BR112017002912B1 - Compostos ligantes de modulação de estabilidade, composição farmacêutica e uso dos mesmos - Google Patents
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Abstract
LIGANTES DE MODULAÇÃO DE ESTABILIDADE PARA USO COM CONJUGADOS ANTICORPO FÁRMACO. A invenção presente refere-se a conjugados de anticorpofármaco modulados por estabilidade, componentes de ligante de modulação de estabilidade usados para preparar este conjugados de anticorpo-fármaco modulados por estabilidade, métodos terapêuticos usando conjugados de anticorpo-fármaco modulados por estabilidade, e métodos de preparar ligantes de modulação de estabilidade e conjugados de anticorpo-fármaco modulados por estabilidade.
Description
[001] A presente invenção refere-se a ligantes usados com relação a conjugados de anticorpo-fármaco (ADCs) que são capazes de super e submodular a estabilidade extracelular e/ou intracelular de conjugados de anticorpo-fármaco. A invenção da mesma forma refere- se a usos terapêuticos e regimes de tratamento empregando tais conjugados de anticorpo-fármaco modulado por estabilidade clinicamente vantajoso. Finalmente, a invenção refere-se a métodos de fazer estabilidade modulando ligantes e conjugados de anticorpo- fármaco modulados por estabilidade. Referência a Listagem de Sequência
[002] Este pedido eletronicamente está sendo depositado eletronicamente por meio de EFS-Web e inclui uma listagem de sequência eletronicamente submetida em formato .txt. O arquivo .txt contém uma listagem de sequência intitulada "PC72108A_SEQ_LISTING_ST25.txt" criada em 14 de agosto de 2015 e tendo um tamanho de 10 KB. A listagem de sequência contida aqui neste arquivo .txt faz parte da especificação e está incorporada aqui por referência em sua totalidade.
[003] Terapia de anticorpo fornece tratamento terapêutico alvejado em pacientes vários distúrbios, tal como cânceres e doenças imunológicas, e, portanto, desempenha um papel importante em pesquisa biológica. Abordagens diferentes de terapia de anticorpo alvejada, incluindo conjugados de anticorpo-fármaco (ADCs), foram exploradas. Chari, R. V., Miller, M. L., and Widdison, W. C. (2014) Antibodydrug conjugates: an emerging concept in cancer therapy . Angewandte Chemie 53, 3796827; Senter, P. D., and Sievers, E. L. (2012) The discovery and development of ADCETRIS® (brentuximab vedotin) for use in relapsed Hodgkin lymphoma and systemic anaplastic large cell lymphoma. Nature biotechnology 30, 6317; Lambert, J. M. (2013) Drugconjugated antibodies for the treatment of cancer. British journal of clinical pharmacology 76, 24862.
[004] No caso de molécula ADCs (da mesma forma denominados imunoconjugados em certos contextos) "cargas úteis", que são frequentemente moléculas pequenas citotóxicas (porções de fármaco), são covalentemente ligadas (conjugadas) a anticorpos para liberação local alvejada das porções de fármaco para tumores. Métodos de conjugação convencionais para ADCs incluem modificação química através das aminas de cadeia lateral de lisina, ou através de grupos de cisteína sulfidrila ativados reduzindo-se as ligações de dissulfeto de intercadeia. Brentuximab Vedotin e KADCYLA® (ado-trastuzumabe emtansina) são dois exemplos de ADCs que usa estes métodos convencionais.
[005] Abordagens enzimáticas usando uma transglutaminase para fazer ADCs foram da mesma forma exploradas. Transglutaminases pertencem a uma família de enzimas que catalisam adição de acila a uma amina primária. Conjugação usando uma transglutaminase fornece as vantagens de alta seletividade, procedimentos de reação simplificados, e condições de reação moderadas. Veja, por exemplo, Strop e outro, Chemistry & Biology, 20:161167 (2013); e Farias e outro, Bioconj. Chem. 25(2):240250 (2014). US20130230543 e US20130122020 descrevem conjugação sítio específica mediada por transglutaminase de anticorpos e moléculas pequenas.
[006] Métodos de conjugação de ADC convencionais resultam em ADCs tendo uma estabilidade inerente em um determinado sistema biológico. Liberação da carga útil no sítio desejado, tipicamente um tumor, é dependente das propriedades da carga útil, o ligante covalente, o anticorpo e o sistema biológico em que o ADC é introduzido. Frequentemente, uma quantidade significante da carga útil é liberada prematuramente de um ADC menos do que otimamente estável, por exemplo, no plasma, e desse modo necessita níveis de dosagem de ADC mais altos para alcançar a exposição desejada a carga útil no sítio de tumor. Em outras circunstâncias uso de um ADC excessivamente estável resulta em menos do que atividade de liberação de carga útil ideal dentro das células de tumor alvejadas.
[007] Ligações com base em peptídeo proteoliticamente cliváveis que empregam o elemento de imolação de paminobenziloxicarbonila (PABC) foi amplamente usado em pesquisa de conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) visto que sua introdução então em 2002 (Dubowchik, G.M. e outro Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855869). Tais ligações supostamente sofrem clivagem em internalização em células alvejadas por antígeno e exposição do ADC ao ambiente proteolítico degradante encontrado em organelas endossômicas e lisossômicas. Variantes ligadas a cisteína destes ligantes de dipeptídeo-PABC foram patenteadas (US 6,214,345 B2), e foram demonstradas que versões de contendo amina destas e outras ligações são apropriadas para conjugações sítio específica para resíduos de glutamina usando conjugações enzimáticas promovidos por transglutaminase microbiana, bem como o uso de anticorpos aglicosados e variantes de anticorpo criadas que sofrem conjugações eficientes usando esta abordagem de conjugação enzimática (WO2012/059882 A2).
[008] Todas as publicações, patentes, e pedidos de patente citadas aqui estão incorporadas aqui por referência em sua totalidade para todos os propósitos para a mesma extensão como se cada publicação individual, patente, e pedido de patente fossem especificamente e individualmente indicadas estar desse modo incorporadas por referência. No evento que um ou mais da literatura incorporada e materiais similares difere-se de ou contradiz este pedido, incluindo, porém não limitado a termos definidos, termo de uso, técnicas descritas, ou similar, este pedido controla.
[009] A presente invenção geralmente refere-se a ADCs, tipicamente feitos empregando-se uma conjugação mediada por transglutaminase, tendo propriedades de estabilidade que são alteradas pela presença de uma porção de modulação nos ligantes de ADCs. Os inventores surpreendentemente detectaram que uma tal porção de modulação posicionada em uma posição específica em um ligante de ADC, e mais especificamente certas características químicas incorporadas nestas porções de modulação, tem a capacidade de aumentar ou diminuir a estabilidade do ADC quando desejado tal que uma proporção grande ou menor da carga útil de ADC é liberada no sítio desejado de ação.
[0010] Desse modo, aqui aquelas substituições específicas no manuseio de conjugação de contendo amina, que são frequentemente derivados acilados de lisina, são fornecidas que pode ter um efeito profundo na estabilidade de plasma in vitro e em exposição in vivo dos ADCs resultantes. É demonstrado que estabilidade conjugada pode ser modulada variando-se a natureza dos substituintes presentes nos manuseios de conjugação contendo amina, e também, que o substituinte pode ser escolhido para aperfeiçoar a estabilidade de cada sítio de conjugação único. Esta invenção, portanto, permite o ajuste fino de estabilidade de ADC in vivo, e consequentemente permite a modulação de parâmetros que afetam ambas eficácia in vivo e segurança, e, portanto, permite a otimização do índice terapêutico de ADCs. Breve Descrição dos Desenhos
[0011] Figuras 1A a 1I mostram estudos de citotoxicidade in vitro de anticorpos anti-Trop2 quiméricos conjugados em uma faixa de sítios com a carga útil citotóxica vcAur0101 de amino-caproíla (C6).
[0012] Figuras 1J a 1O mostram em estudos de citotoxicidade in vitro de anticorpos anti-Trop2 quiméricos conjugados nos sítios LCQ04 e L11B com as cargas úteis de ligante dos Exemplos 2, 3, e 5.
[0013] Figura 2 mostra a estabilidade in vivo dos compostos de ADC Exemplo 12 e 14 (Fig. 2A); os compostos de ADC do Exemplo 16 e 13 (Fig. 2B); e os compostos de ADC dos Exemplos 11, 18 e 17 (Fig. 2C), ligado pelo sítio de LCQ04 no anticorpo Trop2. Linhas tracejadas representam concentração de carga útil, linhas sólidas representam concentração de anticorpo.
[0014] Fig. 3. fornece confirmação de camundongo carboxilesterase 1c como a enzima responsável para clivagem de ligante vc-pabc no plasma por comparação de cepa de camundongo nocaute c56/bl6 ces1c-/-, cepa de heterozigoto c56/bl6 ces1c+/-, e cepa tipo silvestre c56/bl6 ces1c+/+. Descrição Detalhada
[0015] A presente invenção refere-se geralmente a conjugados de anticorpo-fármaco (ADCs) tendo um grau projetado de estabilidade. Especificamente, a invenção fornece compostos da Fórmula (I):
[0016] em que:
[0017] M é um modulador de estabilidade;
[0018] P é uma sequência de peptídeo que inclui um ou mais resíduos de glutamina;
[0019] Q é um dos referidos resíduos de glutamina presentes em P;
[0020] cada E é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em: -C(R1)2-, -OC(R1)2C(R1)2- onde r é pelo menos 2, e - C(R1)2C(R1)2O-, onde s é pelo menos 1;
[0021] cada R1 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em: H, C1-C6 alquila linear ou ramificada, C2-C6 alquenila linear ou ramificada, e C2-C6 alquinila linear ou ramificada;
[0022] cada X é independentemente um aminoácido onde cada aminoácido X é o mesmo ou é diferente;
[0023] cada Y é independentemente um aminoácido onde cada aminoácido Y é o mesmo ou é diferente;
[0024] cada Z é independentemente um elemento espaçador, onde cada elemento espaçador é o mesmo ou é diferente;
[0025] m é 0-5, n é 1-5, p é 0-2, q é 0-10, r é 0-2, e s é 0-2, onde q+r+s=2 ou mais; e
[0026] D é agente citotóxico ou outro agente terapêutico, ou D é um agente de imageamento.
[0027] Modalidades da invenção da mesma forma incluem compostos da Fórmula (II):
[0028] em que:
[0029] M é um modulador de estabilidade;
[0030] P é uma sequência de peptídeo que inclui um ou mais resíduos de glutamina;
[0031] Q é um dos referidos resíduos de glutamina presentes em P;
[0032] cada E é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em: -C(R1)2-, -OC(R1)2C(R1)2- onde r é pelo menos 2, e - C(R1)2C(R1)2O-, onde s é pelo menos 1;
[0033] cada R1 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em: H, C1-C6 alquila linear ou ramificada, C2-C6 alquenila linear ou ramificada, e C2-C6 alquinila linear ou ramificada;
[0034] cada X é independentemente um aminoácido onde cada aminoácido X é o mesmo ou é diferente;
[0035] cada Y é independentemente um aminoácido onde cada aminoácido Y é o mesmo ou é diferente;
[0036] cada Z é independentemente um elemento espaçador, onde cada elemento espaçador é o mesmo ou é diferente;
[0037] m é 0-5, n é 1-5, p é 0-2, q é 0-10, r é 0-2, e s é 0-2, onde q+r+s=2 ou mais; e
[0038] D é agente citotóxico ou outro agente terapêutico, ou D é um agente de imageamento.
[0039] Modalidades adicionais incluem compostos da Fórmula (III):
[0040] úteis para fabricação de conjugados de anticorpo fármaco, em que:
[0041] M é um modulador de estabilidade;
[0042] cada E é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em: -C(R1)2-, -OC(R1)2C(R1)2- onde r é pelo menos 2, e - C(R1)2C(R1)2O-, onde s é pelo menos 1;
[0043] cada R1 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em: H, C1-C6 alquila linear ou ramificada, C2-C6 alquenila linear ou ramificada, e C2-C6 alquinila linear ou ramificada;
[0044] cada X é independentemente um aminoácido onde cada aminoácido X é o mesmo ou é diferente;
[0045] cada Y é independentemente um aminoácido onde cada aminoácido Y é o mesmo ou é diferente;
[0046] cada Z é independentemente um elemento espaçador, onde cada elemento espaçador é o mesmo ou é diferente;
[0047] m é 0-5, n é 1-5, p é 0-2, q é 0-10, r é 0-2, e s é 0-2, onde q+r+s=2 ou mais; e
[0048] D é agente citotóxico ou outro agente terapêutico, ou D é um agente de imageamento.
[0049] Modalidades da invenção incluem compostos como descrito aqui em que M é M1-M2 onde M1 é -NR1C(O)-, -NR1-S(O)2-, ou está ausente, e M2 é selecionado a partir do grupo consistindo em: metila substituída, -C2-C20 alquila, -C1-C20 heteroalquila, -C2-C6 alquenila, -C2C6 alquinila, -C1-C6 alcóxi, carbóxi, -N(R1)2, -C6-C14 arila, -C6-C14 heteroarila, -C1-C10 heterociclila, e -C3-C10 carbociclila, e onde M2 é opcionalmente também substituído com um ou mais substituintes selecionados a partir do grupo consistindo em: -C1-C6 alquila, -C1-C6 alquenila, -C1-C6 alquinila, halo, -C1-C6 alcóxi, hidroxila, -N(R1)2, -C(O) N(R1)2, -NO2, -C6-C14 arila, -C6-C14 heteroarila, -C1-C10 heterociclila, - C3-C10 carbociclila, carbóxi, -SH, -S(C1-C6 alquila), -S(C6-C14 arila), - S(C6-C14 heteroarila), -S(C1-C10 heterociclila), -S(C3-C10) carbociclila, - C1-C8 alquil-C(O)C1-C8 alquila, -C1-C8 alquil-C(O)H, -C1-C8 alquil- C(O)O-C1-C8 alquila, -NR1C(O)N(R1)2, -C1-C8 alquil-O-C(O)N(R1)2, -C1C8 alquil-S(O)2N(R1)2, -C1-C8 alquil-S(O)2-OH, -C1-C8 alquil-S(O)2-C1- C8 alquila, e C1-C8 alquil-S(O)C1-C8 alquila; contanto que M2 não seja metila não substituída quando M1 for -NH-C(O)- e -(C(R1)2)r-Eq- (C(R1)2)s- é uma C4-alquila de cadeia linear.
[0050] Modalidades da invenção incluem compostos como descrito aqui em que M é -M1-M2 onde M1 é -NR1C(O)-, -NR1-S(O)2-, ou está ausente, e M2 é selecionado a partir do grupo consistindo em: -C2-C10 alquila, -C1-C10 heteroalquila, -C6-C14 arila, -C6-C14 heteroarila, -C1-C10 heterociclila, e -C3-C10 carbociclila, e onde M2 é opcionalmente também substituído com um ou mais substituintes selecionados a partir do grupo consistindo em: -C1-C6 alquila, halo, -C6-C14 arila, e -C6C14 heteroarila.
[0051] Modalidades adicionais incluem compostos como descrito aqui em que M2 é selecionado a partir do grupo consistindo em:
[0052] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0053] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0054] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0055] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0056] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0057] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0058] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0059] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0060] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0061] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0062] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0063] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0064] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0065] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0066] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0067] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0068] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0069] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0070] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0071] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0072] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0073] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0074] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um sistema de ligante com base em lisina com uma porção de modulação de acila modificada onde a porção de modulação de acila modificada é:
[0075] Em algumas modalidades, é fornecido um método de modular a estabilidade in vivo de um ADC, o referido método compreendendo as etapas de: selecionar modulador M capaz de modular a estabilidade extracelular do referido composto; incorporando o referido modulador M no referido conjugado; e administrando o referido conjugado a um paciente.
[0076] Em algumas modalidades, estabilidade é modulada tal que a relação de agente citotóxico liberada fora de células alvo comparada a agente citotóxico liberado dentro de células alvo é aumentada.
[0077] Em algumas modalidades, estabilidade é modulada tal que a relação de agente citotóxico liberada fora de células alvo comparada a agente citotóxico liberado dentro de células alvo é diminuída.
[0078] Em algumas modalidades, estabilidade é modulada tal que a relação de agente citotóxico liberada dentro de células alvo comparada a agente citotóxico liberado fora de células alvo é aumentada.
[0079] Em algumas modalidades, estabilidade é modulada tal que a relação de agente citotóxico liberada dentro de células alvo comparada a agente citotóxico liberado fora de células alvo é diminuída.
[0080] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos aqui também compreendem uma etapa de purificação, em que o ADC é purificado por uma etapa de cromatografia.
[0081] Em algumas modalidades, a transglutaminase é uma transglutaminase microbiana, purificada, ou criada.
[0082] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de tratar um câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um ADC ou ADCs como descrito aqui.
[0083] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de inibir crescimento de tumor ou progressão em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo o ADC como descrito aqui.
[0084] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de diagnosticar câncer em um indivíduo suspeito de sofrer de câncer, compreendendo a) contatar uma amostra do indivíduo com o ADC como descrito aqui sob condições que resultam em ligação do ADC com uma proteína relacionada a câncer, e b) determinar ligação do ADC à proteína relacionada a câncer.
[0085] Em algumas modalidades, o anticorpo no ADC como descrito aqui é um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, um minicorpo, um diacorpo, ou um fragmento de anticorpo.
[0086] Modalidades da invenção incluem compostos como descrito aqui em que o agente citotóxico D é selecionado a partir do grupo consistindo em: uma antraciclina, uma auristatina, uma espliceostatina, um dímero de CBI/CPI (incluindo dímeros "misturados" compreendendo ambos os componentes de CBI e CPI, como descrito em pedido de patente Provisório U.S. 61/932,118), uma caliqueamicina, uma duocarmicina, uma enediina, uma geldanamicina, uma maitansina, uma puromicina, um taxano, um alcaloide de vinca, SN-38, uma tubulisina, uma hemiasterlina, uma camptotecina, uma combretastatina, uma dolastatina, um dímero de indolino- benzodiazepina, um dímero de pirrolobenzodiazepina e uma pladienolida, e estereoisômeros, isósteres, análogos, ou derivados dos mesmos. Por exemplo, modalidades em que o agente citotóxico D é uma auristatina selecionada a partir do grupo consistindo em dolestatina, MMAD, MMAE, MMAF, PF06380101, PF06463377 e PF06456780.
[0087] Modalidades adicionais da invenção incluem aquelas em que D é algo diferente de um agente citotóxico, por exemplo, onde D é uma porção tendo propriedades terapêuticas (isto é, agente terapêutico) e inclui peptídeo(s), proteína(s), ácido(s) nucleico(s), fator(es) de crescimento, agente(s) antiviral(is), ou (um) agente(s) imunológico(s), ou D é um fluoróforo(s) ou outro(s) agente(s) de imageamento. Como é o caso onde D é um agente citotóxico, a invenção inclui a modulação de estabilidade de compostos em que D é diferente de agente citotóxico.
[0088] Modalidades adicionais da invenção incluem compostos em que P é um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em: Q, LQG, LLQGG (SEQ ID NO:1), LLQG (SEQ ID NO:2), LSLSQG (SEQ ID NO:3), GGGLLQGG (SEQ ID NO:4), GLLQG (SEQ ID NO:5), LLQ, GSPLAQSHGG (SEQ ID NO:6), GLLQGGG (SEQ ID NO:7), GLLQGG (SEQ ID NO:8), GLLQ (SEQ ID NO:9), LLQLLQGA (SEQ ID NO:10), LLQGA (SEQ ID NO:11), LLQYQGA (SEQ ID NO:12), LLQGSG (SEQ ID NO:13), LLQYQG (SEQ ID NO:14), LLQLLQG (SEQ ID NO:15), SLLQG (SEQ ID NO:16), LLQLQ (SEQ ID NO:17), LLQLLQ (SEQ ID NO:18), LLQGR (SEQ ID NO:19), LLQGPP (SEQ ID NO:20), LLQGPA (SEQ ID NO:21), GGLLQGPP (SEQ ID NO:22), GGLLQGA (SEQ ID NO:23), LLQGA (SEQ ID NO:24), LLQGPGK (SEQ ID NO:25), LLQGPG (SEQ ID NO:26), LLQGP (SEQ ID NO:27), LLQP (SEQ ID NO:28), LLQPGK (SEQ ID NO:29), LLQAPGK (SEQ ID NO:30), LLQGAPG (SEQ ID NO:31), LLQGAP (SEQ ID NO:32), LLQGPA (SEQ ID NO:33), LLQGPP (SEQ ID NO:34), GGLLQGPP (SEQ ID NO:35), e LLQLQG (SEQ ID NO:36).
[0089] Modalidades da invenção da mesma forma incluem compostos como descrito aqui em que P é um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácido XXQX(SEQ ID NO: 37), em que X é qualquer aminoácido.
[0090] Modalidades da invenção incluem compostos como descrito aqui em que a estabilidade do referido composto diminui em pelo menos 1, 5, 10, 25, 50, 75, ou 100 vezes, relativo ao composto correspondente faltando o referido modulador M.
[0091] Modalidades da invenção incluem compostos como descrito aqui em que a estabilidade dos referidos aumentam pelo menos 1, 5, 10, 25, 50, 75, ou 100 vezes, relativo ao composto correspondente faltando o referido modulador M.
[0092] Modalidades da invenção incluem compostos como descrito aqui em que X-Y é selecionado a partir do grupo consistindo em Gly, β-Ala, Val-Cit, Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu- Cit, Ala-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala-Leu-Ala-Leu, Phe- N9-tosyl-Arg, Phe-N9-Nitro-Arg, Val-Ala, e Ala-Ala-Asn.
[0093] Modalidades da invenção incluem compostos como descrito aqui em que P é selecionado a partir do grupo consistindo em: um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, um minicorpo e um fragmento de anticorpo.
[0094] Modalidades da invenção incluem compostos como descrito aqui em que o anticorpo é selecionado a partir de: trastuzumabe, mutantes de trastuzumabe (por exemplo, os mutantes de trastuzumabe descritos aqui ou em pedido de patente internacional PCT/IB2012/056234), oregovomabe, edrecolomabe, cetuximabe, um anticorpo monoclonal humanizado para o receptor de vitronectina (avβ3), alemtuzumabe, anticorpos anti-HLA-Dr incluindo um anticorpo anti-HLA-Dr humanizado para o tratamento do linfoma não Hodgkin, 131I Lym-1, anticorpos anti-HLA-Dr10 incluindo um anticorpo anti- HLA-Dr10 de murino para o tratamento do linfoma não Hodgkin, anticorpos anti-cd33, anticorpos anti-cd22 incluindo um mAb anti-CD22 humanizado para o tratamento de Doença de Hodgkin ou o linfoma não Hodgkin, labetuzumabe, bevacizumabe, ibritumomabe tiuxetan, ofatumumabe, panitumumabe, rituximabe, tositumomabe, ipilimumabe, e gemtuzumabe.
[0095] Modalidades adicionais da invenção incluem compostos como descrito aqui em que cada Q é independentemente um resíduo de uma glutamina endógena para uma sequência de peptídeo P, ou um resíduo de uma glutamina fornecida em uma sequência de rótulo criada em sequência do referido peptídeo P (onde o rótulo pode ser uma sequência de aminoácido múltipla contendo glutamina, ou simplesmente glutamina).
[0096] Em ainda outro aspecto da invenção o anticorpo serve como um veículo macromolecular, com ou sem uma característica de liberação alvejada, facilitando liberação controlada da carga útil D através de um ligante clivável modulado por estabilidade.
[0097] Modalidades da invenção incluem compostos como descrito aqui em que cada Q é um resíduo de uma glutamina endógena para referida sequência de peptídeo P.
[0098] Modalidades da invenção incluem compostos como descrito aqui cada Q é um resíduo de uma glutamina fornecida em uma sequência de rótulo criada em sequência do referido peptídeo P (novamente, onde o rótulo pode ser uma sequência de aminoácido múltipla contendo glutamina, ou simplesmente glutamina).
[0099] Outras modalidades da invenção incluem métodos de modular a estabilidade in vivo de um conjugado de anticorpo fármaco da Fórmula (II):
[00100] em que:
[00101] M é um modulador de estabilidade;
[00102] P é uma sequência de peptídeo que inclui um ou mais resíduos de glutamina;
[00103] Q é um dos referidos resíduos de glutamina presentes em P;
[00104] cada E é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em: -C(R1)2-, -OC(R1)2C(R1)2- onde r é pelo menos 2, e - C(R1)2C(R1)2O-, onde s é pelo menos 1;
[00105] cada R1 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em: H, C1-C6 alquila linear ou ramificada, C2-C6 alquenila linear ou ramificada, e C2-C6 alquinila linear ou ramificada;
[00106] cada X é independentemente um aminoácido onde cada aminoácido X é o mesmo ou é diferente;
[00107] cada Y é independentemente um aminoácido onde cada aminoácido Y é o mesmo ou é diferente;
[00108] cada Z é independentemente um elemento espaçador, onde cada elemento espaçador é o mesmo ou é diferente;
[00109] m é 0-5, n é 1-5, p é 0-2, q é 0-10, r é 0-2, e s é 0-2, onde q+r+s=2 ou mais; e
[00110] D é um agente citotóxico;
[00111] o referido método compreendendo as etapas de:
[00112] selecionar modulador M capaz de modular a estabilidade extracelular do referido composto;
[00113] incorporar o referido modulador M no referido conjugado; e
[00114] administrar o referido conjugado a um paciente.
[00115] Modalidades da invenção incluem métodos de tratamento como descrito aqui em que a relação de agente citotóxico liberado fora de células alvo comparada a agente citotóxico liberado dentro de células alvo é aumentada.
[00116] Modalidades da invenção incluem métodos de tratamento como descrito em que a relação de agente citotóxico liberado fora de células alvo comparada a agente citotóxico liberado dentro de células alvo é diminuída.
[00117] Modalidades da invenção incluem métodos de tratamento como descrito aqui em que a relação de agente citotóxico liberado dentro de células alvo comparada a agente citotóxico liberado fora de células alvo é aumentada.
[00118] Modalidades da invenção incluem métodos como descrito aqui em que a relação de agente citotóxico liberado dentro de células alvo comparada a agente citotóxico liberado fora de células alvo é diminuída.
[00119] Outras modalidades da invenção incluem métodos de sintetizar um composto da Fórmula (II):
[00120] em que:
[00121] M é um modulador de estabilidade;
[00122] P é uma sequência de peptídeo que inclui um ou mais resíduos de glutamina;
[00123] Q é um dos referidos resíduos de glutamina presentes em P;
[00124] cada E é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em: -C(R1)2-, -OC(R1)2C(R1)2- onde r é pelo menos 2, e - C(R1)2C(R1)2O-, onde s é pelo menos 1;
[00125] cada R1 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em: H, C1-C6 alquila linear ou ramificada, C2-C6 alquenila linear ou ramificada, e C2-C6 alquinila linear ou ramificada;
[00126] cada X é independentemente um aminoácido onde cada aminoácido X é o mesmo ou é diferente;
[00127] cada Y é independentemente um aminoácido onde cada aminoácido Y é o mesmo ou é diferente;
[00128] cada Z é independentemente um elemento espaçador, onde cada elemento espaçador é o mesmo ou é diferente;
[00129] m é 0-5, n é 1-5, p é 0-2, q é 0-10, r é 0-2, e s é 0-2, onde q+r+s=2 ou mais; e
[00130] D é um agente citotóxico;
[00131] compreendendo as etapas de:
[00132] fornecer uma quantidade de um primeiro composto da estrutura
[00133] fornecer uma quantidade de um segundo composto que compreende uma sequência de peptídeo incorporando uma glutamina; e,
[00134] reagir as referidas quantidades de primeiro e segundo compostos na presença de transglutaminase.
[00135] Modalidades da invenção incluem compostos como descrito aqui em que Z é selecionado a partir do grupo consistindo em PABC (paminobenzl-carbamoíla), PABOH (paminocarbamoilóxi).
[00136] onde T é O, NH ou S.
