys, Byy=Cit, Bxx1=Phe, Bxx2=Cit e Z=OH). Figura 44: preparação de composto 27, isto é Ac-Cys-Ma-PEG5-Phe-Cit-Lys(Mcc-DM1)-Tyr-OH (composto de fórmula (II) com o=1 e p=1, D=DM1-Mcc, V=Ac-Cys-Ma, S=PEG5, Bxx=Lys, Byy=Tyr, Bxx1=Phe, Bxx2=Cit e Z=OH). Figura 45: preparação de composto 28, isto é Ac-Cys-Mal-PEG4-Phe-Lys- Lys(Mal-DM1)-Phe-Phe-Lys-OH (intermediádio para composto 29).
[00295] Figuras 46-47 – Desenhos esquemáticos mostrando a preparação sintética de compostos 29-30 (compostos de fórmula (II) para liberação múltipla de fármacos). Figura 46: preparação de com- posto 29, isto é Ac-Cys-Mal-PEG4-[Phe-Lys-Lys(Mal-DM1)-Phe]2-OH (composto de fórmula (II) com o=1 e p=2, D=Mal-DM1, V=Ac-Cys, S=PEG4, Bxx=Lys, Byy=Phe, Bxx1=Phe, Bxx2=Lys e Z=OH). Figura 47: preparação de composto 30, isto é Ac-Cys-Mal-PEG4-Phe-Arg- Lys(Mal-DM1)-Arg-Lys(AF)-Phe-OH (composto de fórmula (II) com o=2 e p=1, D=Mal-DM1/AF, V=Ac-Cys, S=PEG4, Bxx=Lys/Lys, Byy=Arg/Phe, Bxx1=Phe, Bxx2=Arg e Z=OH).
[00296] Figuras 48-49 – Desenhos esquemáticos mostrando a preparação sintética de compostos 31-32 (compostos de fórmula (I) para liberação múltipla de fármacos). Figura 48: preparação de com- posto 31, isto é AF-Cit-Lys(Mal-DM1)-Phe-Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-Phe- OH (composto de fórmula (I) em que W é uma porção peptídica de fórmula (Ia) com m=1, D1=AF-Cit, D2=Mal-DM1, Axx/A'xx=Lys, Ayy/A'yy=Phe, T= PEG4-Mal-Cys-Ac e Z=OH). Figura 49: preparação de composto 32, isto é Ac-Cys-Mal-[PEG5-Lys(AF-Cit-Lys(Y)-Phe- OH)]2-Gly-NH2 (composto de fórmula (I) em que W é uma porção de fórmula (III) em que W1=AF, Dxx= ligação única e Dyy=Cit, Axx=Lys, Ayy=Phe e Z=OH; T é uma porção de fórmula (Ia1) com V=Ac-Cys- Mal, S=PEG5-Lys(Y), Y=triazol, Rx=Gly-NH2 e n=2).
[00297] Figura 50 – Estudo de liberação de fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir do composto 13, isto é Ac-Cys-Mal-PEG4-Phe-Lys- Lys(AF)-Phe-OH (fórmula (II)). A clivagem do composto 13 liberou a porção farmacologicamente ativa de Lys(AF)-Phe (t1/2 = 1,62 min).
[00298] Figura 51 – Estudo de liberação de fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir do composto 29, isto é Ac-Cys-Mal-PEG4-[Phe-Lys- Lys(Mal-DM1)-Phe]2-OH (fórmula (II)). Múltiplas clivagens de composto 29 liberaram duas porções farmacologicamente ativas de Lys(Mal- DM1)-Phe.
[00299] Figura 52 – Estudo de liberação de fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir do composto 30, isto é Ac-Cys-Mal-PEG4-Phe-Arg- Lys(Mal-DM1)-Arg-Lys(AF)-Phe-OH (fórmula (II)). Múltiplas clivagens de composto 30 liberaram porções farmacologicamente ativas de Lys(Mal-DM1)-Arg e Lys(AF)-Phe.
[00300] Figura 53 – Estudo de liberação de fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir do composto 31, isto é AF-Cit-Lys(Mal-DM1)-Phe- Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-Phe-OH (fórmula (I)). Múltiplas clivagens de composto 31 liberaram porções farmacologicamente ativas de AF-Cit e Lys(Mal-DM1)-Phe.
[00301] Figura 54 – Estudo de liberação de fármaco induzido por Exo-Cat-B a partir do composto 32, isto é Ac-Cys-Mal-[PEG5-Lys(AF- Cit-Lys(Y)-Phe-OH)]2-Gly-NH2 (fórmula (I), Y=triazol). Múltiplas clivagens de composto 32 liberaram duas porções farmacologicamente ativas de AF-Cit.
[00302] Figura 55 – Estudo de liberação de fármaco induzido por Exo-Cat B a partir de conjugado de anticorpo-fármaco ADC1, isto é AF-Arg-Lys(PEG4-Mal-trastuzumab)-Phe-OH (fórmula (I)). A clivagem de ADC1 liberou a porção farmacologicamente ativa de AF-Arg (t1/2 = 4,22 min).
[00303] Figura 56 – Estudo de estabilidade de plasma do conju- gado de anticorpo-fármaco ADC1 por 24h. Os resultados demonstram que ADC1 exibe excelente estabilidade no plasma (humano e de ca- mundongo).
[00304] Figura 57 – Ensaio de ligação do conjugado de anticorpo- fármaco ADC1 e trastuzumab em linhagens celulares que expressam ErbB2 e ErbB2-negativas (SK-BR-3 e MDA-MB-231, respectivamente). Os resultados mostram que ADC1 tem a mesma afinidade e especi- ficidade por células que expressam ErbB2 do que trastuzumab.
[00305] Figura 58 – Ensaio de ligação do conjugado de anticorpo- fármaco ADC3 e trastuzumab em linhagens celulares que expressam ErbB2 e ErbB2-negativas (BT-474 e MDA-MB-231, respectivamente). Os resultados mostram que ADC3 tem a mesma afinidade e especi- ficidade por células que expressam ErbB2 do que trastuzumab.
[00306] Figura 59 – Estudo de atividade citotóxica de ADC1 em linhagens celulares que expressam ErbB2 e ErbB2-negativas. Figura 59a: razão de sobrevivência de SK-OV-3 que expressa ErbB2 (% de viabilidade) depois de 96h de incubação com concentrações crescen- tes de ADC1 (quadrados), trastuzumab (estrelas), AF-Arg (triângulos) e composto 2 (pontos) (duas rodadas; IC50(ADC1run1)=34,4 pM,
IC50(ADC1run2)=93,9 pM). Figura 59b: razão de sobrevivência de SK- BR-3 expressando ErbB2 (% de viabilidade) depois de 96h de incu- bação com concentrações crescentes de ADC1 (quadrados), trastuzumab (estrelas), AF-Arg (triângulos) e composto 2 (pontos) (du- as rodadas; IC50(ADC1run1)=14,8 pM, IC50(ADC1run2)=43,3 pM). Figura 59c: razão de sobrevivência de MDA-Mb-231 ErbB2-negativo (% de viabilidade) depois de 96h de incubação com concentrações crescen- tes de ADC1 (quadrados), trastuzumab (estrelas), AF-Arg (triângulos) e composto 2 (pontos) (duas rodadas; IC50(ADC1run1)=0,128 nM, IC50(ADC1run2)=23,5 nM).
[00307] Figura 60 – Estudo de atividade citotóxica de ADC3 em linhagens celulares que expressam ErbB2 e ErbB2-negativas. Figura 60a: taxa de sobrevivência de BT-474 expressando ErbB2 (% de via- bilidade) depois de 96h de incubação com concentrações crescentes de ADC3 (triângulos), DM1 (pontos) e trastuzumab (pontos simples), (duas rodadas; IC50(ADC3run1)=0,68 nM, IC50(ADC3run2)=0,35 nM). Figura 60b: taxa de sobrevivência de MDA-MB-231 ErbB2-negativo (% de viabilidade) depois de 96h de incubação com concentrações crescentes de ADC3 (triângulos), DM1 (pontos) e trastuzumab (pontos simples), (duas rodadas; IC50(ADC3run1)=8,69 nM, IC50(ADC3run2)=91,8 nM).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO
1. Definições
[00308] O termo “C-terminal” conforme usado no presente docu- mento se refere à extremidade C-terminal da cadeia de aminoácido, por exemplo aminoácido Ayy no dipeptídeo Axx-Ayy (fórmula (I)) ou aminoácido Axx no dipeptídeo Ayy-Axx (fórmula (I')). A ligação ao “C- terminal” significa que uma ligação covalente é formada entre o grupo ácido do resíduo de aminoácido e o parceiro de ligação. Por exemplo, a ligação do grupo Z ao C-terminal do resíduo de aminoácido Ayy rende um elemento estrutural do tipo éster ou amida –C(O)-X- com X sendo o parceiro de ligação de Z e o grupo carbonila sendo derivado do resíduo de aminoácido Ayy.
[00309] O termo “trifuncional” conforme usado no presente docu- mento se refere a um composto ou porção tendo três grupos funcion- ais que podem formar ou ter três ligações covalentes formadas nas porções adjacentes.
[00310] O termo “grupo funcional” se refere a um grupo que é capaz de se ligar a um outro grupo funcional ao formar pelo menos uma ligação covalente sem a necessidade de quebra de qualquer ligação covalente C-C ou C-H.
[00311] O termo “aminoácido” conforme usado no presente docu- mento se refere a um composto que contém ou é derivado a partir de pelo menos um grupo amino e pelo menos um grupo acídico, preferiv- elmente um grupo carboxila. A distância entre grupo amino e o grupo acídico não está particularmente limitada. α-, β- e -aminoácidos são adequados porém α-aminoácidos e especialmente ácidos α- aminocarboxílicos são particularmente preferidos. Este termo abrange ambos os aminoácidos que ocorrem naturalmente assim como os aminoácidos sintéticos que são encontrados na natureza.
[00312] A expressão “aminoácido na configuração (D)” conforme usada no presente documento se refere ao (D)-isômero de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente ou sintético. Isto se aplica a α- aminoácidos assim como a β- e -aminoácidos. A expressão “ami- noácido na configuração (D)” conforme usado no presente documento não deve abranger aminoácidos não quirais tais como glicina ou outros aminoácidos não quirais tais como ácido aminoisobutírico.
[00313] A menos que especificado de outra forma, os compostos quirais e porções podem estar presentes na forma de um estere- oisômero puro ou na forma de uma mistura de estereoisômeros, inclu-
indo o racemato 50:50. No contexto da presente invenção, referências a estereoisômeros específicos devem ser compreendidos como referências a compostos ou porções, em que o estereoisômero designado está presente em pelo menos 90% de excesso enantiomé- rico (ee), mais preferivelmente pelo menos 95 % de ee e ainda mais preferivelmente 100 % de ee.
[00314] O termo “hidrofóbico” é usado no presente documento para caracterizar compostos, grupos ou porções, que podem carecer de afinidade pela água. Por exemplo, o termo “aminoácido com cadeia lateral hidrofóbica” é usado para caracterizar aminoácidos com uma cadeia lateral alifática hidrofóbica ou parcialmente hidrofóbica ou ami- noácidos com cadeia lateral aromática tal como Phe, Leu, Ile, Val, Tyr, Trp, Ala. Certamente, qualquer outro aminoácido exibindo o mesmo ou um grau maior de hidrofobicidade também deve ser tratado como hi- drofóbico no sentido da presente invenção. Uma comparação do grau de hidrofobicidade por ser feita através da determinação do coeficiente de divisão de n-octanol/água (a 25°C e pH 7): caso a razão das con- centrações em n-octanol/água para um outro aminoácido for igual ou maior do que aquele de um ou mais dos aminoácidos Phe, Leu, Ile, Val, Tyr, Trp, Ala, de forma que o outro aminoácido deve ser tratado como um aminoácido hidrofóbico.
[00315] O termo “aminoácido com uma cadeia lateral básica” é usado no presente documento para caracterizar aminoácidos naturais ou não naturais em que a cadeia lateral contém um ou mais grupos ionizáveis tendo um valor de pKa igual ou maior do que 6. Exemplos de aminoácidos naturais com uma cadeia lateral básica incluem Arg (grupo guanidino, pKa=12.5), Lys (grupo amino, pKa=10.5), His (grupo imidazol, pKa=6). Exemplos de aminoácidos não naturais incluem cit- rulina (Cit), ornitina (Orn), ácido 2,3-diamino-propiônico (Dap), ácido 2,4-diamino-butírico (Dab).
[00316] O termo “grupo solubilizante” conforme usado no presente documento se refere a uma porção hidrofílica, que aumenta a solu- bilidade aquosa do composto ao qual ele é ligado. Exemplos de grupos solubilizantes incluem grupos amônio, grupos sulfato, grupos fosfato, grupos sulfonato e grupos polietileno glicol (PEG), em particu- lar grupos de fórmula –(CH2CH2O)n1-H em que n1 é 2 a 60, por exem- plo 2 a 24.
[00317] O termo “grupo alquila” conforme usado no presente docu- mento se refere a um grupo tendo de 1 a 20 átomos de carbono, pre- ferivelmente um grupo metila ou um grupo etila, um grupo cicloalquila tendo de 3 a 20 átomos de carbono, preferivelmente 5 a 8 átomos de carbono, ou um grupo aromático tendo de 6 a 20 átomos de carbono, preferivelmente 6 ou 10 átomos de carbono. O grupo cicloalquila ou o grupo aromático pode consistir em um anel único, porém ele também pode ser formado por dois ou mais anéis condensados, por exemplo um grupo naftila.
[00318] Onde a presente descrição se refere a modali- dades/características “preferidas”, combinações dessas modali- dades/características “preferidas” também devem ser consideradas como divulgadas à medida que essa combinação de modali- dades/características “preferidas” seja tecnicamente significativa.
[00319] A seguir, na presente descrição da invenção e das reivindi- cações, o uso dos termos “contendo” e “compreendendo” deve ser en- tendido de forma que elementos adicionais não mencionados possam estar presentes além dos elementos mencionados. No entanto, esses termos também devem ser entendidos como divulgadores, como uma modalidade mais restrita, o termo “consistindo de” assim como, de forma que nenhum elemento adicional não mencionado possa estar presente, à medida que esta seja tecnicamente significativa. Por ex- emplo, a expressão “grupo contendo carbonila divalente” inclui como uma modalidade preferida um grupo divalente consistindo de carbonila (-CO-). Além dos mais, a expressão “pelo menos um de X e Y” deve ser entendida amplamente como divulgadora de um ou ambos de X e Y, isto é como sendo equivalente a uma expressão “pelo menos um selecionado a partir do grupo de X e Y”.
[00320] O termo “fármaco” conforme usado no presente documento deve ser entendido como uma substância farmacologicamente ativa que pode inibir ou prevenir a função de células e/ou matar células. Em algumas modalidades, o termo “fármaco” deve ser entendido como sendo sinônimo com outros termos comumente usados na técnica tais como “toxina” ou “carga útil” usados no campo da terapia para o câncer.
[00321] A expressão “porção derivada de um fármaco” conforme usada no presente documento caracteriza uma porção que contém um grupo, que é idêntico a um fármaco nativo exceto pelas modificações estruturais necessárias para ligação do fármaco ao restante do com- posto da presente invenção. Dependendo dos grupos funcionais dis- poníveis no fármaco nativo, a ligação pode ser efetuada usando um dos grupos funcionais já presentes no fármaco nativo ou podem ser efetuados através da incorporação de um novo grupo funcional ou de ligação. Em consequência, o fármaco (nativo) pode ser usado para a ligação em forma não modificada ou em uma forma modificada. Isto é, o fármaco pode ser não modificado (em sua forma natural) exceto quanto à substituição de um átomo de hidrogênio por uma ligação co- valente, ou ele pode ser quimicamente modificado de modo a incorpo- rar um grupo funcional (por exemplo, um grupo selecionado a partir de grupos hidroxila, carboxila, amino e tiol) permitindo ligação(ões) cova- lente(s) a um aminoácido, por exemplo aminoácido Axx na fórmula (I) e Ayy na fórmula (I'), Bxx nas fórmulas (II) e (II'), Cxx nas fórmulas (Ib) e (IIa). O fármaco também pode ser modificado pela ligação covalente a um grupo divalente, por exemplo um aminoácido, um (di)peptídeo, ou um outro ligante ou espaçador tal como descrito no presente docu- mento em relação a S, Sa, Sb, S1, S2, S3, ou combinação dos mes- mos, de forma que a ligação ao restante do composto da presente in- venção seja alcançada através do referido grupo divalente. O referido grupo divalente irá no entanto permanecer ligado ao fármaco depois da clivagem por catepsina B. A expressão “porção derivada de um fármaco” conforme usada no presente documento pretende abranger ambos os significados e pode assim se referir a uma porção que difere do fármaco não modificado (nativo) apenas em virtude da ligação co- valente necessária para ligação ao restante da molécula, ou o fármaco modificado conforme especificado acima contendo adicionalmente por exemplo um ligante ou espaçador.
[00322] A expressão “derivado de maleimida” (ou por exemplo “derivado de triazol” etc.) conforme usada no presente documento se refere a uma porção de maleimida que é modificada em virtude das ligações covalentes necessárias para ligação a outros grupos, por ex- emplo para ligação a um fármaco e ao restante do composto. Por ex- emplo, um derivado de maleimida está covalentemente ligado através de um grupo carboxílico (por exemplo, ácido 3-maleimidopropiônico) a um resíduo N-terminal do composto de fórmula (I)/(I') ou à cadeia lat- eral de Bxx do composto de fórmula (II)/(II')/(IIa). De forma subse- quente, um grupo nucleofílico (por exemplo, um grupo nucleofílico que pode ocorrer no fármaco nativo tal como o grupo tiol de mertansina) é reagido à função de maleimida através da adição de Michael.
[00323] De uma forma análoga, o termo “derivado” é usado em conexão com outras porções para caracterizar a presença de ligações covalentes necessárias para ligação às porções adjacentes.
[00324] O termo “fármaco nativo” se refere a um composto, para o qual a eficácia terapêutica foi estabelecida por testes in vitro e/ou in vivo. Em uma modalidade preferida, o fármaco nativo é um composto para o qual a eficácia terapêutica foi estabelecida por testes clínicos. Mais preferivelmente, o fármaco nativo é um fármaco que já está comercialmente disponível. O tipo de eficácia terapêutica a ser es- tabelecida e os testes adequados a serem aplicados depende cer- tamente do tipo de indicação médica a ser tratada.
[00325] Consequentemente, o fármaco a ser usado no conjugado ligante-fármaco da presente invenção pode ser um fármaco nativo (por exemplo, um fármaco que naturalmente contém um ou mais grupos funcionais permitindo a ligação covalente ao conjugado), ou pode ser um fármaco quimicamente modificado (por exemplo, um fármaco de acordo com a fórmula (III)), uma porção A'xx(D2)-A'yy de acordo com a fórmula (Ia) ou uma porção A'yy-A'xx(D2) de acordo com a fórmula (Ia'), uma porção Bxx(D)-Byy de acordo com a fórmula (II) ou uma por- ção Byy-Bxx(D) de acordo com a fórmula (II')) contanto que o fármaco seja farmacologicamente ativo depois que ele for liberado do conju- gado. A atividade farmacológica nesta conexão significa pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 80% da atividade farmacológica do fármaco nativo.
[00326] Naqueles casos onde o fármaco é um agente citotóxico (por exemplo DM1) que é quimicamente modificado pela ligação covalente a um aminoácido ou um (di)peptídeo, o fármaco quimicamente modifi- cado (por exemplo uma porção de acordo com a fórmula (III)), uma porção A'xx(D2)-A'yy de acordo com a fórmula (Ia), - uma porção A'yy- A'xx(D2) de acordo com a fórmula (Ia'), uma porção Bxx(D)-Byy de acordo com a fórmula (II) ou uma porção Byy-Bxx(D) de acordo com a fórmula (II')) pode ser referido como uma “intra-carga útil”, contanto que o fármaco quimicamente modificado seja farmacologicamente ati- vo depois da sua liberação do conjugado.
[00327] A expressão “análogo de auristatina” (ou simplesmente “au-
ristatina”) se refere a uma classe de compostos estruturalmente rela- cionados ao pentapeptídeo que ocorre naturalmente dolastina 10. Os análogos de auristatina (auristatinas) conforme usados no presente documento satisfazem a fórmula que segue:
[00328] em que R3 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo 1 a 10 átomos de carbono, preferivelmente um átomo de hidrogênio ou um grupo metila; e R4 representa a cadeia lat- eral de qualquer aminoácido natural ou não natural.
[00329] Em uma modalidade específica, a invenção faz uso de de- terminados análogos de auristatina.Os exemplos típicos de análogos de auristatina (compostos estruturalmente relacionados à dolastina 10) incluem monometil auristatina E (MMAE) e monometil auristatina F (MMAF). No que segue, a expressão “análogo de auristatina” se refere, em particular, à auristatina X, em que o aminoácido X C- terminal (conforme mostrado acima) é selecionado a partir de Phe (em cujo caso, o análogo de auristatina é auristatina Phe/F (AF)), Cit (em cujo caso, o análogo de auristatina é auristatina Cit (ACit)), Arg (em cujo caso, o análogo de auristatina é auristatina Arg (AArg)), Lys (em cujo caso, o análogo de auristatina é auristatina Lys (ALys)), Orn (em cujo caso, o análogo de auristatina é auristatina Orn (AOrn)), Dab (em cujo caso, o análogo de auristatina é auristatina Dab (ADab)) e Dap (em cujo caso, o análogo de auristatina é auristatina Dap (ADap)). Os análogos de auristatina conforme usados no presente documento (AF, ACit, AArg, ALys, AOrn, ADab, ADap) devem ser considerados como fármacos nativos, além dos fármacos nativos conforme definidos aci-
ma.
[00330] Em outras modalidades, o análogo de auristatina é um análogo para não ser usado no contexto da presente invenção. Isto seria tipicamente um análogo da fórmula acima em que R3 representa um grupo metila e X é Asp, Glu, Thr, fosfo Thr.
[00331] A expressão “porção derivada de um grupo vetor” conforme usada no presente documento indica que o grupo vetor pode estar em uma forma não modificada ou modificada. Isto é, o grupo vetor pode ser não modificado (em sua forma natural) exceto quanto à ligação de um átomo de hidrogênio por uma ligação covalente, ou quimicamente modificada de modo a introduzir um ou mais grupos funcionais (por exemplo, um grupo selecionado a partir de grupos hidroxila, carboxila, tiol e/ou amino) permitindo a(s) ligação(ões) covalente(s) do grupo ve- tor a S (fórmulas (I) (I'), (II) e (II')), S1 (fórmula (Ia2), ou Azz3 (fórmula (Ia3)) contanto que as referidas modificações não interfiram em um grau significativo com a interação entre o grupo vetor e a célula alvo.
[00332] A expressão “capaz de interagir com uma célula alvo” con- forme usada no presente documento indica que o grupo vetor pode se ligar a, complexar com ou reagir com uma porção, por exemplo uma proteína ou receptor, que é exposto na superfície de uma célula alvo. A referida interação pode dar origem a um efeito direcionador (isto é, a um aumento local da concentração do composto que carrega o vetor na proximidade da célula alvo) e/ou ele pode causar internalização do composto que carrega o vetor da presente invenção na célula alvo.
[00333] A expressão "sais farmaceuticamente aceitáveis" conforme usada no presente documento se refere a derivados dos compostos divulgados em que o composto parental é modificado ao produzir sais de ácido ou base dos mesmos. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais não tóxicos convencionais ou os sais de amônio qua- ternário do composto parental formado, por exemplo, a partir de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. As listas de sais adequados po- dem ser encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, page 1418, S.M. Berge, L.M. Bighley, and D.C. Monkhouse, "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci. 66 (1), 1–19 (1977); P. H. Stahl and C. G. Wermuth, edi- tors, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, Weinheim/Zürich, Wiley-VCH, 2008 and in A.K. Bansal et al., Pharmaceutical Technology, 3(32), 2008. Os sais farmacêuticos po- dem ser sintetizados a partir do composto parental que contém uma porção básica ou acídica através dos métodos químicos convencion- ais. Isto pode ser feito antes ou depois da incorporação da porção de fármaco no composto da presente invenção.
[00334] O termo “anticorpo” conforme usado no presente documen- to cobre anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, dímeros, mul- timeros, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos “folheados”, fragmentos de anticorpo e proteínas imunes pequenas. Um anticorpo é uma proteína gerada pelo sistema imune que é capaz de reconhecer e se ligar a um antígeno específico. Um antígeno alvo tem geralmente numerosos sítios de ligação, também chamados epítopos, reconhecidos por regiões deter- minantes de complementariedade em múltiplos anticorpos. Cada anti- corpo que especificamente se liga a um epítopo diferente tem uma es- trutura diferente. Sendo assim, um antígeno pode ter mais de um anti- corpo correspondente. Um anticorpo inclui uma molécula de imuno- globulina de comprimento total ou uma porção imunologicamente ativa de uma imunoglobulina de comprimento total, isto é, uma molécula que contém um sítio de ligação ao antígeno que liga de forma imuno- específica um antígeno de um alvo de interesse ou partes do mesmo. Os anticorpos podem ser de qualquer tipo, por exemplo IgG, IgE, IgM, IgD e IgA, qualquer classe, por exemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e
IgA2, ou subclasse da mesma. O anticorpo pode ser humano ou derivado de outras espécies.
[00335] O termo "fragmento de anticorpo" conforme usado no presente documento se refere a uma porção de um anticorpo de com- primento total, geralmente a região de ligação ao antígeno ou região variável da mesma. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; an- ticorpos de domínio único. Os anticorpos e seus fragmentos podem ser substituídos por moléculas de ligação baseadas em estruturas al- ternativas de não imunoglobulina, aptâmeros peptídicos, aptâmeros de ácido nucleico e polipeptídeos estruturados compreendendo laços polipeptídicos subtendidos em uma estrutura principal não peptídica, receptores naturais ou domínios dos mesmos.
[00336] O termo "câncer" conforme usado no presente documento significa a condição fisiológica em mamíferos que é caracterizada por crescimento celular desregulado. Um tumor compreende uma ou mais células de câncer. Exemplos de câncer incluem carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfoides. Os exemplos adicionais de câncer incluem câncer de célula escamosa (por exem- plo, câncer de célula escamosa epitelial), câncer pulmonar incluindo câncer pulmonar de células pequenas, câncer pulmonar de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocellular, câncer gástrico ou de estômago incluindo câncer gastrointestinal, tumor gastrointestinal estromal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer hepático, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, carcinoma do endométrio ou carcinoma uterino, carcinoma de glândulas salivares, câncer dos rins ou renal, câncer de próstata, câncer de tireoide e câncer hepático.
[00337] A menos que especificado de outra forma, o termo “alquila” se refere a grupos hidrocarboneto saturados, que podem ser lineares, ramificados, cíclicos ou qualquer combinação dos mesmos. O grupo alquila linear preferivelmente tem 1 a 20 átomos de carbono, mais pre- ferivelmente 1 a 6 átomos de carbono. O grupo alquila ramificado pre- ferivelmente tem 3 a 20 átomos de carbono, mais preferivelmente 4 a 8 átomos de carbono. O grupo alquila cíclico preferivelmente tem 3 a 20 átomos de carbono, mais preferivelmente 5 a 8 átomos de carbono.
[00338] O termo “grupo aromático” caracteriza uma porção que con- tém uma ou mais estruturas cíclicas tendo um sistema de elétrons π deslocalizado que segue a regra Hückel 4n+2. As referidas uma ou mais estruturas cíclicas podem ser um monociclo tal como um anel de 6 membros (por exemplo, benzeno) ou uma estrutura bicíclica tal como uma porção com dois anéis condensados de 6 membros (por exemplo, nafteno) ou uma porção em que dois anéis de 6 membros são ligados um ao outro através de uma única ligação covalente (por exemplo, bifenila). Os grupos aromáticos adicionais podem conter três ou mais ciclos condensados, tais como antraceno, fenantreno, pireno e criseno. Os grupos aromáticos também podem conter estruturas heterocíclicas, incluindo por exemplo anéis de 5 membros contendo um a quatro áto- mos de nitrogênio (os membros de anel restantes sendo carbono ou carbono e oxigênio), os anéis de 5 membros contendo um átomo de oxigênio e enxofre, anéis de 6 membros com um ou dois átomos de nitrogênio, oxigênio ou enxofre ou porções bicíclicas com dois anéis condensados, um dos quais sendo um heterociclo de 5 membros e o outro sendo um carbociclo ou heterociclo de 6 membros.
