KR20170139110A - 칼리케아마이신 구성체 및 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
칼리케아마이신을 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC) 및 증식성 장애를 치료하기 위해 이를 사용하는 방법이 본원에서 제공된다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2015년 4월 21일에 출원된 미국 가출원 62/150,693의 이익을 청구하며, 상기 가출원은 모든 목적상 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 출원은 일반적으로 표적화제에 연결된 칼리케아마이신(calicheamicin)을 포함하는 신규한 화합물(또한 본원에서 칼리케아마이신-링커 구성체로서 언급됨)에 관한 것이다. 표적화제는 항체일 수 있으며, 이에 의해 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 제공할 수 있다. ADC는, 예를 들어 암 및 그의 임의의 재발 또는 전이의 치료, 진단 또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
줄기 세포 및 간 세포의 분화 및 증식은, 기관형성, 세포 복구 및 세포 대체 동안 조직 성장을 뒷받침하도록 협력하여 작용하는 통상적인 진행중 과정이다. 시스템은 유기체의 필요에 기초하여 단지 적절한 신호가 생성되는 것을 보장하도록 엄격하게 조절된다. 세포 증식 및 분화는 통상적으로, 손상된 또는 죽어가는 세포의 대체를 위해 또는 성장을 위해 단지 필요에 따라 일어난다. 그러나, 이들 과정의 파괴는 다양한 신호전달 화학물질의 부족 또는 과다, 변경된 미세환경의 존재, 유전적 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 많은 인자에 의해 촉발될 수 있다. 정상적인 세포 증식 및/또는 분화의 파괴는, 증식성 질환, 예컨대 암을 포함하는 다양한 장애를 일으킬 수 있다.
암에 대한 종래의 치료 요법은 화학요법, 방사선요법 및 면역요법을 포함한다. 종종 이들 치료는 효과적이지 않고, 수술적 절제는 실행가능한 임상적 대안을 제공하지 않을 수 있다. 현재의 관리 표준에서의 한계는, 환자가 첫번째 치료를 받고 이어서 악화되는 경우에 특히 분명하다. 이러한 경우, 종종 공격적이고 불치성인 난치성 종양이 빈번히 발생한다. 많은 고형 종양에 대한 전체적 생존율은, 적어도 부분적으로, 악화, 종양 재발 및 전이를 막는 기존의 요법의 실패로 인해, 수 년간 주로 변하지 않고 남아있다. 따라서, 증식성 장애를 위한 보다 표적화되고 강력한 요법의 개발에 대한 많은 필요성이 남아있다. 본 발명은 이러한 필요성을 다루는 것이다.
제1 양태에서, 하기 화학식 I을 갖는 화합물, 예컨대 항체 약물 컨쥬게이트, 또는 그의 제약상 허용되는 염이 제공된다:
[화학식 I]
Ab-[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]z3
화학식 I의 항체 약물 컨쥬게이트에서, Ab는 표적화제이다. W는 연결 기이다. M은 절단가능한 모이어티이다. L3 및 L4는 독립적으로 링커(예를 들어, 스페이서)이다. P는 디술피드 보호 기이다. D는 칼리케아마이신 또는 그의 유사체이다. 기호 z1, z2 및 z3은 독립적으로 0 내지 10의 정수이다. 구현예에서, z3은 1 내지 10의 정수이다.
화학식 I의 하나의 구현예에서는, 하기 화학식 Ia의 화합물, 예컨대 항체 약물 컨쥬게이트, 또는 그의 제약상 허용되는 염이 제공된다:
[화학식 Ia]
화학식 Ia의 화합물에서, R1은 수소, 할로겐, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)R1E, -OR1A, -NR1BR1C, -C(O)OR1A, -C(O)NR1BR1C, -SR1D, -SOn1R1B 또는 -SOv1NR1BR1C이다. R1A, R1B, R1C, R1D 및 R1E는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -N(O)2, -SH, -S(O)3H, -S(O)4H, -S(O)2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHS(O)2H, -NHC(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이고; 동일한 질소 원자에 결합된 R1B 및 R1C 치환체는 선택적으로 연결되어 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴을 형성할 수 있다. 기호 n1은 독립적으로 0 또는 4의 정수이다. 기호 v1은 독립적으로 1 또는 2이다. 기호 
는 화학식 I에서 P에 대한 부착점을 나타낸다.
화학식 I의 하나의 구현예에서는, 화학식 II의 화합물, 예컨대 항체 약물 컨쥬게이트, 또는 그의 제약상 허용되는 염이 제공된다:
[화학식 II]
화학식 II의 화합물에서, Ab는 표적화 모이어티, 예컨대 항체이다. L3은 결합, -O-, -S-, -NR3B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2, -C(O)NR3B-, -NR3BC(O)-, -NR3BC(O)NH-, -NHC(O)NR3B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이다. L4는 결합, -O-, -S-, -NR4B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR4B-, -NR4BC(O)-, -NR4BC(O)NH-, -NHC(O)NR4B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이다. R1은 수소, 할로겐, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)R1E, -OR1A, -NR1BR1C, -C(O)OR1A, -C(O)NR1BR1C, -SR1D, -SOn1R1B 또는 -SOv1NR1BR1C이다. P는 -O-, -S-, -NR2B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR2B-, -NR2BC(O)-, -NR2BC(O)NH-, -NHC(O)NR2B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다. M은 -O-, -S-, -NR5B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5B-, -NR5BC(O)-, -NR5BC(O)NH-, -NHC(O)NR5B-, -[NR5BC(R5E)(R5F)C(O)]n2-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌 또는 M1A-M1B-M1C이다. W는 -O-, -S-, -NR6B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR6B-, -NR6BC(O)-, -NR6BC(O)NH-, -NHC(O)NR6B, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌 또는 W1A-W1B-W1C이다. M1A는 L3에 결합된다. M1C는 L4에 결합된다. M1A는 결합, -O-, -S-, -NR5AB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5AB-, -NR5ABC(O)-, -NR5ABC(O)NH-, -NHC(O)NR5AB-, -[NR5ABCR5AER5AFC(O)]n3-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다. M1B는 결합, -O-, -S-, -NR5BB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5BB-, -NR5BBC(O)-, -NR5BBC(O)NH-, -NHC(O)NR5BB-, -[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다. M1C는 결합, -O-, -S-, -NR5CB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5CB-, -NR5CBC(O)-, -NR5CBC(O)NH-, -NHC(O)NR5CB-, -[NR5CBCR5CER5CFC(O)]n5-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다. W1A는 Ab에 결합된다. W1C는 L3에 결합된다. W1A는 결합, -O-, -S-, -NR6BA-, -C(O)-, C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR6BA-, -NR6BAC(O)-, -NR6BAC(O)NH-, -NHC(O)NR6BA-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다. W1B는 결합, -O-, -S-, -NR6BB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR6BB-, -NR6BBC(O)-, -NR6BBC(O)NH-, -NHC(O)NR6BB-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다. W1C는 결합, -O-, -S-, -NR6BC-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR6BC-, -NR6BCC(O)-, -NR6BCC(O)NH-, -NHC(O)NR6BC-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다. R1A, R1B, R1C, R1D, R1E, R2B, R3B, R4B, R5B, R5E, R5F, R5AB, R5AE, R5AF, R5BB, R5BE, R5BF, R5CB, R5CE, R5CF , R6B, R6BA, R6BB 및 R6BC는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -N(O)2, -SH, -S(O)3H, -S(O)4H, -S(O)2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHS(O)2H, -NHC(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이고; 동일한 질소 원자에 결합된 R1B 및 R1C 치환체는 선택적으로 연결되어 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴을 형성할 수 있다. 기호 n1은 0 내지 4의 정수이다. 기호 v1은 1 또는 2이다. 기호 n2, n3, n4 및 n5는 독립적으로 1 내지 10의 정수이다. 기호 z1 및 z2는 독립적으로 0 내지 10의 정수이다. 기호 z3은 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
또 다른 양태에서, 하기 화학식 IV의 화합물이 제공된다:
[화학식 IV]
화학식 IV의 화합물에서, L3은 결합, -O-, -S-, -NR3B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR3B-, -NR3BC(O)-, -NR3BC(O)NH-, -NHC(O)NR3B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이다. L4는 결합, -O-, -S-, -NR4B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR4B-, -NR4BC(O)-, -NR4BC(O)NH-, -NHC(O)NR4B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이다. R1은 수소, 할로겐, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)R1E, -OR1A, -NR1BR1C, -C(O)OR1A, -C(O)NR1BR1C, -SR1D, -SOn1R1B 또는 -SOv1NR1BR1C이다. P는 -O-, -S-, -NR2B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR2B-, -NR2BC(O)-, -NR2BC(O)NH-, -NHC(O)NR2B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다. M은 -O-, -S-, -NR5B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5B-, -NR5BC(O)-, -NR5BC(O)NH-, -NHC(O)NR5B-, -[NR5BC(R5E)(R5F)C(O)]n2-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌 또는 M1A-M1B-M1C이다. W1은 반응성 모이어티, 수소, 할로겐, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴, -N3, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)R7E, -OR7A, -NR7BR7C, -C(O)OR7A, -C(O)NR7BR7C, -NO2, -SR7D, -SOn7R7B, -SOv7NR7BR7C, -NHNR7BR7C, -ONR7BR7C 또는 -NHC(O)NHNR7BR7C이다. M1A는 L3에 결합된다. M1C는 L4에 결합된다. M1A는 결합, -O-, -S-, -NR5AB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5AB-, -NR5ABC(O)-, -NR5ABC(O)NH-, -NHC(O)NR5AB-, -[NR5ABCR5AER5AFC(O)]n3-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다. M1B는 결합, -O-, -S-, -NR5BB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5BB-, -NR5BBC(O)-, -NR5BBC(O)NH-, -NHC(O)NR5BB-, [NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다. M1C는 결합, -O-, -S-, -NR5CB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5CB-, -NR5CBC(O)-, -NR5CBC(O)NH-, -NHC(O)NR5CB-, -[NR5CBCR5CER5CFC(O)]n5-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다. R1A, R1B, R1C, R1D, R1E, R2B, R3B, R4B, R5B, R5E, R5F, R5AB, R5AE, R5AF, R5BB, R5BE, R5BF, R5CB, R5CE, R5CF , R6B, R7A, R7B, R7C, R7D, R7E는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -N(O)2, -SH, -S(O)3H, -S(O)4H, -S(O)2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHS(O)2H, -NHC(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이고; 동일한 질소 원자에 결합된 R1B 및 R1C 치환체는 선택적으로 연결되어 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴을 형성할 수 있다. 기호 n1 및 n7은 독립적으로 0 내지 4의 정수이다. 기호 n7 및 v7은 독립적으로 1 또는 2이다. 기호 n2, n3, n4 및 n5는 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
또 다른 양태에서, 항체 약물 컨쥬게이트의 제조 방법이 제공된다. 방법은, 상기에 정의된 바와 같은 화학식 W1-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D를 갖는 칼리케아마이신 구성체를 항체의 아미노산, 예컨대 시스테인 또는 리신과 접촉시키는 것을 포함한다. W1은 리신 측쇄 또는 시스테인 측쇄와 같은 아미노산과 반응성인 관능기이다. M은 절단가능한 모이어티이다. L3 및 L4는 독립적으로 링커이다. P는 디술피드 보호 기이다. D는 칼리케아마이신 또는 그의 유사체이다. 기호 z1 및 z2는 독립적으로 0 내지 10의 정수이다. 기호 z3은 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
또한, 제약 조성물이 본원에서 제공된다. 하나의 양태에서는 본원에 기재된 화합물 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물이다. 또 다른 양태에서는 본원에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물이다.
또한, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서의 암의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 방법은, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 제약 조성물 또는 화합물(예를 들어, 항체 약물 컨쥬게이트)을 투여하는 것을 포함한다.
도 1은, 구성체의 특정 성분을 나타내기 위해 주석을 단, 본 발명에 따라 제작된 예시적 칼리케아마이신-링커 구성체의 화학 구조를 나타낸다.
도 2a 내지 2c는, 개시된 본 발명의 칼리케아마이신-링커 구성체가 효과적으로 절단되어 활성 칼리케아마이신을 제공함을 입증하는 데이터를 제공한다.
도 3a 내지 3d는, IC50 값을 유도하며 칼리케아마이신(도 3a) 및 예시적 칼리케아마이신-링커 구성체(도 3b 내지 3d)가 시험관 내에서 세포를 효과적으로 사멸시킴을 나타낸다.
도 4a 및 4b는, 본 발명의 칼리케아마이신-링커 구성체가 개시된 절차를 사용하여 예시적 항체에 효율적으로 컨쥬게이션됨을 확인하는 질량 분광측정 데이터를 제공한다.
도 5는, RP-HPLC를 사용하여 측정된 바와 같은, 2 종의 상이한 칼리케아마이신-링커 구성체에 컨쥬게이션된 2 종의 예시적 자리-특이적 항체 경쇄 및 중쇄의 컨쥬게이션 백분율을 나타낸다. hSC17ss1-vc는 화학식 4'의 기재된 부착점에서 hSC17 항체에 부착된 화학식 4'이고; 항체는 시스테인 측쇄(들)를 통해 컨쥬게이트/분자의 나머지 부분에 연결된 hSC17ss1(IgG 항체)이다. hSC17ss1-va는 화학식 5'의 기재된 부착점에서 hSC17 항체에 부착된 화학식 5'이고; 항체는 시스테인 측쇄(들)를 통해 컨쥬게이트/분자의 나머지 부분에 연결된 hSC17ss1(IgG 항체)이다. hSC1ss1-vc는 화학식 4'의 기재된 부착점에서 hSC1 항체에 부착된 화학식 4'이고; 항체는 시스테인 측쇄(들)를 통해 컨쥬게이트/분자의 나머지 부분에 연결된 hSC1ss1(IgG 항체)이다.
도 6은, HIC를 사용하여 측정된 바와 같은, 본원에 개시된 절차를 사용하여 컨쥬게이션된 예시적 자리-특이적 항체 구성체의 DAR 분포를 나타내는 그래프 표시를 제공한다.
도 7a 내지 7c는, 시험관 내에서 세포를 사멸시키는 칼리케아마이신-vc 링커(도 7a), 칼리케아마이신-va 링커(도 7b) 또는 칼리케아마이신-옥심 링커(도 7c)를 포함하는 예시적 항체 약물 컨쥬게이트의 능력을 입증한다.
도 8a 내지 8c는, 본 발명의 예시적 항체 약물 컨쥬게이트가 생체 내에서 종양 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있음을 나타내는 데이터를 제공한다. hSC17ss1-ox는 화학식 14'의 기재된 부착점에서 hSC17 항체에 부착된 화학식 14'이고; 항체는 시스테인 측쇄(들)를 통해 컨쥬게이트/분자의 나머지 부분에 연결된 hSC17ss1(IgG 항체)이다.
도 9는, 본 발명의 예시적 항체 약물 컨쥬게이트가 생체 내에서 종양 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있음을 나타내는 데이터를 제공한다.
도 10은, 시노몰구스 몽키(cynomolgus monkey)에서 예시적 항체 약물 컨쥬게이트를 나타내는 약동학 데이터를 제공한다. hSC27ss1-vc는 화학식 4'의 기재된 부착점에서 hSC27 항체에 부착된 화학식 4'이고; 항체는 시스테인 측쇄(들)를 통해 컨쥬게이트/분자의 나머지 부분에 연결된 hSC27ss1(IgG 항체)이다.
도 2a 내지 2c는, 개시된 본 발명의 칼리케아마이신-링커 구성체가 효과적으로 절단되어 활성 칼리케아마이신을 제공함을 입증하는 데이터를 제공한다.
도 3a 내지 3d는, IC50 값을 유도하며 칼리케아마이신(도 3a) 및 예시적 칼리케아마이신-링커 구성체(도 3b 내지 3d)가 시험관 내에서 세포를 효과적으로 사멸시킴을 나타낸다.
도 4a 및 4b는, 본 발명의 칼리케아마이신-링커 구성체가 개시된 절차를 사용하여 예시적 항체에 효율적으로 컨쥬게이션됨을 확인하는 질량 분광측정 데이터를 제공한다.
도 5는, RP-HPLC를 사용하여 측정된 바와 같은, 2 종의 상이한 칼리케아마이신-링커 구성체에 컨쥬게이션된 2 종의 예시적 자리-특이적 항체 경쇄 및 중쇄의 컨쥬게이션 백분율을 나타낸다. hSC17ss1-vc는 화학식 4'의 기재된 부착점에서 hSC17 항체에 부착된 화학식 4'이고; 항체는 시스테인 측쇄(들)를 통해 컨쥬게이트/분자의 나머지 부분에 연결된 hSC17ss1(IgG 항체)이다. hSC17ss1-va는 화학식 5'의 기재된 부착점에서 hSC17 항체에 부착된 화학식 5'이고; 항체는 시스테인 측쇄(들)를 통해 컨쥬게이트/분자의 나머지 부분에 연결된 hSC17ss1(IgG 항체)이다. hSC1ss1-vc는 화학식 4'의 기재된 부착점에서 hSC1 항체에 부착된 화학식 4'이고; 항체는 시스테인 측쇄(들)를 통해 컨쥬게이트/분자의 나머지 부분에 연결된 hSC1ss1(IgG 항체)이다.
도 6은, HIC를 사용하여 측정된 바와 같은, 본원에 개시된 절차를 사용하여 컨쥬게이션된 예시적 자리-특이적 항체 구성체의 DAR 분포를 나타내는 그래프 표시를 제공한다.
도 7a 내지 7c는, 시험관 내에서 세포를 사멸시키는 칼리케아마이신-vc 링커(도 7a), 칼리케아마이신-va 링커(도 7b) 또는 칼리케아마이신-옥심 링커(도 7c)를 포함하는 예시적 항체 약물 컨쥬게이트의 능력을 입증한다.
도 8a 내지 8c는, 본 발명의 예시적 항체 약물 컨쥬게이트가 생체 내에서 종양 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있음을 나타내는 데이터를 제공한다. hSC17ss1-ox는 화학식 14'의 기재된 부착점에서 hSC17 항체에 부착된 화학식 14'이고; 항체는 시스테인 측쇄(들)를 통해 컨쥬게이트/분자의 나머지 부분에 연결된 hSC17ss1(IgG 항체)이다.
도 9는, 본 발명의 예시적 항체 약물 컨쥬게이트가 생체 내에서 종양 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있음을 나타내는 데이터를 제공한다.
도 10은, 시노몰구스 몽키(cynomolgus monkey)에서 예시적 항체 약물 컨쥬게이트를 나타내는 약동학 데이터를 제공한다. hSC27ss1-vc는 화학식 4'의 기재된 부착점에서 hSC27 항체에 부착된 화학식 4'이고; 항체는 시스테인 측쇄(들)를 통해 컨쥬게이트/분자의 나머지 부분에 연결된 hSC27ss1(IgG 항체)이다.
본 발명은 많은 상이한 형태로 구현될 수 있다. 본 발명의 원리를 예시하는 이들의 비-제한적 예시적 구현예가 본원에 개시된다. 본원에서 사용되는 임의의 섹션 제목은 단지 조직적 목적을 위한 것이며 기재된 주제를 제한하도록 해석되지 않아야 한다. 일반적으로, 본원에서 사용된 명명법 및 하기에 기재되는 세포 배양의 실험적 절차, 분자 유전학, 유기 화학 및 핵산 화학 및 혼성화는 당업계에서 통상적으로 사용되는 널리 공지된 것들이다. 핵산 및 펩티드 합성에는 표준 기법이 사용된다. 일반적으로, 효소 반응 및 정제 단계는 제조업자의 사양에 따라 수행될 수 있다. 본 개시내용의 목적상, 모든 식별 서열 등록 번호는 달리 언급되지 않는 한 NCBI 참조 서열(RefSeq) 데이터베이스 및/또는 NCBI 진뱅크(GenBank)® 기록보관 서열 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. 본원에서 사용된 명명법 및 분석 화학에서의 실험 절차, 및 하기에 기재되는 유기 합성은 당업계에서 통상적으로 사용되는 널리 공지된 것들이다. 표준 기법, 또는 그의 변형이 화학적 합성 및 화학적 분석에 사용된다.
I. 정의
용어 "절단가능한 모이어티"는 선택된 표적 자리에서 절단에 적용되는 모이어티를 의미하는 것으로 의도된다. 바람직하게 "절단가능한 모이어티"는, 이를 표적화제로부터 절단 또는 분리함으로써 칼리케아마이신의 분리 및/또는 활성화를 가능하게 한다. 작동적으로 정의된, 링커(하기에 정의됨)는 바람직하게 생리학적 작동체에 의해 표적 자리에서 절단가능한 모이어티의 분기를 통해 절단된다. 절단은, 비-제한적인 임의의 방법, 예를 들어 효소, 환원, pH 등으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게, 절단가능한 모이어티는, 활성화가, 바람직하게는 표적 세포(예를 들어, 암종 세포) 또는 조직 내의 또는 그 근처의 자리인, 요망되는 작용 자리에서 일어나도록 링커 내에서 선택되고 일체화된다. 선택된 구현예에서, 절단가능한 모이어티는 펩티드 결합, 히드라존 모이어티, 옥심 모이어티, 에스테르 연결 및 디술피드 연결을 포함할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 이러한 절단은 효소적 절단이고, 여기서 효소적으로 절단가능한 기의 예는, 천연 아미노산 또는 천연 아미노산으로 종결되는 펩티드 서열을 포함하고, 링커 내에 혼입되어 있다. 바람직하게 혼입된 절단가능한 모이어티는, 투여 24 시간 내에 칼리케아마이신의 적어도 약 10%가 활성화되고 방출되는 것들이고, 보다 바람직하게는 25%가 방출된다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은, 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하도록 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어는, 천연 아미노산 중합체 및 비-천연 아미노산 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 아미노산의 인공적 화학 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 이들 용어는 또한 용어 "항체"를 포함한다.
용어 "아미노산"은 천연 및 합성 아미노산뿐만 아니라, 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 모방체 및 아미노산 유사체를 지칭한다. 천연 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 것들뿐만 아니라, 이후에 변형된 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는, 천연 아미노산과 동일한 기본적 화학 구조, 즉 수소에 결합된 α 탄소, 카르복실 기, 아미노 기, 및 R 기를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 주쇄를 갖지만, 천연 아미노산과 동일한 기본적 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는, 아미노산의 일반적 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학 화합물을 지칭한다. 용어 "비-천연 아미노산"은, 상기에 기재된 20 개의 천연 아미노산의 "D" 입체화학 형태를 나타내는 것으로 의도된다. 추가로, 용어 비-천연 아미노산은 천연 아미노산의 동족체, 및 천연 아미노산의 합성적으로 변형된 형태를 포함하는 것으로 이해된다. 합성적으로 변형된 형태는, 최대 2 개의 탄소 원자만큼 단축되거나 연장된 알킬렌 사슬을 갖는 아미노산, 선택적으로 치환된 아릴 기를 포함하는 아미노산, 및 할로겐화된 기, 바람직하게는 할로겐화된 알킬 및 아릴 기를 포함하는 아미노산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 아미노산은, 본 발명의 링커 또는 컨쥬게이트에 부착시, 아미노산의 카르복실산 기가 케토(C(O)) 기로 대체된 "아미노산 측쇄"의 형태로 존재한다. 따라서, 예를 들어, 알라닌 측쇄는 -C(O)-CH(NH2)-CH3 등이다.
"핵산"은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체(단일- 또는 이중-스트랜드 형태)를 지칭한다. 상기 용어는, 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 기준 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는, 합성, 천연, 및 비-천연의 것인, 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 주쇄 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예는, 비-제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)을 포함한다.
달리 기재되지 않는 한, 특정 핵산 서열은, 명시적으로 기재된 서열뿐만 아니라, 또한 보존적으로 변형된 그의 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보적 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은, 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다.
"지방족"은, (예를 들어, "C3 지방족", "C1-C5 지방족", 또는 "C1 내지 C5 지방족"(후자의 두 어구는 1 개 내지 5 개의 탄소 원자를 갖는 지방족 모이어티에 대한 동의어임)에서와 같이) 명시된 수의 탄소 원자, 또는 탄소 원자의 수가 명시적으로 명시되지 않은 경우에는 1 개 내지 4 개의 탄소 원자(불포화 지방족 모이어티의 경우 2 개 내지 4 개의 탄소)를 갖는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화, 비-방향족 탄화수소 모이어티를 의미한다.
용어 "알킬"은, 지정된 탄소 원자의 수를 갖는(즉, C1-C10은 1 개 내지 10 개의 탄소를 의미함), 그 자체로 또는 또 다른 치환체의 일부로서, 달리 언급되지 않는 한, 완전히 포화되거나, 단일- 또는 다중불포화될 수 있고, 이가 및 다가 라디칼을 포함할 수 있는, 직쇄 또는 분지쇄, 또는 시클릭 탄화수소 라디칼, 또는 이들의 조합을 의미한다. 용어 "알킬"은 또한, 달리 언급되지 않는 한, 하기에 보다 상세히 정의된 알킬의 유도체, 예컨대 "헤테로알킬"을 포함하는 것으로 의도된다. 탄화수소 기로 제한되는 알킬 기는, "호모알킬"로 언급된다. 구현예에서, 알킬은 시클릭 탄화수소 라디칼을 포함하지 않는다. 구현예에서, 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "알킬"은, 1 개 내지 20 개의 탄소 원자를 갖는 포화 선형 또는 분지형 1가 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 포화 탄화수소 라디칼의 예는, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 예를 들어 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸의 동족체 및 이성질체 등과 같은 기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 불포화 알킬 기는 1 개 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 것이다. 불포화 알킬 기의 예는, 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고급 동족체 및 이성질체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "1가"는 분자의 나머지 부분에 대해 하나의 부착점을 갖는 알킬을 의미한다. 알킬 기의 예는, 메틸, 에틸, 1-프로필, 2-프로필, 1-부틸, 2-메틸-l-프로필, -CH2CH(CH3)2, 2-부틸, 2-메틸-2-프로필, 1-펜틸, 2-펜틸, 3-펜틸, 2-메틸-2-부틸, 3-메틸-2-부틸, 3-메틸-1-부틸, 2-메틸-l-부틸, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, 2-메틸-2-펜틸, 3-메틸-2-펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 3-메틸-3-펜틸, 2-메틸-3-펜틸, 2,3-디메틸-2-부틸, 3,3-디메틸-2-부틸, 1-헵틸, 1-옥틸 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 구체적으로, 알킬 기는 1 개 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는다. 보다 구체적으로, 알킬 기는 1 개 내지 4 개의 탄소 원자를 갖는다.
용어 "알킬렌"은 그 자체로 또는 또 다른 치환체의 일부로서, -CH2CH2CH2CH2-로 예시되는(이에 제한되지는 않음), 알칸으로부터 유래된 2가 라디칼을 의미하며, 이는 추가로 "헤테로알킬렌"으로서 하기에 기재되는 기들을 포함한다. 통상적으로, 알킬(또는 알킬렌) 기는 1 개 내지 24 개의 탄소 원자를 가질 것이고, 10 개 이하의 탄소 원자를 갖는 기들이 본 발명에서 바람직하다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은, 일반적으로 8 개 이하의 탄소 원자를 갖는, 보다 단쇄인 알킬 또는 알킬렌 기이다.
용어 "헤테로알킬"은, 그 자체로 또는 또 다른 용어와 조합되어, 달리 언급되지 않는 한, 언급된 수의 탄소 원자 및 O, N, Si 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 개의 헤테로원자로 이루어진, 안정적인 직쇄 또는 분지쇄, 또는 시클릭 탄화수소 라디칼, 또는 이들의 조합을 의미하며, 여기서 질소, 탄소 및 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 선택적으로 4급화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N 및 S 및 Si는 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치에 또는 알킬 기가 분자의 나머지 부분에 부착된 위치에 배치될 수 있다. 그 예는, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어 -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3과 같이 최대 2 개의 헤테로원자가 연속될 수 있다. 유사하게, 용어 "헤테로알킬렌"은, 그 자체로 또는 또 다른 치환체의 일부로서, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-로 예시되는(이에 제한되지는 않음), 헤테로알킬로부터 유래된 2가 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌 기에 대하여, 헤테로원자는 또한 사슬 말단의 한쪽 또는 양쪽 모두를 점유할 수 있다(예를 들어, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노 등). 용어 "헤테로알킬" 및 "헤테로알킬렌"은 폴리(에틸렌 글리콜) 및 그의 유도체를 포함한다. 또한 추가로, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 연결 기에 대하여, 연결 기의 화학식이 기재된 방향에 의해 연결 기의 배향이 암시되는 것은 아니다. 예를 들어, 화학식 -C(O)2R'-는 -C(O)2R'- 및 -R'C(O)2- 둘 다를 나타낸다.
용어 "알킬" 또는 "헤테로알킬"과 조합되는 용어 "저급"은 1 개 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 모이어티를 지칭한다.
용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오"(또는 티오알콕시)는 이들의 종래의 의미로 사용되고, 각각 산소 원자, 아미노 기, 또는 황 원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착된 알킬 기를 지칭한다.
일반적으로, "아실 치환체"는 또한 상기에 제시된 기로부터 선택된다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "아실 치환체"는, 본 발명의 화합물의 폴리시클릭 핵에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 카르보닐 탄소의 원자가를 충족시키고 이에 결합된 기를 지칭한다.
용어 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은, 이들 자체로 또는 기타 다른 용어와 조합되어, 달리 언급되지 않는 한, 각각, 치환된 또는 비-치환된 "알킬" 및 치환된 또는 비-치환된 "헤테로알킬"의 시클릭 버젼을 나타낸다. 추가로, 헤테로시클로알킬에 대하여, 헤테로원자는, 헤테로사이클이 분자의 나머지 부분에 부착된 위치를 점유할 수 있다. 시클로알킬의 예는, 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 헤테로시클로알킬의 예는, 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 시클릭 구조의 헤테로원자 및 탄소 원자는 선택적으로 산화된다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은, 이들 자체로 또는 또 다른 치환체의 일부로서, 달리 언급되지 않는 한, 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드 원자를 의미한다. 추가로, "할로알킬"과 같은 용어는, 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 용어 "할로(C1-C4)알킬"은, 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 것으로 의도된다.
용어 "아릴"(약어 Ar)은, 달리 언급되지 않는 한, 함께 융합되거나 공유 연결된 다중 고리(바람직하게는 1 개 내지 3 개의 고리) 또는 단일 고리일 수 있는, 치환된 또는 비-치환된 다중불포화, 방향족, 탄화수소 치환체를 의미한다. 용어 "헤테로아릴"은, N, O, 및 S로부터 선택되는 1 개 내지 4 개의 헤테로원자를 함유하는 아릴 기(또는 고리)를 지칭하며, 여기서 질소, 탄소 및 황 원자는 선택적으로 산화되고, 질소 원자(들)는 선택적으로 4급화된다. 헤테로아릴 기는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴 기의 비-제한적 예는, 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 퓨리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기 언급된 아릴 및 헤테로아릴 고리 시스템 각각에 대한 치환체는 하기에 기재되는 허용가능한 치환체의 군으로부터 선택된다. "아릴" 및 "헤테로아릴"은 또한, 하나 이상의 비-방향족 고리 시스템이, 아릴 또는 헤테로아릴 시스템에 융합되거나, 또는 다른 방식으로 결합된 고리 시스템을 포함한다.
간단히, 용어 "아릴"은, 기타 다른 용어와 조합되어 사용시(예를 들어, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬), 상기에 정의된 바와 같은 아릴 및 헤테로아릴 고리 둘 다를 포함한다. 따라서, 용어 "아릴알킬"은, 탄소 원자(예를 들어, 메틸렌 기)가, 예를 들어 산소 원자로 대체된 알킬 기(예를 들어, 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등)를 포함한, 아릴 기가 알킬 기에 부착된 라디칼(예를 들어, 벤질, 페네틸, 피리딜메틸 등)을 포함하는 것으로 의도된다.
상기 용어(예를 들어, "알킬", "헤테로알킬", "아릴" 및 "헤테로아릴") 각각은 기재된 라디칼의 치환된 및 비-치환된 형태 둘 다를 포함한다. 각각의 유형의 라디칼에 대한 바람직한 치환체는 하기에 제공된다.
알킬, 및 헤테로알킬 라디칼(종종 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐, 및 헤테로시클로알케닐로서 언급되는 기들 포함)에 대한 치환체는 일반적으로 각각 "알킬 치환체" 및 "헤테로알킬 치환체"로서 언급되고, 이들은 0 내지 (2m'+1) 범위의 수(여기서, m'는 상기 라디칼 중 탄소 원자의 총 수임)로 -O', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -S', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)', -C(O)', -CO2', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)2', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)', -S(O)2', -S(O)2NR'R", -NRSO2', -CN 및 -NO2로부터 선택되는(이에 제한되지는 않음) 각종 기 중 하나 이상일 수 있다. R', R", R'" 및 R""는 각각 바람직하게는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 예를 들어 1 개 내지 3 개의 할로겐으로 치환된 아릴, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기, 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 하나 초과의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들어 R 기는 각각 독립적으로 각각의 R', R", R'" 및 R"" 기(이들 기 중 하나 초과가 존재하는 경우)에서와 같이 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착된 경우, 이들은 질소 원자와 조합되어 5-, 6-, 또는 7-원 고리를 형성한다. 예를 들어, -NR'R"는, 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나 이에 제한되지 않는 것으로 의도된다. 치환체에 대한 상기 논의로부터, 당업자는, 용어 "알킬"이 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예컨대 할로알킬(예를 들어, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실(예를 들어, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등)을 포함하는 것으로 의도됨을 이해할 것이다.
알킬 라디칼에 대해 기재된 치환체와 유사하게, 아릴 치환체 및 헤테로아릴 치환체는 일반적으로 각각 "아릴 치환체" 및 "헤테로아릴 치환체"로서 언급되고, 이들은 다양하며, 0 내지 방향족 고리 시스템 상의 개방 원자가의 총 수 범위의 수로, 예를 들어 할로겐, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로(C1-C4)알킬로부터 선택되며; 여기서 R', R', R'" 및 R""는 바람직하게는 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬 및 헤테로알킬, 비-치환된 아릴 및 헤테로아릴, (비-치환된 아릴)-(C1-C4)알킬, 및 (비-치환된 아릴)옥시-(C1-C4)알킬로부터 선택된다. 예를 들어, 본 발명의 화합물이 하나 초과의 R 기를 포함하는 경우, R 기는 각각 독립적으로 각각의 R', R", R'" 및 R"" 기(이들 기 중 하나 초과가 존재하는 경우)에서와 같이 선택된다.
아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 아릴 치환체 중 2 개는 선택적으로 화학식 -T-C(O)-(CRR')q-U-(여기서, T 및 U는 독립적으로 -NR-, -O-, -CRR'- 또는 단일 결합이고, q는 0 내지 3의 정수임)의 치환체로 대체될 수 있다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환체 중 2 개는 선택적으로 화학식 -A-(CH2)r-B-(여기서, A 및 B는 독립적으로 -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- 또는 단일 결합이고, r은 1 내지 4의 정수임)의 치환체로 대체될 수 있다. 이렇게 형성된 새로운 고리의 단일 결합 중 하나는 선택적으로 이중 결합으로 대체될 수 있다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환체 중 2 개는 선택적으로 화학식 -(CRR')n-X-(CR"R'")d-(여기서, s 및 d는 독립적으로 0 내지 3의 정수이고, X는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, 또는 -S(O)2NR'-임)의 치환체로 대체될 수 있다. 치환체 R, R', R" 및 R'"는 바람직하게 독립적으로 수소 또는 치환된 또는 비-치환된 (C1-C6) 알킬로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "헤테로원자"는 산소(O), 질소(N), 황(S) 및 규소(Si)를 포함한다.
기호 "R"은, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴, 및 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클릴 기로부터 선택되는 치환기를 나타내는 일반적 약어이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "알킬렌"은, 1 개 내지 20 개의 탄소 원자를 갖는 포화 선형 또는 분지형 2가 탄화수소 라디칼을 지칭하며, 그의 예는, 상기에 예시된 것과 동일한 알킬 기의 코어 구조를 갖는 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "2가"는 알킬렌이 분자의 나머지 부분에 대한 2 개의 부착점을 가짐을 의미한다. 구체적으로, 알킬렌 기는 1 개 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는다. 보다 구체적으로, 알킬렌 기는 1 개 내지 4 개의 탄소 원자를 갖는다.
용어 "카르보사이클", "카르보시클릴", 카르보시클릭 및 "카르보시클릭 고리"는, 모노시클릭 고리로서 3 개 내지 12 개의 탄소 원자 또는 비시클릭 고리로서 7 개 내지 12 개의 탄소 원자를 갖는 1가 비-방향족, 포화 또는 부분 불포화 고리를 지칭한다. 7 개 내지 12 개의 원자를 갖는 비시클릭 카르보사이클은, 예를 들어, 비시클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로서 배열될 수 있고, 9 개 또는 10 개의 고리 원자를 갖는 비시클릭 카르보사이클은 비시클로 [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로서, 또는 브릿징된 시스템, 예컨대 비시클로[2.2.1]헵탄, 비시클로[2.2.2]옥탄 및 비시클로[3.2.2]노난으로서 배열될 수 있다. 모노시클릭 카르보사이클의 예는, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 1-시클로펜트-I-에닐, 1-시클로펜트-2-에닐, 1-시클로펜트-3-에닐, 시클로헥실, 1-시클로헥스-I-에닐, 1-시클로헥스-2-에닐, 1-시클로헥스-3-에닐, 시클로헥사디에닐, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 시클로노닐, 시클로데실, 시클로운데실, 시클로도데실 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "시클로알킬알킬"은, 알킬렌 기에 의해 또 다른 기에 연결된 시클로알킬 기를 지칭한다. 시클로알킬알킬의 예는, 시클로헥실메틸, 시클로헥실에틸, 시클로펜틸메틸, 시클로펜틸에틸 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
기가 "선택적으로 치환된" 것으로 기재된 경우, 그 기는 (1) 비-치환되거나, 또는 (2) 치환될 수 있다. 기의 탄소가 선택적으로 치환체의 목록 중 하나 이상으로 치환된 것으로 기재된 경우, 탄소 상의 수소 원자 중 하나 이상(이들이 존재하는 한)은 별도로 및/또는 함께 독립적으로 선택되는 선택적 치환체로 대체될 수 있다.
용어 "표적화제" 및 "세포 결합제"는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 이는 (1) 이것이 부착되어 있는 실체(entity)(예를 들어, 칼리케아마이신)를 표적 세포로, 예를 들어 특정 유형의 종양 세포로 지향시킬 수 있는 또는 (2) 표적 조직, 예를 들어 종양에서 우선적으로 활성화되는 모이어티를 의미하는 것으로 의도된다. 표적화제는 소분자일 수 있고, 이는 비-펩티드 및 펩티드 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 표적화제는 또한 거대분자일 수 있고, 이는 사카라이드, 렉틴, 수용체, 수용체에 대한 리간드, 단백질, 예컨대 BSA, 항체 등을 포함한다. 가장 바람직하게 표적화제는 항체 또는 그의 면역반응성 단편을 포함할 것이다. 구현예에서, 표적화제는 항체 또는 그의 면역반응성 단편이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "염"은, 본 발명의 화합물의 유기 또는 무기 염을 지칭한다. 구체적으로, 염은 제약상 허용되는 염이다. 기타 다른 비-제약상 허용되는 염 또한 본 발명 발명에 포함된다(예를 들어, 분자 또는 거대분자). 염은, 염기성 기를 포함하는 본 발명의 화합물을 무기 산 또는 유기 산(예컨대, 카르복실산)과 반응시킴으로써 형성되는 염, 및 산성 기를 포함하는 본 발명의 화합물을 무기 염기 또는 유기 염기(예컨대, 아민)와 반응시킴으로써 형성되는 염을 포함한다. 예시적 염은 바로 하기에 기재되는 제약상 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 화합물이 비교적 산성인 관능기를 함유하는 경우, 이러한 화합물의 중성 형태를, 용매 없이 또는 적합한 불활성 용매 중에서, 충분한 양의 요망되는 염기와 접촉시킴으로써, 염기 부가 염이 얻어질 수 있다. 제약상 허용되는 염기 부가 염의 예는, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아미노, 또는 마그네슘 염, 또는 유사 염을 포함한다. 본 발명의 화합물이 비교적 염기성인 관능기를 함유하는 경우, 이러한 화합물의 중성 형태를, 용매 없이 또는 적합한 불활성 용매 중에서, 충분한 양의 요망되는 산과 접촉시킴으로써 산 부가 염이 얻어질 수 있다.
제약상 허용되는 산 부가 염의 예는, 무기 산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 일수소탄산, 인산, 일수소인산, 이수소인산, 황산, 일수소황산, 요오드화수소산, 또는 아인산 등으로부터 유래된 것들뿐만 아니라, 비교적 비-독성인 유기 산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠술폰산, p-톨릴술폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄술폰산 등으로부터 유래된 염을 포함한다. 또한, 아미노산의 염, 예컨대 아르기네이트 등, 및 유기 산, 예컨대 글루쿠론산 또는 갈락투노르산 등의 염이 포함된다(예를 들어, 문헌 [Berge et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19] 참조). 본 발명의 어떠한 특정 화합물은, 화합물이 염기 또는 산 부가 염으로 전환될 수 있게 하는 염기성 및 산성 관능기 둘 다를 함유한다.
용어 "제약상 허용되는 염"은, 분자 또는 거대분자의 유기 또는 무기 염을 의미한다. 제약상 허용되는 염은, 본원에 기재된 화합물 상에서 나타나는 특정 치환체에 따라, 비교적 비-독성인 산 또는 염기를 사용하여 제조되는 활성 화합물의 염을 포함한다. 산 부가 염은 아미노 기를 사용하여 형성될 수 있다. 예시적 염은, 술페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 니트레이트, 비술페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 및 파모에이트(즉, 1,1'-메틸렌 비스-(2-히드록시 3-나프토에이트)) 염을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 제약상 허용되는 염은 또 다른 분자, 예컨대 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 기타 다른 반대이온을 포함할 수 있다. 반대이온은 모(parent) 화합물 상의 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 또한, 제약상 허용되는 염은 그의 구조 내에 하나 초과의 대전된 원자를 가질 수 있다. 다수의 대전된 원자가 제약상 허용되는 염의 일부인 경우, 염은 다수의 반대이온을 가질 수 있다. 따라서, 제약상 허용되는 염은 하나 이상의 대전된 원자 및/또는 하나 이상의 반대이온을 가질 수 있다.
화합물의 중성 형태는 바람직하게, 염을 염기 또는 산과 접촉시키고, 모 화합물을 종래의 방식으로 단리함으로써 재생된다. 모 화합물 형태는 특정 물리적 특성, 예컨대 극성 용매 중에서의 용해도에 있어 다양한 염 형태와 상이하지만, 다르게는 염은 본 발명의 목적상 모 화합물 형태와 동등하다.
"제약상 허용되는 용매화물" 또는 "용매화물"은 하나 이상의 용매 분자 및 분자 또는 거대분자의 회합물을 지칭한다. 제약상 허용되는 용매화물을 형성하는 용매의 예는, 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸 아세테이트, 아세트산, 및 에탄올아민을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "링커", "바이오컨쥬게이트 링커", 및 "스페이서"는 상호교환가능하게 사용되며, 본원에서 사용되는 바와 같이 하나의 화학 모이어티를 또 다른 것에 공유 연결시키는 2가 화학 기를 나타낸다. 링커의 구체적 예는 본원에 기재되어 있다. 링커는 폴리에틸렌(PEG) 링커 또는 바이오컨쥬게이트 링커 또는 이들의 조합일 수 있다.
용어 "연결 기", 또는 "바이오컨쥬게이션 모이어티"는, 링커에 대한 표적화제의 부착을 가능하게 하는 모이어티를 지칭한다. 하기에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 예시적 연결 기는, 비-제한적인 예시로, 알킬, 아미노알킬, 아미노카르보닐알킬, 카르복시알킬, 히드록시알킬, 알킬-말레이미드, 알킬-N-히드록실숙신이미드, 폴리(에틸렌 글리콜)-말레이미드 및 폴리(에틸렌 글리콜)-N-히드록실숙신이미드를 포함하며, 이들 모두 추가로 치환될 수 있다. 링커는 또한, 표적화 기에 실제로 부속되는 부착 모이어티를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "반응성 관능기", "반응성 모이어티", "반응성 기"는, 화학 모이어티 사이에 링커를 형성하도록 반응하는 기를 지칭한다. 기재된 반응성 기는, 본원에 기재된 바와 같은, 바이오컨쥬게이트 기법에서 통상적으로 사용되는 반응성 관능기를 포함한다. 구현예에서, 반응성 모이어티는 아미노산(예를 들어, 아미노산 측쇄), 예컨대 리신 측쇄 또는 시스테인 측쇄와 반응성인 관능기일 수 있다. 반응성 기는, 올레핀, 아세틸렌, 알콜, 페놀, 에테르, 옥시드, 할라이드, 알데히드, 케톤, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 시아네이트, 이소시아네이트, 티오시아네이트, 이소티오시아네이트, 아민, 히드라진, 히드라존, 히드라지드, 디아조, 디아조늄, 니트로, 니트릴, 메르캅탄, 술피드, 디술피드, 술폭시드, 술폰, 술폰산, 술핀산, 아세탈, 케탈, 무수물, 술페이트, 술펜산, 이소니트릴, 아미딘, 이미드, 이미데이트, 니트론, 히드록실아민, 옥심, 히드록삼산, 티오히드록삼산, 알렌, 오르토 에스테르, 술파이트, 엔아민, 인아민, 우레아, 슈도우레아, 세미카르바지드, 카르보디이미드, 카르바메이트, 이민, 아지드, 아조 화합물, 아족시 화합물, 및 니트로소 화합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 반응성 관능기는 또한 바이오컨쥬게이트, 예를 들어, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 말레이미드 등을 제조하기 위해 사용되는 것들을 포함한다. 이들 관능기 각각의 제조 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 이들의 응용 또는 특정 목적을 위한 변형은 당업자의 능력 내에 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "컨쥬게이트"는 원자 또는 분자 사이의 회합을 지칭한다. 회합은 직접적 또는 간접적일 수 있다. 예를 들어, 핵산(예를 들어, 리보핵산) 및 본원에서 제공된 바와 같은 화합물 모이어티 사이의 컨쥬게이트는, 예를 들어 공유 결합에 의해 직접적일 수 있거나, 또는 예를 들어 비-공유 결합에 의해 간접적일 수 있다. 선택적으로, 컨쥬게이트는, 친핵성 치환(예를 들어, 아민 및 알콜과 아실 할라이드, 반응성 에스테르의 반응), 친전자성 치환(예를 들어, 엔아민 반응) 및 탄소-탄소 및 탄소-헤테로원자 다중 결합에 대한 부가(예를 들어, 마이클(Michael) 반응, 딜즈-알더(Diels-Alder) 부가)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 컨쥬게이트 화학을 사용하여 형성된다. 이들 및 기타 다른 유용한 반응이, 예를 들어 문헌 [March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985]; [Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996]; 및 [Feeney et al., MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982]에 논의되어 있다. 따라서, 핵산은 그의 주쇄를 통해 화합물 모이어티에 부착될 수 있다. 선택적으로, 리보핵산은, 리보핵산과 화합물 모이어티의 상호작용을 용이하게 하는 하나 이상의 반응성 모이어티, 예를 들어 아미노산 반응성 모이어티를 포함한다.
본원에서 컨쥬게이트 화학에 사용되는 유용한 반응성 모이어티 또는 반응성 관능기는, 예를 들어 하기의 것들을 포함한다:
(a) N-히드록시숙신이미드 에스테르, N-히드록시벤즈트리아졸 에스테르, 산 할라이드, 아실 이미다졸, 티오에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 방향족 에스테르를 포함하나 이에 제한되지는 않는 카르복실 기 및 이들의 다양한 유도체;
(b) 에스테르, 에테르, 알데히드 등으로 전환될 수 있는 히드록실 기;
(c) 할라이드가 이후에 친핵성 기, 예컨대 아민, 카르복실레이트 음이온, 티올 음이온, 탄소음이온, 또는 알콕시드 이온으로 치환되고, 이로써 할로겐 원자의 자리에 새로운 기의 공유 부착이 형성될 수 있는 할로알킬 기;
(d) 딜즈-알더 반응에 참여할 수 있는 친디엔성 기, 예컨대 말레이미도 기;
(e) 예를 들어, 이민, 히드라존, 세미카르바존 또는 옥심과 같은 카르보닐 유도체의 형성을 통해, 또는 그리냐르(Grignard) 부가 또는 알킬리튬 부가와 같은 메커니즘을 통해 후속 유도체화가 가능하도록 하는 알데히드 또는 케톤 기;
(f) 예를 들어, 술폰아미드를 형성하는, 아민과의 후속 반응을 위한 술포닐 할라이드 기;
(g) 디술피드로 전환되거나, 아실 할라이드와 반응하거나, 또는 금속, 예컨대 금에 결합될 수 있는 티올 기;
(h) 예를 들어, 아실화되거나, 알킬화되거나 또는 산화될 수 있는, 아민 또는 술프히드릴 기;
(i) 예를 들어, 시클로부가, 아실화, 마이클 부가 등이 일어날 수 있는 알켄;
(j) 예를 들어, 아민 및 히드록실 화합물과 반응할 수 있는 에폭시드;
(k) 포스포르아미다이트 및 핵산 합성에 유용한 기타 다른 표준 관능기;
(l) 금속 규소 산화물 결합;
(m) 예를 들어, 포스페이트 디에스테르 결합을 형성하는 반응성 인 기(예를 들어, 포스핀)에 대한 금속 결합; 및
(n) 술폰, 예를 들어 비닐 술폰.