[00137] Modalidades da invenção incluem compostos como descrito aqui em que Z é Z1-Z2 onde: Z1 é selecionado a partir do grupo consistindo em p-aminobenzil-carbamoila (PABC), p-aminobenzilóxi, o- aminobenzilcarbamoila, o-aminobenzilóxi, -NHUC(R1)2OCO- e - NHUC(R1)2O-; Z2 está ausente ou é selecionado a partir do grupo consistindo em -N(R1)2(C1-C6alquileno)OCO-, -N(R1)2(C1- C6alquileno)N(R1)2CO-, -N(R1)2(C1-C6alquileno)SCO-, -N(R1)2(C3-C9- cicloalquileno)OCO-, -N(R1)2(C3-C9-cicloalquileno)N(R1)2CO- e - N(R1)2(C3-C9-alquileno)SCO-; em que U é um anel C5-C20 aromático ou heteroaromático opcionalmente substituído com até cinco substituintes adicional selecionados a partir do grupo consistindo em: -C1-C6 alquila, -C1-C6 alquenila, -C1-C6 alquinila, halo, C1-C6 alcóxi, hidroxila, -N(R1)2, -C(O) N(R1)2, -NO2, -C6-C14 arila, -C6-C14 heteroarila, -C1-C10 heterociclila, -C3-C10 carbociclila, carbóxi, -SH, -S(C1-C6 alquila), -S(C6- C14 arila), -S(C6-C14 heteroarila), -S(C1-C10 heterociclila), -S(C3-C10 carbociclila), -C1-C8 alquil-C(O)C1-C8 alquila, -C1-C8 alquil-C(O)H, -C1- C8 alquil-C(O)O-C1-C8 alquila, -NR1C(O)N(R1)2, -C1-C8 alquil-O- C(O)N(R1)2, -C1-C8 alquil-S(O)2N(R1)2, -C1-C8 alquil-S(O)2-OH, -C1-C8 alquil-S(O)2-C1-C8 alquila, e -C1-C8 alquil-S(O)C1-C8 alquila. O padrão de substituição de -NH- e -C(R1)2OCO- ou -C(R1)2O em U deveria estar disposto para permitir eliminação eficiente de Z2-D em clivagem de uma ligação de Y-Z. Por exemplo, veja US 7,754,681 B2 e US 6214345 B2.
[00138] O termo "alquila" por si só ou como parte de outro termo refere-se a um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada, saturado tendo o número indicado de átomos de carbono (por exemplo, "C1-C8" alquila refere-se a um grupo alquila tendo de 1 a 8 átomos de carbono). Quando o número de átomos de carbono não é indicado, o grupo alquila tem de 1 a 8 átomos de carbono. C1-C8 alquilas de cadeia linear representativas incluem, porém não são limitadas a, metila, etila, n-propila, n-butila, n-pentila, n-hexila, n-heptila e noctila; enquanto C1-C8 alquilas ramificadas incluem, porém não são limitadas a, -isopropila, -sec-butila, -isobutila, -tentbutila, -isopentila, e -2- metilbutila; C2C8 alquilas insaturadas incluem, porém não são limitadas a, vinila, allila, 1-butenila, 2-butenila, isobutilenila, 1-pentenila, 2- pentenila, 3-metil-1-butenila, 2-metil-2-butenila, 2,3-dimetil-2-butenila, 1-hexila, 2-hexila, 3-hexila, acetilenila, propinila, 1-butinila, 2-butinila, 1-pentinila, 2-pentinila e 3-metil-1-butinila.
[00139] O termo "heteroalquila" por si só ou em combinação com outro termo significa, a menos que de outra maneira declarado, um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada estável, ou combinações do mesmo, completamente saturado ou contendo de 1 a 3 graus de insaturação, consistindo no número declarado de átomos de carbono e de um a três heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo em O, N, Si e S, e em que o nitrogênio e átomos de enxofre podem opcionalmente ser oxidados e o heteroátomo de nitrogênio pode opcionalmente ser quaternizado. O(s) heteroátomo(s) O, N e S pode(m) ser colocado(s) em qualquer posição interior do grupo heteroalquila. O heteroátomo Si pode ser colocado em qualquer posição do grupo heteroalquila, incluindo a posição em que o grupo alquila é ligado ao resto da molécula. Até dois heteroátomos podem ser consecutivos.
[00140] O termo "arila," por si só ou uma parte de outro termo, significa, a menos que de outra maneira indicado, um radical de hidrocarboneto substituído ou não substituído monovalente carbocíclico aromático de 6-20, preferivelmente 6-14, átomos de carbono derivados pela remoção de um átomo de hidrogênio de um único átomo de carbono de um sistema de anel aromático origem. Grupos arila típicos incluem, porém não são limitados, aos radicais derivados de benzeno, benzeno substituído, naftaleno, antraceno, bifenila, e similar. Um grupo arila pode ser substituído com um ou mais, preferivelmente 1 a 5, dos seguintes grupos: C1-C8 alquila, -O- (C1-C8 alquila), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', - C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halogênio, -N3, -NH2, - NH(R'), -N(R')2 e -CN; em que cada R' é independentemente selecionado a partir de -H, C1-C8 alquila e arila não substituída. O termo "heterociclila" por si só ou como parte de outro termo, a menos que de outra maneira indicado, refere-se a um sistema de anel monovalente substituído ou não substituído aromático ou não aromático monocíclico, bicíclico ou tricíclico tendo de 1 a 10, preferivelmente 3 a 8, átomos de carbono (da mesma forma referido como membros de anel) e um a quatro membros de anel de heteroátomo independentemente selecionados a partir de N, O, P ou S, e derivados por remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo de anel de um sistema de anel origem. Um ou mais átomos de N, C ou S na heterociclila podem ser oxidados. O anel que inclui o heteroátomo pode ser aromático ou não aromático. A menos que de outra maneira notado, a heterociclila é ligada a seu grupo pendente em qualquer heteroátomo ou átomo de carbono que resultam em uma estrutura estável. Exemplos representativos de um -C1-C10 heterociclila incluem, porém não são limitados a, tetrairofuranila, oxetanila, piranila, pirrolidinila, piperidinila, piperazinila, benzofuranila, benzotiofeno, benzotiazolila, indolila, benzopirazolila, pirrolila, tiofenila (tiopeno), furanila, tiazolila, imidazolila, pirazolila, triazolila, quinolinila incluindo porções tal como 1,2,3,4-tetraidroquinolinila, pirimidinila, piridinila, piridonila, pirazinila, piridazinila, isotiazolila, isoxazolila, tetrazolila, epóxido, oxetano e BODIPY (substituído ou não substituído). Uma C1C10 heterociclila podem ser substituídas com até sete grupos incluindo, porém não limitado a, C1-C8 alquila, C1-C8 heteroalquila, OR', arila, - C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, - NHC(O)R', -S(=O)2R', -S(O)R', halogênio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; em que cada R' é independentemente selecionado a partir de -H, C1-C8 alquila, C1-C8 heteroalquila e arila. Em algumas modalidades, uma heterociclila substituída pode da mesma forma incluir um ou mais de: -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' e -SR'.
[00141] O termo "carbociclila" por si só ou como parte de outro termo, a menos que de outra maneira indicado, refere-se a um derivado de anel carbocíclico de 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 membros monovalente, substituído ou não substituído, saturado ou insaturado não aromático monocíclico ou bicíclico pela remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo de anel de um sistema de anel origem. Carbociclila representativa inclui, porém não é limitada a, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclopentadienila, ciclo-hexila, ciclo-hexenila, 1,3-ciclo-hexadienila, 1,4-ciclo-hexadienila, ciclo-heptila, 1,3-ciclo- heptadienila, 1,3,5-ciclo-heptatrienila, ciclo-octila, ciclo-octadienila, biciclo(1.1.1.) pentano, e biciclo(2.2.2.) octano. Um grupo carbociclila pode ser não substituído ou substituído com até sete grupos incluindo, porém não limitado a, C1-C8 alquila, C1-C8 heteroalquila, -OR', arila, - C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, - NHC(O)R', -S(=O)2R', -S(=O)R', -OH, halogênio, -N3, -NH2, -NH(R'), - N(R')2 e -CN; onde cada R' é como indicado acima.
[00142] O termo "alquenila", a menos que de outra maneira indicado, refere-se a um hidrocarboneto insaturado de cadeia linear ou ramificada contendo pelo menos uma ligação dupla e preferivelmente de 2 a 10 átomos de carbono. Exemplos de um grupo alquenila incluem, porém não são limitados a, etileno, propileno, 1-butileno, 2- butileno, isobutileno, sec-butileno, 1-penteno, 2-penteno, isopenteno, 1-hexeno, 2-hexeno, 3-hexeno, isoexeno, 1-hepteno, 2-hepteno, 3- hepteno, 1-octeno, 2-octeno, 3-octeno, 4-octeno, 1-noneno, 2-noneno, 3-noneno, 4-noneno, 1-deceno, 2-deceno, 3-deceno, 4-deceno e 5- deceno. Um grupo alquenila pode ser não substituído ou substituído.
[00143] O termo "alcóxi" refere-se ao grupo alquil-O- onde alquila é definida aqui. Grupos alcóxi exemplares incluem porém não são limitados a metóxi, etóxi, n-propóxi, 1-propóxi, n-butóxi e t-butóxi. Um grupo alcóxi pode ser não substituído ou substituído.
[00144] O termo "alquinila" refere-se a um hidrocarboneto insaturado de cadeia linear ou ramificada contendo pelo menos uma ligação tripla e preferivelmente de 2 a 10 átomos de carbono. Exemplos de um grupo alquinila incluem, porém não são limitados a, acetileno, propina, 1-butina, 2-butina, isobutina, sec-butina, 1-pentina, 2-pentina, isopentina, 1-hexina, 2-hexina, 3-hexina, isoexina, 1- heptina, 2-heptina, 3-heptina, 1-octina, 2-octina, 3-octina, 4octina, 1- nonina, 2-nonina, 3-nonina, 4-nonina, 1-decina, 2-decina, 3-decina, 4decina e 5-decina. Um grupo alquinila pode ser não substituído ou substituído.
[00145] O termo "heteroarila" refere-se a grupos aromáticos mono e bicíclicos 5-10 membros contendo pelo menos um heteroátomo selecionado a partir de oxigênio, enxofre e nitrogênio e tipicamente de 1 a 9 átomos de carbono. Exemplos de radicais de heteroarila monocíclicos incluem, porém não são limitados a, oxazinila, tiazinila, diazinila, triazinila, tiadiazoila, tetrazinila, imidazolila, tetrazolila, isoxazolila, furanila, furazanila, oxazolila, tiazolila, tiophenila, pirazolila, triazolila, pirimidinila, N-piridila, 2-piridila, 3-piridila e 4-piridila. Exemplos de radicais de heteroarila bicíclicos incluem porém não são limitados a, benzimidazolila, indolila, isoquinolinila, benzofuranila, benzotiofenila, indazolila, quinolinila, quinazolinila, purinila, benzisoxazolila, benzoxazolila, benztiazolila, benzodiazolila, benzotriazolila, isoindolila, e indazolila. Um grupo heteroarila pode ser não substituído ou substituído.
[00146] O termo "carboxila" refere-se a um grupo, tipicamente um grupo alquila como definido aqui, que é ligado à estrutura origem através do átomo de oxigênio de uma funcionalidade de carboxila (C(O)-O-). Exemplos de grupos carboxila incluem acetóxi, propionóxi, propilcarboxila, e isopentilcarboxila.
[00147] "Substituído", por exemplo, com relação a uma porção química tal como "alquila substituída", a menos que de outra maneira especificado, significa uma porção em que um ou mais átomos de hidrogênio são cada qual independentemente substituídos com um substituinte. Substituintes típicos incluem, porém não são limitados a, - X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, - N-=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -NRC(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3-, - SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, - P(=O)(OR)2, -PO32-, PO3H2, -AsO2H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, - CO2R, -CO2, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, ou -C(=NR)NR2, onde cada X é independentemente um halogênio: -F, -Cl, -Br, ou -I; e cada R é independentemente -H, C1-C20 alquila, C1-C20 heteroalquila, C6-C20 arila, C1-C10 heterociclila, um grupo de proteção ou uma porção de profármaco.
[00148] Da mesma forma, são fornecidos métodos de tratar um câncer, inibindo crescimento de tumor ou progressão, inibindo metástase de células de câncer ou tumores, ou induzindo regressão de tumor em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição farmacêutica compreendendo os ADCs como descritos aqui. Técnicas Gerais e Definições
[00149] A menos que de outra maneira definido aqui, termos científicos e técnicos usados juntamente com relação à presente invenção terão os significados que são geralmente entendidos por aqueles de experiência ordinária na técnica. Além disso, a menos que de outra maneira requerido pelo contexto, termos singulares incluirão pluralidades e termos plurais incluirão o singular. Geralmente, nomenclatura usada com relação a, e técnicas de, cultura de célula e tecido, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genéticas e proteína e química de ácido nucléico e hibridização descritas aqui são aquelas bem conhecidas e geralmente usadas na técnica.
[00150] Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descrito em várias referências gerais e mais específicas do que são citadas e discutidas ao longo da presente especificação a menos que de outra maneira indicado. Veja, por exemplo, Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel e outro, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); and Coligan e outro, Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como geralmente realizado na técnica ou como descrito aqui. A nomenclatura usada com relação a, e aos procedimentos de laboratório e técnicas de, biologia molecular, bioquímica, imunologia, química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica descritas aqui são aquelas bem conhecidas e geralmente usadas na técnica. Ao longo desta especificação e reivindicações, a palavra "compreende," ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo," será entendida por insinuar a inclusão de inteiros declarados ou grupo de inteiros, porém não a exclusão de qualquer outro inteiro ou grupo de inteiros.
[00151] O termo "rótulo contendo glutamina", "rótulo de glutamina," "Rótulo contendo Q", "rótulo Q", ou "rótulo de transglutaminase," quando aqui usado refere-se a um polipeptídeo ou uma proteína contendo um ou mais resíduo(s) de Gln, ou pode se referir a um único resíduo de glutamina ou glutamina.
[00152] Quando aqui usado, o termo "especificidade de sítio," "sítio especificamente conjugado," ou "sítio especificamente reticulado" refere-se à conjugação específica ou reticulação da porção contendo amina ao anticorpo em um sítio específico (por exemplo, em várias posições listadas na Tabela 1) por meio de um rótulo contendo glutamina, glutamina endógena, e/ou uma glutamina endógena feita reativa pela criação de anticorpo ou uma transglutaminase criada. Sítio especificidade pode ser medida por várias técnicas, incluindo, porém não limitada a, espectrometria de massa (por exemplo, espectrometria de massa de ionização de dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-MS), espectrometria de massa de ionização por eletrovaporização (ESI-MS), espectrometria de massa tandem (MS- MS), e espectrometria de massa de tempo de trajetória (TOF-MS), cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de troca iônica, mutagênese sítio dirigida, rotulagem por fluorescência, cromatografia de exclusão de tamanho, e cristalografia de raio X.
[00153] Os termos "carregamento" ou "carregamento de fármaco" ou "carregamento de carga útil" representam ou referem-se ao número médio de cargas úteis ("carga útil" e "cargas úteis" são usados alternadamente com "fármaco" e "fármacos") por anticorpo em uma molécula de ADC. Carregamento de fármaco pode variar de l a 20 fármacos por anticorpo. Isto às vezes é referido como o DAR, ou fármaco em relação de anticorpo. A relação de fármaco-anticorpo (DAR) da ADC da presente invenção é cerca de 1 a cerca de 60. Em algumas modalidades, a DAR é pelo menos cerca de qualquer de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 e 60. O número médio de fármacos por anticorpo, ou valor de DAR, pode ser caracterizado por meios convencionais tal como espectroscopia de UV/visível, espectrometria de massa, ensaio de ELISA, e HPLC. O valor de DAR quantitativo pode da mesma forma ser determinado. Em alguns exemplos, separação, purificação, e caracterização de ADCs homogêneo tendo um valor de DAR particular pode ser obtido por meios tal como HPLC de fase reversa ou eletroforese. DAR pode ser limitado pelo número de sítios de ligação no anticorpo. Por exemplo, onde a ligação é uma glutamina como na presente invenção um anticorpo pode ter apenas um ou vários resíduos de glutamina adequados pelos quais uma unidade de ligante pode ser ligada. Tipicamente, menos do que o máximo teórico de porções de fármaco são conjugados em um anticorpo durante uma reação de conjugação.
[00154] Quando aqui usado, o termo "uma glutamina endógena (Q) feita reativa" refere-se a uma glutamina endógena que foi feita acessível, exposta, ou reativa à porção contendo amina na presença de uma transglutaminase por criação de anticorpo (por exemplo, deglicosilação enzimática e/ou modificação de aminoácido) ou por uma transglutaminase criada.
[00155] Quando aqui usado, o termo "polímero biocompatível" refere-se a um polímero (por exemplo, unidades de repetição monoméricas ou estruturais) que é adequado para tratamento terapêutico ou médico em um recipiente (por exemplo, humano) sem extrair quaisquer efeitos locais ou sistêmicos indesejáveis no recipiente. Um polímero biocompatível (sintético, recombinante, ou nativo) pode ser um polímero solúvel em água ou insolúvel em água. Um polímero biocompatível pode da mesma forma ser um polímero linear ramificado.
[00156] Quando aqui usado, o termo "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídio, polipeptídeo, etc., por pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Quando aqui usado, a menos que de outra maneira indicado pelo contexto, o termo é pretendido abranger não apenas anticorpos policlonais ou monoclonais intacto, porém da mesma forma fragmentos dos mesmos (tal como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), cadeia única (ScFv) e anticorpos de domínio, incluindo anticorpos de tubarão e camelídeos), e proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo, anticorpos multivalentes (por exemplo, COVX- BODY™), anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos contanto que eles exibam a atividade biológica desejada) e fragmentos de anticorpo como descrito aqui, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tal como IgG, IgA, ou IgM (ou subclasses do mesmo), e o anticorpo não necessita ser de qualquer classe particular. Dependendo da sequência de aminoácido de anticorpo do domínio constante de suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podem ser nomeados em classes diferentes. Há cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias destas podem ser também divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de imunoglobulinas são chamados alfa, delta, epsilon, gama, e mu, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Em um aspecto, a imunoglobulina é uma imunoglobulina humana, de murino, macaco, ou coelho.
[00157] O termo "polipeptídeo contendo Fab" quando aqui usado refere-se a um polipeptídeo compreendendo um fragmento de Fab, fragmento de Fab', ou fragmento de "(Fab')2." Um polipeptídeo contendo Fab pode compreender parte ou toda de uma sequência de articulação tipo silvestre (geralmente ao terminal carboxila da porção de Fab do polipeptídeo). Um polipeptídeo contendo Fab pode ser obtido ou pode ser derivado de qualquer imunoglobulina adequada, tal como de pelo menos um dos vários subtipos de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, ou de IgA, IgE, IgD ou IgM. Um polipeptídeo contendo Fab pode ser um polipeptídeo de fusão contendo Fab, em que um ou mais polipeptídeos são ligados a um polipeptídeo contendo Fab. Uma fusão de Fab combina o polipeptídeo de Fab de uma imunoglobulina com um parceiro de fusão, que em geral pode ser qualquer proteína, polipeptídeo, ou molécula pequena. Virtualmente qualquer proteína ou molécula pequena pode ser ligada ao polipeptídeo de Fab para gerar um polipeptídeo de fusão contendo Fab. Parceiros de fusão contendo Fab podem incluir, porém não são limitados a, a região de ligação alvo de um receptor, uma molécula de adesão, um ligando, uma enzima, uma citocina, uma quimiocina, ou alguma outra proteína ou domínio de proteína.
[00158] Um "fragmento de Fab" é compreendido de uma cadeia leve e o CH1 e regiões variáveis de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula de Fab não pode formar uma ligação de dissulfeto com outra molécula de cadeia pesada.
[00159] Um "fragmento de Fab'" contém uma cadeia leve e uma porção de uma cadeia pesada que contém o domínio de VH e o domínio de CH1 e da mesma forma a região entre os domínios de CH1 e CH2, tal que uma ligação de dissulfeto de intercadeia pode ser formada entre as duas cadeias pesadas de dois fragmentos de Fab' para formar um molécula de F(ab')2.
[00160] Uma "fragmento de F(ab')2" contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas contendo uma porção da região constante entre os domínios de CH1 e CH2, tal que uma ligação de dissulfeto de intercadeia é formada entre as duas cadeias pesadas. Um fragmento de F(ab')2 é composto de dois fragmentos de Fab' que são mantidos juntos por uma ligação de dissulfeto entre as duas cadeias pesadas.
[00161] "Fragmentos de anticorpo" quando aqui usados compreendem apenas uma porção de um anticorpo intacto, em que a porção preferivelmente retém pelo menos um, preferivelmente a maioria ou todas, as funções normalmente associadas com aquela porção quando presentes em um anticorpo intacto.
[00162] Um "anticorpo multiespecífico" é um que alveja mais do que um antígeno ou epítopo. Um anticorpo "biespecífico," "específico dual" ou "bifuncional" é um anticorpo híbrido tendo dois sítios de ligação de antígeno diferentes. Anticorpos biespecíficos é uma espécie de anticorpo multiespecífico e pode ser produzido por uma variedade de métodos incluindo, porém não limitado a, fusão de hibridomas, ligação dos fragmentos de Fab, ou mutações na articulação de anticorpo e domínios de CH3. Veja, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315321 (1990); Kostelny e outro, J. Immunol. 148:15471553 (1992); and Strop e outro, J. Mol. Biol. 420(3):204219 (2012). Os dois sítios de ligação de um anticorpo biespecífico se ligarão a dois epítopos diferentes que podem residir nos mesmos ou diferentes alvos de proteína.
[00163] O termo "anticorpo monoclonal" quando aqui usado refere- se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos com exceção de possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigido contra um único antígeno. Além disso, em contraste com preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antígeno.
[00164] Os anticorpos monoclonais aqui podem, em certas modalidades, especificamente incluir anticorpos "quiméricos" em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica com ou homóloga as sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o resto da(s) cadeia(s) é(são) idêntica(s) com ou homóloga(s) as sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencendo a outra classe ou sub classe de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (Pat U.S. No. 4,816,567; e Morrison e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:68516855 (1984)).
[00165] Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo de recipiente) em que resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo de doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade desejada, afinidade, e capacidade. Em alguns exemplos, resíduos de região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Anticorpos humanizados podem, além disso, compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo de recipiente ou no anticorpo de doador. Estas modificações são feitas para também refinar desempenho de anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado substancialmente compreenderá tudo de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis em que tudo ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem aquelas de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todos os FRs são aqueles de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente da mesma forma compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para outros detalhes adicionais, veja Jones e outro, Nature 321:522525 (1986); Riechmann e outro, Nature 332:323329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593596 (1992). Veja da mesma forma os seguintes artigos de revisão e referências citadas aqui: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:10351038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428433 (1994).
[00166] Um "anticorpo humano" é um que possui uma sequência de aminoácido que corresponde aquela de um anticorpo produzido por um humano e/ou que tem usado quaisquer das técnicas para preparar anticorpos humanos como descrito aqui. Esta definição de um anticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação de antígeno não humanos.
[00167] A "região de articulação," "sequência de articulação," e variação dos mesmos, quando aqui usado, inclui o significado conhecido na técnica que é ilustrada, por exemplo, Janeway e outro, ImmunoBiology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4th ed., 1999); Bloom e outro, Protein Science (1997), 6:407415; Humphreys e outro, J. Immunol. Methods (1997), 209:193202.
[00168] O termo "polipeptídeo contendo Fc" quando aqui usado refere-se a um polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo ou uma imunoadesina) compreendendo as sequências de polipeptídeo de terminal carboxila de uma cadeia pesada de imunoglobulina. O polipeptídeo contendo Fc pode compreender regiões de Fc nativas ou variantes (isto é, sequências). A região de Fc de uma imunoglobulina geralmente compreende dois domínios constantes, um domínio de CH2 e um domínio de CH3, e opcionalmente compreende um domínio de CH4. Um polipeptídeo contendo Fc pode compreender parte ou toda de uma sequência de articulação tipo silvestre (geralmente em terminal amino do polipeptídeo contendo Fc). Um polipeptídeo contendo Fc podem da mesma forma ser um dímero. Um polipeptídeo contendo Fc pode ser obtido ou derivado de qualquer imunoglobulina adequada, tal como de pelo menos um dos vários subtipos de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, ou de IgA, IgE, IgD ou IgM. Embora os limites da região de Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina poderiam variar, por exemplo, a região de Fc de cadeia pesada de IgG humano é normalmente definida para estender de um resíduo de aminoácido na posição Glu216, ou de Ala231, ao terminal carboxila do mesmo. A numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Kabat e outro, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991.
[00169] Um polipeptídeo contendo Fc pode ser um polipeptídeo de fusão contendo Fc, em que um ou mais polipeptídeos são ligados a um polipeptídeo contendo Fc. Uma fusão de Fc combina o polipeptídeo de Fc de uma imunoglobulina com um parceiro de fusão, que em geral pode ser qualquer proteína, polipeptídeo, ou molécula pequena. Virtualmente qualquer proteína ou molécula pequena pode ser ligada à região de Fc para gerar um polipeptídeo de fusão contendo Fc. Parceiros de fusão contendo Fc podem incluir, porém não são limitados, a região de ligação alvo de um receptor, uma molécula de adesão, um ligando, uma enzima, uma citocina, uma quimiocina, ou alguma outra proteína ou domínio de proteína.
[00170] Quando aqui usado, o termo "imunoadesina" designa moléculas semelhantes a anticorpo ou semelhantes à imunoglobulina que combinam o "domínio de ligação" de uma proteína heteróloga (uma "adesina", por exemplo, um receptor, ligando ou enzima) com o componente efetor de domínios constantes de imunoglobulina (isto é, Domínio de Fc). Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão da sequência de aminoácido de adesina com a especificidade de ligação desejada que é diferente do reconhecimento de antígeno e sítio ligação (sítio de combinação de antígeno) de um anticorpo (isto é, é "heterólogo") e uma sequência de domínio constante de imunoglobulina. A sequência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como subtipos de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, IgA, IgE, IgD ou IgM.
[00171] Os termos "polipeptídeo", "oligopeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados alternadamente aqui para se referir a cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, preferivelmente, relativamente curto (por exemplo, 10-100 aminoácidos). A cadeia pode ser linear ou ramificada, pode compreender aminoácidos modificados, e/ou podem ser interrompidas por não aminoácidos. Os termos da mesma forma abrangem uma cadeia de aminoácido que foi modificada naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de rotulagem. Da mesma forma dentro da definição são incluídos, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica. É entendido que os polipeptídeos podem ocorrer como cadeias únicas ou cadeias associadas.
[00172] Quando aqui usado, o termo "aminoácido tipo silvestre," "IgG tipo silvestre," ou "mAb tipo silvestre" refere-se a uma sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente dentro de uma certa população (por exemplo, ser humano, camundongos, ratos, células, etc.).
[00173] Quando aqui usado, o termo "eficiência de conjugação" ou "eficiência de reticulação" é a relação entre as quantidades experimentalmente medidas do ADC como descrito aqui dividido pela quantidade ADC esperada máxima. Eficiência de conjugação ou eficiência de reticulação podem ser medidas por várias técnicas bem conhecidas as pessoas versadas na técnica, tal como cromatografia de interação hidrofóbica. Eficiência de conjugação pode da mesma forma ser medida em temperatura diferente, tal como temperatura ambiente ou 37°C.
[00174] O termo "função efetora" refere-se às atividades biológicas atribuíveis à região de Fc de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem, porém não são limitados a, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), ligação de receptor de Fc, citotoxicidade dependente de complemento (CDC), fagocitose, ligação de -C1q, e sub-regulação de receptores de superfície de célula (por exemplo, receptor de célula B; BCR). Veja, por exemplo, Pat U.S. No. 6,737,056. Tais funções efetoras geralmente requerem a região de Fc ser combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e pode ser avaliada usando vários ensaios conhecidos na técnica para avaliar tais funções efetoras de anticorpo. Uma medida exemplar de função efetora é através de ligação de Fcy3 e/ou C1q.
[00175] Quando aqui usado "citotoxicidade mediada por célula de dependente de anticorpo" ou "ADCC" refere-se a uma reação mediada por célula em que células citotóxicas não específicas que expressam receptores de Fc (FcRs) (por exemplo células exterminadoras naturais (NK), neotrófilos, e macrófagos) reconhecem anticorpo de ligação em uma célula-alvo e subsequentemente causa lise da célula-alvo. Atividade de ADCC de uma molécula de interesse pode ser avaliada usando um ensaio de ADCC in vitro, tal como aquele descrito em Patente U.S. No. 5,500,362 ou 5,821,3-37. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células NK. Alternativamente, ou adicionalmente, atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como aquele descrito em Clynes e outro, 1-998, PNAS (USA), 95:652656.
[00176] "Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-se ao lise de um alvo na presença de complemento. A série de reação de ativação de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a uma molécula (por exemplo um anticorpo) complexado com um antígeno cognato. Para avaliar ativação de complemento, um ensaio de CDC, por exemplo como descrito em Gazzano-Santoro e outro, J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996), pode ser realizado.