[00339] A menos que especificado de outra forma, todas as valên- cias dos átomos individuais dos compostos ou porções descritas no presente documento são saturadas. Em particular, elas são saturadas pelos parceiros de ligação indicados. Se nenhum parceiro de ligação ou um número muito pequeno de parceiros de ligação for indicado, as valências restantes do respectivo átomo são saturadas por um número correspondente de átomos de hidrogênio.
[00340] A menos que especificado de outra forma ou ditado de ou- tra forma pelo contexto, todas as conexões entre grupos de ami- noácido adjacente são formadas por ligações peptídicas (amida).
[00341] A menos que o contexto dite de outra forma e/ou significa- dos alternativos sejam explicitamente providos no presente documen- to, todos os termos pretendem ter significados geralmente aceitos na técnica, conforme refletido pelo IUPAC Gold Book (status of 1st Nov. 2017) ou o Dictionary of Chemistry, Oxford, 6th Ed.
2. Visão geral
[00342] A presente invenção está baseada na descoberta de um ligante dipeptídico C-terminal que pode agir como substrato altamente específico para a atividade da exopeptidase de catepsina B (Cat B). O ligante dipeptídico C-terminal da presente invenção pode ser usado em conjugados de ligante-fármaco (LDCs), resultando em clivagem melhorada e liberação de fármaco a partir dos LDCs.
[00343] Cat B é uma protease de cisteína lisossomal da família da papaína agindo na rotatividade das proteínas assim como em uma var- iedade de processos fisiológicos e patológicos. Os dados estruturais e funcionais extendidos estão presentemente disponíveis, tornando esta protease uma ferramenta versátil no contexto de liberação intracelular de fármaco.
[00344] A dobra da papaína é composta de dois domínios, referidos como o domínio esquerdo (L) e domínio direito (R). O domínio L con- tém três α-hélices, enquanto que o domínio R forma um tipo de β- barreira conforme descrito por Turk et al. (Biochim. Biophys. Acta 2012, 1824(1), 68-88). A interface de dois domínios abre na parte su- perior, formando a fenda da enzima do sítio ativo. No centro da fenda do sítio ativo estão os resíduos Cys25 (no N-terminal da hélice central, L-domínio) e His163 (dentro dos resíduos da β-barreira, domínio R). Esses dois resíduos catalíticos formam o par de íons de tiolato- imidazólio, essencial para a atividade proteolítica da enzima. O subs- trato se liga ao longo da fenda do sítio ativo em uma conformação es- tendida conforme descrito por Turk et al. (Biochem. Soc. Symp. 2003, 70, 15-30), fazendo contatos alternativos com domínios L e R. A maior parte das catepsinas da cisteína exibe atividade predominantemente de endopeptidase (F, L, K, S, V), enquanto Cat X e C exibem apenas atividade de exopeptidase. Em contraste, Cat B exibe ambas a ativi- dades de endopeptidase e exopeptidase (isto é, carboxidipeptidase). A análise de raios X revela que as exopeptidases/carboxidipeptidases tais como Cat B contêm características estruturais adicionais, isto é um laço adicional (“ocludente”), que modifica a fenda do sítio ativo e serve como racional para a ligação do substrato em ambas a atividade de endopeptidase e exopeptidase. Em particular, o laço ocludente pro- vê a base estrutural para a atividade dominante de exo- versus endo- Cat B, conforme mostrado por Renko et al. (FEBS Journal 2010, 277, 4338-4345).
[00345] Os sistemas ligantes cliváveis de Cat B descritos na técnica anterior (por exemplo, o sistema ligante Val-Cit-PABC) são principal- mente baseados na atividade de endopeptidase de Cat B. Por outro lado, o sistema ligante da presente invenção é especificamente designado para attender aos requisitos estruturais para agir como sub- strato específico para a atividade da exopeptidase (carboxidipeptidase) de Cat B.
[00346] Deste modo, o sistema ligante pode ser usado em LDCs como substrato altamente específico para a atividade da exopeptidase (carboxidipeptidase) de Cat B, isto é, no composto de fórmula (I) ou (I') e composto de fórmula (II) ou (II') descrito abaixo, resultando em perfis de clivagem melhorados (por exemplo, liberação de fármaco intracelu- lar rápido). Além do mais, o sistema ligante permite a liberação in- tracelular de múltiplas moléculas de fármaco, em que as moléculas individuais de fármaco podem ser as mesmas ou diferentes. Se o fár- maco é uma carga útil (isto é, um agente citotóxico), o sistema ligante permite a liberação intracelular de múltiplas cargas úteis, que podem ser múltiplas moléculas de fármacos do mesmo fármaco ou múltiplas moléculas de diferentes fármacos (por exemplo, 2 ou mais diferentes fármacos/cargas úteis). Como uma característica especial de LDCs exibindo altos valores de DAR (por exemplo, fórmula (Ia1) ou (II), o – sistema ligante pode ser ligado/conjugado a um sítio único de um grupo vetor capaz de interagir com uma célula alvo (por exemplo, um anticorpo) superando assim problemas de sobrecarga e clivagem ex- tracelular prematura. Sendo assim, o sistema ligante da presente in- venção provê uma plataforma de tecnologia altamente ajustável, que permite alcançar alto carregamento de fármacos (por exemplo, alto DAR) enquanto está estável e não tóxico na circulação sistêmica.
[00347] Além disso, verificou-se surpreendentemente que a presen- ça de uma porção estericamente exigente (T na fórmula (I)/(I') ou D na fórmula (II)/(II')) na cadeia lateral do resíduo Axx na fórmula (I)/(I') ou Bxx na fórmula (II)/(II') não tem nenhum efeito prejudicial na afinidade de ligação do composto da presente invenção a Cat B, nem na taxa de clivagem do composto pela atividade da exopeptidase de Cat B. Sem se ater a nenhuma teoria, acredita-se que a porção estericamente exi- gente T ou D é direcionada na direção de for a da ranhura de ligação de Cat B (conhecida como o “bolso hidrofóbico” de Cat B), levando as- sim à seletividade superior e a taxa de clivagem através da atividade da exopeptidase de Cat B.
3. Composto de fórmulas (I) e (I')
[00348] A presente invenção se refere a um composto (isto é um conjugado de ligante-fármaco (LDC)) representado pelas formulas ge- rais (I) ou (I'):
[00349] O composto de fórmulas (I) ou (I') contém uma unidade di- peptídica C-terminal Axx-Ayy or Ayy-Axx, que serve como substrato para o reconhecimento específico e clivagem pela atividade da exo- peptidase de Cat B.
[00350] Axx representa um aminoácido trifuncional. Axx pode ser qualquer aminoácido trifuncional natural ou não natural com a con- dição de que Axx na fórmula (I) não seja um aminoácido na configura- ção (D). Exemplos de aminoácidos trifuncionais incluem ácidos amino- dicarboxílicos e ácidos diamino-carboxílicos, tais como ácido α-amino adípico (Aaa), ácido diamino propiônico (Dap), ácido diamino butírico (Dab), e ácido amino malônico (Ama). Os aminoácidos trifuncionais adequados adicionais incluem Glu, ácido 2-amino pimélico (Apa), Lys, Orn, Ser e homo-lisina (homo-Lys).
[00351] De acordo com uma modalidade, Axx representa um ami- noácido selecionado a partir de Glu, Apa, Aaa, Dap, Dab, Lys, Orn, Ser, Ama e homolisina (homoLys). De acordo com uma modalidade preferida, Axx representa um aminoácido selecionado a partir de Dap, Dab, Lys, Orn e homoLys.
[00352] Ayy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Fenilglicina (Phg), Met, Val, His, Lys, Arg, Citrulina (Cit), ácido 2-amino butírico (Abu), Orn, Ser, Thr, Leu e Ile; ou Ayy na fórmu- la (I) representa um aminoácido selecionado a partir de homo-tirosina (homo-Tyr), homo-fenilalanina (homo-Phe), beta-fenilalanina (beta- Phe), beta-homo-fenilalanina (beta-homo-Phe), Tyr(OR1) e homo-
Tyr(OR1) em que R1 é um grupo solubilizante, preferivelmente – (CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número inteiro de 2 a 24, por exemplo um inteiro de 5 a 20, ou 8 a 16; com a condição de que Ayy na fórmula (I') não seja um aminoácido na configuração (D). Sem se ater a nenhuma teoria, acredita-se que Ayy provê o composto da presente invenção com as características estruturais para reconhecimento específico e clivagem pela atividade da exopeptidase de Cat B. Como um resultado, o com- posto pode liberar o fármaco em uma taxa significativamente maior quando se compara com um composto clivado pela atividade da endo- peptidase de Cat B (por exemplo, no sistema Val-Cit-PABC).
[00353] De acordo com uma modalidade, Ayy na fórmula (I) repre- senta um aminoácido selecionado a partir de Phe, homo-Phe, Ala, Trp, Leu, Tyr, Phg, Met, Abu, Val, Lys, Cit, Tyr(OR1) e homo-Tyr(OR1), pre- ferivelmente um aminoácido selecionado a partir de Phe, homo-Phe, Ala, Trp, Leu, Val, Tyr, homo-Tyr, Tyr(OR1) e homo-Tyr(OR1), mais preferivelmente Phe, homo-Phe, Tyr, homo-Tyr, Tyr(OR1) ou homo- Tyr(OR1), em que R1 é como especificado acima, em particular Phe ou Tyr; e Ayy na fórmula (I') representa um aminoácido selecionado a par- tir de Phe, homo-Phe, Ala, Ser, Thr, Leu, Val, Tyr, Phg, Trp, Ile e Arg, preferivelmente um aminoácido selecionado a partir de Phe, homo- Phe, Ala, Trp, Phg, Leu, Val, Tyr e Ser, mais preferivelmente Phe, home-Phe or Ser, em particular Phe ou Ser.
[00354] Em algumas modalidades da presente invenção, W repre- senta uma porção representada pela fórmula que segue (III):
[00355] Em conexão com a fórmula (III) apresentada acima, Dxx representa uma única ligação covalente ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, preferivelmente um aminoácido selecionado a partir de Phe, Val e Ala. Em algumas modalidades, Dxx pode conter um elemento adicional de forma que a ligação covalente única ou ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica seja opcionalmente liga- do à porção W1 através de uma porção divalente selecionada a partir de maleimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila, e derivados dos mesmos, preferivelmente através de um derivado de maleimida divalente.
[00356] Em conexão com a fórmula (III) apresentada acima, Dyy representa uma única ligação covalente, Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, preferivelmente um aminoácido selecionado a partir de Arg, Lys, Cit, Orn, Dap e Dab, mais preferivelmente Arg ou Cit; com a condição de que se Dxx é um aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, Dyy é Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, e se Dxx é uma ligação covalente única, Dyy é uma ligação covalente única, Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lat- eral básica.
[00357] A linha quebrada na fórmula (III) indica ligação covalente ao N-terminal de Axx na fórmula (I), ou o N-terminal de Ayy na fórmula (I').
[00358] W1 representa uma porção derivada de um fármaco. Em alguns casos, W representa uma porção derivada de um fármaco ten- do um ou mais grupos selecionados a partir dos grupos hidroxila, car- boxila, amina ou tiol, em que os referidos um ou mais grupos podem opcionalmente servir para ligação covalente à unidade dipeptídica C- terminal Axx-Ayy (fórmula (I)) ou Ayy-Axx (fórmula (I')). O(s) fármaco(s) adequado(s) para uso na presente invenção são descritos em maiores detalhes abaixo. Exemplos de fármacos tendo um ou mais grupos se- lecionados a partir dos grupos hidroxila, carboxila, amina ou tiol in- cluem auristatinas, maitansinas, camptotecinas e doxorrubicinas.
[00359] Em uma modalidade, W1 representa uma porção derivada de um fármaco que difere de um fármaco nativo (por exemplo DM1) apenas em virtude da ligação covalente a Dxx conforme mostrado na fórmula (III). Se o fármaco nativo for um análogo de auristatina, o análogo de auristatina é selecionado a partir de auristatina F (AF), au- ristatina Cit (ACit), auristatina Arg (AArg), auristatina Lys (ALys), auri- statina Orn (AOrn), auristatina Dab (ADab) e auristatina Dap (ADap). Preferivelmente, o análogo de auristatina é AF. Em um aspecto, a au- ristatina não é auristatina Asp (AAsp), auristatina Glu (AGlu), auristat- ina PhosphoThr (AphThr) ou auristatina Thr (AThr).
[00360] Em uma modalidade adicional, W1 representa uma porção derivada de um fármaco, preferivelmente uma porção derivada de um fármaco que difere de um fármaco nativo apenas em virtude da ligação covalente a Dxx; com a condição de que W1 não seja um análogo de auristatina.
[00361] De acordo com uma modalidade, W representa uma porção peptídica representada pela fórmula que segue (Ia) ou (Ia'):
[00362] A'yy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Met, Val, His, Lys, Arg, Cit, Orn e Abu; com a con- dição de que A'yy na fórmula (Ia') não seja um aminoácido na configu- ração (D). De acordo com uma modalidade, A'yy representa um ami- noácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Phg e Tyr, preferivel- mente Phe ou Tyr.
[00363] D1 representa uma porção derivada de um fármaco. Cada D2 independentemente representa um átomo de hidrogênio ou uma porção derivada de um fármaco, com a condição de que pelo menos um D2 não seja um átomo de hidrogênio. Quando D2 representa uma porção derivada de um fármaco, D1 e D2 podem ser porções derivadas do mesmo fármaco ou porções derivadas de fármacos diferentes. O(s)
fármaco(s) adequado(s) para uso na presente invenção são descritos em maiores detalhes abaixo. De acordo com uma modalidade, D1 e D2 cada independentemente representa uma porção derivada de um fár- maco tendo um ou mais grupos selecionados a partir dos grupos hi- droxila, carboxila, amina ou tiol.
[00364] m é um número inteiro de 1 a 10; e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx ou Ayy. Consequentemente, quando m ≥ 1, o composto inclui uma porção D1 e porções D2, em que múltiplas porções D2 podem ser as mesmos ou diferentes. De acordo com uma modalidade preferida, m é um número inteiro de 1 a 4.
[00365] Se m=1, A'xx representa um aminoácido trifuncional tal como um ácido amino-dicarboxílico ou um ácido diamino-carboxílico. A'xx pode ser qualquer aminoácido trifuncional natural ou não natural com a condição de que A'xx na fórmula (Ia) não seja um aminoácido na configuração (D). Exemplos de aminoácidos trifuncionais incluem Glu, Apa, Aaa, Dap, Dab, Lys, Orn, Ser, Ama e homoLys. De acordo com uma modalidade preferida, A'xx representa um aminoácido se- lecionado a partir de Dap, Dab, Lys, Orn e homoLys.
[00366] Se m for maior do que 1, então cada D2 é independente- mente selecionado a partir de um átomo de hidrogênio e porções derivadas de um fármaco, em que múltiplas porções D2 podem ser as mesmas ou diferentes. Se D2 for um átomo de hidrogênio, A'xx repre- senta um aminoácido. A'xx pode ser qualquer aminoácido natural ou não natural- por exemplo um aminoácido bifuncional ou trifuncional – que coletivamente provê as funcionalidades necessárias para ligação ao aminoácido A'yy e porção D1 ou um outro aminoácido A'xx, com a condição de que A'xx na fórmula (Ia) não seja um aminoácido na con- figuração (D). Exemplos de aminoácidos bifuncionais incluem Gly, Ala, Abu, Ciclohexilalanina (Cha), Ile, Leu, Phe, Phg, Val. Se D2 for uma porção derivada de um fármaco, A'xx representa um aminoácido tri-
funcional conforme descrito acima, preferivelmente um aminoácido se- lecionado a partir de Dap, Dab, Lys, Orn e homoLys.
[00367] O peptídeo de fórmula (I)/(Ia), (I)/(Ia'), (I')/(Ia) ou (I')/(Ia') age como um substrato específico para a atividade da exopeptidase de Cat B. Isto é, o composto de fórmula (I) ou (I') descrito no presente docu- mento pode ser clivado como o seu N-terminal por Cat B, liberando W que nem é uma porção D1 derivada de um fármaco ou uma porção di- peptídica tendo a fórmula (Ia) ou (Ia'). Quando W é uma porção dipep- tídica de fórmula (Ia) ou (Ia'), ela pode por sua vez ser clivada por Cat B, liberando assim a porção D1 e peptídeo (A'xx(D2)-A'yy)/(A'yy- A'xx(D2)). Em alguns aspectos da presente invenção, as porções D1 e peptídeos (A'xx(D2)-A'yy)/(A'yy-A'xx(D2)) exibem atividade farmacológi- ca (por exemplo, citotóxica).
[00368] Em alguns aspectos da presente invenção, o peptídeo (A'xx(D2)-A'yy)/(A'yy-A'xx(D2)) pode ser uma porção “autoimolativa”, que pode sofrer aminólise intramolecular (isto é, formação de anel de cinco ou seis membros, ou formação de dicetopiperazina (DKP)), liberando moiety D2 como um produto. When m ≥ 1, o peptídeo (A'xx(D2)-A'yy)m/(A'yy-A'xx(D2)m age como um substrato para Cat B, que pode clivar as ligações (m-1) amida entre aminoácidos A'yy- A'xx/A'yy-A'xx, liberando assim m dipeptídeos (A'xx(D2)-A'yy)/(A'yy- A'xx(D2)). Em alguns aspectos, cada dipeptídeo pode por sua vez sof- rer aminólise intramolecular (A'xx(D2)-A'yy) ou formação de DKP (A'yy- A'xx(D2)), liberando m porções D2 como produto.
[00369] Deste modo, quando W representa um peptídeo tendo a fórmula (Ia)/(Ia'), o ligante pode liberar duas ou mais moléculas dos mesmos ou fármacos diferentes (e assim permite atingir um alto DAR) e a atividade farmacológica completa pode ser aumentada. A liberação de fármacos pode ocorrer de acordo com um mecanismo de múltiplas etapas. Por exemplo, W pode ser primeiro liberado do composto de fórmula (I), e então agir como um substrato para Cat B liberando a porção D1 e, eventualmente, peptídeos m (A'xx(D2)-A'yy)/(A'yy- A'xx(D2)), que podem ser farmacologicamente ativos como tais (por exemplo, intra-cargas úteis) e/ou sofrer aminólise intramolecular, a formação de DKP ou hidrólise para liberar m porções D2.
[00370] O composto da presente invenção é tipicamente estável em um ambiente extracelular (por exemplo, no plasma) na ausência de Cat B (isto é, a enzima capaz de clivar o ligante). No entanto, mediante exposição a Cat B, o ligante é reconhecido e clivado iniciando, even- tualmente, a aminólise autoimolativa espontânea resultando na clivagem da ligação que covalentemente liga a porção autoimolativa, por exemplo A'xx-A'yy, ao fármaco, para assim alcançar a liberação do fármaco D2 na sua forma farmacologicamente ativa. A aminólise au- toimolativa pode ocorrer se A'xx representar um aminoácido tal como Glu, Aaa, Dap, Dab, Ser, Thr, homoSer, homoThr.
[00371] T na fórmula (I) ou (I') representa uma porção tendo a fór- mula que segue (Ia1):
[00372] S representa um grupo di- ou multivalente compreendendo 1 ou mais átomos selecionados a partir de carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre. S liga (une) aminoácido(s) Axx (através da ligação covalente à cadeia lateral de Axx) à porção V (descrita abaixo). S pode ser ligado a Axx e V por exemplo através de procedimentos de ligação quimiosseletivas para a formação da ligação amida ou através da “química click” (por exemplo, cicloadição de azida-alquina). Rx repre- senta um átomo ou grupo que está opcionalmente presente para satu- rar uma valência livre de S, caso presente.
[00373] Em algumas modalidades, S pode agir como uma porção para múltipla ligação a fármacos (Fig. 3). Ele pode ser um pequeno grupo orgânico com duas ou mais valências tendo, por exemplo, um peso molecular de 200 Da ou menos ou ainda apenas 100 Da ou menos, mas ela também pode ser uma porção mais complexa e/ou maior derivada de polímeros funcionais, copolímeros, dendrímeros ou construtos sintéticos incluindo múltiplos grupos reativos para a ligação ao ligante-fármaco.
[00374] Na fórmula acima (Ia1), n é um número inteiro de 1 a 10, por exemplo 1 a 5. Quando n=1, S representa um grupo di- ou trivalen- te e a linha quebrada representa a ligação covalente de S à cadeia lat- eral de Axx. Quando n>1, cada S independentemente representa um grupo di- ou trivalente, e cada linha quebrada representa a ligação co- valente a um grupo de fórmula (I) individual (à cadeia lateral de um aminoácido individual Axx), em que cada grupo de fórmula (I) pode ser o mesmo ou diferente. Quando n>1, o ligante pode liberar duas ou mais moléculas do mesmo ou de fármacos diferentes (e assim permitir atingir um alto DAR) e a atividade farmacológica completa pode ser aumentada.
[00375] Por exemplo, para n=2 e para n=3, as estruturas possíveis são como a seguir:
[00376] Certamente, se os grupos variáveis tais como W, Axx, Ayy e S estão presentes múltiplas vezes, os grupos individuais variáveis do mesmo tipo podem ser os mesmos ou podem diferir um do outro. Além do mais, a posição de ligação de V nas estruturas acima não está par- ticularmente limitada. Por exemplo, na fórmula acima para n=3, V tam- bém pode ser ligado ao grupo central S no lugar do grupo terminal S em que o grupo central S é tetravalente, conforme mostrado abaixo:
[00377] em que n1 e n2 cada independentemente é um número in- teiro de 0 a n e n1+n2+1=n; Rxa e Rxb cada independentemente rep- resenta um átomo ou grupo, que está opcionalmente presente para saturar uma valência livre de S, caso presente.
[00378] Em alguns aspectos da presente invenção, o grupo S diva- lente ou multivalente é selecionado de forma que esteja estável à hidrólise, significando que tipicamente menos do que 20% e preferiv- elmente menos do que 10% de um composto teste sofre hidrólise na solução de tampão fosfato salino (PBS) em pH 7,4 a 37°C dentro de 24 horas, conforme determinado por HPLC, em que o referido com- posto teste é um composto baseado no grupo multivalente S, em que todas as valências de S são saturadas por átomos de hidrogênio.
[00379] Idealmente, o composto de fórmula (I) ou fórmula (II) (isto é o LDC), contendo o referido grupo S di- ou multivalente, quando con- siderado como um todo, também mostra estabilidade à hidrólise, isto é, prefere-se que menos do que 20% e mais preferivelmente menos do que 10% do composto de fórmula (I) sofra hidrólise na solução de tampão fosfato salino (PBS) em pH 7,4 a 37°C dentro de 24 horas, conforme determinado por HPLC.
[00380] S pode ser um grupo divalente ou monovalente polar ou carregado de forma que a solubilidade da água do composto de fórmu- la (I) seja melhorada. S também pode compreender um aminoácido ou uma porção peptídica, preferivelmente uma porção de aminoácido ou peptídeo polar ou carregada, o peptídeo compreendendo de 2 a 10 aminoácidos, que podem ser aminoácidos naturais ou não naturais.
[00381] S também pode ser baseado em uma combinação de dois ou mais dos grupos mencionados acima sendo ligados juntos através de ligações covalentes.
[00382] Os grupos S preferidos são (-O-CH2CH2-)n com n sendo selecionado a partir de 1 a 10, Dab ou combinações desses dois grupos.
[00383] De acordo com uma modalidade adicional, W nas fórmulas (I) e (I') representa uma porção peptídica tendo a fórmula que segue (Ib):
[00384] A'yy, D1 e m na fórmula (Ib) são conforme definidos na fór- mula (Ia), e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx ou Ayy.
[00385] se m=1, A'xx representa um aminoácido selecionado a par- tir de Glu, Aaa, Dap, Dab, Ser, Thr, homoserina (homoSer), homotre- onina (homoThr) e Ama, com a condição de que A'xx não seja um aminoácido na configuração (D). D2 representa uma porção derivada de um fármaco, opcionalmente o mesmo fármaco que D1. Cxx repre- senta uma única ligação covalente a menos que A'xx seja Ama. Quan- do A'xx represents Ama, um aminoácido adicional Cxx está presente. Cxx se liga à cadeia lateral de A'xx, isto é uma das duas extremidades carboxila de Ama, e ela também se liga à porção do fármaco D2. Cxx representa (L)- ou (D)-Pro ou um N-metil aminoácido tal como sarcosi- na (Sar). Preferivelmente, Cxx representa um aminoácido selecionado a partir de (L)- ou (D)-Pro, Sar, N-metil Val e N-metil Leu, mais pre- ferivelmente Sar.
[00386] Se m for maior do que 1, então cada D2 é independente- mente selecionado a partir de um átomo de hidrogênio e porções derivadas de um fármaco, em que múltiplas porções D2 podem ser as mesmas ou diferentes. Se D2 for um átomo de hidrogênio, A'xx repre- senta um aminoácido e Cxx representa uma única ligação covalente (mesmo se A'xx for Ama). A'xx pode ser qualquer aminoácido natural ou não natural - por exemplo, um aminoácido bifuncional ou trifuncion- al - que coletivamente provê as funcionalidades necessárias para a ligação ao aminoácido A'yy e a porção D1 ou um outro aminoácido A'xx, com a condição de que A'xx não seja um aminoácido na configu- ração (D). Se D2 é uma porção derivada de um fármaco, A'xx repre- senta um aminoácido selecionado a partir de Glu, Aaa, Dap, Dab, Ser, Thr, homoserina (homoSer), homotreonina (homoThr) e Ama, e Cxx representa uma única ligação covalente a menos que A'xx seja Ama. Quando A'xx é Ama, Cxx representa um aminoácido selecionado a partir de (L)- ou (D)-Pro, Sar, N-metil Val e N-metil Leu, mais preferiv- elmente Sar.
[00387] Está bem estabelecido que peptídeos e proteínas que pos- suem um resíduo Pro na penultima posição N-terminal sofrem aminólise não enzimática, resultando na formação de DKP. O me- canismo da formação de DKP envolve ataque nucleofílico do ni- trogênio N-terminal na carbonila do segundo aminoácido. Esta aminólise intramolecular prossegue prontamente e tem um papel im- portante na via biossintética de dipeptídeos cíclicos biologicamente ativos tais como c(His-Pro), que são encontrados ao longo do sistema nervoso central, tecidos periféricos e fluidos corporais. No dipeptídeo (Ama(Cxx-D2)-A'yy), o mecanismo da formação de DKP envolve o ataque nucleofílico do nitrogênio N-terminal na cadeia lateral de A'xx, liberando assim a porção D2.
[00388] O peptídeo de fórmula (I)/(Ib) ou (I')/(Ib) age como um sub- strato para a atividade da exopeptidase de Cat B, liberando uma por- ção dipeptídica tendo a fórmula (Ib), que por sua vez pode ser clivada por Cat B para liberar a porção D1 e peptídeo (A'xx(Cxx-D2)-A'yy). O peptídeo (A'xx(Cxx-D2)-A'yy) é uma porção “autoimolativa”, que pode sofrer aminólise intramolecular (isto é, formação de anel com cinco ou seis membros, ou formação de dicetopiperazina (DKP)), liberando a porção D2 como um produto. Quando m ≥ 1, o peptídeo (A'xx(Cxx- D2)-A'yy)m age como um substrato para Cat B, que pode clivar as ligações (m-1) amida entre os aminoácidos A'yy e A'xx, liberando as- sim m peptídeos (A'xx(Cxx-D2)-A'yy). Cada peptídeo (A'xx(Cxx-D2)- A'yy) pode, por sua vez, sofrer aminólise intramolecular, liberando m porções D2 como produto.