컨쥬게이트("클릭") 화학을 사용한 작은 모듈형 유닛을 연결시키는 것에 의한 조성물의 화학적 합성은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [H. C. Kolb, M. G. Finn and K. B. Sharpless ((2001). "Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions". Angewandte Chemie International Edition 40 (11): 2004-2021)]; [R. A. Evans ((2007). "The Rise of Azide-Alkyne 1,3-Dipolar 'Click' Cycloaddition and its Application to Polymer Science and Surface Modification". Australian Journal of Chemistry 60 (6): 384-395]; [W.C. Guida et al. Med. Res. Rev. p 3 1996]; [Spiteri, Christian and Moses, John E. ((2010). "Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition: Regioselective Synthesis of 1,4,5-Trisubstituted 1,2,3-Triazoles". Angewandte Chemie International Edition 49 (1): 31-33)]; [Hoyle, Charles E. and Bowman, Christopher N. ((2010). "Thiol-Ene Click Chemistry". Angewandte Chemie International Edition 49 (9): 1540-1573)]; [Blackman, Melissa L. and Royzen, Maksim and Fox, Joseph M. ((2008). "Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactivity". Journal of the American Chemical Society 130 (41): 13518-13519)]; [Devaraj, Neal K. and Weissleder, Ralph and Hilderbrand, Scott A. ((2008). "Tetrazine Based Cycloadditions: Application to Pretargeted Live Cell Labeling". Bioconjugate Chemistry 19 (12): 2297-2299)]; [Stoeckmann, Henning; Neves, Andre; Stairs, Shaun; Brindle, Kevin; Leeper, Finian ((2011). "Exploring isonitrile-based click chemistry for ligation with biomolecules". Organic & Biomolecular Chemistry)]에 기재되어 있고, 이들 모두 그 전문이 모든 목적상 본원에 참조로 포함된다.
반응성 관능기는, 이들이 본원에 기재된 단백질의 화학적 안정성에 참여하지 않거나, 이를 방해하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 비닐 술폰 또는 기타 다른 반응성 모이어티를 포함할 수 있다. 선택적으로, 핵산은 화학식 S-S-R을 갖는 반응성 모이어티를 포함할 수 있다. R은, 예를 들어 보호 기일 수 있다. 선택적으로, R은 헥산올이다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 헥산올은 화학식 C6H13OH를 갖는 화합물을 포함하고, 이는 1-헥산올, 2-헥산올, 3-헥산올, 2-메틸-1-펜탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 2-메틸-2-펜탄올, 3-메틸-2-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-메틸-3-펜탄올, 3-메틸-3-펜탄올, 2,2-디메틸-1-부탄올, 2,3-디메틸-1-부탄올, 3,3-디메틸-1-부탄올, 2,3-디메틸-2-부탄올, 3,3-디메틸-2-부탄올, 및 2-에틸-1-부탄올을 포함한다. 선택적으로, R은 1-헥산올이다.
"항체"는, 특이적으로 항원에 결합되고 이를 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 그의 단편으로부터의 골격 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론, 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라, 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로서 분류되고, 이는 결국 각각 면역글로불린 부류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 한정한다. 통상적으로, 항체의 항원-결합 영역은 결합의 특이성 및 친화성에 있어 가장 중대할 것이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체의 단편은, 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 낙타 등을 포함하는 상이한 유기체로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 항체는, 항체의 요망되는 기능(예를 들어, 글리코실화, 발현, 항원 인식, 작동체 기능, 항원 결합, 특이성 등)을 개선시키거나 조절하기 위해 하나 이상의 아미노산 위치에서 변형되거나 돌연변이된 항체를 포함할 수 있다.
항체는 복잡한 내부 구조를 갖는 크고 복잡한 분자(약 150,000의 분자량 또는 약 1320 개의 아미노산)이다. 천연 항체 분자는, 각각의 쌍이 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 갖는, 폴리펩티드 사슬의 2 개의 동일한 쌍을 함유한다. 결국 각각의 경쇄 및 중쇄는 2 개의 영역, 즉 표적 항원 결합에 관련되는 가변("V") 영역, 및 면역 시스템의 기타 다른 성분과 상호작용하는 불변("C") 영역으로 이루어진다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 함께 3차원 공간을 이루어 항원(예를 들어, 세포 표면 상의 수용체)에 결합되는 가변 영역을 형성한다. 각각의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 내에는, 상보성 결정 영역("CDR")이라 불리는 3 개의 짧은 세그먼트(평균 10 개의 아미노산 길이)가 존재한다. 항체 가변 도메인 내의 6 개의 CDR(3 개는 경쇄로부터, 그리고 3 개는 중쇄로부터의 것임)은 3차원 공간 내에서 함께 폴딩되어 표적 항원 상에 도킹되는 실제 항원 결합 자리를 형성한다. CDR의 위치 및 길이는 문헌 [Kabat, E. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1983, 1987]에 의해 정확히 정의되어 있다. CDR에 대한 환경을 형성하는, CDR 내에 함유되지 않은 가변 영역의 부분은 골격("FR")이라 불린다.
예시적 면역글로불린(항체) 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는, 각각의 쌍이 하나의 "경쇄"(약 25 kD) 및 하나의 "중쇄"(약 50 kD 내지 70 kD)를 갖는, 폴리펩티드 사슬의 2 개의 동일한 쌍으로 구성된다. 각각의 사슬의 N-말단은 항원 인식에 있어 주로 원인이 되는 약 100 개 내지 110 개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 한정한다. 용어 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 지칭한다. Fc(즉, 단편 결정화가능 영역)는 면역글로불린의 "베이스" 또는 "테일"이고, 이는 통상적으로 항체의 부류에 따라 2 개 또는 3 개의 불변 도메인을 제공하는 2 개의 중쇄로 구성된다. 특정 단백질에 대한 결합에 의해 Fc 영역은, 각각의 항체가 주어진 항원에 대한 적절한 면역 반응을 생성하는 것을 보장한다. Fc 영역은 또한 다양한 세포 수용체, 예컨대 Fc 수용체, 및 기타 다른 면역 분자, 예컨대 보체 단백질에 결합된다.
항체는, 예를 들어 무손상(intact) 면역글로불린으로서 또는 다양한 펩티다제로의 소화에 의해 생성된 다수의 잘 특성화된 단편으로서 존재한다. 따라서, 예를 들어, 펩신은 힌지(hinge) 영역 내의 디술피드 연결 아래의 항체를 소화시켜, 그 자체가 디술피드 결합에 의해 VH-CH1에 연결된 경쇄인 Fab의 이량체인 F(ab)'2를 형성한다. F(ab)'2는 온화한 조건 하에 환원되어 힌지 영역 내의 디술피드 연결을 파괴함으로써 F(ab)'2 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 부분과의 항원 결합 부분이다(문헌 [Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993)] 참조). 무손상 항체의 소화와 관련하여 다양한 항체 단편이 한정되지만, 당업자는 이러한 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 새롭게(de novo) 합성될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 항체는 또한, 전체 항체의 변형에 의해 생성된 항체 단편, 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 드 노보 합성된 것들(예를 들어, 단일쇄 Fv) 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 식별된 것들을 포함한다(예를 들어, 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)] 참조).
용어 "치료 유효량"은, 대상체에서 요망되는 생물학적 반응을 유도하는 활성 칼리케아마이신 또는 항체 약물 컨쥬게이트의 양을 의미한다. 이러한 반응은 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 경감, 질환의 증상 또는 질환 자체의 재발의 방지, 억제 또는 지연, 치료 부재시에 비해 대상체의 수명 증가, 또는 질환의 증상 또는 질환 자체의 진행의 방지, 억제 또는 지연을 포함한다. 유효량의 결정은, 특히 본원에서 제공된 상세한 개시내용에 비추어, 충분히 당업자의 능력 내에 있다. 개시된 화합물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양에서의, 그리고 실험 동물에서의 표준 제약 절차에 의해 측정될 수 있다. 대상체에게 투여되는 본 발명의 화합물 또는 컨쥬게이트 또는 기타 다른 치료제의 유효량은, 다발성 골수종의 단계, 카테고리 및 상황 및 대상체의 특징, 예컨대 전반적 건강 상태, 연령, 성별, 체중 및 약물 용인성에 따라 달라질 것이다. 투여되는 본 발명의 화합물 또는 컨쥬게이트 또는 기타 다른 치료제의 유효량은 또한, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 달라질 것이다. 요망되는 치료 효과를 유지하기에 충분한 활성 화합물의 혈장 수준을 제공하도록 투여량 및 투여 간격을 개별적으로 조정할 수 있다.
특히, 유리한 약동학 및 약역학 특징을 나타내는 칼리케아마이신-링커 구성체를 제공하는 신규한 방법, 화합물, 조성물 및 제조 물품이 본원에서 제공된다. 본원에서 제공되는 이점은, 항체 약물 컨쥬게이트의 분야에서 광범위하게 응용가능할 수 있고, 각종 표적과 반응하는 항체와 함께 사용될 수 있다. 구현예에서, 개시된 화합물(예를 들어, 항체 약물 컨쥬게이트)은, 감소된 비-특이적 독성을 갖는 표적 자리에서의 세포독성 칼리케아마이신 종의 효율적인 제시를 가능하게 하는 절단가능한 모이어티를 갖는 신규한 칼리케아마이신-링커 구성체를 포함한다. 또한, 구현예에서, 개시된 칼리케아마이신-링커 구성체는, 종래의 컨쥬게이션된 제조물과 비교시 비교적 안정적이고, 평균 DAR 분포 및 페이로드 위치에 있어 실질적으로 균질한 자리-특이적 컨쥬게이트 제조물을 제공하는 데 사용된다. 첨부된 실시예에서 나타난 바와 같이, 이러한 자리-특이적 칼리케아마이신 컨쥬게이트의 안정성 및 균질성(평균 DAR 분포 및 칼리케아마이신 위치조절 둘 다와 관련)은 개선된 치료 지수에 기여하는 유리한 독성 프로파일을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 절단가능한 모이어티를 포함하는 칼리케아마이신-링커 구성체에 관한 것이다. 당업자는, 절단가능한 칼리케아마이신 페이로드가 표적 자리(예를 들어, 종양 세포)에 대한 활성화된 탄두(warhead)의 선택적이고 제어된 전달을 가능하게 함을 인지할 것이다.
구현예에서, 개시된 화합물은 종양형성 세포 상에 존재하는 항원 결정인자와 면역특이적으로 반응할 것이다. 따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은, 항체가 다양한 종양과 연관되는 것으로 공지된 SEZ6 결정인자와 면역특이적으로 반응하는 것인, 절단가능한 칼리케아마이신 페이로드를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트에 관한 것이다.
II. 조성물
하기 화학식 2의 화합물(예를 들어, 항체 약물 컨쥬게이트), 또는 그의 제약상 허용되는 염이 본원에서 제공된다:
[화학식 2]
Ab-[W-(X1)a-CM-(X2)b-P-D]n
Ab는 표적화제이다. W는 연결 기 또는 링커이다. CM은 절단가능한 모이어티이다. P는 디술피드 보호 기이다. X1 및 X2는 선택적 스페이서 또는 링커 모이어티를 포함한다. D는 칼리케아마이신이다. 기호 a 및 b는 독립적으로 0 또는 1이다. 기호 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.
하나의 양태에서, 하기 화학식 I의 화합물(예를 들어, 항체 약물 컨쥬게이트), 또는 그의 제약상 허용되는 염이 제공된다:
[화학식 I]
Ab-[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]z3
Ab는 표적화제이다. W는 연결 기 또는 링커 기이다. M은 절단가능한 모이어티이다. L3 및 L4는 독립적으로 링커 또는 스페이서이다. P는 디술피드 보호 기이다. D는 칼리케아마이신 또는 그의 유사체이다. 기호 z1, z2 및 z3은 독립적으로 0 내지 10의 정수이다. 구현예에서, 기호 z3은 1 내지 10의 정수이다.
본원에서 제공된 임의의 화학식에서 D가 칼리케아마이신 또는 그의 유사체인 경우, D(칼리케아마이신 또는 유사체)는, 말단 -S-S-S-CH3 모이어티가 
로 대체되고, 기호 
가 P에 대한 부착점을 나타내는 것인 당업계에 공지된 바와 같은 칼리케아마이신의 부류의 임의의 구성원을 포함함을 이해한다. 칼리케아마이신은, 칼리케아마이신 γ1 I, 칼리케아마이신 β1 Br, 칼리케아마이신 γ1 Br, 칼리케아마이신 α2 I, 칼리케아마이신 α3 I, 칼리케아마이신 β1 i 및 칼리케아마이신 δ1 i를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 박테리움 마이크로모노스포라 에키노스포라(Micromonospora echinospora)로부터 유래된 엔디인 항종양 항생제의 부류이다.
구현예에서, 표적화제는 항체이다.
구현예에서, D는 하기 화학식 Ia를 갖는다:
[화학식 Ia]
R1은 수소, 할로겐, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)R1E, -OR1A, -NR1BR1C, -C(O)OR1A, -C(O)NR1BR1C, -SR1D, -SOn1R1B 또는 -SOv1NR1BR1C이다.
R1A, R1B, R1C, R1D 및 R1E는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -N(O)2, -SH, -S(O)3H, -S(O)4H, -S(O)2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHS(O)2H, -NHC(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다.
구현예에서, 동일한 질소 원자에 결합된 R1B 및 R1C 치환체는 선택적으로 연결되어 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴을 형성할 수 있다. 기호 n1은 독립적으로 0 내지 4의 정수이다. 기호 v1은 독립적으로 1 또는 2이다.
또 다른 양태에서, 하기 화학식 II의 화합물(예를 들어, 항체 약물 컨쥬게이트)이 제공된다:
[화학식 II]
Ab는 표적화제, 예컨대 항체이다. 구현예에서, 항체는 키메라 항체, CDR 그래프팅된 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체 또는 그의 면역반응성 단편이다. 구현예에서, 항체는 항SEZ6 항체이다.
L3은 결합, -O-, -S-, -NR3B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2, -C(O)NR3B-, -NR3BC(O)-, -NR3BC(O)NH-, -NHC(O)NR3B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이다.
L4는 결합, -O-, -S-, -NR4B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR4B-, -NR4BC(O)-, -NR4BC(O)NH-, -NHC(O)NR4B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이다.
R1은 수소, 할로겐, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)R1E, -OR1A, -NR1BR1C, -C(O)OR1A, -C(O)NR1BR1C, -SR1D, -SOn1R1B 또는 -SOv1NR1BR1C이다.
P는 -O-, -S-, -NR2B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR2B-, -NR2BC(O)-, -NR2BC(O)NH-, -NHC(O)NR2B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다.
M은 -O-, -S-, -NR5B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5B-, -NR5BC(O)-, -NR5BC(O)NH-, -NHC(O)NR5B-, -[NR5BC(R5E)(R5F)C(O)]n2-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌 또는 M1A-M1B-M1C이다.
W는 -O-, -S-, -NR6B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR6B-, -NR6BC(O)-, -NR6BC(O)NH-, -NHC(O)NR6B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌 또는 W1A-W1B-W1C이다.
M1A는 L3에 결합된다. M1C는 L4에 결합된다.
M1A는 결합, -O-, -S-, -NR5AB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5AB-, -NR5ABC(O)-, -NR5ABC(O)NH-, -NHC(O)NR5AB-, -[NR5ABCR5AER5AFC(O)]n3-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다.
M1B는 결합, -O-, -S-, -NR5BB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5BB-, -NR5BBC(O)-, -NR5BBC(O)NH-, -NHC(O)NR5BB-, -[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다.
M1C는 결합, -O-, -S-, -NR5CB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5CB-, -NR5CBC(O)-, -NR5CBC(O)NH-, -NHC(O)NR5CB-, -[NR5CBCR5CER5CFC(O)]n5-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다.
W1A는 Ab에 결합된다. W1C는 L3에 결합된다.
W1A는 결합, -O-, -S-, -NR6BA-, -C(O)-, C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR6BA-, -NR6BAC(O)-, -NR6BAC(O)NH-, -NHC(O)NR6BA-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다.
W1B는 결합, -O-, -S-, -NR6BB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR6BB-, -NR6BBC(O)-, -NR6BBC(O)NH-, -NHC(O)NR6BB-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다.
W1C는 결합, -O-, -S-, -NR6BC-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR6BC-, -NR6BCC(O)-, -NR6BCC(O)NH-, -NHC(O)NR6BC-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다.
R1A, R1B, R1C, R1D, R1E, R2B, R3B, R4B, R5B, R5E, R5F, R5AB, R5AE, R5AF, R5BB, R5BE, R5BF, R5CB, R5CE, R5CF , R6B, R6BA, R6BB 및 R6BC는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -N(O)2, -SH, -S(O)3H, -S(O)4H, -S(O)2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHS(O)2H, -NHC(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다.
구현예에서, 동일한 질소 원자에 결합된 R1B 및 R1C 치환체는 선택적으로 연결되어 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴을 형성할 수 있다.
기호 n1은 0 내지 4의 정수이다. 구현예에서, n1은 0이다. 구현예에서, n1은 1이다. 구현예에서, n1은 2이다. 구현예에서, n1은 3이다. 구현예에서, n1은 4이다. 기호 n7은 0 내지 4의 정수이다. 구현예에서, n7은 0이다. 구현예에서, n7은 1이다. 구현예에서, n7은 2이다. 구현예에서, n7은 3이다. 구현예에서, n1은 4이다. 기호 v1은 1 또는 2이다. 기호 n2, n3, n4, n5 및 z3은 독립적으로 1 내지 10의 정수이다. 기호 z1 및 z2는 독립적으로 0 내지 10의 정수이다. 구현예에서, n2는 1이다. 구현예에서, n2는 2이다. 구현예에서, n2는 3이다. 구현예에서, n2는 4이다. 구현예에서, n2는 5이다. 구현예에서, n2는 6이다. 구현예에서, n2는 7이다. 구현예에서, n2는 8이다. 구현예에서, n2는 9이다. 구현예에서, n2는 10이다. 구현예에서, n3은 1이다. 구현예에서, n3은 2이다. 구현예에서, n3은 3이다. 구현예에서, n3은 4이다. 구현예에서, n3은 5이다. 구현예에서, n3은 6이다. 구현예에서, n3은 7이다. 구현예에서, n3은 8이다. 구현예에서, n3은 9이다. 구현예에서, n3은 10이다. 구현예에서, n4는 1이다. 구현예에서, n4는 2이다. 구현예에서, n4는 3이다. 구현예에서, n4는 4이다. 구현예에서, n4는 5이다. 구현예에서, n4는 6이다. 구현예에서, n4는 7이다. 구현예에서, n4는 8이다. 구현예에서, n4는 9이다. 구현예에서, n4는 10이다. 구현예에서, n5는 1이다. 구현예에서, n5는 2이다. 구현예에서, n5는 3이다. 구현예에서, n5는 4이다. 구현예에서, n5는 5이다. 구현예에서, n5는 6이다. 구현예에서, n5는 7이다. 구현예에서, n5는 8이다. 구현예에서, n5는 9이다. 구현예에서, n5는 10이다. 구현예에서, z2는 1이다. 구현예에서, z2는 2이다. 구현예에서, z2는 3이다. 구현예에서, z2는 4이다. 구현예에서, z2는 5이다. 구현예에서, z2는 6이다. 구현예에서, z2는 7이다. 구현예에서, z2는 8이다. 구현예에서, z2는 9이다. 구현예에서, z2는 10이다. 구현예에서, z1은 1이다. 구현예에서, z1은 2이다. 구현예에서, z1은 3이다. 구현예에서, z1은 4이다. 구현예에서, z1은 5이다. 구현예에서, z1은 6이다. 구현예에서, z1은 7이다. 구현예에서, z1은 8이다. 구현예에서, z1은 9이다. 구현예에서, z1은 10이다. 구현예에서, z3은 1이다. 구현예에서, z3은 2이다. 구현예에서, z3은 3이다. 구현예에서, z3은 4이다. 구현예에서, z3은 5이다. 구현예에서, z3은 6이다. 구현예에서, z3은 7이다. 구현예에서, z3은 8이다. 구현예에서, z3은 9이다. 구현예에서, z3은 10이다.
구현예에서, W는 항체 내에서 시스테인 잔기에 공유 부착된다. 구현예에서, 시스테인 잔기는 카바트(Kabat) 위치 C214에 있다. 구현예에서, W는 항체 내에서 리신 잔기에 공유 부착된다.
구현예에서, M은 M1A-M1B-M1C이고, 여기서 M1A는 L3에 결합되고, M1C는 L4에 결합된다.
구현예에서, M1A는 결합, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌 또는 -[NR5ABC(R5AE)(R5AF)C(O)]n3이다. 구현예에서, M1B는 결합, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌 또는 -[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-이다. 구현예에서, M1C는 결합 또는 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다. 구현예에서, M1A는 아미노산이다. 구현예에서, M1B는 아미노산이다. 구현예에서, M1A 또는 M1B 중 적어도 하나는 발린(val)이다. 구현예에서, M1A 또는 M1B 중 적어도 하나는 알라닌(ala)이다. 구현예에서, M1A 또는 M1B 중 적어도 하나는 시트룰린(cit)이다. 구현예에서, M1A, M1B 또는 M1C 중 하나는 치환된 아릴렌이다.
구현예에서, M1A, M1B 또는 M1C 중 적어도 하나는 하기 화학식 III을 갖는다:
[화학식 III]
여기서, Y는 -NH-, -O-, -C(O)NH- 또는 -C(O)O-이고; n6은 0 내지 3의 정수이다.
구현예에서, W는 W1A-W1B-W1C이고, 여기서 W1A는 Ab에 결합되고, W1C는 L3에 결합된다.
구현예에서, P는 치환된 또는 비-치환된 알킬이다.
구현예에서, z3은 1 또는 2이다.
구현예에서, L3은 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이다.
구현예에서, L4는 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이다.
구현예에서, W는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이다.
구현예에서, W는 5- 또는 6-원 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌이다.
구현예에서, W는 하기 화학식을 갖는다:
구현예에서, M은 펩티드를 포함한다.
구현예에서, -[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]는 하기와 같다:
구현예에서, -[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]는 하기 화학식을 갖는다:
추가의 양태에서, 하기 화학식 IV의 화합물이 제공된다:
[화학식 IV]
n1, z1, z2, L3, L4, R1, P 및 M은 본원에 기재된 바와 같다.
W1은 수소, 할로겐, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴, -N3, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)R7E, -OR7A, -NR7BR7C, -C(O)OR7A, -C(O)NR7BR7C, -NO2, -SR7D, -SOn7R7B, -SOv7NR7BR7C, -NHNR7BR7C, -ONR7BR7C, -NHC(O)NHNR7BR7C이다.
기호 n7은 0 내지 4의 정수이다. 기호 v7은 1 또는 2이다.
구현예에서, 화학식 IV의 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
[화학식 IV]
구현예에서, R1은 수소, 치환된 또는 비-치환된 알킬 또는 -C(O)R1E이다. 구현예에서, R1은 수소 또는 -C(O)R1E이다. 구현예에서, R1은 -C(O)R1E이다. 구현예에서, R1은 -C(O)CH3, -C(O)CH2CH3, -C(O)CH2CH2CH3 또는 -C(O)CH2CH2CH2CH3이다. 구현예에서, R1은 -C(O)CH3이다.
구현예에서, L3은 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, R3G-치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 R3G-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이다. 구현예에서, L3은 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, R3G-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬렌 또는 R3G-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬렌이다.
R3G는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R3H-치환된 또는 비-치환된 알킬, R3H-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R3H-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R3H-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R3H-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R3H-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R3G는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R3H-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R3H-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R3H-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R3H-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R3H-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R3H-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, L4는 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, R4G-치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 R4G-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이다. 구현예에서, L4는 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, R4G-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬렌 또는 R4G-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬렌이다.
R4G는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R4H-치환된 또는 비-치환된 알킬, R4H-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R4H-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R4H-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R4H-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R4H-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R4G는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R4H-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R4H-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R4H-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R4H-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R4H-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R4H-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R1은 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)H, -OH, -NH2, -C(O)OH, -C(O)NH2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, R1G-치환된 또는 비-치환된 알킬, R1G-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R1G-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R1G-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R1G-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R1G-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R1은 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)H, -OH, -NH2, -C(O)OH, -C(O)NH2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, R1G-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R1G-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R1G-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R1G-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R1G-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R1G-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
R1G는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R1H-치환된 또는 비-치환된 알킬, R1H-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R1H-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R1H-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R1H-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R1H-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R1G는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R1H-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R1H-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R1H-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R1H-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R1H-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R1H-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, P는 독립적으로 -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, R2G-치환된 또는 비-치환된 알킬, R2G-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R2G-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R2G-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R2G-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R2G-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, P는 독립적으로 -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, R2G-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R2G-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R2G-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R2G-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R2G-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R2G-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
R2G는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R2H-치환된 또는 비-치환된 알킬, R2H-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R2H-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R2H-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R2H-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R2H-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R2G는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R2H-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R2H-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R2H-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R2H-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R2H-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R2H-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, M은 독립적으로 -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, -[NHCH2C(O)]-, -[NHCH2C(O)]2-, -[NHCH2C(O)]3-, -[NHCH2C(O)]4-, -[NHCH2C(O)]5-, -[NHCH2C(O)]6-, -[NHCH2C(O)]7-, -[NHCH2C(O)]8-, -[NHCH2C(O)]9-, -[NHCH2C(O)]10-, R5G-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5G-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5G-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5G-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5G-치환된 또는 비-치환된 아릴, R5G-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴 또는 M1A-M1B-M1C이다. 구현예에서, M은 독립적으로 -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, -[NHCH2C(O)]-, -[NHCH2C(O)]2-, -[NHCH2C(O)]3-, -[NHCH2C(O)]4-, -[NHCH2C(O)]5-, -[NHCH2C(O)]6-, -[NHCH2C(O)]7-, -[NHCH2C(O)]8-, -[NHCH2C(O)]9-, -[NHCH2C(O)]10-, R5G-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5G-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5G-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5G-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5G-치환된 또는 비-치환된 페닐, R5G-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴 또는 M1A-M1B-M1C이다.
R5G는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5H-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5H-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5H-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5H-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5H-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R5H-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R5G는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5H-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5H-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5H-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5H-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5H-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5H-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, W는 독립적으로 -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, R6G-치환된 또는 비-치환된 알킬, R6G-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R6G-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R6G-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R6G-치환된 또는 비-치환된 아릴, R6G-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴 또는 W1A-W1B-W1C이다. 구현예에서, W는 독립적으로 -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH, R6G-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R6G-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R6G-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R6G-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R6G-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R6G-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴 또는 W1A-W1B-W1C이다. 구현예에서, W는 -[(L3)z1-M-(L4)z2-P-D] 또는 -[(L3')z1'-M'-(L4')z2'-P'-D']이고, 여기서 -[(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]는 -[(L3')z1'-M'-(L4')z2'-P'-D']와 동일하거나 또는 선택적으로 상이하다. z1, z2, L3, L4, P, M 및 D는 독립적으로 z1', z2', L3', L4', P', M' 및 D'와 동일하거나 또는 독립적으로 선택적으로 상이하다. z1, z2, L3, L4, P, M 및 D는 본원에 기재된 바와 같다. z1', z2', L3', L4', P', M' 및 D'는 독립적으로 z1, z2, L3, L4, P, M 및 D에 상응하고, 이에 따라 본원에 정의된 바와 같다.
R6G는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6H-치환된 또는 비-치환된 알킬, R6H-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R6H-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R6H-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R6H-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R6H-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R6G는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6H-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R6H-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R6H-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R6H-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R6H-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R6H-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, W1은 수소, 할로겐, -N3, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)H, -OH, -NH2, -C(O)OH, -C(O)NH2, -NO2, -SH, SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, R7G-치환된 또는 비-치환된 알킬, R7G-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R7G-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R7G-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R7G-치환된 또는 비-치환된 아릴 또는 R7G-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, W는 독립적으로 -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH, R7G-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R7G-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R7G-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R7G-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R7G-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R7G-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
R7G는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R7H-치환된 또는 비-치환된 알킬, R7H-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R7H-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R7H-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R7H-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R7H-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R7G는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R7H-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R7H-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R7H-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R7H-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R7H-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R7H-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, M1A는 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, -[NHCH2C(O)]-, -[NHCH2C(O)]2-, -[NHCH2C(O)]3-, -[NHCH2C(O)]4-, -[NHCH2C(O)]5-, -[NHCH2C(O)]6-, -[NHCH2C(O)]7-, -[NHCH2C(O)]8-, -[NHCH2C(O)]9-, -[NHCH2C(O)]10-, R5AG-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5AG-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5AG-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5AG-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5AG-치환된 또는 비-치환된 아릴, R5AG-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, M1A는 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, -[NHCH2C(O)]-, -[NHCH2C(O)]2-, -[NHCH2C(O)]3-, -[NHCH2C(O)]4-, -[NHCH2C(O)]5-, -[NHCH2C(O)]6-, -[NHCH2C(O)]7-, -[NHCH2C(O)]8-, -[NHCH2C(O)]9-, -[NHCH2C(O)]10-, R5AG-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5AG-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5AG-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5AG-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5AG-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5AG-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
R5AG는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5AH-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5AH-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5AH-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5AH-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5AH-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R5AH-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R5AG는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5AH-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5AH-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5AH-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5AH-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5AH-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5AH-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, M1B는 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, -[NHCH2C(O)]-, -[NHCH2C(O)]2-, -[NHCH2C(O)]3-, -[NHCH2C(O)]4-, -[NHCH2C(O)]5-, -[NHCH2C(O)]6-, -[NHCH2C(O)]7-, -[NHCH2C(O)]8-, -[NHCH2C(O)]9-, -[NHCH2C(O)]10-, R5BG-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5BG-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5BG-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5BG-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5BG-치환된 또는 비-치환된 아릴, R5BG-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, M1B는 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, -[NHCH2C(O)]-, -[NHCH2C(O)]2-, -[NHCH2C(O)]3-, -[NHCH2C(O)]4-, -[NHCH2C(O)]5-, -[NHCH2C(O)]6-, -[NHCH2C(O)]7-, -[NHCH2C(O)]8-, -[NHCH2C(O)]9-, -[NHCH2C(O)]10-, R5BG-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5BG-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5BG-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5BG-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5BG-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5BG-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
R5BG는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5BH-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5BH-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5BH-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5BH-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5BH-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R5BH-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R5BG는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5BH-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5BH-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5BH-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5BH-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5BH-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5BH-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, M1C는 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, -[NHCH2C(O)]-, -[NHCH2C(O)]2-, -[NHCH2C(O)]3-, -[NHCH2C(O)]4-, -[NHCH2C(O)]5-, -[NHCH2C(O)]6-, -[NHCH2C(O)]7-, -[NHCH2C(O)]8-, -[NHCH2C(O)]9-, -[NHCH2C(O)]10-, R5CG-치환된 또는 비-치환된 알킬렌, R5CG-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, R5CG-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, R5CG-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, R5CG-치환된 또는 비-치환된 아릴, R5CG-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, M1C는 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, -[NHCH2C(O)]-, -[NHCH2C(O)]2-, -[NHCH2C(O)]3-, -[NHCH2C(O)]4-, -[NHCH2C(O)]5-, -[NHCH2C(O)]6-, -[NHCH2C(O)]7-, -[NHCH2C(O)]8-, -[NHCH2C(O)]9-, -[NHCH2C(O)]10-, R5CG-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬렌, R5CG-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬렌, R5CG-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬렌, R5CG-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬렌, R5CG-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5CG-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
R5CG는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5CH-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5CH-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5CH-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5CH-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5CH-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R5CH-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R5CG는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5CH-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5CH-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5CH-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5CH-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5CH-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5CH-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, W1A는 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, R6AG-치환된 또는 비-치환된 알킬렌, R6AG-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, R6AG-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, R6AG-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, R6AG-치환된 또는 비-치환된 아릴, R6AG-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, W1A는 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH, R6AG-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬렌, R6AG-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬렌, R6AG-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬렌, R6AG-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬렌, R6AG-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R6AG-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
R6AG는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6AH-치환된 또는 비-치환된 알킬, R6AH-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R6AH-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R6AH-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R6AH-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R6AH-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R6AG는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6AH-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R6AH-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R6AH-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R6AH-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R6AH-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R6AH-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, W1B는 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, R6BG-치환된 또는 비-치환된 알킬렌, R6BG-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, R6BG-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, R6BG-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, R6BG-치환된 또는 비-치환된 아릴, R6BG-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, W1B는 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH, R6BG-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬렌, R6BG-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬렌, R6BG-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬렌, R6BG-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬렌, R6BG-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R6BG-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
R6BG는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6BH-치환된 또는 비-치환된 알킬, R6BH-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R6BH-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R6BH-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R6BH-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R6BH-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R6BG는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6BH-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R6BH-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R6BH-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R6BH-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R6BH-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R6BH-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, W1C는 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, R6CG-치환된 또는 비-치환된 알킬렌, R6CG-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, R6CG-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, R6CG-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, R6CG-치환된 또는 비-치환된 아릴, R6CG-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, W1C는 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -NHC(O)NH, R6CG-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬렌, R6CG-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬렌, R6CG-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬렌, R6CG-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬렌, R6CG-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R6CG-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
R6CG는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6CH-치환된 또는 비-치환된 알킬, R6CH-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R6CH-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R6CH-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R6CH-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R6CH-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R6CG는 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6CH-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R6CH-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R6CH-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R6CH-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R6CH-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R6CH-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R1A는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R1.1-치환된 또는 비-치환된 알킬, R1.1-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R1.1-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R1.1-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R1.1-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R1.1-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R1A는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R1.1-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R1.1-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R1.1-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R1.1-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R1.1-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R1.1-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R1B는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R1.2-치환된 또는 비-치환된 알킬, R1.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R1.2-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R1.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R1.2-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R1.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R1B는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R1.2-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R1.2-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R1.2-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R1.2-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R1.2-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R1.2-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R1C는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R1.3-치환된 또는 비-치환된 알킬, R1.3-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R1.3-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R1.3-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R1.3-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R1.3-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R1C는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R1.3-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R1.3-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R1.3-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R1.3-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R1.3-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R1.3-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다. 동일한 질소 원자에 결합된 R1B 및 R1C는 선택적으로 연결되어 R1.3-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬 또는 R1.3-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴을 형성할 수 있다.
구현예에서, R1D는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R1.4-치환된 또는 비-치환된 알킬, R1.4-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R1.4-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R1.4-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R1.4-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R1.4-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R1D는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R1.4-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R1.4-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R1.4-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R1.4-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R1.4-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R1.4-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R1E는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R1.5-치환된 또는 비-치환된 알킬, R1.5-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R1.5-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R1.5-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R1.5-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R1.5-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R1E는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R1.5-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R1.5-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R1.5-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R1.5-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R1.5-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R1.5-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다. 구현예에서, R1E는 비-치환된 알킬이다. 구현예에서, R1E는 비-치환된 C1-C6 알킬이다. 구현예에서, R1E는 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸이다. 구현예에서, R1E는 메틸이다.
구현예에서, R2B는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R2.2-치환된 또는 비-치환된 알킬, R2.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R2.2-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R2.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R2.2-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R2.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R2B는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R2.2-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R2.2-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R2.2-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R2.2-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R2.2-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R2.2-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R3B는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R3.2-치환된 또는 비-치환된 알킬, R3.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R3.2-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R3.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R3.2-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R3.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R3B는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R3.2-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R3.2-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R3.2-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R3.2-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R3.2-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R3.2-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R4B는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R4.2-치환된 또는 비-치환된 알킬, R4.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R4.2-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R4.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R4.2-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R4.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R4B는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R4.2-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R4.2-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R4.2-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R4.2-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R4.2-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R4.2-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R5B는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.2-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5.2-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5.2-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R5.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R5B는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.2-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5.2-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5.2-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5.2-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5.2-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5.2-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R5E는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.5-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5.5-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5.5-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5.5-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5.5-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R5.5-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R5E는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.5-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5.5-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5.5-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5.5-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5.5-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5.5-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R5F는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.6-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5.6-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5.6-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5.6-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5.6-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R5.6-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R5F는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.6-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5.6-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5.6-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5.6-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5.6-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5.6-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R5AB는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.7-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5.7-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5.7-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5.7-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5.7-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R5.7-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R5AB는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.7-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5.7-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5.7-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5.7-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5.7-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5.7-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R5AE는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.8-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5.8-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5.8-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5.8-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5.8-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R5.8-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R5AE는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.8-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5.8-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5.8-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5.8-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5.8-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5.8-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R5AF는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.9-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5.9-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5.9-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5.9-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5.9-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R5.9-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R5AF는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.9-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5.9-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5.9-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5.9-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5.9-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5.9-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R5BB는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.10-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5.10-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5.10-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5.10-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5.10-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R5.10-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R5BB는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.10-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5.10-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5.10-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5.10-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5.10-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5.10-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R5BE는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.11-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5.11-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5.11-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5.11-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5.11-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R5.11-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R5BE는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.11-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5.11-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5.11-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5.11-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5.11-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5.11-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R5BF는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.12-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5.12-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5.12-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5.12-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5.12-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R5.12-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R5BF는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.12-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5.12-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5.12-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5.12-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5.12-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5.12-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R5CB는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.13-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5.13-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5.13-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5.13-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5.13-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R5.13-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R5CB는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.13-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5.13-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5.13-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5.13-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5.13-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5.13-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R5CE는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.14-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5.14-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5.14-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5.14-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5.14-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R5.14-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R5CE는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.14-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5.14-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5.14-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5.14-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5.14-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5.14-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R5CF는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.15-치환된 또는 비-치환된 알킬, R5.15-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R5.15-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R5.15-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R5.15-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R5.15-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R5CF는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R5.15-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R5.15-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R5.15-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R5.15-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R5.15-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R5.15-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R6A는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6.1-치환된 또는 비-치환된 알킬, R6.1-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R6.1-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R6.1-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R6.1-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R6.1-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R6A는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6.1-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R6.1-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R6.1-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R6.1-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R6.1-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R6.1-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R6B는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6.2-치환된 또는 비-치환된 알킬, R6.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R6.2-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R6.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R6.2-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R6.2-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R6B는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6.2-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R6.2-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R6.2-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R6.2-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R6.2-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R6.2-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R6AB는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6.7-치환된 또는 비-치환된 알킬, R6.7-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R6.7-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R6.7-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R6.7-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R6.7-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R6AB는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6.7-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R6.7-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R6.7-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R6.7-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R6.7-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R6.7-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R6BB는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6.10-치환된 또는 비-치환된 알킬, R6.10-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R6.10-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R6.10-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R6.10-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R6.10-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R6BB는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6.10-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R6.10-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R6.10-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R6.10-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R6.10-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R6.10-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
구현예에서, R6BC는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6.13-치환된 또는 비-치환된 알킬, R6.13-치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, R6.13-치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, R6.13-치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, R6.13-치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 R6.13-치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R6BC는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, R6.13-치환된 또는 비-치환된 C1-C6 알킬, R6.13-치환된 또는 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, R6.13-치환된 또는 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, R6.13-치환된 또는 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, R6.13-치환된 또는 비-치환된 페닐, 또는 R6.13-치환된 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
R1H, R2H, R3H, R4H, R5H, R6H, R7H, R5AH, R5BH, R5CH, R6AH, R6BH, R6CH, R1.1, R1.2, R1.3, R1.4, R1.5, R2.2, R3.2, R4.2, R5.2 , R5.5, R5.6, R5.7, R5.8, R5.9, R5.10, R5.11, R5.12, R5.13, R5.14, R5.15, R6.1, R6.2, R6.7, R6.10 및 R6.13은 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O)NH2, -NHSO2H, -NHC=(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCHF2, 비-치환된 알킬, 비-치환된 헤테로알킬, 비-치환된 시클로알킬, 비-치환된 헤테로시클로알킬, 비-치환된 아릴, 또는 비-치환된 헤테로아릴이다. 구현예에서, R1H, R2H, R3H, R4H, R5H, R6H, R7H, R5AH, R5BH, R5CH, R6AH, R6BH, R6CH, R1.1, R1.2, R1.3, R1.4, R1.5, R2.2, R3.2, R4.2, R5.2 , R5.5, R5.6, R5.7, R5.8, R5.9, R5.10, R5.11, R5.12, R5.13, R5.14, R5.15, R6.1, R6.2, R6.7, R6.10 및 R6.13은 독립적으로 옥소, 할로겐, -CF3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O)NH2, -NHSO2H, -NHC=(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCHF2, 비-치환된 C1-C6 알킬, 비-치환된 2 원 내지 6 원 헤테로알킬, 비-치환된 C3-C6 시클로알킬, 비-치환된 3 원 내지 6 원 헤테로시클로알킬, 비-치환된 페닐, 또는 비-치환된 5 원 내지 6 원 헤테로아릴이다.
III. 제약 조성물
또한, 제약 제형이 본원에서 제공된다. 하나의 양태에서, 본원에 기재된 화합물 또는 항체 약물 컨쥬게이트 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
IV. 방법
방법이 본원에서 제공된다. 하나의 양태에서, 항체 약물 컨쥬게이트의 제조 방법이 제공된다. 방법은 칼리케아마이신 구성체를 항체의 시스테인 또는 리신과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 칼리케아마이신 구성체는 화학식 W1-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D(여기서, W1은 리신 측쇄 또는 시스테인 측쇄와 반응성인 관능기이고, M은 절단가능한 모이어티이고, L3 및 L4는 독립적으로 링커이고, P는 디술피드 보호 기이고, D는 칼리케아마이신 또는 그의 유사체임)를 갖는다.
구현예에서, 칼리케아마이신 구성체를 항체의 특이적 시스테인과 접촉시킨다. 구현예에서, 특이적 시스테인은 고유적(native) 디술피드 브릿지로부터 유래된다. 구현예에서, 항체는 조작된 항체이고, 특이적 시스테인은 고유적 디술피드 브릿지로부터 유래되지 않는다. 구현예에서, 특이적 시스테인을 접촉 전에 선택적으로 환원시킨다. 구현예에서, 항체를 선택적으로 환원시키는 단계는, 항체를 안정화제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 개시된 칼리케아마이신-링커 구성체는 하기 화학식의 항체 약물 컨쥬게이트 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제작하는 데 사용되며:
Ab-[W-(X1)a-CM-(X2)b-P-D]n
여기서,
a) Ab는 표적화제를 포함하고;
b) W는 연결 기를 포함하고;
c) CM은 절단가능한 모이어티를 포함하고;
d) P는 디술피드 보호 기를 포함하고;
e) X1 및 X2는 선택적 스페이서 모이어티를 포함하고;
f) D는 칼리케아마이신을 포함하고;
a 및 b는 독립적으로 0 또는 1이고;
n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.
선택된 구현예에서, 표적화제는 하나 이상의 유리 시스테인을 갖는 자리-특이적 항체를 포함할 것이다. 선택된 구현예에서, 절단가능한 모이어티는 펩티드 결합, 히드라존 모이어티, 옥심 모이어티, 에스테르 연결, 및 디술피드 연결을 포함할 수 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 연결 기는 표적화제 상의 시스테인 모이어티와 반응하여 칼리케아마이신-링커 구성체를 표적화제에 공유 연결시킬 것이다.
상기 항체 약물 컨쥬게이트에 추가로, 본 발명은 추가로, 일반적으로 개시된 ADC를 포함하는 제약 조성물 및 이러한 ADC를 사용하여 환자에서의 암을 포함하는 장애를 진단하거나 치료하는 방법을 제공한다. 특히 바람직한 구현예에서, 개시된 컨쥬게이트는 SEZ6 결정인자와 연관될 것이다.
또 다른 구현예에서, 표적화제는 적어도 하나의 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 포함하는 자리-특이적 조작된 IgG1 동형 항체를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기(들)는 중쇄/중쇄 사슬간 잔기와 대조적인 중쇄/경쇄 사슬간 잔기를 포함할 것이다. 다른 구현예에서, 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기는 사슬내 디술피드 브릿지로부터 생성될 것이다.
또 다른 구현예에서, 표적화제는, 상기 자리-특이적 조작된 항체를 구성하는 경쇄의 C214 잔기(카바트의 EU 지수에 따라 번호부여됨)가 또 다른 잔기로 치환되거나 결실된 조작된 항체를 포함할 것이다. 추가의 구현예에서, 표적화제는, 조작된 항체를 구성하는 중쇄의 C220 잔기(카바트의 EU 지수에 따라 번호부여됨)가 또 다른 잔기로 치환되거나 결실된 조작된 항체를 포함한다.
관련 구현예에서, 본 발명은, 종양 세포 또는 종양형성 세포를 본 발명의 칼리케아마이신 ADC로 처리하는 것을 포함하는, 상기 종양 세포 또는 종양형성 세포의 사멸, 그의 빈도수 감소 또는 그의 증식 억제 방법에 관한 것이다. 관련 구현예에서, 본 발명은, 대상체에게 본 발명의 칼리케아마이신 컨쥬게이트를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은,
a) 절단가능한 링커를 포함하는 칼리케아마이신 구성체를 제공하는 단계;
b) 표적화제를 환원시켜 활성화된 잔기를 제공하는 단계; 및
c) 선택적으로 환원된 표적화제를 칼리케아마이신 구성체에 컨쥬게이션시키는 단계
를 포함하는, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트의 제조 방법을 포함한다.
선택된 구현예에서, 표적화제는 하나 이상의 유리 시스테인을 갖는 자리-특이적 항체를 포함할 것이다. 다른 구현예에서, 자리-특이적 항체는 선택적으로 환원될 것이다. 관련된 바람직한 구현예에서, 항체를 선택적으로 환원시키는 단계는, 항체를 안정화제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은, 항체를 온화한 환원제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서의 암 치료 방법이 제공된다. 방법은, 대상체에게 치료 유효량의 청구 제약 조성물 또는 본원에 개시된 항체 약물 컨쥬게이트를 투여하는 것을 포함한다. 구현예에서, 암은 췌장암, 결장직장암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암 및 위암으로부터 선택된다. 구현예에서, 방법은 대상체에게 추가의 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
하나의 양태에서는, 칼리케아마이신 세포독소를 세포로 전달하는 방법이 제공된다. 방법은 세포를 본원에 개시된 바와 같은 항체 약물 컨쥬게이트와 접촉시키는 것을 포함한다.
나타낸 바와 같이, 개시된 컨쥬게이트는 증식성 장애 또는 그의 재발 또는 진행의 치료, 관리, 개선 또는 예방에 사용될 수 있다. 본 발명의 선택된 구현예는, 바람직하게는 종양 개시 세포 빈도수의 감소를 포함하는 악성 종양의 면역요법 치료을 위한 이러한 칼리케아마이신 컨쥬게이트의 용도를 제공한다. 개시된 ADC는 단독으로 또는 매우 다양한 항암 화합물, 예컨대 화학요법제 또는 면역요법제(예를 들어, 치료 항체) 또는 생체 반응 조절제와 조합되어 사용될 수 있다. 다른 선택된 구현예에서는, 둘 이상의 별개의 칼리케아마이신 컨쥬게이트를 조합하여 사용하여 증대된 항종양 효과를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 증식성 장애, 예컨대 암의 치료에 유용한, 본원에 개시된 칼리케아마이신 컨쥬게이트를 사용하는 키트 또는 장치 및 연관 방법, 및 본원에 개시된 바와 같은 칼리케아마이신 컨쥬게이트의 제약 조성물을 제공한다. 이를 위해 본 발명은 바람직하게는, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트를 함유하는 용기 및 증식성 장애 또는 그의 진행 또는 재발의 치료, 개선 또는 예방을 위해 컨쥬게이트를 사용하기 위한 지시용 자료를 포함하는, 이러한 장애의 치료에 유용한 제조 물품을 제공한다. 선택된 구현예에서, 장치 및 연관 방법은 적어도 하나의 암 줄기 세포를 접촉시키는 단계를 포함할 것이다.
상기 설명은 요약이며, 따라서 필요에 따라 상세사항의 간략화, 일반화, 및 생략을 함유하며; 그 결과, 당업자는 요약이 단지 예시적인 것이며 어떠한 방식으로든 제한적인 것으로 의도되지 않음을 인지할 것이다. 본원에 기재된 방법, 조성물 및/또는 장치 및/또는 기타 다른 주제의 기타 다른 양태, 특징, 및 이점은 본원에 기재된 교시내용에서 명백해질 것이다. 요약은 하기 상세한 설명에 추가로 기재되는 간략화된 형태에서의 개념의 선택을 도입하기 위해 제공된 것이다. 이러한 요약은 청구된 주제의 주요 특징 또는 필수적 특징을 규명하는 것으로 의도되지 않으며, 또한 청구된 주제의 범위 결정에 있어 보조물로서 사용되는 것으로 의도되지 않는다.