[00177] Quando aqui usado, "receptor de Fc" e "FcR" descreve um receptor que liga-se à região de Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é um que liga-se a um anticorpo de IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII, FcyRIII, e FcyRIV, incluindo variantes alélicas e formas alternativamente ligadas destes receptores. Receptores de FcyRll incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm sequências de aminoácido similares que diferem-se principalmente nos domínios citoplásmicos dos mesmos. FcRs são revisados em Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:45792; Capel e outro, 1994, Immunomethods, 4:2534; de Haas e outro, 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:33041; Nimmerjahn e outro, 2005, Immunity 23:24. "FcR" da mesma forma inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos ao feto (Guyer e outro, 1976, J. Immunol., 117:587; and Kim e outro, 1994, J. Immunol., 24:249).
[00178] O termo "purificar," e variações gramaticais do mesmo, é usado para significar a remoção, se completamente ou parcialmente, de pelo menos uma impureza de uma mistura contendo o ADC e uma ou mais impurezas, que desse modo melhoram o nível de pureza do ADC na composição (isto é, diminuindo-se a quantidade (ppm) de impureza(s) na composição).
[00179] Referência a "cerca de" um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) modalidades que são dirigidas àquele valor ou parâmetro por si próprio. Por exemplo, descrição referindo-se a "cerca de X" inclui descrição de "X." Faixas numéricas são inclusivas dos números definindo a faixa.
[00180] Um "indivíduo" ou um "sujeito" é um mamífero, mais preferivelmente, um humano. Mamíferos da mesma forma incluem, porém não são limitados a, animais de fazenda, animais de esporte, animais de estimação, primatas, cavalos, cachorros, gatos, camundongos, e ratos.
[00181] É compreendido que onde quer que seja modalidades são descritas aqui com a linguagem "compreendendo," de outra maneira modalidades análogas descritas em termos de "consistindo em" e/ou "consistindo essencialmente em" são da mesma forma fornecidas.
[00182] Onde aspectos ou modalidades da invenção são descritos em termos de um grupo Markush ou outro agrupamento de alternativas, a presente invenção abrange não apenas o grupo inteiro listado como um todo, porém cada membro do grupo individualmente e todos os possíveis subgrupos do grupo principal, porém da mesma forma o grupo principal ausente um ou mais dos membros de grupo. A presente invenção da mesma forma enfrenta a exclusão explícita de um ou mais de quaisquer dos membros de grupo na invenção reivindicada.
[00183] As designações de resíduo neste pedido estão com base no esquema de numeração EU do domínio constante (Edelman e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63(1):7885 (1969).
[00184] A menos que de outra maneira definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como geralmente entendido por alguém de experiência ordinária na técnica a qual esta invenção pertence. Métodos exemplares e materiais são descritos aqui, embora métodos e materiais similares ou equivalentes aqueles descritos podem da mesma forma ser usados na prática ou teste da presente invenção. Todas as publicações e outras referências mencionadas aqui estão incorporadas por referência em sua totalidade. No caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições controlará. Embora vários documentos sejam citados aqui, esta citação não constitui uma admissão que quaisquer destes documentos forma parte do conhecimento geral comum na técnica. Ao longo desta especificação e reivindicações, a palavra "compreende", ou variações tal como "compreende" ou "compreendendo" serão entendidos insinuar a inclusão de uma totalidade declarada ou grupo totalidades, porém não a exclusão de qualquer outra totalidade ou grupo de totalidades. A menos que de outra maneira requerido pelo contexto, termos singulares incluirão pluralidades e termos plurais incluirão o singular. Os materiais, métodos, e exemplos só ilustrativos apenas e não pretenderam ser limitantes.
[00185] Transglutaminases são proteína-glutamina y- glutamiltransferases, que tipicamente catalisam transamidação dependente de pH de resíduos de glutamina com resíduos de lisina. A transglutaminase usada na invenção descrita aqui pode ser obtida ou feita de uma variedade de fontes, ou criada para catalisar transamidação de um ou mais resíduos de glutamina endógenos com um ou mais resíduos de lisina ou outra porção contendo amina. Em algumas modalidades, a transglutaminase é uma transglutaminase dependente de cálcio que requer cálcio para induzir mudanças conformacionais de enzima e permite atividade de enzima. Por exemplo, transglutaminase pode ser derivada de fígado de cobaia e obtida através de fontes comerciais (por exemplo, Sigma-Aldrich (St Louis, MO) e MP Biomedicals (Irvina, CA)). Em algumas modalidades, a transglutaminase é uma transglutaminase independente de cálcio que não requer cálcio para induzir mudanças conformacionais de enzima e para permitir atividade de enzima. Em algumas modalidades, a transglutaminase é uma transglutaminase microbiana derivada de um genoma microbiano, tal como transglutaminase de Streptoverticillium ou Streptomices (por exemplo, Streptomyces mobarensis ou Streptoverticillium mobarensis). Transglutaminase independente de cálcio comercialmente disponível tal como ACTIVA™ (Ajinomoto, Japan) é adequada para a presente invenção. Em algumas modalidades, a transglutaminase é uma proteína de mamífero (por exemplo, transglutaminase humana), uma proteína bacteriana, uma proteína de planta, uma proteína de fungos (por exemplo, Oomycetes e Actinomicetes transglutaminases), ou uma proteína procariótica. Em algumas modalidades, a transglutaminase é de Micrococcus, Clostridium, Turolpsis, Rhizopus, Monascus, ou Bacillus.
[00186] Em algumas modalidades, a transglutaminase usada na invenção descrita aqui é uma transglutaminase criada que catalisa transamidação de um ou mais resíduos de glutamina endógenos no anticorpo com um ou mais resíduos de lisina ou outra porção contendo aminas. Por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido tipo silvestre na transglutaminase de ocorrência natural podem ser deletados, ou trocado ou substituído com outro(s) resíduo(s) de aminoácido para preparar a transglutaminase criada.
[00187] Em algumas modalidades, a transglutaminase usada na invenção descrita aqui pode da mesma forma ser uma proteína recombinante produzida usando técnicas recombinantes conhecidas a pessoas versadas na técnica. Em algumas modalidades, a transglutaminase usada na invenção descrita aqui pode ser uma proteína purificada. Por exemplo, a transglutaminase purificada é menos do que cerca de 50% pura. Quando aqui usado, proteína "pura" ou "purificada" refere-se a uma proteína (por exemplo, transglutaminase) livre de outros contaminantes de proteína. Em algumas modalidades, a transglutaminase purificada é pelo menos cerca de quaisquer de 55%-60%, 60%-65%, 65%-70%, 70%-75%, 75%-80%, 80%-85%, 85%-90%, 90%-95%, 95%-98%, ou 99% pura. Em algumas modalidades, a transglutaminase purificada é cerca de quaisquer de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% pura.
[00188] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende pelo menos 1 glutamina endógena feita reativa em uma reação de transamidação por criação de anticorpo ou por uma transglutaminase criada. Em algumas modalidades, a criação de anticorpo é deglicosilação de anticorpo (por exemplo, deglicosilação enzimática); ou modificação de aminoácido incluindo deleção de aminoácido, inserção, substituição, mutação, ou qualquer combinação do mesmo no anticorpo. Por exemplo, o aminoácido tipo silvestre Asn (N) na posição 297 em um anticorpo é substituído ou mudado com aminoácido Ala (A), resultando em aglicosilação na posição 297 e glutamina endógena reativa (Q) na posição 295. Em outro exemplo a modificação de aminoácido no anticorpo é uma substituição de aminoácido N para Q na posição 297, resultando em aglicosilação na posição 297, Q endógeno reativo na posição 295, e conjugação sítio específica entre o N297Q e Q295 e uma ou mais porções contendo amina nestes dois sítios na presença de uma transglutaminase.
[00189] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende um rótulo contendo glutamina criado em pelo menos uma ou mais posições incluindo, porém não limitado a, 1) terminal carboxila de uma cadeia leve, uma cadeia pesada, ou a cadeia leve e a cadeia pesada; 2) terminal amino de uma cadeia leve, uma cadeia pesada, ou a cadeia leve e a cadeia pesada; e 3) S60R61, R108, T135, S160, S168, S190S192, P189S192, G200S202, K222T225, K222T223, T223, L251S254, M252I253, E294N297, E293N297, N297, e/ou G385, em que o rótulo contendo glutamina é inserido no anticorpo ou substitui um ou mais aminoácido endógeno no anticorpo.
[00190] Exemplos da glutamina específica contendo rótulo e sua posição criada correspondente na Tabela 1, e são descritos nos WO2012/059882 e WO2015/015448, que estão incorporados aqui por referência.
[00191] Em algumas modalidades, o anticorpo do ADC compreende uma modificação de aminoácido na posição 222, 340, ou 370 (numeração de EU) relativo ao anticorpo tipo silvestre na mesma posição. Em algumas modalidades, a modificação é uma delecção de aminoácido, inserção, substituição, mutação, ou qualquer combinação do mesmo. Em algumas modalidades, a substituição compreende substituir um aminoácido tipo silvestre com outro (por exemplo, um aminoácido de tipo não silvestre). Em algumas modalidades, o outro (por exemplo, tipo não silvestre) ou aminoácido inserido é Arg (por exemplo, K222R, K340R, ou K370R). Em algumas modalidades, a inserção compreende inserir um ou mais aminoácido(s) (por exemplo, inserir um, dois, três ou mais aminoácidos). Em algumas modalidades, o outro (por exemplo, tipo não silvestre) aminoácido é Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val.
[00192] Desta maneira, em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende a) substituições de aminoácido nas posições N297Q e K222R, em que a porção contendo amina é sítio especificamente conjugada à glutamina endógena na posição 295 e a glutamina substituída na posição 297; e/ou b) um ou mais rótulo(s) contendo glutamina, em que a porção contendo amina é sítio especificamente conjugada ao(s) rótulo(s) contendo glutamina em um terminal carboxila de uma cadeia leve do anticorpo. Em algumas modalidades a relação de fármaco-anticorpo (DAR) é aproximadamente 39. Em algumas modalidades, o rótulo contendo glutamina ao terminal carboxila da cadeia leve do anticorpo é GGLLQGA (SEQ ID NO: 23).
[00193] Em algumas modalidades, o ADC da presente invenção compreende a) uma substituição de aminoácido nas posições N297Q e K222R, em que a porção contendo amina é sítio especificamente conjugada à glutamina endógena na posição 295 e a glutamina substituída na posição 297; b) um ou mais rótulo(s) contendo glutamina, em que a porção contendo amina é sítio especificamente conjugada ao(s) rótulo(s) contendo glutamina a um terminal carboxila de uma cadeia leve do anticorpo; e/ou c) um ou mais rótulo(s) contendo glutamina, em que a porção contendo amina é também sítio especificamente conjugada ao rótulo contendo glutamina em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo consistindo em S60R61, R108, T135, S160, S168, S190S192, P189S192, G200S202, K222T225, K222T223, T223, L251S254, M252I253, E294N297, E293N297, N297, e G385 no anticorpo, em que o rótulo contendo glutamina é inserido no anticorpo ou substitui um ou mais aminoácido endógeno no anticorpo. Em algumas modalidades, a relação de fármaco-anticorpo é pelo menos de que cerca de 6. Por exemplo, em algumas modalidades, o ADC da presente invenção da mesma forma compreende a) uma substituição de aminoácido nas posições N297Q e K222R, em que a porção contendo amina é sítio especificamente conjugada à glutamina endógena na posição 295 e a glutamina substituída na posição 297; b) um ou mais rótulo(s) contendo glutamina, em que a porção contendo amina é sítio especificamente conjugada ao(s) rótulo(s) contendo glutamina a um terminal carboxila de uma cadeia leve do anticorpo; c) um ou mais rótulo(s) de glutamina, em que a porção contendo amina é também sítio especificamente conjugada ao rótulo contendo glutamina em um terminal carboxila de uma cadeia pesada do anticorpo; e em que a relação de fármaco- anticorpo (DAR) é cerca de 6-9. Em algumas modalidades, o rótulo contendo glutamina ao terminal carboxila da cadeia leve do anticorpo é GGLLQGA (SEQ ID NO: 23); e o rótulo contendo glutamina ao terminal carboxila da cadeia pesada do anticorpo é LLQGA (SEQ ID NO: 11).
[00194] Em uma variação, o ADC da presente invenção compreende a) uma substituição de aminoácido nas posições N297Q e K222R, em que a porção contendo amina é sítio especificamente conjugada à glutamina endógena na posição 295 e a glutamina substituída na posição 297; b) um ou mais rótulo(s) contendo glutamina, em que a porção contendo amina é sítio especificamente conjugada ao(s) rótulo(s) contendo glutamina a um terminal carboxila de uma cadeia leve do anticorpo; c) um ou mais rótulo(s) contendo glutamina, em que a porção contendo amina é da mesma forma sítio especificamente conjugada ao rótulo contendo glutamina inserido depois da posição de aminoácido T135 em uma cadeia pesada do anticorpo; e em que a relação de fármaco-anticorpo (DAR) é cerca de 6-9. Em algumas modalidades, o rótulo contendo glutamina ao terminal carboxila da cadeia leve do anticorpo é GGLLQGA (SEQ ID NO: 23); e o rótulo contendo glutamina inserido depois de T135 na cadeia pesada do anticorpo é LLQG (SEQ ID NO: 2).
[00195] Em outra variação, o ADC da presente invenção compreende a) uma substituição de aminoácido nas posições N297Q e K222R, em que a porção contendo amina é sítio especificamente conjugada à glutamina endógena na posição 295 e a glutamina substituída na posição 297; b) um ou mais rótulo(s) contendo glutamina, em que a porção contendo amina é sítio especificamente conjugada ao(s) rótulo(s) contendo glutamina a um terminal carboxila de uma cadeia leve do anticorpo; c) um ou mais rótulo(s) contendo glutamina, em que a porção contendo amina é também sítio especificamente conjugada ao rótulo contendo glutamina nas posições de aminoácido G200S202 em uma cadeia pesada do anticorpo; e em que a relação de fármaco-anticorpo (DAR) é cerca de 6-9. Em algumas modalidades, o rótulo contendo glutamina ao terminal carboxila da cadeia leve do anticorpo é GGLLQGA (SEQ ID NO: 23); e o rótulo contendo glutamina inserido depois de T135 na cadeia pesada do anticorpo é LLQG (SEQ ID NO: 2).
[00196] Em algumas modalidades, o rótulo contendo glutamina para o ADC descrito aqui compreende uma sequência de aminoácido XXQX (SEQ ID NO:37), em que X pode ser um aminoácido convencional ou não convencional, como descrito aqui. Por exemplo, em algumas modalidades, X é L (Leu), UM (o Ala), G (Gly), S (Ser), V (Val), F (Phe), Y (Tyr), H (His), R (Arg), N (Asn), E (Glu), D (Asp), C (Cys), Q (Gln), I (Ile), M (Met), P (Pro), T (Thr), K (Lys), ou W (Trp).
[00197] Em algumas modalidades, o rótulo contendo glutamina compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em Q, LQG, LLQGG (SEQ ID NO:1), LLQG (SEQ ID NO:2), LSLSQG (SEQ ID NO:3), GGGLLQGG (SEQ ID NO:4), GLLQG (SEQ ID NO:5), LLQ, GSPLAQSHGG (SEQ ID NO:6), GLLQGGG (SEQ ID NO:7), GLLQGG (SEQ ID NO:8), GLLQ (SEQ ID NO:9), LLQLLQGA (SEQ ID NO:10), LLQGA (SEQ ID NO:11), LLQYQGA (SEQ ID NO:12), LLQGSG (SEQ ID NO:13), LLQYQG (SEQ ID NO:14), LLQLLQG (SEQ ID NO:15), SLLQG (SEQ ID NO:16), LLQLQ (SEQ ID NO:17), LLQLLQ (SEQ ID NO:18), LLQGR (SEQ ID NO:19), LLQGPP (SEQ ID NO:20), LLQGPA (SEQ ID NO:21), GGLLQGPP (SEQ ID NO:22), GGLLQGA (SEQ ID NO:23), LLQGA (SEQ ID NO:24), LLQGPGK (SEQ ID NO:25), LLQGPG (SEQ ID NO:26), LLQGP (SEQ ID NO:27), LLQP (SEQ ID NO:28), LLQPGK (SEQ ID NO:29), LLQAPGK (SEQ ID NO:30), LLQGAPG (SEQ ID NO:31), LLQGAP (SEQ ID NO:32), LLQGPA (SEQ ID NO:33), LLQGPP (SEQ ID NO:34), GGLLQGPP (SEQ ID NO:35), e LLQLQG (SEQ ID NO:36).
[00198] Em algumas modalidades, o rótulo contendo glutamina compreende uma sequência de aminoácido LLQGA (SEQ ID NO: 24), LQG, GGLLQGA (SEQ ID NO:23), LLQGPA (SEQ ID NO:33), LLQGPP (SEQ ID NO:34), GGLLQGPP (SEQ ID NO:35), LLQGSG (SEQ ID NO:13), LLQG (SEQ ID NO:2), LLQYQG (SEQ ID NO:14), LLQLLQG (SEQ ID NO:15), LLQLQG (SEQ ID NO:36), LLQLLQ (SEQ ID NO:18), LLQLQ (SEQ ID NO:17), LLQGR (SEQ ID NO:19), LLQYQGA (SEQ ID NO:12), SLLQG (SEQ ID NO:16), ou LLQLLQGA (SEQ ID NO:10).
[00199] Em algumas modalidades, o rótulo contendo glutamina não compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em LGGQGGG (SEQ ID NO:41), GGGQGGL (SEQ ID NO:42), GXGQGGG (SEQ ID NO:43),GGXQGGG (SEQ ID NO:44), GGGQXGG (SEQ ID NO:45), e GGGQGXG (SEQ ID NO:46), em que X é G, A, S, L, V, F, Y, R, N, ou E). Outros rótulos exemplares são da mesma forma descritos, por exemplo, nas US2013/0230543 e US2013/0122020.
[00200] Em algumas modalidades, o anticorpo do ADCs como descrito aqui compreende uma modificação de aminoácido na última posição de aminoácido no terminal carboxila relativo a um anticorpo tipo silvestre na mesma posição. Em algumas modalidades, a modificação é uma deleção de aminoácido, inserção, substituição, mutação, ou qualquer combinação do mesmo. Em algumas modalidades, a substituição compreende substituir um aminoácido tipo silvestre com outro (por exemplo, um aminoácido tipo não silvestre). Em algumas modalidades, a inserção compreende inserir um ou mais aminoácido(s) (por exemplo, inserindo um, dois, três ou mais aminoácidos). Em algumas modalidades, o outro (por exemplo, tipo não silvestre) ou aminoácido inserido é Arg. Em algumas modalidades, o outro (por exemplo, tipo não silvestre) aminoácido é Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val,. Por exemplo, em algumas modalidades, o último aminoácido no terminal carboxila do anticorpo (por exemplo, a cadeia pesada de um anticorpo) pode ser deletado, e o rótulo contendo glutamina criado ao terminal C do polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido LLQGA (SEQ ID NO:11) ou GGLLQGA (SEQ ID NO:23).
[00201] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma modificação de aminoácido na primeira posição de aminoácido no terminal amino relativo, a um anticorpo tipo silvestre na mesma posição. Em algumas modalidades, a modificação é uma deleção de aminoácido, inserção, substituição, mutação, ou qualquer combinação do mesmo. Em algumas modalidades, a substituição compreende substituir um aminoácido tipo silvestre com outro (por exemplo, tipo não silvestre) aminoácido. Em algumas modalidades, a inserção compreende inserir um aminoácido. Em algumas modalidades, o tipo não silvestre ou aminoácido inserido é Arg. Em algumas modalidades, o outro (tipo não silvestre ou inserido) aminoácido é Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, ou Val.
[00202] Em algumas modalidades, o ADC descrito aqui compreende uma cadeia pesada de anticorpo de tamanho natural e uma cadeia leve de anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui é um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, um minicorpo, um diacorpo, ou um fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um IgG. Em algumas modalidades, o IgG é selecionado a partir do grupo consistindo em IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo é um IgA, IgE, IgD, ou IgM. Em algumas modalidades, a função efetora (por exemplo, como medido por ligação de Fcy3 e/ou C1q) dos ADCs descritos aqui diminui não mais do que cerca de qualaquer de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, ou 5 vezes relativo a um anticorpo tipo silvestre. Em algumas modalidades, o anticorpo do ADC é um IgG, em que a função efetora do IgG diminui não mais do que cerca de 2 vezes relativo a um IgG tipo silvestre. Em outras modalidades, a função efetora do IgG diminui cerca de 2 vezes relativo a um IgG tipo silvestre. Em outras modalidades, a função efetora do IgG diminui mais do que cerca de 2 vezes relativo a um IgG tipo silvestre. Em algumas modalidades, o anticorpo do ADC é um IgG, em que a função efetora do IgG diminui nenhum mais do que cerca de 1 vez relativo a um IgG tipo silvestre. Em outras modalidades, a função efetora do IgG diminui cerca de 1 vez relativo a um IgG tipo silvestre. Em algumas modalidades, a função efetora do IgG diminui mais que cerca de quaisquer de 1 vez, 3 vezes, 4 vezes, ou 5 vezes relativo a um IgG tipo silvestre.
[00203] O número de agentes de porções de contendo amina que podem ser conjugados ao anticorpo é dependente de 1) o número de rótulos contendo glutamina que são ligados/inseridos ao anticorpo bem como o número de glutaminas no rótulo contendo glutamina; e/ou 2) o número de glutaminas endógenas no anticorpo (isto é, glutaminas nativas sem criação, tal como glutaminas nos domínios variáveis, CDRs, etc.) e/ou 3) o número de glutaminas endógenas feitas reativas pela criação de anticorpo como descrito aqui ou uma transglutaminase criada. Por exemplo, duas porções contendo amina podem ser sítio especificamente conjugadas a um anticorpo ao terminal carboxila das duas cadeias leves, e quatro porções contendo amina podem ser sítio especificamente conjugadas ao anticorpo nas posições Q295 e N297Q. Em algumas modalidades, a porção contendo amina podem ser as mesmas ou diferentes em cada posição de conjugação.
[00204] Exemplos de um agente citotóxico incluem, porém não são limitados a, uma antraciclina, uma auristatina (por exemplo, dolestatina, MMAD, MMAE, MMAF, PF06380101, PF06463377 e PF06456780), uma espliceostatina, um dímero de CBI/CPI (incluindo dímeros "misturados" compreendendo ambos os componentes CBI e CPI, como descrito em pedido de patente provisório U.S. 61/932,118), uma caliqueamicina, uma duocarmicina, uma enediina, uma geldanamicina, uma maitansina, uma puromicina, um taxano, um alcaloide de vinca, SN-38, uma tubulisina, uma hemiasterlina, uma camptotecina, uma combretastatina, uma dolastatina, um dímero de indolino-benzodiazepina, um dímero de pirrolobenzodiazepina e uma pladienolida, e estereoisômeros, isósteres, análogos, ou derivados dos mesmos.
[00205] As antraciclinas são derivados de bactérias Strepomyces e foram usadas para tratar uma ampla faixa de cânceres, tal como leucemias, linfomas, cânceres de mama, uterinos, ovarianos, e do pulmão. Antraciclinas exemplares incluem, porém não são limitadas a, daunorrubicina, doxorubicina (isto é, adriamicina), epirubicina, idarubicina, valrubicina, e mitoxantrona.
[00206] Dolastatinas e seus análogos peptídicos e derivados, auristatinas, são agentes antimitóticos altamente potentes que foram mostrados ter atividade anticâncer e antifúngica. Veja, por exemplo, Pat. U.S. No. 5,663,149 e Pettit e outro, Antimicrob. Agents Chemother. 42:29612965, 1998. Dolastatinas exemplares e auristatinas incluem, porém não são limitadas a, dolastatina 10, auristatina E, auristatina EB (AEB), auristatina EFP (AEFP), MMAD (Monometil Auristatina D ou monometil dolastatina 10), MMAF (Monometil Auristatina F ou N-metilvalina-valina-dolaisoleuina- dolaproína-fenilalanina), MMAE (Monometil Auristatina E ou N- metilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproína-norefedrina), éster de ácidoAE 5-benzoilvalérico (AEVB), e outras novas auristatinas (tal como aquelas descritas em Publicação U.S. No. 2013/0129753). Em algumas modalidades, a auristatina é 0101 (2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoeptan-4-il]-N-metil-L-valinamida) tendo a seguinte estrutura:
[00207] Em algumas modalidades, a auristatina é 3377 (N,2- dimetilalanil-N-{(1S,2R)4{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxil-2- feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1- [(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida) tendo a seguinte estrutura:
[00208] Em outras modalidades, a auristatina é 0131 (2-metil-L- proli-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2- feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5- metil-1-oxoeptan-4-il]-N-metil-L-valinamida) tendo a seguinte estrutura:
[00209] Em outras modalidades, a auristatina é 0121(2-metil-L-proli- N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3- fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoeptan-4-il]-N-metil-L-valinamida) tendo a seguinte estrutura:
[00210] Camptotecina é um alcalooide de quinolina citotóxico que inibe a enzima topoisomerase I. Exemplos de camptotecina e seus derivados incluem, porém não são limitados a, topotecano e irinotecano, e seus metabólitos, tal como SN-38.
[00211] Combretaestatinas são fenóis naturais com propriedades de rompimento vascular em tumores. Combretaestatinas exemplares e seus derivados incluem, porém não são limitadas a, combretaestatina A-4 (CA4) e ombrabulina.
[00212] Duocarmicina e CC-1065 são agentes de alquilação de DNA com potência citotóxica. Veja Boger e Johnson, PNAS 92:36423649 (1995). Dolaestatinas exemplares e auriestatinas incluem, porém não são limitadas a, (+)docarmicina A e (+)duocarmicina SA, e (+)-CC-1065.
[00213] Enediinas são uma classe de produtos bacterianos antitumor caracterizados por nove e dez membros de anel ou a presença de um sistema cíclico de ligações tripla-dupla-tripla conjugadas. Enediinas exemplares incluem, porém não são limitadas a, caliqueamicina, esperamicina, uncialamicina, dinemicina, e seus derivados.
[00214] Hemiasterlina e seus análogos (por exemplo, HTI-286) ligam-se a tubulina, rompem dinâmicas de microtúbulo normais, e, em quantidades esteiquiométricas, despolimerizam microtúbulos.
[00215] Geldanamicinas são antibiótico de benzoquinona ansamicina que ligam-se a Hsp90 (Proteína de Choque Térmico 90) e foi usado fármacos anti-tumor. Geldanamicinas exemplares incluem, porém não são limitadas a, 17-AAG (17-N-Alilamino-17- Demetoxigeldanamicina) e 17-DMAG (17-Dimetilaminoetilamino-17- demetoxigeldanamicina).
[00216] Maitansinas ou seus maitansinoides derivados inibem proliferação celular inibindo-se a formação de mcirotúbulos durante mitose através da inibição de polimerização de tubulina. Veja Remillard e outro, Science 189:10021005 (1975). Maitansinas exemplares e maitansinoides incluem, porém não são limitados a, mertansina (DM1) e seus derivados bem como ansamitocina.
[00217] Dímeros de pirrolobenzodiazepina (PBDs) e dímeros de indolino-benzodiazepina (IGNs) são agentes antitumor que contêm um ou mais grupos funcionais imina, ou seus equivalentes, que ligam-se a DNA dúplex. Moléculas de PBD e IGN estão com base no produto natural atramicina, e interagem com DNA de uma maneira sequência- seletiva, com uma preferência por sequência de purina-guanina- purina. PBDs exemplar e seus análogos incluem, porém não são limitados a, SJG136.
[00218] Espliceoestatinas e pladienolidas são compostos anti-tumor que inibem entrançamento e interagem com espliceosoma, SF3b. Exemplos de espliceoestatinas incluem, porém não são limitados a, espliceostatina A, FR901464. Exemplos de pladienolidas incluem, porém não são limitados a, Pladienolida B, Pladienolida D, e E7107.
[00219] Taxanos são diterpenos que agem como agentes anti- tubulina ou inibidores mitóticos. Taxanos exemplares incluem, porém não são limitados a, paclitaxel (por exemplo, TAXOL®) e docetaxel (TAXOTERE®).
[00220] Alcaloides de vinca são da mesma forma os agentes anti- tubulina. Alcaloides de vinca exemplares incluem, porém não são limitados a, vincristina, vinblastina, vindesina, e vinorelbina.