[00389] Consequentemente, quando W representa um peptídeo tendo a fórmula (Ib), a liberação de fármaco ocorre de acordo com um mecanismo de múltiplas etapas, por exemplo W pode ser primeiro lib- erado do composto de fórmula (I) e depois agir como um substrato pa- ra Cat B liberando a porção D1 e m peptídeos (A'xx(Cxx-D2)-A'yy), que finalmente sofrem aminólise intramolecular para liberar m porções D2. No peptídeo (Ama(Cxx-D2)-A'yy), o mecanismo da formação de DKP (aminólise intramolecular) envolve ataque nucleofílico do nitrogênio N- terminal de Ama no éster carbonila de Cxx, liberando assim a porção D2.
[00390] Na presente invenção, verificou-se surpreendentemente que a presença de uma porção estericamente exigente (porção T na fórmula (I)/(I')) na cadeia lateral do resíduo Axx na fórmula (I)/(I')) não tem efeito prejudicial na afinidade de ligação do composto da presente invenção ao Cat B, nem na taxa de clivagem do composto pelo me- canismo da exopeptidase de Cat B. Sem se ater a nenhuma teoria, acredita-se que a porção estericamente exigente T está direcionada na direção de fora da ranhura de ligação Cat B (bolso hidrofóbico), levan- do assim à taxa de clivagem superior através do mecanismo da exo- peptidase.
[00391] V representa uma porção derivada de um grupo vetor ca-
paz de interagir com uma célula alvo. V está descrito em maiores de- talhes abaixo. Em algumas modalidades, a porção V é covalentemente ligada a um grupo S contido na porção T descrita acima. Em outras palavras, o sistema ligante da presente invenção é ligado ao grupo ve- tor através de um único ponto de ligação. A ligação de mais de um sistema ligante em múltiplos sítios de um grupo vetor não pretende estar abrangida por esta modalidade. Como um resultado, o sistema ligante pode alcançar alto carregamento de fármaco (alto DAR) e, ao mesmo tempo, pode superar os problemas de sobrecarga do grupo vetor e da clivagem extracelular prematura do conjugado (por exem- plo, morte celular não específica).
[00392] Em alguns aspectos, o sistema ligante provê uma plata- forma de tecnologia nova e altamente ajustável que permite pelo menos um dos itens a seguir: (1) liberação de uma molécula de um fármaco (carga útil) em uma célula alvo, (2) liberação de múltiplas moléculas (por exemplo, 2 a 20 ou 4 a 10) do mesmo fármaco em uma célula alvo (alto DAR), (3) liberação de múltiplas moléculas (por exem- plo, 2 a 20 ou 4 a 10) de diferentes fármacos (carga útil dupla ou carga útil múltipla) em uma célula alvo (alto DAR). Como uma característica particularmente importante, devido a um efeito de solubilização mod- ulável exercido pela porção S, altos valores de DAR podem ser alcan- çados na manutenção com propriedades PK favoráveis dos LDCs.
[00393] De acordo com uma modalidade, T representa uma porção tendo uma das fórmulas que seguem (Ia2) e (Ia3):
[00394] Sa e Sb cada independentemente representa uma única ligação covalente ou um grupo divalente tendo 1 ou mais átomos se- lecionados a partir de carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre.
[00395] S1, S2 e S3 cada independentemente representa um grupo divalente tendo 1 ou mais átomos selecionados a partir de carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre. n representa um inteiro de 1 a 10.
[00396] Na fórmula (Ia2), Azz1 representa um aminoácido trifun- cional; S1 une o N-terminal de aminoácido Azz1 à porção V, S2 une o C-terminal de aminoácido Azz1 ao grupo OH (n=1), e/ou une o C- terminal de aminoácido Azz1 ao N-terminal de um outro aminoácido Azz1 (n>1), e Sa une a cadeia lateral de Azz1 a um grupo de fórmula (I) ou (I') individual; em que se n>1, cada grupo individual de fórmula (Azz1(-Sa---)-S2) pode ser o mesmo ou diferente, e cada linha quebra- da representa uma ligação covalente a um grupo de fórmula (I) ou (I') individual, em que cada grupo de fórmula (I)/(I') pode ser o mesmo ou diferente. Em alguns aspectos da presente invenção, Azz1 é um ami- noácido trifuncional tendo um grupo funcional permitindo que a ligação química do grupo de fórmula (Ia2) a um grupo de fórmula (I) ou (I') in- dividual, por exemplo um grupo azida ou um grupo alquina.
[00397] Na fórmula (Ia3), Azz2 e Azz4 cada independentemente representa um aminoácido; Azz3 representa um aminoácido trifun- cional tal como Lys, em que a porção V é ligada à cadeia lateral de Azz3; S3 une o C-terminal de aminoácido Azz2 ao N-terminal de ami- noácido Azz3 (n=1), e/ou une o C-terminal de aminoácido Azz2 ao N- terminal de um outro aminoácido Azz2 (n>1); Sb une o N-terminal ou cadeia lateral de aminoácido Azz2 a um grupo de fórmula (I) ou (I') in-
dividual. Em alguns aspectos, Azz2 é um aminoácido tendo um grupo functional permitindo a ligação química do grupo de fórmula (Ia3) a um grupo de fórmula (I) ou (I') individual, por exemplo um grupo azida ou um grupo alquina.
[00398] Se n>1, cada grupo individual de fórmula Azz1(Sa)-S2 na fórmula (Ia2) e de fórmula Azz2(Sb)-S3 na fórmula (Ia3) pode ser o mesmo ou diferente, e cada linha quebrada se liga a um grupo de fór- mula (I) ou (I') individual conforme especificado no presente documen- to, em que cada grupo de fórmula (I)/(I') pode ser o mesmo ou diferente.
[00399] Nas fórmulas (Ia2) e (Ia3), Z' representa um grupo covalen- temente ligado a S2 (fórmula (Ia2)) ou ao C-terminal de Azz4 (fórmula (Ia3)) selecionado a partir de –OH e -N(H)(R'), em que R' representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila, um grupo cicloalquila ou um grupo aromático.
[00400] De acordo com uma modalidade, S, Sa, Sb, S1, S2 e S3 cada independentemente representa um grupo alquileno divalente, um grupo alquenileno divalente, um grupo alquinileno divalente ou um grupo óxido de polialquileno divalente. Esses grupos divalentes pre- ferivelmente têm um comprimento de cadeia de estrutura principal de 1 a 100 átomos, mais preferivelmente 2 a 50 átomos, mais preferivel- mente 3 a 25.
[00401] De acordo com uma modalidade, S, Sa, Sb, S1, S2 e S3 cada independentemente representa um grupo divalente tendo a fór- mula –(CH2)q-Azz5-, ou um grupo divalente tendo a fórmula -(OCH2CH2)q-Azz5-; em que q é um número inteiro de 1 a 50, preferiv- elmente um inteiro de 2 a 10; e Azz5 está tanto ausente ou representa um grupo solubilizante tal como um grupo divalente contendo como um substituinte um grupo amônio, um grupo sulfato ou um aminoácido. Azz5 pode por exemplo ser um aminoácido com uma cadeia lateral polar, por exemplo Arg.
[00402] De acordo com uma modalidade, S, Sa, Sb, S1, S2 e S3 cada independentemente representa um grupo divalente tendo a fór- mula -(CH2)q-Azz5-Y-, ou um grupo divalente tendo a fórmula -(OCH2CH2)q-Azz5-Y-; em que Y representa uma porção divalente co- valentemente ligada ao C-terminal ou a cadeia lateral de Azz5 e à por- ção V; se Azz5 estiver ausente, Y representa uma porção divalente covalentemente ligada ao grupo alquileno ou óxido de polietileno e à porção V; Y sendo uma porção divalente selecionado a partir de ma- leimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila, e derivados dos mesmos, preferivelmente uma maleimida divalente ou derivado de triazol; Azz5 e q são conforme especificados acima.
[00403] Por exemplo, quando Y representa uma porção maleimida divalente (derivado), Y pode ser obtido ao se reagir um grupo malei- mido com um grupo nucleofílico tal como um grupo hidroxila, amino ou tiol. O grupo maleimido a ser reagido com um grupo nucleofílico pode ser introduzido por exemplo no C-terminal ou em uma cadeia lateral de Azz5 (e o grupo nucleofílico pode ser assim introduzido na porção V ou já está presente na porção V). Consequentemente, S, Sa, Sb, S1, S2 e S3 cada independentemente pode ser obtido a partir de uma por- ção tendo a fórmula -(CH2)q-Azz5-Y' ou uma porção tendo a fórmula -(OCH2CH2)q-Azz5-Y', em que Y' representa um grupo maleimido, em que q representa um inteiro selecionado a partir da faixa de 1 a 50.
[00404] Quando Y representa uma porção triazol divalente, Y pode ser obtido ao se reagir um grupo azida com um grupo alquina (isto é, “química click”), o grupo azida ou grupo alquina sendo introduzido por exemplo no C-terminal ou em uma cadeia lateral de Azz5. Conse- quentemente. S, Sa, Sb, S1, S2 e S3 cada independentemente pode ser obtido a partir de uma porção tendo a fórmula -(CH2)q-Azz5-Y' ou uma porção tendo a fórmula -(OCH2CH2)q-Azz5-Y', em que Y' repre-
senta um grupo alquina, ou um grupo azida.
[00405] Quando Y representa uma porção hidrazona divalente, Y pode ser obtido ao se reagir um grupo hidrazina com um grupo aldeído, o grupo hidrazina ou o grupo aldeído sendo introduzido por exemplo no C-terminal ou em uma cadeia lateral de Azz5. Além disso, quando Y representa um grupo contendo carbonila divalente, Y pode ser obtido ao se reagir um grupo ácido carboxílico ou derivado do mesmo, por exemplo um grupo cloreto de acila, com um grupo nucle- ofílico tal como um grupo hidroxila ou um grupo amino.
[00406] V nas fórmulas (Ia1), (Ia2) e (Ia3) representa uma porção derivada de um grupo vetor capaz de interagir com uma célula alvo. V é descrito em maiores detalhes abaixo.
[00407] Z representa um grupo covalentemente ligado ao C- terminal de Ayy selecionado a partir de -OH; -N(H)(R), em que R rep- resenta um átomo de hidrogênio, um grupo alquila, um grupo cicloal- quila, ou um grupo aromático; e um agente marcador tal como um derivado de cumarina.
[00408] De acordo com uma modalidade, o composto de fórmula (I) é selecionado a partir dos compostos que seguem, em que Z é pre- ferivelmente –OH: W-Glu(T)-Phe-Z, W-Glu(T)-Ala-Z, W-Glu(T)-Trp-Z, W-Glu(T)-Tyr-Z, W-Apa(T)-Phe-Z, W-Apa(T)-Ala-Z, W-Apa(T)-Trp-Z, W-Apa(T)-Tyr-Z, W-Aaa(T)-Phe-Z, W-Aaa(T)-Ala-Z, W-Aaa(T)-Trp-Z, W-Aaa(T)-Tyr-Z, W-Dap(T)-Phe-Z, W-Dap(T)-Ala-Z, W-Dap(T)-Trp-Z, W- Dap(T)-Tyr-Z, W-Dab(T)-Phe-Z, W-Dab(T)-Ala-Z, W-Dab(T)-Trp-Z, W-Dab(T)-Tyr-Z, W-Lys(T)-Phe-Z, W-Lys(T)-homoPhe-Z, W-Lys(T)- Ala-Z, W-Lys(T)-Trp-Z, W-Lys(T)-Tyr-Z, W-Lys(T)-homoTyr-Z, W- Lys(T)-homoTyr(OR1)-Z em que R1 –(CH2CH2O)n1-H e n1 é um número inteiro de 2 a 24, W-Orn(T)-Phe-Z, W-Orn(T)-Ala-Z, W-Orn(T)- Trp-Z, W-Orn(T)-Tyr-Z, W-Ser(T)-Phe-Z, W-Ser(T)-Ala-Z, W-Ser(T)- Trp-Z, W-Ser(T)-Tyr-Z, W-homoLys(T)-Phe-Z, W-homoLys(T)-Ala-Z,
W-homoLys(T)-Trp-Z, W-homoLys(T)-Tyr-Z.
[00409] De acordo com uma modalidade, o composto de fórmula (I) (em que W é uma porção de fórmula (III)) é selecionado a partir dos compostos que seguem, em que Z é preferivelmente –OH: W1-Arg- Lys(T)-Phe-Z, W1-Arg-Lys(T)-homoPhe-Z, W1-Cit-Lys(T)-Phe-Z, W1- Cit-Lys(T)-Tyr-Z, W1-Cit-Lys(T)-homoTyr-Z, W1-Lys(T)-Phe-Z, W1- Lys(T)-Tyr-Z, W1-Lys(T)-homoTyr-Z, W1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-Phe-Z, W1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-Tyr-Z, W1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-homoTyr-Z, W1- Mal-Phe-Lys-Lys(T)-Phe-Z, W1-Mal-homoPhe-Arg-Lys(T)-Phe-Z, W1- Mal-homoPhe-Cit-Lys(T)-Tyr-Z, W1-Mal-homoPhe-Cit-Lys(T)- Tyr(OR1)-Z com R1 –(CH2CH2O)n1-H e n1 é um número inteiro de 2 a 24 por exemplo 12, W1-Mal-Cit-Lys(T)-Tyr-Z, W1-Mal-Cit-Lys(T)- homoTyr-Z, W1-Mal-Arg-Lys(T)-homoTyr-Z; preferivelmente W1-Arg- Lys(T)-Phe-Z, W1-Cit-Lys(T)-Tyr-Z, W1-Lys(T)-Phe-Z, W1-Lys(T)-Tyr- Z, W1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-Phe-Z, W1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-Tyr-Z, W1- Mal-Cit-Lys(T)-Tyr-Z or W1-Arg-Lys(T)-Phe-Z; mais preferivelmente W1-Lys(T)-Tyr-Z, W1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-Phe-Z or W1-Mal-Cit-Lys(T)- Tyr-Z.
[00410] De acordo com uma modalidade preferida, o composto de fórmula (I) (em que W é uma porção de fórmula (III)) é selecionado a partir dos compostos que seguem, em que Z é preferivelmente –OH: APhe-Arg-Lys(T)-Phe-Z, APhe-Arg-Lys(T)-homoPhe-Z, APhe-Cit- Lys(T)-Phe-Z, APhe-Cit-Lys(T)-Tyr-Z, APhe-Cit-Lys(T)-homoTyr-Z, ACit-Lys(T)-Phe-Z, ACit-Lys(T)-Tyr-Z, ACit-Lys(T)-homoTyr-Z, DM1- Mal-Phe-Cit-Lys(T)-Phe-Z, DM1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-Tyr-Z, DM1-Mal- Phe-Cit-Lys(T)-homoTyr-Z, DM1-Mal-Phe-Lys-Lys(T)-Phe-Z, DM1-Mal- homoPhe-Arg-Lys(T)-Phe-Z, DM1-Mal-homoPhe-Cit-Lys(T)-Tyr-Z, DM1-Mal-homoPhe-Cit-Lys(T)-Tyr(OR1)-Z com R1 –(CH2CH2O)n1-H e n1 é um número inteiro de 2 a 24 por exemplo 12, DM1-Mal-Cit-Lys(T)- Tyr-Z; DM1-Mal-Cit-Lys(T)-homoTyr-Z; DM1-Mal-Arg-Lys(T)-homoTyr-
Z; preferivelmente APhe-Arg-Lys(T)-Phe-Z, APhe-Cit-Lys(T)-Tyr-Z, DM1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-Phe-Z, DM1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-Tyr-Z, DM1- Mal-Cit-Lys(T)-Tyr-Z ou APhe-Arg-Lys(T)-Phe-Z; mais preferivelmente DM1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-Phe-Z or DM1-Mal-Cit-Lys(T)-Tyr-Z.
[00411] Em uma modalidade, o composto de fórmula (I) contém uma porção W representada pela fórmula (III), na qual W1 representa uma porção derivada de um fármaco que não é um análogo de auri- statina (por exemplo AF). Este composto é preferivelmente seleciona- do a partir dos compostos que seguem, em que Z é preferivelmente – OH: DM1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-Phe-Z, DM1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-Tyr-Z, DM1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-homoTyr-Z, DM1-Mal-Phe-Lys-Lys(T)-Phe-Z, DM1-Mal-homoPhe-Arg-Lys(T)-Phe-Z, DM1-Mal-homoPhe-Cit-Lys(T)- Tyr-Z, DM1-Mal-homoPhe-Cit-Lys(T)-Tyr(OR1)-Z com R1 – (CH2CH2O)n1-H e n1 é um número inteiro de 2 a 24 por exemplo 12; DM1-Mal-Cit-Lys(T)-Tyr-Z; DM1-Mal-Cit-Lys(T)-homoTyr-Z and DM1- Mal-Arg-Lys(T)-homoTyr-Z; mais preferivelmente DM1-Mal-Phe-Cit- Lys(T)-Phe-Z, DM1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-Tyr-Z ou DM1-Mal-Cit-Lys(T)- Tyr-Z.
[00412] De acordo com uma modalidade, o composto de fórmula (I) (em que W é uma porção de fórmula (III)) é selecionado a partir dos compostos que seguem, em que Z é preferivelmente –OH: W1-Cit- (Lys(D2)-Phe)m-Lys(T)-Phe-Z, W1-Cit-(Lys(D2)-Phe)m-Lys(T)-homoTyr- Z, W1-Cit-(Lys(D2)-Phe)m-Lys(T)-Tyr(OR1)-Z com R1 –(CH2CH2O)n1-H e n1 é um número inteiro de 2 a 24 por exemplo 12, W1-(Lys(D2)- Phe)m-Lys(T)-Phe-Z, W1-Phe-(Phe-Lys(D2))m-Lys(T)-Tyr-Z, W1-(Phe- Lys(D2))m-Lys(T)-Tyr-Z, W1-Phe-(Phe-Lys(D2))m-Lys(T)-homoTyr-Z, W1-Arg-(Phe-Lys(D2))m-Lys(T)- Tyr(OR1)-Z; preferivelmente a partir de AF-Cit-(Lys(Mal-DM1)-Phe)m-Lys(T)-Phe-Z, AF-Cit-(Lys(Mal-DM1)- Phe)m-Lys(T)-homoTyr-Z, AF-Cit-(Lys(Mal-DM1)-Phe)m-Lys(T)- Tyr(OR1)-Z com R1 –(CH2CH2O)n1-H e n1 é um número inteiro de 2 a
24 por exemplo 12, AF-Phe-(Phe-Lys(Mal-DM1))m-Lys(T)-Tyr-Z, AF- Arg-(Phe-Lys(Mal-DM1))m-Lys(T)- Tyr(OR1)-Z; em que m é preferivel- mente um inteiro de 1 a 8, por exemplo 1 a 4.
[00413] De acordo com uma modalidade, o composto de fórmula (I') é selecionado a partir dos compostos que seguem, em que Z é pre- ferivelmente –OH: W-Phe-Glu(T)-Z, W-Ala-Glu(T)-Z, W-Trp-Glu(T)-Z, W-Tyr-Glu(T)-Z, W-Phe-Apa(T)-Z, W-Ala-Apa(T)-Z, W-Trp-Apa(T)-Z, W-Tyr-Apa(T)-Z, W-Phe-Aaa(T)-Z, W-Ala-Aaa(T)-Z, W-Trp-Aaa(T)-Z, W-Tyr-Aaa(T)-Z, W-Phe-Dap(T)-Z, W-Ala-Dap(T)-Z, W-Trp-Dap(T)-Z, W-Tyr-Dap(T)-Z, W-Phe-Dab(T)-Z, W-Ala-Dab(T)-Z, W-Trp-Dab(T)-Z, W-Tyr-Dab(T)-Z, W-Phe-Lys(T)-Z, W-Ala-Lys(T)-Z, W-Trp-Lys(T)-Z, W- Tyr-Lys(T)-Z, W-Phe-Orn(T)-Z, W-Ala-Orn(T)-Z, W-Trp-Orn(T)-Z, W- Tyr-Orn(T)-Z, W-Phe-Ser(T)-Z, W-Ala-Ser(T)-Z, W-Trp-Ser(T)-Z, W- Tyr-Ser(T)-Z, W-Phe-Ama(T)-Z, W-Ala-Ama(T)-Z, W-Trp-Ama(T)-Z, W- Tyr-Ama(T)-Z, W-Phe-homoLys(T)-Z, W-Ala-homoLys(T)-Z, W-Trp- homoLys(T)-Z, W-Tyr-homoLys(T)-Z.
[00414] De acordo com uma modalidade, o composto de fórmula (I') (em que W é uma porção de fórmula (III)) é selecionado a partir de W1-Arg-Phe-Lys(T)-Z, W1-Arg-Ser-Lys(T)-Z, W1-Cit-Phe-Lys(T)-Z, W1-Cit-Ser-Lys(T)-Z, W1-Cit-homoPhe-Lys(T)-Z, W1-Phe-Lys(T)-Z, W1-Ser-Lys(T)-Z, W1-Mal-Phe-Cit-Phe-Lys(T)-Z, W1-Mal-homoPhe- Cit-Phe-Lys(T)-Z, W1-Mal-Phe-Arg-Phe-Lys(T)-Z, W1-Mal-Cit-Phe- Lys(T)-Z, W1-Mal-Phe-Ser-Lys(T)-Z, W1-Mal-Ala-Phe-Lys(T)-Z, W1- Mal-Cit-Ser-Lys(T)-Z, W1-Mal-Arg-homoPhe-Lys(T)-Z; preferivelmente W1-Arg-Phe-Lys(T)-Z, W1-Cit-Phe-Lys(T)-Z, W1-Phe-Lys(T)-Z, W1- Mal-Phe-Cit-Phe-Lys(T)-Z, W1-Mal-Phe-Arg-Phe-Lys(T)-Z, W1-Mal-Cit- Phe-Lys(T)-Z, W1-Mal-Phe-Ser-Lys(T)-Z, W1-Mal-Ala-Phe-Lys(T)-Z; mais preferivelmente W1-Cit-Phe-Lys(T)-Z, W1-Phe-Lys(T)-Z, W1-Mal- Phe-Cit-Phe-Lys(T)-Z ou W1-Mal-Phe-Ser-Lys(T)-Z.
[00415] De acordo com uma modalidade preferida, o composto de fórmula (I') (em que W é uma porção de fórmula (III)) é selecionado a partir dos compostos que seguem, em que Z é preferivelmente –OH: APhe-Arg-Phe-Lys(T)-Z, APhe-Arg-Ser-Lys(T)-Z, APhe-Cit-Phe-Lys(T)- Z, APhe-Cit-Ser-Lys(T)-Z APhe-Cit-homoPhe-Lys(T)-Z, ACit-Phe- Lys(T)-Z, ACit-Ser-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Phe-Cit-Phe-Lys(T)-Z, DM1- Mal-homoPhe-Cit-Phe-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Phe-Arg-Phe-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Cit-Phe-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Phe-Ser-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Ala- Phe-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Cit-Ser-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Arg-homoPhe- Lys(T)-Z; mais preferivelmente APhe-Arg-Phe-Lys(T)-Z, APhe-Cit-Phe- Lys(T)-Z, DM1-Mal-Phe-Cit-Phe-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Phe-Arg-Phe- Lys(T)-Z, DM1-Mal-Cit-Phe-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Phe-Ser-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Ala-Phe-Lys(T)-Z; ainda mais preferivelmente APhe-Cit-Phe- Lys(T)-Z, DM1-Mal-Phe-Cit-Phe-Lys(T)-Z or DM1-Mal-Phe-Ser-Lys(T)- Z.
[00416] Em uma modalidade, o composto de fórmula (I') contém uma porção W representada pela fórmula (III), na qual W1 representa uma porção derivada de um fármaco que não é um análogo de auri- statina (por exemplo AF). Este composto é preferivelmente seleciona- do a partir dos compostos que seguem, em que Z é preferivelmente – OH: DM1-Mal-Phe-Cit-Phe-Lys(T)-Z, DM1-Mal-homoPhe-Cit-Phe- Lys(T)-Z, DM1-Mal-Phe-Arg-Phe-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Cit-Phe-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Phe-Ser-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Ala-Phe-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Cit- Ser-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Arg-homoPhe-Lys(T)-Z; mais preferivelmente DM1-Mal-Phe-Cit-Phe-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Phe-Arg-Phe-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Cit-Phe-Lys(T)-Z, DM1-Mal-Phe-Ser-Lys(T)-Z ou DM1-Mal- Ala-Phe-Lys(T)-Z; ainda mais preferivelmente DM1-Mal-Phe-Cit-Phe- Lys(T)-Z or DM1-Mal-Phe-Ser-Lys(T)-Z.
[00417] O composto de fórmula (I) ou (I') pode ser selecionado a partir de:
[00418] Nos compostos acima, os grupos variáveis W, W1, V, D1 e D2 têm os mesmos significados conforme descritos acima e abaixo. Preferivelmente, nos compostos de fórmulas (I) e (I') exemplificadas acima, W1, D1 e D2 cada independentemente representa uma porção derivada de um fármaco, e especialmente uma porção derivada a par- tir de auristatina F (AF), auristatina X (AX; “AX” se refere a análogos de auristatina em que X representa o aminoácido C-terminal da cadeia peptídica de auristatina), Camptotecina (CPT). Além do mais, nos compostos mostrados acima, se um grupo de óxido de etileno (isto é, um grupo de fórmula (OCH2CH2)) liga o N-terminal de um aminoácido, um grupo carboxila adicional (CO) pode estar presente (não mostrado nos compostos acima) de forma que uma ligação amida esteja presente entre o grupo de óxido de etileno e o N-terminal do ami- noácido.
[00419] Em uma modalidade da presente invenção, o composto de fórmula (I) ou fórmula (I') é selecionado a partir de:
[00420] em que nos compostos acima DMR e DM1 representam fármacos de maitansinoide (por exemplo, mertansina) e mAb repre-
senta um vetor de anticorpo monoclonal capaz de interagir com uma célula alvo (descrita abaixo).
4. Composto de fórmula (II) e (II')
[00421] A presente invenção também se refere a um composto (isto é, um LDC) representado pela fórmula geral (II) ou (II'):
[00422] O composto de fórmula (II) ou (II') contém uma unidade di- peptídica C-terminal Bxx-Byy ou Byy-Bxx, que serve como substrato para reconhecimento e clivagem por Cat B (através da atividade da exopeptidase de Cat B).
[00423] O termo “C-terminal” conforme usado no presente docu- mento se refere à extremidade C-terminal (C-terminal) da cadeia de aminoácido, por exemplo aminoácido Byy no dipeptídeo Bxx-Byy, e significa que nenhum fármaco ou grupo vetor esteja ligado ao C- terminal de Byy. Ainda, se o>1 e/ou p>1, o C-terminal de Byy pode se ligar ao N-terminal de uma outra unidade dipeptídica Bxx-Byy ou uni- dade dipeptídica Bxx1-Bxx2 conforme descrito em maiores detalhes abaixo.
[00424] D representa uma porção derivada de um fármaco. Se p>1 e/ou o>1, é possível que até (o*p)-1 grupos D estejam ausentes, isto é que os respectivos grupos D representem um átomo de hidrogênio ou um grupo solubilizante tal como –(CH2CH2O)n1-H em que n1 é um número inteiro de 2 a 24. De acordo com uma modalidade, D repre- senta uma porção derivada de um fármaco tendo um ou mais grupos selecionado a partir de grupos hidroxila, carboxila, amino ou tiol. O(s)
fármaco(s) adequado(s) para uso na presente invenção são descritos em maiores detalhes abaixo. Exemplos de grupos adequados incluem auristatinas, maitansinas, camptotecinas e doxorrubicinas.
[00425] Bxx representa um aminoácido trifuncional tal como um ácido amino-dicarboxílico ou um ácido diamino-carboxílico. Bxx pode ser qualquer aminoácido natural ou não natural que provê as três fun- cionalidades necessárias para ligação aos grupos adjacentes tais co- mo aminoácidos Bxx2 e/ou Byy e porção D na fórmula (II); com a con- dição de que Bxx na fórmula (II) não seja um aminoácido na configura- ção (D). Exemplos de aminoácidos trifuncionais incluem ácidos amino- dicarboxílicos e ácidos diamino-carboxílicos, tal como Aaa, Dap, Dab e Ama. Os aminoácidos trifuncionais adicionais adequados incluem Glu, Apa, Lys, Orn, Ser e homoLys. Naqueles casos onde Bxx carrega um hidrogênio como grupo D, Bxx também pode ser qualquer outro ami- noácido, com a condição de que Bxx na fórmula (II) não seja um ami- noácido na configuração (D).