I
칼리케아마이신
칼리케아마이신은, 칼리케아마이신 γ1 I, 칼리케아마이신 β1 Br, 칼리케아마이신 γ1 Br, 칼리케아마이신 α2 I, 칼리케아마이신 α3 I, 칼리케아마이신 β1 i 및 칼리케아마이신 δ1 i(이들은 단리되고 특성화되었음)를 포함하는, 박테리움 마이크로모노스포라 에키노스포라로부터 유래된 엔디인 항종양 항생제의 부류이다. 상기 칼리케아마이신 유사체 각각의 구조는 당업계에 널리 공지되어 있고(예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Lee et al., Journal of Antibiotics, July 1989] 참조), 이들은 본원에 개시된 칼리케아마이신 구성체 및 항체 약물 컨쥬게이트와 상용성이다. 일반적으로, 칼리케아마이신 γ1은, 각각 화합물의 생물학적 활성에 있어 특정 역할을 수행하는 2 개의 별개의 구조 영역을 함유한다. 둘 중 보다 큰 것은, 4 개의 모노사카라이드 단위 및 1 개의 6치환된 벤젠 고리를 포함하는 연장된 당 잔기로 이루어지고; 이들은 글리코시드, 티오에스테르, 및 히드록실아민 연결의 매우 특이한 시리즈를 통해 함께 연결되어 있다. 두번째 구조 영역, 아글리콘(칼리케아마이시논으로서 공지됨)은 브릿징 10 원 고리 내의 변형력 부여된(strained) 엔디인 단위를 하우징하는 고도로 관능화된 압축형 비시클릭 코어를 함유한다. 이 아글리콘 서브유닛은, 하기에 기재되는 바와 같이, 분자의 세포독성 형태를 생성하는 활성화제로서 기능하는 알릴형 트리술피드를 추가로 포함한다.
예를 들어 트리술피드 칼리케아마이신 γ1 I의 구조를 하기에 나타내었다:
[화학식 1]
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "칼리케아마이신"은, N-아세틸 유도체, 술피드 유사체 및 그의 유사체와 함께 칼리케아마이신 γ1 I, 칼리케아마이신 β1 Br, 칼리케아마이신 γ1 Br, 칼리케아마이신 α2 I, 칼리케아마이신 α3 I, 칼리케아마이신 β1 i 및 칼리케아마이신 δ1 중 임의의 하나를 의미하는 것으로 의도될 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "칼리케아마이신"은 자연에서 발견되는 칼리케아마이신뿐만 아니라 또 다른 분자(예를 들어, 항체 약물 컨쥬게이트)에 대한 부착점을 갖는 디술피드에서 종결되는 칼리케아마이신 모이어티 및 그의 유사체를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 바와 같이 칼리케아마이신 γI은 하기와 같이 해석되도록 이해되어야 한다:
상기 언급된 임의의 화합물은 본원의 교시내용과 상용성이며, 개시된 칼리케아마이신 구성체 및 항체 약물 컨쥬게이트를 제작하는 데 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 특정 구현예에서, 개시된 항체 약물 컨쥬게이트의 칼리케아마이신 성분은 N-아세틸 칼리케아마이신 γ1 I을 포함할 것이다.
칼리케아마이신은 핵산을 표적화하고, 스트랜드 절단을 일으킴으로써 표적 세포를 사멸시킨다. 보다 구체적으로, 칼리케아마이신은 DNA의 좁은 홈에 결합되고, 여기서 이들은 이어서 베르그만(Bergman) 고리화와 유사한 반응에 놓여 2가 라디칼 종을 생성하는 것으로 나타났다. 이와 관련하여, 아릴 테트라사카라이드 서브유닛은 약물을 그의 표적으로 전달하여, 이중 나선형 DNA의 좁은 홈에 단단히 결합되도록 작용한다(크로터스(Crothers) 등(1999)에 의해 입증됨). 친핵체(예를 들어, 글루타티온)가 트리술피드 기의 중심 황 원자를 공격하면, 이는 구조적 기하구조를 현저히 변화시키고, 10 원 엔디인 고리 상에 많은 변형력을 부여한다. 이 변형력은 시클로방향족화 반응에 놓이는 엔디인에 의해 완전히 완화되고, 이는 고도-반응성 1,4-벤제노이드 2가 라디칼을 생성하고, 이는 결국, 스트랜드 절단을 일으키는 데옥시리보스 DNA 주쇄로부터의 수소 원자의 유인에 의해 DNA 절단으로 이어진다. 본 발명의 칼리케아마이신 디술피드 유사체 구성체에서 친핵체는 보호된 디술피드 결합을 절단하여 요망되는 2가 라디칼을 생성함을 인지한다(도 1 참조).
2000년에, N-아세틸 디메틸 히드라지드 칼리케아마이신을 포함하는 CD33 항원-표적화된 면역컨쥬게이트(밀로타르그(Mylotarg)®)가 개발되었고, 이는 급성 골수성 백혈병(AML)에 대한 표적화된 요법제로서 시판되었다. 이후 상기 약물은 효능 및 독성 문제로 인해 회수되었다. 이에 반해 본 발명의 항체 칼리케아마이신 컨쥬게이트는 유리한 치료 프로파일을 나타내며, 이는 이들이 많은 증식성 장애를 치료하는 데 효과적으로 사용될 수 있음을 시사한다.
II
항체 컨쥬게이트
바람직한 구현예에서, 본 발명과 상용성인 표적화제는 신규한 칼리케아마이신 구성체와 컨쥬게이션되어 "항체 약물 컨쥬게이트"(ADC) 또는 "항체 컨쥬게이트"를 형성한다. 용어 "컨쥬게이트"는 광범위하게 사용되며, 이는 정확한 회합 방법과 관계 없이 본 발명과 상용성인 표적화제(예를 들어, 항체)와 임의의 절단가능한 칼리케아마이신 모이어티의 공유 또는 비-공유 회합을 의미한다. 바람직한 특정 구현예에서, 회합은 표적화제의 시스테인 잔기를 통해 달성된다. 특히 바람직한 구현예에서, 칼리케아마이신은 하나 이상의 자리-특이적 유리 시스테인(들)을 거쳐 절단가능한 링커를 통해 항체에 컨쥬게이션될 수 있다. 개시된 ADC는 암의 치료를 포함하는 치료 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 ADC는 세포독소 또는 기타 다른 페이로드를 표적 위치(예를 들어, SEZ6을 발현하는 종양형성 세포)로 전달하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "약물" 또는 "탄두"는 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 상기에 기재된 바와 같은 임의의 칼리케아마이신 또는 칼리케아마이신 유사체를 의미할 것이다. 바람직한 구현예에서, 개시된 ADC는 칼리케아마이신 탄두를 포함하는 결합된 페이로드를 비교적 비-반응성, 비-독성인 상태로 표적 자리로 지향시킨 후, 그 탄두를 방출하고 활성화시킨다. 이러한 탄두의 표적화된 방출은 바람직하게는 페이로드의 안정한 컨쥬게이션(예를 들어, 항체 상의 하나 이상의 시스테인을 통해) 및 과잉-컨쥬게이션된 독성 종을 최소화하는 ADC 제조물의 비교적 균질한 조성을 통해 보조된다. 칼리케아마이신 포함 페이로드를 주로 방출하도록 디자인된 절단가능한 약물 링커와 커플링되어 이것이 종양 자리로 전달되면, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는 바람직하지 않은 비-특이적 독성을 상당히 감소시킬 수 있다. 이는 유리하게는, 비-표적화된 세포 및 조직의 노출을 최소화하면서 종양 자리에 비교적 높은 수준의 활성 칼리케아마이신을 제공함으로써 증대된 치료 지수를 제공한다.
어떤 경우에도 칼리케아마이신을 포함하는 선택된 페이로드는 항체에 공유 또는 비-공유 연결되고, 적어도 부분적으로, 컨쥬게이션을 달성하기 위해 사용되는 방법에 따라, 다양한 화학량론적 몰비를 나타낼 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 하기 화학식 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 표시될 수 있으며:
[화학식 2]
Ab-[W-(X1)a-CM-(X2)b-P-D]n
여기서,
a) Ab는 표적화제를 포함하고;
b) W는 연결 기를 포함하고;
c) CM은 절단가능한 모이어티를 포함하고;
d) P는 디술피드 보호 기를 포함하고;
e) X1 및 X2는 선택적 스페이서 모이어티를 포함하고;
f) D는 칼리케아마이신을 포함하고;
a 및 b는 독립적으로 0 또는 1이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.
본 개시내용의 목적상, 성분 W-(X1)a-CM-(X2)b-P는 일반적으로 "링커" 또는 "링커 단위"로서 지칭될 수 있고, 이는 칼리케아마이신 탄두를 표적화제에 연결(예를 들어, 일련의 공유 결합을 통해)하는 것으로 이해될 것이다. 칼리케아마이신 및 링커는 함께 본원에 기재된 바와 같은 표적화제에 컨쥬게이션되는 페이로드를 구성한다.
특정 구현예에서, 링커는 분지화된 링커를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 표적화제는 항체를 포함할 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, D는 하기 화학식 3으로 나타낸 바와 같은 N-아세틸 칼리케아마이신을 포함할 것이다:
[화학식 3]
여기서, * 기호는 링커의 나머지 부분 및 궁극적으로는 표적화제(Ab)에 공유 결합되는 디술피드 보호 기를 나타낸다. 다른 바람직한 구현예 및 링커 성분 및 링커 구성은 하기에서 보다 상세히 논의될 것이다.
화학식 3과 관련하여, 예시된 화합물은 링커의 나머지 부분에 공유 결합되는 디술피드 보호 기(*로 표시됨)에 결합된 디술피드 N-아세틸 칼리케아마이신 유사체를 포함함을 인지할 것이다. 하기 실시예에 나타난 바와 같이, 디술피드 보호 기는 혈류 내의 디술피드 결합의 안정성을 개선시키고, 개시된 칼리케아마이신-링커 구성체의 효과적인 합성을 가능하게 한다. 표적(예를 들어, 암 세포)에 도달시, 절단가능한 모이어티(CM)는 절단되어 디술피드 보호 기를 통해 링커(예를 들어, X2 - 도 2 참조)의 부분에 부착된 칼리케아마이신을 방출시킬 것이다. 링커가 CM에서 초기에 절단되면, 칼리케아마이신에 부착된 링커의 나머지 부분은 생리학적 조건 하에 디술피드 결합의 절단점까지(바람직하게는 세포내에서) 분해된 후 재배열되어 활성 2가 라디칼 칼리케아마이신 종이 형성될 것이다. 이러한 형태의 칼리케아마이신 탄두가 세포 DNA의 좁은 홈에 결합되어 요망되는 세포독성 효과를 유도하는 것이다(그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Walker et al. Biochemistry 89: 4608-4612, 5/92] 참조). 도 1은, 설명을 위해 개개의 성분을 묘사한 본 발명의 디펩티드 칼리케아마이신-링커 구성체를 도시한 주석을 단 화학 구조를 제공한다.
어떤 경우에도 상기 언급된 화학식 2에 따른 컨쥬게이트가 많은 상이한 절단가능한 링커를 사용하여 제작될 수 있고, 이러한 컨쥬게이션 방법은 성분의 선택에 따라 달라질 것이다. 이와 같이, 칼리케아마이신과 회합된 화학식 2의 임의의 절단가능한 링커 화합물 및 개시된 표적화제의 반응성 잔기(예를 들어, 시스테인)는 본원의 교시내용과 상용성이다. 유사하게, 항체에 대한 선택된 칼리케아마이신-링커의, 자리-특이적 컨쥬게이션을 포함하는 컨쥬게이션을 가능하게 하는 임의의 반응 조건이 본 발명의 범위 내에 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 특히 바람직한 구현예는, 안정화제를 본원에 기재된 바와 같은 온화한 환원제와 조합하여 사용하는 유리 시스테인에 대한 칼리케아마이신-링커의 선택적 컨쥬게이션을 포함한다. 이러한 반응 조건은 보다 적은 비-특이적 컨쥬게이션 및 오염물 및 상응하게 보다 적은 독성을 갖는 보다 균질한 제조물을 제공하는 경향이 있다.
III
결정인자
먼저 본 발명의 칼리케아마이신 구성체 및 상응하는 항체 약물 컨쥬게이트가 임의의 특정 표적 또는 항원으로 제한되지 않음을 인지하는 것이 중요하다. 그보다는, 임의의 기존 항체 또는 본원에 기재된 바와 같이 생성될 수 있는 임의의 항체를 포함하는 임의의 표적화제가 신규한 칼리케아마이신-링커 구성체에 컨쥬게이션될 수 있음에 따라, 본 발명에 의해 제공되는 이점은 광범위하게 응용가능하고, 임의의 표적 항원(또는 결정인자)와 함께 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 신규한 칼리케아마이신-링커 구성체의 사용에 의해 부여되는 유리한 특성(예를 들어, 잠재적인 자리-특이적 컨쥬게이션, 증대된 컨쥬게이트 안정성 및 감소된 비-특이적 독성)은 특정 표적에 관계 없이 치료 항체에 광범위하게 응용가능하다. 따라서, 선택된 결정인자에 지향되는 특정 비-제한적 표적화제를 본 발명의 설명 및 이점의 입증을 위해 사용하였지만, 이들은 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위에 대하여 제한적인 것은 아니다.
따라서 당업자는, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트가, 임의의 선택된 결정인자를 특정적으로 인식하거나 그와 회합되는 임의의 표적화제(예를 들어, 항체)를 혼입할 수 있음을 인지할 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "결정인자"는, 특정 세포, 세포 개체군 또는 조직과 식별가능하게 연관된, 또는 이들 내에서 또는 이들 상에서 특정적으로 나타나는 임의의 검출가능한 특색, 특성, 마커 또는 인자를 의미한다. 결정인자는 성질상 모폴로지(morphology)적, 기능적 또는 생화학적일 수 있고, 일반적으로 표현형이다. 바람직한 특정 구현예에서, 결정인자는 그의 물리적 구조 및/또는 화학적 조성에 대하여 구별 변형된 단백질 또는 특정 조건(예를 들어, 특정 적소에서의 세포 또는 세포 사이클의 특정 지점) 하에 세포에 의해 또는 특정 세포 유형에 의해 구별 발현되는(상향-조절 또는 하향-조절되는) 단백질이다. 본 발명의 목적상, 결정인자는 바람직하게는 세포 표면 항원, 또는 화학적 변형, 제시 형태(예를 들어, 스플라이스 변이체), 시기 또는 양에 의해 입증되는 바와 같은 비-정상적 세포에 의해 구별 발현되는 단백질(들)을 포함한다. 특정 구현예에서, 결정인자는 SEZ6 단백질, 또는 그의 임의의 변이체, 이소형 또는 패밀리 구성원, 및 그의 특정 도메인, 영역 또는 에피토프를 포함할 수 있다. "면역 결정인자" 또는 "항원 결정인자" 또는 "면역원" 또는 "항원"은, 면역적격 동물 내로 도입시 면역 반응을 자극할 수 있고 면역 반응으로부터 생성된 항체에 의해 인식되는 폴리펩티드의 임의의 단편, 영역 또는 도메인을 의미한다. 본원에서 고려되는 결정인자는 그 존재(포지티브 결정인자) 또는 부재(네거티브 결정인자)에 의해 세포, 세포 부분개체군 또는 조직(예를 들어, 종양)을 식별할 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 개시된 항체 약물 컨쥬게이트는 SEZ6을 지향하는 항체를 포함할 것이다. SEZ6(또한 발작 관련 6 동족체로서 공지됨)은, 경련유발 펜틸렌테트라졸(Shimizu-Nishikawa, 1995, PMID: 7723619)로 처리된 마우스 대뇌 피질-유래 세포로부터 근원 클로닝된 유형 I 트랜스멤브레인 단백질이다. SEZ6은 2 개의 이소형을 갖고, 그 중 하나는 994 개의 아미노산 단백질(NP_849191)을 코딩하는 대략 4210 개의 염기(NM_178860)이고, 하나는 993 개의 아미노산 단백질 (NP_001092105)을 코딩하는 대략 4194 개의 염기(NM_001098635)이다. 이들은 이들의 ECD에서 단지 최종 10 개의 아미노산 잔기에 있어 상이하다. SEZ6은 2 개의 기타 다른 패밀리 구성원을 갖는다: SEZ6L 및 SEZ6L2. 용어 "SEZ6 패밀리는", SEZ6, SEZ6L, SEZ6L2 및 이들의 다양한 이소형을 지칭한다. 성숙 SEZ6 단백질은 일련의 구조적 도메인: 세포질 도메인, 트랜스멤브레인 도메인 및 세포외 도메인(독특한 N-말단 도메인을 포함함), 그 후 2 개의 교호 스시(Sushi) 및 CUB-유사 도메인, 및 3 개의 추가의 탠덤 스시 도메인 반복으로 구성된다. 인간 SEZ6 유전자에서의 돌연변이는, 열성 발작, 체온 상승과 관련된 경기 및 가장 통상적인 유형의 아동기 발작과 연관된다(Yu et al., 2007, PMID:17086543). 상동성 및 서열 분석에 의해 식별된 SEZ6 단백질의 구조적 모듈의 검토는, 신호전달, 세포-세포 소통, 및 신경 발달에서의 가능한 역할을 시사한다. 본 발명과 상용성인 항SEZ6 인간화된 항체는, SEZ6 항원으로 면역화된 마우스로부터 단리된 항체로부터, 그 전문이 본원에서 참조로 포함되는 WO2015/031541에 기재된 바와 같이 생성되었다.
IV
표적화제
A.
작용제 구조
상기에서 암시된 바와 같이, 본 발명의 특히 바람직한 구현예는 바람직하게는, 항체 형태의 표적화제, 또는 선택된 결정인자 상의 하나 이상의 에피토프와 우선적으로 회합되는 그의 면역반응성 단편을 갖는 개시된 컨쥬게이트를 포함한다. 항체 및 그의 변이체 및 유도체(허용된 명명법 및 번호부여 시스템 포함)는, 광범위하게 기재되어 있다(예를 들어, 문헌 [Abbas et al. (2010), Cellular and Molecular Immunology (6th Ed.), W.B. Saunders Company; 또는 Murphey et al. (2011), Janeway's Immunobiology (8th Ed.), Garland Science]).
본원에서 사용되는 바와 같이, "항체" 또는 "무손상 항체"는 통상적으로, 공유 디술피드 결합 및 비-공유 상호작용에 의해 함께 합쳐진 2 개의 중쇄(H) 및 2 개의 경쇄(L) 폴리펩티드 사슬을 포함하는 Y형 사량체 단백질을 지칭한다. 각각의 경쇄는 1 개의 가변 도메인(VL) 및 1 개의 불변 도메인(CL)으로 구성된다. 각각의 중쇄는 1 개의 가변 도메인(VH) 및 IgG, IgA, 및 IgD 항체의 경우, CH1, CH2, 및 CH3이라 불리는 3 개의 도메인을 포함하는(IgM 및 IgE는 제4 도메인, CH4를 가짐) 불변 영역을 포함한다. IgG, IgA, 및 IgD 부류에서, CH1 및 CH2 도메인은, 가변 길이(다양한 IgG 하위부류에서 약 10 개 내지 약 60 개의 아미노산)를 갖는 프롤린 및 시스테인 풍부 세그먼트는 유연성 힌지 영역에 의해 분리된다. 경쇄 및 중쇄 둘 다에서 가변 도메인은 약 12 개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 불변 도메인에 연결되고, 중쇄는 또한 약 10 개의 추가의 아미노산의 "D" 영역을 갖는다. 항체의 각각의 부류는 쌍을 이룬 시스테인 잔기에 의해 형성된 사슬간 및 사슬내 디술피드 결합을 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "항체"는 폴리클로날 항체, 멀티클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화된 및 영장류화된 항체, CDR 그래프팅된 항체, 인간 항체, 재조합 생성된 항체, 세포내항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 1가 항체, 다가 항체, 항유전자형 항체, 합성 항체(이들의 돌연변이 단백질 및 변이체 포함), 면역특이적 항체 단편, 예컨대 Fd, Fab, F(ab')2, F(ab') 단편, 단일쇄 단편(예를 들어, ScFv 및 ScFvFc); 및 Fc 융합 및 기타 다른 변형을 포함하는 이들의 유도체, 및 결정인자와의 우세한 회합 또는 결합을 나타내는 한 임의의 기타 다른 면역반응성 분자를 포함한다. 또한, 문맥적 제약에 의해 달리 언급되지 않는 한 상기 용어는 항체의 모든 부류(즉, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM) 및 모든 하위부류(즉, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2)를 추가로 포함한다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 통상적으로 각각 상응하는 소문자 그리스문자 α, δ, ε, γ, 및 μ로 나타내어진다. 유사하게, 임의의 척추동물 종으로부터 항체의 임의의 경쇄는, 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)라 불리는 두가지 명백히 별개의 유형 중 하나로 배정될 수 있다. 두가지 경쇄 모두 본원의 교시내용과 상용성이고, 개시된 항체 약물 컨쥬게이트의 제작에 사용될 수 있다.
항체의 가변 도메인은 하나의 항체로부터 또 다른 항체까지 아미노산 조성의 상당한 변화를 나타내고, 이는 주로 항원 인식 및 결합에 대한 원인이 된다. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은, 무손상 IgG 항체가 2 개의 결합 자리를 갖도록 하는 항체 결합 자리를 형성한다(즉, 이는 2가임). VH 및 VL 도메인은, 골격 영역(FR)으로서 공지된 4 개의 보다 덜 가변성인 영역에 의해 프레임화되고 분리된, 극심한 가변성을 갖는 3 개의 영역(이들은 초가변 영역이라 불림), 또는 보다 통상적으로는, 상보성-결정 영역(CDR)을 포함한다. VH와 VL 영역 사이의 비-공유 회합은 항체의 2 개의 항원-결합 자리 중 하나를 함유하는 Fv 단편("가변성 단편")을 형성한다. 유전 공학에 의해 얻어질 수 있는 ScFv 단편(가변성 단일쇄 단편)은 단일 폴리펩티드 사슬 내에서 회합되고, 여기서 항체의 VH 및 VL 영역은 펩티드 링커에 의해 분리된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 각각의 도메인, 골격 영역 및 CDR로의 아미노산의 배정은, 달리 언급되지 않는 한, 문헌 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th Ed.), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242]; [Chothia et al., 1987, PMID: 3681981]; [Chothia et al., 1989, PMID: 2687698]; [McCallum et al.,1996, PMID: 8876650]; 또는 [Dubel, Ed. (2007) Handbook of Therapeutic Antibodies, 3rd Ed., Wily-VCH Verlag GmbH and Co or AbM (Oxford Molecular/MSI Pharmacopia)]에 의해 제공되는 번호부여 체계 중 하나에 따를 수 있다. 아비시스(Abysis) 웹사이트 데이터베이스(하기 참조)로부터 얻어지는 카바트, 코티아(Chothia), 맥칼럼(MacCallum)(또한 콘택트(Contact)로서 공지됨) 및 AbM에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산 잔기를 하기에 기재하였다.
항체 서열에서 가변 영역 및 CDR은, 당업계에서 개발된 일반적 법칙에 따라(상기에 기재된 바와 같음, 예컨대 카바트 번호부여 시스템) 또는 공지된 가변 영역의 데이터베이스에 대하여 서열을 정렬시킴으로써 식별될 수 있다. 이들 영역의 식별 방법은 문헌 [Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001] 및 [Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000]에 기재되어 있다. 항체 서열의 예시적 데이터베이스는, www.bioinf.org.uk/abs의 "아비시스" 웹사이트(마틴(A.C. Martin)(Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London; 영국 런던)에 의해 유지됨) 및 www.vbase2.org의 VBASE2 웹사이트(문헌 [Retter et al., Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671 -D674 (2005)]에 기재됨)에 기재되어 있고, 이를 통해 접근될 수 있다. 바람직하게는 서열은, 카바트, IMGT 및 단백질 데이터 뱅크(PDB)로부터의 서열 데이터를 PDB으로부터의 구조 데이터와 통합하는 아비시스 데이터베이스를 사용하여 분석된다. 문헌 [Dr. Andrew C. R. Martin's book chapter Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547, 웹사이트 bioinforg.uk/abs 상에서도 이용가능함)] 참조. 아비시스 데이터베이스 웹사이트는 추가로, 본원의 교시내용에 따라 사용될 수 있는 CDR의 식별을 위해 개발된 일반적 법칙을 포함한다. 달리 기재되지 않는 한, 본원에 기재된 임의의 CDR은 카바트 등에 따른 아비시스 데이터베이스 웹사이트에 따라 유래된 것이다.
본 발명에서 논의된 중쇄 불변 영역 아미노산 위치에 대하여, 번호부여는, 보고에 따르면 최초 인간 IgG1 서열화된 골수종 단백질 Eu의 아미노산 서열을 기재하는 문헌 [Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1): 78-85]에 최초로 기재된 Eu 인덱스에 따른다. 에델만(Edelman)의 EU 인덱스는 또한 카바트 등의 1991년 문헌(상기 참조)에 기재되어 있다. 따라서, 중쇄와 관련하여 용어 "카바트에 기재된 EU 인덱스" 또는 "카바트의 EU 인덱스" 또는 "EU 인덱스"는 카바트 등의 1991년 문헌(상기 참조)에 기재된 에델만 등의 인간 IgG1 Eu 항체에 기초한 잔기 번호부여 시스템을 지칭한다. 경쇄 불변 영역 아미노산 서열에 사용되는 번호부여 시스템도 카바트 등의 문헌(상기 참조)에 유사하게 기재되어 있다. 본 발명과 상용성인 예시적 카파 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 하기에 기재하였다(하기에서 논의되는 바와 같은 유리 시스테인을 포함할 수 있는 C214 위치는 밑줄표시함).
유사하게, 본 발명과 상용성인 예시적 IgG1 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 하기에 기재하였다(하기에서 논의되는 바와 같은 유리 시스테인을 포함할 수 있는 C220 위치는 밑줄표시함).
개시된 불변 영역 서열, 또는 이들의 변형물 또는 유도체는, 본 발명의 ADC에 혼입될 수 있는 전장 항체를 제공하도록 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 작동가능하게 회합될 수 있다.
당업자는, 면역글로불린 분자 내에는 두가지 유형의 디술피드 브릿지 또는 결합: 사슬간 및 사슬내 디술피드 결합이 존재함을 인지할 것이다. 널리 공지된 바와 같이, 사슬간 디술피드 결합의 위치 및 수는 면역글로불린 부류 및 종에 따라 달라진다. 본 발명은 임의의 특정 부류 또는 하위부류의 항체로 제한되지 않지만, 예시 목적을 위해 본 개시내용 전반에 걸쳐 IgG1 면역글로불린이 일반적으로 사용될 것이다. 야생형 IgG1 분자에서는, 12 개의 사슬내 디술피드 결합(4 개는 각각의 중쇄 상에, 또한 2 개는 각각의 경쇄 상에) 및 4 개의 사슬간 디술피드 결합이 존재한다. 사슬내 디술피드 결합은 일반적으로 어느 정도 보호되고, 사슬간 결합에 비해 환원에 대해 비교적 덜 민감하다. 역으로, 사슬간 디술피드 결합은 면역글로불린의 표면 상에 위치하고, 용매에 접근가능하며, 통상적으로 비교적 쉽게 환원된다. 2 개의 사슬간 디술피드 결합이 중쇄 사이에 존재하고, 각각의 중쇄로부터의 것이 그의 각각의 경쇄에 대하여 존재한다. 사슬간 디술피드 결합은 중쇄 및 경쇄 회합에 있어 필수적이지 않음이 입증되었다. IgG1 힌지 영역은, Fab 운동을 용이하게 하는 유연성과 함께 구조적 지지를 제공하는, 사슬간 디술피드 결합을 형성하는 중쇄 내 시스테인을 함유한다. 증쇄/중쇄 IgG1 사슬간 디술피드 결합은 잔기 C226 및 C229(Eu 번호부여)에 존재하며, IgG1의 경쇄와 중쇄 사이의 IgG1 사슬간 디술피드 결합(중쇄/경쇄)은 카파 또는 람다 경쇄의 C214와 중쇄의 상부 힌지 영역의 C220 사이에 형성된다.
B. 항체 생성 및 제조
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 각종 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
1. 숙주 동물에서의 폴리클로날 항체의 생성
다양한 숙주 동물에서의 폴리클로날 항체의 생성은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane (Eds.) (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press]; 및 [Harlow et al. (1989) Antibodies, NY, Cold Spring Harbor Press] 참조). 폴리클로날 항체를 생성하기 위해, 면역적격 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 비-인간 영장류 등)을 항원 단백질 또는 항원 단백질을 포함하는 세포 또는 제조물로 면역화한다. 일정 기간 후, 폴리클로날 항체-함유 혈청을 동물의 출혈 또는 희생에 의해 얻는다. 혈청은 동물로부터 얻은 형태로 사용할 수 있거나, 또는 항체를 부분 또는 완전 정제하여 면역글로불린 분획 또는 단리된 항체 제조물을 얻을 수 있다.
임의의 형태의 항원, 또는 항원을 함유하는 세포 또는 제조물을 사용하여 결정인자에 대해 특이적인 항체를 생성할 수 있다. 용어 "항원"은 광범위한 의미로 사용되고, 단일 에피토프, 다중 에피토프, 단일 또는 다중 도메인 또는 전체 세포외 도메인(ECD)을 포함하는 선택된 표적의 임의의 면역성 단편 또는 결정인자를 포함할 수 있다. 항원은 단리된 전장 단백질, 세포 표면 단백질(예를 들어, 표면 상에서 항원의 적어도 일부를 발현하는 세포로 면역화됨), 또는 가용성 단백질(예를 들어, 단백질의 단지 ECD 부분으로 면역화됨)일 수 있다. 항원은 유전적으로 변형된 세포에서 생성될 수 있다. 상기 언급된 항원 중 임의의 것이 단독으로 또는 당업계에 공지된 하나 이상의 면역성 증대 애주번트와 조합되어 사용될 수 있다. 항원을 코딩하는 DNA는 게놈형 또는 비-게놈형(예를 들어, cDNA)일 수 있고, 이는 면역 반응을 유도하기에 충분한 ECD의 적어도 일부를 코딩할 수 있다. 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 플라스미드, 및 비-바이러스 벡터, 예컨대 양이온성 지질을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 벡터를 사용하여 항원이 발현되는 세포를 형질전환시킬 수 있다.
2. 모노클로날 항체
선택된 구현예에서, 본 발명은 모노클로날 항체의 사용을 고려한다. 용어 "모노클로날 항체" 또는 "mAb"는 실질적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 얻어진 항체를 지칭하며, 즉 개체군을 구성하는 개개의 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이(예를 들어, 천연 돌연변이)를 제외하고는 동일하다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 기법, 재조합 기법, 파지 디스플레이 기법, 트랜스제닉 동물(예를 들어, 제노마우스(XenoMouse)®) 또는 이들의 조합을 포함하는 매우 다양한 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구현예에서 모노클로날 항체는, 문헌 [An, Zhigiang (ed.) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley and Sons, 1st ed. 2009]; [Shire et. al. (eds.) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Springer Science + Business Media LLC, 1st ed. 2010]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988]; [Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]에 보다 상세히 기재된 바와 같은 하이브리도마 및 생화학 및 유전 공학 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 결정인자에 특이적으로 결합되는 많은 모노클로날 항체의 생성에 따라, 특히 적합한 항체는, 예를 들어, 내재화의 속도 또는 결정인자에 대한 친화성에 기초하여, 다양한 스크리닝 방법을 통해 선택될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 생성된 모노클로날 항체는 "공급원" 항체로서 사용될 수 있고, 이는, 예를 들어, 표적에 대한 친화성의 개선, 세포 배양에서의 그의 생성 개선, 생체 내 면역성 감소, 다중특이적 구성체 생성 등을 위해 추가로 변형될 수 있다.
3. 인간 항체
항체는 완전 인간 항체를 포함할 수 있다. 용어 "인간 항체"는, 인간에 의해 생성된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나, 하기에 기재되는 인간 항체의 제조를 위한 임의의 기법을 사용하여 제조된 항체(바람직하게는 모노클로날 항체)를 지칭한다.
하나의 구현예에서, 재조합 인간 항체는, 파지 디스플레이를 사용하여 제조된 재조합 복합적 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 하나의 구현예에서, 라이브러리는, B-세포로부터 단리된 mRNA로부터 제조된 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 생성된, scFv 파지 또는 이스트 디스플레이 라이브러리이다.
인간 항체는 또한, 인간 면역글로불린 유전자좌를 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화되고 인간 면역글로불린 유전자가 도입된 마우스 내로 도입함으로써 제조될 수 있다. 시험감염에 따라, 유전자 재배열, 어셈블리, 및 완전한 인간 항체 레퍼토리를 포함하여, 모든 면에서 인간에서 나타나는 것과 가깝게 닮은 항체 생성이 나타난다. 이러한 접근은, 예를 들어, U.S.P.N. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, 및 U.S.P.N. 6,075,181 및 6,150,584(제노마우스® 기술 관련); 및 문헌 [Lonberg and Huszar, 1995, PMID: 7494109]에 기재되어 있다. 대안적으로, 인간 항체는 표적 항원에 대항하여 지향된 항체를 생성하는 인간 B 림프구의 불멸화를 통해 제조될 수 있다(이러한 B 림프구는 신생 장애를 갖는 개체로부터 회수될 수 있거나, 또는 시험관내에서 면역화될 수 있음). 예를 들어, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al., 1991, PMID: 2051030]; 및 U.S.P.N. 5,750,373 참조. 기타 다른 모노클로날 항체와 같이, 이러한 인간 항체가 공급원 항체로서 사용될 수 있다.
4. 유도 항체:
상기에 기재된 바와 같이 공급원 항체가 생성되고 선택되고 단리되면, 이들은 개선된 제약학적 특징을 갖는 본 발명과 상용성인 항체를 제공하도록 추가로 변경될 수 있다. 바람직하게는 요망되는 치료 특성을 갖는 유도 항체를 제공하도록 공지된 분자 공학 기법을 사용하여 공급원 항체를 변형 또는 변경시킬 수 있다.
4.1
키메라 및 인간화된 항체
본 발명의 선택된 구현예는 선택된 결정인자(예를 들어, SEZ6)에 면역특이적으로 결합되는 뮤린 모노클로날 항체를 포함하고, 본 개시내용의 목적상, 이는 "공급원" 항체로 고려될 수 있다. 선택된 구현예에서, 본 발명과 상용성인 항체는 공급원 항체의 불변 영역 및/또는 항원 결합 아미노산 서열의 선택적 변형을 통해 이러한 공급원 항체로부터 유도될 수 있다. 특정 구현예에서, 공급원 항체 중의 선택된 아미노산이 결실, 돌연변이, 치환, 통합 또는 조합을 통해 변경되는 경우, 공급원 항체로부터 항체가 유도된다. 또 다른 구현예에서, "유도" 항체는, 유도체 항체(예를 들어, 키메라 또는 인간화된 항체)를 제공하도록 공급원 항체의 단편(예를 들어, 하나 이상의 CDR 또는 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역)이 수용체 항체 서열과 조합되거나 이들로 혼입된 것이다. 이들 유도 항체는, 결정인자에 대한 친화성 개선; 항체 안정성 개선; 세포 배양에서의 생산 및 수율 개선; 생체 내 면역성 감소; 독성 감소; 활성 모이어티의 컨쥬게이션 용이화; 또는 다중특이적 항체 생성 등을 위해 하기에 기재되는 바와 같은 표준 분자 생물 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 항체는 또한, 화학적 수단 또는 번역후 변형에 의한 성숙 분자의 변형(예를 들어, 글리코실화 또는 페길화)을 통해 공급원 항체로부터 유도될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 키메라 항체는, 공유 연결된 적어도 두가지 상이한 종 또는 부류의 항체로부터의 단백질 세그먼트로부터 유도된 키메라 항체를 포함한다. 용어 "키메라" 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터의 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 구성체에 관한 것이며, 사슬(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터의 또는 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체뿐만 아니라, 이러한 항체의 단편에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다(U.S. P.N. 4,816,567; Morrison et al., 1984, PMID: 6436822). 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 키메라 항체는 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 선택된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 전부 또는 대부분을 포함할 수 있다. 다른 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명과 상용성인 항체는 본원에 개시된 마우스 항체로부터 "유도될" 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 키메라 항체는 "CDR 그래프팅된" 항체이고, 여기서 CDR(카바트, 코티아, 맥칼럼 등을 사용하여 정의됨)은 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하며, 항체의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터의 또는 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체로부터 유래된다. 인간에서의 사용을 위해, 하나 이상의 선택된 설치류 CDR(예를 들어, 마우스 CDR)을 인간 수용체 항체 내로 그래프팅하여, 인간 항체의 천연 CDR 중 하나 이상을 대체할 수 있다. 이들 구성체는 일반적으로, 전강도 인간 항체 기능, 예를 들어, 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 제공하면서 대상체에 의한 항체에 대한 원치않는 면역 반응을 감소시킨다는 이점을 갖는다. 특히 바람직한 구현예에서, CDR 그래프팅된 항체는 인간 골격 서열 내에 혼입된 마우스로부터 얻어진 하나 이상의 CDR을 포함할 것이다.
"인간화된" 항체는 CDR-그래프팅된 항체와 유사하다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "인간화된" 항체는, 하나 이상의 비-인간 항체(공여체 또는 공급원 항체)로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 서열(예를 들어, CDR 서열)을 포함하는 인간 항체(수용체 항체)이다. 특정 구현예에서, "역 돌연변이"가 인간화된 항체 내로 도입될 수 있으며, 여기서는 수용자 인간 항체의 가변 영역의 하나 이상의 FR 내의 잔기가 비-인간 종 공여체 항체부터 상응하는 잔기로 대체된다. 이러한 역 돌연변이는 그래프팅된 CDR(들)의 적절한 3차원 구성을 유지하도록 돕고, 이로써 친화성 및 항체 안정성을 개선시킬 수 있다. 비-제한적으로 마우스, 래트, 토끼, 또는 비-인간 영장류를 포함하는 다양한 공여체 종으로부터의 항체가 사용될 수 있다. 또한, 인간화된 항체는, 예를 들어, 항체 성능을 추가로 세밀화하기 위해, 추가의 수용자 항체 또는 공여체 항체에서 나타나지 않는 새로운 잔기를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 선행 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 본 발명과 상용성이며 하기 실시예에 기재된 공급원 뮤린 항체를 포함하는 CDR 그래프팅된 및 인간화된 항체가 쉽게 제공될 수 있다.
관련 분야에 인식되어 있는 다양한 기법을 추가로 사용하여, 본 발명에 따른 인간화된 구성체를 제공하기 위해 수용체 항체로서 어떠한 인간 서열을 사용할지를 결정할 수 있다. 상용성 인간 생식라인 서열의 종합 및 수용체 서열로서의 이들의 적합성을 결정하는 방법은, 예를 들어, 문헌 [Tomlinson, I. A. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798]; [Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today 16: 237-242]; [Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817]; 및 [Tomlinson et al. (1995) EMBO J 14:4628-4638]에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 인간 면역글로불린 가변 영역 서열의 포괄적 디렉토리(톰린슨(Tomlinson, I. A.) 등(MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)에 의해 종합됨)를 제공하는 V-BASE 디렉토리(VBASE2 - Retter et al., Nucleic Acid Res. 33; 671-674, 2005)를 사용하여 상용성 수용체 서열을 식별할 수도 있다. 추가로, 예를 들어, U.S.P.N. 6,300,064에 기재된 공통 인간 골격 서열이 또한 상용성 수용체 서열인 것으로 판명될 수 있고, 이것이 본 교시내용에 따라 사용될 수 있다. 일반적으로, 인간 골격 수용체 서열은, 공급원 및 수용체 항체의 CDR 정준 구조의 분석과 함께 뮤린 공급원 골격 서열과의 상동성에 기초하여 선택된다. 이에 따라, 유도 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유도 서열을 관련 분야에 인식된 기법을 사용하여 합성할 수 있다.
예를 들어 CDR 그래프팅된 및 인간화된 항체, 및 연관 방법은 U.S.P.N. 6,180,370 및 5,693,762에 기재되어 있다. 추가의 상세사항에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Jones et al., 1986, PMID: 3713831]; 및 U.S.P.N. 6,982,321 및7,087,409를 참조한다.
인간 수용체 가변 영역에 대한 CDR 그래프팅된 또는 인간화된 항체 가변 영역의 서열 동일성 또는 상동성은 본원에서 논의된 바와 같이 측정될 수 있고, 이와 같이 측정시, 이는 바람직하게는 적어도 60% 또는 65% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 서열 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 93%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유할 것이다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은, 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2 개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 치환의 보존적 성질에 대한 보정을 위해 퍼센트 서열 동일성 또는 유사도를 상향 조정할 수 있다.
4.2 자리-특이적 항체
본 발명의 항체는 칼리케아마이신-링커 구성체에 대한 컨쥬게이션을 용이하게 하도록 조작될 수 있다. 항체 약물 컨쥬게이트 제조물은 항체 상의 세포독소의 위치 및 약물 대 항체 비율(DAR)에 있어 ADC 분자의 균질한 개체군을 포함하는 것이 유리하다. 본 개시내용에 기초하여, 당업자는 본원에 기재된 바와 같이 자리-특이적 조작된 구성체를 용이하게 제작하고 이들을 칼리케아마이신-링커 구성체에 선택적으로 컨쥬게이션시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "자리-특이적 항체" 또는 "자리-특이적 구성체"는, 중쇄 또는 경쇄 내의 적어도 하나의 아미노산이 결실되거나 변경되거나 또는 치환되어(바람직하게는 또 다른 아미노산으로) 적어도 하나의 유리 시스테인을 제공하는 항체, 또는 그의 면역반응성 단편을 의미한다. 유사하게, "자리-특이적 컨쥬게이트"는 쌍을 이루지 않은 시스테인(들)에 컨쥬게이션된 자리-특이적 항체 및 적어도 하나의 칼리케아마이신 화합물을 포함하는 ADC를 의미하는 것으로 여겨질 것이다. 특정 구현예에서, 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기는 쌍을 이루지 않은 사슬내 잔기를 포함할 것이다. 다른 바람직한 구현예에서, 유리 시스테인 잔기는 쌍을 이루지 않은 사슬간 시스테인 잔기를 포함할 것이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 또한 하기에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 쌍을 이루지 않은 또는 유리 시스테인은 선택된 항체 또는 그의 면역반응성 단편에 존재하는 임의의 잔기 자리에서 조작될 수 있다(즉, 이러한 자리는 고유적 천연 디술피드 결합의 파괴를 필요로 하지 않음). 조작된 항체는 다양한 동형의 것일 수 있고(예를 들어, IgG, IgE, IgA 또는 IgD); 이들 부류 내에서 항체는 다양한 하위부류의 것일 수 있다(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4). IgG 구성체에서, 항체의 경쇄는, 바람직한 구현예에서는, IgG1 중쇄 내의 C220 잔기의 부재로 인해 쌍을 이루지 않을 수 있는, C214를 각각 혼입한 카파 또는 람다 동형을 포함할 수 있다.
미리 선택된 자리에 유리 시스테인을 도입하든 또는 고유적 디술피드 결합을 파괴하든, 본원에 기재된 바와 같은 항체의 조작은, 약물 대 항체 비율("DAR")이 주로 정확하게 고정되어 실질적으로 DAR 균질 제조물을 생성할 수 있게 하는 칼리케아마이신의 조절된 화학량론적 컨쥬게이션을 제공한다. 또한, 개시된 자리-특이적 구성체는 추가로, 항체 상의 페이로드의 위치에 있어 실질적으로 균질한 제조물을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같은 안정화제를 사용하는 조작된 구성체의 선택적 컨쥬게이션은 요망되는 DAR 종 백분율을 증가시키고, 제작된 쌍을 이루지 않은 또는 유리 시스테인 자리와 함께, 칼리케아마이신의 의도하지 않은 침출에 의해 발생하는 비-특이적 독성을 감소시키는 컨쥬게이트 안정성 및 균질성을 부여한다. 유리 시스테인의 선택적 컨쥬게이션 및 제조물의 상대적 균질성(컨쥬게이션 위치 및 DAR 둘 다에서)에 의해 제공된 이러한 독성 감소는 또한, 종양 자리에서의 칼리케아마이신 페이로드 수준 증가를 가능하게 하는 증대된 치료 지수를 제공한다. 추가로, 생성된 자리-특이적 컨쥬게이트를 선택적으로 다양한 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제함으로써, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 심지어 95% 초과의 요망되는 DAR 종(예를 들어, DAR=2)을 포함하는 매우 균질한 자리-특이적 컨쥬게이트 제조물을 제공할 수 있다. 이러한 컨쥬게이트 균질성은, 독성을 증가시킬 수 있는 원치않는 보다 높은 DAR 컨쥬게이트 불순물(이는 비교적 불안정할 수 있음)을 제한함으로써 개시된 제조물의 치료 지수를 추가로 증가시킬 수 있다.
개시된 조작된 컨쥬게이트 제조물에 의해 나타나는 유리한 특성은, 적어도 부분적으로, 컨쥬게이션을 특정적으로 지향하고 제작된 컨쥬게이트를 주로 칼리케아마이신 위치 및 절대적 DAR에 있어 제한하는 능력에 기초하여 설명됨을 인지할 것이다. 대부분의 종래의 ADC 제조물과 달리, 본 발명의 바람직한 구현예는 랜덤 컨쥬게이션 자리를 제공하는 항체의 부분적 또는 전체적 환원 및 DAR 종의 비교적 비-제어된 생성에 전적으로 의존하지 않는다. 그보다는, 본 발명의 선택된 구현예는, 천연(즉, "고유적") 사슬간 또는 사슬내 디술피드 브릿지 중 하나 이상을 파괴하거나 또는 임의의 위치에서 시스테인 잔기를 도입하도록 표적화 항체를 조작함으로써 하나 이상의 미리 정해진 쌍을 이루지 않은(또는 유리) 시스테인 자리를 제공한다. 후자의 경우, 선택된 구현예에서, 시스테인 잔기는 표준 분자 공학 기법을 사용하여 항체(또는 그의 면역반응성 단편) 중쇄 또는 경쇄를 따라 또는 그에 부속되어 임의의 위치에서 혼입될 수 있음을 인지할 것이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 고유적 디술피드 결합의 파괴는, 이후에 컨쥬게이션 자리로서 사용될 수 있는 다중 유리 시스테인을 제공하도록 비-고유적 시스테인의 도입과 조합되어 수행될 수 있다.
(고유적 디술피드 결합의 파괴와 대조적으로) 유리 시스테인을 제공하기 위한 시스테인 잔기(들)의 도입 또는 첨가와 관련하여, 항체 또는 항체 단편 상의 상용성 위치(들)는 당업자에 의해 쉽게 파악될 수 있다. 따라서, 선택된 구현예에서, 시스테인(들)은, 요망되는 DAR, 항체 구성체, 선택된 칼리케아마이신-링커 및 항체 표적에 따라 CH1 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인 또는 임의의 이들의 조합에 도입될 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 시스테인은 카파 또는 람다 CL 도메인 내로, 또한 특히 바람직한 구현예에서, CL 도메인의 c-말단 영역에 도입될 수 있다. 각 경우에, 분자 안정성, 컨쥬게이션 효율을 용이하게 하거나 또는 부착시 칼리케아마이신 페이로드에 대한 보호 환경을 제공하도록 시스테인 삽입 자리에 근접한 기타 다른 아미노산 잔기가 변경, 제거 또는 치환될 수 있다. 특정 구현예에서, 치환된 잔기는 항체의 임의의 접근가능한 자리에서 나타난다. 이러한 표면 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기는 항체 상의 쉽게 접근가능한 자리에 배치되고, 본원에 추가로 기재된 바와 같이 선택적으로 환원될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "유리 시스테인" 또는 "쌍을 이루지 않은 시스테인"은 문맥에서 달리 지시되지 않는 한 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 이는, 동일한 항체 상의 또 다른 시스테인과 고유적 디술피드 브릿지를 형성하지 않는, 자연적으로 존재하거나 또는 분자 공학 기법을 사용하여 선택된 잔기 위치 내에 특정적으로 혼입된, 항체의 임의의 시스테인 구성성분을 의미한다. 따라서, 바람직한 특정 구현예에서, 유리 시스테인은, 생리학적 조건 하에 천연 디술피드 브릿지를 파괴하여 쌍을 이루지 않은 시스테인이 자리-특이적 컨쥬게이션에 적합하게 되도록 하기 위해 고유적 사슬간 또는 사슬내 디술피드 브릿지 파트너가 치환되거나 제거되거나 또는 다른 방식으로 변경된 천연 시스테인을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 유리 또는 쌍을 이루지 않은 시스테인은 항체 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열 내의 미리 정해진 자리에 선택적으로 위치하는 시스테인 잔기를 포함할 것이다. 컨쥬게이션 전에, 유리 또는 쌍을 이루지 않은 시스테인은, 시스템의 산화 상태에 따라 동일한 항체 상의 또 다른 유리 시스테인과 함께 티올로서(환원된 시스테인), 캡핑된 시스테인으로서(산화된) 또는 비-천연 분자내 디술피드 결합으로서 (산화된) 존재할 수 있음을 인지할 것이다. 하기에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 이러한 항체 구성체의 온화한 환원은 자리-특이적 컨쥬게이션에 이용가능한 티올을 제공할 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, 유리 또는 쌍을 이루지 않은 시스테인(천연이든 혼입된 것이든)은 선택적 환원 및 후속 칼리케아마이신 컨쥬게이션에 적용되어 개시된 균질한 DAR 조성물을 제공할 것이다.