[00221] Em algumas modalidades, a porção de agente é um polipeptídeo de toxina (ou uma proteína de toxina). Exemplos de um polipeptídeo de toxina incluem, porém não são limitados a, cadeia de difteria A, fragmentos ativos sem ligação de toxina de difteria, cadeia de exotoxina A, cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modecina A, alfasarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, tricotecenos, inibidor de peptídeos de nódulo de cistina (ICK) (por exemplo, ceratotoxinas), e conotoxina (por exemplo, KIIIA ou SmIIIa). Métodos para Conjugar ADCs
[00222] Conjugação de anticorpos anti-Trop2 com o ligante-cargas úteis da presente invenção é realizada pela qual uma quantidade de anticorpo é ajustada a 5 mg/mL em tampão contendo 25 mM de Tris- HCl, pH 8,0-8,5. Uma quantidade de ligante-carga útil é adicionada em uma 5-50 vezes, ou 5-500 vezes, excesso molar sobre anticorpo e a reação enzimática iniciada por adição de 2% (w/v) transglutaminase bacteriana (Ajinomoto Activa TI, Japan), e incubado com agitação suave a 37°C durante 16-24 horas. O ADC é purificado usando Butyl SepharoseTM High Performance (Butyl HP, GE Healthcare Biosciences) ajustando-se a mistura reacional para obter uma composição de tampão de 0,75 M de sulfato de amônio, 25 mM de fosfato de potássio, pH 7 (Tampão A). O material é aplicado a um Butyl HP, lavado com 5 CV Tampão A, e eluído com um gradiente linear de 20 CV em 25 mM de fosfato de potássio, pH 7. Frações contendo o ADC são agrupadas, dializadas contra PBS, concentradas usando uma unidade de filtro centrífuga de 10 kDa Amicon Ultra (Millipore Corporation), e filtrada estéril através de um filtro de 0,2 μm. Alternativamente, o ADC é purificado usando resina MabSelect Protein A (GE Healthcare Biosciences) seguindo protocolos-padrão, e tampão trocado em PBS. Outros métodos de conjugar ADCs são conhecidos, incluindo aqueles métodos descritos no WO2012/059882. Método de Usar Conjugados de Anticorpo-Fármaco da Invenção
[00223] Os ADCs da presente invenção são úteis em várias aplicações incluindo, porém não são limitados a, métodos de tratamento terapêuticos e métodos de tratamento diagnósticos.
[00224] Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar um câncer em um indivíduo. Desta maneira, em algumas modalidades, fornecido é um método de tratar um câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) compreendendo o ADC como descrito aqui. Quando aqui usado, cânceres incluem, porém não são limitados a, um câncer sólido (tal como câncer de bexiga, mama, cervical, coriocarcinoma, cólon, esofágico, gástrico, glioblastoma, cabeça e pescoço, rim, fígado, pulmão (por exemplo, Câncer do pulmão de Célula Não Pequena (NSCLC)), oral, ovariano, pancreático, prostático, e pele); e um câncer líquido (tal como leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mielogenosa aguda (AML), leucemia mielogenosa crônica (CML), leucemia de célula pilosa (HCL), leucemia prolinfocítica de célula T (T-PLL), leucemia linfocítica granular grande, leucemia de célula T adulta e mieloma múltiplo).
[00225] Em algumas modalidades, fornecido é um método de inibir crescimento de tumor ou progressão em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo os ADCs como descrito aqui. Em outras modalidades, fornecido é um método de inibir metástase de células de câncer ou tumores (por exemplo, tumores sólidos ou líquidos) em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo os ADCs como descrito aqui. Em outras modalidades, fornecido é um método de induzir regressão de tumor em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo os ADCs como descrito aqui.
[00226] A porção de agente nos ADCs como descrito aqui pode ser uma porção detectável tal como agente de imageamento e um rótulo de enzima-substrato. Os ADCs como descrito aqui podem da mesma forma ser usados para ensaios diagnósticos in vivo, tal como imageamento in vivo (por exemplo, PET ou SPECT), ou um reagente de manchamento.
[00227] Em algumas modalidades, os métodos descritos aqui também compreendem uma etapa de tratar um indivíduo com uma forma adicional de terapia. Em algumas modalidades, a forma adicional de terapia é uma terapia anti-câncer adicional incluindo, porém não limitada a, quimioterapia, radiação, cirurgia, terapia de hormônio, e/ou imunoterapia adicional.
[00228] Em algumas modalidades, a forma adicional de terapia compreende administrar um ou mais agente terapêutico além dos ADCs como descrito aqui. Os agentes terapêuticos incluem, porém não são limitados a, um segundo ADC (por exemplo, ADC convencional tal como brentuximabe vedotina (ADCETRIS®) e adotrastuzumabe entansina (KADCYLA®)), um anticorpo (por exemplo, um anticorpo de anti-VEGF, um anticorpo anti-HER2, anticorpo anti-CD25, e/ou um anticorpo anti-CD20), um inibidor de angiogênese, agente citotóxico (por exemplo, docetaxel, cisplatina, doxorrubicina, mitomicina, tamoxifena, ou fluorouracila), e agente anti- inflamatório (por exemplo, prednisona, e progesterona). Composições farmacêuticas
[00229] A presente invenção da mesma forma fornece uma composição farmacêutica compreendendo os ADCs como descrito aqui em um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável. Os ADCs podem ser administrados sozinhos ou em combinação com um ou mais outros ADCs da invenção ou em combinação com um ou mais outros fármacos (ou como qualquer combinação dos mesmos). Por exemplo, os ADCs da presente invenção podem ser administrados em combinação com os ADCs convencionais (isto é, não projetado com características de modulação de estabilidade). Os métodos e usos da invenção desse modo da mesma forma abrangem modalidades de combinações (coadministração) com outros agentes ativos, como detalhado abaixo.
[00230] Quando aqui usado, o termo "coadministração," "coadministrado," ou "em combinação com" é pretendido significar e refere-se ao seguinte: (i) administração simultânea de uma combinação de um ADC descrito aqui e agente(s) terapêutico(s) para um paciente em necessidade de tratamento, quando tais componentes são formulados juntos em uma única forma de dosagem que libera os referidos componentes substancialmente ao mesmo tempo ao referido paciente; (ii) administração substancialmente simultânea de tal combinação de um ADC descrito aqui e agente(s) terapêutico(s) a um paciente em necessidade de tratamento, quando tais componentes são formulados aparte um do outro em formas de dosagem separadas que são empregadas substancialmente ao mesmo tempo ao referido paciente, depois disso os referidos componentes são liberados substancialmente ao mesmo tempo ao referido paciente; (iii) administração sequencial de tal combinação de um ADC descrito aqui e agente(s) terapêutico(s) a um paciente em necessidade de tratamento, quando tais componentes são formulados aparte um do outro em formas de dosagem separadas que são empregadas em tempos consecutivos pelo referido paciente com um intervalo de tempo significante entre cada administração, depois os referidos componentes são liberados em tempos substancialmente diferentes ao referido paciente; e (iv) administração sequencial de tal combinação de um ADC descrito aqui e agente(s) terapêutico(s) a um paciente em necessidade de tratamento, quando tais componentes são formulados juntos em uma única forma de dosagem que libera os referidos componentes de uma maneira controlada depois disso eles são simultaneamente, consecutivamente, e/ou por sobreposição liberados ao mesmo tempo e/ou tempos diferentes ao referido paciente, onde cada parte pode ser administrada na mesmo ou uma rotina diferente.
[00231] Geralmente, os ADCs descritos aqui são adequados para ser administrados como uma formulação em associação com um ou mais excipiente(s) farmaceuticamente aceitável(is). O termo 'excipiente' é aqui usado para descrever qualquer ingrediente diferente do(s) composto(s) da invenção. A escolha de excipiente(s) em uma ampla extensão dependa de fatores tais como o modo particular de administração, o efeito do excipiente em solubilidade e estabilidade, e a natureza da forma de dosagem. Quando aqui usado, "excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, isotônicos e agentes de atraso de absorção, e similar que são fisiologicamente compatíveis. Alguns exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis são água, solução salina, solução salina tamponada de fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similar, bem como combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, agentes isotônicos, incluindo, porém não limitados a, açúcares, poliálcoois (por exemplo, manitol, sorbitol) ou cloreto de sódio são incluídos na composição farmacêutica. Exemplos adicionais de substâncias farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém não são limitadas a, agentes umectantes ou quantidades menores de substâncias auxiliares tal como agentes umectantes ou emulsificantes, preservativos ou tampões, que realçam a vida de prateleira ou efetividade do anticorpo.
[00232] Em algumas modalidades, os ADCs descritos aqui podem ser desimunizados para reduzir imunogenicidade em administração a um indivíduo processando técnicas conhecidas tal como aquelas descritas, por exemplo, em Publicação PCT WO98/52976 e WO00/34317.
[00233] Composições farmacêuticas da presente invenção e métodos para sua preparação são facilmente aparentes para aqueles versados na técnica. Tais composições e métodos para sua preparação podem ser encontrados, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd Edition (Mack Publishing Company, 2012). Composições farmacêuticas são preferivelmente fabricadas sob condições de GMP.
[00234] Uma composição farmacêutica da invenção pode ser preparada, empacotadas, ou vendida a granel, como uma única dose unitária, ou como uma pluralidade de únicas doses unitárias. Quando aqui usado, uma dose unitária é quantidade discreta da composição farmacêutica compreendendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo. A quantidade do ingrediente ativo é geralmente igual à dosagem do ingrediente ativo tal que seria administrada a um indivíduo ou uma fração conveniente de uma tal dosagem, por exemplo, uma metade ou um terço de tal uma dosagem. Qualquer método para administrar peptídeos, proteínas ou anticorpos aceitos na técnica pode adequadamente ser empregado para os conjugados de polipeptídeo criado descritos aqui.
[00235] As composições farmacêuticas da invenção são tipicamente adequadas para administração parenteral. Administração parenteral de uma composição farmacêutica inclui qualquer rotina de administração caracterizada por violação física de um tecido de um indivíduo e administração da composição farmacêutica pela brecha no tecido, desse modo geralmente resultando na administração direta na corrente sanguínea, no músculo, ou em um órgão interno. Por exemplo, administração parenteral inclui, porém não é limitada a, administração de uma composição farmacêutica por injeção da composição, por aplicação da composição através de uma incisão cirúrgica, por aplicação da composição através de uma ferida não cirúrgica de penetração de tecido, e similar. Em particular, administração parenteral é contemplada para incluir, porém não é limitada a, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, intraesternal, intravenosa, intra-arterial, intratecal, intraventricular, intrauretral, intracraniana, injeção intrassinovial ou infusões; e técnicas de infusão dialíticas renais. Em algumas modalidades, administração parenteral é a via intravenosa ou subcutânea.
[00236] Formulações de uma composição farmacêutica adequadas para administração parenteral tipicamente geralmente compreendem o ingrediente ativo combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como água estéril ou solução salina isotônica estéril. Tais formulações podem ser preparadas, empacotadas, ou vendidas em uma forma adequada para administração de bolo ou para administração contínua. Formulações injetáveis podem ser preparadas, empacotadas, ou vendidas em forma de dosagem unitária, tal como em ampolas ou em recipientes de multidose contendo um preservativo. Formulações para administração parenteral incluem, porém não são limitadas a, suspensões, soluções, emulsões em veículos oleosos ou aquosos, pastas, e similar. Tais formulações podem compreender um ou mais ingredientes adicionais incluindo, porém não limitado a, agentes de suspensão, estabilização, ou dispersão. Em uma modalidade de uma formulação para administração parenteral, o ingrediente ativo é fornecido na forma seca (isto é pó ou granular) para reconstituição com um veículo adequado (por exemplo, água livre de pirogênio estéril) antes da administração parenteral da composição reconstituída. Formulações parenterais da mesma forma incluem soluções aquosas que podem conter excipientes tal como sais, carboidratos e agentes de tamponamento (preferivelmente em um pH de 3 a 9), porém, para algumas aplicações, eles podem ser mais adequadamente formulados como uma solução não aquosa estéril ou como uma forma seca a ser usada juntamente com um veículo adequado tal como água estéril, livre de pirogênio. Formas de administração parenterais exemplares incluem soluções ou suspensões em soluções aquosas estéreis, por exemplo, soluções de propileno glicol ou dextrose aquosas. Tais formas de dosagem podem ser adequadamente tamponadas, se desejado. Outras formulações de parentalmente administráveis que são úteis incluem aquelas que compreendem o ingrediente ativo na forma microcristalina, ou em uma preparação lipossômica. Formulações para administração parenteral podem ser formuladas para ser liberação imediata e/ou liberação modificada. Formulações de liberação modificada incluem formulações de liberação controlada, atrasada, prolongada, pulsada, alvejada e programada. Por exemplo, em um aspecto, soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando-se o polipeptídeo contendo Fc criado, por exemplo, conjugados de anticorpo-fármaco ou anticorpo biespecifico, na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumeradas acima, quando requerido, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, dispersões são preparadas incorporando-se o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos a partir desses enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento que rende um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução filtrada previamente estéril do mesmo. A própria fluidez de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Absorção prolongada de composições injetáveis pode ser provocada incluindo-se na composição um agente que atrasa absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
[00237] Regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta desejada ideal. Por exemplo, um único bolo pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas com o passar do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada quando indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma unitária de dosagem, quando aqui usada, refere- se a unidades fisicamente discretas servidas como dosagens unitárias para os pacientes/indivíduos a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada do composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. A especificação para as formas unitárias de dosagem da invenção é geralmente ditada por e diretamente dependente de (a) as características únicas da porção de agente (por exemplo, moléculas pequenas tal como agente citotóxico) e o efeito terapêutico ou profiláctico particular a ser obtido, e (b) as limitações inerentes na técnica de compor um tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
[00238] Desse modo, o técnico versado apreciaria, com base na descrição fornecida aqui, que a dose e regime de dosagem são ajustados de acordo com métodos bem conhecidos nas técnicas terapêuticas. Isto é, a tolerável máxima pode ser facilmente estabelecida, e a quantidade eficaz que fornecendo um benefício terapêutico detectável a um paciente pode da mesma forma ser determinada, como as exigências temporais para administrar cada agente para fornecer um benefício terapêutico detectável ao paciente. Desta maneira, enquanto certa dose e regimes de administração são exemplificados aqui, estes exemplos de nenhuma maneira limitam a dose e regime de administração que podem ser fornecidos a um paciente praticando a presente invenção.
[00239] Será notado que valores de dosagem podem variar com o tipo e severidade da condição a ser aliviada, e pode incluir únicas ou múltiplas doses. Será também entendido que para qualquer indivíduo particular, regimes de dosagem específicos deveriam ser ajustados com o passar do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa administrando ou supervisionando a administração das composições, e que faixas de dosagem mencionadas aqui são exemplares apenas e não são pretendidas limitar o escopo ou prática da composição reivindicada. Além disso, o regime de dosagem com as composições desta invenção pode estar com base em uma variedade de fatores, incluindo o tipo de doença, a idade, peso, sexo, condição médica do paciente, a severidade da condição, a rotina de administração, e o anticorpo particular empregado. Desse modo, o regime de dosagem pode variar amplamente, porém pode ser determinado habitualmente usando métodos-padrão. Por exemplo, doses podem ser ajustadas com base em parâmetros farmacocinéticos ou farmacodinâmicos, que podem incluir efeitos clínicos tal como efeitos tóxicos e/ou valores de laboratório. Desse modo, a presente invenção abrange dose- escalação intrapaciente como determinado pelo técnico versado. Dosagens e regimes apropriados de determinação são bem conhecidos na técnica relevante e seriam entendidos para estar abrangidos pelo técnico versado uma vez forneceu os ensinos descritos aqui.
[00240] Para administração a indivíduos humanos, a dose mensal total de um ADC descrito aqui está tipicamente na faixa de cerca de 0,01 mg a cerca de 1200 mg por paciente, dependendo, claro que, do modo de administração. Por exemplo, uma dose mensal intravenosa pode requerer cerca de 1 a cerca de 1000 mg/paciente. A dose mensal total pode ser administrada em doses únicas ou divididas e pode, na discrição do médico, cair fora da faixa típica determinada aqui.
[00241] Uma faixa exemplar, não limitante para uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um ADC como descrito aqui é cerca de 0,01 a cerca de 1000 mg/paciente/mês. Em certas modalidades, o ADC pode ser administrado à cerca de 1 a cerca de 200 ou cerca de 1 a cerca de 150 mg/paciente/mês. Em algumas modalidades, o paciente é humano. Kits
[00242] A invenção da mesma forma fornece kits (ou artigos de fabricação) para uso no tratamento dos distúrbios descritos acima. kits da invenção incluem um ou mais recipientes compreendendo um ADC purificado e instruções para usar o conjugado para tratar uma doença. Por exemplo, as instruções compreendem uma descrição de administração do ADC para tratar uma doença, tal como câncer (por exemplo, um câncer sólido ou líquido). O kit pode também compreender uma descrição de selecionar um indivíduo adequado para tratamento com base em identificar se aquele indivíduo tem a doença e no estágio da doença.
[00243] As instruções relativas ao uso do ADC geralmente incluem informação sobre dosagem, horário de dosagem, e rotina de administração para o tratamento pretendido. Os recipientes podem ser doses unitárias, pacotes de colume (por exemplo, pacotes de multidose) ou doses subunitárias. Instruções fornecidas nos kits da invenção são tipicamente instruções escritas em um rótulo ou suplemento de pacote (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), porém instruções de legível por máquina (por exemplo, instruções realizadas em um disco de armazenamento magnético ou óptico) são da mesma forma aceitáveis.
[00244] Os kits desta invenção estão em empacotamento adequado. Empacotamento adequado inclui, porém não é limitado a, frasconetes, garrafas, jarros, empacotamento flexível (por exemplo, Mylar selado ou sacolas plásticas), e similar. Da mesma forma são contemplados pacotes para uso em combinação com um dispositivo específico, tal como um inalador, dispositivo de administração nasal (por exemplo, um atomizador) ou um dispositivo de infusão tal como uma minibomba. Um kit pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasconete tendo um tampão perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O recipiente pode da mesma forma ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasconete tendo um tampão perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é o ADC carregado mais alto como descrito aqui. O recipiente pode também compreender um segundo agente farmaceuticamente ativo.
[00245] Kits podem opcionalmente fornecer componentes adicionais tal como tampões e informação interpretativas. Normalmente, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou inserção(ões) de pacote no ou associado com o recipiente. EXEMPLOS
[00246] É entendido que os exemplos e modalidades descritas aqui são para propósitos ilustrativos apenas e que várias modificações ou mudanças à luz disso serão sugeridas a pessoas versadas na técnica e serão incluídas dentro do espírito e esfera deste pedido. Condições de HPLC e LCMS Usadas para Análises:
[00247] Condições de HPLC analíticas: Phenomenex Luna coluna C18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 0% a 100% B durante 8.5 minutos, em seguida 100% B durante 1,5 minutos; taxa de Fluxo: 1.5 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: 10 μL; Instrumento: Agilent 1100 HPLC.
[00248] Condições de LCMS analíticas: Waters Acquity UPLC HSS T3, -C18, 2.1 x 50 mm, 1.7 μm; fase Móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água (v/v); fase Móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (v/v); Gradiente: 5% B durante 0,1 minuto, 5% a 95% B durante 2,5 minutos, 95% B durante 0,35 minuto; taxa de Fluxo: 1,25 mL/minuto. Temperatura: 60 °C; Detecção: 200-450nm; faixa de MS (+) 100-2000 Dáltons; volume de Injeção: 5 μL; Instrumento: Waters Acquity. Condições de HPLC Preparativa Usadas para Purificações:
[00249] Método A: Phenomenex Luna coluna C18, 100 x 30 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 5% a 50% de B durante 20 minutos; taxa de Fluxo: 20 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: Gilson 215.
[00250] Método B: Phenomenex Luna coluna C18, 100 x 30 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 20% a 80% B durante 20 minutos; taxa de Fluxo: 20 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: Gilson 215.
[00251] Método C: Phenomenex Luna coluna C18, 100 x 30 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 5% a 70% B durante 20 minutos; taxa de Fluxo: 20 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: Gilson 215.
[00252] Método D: Phenomenex Luna coluna C18, 100 x 30 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 10% a 70% B durante 20 minutos; taxa de Fluxo: 20 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: Gilson 215.
[00253] Método E: Phenomenex Luna coluna C18, 100 x 30 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 30% a 85% B durante 20 minutos; taxa de Fluxo: 20 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: Gilson 215.
[00254] Método F: Phenomenex Luna coluna C18, 100 x 30 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 10% a 90% B durante 20 minutos; taxa de Fluxo: 20 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: Gilson 215.
[00255] Método G: Phenomenex Luna coluna C18, 100 x 30 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 10% a 95% B durante 20 minutos; taxa de Fluxo: 20 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: Gilson 215.
[00256] Método H: Phenomenex Luna coluna C18, 100 x 30 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 25% a 65% B durante 20 minutos; taxa de Fluxo: 20 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: Gilson 215.
[00257] Método I: Phenomenex Synergi Max coluna C18, 250x50mm, 10 um; fase Móvel A: 0,2% de ácido fórmico em água (v/v); fase Móvel B: acetonitrila; Gradiente: 33,0% a 58% B em 25 minutos, em seguida elevando para 100% B em 2 minutos, mantido durante 5 minutos; taxa de Fluxo: 80 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 220 nm.
[00258] Método J: DIKMA coluna Diamonsil(2) C18, 200x20mm, 5um; fase Móvel A: 0,225% de ácido fórmico em água (v/v); fase Móvel B: acetonitrila; Gradiente: 53% a 73% B durante 11 minutos, em seguida elevando para 100% B em 0,5 minutos, mantido durante 2 minutos; taxa de Fluxo: 35 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 220 nm.
[00259] Método K: Phenomenex Luna coluna C18, 100 x 30 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 20% a 90% B durante 20 minutos; taxa de Fluxo: 20 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: Gilson 215.
[00260] Método L: Phenomenex Luna coluna C18, 100 x 30 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 10% a 80% B durante 20 minutos; taxa de Fluxo: 20 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: Gilson 215.
[00261] Método M: Phenomenex Luna coluna C18, 150 x 21.2 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido acético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido acético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 1% a 100% B durante 8,5 minutos em seguida mantido a 100% B durante 2 minutos; taxa de Fluxo: 27 mL/minuto. Temperatura: 25 °C; Detecção: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) faixa 150-2000 Dáltons; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: 305 RP Waters FractionLynx LCMS.
[00262] Método N: Phenomenex Luna coluna C18, 100 x 30 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 50% a 100% B durante 20 minutos; taxa de Fluxo: 20 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: Gilson 215.
[00263] Método O: Phenomenex Luna coluna C18, 150 x 21.2 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido acético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido acético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 35% a 50% B durante 8,5 minutos em seguida mantido a 100% B durante 2 minutos; taxa de Fluxo: 27 mL/minuto. Temperatura: 25 °C; Detecção: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) faixa 150-2000 Dáltons; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: 305 RP Waters FractionLynx LCMS.
[00264] Método P: Phenomenex Luna coluna C18, 100 x 30 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 25% a 100% B durante 20 minutos; taxa de Fluxo: 20 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: Gilson 215.
[00265] Método Q: Phenomenex Luna coluna C18, 100 x 30 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 20% a 100% B durante 20 minutos; taxa de Fluxo: 20 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: Gilson 215.
[00266] Método R: Phenomenex Luna coluna C18, 150 x 21.2 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido acético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido acético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 35% a 50% B durante 8,5 minutos em seguida mantido a 100% B durante 2 minutos; taxa de Fluxo: 27 mL/minuto. Temperatura: 25 °C; Detecção: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) faixa 150-2000 Dáltons; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: 305 RP Waters FractionLynx LCMS.
[00267] Método S: Phenomenex Luna coluna C18, 100 x 30 mm, 5 μm; fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 20% a 90% B durante 20 minutos; taxa de Fluxo: 20 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL. Instrumento: Gilson 215.
[00268] Método T: Phenomenex Synergi Max coluna C18, 250x50mm, 10 um; fase Móvel A: 0,2% de ácido fórmico em água (v/v); fase Móvel B: acetonitrila; Gradiente: 35.0% a 65% B em 30 minutos, em seguida elevando para 100% B em 2 minutos, mantido durante 5 minutos; taxa de Fluxo: 30 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 220 nm.
[00269] Método U: Isco MPLC, RediSep 43 g coluna C18 Gold; fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 20-100% B em 20 minutos; taxa de Fluxo: 40 ml/min; Temperatura: não controlada; DAD 214, 254 nm.
[00270] Método V: Isco MPLC, RediSep 43 g coluna C18 Gold;, fase Móvel A: 0,02% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,02% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente 10-80% B em 20 minutos; taxa de Fluxo: 40 ml/min; Temperatura: não controlada; DAD 214, 254 nm.
[00271] Método W: Phenomenex Synergi Max-RP coluna 250 x 50 mm, 10 μm; fase Móvel A: 0,1% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,1% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 24% a 54% B durante 30 minutos; taxa de Fluxo: 30 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL.
[00272] Método X: Luna coluna C18 150 x 25, 5 μm; fase Móvel A: 0,2% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,2% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 30% a 50% B durante 11 minutos; taxa de Fluxo: 35 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL.
[00273] Método Y: Phenomenex Synergi Max-RP coluna 250 x 50 mm, 100 x 30 mm, 10 μm; fase Móvel A: 0,1% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,1% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 30% a 60% B durante 22 minutos; taxa de Fluxo: 80 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL.
[00274] Método Z: Phenomenex Synergi Max-RP coluna 250 x 50 mm, 10 μm; fase Móvel A: 0,1% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,1% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 30% a 60% B durante 21,5 minutos; taxa de Fluxo: 80 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 210, 254 nm; volume de Injeção: até 5 mL.
[00275] Método AA: Phenomenex Synergi Max-RP coluna 250 x 80, 10 μm; fase Móvel A: 0,1% de ácido trifluoroacético em água (v/v); fase Móvel B: 0,1% de ácido trifluoroacético em acetonitrila (v/v); Gradiente: 40% a 70% B durante 30 minutos; taxa de Fluxo: 30 mL/minuto. Temperatura: não controlada; Detecção: DAD 220 nm; volume de Injeção: até 5 mL. Exemplo 1: Preparação de N~2~-Benzoil-L-lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11 -[(2S)butan-2-il]- 12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil- 3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (6)
[00276] Etapa 1: Síntese de
[00277] N~2~-benzoil-N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisil-L-valil-N- ~5~-carbamoil-N-[-4-(hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (2). Em uma solução de N~2~-benzoil-N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisina (100 mg, 0,285 mmol) e L-valil-N-~5~-carbamoil-N-[-4-(hidroximetil)fenil]- L-ornitinamida (1, 108 mg, 0,285 mmol) em 1 mL de N,N- dimetilformamida foram adicionados hexafluorofosfato de O-(7- azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio (HATU, 111 mg, 0,285 mmol) seguido por N,N-di-isopropiletilamina (201 ul, 149 mg, 1,14 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 16 horas em temperatura ambiente. A reação foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método A). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 127 mg (63%) do produto desejado. LCMS m/z 712,4 [M+H+]; 710,4 [MH+]; tempo de retenção = 1,30 minuto.
[00278] Etapa 2: Síntese de
[00279] N~2~-benzoil-N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisil-L-valil- N~5~-carbamoil-N-[-4-({[(4nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L- ornitinamida (3). Uma solução de N~2~-benzoil-N~6~-(terc- butoxicarbonil)-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[-4- (hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (2, 125 mg, 0,352 mmol) em 1 mL de N,N-dimetilformamida foi tratada com carbonato de p-nitrofenila (107 mg, 0,352 mmol) e trietilamina (101 ul, 73,4 mg, 0,704 mmol). A mistura foi agitada durante duas horas em temperatura ambiente e foi em seguida concentrada para se aproximar a secura e purificada por cromatografia sílica gel usando um gradiente de eluição de 5% a 20% de metanol em diclorometano para produzir 129 mg (83,6%) do produto desejado. LCMS m/z 877,4 [M+H+]; 899,3 [M+Na+]; tempo de retenção = 1,73 minutos.
[00280] Etapa 3: Síntese de
[00281] N~2~-benzoil-N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisil-L-valil-N-{- 4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi- 2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (5). Em uma solução de 2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil- 1-oxoeptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (4, 20 mg, 0,027 mmol) N~2~- benzoil-N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[- 4-({[(4nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-ornitinamida (3, 28 mg, 0,032 mmol) em 0,2 mL de N,N-dimetilformamida foram adicionados 2,6-lutidina (5,8 mg, 0,032 mmol), N,N-di-isopropiletilamina (9 ul, 7 mg, 0,054 mmol) e 3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin3-ol (HOAt, 4,4 mg, 0,032 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 16 horas em temperatura ambiente. A reação foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método B). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 30 mg (75%) do produto desejado. LCMS m/z 1481,8 [M+H+]; 1478,8 [MH+]; tempo de retenção = 1,91 minutos.