[00426] De acordo com uma modalidade, Bxx representa um ami- noácido selecionado a partir deGlu, Apa, Aaa, Dap, Dab, Lys, Orn, Ser Thr, Ama, homoSer, homoThr e homoLys. De acordo com uma modal- idade preferida, Bxx representa um aminoácido selecionado a partir de Dap, Dab, Lys, Orn e homoLys, preferivelmente Lys ou Dab, mais pre- ferivelmente Lys.
[00427] Byy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Val, His, Lys, Abu, Met, Cit, Orn, Ser, Thr, Leu, Ile, Arg e Tyr(OR1) em que R1 é –(CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um áto- mo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número inteiro de 2 a 24; ou Byy na fórmula (II) representa um aminoácido selecionado a partir de homo-Tyr, homo-Phe, beta-Phe e beta-homo-Phe; com a condição de que Byy na fórmula (II') não seja um aminoácido na con- figuração (D) e com a condição de que se o*p>1, apenas o Byy C-
terminal na fórmula (II) pode representar um aminoácido selecionado a partir de homo-Phe, beta-Phe e beta-homo-Phe. Preferivelmente, Byy nas fórmulas (II) e (II') representa Cit, Phe, Phg, Ser, Trp, Tyr ou Tyr(OR1) em que R1 é –(CH2CH2O)n1- R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número inteiro de 2 a 24, mais preferivelmente Phe, Tyr ou Tyr(OR1); se o*p>1, Byy representa preferivelmente Tyr ou Tyr(OR1). Sem se ater à teoria, acredita-se que Byy provê o composto de fórmula (II) ou (II') com as necessidades es- truturais para reconhecimento e clivagem por Cat B.
[00428] Bxx1 é tanto ausente (representa uma única ligação cova- lente), ou representa um aminoácido (isto é, um aminoácido natural ou não natural) tendo uma cadeia lateral hidrofóbica ou básica; com a condição de que se p for maior do que 1, Bxx1 não seja um ami- noácido na configuração (D). Exemplos de aminoácidos naturais tendo uma cadeia lateral hidrofóbica ou básica incluem Phe, Tyr, Val, Ala, Ile, Leu, Ser, His, Met. Exemplos de aminoácidos não naturais tendo uma cadeia lateral hidrofóbica incluem fenilglicina (Phg), ciclohexil Ala (Cha), ácido 2-amino isobutírico (Aib), butil Gly (Tle), norleucina (Nle), norvalina (Nva).
[00429] De acordo com uma modalidade, Bxx1 representa um ami- noácido selecionado a partir de Phe, homo-Phe, Phg, Val, Ser, Leu, Tyr, Ala, Ile; preferivelmente um aminoácido selecionado a partir de Phe, homo-Phe, Tyr e Val, mais preferivelmente Phe, homo-Phe ou Tyr.
[00430] Bxx2 representa um aminoácido (isto é, um aminoácido natural ou não natural) tendo uma cadeia lateral hidrofóbica ou básica. De acordo com uma modalidade, Bxx2 representa um aminoácido se- lecionado a partir de Arg, Lys, Cit, Val, Leu, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Phg e Phe. De acordo com uma modalidade preferida, Bxx2 represen- ta um aminoácido selecionado a partir de Arg, Lys, Cit e Phe, preferiv-
elmente Arg ou Cit.
[00431] S nas fórmulas (II) e (II') representa um grupo divalente tendo 1 ou mais átomos selecionados a partir de carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre. S une aminoácido Bxx1 ou se Bxx1 estiver ausente a Byy (através de ligação covalente ao N-terminal de Bxx1 ou Bxx2) à porção V (descrita abaixo).
[00432] De acordo com uma modalidade, S representa um grupo alquileno divalente, um grupo alquenileno divalente ou um grupo de óxido de polialquileno divalente. Preferivelmente, S representa um grupo divalente tendo a fórmula –(CH2)q-Azz5-, ou um grupo divalente tendo a fórmula -(OCH2CH2)q-Azz5-; em que q é um número inteiro de 1 a 50, preferivelmente um inteiro de 2 a 10; e Azz5 está tanto ausente, ou representa um grupo solubilizante tal como um grupo diva- lente contendo um grupo amônio, um grupo sulfato ou um aminoácido como um substituinte. Azz5 pode por exemplo ser um aminoácido com uma cadeia lateral polar.
[00433] De acordo com uma modalidade preferida, S representa um grupo divalente tendo a fórmula –Y-Azz5-(CH2)q-, ou um grupo divalen- te tendo a fórmula –Y-Azz5-(OCH2CH2)q-; em que Y representa uma porção divalente covalentemente ligada ao N-terminal de Azz5 e à porção V; se Azz5 estiver ausente, Y representa uma porção divalente covalentemente ligada ao grupo alquila ou óxido de polietileno e à por- ção V; Y sendo uma porção divalente selecionada a partir de ma- leimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila, e derivados dos mesmos, preferivelmente um derivado de maleimida divalente ou porção de triazol. O grupo divalente de fórmula –Y-Azz5-(CH2)q- pode ser obtido conforme descrito abaixo.
[00434] Cada um de o e p nas fórmulas (II) e (II') independente- mente é um número inteiro de 1 a 10, preferivelmente um inteiro de 1 a
4.
[00435] V representa uma porção derivada de um grupo vetor ca- paz de interagir com uma célula alvo. A expressão “capaz de interagir com uma célula alvo” conforme usado no presente documento indica que o grupo vetor pode se ligar, complexar com ou reagir com uma porção, por exemplo uma proteína ou receptor, de uma célula alvo, causando assim a internalização do composto de fórmula (II) na célula alvo. V será descrito em maiores detalhes abaixo.
[00436] Z representa um grupo covalentemente ligado ao C- terminal de Byy (e no caso de p>1 o grupo Byy, que é isolado no C- terminal) selecionado a partir de -OH; -N(H)(R), em que R representa um grupo hidroxila, um átomo de hidrogênio, um grupo alquila, um grupo cicloalquila ou um grupo aromático, preferivelmente um grupo hidroxila; e um agente marcador tal como um derivado de cumarina.
[00437] De acordo com uma modalidade, R representa um grupo alquila tendo de 1 a 20 átomos de carbono, preferivelmente um grupo metila ou etila, um grupo cicloalquila tendo de 3 a 20 átomos de car- bono, preferivelmente 5 a 8 átomos de carbono ou um grupo aromático tendo de 6 a 20 átomos de carbono, preferivelmente 6 ou 10 átomos de carbono.
[00438] Os peptídeos Bxx(D)-Byy e Byy-Bxx(D) nas respectivas fórmulas (II) e (II') agem seletivamente como substrato para a atividade da exopeptidase de Cat B. Isto é, Cat B cliva o composto de fórmula (II) ou (II') no N-terminal de (cada) resíduo Bxx (fórmula (II)) ou Byy (fórmula (II')), liberando a porção peptídica V-S-Bxx1-Bxx2, uma por- ção peptídica Bxx(D)-Byy-Z e porções peptídicas (p-1) Bxx1-Bxx2 as- sim como porções peptídicas ((o*p)-1) Bxx(D)-Byy-OH. De acordo com algumas modalidades, Bxx(D)-Byy-OH e Bxx(D)-Byy-Z podem ser por- ções autoimolativas, que podem sofrer aminólise intramolecular ou hidrólise resultando na liberação da porção D como um produto. Em alguns aspectos, o dipeptídeo Bxx(D)-Byy-OH/Byy-Bxx(D)-OH pode exibir atividade farmacológica (por exemplo, citotóxica).
[00439] De acordo com uma modalidade adicional, o composto da presente invenção é representado pelas fórmulas gerais que seguem (IIa):
[00440] Na fórmula (IIa), Bxx representa um aminoácido carboxílico (isto é, tendo um grupo COOH em sua cadeia lateral) tal como Ama, Glu, Aaa, Apa ou um aminoácido trifuncional selecionado a partir de Dap, Dab, Ser, Thr, Lys, Orn, homoLys, homoSer e homoThr; com a condição de que Bxx não seja um aminoácido na configuração (D). Preferivelmente, Bxx representa um aminoácido trifuncional seleciona- do a partir de Ama, Glu, Aaa, Dap, Dab, Ser, Thr, Apa, Lys, Orn, ho- moLys, homoSer e homoThr.
[00441] Cxx representa uma única ligação covalente a menos que Bxx seja Ama. Se Bxx for Ama, Cxx representa (L)- ou (D)-Pro, ou um N-alquil aminoácido tal como Sar, o N-terminal de Cxx se liga a uma extremidade carboxila de Ama e o C-terminal de Cxx se liga através de, por exemplo ligação éster à porção do fármaco D (por exemplo, CPT).
[00442] De acordo com uma modalidade preferida, Cxx representa um aminoácido selecionado a partir de (L)- ou (D)-Pro, sarcosina (Sar), N-metil Val e N-metil Leu.
[00443] Byy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Val, His, Lys, Abu, Met, Cit, Orn, Ser, Thr, Leu, Ile, Arg, homo-Phe, beta-Phe e beta-homo-Phe com a condição de que se o*p>1, apenas o Byy C-terminal pode representar um aminoácido se- lecionado a partir de homo-Phe, beta-Phe e beta-homo-Phe. Preferiv-
elmente, Byy representa Cit, Phe, homo-Phe, Ser, Trp, Tyr or Tyr(OR1) em que R1 é -(CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número inteiro de 2 a 24; mais preferivelmente Phe, Tyr ou Tyr(OR1); se o*p>1, Byy representa preferivelmente Tyr ou Tyr(OR1). Sem se ater à teoria, acredita-se que Byy provê o composto de fórmula (IIa) com as necessidades estru- turais para reconhecimento e clivagem por Cat B.
[00444] O peptídeo Bxx(Cxx-D)-Byy nas fórmulas (IIa) seletivamen- te age como um substrato para a atividade da exopeptidase de Cat B, isto é Cat B cliva o composto de fórmula (IIa) no N-terminal de (cada) resíduo de Bxx, liberando a porção peptídica V-S-Bxx1-Bxx2, uma porção peptídica Bxx(Cxx-D)-Byy-Z e porções peptídicas (p-1) Bxx1- Bxx2 assim como porções peptídicas ((o*p)-1) Bxx(Cxx-D)-Byy-OH. Bxx(Cxx-D)-Byy-OH e Bxx(Cxx-D)-Byy-Z são porções autoimolativas, que podem sofrer aminólise intramolecular (formação de DKP) re- sultando na liberação da porção D como um produto. Nos peptídeos Ama(Cxx-D2)-Byy-OH e Ama(Cxx-D2)-Byy-Z, o mecanismo da formação de DKP envolve ataque nucleofílico do nitrogênio N-terminal de Ama no carbonil éster de Cxx, liberando assim a porção D2 (por exemplo, CPT).
[00445] D, Bxx1, Bxx2, S e V nas fórmulas (IIa) são conforme definidos acima em relação a fórmulas (II) e (II'). Naqueles casos onde Bxx na fórmula (IIa) carrega um hidrogênio como grupo D, Bxx tam- bém pode ser qualquer outro aminoácido, com a condição de que Bxx não seja um aminoácido na configuração (D).
[00446] Na presente invenção, verificou-se surpreendentemente que a presença da porção estericamente exigente D na cadeia lateral de resíduo Bxx (ou Cxx caso presente) não tem nenhum efeito prejudi- cial na afinidade de ligação do composto da presente invenção a Cat B, nem na taxa de clivagem do composto pelo mecanismo da exopep-
tidase de Cat B. Sem se ater à nenhuma teoria, acredita-se que a por- ção estericamente exigente D está direcionada para fora da ranhura de ligação de Cat B (conhecido como o “bolso hidrofóbico” de Cat B), levando assim à seletividade superior e taxa de clivagem através do mecanismo da exopeptidase.
[00447] No composto de fórmula (II)/(II'), a porção V (grupo vetor) é covalentemente ligada a um grupo S conforme mostrado acima, isto é o sistema ligante é ligado ao grupo vetor através de um único ponto de ligação (por exemplo, através de uma ligação de cisteína-maleimida). A ligação de mais de um sistema ligante em múltiplos sítios de uma porção V não deve ser abrangida pela presente divulgação. Como um resultado, alto carregamento de fármaco (alto DAR) pode ser alcan- çado e, ao mesmo tempo, os problemas de sobrecarga do grupo vetor e/ou clivagem prematura extracelular do conjugado (por exemplo, morte celular não específica) podem ser superados.
[00448] Em alguns aspectos, o sistema ligante provê uma plata- forma de tecnologia nova e altamente ajustável levando a pelo menos um dos itens que seguem: (1) liberação de uma molécula de um fár- maco (carga útil) em uma célula alvo, (2) liberação de múltiplas moléculas (por exemplo 2 a 20 ou 4 a 10) do mesmo fármaco em uma célula alvo (alto DAR), (3) liberação de múltiplas moléculas (por exem- plo 2 a 20 ou 4 a 10) de diferentes fármacos (carga útil dupla ou carga útil múltipla) em uma célula alvo (alto DAR).
[00449] De acordo com uma modalidade, o composto de fórmula (II) é selecionado a partir dos compostos que seguem, em que Z é pre- ferivelmente –OH: V-S-Phe-Lys-Lys(D)-Phe-Z, V-S-Phe-Cit-Lys(D)-Cit- Z, V-S-Phe-Cit-Lys(D)-Tyr-Z, V-S-Phe-Cit-Lys(D)-homoTyr-Z, V-S-Phe- Arg-Lys(D)-Arg-Lys(D)-Phe-Z, V-S-Phe-Arg-(Lys(D)-Cit)o-Z, V-S-Phe- Arg-(Lys(D)-Tyr(OR1))o-Z em que R1 é –(CH2CH2O)n1- R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número in-
teiro de 2 a 24 por exemplo 12, V-S-Phe-Arg--(Lys(D)-Cit)o-Tyr(OR1)- Tyr-Z; preferivelmente from V-S-Phe-Lys-Lys(D)-Phe-Z, V-S-Phe-Cit- Lys(D)-Cit-Z, V-S-Phe-Cit-Lys(D)-homoTyr-Z ou V-S-Phe-Arg-Lys(D)- Arg-Lys(D)-Phe-Z.
[00450] De acordo com uma modalidade preferida, o composto de fórmula (II) é selecionado a partir dos compostos que seguem, em que Z é preferivelmente –OH: V-S-Phe-Lys-Lys(Mal-DM1)-Phe-Z, V-S-Phe- Lys-Lys(AF)-Phe-Z, V-S-Phe-Cit-Lys(Mal-DM1)-Cit-Z, V-S-Phe-Cit- Lys(Mal-DM1)-Tyr-Z, V-S-Phe-Cit-Lys(Mal-DM1)-homoTyr-Z, V-S-Phe- Arg-Lys(Mal-DM1)-Arg-Lys(AF)-Phe-Z, V-S-Phe-Arg-(Lys(Mal-DM1)- Cit)o-Z, V-S-Phe-Arg-(Lys(Mal-DM1)-Tyr(OR1))o-Z em que R1 é – (CH2CH2O)n1- R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um número inteiro de 2 a 24 por exemplo 12, V-S-Phe- Arg--(Lys(Mal-DM1)-Cit)o-Tyr(OR1)-Tyr-Z e V-S-Phe-Arg-(Lys(AF)- Cit)o-Z; preferivelmente a partir de V-S-Phe-Lys-Lys(Mal-DM1)-Phe-Z, V-S-Phe-Lys-Lys(AF)-Phe-Z, V-S-Phe-Cit-Lys(Mal-DM1)-homoTyr-Z ou V-S-Phe-Arg-Lys(Mal-DM1)-Arg-Lys(AF)-Phe-Z.
[00451] De acordo com uma modalidade, o composto de fórmula (II') é selecionado a partir dos compostos que seguem, em que Z é preferivelmente –OH: V-S-Phe-Arg-Phe-Lys(D)-Ser-Lys(D)-Z, V-S-Phe- Arg-(Phe-Lys(D))o-Z, V-S-Phe-Arg-(Ser-Lys(D))o-Z, V-S-Phe-Arg- (Tyr(OR1)-Lys(D))o-Z, V-S-Phe-Arg-(Phe-Lys(D))o-Phe-Tyr(OR1)-Z; preferivelmente V-S-Phe-Arg-Phe-Lys(D)-Ser-Lys(D)-Z, V-S-Phe-Arg- (Phe-Lys(D))o-Z ou V-S-Phe-Arg-(Ser-Lys(D))o-Z; mais preferivelmente V-S-Phe-Arg-(Phe-Lys(D))o-Z.
[00452] De acordo com uma modalidade preferida, o composto de fórmula (II') é selecionado a partir de V-S-Phe-Arg-Phe-Lys(Mal-DM1)- Ser-Lys(AF)-Z, V-S-Phe-Arg-(Phe-Lys(Mal-DM1))o-Z, V-S-Phe-Arg- (Ser-Lys(Mal-DM1))o-Z, V-S-Phe-Arg-(Tyr(OR1)-Lys(Mal-DM1))o-Z, V- S-Phe-Arg-(Phe-Lys(Mal-DM1))o-Phe-Tyr(OR1)-Z; preferivelmente V-
S-Phe-Arg-Phe-Lys(Mal-DM1)-Ser-Lys(AF)-Z, V-S-Phe-Arg-(Phe- Lys(Mal-DM1))o-Z ou V-S-Phe-Arg-(Ser-Lys(Mal-DM1))o-Z; mais pre- ferivelmente V-S-Phe-Arg-(Phe-Lys(Mal-DM1))o-Z.
[00453] De acordo com uma modalidade, o composto de fórmula (II) pode ser selecionado a partir de:
[00454] Em uma modalidade da presente invenção, o composto de fórmula (II) é selecionado a partir de:
[00455] em que nos compostos acima DM1 representa um fármaco maitansinoide (isto é, mertansina) e mAb representa um vetor do anti- corpo monoclonal capaz de interagir com uma célula alvo (descrito abaixo).
5. Fármacos
[00456] No composto da presente invenção, cada porção derivada de um fármaco é independentemente selecionada a partir de: (i) fármacos antineoplásicos; (ii) fármacos imunomoduladores; (iii) fármacos para doença anti-infecciosa; e radioisótopos e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados dos mesmos.
[00457] De acordo com uma modalidade, cada porção derivada de um fármaco é independentemente derivada de um fármaco tendo um ou mais grupos selecionados a partir do grupo hidroxila, carboxila, tiol ou amino.
[00458] O fármaco pode ser não modificado (em sua forma natural exceto pela substituição de um átomo de hidrogênio por uma ligação covalente) ou quimicamente modificado de modo a incorporar um ou mais grupos funcionais (por exemplo, um ou mais grupos selecionados a partir de grupos hidroxila, carboxila, amino e tiol) permitindo a(s) ligação(ões) covalente(s) a um aminoácido, por exemplo aminoácido Axx nas fórmulas (I) e (I'), aminoácido A'xx nas fórmulas (Ia) e (Ib), aminoácido Bxx nas fórmulas (II), (II') e (IIa), e/ou Cxx nas fórmulas
(Ib) e (IIa). O fármaco também pode ser modificado pela ligação cova- lente a um grupo divalente, por exemplo um aminoácido, um peptídeo, um ligante ou espaçador conforme descrito acima, etc.
[00459] De acordo com uma modalidade, o fármaco pode ser modi- ficado pela introdução de um grupo divalente, por exemplo um ami- noácido ou um peptídeo, que pode aumentar a afinidade do conjugado por Cat B, em particular pela atividade da exopeptidase (carboxipepti- dase) de Cat B. Por exemplo, o fármaco pode ser modificado pela in- trodução de um aminoácido tal como Phe, Lys, Cit ou Arg, entre o fár- maco (nativo) e o aminoácido Axx de fórmula (I) ou Ayy de fórmula (I'). Um exemplo do referido fármaco modificado é provido na Figura 12, mostrando um fármaco maitansinoide contendo aminoácido Dyy tal como Arg, Phe, Cit ou Lys, entre o fármaco e um peptídeo de acordo com a fórmula (I') (isto é, fármaco e aminoácido juntos formando a porção W de acordo com a fórmula (I')). Conforme mostrado na Figura 12, a clivagem enzimática induzida por Cat B no N-terminal de Axx libera a porção W (isto é, fármaco derivado de maitansina) na célula alvo.
[00460] Em alguns aspectos da presente invenção, cada porção derivada de um fármaco independentemente representa um grupo profármaco que não é farmacologicamente ativo na forma conjugada (por exemplo, quando encontrada no composto de fórmula (I), (I'), (II), (II') ou (IIa)), mas que se torna farmacologicamente ativo seja uma vez liberado a partir do conjugado ou adicionalmente ativado de forma in- tracelular.
[00461] Consequentemente, o fármaco a ser usado no conjugado de ligante-fármaco da presente invenção pode ser um fármaco nativo (por exemplo, um fármaco contendo um ou mais grupos funcionais permitindo a ligação covalente ao conjugado), ou podem ser um fár- maco quimicamente modificado, contanto que o fármaco seja farmaco-
logicamente ativo tanto quando ele é liberado do conjugado ou adi- cionalmente ativado intracelularmente. Em uma modalidade preferida, o fármaco é um fármaco modificado de forma que seja farmacologi- camente ativo de tal forma que retenha pelo menos 20%, mais pre- ferivelmente pelo menos 50% da atividade farmacológica do fármaco não modificado (nativo).
[00462] Abaixo estão fármacos exemplificadores que podem ser usados em um conjugado de ligante-fármaco da presente invenção.
[00463] (i) Agentes antineoplásicos incluem:
[00464] (a) Agentes alquilantes tais como análogos da mostarda nitrogenada (por exemplo, ciclofosfamida clorambucil, melfalan, clor- metina, ifosfamida, trofosfamida, prednimustina, bendamustina, clor- nafazina, estramustina, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, manomustina, mitolactol, novembicin, fenesterina, mo- starda de uracila); alquil sulfonatos (por exemplo busulfan, treosulfan, manosulfan, improsulfan e piposulfan); etileno iminas (por exemplo, tiotepa, triaziquona, carboquona); nitrosoureias (por exemplo car- mustina, lomustina, semustina, estreptozocina, clorozotocina, fotemustina, nimustina, ranimustina); epóxidos (por exemplo etoglu- cid); outros agetes alquilantes (por exemplo mitobronitol, pipobroman, temozolomida, dacarbazina);
[00465] (b) Alcaloides tais como vinca alcaloides (por exemplo, vin- cristina, vinblastina, vindesina, vinorelbina, navelbin, vinflunida, vin- tafolida); taxanos (por exemplo paclitaxel, docetaxel, paclitaxel poliglumex, cabazitaxel) e seus análogos, maitansinoides (por exemplo DM1, DM2, DM3, DM4, maitansina e ansamitocinas) e seus análogos, criptoficinas (por exemplo criptoficina 1 e criptoficina 8); epotilonas, eleuterobina, discodermolida, briostatinas, dolostatinas, auristatinas (por exemplo, monometil auristatina E, monometil auristatina F), tubu- lisinas, cefalostatinas; pancratistatina; sarcodictiina; espongistatina;
demecolcina; epipodofilinas (por exemplo, 9-aminocamptotecina, camptotecina, crisnatol, daunomicina, etoposida, fosfato de etoposida, irinotecan e metabólitos dos mesmos tais como SN-38, mitoxantrona, novantrona, ácidos retinoicos (retinois), teniposida, topotecan, 9- nitrocamptotecina (RFS 2000)); mitomicinas (por exemplo, mitomicina C);
[00466] (c) Antimetabólitos tais como inibidores de DHFR (por ex- emplo, metotrexato, trimetrexato, denopterina, pteropterina, aminopter- ina (ácido 4-aminopteroico) ou outros análogos de ácido fólico tais co- mo raltitrexed, pemetrexed, pralatrexato); inibidores de IMP desidro- genase (por exemplo, ácido micofenólico, tiazofurina, ribavirina, EIC- AR); inibidores de ribonucleotídeo reductase (por exemplo, hidroxi- ureia, deferoxamina); análogos de pirimidina (por exemplo, citarabina, fluorouracila, 5-fluorouracila e metabólitos dos mesmos, tegafur, car- mofur, gemcitabina, capecitabina, azacitidina, decitabina, combinações de fluorouracila, combinações de tegafur, combinações de trifluridina, citosina arabinosida, ancitabina, floxuridina, doxifluridina), análogos de uracila (por exemplo, 6-azauridina, desoxiuridina); análogos de citosina (por exemplo, enocitabina) ; análogos de purina (por exemplo, aza- tioprina, fludarabina, mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, cladribina, clofarabina, nelarabina); repositor de ácido fólico tal como ácido folí- nico;
[00467] (d) Terapias endócrinas usadas especificamente no trata- mento de doenças neoplásicas, tais como estrogênios, proges- togênios, análogos de hormônio liberando gonadotropina, anti- estrogênios, anti-androgênios, inibidores de aromatase;
[00468] (e) Inibidores da cinase tais como BIBW 2992 (anti- EGFR/Erb2), imatinib, gefitinib, pegaptanib, sorafenib, dasatinib, sunitinib, erlotinib, nilotinib, lapatinib, axitinib, pazopanib, vandetanib, afatinib, vemurafenib, crizotinib, regorafenib, masitinib, dabrafenib,
trametinib, ibrutinib, ceritinib, lenvatinib, nintedanib, cediranib, palbo- cidib, osimertinib, alectinib, alectinib, rociletinib, cobimetinib, midostau- rin, olmutinib, E7080 (anti-VEGFR2), mubritinib, ponatinib (AP24534), bafetinib (INNO-406), bosutinib (SKI-606), cabozantinib, vismodegib, iniparib, ruxolitinib, CYT387, tivozanib, ispinesib, temsirolimus, evero- limus, ridaforolimus;
[00469] (f) Outros tais como duocarmicina (incluindo análogos sin- téticos: adozelesina, carzelesina, bizelesina, KW-2189 e CBI-TMI); dí- meros benzodiazepínicos (dímeros de pirrolobenzodiazepina ou to- maimicina, indolinobenzodiazepinas, imidazobenzotiadiazepinas, ou oxazolidinobenzodiazepinas); compostos contendo platina (por exem- plo, carboplatina, cisplatina, oxaliplatina, satraplatina, poliplatilen); aziridinas tais como benzodopa, meturedopa e uredopa; metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietile- nefosforamida, trietilenotiofosfaoramida e trimetilolomelamina; dinemicina, esperamicina, kedarcidina, maduropeptina, aclacino- misinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinom- icina, carabicina, carminomicina, carzinofilina; cromomicinas, dacti- nomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino- doxorrubicina e desoxidoxorrubicina, epirrubicina, esorrubi- cina, idarrubicina, marcelomicina, nitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; policetídeos (por exemplo, aceto- geninas); gemcitabina, epoxomicinas (por exemplo, carfilzomib).
[00470] (ii) Agentes imunomoduladores incluem imunoestimulantes, imunossupressores, ciclosporina, ciclosporina A, ácido aminocaproico, azatioprina, bromocriptina, clorambucil, cloroquina, ciclofosfamida, cor- ticoesteroides (por exemplo, amcinonida, betametasona, budesonida,
hidrocortisona, flunisolida, propionato de fluticasona, fluocortolona danazol, dexametasona, prednisona, triamcinolona acetonida, dipropi- onato de beclometasona), DHEA, hidroxicloroquina, meloxicam, meto- trexato, mofetil, micofenilato, sirolimus, tacrolimus, everolimus, fin- golimod, ibrutinib.
[00471] (iii) Agentes anti-infecciosos incluem fármacos antibacteri- anos, fármacos antimitóticos, fármacos antimicobacterianos e fárma- cos antivirais. Um exemplo não limitante de antibiótico usado em um conjugado de fármaco antibiótico-anticorpo é rifalogue, um derivado de rafamicina.