일부 구현예에서는, 사슬간 시스테인 잔기가 결실된다. 다른 구현예에서는, 사슬간 시스테인이 또 다른 아미노산(예를 들어, 천연 아미노산)에 대해 치환된다. 예를 들어, 아미노산 치환은 중성(예를 들어, 세린, 트레오닌 또는 글리신) 또는 친수성(예를 들어, 메티오닌, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신) 잔기로의 사슬간 시스테인의 대체를 제공할 수 있다. 하나의 특히 바람직한 구현예에서, 사슬간 시스테인은 세린으로 대체된다.
일부 구현예에서는, 결실된 또는 치환된 시스테인 잔기가 경쇄(카파 또는 람다) 상에 있고, 이로써 유리 시스테인을 중쇄 상에 남기는 것이 본 발명에 의해 고려된다. 다른 구현예에서, 결실된 또는 치환된 시스테인 잔기는 중쇄 상에 있어 유리 시스테인을 경쇄 불변 영역 상에 남긴다. 어셈블리시, 무손상 항체의 경쇄 또는 중쇄 내의 단일 시스테인의 결실 또는 치환은 2 개의 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 갖는 자리-특이적 항체를 형성함을 인지할 것이다.
하나의 특히 바람직한 구현예에서는, IgG 경쇄 (카파 또는 람다)의 위치 214의 시스테인(C214)이 결실되거나 치환된다. 또 다른 바람직한 구현예에서는, IgG 중쇄 상의 위치 220의 시스테인(C220)이 결실되거나 치환된다. 추가의 구현예에서, 중쇄 상의 위치 226 또는 위치 229의 시스테인이 결실되거나 치환된다. 하나의 구현예에서, 중쇄 상의 C220이 세린(C220S)으로 치환되어 경쇄 내에 요망되는 유리 시스테인을 제공한다. 이러한 조작된 구성체가 하기 실시예에서 사용되어 본원의 교시내용과 상용성인 신규한 항체 약물 컨쥬게이트를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 경쇄 내의 C214는 세린(C214S)으로 치환되어 중쇄 내의 요망되는 유리 시스테인을 제공한다. 이들 바람직한 구성체의 요약을 하기 표 2에 나타내었고, 여기서 모든 번호부여는 카바트에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 따르고, WT는 변경이 없는 "야생형" 또는 고유적 불변 영역 서열을 나타내고, 델타(Δ)는 아미노산 잔기의 결실을 나타낸다(예를 들어, C214Δ는 위치 214의 시스테인이 결실되었음을 나타냄).
(고유적 디술피드 결합의 파괴와 대조적으로) 유리 시스테인을 제공하기 위한 시스테인 잔기(들)의 도입 또는 첨가와 관련하여, 항체 또는 항체 단편 상의 상용성 위치(들)는 당업자에 의해 쉽게 파악될 수 있다. 따라서, 선택된 구현예에서, 시스테인(들)은, 요망되는 DAR, 항체 구성체, 선택된 페이로드 및 항체 표적에 따라 CH1 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인 또는 임의의 이들의 조합에 도입될 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 시스테인은 카파 또는 람다 CL 도메인 내로, 또한 특히 바람직한 구현예에서, CL 도메인의 c-말단 영역에 도입될 수 있다. 각 경우에, 분자 안정성, 컨쥬게이션 효율을 용이하게 하거나 또는 부착시 페이로드에 대한 보호 환경을 제공하도록 시스테인 삽입 자리에 근접한 기타 다른 아미노산 잔기가 변경, 제거 또는 치환될 수 있다. 특정 구현예에서, 치환된 잔기는 항체의 임의의 접근가능한 자리에서 나타난다. 이러한 표면 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기는 항체 상의 쉽게 접근가능한 자리에 배치되고, 본원에 추가로 기재된 바와 같이 선택적으로 환원될 수 있다. 특정 구현예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 자리에서 나타난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기는 항체의 접근가능한 자리에 배치되고, 항체를 선택적으로 컨쥬게이션시키는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 하기 잔기 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카바트 번호부여); 중쇄의 A118(Eu 번호부여); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(Eu 번호부여). 추가의 치환 위치 및 상용성 자리-특이적 항체의 제작 방법은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 U.S.P.N. 7,521,541에 기재되어 있다.
자리-특이적 구성체가 제공되면, 무손상 고유적 디술피드 브릿지를 실질적으로 파괴하지 않으면서 본원에 개시된 신규한 기법을 사용하여 생성된 유리 시스테인을 선택적으로 환원시켜, 대부분 선택된 시스테인 자리에서 반응성 티올을 제공할 수 있다. 이어서, 이들 제조된 티올을, 실질적인 비-특이적 컨쥬게이션 없이 개시된 칼리케아마이신-링커 구성체와의 지향된 컨쥬게이션에 적용한다. 즉, 조작된 구성체 및, 선택적으로, 본원에 개시된 선택적 환원 기법을 사용하여 칼리케아마이신 페이로드의 비-특이적 랜덤 컨쥬게이션을 주로 제거할 수 있다. 중요하게 이는 DAR 종 분포 및 표적화 항체 상의 칼리케아마이신 위치 둘 다에서 실질적으로 균질한 제조물을 제공한다. 하기에서 논의되는 바와 같이 비교적 높은 DAR 오염물의 제거는, 그 자체로, 비-특이적 독성을 감소시키고 제조물의 치료 지수를 확장시킬 수 있다. 또한, 이러한 선택성은 칼리케아마이신 페이로드가, 칼리케아마이신-링커 구성체가 종양에 도달될 때까지 어느 정도 보호되지만 전달시 적합하게 제시되고 처리되는 특히 유리한 미리 정해진 위치(예컨대, 경쇄 불변 영역의 말단 영역)에 주로 배치될 수 있게 한다. 따라서, 특이적 칼리케아마이신 페이로드 위치조절을 용이하게 하는 조작된 항체의 디자인을 사용하여 개시된 제조물의 비-특이적 독성을 감소시킬 수 있다. 마지막으로, 항체의 컨쥬게이션을 선택적으로, 또한 재현가능하게 지향시키는 능력은 생성된 조성물의 특성화를 매우 단순화시키고, 이로써 약물 개발을 용이하게 한다.
이들 미리 정해진 유리 시스테인 자리의 생성은, 항체 상의 미리 선택된 자리에 시스테인을 도입하기 위한 또는 디술피드 결합의 구성성분 시스테인 잔기 중 하나를 제거하거나 변경하거나 또는 대체하기 위한 관련 분야에 인식된 분자 공학 기법을 사용하여 달성될 수 있음을 인지할 것이다. 이들 기법을 사용하여 당업자는, 임의의 항체 부류 또는 동형이 본 발명에 따라 선택적으로 컨쥬게이션될 수 있는 하나 이상의 유리 시스테인(들)을 나타내도록 조작될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 선택된 항체는 요망되는 DAR에 따라 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 심지어 8 개의 유리 시스테인을 특정적으로 나타내도록 조작될 수 있다. 보다 바람직하게는, 선택된 항체는 2 개 또는 4 개의 유리 시스테인을 함유하도록, 또한 훨씬 더 바람직하게는 2 개의 유리 시스테인을 함유하도록 조작될 것이다. 또한, 유리 시스테인은 비-특이적 독성을 감소시키면서 표적에 대한 컨쥬게이션된 칼리케아마이신의 전달을 용이하게 하도록 조작된 항체 내에 위치할 수 있음을 인지할 것이다. 이와 관련하여, IgG1 항체를 포함하는 본 발명의 선택된 구현예는 칼리케아마이신 페이로드를 CH1 도메인 상에, 또한 보다 바람직하게는 도메인의 C-말단 단부 상에 배치할 것이다. 다른 바람직한 구현예에서, 항체 구성체는 칼리케아마이신을 경쇄 불변 영역 상에, 또한 보다 바람직하게는 불변 영역의 C-말단 단부 상에 배치하도록 조작될 것이다.
중요하게, 페이로드 컨쥬게이션을 조작된 유리 시스테인으로 제한하는 것은 또한, 하기에 기재되는 신규한 안정화제 및 칼리케아마이신-링커 구성체를 사용하는 구성체의 선택적 환원에 의해 용이해질 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "선택적 환원"은, 무손상 고유적 디술피드 결합을 실질적으로 파괴하지 않으면서 유리 시스테인을 환원시키는(이로써 반응성 티올을 제공함) 환원 조건으로의 조작된 구성체의 노출을 의미한다. 일반적으로 선택적 환원은, 무손상 디술피드 결합을 파괴하지 않으면서 요망되는 티올을 제공하는 임의의 환원제, 또는 이들의 조합을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 특정 구현예에서, 또한 하기 실시예에 기재되는 바와 같이, 선택적 환원은, 컨쥬게이션을 위한 조작된 구성체를 제조하도록 온화한 환원 조건 및 안정화제를 사용하여 수행될 수 있다. 본원에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 상용성 안정화제는 일반적으로 유리 시스테인의 환원을 용이하게 하고, 요망되는 컨쥬게이션이 덜 엄중한 환원 조건 하에 진행될 수 있게 한다. 이는 상당한 다수의 고유적 디술피드 결합이 무손상 상태로 유지되고, 비-특이적 컨쥬게이션의 양을 현저히 감소시킴으로써 원치않는 오염물 및 잠재적인 독성을 제한할 수 있게 한다. 비교적 온화한 환원 조건은 다수의 시스템의 사용을 통해 달성될 수 있지만, 이는 바람직하게는 티올 함유 화합물의 사용을 포함한다. 당업자는 본 개시내용에 비추어 상용성 환원 시스템을 쉽게 도출할 수 있음을 인지할 것이다.
4.3 불변 영역 변형 및 변경된 글리코실화
본 발명의 선택된 구현예는 또한, 변경된 약동학, 증가된 혈청 반감기, 증가된 결합 친화성, 감소된 면역성, 증가된 생성, 변경된 Fc 수용체(FcR)에 대한 Fc 리간드 결합, 증대된 또는 감소된 ADCC 또는 CDC, 변경된 글리코실화 또는 변형된 불변 영역 결합 특이성을 포함하나 제한되지는 않는 바람직한 특징을 갖는 화합물을 제공하는, 비-제한적으로 아미노산 잔기 치환, 돌연변이 및/또는 변형을 포함하는, 불변 영역(즉, Fc 영역)의 치환 또는 변형을 포함할 수 있다.
개선된 Fc 작동체 기능을 갖는 화합물은, 예를 들어, 증가된 세포독성 및/또는 변경된 약동학, 예컨대 증가된 혈청 반감기로 이어질 수 있는, Fc 도메인과 Fc 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγRIIA 및 B, FcγRIII 및 FcRn) 사이의 상호작용에 참여하는 아미노산 잔기의 변화를 통해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)] 참조).
선택된 구현예에서, 증가된 생체 내 반감기를 갖는 항체는, Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 참여하는 것으로 식별된 아미노산 잔기의 개질(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 국제 특허출원 공개 번호 WO 97/34631; WO 04/029207; U.S.P.N. 6,737,056 및 U.S.P.N. 2003/0190311 참조). 이러한 구현예와 관련하여, Fc 변이체는 포유류, 바람직하게는 인간에서, 5 일 초과, 10 일 초과, 15 일 초과, 바람직하게는 20 일 초과, 25 일 초과, 30 일 초과, 35 일 초과, 40 일 초과, 45 일 초과, 2 개월 초과, 3 개월 초과, 4 개월 초과, 또는 5 개월 초과의 반감기를 제공할 수 있다. 증가된 반감기는 보다 높은 혈청 역가(titer)를 제공하고, 그에 따라 이는 항체 약물 컨쥬게이트의 투여 빈도수를 감소시키거나 투여되는 항체의 농도를 감소시킨다. 생체 내에서 인간 FcRn에 대한 결합 및 인간 FcRn 고친화성 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기는, 예를 들어, 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 트랜스펙션된 인간 세포주에서, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드가 투여되는 영장류에서 분석될 수 있다. WO 2000/42072에는 FcRn에 대한 개선된 또는 약화된 결합을 갖는 항체 변이체가 기재되어 있다. 또한, 예를 들어, 문헌 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)]을 참조한다.
다른 구현예에서, Fc 변경은 증대된 또는 감소된 ADCC 또는 CDC 활성을 초래할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, CDC는 보체의 존재 하에서의 표적 세포의 용해를 지칭하고, ADCC는 특정 세포독성 세포(예를 들어, 천연 킬러 세포, 호중구, 및 매크로파지) 상에 존재하는 FcR 상에 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 작동체 세포가 항원-보유 표적 세포에 특정적으로 결합되고, 이어서 세포독소로 표적 세포를 사멸시킬 수 있도록 하는 세포독성 형태를 지칭한다. 본 발명과 관련하여 항체 변이체에는, 모항체 또는 변형되지 않은 항체 또는 고유적 서열 FcR을 포함하는 항체에 비해 증대된 또는 약화된 결합인 "변경된" FcR 결합 친화성이 제공된다. 감소된 결합을 나타내는 이러한 변이체는, 예를 들어 당업계에 널리 공지된 기법에 의해 측정시, FcR에 대해 거의 또는 전혀 감지가능하지 않은 결합, 예를 들어 고유적 서열에 비해 0% 내지 20% 결합을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 변이체는 고유적 면역글로불린 Fc 도메인에 비해 증대된 결합을 나타낼 것이다. 개시된 항체의 효과적인 항종양 특성을 증대시키기 위해 이들 유형의 Fc 변이체가 유리하게 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 또 다른 구현예에서, 이러한 변경은 증가된 결합 친화성, 감소된 면역성, 증가된 생성, 변경된 글리코실화 및/또는 디술피드 결합(예를 들어, 컨쥬게이션 자리에 대해), 변형된 결합 특이성, 증가된 식균작용; 및/또는 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 제공할 수 있다.
또 다른 구현예는 하나 이상의 조작된 당형태(glycoform), 예를 들어, 단백질(예를 들어, Fc 도메인 내)에 공유 부착된 변경된 글리코실화 패턴 또는 변경된 탄수화물 조성을 포함하는 자리-특이적 항체를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조. 조작된 당형태는, 작동체 기능의 증대 또는 감소, 표적에 대한 항체의 친화성 증가 또는 항체의 생성 용이화를 포함하나 이에 제한되지는 않는 각종 목적상 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 감소된 작동체 기능이 요망되는 경우, 분자를 아글리코실화된 형태를 발현하도록 조작할 수 있다. 하나 이상의 가변 영역 골격 글리코실화 자리의 제거를 초래할 수 있는 치환(이로써 그 자리에서의 글리코실화가 제거됨)은 널리 공지되어 있다(예를 들어, U.S.P.N. 5,714,350 및 6,350,861 참조). 역으로, 하나 이상의 추가의 글리코실화 자리에서의 조작에 의해 Fc 함유 분자에 증대된 작동체 기능 또는 개선된 결합이 부여될 수 있다.
다른 구현예는 변경된 글리코실화 조성을 갖는 Fc 변이체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 하이포푸코실화된 항체 또는 증가된 양분화 GlcNAc 구조를 갖는 항체를 포함한다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은, 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 조작된 당형태는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 조작된 또는 변이체 발현 변형력 사용에 의해, 하나 이상의 효소(예를 들어, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII))와의 공동-발현에 의해, 다양한 유기체 또는 다양한 유기체로부터의 세포주에서의 Fc 영역을 포함하는 분자의 발현에 의해 또는 Fc 영역을 포함하는 분자 발현 후 탄수화물(들)의 변형에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, WO 2012/117002 참조).
4.4 단편
본 발명의 실행을 위해 어떠한 형태의 항체(예를 들어, 키메라, 인간화된 등)가 선택되는지에 관계 없이, 항체 약물 컨쥬게이트의 표적화제로서, 그의 면역반응성 단편이 본원의 교시내용에 따라 사용될 수 있음을 인지할 것이다. "항체 단편"은 무손상 항체의 적어도 일부를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 항체 분자의 "단편"이라는 용어는 항체의 항원-결합 단편을 포함하고, 용어 "항원-결합 단편" 또는 "면역반응성 단편"은 선택된 항원 또는 그의 면역성 결정인자와 면역특이적으로 결합되거나 반응하는 또는 특이적 항원 결합에 대해 단편이 유래된 무손상 항체와 경쟁하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 단편을 지칭한다.
예시적 자리-특이적 단편은, 가변 경쇄 단편(VL), 가변 중쇄 단편(VH), scFv, F(ab')2 단편, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항체 단편, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단일쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 추가로, 활성 자리-특이적 단편은, 항원/기질 또는 수용체와 상호작용하고 무손상 항체와 유사한 방식으로(어느 정도 낮은 효율성을 가질 수는 있지만) 이를 변형시키는 능력을 보유하는 항체의 부분을 포함한다. 이러한 항체 단편은 하나 이상의 유리 시스테인을 포함하도록 추가로 조작될 수 있다.
다른 구현예에서, 항체 단편은, Fc 영역을 포함하고, FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 보체 결합과 같은, 무손상 항체 중에 존재시 Fc 영역과 통상적으로 연관되는 생물학적 기능 중 적어도 하나를 보유하는 것이다. 하나의 구현예에서, 항체 단편은 무손상 항체와 실질적으로 유사한 생체 내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 이러한 항체 단편은, 단편에 생체 내 안정성을 제공할 수 있는 적어도 하나의 유리 시스테인을 포함하는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암(arm)을 포함할 수 있다.
당업자에 의해 널리 인식되는 바와 같이, 단편은 분자 공학에 의해 또는 무손상 또는 완전 항체 또는 항체 사슬의 화학적 또는 효소적 처리(예컨대, 파파인 또는 펩신)에 의해 또는 재조합 수단에 의해 얻어질 수 있다. 항체 단편에 대한 보다 상세한 설명에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999)]을 참조한다.
4.5
다가 구성체
다른 구현예에서, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는 1가 또는 다가(예를 들어, 2가, 3가 등)일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "-가"는 항체와 회합되는 잠재적인 표적 결합 자리의 수를 지칭한다. 각각의 표적 결합 자리는 하나의 표적 분자 또는 표적 분자 상의 특정 위치 또는 장소에 특이적으로 결합된다. 항체가 1가인 경우, 분자의 각각의 결합 자리는 단일 항원 위치 또는 에피토프에 특정적으로 결합할 것이다. 항체가 1 개 초과의 표적 결합 자리를 포함하는 경우(다가), 각각의 표적 결합 자리는 동일한 또는 상이한 분자에 특정적으로 결합할 수 있다(예를 들어, 상이한 리간드 또는 상이한 항원, 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프 또는 위치에 결합할 수 있음). 예를 들어, U.S.P.N. 2009/0130105를 참조한다.
하나의 구현예에서, 항체는, 문헌 [Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539]에 기재된 바와 같이, 2 개의 사슬이 상이한 특이성을 갖는 이중특이적 항체이다. 다른 구현예는 추가의 특이성을 갖는 항체, 예컨대 삼중특이적 항체를 포함한다. 기타 다른 보다 정교한 상용성 다중특이적 구성체 및 그의 제작 방법은 U.S.P.N. 2009/0155255뿐만 아니라, WO 94/04690; 문헌 [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121:210]; 및 WO 96/27011에 기재되어 있다.
다가 항체는 요망되는 표적 분자의 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 표적 분자뿐만 아니라 이종 에피토프, 예컨대 이종 폴리펩티드 또는 고체 지지체 물질에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 바람직한 구현예는 단지 2 개의 항원에 결합되지만(즉, 이중특이적 항체), 삼중특이적 항체와 같은 추가의 특이성을 갖는 항체 또한 본 발명에 포함된다. 이중특이적 항체는 또한 가교된 또는 "헤테로컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로컨쥬게이트 내의 항체 중 하나는 아비딘에, 또한 기타 다른 것은 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어, 원치않는 세포에 대해 면역 시스템 세포를 표적화하기 위해(U.S.P.N. 4,676,980), 또한 HIV 감염의 치료를 위해(WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089) 제안되었다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교제는 당업계에 널리 공지되어 있고, 많은 가교 기법과 함께 U.S. P.N. 4,676,980에 개시되어 있다.
5. 항체의 재조합 생성
항체 및 그의 단편은 항체 생성 세포로부터 얻어진 유전 물질 및 재조합 기술을 사용하여 생성하거나 변형시킬 수 있다(예를 들어, 문헌 [Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology vol. 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA]; [Sambrook and Russell (Eds.) (2000) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press]; [Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc.]; 및 U.S.P.N. 7,709,611 참조). 핵산은 전체 세포 내에, 세포 용해물 내에, 또는 부분 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은, 알칼리/SDS 치료, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 널리 공지된 다른 것들을 포함하는 표준 기법에 의해, 기타 다른 세포 성분 또는 기타 다른 오염물, 예를 들어, 기타 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 분리시, "단리"되거나 또는 실질적으로 순수해진다. 본 발명의 핵산은, 예를 들어, DNA(예를 들어, 게놈 DNA, cDNA), RNA 및 그의 인공 변이체(예를 들어, 펩티드 핵산)(단일-스트랜드형이든 이중-스트랜드형이든 RNA이든), RNA일 수 있고, 이는 인트론을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
핵산은 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 얻을 수 있다. 하이브리도마에 의해 발현되는 항체에서, 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기법에 의해 얻을 수 있다. (예를 들어, 파지 디스플레이 기법 사용시와 같이) 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 얻어진 항체에서, 항체의 면역반응성 단편을 코딩하는 핵산은 관련 분야에 인식된 표준 기법을 사용하여 라이브러리로부터 회수될 수 있다.
VH 및 VL 세그먼트를 코딩하는 DNA 단편은, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자로, Fab 단편 유전자로 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위해, 표준 재조합 DNA 기법에 의해 추가로 조작될 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편은 또 다른 단백질을 코딩하는 또 다른 DNA 단편, 예컨대 항체 불변 영역 또는 유연성 링커에 작동가능하게 연결된다. 이와 관련하여 사용되는 바와 같이 용어 "작동가능하게 연결된"은, 2 개의 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 골격내(in-frame) 유지되도록 2 개의 DNA 단편이 접합됨을 의미한다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는, VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고(예를 들어, 카바트 등의 1991년 문헌(상기 참조) 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있으나, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. 예시적 IgG1 불변 영역은 서열번호 2에 기재되어 있다. Fab 단편 중쇄 유전자에 대해, VH-코딩 DNA는 단지 중쇄 CH1 불변 영역을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는, VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자(뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고(예를 들어, 카바트 등의 1991년 문헌(상기 참조) 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있으나, 가장 바람직하게는 카파 불변 영역이다. 이와 관련하여 예시적 상용성 카파 경쇄 불변 영역은 서열번호 1에 기재되어 있다.
본 발명과 상용성인 항체는, 프로모터(예를 들어, WO 86/05807; WO 89/01036; 및 U.S.P.N. 5,122,464 참조); 및 진핵생물 분비 경로의 기타 다른 전사 조절 및 처리 제어 요소에 작동가능하게 연결될 수 있는, 상기에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터를 사용하여 생성될 수 있다. 이어서, 관련 분야에 인식된 기법을 사용하여 이러한 벡터를 보유하는 숙주 세포 및 숙주-발현 시스템을 배양하여 요망되는 항체를 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "숙주-발현 시스템"은, 본 발명과 상용성인 핵산 또는 폴리펩티드 및 항체를 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 포함한다. 이러한 숙주-발현 시스템은, 재조합 박테리오파지 DNA 또는 플라스미드 DNA로 형질전환되거나 트랜스펙션된 미생물(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 비. 서브틸리스(B. subtilis)); 재조합 이스트 발현 벡터로 트랜스펙션된 이스트(예를 들어, 사카로미세스(Saccharomyces)); 포유류 세포 또는 바이러스의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구성체를 보유하는 포유류 세포(예를 들어, COS, CHO-S, HEK-293T, 3T3 세포)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 숙주 세포는 2 개의 발현 벡터, 예를 들어, 중쇄 유래 폴리펩티드를 코딩하는 제1 벡터 및 경쇄 유래 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터로 공동-트랜스펙션될 수 있다.
포유류 세포의 형질전환 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, U.S.P.N. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, 및 4,959,455를 참조한다. 숙주 세포는 또한, 다양한 특징(예를 들어, 변형된 당형태 또는 GnTIII 활성을 갖는 단백질)을 갖는 항원 결합 분자의 생성을 가능하게 하도록 조작될 수 있다.
재조합 단백질의 장기간 고수율 생성을 위해, 안정적 발현이 바람직하다. 따라서, 관련 분야에 인식된 표준 기법을 사용하여 선택된 항체를 안정적으로 발현하는 세포주를 조작할 수 있고, 이는 본 발명의 일부를 형성한다. 복제의 바이러스 근원을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 자리 등), 및 선택가능 마커에 의해 제어된 DNA로 형질전환될 수 있다. 특정 조건 하에 발현을 증대시키기에 효율적인 접근을 제공하는 글루타민 신테타제 유전자 발현 시스템(GS 시스템)을 포함하는, 당업계에 널리 공지된 임의의 선택 시스템이 사용될 수 있다. GS 시스템은 EP 0 216 846, EP 0 256 055, EP 0 323 997 및 EP 0 338 841 및 U.S.P.N. 5,591,639 및 5,879,936과 관련하여 전체적으로 또는 부분적으로 논의되어 있다. 안정적인 세포주의 발달을 위한 또 다른 바람직한 발현 시스템은 프리덤(Freedom)™ CHO-S 키트(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))이다.
본 발명과 상용성인 항체가 재조합 발현 또는 개시된 기법 중 임의의 기타 다른 것에 의해 생성되면, 이를 당업계에 공지된 방법에 의해 정제 또는 단리할 수 있으며, 이는 이를 그의 자연 환경으로부터, 또한 ADC를 포함하는 항체에 대한 치료적 사용을 방해하는 오염물로부터 식별, 특성화, 분리 및/또는 회수함을 의미한다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다.
이들 단리된 제조물을 다양한 관련 분야에 인식된 기법, 예컨대 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피, 투석, 희석여과, 및 친화성 크로마토그래피, 특히 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다.
6. 생성후 선택
어떻게 얻어지든, 항체-생성 세포(예를 들어, 하이브리도마, 이스트 콜로니 등)를, 예를 들어, 강건한 성장, 높은 항체 생성 및 바람직한 항체 특징, 예컨대 관심 항원에 대한 높은 친화성을 포함하는 바람직한 특징을 위해 선택하고, 클로닝하고, 추가로 스크리닝할 수 있다. 하이브리도마를 세포 배양에서 시험관 내 또는 공통유전자 면역손상된 동물에서 생체 내 확장시킬 수 있다. 하이브리도마 및/또는 콜로니의 선택, 클로닝 및 확장 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 요망되는 항체가 식별되면, 관련 분야에 인식된 통상의 분자 생물학 및 생화학 기법을 사용하여 관련 유전 물질을 단리하고, 조작하고, 발현시킬 수 있다.
나이브(naive) 라이브러리(천연 또는 합성)에 의해 생성된 항체는 중간 정도의 친화성 (약 106 M-1 내지 107 M-1의 KA)을 가질 수 있다. 친화성 증대를 위해, 항체 라이브러리를 구성하고(예를 들어, 오류 유발 폴리머라제를 사용하여 랜덤 돌연변이를 시험관 내 도입), 이들 제2 라이브러리로부터 항원에 대한 높은 친화성을 갖는 항체를 재선택(예를 들어, 파지 또는 이스트 디스플레이 사용)함으로써 친화성 성숙을 시험관 내에서 모방할 수 있다. WO 9607754에, 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성하도록 면역글로불린 경쇄의 CDR에서 돌연변이생성을 유도하는 방법이 기재되어 있다.
파지 또는 이스트 디스플레이를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기법을 사용하여 항체를 선택할 수 있으며, 여기서는 인간 복합적 항체 또는 scFv 단편의 라이브러리르를 파지 또는 이스트 상에서 합성하고, 라이브러리를 관심 항원 또는 그의 항체-결합 부분으로 스크리닝하고, 항원에 결합된 파지 또는 이스트를 단리하고, 이로부터 항체 또는 면역반응성 단편을 얻을 수 있다(Vaughan et al., 1996, PMID: 9630891; Sheets et al., 1998, PMID: 9600934; Boder et al., 1997, PMID: 9181578; Pepper et al., 2008, PMID: 18336206). 파지 또는 이스트 디스플레이 라이브러리의 생성을 위한 키트는 상업적으로 입수가능하다. 또한, 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는 데 사용될 수 있는 기타 다른 방법 및 시약이 존재한다(U.S.P.N. 5,223,409; WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; 및 문헌 [Barbas et al., 1991, PMID: 1896445] 참조). 이러한 기법은 유리하게, 다수의 후보 항체의 스크리닝을 가능하게 하고, 서열의 비교적 용이한 조작을 제공한다(예를 들어, 재조합 셔플링에 의해).
V
항체의 특징
선택된 구현예에서, 항체-생성 세포(예를 들어, 하이브리도마, 이스트 콜로니 등)를, 유리한 성질, 예를 들어, 강건한 성장, 높은 항체 생성, 및 하기에서 보다 상세히 논의되는 바와 같은, 바람직한 항체 약물 컨쥬게이트 특징을 위해 선택하고, 클로닝하고, 추가로 스크리닝할 수 있다. 다른 경우, 항체의 특징은, 특정 항원(예를 들어, 특이적 단백질 도메인) 또는 동물 접종을 위한 표적 항원의 면역반응성 단편을 선택함으로써 부여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 선택된 항체를, 친화성 또는 약동학과 같은 면역화학적 특징을 증대시키거나 세밀화하기 위해 상기에 기재된 바와 같이 조작할 수 있다.
A. 중화 항체
선택된 구현예에서, 본 발명과 상용성인 항체는 "길항제" 또는 "중화" 항체일 수 있고, 이는 항체가 결정인자와 회합되어, 직접적으로, 또는 결정인자와 결합 파트너, 예컨대 리간드 또는 수용체의 회합을 막고, 이로써 다른 경우에는 분자의 상호작용으로부터 초래되는 생물학적 반응을 방해함으로써 상기 결정인자의 활성을 블록킹하거나 억제할 수 있음을 의미한다. 중화 또는 길항제 항체는, 예를 들어, 표적 분자 활성에 의해 또는 시험관 내 경쟁 결합 분석으로 측정시, 과량의 항체가 결정 인자에 결합된 결합 파트너의 양을 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상만큼 감소시키는 경우, 실질적으로 해당 리간드 또는 기질에 대한 결정 인자의 결합을 억제할 것이다. 변형된 활성은 관련 분야에 인식된 기법을 사용하여 직접적으로 측정될 수 있거나, 또는 변경된 활성이 하류에서 갖는 영향(종양형성 또는 세포 생존)에 의해 측정될 수 있음을 인지할 것이다.
B. 내재화 항체
많은 경우에, 선택된 결정인자는 종양형성 세포 표면과 회합되어 유지되고, 이로써 개시된 ADC의 국소화 및 내재화를 가능하게 한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 항체는, 내재화시 세포를 사멸시키는 하나 이상의 칼리케아마이신 페이로드(들)과 회합되거나 그에 컨쥬게이션될 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 ADC는 칼리케아마이신 페이로드(들)와의 내재화 자리-특이적 ADC를 포함할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "내재화"되는 항체는, 연관 항원 또는 수용체에 결합시 세포에 의해 흡수되는(임의의 세포독소와 함께) 것이다. 치료 응용을 위해, 내재화는 바람직하게는 이를 필요로 하는 대상체에서 생체 내에서 일어날 것이다. 내재화된 ADC의 수는, 항원-발현 세포, 특히 항원-발현 암 줄기 세포를 사멸시키기에 충분할 수 있다. 칼리케아마이신 또는 전체적으로 ADC의 효력(예를 들어, DAR에 기초)에 따라, 세포 내로의 단일 항체 분자의 흡수는, 항체가 결합되는 표적 세포를 사멸시키기에 충분할 수 있다. 예를 들어, 보다 높은 DAR 및 부착된 칼리케아마이신의 효율적인 전달을 갖는 일부 ADC는, 몇몇 분자의 내재화가 종양 세포를 사멸시키기에 충분할 정도로 매우 강력할 수 있다. 포유류 세포에 결합시 항체가 내재화되는지의 여부는, 다양한 관련 분야에 인식된 분석(예를 들어, 사포린 분석, 예컨대 Mab-Zap 및 Fab-Zap; 고급 표적화 시스템)에 의해 결정될 수 있다. 항체가 세포 내로 내재화되는지의 여부를 검출하는 방법은 또한 U.S.P.N. 7,619,068에 기재되어 있다.
C. 감손 항체
다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 감손 항체이다. 용어 "감손" 항체는, 바람직하게 세포 표면 상의 또는 그 근처의 항원에 결합되고, 세포의 사멸을 유도, 촉진 또는 유발하는(예를 들어, CDC, ADCC 또는 세포독성제의 도입에 의해) 항체를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 선택된 감손 항체는 세포독소에 컨쥬게이션될 것이다. 바람직하게는 감손 항체는, 한정된 세포 개체군에서 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%의 SEZ6-발현 세포를 사멸시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 개체군은 암 줄기 세포를 포함하는, 풍부화된, 구역화된, 정제된 또는 단리된 종양형성 세포를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 세포 개체군은 전체 종양 샘플 또는 암 줄기 세포를 포함하는 이질 종양 추출물을 포함할 수 있다. 표준 생화학 기법을 사용하여 본원의 교시내용에 따른 종양형성 세포의 감손을 모니터링하고 정량할 수 있다.
D. 결합 친화성
본 발명과 상용성인 항체는 바람직하게는 선택된 결정인자(예를 들어, SEZ6)에 대해 높은 결합 친화성을 갖는다. 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수 또는 겉보기 친화성을 지칭한다. 본 발명과 상용성인 항체는, 해리 상수 KD(k오프(off)/k온(on))가 ≤≤ 10-6 M인 경우에 그의 표적 항원에 면역특이적으로 결합될 수 있다. 항체는, KD가 ≤≤ 5×10-9 M인 경우에 높은 친화성으로, 또한 KD가 ≤≤ 5×10-10 M인 경우에 매우 높은 친화성으로 항원에 특이적으로 결합된다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 항체는 ≤≤ 10-9 M의 KD 및 약 1×10-4/초의 오프-속도를 갖는다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 오프-속도는 < 1x10-5 /초이다. 본 발명의 다른 구현예에서, 항체는 약 10-7 M 내지 10-10 M의 KD로 결정인자에 결합될 것이고, 또한 또 다른 구현예에서, 이는 KD ≤≤ 2×10-10 M로 결합될 것이다. 본 발명의 또 다른 선택된 구현예는, 10-6 M 미만, 5x10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 5x10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 5×10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 5x10-9 M 미만, 10-10 M 미만, 5×10-10 M 미만, 10-11 M 미만, 5×10-11 M 미만, 10-12 M 미만, 5x10-12 M 미만, 10-13 M 미만, 5×10-13 M 미만, 10-14 M 미만, 5×10-14 M 미만, 10-15 M 미만 또는 5×10-15 M 미만의 KD(k오프/k온)를 갖는 항체를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명과 상용성인 항체는, 적어도 105 M- ls-l, 적어도 2×105 M- ls-l, 적어도 5×105 M- ls-l, 적어도 106 M- ls-l, 적어도 5×106 M- ls-l, 적어도 107 M-ls-l, 적어도 5×107 M- ls-l, 또는 적어도 108 M- ls-l의 회합 속도 상수 또는 k온(또는 ka) 속도(항체 + 항원(Ag)k 온←항체-Ag)로 결정인자에 면역특이적으로 결합된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명과 상용성인 항체는, 10-1s-1 미만, 5×10-1s-1 미만, 10-2s-1 미만, 5×10-2s-1 미만, 10-3s-1 미만, 5×10-3s-1 미만, 10-4s-1 미만, 5×104s-1 미만, 10-5s-1 미만, 5×10-5s-1 미만, 10-6s-1 미만, 5×10-6s-1 미만, 10-7s-1 미만, 5×10-7s-1 미만, 10-8s-1 미만, 5×10-8s-1 미만, 10-9s-1 미만, 5×10-9s-1 미만 또는 10-10s-1 미만의 해리 속도 상수 또는 k오프(또는 kd) 속도(항체 + 항원(Ag)k 오프←항체-Ag)로 결정인자에 면역특이적으로 결합된다.
결합 친화성은 당업계에 공지된 다양한 기법, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명, 바이오-층 간섭측정법, 이중 편파 간섭측정법, 정적 광 산란, 동적 광 산란, 등온 적정 열량측정법, ELISA, 분석 초원심분리, 및 유동 세포측정법을 사용하여 측정될 수 있다.
E. 비닝 (Binning) 및 에피토프 맵핑
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "비닝"은, 항체의 항원 결합 특징 및 이들이 서로 경쟁하는지의 여부에 기초하여 항체를 "빈(bin)"으로 그룹화하는 데 사용되는 방법을 지칭한다. 빈의 초기 측정은 에피토프 맵핑 및 본원에 기재된 바와 같은 기타 다른 기법에 의해 추가로 세밀화되고 확인될 수 있다. 그러나, 개개의 빈으로의 항체의 경험적 배정은 개시된 항체 약물 컨쥬게이트의 치료 잠재성의 지표가 될 수 있는 정보를 제공함을 인지할 것이다.
보다 구체적으로, 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 선택된 기준 항체(또는 그의 단편)가 2차 시험 항체(즉, 동일한 빈 내에 있는)와 결합에 있어 경쟁하는지의 여부를 결정할 수 있다. 하나의 구현예에서는, 기준 항체를 포화 조건 하에 선택된 항원과 회합시키고, 이어서 2차 또는 시험 항체가 동일한 항원에 결합되는 능력을 표준 면역화학 기법을 사용하여 측정한다. 시험 항체가 기준 항체와 동시에 항원에 실질적으로 결합할 수 있는 경우, 2차 또는 시험 항체는 1차 또는 기준 항체와 상이한 에피토프에 결합한다. 그러나, 시험 항체가 실질적으로 동시에 항원에 결합되지 못하는 경우, 시험 항체는 동일한 에피토프, 오버랩핑 에피토프, 또는 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 가깝게 근접한(적어도 입체적으로) 에피토프에 결합된다. 즉, 시험 항체는 항원 결합에 있어 경쟁하고, 기준 항체와 동일한 빈 내에 있다.
개시된 항체와 관련하여 사용되는 경우 용어 "경쟁" 또는 "경쟁 항체"는, 시험 항체 또는 시험되는 면역 기능적 단편이 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 억제하는 분석에 의해 측정시, 항체 사이의 경쟁을 의미한다. 통상적으로, 이러한 분석은, 비-표지된 시험 항체, 표지된 기준 항체, 및 고체 표면 또는 발현 세포에 결합된 정제된 항원(또는 그의 도메인 또는 단편)의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는, 시험 항체의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 통상적으로 시험 항체가 과량으로 존재하고/존재하거나 먼저 결합되도록 한다. 경쟁적 결합을 측정하는 방법에 대한 추가의 상세사항은 본원 실시예에서 제공된다. 통상적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 이는 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 적어도 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75%만큼 억제할 것이다. 일부 경우, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97% 또는 그 이상만큼 억제된다.
역으로, 기준 항체가 결합되는 경우, 이는 바람직하게는 후속 첨가된 시험 항체의 결합을 적어도 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75%만큼 억제할 것이다. 일부 경우, 시험 항체의 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97% 또는 그 이상만큼 억제된다.
일반적으로 비닝 또는 경쟁적 결합은 관련 분야에 인식된 다양한 기법, 예컨대 면역분석, 예컨대 웨스턴 블롯, 방사면역분석, 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 침전소 반응, 겔 확산 침전소 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체-결합 분석, 면역방사측정 분석, 형광 면역분석 및 단백질 A 면역분석을 사용하여 측정할 수 있다. 이러한 면역분석은 일상적인 것이며, 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌 [Ausubel et al, eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York] 참조). 추가로, 교차-블록킹 분석이 사용될 수 있다(예를 들어, WO 2003/48731; 및 문헌 [Harlow et al. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane] 참조).
경쟁적 억제(또한 그에 따라 "빈")의 측정에 사용되는 다른 기술은, 예를 들어, 비아코어(BIAcore)™ 2000 시스템(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))을 사용하는 표면 플라즈몬 공명; 예를 들어, 포르테바이오(ForteBio)® 옥텟(Octet) RED(포르테바이오)를 사용하는 바이오-층 간섭측정법; 예를 들어, 팍스칸토(FACSCanto) II(비디 바이오사이언스(BD Biosciences)) 또는 복합 루미넥스(LUMINEX)™ 검출 분석(루미넥스)을 사용하는 유동 세포측정 비드 어레이를 포함한다.
루미넥스는, 대규모 복합 항체 쌍 형성을 가능하게 하는 비드에 기초한 면역분석 플랫폼이다. 분석은 표적 항원에 대한 항체 쌍의 동시 결합 패턴을 비교한다. 쌍에서 하나의 항체(캡쳐 mAb)는 루미넥스 비드에 결합되고, 여기서 각각의 캡쳐 mAb는 상이한 색의 비드에 결합된다. 기타 다른 항체(디텍터 mAb)는 형광 신호(예를 들어, 피코에리트린(PE))에 결합된다. 분석에서는, 항원에 대한 항체의 동시 결합(쌍 형성)을 분석하고, 유사한 쌍 형성 프로파일을 갖는 항체를 함께 그룹화한다. 디텍터 mAb 및 캡쳐 mAb의 유사한 프로파일은, 두 항체가 동일한 또는 가깝게 관련되는 에피토프에 결합됨을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 쌍 형성 프로파일은, 시험되는 항체의 패널 상에서 임의의 특정 항체에 가장 가깝게 상관되는 항체를 식별하는 피어슨(Pearson) 상관 계수를 사용하여 측정될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체 쌍의 피어슨 상관 계수가 적어도 0.9인 경우, 시험/디텍터 mAb는 기준/캡쳐 mAb와 동일한 빈 내에 있는 것으로 결정될 것이다. 다른 구현예에서, 피어슨 상관 계수는 적어도 0.8, 0.85, 0.87 또는 0.89이다. 추가의 구현예에서, 피어슨 상관 계수는 적어도 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99 또는 1이다. 루미넥스 분석으로부터 얻어진 데이터를 분석하는 기타 다른 방법은 U.S.P.N. 8,568,992에 기재되어 있다. 루미넥스가 100 개의 상이한 유형의 비드(또는 그 이상)를 분석하는 능력은, 거의 무제한의 항원 및/또는 항체 표면을 동시에 제공하고, 이는 바이오센서 분석 상에서 항체 에피토프 프로파일링에 있어 개선된 처리량 및 해상도를 제공한다(Miller, et al., 2011, PMID: 21223970).
"표면 플라즈몬 공명"은, 바이오센서 매트릭스 내에서의 단백질 농도 변경의 검출에 의한 실시간 특이적 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 지칭한다.
다른 구현예에서, 시험 항체가 기준 항체와 결합에 있어 "경쟁"하는지의 여부를 결정하는 데 사용될 수 있는 기법은, 2 개의 표면: 바이오센서 팁 상의 부동화된 단백질의 층, 및 내부 기준 층으로부터 반사된 백색광의 간섭 패턴을 분석하는 광학 분석 기법, "바이오-층 간섭측정법"이다. 바이오센서 팁에 결합된 분자 수의 임의의 변화는 간섭 패턴에서의 변위를 일으키고, 이는 실시간으로 측정될 수 있다. 이러한 바이오층 간섭측정법 분석은 하기와 같이 포르테바이오® 옥텟 RED 기계를 사용하여 수행할 수 있다. 기준 항체(Ab1)를 항마우스 캡쳐 칩 상에 캡쳐링하고, 이어서 고농도의 비-결합 항체를 사용하여 칩을 블록킹하고, 기준선을 수집한다. 이어서, 단량체, 재조합 표적 단백질을 특정 항체(Ab1)에 의해 캡쳐링하고, 팁을 대조군과 동일한 항체(Ab1)를 갖는 웰 내에 또는 상이한 시험 항체(Ab2)를 갖는 웰 내에 침지시킨다. 대조군 Ab1와의 결합 수준 비교에 의해 측정시, 추가의 결합이 나타나지 않는 경우, Ab1 및 Ab2는 "경쟁" 항체인 것으로 결정된다. Ab2에서 추가의 결합이 나타나는 경우, Ab1 및 Ab2는 서로 경쟁하지 않는 것으로 결정된다. 이 과정을 확장시켜 독특한 빈을 나타내는 96-웰 플레이트 내의 항체의 전체 행(row)을 사용하여 독특한 항체의 큰 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 기준 항체가 공통 항원에 대한 시험 항체의 특이적 결합을 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75%만큼 억제하는 경우, 시험 항체는 기준 항체와 경쟁할 것이다. 다른 구현예에서, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97% 또는 그 이상만큼 억제된다.
경쟁 항체의 그룹을 포함하는 빈이 한정되면, 빈 내의 항체가 결합되는 항원 상의 특정 도메인 또는 에피토프를 측정하기 위해 추가의 특성화가 수행될 수 있다. 문헌 [Cochran et al., 2004, PMID: 15099763]에 기재된 프로토콜의 변형을 사용하여 도메인-수준 에피토프 맵핑을 수행할 수 있다. 미세 에피토프 맵핑은, 항체가 결합되는 결정인자의 에피토프를 포함하는 항원 상의 특정 아미노산을 측정하는 방법이다. 용어 "에피토프"는 그의 통상적 생화학적 의미로 사용되며, 특정 항체에 의해 인식되고 특정적으로 결합될 수 있는 표적 항원의 부분을 지칭한다. 특정 구현예에서, 에피토프 또는 면역성 결정인자는, 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 기, 또는 술포닐 기와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹을 포함하고, 특정 구현예에서, 이는 특이적 3차원 구조적 특징, 및/또는 특이적 변화 특징을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는, 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 내에서 그의 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항원에 특정적으로 결합된다고 언급된다.
항원이 SEZ6과 같은 폴리펩티드인 경우, 에피토프는 일반적으로 단백질의 3차원 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산 및 비-인접 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다("형태적 에피토프"). 이러한 형태적 에피토프에서, 상호작용점은 서로 선형 분리되어 있는 단백질 상의 아미노산 잔기를 횡단하여 발생한다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프(때로는 "선형" 또는 "연속" 에피토프로서 언급됨)는 단백질 변성시 통상적으로 유지되지만, 3차원 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 단백질 변성시 통상적으로 손실된다. 항체 에피토프는, 독특한 공간 입체형태 내에 통상적으로 적어도 3 개, 또한 통상적으로는 적어도 5 개 또는 8 개 내지 10 개의 아미노산을 포함한다. 에피토프 측정 또는 "에피토프 맵핑" 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 이를 본 개시내용과 함께 사용하여 개시된 항체 약물 컨쥬게이트에 의해 결합되는 SEZ6 상의 에피토프를 식별할 수 있다.
상용성 에피토프 맵핑 기법은 알라닌 스캐닝 돌연변이, 펩티드 블롯(Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), 또는 펩티드 절단 분석을 포함한다. 추가로, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 사용될 수 있다(Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). 다른 구현예에서는, 또한 항원 구조에 기초한 항체 프로파일링(ASAP)로서 공지된, 변형-보조 프로파일링(Modification-Assisted Profiling (MAP))은, 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 항원 표면에 대한 각각의 항체의 결합 프로파일의 유사성에 따라 동일한 항원에 대하여 지향된 다수의 모노클로날 항체를 분류하는 방법을 제공한다(U.S.P.N. 2004/0101920). 이 기술은, 특성화가 유전적으로 별개의 항체에 집중될 수 있도록, 유전적으로 동일한 항체의 빠른 필터링을 가능하게 한다. MAP을 사용하여 본 발명과 상용성인 항체를 상이한 에피토프에 결합되는 항체의 군으로 분류할 수 있음을 인지할 것이다.
항원 상의 요망되는 에피토프가 측정되면, 예를 들어, 본 발명에 기재된 기법을 사용하여 에피토프를 포함하는 펩티드로의 면역화에 의해, 그 에피토프에 대한 항체를 생성할 수 있다. 대안적으로, 발견 과정 동안, 항체의 생성 및 특성화는 특이적 도메인 또는 모티프 내에 위치하는 바람직한 에피토프에 대한 정보를 설명할 수 있다. 이에 따라, 이러한 정보로부터, 동일한 에피토프에 대한 결합에 대하여 항체를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근은, 항원에 대한 결합에 있어 경쟁하는 항체를 찾는 경쟁 연구를 수행하는 것이다. 이들의 교차-경쟁에 기초한 항체 비닝을 위한 고처리량 방법이 WO 03/48731에 기재되어 있다. 이스트에서의 항체 경쟁 또는 항원 단편 발현을 포함하는 비닝 또는 도메인 수준 또는 에피토프 맵핑의 기타 다른 방법이 당업계에 공지되어 있다.
VI
링커 성분
일반 화학식 [-W-(X1)a-CM-(X2)b-P-]의 수많은 링커 화합물을 사용하여 본 발명의 표적화제를 선택된 칼리케아마이신 탄두에 컨쥬게이션시킬 수 있다. 링커는 단지 표적화제 상의 반응성 잔기(바람직하게는 시스테인 또는 리신) 및 선택된 칼리케아마이신 또는 칼리케아마이신 유사체와 공유 결합되어야 한다. 따라서, 표적화제의 선택된 잔기와 반응하는 임의의 개시된 칼리케아마이신-링커 구성체를 사용하여 본 발명의 비교적 안정적인 컨쥬게이트(자리-특이적인 또는 다른 방식의)를 제공할 수 있고, 이는 본원의 교시내용과 상용성이다.