[00282] Etapa 4: Síntese de
[00283] N~2~-benzoil-L-lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11- [(2S)butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2- oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (6). Em uma solução de N~2~-benzoil-N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisil-L-valil-N- {-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (5, 3-0 mg, 0,02 mmol) em 2,5 mL de diclorometano foi adicionado 2,5 mL de uma solução a 10% de ácido trifluoroacético em diclorometano. A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 2,25 horas em temperatura ambiente. A reação foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método C). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 22 mg (74%) do produto desejado. LCMS m/z 1381,7 [M+H+]; tempo de retenção = 1,54 minutos. HPLC retenção tempo analítico = 6,00 minutos. Exemplo 2: Preparação de N~2~-(2,2-Dimetilpropanoil)-L-lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11- [(2S)butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2- oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (12)
[00284] Etapa 1: Síntese de
[00285] N-(terc-butoxicarbonil)-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)- butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2- fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (8). Em uma solução de 2- metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil- 3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5- metil-1-oxoeptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (4, 80 mg, 0,11 mmol) e N- (terc-butoxicarbonil)-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[-4-({[(4- nitrofenóxi)carbonil]óóxi}metil)fenil]-L-ornitinamida (7, 76,7 mg, 0,119 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilformamida foram adicionados 2,6- lutidina (46,3 mg, 0,432 mmol), N,N-di-isopropiletilamina (67,7 ul, 56,4 mg, 0,432 mmol) e 3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin3-ol (HOAt, 17,7 mg, 0.130 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 16 horas a 45°C. A reação foi em seguida concentrada e purificada por cromatografia sílica gel usando um gradiente de eluição de 5% a 20% de metanol em diclorometano para fornecer 90 mg (67%) do produto desejado. LCMS m/z 1248,7 [M+H+]; tempo de retenção = 1,84 minutos.
[00286] Etapa 2: Síntese de
[00287] L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)- 2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (9). Em uma solução de N-(terc- butoxicarbonil)-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12- (2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol- 2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (8, 91 mg, 0,072 mmol) em 5 mL de diclorometano foi adicionado 2 mL de um 20% de ácido trifluoroacético de solução em diclorometano. A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 2,75 horas em temperatura ambiente. A reação foi em seguida concentrada para fornecer 91 mg (100%) do produto desejado que foi diretamente usado na próxima etapa sem purificação. LCMS m/z 1148,7 [M+H+]; tempo de retenção = 1,43 minutos.
[00288] Etapa 3: Síntese de
[00289] N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisil-L-valil-N-{-4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (10). Em uma solução de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-lisina (50,6 mg, 0,108 mmol) em 0,5 mL de N,N- dimetilformamida foram adicionados hexafluorofosfato de O-(7- azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio (HATU, 41,6 mg, 0.108 mmol) seguido por N,N-di-isopropiletilamina (51 ul, 37,6 mg, .288 mmol) e a mistura foi agitada durante 15 minutos em temperatura ambiente. Uma solução de L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan- 2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1- (1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil- 3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}- N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (9, 91mg, 0,072 mmol) em 1 mL de N,N-dimetilformamida foi em seguida adicionado. A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 2 horas em temperatura ambiente antes que dietilamina (2 ml, 1,41 g, 19,3 mmols) fosse adicionada lentamente. A reação foi permitida agitar durante 16 horas, e foi em seguida acidificada por adição de ácido trifluoroacético, concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método D). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 99 mg (92%) do produto desejado. LCMS m/z 1376,8 [M+H+]; 1374,8 [MH+]; tempo de retenção = 1,40 minuto.
[00290] Etapa 4: Síntese de
[00291] N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-(2,2-dimetilpropanoil)-L- lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (11). Em uma solução de trifluoracetato de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)- butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2- fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (10, 21,5 mg, 0,015 mmol) e anidrido piválico (5,6 mg, 0,030 mmol) em 0,2 mL de N,N- dimetilformamida foi adicionado N,N-di-isopropiletilamina (26 ul, 19,4 mg, 0,15 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 45 minutos. A solução foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método E). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 21,9 mg (100%) do produto desejado. LCMS m/z 1460,7 [M+H+]; 1458,5 [MH+]; tempo de retenção = 1,93 minuto.
[00292] Etapa 5: Síntese de
[00293] N~2~-(2,2-dimetilpropanoil)-L-lisil-L-valil-N-{-4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (12). Em uma solução de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-(2,2- dimetilpropanoil)-L-lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]- 12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (11, 21,9 mg, 0,015 mmol) em 1 mL de diclorometano foi adicionado 0,33 mL de ácido trifluoroacético. A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 1 hora em temperatura ambiente. A reação foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método F). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 8 mg (36%) do produto desejado. LCMS m/z 1360,7 [M+H+]; tempo de retenção = 1,45 minutos. HPLC retenção tempo analítico = 6,01 minutos. Exemplo 3: Preparação de N~2~-(Fenilacetil)-L-lisil-L-valil-N-{-4- [(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1 -il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-omitinamida (14)
[00294] Etapa 1: Síntese de
[00295] N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-(fenilacetil)-L-lisil-L-valil-N- {-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi- 2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (13). Em uma solução de ácido fenilacético (15 mg, 0,11 mmol) em 0,2 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'- tetrametilurônio (HATU, 43,1 mg, 0,11 mmol) seguido por N,N-di- isopropiletilamina (20 ul, 14,5 mg, 0,11 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 45 minutos. Uma solução de trifluroacetato de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisil-L-valil-N-{-4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (10, 20 mg, 0,013 mmol) em 0,2 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionada e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 16 horas. A solução foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método G). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 10 mg (52%) do produto desejado. LCMS m/z 1495,3 [M+H+]; 1493,1 [MH+]; tempo de retenção = 1,93 minuto.
[00296] Etapa 2: Síntese de
[00297] N~2~-(fenilacetil)-L-lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11- [(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (14). Em uma solução de N~6~- (terc-butoxicarbonil)-N~2~-(fenilacetil)-L-lisil-L-valil-N-{-4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (13, 10 mg, 0,007 mmol) em 1 mL de diclorometano foi adicionado 1 mL de uma solução a 20% de ácido trifluoroacético em diclorometano. A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 2 horas em temperatura ambiente. A reação foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método G). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 10 mg (100%) do produto desejado. LCMS m/z 1394,7 [M+H+]; tempo de retenção = 1,52 minutos. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,39 minutos. Exemplo 4: Preparação de N~2~-(1H-Imidazol-5-ilcarbonil)-L-lisil-L- valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-omitinamida (16)
[00298] Etapa 1: Síntese de
[00299] N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-(1H-imidazol-5-ilcarbonil)- L-lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (15). Em uma solução de trifluroacetato de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)- butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2- fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (10, 20,5 mg, 0,014 mmol) e ácido 1H-imidazol-5-carboxílico (15,7 mg, 0,14 mmol) em 0,2 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado N,N-di-isopropiletilamina (25 ul, 18,3mg, 0,14 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 5 minutos. Hexafluorofosfato de O-(7-Azabenzotriazol-1-il)- N,N,N',N'-tetrametilurônio (HATU, 54,3 mg, 0,14 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada durante uma hora adicional em temperatura ambiente. A solução foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método G). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 13 mg (59%) do produto desejado. LCMS m/z 1471,6 [M+H+]; 1469,0 [MH+]; tempo de retenção = 1,70 minuto.
[00300] Etapa 2: Síntese de
[00301] N~2~-(1H-imidazol-5-ilcarbonil)-L-lisil-L-valil-N-{-4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (16). Em uma solução de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-(1H-imidazol-5- ilcarbonil)-L-lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12- (2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol- 2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (15, 13 mg, 0,008 mmol) em 5 mL de diclorometano foi adicionado 2 mL de uma solução a 20% de ácido trifluoroacético em diclorometano. A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 15 minutos em temperatura ambiente. A reação foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método D). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 6 mg (50%) do produto desejado. LCMS m/z 1370,7 [M+H+]; 1368,6 [MH+]; tempo de retenção = 1,39 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,30 minutos. Exemplo 5: Preparação de N~2~-(1H-Imidazol-5-ilacetil)-L-lisil-L-valil- N-{-4-[(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-omitinamida (18)
[00302] Etapa 1: Síntese de
[00303] N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-(1H-imidazol-5-ilacetil)-L- lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (17). Em uma solução de trifluroacetato de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)- butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2- fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (10, 20 mg, 0.013 mmol) e ácido 2-(1H-imidazol-5-il)acético (30,0 mg, 0,20 mmol) em 0.2 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado N,N-di-isopropiletilamina (23 ul, 17mg, 0,13 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 5 minutos. Hexafluorofosfato de O-(7-Azabenzotriazol-1-il)- N,N,N',N'-tetrametilurônio (HATU, 50,4 mg, 0,13 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada durante uma hora adicional em temperatura ambiente. A solução foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método G). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 13,6 mg (65%) do produto desejado. LCMS m/z 1485,6 [M+H+]; 1483,5 [MH+]; tempo de retenção = 1,44 minuto.
[00304] Etapa 2: Síntese de
[00305] N~2~-(1H-imidazol-5-ilacetil)-L-lisil-L-valil-N-{-4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (18). Em uma solução de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-(1H-imidazol-5- ilacetil)-L-lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12- (2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol- 2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (17, 13,6 mg, 0,009 mmol) em 5 mL de diclorometano foi adicionado 2 mL de uma solução a 20% de ácido trifluoroacético em diclorometano. A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 15 minutos em temperatura ambiente. A reação foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método D). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 13 mg (96%) do produto desejado. LCMS m/z 1384,9 [M+H+]; 1382,8 [MH+]; tempo de retenção = 1,26 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,21 minutos. Exemplo 6: Preparação de N~2~-(3-Metilbutanoil)-L-lisil-L-valil-N-{-4- [(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1 -il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-omitinamida (19)
[00306] Uma solução de ácido 3-metilbutanóico (10,2 mg, 0,100 mmol) em 0,4 mL de N,N-dimetilformamida foi tratado com N,N-di- isopropiletilamina (35 ul, 26,1mg, 0,200 mmol) e hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio (HATU, 77,6 mg, 0,200 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante cinco minutos. Uma solução de trifluroacetato de N~6~-(terc- butoxicarbonil)-L-lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]- 12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (10, 30 mg, 0,020 mmol) em 0,4 mL de N,N- dimetilformamida foi adicionado e a mistura foi permitida agitar em temperatura ambiente durante 1 hora. A solução foi em seguida concentrada para se aproximar a secura, em seguida foi dissolvida em 2 mL de diclorometano e tratada com 0,5 mL de ácido trifluoroacético. Depois da agitação em temperatura ambiente de um adicional de 30 minutos a reação foi concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método H). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 13 mg (44%) do produto desejado. LCMS m/z 1360,8 [M+H+]; 1358,4[MH+]; tempo de retenção = 1,49 minutos. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,98 minutos. Exemplo 7: Preparação de N~2~-(2Metilpropanoil)-L-lisil-L-valil-N-{-4- [(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]—12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1 -il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (25)
[00307] Etapa 1: Síntese de
[00308] N~2~-(terc-butoxicarbonil)-N~6~[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[-4-(hidroximetil)fenil]- L-ornitinamida (20). Em uma solução de L-valil-N~5~-carbamoil-N-[-4- (hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (1, 6,5 g, 17,1 mmol) e N~2~-(terc- butoxicarbonil)-N~6~[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisina (8,03 g, 17,1 mmol) em 200 mL de N,N-dimetilformamida foram adicionados N,N-di-isopropiletilamina (3,32 g, 25,7 mmols) e hexafluorofosfato de O-(7-Azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio (HATU, 7,8 g, 20,56 mmols). A mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 12 horas e foi em seguida concentrada e purificada por cromatografia de sílica usando um gradiente de eluição de 5% a 17% metanol em diclorometano para produzir 4,00 g (28,2%) do produto desejado como um sólido branco.
[00309] Etapa 2: Síntese de
[00310] N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N~5~- carbamoil-N-[-4-(hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (21). Uma mistura de N~2~-(terc-butoxicarbonil)-N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L- lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[-4-(hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (20, 4,8 g, 5,78 mmol) em 96 mL de 4M ácido clorídrico aquoso foi agitada em temperatura ambiente durante 12 horas. A mistura reacional foi ajustada em pH 7.5 por adição lenta de K2CO3 aquoso saturado e em seguida a suspensão resultante foi filtrada. O sólido foi coletado e secado em vácuo para produzir 4,00 g (94,9%) do produto desejado como um sólido amarelo.
[00311] Etapa 3: Síntese de N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]- N~2~-(2-metilpropanoil)-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[-4- (hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (22). Em uma solução de N~6~-[(9H- fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[-4- (hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (21, 500 mg, 0,685 mmol) e 1[(2- metilpropanoil)oxi]pirrolidina-2,5-diona (190 mg, 1,03 mmol) em 20 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado N-N-di-isopropiletilamina (221 mg, 1,7 mmol). Depois da agitação durante 2 horas em temperatura ambiente a mistura foi concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método I) para produzir 100 mg (18,2%) do produto desejado como um sólido branco.
[00312] Etapa 4: Síntese de
[00313] N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N~2~-(2- metilpropanoil)-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[-4- ({[(4nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-ornitinamida (23). Em uma solução de N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N~2~-(2- metilpropanoil)-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[-4-(hidroximetil)fenil]-L- ornitinamida (22, 100 mg, 0,125 mmol) e carbonato de p-nitrofenila (42 mg, 0,138 mmol) em 5 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado N,N-di-isopropiletilamina (32 mg, 0,25 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 12 horas. A solução foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método J) para produzir 110 mg (91,7%) do produto desejado como um sólido branco. HRMS m/z para C50H60N8O12: 987.4036 (M+Na)+. 1H RMN (400 MHz, DMSO): 10,12 (s, 1-H), 8,30 (m, 2-H), 8,18 (m, 1-H), 7,88 (m, 3-H), 7,64 (m, 6H), 7,27 (m, 6H), 6,00 (s, 1-H), 5,44 (s, 2-H), 5,23 (s, 2-H), 4,21 (m, 6H), 2,95 (m, 5H), 1,99 (m, 1-H), 1,24 (m, 1-2H), 0,99 (d, 6H), 0,85 (d, 6H);
[00314] Etapa 4: Síntese de
[00315] N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N~2~-(2- metilpropanoil)-L-lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]- 12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (24). Em uma solução de 2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoeptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (4, 27,5 mg, 0,032 mmol) e N~6~- [(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N~2~-(2-metilpropanoil)-L-lisil-L-valil- N~5~-carbamoil-N-[-4-({[(4nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L- ornitinamida (23, 36,7 mg, 0,038 mmol) em 1 mL de N,N- dimetilacetamida foram adicionados 2,6-lutidina (13,7 mg, 0,128 mmol), N,N-di-isopropiletilamina (23 ul, 16,7 mg, 0,128mmol) e 3H- [1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin3-ol (HOAt, 5,2 mg, 0,038 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 16 horas em temperatura ambiente. A solução foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método K). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 30 mg (60%) do produto desejado.
[00316] Etapa 5: Síntese de
[00317] N~2~-(2-metilpropanoil)-L-lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)- 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)- 5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (25). Uma solução de N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N~2~-(2- metilpropanoil)-L-lisil-L-valil-N-{-4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]- 12-(2{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (24, 30 mg, 0,019 mmol) em 1 mL de diclorometano foi tratado com 1 mL de dietilamina. A solução foi agitada em temperatura ambiente durante cinco horas, e em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método K). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 6,0 mg (21%) do produto desejado. LCMS m/z 1346,9 [M+H+]; tempo de retenção = 1,47 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,87 minutos. Procedimento para Exemplos 818 e 49-71: Conjugação, Purificação de ADCs Anti-Trop2 Sítio-Específico
[00318] Para a conjugação de anticorpos anti-Trop2 com o ligante- cargas úteis (LPs) dos Exemplos 1 a 7, a quantidade indicada de anticorpo foi ajustada em 5 mg/mL em tampão contendo 25 mM de Tris-HCl, pH 8,0-8,5. A quantidade indicada de LP foi adicionada em um excesso molar de 5-50 vezes sobre anticorpo e a reação enzimática iniciadas pela adição de 2% (p/v) transglutaminase bacteriana (Ajinomoto Activa TI, Japan), e incubada com agitação suave a 37°C durante 1624 horas. O ADC foi purificado usando Butyl SepharoseTM de Alto Desempenho (Butyl HP, GE Healthcare Biosciences) ajustando-se a mistura reacional para obter uma composição de tampão de 0,75 M de sulfato de amônio, 25 mM de fosfato de potássio, pH 7 (Tampão A). O material foi aplicado a um Butyl HP, lavado com 5 CV Tampão A, e eluído com um 20 CV gradiente linear em 25 mM de fosfato de potássio, pH 7. Frações contendo o ADC, foram agrupadas, dialisadas contra PBS, concentradas usando uma unidade de filtro de centrífuga 10 kDa Amicon Ultra (Millipore Corporation), e filtrada estéril por um filtro de 0,2 μm. Alternativamente, o ADC foi purificado usando resina MabSelect Proteína A (GE Healthcare Biosciences) seguindo protocolos padrões, e tampão trocado em PBS.
[00319] Os seguintes ADCs (ligados a várias posições e em vários rótulos no anticorpo de Trop2, como indicado nas Tabelas 2 a 7) foram feitos usando a técnica descrita acima (porção entre parênteses indica um resíduo de glutamina, com linhas onduladas mostrando pontos de ligações ao restante do anticorpo Anti-Trop2): Exemplo comparativo 8: C6vcMMAD: Exemplo comparativo 9: AcLysvcMMAD: Exemplo comparativo 10: C6vc0101: Exemplo comparativo 11: AcLysvc0101: Exemplo 12: Exemplo 13: Exemplo 14: Exemplo 15: Exemplo 16: Exemplo 17: Exemplo 18: Exemplo 19: Ensaio de estabilidade in vivo - Camundongo
[00320] Amostras de plasma foram obtidas a partir de camundongos em pontos de tempo variando de 1 a 10 dias depois de uma única dose de 9 mg/kg de ADC. Amostras foram diluídas com um volume igual de 1x PBS, e ADCs foram isoladas usando contas de MabSelect ou antígeno de Trop2 acoplado a Sepharose ativada por CNB (GE Healthcare) usando protocolos padrões. Relações de fármaco-anticorpo foram avaliadas antes e depois da exposição in vivo usando métodos de HIC e espectrometria de massa. Exemplo 20: Ensaio de estabilidade in vivo - Rato
[00321] Amostras de plasma foram obtidas a partir de ratos em pontos de tempo variando de 1 a 10 dias depois de uma única dose de 9 mg/kg de ADC. Amostras foram diluídas com um volume igual de 1x PBS, e ADCs foram isolados usando antígeno de Trop2 acoplado a Sepharose ativada por CNB (GE Healthcare) usando protocolos padrões. Relações de fármaco-anticorpo foram avaliadas antes e depois da exposição in vivo usando métodos de HIC e espectrometria de massa. Exemplo 21A: Ensaio de estabilidade in vitro - Plasma de Camundongo
[00322] 100200 ug de ADC foram incubados em plasma de camundongo (fornecido por Bioreclamation) suplementado com 1x PBS à concentração de ADC final de 0,125 mg/mL. Seguindo incubação durante 37 dias, amostras foram diluídas com um volume igual de 1x PBS, e ADCs foram isolados usando antígeno de Trop2 acoplado a Sepharose ativada por CNB (GE Healthcare) usando protocolos padrões. Relações de fármaco-anticorpo foram avaliadas antes e depois da exposição in vitro usando métodos de HIC e espectrometria de massa. Exemplo 21B: Identificação da enzima de plasma de camundongo responsável para clivagem de ligante
[00323] Para classificar a enzima de plasma de camundongo, ensaios de estabilidade in vitro foram realizados na presença de vários inibidores de protease usando conjugado anti-Trop2 L11B C6 vc0101 como um substrato. Os resultados mostraram que a enzima de plasma de camundongo é provavelmente uma serina hidrolase inibida por 1 mM de Pefabloc (Roche) e 100 uM de BNPP (Sigma). Para identificar a enzima, nós enriquecemos a atividade de hidrólise de ligante anti- Trop2 L11B C6 vc0101 fracionando-se o Soro de camundongo Balb/c usando uma sequência de etapas. Primeiro, soro de Balb/c (BioreclamationIVT) foi esvaziado de IgG e albumina usando resina de Proteína A e Proteína G MabSelect comercialmente disponível (GE Healthcare), seguido por Kit de Depelção de Albumina de Murino Qproteome (Qiagen). O soro esvaziado foi em seguida submetido a precipitação sequencial com sulfato de amônio. Frações com a atividade de hidrolase de ligante mais alta foram em seguida aplicadas a coluna HiTrap SP de troca catiônica (GE Healthcare) usando eluições de gradiente de etapa com cloreto de sódio. Depois disso, frações de SP com a atividade mais alta foram aplicadas a coluna HiTrap Q de troca aniônica (GE Healthcare) usando eluições de gradiente de etapa com cloreto de sódio. Frações com a atividade de hidrolase mais alta foram em seguida combinadas e fracionadas por tamanho usando coluna Superdex 200 (GE Healthcare). Análise proteômicas das frações de Superdex 200 agrupadas com a atividade mais alta revelaram Carboxilesterase 1C que é capaz de hidrolisar ligações de amida, e pode ser inibido com Pefabloc e BNPP. Para verificar a identificação correta de camundongo Carboxilesterase 1C como a enzima de plasma responsável por clivagem de ligante, a proteína recombinante foi expressada em células Expi 293, e purificada usando um rótulo de HIS seguindo protocolos padrões. A proteína purificada foi confirmada para clivar conjugados múltiplos com ligantes com base em VC com a mesma atividade relativa como mostrado para o plasma de camundongo. Exemplo 22: Ensaio de estabilidade in vitro - Plasma de Rato
[00324] 100200 ug de ADC foram incubados em plasma de rato (fornecido por Bioreclamation) suplementados com 1x PBS à concentração de ADC final de 0,125 mg/mL. Seguindo incubação durante 3-7 dias, amostras foram diluídas com um volume igual de 1x PBS, e ADCs foram isolados usando antígeno de Trop2 acoplado a Sepharose ativada por CNB (GE Healthcare) usando protocolos- padrão. Relações de fármaco-anticorpo foram avaliadas antes e depois da exposição in vitro usando métodos de HIC e espectrometria de massa. Exemplo 23: Ensaio de estabilidade in vitro - Plasma de Cinomolgos
[00325] 100200 ug de ADC foram incubados em plasma de cinomolgos (fornecido por Bioreclamation) suplementados com 1x PBS à concentração de ADC final de 0,125 mg/mL. Seguindo incubação durante 3-7 dias, amostras foram diluídas com um volume igual de 1x PBS, e ADCs foram isolados usando antígeno de Trop2 acoplado a Sepharose ativada por CNB (GE Healthcare) usando protocolos- padrão. Relações de fármaco-anticorpo foram avaliadas antes e depois da exposição in vitro usando métodos de HIC e espectrometria de massa. Exemplo 24: Ensaio de citotoxicidade in vitro
[00326] Como mostrado na Fig. 1 (A a I), estudos de citotoxicidade in vitro de anticorpos anti-Trop2 quiméricos conjugados em uma faixa de sítios com a carga útil citotóxica de aminocaproíla (C6) vc Aur0101 foram realizados com células de BxPC3 de expressão alvo. Compostos não tratados (linha sólida) e seus metabólitos isolados depois de uns 4,5 dias de tratamento em plasma de camundongo (linha quebrada) foram testados lado a lado para determinar quaisquer mudanças em citotoxicidade. BxPc3 é uma linhagem de célula de câncer com níveis de expressão alvo altos (Trop-2 +++). Células foram semeadas em placas de base claras de parede branca em 2000 células por cavidade durante 24 horas antes do tratamento. Células foram tratadas com conjugados de fármaco-anticorpo serialmente diluídos 4 vezes em triplicatas. Viabilidade de célula foi determinada por CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay 96 (Promega, Madison, WI) 96 horas depois do tratamento. Viabilidade de célula relativa foi determinada como porcentagem de controle não tratado.
[00327] Da mesma forma como mostrado na Fig. 1 (J a O), estudos de citotoxicidade in vitro de anticorpos anti-Trop2 quiméricos conjugados nos sítios de LCQ04 ou L11B com uma das três cargas úteis de ligante (cargas úteis de ligante dos Exemplos 2, 3 e 5) foram realizados com células de BxPC3 de expressão alvo. Compostos não tratados (linha sólida) e seus metabólitos isolados depois de uns 4,5 dias de tratamento em plasma de camundongo (linha quebrada) foram testados lado a lado para determinar qualquer mudança em citotoxicidade. BxPc3 é uma linhagem de célula de câncer com níveis de expressão alvo (Trop-2 +++). Células foram semeadas em placas de base claras de parede branca em 2000 células por cavidade durante 24 horas antes do tratamento. Células foram tratadas com conjugados de anticorpo-fármaco serialmente diluídos 4 vezes. Viabilidade de célula foi determinada por CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay 96 (Promega, Madison, WI) 96 horas depois do tratamento. Viabilidade de célula relativa foi determinada como porcentagem de controle não tratado. Exemplo 25: Preparação de N~2~-(hidroxiacetil)-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3--tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1 -il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-omitinamida (30)
[00328] Etapa 1: Síntese de
[00329] N~2~-(tert-butoxicarbonil)-N~6~-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(4- nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-ornitinamida (26). Em uma solução de N~2~-(terc-butoxicarbonil)-N~6~-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-Llisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[-4-(hidroximetil)fenil]- L-ornitinamida (20, 998 mg, 1,20 mmol) e carbonato de p-nitrofenila (748 mg, 2,41 mmols)) em 7 mL de N,N-dimetilformamida e em 7 mL de diclorometano foi adicionado N,N-di-isopropiletilamina (452 uL 0,328 g, 2,41 mmols,) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 3 horas. O resíduo foi diluído com acetato de etila e éter dietílico e a suspensão resultante foi agitada durante 30 minutos. O sólido foi isolado por filtração e lavado com éter várias vezes e para produzir depois da secagem a ar o produto desejado como um sólido amarelo (1319 mg) que foi usado na forma em que se encontra sem outra purificação. LCMS m/z 995,5 [M+H+]; tempo de retenção = 1,02 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 8,181 minutos.
[00330] Etapa 2: Síntese de
[00331] N~2~-(terc-butoxicarbonil)-N~6~-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]- 12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (27). Em uma solução de 2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoeptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (4, 371 mg, 0,499 mmol) e N~2~- (terc-butoxicarbonil)-N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L- valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L- ornitinamida (26, 802 mg, 0,64 mmol) em 2,5 mL de N,N- dimetilacetamida foram adicionados 2,6-lutidina (216 uL, 200 mg, 1,9 mmol,) N,N-di-isopropiletilamina (326 uL, 240 mg, 1,9 mmol) e 3H- [1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin3-ol (HOAt, 17,7 mg, 0,130 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 90 minutos a 50°C e em seguida em temperatura ambiente durante 16 horas. A reação foi em seguida purificada por cromatografia de fase reversa (Método U) para fornecer depois da liofilização 339 mg (42%, 2 etapas) do produto desejado como um sólido branco. LCMS m/z 1599,9 [M+H+]; tempo de retenção = 1,09 minutos. tempo de retenção de HPLC analítica = 8,163 minutos.
[00332] Etapa 3: Síntese de
[00333] N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3--tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1- il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (28). Em uma suspensão de N~2~-(terc-butoxicarbonil)-N~6~-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12- (2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L- ornitinamida (27, 439 mg, 0,275 mmol) em 2 mL de diclorometano foi adicionado 1 mL de ácido trifluoroacético. A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 20 minutos em temperatura ambiente. A reação foi em seguida concentrada e purificada por cromatografia de fase reversa (Método V) para fornecer depois da liofilização 410 mg (96%). LCMS m/z 1499,8 [M+H+]; tempo de retenção = 0,86 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 6,778 minutos.
[00334] Etapa 4: Síntese de
[00335] N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N~2~-(hidroxiacetil)-L- lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3--tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L- ornitinamida (29). Em uma solução de ácido hidroxiacético (14,7 mg, 0,193 mmol) em 0,3 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado cloridrato de N-(3-Dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (EDCI, 7, 99 mg, 0,0417 mmol), (Hidroxiimino)cianoacetato de etila (Oxyma, 20 mg, 0,14 mmol) e N-metil morfolina (40 uL, 37 mg, 0,36 mmol). A solução amarela resultante foi agitada durante 20 minutos e em seguida uma solução de N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11- [(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2- fenil-1-(1,3--tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (28, 50 mg, 0,032 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionada. A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante uma hora em temperatura ambiente, e foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método F). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer depois da liofilização 12,2 mg (24%). LCMS m/z 1557,8 [M+H+]; tempo de retenção = 0,98 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 7,371 minutos.