[00472] Os fármacos usados no presente documento também in- cluem radioisótopos dos mesmos. Exemplos de radioisótopos (radio- nuclídeo) são por exemplo 3H, UC, 14 C, 18 F, 32 P, 35 S, 64 Cu, 68 Ga, 86 Y, 99 111 123 124 125 131 177 Tc, In, I, I, I, I, Lu,186Re, 188 Re, 211 At, 212 Bi, 213 Bi ou 225 Ac. Os fármacos marcados com radioisótopos podem ser usados em experimentos direcionados de imagem ou tratamentos direciona- dos (Wu et al Nat. Biotech. 2005, 23, 1137-1146).
[00473] Os fármacos usados no presente documento também in- cluem sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados dos mesmos.
[00474] De acordo com uma modalidade preferida, cada porção derivada de um fármaco é independentemente derivada de um fárma- co selecionado a partir de duocarmicina, auristatina (um análogo de auristatina), maitansina, tubulisina, caliqueamicina, camptotecina, SN- 38, taxol, daunomicina, vinblastina, doxorrubicina, metotrexato, pirrolo- benzodiazepina ou radioisótopos e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos; preferivelmente derivados de um fármaco se- lecionado a partir de auristatina, maitansina, camptotecina, doxorrubi- cina, pirrolobenzodiazepina ou radioisótopos e/ou sais farmaceuti- camente aceitáveis dos mesmos. Em uma modalidade, o fármaco não é um análogo de auristatina.
[00475] De acordo com uma modalidade, cada porção D1 nas fór- mulas (Ia), (Ia') e (Ib) é independentemente representada pela fórmula que segue (III):
[00476] W1 representa uma porção derivada de um fármaco que difere de um fármaco nativo apenas em virtude da ligação covalente a Dxx (conforme mostrado acima). Em uma modalidade W1 representa uma porção derivada de duocarmicina, auristatina, maitansina, tubu- lisina, caliqueamicina, camptotecina, SN-38, taxol, daunomicina, vin- blastina, doxorrubicina, metotrexato, pirrolobenzodiazepina ou radio- isótopos e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos; pre- ferivelmente uma porção derivada de auristatina, maitansina, camp- totecina, doxorrubicina, pirrolobenzodiazepina ou radioisótopos e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00477] De acordo com uma modalidade, W1 representa uma por- ção derivada de auristatina, preferivelmente uma porção derivada de auristatina F (AF), auristatina E (AE), auristatina Cit (ACit), monometil auristatina F (MMAF), monometil auristatina Cit (MMACit) ou monometil auristatina E (MMAE), mais preferivelmente uma porção derivada de AF ou MMAF, ou representa uma porção derivada de maitansina, tal como mertansina (também conhecido como DM1) ou ravtansina (também conhecido como DM4). Em alguns casos, W1 não é um análogo de auristatina. Em outras modalidades, W1 não é auri- statina Asp (AAsp), auristatina Glu (AGlu), auristatina PhosphoThr (AphThr) ou auristatina Thr (AThr).
[00478] Dxx representa uma única ligação covalente ou um ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, preferivelmente um ami- noácido selecionado a partir de Phe, Val, Tyr e Ala. De acordo com uma modalidade, Dxx representa uma combinação de um aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica conforme especificado acima e uma porção divalente selecionada a partir de maleimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila, e derivados dos mesmos que são ligados (pelo N-terminal do aminoácido com cadeia lateral hidro- fóbica) à porção W1 através da porção divalente selecionada a partir de maleimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila, e derivados dos mesmos. Preferivelmente, Dxx é uma porção consistin- do de um aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica conforme especificado acima e um derivado de maleimida ou triazol divalente em que a ligação à porção W1 é através do derivado de maleimida ou triazol divalente.
[00479] Dyy representa uma única ligação covalente ou um ami- noácido tendo uma cadeia lateral básica, preferivelmente um ami- noácido selecionado a partir de Arg, Lys, Phe, Cit, Orn, Dap e Dab, mais preferivelmente Arg ou Cit.
[00480] A linha quebrada indica a ligação covalente ao N-terminal de Axx na fórmula (I), o N-terminal de Ayy na fórmula (I'), o N-terminal de A'xx nas fórmulas (Ia) e (Ib), ou o N-terminal de A'yy na fórmula (Ia').
[00481] De acordo com uma modalidade preferida, W1 representa uma porção derivada de auristatina, preferivelmente AF, Dxx represen- ta uma única ligação covalente, e Dyy representa um aminoácido se- lecionado a partir de Arg, Lys, Phe, Cit, Orn, Dap e Dab, preferivel- mente Arg ou Cit.
[00482] De acordo com uma modalidade adicional preferida, W1 representa uma porção derivada de maitansina, preferivelmente DM1; Dyy é Arg, Lys ou Cit, preferivelmente Cit ou Lys; Dxx é um ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, por exemplo Phe, que é ligado a maitansina através de um derivado de maleimida divalente.
[00483] De acordo com uma modalidade adicional, cada porção D2 e D nas fórmulas (Ia), (Ia'), (Ib), (II), (II') e (IIa) é independentemente representada pela fórmula que segue (IIIa):
[00484] W2 representa uma porção derivada de duocarmicina, auri- statina, maitansina, tubulisina, caliqueamicina, camptotecina, SN-38, taxol, daunomicina, vinblastina, doxorrubicina, metotrexato, pirroloben- zodiazepina, ou radioisótopos e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00485] Exx representa uma única ligação covalente ou uma porção divalente selecionada a partir de maleimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila, aminoácidos, porções dipeptídicas e derivados dos mesmos, preferivelmente um derivado de maleimida ou triazol divalente, mais preferivelmente um derivado de maleimida.
[00486] A linha quebrada indica ligação covalente à cadeia lateral de A'xx nas fórmulas (Ia) e (Ia'), a cadeia lateral de A'xx ou o C- terminal de Cxx caso presente na fórmula (Ib), a cadeia lateral de Bxx nas fórmulas (II) e (II'), a cadeia lateral de Bxx ou o C-terminal de Cxx caso presente na fórmula (IIa).
[00487] De acordo com uma modalidade preferida, W2 representa uma porção derivada de auristatina (por exemplo AF) ou maitansina (por exemplo DM1). Se W2 for uma porção derivada de auristatina (por exemplo AF), a ligação pode ocorrer através do grupo carboxila C- terminal do fármaco e o grupo ω-amino de Bxx (fórmulas (II) e (II')) ou A'xx (fórmulas (Ia), (Ia') e (Ib)). Se W2 for uma porção derivada de maitansina (por exemplo DM1) a ligação ao grupo ω-amino de Bxx ou A'xx preferivelmente ocorre através de um derivado de maleimida diva- lente.
6. Grupo vetor
[00488] V nas fórmulas (I), (I'), (Ia1), (Ia2), (Ia3), (II), (II') e (IIa) rep- resenta uma porção derivada de um grupo vetor capaz de interagir com uma célula alvo. A expressão “capaz de interagir com uma célula alvo”, conforme usada no presente documento, indica que o grupo ve- tor pode se ligar a, complexar com, ou reagir com uma porção, por ex- emplo um antígeno ou um receptor, na superfície de uma célula alvo. Uma referida interação com uma célula alvo pode ser experimental- mente verificada por métodos conhecidos na técnica, por exemplo ao prover um composto de fórmula (I), que carrega um marcador (tal co- mo um marcador de fluorescência), ao colocar o referido composto em contato com tecido contendo células alvo e ao detectar a distribuição do marcador de fluorescência dentro do tecido (por exemplo, através de microscopia por fluorescência). Um aumento da intensidade de flu- orescência nas células alvo indica uma interação com a célula alvo de acordo com a presente invenção. Em algumas modalidades preferidas, o grupo vetor também é capaz de causar ou contribuir para a internali- zação do conjugado de fármaco direcionado (isto é, composto de fór- mula (I) ou fórmula (II)) na célula alvo.
[00489] De acordo com uma modalidade, V representa uma porção derivada de um grupo vetor selecionado a partir de anticorpos, frag- mentos de anticorpo, proteínas, peptídeos e moléculas não peptídicas.
[00490] De acordo com uma modalidade preferida, V representa uma porção derivada de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo tal como um anticorpo de cadeia única, um anticorpo monoclonal, um anticorpo monoclonal de cadeia única, um fragmento de anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um fragmento de anticorpo qui- mérico, um anticorpo de domínio ou fragmento do mesmo, uma citocina, um hormônio, um fator de crescimento, um fator estimulador de colônia, um neurotransmissor ou uma molécula para transporte de nutrientes.
[00491] De acordo com uma outra modalidade preferida, V repre- senta uma porção derivada de um peptídeo capaz de interagir com um alvo de interesse. Os exemplos não limitantes de peptídeos incluem somatostatina ou análogos da mesma, tal como octreotido, Angiopep- 2, peptídeo que libera gastrina, peptídeo derivado de transferrina, derivado do neuropeptídeo Y, peptídeos RGD, análogos de peptídeo do hormônio estimulante alfa-melanócito, peptídeo intestinal vasoativo, análogos de (LHRH) de hormônio que libera neurotensina e agente luteinizante.
[00492] De acordo com ainda uma outra modalidade preferida, V representa uma porção derivada de uma molécula não peptídica tal como ácido fólico, ácido hialurônico, um antagonista do receptor de neurotensina 1 (NRT1) tais como derivados de SR 142948A e um ligante do antígeno da membrana específica da próstata (PSMA) tal como PSMA-617 e PSMA-11.
[00493] De acordo com uma modalidade, a célula alvo é seleciona- da a partir de células tumorais, células infectadas por vírus, células infectadas por microorganismos, células infectadas por parasitas, célu- las envolvidas em doenças autoimunes, células ativadas, células mieloides, células linfoides, melanócitos e agentes infecciosos inclu- indo bactérias, vírus, micobactérias, fungos.
[00494] De acordo com uma modalidade preferida, a célula alvo é qualquer célula tumoral de um tumor sólido ou líquido, incluindo mas sem se limitar a células de linfoma, células de mieloma, células de câncer renal, células de câncer de mama, células de câncer de próstata, células de câncer ovariano, células de câncer colorretal, célu- las de câncer gástrico, células de câncer escamoso, células de câncer de célula pequena, células de câncer testicular ou qualquer célula cre- scendo e se dividindo em um ritmo desregulado e acelerado para causar cânceres.
7. Composições farmacêuticas
[00495] Os compostos da presente invenção podem ser providos na forma de composições farmacêuticas para uso humano ou animal na medicina humana e veterinária. As referidas composições tipicamente compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de LDC de acordo com a presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um ou mais componentes selecionados a partir de um veículo, um diluente e outros excipientes.
[00496] Os veículos, diluentes e outros excipientes adequados para uso nas composições farmacêuticas são bem conhecidos na técnica, e são, por exemplo descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (Gennaro AR, 1985). O veículo, diluente e/ou out- ro excipiente pode ser selecionado com relação à via pretendida de administração e prática farmacêutica. As composições farmacêuticas podem compreender como o veículo, diluentes e/ou outros excip- ientes, ou além de, qualquer ligante(s), lubrificante(s), agente(s) de suspensão, agente(s) de revestimento, agente(s) solubilizante(s).
[00497] A quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determina- da por um médico em uma base de rotina. O nível de dose específico e a frequência da dosagem para qualquer indivíduo/paciente específi- co pode variar e depende de uma variedade de fatores incluindo a ati- vidade do composto de fármaco específico empregado, a estabilidade metabólica e duração da ação daquele composto, a idade do paciente, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, modo e tempo de admin- istração, taxa de excreção, combinação de fármacos, a gravidade da condição específica, e a terapia individual utilizada. Esses fatores são levados em consideração pelo médico quando se determina a dose terapeuticamente eficaz.
8. Uso de LDCs ou composições dos mesmos em métodos de prevenção ou tratamento de doenças
[00498] Os compostos da presente invenção incluindo o composto de fórmula (I)/(I') ou o composto de fórmula (II)/(II') podem ser usados para tratar a doença. O tratamento pode ser um tratamento terapêutico e/ou profilático, com o objetivo de prevenir, reduzir ou parar uma mu- dança ou distúrbio fisiológico indesejado. Em alguns aspectos, o tratamento pode prolongar a sobrevivência de um indivíduo conforme comparado com a sobrevivência esperada caso não receba o trata- mento.
[00499] A doença que é tratada pelo LDC pode ser qualquer doen- ça que se beneficia do tratamento, incluindo distúrbios ou doenças crônicos e agudos e também aquelas condições patológicas que pre- dispõem ao distúrbio. Em alguns aspectos, a doença é uma doença neoplásica tal como câncer que pode ser tratado através da destruição direcionada de células tumorais. Os exemplos não limitantes de cân- ceres que podem ser tratados incluem tumores benignos e malignos, seja sólidos ou líquidos; leucemia e malignidades linfoides, assim co- mo câncer de mama, câncer ovariano, de estômago, endométrio, glândula salivar, pumão, rins, cólon, tireoide, pancreático, próstata ou bexiga. A doença pode ser uma doença neuronal, glial, astrocital, hipotalâmica ou outra glandular, macrófaga, epitelial, estromal e blas- tocoélica; ou inflamatória, angiogênic ou uma doença imunológica. Uma doença exemplificadora é um tumor sólido, maligno.
[00500] De acordo com uma modalidade, o composto da presente invenção ou composição do mesmo é usado em um método de trata- mento ou prevenção de um câncer, uma doença autoimune e/ou uma doença infecciosa, por exemplo ao administrar uma quantidade tera- peuticamente eficaz do composto da presente invenção ou com- posição do mesmo a um paciente que necessita do mesmo.
[00501] A molécula pode ser administrada a um indivíduo (por ex- emplo, um paciente) em uma vez ou durante uma série de tratamen- tos. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, entre cerca de 0,1 µg/kg a 1 mg/kg de fármaco pode ser usado como uma dosagem ini-
cial para primeira administração em um primeiro teste em humano, por exemplo através de uma ou mais administrações separadas, ou atra- vés da infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 0,1 mg/kg a 50 mg/kg ou mais, ou de cerca de 0,5 a cerca de 25 mg/kg do peso do paciente.
[00502] Quando se trata câncer, o efeito terapêutico que é obser- vado pode ser uma redução no número de células de câncer; uma re- dução no tamanho do tumor; inibição ou retarddo da infiltração de células de câncer nos órgãos periféricos; inibição do crescimento tu- moral; e/ou alívio de um ou mais dos sintomas associados com câncer.
[00503] As vias para a administração (liberação) incluem uma ou mais de oral (por exemplo, comprimido, cápsula, solução ingerível), tópica, mucosal (por exemplo, spray nasal, aerossol para inalação), nasal, parenteral (por exemplo, uma forma injetável), gastrointestinal, intraespinhal, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intrauterina, intraocular, intradérmica, intracranial, intratraqueal, intravaginal, intrac- erebroventricular, intracerebral, subcutânea, oftálmica (incluindo in- travítrea ou intracameral), transdérmica, retal, bucal, vaginal, epidural, sublingual. De acordo com uma modalidade preferida, o composto da presente invenção é administrado através de injeção, tal como de for- ma parenteral, intravenosa, subcutânea, intramuscular, transdérmica.
[00504] De acordo com uma modalidade adicional, o composto da presente invenção é usado em um método de tratamento ou pre- venção de um câncer, uma doença autoimune e/ou uma doença infec- ciosa, e é administrado de forma concomitante com um ou mais outros agentes terapêuticos tais como agentes quimioterápicos, terapia de radiação, agentes imunoterápicos, agentes para doenças autoimunes, agentes anti-infecciosos, ou um ou mais outros compostos de fórmula (I)/(I') e/ou (II)/(II') e/ou (IIa). Também é possível administrar o outro agente terapêutico antes ou depois do composto da presente in- venção.
9. Uso de LDCs marcados para finalidades diagnósticas e/ou terapêuticas
[00505] No composto (LDC) da presente invenção, Z pode ser um agente marcador tal como um derivado de cumarina ou similar. Agentes marcadores incluem porções derivadas de compostos fluo- rescentes ou luminescentes, agentes para transferência de elétrons, ou outros agentes marcadores conhecidos na técnica. O composto da presente invenção pode ser clivado pela atividade da exopeptidase de Cat B no seu C-terminal liberando assim o agente marcador, por ex- emplo um derivado de amino cumarina fluorescente (AMC) em uma célula alvo (Figura 10).
[00506] Os LDCs marcados da presente invenção podem ser usa- dos para finalidades de diagnóstico in vitro, por exemplo para monito- rar a liberação de fármacos em uma célula alvo, para imunoensaios, ou para imuno-histologia, assim como para aplicações diagnósticas e/ou terapêuticas in vivo. Por exemplo, os LDCs marcados podem ser usados como um auxiliar nas aplicações terapêuticas tais como cirur- gia (oncológica), por exemplo como sondas fluorescentes em tempo real para cirurgia orientada por imagens.
[00507] A administração do composto marcado de acordo com a presente invenção para aplicações diagnósticas e/ou terapêuticas in vivo (por exemplo, cirurgia) será através de métodos análogos aos compostos não marcados. Os referidos modos de administração já estão descritos acima, e também são encontrados na literatura, de forma quel eles serão bem conhecidos do versado na técnica.
10. Preparação dos compostos da invenção
[00508] A seguir, os métodos são providos para a preparação de ligantes, fármaco-ligantes e conjugados de ligantes-fármacos. Os compostos da invenção podem ser sintetizados dependendo da sínte- se de peptídeo de fase sólida baseado em Fmoc padrão (SPPS), inclu- indo acoplamento de peptídeo em resina e estratégias convergentes. A introdução de vários derivados de maleimido e subsequente ligação quimiosseletiva a porções derivadas de um grupo vetor também é ex- emplificada abaixo. As estratégias e a metodologia geral que podem ser usadas para preparar os compostos da presente invenção são bem conhecidas do versado na técnica e são ilustradas nas Figuras 11-28 e 36-49.
11. Exemplos
11.1 - Lista de abreviações usadas nos exemplos: Ac: Acetila AF: Auristatina Phe ou Auristatina F ACit: Auristatina Cit Cit: Citrulina CPT: Camptotecina Dab: ácido diamino butírico Dap: ácido diamino propiônico DCM: diclorometano DIEA: di-isopropiletilamina DM1: N2'-deacetil-N2'-(3-mercapto-1-oxopropil)-maytansina (Mertansi- na) DM1-smcc: N2'-Deacetil-N2'-[3-[[1-[[4-[[(2,5-dioxo-1- pirrolidinil)oxi]carbonil]ciclo-hexil]metil]-2,5-dioxo-3-pirrolidinil]tio]-1- oxopropil]-maytansina (CAS: 1228105-51-8) DMAP: Dimetilaminopiridina DMF: Dimetilformamida DMSO: Dimetilsulfóxido DPBS = tampão fosfato salino Dulbecco (referência D8537 da Sigma) DTT: Ditiotreitol eq: equivalente HATU: 3-óxido hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H- 1,2,3-triazolo[4,5-b]piridínio HBTU: hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3- tetrametilamínio FA: ácido fórmico Mal: 3-maleimidopropionila Ma: 2-maleimidoacetila Mal-NHS: ácido maleimido-N-hidroxissuccínico MC: Maleimidocaproíla Mcc: 4-(N-Maleimidometil) ciclohexano-1-carboxila MES: ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico MS: espectroscopia de massa MMAF: Monometil Auristatina F Mtt: Metil tritila Mw: peso molecular NHS: éster de N-hidroxissuccinimida PABC: Para-amino benziloxicarbonila Pbf: 2,2,4,6,7-Pentametildiidrobenzofuran-5-sulfonila PEG4: Tetraetileno glicol PNP: p-Nitrofenila Sar: Sarcosina SPPS: síntese peptídica de fase sólida SQD: detector quádruplo único TFA: ácido trifluoroacético TIS: triisopropil silano Trt: tritila TQ: quadrupolo triplo UPLC: cromatografia líquida de alto desempenho v/v: volume/volume
11.2 - materiais de partida e químicos:
[00509] Os principais materiais de partida e químicos usados nos exemplos que seguem são listados abaixo: > Resinas e aminoácidos protegidos para síntese peptídica de fase sólida da Bachem ou Novabiochem (Suíça) a menos que indicado de outra forma; > ácido maleimidopropiônico, 4-nitrofenil cloroformiato, TFA, TIS e DIEA da Sigma-Aldrich (Suíça);> HBTU da Merck (Suíça) e HATU da Combi-Blocks (Suíça); > derivados de PEG (Fmoc-NH-PEG4-COOH, Fmoc-NH-PEG5- COOH and Mal-PEG4-NHS) da Iris Biotech Gmbh (Germany); > AF (Auristatina F) da Levena Biopharma (USA); > ACit (Auristatina Cit) da Bachem (Suíça); > DM1 (Mertansina) da Active Biochem (Germany); > DM1-smcc da eNovation Chemicals > CPT (Camptotecina) e Mal-NHS da Fluorochem (Reino unido); > Ma-NHS (AMAS) da AstaTech (USA); > H-Sar-OCPT da Almac (Reino unido); > Herceptin (Trastuzumab) da Roche Pharma (Schweiz) AG > coluna Sephadex® PD 10 da GE-Healthcare (referência 17-0851- 01) > unidade de filtro centrífugo Amicon Ultra-4 com membrana Ultracel- 30 > tampão PBs Dulbecco da Sigma (referência D8537) > catepsina B humana recombinante em uma forma precursora da R&D Systems (Bio-Techne AG, cat de produto #. 953-CY-010); > Cys-MC-Val-Cit-PABC-MMAF da IBIOsource (USA, cat de produto #. S10001); > Monometil Auristatina F (MMAF) da MedKoo (USA, cat de produto #: 407222);
> plasma humano e CD-1 de camundongo, gênero misto agrupado K2 EDTA, da Seralab (agora chamada BioIVT) (UK); > cloridrato de procaína da Sigma-Aldrich (Suíça, cat de produto #: 46608). > ELISA sanduíche (EDI™ Intact MMAF ADC ELISA Kit, #KTR-783) da Epitope Diagnostics Inc.
11.3 - Métodos:
[00510] Os métodos que seguem podem ser usados para avaliar os compostos da presente invenção.
11.3.1 - clivagem induzida por catepsina B humana recombinante
[00511] A clivagem induzida por Cat B dos compostos da presente invenção foi avaliada de acordo com o ensaio de clivagem enzimática in vitro usando catepsina B recombinante humana e análise UHPLC- MS/MS conforme descrito abaixo.
[00512] Os compostos de referência Cys-MC-Val-Cit-PABC-MMAF e MMAF foram usados como controles positivos. A enzima foi recon- stituída em tampão MES 25mM ajustado em pH 5,0 com uma solução de NaOH 1M e depois ativada com uma solução 20nM de DDT em temperature ambiente por pelo menos 15 min.
[00513] O ensaio enzimático in vitro foi conduzido a 37°C com os compostos de teste em uma concentração de 10µM (2.5µM quando o composto de teste é um conjugado de anticorpo-fármaco) na presença de enzima de catepsina B humana recombinante ativada em 2 µg/mL em um tampão MES 25mM pH 5,0. A reação da clivagem enzimática foi parada para cada ponto do tempo definido ao se misturar um vol- ume igual de acetonitrila + 0,1% de FA contendo um padrão interno (warfarina a 8µM).
[00514] As análises foram conduzidas usando um sistema Waters Acquity UPLC acoplado a um espectrômetro de massa Waters Xevo TQ triple quad. UHPLC foi conduzido dependendo dos compostos de teste com colunas BEH C8 1,7µm 100x2,1mm ou BEH C18 1,7µm 50x2,1mm ou HSS T3 1,7µm 50x2,1mm aquecidas a 45°C ou 50°C e ajustadas com pré-colunas de filtro de inserto de 2µm (disponível da Waters), e sistemas solventes A1 (H2O+0,1%FA) e B1 (acetoni- trila+0,1%FA) em uma taxa de vazão de 0,6 mL/min e um gradiente de 10–95% de B1 durante 1,9 min.
[00515] MS/MS foi realizado usando interface de ionização com eletropulverização (ESI) em modo positivo e transições específicas de MRM para cada composto testado.
11.3.2 - Estabilidade do plasma humano e de camundongo
[00516] A estabilidade do plasma humano e de camundongo de conjugados de ligante-fármaco da presente invenção foi avaliada de acordo com o ensaio de estabilidade do plasma usando a análise UHPLC-MS/MS conforme descrito abaixo. Quando o composto de teste é um conjugado de anticorpo-fármaco, os imunoensaios suple- mentares foram conduzidos.
[00517] Procaína foi usada como controle positivo para estabilidade do plasma humano e de camundongo. A estabilidade do plasma in vitro foi realizada a 37°C com um composto de teste 1µM (LDC) con- centração no plasma durante 24h. A reação enzimática foi parada para cada ponto do tempo definido ao se misturar 1 volume de plasma com 3 volumes de acetonitrila + 0.1%FA contendo um padrão interno (war- farina a 0,65µM). Cada amostra foi então centrifugada a 16'000 xg por 5 min a 4°C. Os sobrenadantes foram transferidos em frascos de in- jeção.
[00518] As análises foram conduzidas usando um sistema Waters Acquity UPLC acoplado a um espectrômetro de massa Waters Xevo TQ triple quad. UHPLC foi conduzido dependendo dos compostos de teste com colunas BEH C8 1,7µm 100x2,1mm ou BEH C18 1,7µm 50x2,1mm ou HSS T3 1,7µm 50x2,1mm aquecidas a 45°C ou 50°C e ajustadas com pré-colunas de filtro de inserto de 2µm (disponível da Waters), e sistemas solventes A1 (H2O+0,1%FA) e B1 (acetoni- trila+0,1%FA) em uma taxa de vazão de 0,6 mL/min e um gradiente de 10–95% de B1 durante 1,9 min.
[00519] MS/MS foi realizado usando interface de ionização com eletropulverização (ESI) em modo positivo e transições específicas de MRM para cada composto testado.
[00520] A integridade do conjugado anticorpo-fármaco foi controla- da por imunoensaio. Por exemplo, no caso de ADC1 (descrito em ma- iores detalhes abaixo), a concentração de ADC intacto foi quantificada usando ELISA sanduíche (EDI™ Intact MMAF ADC ELISA Kit, #KTR- 783) de acordo com a instrução do fabricante. Em resumo, as alíquo- tas foram coletadas em diferentes pontos do tempo durante o experi- mento da estabilidade do plasma descrito acima. Todas as amostras foram diluídas 1:800 antes da imunodetecção. Trastuzumab e AF-Arg foram incluídos como controles negativos (dados não mostrados). Pa- drões e amostras QC (baixos, médios, altos) que subiram com concen- trações conhecidas de ADC1 foram usados para quantificar amostras desconhecidas e validar a execução respectivamente.
11.3.3 - Ensaio de afinidade de ligação
[00521] A afinidade de ligação dos conjugados de anticorpo- fármaco de acordo com a presente invenção foi avaliada como a se- guir.
[00522] No caso de ADC1 (descrito em maiores detalhes abaixo), as células SK-BR-3 (expressando ErbB2) e MD-MB-231 (ErbB2- negativas) foram incubadas seja com trastuzumab ou ADC1. Para as células SK-BR-3, a concentração de ambos os compostos de 3 µg/mL a 3x10-4 µg/mL (diluições 1/10). Para as células MDA-MB-231, apenas a concentração de 3 µg/mL foi usada para ambos os compostos. A se- guir, as células foram incubadas com um anticorpo de cabra anti-
humano secundário conjugado com Alexa 488 (BioLegend) e uma mancha viva/morta antes da análise em um instrumento BD LSRII. Barras de erro: SD (n=2). Os dados puros foram analisados em FlowJo (FlowJo).
[00523] No caso de ADC3 (descrito em maiores detalhes abaixo), as células BT-474 (expressando ErbB2) e MD-MB-231 (ErbB2- negativas) foram incubadas seja com ADC3 ou trastuzumab. Para as células BT-474, a concentração de todos os compostos variou de 3 µg/mL a 3x10-6 µg/mL (diluições 1/10). Para as células MDA-MB-231, apenas a concentração de 3 µg/mL foi usada para ambos os compos- tos. A seguir, as células foram incubadas com um anticorpo de Fc de IgG de rato anti-humano secundário conjugado com Alexa 488 (Bio- Legend) e uma mancha viva/morta antes da análise em um citômetro de fluxo Attune Nxt. Barras de erro: SD (n=2). Os dados puros foram analisados em FlowJo (FlowJo).