바람직한 구현예에서 상용성 링커는 세포외 환경에서 ADC 상의 안정성을 제공하고, ADC 분자의 응집을 막고, ADC를 수성 매질 중에서 자유롭게 가용성으로, 또한 단량체 상태로 유지할 것이다. 세포로의 수송 또는 전달 전에, ADC는 바람직하게는 안정적이고, 무손상으로 유지되고, 즉 표적화제가 칼리케아마이신에 연결되어 유지된다. 링커는 표적 세포 외부에서는 안정적이지만, 이들은 표적에서 또는 보다 바람직하게는 세포 내부에서 다소 효과적인 속도로 절단되고/절단되거나 분해되도록 특정적으로 디자인된다. 따라서 효과적인 링커는, (i) 표적화제의 특정 결합 특성을 유지하고; (ii) 페이로드 또는 칼리케아마이신 탄두의 세포내 전달을 용이하게 하고; (iii) 탄두가 그의 표적화된 자리로 전달되거나 수송될 때까지, 안정적이고 무손상되어, 즉 절단되거나 분해되지 않고 유지되고; (iv) 선택된 칼리케아마이신의 세포독성, 세포-사멸 효과 또는 정균 효과(일부 경우, 임의의 방관자(bystander) 효과 포함)를 유지한다. 첨부된 실시예에서 나타난 바와 같이, ADC의 제작 및 안정성은, 표준 분석 기법, 예컨대 HPLC/UPLC, 질량 분광분석법, HPLC, 및 분리/분석 기법 LC/MS 및 LC/MS/MS에 의해 측정될 수 있다.
A. 절단가능한 모이어티 - (CM)
본 발명과 상용성인 링커는 광범위하게 절단가능한 것으로서 분류될 수 있고, 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 절단가능한 모이어티를 포함한다. 산-분해성(labile) 링커, 프로테아제 절단가능한 링커 및 디술피드 링커를 포함할 수 있는 절단가능한 링커는, 바람직하게는 표적 세포 내로 내재화되고, 세포 내부에서 엔도좀-리소좀 경로에서 절단된다. 이러한 경우, 칼리케아마이신 탄두의 방출 및 활성화는, 히드라존 또는 옥심과 같은 산-분해성 화학적 연결의 절단을 용이하게 하는 엔도좀/리소좀 산성 구획에 의존할 수 있다. 바람직하게는 개시된 칼리케아마이신 탄두를 그의 세포내 표적 근처로 방출시키도록 리소좀-특이적 프로테아제 절단 자리(들)가 링커 내로 조작될 수 있다. 대안적으로, (칼리케아마이신 탄두에 근접한 것에 추가로) 절단가능한 디술피드 모이어티를 함유하는 링커는, 디술피드 결합이 세포의 환원 환경에서는 선택적으로 절단되지만, 혈류 내의 산소-풍부 환경에서는 절단되지 않음에 따라 칼리케아마이신을 세포내에서 방출시키는 접근을 제공한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 특정 구현예는 세포내 환경(예를 들어, 리소좀 또는 엔도좀 또는 포낭 내)에서 존재하는 절단제에 의해 절단가능한 링커를 포함한다. 링커는, 예를 들어, 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티딜 링커는 적어도 2 개의 아미노산 길이 또는 적어도 3 개의 아미노산 길이를 갖는다. 절단제는 카텝신 B 및 D 및 플라스민을 포함할 수 있고, 이들 각각은 표적 세포 내에서 활성 칼리케아마이신의 방출을 일으키는 디펩티드 약물 유도체를 가수분해하는 것으로 공지되어 있다. 티올-의존적 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단가능한 예시적 펩티딜 링커는 Phe-Leu를 포함하는 펩티드이다(카텝신-B는 암 조직에서 고도로 발현되는 것으로 나타났음). 이러한 링커의 기타 다른 예는, 예를 들어, U.S.P.N. 6,214,345에 기재되어 있다. 구체적 바람직한 구현예에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티딜 링커는 Val-Cit 링커, Val-Ala 링커 또는 Phe-Lys 링커(U.S.P.N. 6,214,345에 기재됨)이다. 치료제의 세포내 단백질분해 방출을 사용하는 것의 한 가지 이점은, 작용제가 컨쥬게이션시 통상적으로 희박화되고, 컨쥬게이트의 혈청 안정성이 통상적으로 높다는 점이다.
따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 절단가능한 모이어티는, 혈청 내에서의 프로테아제에 의한 것과 대조적으로, 의도된 작용 자리에서 프로테아제에 의해 우선적으로 절단되는 펩티드 결합을 포함한다. 통상적으로, 절단가능한 모이어티의 펩티드 성분은 1 개 내지 20 개의 아미노산, 바람직하게는 1 개 내지 6 개의 아미노산, 보다 바람직하게는 1 개 내지 3 개의 아미노산을 포함한다. 아미노산(들)은 천연 및/또는 비-천연 α-아미노산일 수 있다. 천연 아미노산은, 유전 암호에 의해 코딩되는 것들뿐만 아니라, 이로부터 유래된 아미노산, 예를 들어, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 시트룰린, 및 0-포스포세린이다. 용어 아미노산은 또한, 아미노산 유사체 및 모방체를 포함한다. 유사체는, R 기가 천연 아미노산 중에서 나타난 것이 아닌 것을 제외하고는, 천연 아미노산과 동일한 일반적 H2N(R)CHCO2H 구조를 갖는 화합물이다. 유사체의 예는, 호모세린, 노르류신, 메티오닌-술폭시드, 및 메티오닌 메틸 술포늄을 포함한다. 아미노산 모방체는, α-아미노산의 일반적 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 그와 유사한 방식으로 기능하는 화합물이다. 용어 "비-천연 아미노산"은 "D" 입체화학 형태를 나타내는 것으로 의도되고, 천연 아미노산은 "L" 형태를 갖는다.
특히 바람직한 구현예에서, 상용성 펩티딜 링커는 하기의 것을 포함한다:
여기서, 별표는 선택적 스페이서(또는 링커) X2 또는 디술피드 보호 기에 대한 부착점이고, TA는 본원에 개시된 것과 같은 표적화제이고, L1은 펩티딜 절단가능한 모이어티이고, W는 L1을 표적화제 상의 반응성 잔기에 연결시키는 연결 기(선택적으로 스페이서(또는 링커) X1 포함)이고, L2는 공유 결합이거나 또는 -OC(=O)-와 함께 자기-희생 링커를 형성한다. L1-L2-OC(O)-는 화학식 2에서 -(X1)a-CM-에 상응하고, 화학식 I/Ia에서 -(L3)Z1-M-에 상응한다.
펩티딜 절단가능한 링커로서 L1은 바람직하게는 링커 분해를 개시하여 디술피드 결합의 절단 및 표적 자리에서의 활성 2가 라디칼 칼리케아마이신 종의 생성을 일으키는 트리거(trigger)이다.
L1 및 L2의 성질은 폭넓게 다양할 수 있음을 인지할 것이다. 이들 기는, 컨쥬게이트가 전달되는 자리에서의 조건에 의해 나타날 수 있는, 이들의 절단 특징에 기초하여 선택된다. 일부 경우에는 효소 작용에 의해 절단되는 모이어티가 바람직하지만, pH 변화(예를 들어, 산 또는 염기-분해성), 온도 또는 광조사(예를 들어, 광-분해성)에 의해 절단가능한 모이어티도 본 발명과 상용성이며 CM으로서 사용될 수 있음이 강조되어야 한다. 환원 또는 산화 조건 하에 절단가능한 모이어티 또한 상용성이며 절단가능한 모이어티로서 사용될 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, L1은 아미노산의 인접 서열을 포함할 수 있다. 아미노산 서열, 또는 절단가능한 펩티드는, 효소적 절단에 대한 표적 기질일 수 있고, 이로써 약물의 방출이 가능해진다. 용어 "절단가능한 펩티드"는 프로테아제의 절단 인식 서열을 함유하는 펩티드를 지칭한다. 프로테아제에 대한 절단 인식 서열은 단백질분해 절단 동안 프로테아제에 의해 인식되는 아미노산 서열이다. 많은 프로테아제 절단 자리가 당업계에 공지되어 있고, 이들 및 기타 다른 절단 자리가 링커, 스페이서, 또는 링커 모이어티에 포함될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Matayoshi et al., Science 247:954 (1990)]; [Dunn et al., Meth. Enzymol. 241:254 (1994)]; [Seidah et al, Meth. Enzymol. 244: 175 (1994)]; [Thornberry, Meth. Enzymol. 244:615 (1994)]; [Weber et al., Meth. Enzymol. 244:595 (1994)]; [Smith et al., Meth. Enzymol. 244:412 (1994)]; [Bouvier et al., Meth. Enzymol. 248: 614(1995)], [Hardy et al, in AMYLOID PROTEIN PRECURSOR IN DEVELOPMENT, AGING, AND ALZHEIMER'S DISEASE, Ed. Masters et al., pp. 190-198 (1994)]을 참조한다.
따라서, 선택된 구현예에서, L1은 효소 작용에 의해 절단가능하다. 다른 선택된 구현예에서, 효소는 에스테라제 또는 펩티다제를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 펩티드 서열은, 종양-연관 프로테아제, 예를 들어, 종양 세포의 부근에서 암 세포의 표면 상에서 또는 세포외에서 나타나는 프로테아제에 의해 절단되는 그의 능력에 기초하여 선택된다. 이러한 프로테아제의 예는 티메트 올리고펩티다제(TOP), CDIO(네프릴리신), 매트릭스 메탈로프로테아제(예컨대, MMP2 또는 MMP9), 유형 II 트랜스멤브레인 세린 프로테아제(예컨대, 헵신, 테스티신, TMPRSS4 또는 마트립타제/MT-SPl) 및 레구마인을 포함한다. 종양-연관 프로테아제에 의해 절단되는 펩티드의 능력은 당업계에 공지된 시험관 내 프로테아제 절단 분석에 의해 시험할 수 있다.
세포에 의해 내재화되도록 디자인된 컨쥬게이트에서, 절단가능한 모이어티는 바람직하게는 엔도좀 또는 리소좀 프로테아제에 의한 절단을 위해 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 프로테아제의 비-제한적 예는, 카텝신 B, C, D, H, L 및 S, 특히 카텝신 B를 포함한다. 카텝신 B는, 서열 -AA2-AA1-(여기서, AA1 은 기본적 또는 강하게 수소 결합되는 아미노산(예컨대, 리신, 아르기닌, 또는 시트룰린)이고, AA2는 소수성 아미노산(예컨대, 페닐알라닌, 발린, 알라닌, 류신, 또는 이소류신), 예를 들어 Val-Cit(여기서, Cit는 시트룰린을 나타냄) 또는 Val-Lys임)에서 펩티드를 우선적으로 절단한다. (본원에서, 아미노산 서열은, 문맥에서 달리 명백히 나타내지 않는 한, H2N-AA2-AA1-CO2H와 같이 N-C 방향으로 기재됨) 카텝신-절단가능한 기에 대한 추가의 정보는, 그 개시내용이 참조로 포함되는, 문헌 [Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 8, 3341-3346 (1998)]; [Dubowchik et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8 3347-3352 (1998)]; 및 [Dubowchik et al., Bioconjugate Chem.13, 855-869 (2002)]을 참조한다. 펩티딜 링커 절단에 사용될 수 있는 또 다른 효소는 Ala-Ala-Asn에서 우선적으로 절단하는 리소좀 시스테인 프로테아제, 레구마인이다.
따라서, 바람직한 구현예에서, L1은 펩티드를 포함한다. 선택된 특정 구현예에서, 이는 -NH-AA2-AA1-CO-(여기서, -NH- 및 -CO-는 각각 아미노산 기의 N- 및 C-말단을 나타냄)로서 표시되는 디펩티드일 수 있다. 다른 구현예에서, 절단가능한 펩티드는 트리펩티드, 쿼트라펩티드 또는 펜타펩티드일 수 있고, 여기서 각각의 아미노산은 독립적으로 L 또는 D 이성질체이다.
특정 구현예에서, 펩티드는 Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Lle-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu- Ala-Leu(서열번호 3), β-Ala-Leu- Ala-Leu(서열번호 4), Gly-Phe-Leu-Gly(서열번호 5), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D- Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D- Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala- Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, 및 D-Ala-D-Ala, Gly-Gly-Gly, Ala- Ala- Ala, D- Ala- Ala- Ala, Ala-D- Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala- Val-Cit, 및 Ala-Val-Ala로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 대안으로, 펩티드는 Gly-Gly-Gly, Ala- Ala- Ala, D-Ala- Ala- Ala, Ala-D-Ala- Ala, 및 Ala-Val-Ala로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대안적으로, 펩티드는 Gly-Gly-Ala, Val-Ala, Glu-Ala, 또는 Glu(OMe)-Ala이다. 관련 구현예에서, 상기에 기재된 임의의 펩티드 서열은, 상기에 정의된 바와 같이, 양 방향으로 존재할 수 있다.
추가로, 카르복실 또는 아미노 측쇄 관능기(예를 들어, 각각 Glu 및 Lys)를 갖는 아미노산 기에 대하여, CO 및 NH는 측쇄 관능기를 나타낼 수 있다.
하나의 구현예에서, 디펩티드, -NH-AA2-AA1-CO-에서 -AA2-AA1- 기는, -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-, -Phe-Cit-, -Leu-Cit-, -Ile-Cit-, -Phe-Arg- 및 -Trp-Cit-(여기서, Cit은 시트룰린임)로부터 선택된다.
바람직하게는, 디펩티드, -NH-AA2-AA1-CO-에서 -AA2-AA1- 기는, -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, 및 -Val-Cit-로부터 선택된다.
가장 바람직하게는, 디펩티드, -NH-AA2-AA1-CO-에서 -AA2-AA1- 기는, -Val-Cit-, -Phe-Lys- 또는 -Val-Ala-이다.
바람직한 특정 구현예에서는, L2가 존재하고, -C(=O)O-와 함께 자기-희생 링커를 형성한다. 다른 구현예에서, L2는 효소적 활성에 대한 기질이고, 이로써 약물의 방출이 추가로 조절된다.
하나의 구현예에서, L1가 효소 작용에 의해 절단가능하고, L2가 존재하는 경우, 효소는 L1과 L2 사이의 결합을 절단한다.
특정 구현예에서, L1 및 L2(존재하는 경우)는, -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -NH(Ar), -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, 및 -NHC(=O)NH-로부터 선택된 결합에 의해 연결될 수 있다.
L2에 연결되는 L1의 아미노 기는 아미노산의 N-말단일 수 있고, 이는 아미노산 측쇄, 예를 들어 리신 아미노산 측쇄의 아미노 기로부터 유래될 수 있다.
펩티딜 절단가능한 모이어티를 포함하는 상용성 칼리케아마이신-링커 구성체의 특히 바람직한 구현예를 하기에 화학식 4 내지 12로서 나타내었다. 화학식 6 내지 12의 구성체는 실질적으로, 단지 요망되는 디펩티드 모이어티의 치환에 의해, 실시예 3(화학식 4, Val-Cit) 및 4(화학식 5, Val-Ala)에 기재된 바와 같이 제작될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 본 개시내용에 비추어, 당업자는 유사한 합성 반응식을 사용하여 추가의 펩티딜 링커 칼리케아마이신 구성체를 쉽게 제작할 수 있다.
화학식 4(ADC19.4-디펩티드)(Val-Cit 디펩티드)
화학식 5(ADC19.5-디펩티드)(Val-Ala 디펩티드)
화학식 6 - (Phe-Ala)
화학식 7 - (Ile-Ala)
화학식 8 - (Trp-Ala)
화학식 9 - (Phe-Cit)
화학식 10 - (Ile-Cit)
화학식 11 - (Trp-Cit)
화학식 12 - (Phe-Lys)
L2에 연결되는 L1의 카르복실 기는 아미노산의 C-말단일 수 있거나, 또는 아미노산 측쇄, 예를 들어 글루탐산 아미노산 측쇄의 카르복실 기로부터 유래될 수 있다.
L2에 연결되는 L1의 히드록실 기는 아미노산 측쇄, 예를 들어 세린 아미노산 측쇄의 히드록실 기로부터 유래될 수 있다.
용어 "아미노산 측쇄"는 (i) 천연 아미노산, 예컨대 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린; (ii) 소수 아미노산, 예컨대 오르니틴 및 시트룰린; (iii) 비-천연 아미노산, 베타-아미노산, 천연 아미노산의 합성 유사체 및 유도체; 및 (iv) 이들의 모든 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 이성질체 풍부, 동위원소 표지(예를 들어, 2H, 3H, 14C, 15N), 보호 형태, 및 라세미 혼합물에서 나타나는 기들을 포함한다.
하나의 구현예에서, -C(=O)O- 및 L2는 함께 하기 기를 형성한다:
여기서, 별표는 선택적 스페이서 X2 또는 디술피드 보호 기에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 절단가능한 모이어티에 대한 부착점을 나타내고, Y는 -N(H)-, -O-, -C(=O)N(H)- 또는 -C(=O)O-이고, n은 0 내지 3이다. 페닐렌 고리는 본원에 기재된 바와 같은 1 개, 2 개 또는 3 개의 치환체로 선택적으로 치환된다. 하나의 구현예에서, 페닐렌 기는 할로, NO2, R 또는 OR(여기서, R은 상기에 정의된 바와 같음)로 선택적으로 치환된다.
하나의 구현예에서, Y는 NH이다.
하나의 구현예에서, n은 0 또는 1이다. 바람직하게는, n은 0이다.
Y가 NH이고, n이 0인 경우, 자기-희생 링커는 p-아미노벤질카르보닐 링커(PABC)로서 언급될 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 링커는 자기-희생 링커를 포함하고, 디펩티드는 함께 기 -NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-(화학식 5 참조)를 형성하며, 이는 하기와 같이 예시된다:
여기서, 별표는 칼리케아마이신 탄두에 근접한 선택적 스페이서 또는 디술피드 보호 기에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 링커의 나머지 부분(예를 들어, 선택적 스페이서-연결 기 세그먼트)에 대한 부착점을 나타낸다. 디펩티드가 효소적 절단되면, 자기-희생 링커는 먼 자리 활성화시 보호된 화합물(즉, 칼리케아마이신 디술피드 유사체)의 완전한 방출을 가능하게 할 것이며, 이는 하기에 나타낸 라인을 따라 진행된다:
여기서, L*은 표적화 항원 및 이제 절단된 펩티딜 단위를 포함하는 링커의 나머지 부분의 형태이다. 디술피드 보호 기와 함께 칼리케아마이신 유사체의 완전한 방출은 나머지 링커 단편의 분해 및 요망되는 2가 라디칼 종의 생성을 용이하게 한다. 다른 특히 바람직한 구현예에서, 선택된 링커는 -NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-를 포함할 것이다(화학식 4 참조).
자기-희생 모이어티에 대한 추가의 개시내용에 대해서는, 그 개시내용이 참조로 포함되는 문헌 [Carl et al., J. Med. Chem., 24 (3), 479-480 (1981)]; [Carl et al., WO 81/01145 (1981)]; [Dubowchik et al., Pharmacology & Therapeutics, 83, 67-123 (1999)]; Firestone et al., 미국 특허 6,214,345 B1 (2001); [Toki et al., J. Org. Chem. 67, 1866-1872 (2002)]; [Doronina et al., Nature Biotechnology 21 (7), 778-784 (2003) (erratum, p. 941)]; Boyd et al., 미국 특허 7,691,962 B2; Boyd et al., US 2008/0279868 A1; Sufi et al., WO 2008/083312 A2; Feng, 미국 특허 7,375,078 B2; 및 Senter et al., US 2003/0096743 A1]을 참조한다.
다른 구현예에서, 절단가능한 링커는 pH-민감성(예를 들어, 화학식 13 및 화학식 14 참조)이다. 통상적으로, pH-민감성 링커는 산성 조건 하에 가수분해가능할 것이다. 예를 들어, 리소좀 내에서 가수분해가능한 산-분해성 링커(예를 들어, 히드라존, 옥심, 세미카르바존, 티오세미카르바존, 시스-아코니틱 아미드, 오르토에스테르, 아세탈, 케탈 등)가 사용될 수 있다(예를 들어, U.S.P.N. 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929 참조). 이러한 링커는, 혈액 내에서와 같이 중성 pH 조건 하에서는 비교적 안정적이지만, 리소좀의 대략적 pH인 pH 5.5 또는 5.0 미만에서는 불안정적이다. 따라서, 절단이 산 촉매화되는 절단가능한 모이어티는 혈장 속도에서보다 리소좀 내부에서 수 자릿수 더 빠른 속도로 절단될 것이다. 적합한 산-민감성 기의 예는, 그 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 Shen et al., 미국 특허 4,631,190 (1986); Shen et al., 미국 특허 5,144,011 (1992); 문헌 [Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102, 1048-1054 (1981)] 및 [Yang et al., Proc. Natl Acad. Sci (USA), 85, 1189-1193 (1988)]에 기재된 바와 같은 시스-아코니틸 아미드 및 히드라존이다.
또 다른 구현예에서, 링커는 환원 조건 하에 절단가능하다(예를 들어, 디술피드 링커). 디술피드는, 주위 티올 농도에 의존적인 속도로 티올-디술피드 교환 메커니즘에 의해 절단될 수 있다. 글루타티온 및 기타 다른 티올의 세포내 농도가 이들의 혈청 농도보다 더 높음에 따라, 디술피드의 절단 속도는 세포내에서 더 높을 것이다. 또한, 티올-디술피드 교환의 속도는 디술피드의 입체적 및 전자적 특징의 조정에 의해 조절될 수 있고(예를 들어, 알킬-아릴 디술피드 대 알킬-알킬 디술피드; 아릴 고리 상의 치환 등), 이는 증대된 혈청 안정성 또는 특정 절단 속도를 갖는 디술피드 연결의 디자인을 가능하게 한다. 각종 디술피드 링커가 당업계에 공지되어 있고, 이는 예를 들어, SATA(N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트), SPDP(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 부티레이트) 및 SMPT(N-숙신이미딜-옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔)를 사용하여 형성될 수 있는 것들을 포함한다. 컨쥬게이트 내의 디술피드 절단가능한 기에 대한 추가의 개시내용에 대해서는, 예를 들어, 그 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Thorpe et al., Cancer Res. 48, 6396-6403 (1988)]; Santi et al., 미국 특허 7,541,530 B2 (2009); Ng et al., 미국 특허 6,989,452 B2 (2006); Ng et al., WO 2002/096910 A1; Boyd et al., 미국 특허 7,691,962 B2; 및 Sufi et al., US 2010/0145036 A1을 참조한다.
B. 선택적 스페이서 - (X1 및 X2)
상기에서 암시된 바와 같이, 개시된 절단가능한 모이어티는 하나 이상의 선택적 스페이서(X1 및 X2)에 의해 플랭킹될 수 있거나, 또는 표적화제 또는 디술피드 보호 기와 직접 회합될 수 있고; 즉, 스페이서 X1 및 X2는 부재하거나 독립적으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 절단가능한 모이어티가 디술피드를 포함하는 경우, 2 개의 황 중 하나는 시스테인 잔기 또는 그의 대용물 표적화제일 수 있다. 다른 구현예에서, 절단가능한 모이어티는 항체의 탄수화물 측쇄 상의 알데히드에 결합된 히드라존일 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 절단가능한 모이어티(가능하게는 선택적 자기-희생 기와 함께)는 선택된 구성의 2 개의 스페이서에 결합될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "스페이서"는 임의의 2 개의 화학 기 사이에 삽입된 화학 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 스페이서의 한쪽 말단(예를 들어, X1)은 직접 표적화제에, 또는 다른 구현예에서는 세포-결합제와 공유 결합을 형성할 수 있는 반응성 관능기(즉, 연결 기)에 연결된다. 또 다른 구현예에서, 스페이서의 한쪽 말단(예를 들어, X2)은 디술피드 보호 기 또는 디술피드 보호 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 반응성 관능기에 연결된다. 일부 구현예에서, 스페이서의 한쪽 말단은 분지화된 스캐폴드에 연결된다. 일부 구현예에서, 스페이서는 (1) 표적화제, 또는 표적화제와 공유 결합될 수 있는 반응성 관능기와; (2) 분지화된 스캐폴드 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 스페이서는 (1) 디술피드 보호 기, 또는 디술피드 보호 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 반응성 관능기와; (2) 분지화된 스캐폴드 사이에 삽입된다. 바람직한 특정 구현예에서, 스페이서는 한쪽 말단에서 반응성 관능기에 부착되어, 표적화제 또는 보호 디술피드 기와 추가로 반응할 수 있는 링커 모이어티를 형성할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "분지화된 스캐폴드"는 2 개 이상의 스페이서에 연결된 화학 모이어티(즉, "분지화 단위")를 포함한다. 분지화된 스캐폴드는 2 개 이상의 칼리케아마이신 모이어티가 표적화제에 부착될 수 있게 한다(화학식 15). 예시적 분지화된 스캐폴드는 아미노 기(예컨대, Lys) 또는 카르복실 기(예컨대, Glu 또는 Asp)를 포함하는 측쇄를 갖는 아미노산, 또는 2 개 이상의 이러한 아미노산을 포함하는 펩티드(예를 들어, Lys-Lys 이량체 등)로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서, 분지화 단위는 3급 아민과 같은 반응성 모이어티로부터 유래되거나 이를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 스페이서는, 예를 들어, 입체 장애를 피하거나 분자 유연성을 촉진시키도록 하는, 2 개의 화학 기 사이의 요망되는 거리를 생성한다. 특정 구현예에서, 스페이서의 존재는 플랭킹 화학 기의 기능(예를 들어, 세포 상의 표적 분자에 결합되는 세포-결합제의 능력, 또는 세포독성 약물의 세포독성)을 방해하거나, 억제하거나, 다른 방식으로 이에 부정적 영향을 주지 않는다. 특정 구현예에서, 스페이서는, 스페이서를 포함하는 면역컨쥬게이트 또는 링커 화합물에, 추가의 유리한 특징, 예컨대 증대된 효력, 용해도, 혈청 안정성, 및/또는 효능을 제공한다. 특정 구현예에서, 스페이서는, 프로테아제 또는 펩티다제(예컨대, 세포내 / 리소좀 펩티다제) 절단에 대해 내성을 가질 수 있거나 갖지 않을 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들어, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 또는 그 이상의 잔기)를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 단위 -(CH2-CH2-0)의 하나 이상의 반복, 예컨대 1 개 내지 1000 개의 PEG 단위, 1 개 내지 500 개의 PEG 단위, 1 개 내지 24 개의 PEG 단위, 또는 2 개 내지 8 개의 PEG 단위(2 개, 4 개, 6 개, 또는 8 개의 PEG 단위)를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 바람직한 스페이서는 직쇄 또는 분지쇄, 치환된 또는 비-치환된 알킬 또는 아릴 모이어티를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 선택적 스페이서 X1 또는 X2는 자기-희생 모이어티를 포함할 수 있다.
C.
디술피드 보호 기 - (P)
이전에 나타낸 바와 같이, 칼리케아마이신 디술피드 기는 바람직하게, ADC가 표적 세포에 도달할 때까지 안정성(예를 들어, 혈장 안정성)을 제공하는 단쇄 치환 또는 비-치환 2관능성 지방족 또는 아릴 기("디술피드 보호 기")에 의해 보호된다. 이와 관련하여, 디술피드 보호 기는 칼리케아마이신 디술피드 기를 선택적 스페이서 X2와, 또는 스페이서가 존재하지 않는 경우에는, 직접 절단가능한 모이어티 또는 선택적 자기 희생 기와 공유 연결시킨다. 이와 같이 함에 있어, 디술피드 보호 기는 디술피드 결합에 대하여 어느 정도의 입체 장애를 제공하고, 이로써 티올-디술피드 교환 반응을 통한 절단에 대한 그의 민감성을 감소시킨다. 본 개시내용에 비추어, 당업자는, 요망되는 안정성을 제공하고 칼리케아마이신 ADC의 치료 지수를 최적화하는 상용성 디술피드 보호 기를 쉽게 선택할 수 있다(문헌 [Kellogg et al., Bioconj. Chem, 2011, 22, 717-727] 참조). 안정화된 디술피드 결합을 제공하는 추가의 방법은, 본원에 참조로 포함되는 USPN 20010036926에서 찾아볼 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 디술피드 보호 기는 시클릭 또는 비-시클릭 직쇄 또는 분지쇄 C1-C12 포화 또는 불포화 지방족 모이어티를 포함할 것이다. 바람직한 특정 구현예에서, 지방족 모이어티는 치환될 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 지방족 모이어티는 비-치환될 수 있다. 또 다른 디술피드 보호 기 구현예는 디술피드 모이어티에 근접한 탄소에 결합된 1 개 또는 2 개의 메틸 기를 갖는 지방족 모이어티를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 지방족 모이어티는 디술피드 모이어티에 근접한 탄소에 결합된 단일 메틸 기를 포함할 것이다. 다른 바람직한 구현예는 근접 탄소로부터 1 개, 2 개 또는 3 개의 탄소만큼 떨어져 있는 하나 이상의 메틸 기를 갖는 지방족 모이어티를 포함할 것이다. 이러한 각각의 구성체에 의해 부여된 안정성은 관련 분야에 인식된 기법을 사용하여 쉽게 측정할 수 있다. 각각의 경우, 선택된 디술피드 보호 기는 디술피드 결합의 안정성을 증가시키고 생체 내에서 칼리케아마이신 ADC의 반감기를 연장시키도록 작용할 것이다.
D. 연결 기 - (W)
연결 기는 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트를 제공하도록 표적화제에 개시된 칼리케아마이신 구성체를 회합시키는 데 사용된다. 바람직한 구현예에서, 이러한 연결제는, 단백질 표적화제의 표면 상의 선택된 천연 아미노산(시스테인, 리신, 티로신, 트립토판)의 화학선택적 변형에 참여하는 것으로 공지된 모이어티; 글루코컨쥬게이션에 참여하는 것으로 공지된 반응성 관능기; 비-천연 아미노산과의 화학선택적 반응에 적합한 반응성 모이어티; 특이적 펩티드 태그와의 효소적 반응을 통한 바이오컨쥬게이션에 적합한 반응성 기를 포함할 수 있다(이들 방법에 대한 일반적 설명은 문헌 [Bioconj. Chemistry 2015, 26, 176-192]을 참조한다). 본원에서 상세히 논의된 바와 같이, 자리-특이적 항체 약물 컨쥬게이트의 생성에 적합한 티올 기재의 연결 기가 특히 바람직하다.
수많은 상용성 링커가 유리하게 친핵성인 환원된 시스테인 및 리신에 결합될 수 있다. 환원된 시스테인 및 리신을 포함하는 컨쥬게이션 반응은, 티올-말레이미드, 티올-디브로모말레이미드, 티올-할로게노(아실 할라이드), 티올-엔, 티올-인, 티올- 비닐술폰, 티올-비술폰, 티올-티오술포네이트, 티올-피리딜 디술피드 및 티올-파라플루오로 반응을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 추가로 논의되는 바와 같이, 티올-말레이미드 바이오컨쥬게이션은, 그의 빠른 반응 및 온화한 컨쥬게이션 조건으로 인해 가장 폭넓게 사용되는 접근 중 하나이다. 이 접근에서의 한 가지 문제는 역-마이클 반응 및 혈장, 예컨대 인간 혈청 알부민에서의 항체로부터 기타 다른 단백질로의 말레이미도-연결된 페이로드의 손실 또는 전달의 가능성이다. 그러나, 바람직한 구현예에서, 본원에서 실시예 8 및 9에 기재된 바와 같은 선택적 환원 및 자리-특이적 항체의 사용은 컨쥬게이트를 안정화시키고 이러한 원치않는 전달을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 티올-아실 할라이드 반응은 역-마이클 반응이 일어날 수 없고 따라서 보다 안정적인 바이오컨쥬게이트를 제공한다. 불행히도, 티올-할라이드 반응은 일반적으로 말레이미드 기재의 컨쥬게이션에 비해 더 느린 반응 속도를 갖고, 따라서 원치않는 약물 대 항체 비율을 제공함에 있어 효율적인 것이 아니다. 티올-피리딜 디술피드 반응은 또 다른 통상적 바이오컨쥬게이션 경로이다. 피리딜 디술피드는 유리 티올과 빠르게 교환되어 혼합 디술피드를 생성하고 피리딘-2-티온을 방출시킨다. 혼합 디술피드는 환원적 세포 환경에서 절단되어 페이로드를 방출시킬 수 있다. 바이오컨쥬게이션에서 보다 관심이 모아지는 기타 다른 접근은 티올-비닐술폰 및 티올-비술폰 반응이고, 이들은 각각 본원의 교시내용과 상용성이고, 명시적으로 본 발명의 범위 내에 포함된다. 당업자는, 상기 언급된 컨쥬게이션 기법 및 시약 각각이 본 발명과 상용성이며 개시된 항체 약물 컨쥬게이트를 제공하는 데 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
상기 언급된 절차에도 불구하고, 본 발명의 칼리케아마이신-링커는, 바람직하게는, 유리 시스테인에 의해 제공되는 것들을 포함하는, 시스테인 상의 반응성 티올 친핵체에 연결될 것이다. 이를 위해 표적화제의 시스테인은, 다양한 환원제, 예컨대 DTT 또는 TCEP 또는 본원에 기재된 바와 같은 온화한 환원제로의 처리에 의해 링커 시약과의 컨쥬게이션을 위해 반응성으로 만들어질 수 있다.
이와 관련하여 바람직한 연결 기는 단백질 표적제 상의 친핵성 관능기와의 반응을 위한 친전자성 관능기를 함유한다. 단백질 상의 친핵성 기는, (i) N-말단 아민 기, (ii) 측쇄 아민 기, 예를 들어 리신, (iii) 측쇄 티올 기, 예를 들어 시스테인, 및 (iv) 당 히드록실 또는 아미노 기(여기서 항체가 글리코실화됨)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 아민, 티올, 및 히드록실 기는 친핵성이고, (i) 말레이미드 기, (ii) 활성화된 디술피드, (iii) 활성 에스테르, 예컨대 NHS(N-히드록시숙신이미드) 에스테르, HOBt(N-히드록시벤조트리아졸) 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (iv) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; 및 (v) 알데히드, 케톤, 및 카르복실 기를 포함하는, 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있다.
바람직한 연결 기는 하기의 것들을 포함한다:
선택된 구현예에서, 표적화제와 칼리케아마이신-링커 모이어티 사이의 연결은 표적화제 상의 시스테인(예를 들어, 유리 시스테인)의 티올 잔기 및 링커 상에 존재하는 말단 말레이미드 기(즉, 연결 기)를 통해 이루어진다. 이러한 구현예에서, 단백질 표적화제와 칼리케아마이신-링커 사이의 연결은 하기와 같다:
여기서, 별표는 칼리케아마이신-링커의 나머지 부분에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 표적화제의 나머지 부분에 대한 부착점을 나타낸다. 선택된 구현예에서, 황 원자는 바람직하게는 자리-특이적 유리 시스테인으로부터 유래될 수 있다. 기타 다른 상용성 링커와 관련하여, 연결 기는, 활성화된 잔기와 반응하여 요망되는 컨쥬게이트를 제공할 수 있는 말단 아이오도아세트아미드를 포함한다. 어떤 경우에도 당업자는 본 개시내용에 비추어 상용성 표적화제(예를 들어, 자리-특이적 항체)와 개시된 칼리케아마이신-링커 구성체 각각을 쉽게 컨쥬게이션시킬 수 있다.
활성화된 티올 기에 추가로, 리신 컨쥬게이션은, N-히드록시 숙신아미드(NHS) 에스테르, 펜타플루오로페놀 에스테르, 테트라플루오로페놀 에스테르, 파라-니트로페놀 에스테르, 히드록실-벤조트리아졸(HOBt) 에스테르 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 각종 활성화된 에스테르를 통해 수행될 수 있다. 섭동된 pKa를 갖는 리신의 특정 경우에, 자리 특이적 리신 컨쥬게이트는, 아자테디논 모이어티 및 베타-디케톤과의 반응에 의해 생성될 수 있다.
다른 구현예에서, 티로신 및 트립토판 항체 구성성분은 디아조늄 염, 옥사디아졸 3,5-디온 유도체, 시클릭 이민 및 기타 다른 관능기를 사용하여 컨쥬게이션시킬 수 있다.
다른 구현예는 개시된 칼리케아마이신 구성체를 특정 표적화제(예를 들어, 항체) 상에 존재하는 N-글리칸에 컨쥬게이션시키는 것을 포함한다. 하나의 통상적으로 사용되는 방법은, 퍼아이오데이트로의 처리에 의한 부근의 디올과 글리칸의 산화로부터 알데히드를 생성하는 것을 포함한다. 이에 따라, 링커 상의 연결 기는 환원성 아미노화에 적합한 알데히드 반응성 관능기, 예컨대 히드라진, 아미노옥시 화합물 또는 아민으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서, 링커 상의 연결 기는 각종 변형력 부여된 시클로옥틴으로부터 선택된다. 기타 다른 상용성 접근은, 표적화제의 표면 상의 티올-관능화된 글리칸의 대사적 발현을 포함한다. 이에 따라, 티올의 컨쥬게이션은 상기에 기재된 시스테인 활성 연결 기를 통해 가능할 것이다.
또 다른 상용성 구현예에서, 표적화제 내의 비-천연 아미노산의 혼입은 미리 선택된 자리로의 쌍직교 화학적 관능기의 효율적인 컨쥬게이션을 가능하게 한다. 이에 따라, 연결 기는 상보적 쌍직교 반응성 관능기로부터 선택된다. 예를 들어, 혼입된 p-아세틸페닐알라닌 잔기는, 환원성 아미노화에 적합한 히드라진, 아미노옥시 화합물 및 아민과 같은 케톤-반응성 연결 기를 사용하여 컨쥬게이션될 수 있다. 대안적으로, 비-구리 클릭 화학 시약, 예컨대 변형력 부여된 시클로옥틴을 사용하여 아지드-관능화된 비-천연 아미노산을 혼입 및 컨쥬게이션시킬 수 있다.
또 다른 상용성 구현예는 개시된 표적화제와 칼리케아마이신 구성체의 효소 매개된 컨쥬게이션을 포함한다. 이를 위해 비오틴 리가제, 트랜스글루타미나제 및 리포산 리가제를 사용하여 소분자를 단백질 자리에 특정적으로 결찰시킬 수 있다. 예를 들어, 트랜스글루타미나제는 1급 아민 연결 기를 함유하는 소분자와 글루타민 측쇄 사이의 아미드 결합 형성을 촉매화한다. 하나의 특히 바람직한 구현예는 트랜스글루타미나제 스트렙토베르티실륨 모바라네제(Streptovertticillium mobaranese)에 의한 특정 펩티드 태그(LLQGA)의 변형 및 후속 컨쥬게이션을 포함한다. 이러한 펩티드 태그는, 단일 태그가 항체의 중쇄 및 경쇄 내에 혼입되는 경우에 가장 효율적으로 컨쥬게이션되는 것으로 나타났다. 이러한 구성은 MMAD-아민과의 반응에서 1.8 내지 1.9 정도의 약물 항체 비율 수준을 재현가능하게 제공할 수 있다. 대안 전략으로서, 포르밀글리신 생성 효소가 사용되었다. 효소는 펩티드 태그 CXPXR 내의 시스테인 잔기를 포르밀글리신으로 형질전환시킨다. 포르밀글리신은, 적절한 연결 기와의 옥심 및 히드라진 형성과 상용성이기는 하나, 바람직하게는 아미노옥시- 또는 히드라진-관능화된 트립타민 연결 기와의 픽텟-스펭글러(Pictet-Spengler) 결찰을 통해 컨쥬게이션된다. 이러한 반응의 생성물은 생리학적 조건 하에 매우 안정적인 것으로 나타났고, 본 발명에 따른 칼리케아마이신 ADC를 쉽게 제공할 수 있다.
일반 항체에 연결된 칼리케아마이신-링커 구성체의 예를, 화학식 4' 내지 12' 및 14' 내지 17'로서 하기에 나타내었다. 
기호는 화학식 I에서 Ab에 대한 부착점을 나타낸다.
본 개시내용에 비추어, 당업자는 유사한 합성 반응식을 사용하여 추가의 펩티딜 링커 칼리케아마이신 구성체를 쉽게 제작할 수 있다.
VII
컨쥬게이션 제조물
A. 컨쥬게이션 절차
상기에서 암시된 바와 같이, 다수의 널리 공지된 상이한 반응을 사용하여 개시된 칼리케아마이신-링커 구성체를 선택된 표적화제에 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 시스테인의 술프히드릴 기를 사용하는 다양한 반응을 요망되는 페이로드의 컨쥬게이션에 사용할 수 있다. 특히 바람직한 구현예는 하기에서 상세히 논의되는 바와 같은 하나 이상의 유리 시스테인을 포함하는 항체의 컨쥬게이션을 포함할 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 ADC는 선택된 항체 중에 존재하는 리신 잔기의 용매-노출 아미노 기에 대한 칼리케아마이신의 컨쥬게이션을 통해 생성될 수 있다. 또 다른 구현예는, 이후에 개시된 페이로드를 항체에 부착시키는 데 사용될 수 있는 N-말단 트레오닌 및 세린 잔기의 활성화를 포함한다. 선택된 컨쥬게이션 방법은 바람직하게는 항체에 부착된 약물의 수를 최적화하고 비교적 높은 치료 지수를 제공하는 데에 맞게 조정될 것이다.
시스테인 잔기에 대한 치료 화합물의 컨쥬게이션을 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 염기성 조건 하에, 시스테인 잔기는 탈양성자화되어 티올레이트 친핵체를 생성할 것이고, 이는 연성 친전자체, 예컨대 말레이미드 및 아이오도아세트아미드와 반응할 수 있다. 일반적으로 이러한 컨쥬게이션을 위한 시약은 시스테인의 시스테인 티올과 직접 반응하여 컨쥬게이션된 단백질을 형성하거나, 또는 링커-약물과 반응하여 링커-약물 중간체를 형성할 수 있다. 링커의 경우, 유기 화학 반응, 조건, 및 시약을 사용하는 여러 경로가 당업자에게 공지되어 있고, 이는 (1) 본 발명의 단백질의 시스테인 기와 링커 시약의 반응으로부터, 공유 결합을 통한, 단백질-링커 중간체의 형성 후, 활성화된 화합물과의 반응; 및 (2) 화합물의 친핵성 기와 링커 시약과의 반응으로부터, 공유 결합을 통한, 약물-링커 중간체의 형성 후, 본 발명의 단백질의 시스테인 기와의 반응을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 개시된 2관능성 링커는 시스테인 잔기(들)에 대한 공유 연결을 위한 티올 변형 기 및 칼리케아마이신에 대한 공유 또는 비-공유 연결을 위한 적어도 하나의 부착 모이어티(예를 들어, 제2 티올 변형 모이어티)를 포함할 수 있다.
컨쥬게이션 전에, 항체는, 환원제, 예컨대 디티오트레이톨(DTT) 또는 (트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)로의 처리에 의해 링커 시약과의 컨쥬게이션을 위해 반응성으로 만들어질 수 있다. 다른 구현예에서, 추가의 친핵성 기가, 2-이미노티올란(트라우트(Traut) 시약), SATA, SATP 또는 SAT(PEG)4를 포함하나 이에 제한되지는 않는 시약과 리신의 반응을 통해 항체 내로 도입될 수 있고, 이는 아민을 티올로 전환시킨다
이러한 컨쥬게이션과 관련하여, 시스테인 티올 또는 리신 아미노 기는 친핵성이고, 술피드 교환을 통해, (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실, 및 말레이미드 기; 및 (iv) 피리딜 디술피드를 포함하는 디술피드를 포함하는 링커 시약 또는 화합물-링커 중간체 또는 약물 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있다. 화합물 또는 링커 상의 친핵성 기는, 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있는 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드 기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
바람직한 표지 시약은 말레이미드, 할로아세틸, 아이오도아세트아미드 숙신이미딜 에스테르, 이소티오시아네이트, 술포닐 클로라이드, 2,6-디클로로트리아지닐, 펜타플루오로페닐 에스테르, 및 포스포르아미다이트를 포함하나, 기타 다른 관능기도 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 방법은, 예를 들어, 말레이미드, 아이오도아세트이미드 또는 할로아세틸/알킬 할라이드, 아지리딘, 아크릴로일 유도체를 사용하여 시스테인의 티올과 반응시켜 화합물과 반응성인 티오에테르를 생성하는 것을 포함한다. 활성화된 피리딜디술피드와 유리 티올의 디술피드 교환 또한, 컨쥬게이트 생성에 유용하다(예를 들어, 5-티오-2-니트로벤조(TNB) 산의 사용). 바람직하게는, 말레이미드가 사용된다.
상기에 나타낸 바와 같이, 반응성 잔기로서 리신을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 컨쥬게이션을 수행할 수도 있다. 친핵성 리신 잔기는 통상적으로 아민-반응성 숙신이미딜에스테르를 통해 표적화된다. 최적 수의 탈양성자화된 리신 잔기를 얻기 위해, 수용액의 pH가 리신 암모늄 기의 pKa(약 10.5임) 미만이여야 하고, 따라서 반응의 통상적인 pH는 약 8 및 9이다. 커플링 반응을 위한 통상적인 시약은, 리신 아실화 메커니즘을 통해 친핵성 리신과 반응하는 NHS-에스테르이다. 유사한 반응이 일어나는 기타 다른 상용성 시약은 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트를 포함하며, 이들 또한 본원의 교시내용과 함께 사용되어 ADC를 제공할 수 있다. 리신이 활성화되면, 많은 상기 언급된 연결 기를 사용하여 탄두를 항체에 공유 결합시킬 수 있다.
화합물을 트레오닌 또는 세린 잔기(바람직하게는 N-말단 잔기)에 컨쥬게이션시키는 방법이 또한 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 카르보닐 전구체를 세린 또는 트레오닌의 1,2-아미노알콜로부터 유도하고, 이를 퍼아이오데이트 산화에 의해 선택적으로 빠르게 알데히드 형태로 전환시킬 수 있는 방법이 기재되었다. 본 발명의 단백질에 부착되는 화합물 중의 시스테인의 1,2-아미노티올과 알데히드의 반응은 안정적인 티아졸리딘 생성물을 형성한다. 이 방법은 N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기에서의 단백질 표지에 특히 유용하다.
특히 바람직한 구현예에서, 반응성 티올 기는, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 그 이상의 유리 시스테인 잔기의 도입에 의해 선택된 항체(또는 그의 단편) 내로 도입될 수 있다(예를 들어, 하나 이상의 유리 비-고유적 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 항체 제조). 상기에 기재된 바와 같이, 이러한 자리-특이적 또는 조작된 항체는, 적어도 부분적으로, 조작된 유리 시스테인 자리(들)의 제공 및/또는 본원에 기재된 신규한 컨쥬게이션 절차로 인해, 증대된 안정성 및 상당한 균질성을 나타내는 컨쥬게이트 제조를 가능하게 한다. 사슬내 또는 사슬간 항체 디술피드 결합 각각을 완전히 또는 부분적으로 환원시켜 컨쥬게이션 자리를 제공하는(또한 본 발명과 완전히 상용성인) 종래의 컨쥬게이션 방법과 달리, 본 발명은 추가로, 제조된 특정 유리 시스테인 자리의 선택적 환원 및 이것으로의 칼리케아마이신-링커의 지향을 제공한다. 조작된 자리 및 선택적 환원에 의해 촉진된 컨쥬게이션 특이성은 요망되는 위치에서의 높은 백분율의 자리 지향된 컨쥬게이션을 가능하게 한다. 중요하게, 이들 컨쥬게이션 자리 중 일부, 예컨대 경쇄 불변 영역의 말단 영역에 존재하는 부분은 통상적으로, 이들이 기타 다른 유리 시스테인과 교차-반응하는 경향이 있기 때문에, 효과적으로 컨쥬게이션되기 어렵다. 그러나, 분자 공학 및 생성된 유리 시스테인의 선택적 환원을 통해, 효율적인 컨쥬게이션 속도가 얻어질 수 있고, 이는 원치않는 고-DAR 오염물 및 비-특이적 독성을 상당히 감소시킨다. 보다 일반적으로, 조작된 구성체 및 선택적 환원을 포함하는 개시된 신규한 컨쥬게이션 방법은, 개선된 약동학 및/또는 약역학 및, 잠재적으로, 개선된 치료 지수를 갖는 ADC 제조물을 제공한다.
상기에서 논의된 바와 같이, 자리-특이적 구성체는, 환원시, 친핵성이고, 상기에 개시된 것들과 같은 링커 모이어티 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있는 티올 기를 포함하는 유리 시스테인(들)을 제시한다. 본 발명의 바람직한 항체는 환원가능한 쌍을 이루지 않은 사슬간 또는 사슬내 시스테인, 즉 이러한 친핵성 기를 제공하는 시스테인을 가질 것이다. 따라서, 특정 구현예에서, 환원된 쌍을 이루지 않은 시스테인의 유리 술프히드릴 기 및 개시된 약물-링커의 말단 말레이미도 또는 할로아세트아미드 기의 반응은 요망되는 컨쥬게이션을 형성할 것이다. 이러한 경우, 항체의 유리 시스테인은, 환원제, 예컨대 디티오트레이톨(DTT) 또는 (트리스 (2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)로의 처리에 의해 링커 시약과의 컨쥬게이션을 위해 반응성으로 만들어질 수 있다. 따라서, 각각의 유리 시스테인은 이론적으로 반응성 티올 친핵체를 제시할 것이다. 이러한 시약이 상용성이지만, 당업자에게 공지된 다양한 반응, 조건 및 시약을 사용하여 자리-특이적 항체의 컨쥬게이션을 수행할 수 있음을 인지할 것이다.