[00336] Etapa 5: Síntese de
[00337] N~2~-(hidroxiacetil)-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)- butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil- 1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil- 3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}- N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (30). Em uma solução de N~6~-[(9H- fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N~2~-(hidroxiacetil)-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}- 2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (29, 12,2 mg, 0,00784 mmol) em 0,3 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionada piperidina (0,1 mL, 90 mg, 1 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora. A solução foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método E). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 8 mg (70%) do produto desejado. LCMS m/z 1334,8 [M+H+]; tempo de retenção = 0,76 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,788 minutos. Exemplo 26: Preparação de N~2~-(metilcarbamoil)-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]- 12-(2-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (33)
[00338] Etapa 1: Síntese de N-metil-1H-imidazole-1-carboxamida (31). Uma mistura de 1,1'-carbonildiimidazol (1,76 g, 10,7 mmol) e cloridrato de metilamina (661 mg, 9,7 mmols) foram dissolvidos em 1,8 mL de N,N-dimetilformamida e 5,5 mL de acetonitrila. A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 3,25 horas em temperatura ambiente. A reação foi em seguida concentrada e purificada por cromatografia sílica gel usando um gradiente de eluição de 0% a 10% metanol em diclorometano para fornecer 696 mg (57%) do produto desejado. LCMS m/z 126,0 [M+H+]; tempo de retenção = 0,17 minutos. 1H RMN (400MHz, DMSO-d6) δ = 8,22 (s, 1-H), 7,65 (s, 1-H), 7,03 (s, 1-H), 2,83 (d, J=4,3 Hz, 3-H).
[00339] Etapa 2: Síntese de N~6~-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-N~2~-(metilcarbamoil)-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi- 2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (32). Em uma mistura de N-metil-1H- imidazol-1-carboxamida (40,1 mg, 0,321 mmol) e N~6~-[(9H-fluoren- 9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2- il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1- (1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec- 1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (28, 50 mg, 0,032 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionada trietilamina (44,7 uL, 32,5 mg, 0,321 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 1,5 em temperatura ambiente, e foi em seguida diluída com dimetilsulfóxido e purificada por HPLC de fase reversa (Método L) para fornecer depois da liofilização 8,8 mg (18%) do produto desejado. LCMS m/z 1556,8 [M+H+]; tempo de retenção = 0,99 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 7,521 minutos.
[00340] Etapa 3: Síntese de N~2~-(metilcarbamoil)-L-lisilvalil-N- {4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (33). Em uma solução de N~6~-[(9H- fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N~2~-(metilcarbamoil)-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi- 2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (32, 8,8 mg, 0,0057 mmol) em 0,3 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionada piperidina (0,1 mL, 90 mg, 1 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 1,5 hora. A solução foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método E em seguida M). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 4,6 mg (58%) do produto desejado. LCMS m/z 1333,7 [M+H+]; tempo de retenção = 0,76 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,825 minutos. Exemplo 27: Preparação de N-metilglicil-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi- 2-metil-3-oxo-3-{[(1 S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (34)
[00341] Em uma solução de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-N- metilglicinato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (11,9 mg, 0,0416 mmol) em 0,1 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado N~6~-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12- (2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol- 2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (28, 50 mg, 0,032 mmol) e N,N-di- isopropiletilamina (17 uL, 13 mg, 0,096 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante uma hora em temperatura ambiente (LCMS m/z 1670,7 1[M+H+]; tempo de retenção = 1,03 minuto). A mistura foi concentrada sob um fluxo forte de nitrogênio e o resíduo foi dissolvido novamente em metanol e passado através de uma coluna de SCX (pré-lavada com 2 volumes de coluna de metanol). O cartucho foi lavado com volume de coluna de metanol e o produto foi deixado sentar durante a noite em coluna. A coluna foi estimulada com uma solução a 7M de amônia em metanol depois da concentração o resíduo foi purificado por HPLC de fase reversa (Método L). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 4,2 mg (8%) do produto desejado. LCMS m/z 1347,51 [M+H+]; tempo de retenção = 0,68 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,486 minutos. Exemplo 28: Preparação de N,N-dimetilglicil-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]—12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1 -il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (35)
[00342] Em uma solução de N,N-dimetilglicina (4,5 mg, 0,044 mmol) em 0,1 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado 0,1 mL de uma solução de matéria prima de cloridrato de N-(3-Dimetilaminopropil)-N'- etilcarbodiimida (EDCI, 79,9 mg, 0,417 mmol), (Hidroxiimino)cianoacetato de etila (Oxyma, 10 mg, 0,07 mmol) e N- metil morfolina (10 uL, 9 mg, 0,09 mmol) em 1 mL de N,N- dimetilformamida. A solução amarela resultante foi agitada durante 15 minutos, em seguida uma solução de N~6~-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12- (2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol- 2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (28, 50 mg, 0,032 mmol) em 0,5 mL de N,N- dimetilformamida foi adicionada. A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 40 minutos em temperatura ambiente e mais N-metil morfolina (50 uL, 45 mg, 0,45 mmol). A mistura foi agitada durante 16 horas, concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método L). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 5,4 mg (11%) do produto desejado. LCMS m/z 1361,8 [M+H+]; tempo de retenção = 0,71 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,481 minutos. Exemplo 29: Preparação de glicil-L-lisilvalil-N-{4-[(8S111S112R)-11- [(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (37)
[00343] Etapa 1: Síntese de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicil- N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)- 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)- 5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (36). Em uma solução de N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (28, 65,0 mg, 0,043 mmol)) em 0,650 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicinato de 2,5- dioxopirrolidin-1-ila (68,4 mg, 0,173 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (23,1 mg, 0,173 mmol, 30,8 uL). A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 2 horas em temperatura ambiente e foi purificada diretamente por HPLC de fase reversa (Método N). Produto contendo frações foi liofilizado para fornecer 22,3 mg (29%) do produto desejado. LCMS m/z 1777,2 [M+H+]; tempo de retenção = 1,10 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 8,544 minutos.
[00344] Etapa 2: Síntese de glicil-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11- [(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (37). Em uma solução de N- [(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicil-N~6~-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]- 12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (36, 20 mg, 0,011 mmol) em 0,6 mL de N,N- dimetilacetamida foi adicionada piperidina (0,3 mL, 270 mg, 3 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 15 minutos. A solução foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método L em seguida M). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 14,4 mg (90%) do produto desejado. LCMS m/z 1333,8 [M+H+]; tempo de retenção = 0,70 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,825 minutos. Exemplo 30: Preparação de N~2~-[(3-metiloxetan-3-il)carbonil]-L-lisil- L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11 -[(2S)—butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)- 1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (39)
[00345] Etapa 1: Síntese de N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]- N~2~-[(3-metiloxetan-3-il)carbonil]-L-lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11- [(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (38). Em um banho de água gelada, em uma solução de N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L- lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)- 1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (28, 50,0 mg, 0,031 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilacetamida foram adicionados ácido 3-metiloxetano-3- carboxílico (22 mg, 0,19 mmol), hexafluorofosfato de O-(7- Azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio (HATU, 65 mg, 0,17 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (35 uL, 26 mg, 0,20 mmol). A mistura foi agitada durante 40 minutos adicionais no banho de água gelada. A solução foi em seguida diretamente purificada por HPLC de fase reversa (Método P). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 37,4 mg (55%) do produto desejado. LCMS m/z 1597,8 [M+H+]; tempo de retenção = 1,00 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 7,567 minutos.
[00346] Etapa 2: Síntese de N~2~-[(3-metiloxetan-3-il)carbonil]-L- lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (39). Em uma solução de N~6~-[(9H-fluoren- 9-ilmetóxi)carbonil]-N~2~-[(3-metiloxetan-3-il)carbonil]-L-lisil-L-valil-N- {4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi- 2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (38, 27,4 mg, 0,0172 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilacetamida foi adicionada uma solução aquosa de hidróxido de lítio (411 uL, 41,1 mg, 0,0343 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora. A solução foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método L). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 9,3 mg (36%) do produto desejado. LCMS m/z 1374,4 [M+H+]; tempo de retenção = 0,77 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,841 minutos. Exemplo 31: Preparação de 2-metilalanil-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]—12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1 -il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (41)
[00347] Etapa 1: Síntese de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2- metilalanil-N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (40). Em um banho de água gelada, em uma solução de N~6~-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12- (2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol- 2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (28, 50,0 mg, 0,031 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilacetamida foram adicionados N-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanina (17,5 mg, 0,0538 mmol), hexafluorofosfato de O-(7-Azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'- tetrametilurônio (HATU, 25,9 mg, 0,0681 mmol) e N,N-di- isopropiletilamina (25 uL, 19 mg, 0,14 mmol). A mistura foi agitada durante um adicional de 40 minutos no banho de água gelada. A solução foi em seguida diretamente purificada por HPLC de fase reversa (Método Q). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 56 mg (100%) do produto desejado. LCMS m/z 1806,9 [M+H+]; tempo de retenção = 1,12 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 8,817 minutos.
[00348] Etapa 2: Síntese de 2-metilalanil-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (40). Em uma solução de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-2-metilalanil-N~6~- [(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11- [(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (40, 56 mg, 0,031 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilacetamida foi adicionada uma solução aquosa de hidróxido de lítio (100 uL, 10 mg, 0,4 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora. A solução foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método L). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 7,6 mg (15%) do produto desejado. LCMS m/z 1384,2 [M+Na+]; tempo de retenção = 0,71 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,467 minutos. Exemplo 32: Preparação de N~2~-(metoxicarbonil)-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1 -il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-omitinamida (43)
[00349] Etapa 1: Síntese de N-(metoxicarbonil)-2-metilalanil-N~6~- [(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11- [(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (42). Em uma solução de N~6~- [(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)- butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2- fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (28, 30,0 mg, 0,019 mmol)) em 0,3 mL de N,N-dimetilacetamida e 0,2 mL de diclorometano foi adicionado metilcloroformiato (29 uL, 35,2 mg, 0.372 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 2 horas em temperatura ambiente Depois de 2 h, N,N-di-isopropiletilamina (10,0 uL, 7,5 mg, 0,056 mmol) foi adicionado e a mistura agitada durante um extra de 16 horas. LC-MS ainda mostrou a reação estar incompleta desse modo metilcloroformiato (60 uL, 73 mg, 0,78 mmol) foi adicionado seguido por N,N-di-isopropiletilamina (10 uL, 7,5 mg, 0,056 mmol). Depois de agitar em temperatura ambiente durante outras 4 horas, a mistura foi purificada diretamente por HPLC de fase reversa (Método Q). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 6,4 mg (22%) do produto desejado. LCMS m/z 1557,9 [M+H+]; tempo de retenção = 1,05 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 7,709 minutos.
[00350] Etapa 2: Síntese de N~2~-(metoxicarbonil)-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (43). Em uma solução de N-(metoxicarbonil)-2-metilalanil-N~6~-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]- 12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (42, 6,4 mg, 0,0041 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilacetamida foi adicionado dietilamina (0,3 mL, 200 mg, 3 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 3 horas. A solução foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método L). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 2,6 mg (44%) do produto desejado. LCMS m/z 1334,8 [M+H+]; tempo de retenção = 0,83 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,908 minutos. Exemplo 33: Preparação de L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)- butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2- fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (44)
[00351] Em uma solução de N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]- L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (28, 20,0 mg, 0,012 mmol)) em 0,2 mL de N,N-dimetilacetamida foi adicionado piperidina (0,1 mL, 90 mg, 1 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 4 horas. A solução foi em seguida diretamente purificada por HPLC de fase reversa (Método L em seguida R). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 7,6 mg (44%) do produto desejado. LCMS m/z 1276,7 [M+H+]; tempo de retenção = 0,70 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,516 minutos. Exemplo 34: Preparação de L-alanil-L-lisilvalil-N-{4-[(8S111S112R)-11- [(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (46)
[00352] Etapa 1: Síntese de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L- alanil-N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (45). Em um banho de água gelada, a uma solução de N~6~-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12- (2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol- 2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (28, 8,7 mg, 0,0054 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilacetamida foi adicionado N-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-alaninato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila ((8,81 mg, 0,0216 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (10,0 uL, 7,5 mg, 0,056 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 16 horas em temperatura ambiente e diretamente purificada por HPLC de fase reversa (Método S). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 5,3 mg (55%) do produto desejado. LCMS m/z 1791,7 [M+H+]; tempo de retenção = 1,11 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 8,655 minutos.
[00353] Etapa 2: Síntese de L-alanil-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)- 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)- 5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (46). Em uma solução de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-alanil-N~6~-[(9H- fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)- butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2- fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (45, 5,3 mg, 0,0030 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilacetamida foi adicionada uma solução aquosa de hidróxido de lítio (210 uL, 20 mg, 0,9 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora. A solução foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método L). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 3,4 mg (73%) do produto desejado. LCMS m/z 1347,7 [M+H]+; tempo de retenção = 0,69 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,487 minutos. Exemplo 35: Preparação de D-alanil-L-lisilvalil-N-{4-[(8S111S112R)-11- [(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (48)
[00354] Etapa 1: Síntese de N-(terc-butoxicarbonil)-D-alanil-N~6~- [(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11- [(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (47). Em um banho de água gelada, a uma solução de N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L- lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)- 1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (28, 50 mg, 0,03 mmol) em 0,5 mL de N,N- dimetilacetamida foi adicionado N-(terc-butoxicarbonil)-D-alaninato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (15,7 mg, 0,0548 mmol) e N,N-di- isopropiletilamina (22,0 uL, 16 mg, 0,12 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 16 horas em temperatura ambiente e diretamente purificada por HPLC de fase reversa (Método S). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 20,0 mg (40%) do produto desejado. LCMS m/z 1791,7 [M+H+]; tempo de retenção = 1,08 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 8,024 minutos.
[00355] Etapa 2: Síntese de D-alanil-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)- 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)- 5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (48). Em uma solução de N-(terc-butoxicarbonil)-D-alanil-N~6~-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]- 12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (47, 20,0 mg, 0,012 mmol) em 1 mL de acetonitrila foi adicionado 0,5 mL de ácido trifluoroacético. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 15 minutos em seguida concentrada. O resíduo foi dissolvido em 0,5 mL de N,N- dimetilacetamida e resfriado com um banho de água gelada. A isto foi adicionada uma solução aquosa de hidróxido de lítio (50,3 uL, 5,3 mg, 0,12 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução foi em seguida diretamente purificada por HPLC de fase reversa (Método L). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 8,9 mg (47%) do produto desejado. LCMS m/z 1347,9 [M+H]+; tempo de retenção = 0,77 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,429 minutos. Exemplo 36: Preparação de L-alfa-aspartil-L-lisil-L-valil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]—12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1 -il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (50)
[00356] Etapa 1: Síntese de (6S,9S,12S,15S)-1-amino-6-({4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}carbamoil)-15-{[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]amino}-12-(4-{[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]amino}butil)-1,8,11,14-tetraoxo-9-(propan-2-il)- 2,7,10,13-tetraazaeptadecan-17-oato de terc-butila (49). Em um banho de água gelada, a uma solução de N~6~-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12- (2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol- 2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (28, 50 mg, 0,03 mmol) em 0,5 mL de N,N- dimetilacetamida foi adicionado ácido (2S)-4-terc-butoxi-2-{[(9H- fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}-4-oxobutanóico (20,9 mg, 0,0722 mmol), hexafluorofosfato de O-(7-Azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'- tetrametilurônio (HATU, 28,0 mg, 0,074 mmol) e N,N-di- isopropiletilamina (22,0 uL, 16 mg, 0,12 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante uma hora e foi diretamente purificada por HPLC de fase reversa (Método Q). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 41 mg (70%) do produto desejado. LCMS m/z 1771,2 [M+H+]; tempo de retenção = 1,16 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 8,591 minutos.
[00357] Etapa 2: Síntese de L-alfa-aspartil-L-lisil-L-valil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (50). Em uma solução de (6S,9S,12S,15S)-1-amino-6-({4-[(8S,11S,12R)-11- [(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}carbamoil)-15-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}-12-(4- {[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}butil)-1,8,11,14-tetraoxo-9- (propan-2-il)-2,7,10,13-tetraazaeptadecan-17-oato de terc-butila (49, 41,0 mg, 0,023 mmol) em 1 mL de acetonitrila foi adicionado 0,5 mL de ácido trifluoroacético. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 25 minutos (LCMS m/z 1671,0 [M+H]+; tempo de retenção = 0,93 minutos) em seguida concentrada. O resíduo foi dissolvido em 0.5 mL de N,N-dimetilacetamida e resfriado com um banho de água gelada. A isto foi adicionada uma solução aquosa de hidróxido de lítio (50,3 uL, 5,3 mg, 0,12 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 20 minutos. A solução foi em seguida diretamente purificada por HPLC de fase reversa (Método Q). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 1,1 mg (3%) do produto desejado. LCMS m/z 1392,1 [M+H]+; tempo de retenção = 0,80 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,309 minutos. Exemplo 37: Preparação de N-acetilglicil-L-lisil-L-valil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1 -il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (52)
[00358] Etapa 1: Síntese de N-acetilglicil-N~6~-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]- 12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (51). Em um banho de água gelada, a uma solução de N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (28, 30 mg, 0,02 mmol) em 0,3 mL de N,N-dimetilacetamida foi adicionado N- acetilglicinato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (13,7 mg, 0,0640 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (22 uL, 16 mg, 0,12 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 16 horas em temperatura ambiente e foi diretamente purificada por HPLC de fase reversa (Método Q). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 17,4 mg (60%) do produto desejado. LCMS m/z 1598,9 [M+H+]; tempo de retenção = 1,04 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 7,326 minutos.
[00359] Etapa 2: Síntese de N-acetilglicil-L-lisil-L-valil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (52). Em uma solução de N-acetilglicil-N~6~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L- lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (51, 17,4 mg, 0,0109 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilacetamida foi adicionada uma solução aquosa de hidróxido de lítio (100 uL, 10 mg, 0,2 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 20 minutos. A solução foi em seguida diretamente purificada por HPLC de fase reversa (Método B). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 9,4 mg (58%) do produto desejado. LCMS m/z 1398,1 [M+Na+]; tempo de retenção = 0,84 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,715 minutos. Exemplo 38: Preparação de L-seril-L-lisilvalil-N-{4-[(8S111S112R)-11- [(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (57)
[00360] Etapa 1: Síntese de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-[(9H- fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisilvalil-N~5~-carbamoil-N-[4- (hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (53). Em um banho de água gelada, a uma solução de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-lisina (1090 mg, 2,32 mmols) em 15 mL de N,N- dimetilformamida foi adicionado hexafluorofosfato de O-(7- azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio (HATU, 882 mg, 2,32 mmol). Depois de 40 minutos, L-valil-N~5~-carbamoil-N-[-4- (hidroximetil) fenil]-L-ornitinamida (1, 800 mg, 2,11 mmol) foi adicionado seguido por N,N-di-isopropiletilamina (1,114 ml, 817 mg, 6,32 mmols). A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 2 horas em temperatura ambiente. A reação foi em seguida derramada em éter metil terc-butílico (150 mL), agitada durante 15 minutos, em seguida filtrada. O sólido resultante foi lavado com uma mistura de diclorometano: éter metil terc-butílico:metanol (10:10:2) para proporcionar o produto cru (1.3 g) como sólido cinza. Este sólido foi purificado por HPLC de fase reversa (Método T). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 570 mg (33%) do produto desejado. tempo de retenção de HPLC analítica = 4,55 minutos. 1H RMN (400MHz, DMSO-d6) δ = 9,97 (br, s,, 1-H), 8,14 (d, J=6,5 Hz, 1H), 7,90 (d, J=7,5 Hz, 2-H), 7,73 (br, s,, 3-H), 7,54 (d, J=8,5 Hz, 3-H), 7,42 (t, J=7,3 Hz, 2-H), 7,33 (t, J=7,3 Hz, 2-H), 7,23 (d, J=8,0 Hz, 2-H), 6,78 (br, s,, 1-H), 5,98 (br, s,, 1-H), 5,43 (br, s,, 2-H), 5,11 (br, s,, 1-H), 4,45 - 4,34 (m, 3-H), 4,34 - 4,15 (m, 4-H), 4,02 (br, s,, 1-H), 3,02 (d, J=5,5 Hz, 1-H), 2,89 (br, s,, 3-H), 1,98 (d, J=6,5 Hz, 1-H), 1,61 (br, s,, 3-H), 1,52 (br, s,, 1-H), 1,42-1,30 (m, 1-3H), 1,24 (br, s,, 2-H), 0,83 (d, J=12,0 Hz, 3-H), 0,85 (d, J=11,5 Hz, 3-H).
[00361] Etapa 2: Síntese de
[00362] N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-lisilvalil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(4- nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-ornitinamida (54). Em um banho de água gelada, a uma solução de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~- [(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisilvalil-N~5~-carbamoil-N-[4- (hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (53, 570 mg, 0,687 mmol) e carbonato de p-nitrofenila (418 mg, 1,37 mmol) em 10 mL de N,N- dimetilformamida foi adicionado N,N-di-isopropiletilamina (257 uL, 178 mg, 1,37 mmol,) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 6 horas. A reação foi em seguida derramada em éter metil terc-butílico (150 mL), agitada durante 15 minutos, em seguida filtrada. O sólido resultante foi disperso em diclorometano (20 mL) durante 20 minutos em seguida filtrado para fornecer 400 mg (58%) do produto desejado. LCMS m/z 996,0 [M+H+]; tempo de retenção = 4,829 minutos. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,43 minutos. 1H RMN (400MHz, DMSO-d6) δ = 10,14 (s, 1-H), 8,36 - 8,29 (m, 2-H), 8,18 (d, J=7,5 Hz, 1-H), 7,90 (d, J=7,5 Hz, 2-H), 7,74 (d, J=7,0 Hz, 2-H), 7,66 (d, J=8,0 Hz, 2-H), 7,62 - 7,50 (m, 2-H), 7,42 (d, J=7,0 Hz, 3-H), 7,38 - 7,11 (m, 3-H), 6,78 (br, s,, 1-H), 6,00 (br, s,, 1-H), 5,44 (br, s,, 2-H), 5,26 (s, 2-H), 4,39 (br, s,, 1-H), 4,35 - 4,16 (m, 4-H), 4,04 (br, s,, 1-H), 3,05 (d, J=7,0 Hz, 1-H), 2,90 (br, s,, 3-H), 2,74 (s, 1-H), 2,34 (br, s,, 1-H), 2,10 (s, 1-H), 1,99 (d, J=6,0 Hz, 1-H), 1,68 (br, s,, 1-H), 1,62 (br, s,, 2-H), 1,53 (br, s,, 2-H), 1,38 (s, 1-1H), 1,42 - 1,20 (m, 1-H), 1,42 - 1,20 (m, 1-H), 0,85 (d, J=12,5 Hz, 3-H), 0,86 (d, J=12,5 Hz, 3-H).
[00363] Etapa 3: Síntese de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-[(9H- fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)- butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2- fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (55). Em uma solução de 2- metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil- 3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5- metil-1-oxoeptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (4, 440 mg, 0,59 mmol) e N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L- lisilvalil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L- ornitinamida (54, 658,0 mg, 0,661 mmol) em 1,3 mL de N,N- dimetilacetamida foram adicionados 2,6-lutidina (137 uL, 130 mg, 1,2 mmol) N,N-di-isopropiletilamina (207,0 uL, 160 mg, 1,2 mmol) e 3H- [1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin3-ol (HOAt, 92,1 mg, 0,677 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 2.5 horas a 50oC e em seguida em temperatura ambiente durante 16 horas. A reação foi em seguida purificada por cromatografia de fase reversa (Método U) para fornecer depois da liofilização 630 mg (67%) do produto desejado como um sólido branco. LCMS m/z 1600,6 [M+H+]; tempo de retenção = 1,07 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 8,213 minutos.
[00364] Etapa 4: Síntese N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (56). Em um banho de água gelada, a uma solução N~6~-(terc-butoxicarbonil)- N~2~-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)- 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)- 5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (55, 630 mg, 0,394 mmol) em 5 mL de N,N-dimetilacetamida foi adicionado uma solução de hidróxido de lítio (29,4 mg, 1,23 mmol) em 0,5 mL de água e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 30 minutos em que hidróxido de lítio (40,4 mg, 1,69 mmol) foi adicionado. Depois de um total de 3 horas, a solução foi resfriada em um banho de água gelada, em seguida extinguida com ácido acético (0,2 mL) e purificada por HPLC de fase reversa (Método 2). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 350 mg (60%) do produto desejado. LCMS m/z 1377,6 [M+H+]; tempo de retenção = 0,77 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 6,181 minutos.
[00365] Etapa 5: Síntese de L-seril-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)- 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)- 5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (57). Em um banho de água gelada, a uma solução de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L- lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)- 1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (56, 50,0 mg, 0,0335 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilacetamida foram adicionados N-(terc-butoxicarbonil)-L- serina (6,88 mg, 0,0335 mmol) em 0,1 mL de N,N-dimetilacetamida, hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'- tetrametilurônio (HATU, 15,3 mg, 0,0402 mmol) em 0,1 mL de N,N- dimetilacetamida e N,N-di-isopropiletilamina (17,9 uL, 13,4 mg, 0,101 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e em seguida permitida agitar durante 45 minutos em temperatura ambiente concentrada sob um fluxo forte de nitrogênio para produzir o cru (LCMS m/z 1565,6 [M+H+], tempo de retenção = 0,96 minuto). O resíduo amarelo foi dissolvido em 1,2 mL de metanol e carregado igualmente em dois cartuchos de pré-eluídos com 3 volumes de coluna de metanol. As colunas foram lavadas com 3 volumes de coluna de metanol (nenhum traço do produto em lavagens de acordo com LC-MS). O produto foi deixado assentar na coluna durante a noite. O produto desejado foi eluído com 2 volumes de coluna de 1 N de trietilamina em metanol. Depois da concentração sob pressão reduzida, o resíduo foi em seguida purificado por cromatografia de fase reversa (Método V) para fornecer depois da liofilização 8,3 mg (16%) do produto desejado. LCMS m/z 1364,5 [M+H+], tempo de retenção = 0,68 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,464 minutos. Exemplo 39: Preparação de D-seril-L-lisilvalil-N-{4-[(8S111S112R)-11- [(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (58)
[00366] Em um banho de água gelada, a uma solução de N~6~- (terc-butoxicarbonil)-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]- 12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (56, 50,0 mg, 0,0335 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilacetamida foram adicionados N-(terc-butoxicarbonil)-D- serina (6,88 mg, 0,0335 mmol) em 0,1 mL de N,N-dimetilacetamida, hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'- tetrametilurônio (HATU, 15,3 mg, 0,0402 mmol) em 0,1 mL de N,N- dimetilacetamida e N,N-di-isopropiletilamina (17,9 uL, 13,4 mg, 0,101 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e em seguida permitida agitar durante 45 minutos em temperatura ambiente concentrada sob um fluxo forte de nitrogênio para produzir o cru (LCMS m/z 1565,6 [M+H+], tempo de retenção = 0,96 ata). O resíduo amarelo foi dissolvido em 1,2 mL de metanol e carregado igualmente em dois cartuchos de SCX pré-eluídos com 3 volumes de coluna de metanol. As colunas foram lavadas com 3 volumes de coluna de metanol (nenhum traço de produto em lavagens de acordo com LC-MS). O produto foi deixado assentar na coluna durante a noite. O produto desejado foi eluído com 2 volumes de coluna de 1 N de trietilamina em metanol. Depois da concentração sob pressão reduzida, o resíduo foi em seguida purificado por cromatografia de fase reversa (Método V) para fornecer depois da liofilização 10,4 mg (19%) do produto desejado. LCMS m/z 1364,5 [M+H+], tempo de retenção = 0,67 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,424 minutos. Exemplo 40: Preparação de N~2~-[(2S)-2-hidroxipropanoil]-L-lisilvalil- N-{4-[(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (59)
[00367] Em um banho de água gelada, a uma solução de N~6~- (terc-butoxicarbonil)-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]- 12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (56, 50,0 mg, 0,0335 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilacetamida foram adicionados ácido (2S)-2- hidroxipropanóico (3,02 mg, 0,0335 mmol) em 0,1 mL de N,N- dimetilacetamida, hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)- N,N,N',N'-tetrametilurônio (HATU, 15,3 mg, 0,0402 mmol) em 0,1 mL de N,N-dimetilacetamida e N,N-di-isopropiletilamina (17,9 uL, 13,4 mg, 0,101 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 45 minutos em temperatura ambiente em seguida concentrada sob um fluxo forte de nitrogênio para produzir o cru (LCMS m/z 1449,5 [M+H+], tempo de retenção = 0,91 minuto). O resíduo amarelo foi dissolvido em 1,2 mL de metanol e carregado igualmente em dois cartuchos de SCX pré-eluídos com 3 volumes de coluna de metanol. As colunas foram lavadas com 3 volumes de coluna de metanol (nenhum traço de produto em lavagens de acordo com LC-MS). O produto foi deixado assentar na coluna durante a noite. O produto desejado foi eluído com 2 volumes de coluna de 1 N de trietilamina em metanol. Depois da concentração sob pressão reduzida, o resíduo foi em seguida purificado por cromatografia de fase reversa (Método V) para fornecer depois da liofilização 12,9 mg (26%) do produto desejado. LCMS m/z 1349.4 [M+H+], tempo de retenção = 0,74 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,813 minutos. Exemplo 41: Preparação de N~2~-[(2R)-2-hidroxipropanoil]-L-lisilvalil- N-{4-[(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (60)
[00368] Em um banho de água gelada, a uma solução de N~6~- (terc-butoxicarbonil)-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]- 12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (56, 50,0 mg, 0,0335 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilacetamida foram adicionados ácido (2R)-2- hidroxipropanóico (3,01 mg, 0,0334 mmol) em 0,1 mL de N,N- dimetilacetamida, hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)- N,N,N',N'-tetrametilurônio (HATU, 15,3 mg, 0,0402 mmol) em 0,1 mL de N,N-dimetilacetamida e N,N-di-isopropiletilamina (17,9 uL, 13,4 mg, 0,101 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e em seguida permitida agitar durante 45 minutos em temperatura ambiente concentrada sob um fluxo forte de nitrogênio para produzir o cru (LCMS m/z 1449,4 [M+H+], tempo de retenção = 0,90 minuto). O resíduo foi em seguida purificado por cromatografia de fase reversa (Método V) para fornecer depois da liofilização 29,6 mg (60%) do produto desejado. LCMS m/z 1349,4 [M+H+], tempo de retenção = 0,75 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,740 minutos. Exemplo 42: Preparação de N~2~-[(2S)-2,3-diidroxipropanoil]-L- lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)- 1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-omitinamida (62)
[00369] Etapa 1: Síntese de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-[(2S)- 2,3-diidroxipropanoil]-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]- 12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (61). Em um banho de água gelada, a uma solução de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)- 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)- 5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (56, 50,0 mg, 0,0335 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilacetamida foram adicionados ácido (2S)-2,3-diidroxipropanóico (4,02 mg, 0,0379 mmol) em 0,1 mL de N,N-dimetilacetamida, hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1- il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio (HATU, 15,3 mg, 0,0402 mmol) em 0,1 mL de N,N-dimetilacetamida e N,N-di-isopropiletilamina (17,9 uL, 13,4 mg, 0,101 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e em seguida permitida agitar durante 45 minutos em temperatura ambiente concentrada sob um fluxo forte de nitrogênio. O resíduo amarelo foi em seguida purificado por cromatografia de fase reversa (Método U) para fornecer depois da liofilização 10,8 mg (22%) do produto desejado. LCMS m/z 1465,5 [M+H+], tempo de retenção = 0,89 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 6,607 minutos.