11.3.4 - Atividade citotóxica
[00524] As culturas em fase log de linhagens celulares SK-OV-3 (expressando ErbB2), SK-BR-3 (expressando ErbB2), BT-474 (ex- pressando ErbB2) e MDA-MB-231 (ErbB2 negativas) foram coletadas e as células colocadas em placas em densidades de cultura que vari- am de 1,500 a 12,000 células/poço em placas de microtitulação de 96 poços de acordo com as condições predeterminadas. Depois da incu- bação de um dia para o outro (a 37°C, 5% CO2 ou 0% CO2 para célu- las MDA-MB-231) para permitir a adesão celular e a reconstituição da proteína na superfície, diluições seriais de compostos de teste foram adicionadas (0,1 % de DMSO em concentração final para AF, AF-Arg e DM1; 5% de água de injeção para trastuzumab; 5% de PBS para ADC1 e ADC3) e as culturas incubadas adicionalmente durante 72, 96 ou 120 horas.
[00525] A avaliação do crescimento celular foi feita usando ensaio de redução com corante Alamar Blue (disponível da Thermo Fisher Scientific). Alamar Blue foi adicionado a células para constituir 10% do volume de cultura. As células foram incubadas por 4 a 6 horas, e a re- dução do corante foi medida por fluorescência em uma leitora de plac- as EnSpire (Perkin Elmer). As medições de fluorescência corrigidas anteriormente foram transformadas em escala % ao se considerer o valor de veículo como 100% de atividade (medições relativas). A se- guir, as medições relativas foram analisadas usando software GraphPad Prism para derivar IC50 relativo. Todos os experimentos foram feitos duas vezes com 3 réplicas por concentração. Barras de erro: SEM (n=3).
[00526] A citotoxicidade de AF e AF-Arg em células SK-OV-3 e SK- BR-3 que expressam ErbB2 depois de 72 e 120h de tratamento. As células SK-OV-3 e SK-BR-3 foram semeadas no dia antes do trata- mento em meio de cultura completo. Depois de descansar de um dia para o outro, as células foram tratadas com concentrações decrescen- tes de compostos de teste em meio de cultura completo (AF: 10 µM-1 pM; AF-Arg: 10 µM-1 pM, diluição em log).
[00527] A citotoxicidade de ADC1 e derivados (trastuzumab, AF-Arg e composto 2) em células SK-OV-3 e SK-BR-3 que expressam ErbB2 e células MDA-MB-231 ErbB2-negativas depois de 96h de tratamento. As células SK-OV-3, SK-BR-3 e MDA-MB-231 foram semeadas no dia antes do tratamento em meio de cultura completo. Depois de descan- sar de um dia para o outro, as células foram tratadas com concen- trações decrescentes de compostos de teste em meio de cultura com- pleto (Composto 2: 10 µM-1 pM; AF-Arg: 10 µM-1 pM; trastuzumab: 7,22 µM-0,72 pM; ADC1: 0,4 µM-0,04 pM, diluição em log).
[00528] A citotoxicidade de ADC3 e derivados (trastuzumab e DM1) em células BT-474 que expressam ErbB2 e células MDA-MB-231 ErbB2-negativas depois de 96h de tratamento. As células BT-474 e
MDA-MB-231 foram semeadas no dia antes do tratamento em meio de cultura completo. Depois de descansar de um dia para o outro, as células foram tratadas com concentrações decrescentes de compostos de teste em meio de cultura completo (DM1: 10 µM-1 pM;ADC3: 1 µM-
0.1 pM; trastuzumab: 7,215 µM - 1 pM, diluição em log).
11.3.5 - Razão de fármaco-anticorpo
[00529] A razão de fármaco-anticorpo (DAR) foi medida por RP-LC usando um sistema UPLC Waters Acquity equipado com uma bomba de liberação binária, um autoamostrador operando a 25°C, um forno de coluna e um detector de feixes de diodo (DAD) operando na faixa de 190-500 nm. Para separar as diferentes cadeias de ADC (cadeias pesadas e leves) uma coluna Thermo mAb pack RP (4µm 2,1x100mm) (Thermo Fisher Scientific AG, Sunnyvale, CA, USA) foi usada.
[00530] As amostras foram preparadas pela adição de 5 µL de uma solução 100 mM de ditiotreitol (DDT) a 45 µL de solução de ADC em 2,5 mg/mL em água para separar as cadeias leves e pesadas ligadas pelas pontes dissulfeto. A mistura foi então incubada por 1 hora a 30°C.
[00531] Um modo gradiente foi aplicado conforme descrito na tabela que segue (fase móvel A foi constituída de trifluoroacetato 0,1% (volume) em água e fase móvel B de trifluoracetato 0,1% (volume) em acetonitrila). t (min) vazão (mL/min) %A %B 0,0 0,6 73 27 13,0 0,6 60 40 13,1 0,6 73 27 16,0 0,6 73 27
[00532] A temperatura da coluna era de 90°C, o volume de injeção foi de 5 µL e os cromatogramas foram adquiridos a 280 nm. DAR foi então calculado usando AUC de cada pico.
[00533] A quantificação foi realizada por espectrometria UV usando uma leitora de microplacas BioTeck Synergy HT (BioTeck Instrument, Sursee, Suíça) e microplacas Greiner Bio-one (Huberlab, Aesch, Suíça).
[00534] Antes da quantificação da solução, uma comparação entre o espectro de absorvência em 280nm de ADC antes e depois da pu- rificação (com e sem o fármaco/carga útil livre, respectivamente) foi realizada para avaliar a interferência de absorvência de UV que existe entre mAb (por exemplo trastuzumab) e o fármaco.
[00535] Devido à absorvência de UV do fármaco (por exemplo, DM1) de ADC interferir com mAb (por exemplo, trastuzumab), a quan- tificação tem que ser realizada de acordo com a equação que segue levando em consideração ambas a resposta UV de mAb e fármaco:
[00536] onde:
[00537] > Ax corresponde à absorvência total no comprimento de onda x
[00538] > Axy corresponde à absorvência de UV no comprimento de onda x para a espécie y (mAb ou fármaco)
[00539] > xy corresponde ao coeficiente de refração molar no com- primento de onda x para a espécie y
[00540] > l corresponde à via ótica
[00541] > CmAb corresponde à concentração de ADC/mAb na solução.
[00542] Determinação de mAb e drug: duas curvas de calibração foram realizadas a 280 nm e 252 nm com 5 soluções de trastuzumab (respectivamente fármaco) de concentrações conhecidas. O mAb (re- spectivamente drug) foi então calculado usando a equação Lambert- Beer: Abs= x l x C.
[00543] Preparação da amostra: a solução de ADC (em água) foi primeiro centrifugada por 5 min a 21'500g. Então, a solução foi diluída com volume adequado de água para corresponder à faixa de concen- tração da curva de calibração. A solução diluída foi então centrifugada por 5 min a 21'500g. 200 µL de sobrenadante foram então dispensa- dos em uma microplaca UV para análise de UV. Exemplo 1: Preparação de compostos de fórmula (I) ou (I')
[00544] Os compostos descritos no presente documento foram preparados ao se usar SPPS baseado em Fmoc padrão, incluindo o acoplamento de peptídeo em resina e estratégias convergentes con- forme mostrado nas Figuras 11 a 17 e nas Figuras 36 a 41. Os com- postos preparados no Exemplo 1 são mostrados na Tabela 1 abaixo. Tabela 1: Compostos de fórmula (I)/(I') Composto Estrutura 1 AF-Arg-Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-Phe-OH 2 AF-Arg-Lys(PEG4-Mal)-Phe-OH 3 AF-Arg-Phe-Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-OH 4 AF-Arg-Phe-Lys(PEG4-Mal)-OH 5 DM1-Mal-Phe-Lys-Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-Phe-OH 6 DM1-Mal-Phe-Cit-Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-Phe-OH 7 DM1-Mal-Phe-Cit-Phe-Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-OH 19 AF-Cit-Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-Phe-OH 20 ACit-Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-Phe-OH 21 ACit-Phe-Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-OH 22 DM1-Mcc-Phe-Cit-Lys(PEG5-Ma-Cys-Ac)-Tyr-OH 23 DM1-Mcc-Cit-Lys(PEG5-Ma-Cys-Ac)-Tyr-OH 24 DM1-Mcc-Phe-Lys(PEG5-Ma-Cys-Ac)-Tyr-OH
[00545] Os peptídeos foram preparados por SPPS baseado em Fmoc padrão usando um sintetizador de peptídeos automatizado Ac- tive P-11 (disponível da Activotec), e uma resina Fmoc-Xxx-Wang (Xxx: aminoácido C-terminal; carregamento: 0,60 mmol/g; Bachem) conforme mostrado nas Figs. 11-17 e nas Figs. 36-41.
[00546] As reações de acoplamento para a formação de ligação amida foram realizadas durante 30 min em temperatura ambiente usando 3 eq de Fmoc-aminoácidos, Fmoc-NH-PEG4-COOH ou Fmoc- NH-PEG5-COOH ativado com HBTU (2,9 eq) na presença de DIEA (7 eq). A desproteção de Fmoc foi conduzida com uma solução de 20% de piperidina em DMF. A remoção seletiva do grupo protetor de cadeia lateral Mtt (Lys) foi realizada usando DCM/TFA/TIS (94/1/5, v/v/v).
[00547] Para a síntese dos compostos 1 a 4 e 19, Auristatina F (AF) foi acoplada depois da remoção de Fmoc pela condensação de frag- mentos (3 eq AF; 2,9 eq HBTU, 7 eq DIEA) durante 30 min. Para a sín- tese dos compostos 20 e 21, Auristatina Cit (ACit) foi acoplada depois da remoção de Fmoc em condições idênticas (3 eq ACit; 2,9 eq HBTU, 7 eq DIEA).
[00548] Para a síntese dos compostos 1 a 4 e 19 a 21, o derivado Mal-PEG4-NHS foi adicionado em resina por 30 min (3 eq de Mal- PEG4-NHS, 7 eq DIEA) depois da remoção de Mtt por DCM/TFA/TIS (94/1/5, v/v/v). Depois, para os compostos 1, 3, 19, 20 e 21, o resíduo de maleimida na cadeia PEG foi reagido na resina com acetil-cisteína (Ac-Cys-OH) através da ligação quimiosseletiva (3 eq of Ac-Cys-OH, DIEA, 7 eq) durante 20 min. Os peptídeos foram clivados a partir da desproteção de cadeia lateral simultânea do ligante de resina através do tratamento com TFA/TIS/água (95/2.5/2.5, v/v/v) durante 60 min. Depois da concentração da mistura de clivagem, os peptídeos brutos foram precipitados com dietil éter frio e centrifugados (Fig. 11-14 e Fig. 36-38).
[00549] Para a síntese dos compostos 5 a 7, o derivado Mal-PEG4- NHS foi adicionado em resina por 30 min (3 eq de Mal-PEG4-NHS, 7 eq DIEA) depois da remoção de Mtt por DCM/TFA/TIS (94/1/5, v/v/v). Depois, o resíduo de maleimida na cadeia PEG foi reagido na resina com acetil-cisteína (Ac-Cys-OH) através da ligação quimiosseletiva entre maleimida e tiol (3 eq de Ac-Cys-OH, DIEA, 7 eq) durante 20 min. O derivado de Mal foi inserido através da adição da porção Mal- NHS ao N-terminal de Phe depois da desproteção de Fmoc. Os pep- tídeos foram clivados a partir da desproteção de cadeia lateral sim- ultânea do ligante de resina através do tratamento com TFA/TIS/água (95/2.5/2.5, v/v/v) during 60 min. Depois da concentração da mistura de clivagem, os peptídeos brutos foram precipitados com dietil éter frio e centrifugados. Depois, mertansina (DM1, 1.45 eq) foi reagida com o grupo maleimida terminal através da ligação quimiosseletiva em tampão PBS a pH 7,4 e acetonitrila (razão 2:1) (Figs. 15-17).
[00550] Para a síntese dos compostos 22 a 24, o derivado Ma-NHS foi adicionado em resina por 30 min (3 eq de Mal-NHS, 7 eq DIEA) de- pois da remoção de Fmoc. Depois, o resíduo de maleimida foi reagido em resina com acetil-cisteína (Ac-Cys-OH) através da ligação quimiosseletiva (3 eq de Ac-Cys-OH, DIEA, 7 eq) durante 20 min. Os peptídeos foram clivados a partir da desproteção de cadeia lateral simultânea do ligante de resina através do tratamento com TFA/TIS/água (95/2.5/2.5, v/v/v) durante 60 min. Depois da concen- tração da mistura de clivagem, os peptídeos brutos foram precipitados com dietil éter frio e centrifugados. Depois da sua purificação, o derivado DM1-smcc (1,1 eq) foi regido ao N-terminal do ligante em solução em DMF e 4-metilmorfolina (6 eq) por 4h (Figs. 39-41).
[00551] Os peptídeos foram purificados em um sistema HPLC de autopurificação Waters acoplado ao espectrômetro de massa SQD com uma coluna prep XSelect Peptide CSH C18 OBD (130 Å, 5µm, 19 mm x 150 mm) usando sistema solvente A (0,1% de TFA em água) e B (0,1% de TFA em acetonitrila) em uma taxa de vazão de 24 mL/min e um gradiente de 20-60% de B durante 30 min.
[00552] As frações apropriadas foram concentradas e liofilizadas. A pureza foi determinada em um sistema Waters Acquity UPLC acoplado ao espectrômetro de massa SQD com uma coluna CSH C18 (130 Å;
1,7µm; 2,1 mm x 50 mm) usando sistema solvente A (0,1% de FA em água) e B (0,1% de FA em acetonitrila) em uma taxa de vazão de 0,6 mL/min e um gradiente de 5-85% de B durante 5 min ou coluna CSH Floro-fenila (130 Å; 1,7µm; 2,1 mm x 50 mm) usando sistema solvente A (0,1% de FA em água) e B (0,1% de FA em acetonitrila) em uma taxa de vazão de 0,9 mL/min e um gradiente de 5-95% de B durante 2,9 min.
[00553] A análise MS foi realizada usando interface de ionização por eletropulverização (ESI) em modo positivo e negativo. Os resulta- dos da análise dos compostos obtidos no Exemplo 1 são mostrados na Tabela 2 abaixo. Tabela 2: Análise dos compostos 1-7 e 19-24 Com- Fórmula Pureza Pm [M+2H+]+2 [M+3H+]+3 posto (%) 1 C86H139N15O23S 94 1783,2 892,8 595,6 2 C79H126N14O19 96 1575,9 789,0 526,7 3 C84H135N15O22S 90 1739,1 870,8 581,0 4 C79H126N14O19 98 1575,9 789,3 526,7 5 C95H132ClN13O29S2 98 2019,7 1011,5 674,5 6 C95H131ClN14O30S2 97 2048,7 1025,6 683,8 7 C95H131ClN14O30S2 94 2048,7 1026,1 685,0 19 C84H135N15O22S 90 1739,2 871,9 581,6 20 C75H125N13O22S 96 1592,9 798,3 532,2 21 C75H125N13O22S 96 1592,9 798,4 532,1 22 C101H141ClN14O32S2 99 2162,9 1082,2 721,9 23 C92H132ClN13O31S2 89 2015,7 1008,7 673,0 24 C95H130ClN11O30S2 89 2005,7 - 669,0 Exemplo 2: Preparação de compostos de fórmula (II) ou (II')
[00554] Os compostos descritos no presente documento foram preparados usando SPPS baseado em Fmoc padrão, incluindo acoplamento peptídico em resina e estratégias convergentes conforme mostrado nas Figs. 18- 26 e nas Figs. 42-45. Os compostos prepara-
dos no Exemplo 2 são mostrados na Tabela 3 abaixo. Tabela 3: Compostos de fórmula (II)/(II') Composto Estrutura 8 Arg-PEG4-Phe-Arg-Glu(Sar-OCPT)-Phe-OH 9 Arg-PEG4-Phe-Arg-Dap(CO-CPT)-Phe-OH 10 Arg-PEG4-Phe-Arg-Dab(CO-CPT)-Phe-OH 11 Arg-PEG4-Phe-Arg-Ser(CO-CPT)-Phe-OH 12 Ac-Cys-Mal-PEG4-Phe-Lys-Lys(Mal-DM1)-Phe-OH 13 Ac-Cys-Mal-PEG4-Phe-Lys-Lys(AF)-Phe-OH 14 Mal-PEG4-Phe-Lys-Lys(AF)-Phe-OH 15 Arg-PEG4-Phe-Arg-Glu(Sar-OCPT)-Arg-OH 16 Arg-PEG4-Phe-Arg-Glu(Sar-OCPT)-Arg-Phe-Arg-OH 25 Ac-Cys-Ma-PEG5-Phe-Cit-Lys(Mcc-DM1)-Cit-OH 26 Ma-PEG5-Phe-Cit-Lys(Mcc-DM1)-Cit-OH 27 Ac-Cys-Ma-PEG5-Phe-Cit-Lys(Mcc-DM1)-Tyr-OH 28 Ac-Cys-Mal-PEG4-Phe-Lys-Lys(Mal-DM1)-Phe-Phe-Lys-
OH
[00555] Os peptídeos foram preparados através de SPPS baseado em Fmoc padrão usando um sintetizador peptídico automatizado Ac- tive P-11 (disponível da Activotec), e uma resina Fmoc-Xxx-Wang (Xxx: aminoácido C-terminal; carregamento: 0,60 mmol/g; Bachem) conforme mostrado nas Figs. 18-26 e nas Figs. 42-45.
[00556] As reações de acoplamento para a formação da ligação amida foram realizadas durante 30 min em temperatura ambiente usando 3 eq de Fmoc-aminoácidos, Fmoc-NH-PEG4-COOH ou Fmoc- NH-PEG5-COOH ativados com HBTU (2,9 eq) na presença de DIEA (7 eq). A desproteção de Fmoc foi conduzida com uma solução de 20% de piperidina em DMF. A remoção seletiva do grupo protetor de cadeia lateral Mtt (Lys) foi realizada usando DCM/TFA/TIS (94/1/5, v/v/v).
[00557] Para a síntese do composto 8, 15 e 16, ácido glutâmico foi acoplado como Fmoc-Glu(PhiPr)-OH e o resíduo N-terminal Arg foi introduzido como Boc-Arg(Pbf)-OH. O grupo protetor de cadeia lateral
PhiPr foi seletivamente removido na presença de grupos protetores de cadeia lateral Boc/Pbf através do tratamento com 1 % (v) TFA em DCM. O acoplamento em resina de H-Sar-OCPT foi conduzido usando 1,5 eq Sar-OCPT/ 1,4 eq HATU/ 4 eq DIEA em DMF por 90 min (Figs. 18 e 25-26).
[00558] Para a síntese dos compostos 9 e 10, os resíduos Dap e Dab foram introduzidos como Fmoc-Dap(Mtt)-OH e Fmoc-Dab(Mtt)- OH, respectivamente. O grupo protetor de cadeia lateral Mtt foi se- letivamente removido usando 1 % (v) de TFA em DCM. A formação da ligação carbamato com CPT foi conduzida usando 1,5 eq de CPT-PNP preparada conforme descrito (Pessah et al. Bioorg & Med Chem, 2004,12,1-8) e 4 eq de DIEA em DCM por 30 min (Figs. 19-20).
[00559] Para a síntese do composto 11, Ser foi introduzido como Fmoc-Ser(Trt)-OH e o grupo protetor Trt foi seletivamente removido usando DCM/TFA/TIS (94/1/5, v/v/v). A formação da ligação carba- mato com CPT foi conduzida usando 1,5 eq de CPT-PNP e DMAP/DIEA (1 eq) em DCM durante 12 h (Fig. 21).
[00560] Para a síntese do composto 12 e 28, o derivado Mal-PEG4- NHS foi adicionado em resina por 30 min (3 eq de Mal-PEG4-NHS, 7 eq DIEA) depois da desproteção de Fmoc ser conduzida com uma solução de 20% de piperidina em DMF. Depois, o resíduo de ma- leimida na cadeia PEG foi reagido em resina com acetil-cisteína (Ac- Cys-OH) através da ligação quimiosseletiva entre maleimida e tiol (3 eq de Ac-Cys-OH, DIEA, 7 eq) durante 20 min. Depois, o derivado Mal foi inserido ao se adicionar a porção Mal-NHS ao grupo ε-amino de Lys depois da remoção de Mtt por DCM/TFA/TIS (94/1/5, v/v/v). Os peptídeos foram clivados a partir da desproteção de cadeia lateral simultânea do ligante de resina através do tratamento com TFA/TIS/água (95/2.5/2.5, v/v/v) during 60 min. Depois da concen- tração da mistura de clivagem, os peptídeos brutos foram precipitados com dietil éter frio e centrifugados. Depois, mertansina (DM1, 1.45 eq) foi reagida com o grupo maleimida terminal através da ligação quimiosseletiva em tampão PBS pH 7,4 e acetonitrila (razão 2:1) (Figs. 22 e 45).
[00561] Para a síntese dos compostos 13 e 14, AF foi acoplado por condensação de fragmento (3 eq de AF, 2,9 eq de HBTU, 7 eq de DIEA) em resina ao N-terminal do resíduo Lys depois da remoção de Mtt com DCM/TFA/TIS (94/1/5, v/v/v). Mal-PEG4-NHS foi adicionado em resina por 30 min (3 eq de Mal-PEG4-NHS, 7 eq de DIEA) depois da remoção de Fmoc. Para o composto 13, o resíduo de maleimida na cadeia PEG foi reagido em resina com acetil-cisteína (Ac-Cys-OH) at- ravés da ligação quimiosseletiva entre maleimida e tiol (3 eq de Ac- Cys-OH, DIEA, 7 eq) durante 20 min (Figs. 23-24).
[00562] Para a síntese dos compostos 25 a 27, o derivado Ma-NHS foi adicionado em resina por 30 min (3 eq de Mal-NHS, 7 eq de DIEA) depois da desproteção com Fmoc conduzida com uma solução de 20% de piperidina em DMF. Depois, Os peptídeos foram clivados a partir da desproteção de cadeia lateral simultânea do ligante de resina através do tratamento com TFA/TIS/água (95/2.5/2.5, v/v/v) during 60 min. Depois da concentração da mistura de clivagem, os peptídeos brutos foram precipitados com dietil éter frio e centrifugados. Depois da sua purificação, o derivado DM1-smcc (1,1 eq) foi reagido ao N- terminal do ligante em solução em DMF e 4-metilmorfolina (6 eq) por 4h. Para os compostos 25 e 27, o resíduo de maleimida foi reagido com acetil-cisteína (Ac-Cys-OH) (20 eq) em acetonitrila e DPBS (razão 1:1) por 6h (Figs. 42 a 44).
[00563] Os peptídeos foram purificados e analisados da mesma maneira e usando o mesmo equipamento conforme descrito no Exem- plo 1 acima. Os resultados da análise dos compostos obtidos no Ex- emplo 2 são mostrados na Tabela 4 abaixo.
Tabela 4: Análise dos compostos 8-16 e 25-28 Composto Fórmula Pureza pm [M+H+]+ [M+2H+]+2 [M+3H+]+3 (%) 8 C71H95N15O18 94 1446,6 1447,9 724,2 483,7 9 C67H89N15O17 96 1376,6 - 689,2 459,8 10 C68H91N15O17 83 1390,5 1391,0 696,4 464,6 11 C67H88N14O18 90 1377,5 1378,2 689,8 460,3 12 C95H132ClN13O29S2 94 2019,7 - 1010,4 674,3 13 C93H144N14O23S 98 1858,3 1859,0 931,0 620,7 14 C88H135N13O20 95 1695,1 - 848,8 566,4 15 C68H98N18O18 95 1455,6 - 729,0 486,5 16 C83H118N23O20 96 1759,0 - 880,9 587,7 25 C98H143ClN16O32S2 94 2156,9 - 1080,5 720,1 26 C96H134ClN15O29S 97 1993,7 1994,6 988,4 665,7 27 C101H141ClN14O32S2 80 2162,9 - 1083,0 721,9 28 C110H153ClN16O31S2 94 2295,1 - 1148,6 765,9 Exemplo 3: Preparação de compostos de fórmula (II) para múltipla liberação de fármacos
[00564] Os compostos descritos no presente documento foram preparados usando SPPS baseado em Fmoc padrão, incluindo acoplamento peptídico em resina e estratégias convergentes conforme mostrado nas Figs. 27 e 28 e nas Figs. 46 e 47. Os compostos prepar- ados no Exemplo 3 são mostrados na Tabela 5 abaixo. Tabela 5: Compostos de fórmula (II) adequados para múltipla liberação de fármacos Composto Estrutura 17 Arg-PEG4-Phe-Arg-[Glu(Sar-OCPT)-Phe]2-OH 18 Arg-PEG4-[Phe-Arg-Glu(Sar-OCPT)-Arg]2-OH 29 Ac-Cys-Mal-PEG4-[Phe-Lys-Lys(Mal-DM1)-Phe]2-OH 30 Ac-Cys-Mal-PEG4-Phe-Arg-Lys(Mal-DM1)-Arg-Lys(AF)- Phe-OH
[00565] Para a síntese dos compostos 17 e 18, o ácido glutâmico foi acoplado como Fmoc-Glu(PhiPr)-OH e o resíduo N-terminal Arg foi introduzido como Boc-Arg(Pbf)-OH. O grupo protetor da cadeia lateral de PhiPr foi seletivamente removido na presença de grupos protetores de cadeia lateral Boc/Pbf através do tratamento com 1 % (v) de TFA em DCM. O acoplamento da resina de H-Sar-OCPT foi conduzido usando 1,5 eq de Sar-OCPT (1,4 eq) de HATU (4 eq) de DIEA em DMF por 90 min.
[00566] Os peptídeos foram clivados a partir da desproteção de cadeia lateral simultânea do ligante de resina através do tratamento com TFA/TIS/água (95/2.5/2.5, v/v/v) during 60 min. Depois da con- centração da mistura de clivagem, os peptídeos brutos foram precip- itados com dietil éter frio e centrifugados (Figs. 27-28).
[00567] Para a síntese do composto 29, o derivado Mal-PEG4-NHS foi adicionado em resina por 30 min (3 eq de Mal-PEG4-NHS, 7 eq de DIEA) depois da desproteção de Fmoc conduzida com uma solução de 20% de piperidina em DMF. Depois, o resíduo de maleimida na cadeia PEG foi reagido em resina com acetil-cisteína (Ac-Cys-OH) através da ligação quimiosseletiva entre maleimida e tiol (3 eq de Ac-Cys-OH, DIEA, 7 eq) durante 20 min. Depois, o derivado de Mal foi inserido at- ravés da adição da porção Mal-NHS ao grupo ε-amino de Lys depois da remoção de Mtt por DCM/TFA/TIS (94/1/5, v/v/v). O peptídeo foi clivado a partir da desproteção de cadeia lateral simultânea do ligante de resina através do tratamento com TFA/TIS/água (95/2.5/2.5, v/v/v) durante 60 min. Depois da concentração da mistura de clivagem, os peptídeos brutos foram precipitados com dietil éter frio e centrifugados. Depois, mertansina (DM1, 2,9 eq) foi reagida com o grupo de ma- leimida terminal através da ligação quimiosseletiva em tampão PBS pH 7,4 e acetonitrila (razão 2:1) (Fig. 46).