추가로, 조작된 항체의 유리 시스테인은 선택적으로 환원되어 증대된 자리-지향된 컨쥬게이션 및 원치않는 잠재적으로 독성인 오염물의 감소를 제공할 수 있는 것으로 나타났다. 보다 구체적으로 "안정화제", 예컨대 아르기닌은 단백질에서의 분자내 및 분자간 상호작용을 조절하는 것으로 나타났고, 이는 선택된 환원제(바람직하게는 비교적 온화한)와 함께 사용되어 유리 시스테인을 선택적으로 환원시키고 본원에 기재된 바와 같은 자리-특이적 컨쥬게이션을 용이하게 할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "선택적 환원" 또는 "선택적으로 환원되는"은 상호교환가능하게 사용되고, 조작된 항체 중에 존재하는 고유적 디술피드 결합을 실질적으로 파괴하지 않으면서 유리 시스테인(들)을 환원시키는 것을 의미할 것이다. 선택된 구현예에서, 이는 특정 환원제에 의해 달성될 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 조작된 구성체의 선택적 환원은 환원제(온화한 환원제 포함)와 조합된 안정화제의 사용을 포함할 것이다. 용어 "선택적 컨쥬게이션"은 본원에 기재된 바와 같은 칼리케아마이신과 선택적으로 환원된 조작된 항체의 컨쥬게이션을 의미할 것임을 인지할 것이다. 이와 관련하여, 선택되는 환원제와 조합된 이러한 안정화제의 사용은, 항체 중쇄 및 경쇄 상의 컨쥬게이션 정도 및 제조물의 DAR 분포에 의해 측정되는 바와 같은 자리-특이적 컨쥬게이션의 효율을 현저히 개선시킬 수 있다.
임의의 특정 이론에 의해 국한되길 바라지는 않지만, 이러한 안정화제는 정전 미세환경을 조절하고/조절하거나 요망되는 컨쥬게이션 자리에서의 형태적 변화를 조절하도록 작용함으로써, 비교적 온화한 환원제(무손상 고유적 디술피드 결합을 실질적으로 환원시키지 않음)가 요망되는 유리 시스테인 자리에서의 컨쥬게이션을 용이하게 할 수 있게 한다. 이러한 작용제(예를 들어, 특정 아미노산)은 염 브릿지를 형성(수소 결합 및 정전 상호작용을 통해)하는 것으로 공지되어 있고, 이는 유리한 형태 변화를 일으킬 수 있고/있거나 불리한 단백질-단백질 상호작용을 감소시킬 수 있는 안정화 효과를 부여하는 방식으로 단백질-단백질 상호작용을 조절할 수 있다. 또한, 이러한 작용제는 환원 후 원치않는 분자내(및 분자간) 시스테인-시스테인 결합의 형성을 억제하도록 작용하여, 조작된 자리-특이적 시스테인이 약물에 결합(바람직하게는 링커를 통해)되는 요망되는 컨쥬게이션 반응을 용이하게 할 수 있다. 선택적 환원 조건은 무손상 고유적 디술피드 결합의 유의한 환원을 제공하지 않기 때문에, 후속 컨쥬게이션 반응은 유리 시스테인 상의 비교적 소수의 반응성 티올(예를 들어, 바람직하게는 항체 당 2 개의 유리 티올)로 자연적으로 유도된다. 이에 대해 상기에서 암시된 바와 같이, 이는 비-특이적 컨쥬게이션 및 본원에 기재된 바와 같이 제작된 컨쥬게이트 제조물 중의 상응하는 불순물의 수준을 상당히 감소시킨다.
선택된 구현예에서, 본 발명과 상용성인 안정화제는 일반적으로 염기성 pKa를 갖는 적어도 하나의 모이어티를 갖는 화합물을 포함할 것이다. 특정 구현예에서, 모이어티는 1급 아민을 포함할 것이며, 다른 바람직한 구현예에서, 아민 모이어티는 2급 아민을 포함할 것이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 아민 모이어티는 3급 아민 또는 구아니디늄 기를 포함할 것이다. 다른 선택된 구현예에서, 아민 모이어티는 아미노산을 포함할 것이며, 다른 상용성 구현예에서, 아민 모이어티는 아미노산 측쇄를 포함할 것이다. 또 다른 구현예에서, 아민 모이어티는 단백질성(proteinogenic) 아미노산을 포함할 것이다. 또 다른 구현예에서, 아민 모이어티는 비-단백질성 아미노산을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 상용성 안정화제는 아르기닌, 리신, 프롤린 및 시스테인을 포함할 수 있다. 추가로, 상용성 안정화제는 구아니딘 및 염기성 pKa를 갖는 질소 함유 헤테로사이클을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 상용성 안정화제는 약 7.5 초과의 pKa를 갖는 적어도 하나의 아민 모이어티를 갖는 화합물을 포함하고, 다른 구현예에서, 대상 아민 모이어티는 약 8.0 초과의 pKa를 가질 것이고, 또 다른 구현예에서, 아민 모이어티는 약 8.5 초과의 pKa를 가질 것이고, 또 다른 구현예에서, 안정화제는 약 9.0 초과의 pKa를 갖는 아민 모이어티를 포함할 것이다. 다른 바람직한 구현예는 아민 모이어티가 약 9.5 초과의 pKa를 가질 것인 안정화제를 포함할 것이며, 특정 다른 구현예에서는 약 10.0 초과의 pKa를 갖는 적어도 하나의 아민 모이어티를 나타내는 안정화제를 포함할 것이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 안정화제는 약 10.5 초과의 pKa를 갖는 아민 모이어티를 갖는 화합물을 포함할 것이고, 다른 구현예에서, 안정화제는 약 11.0 초과의 pKa를 갖는 아민 모이어티를 갖는 화합물을 포함할 것이며, 또 다른 구현예에서, 안정화제는 약 11.5 초과의 pKa를 갖는 아민 모이어티를 포함할 것이다. 또 다른 구현예에서, 안정화제는 약 12.0 초과의 pKa를 아민 모이어티를 갖는 화합물을 포함할 것이며, 또 다른 구현예에서, 안정화제는 약 12.5 초과의 pKa를 아민 모이어티를 포함할 것이다. 당업자는, 표준 기법을 사용하여 관련 pKa가 쉽게 계산되거나 측정될 수 있으며, 이것이 안정화제로서 선택된 화합물의 사용에 있어 응용가능성을 결정하는 데 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
개시된 안정화제는, 특정 환원제와 조합시 유리 자리-특이적 시스테인에 대한 표적화 컨쥬게이션에 있어 특히 효과적인 것으로 나타났다. 본 발명의 목적상, 상용성 환원제는, 조작된 항체 고유적 디술피드 결합을 유의하게 파괴하지 않으면서 컨쥬게이션을 위한 환원된 유리 자리-특이적 시스테인을 생성하는 임의의 화합물을 포함할 수 있다. 선택된 안정화제 및 환원제의 조합에 의해 제공되는 이러한 조건 하에, 활성화된 칼리케아마이신-링커는 요망되는 유리 자리-특이적 시스테인 자리에 대한 결합으로 주로 제한한다. 비교적 온화한 환원제 또는 온화한 조건을 제공하도록 비교적 저농도로 사용되는 환원제가 특히 바람직하다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "온화한 환원제" 또는 "온화한 환원 조건"은, 조작된 항체 중에 존재하는 고유적 디술피드 결합을 실질적으로 파괴하지 않으면서 유리 시스테인 자리(들)에서 티올을 제공하는 환원제에 의해 생성되는(선택적으로 안정화제의 존재 하에) 임의의 작용제 또는 상태를 의미하는 것으로 의도될 것이다. 즉, 온화한 환원제 또는 조건은 단백질의 고유적 디술피드 결합을 유의하게 파괴하지 않으면서 유리 시스테인(들)을 효과적으로 환원(티올을 제공)시킬 수 있다. 요망되는 환원 조건은, 선택적 컨쥬게이션에 적절한 환경을 확립하는 다수의 술프히드릴 기재의 화합물에 의해 제공될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 온화한 환원제는 1 개 이상의 유리 티올을 갖는 화합물을 포함할 수 있으며, 특히 바람직한 구현예에서, 온화한 환원제는 단일 유리 티올을 갖는 화합물을 포함할 것이다. 본 발명과 상용성인 환원제의 비-제한적 예는, 글루타티온, n-아세틸 시스테인, 시스테인, 2-아미노에탄-1-티올 및 2-히드록시에탄-1-티올을 포함한다.
상기에 기재된 선택적 환원 방법은 유리 시스테인에 대한 표적화된 컨쥬게이션에 있어 특히 효과적임을 인지할 것이다. 이와 관련하여, 자리-특이적 항체 내의 요망되는 표적 자리로의 컨쥬게이션 정도(본원에서 "컨쥬게이션 효율"로서 정의됨)는, 관련 분야에서 허용되는 다양한 기법에 의해 측정될 수 있다. 항체에 대한 약물의 자리-특이적 컨쥬게이션의 효율은, 모든 기타 다른 컨쥬게이션된 자리에 대한 표적 컨쥬게이션 자리(본 발명에서 경쇄의 c-말단 상의 유리 시스테인) 상의 컨쥬게이션의 백분율을 평가함으로써 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서의 방법은 유리 시스테인을 포함하는 항체에 대한 약물의 효율적 컨쥬게이션을 제공한다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이션 효율은, 모든 기타 다른 컨쥬게이션 자리에 대한 표적 컨쥬게이션의 백분율에 의해 측정시, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 그 이상이다.
추가로, 컨쥬게이션 가능한 조작된 항체는, 항체가 생성되거나 저장됨에 따라 블록킹되거나 캡핑되는 술프히드릴 기를 포함하는 유리 시스테인 잔기를 함유할 수 있음을 인지할 것이다. 이러한 캡은 술프히드릴 기와 상호작용하고 컨쥬게이트 형성을 막거나 억제하는 소분자, 단백질, 펩티드, 이온 및 기타 다른 물질을 포함한다. 일부 경우, 비-컨쥬게이션된 조작된 항체는 동일한 또는 상이한 항체 상의 기타 다른 유리 시스테인에 결합되는 유리 시스테인을 포함할 수 있다. 본원에서 논의된 바와 같이, 이러한 교차-반응성은 제작 절차 동안 다양한 오염물을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 항체는 컨쥬게이션 반응 전에 언캡핑을 필요로 할 수 있다. 구체적 구현예에서, 본원에서의 항체는 언캡핑되고, 컨쥬게이션 가능한 유리 술프히드릴 기를 나타낸다. 구체적 구현예에서, 본원에서의 항체는 천연 디술피드 결합을 파괴하거나 재배열시키지 않는 언캡핑 반응에 적용된다. 대부분의 경우에 언캡핑 반응은 통상적 환원 반응(환원 및 선택적 환원) 동안 일어날 것임을 인지할 것이다.
B. DAR 분포 및 정제
본 발명의 자리 특이적 항체와의 컨쥬게이션의 이점 중 하나는, 좁은 DAR 분포를 포함하는 비교적 균질한 ADC 제조물을 생성하는 능력이다. 이와 관련하여, 개시된 구성체 및/또는 선택적 컨쥬게이션은, 약물과 조작된 항체 사이의 화학량론적 비율에 대하여 샘플 내에서 ADC 종의 균질성을 제공한다. 상기에서 간단히 논의된 바와 같이, 용어 "약물 대 항체 비율" 또는 "DAR"은, 항체에 대한 약물의 몰비를 지칭한다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트 제조물은 그의 DAR 분포에 있어 실질적으로 균질할 수 있고, 이는 로딩 자리(즉, 유리 시스테인 상)에 대하여 또한 균일한 특정 DAR(예를 들어, 2 또는 4의 DAR)을 갖는 자리-특이적 ADC의 우세 종이 제조물 내에 존재함을 의미한다. 본 발명의 특정 구현예에서는, 자리-특이적 항체 및/또는 선택적 환원 및 컨쥬게이션의 사용을 통해 요망되는 균질성을 달성할 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 요망되는 균질성은 선택적 환원과 조합된 자리-특이적 구성체의 사용을 통해 달성될 수 있다. 또 다른 특히 바람직한 구현예에서, 제조물은 분석 또는 제조 크로마토그래피 기법을 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 이들 구현예 각각에서, ADC 샘플의 균질성은, 질량 분광측정, HPLC(예를 들어, 크기 배제 HPLC, RP-HPLC, HIC-HPLC 등) 또는 모세관 전기영동을 포함하나 이에 제한되지는 않는 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 분석될 수 있다.
ADC 제조물의 정제와 관련하여, 요망되는 순도를 얻기 위해 표준 제약 제조 방법이 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 본원에서 논의된 바와 같이, 액체 크로마토그래피 방법, 예컨대 역상(RP) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 혼합물 중의 화합물을 약물 로딩 값에 의해 분리할 수 있다. 일부 경우, 이온-교환(IEC) 또는 혼합식 크로마토그래피(MMC)를 사용하여 특정 약물 로드를 갖는 종을 단리할 수 있다.
개시된 ADC 및 그의 제조물은, 칼리케아마이신 및 항체 모이어티를, 항체의 구성 및, 적어도 부분적으로, 컨쥬게이션 수행을 위해 사용되는 방법에 따라 다양한 화학량론적 몰비로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, ADC 당 칼리케아마이신 로딩은 1 개 내지 20 개의 탄두(즉, n이 1 내지 20)를 포함할 수 있다. 다른 선택된 구현예는 1 개 내지 15 개의 탄두의 약물 로딩을 갖는 ADC를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, ADC는 1 개 내지 12 개의 탄두 또는, 보다 바람직하게는, 1 개 내지 10 개의 탄두를 포함할 수 있다. 바람직한 특정 구현예에서, ADC는 1 개 내지 8 개의 탄두를 포함할 것이다.
이론적 약물 로딩은 비교적 높을 수 있지만, 유리 시스테인 교차 반응성 및 탄두 소수성과 같은 실용적 제한은 응집물 및 기타 다른 오염물로 인한 이러한 DAR을 포함하는 균질한 제조물의 생성을 제한하는 경향이 있다. 즉, 보다 높은 약물 로딩, 예를 들어 >10은, 응집, 불용성, 독성, 또는 특정 항체-약물 컨쥬게이트의 세포 투과성 손실을 초래할 수 있다. 이러한 고려사항에 비추어, 본 발명에 의해 제공되는 실용적 약물 로딩은 바람직하게는 컨쥬게이트 당 1 개 내지 10 개의 약물 범위이고, 즉 여기서는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개의 약물이 각각의 항체에 공유 부착된다(예를 들어, IgG1의 경우, 기타 다른 항체는 디술피드 결합의 수에 따라 상이한 로딩능을 가질 수 있음). 바람직하게는 본 발명의 조성물의 DAR은 대략 2, 4 또는 6일 것이고, 특히 바람직한 구현예에서, DAR은 대략 2 또는 4를 포함할 것이다.
본 발명에 의해 제공되는 비교적 높은 수준의 균질성에도 불구하고, 개시된 조성물은 실제로, 1 개 내지 10 개(IgG1의 경우)의 칼리케아마이신 화합물 범위를 갖는 컨쥬게이트의 혼합물을 포함한다. 이와 같이, 개시된 ADC 조성물은, 대부분의 구성성분 항체가 하나 이상의 칼리케아마이신 모이어티에 공유 연결된, 또한 (선택적 환원의 컨쥬게이트 특이성에도 불구하고) 칼리케아마이신이 다양한 티올 기에 의해 항체에 부착될 수 있는 컨쥬게이트의 혼합물을 포함한다. 즉, 컨쥬게이션 후, 본 발명의 ADC 조성물은 (주로 유리 시스테인 교차 반응성에 의해 발생되는 특정 반응 오염물과 함께) 다양한 농도로 상이한 칼리케아마이신 로드(예를 들어, IgG1 항체 당 1 개 내지 10 개의 약물)를 갖는 컨쥬게이트의 혼합물을 포함할 것이다. 선택적 환원 및 제작후 정제를 사용하여, 컨쥬게이트 조성물을, 이들이, 비교적 낮은 수준의 기타 다른 ADC 종(예를 들어, 1 개, 3 개, 5 개 등의 약물 로딩을 가짐)을 가지면서 단일의 우세한 요망되는 ADC 종(예를 들어, 2 개 또는 4 개의 약물 로딩을 가짐)을 주로 함유하는 시점까지 유도할 수 있다. 평균 DAR 값은 전체적 조성(즉, 모든 ADC 종을 함께 합친 것)에 대한 칼리케아마이신 로딩의 가중 평균을 나타낸다. 사용되는 정량 방법에서의 본래의 불확정성 및 상업적 셋팅에서 비-우세 ADC 종을 완전히 제거하는 것의 어려움으로 인해, 허용가능한 DAR 값 또는 규격은 종종 평균, 범위 또는 분포(즉, 2 +/- 0.5의 평균 DAR)로서 제시된다. 바람직하게는, 범위(즉, 1.5 내지 2.5) 내의 측정 평균 DAR을 포함하는 조성물이 제약 셋팅에 사용될 것이다.
따라서, 바람직한 특정 구현예에서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8(각각 +/- 0.5)의 평균 DAR을 갖는 조성물을 포함할 것이다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 2, 4, 6 또는 8 +/- 0.5의 평균 DAR을 포함할 것이다. 마지막으로, 선택된 바람직한 구현예에서, 본 발명은 2 +/- 0.5의 평균 DAR을 포함할 것이다. 바람직한 특정 구현예에서 범위 또는 편차는 0.4 미만일 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 다른 구현예에서, 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8(각각 +/- 0.3)의 평균 DAR, 2, 4, 6 또는 8 +/- 0.3의 평균 DAR, 훨씬 더 바람직하게는 2 또는 4 +/- 0.3의 평균 DAR 또는 심지어 2 +/- 0.3의 평균 DAR을 포함할 것이다. 다른 구현예에서, IgG1 컨쥬게이트 조성물은 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8(각각 +/- 0.4)의 평균 DAR 및 비교적 낮은 수준(즉, 30% 미만)의 비-우세 ADC 종을 갖는 조성물을 포함할 것이다. 다른 바람직한 구현예에서, ADC 조성물은 2, 4, 6 또는 8(각각 +/- 0.4)의 평균 DAR과 비교적 낮은 수준(< 30%)의 비-우세 ADC 종을 포함할 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, ADC 조성물은 2 +/- 0.4의 평균 DAR과 비교적 낮은 수준(< 30%)의 비-우세 ADC 종을 포함할 것이다. 또 다른 구현예에서, 우세 ADC 종(예를 들어, 2 또는 4의 DAR)은, 기타 다른 DAR 종에 대하여 측정시, 65% 초과의 농도, 70% 초과의 농도, 75% 초과의 농도, 80% 초과의 농도, 85% 초과의 농도, 90% 초과의 농도, 93% 초과의 농도, 95% 초과의 농도 또는 심지어 97% 초과의 농도로 존재할 것이다.
하기 실시예에서 상술된 바와 같이, 컨쥬게이션 반응으로부터의 ADC의 제조물에서 항체 당 칼리케아마이신의 분포는, 종래의 수단, 예컨대 UV-Vis 분광측정법, 역상 HPLC, HIC, 질량 분광분석법, ELISA, 및 전기영동에 의해 특성화될 수 있다. 항체 당 약물에 대한 ADC의 정량 분포 또한 측정될 수 있다. ELISA에 의해, ADC의 특정 제조물에서의 항체 당 약물의 평균 값이 측정될 수 있다. 그러나, 항체 당 약물의 분포 값은, 항체-항원 결합 및 ELISA의 검출 한계에 의해 파악가능하지 않다. 또한, 항체-약물 컨쥬게이트의 검출을 위한 ELISA 분석은, 약물 모이어티가 항체, 예컨대 중쇄 또는 경쇄 단편, 또는 특정 아미노산 잔기에 부착된 위치를 측정하지 못한다.
VIII
제약 제조물 및 치료 용도
A. 제형 및 투여 경로
본 발명의 칼리케아마이신 ADC는 관련 분야에서 인식되는 기법을 사용하여 다양한 방식으로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 치료 ADC 조성물은 용매 없이 또는 최소량의 추가 성분과 함께 투여될 수 있으며, 다른 것들은 선택적으로 적합한 제약상 허용되는 담체를 함유하도록 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "제약상 허용되는 담체"는 당업계에 널리 공지된 부형제, 비히클, 애주번트 및 희석제를 포함하고, 이들은 제약 제조물에서의 사용을 위해 상업적 공급원으로부터 입수가능할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Gennaro (2003) Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed., Mack Publishing]; [Ansel et al. (2004) Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th ed., Lippencott Williams and Wilkins]; [Kibbe et al.(2000) Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd ed., Pharmaceutical Press] 참조).
적합한 제약상 허용되는 담체는 비교적 불활성이며 ADC의 투여를 용이하게 할 수 있거나 또는 활성 화합물의 작용 자리로의 전달을 위해 제약학적으로 최적화된 제조물로의 가공을 도울 수 있는 물질을 포함한다.
이러한 제약상 허용되는 담체는, 제형의 형태, 컨시스턴시(consistency), 점도, pH, 독성, 안정성, 삼투성, 약동학, 단백질 응집 또는 용해도를 변경할 수 있는 작용제를 포함하고, 이는 완충제, 습윤제, 유화제, 희석제, 캡슐화제 및 피부 침투 개선제를 포함하다. 담체의 특정 비-제한적 예는, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 아르기닌, 수크로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 소르비톨, 덱스트란, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스 및 이들의 조합을 포함한다. 전신 투여용 ADC는 장관, 비경구 또는 국소 투여를 위해 제형화될 수 있다. 실제로, 제형의 세 가지 유형 모두를 동시에 사용하여 활성 성분의 전신 투여를 달성할 수 있다. 부형제뿐만 아니라 비경구 및 비-비경구 약물 전달을 위한 제형이 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) 20th Ed. Mack Publishing]에 기재되어 있다.
장관 투여에 적합한 제형은 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 환제, 정제(코팅 정제 포함), 엘릭시르, 현탁액, 시럽 또는 흡입제 및 이들의 제어 방출 형태를 포함한다.
비경구 투여(예를 들어, 주사에 의한)에 적합한 제형은, 활성 성분이 용해되거나, 현탁되거나 또는 다른 방식으로 제공되어 있는(예를 들어, 리포좀 또는 기타 다른 마이크로미립자 내에) 수성 또는 비-수성, 등장성, 무-발열원, 멸균 액체(예를 들어, 용액, 현탁액)을 포함한다. 이러한 액체는 기타 다른 제약상 허용되는 담체, 예컨대 항산화제, 완충제, 보존제, 안정화제, 정균제, 현탁화제, 증점제, 및 제형이 의도된 수용자의 혈액(또는 기타 다른 관련 체액)과 등장성이 되게 하는 용질을 추가로 함유할 수 있다. 부형제의 예는, 예를 들어, 물, 알콜, 폴리올, 글리세롤, 식물성 오일 등을 포함한다. 이러한 제형에서의 사용에 적합한 등장성의 제약상 허용되는 담체는 염화나트륨 주사제, 링거액, 또는 락트산 링거액을 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제형화된 조성물은, 이후에 재구성된 후 투여될 수 있는 항체 또는 ADC의 분말화된 형태를 제공하도록 동결건조될 수 있다. 주사액의 제조를 위한 멸균 분말은, 개시된 항체 또는 ADC를 포함하는 용액을 동결건조시켜 임의의 선택적 공동-가용화된 생체적합성 성분과 함께 활성 성분을 포함하는 분말을 얻음으로써 생성될 수 있다. 일반적으로, 분산액 또는 용액은, 활성 화합물을 염기성 분산 매질 또는 용매(예를 들어, 희석제), 및 선택적으로 기타 다른 생체적합성 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 상용성 희석제는 제약상 허용되고(인간에게 투여하기에 안전하고 비-독성임) 액체 제형, 예컨대 동결건조 후 재구성된 제형의 제조에 유용할 것이다. 예시적 희석제는, 멸균수, 주사용 정균수(BWFI), pH 완충 용액(예를 들어, 포스페이트-완충 식염수), 멸균 식염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 대안적 구현예에서, 희석제는 완충제 및/또는 염의 수용액을 포함할 수 있다.
바람직한 특정 구현예에서, 항체 또는 ADC는 제약상 허용되는 당과 조합되어 동결건조될 것이다. "제약상 허용되는 당"은, 관심 단백질과 조합시, 저장에 따른 단백질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 현저히 막거나 감소시키는 분자이다. 제형은 동결건조되고 이어서 재구성되는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 바와 같이 제약상 허용되는 당은 또한 "동결건조보호제"로서 언급될 수 있다. 예시적 당 및 이들의 상응하는 당 알콜은, 아미노산, 예컨대 일나트륨 글루타메이트 또는 히스티딘; 메틸아민, 예컨대 베타인; 친액성 염, 예컨대 황산마그네슘; 폴리올, 예컨대 3가 또는 보다 높은 분자량의 당 알콜, 예를 들어 글리세린, 덱스트란, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨, 및 만니톨; 프로필렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; 플루로닉스(PLURONICS)®; 및 이들의 조합을 포함한다. 추가의 예시적 동결건조보호제는 글리세린 및 젤라틴, 및 당 멜리비오스, 멜레지토스, 라피노스, 만노트리오스 및 스타키오스를 포함한다. 환원 당의 예는 글루코스, 말토스, 락토스, 말툴로스, 이소-말툴로스 및 락툴로스를 포함한다. 비-환원 당의 예는 당 알콜 및 기타 다른 직쇄 폴리알콜로부터 선택되는 폴리히드록시 화합물의 비-환원 글리코시드를 포함한다. 바람직한 당 알콜은 모노글리코시드, 특히 디사카라이드, 예컨대 락토스, 말토스, 락툴로스 및 말툴로스의 환원에 의해 얻어진 화합물이다. 글리코시드 측기는 글루코시드 또는 갈락토시드 측기일 수 있다. 당 알콜의 추가의 예는, 글루시톨, 말티톨, 락티톨, 및 이소-말툴로스이다. 바람직한 제약상 허용되는 당은 비-환원 당 트레할로스 또는 수크로스이다. 제약상 허용되는 당은 "보호량"으로 제형에 첨가되고(예를 들어, 예비-동결건조), 이는 단백질이 저장 동안(예를 들어, 재구성 및 저장 후) 그의 물리적 및 화학적 안정성 및 일체성을 본질적으로 유지함을 의미한다.
당업자는, 상용성 동결건조보호제는, 약 1 mM 내지 약 1000 mM, 약 25 mM 내지 약 750 mM, 약 50 mM 내지 약 500 mM, 약 100 mM 내지 약 300 mM, 약 125 mM 내지 약 250 mM, 약 150 mM 내지 약 200 mM 또는 약 165 mM 내지 약 185 mM 범위의 농도로 액체 또는 동결건조된 제형에 첨가될 수 있음을 인지할 것이다. 특정 구현예에서, 동결건조보호제(들)는, 약 10 mM, 약 25 mM, 약 50 mM, 약 75 mM, 약 100 mM, 약 125 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 160 mM, 약 165 mM, 약 170 mM, 약 175 mM, 약 180 mM, 약 185 mM 약 190 mM, 약 200 mM, 약 225 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 400 mM, 약 500 mM, 약 600 mM, 약 700 mM, 약 800 mM 약 900 mM, 또는 약 1000 mM의 농도를 제공하도록 첨가될 수 있다. 바람직한 특정 구현예에서, 동결건조보호제(들)는 제약상 허용되는 당을 포함할 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 제약상 허용되는 당은 트레할로스 또는 수크로스를 포함할 수 있다.
다른 선택된 구현예에서, 본 발명의 액체 및 동결건조된 제형은, 안정화제 또는 완충제로서 작용하도록, 아미노산 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 특정 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 화합물은 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 5 mM 내지 약 75 mM, 약 5 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM 또는 약 15 mM 내지 약 25 mM 범위의 농도로 첨가될 수 있다. 특정 구현예에서, 완충제(들)는 약 1 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM 또는 약 100 mM의 농도를 제공하도록 첨가될 수 있다. 다른 선택된 구현예에서, 완충제는 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM 또는 약 100 mM의 농도를 제공하도록 첨가될 수 있다. 바람직한 특정 구현예에서, 완충제는 히스티딘 히드로클로라이드를 포함할 것이다.
또 다른 선택된 구현예에서, 본 발명의 액체 및 동결건조된 제형은 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 또는 폴리소르베이트 80을 안정화제로서 포함할 수 있다. 이러한 화합물은 약 0.1 mg/ml 내지 약 2.0 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 약 0.2 mg/ml 내지 약 0.8 mg/ml, 약 0.2 mg/ml 내지 약 0.6 mg/ml 또는 약 0.3 mg/ml 내지 약 0.5 mg/ml 범위의 농도로 첨가될 수 있다. 특정 구현예에서, 계면활성제는 약 0.1 mg/ml, 약 0.2 mg/ml, 약 0.3 mg/ml, 약 0.4 mg/ml, 약 0.5 mg/ml, 약 0.6 mg/ml, 약 0.7 mg/ml, 약 0.8 mg/ml, 약 0.9 mg/ml 또는 약 1.0 mg/ml의 농도를 제공하도록 첨가될 수 있다. 다른 선택된 구현예에서, 계면활성제는 약 1.1 mg/ml, 약 1.2 mg/ml, 약 1.3 mg/ml, 약 1.4 mg/ml, 약 1.5 mg/ml, 약 1.6 mg/ml, 약 1.7 mg/ml, 약 1.8 mg/ml, 약 1.9 mg/ml 또는 약 2.0 mg/ml의 농도를 제공하도록 첨가될 수 있다. 바람직한 특정 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 40을 포함할 것이다.
동결건조된 분말으로부터 재구성되든 원래 용액으로부터 재구성되든, 비경구 투여(예를 들어, 정맥내 주사)를 위한 개시된 항체 또는 ADC의 상용성 제형은 약 10 ㎍/mL 내지 약 100 mg/mL의 ADC 또는 항체 농도를 포함할 수 있다. 선택된 특정 구현예에서, 항체 또는 ADC 농도는 20 ㎍/mL, 40 ㎍/mL, 60 ㎍/mL, 80 ㎍/mL, 100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL, 300 ㎍/mL, 400 ㎍/mL, 500 ㎍/mL, 600 ㎍/mL, 700 ㎍/mL, 800 ㎍/mL, 900 ㎍/mL 또는 1 mg/mL를 포함할 것이다. 다른 구현예에서, ADC 농도는 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 8 mg/mL, 10 mg/mL, 12 mg/mL, 14 mg/mL, 16 mg/mL, 18 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL, 30 mg/mL, 35 mg/mL, 40 mg/mL, 45 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL 또는 100 mg/mL를 포함할 것이다.
어떤 경우에도, 본 발명의 화합물 및 조성물은, 이를 필요로 하는 대상체에게 경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 비경구, 비강내, 근육내, 심장내, 심실내, 기관내, 구강, 직장, 복강내, 피내, 국소, 경피, 및 경막내, 또는 다른 방식의 이식 또는 흡입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 경로에 의해 생체 내 투여될 수 있음을 인지할 것이다. 대상 조성물은, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌제, 관장제, 주사제, 흡입제, 및 에어로졸을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고체, 반-고체, 액체, 또는 기체 형태의 제조물로 제형화될 수 있다. 적절한 제형 및 투여 경로는 의도된 응용 및 치료 방식에 따라 선택될 수 있다.
B. 투여량
특정 투여량 방식, 즉, 용량, 시기 및 반복은 특정 개체뿐만 아니라, 경험적 고려사항, 예컨대 약동학(예를 들어, 반감기, 제거율 등)에 따라 달라질 것이다. 투여 빈도수의 결정은 당업자, 예컨대 담당의에 의해 병태 및 치료되는 병태의 중증도, 치료되는 대상체의 연령 및 일반적 건강 상태 등의 고려사항에 기초하여 이루어질 수 있다. 투여 빈도수는 선택된 조성물의 효능 평가 및 투여 방식에 기초하여 치료 과정에 걸쳐 조정될 수 있다. 이러한 평가는 특정 질환, 장애 또는 병태의 마커에 기초하여 이루어질 수 있다. 개체가 암을 갖는 구현예에서, 이들은 촉진(palpation) 또는 가시적 관찰을 통한 종양 크기의 직접적 측정; x선 또는 기타 다른 이미징 기법에 의한 종양 크기의 간접적 측정; 직접적 종양 생검 및 종양 샘플의 현미경 검사에 의해 평가된 개선; 본원에 기재된 방법에 따라 식별된 간접적 종양 마커(예를 들어, 전립선암에 대한 PSA) 또는 항원의 측정; 증식성 또는 종양형성 세포의 수 감소, 이러한 신생 세포의 감소 유지; 신생 세포의 증식 감소; 또는 전이 발생의 지연을 포함한다.
본 발명의 칼리케아마이신 ADC는 다양한 범위로 투여될 수 있다. 이들은 용량 당 약 5 ㎍/체중 kg 내지 약 100 mg/체중 kg; 용량 당 약 50 ㎍/체중 kg 내지 약 5 mg/체중 kg; 용량 당 약 100 ㎍/체중 kg 내지 약 10 mg/체중 kg을 포함한다. 기타 다른 범위는 용량 당 약 100 ㎍/체중 kg 내지 약 20 mg/체중 kg 및 용량 당 약 0.5 mg/체중 kg 내지 약 20 mg/체중 kg을 포함한다. 특정 구현예에서, 투여량은 적어도 약 100 ㎍/체중 kg, 적어도 약 250 ㎍/체중 kg, 적어도 약 750 ㎍/체중 kg, 적어도 약 3 mg/체중 kg, 적어도 약 5 mg/체중 kg, 적어도 약 10 mg/체중 kg을 포함한다.
선택된 구현예에서, ADC는 용량 당 대략 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 ㎍/체중 kg으로 투여(바람직하게는 정맥내)될 것이다. 다른 구현예는 용량 당 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 또는 2000 ㎍/체중 kg의 ADC 투여를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 개시된 컨쥬게이트는 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 9 또는 10 mg/kg으로 투여될 것이다. 또 다른 구현예에서, 컨쥬게이트는 용량 당 12, 14, 16, 18 또는 20 mg/체중 kg으로 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 컨쥬게이트는 용량 당 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 또는 100 mg/체중 kg으로 투여될 수 있다. 본원의 교시내용에서, 당업자는 특정 표적, 임상전 동물 연구, 임상 관찰 및 표준 의학 및 생화학 기법 및 측정에 기초하여 ADC에 대한 적절한 투여량을 쉽게 결정할 수 있다.
다른 투여 방식은 U.S.P.N. 7,744,877에 개시된 바와 같은 체표면적(BSA) 계산으로 설명될 수 있다. 널리 공지된 바와 같이, BSA는 환자의 신장 및 체중을 사용하여 계산되고, 이는 대상체 신체의 표면적으로 나타내어지는 바와 같이 대상체의 크기에 대한 척도를 제공한다. 특정 구현예에서, 컨쥬게이트는 1 mg/㎡ 내지 800 mg/㎡, 50 mg/㎡ 내지 500 mg/㎡의 투여량으로, 또한 100 mg/㎡, 150 mg/㎡, 200 mg/㎡, 250 mg/㎡, 300 mg/㎡, 350 mg/㎡, 400 mg/㎡ 또는 450 mg/㎡의 투여량으로 투여될 수 있다. 또한, 관련 분야에 인식된 및 경험적 기법을 사용하여 적절한 투여량을 결정할 수 있음을 인지할 것이다.
개시된 ADC는 특정 스케쥴로 투여될 수 있다. 일반적으로, 유효 용량의 칼리케아마이신 컨쥬게이트를 대상체에게 1 회 이상 투여한다. 보다 구체적으로, 유효 용량의 개시된 ADC를 주 1 회, 2 주에 1 회, 3 주에 1 회, 월 1 회 또는 월 1 회 미만으로 투여한다. 특정 구현예에서는, 유효 용량의 선택된 ADC를, 적어도 1 개월, 적어도 6 개월, 적어도 1 년, 적어도 2 년 또는 수 년의 기간 동안을 포함하여 다수 회 투여할 수 있다. 또 다른 구현예에서는, 개시된 항체 또는 ADC의 투여 사이에 수일 (2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일 또는 7일), 수주(1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주 또는 8 주) 또는 수개월(1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월 또는 8 개월) 또는 심지어 1 년 또는 수 년이 경과할 수 있다.
바람직한 특정 구현예에서, 컨쥬게이션된 항체를 포함하는 치료 과정은 수주 또는 수개월의 기간에 걸쳐 선택된 약물 생성물의 다중 용량을 포함할 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 항체 또는 ADC는 매일, 2 일마다, 4 일마다, 매주, 10 일마다, 2 주마다, 3 주마다, 매월, 6 주마다, 2 개월마다, 10 주마다 또는 3 개월마다 1 회 투여할 수 있다. 이와 관련하여, 환자 반응 및 임상 실무에 따라 투여량이 변경될 수 있거나 간격이 변경될 수 있음을 인지할 것이다.
투여량 및 방식은 또한 하나 이상의 투여(들)를 받은 개체에서 개시된 치료 조성물에 대하여 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 개체는 점증적 투여량의 본원에 기재된 바와 같이 제조된 치료 조성물을 받을 수 있다. 선택된 구현예에서, 투여량은 각각 경험적으로 측정된 또는 관찰된 부작용 또는 독성에 기초하여 점차 증가되거나 감소 또는 희박화될 수 있다. 선택된 조성물의 효능을 평가하기 위해, 특정 질환, 장애 또는 병태의 마커가 상기에 기재된 바에 따를 수 있다. 암에 대하여, 이들은 촉진 또는 또는 가시적 관찰을 통한 종양 크기의 직접적 측정; x선 또는 기타 다른 이미징 기법에 의한 종양 크기의 간접적 측정; 직접적 종양 생검 및 종양 샘플의 현미경 검사에 의해 평가된 개선; 본원에 기재된 방법에 따라 식별된 간접적 종양 마커(예를 들어, 전립선암에 대한 PSA) 또는 종양형성 항원의 측정, 통증 또는 마비의 감소; 개선된 언어능력, 시력, 호흡 또는 기타 다른 종양 연관 장애; 증가된 식욕; 허용 시험에 의해 측정된 삶의 질 개선 또는 생존 연장을 포함한다. 투여량은 개체, 신생 병태의 유형, 신생 병태의 단계, 신생 병태가 개체에서 기타 다른 위치로 전이되기 시작했는지의 여부, 및 사용되는 과거 및 동시 치료에 따라 달라질 것임이 당업자에게 명백할 것이다.
C. 조합 요법
조합 요법은 원치않는 신생 세포 증식의 감소 또는 억제, 암 발병의 감소, 암 재발의 감소 또는 방지, 또는 암 확산 또는 전이의 감소 또는 방지에 특히 유용할 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 항체 또는 ADC는, 다른 경우에는 종양 덩어리를 받쳐주거나 영속시킬 것인 CSC를 제거함으로써 감작제 또는 화학감작제로서 기능하고, 이로써 현재의 관리 기준 용적축소제 또는 항암제의 보다 효과적인 사용을 가능하게 할 수 있다. 즉, 개시된 항체 또는 ADC는, 특정 구현예에서, 또 다른 투여 치료제의 작용 방식을 강력화하는 증대된 효과(예를 들어, 성질상 부가적 또는 상승작용적 효과)를 제공한다. 본 발명의 문맥에서, "조합 요법"은 광범위하게 해석될 것이며, 이는 단지 칼리케아마이신 항체 또는 ADC, 및 세포독성제, 세포정지제, 항혈관형성제, 용적축소제, 화학요법제, 방사선요법 및 방사선요법제, 표적화 항암제(모노클로날 항체 및 소분자 실체), BRM, 치료 항체, 암 백신, 시토킨, 호르몬 요법, 방사선 요법 및 항전이제 및 면역요법제(특이적 및 비-특이적 접근 둘 다 포함)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 항암제의 투여를 지칭한다.
조합 결과가, 각각의 치료(예를 들어, 칼리케아마이신 ADC 및 항암제)가 별도로 수행되는 경우에 나타나는 효과에 부가적이 되어야 한다는 요건은 없다. 적어도 부가적 효과가 일반적으로 바람직하지만, 단일 요법 중 하나를 초과하는 임의의 증가된 항종양 효과가 유리하다. 또한, 본 발명은 조합 치료가 상승작용적 효과를 나타낼 것을 필요로 하지 않는다. 그러나, 당업자는, 바람직한 구현예를 포함하는 선택된 특정 조합으로 상승작용이 나타날 수 있음을 인지할 것이다.
이와 같이, 특정 측면에서, 조합 요법은, (i) ADC 단독 사용, 또는 (ii) 치료 모이어티 단독 사용, 또는 (iii) ADC가 첨가되지 않은 또 다른 치료 모이어티와 조합된 치료 모이어티의 사용에 비해, 치료 상승작용을 갖거나 암 치료에서 측정가능한 치료 효과를 개선시킨다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "치료 상승작용"은, ADC 및 하나 이상의 치료 모이어티(들)의 조합의 부가적 효과보다 더 큰 치료 효과를 갖는 ADC 및 하나 이상의 치료 모이어티(들)의 조합을 의미한다.
개시된 조합의 요망되는 결과는 대조군 또는 기준선 측정과 비교하여 정량된다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "개선", "증가" 또는 "감소"와 같은 상대적 용어는 대조군, 예컨대 본원에 기재된 치료 개시 전 동일한 개체에서의 측정, 또는 본원에 기재된 개시된 ADC는 부재하지만 기타 다른 치료 모이어티(들), 예컨대 관리 표준 치료제가 존재하는 대조군 개체(또는 다수의 대조군 개체)에서의 측정에 대해 상대적인 값을 나타낸다. 대표적 대조군 개체는, 치료되는 개체와 동일한 형태의 암을 겪고, 치료되는 개체와 대략 동일한 연령인 개체(치료 개체와 대조군 개체에서의 질환 단계가 유사하도록 보장하기 위해)이다.
요법에 반응하는 변화 또는 개선은 일반적으로 통계적으로 유의하다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "유의성" 또는 "유의한"은, 둘 이상의 실체 사이의 비-랜덤 회합이 존재할 확률의 통계적 분석에 관한 것이다. 관계가 "유의한" 것이거나 또는 "유의성"을 갖는지의 여부를 결정하기 위해, "p-값"이 계산될 수 있다. 사용자-정의 컷오프 점 미만에 있는 P-값이 유의한 것으로 간주된다. 0.1 이하, 0.05 미만, 0.01 미만, 0.005 미만, 또는 0.001 미만의 p-값이 유의한 것으로 간주될 수 있다.
상승작용적 치료 효과는, 단일 치료 모이어티 또는 칼리케아마이신 ADC에 의해 유도된 치료 효과, 또는 주어진 조합의 ADC 또는 단일 치료 모이어티(들)에 의해 유도된 치료 효과의 합계의 적어도 약 2 배 초과, 또는 적어도 약 5 배 초과, 또는 적어도 약 10 배 효과, 또는 적어도 약 20 배 초과, 또는 적어도 약 50 배 초과, 또는 적어도 약 100 배 초과의 효과일 수 있다. 상승작용적 치료 효과는 또한, 단일 치료 모이어티 또는 ADC에 의해 유도된 치료 효과, 또는 주어진 조합의 ADC 또는 단일 치료 모이어티(들)에 의해 유도된 치료 효과의 합계에 비해 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 100%, 또는 그 이상의 치료 효과 증가로서 나타날 수 있다. 상승작용적 효과는 또한, 치료제의 조합 사용시 치료제의 감소된 투여를 허용하는 효과이다.
조합 요법의 실시에서, 칼리케아마이신 ADC 및 치료 모이어티(들)는 동시에, 단일 조성물로, 또는 둘 이상의 별개의 조성물로서 동일한 또는 상이한 투여 경로를 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, ADC로의 치료는, 예를 들어 수분 내지 수주 범위의 간격으로, 치료 모이어티 치료 이전에 또는 이후에 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서는, 치료 모이어티 및 ADC 둘 다 서로 약 5분 내지 약 2주 이내에 투여된다. 또 다른 구현예에서는, ADC 및 치료 모이어티의 투여 사이에 수 일(2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일 또는 7 일), 수 주(1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주 또는 8 주) 또는 수 개월(1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월 또는 8 개월)이 경과할 수 있다.
조합 요법은 다양한 스케쥴로, 예컨대 1 일 1 회, 2 회 또는 3 회, 2 일에 1 회, 3 일에 1 회, 매주 1 회, 2 주에 1 회, 매월 1 회, 2 개월에 1 회, 3 개월에 1 회, 6 개월에 1 회로 병태가 치료되거나, 경감되거나 또는 치유될 때까지 투여될 수 있거나, 또는 연속 투여될 수 있다. 선택된 ADC 및 치료 모이어티(들)는 격일 또는 격주로 투여될 수 있거나; 또는 일련의 ADC 치료가 주어진 후, 추가의 치료 모이어티로의 하나 이상의 치료가 이어질 수 있다. 하나의 구현예에서, ADC는 짧은 치료 사이클 동안 하나 이상의 치료 모이어티(들)와 조합 투여된다. 다른 구현예에서, 조합 치료는 긴 치료 사이클 동안 투여된다. 조합 요법은 임의의 경로를 통해 투여될 수 있다.
일부 구현예에서는, 칼리케아마이신 ADC를 다양한 제1 라인 암 치료와 조합하여 사용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 조합 요법은 ADC 및 세포독성제, 예컨대 이포스파미드, 미토마이신 C, 빈데신, 빈블라스틴, 에토포시드, 이로니테칸, 겜시타빈, 탁산, 비노렐빈, 메토트렉세이트, 및 페메트렉세드) 및 선택적으로 하나 이상의 기타 다른 치료 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 조합 요법은 ADC 및 백금 기재의 약물(예를 들어, 카르보플라틴 또는 시스플라틴) 및 선택적으로 하나 이상의 기타 다른 치료 모이어티(들)(예를 들어, 비노렐빈; 겜시타빈; 탁산, 예컨대 도세탁셀 또는 파클리탁셀; 이리노티칸; 또는 페메트렉세드)의 사용을 포함한다.
선택된 구현예에서, 본 발명의 화합물 및 조성물은 체크포인트 억제제, 예컨대 PD-1 억제제 또는 PD-L1 억제제와 함께 사용될 수 있다. PD-1은, 그의 리간드 PD-L1과 함께, 항종양 T 림프구 반응의 네거티브 조절제이다. 하나의 구현예에서, 조합 요법은 항PD-1 항체(예를 들어, 펨브롤리주맵, 니볼루맵, 피딜리주맙) 및 선택적으로 하나 이상의 기타 다른 치료 모이어티(들)와 함께 칼리케아마이신 ADC의 투여를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조합 요법은 항PD-L1 항체(예를 들어, 아벨루맵, 아테졸리주맵, 두르발루맙) 및 선택적으로 하나 이상의 기타 다른 치료 모이어티(들)와 함께 칼리케아마이신 ADC의 투여를 포함할 수 있다. 또한 또 다른 구현예에서, 조합 요법은, 체크포인트 억제제 및/또는 표적화된 BRAF 조합 요법(예를 들어, 베무라페닙 또는 다브라피닙)으로의 치료에 따르는 진전을 계속하고 있는 환자에게 투여된 항PD-1 항체 또는 항PD-L1와 함께 칼리케아마이신 ADC의 투여를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 예를 들어, BR-ERPR, BR-ER 또는 BR-PR 암의 치료에서, 조합 요법은 ADC 및 "호르몬 요법"으로서 기재되는 하나 이상의 치료 모이어티의 사용을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "호르몬 요법"은, 예를 들어, 타목시펜; 고나도트로핀 또는 황체형성 방출 호르몬(GnRH 또는 LHRH); 에베롤리무스 및 엑세메스탄; 토레미펜; 또는 아로마타제 억제제(예를 들어, 아나스트로졸, 레트로졸, 엑세메스탄 또는 풀베스트란트)를 지칭한다.
또 다른 구현예에서, 예를 들어, BR-HER2의 치료에서, 조합 요법은 ADC 및 트라스투주맙 또는 아도-트라스투주맙 엠탄신 및 선택적으로 하나 이상의 기타 다른 치료 모이어티(들)(예를 들어, 페르투주맙 및/또는 도세탁셀)의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 전이성 유방암의 치료에서, 조합 요법은 개시된 ADC 및 탁산(예를 들어, 도세탁셀 또는 파클리탁셀) 및 선택적으로 추가의 치료 모이어티(들), 예를 들어, 안트라사이클린(예를 들어, 독소루비신 또는 에피루비신) 및/또는 에리불린의 사용을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 예를 들어, 전이성 또는 재발성 유방암 또는 BRCA-돌연변이 유방암의 치료에서, 조합 요법은 개시된 ADC 및 메게스트롤 및 선택적으로 추가의 치료 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
추가의 구현예에서, 예를 들어, BR-TNBC의 치료에서, 조합 요법은 칼리케아마이신 ADC 및 폴리 ADP 리보스 폴리머라제(PARP) 억제제(예를 들어, BMN-673, 올라파립, 루카파립 및 벨리파립) 및 선택적으로 추가의 치료 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 예를 들어, 유방암의 치료에서, 조합 요법은 개시된 ADC 및 시클로포스파미드 및 선택적으로 추가의 치료 모이어티(들)(예를 들어, 독소루비신, 탁산, 에피루비신, 5-FU 및/또는 메토트렉세이트의 사용을 포함한다.