[00370] Etapa 2: Síntese de N~2~-[(2S)-2,3-diidroxipropanoil]-L- lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)- 1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (62). Em uma suspensão de N~6~-(terc- butoxicarbonil)-N~2~-[(2S)-2,3-diidroxipropanoil]-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (61, 10,8 mg, 0,0074 mmol) em 1 mL de diclorometano foi adicionado 0,5 mL de ácido trifluoroacético. A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 20 minutos em temperatura ambiente. A reação foi em seguida concentrada e purificada por cromatografia de fase reversa (Método V) para fornecer depois da liofilização 3,6 mg (33%). LCMS m/z 1365.4 [M+H+]; tempo de retenção = 0,74 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,749 minutos. Exemplo 43: Preparação de N~2~-(3-hidroxipropanoil)-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1 -il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-omitinamida (64)
[00371] Etapa 1: Síntese de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-(3- hidroxipropanoil)-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12- (2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol- 2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (63). Em um banho de água gelada, a uma solução de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisilvalil-N-{4-[(8S,11S,12R)- 11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)- 5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (56, 50,0 mg, 0,0335 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilacetamida foram adicionados ácido 3-hidroxipropanóico (4,01 mg, 0,0445 mmol) em 0,1 mL de N,N- dimetilacetamida, hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)- N,N,N',N'-tetrametilurônio (HATU, 15,3 mg, 0,0402 mmol) em 0,1 mL de N,N-dimetilacetamida e N,N-di-isopropiletilamina (17,9 uL, 13,4 mg, 0,101 mmol). A mistura foi monitorada por LCMS e em seguida permitida agitar durante 45 minutos em temperatura ambiente concentrada sob um fluxo forte de nitrogênio. O resíduo amarelo foi em seguida purificado por cromatografia de fase reversa (Método U) para fornecer depois da liofilização 13,9 mg (29%) do produto desejado. LCMS m/z 1449,6 [M+H+], tempo de retenção = 0,91 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 6,721 minutos.
[00372] Etapa 2: Síntese de N~2~-(3-hidroxipropanoil)-L-lisilvalil-N- {4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi- 2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoil-L-ornitinamida (64). A uma suspensão de N~6~-(terc- butoxicarbonil)-N~2~-(3-hidroxipropanoil)-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-ornitinamida (63, 13,9 mg, 0,0096 mmol) em 1 mL de diclorometano foi adicionado 0,5 mL de ácido trifluoroacético. A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 20 minutos em temperatura ambiente. A reação foi em seguida concentrada e purificada por cromatografia de fase reversa (Método V) para fornecer depois da liofilização 4,1 mg (29%). LCMS m/z 1349,4 [M+H+]; tempo de retenção = 0,75 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,758 minutos. Exemplo 44: Preparação de N~2~-(metilsulfonil)lisil-L-valil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1 -il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoilomitinamida,sal trifluoroacético (70)
[00373] Etapa 1: Síntese de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~- (metilsulfonil)-L-lisinato de metila (65). A uma solução congelada de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-L-lisinato de metila (2,0 g, 6,73 mmols) em tetra-hidrofurano:água (1:1, 20 mL) foi adicionado carbonato de potássio (4,6 g, 33,7 mmols) seguido por adição gota a gota de cloreto de mesila (0,62 mL, 8,08 mmols). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 3 horas e a mistura foi em seguida filtrada. O filtrado foi extraído três vezes com acetato de etila. Os extratos combinados foram lavados com salmoura, secados em sulfato de sódio e concentrados sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia sílica gel usando um gradiente de eluição de 0% a 2% metanol em diclorometano para fornecer 2,0 g (87%) do produto desejado como óleo incolor. 1H RMN (400MHz, Clorofórmio-d) δ = 5,23 (d, J=9,0 Hz, 1-H), 4,62 (br, s,, 1-H), 4,10 (dt, J=5,0, 8,5 Hz, 1-H), 3,78 (s, 3-H), 3,16 - 3,04 (m, 2-H), 2,95 (s, 3-H), 1,88 - 1,78 (m, 2-H), 1,77 - 1,64 (m, 1-H), 1,59 - 1,47 (m, 3-H), 1,45 (s, 9H).
[00374] Etapa 2: Síntese de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~- (metilsulfonil)-L-lisina (66). A uma solução agitada de N~6~-(terc- butoxicarbonil)-N~2~-(metilsulfonil)-L-lisinato de metila (65, 2,0 g, 5,90 mmols) em tetra-hidrofurano:água:metanol (1:1:1, 30 mL) foi adicionado monoidrato de hidróxido de lítio (496 mg, 11,8 mmols). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida. A camada aquosa restante foi extraída duas vezes com acetato de etila. O aquoso foi acidificado em pH 3 com uma solução aquosa a 1N de ácido clorídrico e em seguida extraído duas vezes com álcool isopropílico:acetato de etila (1:5). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secados em sulfato de sódio e concentrados sob pressão reduzida para fornecer 1,3 g (68%) do produto desejado como um sólido branco. MS m/z 323,1 [M-H+]; 1H RMN (400MHz, Clorofórmio-d) δ = 6,40 (br, s,, 1-H), 5,81 - 5,66 (m, 1-H), 4,79 (br, s,, 1-H), 3,23 - 3,06 (m, 2-H), 2,99 (s, 3-H), 1,96 - 1,71 (m, 2-H), 1,55 - 1,39 (m, 1-3H).
[00375] Etapa 3: Síntese de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~- (metilsulfonil)-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4- (hidroximetil)fenil]ornitinamida (67). A uma solução congelada de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-(metilsulfonil)-L-lisina (66, 1,0 g, 3,09 mmols) e L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-(hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (1, 1,28 g, 3,40 mmols) em 20 mL de N,N-dimetilformamida foram somados N,N-di-isopropiletilamina (600 uL, 438 mg, 3,40 mmols), cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (649 mg, 3,40 mmols) e hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (459 mg, 3,40 mmols). A mistura foi permitida aquecer em temperatura ambiente e foi agitada durante 16 horas. A mistura foi em seguida adicionada gota a gota a 150 mL de éter terc-Butil metílico. O sólido foi purificado por HPLC de fase reversa. Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 580 mg (28%) do produto desejado como um sólido branco.
[00376] Etapa 4: Síntese de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~- (metilsulfonil)-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(4- nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]ornitinamida (68). A uma solução agitada de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-(metilsulfonil)-L-lisil-L-valil- N~5~-carbamoil-N-[4-(hidroximetil)fenil]ornitinamida (67, 580 mg, 0,85 mmol) e carbonato de p-nitrofenila (770 mg, 2,56 mmols) em 10 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado N,N-di-isopropiletilamina (451 ul, 330 mg, 2,56 mmols). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 16 horas. A mistura foi adicionada gota a gota a 150 mL de éter terc-Butil metílico. O sólido foi purificado por HPLC de fase reversa (Método XXX). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 200 mg (28%) do produto desejado como um sólido branco. MS m/z 851,4 [M+H+] .1H RMN (400MHz, DMSO-d6) δ = 10,16 (s, 1-H), 8,32 (d, J=9,5 Hz, 2-H), 8,26 (d, J=6,5 Hz, 1-H), 7,95 (t, J=7,4 Hz, 1-H), 7,65 (d, J=8,5 Hz, 2-H), 7,58 (t, J=5,9 Hz, 2-H), 7,45 (d, J=9,0 Hz, 1-H), 7,42 (d, J=8,5 Hz, 2-H), 6,79 (t, J=5,5 Hz, 1-H), 6,00 (t, J=5,8 Hz, 1-H), 5,45 (s, 2-H), 4,40 (d, J=5,0 Hz, 1-H), 4,33 - 4,06 (m, 1-H), 3,84 (d, J=4,5 Hz, 1-H), 3,30 (br, s,, 1-H), 3,09 - 2,99 (m, 1-H), 2,98 - 2,93 (m, 1-H), 2,93 - 2,86 (m, 2-H), 2,83 (s, 3-H), 2,01 (d, J=6,5 Hz, 1H), 1,59 (br, s,, 3-H), 1,47 (d, J=13,1 Hz, 2-H), 1,38 (s, 1-3H), 0,89 (d, J=7,0 Hz, 3-H), 0,85 (d, J=7,0 Hz, 3-H).
[00377] Etapa 5: Síntese de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~- (metilsulfonil)-D-lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12- (2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol- 2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo- 8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoilornitinamida (69). Em uma solução de 2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoeptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (4, 52,0 mg, 0,070 mmol) e N~6~- (terc-butoxicarbonil)-N~2~-(metilsulfonil)-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil- N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]ornitinamida (68, 60,6 mg, 0,0710 mmol) em 2 mL de N,N-dimetilacetamida foram adicionados 2,6-lutidina (31 uL, 28,3 mg, 0,264 mmol) N,N-di-isopropiletilamina (46 uL, 34,1 mg, 0,264 mmol) e 3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin3-ol (9 mg, 0,066 mmol). A mistura foi permitida agitar durante 16 horas a 45°C. A reação foi em seguida purificada por HPLC de fase reversa (Método S) para fornecer depois da liofilização 70 mg (69%) do produto desejado como um sólido branco. LCMS m/z 1455,09 [M+H+], 1453,77 [M-H+]; tempo de retenção = 1,80 minuto.
[00378] Etapa 6: Síntese de N~2~-(metilsulfonil)lisil-L-valil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoilornitinamida, sal trifluoroacético (70). Em uma solução de N~6~-(terc-butoxicarbonil)- N~2~-(metilsulfonil)-D-lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2- il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoilornitinamida (69, 30 mg, 0,021 mmol) em 0,8 mL de diclorometano foi adicionado 0,2 mL de ácido trifluoroacético. A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 30 minutos em temperatura ambiente. A solução foi em seguida diretamente purificada por HPLC de fase reversa (Método B). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer depois da liofilização 15 mg (48%). LCMS m/z 1355.4 [M+H+], 1-353.3 [M-H+]; tempo de retenção = 1,42 minuto. Exemplo 45: Preparação de N~2~-(fenilsulfonil)lisil-L-valil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]—12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1 -il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoilornitinamida,sal trifluoroacético (75)
[00379] Etapa 1: Síntese de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~- (fenilsulfonil)-L-lisina (71). Em uma solução congelada de N~6~-(terc- butoxicarbonil)-L-lisina (3,0 g, 12,2 mmol) em tetra-hidrofurano:água (1:1, 100 mL) foi adicionado carbonato de potássio (8,4 g, 61,0 mmol) seguido por adição gota a gota de cloreto de benzenossulfonila (1,86 mL, 14,6 mmols). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 3 horas e a mistura foi em seguida filtrada. O filtrado foi extraído três vezes com acetato de etila: álcool isopropílico 10:1. Os extratos combinados foram lavados com salmoura, secados em sulfato de sódio e concentrados sob pressão reduzida. Ao resíduo foram adicionados 100 mL de éter terc-Butil metílico e a mistura foi agitada durante 30 minutos. O sólido foi coletado por filtração e purificado por HPLC de fase reversa. Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 538 mg (11%) do produto desejado como um sólido branco. MS m/z 408,9 [M+Na+] .1H RMN (400MHz, DMSO-d6) δ = 7,76 (d, J=7,5 Hz, 2-H), 7,63 - 7,50 (m, 3-H), 3,61 - 3,53 (m, 1-H), 2,82 - 2,73 (m, 2-H), 1,61 - 1,40 (m, 2-H), 1,35 (s, 9H), 1,28 - 1,06 (m, 4-H).
[00380] Etapa 2: Síntese de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~- (fenilsulfonil)-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4- (hidroximetil)fenil]ornitinamida (72). Em uma solução congelada de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-(fenilsulfonil)-L-lisina (71, 1,2 g, 3,10 mmols) e L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-(hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (1, (1,30 g, 3,41 mmols) em 20 mL de N,N-dimetilformamida foram adicionados N,N-di-isopropiletilamina (600 uL, 438 mg, 3,40 mmols), cloridrato de N-(3-Dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (650 mg, 3,41 mmols) e hidrato de 1-Hidroxibenzotriazol (460 mg, 3,41 mmols). A mistura foi permitida aquecer em temperatura ambiente e foi agitada durante 16 horas. A mistura foi adicionada gota a gota a 150 mL de éter terc-Butil metílico. O sólido foi isolado por filtração e em seguida purificado por HPLC de fase reversa. Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 850 mg (37%) do produto desejado como um sólido branco.
[00381] Etapa 3: Síntese de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~- (fenilsulfonil)-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(4- nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]ornitinamida (73). Em uma solução agitada de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~-(fenilsulfonil)-L-lisil-L-valil- N~5~-carbamoil-N-[4-(hidroximetil)fenil]ornitinamida (72, 850 mg, 1,14 mmol) e carbonato de p-nitrofenila (853 mg, 2,85 mmols) em 15 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado N,N-di-isopropiletilamina (501 ul, 365 mg, 2,85 mmols). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 16 horas. A mistura foi adicionada gota a gota a 150 mL de éter terc-Butil metílico. O sólido foi purificado por HPLC de fase reversa. Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 450 mg (43%) do produto desejado como um sólido branco. MS m/z 935.1 [M+Na+]; 1H RMN (400MHz, DMSO-d6) δ = 10,11 (s, 1-H), 8,35 - 8,27 (m, 2-H), 8,10 (d, J=7,0 Hz, 1-H), 7,94 (d, J=8,5 Hz, 1-H), 7,83 (d, J=8,5 Hz, 1-H), 7,76 (d, J=7,5 Hz, 2-H), 7,63 (d, J=8,5 Hz, 2-H), 7,60 - 7,48 (m, 5H), 7,40 (t, J=5,8 Hz, 2-H), 6,70 (s, J=5,6, 5,6 Hz, 1-H), 6,01 - 5,93 (m, 1-H), 5,43 (s, 2-H), 4,36 (d, J=6,0 Hz, 1-H), 4,01 (t, J=7,5 Hz, 1-H), 3,78 (d, J=5,0 Hz, 1-H), 3,01 (d, J=6,0 Hz, 1-H), 2,97 - 2,88 (m, 1H), 2,76 (q, J=6,5 Hz, 2-H), 1,86 (d, J=6,5 Hz, 1-H), 1,44 (d, J=5,5 Hz, 4-H), 1,41 - 1,40 (m, 1-H), 1,36 (s, 9H), 1,31 - 1,13 (m, 3-H), 1,05 (br, s,, 1-H), 0,75 (d, J=7,0 Hz, 3-H), 0,73 (d, J=7,0 Hz, 3-H).
[00382] Etapa 4: Síntese de N~6~-(terc-butoxicarbonil)-N~2~- (fenilsulfonil)lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2- {(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoilornitinamida (74). Em uma solução de 2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3- {[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1- oxoeptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (4, 52,0 mg, 0,070 mmol) e N~6~- (terc-butoxicarbonil)-N~2~-(fenilsulfonil)-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil- N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]ornitinamida (73, 60,4 mg, 0,066 mmol) em 2 mL de N,N-dimetilacetamida foram adicionados 2,6- lutidina (31 uL, 2-8,3 mg, 0,264 mmol) N,N-di-isopropiletilamina (46 uL, 34,1 mg, 0,264 mmol) e 3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin3-ol (9 mg, 0,066 mmol). A mistura foi permitida agitar durante 16 horas a 45°C. A reação foi em seguida purificada por HPLC de fase reversa (Método S) para fornecer depois da liofilização 85 mg (85%) do produto desejado como um sólido branco. LCMS m/z 1518,4 [M+H+], 1516,3 [M-H+]; tempo de retenção = 1,93 minuto.
[00383] Etapa 5: Síntese de N~2~-(fenilsulfonil)lisil-L-valil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoilornitinamida, sal trifluoroacético (75). Em uma solução de N~6~-(terc-butoxicarbonil)- N~2~-(fenilsulfonil)lisil-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]- 12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoilornitinamida (75, 82 mg, 0,054 mmol) em 0.8 mL de diclorometano foi adicionado 0,2 mL de ácido trifluoroacético. A mistura foi monitorada por LCMS e permitida agitar durante 30 minutos em temperatura ambiente. A solução foi em seguida diretamente purificada por HPLC de fase reversa (Método B). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer depois da liofilização 35 mg (42%). LCMS m/z 1416,87 [M+H+]; tempo de retenção = 1,35 minuto. Exemplo 46: Preparação de N-acetil-O-(2-aminoetil)-D-seril-L-valil-N- {4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi- 2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoilornitinamida, sal de ácido trifluoroacético (83) HOAt, 2,6-lutidina, iPr2NEt, DMF
[00384] ilmetóxi)carbonil] amino}etil)-L-serinato de metila (78). Em uma suspensão de (2-hidroxietil)carbamato de 9H-fluoren-9-ilmetila (1000 mg, 3,53 mmols) e (2S)-1-acetilaziridina-2-carboxilato de metila (US 20110021482, 758 mg, 5,29 mmol) em 20 mL de diclorometano a - 30°C foi adicionado gota a gota eterato de dietila de trifluoreto de boro (532 uL, 601 mg, 4,24 mmols). A mistura foi em seguida agitada naquela temperatura durante 2 horas permitiu aquecer até temperatura ambiente. Depois de outra hora, à reação foi adicionada uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio e diluiu com diclorometano (80 mL). A fase orgânica foi separada e lavada com salmoura, secada em sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por HPLC de fase reversa (Método W). As frações apropriadas foram combinadas e os solventes orgânicos foram removidos sob pressão reduzida. A mistura extraída com acetato de etila (2 x 100 mL). Os foram lavados com salmoura, secados em concentrados. O resíduo foi co-evaporado com diclorometano (50 mL) uma vez para produzir para o composto do título 160 mg (11%) como uma goma amarela clara. MS m/z 448,9 [M+Na+]; 1H RMN (400MHz, Clorofórmio-d) δ = 7,78 (d, J=7,5 Hz, 2-H), 7,60 (d, J=7,5 Hz, 2-H), 7,42 (t, J=7,5 Hz, 2-H), 7,37 - 7,31 (m, 2-H), 6,66 (br, s,, 1-H), 5,07 (br, s,, 1-H), 4,89 - 4,72 (m, 1-H), 4,45 (d, J=6,5 Hz, 2-H), 4,23 (d, J=6,5 Hz, 1-H), 3,88 (d, J=6,5 Hz, 1-H), 3,72 (br, s,, 4-H), 3,54 (br, s,, 2-H), 3,36 (br, s,, 2-H), 2,09 (s, 3-H).
[00385] Etapa 2: Síntese de N-acetil-O-(2-{[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]amino}etil)-L-serina (79). Em uma solução de N-acetil-O- (2-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}etil)-L-serinatp (78, 160 mg, 0,375 mmol) isopropanol:água (7:3, 10 mL) foi adicionado cloreto de cálcio (833 g, 7,5 mmol). Uma vez que a mistura tornou-se clara, hidróxido de sódio (18 mg, 0,450 mmol) foi adicionado. A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura foi em seguida acidificada em pH~1-2 com uma solução aquosa a 3M de ácido clorídrico e diluída com água (10 mL). A mistura foi extraída com acetato de etila (20 mL) e o orgânico foi isolado e concentrado sob pressão reduzida para remover a maioria do isopropanol. A fase aquosa foi extraída com acetato de etila (2 x 100 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas em sulfato de sódio e concentradas para fornecer 107 mg (96%) o composto desejado como um sólido azul que será usado na forma em que se encontra na próxima etapa sem outra purificação. MS m/z 434,8 [M+Na+]; 1H RMN (400MHz, Clorofórmio-d) δ = 8,48 (d, J=9,0 Hz, 1-H), 7,78 (d, J=7,5 Hz, 2-H), 7,56 (d, J=7,5 Hz, 2-H), 7,47 - 7,37 (m, 2H), 7,35 - 7,29 (m, 2-H), 7,15 (t, J=6,1 Hz, 1-H), 5,03 (d, J=9,0 Hz, 1-H), 4,51 (dd, J=6,8, 1-0,8 Hz, 1-H), 4,41 (dd, J=7,0, 1-0,5 Hz, 2-H), 4,30 - 4,23 (m, 1-H), 4,32 - 4,21 (m, 1-H), 4,21 - 4,09 (m, 1-H), 3,57 (t, J=8,3 Hz, 3-H), 3,53 - 3,45 (m, 2-H), 3,40 (br, s,, 1-H), 3,31 (d, J=9,0 Hz, 1-H), 2,00 (s, 3H).
[00386] Etapa 3: Síntese de N-acetil-O-(2-{[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]amino}etil)-L-serilvalil-N~5~-carbamoil-N-[4- (hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (80). Em uma solução de N-acetil-O-(2- {[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}etil)-L-serina (79, 105 mg, 0,255 mmol) e L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-(hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (1, 96,6 mg, 0.255 mmol) em 3 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado hexafluorofosfato de O-(7 azabenzotriazol 1 il) N,N,N',N tetrametilurônio (106 mg, 0,280 mmol) seguido por N,N di-isopropiletilamina (98,7 mg, 0,764 mmol). A mistura clara amarela foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura foi diluída com éter terc-butil metílico (60 mL) e agitada durante 30 minutos. O sólido foi isolado por filtração e em seguida purificado por HPLC de fase reversa (Método X). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 84 mg (43%) do produto desejado como um sólido branco. MS m/z 774,2 [M+H+].
[00387] Etapa 4: Síntese de N-acetil-O-(2-{[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]amino}etil)serilvalil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(4- nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-ornitinamida (81). Em uma solução agitada de N-acetil-O-(2-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}etil)-L- serilvalil-N~5~-carbamoil-N-[4-(hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (80, 200 mg, 0,258 mmol) e carbonato de p-nitrofenila (853 mg, 2,85 mmols) em 5 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado N,N-di-isopropiletilamina (100,8 ul, 73,5 mg, 0,569 mmol). A mistura foi em seguida agitada em temperatura ambiente durante 3 horas mais carbonato de p-nitrofenila (78,6 mg, 0,258 mmol) foi adicionado. Depois de uma hora extra, a mistura foi adicionada gota a gota a 100 mL de éter de terc-butil metílico. O sólido foi isolado por filtração, lavado com algum éter terc-butil metílico para fornecer depois da secagem a ar 180 mg (74%) do produto desejado como um sólido amarelo. MS m/z 939,2 [M+H+] 961,1 [M+Na+].
[00388] Etapa 5: Síntese de N-acetil-O-(2-{[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]amino}etil)-D-seril-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)- butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1- (1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoilornitinamida (82). Em uma solução de 2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2- fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoeptan-4-il]- N-metil-L-valinamida (4, 60,0 mg, 0,081 mmol) e N-acetil-O-(2-{[(9H- fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}etil)serilvalil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(4- nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-ornitinamida (81, 121 mg, 0,188 mmol) em 2,5 mL de N,N-dimetilacetamida foram adicionados 2,6-lutidina (37,4 uL, 34,6 mg, 0,323 mmol) N,N-di-isopropiletilamina (42,2 uL, 31,3 mg, 0,242 mmol) e 3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b] piridin3-ol (11,0 mg, 0,081 mmol). A mistura foi permitida agitar durante 6 horas a 45°C. A reação foi em seguida purificada por HPLC de fase reversa (Método G) para fornecer depois da liofilização 62 mg (50%) do produto desejado como um sólido branco. LCMS m/z 1543,3 [M+H+]; tempo de retenção = 2,25 minutos. tempo de retenção de HPLC analítica = 7,435 minutos. Etapa 6: Síntese de N-acetil-O-(2-aminoetil)-D-seril-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)- butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1- (1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9- trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoilornitinamida, sal de ácido trifluoroacético (83) Em uma solução de N-acetil-O-(2-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}etil)-D-seril-L-valil- N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}- 2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoilornitinamida (82, 42 mg, 0,027 mmol) em 2,5 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado uma solução aquosa de hidróxido de lítio (3,26 mg, 0,136 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora. A solução foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método L). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 29 mg (74%) do produto desejado. LCMS m/z 1321,2 [M+H+]; tempo de retenção = 1,30 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,804 minutos. Exemplo 47: N-acetil-O-[2-(2-aminoetóxi)etil]-L-seril-L-valil-N-{4" [(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1 R,2R)-1 -metóxi-2-metil- 3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2- oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10- triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoilornitinamida, sal de ácido trifluoroacético (90)
[00389] Etapa 1: Síntese de N-acetil-O-[2-(2-{[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]amino}etóxi)etil]-L-serinato de metila (85). Em uma solução de [2-(2-hidroxietóxi)etil]carbamato de 9H-fluoren-9-ilmetila (84, 7,55 g, 23,1 mmol) e (2S)-1-acetilaziridina-2-carboxilato de metila (758 mg, 5,29 mmols) em 130 mL de diclorometano foi adicionado gota a gota eterato de dietila de trifluoreto de boro (3,94 mL, 4,46 g, 31,4 mmols). Depois de uma hora, à reação foi adicionada uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio. A fase orgânica foi separada e lavada com salmoura, secada em sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por HPLC de fase reversa (Método Y). As frações apropriadas foram combinadas e os solventes orgânicos foram removidos sob pressão reduzida. A mistura aquosa restante foi extraída com diclorometano (2 x 100 mL). Os extratos combinados foram lavados com salmoura, secados em sulfato de sódio e concentrados sob pressão reduzida para produzir o composto do título 3,8 g (26%) como um óleo incolor. MS m/z 493,0 [M+Na+]; 1H RMN (400MHz, Clorofórmio-d) δ = 7,77 (d, J=7,5 Hz, 2-H), 7,62 (d, J=7,0 Hz, 2-H), 7,44 - 7,37 (m, 2-H), 7,35 - 7,29 (m, 2-H), 6,69 (d, J=6,5 Hz, 1-H), 5,49 (br, s,, 1-H), 4,78 (d, J=8,0 Hz, 1-H), 4,42 (d, J=6,5 Hz, 2-H), 4,25 (d, J=7,0 Hz, 1-H), 3,95 (d, J=10,0 Hz, 1-H), 3,75 (s, 3-H), 3,66 - 3,50 (m, 6H), 3,41 (br, s,, 2-H), 2,04 (s, 3-H).