[00568] Para a síntese do composto 30, o derivado Mal-PEG4-NHS foi adicionado em resina por 30 min (3 eq de Mal-PEG4-NHS, 7 eq de DIEA) depois da desproteção de Fmoc conduzida com uma solução de 20% de piperidina em DMF. Depois, o resíduo de maleimida na cadeia
PEG foi reagido em resina com acetil-cisteína (Ac-Cys-OH) através da ligação quimiosseletiva entre maleimida e tiol (3 eq de Ac-Cys-OH, DIEA, 7 eq) durante 20 min. AF foi então acoplada através da conden- sação de fragmentos (3 eq de AF; 2,9 eq de HBTU, 7 eq de DIEA) em resina ao resíduo Lys depois da remoção de Mtt com DCM/TFA/TIS (94/1/5, v/v/v). O derivado Mal foi inserido através da adição da porção Mal-NHS à cadeia lateral de Lys depois da remoção de Boc por DCM/TMSOTf/TEA (97/1/2, v/v/v). O peptídeo foi clivado a partir da desproteção de cadeia lateral simultânea do ligante de resina através do tratamento com TFA/TIS/água (95/2.5/2.5, v/v/v) during 60 min. De- pois da concentração da mistura de clivagem, os peptídeos brutos foram precipitados com dietil éter frio e centrifugados. Depois, mertan- sina (DM1; 1,45 eq) foi reagida com o grupo N-terminal maleimida at- ravés da ligação quimiosseletiva em tampão PBS a pH 7,4 e acetoni- trila (razão 2:1) (Fig. 47).
[00569] Os peptídeos foram purificados e analisados da mesma maneira usando o mesmo equipamento conforme descrito no Exemplo 1 acima. Os resultados da análise dos compostos obtidos no Exemplo 3 são mostrados na tabela 6 abaixo. Tabela 6: Análise dos compostos 17-18 e 29-30 Com- Fórmula Pureza pm [M+2H+]+2 [M+3H+]+3 posto (%) 17 C117H157N31O28 91 2445,7 - 816,7 18 C108H130N20O26 96 2124,3 1064,0 709,7 29 C167H227Cl2N23O46S2 89 3459,8 1731,6 1154,1 30 C147H222ClN27O37S2 90 3059,1 1530,6 1021,6 Exemplo 4: Preparação de compostos de fórmula (I) para múltipla liberação de fármacos
[00570] Os compostos descritos no presente documento foram preparados usando SPPS baseado em Fmoc padrão, incluindo acoplamento peptídico e estratégias convergentes conforme mostrado nas Figs. 48 e 49. Os compostos preparados no Exemplo 4 são mostrados na tabela 7 abaixo. Tabela 7: Compostos de fórmula (Ia)/(Ia1) adequados para múltipla lib- eração de fármacos; Y= ligação covalente entre porção T e a unidade de fármaco-ligante, por exemplo através da química click (formação da porção triazol) Composto Estrutura 31 AF-Cit-Lys(Mal-DM1)-Phe-Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)- Phe-OH 32 Ac-Cys-Mal-[PEG5-Lys(AF-Cit-Lys(Y)-Phe-OH)]2-Gly- NH2
[00571] Para a síntese dos compostos 31, a auristatina F (AF) foi acoplada depois da remoção de Fmoc através da condensação de fragmentos (3 eq de AF, 2,9 eq de HBTU, 7 eq de DIEA). Depois, o derivado Mal-PEG4-NHS foi adicionado em resina por 30 min (3 eq de Mal-PEG4-NHS, 7 eq de DIEA) depois da remoção de Mtt através de DCM/TFA/TIS (94/1/5, v/v/v). Depois, o resíduo de maleimida na cadeia PEG foi reagido na resina com acetil-cisteína (Ac-Cys-OH) at- ravés da ligação quimiosseletiva entre maleimida e tiol (3 eq de Ac- Cys-OH, DIEA, 7 eq) durante 20 min. O derivado Mal foi inserido pela adição da porção Mal-NHS à cadeia lateral de Lys depois da remoção de Boc por DCM/TMSOTf/TEA (97/1/2, v/v/v).
[00572] O peptídeo foi clivado a partir da resina através de trata- mento com TFA/TIS/água (95/2.5/2.5, v/v/v) durante 60 min. Depois da concentração da mistura de clivagem, o peptídeo bruto foi precipitado com dietil éter frio e centrifugado. Depois, mertansina (DM1, 1,45 eq) foi reagida com o grupo de maleimida N-terminal através da ligação quimiosseletiva em tampão PBS a pH 7,4 e acetonitrila (razão 2:1) (Fig. 48).
[00573] Para a síntese do composto 32, os peptídeos Ac-Cys-Mal- [PEG5-Lys(Poc)]2-Gly-NH2 (porção T) e AF-Cit-Lys(N3)-Phe-OH (fár-
maco-ligante) foram preparados de acordo com protocolos descritos no Exemplo 1 e 2. Derivados Fmoc-Lys(Poc)-OH e Fmoc-Lys(N3)-OH foram usados como componentes de alquina e azida para a química click. Para esta finalidade, Ac-Cys-Mal-[PEG5-Lys(Poc)]2-Gly-NH2 (1 eq) foi acoplado em solução a AF-Cit-Lys(N3)-Phe-OH (1 eq) seguindo química click padrão (Fig. 49).
[00574] Os peptídeos foram purificados e analisados conforme descrito no Exemplo 1 acima. Os resultados da análise dos compostos obtidos no Exemplo 4 são mostrados na tabela 8 abaixo. Tabela 8: Análise dos compostos 31-32 Com- Fórmula Pureza Pm [M+2H+]+2 [M+3H+]+3 posto (%) 31 C167H227Cl2N23O46S2 89 3459,8 1731,6 1154,1 32 C182H292N36O49S 85 3800,5 1901,8 1268,2 Exemplo 5: Estudo de clivagem induzido por Cat B usando com- postos 1 a 7, 19, 22 e 23 (fórmula I/I')
[00575] A propensão dos compostos 1-7 e 19-23 (fórmula (I)/(I')) para serem clivados por Catepsina B foi avaliada usando o ensaio de clivagem enzimática in vitro descrito acima. Os resultados são dados na Tabela 9 abaixo e mostrados nas Figs. 29-31. Tabela 9: Estudo de clivagem induzido por Cat B dos compostos de fórmula (I)/(I') (composto de referência: Cys-MC-Val-Cit-PABC-MMAF) Composto Composto Referência Razão T1/2 T1/2 (composto T1/2/ (min) (min) referência T1/2) 1 1,5 12,9 0,12 3 1,4 12,9 0,11 5 0,6 10,9 0,05 6 0,3 13,1 0,02 7 1,2 13,1 0,09 19 1,1 12,6 0,09 22 0,06 11,4 0,005 23 0,0004 11,4 0,00004
[00576] A partir desses resultados, fica aparente que a clivagem de exo-Cat B e a liberação de fármacos (AF-Arg, AF-Cit, ACit, DM1-Mal- Phe-Lys, DM1-Mal-Phe-Cit, DM1-Mcc-Phe-Cit) nos compostos de fór- mula (I)/(I') ocorreram simultaneamente e foram muito rápidas. Por ex- emplo, a liberação do fármaco induzida por Cat B a partir do composto 5 ocorreu 20 vezes mais rápido quando comparado ao composto PABC de referência Cys-MC-Val-Cit-PABC-MMAF. A rápida cinética de clivagem alcançada por compostos 1-7, 19 e 22-23 demonstra que os compostos da presente invenção exibem alta seletividade e afini- dade de ligação para a atividade da exopeptidase de Catepsina B. Além disso, verificou-se surpreendentemente que a presença de uma porção Ac-Cys-PEG4 na cadeia lateral do resíduo Lys (corre- spondendo ao resíduo Axx na fórmula (I ou I')) não teve nenhum efeito prejudicial na afinidade de ligação dos compostos para Cat B. Esses resultados também indicam que, em constraste, a clivagem pelo me- canismo baseado em endopeptidase de Cat B conforme realizado nos sistemas ligantes de PABC (por exemplo, composto de referência) ocorre em taxas significativamente mais lentas. Como exemplos no- táveis específicos, os compostos 22 e 23 são espontaneamente cliva- dos por exo-Cat B (T ½ < 1 min), demonstrando as propriedades de ligação altamente favoráveis dos substratos baseados na fórmula (I); acredita-se que a interação favorável entre o Tyr C-terminal e o laço oclusivo de Cat B continua fortemente na taxa de clivagem rápida ob- servada nesses compostos. Exemplo 6: Estudo de clivagem induzido por Cat B usando com- postos 8-13 e 27-28 (fórmula II)
[00577] A propensão dos compostos 8-13 e 27-28 (fórmula (II)) a ser clivada por catepsina B foi avaliada usando o ensaio de clivagem enzimático in vitro descrito acima. Os resultados são dados na Tabela 10 abaixo e mostrados nas Figs. 32 e 50.
Tabela 10: Estudo de clivagem induzido por Cat B dos compostos de fórmula (II)/(II') (composto de referência: Cys-MC-Val-Cit-PABC- MMAF) Composto Composto Referência Razão T1/2 T1/2 (composto T1/2/ (min) (min) referência T1/2) 8 2,2 11,6 0,19 9 4,5 7,2 0,63 10 0,9 10,2 0,1 11 2,2 11,1 0,2 12 1,5 10,9 0,14 13 1,6 10,7 0,15 27 0,06 11,4 0,005 28 0,3 10,7 0,03
[00578] Esses resultados demonstram que a clivagem induzida por Cat B a partir dos compostos 8-13 carregando o sítio de ligação ao ve- tor no N-terminal do sistema ligante foi muito rápida. As taxas de clivagem até 10 vezes mais rápidas comparado com o sistema ligante de PABC de referência foram observadas, indicando assim que os compostos 8-13 foram clivados pelo mecanismo da exopeptidase de Cat B. Surpreendentemente, a presença de porções de fármaco ester- icamente exigentes tais como CPT, DM1 ou AF na cadeia lateral do resíduo Bxx na fórmula (II) não teve nenhum efeito prejudicial nas tax- as de clivagem observadas, indicando que as porções estericamente exigentes foram direcionadas fora da ranhura de ligação de Cat B. No composto 8, a lliberação de fármaco (CPT) ocorre através da hidrólise catalisada de ácido ou enzima (esterase), enquanto que os compostos 9 e 11 podem sofrer aminólise intramolecular (formação de ureia cícli- ca ou carbamato) para a liberação de CPT. Mais notavelmente, nos compostos 12 e 13, a porção farmacologicamente ativa - isto é H- Lys(Mal-DM1)-Phe-OH ou H-Lys(AF)-Phe-OH – foi liberada simultane-
amente pela clivagem induzida por Cat B.
[00579] O composto 27 demonstra a importância do resíduo C- terminal mediante a taxa de clivagem. Conforme observado acima, Tyr (no composto 27) é propenso a interações favoráveis (presumidamen- te através da ligação a H) levando à clivagem muito rápida através da atividade da exopeptidase de Cat B (ca 2300 vezes mais rápida do que comparada com a referência de PABC). Exemplo 7: Estudo de clivagem induzido por Cat B usando com- postos multiméricos (liberando múltiplos fármacos) como pela fórmula (II)
[00580] A propensão dos compostos multiméricos 17-18 e 29-30 (fórmula (II)) a ser clivada pela catepsina B foi avaliada usando o ensaio de clivagem enzimática in vitro descrito acima. Os resultados são mostrados nas Figuras 33-34 e nas Figuras 51-52.
[00581] Conforme mostrado na Figura 33, a clivagem do composto induzida por Cat B17 rapidamente liberou a unidade de fármaco dipep- tídica C-terminal Glu(Sar-OCPT)-Phe-OH e o composto 8 como um intermediário, indicando que a clivagem ocorreu de acordo com o me- canismo da exopeptidase de Cat B. Por sua vez, o composto 8 foi rap- idamente clivado para liberar a unidade de fármaco dipeptídica C- terminal H-Glu(Sar-OCPT)-Phe-OH. Cada unidade de fármaco dipep- tídica H-Glu(Sar-OCPT)-Phe-OH pode por sua vez sofrer a hidrólise catalisada por ácido ou enzima para liberar CPT nativa.
[00582] Conforme mostrado na Figura 34, a clivagem do composto induzida por Cat B 18 rapidamente liberou a unidade de fármaco di- peptídica C-terminal H-Glu(Sar-OCPT)-Arg-OH e o composto 16 como um primeiro intermediário, o qual por sua vez rapidamente clivou atra- vés do mecanismo de exo-Cat B para liberar o composto 15 como um Segundo intermediário. A clivagem do composto induzida por Cat B15 libera uma segunda unidade de fármaco dipeptídica C-terminal H-
Glu(Sar-OCPT)-Arg-OH. Cada unidade de fármaco dipeptídica H- Glu(Sar-OCPT)-Phe-OH pode por sua vez sofrer a hidrólise catalisada por ácido ou enzima para liberar CPT nativa. Devido à identificação dos compostos intermediários esperados (HPLC e MS/MS), a clivagem seletiva de acordo com o mecanismo da exopeptidase de Cat B po- deria ser estabelecida.
[00583] Conforme mostrado na Figura 51, a clivagem do composto induzida por Cat B29 rapidamente (ca 5 vezes comparado com o sistema de referência de PABC) liberou a unidade de fármaco dipep- tídica C-terminal H-Lys(Mal-DM1)-Phe-OH e o composto 28 como um primeiro intermediário, o qual por sua vez rapidamente clivou através do mecanismo de exo-Cat B para liberar o composto 12 como um se- gundo intermediário. A clivagem do composto induzida por Cat B12 libera a segunda unidade de fármaco dipeptídica H-Lys(Mal-DM)-Phe- OH. Novamente, a identificação do compostos intermediários espera- dos permite o estabelecimento da clivagem seletiva e rápida de acordo com o mecanismo da exopeptidase de Cat B.
[00584] Conforme mostrado na Figura 52, a clivagem do composto induzida por Cat B30 rapidamente liberou a unidade de fármaco dipep- tídica C-terminal H-Lys(AF)-Phe-OH. Depois desta etapa de clivagem muito rápida (mais de 10 vezes comparado com o sistema de referên- cia de PABC), o fármaco-ligante intermediário contendo uma Arg C- terminal (resíduo Byy) foi clivado moderadamente rápido (T ½ < 30 min) para liberar a segunda unidade de fármaco dipeptídica (diferente) H-Lys(Mal-DM1)-Arg-OH. A clivagem sequencial dos fármacos dipep- tídicos claramente demonstra a clivagem seletiva pela atividade da ex- opeptidase de Cat B.
[00585] Os resultados para os compostos 29 e 30 são dados na Tabela 11.
Tabela 11: Estudo de clivagem induzido por Cat B dos compostos 29 e 30 liberando múltiplos fármacos como pela fórmula (II) (composto de referência: Cys-MC-Val-Cit-PABC-MMAF) Composto Composto Referência Razão T1/2 T1/2 (composto T1/2/ (min) (min) referência T1/2) 29 2,4 10,7 0,23 30 1,1 15,4 0,07 Exemplo 8: Estudo de clivagem induzido por Cat B usando com- postos multiméricos (fórmula (I) e (I'))
[00586] A propensão dos compostos multiméricos 31-32 (fórmula (Ia e Ia1)) a serem clivados por Cat B foi avaliada usando o ensaio de clivagem enzimática in vitro conforme descrito acima. Os resultados são dados na Tabela 12 e são mostrados nas Figuras 53-54. Tabela 12: Estudo de clivagem induzido por Cat B dos compostos liberando múltiplos fármacos como pela fórmula (Ia) e (Ia1) (composto de referência: Cys-MC-Val-Cit-PABC-MMAF) Composto Composto Referência Razão T1/2 T1/2 (composto T1/2/ (min) (min) referência T1/2) 31 1,08 12,7 0,08 32 0,98 15,4 0,06
[00587] Conforme mostrado na Figura 53, a clivagem do composto induzida por Cat B31 rapidamente liberou a unidade dipeptídica C- terminal, isto é o vetor contendo H-Lys(PEG4-Mal-Cys-Ac)-Phe-OH. Depois desta etapa de clivagem muito rápida (mais de 10 vezes com- parado com o sistema de referência de PABC), o fármaco-ligante du- plo intermediário foi clivado para liberar simultaneamente os diferentes fármacos AF-Cit e H-Lys(Mal-DM1)-Phe-OH, novamente provando o mecanismo da clivagem de exo-Cat B.
[00588] Conforme mostrado na Figura 54, a clivagem do composto induzida por Cat B 32 rapidamente liberou o fármaco AF-Cit (taxa de clivagem ca 20 vezes comparado com o sistema de referência de PABC). Mais notavelmente, a liberação das 2 porções de fármaco AF- Cit ocorreu quase espontaneamente, confirmando que o sistema ligante é adequado para aumentar os valores de DAR em ADCs. Os dados confirmam a função dupla e sinergística de fórmula (I) e (Ia1), isto é permitindo a rápida liberação de fármaco devido ao ligante de fórmula (I) e aumentando a solubilidade em água devido ao efeito sol- ubilizador da porção de fórmula (Ia1). Exemplo 9 – Atividade citotóxica de AF-Arg e AF
[00589] As atividades citotóxicas in vitro de AF e AF-Arg nativas, isto é um fármaco quimicamente modificado de acordo com a fórmula (III) em que W1 representa AF, Dxx representa uma única ligação co- valente, e Dyy representa Arg, foram avaliadas em duas linhagens celulares que expressam ErbB2, a saber células SK-BR-3 e SK-OV-3. O teste de atividade citotóxica foi conduzido de acordo com o método descrito no item 11.3.4 acima.
[00590] Os resultados do teste de atividade citotóxica em tempos de incubação de 72h e 120h são dados nas respectivas tabelas 13 e 14 abaixo. Tabela 13: Estudo de citotoxicidade de AF e AF-Arg em células SK- OV-3 e SK-BR-3 que expressam ErbB2 depois de 72h Fármaco IC50 relativo (nM) at 72h (day 3) SK-OV-3 SK-BR-3 rodada 1 rodada 2 rodada 1 rodada 2 AF 82,79 153,8 37,43 53,66 AF-Arg 179,6 239,5 ~98,02 ~110,7
Tabela 14: Estudo de citotoxicidade de AF e AF-Arg em células SK- OV-3 e SK-BR-3 que expressam ErbB2 depois de 120h Fármaco IC50 relativo (nM) em 120h (dia 5) SK-OV-3 SK-BR-3 rodada 1 rodada 2 rodada 1 rodada 2 AF ~100,2 145,2 18,82 21,75 AF-Arg 146,7 204,7 20,9 24,92
[00591] Esses resultados indicam que o fármaco quimicamente modificado (AF-Arg) retém atividade citotóxica, por exemplo maior do que 85% da atividade citotóxica do fármaco nativo (AF) em células SK-BR-3 e cerca de 70% em células SK-OV-3 em 120h (Fig. 35). Além do mais, esses resultados também indicam que a introdução de um grupo divalente, isto é Arg (aminoácido Dyy na fórmula (III)), entre o fármaco e o sistema ligante da presente invenção não afeta de forma prejudicial a atividade farmacológica da porção de fármaco (modifica- da) liberada na célula alvo. Em particular, se o fármaco for internaliza- do na célula alvo através da vetorização, a citotoxicidade do fármaco (AF-Arg) não é mais atenuada pela permeabilidade celular reduzida do fármaco modificado devido ao aumento na polaridade, isto é, a cadeia lateral carregada de Arg. Exemplo 10 – Preparação de conjugados de anticorpo-fármaco
[00592] Para a preparação de ADC1, uma solução de trastuzumab comercial (10,0 mg; 0,066 µmol) em água (0,48 mL) e DPBS a pH 7,4 (0,52 mL) em temperatura ambiente (RT), foi parcialmente reduzida pela adição de uma solução de cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina (0,058 mg; 0,24 µmol) em tampão PBS pH 7,4 (50 µL). Depois de 60 min de agitação, uma solução do composto 2 (AF-Arg-Lys(PEG4-Mal)- Phe-OH) (1,04 mg; 0,66 µmol) em DMSO (50 µL) foi adicionada. A reação foi agitada por 1h em temperatura ambiente e dissolvida com mais tampão PBS pH 7,4 (1,92 mL). A solução foi então carregada na parte superior de uma coluna Sephadex® PD-10 (GE Healthcare)
equilibrada com tampão PBS pH 7,4. Os primeiros 2,5 mL de eluente gerados mediante carregamento foram descartados. A coluna foi ainda eluída com tampão PBS pH 7,4 (3,5 mL) e todos os eluentes foram coletados. Toda material suspenso foi removido através de centrifu- gação e o sobrenadante foi concentrado em uma unidade de filtro cen- trífugo Amicon® a um volume de 0,3 mL e dissolvido em PBS pH 7,4 (7 mL).
[00593] Para a preparação de ADC3, a uma solução de trastuzumab comercial (50 mg) em água (2,38 mL) e DPBS a pH 7,4 (1,87 mL) em RT, foi adicionada uma solução de cloridrato de tris(2- carboxietil)fosfina (0,38 mg; 1,33 µmol) em DPBS (450 µL). A reação foi agitada por 75 min. Uma solução de composto 26 (Ma-PEG5-Phe- Cit-Lys(Mcc-DM1)-Cit-OH) (6,65 mg; 3,33 µmol) em DMSO (300 µL) foi adicionada à reação, que foi agitada em RT por 60 min. 100 mL de DPBS comercial foram ajustados até pH 8 com uma solução aquosa de hidróxido de sódio (1 mol/L). Duas colunas PD 10 foram então pré- lavadas com a solução de DPBS (25 mL cada) em pH 8. A mistura de reação foi aplicada na parte superior de 2 colunas (2,5 mL em cada coluna). Os eluentes gerados durante a fase de carregamento foram descartados. As duas colunas foram então eluídas com tampão DPBS pH 8 (3,5 mL cada). Os eluentes coletados (2 x 3.5 mL) foram com- binados e agitados por 15h em temperatura ambiente para estabilizar a tiomaleimida através da abertura de anel. Todo o material suspenso foi removido por centrifugação a 4000 rpm (10 min). A solução foi di- vidida (2 x 3,5 mL) e transferida em 2 filtros centrífugos Amicon®. As duas soluções foram concentradas através de centrifugação a 4000 rpm por 2h até alcançar um volume final de 0,5 mL em cada célula. As duas soluções foram então combinadas. As membranas dos 2 filtros foram lavadas com tampão PBS Dulbecco (4 mL). A solução de lav- agem foi adicionada ao ADC para obter a solução final de ADC (V =
5,0 mL).
[00594] Os respectivos valores de DAR dos ADCs 1 e 3 apresenta- dos na Tabela 15 foram determinados de acordo com o método descri- to no item 11.3.5 acima. Tabela 15: valores DAR de ADC1 e ADC3 Composto Fármaco ligante Fórmula DAR Concentração ADC1 Composto 2 I 4,2 1,17 mg/mL ADC3 Composto 26 I 4,4 10,4 mg/mL Exemplo 11: Estudo de clivagem induzido por Cat B usando ADC1
[00595] A clivagem de ADC1 por Cat B ocorreu rápido conforme mostrado pela rápida liberação de AF-Arg (T ½ < 5 min), confirmando o mecanismo pela atividade de exo-Cat B em construtos de fórmula (I) (Figura 55). Os resultados mostram que a ligação de um mAb à cadeia lateral de Lys não leva a uma redução da taxa de clivagem observada conforme comparado com a porção modelo V (–Cys-Ac).
[00596] ADC3 foi similarmente clivado por exo-Cat B (dados não mostrados). Exemplo 12: Estabilidade de plasma dos ADCs
[00597] As análises por UHPLC-MS/MS mostram que nenhum fár- maco livre (nem AF ou AF-Arg para ADC1 ou derivado de DM1 para ADC3) foi detectado.
[00598] O gráfico (Figura 56) mostra que as concentrações médias calculadas de ADC em amostras de plasma humano e de camundon- go. Barras de erro: SD (n=2). Os resultados mostram que ADC1 esta- va estável no plasma de camundongo e humano durante 24h. Exemplo 13: Ensaios de ligação de ADCs
[00599] ADC1: Ensaio de ligação de ADC1 e trastuzumab em célu- las SK-BR-3 (que expressam ErbB2) e MDA-MB-231 (ErbB2 negati- vas) mostrou que ADC1 tem a mesma afinidade e especificidade por células que expressam ErbB2 do que trastuzumab (Figura 57).
[00600] ADC3: Ensaio de ligação de ADC3 e trastuzumab em célu-
las BT-474 (que expressam ErbB2) e MDA-MB-231 (ErbB2 negativas) mostrou que ADC3 tem a mesma afinidade e especificidade por célu- las que expressam ErbB2 do que trastuzumab (Figura 58). Exemplo 14: Atividade citotóxica de ADCs
[00601] O ensaio de citotoxicidade de ADC1 e derivados (trastuzumab, composto 2 ou AF-Arg) em células SK-OV-3 e SK-BR-3 que expressam ErbB2 e células MDA-MB-231 ErbB2-negativas foi conduzido de acordo com o método descrito no item 11.3.4 acima. Es- te ensaio demonstrou a atividade citotóxica aumentada de ADC1 com- parada com o anticorpo monoclonal (trastuzumab), composto 2 ou AF- Arg. A Figura 59(a)-(c) mostra as curvas de dose-resposta de duas rodadas independentes com os valores relativos de IC50 conforme de- terminado com o ensaio com Alamar Blue depois de 96h de incu- bação. Os resultados correspondentes dos testes de atividade citotóxi- ca são dados na Tabela 16 abaixo. Tabela 16: Estudo de citotoxicidade de ADC1, trastuzumab, AF-Arg e composto 2 em células SK-OV-3 e SK-BR-3 que expressam ErbB2 e em células ErbB2 negativas depois de 96h Fármaco IC50 relativo (nM) em 96h (dia 4) SK-OV-3 SK-BR-3 MDA-MB-231 rodada 1 rodada 2 rodada 1 rodada 2 rodada 1 rodada 2 Composto 2 122,7 ~86,74 39,35 ~80,51 23,7 1,288 AF-Arg 82,57 243,5 ~92,13 128,3 15,23 5,844 trastuzumab ~793,4 ~16122 759,9 15481127 2,144 10,89 ADC1 0,03438 0,09391 0,01476 0,04327 0,1279 23,46
[00602] A atividade citotóxica de ADC3 e derivados (trastuzumab e DM1) em células BT-474 que expressam ErbB2 e células MDA-MB- 231 ErbB2-negativas foi conduzida de acordo com o método descrito no item 11.3.4 acima. Este ensaio confirmou a atividade citotóxica au- mentada de ADC3 comparado com trastuzumab e DM1. A Figura 60(a)-(b) mostra as curvas de dose-resposta de duas rodadas inde- pendentes com os valores relativos de IC50 conforme determinado com o ensaio com Alamar Blue depois de 96h de incubação.
Os resultados correspondentes dos testes de atividade citotóxica são dados na Tabela 17 abaixo.
Tabela 17: Estudo de citotoxicidade de ADC3, trastuzumab e DM1 em células BT-474 que expressam ErbB2 e em células ErbB2 negativas depois de 96h.