또 다른 구현예에서, EGFR-포지티브 NSCLC의 치료를 위한 조합 요법은 개시된 ADC 및 아파티닙 및 선택적으로 하나 이상의 기타 다른 치료 모이어티(들)(예를 들어, 에를로티닙 및/또는 베바시주맙)의 사용을 포함한다.
또 다른 구현예에서, EGFR-포지티브 NSCLC의 치료를 위한 조합 요법은 ADC 및 에를로티닙 및 선택적으로 하나 이상의 기타 다른 치료 모이어티(들)(예를 들어, 베바시주맙)의 사용을 포함한다.
또 다른 구현예에서, ALK-포지티브 NSCLC의 치료를 위한 조합 요법은 ADC 및 세리티닙 및 선택적으로 하나 이상의 기타 다른 치료 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
또 다른 구현예에서, ALK-포지티브 NSCLC의 치료를 위한 조합 요법은 ADC 및 크리조티닙 및 선택적으로 하나 이상의 기타 다른 치료 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 조합 요법은 ADC 및 베바시주맙 및 선택적으로 하나 이상의 기타 다른 치료 모이어티(들)(예를 들어, 탁산, 예컨대 도세탁셀 또는 파클리탁셀; 및/또는 백금 유사체)의 사용을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 조합 요법은 ADC 및 베바시주맙 및 선택적으로 하나 이상의 기타 다른 치료 모이어티(들)(예를 들어, 겜시타빈 및/또는 백금 유사체)의 사용을 포함한다.
특정 구현예에서, 백금-내성 종양의 치료를 위한 조합 요법은 ADC 및 독소루비신 및/또는 에토포시드 및/또는 겜시타빈 및/또는 비노렐빈 및/또는 이포스파미드 및/또는 류코보린-조절된 5-플루오로우실 및/또는 베바시주맙 및/또는 타목시펜; 및 선택적으로 하나 이상의 기타 다른 치료 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 조합 요법은 ADC 및 PARP 억제제 및 선택적으로 하나 이상의 기타 다른 치료 모이어티(들)의 사용을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 조합 요법은 ADC 및 베바시주맙 및 선택적으로 시클로포스파미드의 사용을 포함한다.
조합 요법은 ADC 및 돌연변이된 또는 비-정상 발현된 유전자 또는 단백질(예를 들어, BRCA1)을 포함하는 종양에 대해 효과적인 화학요법 모이어티를 포함할 수 있다.
T 림프구(예를 들어, 세포독성 림프구(CTL))는 악성 종양에 대한 숙주 방어에 있어 중요한 역할을 한다. CTL은 항원 제시 세포 상의 종양 연관 항원의 제시에 의해 활성화된다. 활성 특이적 면역요법은, 환자에게 공지된 암 연관 항원으로부터 유래된 펩티드를 백신접종합으로써 암에 대한 T 림프구 반응을 증대시키는 데 사용될 수 있는 방법이다. 하나의 구현예에서, 조합 요법은 ADC 및 암 연관 항원에 대한 백신(예를 들어, 멜라노사이트-계통 특이적 항원 티로시나제, gp100, Melan-A/MART-1 또는 gp75)을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 조합 요법은 자가조직 CTL 또는 천연 킬러 세포의 시험관 내 확장, 활성화, 및 채택 재도입과 함께 ADC의 투여를 포함할 수 있다. CTL 활성화는 또한, 항원 제시 세포에 의한 종양 항원 제시를 증대시키는 전략에 의해 촉진될 수 있다. 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)는 수지상 세포의 점증 및 수지상 세포 교차-프라이밍의 활성화를 촉진시킨다. 하나의 구현예에서, 조합 요법은, 개시된 ADC 및 선택적으로 하나 이상의 상이한 치료 모이어티(들)의 사용과 조합된 항원 제시 세포의 단리, 자극성 시토킨(예를 들어, GM-CSF)로의 이러한 세포의 활성화, 종양-연관 항원으로의 프라이밍, 및 이어서 환자로의 항원 제시 세포의 채택 재도입을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 ADC는 하기에 기재된 항암제 중 하나 이상과 조합되어 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "항암제" 또는 "화학요법제"는, 또한 "제약 활성 모이어티"로서 기재된 작용제의 서브세트인, "치료 모이어티"의 하나의 서브세트이다. 보다 구체적으로, "항암제"는 암과 같은 세포증식성 장애를 치료하는 데 사용될 수 있는 임의의 작용제를 의미하고, 세포독성제, 세포정지제, 항혈관형성제, 용적축소제, 화학요법제, 방사선요법 및 방사선치료제, 표적화된 항암제, 생체 반응 조절제, 치료 항체, 암 백신, 시토킨, 호르몬 요법, 항전이제 및 면역요법제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기에 논의된 바와 같은 선택된 구현예에서, 이러한 항암제는 항체 약물 컨쥬게이트를 포함할 수 있고, 투여 전 항체와 회합될 수 있음을 인지할 것이다. 특정 구현예에서, 생성된 항암제 ADC는 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 ADC와 조합되어 사용될 수 있다.
항암제일 수 있는 용어 "세포독성제"는, 세포에 대해 독성이고 세포의 기능을 감소시키거나 억제하고/억제하거나 세포의 파괴를 일으키는 물질을 의미한다. 통상적으로, 물질은 살아 있는 유기체로부터 유래된 천연 분자(또는 합성적으로 제조된 천연 생성물)이다. 세포독성제의 예는, 박테리아의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소(예를 들어, 디프테리아(Diptheria) 독소, 슈도모나스(Pseudomonas) 내독소 및 외독소, 스타필로코칼(Staphylococcal) 장독소 A), 진균(예를 들어, α-사르신, 레스트릭토신), 식물(예를 들어, 아브린, 리신, 모데신, 비스쿠민, 포크위드 항바이러스 단백질, 사포린, 겔로닌, 모모리딘, 트리코산틴, 보리 독소, 알류라이테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이토라카 메리카나(Phytolacca mericana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 억제제, 미테겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 네오마이신, 및 트리코테세네스) 또는 동물(예를 들어, 세포독성 RN아제, 예컨대 세포외 췌장 RN아제; DN아제 I(이들의 단편 및/또는 변이체 포함))을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
항암제는, 암 세포 또는 암성이 될 또는 종양형성 자손(예를 들어, 종양형성 세포)을 생성할 가능성이 있는 세포를 억제하거나 이를 억제하도록 디자인된 임의의 화학 작용제를 포함할 수 있다. 이러한 화학 작용제는 종종 세포 성장 또는 분할을 위해 필수적인 세포내 과정에 관련되고, 따라서 특히 일반적으로 빠르게 성장하고 분할되는 암 세포에 대해 효과적이다. 예를 들어, 빈크리스틴은 미소관을 해중합시키고, 따라서 세포가 유사분열로 도입되는 것을 억제한다. 이러한 작용제는 종종, 조합되어, 예를 들어 제형 CHOP에서 투여되고, 여기서 가장 효과적이다. 또한, 선택된 구현예에서, 이러한 항암제는 개시된 항체에 컨쥬게이션될 수 있다.
본 발명의 칼리케아마이신 ADC와 조합되어 사용될 수 있는 항암제의 예는, 알킬화제, 알킬 술포네이트, 아나스트로졸, 아마니틴, 아지리딘, 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 아세토게닌, 캄프토테신, BEZ-235, 보르테조밉, 브리요스타틴, 칼리스타틴, CC-1065, 세리티닙, 크리조티닙, 크립토파이신, 돌라스타틴, 듀오카르마이신, 엘류테로빈, 에를로티닙, 판크라티스타틴, 사르코딕티인, 스폰지스타틴, 질소 머스타드, 항생제, 엔디인 다이네미신, 비스포스포네이트, 에스페라미신, 크로모단백질 엔디인 항생 크로모포어, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칸포스파미드, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 시클로스포스파미드, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 엑세메스탄, 플루오로우라실, 풀베스트란트, 게피티닙, 이다루비신, 라파티닙, 레트로졸, 로나파르닙, 마르셀로마이신, 메게스트롤 아세테이트, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 파조파닙, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, ?"라마이신, 라파마이신, 로도루비신, 소라페닙, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 타목시펜, 타목시펜 시트레이트, 테모졸로미드, 테포디나, 티피파르닙, 투베르시닌, 우베니멕스, 반데타닙, 보로졸, XL-147, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물질, 폴산 유사체, 퓨린 유사체, 안드로겐, 항부신제, 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산, 아세글라톤, 알도포스파미드 글리코시드, 아미노레불린산, 에닐우라실, 암사크린, 베스트라부실, 비산트렌, 에다트락세이트, 데포파민, 데메콜신, 디아지쿠온, 엘포르니틴, 엘리프티늄 아세테이트, 에포틸론, 에토글루시드, 갈륨 니트레이트, 히드록시우레아, 렌티난, 로니다이닌, 마이탄시노이드, 미토구아존, 미톡산트론, 모피단몰, 니트라에린, 펜토스타틴, 페나메트, 피라루비신, 로속산트론, 포도필린산, 2-에틸히드라지드, 프로카르바진, 폴리사카라이드 복합체, 라족산; 리족신; SF-1126, 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드; 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 클로란부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 빈블라스틴; 백금; 에토포시드; 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; 이리노테칸, 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴; 레티노이드; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린; 옥살리플라틴; 세포 증식을 감소시키는 PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR 및 VEGF-A의 억제제, XL518 및 이들 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물, 산 또는 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 이 정의에는, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하도록 작용하는 항호르몬제, 예컨대 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 항체, 부신에서의 에스트로겐 생성을 조절하는, 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 및 항안드로겐; 뿐만 아니라 트록사시타빈(1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 예컨대 VEGF 발현 억제제 및 HER2 발현 억제제; 백신, 프롤류킨(PROLEUKIN)® rIL-2; 루르토테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라미신(Esperamicin) 및 이들 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물, 산 또는 유도체가 포함된다.
특히 바람직한 항암제는 상업적으로 또는 임상적으로 이용가능한 화합물, 예컨대 에를로티닙(타르세바(TARCEVA)®, 제넨텍(Genentech)/오에스아이 파마슈티칼즈(OSI Pharm.)), 도세탁셀(탁소테레(TAXOTERE)®, 사노피-아벤티스(Sanofi-Aventis)), 5-FU(플루오로우라실, 5-플루오로우라실, CAS No. 51-21-8), 겜시타빈(겜자르(GEMZAR)®, 릴리(Lilly)), PD-0325901(CAS No. 391210-10-9, 화이자(Pfizer)), 시스플라틴(시스-디아민, 디클로로백금(II), CAS No. 15663-27-1), 카르보플라틴(CAS No. 41575-94-4), 파클리탁셀(탁솔(TAXOL)®, 브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology, 미국 뉴저지주 프린스톤)), 트라스투주맙(헤르셉틴(HERCEPTIN)®, 제넨텍), 테모졸로미드(4-메틸-5-옥소-2,3,4,6,8-펜타자비시클로 [4.3.0] 노나-2,7,9-트리엔-9-카르복사미드, CAS No. 85622-93-1, 테모다르(TEMODAR)®, 테모달(TEMODAL)®, 쉐링 플로우(Schering Plough)), 타목시펜((Z)-2-[4-(1,2-디페닐부트-1-에닐)페녹시]-N,N-디메틸에탄아민, 놀바덱스(NOLVADEX)®, 이스투발(ISTUBAL)®, 발로덱스(VALODEX)®), 및 독소루비신(아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®)을 포함한다. 추가의 상업적으로 또는 임상적으로 이용가능한 항암제는 옥살리플라틴(엘록사틴(EL옥사TIN)®, 사노피), 보르테조밉(벨카데(VELCADE)®, 밀레니엄 파마슈티칼즈(Millennium Pharm.)), 수텐트(수니티닙(SUNITINIB)®, SU11248, 화이자), 레트로졸(페마라(FEMARA)®, 노바티스(Novartis)), 이마티닙 메실레이트(글리벡(GLEEVEC)®, 노바티스), XL-518(Mek 억제제, 엑셀릭시스(Exelixis), WO 2007/044515), ARRY-886 (Mek 억제제, AZD6244, 어레이 바이오파마(Array BioPharma), 아스트라 제네카(Astra Zeneca)), SF-1126(PI3K 억제제, 세마포레 파마슈티칼즈(Semafore Pharmaceuticals)), BEZ-235(PI3K 억제제, 노바티스), XL-147 (PI3K 억제제, 엑셀릭시스), PTK787/ZK 222584(노바티스), 풀베스트란트(파슬로덱스(FASLODEX)®, 아스트라제네카), 류코보린(폴린산), 라파마이신(시롤리무스, 라파뮨(RAPAMUNE)®, 와이어스(Wyeth)), 라파티닙(티케르브(TYKERB)®, GSK572016, 글락소 스미스 클라인(Glaxo Smith Kline)), 로나파르닙(사라사르(SARASAR)™, SCH 66336, 쉐링 플로우), 소라페닙(넥사바르(NEXAVAR)®, BAY43-9006, 바이엘 랩스(Bayer Labs)), 게피티닙(이레사(IRESSA)®, 아스트라제네카), 이리노테칸(캄프토사르(CAMPTOSAR)®, CPT-11, 화이자), 티피파르닙(자르네스트라(ZARNESTRA)™, 존슨 앤 존슨(Johnson & Johnson)), 아브락산(ABRAXANE)™(크레모포르-무함유), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형(아메리칸 파마슈티칼 파트너스(American Pharmaceutical Partners, 미국 일리노이주 샴버그), 반데타닙(rINN, ZD6474, 작티마(ZACTIMA)®, 아스트라제네카), 클로람부실, AG1478, AG1571(SU 5271; 수겐(Sugen)), 템시롤리무스(토리셀(TORISEL)®, 와이어스), 파조파닙(글락소 스미스 클라인), 칸포스파미드(텔시타(TELCYTA)®, 텔릭(Telik)), 티오테파 및 시클로스포스파미드(시톡산(CYTOXAN)®, 네오사르(NEOSAR)®); 비노렐빈(나벨빈(NAVELBINE)®); 카페시타빈(크셀로다(XELODA)®, 로셰(Roche)), 타목시펜(놀바덱스(NOLVADEX)® 포함); 타목시펜 시트레이트, 파레스톤(FARESTON)®(토레미핀 시트레이트) 메가세(MEGASE)®(메게스트롤 아세테이트), 아로마신(AROMASIN)®(엑세메스탄; 화이자), 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)®(보로졸), 페마라(FEMARA)®(레트로졸; 노바티스), 및 아리미덱스(ARIMIDEX)®(아나스트로졸; 아스트라제네카)를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 ADC는, 현재 임상 시험 중인 또는 상업적으로 입수가능한 다수의 항체(또는 면역요법제) 중 어느 하나와 조합되어 사용될 수 있다. 개시된 항체는, 아바고보맵, 아데카투무맵, 아푸투주맵, 알렘투주맵, 알투모맵, 아마툭시맵, 아나투모맵, 아르시투모맵, 바비툭시맵, 베크투모맵, 베바시주맵, 비바투주맵, 블리나투모맵, 브렌툭시맵, 칸투주맵, 카투막소맵, 세툭시맵, 시타투주맵, 식수투무맵, 클리바투주맵, 코나투무맵, 다라투무맵, 드로지투맵, 둘리고투맵, 두시기투맵, 데투모맵, 다세투주맵, 달로투주맵, 에크로멕시맵, 엘로투주맵, 엔시툭시맵, 에르투막소맵, 에타라시주맵, 파를레투주맵, 피클라투주맵, 피기투무맵, 플란보투맵, 푸툭시맵, 가니투맵, 겜투주맵, 기렌툭시맵, 글렘바투무맵, 이브리투모맵, 이고보맵, 임가투주맵, 인다툭시맵, 이노투주맵, 인테투무맵, 이필리무맵, 이라투무맵, 라베투주맵, 람브롤리주맵, 렉사투무맵, 린투주맵, 로르보투주맵, 루카투무맵, 마파투무맵, 마투주맵, 밀라투주맵, 민레투모맵, 미투모맵, 목세투모맵, 나르나투맵, 나프투모맵, 네시투무맵, 니모투주맵, 니볼루맵, 노페투모맵, 오비누투주맵, 오카라투주맵, 오파투무맵, 올라라투맵, 올라파립, 오나르투주맵, 오포르투주맵, 오레고보맵, 파니투무맵, 파르사투주맵, 파트리투맵, 펨투모맵, 페르투주맵, 피딜리주맵, 핀투모맵, 프리투무맵, 라코투모맵, 라드레투맵, 라무시루맵, 릴로투무맵, 리툭시맵, 로바투무맵, 사투모맵, 셀루메티닙, 시브로투주맵, 실툭시맵, 심투주맵, 솔리토맵, 타카투주맵, 타플리투모맵, 테나투모맵, 테프로투무맵, 티가투주맵, 토시투모맵, 트라스투주맵, 투코투주맵, 우블리툭시맵, 벨투주맵, 보르세투주맵, 보투무맵, 잘루투무맵, CC49, 3F8, MDX-1105 및 MEDI4736 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체와 조합되어 사용될 수 있다.
다른 특히 바람직한 구현예는, 리툭시맵, 겜투주맵 오조감신, 알렘투주맵, 이브리투모맵 티욱세탄, 토시투모맵, 베바시주맵, 세툭시맵, 파티투무맵, 오파투무맵, 이필리무맵 및 브렌툭시맵 베도틴을 포함하나 이에 제한되지는 않는 암 치료에 대해 승인된 항체의 사용을 포함한다. 당업자는 본원의 교시내용과 상용성인 추가의 항암제를 쉽게 식별할 수 있을 것이다.
D. 방사선요법
본 발명은 또한 ADC와 방사선요법(즉, 종양 세포 내에서 국소적으로 DNA 손상을 유도하는 임의의 메커니즘, 예컨대 감마-광조사, X선, UV-광조사, 마이크로파, 전자 방출 등)의 조합을 제공한다. 종양 세포에 대한 방사성동위원소의 지향 전달을 사용한 조합 요법 또한 고려되고, 개시된 ADC는 표적화 항암제 또는 기타 다른 표적화 수단과 함께 사용될 수 있다. 통상적으로, 방사선 요법은 약 1주 내지 약 2주의 기간에 걸쳐 펄스로 투여된다. 방사선 요법은 두부 및 경부 암을 갖는 대상체에게 약 6주 내지 7주 동안 투여될 수 있다. 선택적으로, 방사선 요법은 단일 용량으로서 또는 다중 순차적 용량으로서 투여될 수 있다.
IX
지시
본 발명은, 신생, 염증, 혈관형성 및 면역 장애 및 병원균 유발 장애를 포함하는 다양한 장애의 진단, 테라그노시스, 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명의 ADC의 용도를 제공한다. 특히, 치료를 위한 주요 표적은 고형 종양을 포함하는 신생 병태이지만, 혈액학적 악성 종양도 본 발명의 범위 내에 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 ADC는 특정 결정인자(예를 들어, SEZ6)를 발현하는 종양 또는 종양형성 세포를 치료하는 데 사용될 것이다. 바람직하게는 치료되는 "대상체" 또는 "환자"는 인간일 것이지만, 본원에서 사용되는 바와 같이 상기 용어는 명시적으로 임의의 포유류 종을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 화합물 및 조성물은 질환의 다양한 단계에서, 또한 이들의 치료 사이클에서 상이한 시점에 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 및 ADC는 최전선 요법으로서 사용되고, 암 병태에 대하여 이전에 치료되지 않았던 대상체에게 투여될 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 및 ADC는 제2 및 제3선 환자(즉, 동일한 병태에 대하여 이전에 각각 1 회 또는 2 회 치료받은 적 있는 환자)의 치료에 사용될 것이다. 또 다른 구현예는, 동일한 또는 관련 병태에 대하여 개시된 ADC 또는 상이한 치료제로 3회 이상 치료받은 적이 있는 제4선 또는 그 이상의 환자(예를 들어, SCLC 환자)의 치료를 포함할 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 화합물 및 조성물은 이전에 치료받은(본 발명의 항체 또는 ADC로 또는 기타 다른 항암제로) 적이 있고 재발되거나 이전 치료에 대해 난치성인 것으로 결정된 대상체의 치료에 사용될 것이다. 선택된 구현예에서, 본 발명의 화합물 및 조성물은 재발성 종양을 갖는 대상체의 치료에 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 증식성 장애는, 부신, 간, 신장, 방광, 유방, 위, 난소, 자궁경부, 자궁, 식도, 결장직장, 전립선, 췌장, 폐(소세포 및 비-소세포 둘 다), 갑상선, 암종, 육종, 교모세포종 및 다양한 두부 및 경부 종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고형 종양을 포함할 것이다. 다른 바람직한 구현예에서, 또한 하기 실시예에 나타난 바와 같이, 개시된 ADC는 특히 소세포 폐암(SCLC) 및 비-소세포 폐암(NSCLC)(예를 들어, 편평 세포 비-소세포 폐암 또는 편평 세포 소세포 폐암)의 치료에 효과적이다. 특정 구현예에서, 폐암은 백금 기재의 작용제(예를 들어, 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 토포테칸) 및/또는 탁산(예를 들어, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀 또는 카바지탁셀)에 대해 난치성, 재발성 또는 내성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 치료되는 대상체는 대세포 신경내분비 암종(LCNEC)을 앓고 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 개시된 항체 및 ADC는 갑상선 수질 암, 교모세포종, 신경내분비 전립선암(NEPC), 고등급 위장췌장암(GEP) 및 악성 흑색종의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 치료가 적용되는 보다 일반적으로 예시적 신생 병태는, 양성 또는 악성; 고형 종양 또는 기타 다른 혈액 종양형성일 수 있고; 부신 종양, AIDS-연관 암, 포상 연부 육종, 성상세포 종양, 자율 신경절 종양, 방광 암(편평 세포 암종 및 이행 세포 암종), 포배강 장애, 골암(법랑종, 동맥류 골 낭종, 골연골종, 골육종), 뇌 및 척수 암, 전이성 뇌 종양, 유방암, 경동맥체 종양, 자궁경부 암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 결장직장암, 피부 양성 섬유 조직구종, 결합조직성 소원형세포 종양, 뇌실막종, 상피성 장애, 유잉(Ewing) 종양, 골외 점액성 연골육종, 골성 불완전 섬유원증, 뼈의 섬유 이형성증, 담낭 및 담관 암, 위암, 위장, 임신 영양막 질환, 생식 세포 종양, 샘 장애, 두부 및 경부 암, 시상하부, 장암, 도세포 종양, 카포시 육종(Kaposi's Sarcoma), 신장암(신아종, 유두상 신장 세포 암종), 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암(간아종, 간세포 암종), 림프종, 폐암(소세포 암종, 선암, 편평 세포 암종, 대세포 암종 등), 대식세포 장애, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비샘 종양, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경아세포종, 신경내분비 종양, 난소 암, 췌장암, 유두상 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초 신경 초종, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀 혈액학적 장애, 신장 전이성 암, 횡문근양 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평 세포 암, 위암, 간질 장애, 활막 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선 전이성 암, 및 자궁암(자궁경관의 암종, 자궁내막 암종, 및 평활근종)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 군으로부터 선택될 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 대상체는 췌장암, 결장직장암, 비-소세포 폐암, 및 위암을 앓고 있을 것이다. 바람직한 구현예에서, 대상체는 췌장암, 결장직장암, 비-소세포 폐암, 및 위암에 대하여 난치성일 것이다.
다른 바람직한 구현예에서, ADC는, 하기 서브유형: 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암(예를 들어, 편평 세포 비-소세포 폐암 또는 편평 세포 소세포 폐암)을 포함하는 폐암의 치료에 특히 효과적이다. 선택된 구현예에서, 항체 및 ADC는 제한기 질환 또는 확장기 질환을 나타내는 환자에게 투여될 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 개시된 컨쥬게이션된 항체는 난치성 환자(즉, 그의 질환이 초기 요법 과정 완료 동안 또는 그 직후에 재발하는 환자); 민감성 환자(즉, 그의 재발이 1차 요법 후 2 내지 3 개월 초과인 환자); 또는 백금 기재의 작용제(예를 들어, 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴) 및/또는 탁산(예를 들어, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀 또는 카바지탁셀)에 대하여 내성을 나타내는 환자에게 투여될 것이다.
또 다른 특히 바람직한 구현예에서, 개시된 ADC는 난소-혈청 암종 및 난소-유두상 혈청 암종을 포함하는 난소 암의 치료에 효과적이다.
본 발명은 또한, 양성 또는 전암성 종양을 갖는 대상체의 방지적 또는 예방적 치료를 제공한다. 어떠한 특정 유형의 종양 또는 증식성 장애도 본 발명의 항체를 사용한 치료로부터 배제되지 않는다.
X
제조 물품
본 발명은, 하나 이상의 용량의 본 발명의 ADC를 포함할 수 있는 하나 이상의 용기를 포함하는 제약학적 팩 및 키트를 포함한다. 특정 구현예에서, 팩 또는 키트는 단위 투여량을 함유하며, 이는 예를 들어, 본 발명의 ADC를, 하나 이상의 추가의 작용제 및 선택적으로, 하나 이상의 항암제와 함께 또는 이들 없이 포함하는 소정량의 조성물을 의미한다.
본 발명의 키트는 일반적으로 적합한 용기 내에 제약상 허용되는 제형의 본 발명의 ADC를, 또한 선택적으로, 동일한 또는 상이한 용기 내에 하나 이상의 항암제를 함유할 것이다. 키트는 또한, 진단 또는 조합 요법을 위한 기타 다른 제약상 허용되는 제형 또는 장치를 함유할 수 있다. 장치 또는 기기의 예는, 증식성 장애 연관 세포 또는 마커를 검출, 모니터링, 정량 또는 프로파일링하는 데 사용될 수 있는 것들을 포함한다. 본 발명에 의해 고려되는 키트는 또한 본 발명의 ADC를 항암제 또는 진단제와 조합하기 위해 적절한 시약을 함유할 수 있다(예를 들어, U.S.P.N. 7,422,739 참조).
키트의 성분이 하나 이상의 액체 용액 중에 제공되는 경우, 액체 용액은 비-수성일 수 있지만, 수용액이 바람직하고, 멸균 수용액이 특히 바람직하다. 키트 내의 제형은 또한 건조 분말(들)로서 또는 동결건조된 형태로 제공될 수 있고, 이는 적절한 액체의 첨가시 재구성될 수 있다. 재구성에 사용되는 액체는 별도의 용기 내에 함유될 수 있다. 이러한 액체는 제약상 허용되는 멸균 완충제(들) 또는 기타 다른 희석제(들), 예컨대 주사용 정균수, 포스페이트-완충 식염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함할 수 있다. 키트가 본 발명의 ADC를 추가의 치료제 또는 작용제와 조합하여 포함하는 경우, 용액은, 몰 당량 조합으로 또는 하나의 성분을 기타 다른 성분에 비해 과량으로 예비-혼합될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 ADC 및 임의의 선택적 항암제 또는 기타 다른 작용제는 환자에게 투여되기 전에 별개의 용기 내에서 별도로 유지될 수 있다.
키트는, 하나 또는 다수의 용기, 및 내포된 조성물이 선택된 질환 병태를 진단하거나 치료하는 데 사용됨을 지시하는, 용기(들) 내의, 용기(들) 상의 또는 그와 연관되어 있는 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 각종 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기(들)는 멸균 접근 포트를 포함할 수 있고, 예를 들어, 용기는 피하 주사기 니들로 뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는, ADC 및 임의의 선택적 성분을 환자에게 투여하는 수단, 예를 들어, 하나 이상의 니들 또는 시린지(예비-충전된 또는 비어 있는), 점안기, 피펫, 또는 그로부터 제형을 대상체 내로 주입하거나 도입할 수 있는 또는 신체의 질환 부위로 적용할 수 있는 기타 다른 유사 장치를 함유할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 통상적으로, 바이알, 또는 유사물, 및 기타 다른 성분을 시판을 위해 밀폐 한정 공간 내에 함유시키기 위한 수단, 예컨대 요망되는 바이알 및 기타 다른 장치가 내부에 배치되어 유지되는 취입 성형 플라스틱 용기를 포힘할 것이다.
XI
기타
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수형 용어는 단수형을 포함할 것이다. 추가로, 명세서 및 첨부된 청구범위에 제공된 범위는 양쪽 종점 및 종점 사이의 모든 점을 포함한다. 따라서, 2.0 내지 3.0의 범위는 2.0, 3.0, 및 2.0과 3.0 사이의 모든 점을 포함한다.
일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양 기법, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 화학은 당업계에 널리 공지되고 통상적으로 사용되는 것들이다. 이러한 기법과 연관하여 본원에서 사용된 명명법 또한 당업계에서 통상적으로 사용된다. 본 발명의 방법 및 기법은, 달리 기재되지 않는 한, 일반적으로 당업계에 널리 공지된 종래의 방법에 따라, 또한 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 다양한 참조문헌에 기재된 바와 같이 수행된다.
XII
참조문헌
본원에서 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 공개 문헌, 및 전자 이용가능 자료(예를 들어, 뉴클레오티드 서열 기탁(예를 들어, GenBank 및 RefSeq), 및 아미노산 서열 기탁(예를 들어, SwissProt, PIR, PRF, PDB, 및 GenBank 및 RefSeq에서의 주석이 달린 코딩 영역으로부터의 번역) 포함)의 전체 개시내용은, 어구 "참조로 포함됨"이 특정 참조문헌과 관련하여 사용되었는지의 여부에 관계 없이, 참조로 포함된다. 상기 상세한 설명 및 하기 실시예는 단지 이해의 명확성을 위해 제공된 것이다. 이로부터의 불필요한 제한은 없음을 이해하여야 한다. 본 발명은, 나타내고 기재된 정확한 상세사항으로 제한되지 않는다. 당업자에게 명백한 변화가 청구범위에 의해 한정되는 본 발명에 포함된다. 본원에서 사용된 임의의 섹션 제목은 단지 조직적 목적을 위한 것이며, 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어선 안된다.
XIII
서열 목록 요약
많은 핵산 및 아미노산 서열을 포함하는 도면이 본원에 첨부된다. 하기 표 3은 포함된 서열의 요약을 제공한다.
구현예.
본원에 개시된
구현예는
하기
구현예
P1 내지 P27을 포함한다.
구현예 P1. 하기 화학식의 항체 약물 컨쥬게이트 또는 그의 제약상 허용되는 염:
Ab-[W-(X1)a-CM-(X2)b-P-D]n
여기서, a) Ab는 표적화제를 포함하고; b) W는 연결 기를 포함하고; c) CM은 절단가능한 모이어티를 포함하고; d) P는 디술피드 보호 기를 포함하고; e) X1 및 X2는 선택적 스페이서 모이어티를 포함하고; f) D는 칼리케아마이신을 포함하고; a 및 b는 독립적으로 0 또는 1이고; n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.
구현예 P2. 표적화제가 항체를 포함하는 것인, 구현예 P1의 항체 약물 컨쥬게이트.
구현예 P3. 항체가 키메라, CDR 그래프팅된, 인간화된 또는 인간 항체 또는 그의 면역반응성 단편을 포함하는 것인, 구현예 P2의 항체 약물 컨쥬게이트.
구현예 P4. 항체가 항SEZ6 항체를 포함하는 것인, 구현예 P2 또는 P3의 항체 약물 컨쥬게이트.
구현예 P5. 항체가 자리-특이적 항체를 포함하는 것인, 구현예 P2 내지 P4 중 어느 하나의 항체 약물 컨쥬게이트.
구현예 P6. 항체가 2 개의 쌍을 이루지 않은 시스테인을 포함하는 것인, 구현예 P2 내지 P5 중 어느 하나의 항체 약물 컨쥬게이트.
구현예 P7. 각각의 항체 경쇄가 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 포함하는 것인, 구현예 P6에 따른 항체 약물 컨쥬게이트.
구현예 P8. 각각의 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기가 위치 C214에 있는 것인, 구현예 P7에 따른 항체 약물 컨쥬게이트.
구현예 P9. n이 2 내지 8의 정수를 포함하는 것인, 구현예 P1 내지 P8 중 어느 하나의 항체 약물 컨쥬게이트.
구현예 P10. n이 2의 정수를 포함하는 것인, 구현예 P1 내지 P9 중 어느 하나의 항체 약물 컨쥬게이트.
구현예 P11. D가 칼리케아마이신 γ1 I의 유사체를 포함하는 것인, 구현예 P1 내지 P10 중 어느 하나의 항체 약물 컨쥬게이트.
구현예 P12. 칼리케아마이신이 칼리케아마이신의 N-아세틸 유도체 또는 디술피드 유사체인, 구현예 P1 내지 P11 중 어느 하나의 항체/약물 컨쥬게이트.
구현예 P13. 칼리케아마이신이 N-아세틸-γ-칼리케아마이신인, 구현예 P1 내지 P12 중 어느 하나의 항체/약물 컨쥬게이트.
구현예 P14. 절단가능한 모이어티가 펩티드 결합, 히드라존 모이어티, 옥심 모이어티, 에스테르 연결, 또는 디술피드 연결을 포함하는 것인, 구현예 P1 내지 P13 중 어느 하나의 항체 약물 컨쥬게이트.
구현예 P15. 절단가능한 모이어티가 펩티드 결합을 포함하는 것인, 구현예 P1 내지 P14 중 어느 하나의 항체 약물 컨쥬게이트.
구현예 P16. 구현예 P1 내지 P15 중 어느 하나의 항체 약물 컨쥬게이트를 포함하는 제약 조성물.
구현예 P17. 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 구현예 16의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법.
구현예 P18. 암이 췌장암, 결장직장암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암 및 위암으로부터 선택되는 것인, 구현예 P17의 방법.
구현예 P19. 대상체에게 적어도 하나의 추가의 치료 모이어티를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 구현예 P17 또는 P18의 방법.
구현예 P20. 세포를 구현예 P1 내지 P15 중 어느 하나의 항체 약물 컨쥬게이트와 접촉시키는 것을 포함하는, 칼리케아마이신 세포독소를 세포로 전달하는 방법.
구현예 P21. a) 절단가능한 링커를 포함하는 칼리케아마이신 구성체를 제공하는 단계; b) 표적화제를 환원시켜 활성화된 잔기를 제공하는 단계; 및 c) 환원된 표적화제를 칼리케아마이신 구성체에 컨쥬게이션시키는 단계를 포함하는, 항체 약물 컨쥬게이트의 제조 방법.
구현예 P22. 표적화제가 자리-특이적 항체를 포함하는 것인, 구현예 P21의 방법.
구현예 P23. 자리-특이적 항체가 고유적 디술피드 브릿지로부터 유래된 유리 시스테인인, 구현예 P22의 방법.
구현예 P24. 조작된 항체가 고유적 디술피드 브릿지로부터 유래되지 않는 유리 시스테인을 포함하는 것인, 구현예 P22의 방법.
구현예 P25. 유리 시스테인이 유도된 시스테인 잔기 또는 치환된 시스테인 잔기를 포함하는 것인, 구현예 P22의 방법.
구현예 P26. 표적화제를 환원시키는 단계가 표적화제를 선택적으로 환원시키는 것을 포함하는 것인, 구현예 P21 내지 P25 중 어느 하나의 방법.
구현예 27. 항체를 선택적으로 환원시키는 단계가, 항체를 안정화제와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 구현예 P26의 방법.
추가의 구현예는 하기 구현예 1 내지 44를 포함한다.
구현예 1. 하기 화학식 I을 갖는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염:
[화학식 I]
Ab-[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]z3
여기서, Ab는 표적화제이고; W는 연결 기이고; M은 절단가능한 모이어티이고; L3 및 L4는 독립적으로 링커이고; P는 디술피드 보호 기이고; D는 칼리케아마이신 또는 그의 유사체이고; z1 및 z2는 독립적으로 0 내지 10의 정수이고; z3은 1 내지 10의 정수이다.
구현예 2. D가 하기 화학식 Ia를 포함하는 것인, 구현예 1의 화합물:
[화학식 Ia]
여기서, R1은 수소, 할로겐, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)R1E, -OR1A, -NR1BR1C, -C(O)OR1A, -C(O)NR1BR1C, -SR1D, -SOn1R1B 또는 -SOnv1NR1BR1C이고; R1A, R1B, R1C, R1D 및 R1E는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3 , -CBr3, -CI3, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -N(O)2, -SH, -S(O)3H, -S(O)4H, -S(O)2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHS(O)2H, -NHC(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이고; 동일한 질소 원자에 결합된 R1B 및 R1C 치환체는 선택적으로 연결되어 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴을 형성할 수 있고; n1은 0 내지 4의 정수이고; v1은 1 또는 2이다.
구현예 3. R1이 수소, 치환된 또는 비-치환된 알킬 또는 -C(O)R1E인, 구현예 2의 화합물.
구현예 4. 표적화제가 항체인, 구현예 2의 화합물.
구현예 5. 항체가 키메라 항체, CDR 그래프팅된 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체 또는 그의 면역반응성 단편인, 구현예 4의 화합물.
구현예 6. 항체가 항SEZ6 항체인, 구현예 4의 화합물.
구현예 7. W가 항체 내에서 시스테인 잔기에 공유 부착된 것인, 구현예 4의 화합물.
구현예 8. 시스테인 잔기가 카바트 위치 C214에 있는 것인, 구현예 7의 화합물.
구현예 9. W가 항체 내에서 리신 잔기에 공유 부착된 것인, 구현예 4의 화합물.
구현예 10. 하기 화학식 II를 갖는 구현예 1의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염:
[화학식 II]
여기서, Ab는 항체이고; L3은 결합, -O-, -S-, -NR3B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR3B-, -NR3BC(O)-, -NR3BC(O)NH-, -NHC(O)NR3B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이고; L4는 결합, -O-, -S-, -NR4B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR4B-, -NR4BC(O)-, -NR4BC(O)NH-, -NHC(O)NR4B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이고; R1은 수소, 할로겐, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)R1E, -OR1A, -NR1BR1C, -C(O)OR1A, -C(O)NR1BR1C, -SR1D, -SOn1R1B 또는 -SOv1NR1BR1C이고; P는 -O-, -S-, -NR2B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR2B-, -NR2BC(O)-, -NR2BC(O)NH-, -NHC(O)NR2B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고; M은 -O-, -S-, -NR5B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5B-, -NR5BC(O)-, -NR5BC(O)NH-, -NHC(O)NR5B-, -[NR5BC(R5E)(R5F)C(O)]n2-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌 또는 M1A-M1B-M1C이고; W는 -O-, -S-, -NR6B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR6B-, -NR6BC(O)-, -NR6BC(O)NH-, -NHC(O)NR6B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌 또는 W1A-W1B-W1C이고; M1A는 L3에 결합되고, M1C는 L4에 결합되고; M1A는 결합, -O-, -S-, -NR5AB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5AB-, -NR5ABC(O)-, -NR5ABC(O)NH-, -NHC(O)NR5AB-, -[NR5ABCR5AER5AFC(O)]n3-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고; M1B는 결합, -O-, -S-, -NR5BB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5BB-, -NR5BBC(O)-, -NR5BBC(O)NH-, -NHC(O)NR5BB-, -[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고; M1C는 결합, -O-, -S-, -NR5CB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5CB-, -NR5CBC(O)-, -NR5CBC(O)NH-, -NHC(O)NR5CB-, -[NR5CBCR5CER5CFC(O)]n5-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고; W1A는 Ab에 결합되고, W1C는 L3에 결합되고; W1A는 결합, -O-, -S-, -NR6AB-, -C(O)-, C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR6AB-, -NR6ABC(O)-, -NR6ABC(O)NH-, -NHC(O)NR6AB-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고; W1B는 결합, -O-, -S-, -NR6BB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR6BB-, -NR6BBC(O)-, -NR6BBC(O)NH-, -NHC(O)NR6BB-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고; W1C는 결합, -O-, -S-, -NR6CB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR6CB-, -NR6CBC(O)-, -NR6CBC(O)NH-, -NHC(O)NR6CB-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고; R1A, R1B, R1C, R1D, R1E, R2B, R3B, R4B, R5B, R5E, R5F, R5AB, R5AE, R5AF, R5BB, R5BE, R5BF, R5CB, R5CE, R5CF , R6B, R6AB, R6BB 및 R6CB는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -N(O)2, -SH, -S(O)3H, -S(O)4H, -S(O)2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHS(O)2H, -NHC(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이고; 동일한 질소 원자에 결합된 R1B 및 R1C 치환체는 선택적으로 연결되어 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴을 형성할 수 있고; n1은 0 내지 4의 정수이고; v1은 1 또는 2이고; n2, n3, n4 및 n5는 독립적으로 1 내지 10의 정수이고; z1 및 z2는 독립적으로 0 내지 10의 정수이고; z3은 1 내지 10의 정수이다.
구현예 11. M이 M1A-M1B-M1C이고, 여기서 M1A는 L3에 결합되고, M1C는 L4에 결합되는 것인, 구현예 10의 화합물.
구현예 12. W가 W1A-W1B-W1C이고, 여기서 W1A는 Ab에 결합되고, W1C는 L3에 결합되는 것인, 구현예 10의 화합물.
구현예 13. P가 치환된 또는 비-치환된 알킬인, 구현예 10의 화합물.
구현예 14. z3이 1 또는 2인, 구현예 10의 화합물.
구현예 15. L3이 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌인, 구현예 10의 화합물.
구현예 16. L4가 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌인, 구현예 10의 화합물.
구현예 17. R1이 수소 또는 -C(O)R1E인, 구현예 10의 화합물.
구현예 18. W가 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌인, 구현예 10의 화합물.
구현예 19. W가 5- 또는 6-원 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌인, 구현예 18의 화합물.
구현예 20. W가 하기 화학식의 화합물인, 구현예 19의 화합물:
구현예 21. M이 펩티드를 포함하는 것인, 구현예 10의 화합물.
구현예 22. M1A가 결합, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌 또는 -[NR5ABC(R5AE)(R5AF)C(O)]n3이고; M1B가 결합, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌 또는 -[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-이고; M1C가 결합 또는 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌인, 구현예 10의 화합물.
구현예 23. M1A 및 M1B가 독립적으로 아미노산인, 구현예 10의 화합물.
구현예 24. M1A 또는 M1B 중 적어도 하나가 발린(val)인, 구현예 10의 화합물.
구현예 25. M1A 또는 M1B 중 적어도 하나가 알라닌(ala)인, 구현예 10의 화합물.
구현예 26. M1A 또는 M1B 중 적어도 하나가 시트룰린(cit)인, 구현예 10의 화합물.
구현예 27. M1A, M1B 또는 M1C 중 적어도 하나가 치환된 아릴렌인, 구현예 10의 화합물.
구현예 28. M1A, M1B 또는 M1C 중 적어도 하나가 하기 화학식 III을 갖는 것인, 구현예 10의 화합물:
[화학식 III]
여기서, Y는 -NH-, -O-, -C(O)NH- 또는 -C(O)O-이고; n6은 0 내지 3의 정수이다.
구현예 29. -[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]가 하기와 같은 것인, 구현예 10의 화합물:
구현예 30. -[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]가 하기 화학식을 갖는 것인, 구현예 10의 화합물:
구현예 31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
구현예 32. 대상체에게 치료 유효량의 구현예 31의 제약 조성물 또는 구현예 1 내지 30 중 어느 하나의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서의 암 치료 방법.
구현예 33. 암이 췌장암, 결장직장암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암 및 위암으로부터 선택되는 것인, 구현예 32의 방법.
구현예 34. 대상체에게 추가의 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 구현예 32의 방법.
구현예 35. 세포를 구현예 1 내지 30 중 어느 하나의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, 칼리케아마이신 세포독소를 세포로 전달하는 방법.
구현예 36. 칼리케아마이신 구성체를 항체의 시스테인 또는 리신과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 칼리케아마이신 구성체는 화학식 W1-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D(여기서, W1은 리신 측쇄 또는 시스테인 측쇄와 반응성인 관능기이고, M은 절단가능한 모이어티이고, L3 및 L4는 독립적으로 링커이고, P는 디술피드 보호 기이고, D는 칼리케아마이신 또는 그의 유사체임)를 갖는 것인, 항체 약물 컨쥬게이트의 제조 방법.
구현예 37. 칼리케아마이신 구성체를 항체의 특이적 시스테인과 접촉시키는 것인, 구현예 36의 방법.
구현예 38. 특이적 시스테인이 고유적 디술피드 브릿지로부터 유래되는 것인, 구현예 37의 방법.
구현예 39. 항체가 조작된 항체이고, 특이적 시스테인이 고유적 디술피드 브릿지로부터 유래되지 않은 것인, 구현예 37의 방법.
구현예 40. 특이적 시스테인을 접촉 전에 선택적으로 환원시키는 것인, 구현예 36 내지 39 중 어느 하나의 방법.
구현예 41. 항체를 선택적으로 환원시키는 단계가, 항체를 안정화제와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 구현예 40의 방법.
구현예 42. 하기 화학식 IV를 갖는 화합물:
[화학식 IV]
여기서, L3은 결합, -O-, -S-, -NR3B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR3B-, -NR3BC(O)-, -NR3BC(O)NH-, -NHC(O)NR3B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이고; L4는 결합, -O-, -S-, -NR4B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR4B-, -NR4BC(O)-, -NR4BC(O)NH-, -NHC(O)NR4B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이고; R1은 수소, 할로겐, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)R1E, -OR1A, -NR1BR1C, -C(O)OR1A, -C(O)NR1BR1C, -SR1D, -SOn1R1B 또는 -SOv1NR1BR1C이고; P는 -O-, -S-, -NR2B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR2B-, -NR2BC(O)-, -NR2BC(O)NH-, -NHC(O)NR2B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고; M은 -O-, -S-, -NR5B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5B-, -NR5BC(O)-, -NR5BC(O)NH-, -NHC(O)NR5B-, -[NR5BC(R5E)(R5F)C(O)]n2-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌 또는 M1A-M1B-M1C이고; W1은 수소, 할로겐, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴, -N3, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)R7E, -OR7A, -NR7BR7C, -C(O)OR7A, -C(O)NR7BR7C, -NO2, -SR7D, -SOn7R7B, -SOv7NR7BR7C, -NHNR7BR7C, -ONR7BR7C, -NHC(O)NHNR7BR7C이고; M1A는 L3에 결합되고, M1C는 L4에 결합되고; M1A는 결합, -O-, -S-, -NR5AB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5AB-, -NR5ABC(O)-, -NR5ABC(O)NH-, -NHC(O)NR5AB-, -[NR5ABCR5AER5AFC(O)]n3-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고; M1B는 결합, -O-, -S-, -NR5BB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5BB-, -NR5BBC(O)-, -NR5BBC(O)NH-, -NHC(O)NR5BB-, -[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고; M1C는 결합, -O-, -S-, -NR5CB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5CB-, -NR5CBC(O)-, -NR5CBC(O)NH-, -NHC(O)NR5CB-, -[NR5CBCR5CER5CFC(O)]n5-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고; R1A, R1B, R1C, R1D, R1E, R2B, R3B, R4B, R5B, R5E, R5F, R5AB, R5AE, R5AF, R5BB, R5BE, R5BF, R5CB, R5CE, R5CF , R6B, R7A, R7B, R7C, R7D, R7E는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -N(O)2, -SH, -S(O)3H, -S(O)4H, -S(O)2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHS(O)2H, -NHC(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이고; 동일한 질소 원자에 결합된 R1B 및 R1C 치환체는 선택적으로 연결되어 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴을 형성할 수 있고; n1 및 n7은 독립적으로 0 내지 4의 정수이고; v1 및 v7은 독립적으로 1 또는 2이고; n2, n3, n4 및 n5는 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
구현예 43.
인 구현예 42의 화합물.
XIV
실시예
따라서, 상기에 일반적으로 기재된 본 발명은, 하기 실시예를 참조로 하여 보다 쉽게 이해될 것이며, 하기 실시예는 예시로서 제공되는 것이고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 실시예는, 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중랑부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
PDX 종양 세포 유형은 약어 후에 숫자로 나타내었고, 이는 특정 종양 세포주를 나타낸다. 시험 샘플의 통과 수는 p0-p#를 샘플 명칭에 부속시켜 나타내었고, 여기서 p0은 환자 종양으로부터 직접 얻어진 비-통과 샘플의 표시이고, p#는 시험 전에 마우스로 종양이 통과된 횟수의 표시이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 종양 유형 및 서브유형의 약어를 하기 표 4에 나타내었다:
분석 및 제조 HPLC 방법에 대한 일반적 정보
분석 방법 A:
MS: 아큐이티 울트라(Acuity Ultra) SQ 검출기 ESI, 스캔 범위 120 Da 내지 2040 Da.
컬럼: 워터스 아큐이티(Waters Acuity) UPLC BEH C18, 1.7 ㎛, 2.1 × 50 mm
컬럼 온도: 50℃
유량: 0.6 ml/분
이동 상 A: 물 중 0.1% 포름산.
이동 상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산.
구배:
분석 방법 B:
MS: 아큐이티 울트라 SQ 검출기 ESI, 스캔 범위 120 Da 내지 2040 Da,
컬럼: 워터스 아큐이티 UPLC BEH C18, 1.7 ㎛, 2.1 × 50 mm
컬럼 온도: 60℃
유량: 0.4 ml/분
이동 상 A: 물 중 0.1% 포름산.