[00390] Etapa 2: Síntese de N-acetil-O-[2-(2-{[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]amino} etóxi)etil]-L-serina (86). Em uma solução de N- acetil-O-[2-(2-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}etóxi)etil]-L- serinato de metila (85, 3200 mg, 6,8 mmols) em 90 mL de isopropanol e 40 mL de água foi adicionado cloreto de cálcio (15,1 g, 136 mmols). Uma vez que a mistura tornou-se clara, hidróxido de sódio (326 mg, 8,16 mmol) foi adicionado. Depois de 2 horas, a mistura foi em seguida acidificada em pH~1-2 com uma solução aquosa a 3M de ácido clorídrico e diluída com água (300 mL). A mistura foi extraída com acetato de etila (3 x 250 mL) e o orgânico foi isolado e concentrado sob pressão reduzida para fornecer 3000 mg (97%) o composto desejado como um sólido branco, que foi usado na forma em que se encontra na próxima etapa sem outra purificação. MS m/z 456,9 [M+H+]; 1H RMN (400MHz, Clorofórmio-d) δ = 7,77 (d, J=7,5 Hz, 2-H), 7,63 - 7,53 (m, 2-H), 7,44 - 7,38 (m, 2-H), 7,36 - 7,30 (m, 2-H), 6,65 (d, J=6,0 Hz, 1-H), 4,77 (br, s,, 1-H), 4,51 (br, s,, 1-H), 4,43 (d, J=6,5 Hz, 1-H), 4,26 (d, J=6,0 Hz, 1-H), 3,95 (br, s,, 1-H), 3,76 (br, s,, 1-H), 3,70 - 3,57 (m, 3-H), 3,54 (d, J=7,5 Hz, 2-H), 3,41 (d, J=13,1 Hz, 2-H), 3,29 (br, s,, 1-H), 2,05 (br, s,, 3-H).
[00391] Etapa 3: Síntese de N-acetil-O-[2-(2-{[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]amino} etóxi)etil]-L-serilvalil-N~5~-carbamoil-N-[4- (hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (87). Em uma solução de N-acetil-O- [2-(2-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}etóxi)etil]-L-serina (86, 3000 mg, 6,57 mmols) em 45 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado hexafluorofosfato de de O-(7 azabenzotriazol 1 il) N,N,N',N' tetrametilurônio (HATU, 3000 mg, 7,89 mmols). Depois de 20 minutos, L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-(hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (1, 2490 mg, 6,57 mmols) foi adicionado seguido por N,N-di-isopropiletilamina (2550 mg, 19,7 mmols). Depois de 3 horas, a mistura foi derramada em uma mistura de éter terc-butil metílico (500 mL) e éter de petróleo (200 mL) e agitada durante 20 minutos. O sólido foi isolado por filtração e em seguida purificado por cromatografia sílica gel usando um gradiente de eluição de 1% a 20% metanol em diclorometano para fornecer 3100 mg (58%) do produto desejado como um sólido branco. MS m/z 818,1[M+H+].
[00392] Etapa 4: Síntese de
[00393] N-acetil-O-[2-(2-{[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]amino}etóxi)etil]-L-serilvalil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(4- nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]-L-ornitinamida (88). Em uma solução agitada resfriada de N-acetil-O-[2-(2-{[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]amino}etóxi)etil]-L-serilvalil-N~5~-carbamoil-N-[4- (hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (87, 500 mg, 0,611 mmol) e carbonato de p-nitrofenila (279 mg, 0,917 mmol) em 6 mL de N,N- dimetilformamida foi adicionado N,N-di-isopropiletilamina (216,7 ul, 158 mg, 1,22 mmol). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 5 horas em seguida mais e carbonato de p-nitrofenila (100 mg, 0,538 mmol) foi adicionado. Depois de um extra de 12 horas, a mistura foi derramada em uma mistura de éter terc-butil metílico (60 mL) e éter de petróleo (20 mL) e agitada durante 15 minutos. O sólido foi em seguida isolado por filtração purificada por cromatografia sílica gel usando um gradiente de eluição de 1% a 10% de metanol em diclorometano para fornecer 300 mg (50%) do produto desejado como um sólido branco. MS m/z 983,5 [M+H+].
[00394] Etapa 5: Síntese de
[00395] N-acetil-O-[2-(2-{[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]amino}etóxi)etil]-L-seril-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11- [(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoilornitinamida (89). Em uma solução de 2- metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil- 3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5- metil-1-oxoeptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (4, 60,0 mg, 0,081 mmol) e N-acetil-O-[2-(2-{[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]amino}etóxi)etil]-L- serilvalil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenóxi)carbonil]óxi}metil)fenil]- L-ornitinamida (88, 75,4 mg, 0,077 mmol) em 2,5 mL de N,N- dimetilacetamida foram adicionados 2,6-lutidina (37,4 uL, 34,6 mg, 0,323 mmol) N,N-di-isopropiletilamina (42,2 uL, 31,3 mg, 0,242 mmol) e 3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin3-ol (HOAt, 11,0 mg, 0,081 mmol). A mistura foi permitida agitar durante 16 horas a 45°C. A reação foi em seguida purificada por HPLC de fase reversa (Método G) para fornecer depois da liofilização 76 mg (58%) do produto desejado como um sólido branco. LCMS m/z 1587,3 [M+H+]; tempo de retenção = 2,26 minutos. tempo de retenção de HPLC analítica = 7,459 minutos.
[00396] Etapa 6: Síntese de N-acetil-O-[2-(2-aminoetóxi)etil]-L-seril- L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)- 1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoilornitinamida, sal de ácido trifluoroacético (90). Em uma solução de N-acetil-O-[2-(2-{[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]amino}etóxi)etil]-L-seril-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11- [(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)- 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoilornitinamida (89, 40 mg, 0,025 mmol) em 2,5 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionada uma solução aquosa de hidróxido de lítio (3,02 mg, 0,126 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução foi em seguida purificada por HPLC de fase reversa (Método D). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 27 mg (72%) do produto desejado. LCMS m/z 1365,2 [M+H+]; tempo de retenção = 1,26 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,768 minutos. Exemplo 48: Preparação de N~2~-(3-hidroxipropanoil)-L-lisilvalil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11 -[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil1amino}propil]pirrolidin- 1 -il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoil-L-omitinamida, sal de ácido trifluoroacético (97)
[00397] Etapa 1: Síntese de N-acetil-O-[1-(9H-fluoren-9-il)-3-oxo- 2,7,10,13,16,19-hexaoxa-4-azaenicosan-21-il]-L-serinato de metila (92). Em uma solução de (17-hidroxi-3,6,9,12,15-pentaoxaeptadec-1- il)carbamato de 9H-fluoren-9-ilmetila (91, 7600 mg, 15,09 mmol) e (2S)-1-acetilaziridina-2-carboxilato de metila (4320 mg, 30,2 mmols) em 150 mL de diclorometano foi adicionado gota a gota eterato de dietila de trifluoreto de boro (2,84 mL, 3210 mg, 22,6 mmols). Depois de 2,5 horas, a reação foi lavada com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio em seguida salmoura, secada em sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por HPLC de fase reversa (Método Z). As frações apropriadas foram combinadas e os solventes orgânicos foram removidos sob pressão reduzida. A mistura aquosa restante foi extraída com acetato de etila (2 x 100 mL). Os extratos combinados foram secados em sulfato de sódio e concentrado para produzir o composto do título 5 g (51%) como um óleo. MS m/z 647,1 [M+H+]; 1H RMN (400MHz, Clorofórmio- d) δ = 7,76 (d, J=7,5 Hz, 2-H), 7,61 (d, J=7,5 Hz, 2-H), 7,40 (t, J=7,5 Hz, 2-H), 7,31 (t, J=7,4 Hz, 2-H), 6,72 (d, J=7,5 Hz, 1-H), 5,47 (br, s,, 1H), 4,73 (td, J=3,5, 8,0 Hz, 1-H), 4,41 (d, J=7,0 Hz, 2-H), 4,26 - 4,19 (m, 1-H), 3,94 (dd, J=3,5, 1-0,0 Hz, 1-H), 3,75 (s, 3-H), 3,70 (dd, J=3,5, 1-0,0 Hz, 1-H), 3,67 - 3,56 (m, 2-2H), 3,40 (q, J=5,2 Hz, 2-H), 2,07 (s, 3-H).
[00398] Etapa 2: Síntese de N-acetil-O-[1-(9H-fluoren-9-il)-3-oxo- 2,7,10,13,16,19-hexaoxa-4-azaenicosan-21-il]-L-serina (93). Em uma solução de N-acetil-O-[1-(9H-fluoren-9-il)-3-oxo-2,7,10,13,16,19- hexaoxa-4-azaenicosan-21-il]-L-serinato de metila (92, 4200 mg, 6,49 mmols) em isopropanol:água (7:3, 170 mL) foi adicionado cloreto de cálcio (14,4 g, 130 mmols). Uma vez a mistura tornou-se clara, hidróxido sódio (312 mg, 7,79 mmol) foi adicionado. A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura foi em seguida acidificada em pH~1-2 com uma solução aquosa a 3M de ácido clorídrico e diluída com água (100 mL). A mistura foi extraída com acetato de etila (100 mL) e o orgânico foi isolado e concentrado sob pressão reduzida para remover a maioria do isopropanol. A fase aquosa foi extraída com acetato de etila (2 x 100 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas em sulfato de sódio e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi em seguida purificado por cromatografia sílica gel usando um gradiente de eluição de 0% a 15% de metanol em diclorometano para fornecer 3,4 g (83%) o composto desejado como um óleo amarelo. MS m/z 633,1 [M+H+].
[00399] Etapa 3: Síntese de N-acetil-O-[1-(9H-fluoren-9-il)-3-oxo- 2,7,10,13,16,19-hexaoxa-4-azaenicosan-21-il]-L-serilvalil-N~5~- carbamoil-N-[4-(hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (94). Em uma solução congelada de N-acetil-O-[1-(9H-fluoren-9-il)-3-oxo-2,7,10,13,16,19- hexaoxa-4-azaenicosan-21-il]-L-serina (93, 1,20 g, 1,90 mmol) e L- valil-N~5~-carbamoil-N-[4-(hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (1, 720 mg, 1,90 mmol) em 15 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado hexafluorofosfato de O-(7 1 azabenzotriazol il) N,N,N',N' tetrametilurônio (794 mg, 2,09 mmol) seguido por N,N di- isopropiletilamina (736 mg, 5,69 mmols). A mistura clara amarela foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura foi diluída com acetato de etila (3 x 30 mL), lavada com água (60 mL) e secada em sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi em seguida purificado por cromatografia sílica gel usando um gradiente de eluição de 0% a 15% de metanol em diclorometano para fornecer 1,5 g (80%) do produto desejado como um vidro incolor. MS m/z 994,8 [M+H+].
[00400] Etapa 4: Síntese de N-acetil-O-[2-(2-aminoetóxi)etil]-L-seril- L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)- 1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoilornitinamida (95). Em um banho gelado, em uma solução agitada N-acetil-O-[1-(9H-fluoren-9-il)-3-oxo-2,7,10,13,16,19-hexaoxa- 4-azaenicosan-21-il]-L-serilvalil-N~5~-carbamoil-N-[4- (hidroximetil)fenil]-L-ornitinamida (94, 1,5 g, 1,5 mmol) e carbonato de p-nitrofenila (918 mg, 3,02 mmols) em 15 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado N,N-di-isopropiletilamina (402 ul, 293 mg, 2,26 mmols). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 16 horas em seguida mais carbonato de p-nitrofenila (918 mg, 3,02 mmols) foi adicionado. Depois de um extra de 3 horas, a mistura foi diluída com acetato de etila (30 mL), lavado com água (40 mL). A fase aquosa foi extraída com acetato de etila (30 mL). As camadas orgânicas combinadas foram concentradas sob pressão reduzida em seguida purificada por cromatografia sílica gel usando um gradiente de eluição de 0% a 15% metanol em diclorometano em seguida por purificado por HPLC de fase reversa (Método AA) fornecer depois da liofilização 944 mg (54%) do produto desejado como um sólido branco. MS m/z 1159,8 [M+H+].
[00401] Etapa 5: Síntese de N-acetil-O-[1-(9H-fluoren-9-il)-3-oxo- 2,7,10,13,16,19-hexaoxa-4-azaenicosan-21-il]-L-seril-L-valil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoilornitinamida (96). Em uma solução de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoeptan-4-il]-N-metil-L- valinamida (4, 55,0 mg, 0,074 mmol) e N-acetil-O-[2-(2-aminoetóxi)etil]- L-seril-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8- (propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~- carbamoilornitinamida (95, 85,8 mg, 0,074 mmol) em 2,5 mL de N,N- dimetilacetamida foram adicionados 2,6-lutidina (34,3 uL, 31,7 mg, 0,296 mmol) N,N-di-isopropiletilamina (38,7 uL, 28,7 mg, 0,222 mmol) e 3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin3-ol (10,1 mg, 0,074 mmol). A mistura foi permitida agitar durante 6 horas a 45°C. A reação foi em seguida purificada por HPLC de fase reversa (Método G) para fornecer depois da liofilização 90 mg (69%) do produto desejado como um sólido branco. LCMS m/z 1764,4 [M+H+]; tempo de retenção = 1,99 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 7,476 minutos.
[00402] Etapa 6: Síntese de N-acetil-O-(17-amino-3,6,9,12,15- pentaoxaeptadec-1-il)-L-seril-L-valil-N-{4-[(8S,11S,12R)-11-[(2S)- butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2- fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-5,5,10- trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa-4,7,10-triazatetradec-1- il]fenil}-N~5~-carbamoilornitinamida, sal de ácido trifluoroacético (97) Em uma solução de N-acetil-O-[1-(9H-fluoren-9-il)-3-oxo- 2.7.10.13.16.19- hexaoxa-4-azaenicosan-21-il]-L-seril-L-valil-N-{4- [(8S,11S,12R)-11-[(2S)-butan-2-il]-12-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-2- metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin- 1-il}-2-oxoetil)-5,5,10-trimetil-3,6,9-trioxo-8-(propan-2-il)-2,13-dioxa- 4,7,10-triazatetradec-1-il]fenil}-N~5~-carbamoilornitinamida (96, 46 mg, 0,026 mmol) em 2,5 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionada uma solução aquosa de hidróxido de lítio (3,1 mg, 0,130 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 20 minutos. A solução foi em seguida concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (Método D em seguida Método H). Frações contendo produto foram liofilizadas para fornecer 15 mg (35%) do produto desejado. LCMS m/z 1542,2 [M+H+]; tempo de retenção = 1,41 minuto. tempo de retenção de HPLC analítica = 5,836 minutos.
[00403] Os seguintes ADCs adicionais (ligados em várias posições e em vários rótulos no anticorpo de Trop2, como indicado nas Tabelas 2 a 7) foram feitos usando a técnica de conjugação descrita acima (porção entre parênteses indica um resíduo de glutamina, com linhas onduladas mostrando pontos de ligação ao resto do anticorpo Anti- Trop2):
Exemplo 72 Confirmação Carboxilesterase 1C de Camundongo como a Enzima Responsável por Clivagem de Ligante de VC-PABC no Plasma
[00404] Amostras de plasma de cepa de camundongo nocaute C56/BL6 Ces1C-/-, cepa de heterozigoto C56/BL6 Ces1C+/-, e cepa tipo silvestre C56/BL6 Ces1C+/+ foram usadas para testar estabilidade do conjugado anti-Trop2 L11B-C6-VC-PABC-Aur0101. 56 ug de ADC foram incubados no plasma em 35% de plasma suplementado com 1x PBS na concentração de ADC final de 0,125 mg/mL. Seguindo incubação durante 18 horas, ADCs foram isolados usando antígeno de M1S1 acoplado a Sepharose ativada por CNBr (GE Healthcare) usando protocolos-padrão. Valores de DAR foram avaliados antes e depois da incubação usando análise de HIC. Estabilidade conjugada (%) é calculada como % de DAR permanecendo depois da incubação. Veja Fig. 3. DADOS BIOLÓGICOS
[00405] Os dados de estabilidade gerados nos procedimentos esboçados nos Exemplos 8 a 18 nas Tabelas 2 a 7. Tabela 2 - Estabilidade de Conjugado In Vivo em Camundongo Estabilidade conjugada in vivo no camundongo. Valores de DAR para conjugados purificados de animais dosados em 9 mg/kg foram comparados a valores de DAR antes da exposição in vivo. Valores de estabilidade acima são expressados como % de DAR permanecendo depois de determinado período de exposição (mostrado em parênteses). Tabela 3 - Estabilidade de Conjugado In Vivo em Rato Estabilidade de conjugado in vivo no rato. Valores de DAR para conjugados purificados de animais dosados a 9 mg/kg Tabela 4 - Estabilidade de Conjugado In Vitro em Plasma de Camundongo
Estabilidade de conjugado in vitro no plasma de camundongo. Valores de DAR para conjugados purificados depois Tabela 5 - Estabilidade de Conjugado In Vitro em Plasma de Rato Estabilidade de conjugado in vitro no plasma de rato. Valores de DAR para conjugados purificados depois que a incubação de plasma foi comparada a valores de DAR antes do tratamento de plasma. Valores de estabilidade acima são expressados como % de DAR permanecendo depois de determinado período de incubação (mostrado em parênteses). Tabela 6 - Estabilidade de Conjugado In Vitro em Plasma de Cyno Estabilidade de conjugado in vitro no plasma de cyno. Valores de DAR para conjugados purificados depois que a incubação de plasma foi comparada a valores de DAR antes do tratamento de plasma. Valores de estabilidade acima são expressados como % de DAR permanecendo depois de determinado período de incubação (mostrado em parênteses). Tabela 7A - Valores de DAR Experimentais com % de Estabilidade Calculada
[00406] Todos os valores de DAR foram determinados avaliando o número de fármacos ligados ao anticorpo usando HIC ou análise de espectrometria de massa. Estabilidade de conjugado é calculada como o % de DAR permanecendo depois da incubação em plasma durante 3 ou 4,5 dias.
Tabela 7B - Valores de DAR Experimentais Adicionais com % de Estabilidade Calculada
[00407] Todos os valores de DAR foram determinados avaliando o número de fármaco ligado ao anticorpo usando HIC ou análise de espectrometria de massa. Estabilidade de conjugado é calculada como o % de DAR permanecendo depois da incubação em plasma durante 3 ou 4,5 dias.
* Produziu como descrito nos WO2012/059882 e WO2015/015448. Tabela 8 - Valores de DAR Experimentais Adicionais com % de Estabilidade Calculado, cargas úteis de ligante Conjugadas ao Anticorpo ComboRd4 0.6nMC29 com o Rótulo Contendo Glutamina LCQ05
[00408] Métodos de conjugação foram como descrito aqui para anticorpos anti-Trop2. Anticorpo Combo_Rd4_0.6nM_C29 é o anticorpo anti-BCMA como descrito em Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. 62/146,843. Seguindo incubação em plasma de camundongo SCID, compostos foram purificados usando resina MabSelect Proteína A (GE Healthcare) de acordo com métodos padrões. Todos os valores de DAR foram determinados avaliando-se o número de fármaco ligado ao anticorpo usando análise de HIC. Estabilidade de conjugado é calculada como o % de DAR permanecendo depois da incubação em plasma de camundongo SCID durante 4.5 dias.
[00409] Embora os ensinos descritos foram descritos com referência a vários pedidos, métodos, e composições, será apreciado que várias mudanças e modificações podem ser feitas sem partir dos ensinos aqui e a invenção reivindicada abaixo. Os exemplos anteriores são fornecidos para melhor ilustrar os ensinos descritos e não são pretendidos limitar o escopo dos ensinos apresentados aqui. Enquanto os presentes ensinos foram descritos em termos destas modalidades exemplares, o técnico versado facilmente entenderá que numerosas variações e modificações destas modalidades exemplares são possíveis sem experimentação indevida. Todas as tais variações e modificações estão dentro do escopo dos ensinos atuais.
[00410] Todas as referências citadas aqui, incluindo patentes, pedidos de patente, documentos, livro didático, e similar, e as referências citadas aqui, à medida que já não estejam, estão incorporadas aqui por referência em sua totalidade. No evento que uma ou mais da literatura incorporada e materiais similares difere-se de ou contradiz este pedido, incluindo, porém não limitado a termos definidos, termo de uso, técnicas descritas, ou similar, este pedido controla.
[00411] A descrição anterior e Exemplos detalham certas modalidades específicas da invenção e descrevem o melhor modo contemplado pelos inventores. Será apreciado, entretanto, que não importa como detalhado o anterior pode aparecer no texto, a invenção pode ser praticada de muitas maneiras e a invenção deveria ser interpretada de acordo com as reivindicações anexas e quaisquer equivalentes da mesma.
Claims (17)
1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula (I): ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo; em que: M é um modulador de estabilidade, em que M é -M1-M2; onde M1 é -NR1-C(O)-, -NR1-S(O)2-, ou está ausente, e M2 é selecionado do grupo que consiste em: P é uma sequência de peptídeo que inclui um ou mais resíduos de glutamina; Q é um resíduo de glutamina presente em P; cada E é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em: -C(R1)2-, -OC(R1)2C(R1)2-, em que, quando E for -O-C(R1)2-C(R1)2, r é pelo menos 2, e - C(R1)2C(R1)2O-, em que, quando E for -C(R1)2-C(R1)2-O-, s é pelo menos 1; cada R1 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em: H e C1-C6 alquila linear ou ramificada; em que -Xm-Yn- é X-Y e X-Y é selecionado a partir do grupo consistindo de Gly, β-Ala, Val-Cit, Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ala-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala-Leu-Ala-Leu, Phe-N9-tosyl-Arg, Phe-N9-Nitro-Arg, Val-Ala, e Ala-Ala-Asn; cada Z é PABC (p-aminobenzil-carbomoil); p é 0-2, q é 0-10, r é 0-2, e s é 0-2, onde q+r+s=2 ou mais; e D é um agente citotóxico.
2. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula (II): ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo; em que: M é um modulador de estabilidade, em que M é -M1M2; onde M1 é -NR1-C(O)-, -NR1-S(O)2-, ou está ausente, e M2 é selecionado do grupo que consiste em: P é uma sequência de peptídeo que inclui um ou mais resíduos de glutamina; Q é um dos referidos resíduos de glutamina presentes em P; cada E é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em: -C(R1)2-, -OC(R1)2C(R1)2-, em que, quando E for -O-C(R1)2-C(R1)-, r é pelo menos 2, e - C(R1)2C(R1)2O-, em que, quando E for -C(R1)2-C(R1)2-O-, s é pelo menos 1; cada R1 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em: H, C1-C6 alquila linear ou ramificada; em que - Xm-Yn- é X-Y e X-Y é selecionado a partir do grupo consistindo em Gly, β-Ala, Val-Cit, Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ala-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala-Leu-Ala-Leu, Phe-N9-tosyl-Arg, Phe-N9-Nitro-Arg, Val-Ala, e Ala-Ala-Asn; cada Z é é PABC (-p-aminobenzil-carbomoil); p é 0-2, q é 0-10, r é 0-2, e s é 0-2, onde q+r+s=2 ou mais; e D é um agente citotóxico.
3. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula (III): o ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo; em que: M é um modulador de estabilidade, em que M é -M1M2; onde M1 é -NR1-C(O)-, -NR1-S(O)2-, ou está ausente, e M2 é selecionado do grupo que consiste em: cada E é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em: -C(R1)2-, -OC(R1)2C(R1)2- em que, quando E for -O- C(R1)2-C(R1)2, r é pelo menos 2, e -C(R1)2C(R1)2O-, em que, quando E for -C(R1)2-C(R1)2-O-, s é pelo menos 1; cada R1 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em: H e C1-C6 alquila linear ou ramificada; em que -Xm-Yn- é X-Y e X-Y é selecionado a partir do grupo consistindo em Gly, β-Ala, Val-Cit, Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ala-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala-Leu-Ala-Leu, Phe-N9-tosyl-Arg, Phe-N9-Nitro-Arg, Val-Ala, e Ala-Ala-Asn; cada Z é PABC (-p-aminobenzil-carbomoil); p é 0-2, q é 0-10, r é 0-2, e s é 0-2, onde q+r+s=2 ou mais; e D é um agente citotóxico.
4. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico D é selecionado a partir do grupo consistindo em: uma antraciclina, uma auristatina, uma espliceostatina, um dímero de CBI/CPI, uma caliqueamicina, uma duocarmicina, uma enediina, uma geldanamicina, uma maitansina, uma puromicina, um taxano, um alcaloide de vinca, SN-38, uma tubulisina, uma hemiasterlina, uma camptotecina, uma combretastatina, uma dolastatina, um dímero de indolino- benzodiazepina, um dímero de pirrolobenzodiazepina e uma pladienolida.
5. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico D é uma auristatina selecionada a partir do grupo consistindo em dolestatina, MMAD, MMAE, MMAF, PF06380101, PF06463377 e PF06456780.
6. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que P é um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em: Q, LQG, LLQGG (SEQ ID NO:1), LLQG (SEQ ID NO:2), LSLSQG (SEQ ID NO:3), GGGLLQGG (SEQ ID NO:4), GLLQG (SEQ ID NO:5), LLQ, GSPLAQSHGG (SEQ ID NO:6), GLLQGGG (SEQ ID NO:7), GLLQGG (SEQ ID NO:8), GLLQ (SEQ ID NO:9), LLQLLQGA (SEQ ID NO:10), LLQGA (SEQ ID NO:11), LLQYQGA (SEQ ID NO:12), LLQGSG (SEQ ID NO:13), LLQYQG (SEQ ID NO:14), LLQLLQG (SEQ ID NO:15), SLLQG (SEQ ID NO:16), LLQLQ (SEQ ID NO:17), LLQLLQ (SEQ ID NO:18), LLQGR (SEQ ID NO:19), LLQGPP (SEQ ID NO:20), LLQGPA (SEQ ID NO:21), GGLLQGPP (SEQ ID NO:22), GGLLQGA (SEQ ID NO:23), LLQGA (SEQ ID NO:24), LLQGPGK (SEQ ID NO:25), LLQGPG (SEQ ID NO:26), LLQGP (SEQ ID NO:27), LLQP (SEQ ID NO:28), LLQPGK (SEQ ID NO:29), LLQAPGK (SEQ ID NO:30), LLQGAPG (SEQ ID NO:31), LLQGAP (SEQ ID NO:32), LLQGPA (SEQ ID NO:33), LLQGPP (SEQ ID NO:34), GGLLQGPP (SEQ ID NO:35), LLQLQG (SEQ ID NO:36), e XXQX(SEQ ID NO: 37).
7. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo consistindo em:
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
8. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo consistindo em:
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que a porção entre parênteses do composto representa um resíduo de glutamina dentro de uma sequência de peptídeo.
9. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que P é selecionado a partir do grupo consistindo em: um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo biespecífico, um minicorpo e um fragmento de anticorpo.
10. Composto, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo em: trastuzumabe, mutantes de trastuzumabe, oregovomabe, edrecolomabe, cetuximabe, um anticorpo monoclonal humanizado para o receptor de vitronectina (avβ3), alemtuzumabe, anticorpos anti-HLA-Dr, 1-31I Lym-1, anticorpos anti-HLA-Dr10, anticorpos anti-cd33, anticorpos anti-cd22, labetuzumabe, bevacizumabe, ibritumomabe tiuxetan, ofatumumabe, panitumumabe, rituximabe, tositumomabe, ipilimumabe e gemtuzumabe.
11. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que cada Q é independentemente um resíduo de uma glutamina endógena para sequência do referido peptídeo P, ou um resíduo de uma glutamina fornecida em uma sequência de rótulo criada na referida sequência de peptídeo P.
12. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que um ou mais Q é um resíduo de uma glutamina endógena para referida sequência de peptídeo P.
13. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que um ou mais Q é um resíduo de uma glutamina fornecida em uma sequência de rótulo criada na referida sequência de peptídeo P.
14. Composto, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que um ou mais rótulos são os únicos aminoácidos glutamina.
15. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, e um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
16. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer.
17. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição, medicamento, combinação ou kit para: (i) tratar câncer; (ii) inibir crescimento ou progressão de tumor; e/ou (iii) induzir regressão de tumor.
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