Fármaco IC50 relativo (nM) em 96h (dia 4) BT-474 MDA-MB-231 rodada 1 rodada 2 rodada 1 rodada 2 DM1 2,802 3,002 44,21 57,02 Trastuzumab 0,5711 4,558 1080 686 ADC3 0,683 0,3456 8,689 91,79

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES
1. Composto, caracterizado pelo fato de ser representado pela fórmula geral (I) ou (I'): em que, nas fórmulas (I) e (I'), W representa uma porção representada pela fórmula que segue (III): em que W1 representa uma porção derivada de um fármaco que difere de um fármaco nativo apenas em virtude da ligação covalente a Dxx conforme mostrado na fórmula (III), se o fármaco for um análogo de auristatina, o análogo de auristatina é auristatina Phe (AF), auristat- ina Cit (ACit), auristatina Arg (AArg), auristatina Lys (ALys), auristatina Orn (AOrn), auristatina Dab (ADab) ou auristatina Dap (ADap), pre- ferivelmente AF; Dxx representa uma única ligação covalente ou um ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, preferivelmente um ami- noácido selecionado a partir de Phe, Val, Tyr, homo-Phe e Ala, pre- ferivelmente Phe ou Val, em que a ligação covalente única ou ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica é opcionalmente ligada à porção W1 através de uma porção divalente selecionada a partir de maleimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila e deriva- dos dos mesmos, preferivelmente através de um derivado de ma- leimida divalente; Dyy representa uma única ligação covalente, Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, preferivelmente um ami-
noácido selecionado a partir de Arg, Lys, Citrulina (Cit), Ornitina (Orn), ácido 2,3-diamino-propiônico (Dap), ácido 2,4-diamino-butírico (Dab), mais preferivelmente Arg ou Cit; com a condição de que se Dxx for um aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, Dyy é Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, e se Dxx é uma única ligação covalente, Dyy é uma única ligação covalente, Phe ou um aminoácido com uma cadeia lateral básica, preferivelmente Arg ou Cit; e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx na fórmula (I) ou o N-terminal de Ayy na fórmula (I'); Axx representa um aminoácido trifuncional tal como um ácido amino-dicarboxílico ou um ácido diamino-carboxílico; com a condição de que Axx na fórmula (I) não seja um aminoácido na config- uração (D); Ayy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, fenilglicina (Phg), Met, Val, His, Lys, Arg, Cit, ácido 2- amino-butírico (Abu), Orn, Ser, Thr, Leu e Ile; ou Ayy na fórmula (I) representa um aminoácido selecionado a partir de homo-tirosina (ho- mo-Tyr), homo-fenilalanina (homo-Phe), beta-fenilalanina (beta-Phe) e beta-homo-fenilalanina (beta-homo-Phe), Tyr(OR1) e homo-Tyr(OR1) em que R1 é –(CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou grupo metila e n1 é um inteiro de 2 a 24; com a condição de que Ayy na fórmula (I') não seja um aminoácido na configuração (D); T é uma porção sendo representada pela fórmula que se- gue (Ia1):
em que, na fórmula (Ia1), S representa um grupo contendo um ou mais átomos se- lecionados a partir de carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre;
V representa uma porção derivada de um grupo vetor ca- paz de interagir com uma célula alvo; n é um inteiro de 1 a 10; Rx é um átomo ou grupo que está opcionalmente presente para saturar uma valência livre de S, caso presente; e a linha quebrada indica ligação covalente à cadeia lateral de Axx; se n for maior do que 1, cada linha quebrada representa uma ligação covalente a um grupo individual, separado de fórmula (I) ou fórmula (I'), em que múltiplos grupos de fórmula (I) ou fórmula (I') po- dem ser os mesmos ou diferentes; se n for maior do que 1, cada S pode ser o mesmo ou diferente; Z representa um grupo covalentemente ligado ao C- terminal de Ayy ou Axx selecionado a partir de –OH; -N(H)(R), em que R representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila, um grupo cicloalquila ou um grupo aromático; e um agente marcador tal como um derivado de cumarina.
2. Composto, caracterizado pelo fato de ser representado pela fórmula geral (I) ou (I'): em que, nas fórmulas (I) e (I'), W representa uma porção representada pela fórmula que segue (III): em que W1 representa uma porção derivada de um fármaco com a condição de que W1 não seja um análogo de auristatina; Dxx representa uma única ligação covalente ou um ami-
noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, preferivelmente um ami- noácido selecionado a partir de Phe, Val, Tyr, homo-Phe e Ala, mais preferivelmente Phe ou Val, em que a ligação covalente única ou ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica está opcionalmente liga- do à porção W1 através de uma porção divalente selecionada a partir de maleimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila e derivados dos mesmos, preferivelmente através de um derivado de maleimida divalente; Dyy represente uma única ligação covalente, Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, preferivelmente um ami- noácido selecionado a partir de Arg, Lys, Cit, Orn, Dap e Dab, mais preferivelmente Arg ou Cit; com a condição de que se Dxx for um aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, Dyy é Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, e se Dxx é uma única ligação covalente, Dyy é uma única ligação covalente, Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, preferivelmente Arg ou Cit; e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx na fórmula (I), ou o N-terminal de Ayy na fórmula (I'); Axx representa um aminoácido trifuncional tal como um ácido amino-dicarboxílico ou um ácido diamino-carboxílico; com a condição de que Axx na fórmula (I) não seja um aminoácido na config- uração (D); Ayy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Met, Val, His, Lys, Arg, Cit, Abu, Orn, Ser, Thr, Leu e Ile; ou Ayy na fórmula (I) representa um aminoácido selecionado a partir de homo-Tyr, homo-Phe, beta-Phe e beta-homo-Phe), Tyr(OR1) e homo-Tyr(OR1) em que R1 é –(CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um inteiro de 2 a 24; com a condição de que Ayy na fórmula (I') não seja um aminoácido na configuração (D); T é uma porção sendo representada pela fórmula que se- gue (Ia1): em que, na fórmula (Ia1), S representa um grupo contendo um ou mais átomos se- lecionados a partir de carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre; V representa uma porção derivada de um grupo vetor ca- paz de interagir com uma célula alvo; n é um inteiro de 1 a 10; Rx é um átomo ou grupo que está opcionalmente presente para saturar uma valência livre de S, caso presente; e a linha quebrada indica ligação covalente à cadeia lateral de Axx; se n for maior do que 1, cada linha quebrada representa uma ligação covalente a um grupo individual, separado de fórmula (I) ou fórmula (I'), em que múltiplos grupos de fórmula (I) ou fórmula (I') po- dem ser os mesmos ou diferentes; se n for maior do que 1, cada S pode ser o mesmo ou diferente; Z representa um grupo covalentemente ligado ao C- terminal de Ayy ou Axx selecionado a partir de –OH; -N(H)(R), em que R representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila, um grupo cicloalquila ou um grupo aromático; e um agente marcador tal como um derivado de cumarina.
3. Composto, caracterizado pelo fato de ser representado pela fórmula geral (I) ou (I'):
em que, nas fórmulas (I) e (I'), W representa uma porção peptídica representada pela fór- mula (Ia), (Ia') ou (Ib):
em que, nas fórmulas (Ia) e (Ia'), A'yy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Met, Val, His, Lys, Arg, Cit, Abu, Orn, com a con- dição de que A'yy na fórmula (Ia') não seja um aminoácido na configu- ração (D); D1 representa uma porção derivada de um fármaco; m é um inteiro de 1 a 10; se m=1, então A'xx representa um aminoácido trifuncional tal como um ácido amino dicarboxílico ou um ácido diamino carboxílico com a condição de que A'xx na fórmula (Ia) não seja um aminoácido na configuração (D), D2 representa uma porção derivada de um fárma- co, opcionalmente uma porção derivada do mesmo fármaco que D1; se m for maior do que 1, então cada D2 é independente- mente selecionado a partir de um átomo de hidrogênio e porções derivadas de um fármaco, em que múltiplas porções D2 podem ser as mesmas ou diferentes com a condição de que pelo menos um D2 não seja um átomo de hidrogênio, se D2 for um átomo de hidrogênio então A'xx representa um aminoácido com a condição de que A'xx na fórmu- la (Ia) não seja um aminoácido na configuração (D), se D2 for uma por- ção derivada de um fármaco, então A'xx representa um amino trifun- cional com a condição de que A'xx na fórmula (Ia) não seja um ami- noácido na configuração (D); e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx ou Ayy;
em que, na fórmula (Ib), A'yy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Met, Val, His, Lys, Arg, Cit, Abu, Orn; D1 representa uma porção derivada de um fármaco; m é um inteiro de 1 a 10; se m=1, então A'xx representa um aminoácido trifuncional selecionado a partir de Glu, ácido α-amino adípico (Aaa), Dap, Dab, Ser, Thr, homo-serina (homo-Ser), homo-treonina (homo-Thr) e ácido amino-malônico (Ama) com a condição de que A'xx não seja um ami- noácido na configuração (D); D2 representa uma porção derivada de um fármaco, opcionalmente uma porção derivada do mesmo fármaco que D1, Cxx representa uma única ligação covalente a menos que A'xx seja Ama, se A'xx for Ama, Cxx representa (L)- ou (D)-Pro, ou um N- metil aminoácido tal como sarcosina (Sar), o N-terminal de Cxx se liga a uma extremidade carboxila de Ama e o C-terminal de Cxx se liga a uma porção D2; se m for maior do que 1, então cada D2 é independente- mente selecionado a partir de um átomo de hidrogênio e porções derivadas de um fármaco, em que múltiplas porções D2 podem ser as mesmas ou diferentes com a condição de que pelo menos um D2 não seja um átomo de hidrogênio, se D2 for um átomo de hidrogênio então A'xx representa um aminoácido com a condição de que A'xx esteja na configuração (D) e Cxx represente uma única ligação covalente, se D2 for uma porção derivada de um fármaco então A'xx representa um aminoácido selecionado a partir de Glu, Aaa, Dap, Dab, Ser, Thr, ho- mo-Ser, Homo-Thr e Ama com a condição de que A'xx não seja um aminoácido na configuração (D), Cxx representa uma única ligação covalente a menos que A'xx seja Ama, se A'xx for Ama, Cxx represen- ta (L)- ou (D)-Pro, ou um N-metil aminoácido tal como Sar em que o N- terminal de Cxx se liga a uma extremidade carboxila de Ama e o C-terminal de Cxx se liga à porção D2; e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx ou Ayy; Axx representa um aminoácido trifuncional tal como um ácido amino-dicarboxílico ou um ácido diamino-carboxílico; com a condição de que Axx na fórmula (I) não seja um aminoácido na config- uração (D); Ayy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Met, Val, His, Lys, Arg, Cit, Abu, Orn, Ser, Thr, Leu e Ile; ou Ayy na fórmula (I) representa um aminoácido selecionado a partir de homo-Tyr, homo-Phe, beta-Phe e beta-homo-Phe, Tyr(OR1) e homo-Tyr(OR1) em que R1 é –(CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um áto- mo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um inteiro de 2 a 24; com a condição de que Ayy na fórmula (I') não seja um aminoácido na con- figuração (D); T é uma porção sendo representada pela fórmula que se- gue (Ia1):
em que, na fórmula (Ia1), S representa um grupo contendo um ou mais átomos se- lecionados a partir de carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre; V representa uma porção derivada de um grupo vetor ca- paz de interagir com uma célula alvo; n é um inteiro de 1 a 10; Rx é um átomo ou grupo que esteja opcionalmente presente para saturar uma valência livre de S, caso presente; e a linha quebrada indica ligação covalente à cadeia lateral de Axx; se n for maior do que 1, cada linha quebrada representa uma ligação covalente a um grupo individual, separado de fórmula (I) ou fórmula (I'), em que múltiplos grupos de fórmula (I) ou fórmula (I') po- dem ser os mesmos ou diferentes; se n for maior do que 1, cada S pode ser o mesmo ou diferente; Z representa um grupo covalentemente ligado ao C- terminal de Ayy ou Axx selecionado a partir de –OH; -N(H)(R), em que R representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila, um grupo cicloalquila ou um grupo aromático; e um agente marcador tal como um derivado de cumarina.
4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de Axx e Ayy é definido como a seguir: Axx representa um aminoácido selecionado a partir de Glu, ácido 2-amino-pimélico (Apa), Aaa, Dap, Dab, Lys, Orn, Ser, Ama, e homo-lisina (homo-Lys), preferivelmente um aminoácido selecionado a partir de Dap, Dab, Lys, Orn e homo-Lys; Ayy na fórmula (I) representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, homo-Phe, Ala, Trp, Phg, Leu, Val, Tyr, homo-Tyr, Tyr(OR1) e homo-Tyr(OR1) em que R1 é –(CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um inteiro de 2 a 24, preferivelmente Phe, homo-Phe, Tyr, homo-Tyr, Tyr(OR1) ou ho- mo-Tyr(OR1), mais preferivelmente Phe ou Tyr; Ayy na fórmula (I') representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, homo-Phe, Ala, Trp, Phg, Leu, Val, Tyr e Ser, preferiv- elmente Phe, home-Phe ou Ser, mais preferivelmente Phe ou Ser.
5. Composto de acordo com a reivindicação 3 ou 4, carac- terizado pelo fato de que pelo menos um de A'xx, A'yy e m é definido como a seguir: A'xx nas fórmulas (Ia) e (Ia') representa um aminoácido se- lecionado a partir de Dap, Dap, Lys, Orn e homo-Lys, preferivelmente Lys; A'yy nas fórmulas (Ia), (Ia') e (Ib) representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, Ala, Trp, Phg e Tyr, preferivelmente Phe ou Tyr; m é um inteiro de 1 a 4.
6. Composto, caracterizado pelo fato de ser representado por uma das fórmulas gerais que seguem (II), (II') e (IIa): em que, D representa uma porção derivada de um fármaco; se o*p > 1 um ou mais D's pode ser hidrogênio ou um grupo solubilizante tal como –(CH2CH2O)n1- R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um inteiro de 2 a 24, com a condição de que pelo menos um D represente uma porção derivada de um fármaco; Bxx nas fórmulas (II) e (II') representa um aminoácido tri- funcional tal como um ácido amino-dicarboxílico ou um ácido diamino- carboxílico; com a condição de que Bxx na fórmula (II) não seja um aminoácido na configuração (D);
Bxx na fórmula (IIa) representa um aminoácido carboxílico tal como Ama, Glu, Aaa, Apa ou um aminoácido trifuncional seleciona- do a partir de Dap, Dab, Ser, Thr, Lys, Orn, homoLys, homoSer e ho- moThr; com a condição de que Bxx não seja um aminoácido na con- figuração (D); Cxx representa uma única ligação covalente a menos que Bxx seja Ama; se Bxx for Ama, Cxx representa (L)- ou (D)-Pro, ou um N-metil aminoácido tal como Sar, o N-terminal de Cxx se liga a uma extremidade carboxila de Ama e o C-terminal de Cxx se liga à porção D; naqueles casos onde Bxx nas fórmulas (II), (II') e (IIa) carrega um hidrogênio como grupo D, Bxx pode ser qualquer outro aminoácido, com a condição de que Bxx nas fórmulas (II) e (IIa) não seja um aminoácido na configuração (D); Byy representa um aminoácido selecionado a partir de Phe, homo-Phe, Ala, Trp, Tyr, Phg, Val, His, Lys, Abu, Met, Cit, Orn, Ser, Thr, Leu, Ile, Arg e Tyr(OR1) em que R1 é –(CH2CH2O)n1- R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um inteiro de 2 a 24; ou Byy nas fórmulas (II) e (IIa) representa um aminoácido se- lecionado a partir de homo-Tyr, homo-Tyr(OR1), homo-Phe, beta-Phe e beta-homo-Phe; com a condição de que Byy na fórmula (II') não seja um aminoácido na configuração (D) e com a condição de que se o*p>1, apenas o Byy C-terminal nas fórmulas (II) e (IIa) pode represen- tar um aminoácido selecionado a partir de beta-Phe e beta-homo-Phe; Bxx1 representa uma única ligação covalente ou um ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica ou básica; Bxx2 representa um aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica ou básica; S e V são conforme definidos na reivindicação 1; Z é covalentemente ligado ao C-terminal de Byy nas fórmu- las (II) e (IIa) e o C-terminal de Bxx na fórmula (II'), e representa um grupo selecionado a partir de -OH; -N(H)(R), R sendo de acordo com a reivindicação 1; e um agente marcador; e o e p cada independentemente é um inteiro de 1 a 10, se p for maior do que 1, Bxx1 não seja um aminoácido na configuração (D); se p for maior do que 1 e/ou se o for maior do que 1, então cada D pode ser independentemente selecionado a partir de porções deriva- das de um fármaco.
7. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracter- izado pelo fato de que pelo menos um de Bxx1, Bxx2, Bxx, Byy, o e p é definido como a seguir: Bxx1 representa uma única ligação covalente ou um ami- noácido selecionado a partir de Phe, homo-Phe, Phg, Val, Ser, Tyr, Ala, Leu, Ile; preferivelmente um aminoácido selecionado a partir de Phe, homo-Phe, Tyr e Val, mais preferivelmente Phe, homo-Phe ou Tyr; Bxx2 representa um aminoácido selecionado a partir de Arg, Lys, Cit, Val, Leu, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Phg e Phe; preferivelmente um aminoácido selecionado a partir de Arg, Lys, Cit e Phe, mais pre- ferivelmente Arg ou Cit; Bxx nas fórmulas (II) e (II') representa um aminoácido se- lecionado a partir de Dap, Dab, Lys, Orn, Ser, Glu, Ama, Thr, Tyr, Aaa, homo-Ser e homo-Thr; preferivelmente Lys ou Dab, mais preferivel- mente Lys; Byy representa Cit, Phe, homo-Phe, Ser, Trp, Tyr or Tyr(OR1) em que R1 é –(CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um inteiro de 2 a 24, preferivel- mente Phe, Tyr ou Tyr(OR1); se o*p>1, Byy representa preferivelmen- te Tyr ou Tyr(OR1); e o e p cada independentemente é um inteiro de 1 a 4.
8. Composto de acordo com qualquer uma das reivindi-
cações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que nas fórmulas (Ia1), (II), (II') e (IIa), S representa um grupo divalente selecionado a partir de um grupo alquileno divalente, um grupo alquenileno divalente, um grupo alquinileno divalente, e um grupo de óxido de polialquileno divalente; preferivelmente um grupo divalente tendo fórmula –(CH2)q- Azz5-, ou -(OCH2CH2)q-Azz5-; em que q é um inteiro de 1 a 50; e Azz5 está ausente, ou representa um grupo solubilizante preferivelmente selecionado a partir de um aminoácido tal como Arg ou (D)-Arg e um grupo divalente contendo um grupo amônio, um grupo sulfato, um grupo sulfonato ou um grupo diéster pirofosfato.
9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que nas fórmulas (Ia1), (II), (II') e (IIa), S representa um grupo divalente tendo fórmula -(CH2)q- Azz5-Y-, ou um grupo divalente tendo fórmula -(OCH2CH2)q-Azz5-Y-; em que Y representa uma porção divalente covalente- mente ligada ao C-terminal de Azz5 e à porção V; se Azz5 estiver ausente, Y é covalentemente ligado ao grupo alquila ou grupo de óxido de polietileno e à porção V; Y é derivado de um composto selecionado a partir de maleimidas, triazóis, especialmente 1,2,3-triazol, hidra- zonas, grupos contendo carbonila e derivados dos mesmos, preferiv- elmente a partir de maleimidas e derivados dos mesmos; q é um in- teiro de 1 a 50; e Azz5 é de acordo com a reivindicação 8.
10. Composto de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, ca- racterizado pelo fato de que o composto de fórmula (I) e fórmula (Ia) é selecionado a partir de W1-Arg-Lys(T)-Phe-Z, W1-Arg-Lys(T)- homoPhe-Z, W1-Cit-Lys(T)-Phe-Z, W1-Cit-Lys(T)-Tyr-Z, W1-Cit- Lys(T)-homoTyr-Z, W1-Lys(T)-Phe-Z, W1-Lys(T)-Tyr-Z, W1-Lys(T)- homoTyr-Z, W1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-Phe-Z, W1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-
Tyr-Z, W1-Mal-Phe-Cit-Lys(T)-homoTyr-Z, W1-Mal-Phe-Lys-Lys(T)- Phe-Z, W1-Mal-homoPhe-Arg-Lys(T)-Phe-Z, W1-Mal-homoPhe-Cit- Lys(T)-Tyr-Z, W1-Mal-homoPhe-Cit-Lys(T)-Tyr(OR1)-Z com R1 – (CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um inteiro de 2 a 24, por exemplo 12, W1-Mal-Cit-Lys(T)- Tyr-Z, W1-Mal-Cit-Lys(T)-homoTyr-Z, W1-Mal-Arg-Lys(T)-homoTyr-Z, W1-Cit-(Lys(D2)-Phe)m-Lys(T)-Phe-Z, W1-Cit-(Lys(D2)-Phe)m-Lys(T)- homoTyr-Z, W1-Cit-(Lys(D2)-Phe)m-Lys(T)-Tyr(OR1)-Z com R1 – (CH2CH2O)n1-R2, em que R2 é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila e n1 é um inteiro de 2 a 24, por exemplo 12, W1-(Lys(D2)- Phe)m-Lys(T)-Phe-Z, W1-Phe-(Phe-Lys(D2))m-Lys(T)-Tyr-Z, W1-(Phe- Lys(D2))m-Lys(T)-Tyr-Z, W1-Phe-(Phe-Lys(D2))m-Lys(T)-homoTyr-Z e W1-Arg-(Phe-Lys(D2))m-Lys(T)- Tyr(OR1)-Z; e o composto de fórmula (I') é selecionado a partir de W1- Arg-Phe-Lys(T)-Z, W1-Arg-Ser-Lys(T)-Z, W1-Cit-Phe-Lys(T)-Z, W1-Cit- Ser-Lys(T)-Z, W1-Cit-homoPhe-Lys(T)-Z, W1-Phe-Lys(T)-Z, W1-Ser- Lys(T)-Z, W1-Mal-Phe-Cit-Phe-Lys(T)-Z, W1-Mal-homoPhe-Cit-Phe- Lys(T)-Z, W1-Mal-Phe-Arg-Phe-Lys(T)-Z, W1-Mal-Cit-Phe-Lys(T)-Z, W1-Mal-Phe-Ser-Lys(T)-Z, W1-Mal-Ala-Phe-Lys(T)-Z, W1-Mal-Cit-Ser- Lys(T)-Z e W1-Mal-Arg-homoPhe-Lys(T)-Z. em que W1, T, Z, D2 e m tem os mesmos significados con- forme especificado na reivindicação 1, 2 ou 3; e Z é preferivelmente - OH.
11. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracter- izado pelo fato de que é selecionado a partir de V-S-Phe-Arg-Phe- Lys(D)-Ser-Lys(D)-Z, V-S-Phe-Arg-(Phe-Lys(D))o-Z, V-S-Phe-Arg-(Ser- Lys(D))o-Z, V-S-Phe-Arg-(Tyr(OR1)-Lys(D))o-Z, V-S-Phe-Arg-(Phe- Lys(D))o-Phe-Tyr(OR1)-Z; preferivelmente V-S-Phe-Arg-Phe-Lys(D)- Ser-Lys(D)-Z, V-S-Phe-Arg-(Phe-Lys(D))o-Z ou V-S-Phe-Arg-(Ser- Lys(D))o-Z; mais preferivelmente V-S-Phe-Arg-(Phe-Lys(D))o-Z em que V, S, D, Z e o tem os mesmos significados con- forme especificado na reivindicação 6; e Z é preferivelmente -OH.
12. Composto de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que cada porção derivada de um fármaco é independentemente selecionada a partir de: (i) agentes antineoplásicos incluindo agentes alquilantes, alcaloides tais como taxanos e maitansinoides, antimetabólitos, tera- pias endócrinas, inibidores de cinase; (ii) agentes imunomoduladores tais como imunoestimu- lantes e imunossupressores; (iii) agentes anti-infecciosos incluindo fármacos antibacteri- anos, fármacos antimitóticos, fármacos antimicobacterianos e fárma- cos antivirais; radioisótopos e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
13. Composto de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que cada porção derivada de um fármaco é independentemente derivada de amanitina, duocarmici- na, auristatina, maitansina, tubulisina, caliqueamicina, camptotecina, SN-38, taxol, daunomicina, vinblastina, doxorrubicina, metotrexato, pir- rolobenzodiazepina ou radioisótopos e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
14. Composto de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 3, 4, 8, 9, 10, 12 e 13, caracterizado pelo fato de que cada por- ção D1 é independentemente representado pela fórmula que segue (III): em que W1 representa uma porção derivada de amanitina, duocar- micina, auristatina, maitansina, tubulisina, caliqueamicina, camp-
totecina, SN-38, taxol, daunomicina, vinblastina, doxorrubicina, meto- trexato, pirrolobenzodiazepina ou radioisótopos e/ou sais farmaceuti- camente aceitáveis dos mesmos; Dxx representa uma única ligação covalente ou um ami- noácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, preferivelmente um ami- noácido selecionado a partir de Phe, homo-Phe, Val e Ala, em que a ligação covalente única ou aminoácido tendo uma cadeia lateral hidro- fóbica é opcionalmente ligada à porção W1 através de uma porção di- valente selecionada a partir de maleimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila e derivados dos mesmos, preferivelmente através de um derivado de maleimida divalente; Dyy representa uma única ligação covalente, Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, preferivelmente um ami- noácido selecionado a partir de Arg, Lys, Cit, Orn, Dap, e Dab, mais preferivelmente Arg ou Cit; com a condição de que se Dxx for um aminoácido tendo uma cadeia lateral hidrofóbica, Dyy é Phe ou um aminoácido tendo uma cadeia lateral básica, e se Dxx for uma única ligação covalente, Dyy é uma única ligação covalente, Phe ou um aminoácido com uma cadeia lateral básica; e a linha quebrada indica ligação covalente ao N-terminal de Axx na fórmula (I), o N-terminal de Ayy na fórmula (I'), o N-terminal de A'xx nas fórmulas (Ia) e (Ib), ou o N-terminal A'yy na fórmula (Ia').
15. Composto de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 3 a 14, caracterizado pelo fato de que cada porção D2 e D é independentemente representado pela fórmula que segue (IIIa): em que W2 representa uma porção derivada de amanitina, duocar- micina, auristatina, maitansina, tubulisina, caliqueamicina, camp-
totecina, SN-38, taxol, daunomicina, vinblastina, doxorrubicina, meto- trexato, pirrolobenzodiazepina ou radioisótopos e/ou sais farmaceuti- camente aceitáveis dos mesmos; Exx representa uma única ligação covalente ou uma porção divalente selecionada a partir de maleimidas, triazóis, hidrazonas, grupos contendo carbonila, aminoácidos, porções dipeptídicas e derivados dos mesmos, preferivelmente um derivado de maleimida divalente; e a linha quebrada indica ligação covalente à cadeia lateral de A'xx nas fórmulas (Ia) e (Ia'), a cadeia lateral de A'xx ou C-terminal de Cxx caso presente na fórmula (Ib), a cadeia lateral de Bxx nas fór- mulas (II) e (II'), a cadeia lateral de Bxx ou C-terminal de Cxx caso presente na fórmula (IIa).
16. Composto de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que V representa uma por- ção derivada de um grupo vetor selecionado a partir de anticorpos, fragmentos de anticorpo, proteínas, peptídeos e moléculas não pep- tídicas; preferivelmente um anticorpo ou um fragmento de anticorpo tal como um anticorpo de cadeia única, um anticorpo monoclonal, um anticorpo de cadeia única monoclonal, um fragmento de anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um fragmento de anticorpo qui- mérico, um anticorpo de domínio ou fragmento do mesmo, uma citocina, um hormônio, um fator de crescimento, um fator estimulador de colônias, um neurotransmissor ou uma molécula de transporte de nutrientes.
17. Composto de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que V representa uma porção derivada de um grupo vetor ca- paz de interagir com uma célula alvo, em que a célula alvo é selecion-
ada a partir de células tumorais, células infectadas por vírus, células infectadas por micro-organismos, células infectadas por parasitas, células envolvidas em doenças autoimunes, células ativadas, células mieloides, células linfoides, melanócitos e agentes infecciosos inclu- indo bactérias, vírus, micobactérias, fungos; preferivelmente a célula alvo é selecionada a partir de célu- las de linfoma, células de mieloma, células de câncer renal, células de câncer de mama, células de câncer de próstata, células de câncer ovariano, células de câncer colorretal, células de câncer gástrico, célu- las de câncer escamoso, células de câncer de célula pequena, céulas de câncer testicular e qualquer célula crescendo e se dividindo em um ritmo desregulado e acelerado para causar cânceres.
18. Composição, caracterizada pelo fato de que com- preende uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 ou um sal farma- ceuticamente aceitável do mesmo, e um ou mais componentes se- lecionados a partir de um veículo, um diluente e outros excipientes.
19. Composto ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizados pelo fato de ser para uso em um método de tratamento ou prevenção de um câncer, uma doença autoimune e/ou uma doença infecciosa.
20. Composto ou composição para uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizados pelo fato de que no método de trata- mento ou prevenção de um câncer, uma doença autoimune e/ou uma doença infecciosa, o composto ou composição é administrado de for- ma concomitante com, antes ou depois de um ou mais outros agentes terapêuticos ou terapias tais como agentes quimioterápicos, terapias de radiação, agentes imunoterápicos, agentes para distúrbio au- toimune, agentes anti-infecciosos ou outros compostos de fórmula (I)/(I') ou (II)/(II')/(IIa).
21. Método para tratamento ou prevenção de um câncer, uma doença autoimune e/ou uma doença infecciosa, caracterizado pelo fato de que uma quantidade terapeuticamente eficaz de composto ou composição como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 é administrada a um paciente que necessita do mesmo.
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