이동 상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산.
구배:
분석 방법 C:
HRMS: 에이비사이엑스(ABSciex) 5600 플러스 트리플 비행 시간(TOF), 스캔 범위 250 Da 내지 2500 Da
컬럼: 워터스 아큐이티 UPLC BEH C18, 1.7 ㎛, 2.1 × 50 mm
컬럼 온도: 60℃
유량: 0.4 ml/분
이동 상 A: 물 중 0.1% 포름산.
이동 상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산.
구배:
제조 HPLC 방법 A:
컬럼: 워터스 엑스브릿지 프렙(Waters XBridge prep) C18 5 ㎛ OBD, 19 × 100 mm
컬럼 온도: 상온
유량: 15 ml/분
이동 상 A: 물 중 0.1% 포름산.
이동 상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산.
구배:
제조 HPLC 방법 B:
컬럼: 워터스 엑스브릿지 프렙 C18 5 ㎛ OBD, 19 × 100 mm
컬럼 온도: 상온
유량: 15 ml/분
이동 상 A: 물.
이동 상 B: 아세토니트릴.
구배:
실시예
1
히드라존
링커를 포함하는
칼리케아마이신
구성체의 합성
하기에 기재되는 바와 같은 세 가지 상이한 방법을 사용하여 하기 화학식 13에 따른 약물-링커 화합물을 합성하였다:
[화학식 13]
합성 경로 1:
(i) S-((2R,3S,4S,6S)-6-((((2R,3S,4R,5R,6R)-5-(((2S,4S,5S)-5-(N-에틸아세트아미도)-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-6-(((2S,5Z,9R,13E)-13-(2-((4-히드라지닐-2-메틸-4-옥소부탄-2-일)디술파닐)에틸리덴)-9-히드록시-12-((메톡시카르보닐)아미노)-11-옥소비시클로[7.3.1]트리데카-1(12),5-디엔-3,7-디인-2-일)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일)아미노)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일) 4-(((2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-3-아이오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤조티오에이트 (3).
N-아세틸 칼리케아마이신(2, 20 mg, 14 ㎛ol)을 2 ml의 아세토니트릴 중에 용해시키고, -15℃까지 냉각시켰다. 3-메르캅토-3-메틸부탄히드라지드(21 mg, 0.14 mmol, 10 당량)를 0.5 ml의 아세토니트릴 중에 용해시키고, 칼리케아마이신의 냉각된 용액에 서서히 첨가한 후, 트리에틸 아민(18.8 ㎕, 014 mmol, 10 당량)을 첨가하였다. 반응물을 반응 완료시까지 가온시켰다. 3 시간 후, 반응물을 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 상에서 컬럼 크로마토그래피(MeOH / DCM 1% 내지 20%)로 정제하여 3(18.7 mg, 89%)을 백색 고체로서 수득하였다. LCMS(분석 방법 A): Rt = 1.80 분, [M+H]+ = 1478.57.
(ii) 4-(4-((E)-1-(2-(3-(((E)-2-((1R,8S,Z)-8-(((2R,3R,4R,5S,6R)-5-((((2S,4S,5S,6R)-5-((4-(((2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-3-아이오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤조일)티오)-4-히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)아미노)-3-(((2S,4S,5S)-5-(N-에틸아세트아미도)-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-4-히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-1-히드록시-10-((메톡시카르보닐)아미노)-11-옥소비시클로[7.3.1]트리데카-4,9-디엔-2,6-디인-13-일리덴)에틸)디술파닐)-3-메틸부타노일)히드라조노)에틸)페녹시)부탄산(4.)
4-(4-아세틸페녹시)부탄산(3.8 mg, 17 ㎛ol, 5 당량)을 분자 체의 존재 하에 알콜(100 ㎕) 중의 화합물 3(5 mg, 3.4 ㎛ol)에 첨가하였다. 아세트산(15 ㎕, 80 당량)을 첨가하고, 반응물을 37℃에서 3 일 동안 교반하였다. 그 시간 후, 80% 전환이 나타났고, 반응물을 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 상에서 컬럼 크로마토그래피(MeOH / DCM 1% 내지 20%)로 정제하여 4(1.1 mg, 20%)를 수득하였다. LCMS(분석 방법 A): Rt = 1.96 분, [M+H]+ = 1682.53
(iii) S-((2R,3S,4S,6S)-6-((((2R,3S,4R,5R,6R)-6-(((2S,5Z,9R,13E)-13-(2-((4-(2-((E)-1-(4-(4-((2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)에틸)아미노)-4-옥소부톡시)페닐)에틸리덴)히드라지닐)-2-메틸-4-옥소부탄-2-일)디술파닐)에틸리덴)-9-히드록시-12-((메톡시카르보닐)아미노)-11-옥소비시클로[7.3.1]트리데카-1(12),5-디엔-3,7-디인-2-일)옥시)-5-(((2S,4S,5S)-5-(N-에틸아세트아미도)-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일)아미노)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일) 4-(((2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-3-아이오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤조티오에이트(1.)
5 ㎕의 DIPEA(10 당량)를 DMF 중의 N-(2-아미노에틸)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드(7 mg/mL, 14 ㎛ol, 5 당량)의 500 ㎕ 용액에 첨가하였다. 이 용액을 5 ㎕의 DIPEA(10 당량)와 함께 4의 용액(480 ㎕, 10 mg/mL, DCM)에 첨가하였다. 마지막으로 11 mg EDCI(11 mg, 28 ㎛ol, 10 당량)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15 시간 동안 교반하였다. 출발 물질이 소비되고, 요망되는 생성물이 LCMS에 의해 나타났다. LCMS(분석 방법 A): Rt = 1.98 분, [M+H]+ = 1918.29
합성 경로 2:
(i) N-(2-(4-(4-아세틸페녹시)부탄아미도)에틸)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드(6)
N-(2-아미노에틸)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드(137 mg, 0.54 mmol, 1.2 당량)를 THF(2 mL) 중의 5(100 mg, 0.45 mmol)의 용액에 첨가한 후, HATU(205.3 mg, 0.54 mmol, 1.2 당량) 및 HOBt 수화물(82.6 mg, 0.54 mmol, 1.2 당량)을 첨가하였다. 이어서, DIPEA(1.57 mL, 9.00 mmol, 20 당량)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 15 시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 요망되는 생성물 6(200 mg, 97%)을 백색 고체로서 수득하였다. LCMS(분석 방법 A): Rt = 1.60 분, [M+H]+ = 458.37.
(ii) S-((2R,3S,4S,6S)-6-((((2R,3S,4R,5R,6R)-6-(((2S,5Z,9R,13E)-13-(2-((4-(2-((E)-1-(4-(4-((2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)에틸)아미노)-4-옥소부톡시)페닐)에틸리덴)히드라지닐)-2-메틸-4-옥소부탄-2-일)디술파닐)에틸리덴)-9-히드록시-12-((메톡시카르보닐)아미노)-11-옥소비시클로[7.3.1]트리데카-1(12),5-디엔-3,7-디인-2-일)옥시)-5-(((2S,4S,5S)-5-(N-에틸아세트아미도)-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일)아미노)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일) 4-(((2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-3-아이오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤조티오에이트(1).
20 ㎕의 알콜 중의 N-(2-(4-(4-아세틸페녹시)부탄아미도)에틸)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 6(0.3 mg, 0.6 ㎛ol, 5 당량)의 용액을 DMF(20 ㎕) 중의 화합물 3(0.2 mg, 0.14 ㎛ol)에 첨가하였다. 아세트산(1 ㎕, 100 당량)을 첨가하고, 반응물을 37℃에서 24 시간 동안 교반하였다. 그 시간 후, 요망되는 생성물이 나타났다. LCMS(분석 방법 A): Rt = 1.98 분, [M+H]+ = 1918.69.
합성 경로 3:
(i) (E)-4-(4-(1-(2-(3-메르캅토-3-메틸부타노일)히드라조노)에틸)페녹시)부탄산(8).
4-(4-아세틸페녹시)부탄산(5.750 mg, 3.37 mmol, 5 당량)을 DMF(5 mL) 중의 3-메르캅토-3-메틸부탄히드라지드(7.100 mg, 0.67 mmol)에 첨가하였다. 아세트산(3.0 mL, 80 당량)을 첨가하고, 반응물을 37℃에서 3 일 동안 교반하였다. 그 시간 후, 80% 전환이 나타났고, 반응물을 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 상에서 컬럼 크로마토그래피(MeOH/DCM 1% 내지 20%)로 정제하여 8(7.0 mg, 3%)을 수득하였다. LCMS(분석 방법 A): Rt = 1.74 분, [M+H]+ = 353.28.
(ii) 4-(4-((E)-1-(2-(3-(((E)-2-((1R,8S,Z)-8-(((2R,3R,4R,5S,6R)-5-((((2S,4S,5S,6R)-5-((4-(((2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-3-아이오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤조일)티오)-4-히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)아미노)-3-(((2S,4S,5S)-5-(N-에틸아세트아미도)-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-4-히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-1-히드록시-10-((메톡시카르보닐)아미노)-11-옥소비시클로[7.3.1]트리데카-4,9-디엔-2,6-디인-13-일리덴)에틸)디술파닐)-3-메틸부타노일)히드라조노)에틸)페녹시)부탄산(4).
N-아세틸 칼리케아마이신(2.5 mg, 3.5 ㎛ol)을 50 ㎕의 아세토니트릴 중에 용해시키고, -15℃까지 냉각시켰다. 화합물 8(6.2 mg, 17.7 ㎛ol, 5 당량)을 50 ㎕의 아세토니트릴 중에 용해시키고, 칼리케아마이신의 냉각된 용액에 서서히 첨가한 후, 트리에틸 아민(2.3 ㎕, 17.7 ㎛ol, 5 당량)을 첨가하였다. 반응물을 반응 완료시까지 가온시켰다. 3 시간 후, 반응물을 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 상에서 컬럼 크로마토그래피(MeOH/DCM 1%에서 20%)로 정제하여 4를 수득하였다. LCMS(분석 방법 A) Rt = 1.96 분, [M+H]+ = 1682.80.
(iii) S-((2R,3S,4S,6S)-6-((((2R,3S,4R,5R,6R)-6-(((2S,5Z,9R,13E)-13-(2-((4-(2-((E)-1-(4-(4-((2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)에틸)아미노)-4-옥소부톡시)페닐)에틸리덴)히드라지닐)-2-메틸-4-옥소부탄-2-일)디술파닐)에틸리덴)-9-히드록시-12-((메톡시카르보닐)아미노)-11-옥소비시클로[7.3.1]트리데카-1(12),5-디엔-3,7-디인-2-일)옥시)-5-(((2S,4S,5S)-5-(N-에틸아세트아미도)-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일)아미노)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일) 4-(((2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-3-아이오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤조티오에이트(1)
합성 경로 1 참조.
실시예
2
옥심
링커를 포함하는
칼리케아마이신
구성체의 합성
하기에 기재되는 바와 같이 하기 화학식 14에 따른 약물-링커 화합물을 합성하였다:
[화학식 14]
합성 부분 1: 링커 형성
(i) N-(2-(4-(4-아세틸페녹시)부탄아미도)에틸)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드(6).
실시예 1 / 합성 경로 2와 동일한 절차
(ii) tert-부틸 (Z)-(2-(((1-(4-(4-((2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)에틸)아미노)-4-옥소부톡시)페닐)에틸리덴)아미노)옥시)에틸)카르바메이트(10).
Tert-부틸 (2-(아미노옥시)에틸)카르바메이트(46.2 mg, 0.26 mmol, 1.2 당량)를 디메틸포름아미드(200 ㎕) 중의 N-(2-(4-(4-아세틸페녹시)부탄아미도)에틸)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 6(100 mg, 0.22 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 40℃에서 15 시간 동안 교반하였다. 반응물을 농축시키고, 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 요망되는 생성물 10(65.5 mg, 50%)을 백색 고체로서 수득하였다. LCMS(분석 방법 A): Rt = 1.92 분, [M+H]+ = 616.44.
(iii) (Z)-N-(2-(4-(4-(1-((2-아미노에톡시)이미노)에틸)페녹시)부탄아미도)에틸)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드(11).
tert-부틸 (Z)-(2-(((1-(4-(4-((2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)에틸)아미노)-4-옥소부톡시)페닐)에틸리덴)아미노)옥시)에틸)카르바메이트 10을 디클로로메탄 중의 10% TFA의 용액 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 용매를 증발시켰다. 생성된 조 혼합물을 다음 단계에서 사용하였다.
합성 부분 2: 링커-약물 제작
(i) 4-(((E)-2-((1R,8S,Z)-8-(((2R,3R,4R,5S,6R)-5-((((2S,4S,5S,6R)-5-((4-(((2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-3-아이오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤조일)티오)-4-히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)아미노)-3-(((2S,4S,5S)-5-(N-에틸아세트아미도)-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-4-히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-1-히드록시-10-((메톡시카르보닐)아미노)-11-옥소비시클로[7.3.1]트리데카-4,9-디엔-2,6-디인-13-일리덴)에틸)디술파닐)-4-메틸펜탄산(12).
N-아세틸 칼리케아마이신 γ 1(0.2 g, 0.142 mmol, 1 당량)을 30 ml의 아세토니트릴 중에 용해시키고, 용액을 -15℃까지 냉각시켰다. 4-메르캅토-4-메틸펜탄산(0.420 ml, 2.837 mmol, 20 당량)을 10 ml의 아세토니트릴 중에 용해시키고, N-아세틸 칼리케아마이신의 냉각된 용액에 서서히 첨가하였다. 트리에틸아민(0.377 ml, 2.837 mmol, 20 당량)을 반응 혼합물에 첨가하고, 반응물을 3 시간 내지 18 시간에 걸쳐 실온까지 가온시켰다. 반응 완료시, 혼합물을 농축시키고, 플래쉬 크로마토그래피 정제를 위해 실리카 겔 상으로 건조 로딩하였다. DCM 중의 2%에서 20% MeOH로의 플래쉬 크로마토그래피 정제로부터 요망되는 생성물을 유리형 고체(0.19 g, 90.5% 수율)로서 단리하였고, 이는 백색 분말로서 저온 디에틸 에테르로부터 침전될 수 있었다. LCMS(분석 방법 A): Rt = 1.92 분, [M+H]+ = 1478.64.
(ii) S-((2R,3S,4S,6S)-6-((((2R,3S,4R,5R,6R)-6-(((2S,5Z,9R,13E)-13-((Z)-2-(4-(4-((2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)에틸)아미노)-4-옥소부톡시)페닐)-11,11-디메틸-8-옥소-4-옥사-12,13-디티아-3,7-디아자펜타데스-2-엔-15-일리덴)-9-히드록시-12-((메톡시카르보닐)아미노)-11-옥소비시클로[7.3.1]트리데카-1(12),5-디엔-3,7-디인-2-일)옥시)-5-(((2S,4S,5S)-5-(N-에틸아세트아미도)-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일)아미노)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일) 4-(((2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-3-아이오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤조티오에이트(9).
(Z)-N-(2-(4-(4-(1-((2-아미노에톡시)이미노)에틸)페녹시)부탄아미도)에틸)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 11(2.1 mg, 4 ㎛ol, 1.5 당량)을 100 ㎕의 디메틸포름아미드 중에 용해시키고, 5 ㎕의 DIPEA(10 당량)를 첨가하였다. 이어서, 이 용액을 5 ㎕의 DIPEA(10 당량)와 함께 100 ㎕의 디메틸포름아미드 중의 12(4.0 mg, 2.7 ㎛ol)의 용액에 첨가하였다. EDCI(2.6 mg, 13.5 ㎛ol, 5 당량) 및 HOBt 수화물(4.1 mg, 27 ㎕, 10 당량)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 20 시간 동안 교반하였다. 완전한 전환이 나타났고, 반응물을 농축시킨 후, 제조 HPLC(제조 HPLC 방법 B) 상에서 정제하여 요망되는 생성물 9(0.4 mg, 7.5%)를 수득하였다. LC/HRMS(분석 방법 C): Rt = 9.06 분, [M+2H]+에 대한 M/Z 관측치 = 988.3195. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) δ 7.56 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.90 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.68 (s, 2H), 6.46 (s, 2H), 6.23 (d, J = 65.9 Hz, 3H), 5.73 (s, 1H), 4.68 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.48 (s, 1H), 4.32 (s, 1H), 4.24 (s, 3H), 4.04 (q, J = 6.3 Hz, 4H), 3.89 (s, 3H), 3.84 (s, 4H), 3.82 - 3.54 (m, 13H), 3.49 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 3.42 - 3.25 (m, 10H), 2.61 (d, J = 17.7 Hz, 1H), 2.39 (d, J = 21.7 Hz, 8H), 2.29 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 2.21 (s, 5H), 2.11 (d, J = 8.0 Hz, 7H), 2.02 (s, 2H), 1.93 (s, 2H), 1.67 - 1.49 (m, 42H), 1.41 (d, J = 6.3 Hz, 4H), 1.31 (d, J = 6.2 Hz, 5H), 1.28 - 1.15 (m, 12H).
실시예
3
Val-
Cit
디펩티드
링커를 포함하는
칼리케아마이신
구성체의 합성
하기에 기재되는 바와 같이 하기 화학식 4에 따른 약물-링커 화합물(도 1)을 합성하였다:
[화학식 4]
합성 부분 1: 링커 형성
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 (4-니트로페닐) 카르보네이트 14.
14의 합성은 이전에 기재되었다(US 6,214,345 B1).
tert-부틸 (4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질) 에탄-1,2-디일디카르바메이트 15.
4-니트로페닐 카르보네이트 14(100 mg, 0.136 mmol, 1 당량)를 5 ml 무수 DMF 중에 용해시키고, 0℃까지 냉각시키고, tert-부틸 (2-아미노에틸)카르바메이트(21.4㎕, 0.136 mmol, 1 당량)로 처리하였다. 반응 혼합물을 2 시간 동안 교반하고, 농축시키고, 컬럼 크로마토그래피(2%에서 50% 구배 MeOH/DCM)로 정제하여 회백색 고체(55 mg, 53%)를 수득하였다. LCMS(분석 방법 A): Rt =1.73 분, [M+H]+ = 759.38.
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 (2-아미노에틸)카르바메이트 16.
Boc-아민 링커 15(50 mg, 0.066 mmol, 1 당량)를 10% TFA/DCM 용액(5 ml) 중에 용해시키고, 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 반응 완료가 LCMS에 의해 확인되었고, 용매를 진공에서 제거하였다. 생성된 유리 아민의 TFA 염을 바로 다음 단계예서 사용하였다. LCMS(분석 방법 A): Rt =1.36 분, [M+H]+ = 659.52.
합성 부분 2: 약물-링커 제작
S-((2R,3S,4S,6S)-6-((((2R,3S,4R,5R,6R)-6-(((2S,5Z,9R,13E)-13-(1-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)페닐)-11,11-디메틸-3,8-디옥소-2-옥사-12,13-디티아-4,7-디아자펜타데칸-15-일리덴)-9-히드록시-12-((메톡시카르보닐)아미노)-11-옥소비시클로[7.3.1]트리데카-1(12),5-디엔-3,7-디인-2-일)옥시)-5-(((2S,4S,5S)-5-(N-에틸아세트아미도)-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일)아미노)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일) 4-(((2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-3-아이오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤조티오에이트 13.
칼리케아마이신-산 유도체 10(108 mg, 0.073 mmol 1 당량)을 20 ml의 건조 DMF 중에 용해시킨 후, EDCI(140.1 mg, 0.731 mmol, 10 당량), HOBt(111.8 mg, 0.731 mmol, 10 당량) 및 건조 DIPEA(0.253 ml, 1.46 mmol, 20 당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 10 분 동안 교반하였다. 링커 아민 16(144.2 mg, 0.219 mmol, 3 당량)을 3 ml의 건조 DMF 및 건조 DIPEA(0.253 ml, 1.46 mmol, 20 당량) 중에 용해시키고, 링커 용액에 첨가하였다. 이어서, 링커-아민 용액을 활성화된 산 용액에 첨가하였다. 반응물을 37℃에서 밤새 교반하고, LCMS로 모니터링하였다. 반응 완료시, DMF를 진공에서 제거하고, 얻어진 잔류물을 제조 HPLC 정제(방법 A)를 위해 1:1 아세토니트릴:물 중에 용해시켰다. 요망되는 생성물을 제조 HPLC 방법 A에 의해 백색 분말(20 mg, 12.9%)로서 단리하였다. LCMS: Rt(분석 방법 A 또는 C) = 8.52 분, [M+H]+에 대한 M/Z 관측치 = 2118.7134. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) δ 7.52 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.26 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.95 - 6.86 (m, 2H), 6.68 (s, 2H), 6.44 - 6.36 (m, 1H), 6.23 (s, 1H), 5.91 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 5.82 - 5.73 (m, 2H), 5.67 (d, J = 1.7 Hz, 2H), 5.03 (dd, J = 16.4, 7.7 Hz, 4H), 4.73 - 4.49 (m, 5H), 4.46 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 4.27 (s, 2H), 4.24 - 4.14 (m, 3H), 3.88 (s, 4H), 3.83 (d, J = 2.5 Hz, 4H), 3.81 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 3.77 - 3.59 (m, 9H), 3.57 (s, 4H), 3.49 (q, J = 8.2, 7.4 Hz, 3H), 3.42 - 3.20 (m, 13H), 3.18 - 3.04 (m, 3H), 2.44 - 2.33 (m, 6H), 2.29 (t, J = 9.8 Hz, 2H), 2.23 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 2.20 - 1.96 (m, 31H), 1.87 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 1.80 - 1.47 (m, 11H), 1.46 - 1.35 (m, 5H), 1.35 - 1.14 (m, 18H), 0.92 (dd, J = 6.7, 3.2 Hz, 6H).
실시예
4
Val-Ala
디펩티드
링커를 포함하는
칼리케아마이신
구성체의 합성
하기에 기재되는 바와 같이 하기 화학식 5에 따른 약물-링커 화합물을 합성하였다:
[화학식 5]
합성 부분 1: 링커 형성
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤질 (4-니트로페닐) 카르보네이트 18.
4-니트로페닐 카르보네이트 18의 합성은 이전에 기재되었다(US 6,214,345 B1).
tert-부틸 (4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤질) 에탄-1,2-디일디카르바메이트 19.
링커 15의 제조에 대한 것과 동일한 합성 절차를 사용하여 합성을 수행하였다. 단리 수율 68 mg(63%), LCMS(분석 방법 A): Rt =1.85 분, [M+H]+ = 673.39.
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤질 (2-아미노에틸)카르바메이트 20.
링커 16의 제조에 대한 것과 동일한 합성 절차. LCMS(분석 방법 A): Rt =1.38 분, [M+H]+ = 573.44.
합성 부분 2. 약물-링커 제작
S-((2R,3S,4S,6S)-6-((((2R,3S,4R,5R,6R)-6-(((2S,5Z,9R,13E)-13-(1-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)페닐)-11,11-디메틸-3,8-디옥소-2-옥사-12,13-디티아-4,7-디아자펜타데칸-15-일리덴)-9-히드록시-12-((메톡시카르보닐)아미노)-11-옥소비시클로[7.3.1]트리데카-1(12),5-디엔-3,7-디인-2-일)옥시)-5-(((2S,4S,5S)-5-(N-에틸아세트아미도)-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일)아미노)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일) 4-(((2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-3-아이오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤조티오에이트 17.
링커 13의 제조에 대한 것과 동일한 합성 절차. 백색 고체로서 단리. LCMS(분석 방법 B 또는 C) Rt= 8.93 분, LC/HRMS [M+2H]+에 대한 M/Z 관측치 = 1016.8810 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) δ 7.50 (d, J = 8.2 Hz, 3H), 7.26 (s, 4H), 6.68 (s, 2H), 6.25 (s, 3H), 5.83 - 5.75 (m, 2H), 5.73 (s, 2H), 5.64 (d, J = 14.1 Hz, 2H), 5.06 (t, J = 12.7 Hz, 4H), 4.75 - 4.52 (m, 6H), 4.48 (s, 2H), 4.32 (s, 3H), 4.20 (dd, J = 9.4, 6.1 Hz, 2H), 4.05 (s, 4H), 3.89 (s, 4H), 3.84 (d, J = 1.6 Hz, 5H), 3.77 (dd, J = 15.6, 9.1 Hz, 4H), 3.73 - 3.60 (m, 7H), 3.58 (s, 4H), 3.49 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 3.43 - 3.22 (m, 13H), 3.18 (d, J = 17.2 Hz, 2H), 2.98 (s, 3H), 2.37 (s, 7H), 2.33 - 2.13 (m, 8H), 2.10 (s, 7H), 1.90 (s, 3H), 1.59 (s, 19H), 1.50 - 1.37 (m, 10H), 1.35 - 1.13 (m, 22H), 0.93 (d, J = 6.8 Hz, 7H).
실시예
5
비스
-Val-
Cit
디펩티드
링커를 포함하는
칼리케아마이신
구성체의 합성
하기에 기재되는 바와 같이 하기 화학식 15에 따른 약물-링커 화합물을 합성하였다:
[화학식 15]
합성 부분 1: 링커 형성.
((((2S,5S,15S,18S)-10-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸)-5,15-디이소프로필-4,7,13,16-테트라옥소-2,18-비스(3-우레이도프로필)-3,6,10,14,17-펜타아자노나데칸디오일)비스(아잔디일))비스(4,1-페닐렌))비스(메틸렌) 비스(4-니트로페닐) 비스(카르보네이트) 22.
카르보네이트 18과 유사하게 4-니트로페닐 카르보네이트 22의 합성을 달성하였다.
((((2S,5S,15S,18S)-10-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸)-5,15-디이소프로필-4,7,13,16-테트라옥소-2,18-비스(3-우레이도프로필)-3,6,10,14,17-펜타아자노나데칸디오일)비스(아잔디일))비스(4,1-페닐렌))비스(메틸렌) 비스((2-아미노에틸)카르바메이트) 23의 비스 tert-부틸 카르복실레이트.
링커 15 및 19의 제조에 대한 것과 동일한 합성 절차를 사용하여 합성을 수행하였다. 단리 수율 13 mg(51%), LCMS(분석 방법 A): Rt =1.68 분, [M+H]+ = 1379.85.
((((2S,5S,15S,18S)-10-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸)-5,15-디이소프로필-4,7,13,16-테트라옥소-2,18-비스(3-우레이도프로필)-3,6,10,14,17-펜타아자노나데칸디오일)비스(아잔디일))비스(4,1-페닐렌))비스(메틸렌) 비스((2-아미노에틸)카르바메이트) 24.
링커 16 및 20의 제조에 대한 것과 동일한 합성 절차. LCMS(분석 방법 A): Rt =1.52 분, [M+H]+ = 1179.67.
합성 부분 2. 링커-약물 제작
말레이미도 비스-Val-Cit-PABA-칼리케아마이신 감마 1 유도체 21.
13 및 17의 제조에 대한 것과 동일한 합성 절차. 백색 고체로서 단리. LCMS(분석 방법 B 또는 C) Rt= 7.80 분, LC/HRMS [M+3H]+에 대한 M/Z 관측치 = 1366.7897.
실시예
6
가변 PEG
스페이서를
갖는 Val-
Cit
디펩티드
링커를 포함하는
칼리케아마이신
링커-약물의 합성
하기에 기재되는 바와 같이 하기 화학식 16의 화합물을 합성하였다:
[화학식 16]
합성 부분 1: 링커 형성.
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 (2,2-디메틸-4-옥소-3,9,12,15-테트라옥사-5-아자옥타데칸-18-일)카르바메이트(26).
링커 15의 제조에 대한 것과 동일한 합성 절차를 사용하여 합성을 수행하였다. LCMS(분석 방법 A): Rt =1.81 분, [M+H]+ = 919.36.
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 (3-(2-(2-(3-아미노프로폭시)에톡시)에톡시)프로필)카르바메이트(27)
링커 16의 제조에 대한 것과 동일한 합성 절차. LCMS(분석 방법 A): Rt =1.46 분, [M+H]+에 대한 M/Z 관측치 = 819.36.
합성 부분 2. 약물-링커 제작
S-((2R,3S,4S,6S)-6-((((2R,3S,4R,5R,6R)-6-(((2S,5Z,9R,13Z)-13-(1-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)페닐)-22,22-디메틸-3,19-디옥소-2,8,11,14-테트라옥사-23,24-디티아-4,18-디아자헥사코산-26-일리덴)-9-히드록시-12-((메톡시카르보닐)아미노)-11-옥소비시클로[7.3.1]트리데카-1(12),5-디엔-3,7-디인-2-일)옥시)-5-(((2S,4S,5S)-5-(N-에틸아세트아미도)-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일)아미노)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일) 4-(((2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-3-아이오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤조티오에이트 (25)
13 및 17의 제조에 대한 것과 동일한 합성 절차. 백색 고체로서 단리. LCMS(분석 방법 B 또는 C) Rt= 8.62 분, LC/HRMS [M+2H]+에 대한 M/Z 관측치 = 1139.9088.
하기에 기재되는 바와 같이 하기 화학식 17의 화합물을 합성하였다:
[화학식 17]
합성 부분 1: 링커 형성.
tert-부틸 (4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질) (3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-운데카옥사펜타트리아콘탄-1,35-디일)디카르바메이트(29).
링커 15의 제조에 대한 것과 동일한 합성 절차를 사용하여 합성을 수행하였다. LCMS(분석 방법 A): Rt =1.80 분, [M+H]+에 대한 M/Z 관측치 = 1243.69.
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 (35-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-운데카옥사펜타트리아콘틸)카르바메이트(30).
링커 16의 제조에 대한 것과 동일한 합성 절차. LCMS(분석 방법 A): Rt =1.50 분, [M+H]+에 대한 M/Z 관측치 = 1143.50.
합성 부분 2. 약물-링커 제작
S-((2R,3S,4S,6S)-6-((((2R,3S,4R,5R,6R)-6-(((2S,5Z,9R,13Z)-13-(1-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)페닐)-44,44-디메틸-3,41-디옥소-2,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사-45,46-디티아-4,40-디아자옥타테트라콘탄-48-일리덴)-9-히드록시-12-((메톡시카르보닐)아미노)-11-옥소비시클로[7.3.1]트리데카-1(12),5-디엔-3,7-디인-2-일)옥시)-5-(((2S,4S,5S)-5-(N-에틸아세트아미도)-4-메톡시테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일)아미노)옥시)-4-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일) 4-(((2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-디히드록시-4-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)-3-아이오도-5,6-디메톡시-2-메틸벤조티오에이트(28).
13 및 17의 제조에 대한 것과 동일한 합성 절차. 백색 고체로서 단리. LCMS(분석 방법 B 또는 C) Rt= 8.61 분, LC/HRMS [M+2H]+에 대한 M/Z 관측치 = 1302.0007.
실시예
7
디펩티드
링커 -
칼리케아마이신
구성체는 시험관 내에서 효율적으로 절단됨
이전 실시예에서 제조된 디펩티드 링커-약물 구성체가 효소적 절단에 대해 민감한지를 입증하기 위해 카텝신 B 분석을 수행하였다. 초기에 실시예 3 및 4로부터의 링커 약물 구성체를 1 M N-아세틸 시스테인 용액으로 처리하여 말레이미드 관능기를 켄칭시킨 후 카텝신 B 처리를 수행하였다. 과량의 N-아세틸 시스테인을 사용하여 카텝신 B를 활성화시켰다.
보다 구체적으로 1:1 아세토니트릴:물 용액(20 ㎕) 중의 켄칭된 링커-약물을 20 mM HisCl pH 6.0으로 10% v/v(80 ㎕)의 최종 아세토니트릴 함량으로 희석하였다. 카텝신 B 효소를 첨가하여 링커-약물에 대하여 2.5 mol%, 5 mol% 또는 10 mol% 효소를 형성하였다. 반응물을 온화하게 와류운동시키고, 실온에서 유지하였다. 15 분, 30 분, 60 분 및 90 분의 시점에, 3 ㎕의 반응 혼합물을 5 ㎕ 트리스 pH 9, 2 ㎕ 100 mM 디히드록시 아스코르브산(DHAA), 15 ㎕ 물을 함유하는 전체 회수 바이알에 넣었다. 샘플을 상기에 기재된 분석 방법 B를 사용하여 분석하였다. 출발 물질 피크 면적의 감소에 기초하여 전환을 계산하였다. 결과를 도 2a 내지 2c에 나타내었다.
Val-Cit 칼리케아마이신 구성체는 일반적으로 Val-Ala 디펩티딜 구성체에 비해 보다 빠르게 절단되었다(두 구성체 모두 카텝신 B에 의해 효과적으로 절단되었음). 예상된 페이로드 아민의 방출을 1520.53의 [MH]+ 이온을 나타내는 질량 분광측정 특성화에 의해 확인하였다. 세포에서 나타나는 것들에 접근하는 이온화 조건 하에, 디술피드 결합 절단 및 재배열의 생성물은 또한 1334.39의 [MH]+ 이온으로서 나타났다(도 1).
상기 언급된 결과는 명백히, 링커 절단 과정이 칼리케아마이신 페이로드의 완전한 방출을 제공함을 입증한다. 이 데이터는, 예시적 디펩티딜 약물 링커가 바람직한 치료적 특징을 갖고, 개시된 항체 약물 컨쥬게이트 내에 효과적으로 혼입될 수 있음을 나타낸다.
실시예
8
칼리케아마이신
- 링커 구성체는 시험관 내에서 치료 유효 세포독성을 나타냄
상기에 기재된 것들과 같은 칼리케아마이신-링커 구성체가 세포 사멸 능력을 보유하고 항체 약물 컨쥬게이트의 부분으로서 기능할 수 있음을 입증하기 위해 추가의 분석을 수행하였다. 293 T 세포를, ATCC로부터 구입된 자궁 육종 라인을 포함하는 MES SA 및 MES SA/Dx 세포와 함께 사용하였다. 증가량의 독소루비신과 함께 배양된 MES SA 세포로부터 MES SA/Dx 세포주를 생성시켜, 독소루비신에 대한 100배 내성 및 MDR1의 상향조절을 얻었다. 독소루비신 이외에도, MES-SA/Dx 세포는 많은 기타 다른 화학요법제(다우노루비신, 닥티노마이신, 빈크리스틴, 탁솔, 콜키신 포함)에 대한 현저한 교차-내성뿐만 아니라, 미토마이신 C 및 멜팔란에 대하여 중간 정도의 교차-내성을 나타낸다.
세포를 약 50% 내지 80% 컨플루언시(confluency)까지 T75 플라스크에서 배양하고, 트립신으로 단일 세포 현탁액 내로 수확하였다. 웰 당 오백(500) 개 세포를 50 ㎕/웰 배지에서 조직 배양 플레이트에서 시딩하고, 37℃에서 18 시간 내지 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 화합물을 DMSO 중에 400 배의 최종 요망되는 농도로 희석하였다. 이어서, DMSO 중의 일련의 희석액을 0.25%의 최종 DMSO 농도로 배지 중에서 희석하고, 50 ㎕/웰의 최종 희석액을 세포에 첨가하였다(Vf = 100 ㎕). 플레이팅 및 처리 후, 세포를 추가의 72 시간 동안 인큐베이터로 복귀시켰다. 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 시약을 제조업체의 지시에 따라 제조하고, 100 ㎕/웰로 배양에 첨가하였다. 셀타이터-글로는, 세포내 ATP 농도의 정량에 의해 대사 활성 세포의 상대적 계산을 가능하게 한다. 주변 실온에서의 셀타이터-글로와의 인큐베이션 5 분 후, 125 ㎕/웰의 셀 타이터 글로/세포 용해물 용액을 블랙 분석 플레이트로 옮기고, 이어서 이를 30 분 내에 광도계에서 판독하였다. 0.25% DMSO 이외의 임의의 처리를 받지 않은 배양물로부터 얻어진 발광 판독치를 100% 대조군으로서 셋팅하고, 모든 기타 다른 발광 값을 이들 대조군에 대해 정규화하였다(예를 들어, 정규화된 RLU, 상대적 발광 단위).
분석 결과를 도 3a 내지 3d에 나타내었고, 동일한 데이터로부터 유도된 선택된 IC50 값을 하기 표 5에 나타내었다. 보다 구체적으로, 도 3a 내지 3d는, 칼리케아마이신(도 3a), 상기 실시예 3으로부터의 Val-Cit 칼리케아마이신(화학식 3)(도 3b), 상기 실시예 4로부터의 Val-Ala 칼리케아마이신(화학식 4)(도 3c) 및 상기 실시예 1로부터의 옥심 링커를 포함하는 칼리케아마이신(화학식 1)에 대한 농도 의존적 시험관 내 세포 사멸 곡선을 도시한 것이다. 각각의 화합물 각각에 대하여 MES 세포, MES SA/DX 세포 및 293T 대조군 세포에 대하여 세포 사멸 능력을 측정하였다.
도 3a 내지 3d에 나타낸 곡선에 의해 나타나는 바와 같이, 칼리케아마이신 및 링커 약물 화합물 각각은 제약상 허용되는 활성을 나타내고, MES SA 세포 및 293T 대조군 세포를 비교적 낮은 농도에서 사멸시켰다. 이와 관련하여, 칼리케아마이신 자체는 링커-약물 구성체에 의해 얻어진 것에 비해 대략 한자릿수 정도 낮은 농도로 활성을 나타내었다. 또한, 예상되는 바와 같이, MES SA/DX 세포는 보다 큰 내성을 가졌고, 세포 사멸을 유도하기 위해 독소 자체 및 약물-링커 구성체 둘 다의 보다 높은 독소 농도를 필요로 하였다.
표 5와 관련하여, 유도된 IC50 값은, 칼리케아마이신 자체 및 세포독소 대조군은 피코몰 범위의 활성을 가지며, 칼리케아마이신-링커 구성체는 나노몰 범위의 활성을 가짐을 나타낸다. 링커 모이어티의 첨가에 의해 제공된 세포독성의 감소는, 이것이 약물 링커가 어떻게든 표적화 모이어티로부터 해리되는 경우에 감소된 비-국소화된 독성을 제공한다는 점에서 바람직함을 인지할 것이다. 이와 같이, 도 3a 내지 3d에 나타낸 데이터는, 개시된 칼리케아마이신-링커가 항체 약물 컨쥬게이트 중의 포함에 있어 유리한 후보물임을 나타낸다.
실시예
9
세포 결합제에 대한
칼리케아마이신
-링커 구성체의
컨쥬게이션
본 발명의 칼리케아마이신-링커 구성체를 추가로 특성화하기 위해, 상기 실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이 제작된 디펩티딜 약물-링커 화합물을, 안정화제(예를 들어, L-아르기닌) 및 온화한 환원제(예를 들어, 글루타티온)를 포함하는 선택적 환원 과정을 사용하여 자리-특이적 항SEZ6 항체에 컨쥬게이션시켰다. 상기에서 논의된 바와 같이, 선택적 컨쥬게이션은, 미소한 비-특이적 컨쥬게이션을 가지면서, 우선적으로 칼리케아마이신-링커 구성체를 항체 상의 조작된 유리 시스테인에 컨쥬게이션시킨다.
이와 관련하여, hSC17ss1 구성체에 대한 표적 컨쥬게이션 자리는 위치 214에서의 각각의 경쇄 상의 쌍을 이루지 않은 시스테인(C214)이다. 이들 조작된 자리의 컨쥬게이션을 수행하기 위해, hSC17ss1의 제조물을 실온에서 최소 2 시간 동안 1 M L-아르기닌/8 mM 글루타티온, 환원된 (GSH)/5 mM EDTA를 함유하는 완충제(pH 8.0) 중에서 부분 환원시켰다. 이어서, 제조물을 30 kDa 멤브레인(밀리포어 아미콘 울트라(Millipore Amicon Ultra))을 사용하여 20 mM 트리스/3.2 mM EDTA(pH 7.0) 완충제로 완충제 교환시켰다. 생성된 부분 환원된 제조물은 1.9 내지 2.3의 유리 티올 농도를 가졌고, 이어서 모든 제조물을, 4℃에서 밤새 말레이미도 모이어티를 통해 Val-Ala 칼리케아마이신(hSC17ss1-va) 및 Val-Cit 칼리케아마이신(hSC17ss1-vc)에 컨쥬게이션시켰다. 이어서, 물 중에서 제조된 10 mM 모액을 사용하여 1.2 몰 과량의 NAC를 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 이어서, 20 분의 최소 켄칭 시간 후, 항체-칼리케아마이신의 제조물을 30 kDa 멤브레인(밀리포어 아미콘 울트라)을 사용한 희석여과에 의해 20 mM 히스티딘 클로라이드(pH 6.0) 중으로 희석여과하였다.
실시예
10
칼리케아마이신
ADC의
특성화
칼리케아마이신 항체-약물 컨쥬게이트의 비-환원된 질량을 에이비 사이엑스 5600 트리플 비행 시간 질량 분광계(HR Triple TOF MS) 및 브루커 막시스(Bruker maXis) II 초고해상도 비행 시간 질량 분광계(UHR-TOF MS)로 측정하였다. 둘 다에 전기분무 이온화(ESI) 공급원을 장착하였고, 이는 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC) 시스템에 직접 커플링되었다. 샘플을 먼저 1 mg/mL로 희석하고, 이어서 이들의 비-환원 형태로 분석하였다. 단백질을 변성 이동 상 시스템으로 역상 컬럼(포로쉘(Poroshell) 300 SB-C3, 5 um, 1.0 × 75 mm, 애질런트(Agilent) P/N 661750-909; 액쿼티(Acquity) BEH300 C4, 1.7 um, 2.1×50 mm, 워터스 P/N 186004495) 상에서 분리하였다. 이동 상 A는 물 중 0.1%(v/v) 포름산이다. 이동 상 B는 80%(v/v) 2-프로판올, 10%(v/v) 아세토니트릴, 10%(v/v) 물 중 0.1%(v/v) 포름산이다(이동 상 B). 각각의 단백질의 MS 스펙트럼(예를 들어, 도 4a 및 4b)을 평균화하고, 이어서 디컨볼루션하여 평균 질량 및 단일동위원소 질량을 얻었다. 하기 표 5에 상응하는 컨쥬게이션된 칼리케아마이신 링커-약물과 함께 SC17ss1 LC의 평균 및 단일동위원소 질량의 이론치 및 관측치를 요약하였다.
이 데이터는, 칼리케아마이신-링커 구성체가 조작된 항SEZ6 항체의 유리 시스테인에 성공적으로 컨쥬게이션되었음을 나타낸다.
상기 실시예로부터의 항체-약물 제조물(CD46에 면역특이적으로 결합되고, 다른 제조물과 실질적으로 동일한 방식으로 컨쥬게이션된 또 기타 다른 제조물, hSC1ss1-vc와 함께)을 역상(RP-HPLC) 분석에 의해 추가로 특성화하여 중쇄 vs 경쇄 컨쥬게이션 자리를 정량하였다. 보다 구체적으로, 도 5에 나타낸 바와 같이, RP-HPLC를 사용하여 hSC17ss1-vc(화학식 4'), hSC17ss1-va(화학식 5)', 및 hSC1ss1-vc(화학식 4')에 대한 표적상 경쇄 컨쥬게이션의 백분율을 측정하였다(도 5). 이동 상 A로서 물 중 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(TFA) 및 이동 상 B로서 90%(v/v) 아세토니트릴 중 0.1%(v/v) TFA와 함께 아에리스 와이드포어(Aeris WIDEPORE) 3.6 ㎛ C4 컬럼(페노메넥스(Phenomenex))을 사용하여 분석을 수행하였다. 샘플을 분석 전에 DTT로 완전히 환원시키고, 이어서 컬럼 상에 주입하였고, 여기서 30% 내지 70% 구배의 이동 상 B를 15 분에 걸쳐 적용하였다. 214 nm에서의 UV 신호를 수집하고, 이어서 이를 사용하여 중쇄 및 경쇄 컨쥬게이션의 정도를 계산하였다.
이전에 확립된 피크의 RP-HPLC 곡선 하의 면적(경쇄, 경쇄+1 약물, 중쇄, 중쇄+1 약물, 중쇄+2 약물 등)을 적분하고, 별도로 각각의 사슬에 대한 % 컨쥬게이션을 계산함으로써 중쇄 및 경쇄 상의 퍼센트 컨쥬게이션을 구하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, hSC17 자리 특이적인 경쇄 상의 퍼센트 컨쥬게이션은 Val-Cit 및 Val-Ala 칼리케아마이신 구성체 둘 다와의 컨쥬게이션에 대해 80% 초과이다. Val-Cit 칼리케아마이신에 대한 hSC1ss1 자리 특이적 컨쥬게이션 또한 80% 초과의 경쇄 컨쥬게이션을 제공하였다. 상기에 기재된 샘플의 중쇄 상의 퍼센트 컨쥬게이션은, hSC17 자리 특이적 컨쥬게이트에 대해 15% 미만, 또한 hSC1ss1 자리 특이적 컨쥬게이션에 대해 30% 미만이고, 이는 각각 hSC17 자리 특이적 Val-Cit 및 Val-Ala 컨쥬게이트에 대해 얻어진 1.9 및 1.8의 DAR에 비해 이 샘플에 대해 얻어진 2.3의 보다 높은 DAR로 인해 예상되는 것이다. 모든 경우에, 중쇄 상의 퍼센트 컨쥬게이션을 감소시키면서 경쇄 상의 퍼센트 컨쥬게이션을 증가시키기 위해 컨쥬게이션 파라미터를 추가로 최적화할 수 있다.
동일한 hSC17ss1-vc, hSC17ss1-va, 및 hSC1ss1-vc 제조물을 또한, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) HPLC에 기초한 방법을 사용하여 분석하여, ADC에 대해 원치않는 DAR > 2 종에 비해 DAR=2 종의 양을 측정하였다. 이와 관련하여, HIC는, 이동 상 A로서 물 중 1.5 M 황산암모늄 및 25 mM 인산칼륨 및 이동 상 B로서 물 중 0.25% w/v CHAPS 및 25 mM 인산칼륨과 함께 폴리프로필 A 컬럼(PolyLC)을 사용하여 수행하였다. 샘플을 컬럼 상에 직접 주입하고, 여기서 0% 내지 100% 구배의 이동 상 B를 15 분에 걸쳐 적용하였다. 280 nm에서의 UV 신호를 수집하고, 비-컨쥬게이션된 항체 및 보다 높은 DAR 종에 대하여 크로마토그램을 분석하였다. DAR 계산은, 이전에 확립된 피크의 HIC 곡선 하의 면적(DAR=0, DAR=1, DAR=2, DAR=4 등)을 적분하고, 각각의 피크의 %를 계산함으로써 수행하였다. hSC17ss1-vc 및 hSC1ss1-vc에 대한 결과 DAR 분포를 도 6에 나타내었다. hSC17 자리-특이적 컨쥬게이트 제조물의 HIC에 의해 구한 DAR 분포(hSC17ss1-va에 대한 데이터는 나타내지 않음)는, 모든 3종의 컨쥬게이트가 65% 초과의 DAR=2를 제공함을 나타낸다. 컨쥬게이트 제조물은 또한 25% 미만의 DAR < 2 및 15% 미만의 DAR >2를 제공하였다.
동일한 절차를 사용하여 N149, SC27 및 SC57(다양한 결정인자에 대한 IgG1 자리-특이적 항체)의 후속 컨쥬게이션을 분석하고, 그에 따른 결과를 표 7에 요약하였다. 상기에 기재된 HIC 방법 또는 하기에 기재되는 크기 배제 크로마토그래피 방법을 사용하여 DAR 계산을 수행하였다.
크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 칼리케아마이신 항체-약물 컨쥬게이트의 크기 이질성을 특성화하였다. 분석에서는, 이동 상으로서 물 중 25 mM 인산나트륨(pH 6.5), 500 mM L-아르기닌, 및 10% 이소프로판올(IPA)과 함께 액쿼티 1.7-㎛, 4.6 × 300 mm UPLC BEH200 SEC 컬럼을 사용하였다. 샘플을 용매 없이 주입하고, 이동 상을 22 분 동안 0.2 mL/분으로 등용매 적용하였다. 280 nM에서의 UV 신호를 수집하고, 피크 면적을 사용하여 ADC의 응집 및 단편화 정도를 계산하였다.
비교적 치밀한 평균 DAR 및 낮은 비율의 응집 또는 단편화는, 생성된 제조물이 유리한 치료 지수 및 비교적 낮은 비-특이적 독성을 나타낼 것임을 시사한다.
실시예
11
칼리케아마이신
ADC는
시험관 내에서 항원 발현 세포를 사멸시킴
본 발명의 항SEZ6 ADC가 세포독성제의 살아 있는 종양 세포로의 전달을 매개하고 내재화될 수 있는지의 여부를 측정하기 위해, 실시예 9에서 제공된 것들과 같은 선택된 항SEZ6 ADC를 사용하여 시험관 내 세포 사멸 분석을 수행하였다.
상기 실시예 8에 일반적으로 기재된 바와 같이 세포를 배양하고 플레이팅하였다. 하루 후, 종양 세포를 0 pM 내지 1000 pM의 범위에서 다양한 농도로 인간화된 항SEZ6 ADC(화학식 1의 옥심 약물-링커를 포함하는 hSC17ss1-va, hSC17ss1-vc 및 hSC17ss1-ox)에 노출시켰다. 96 시간 동안 인큐베이션 후, 생존가능 세포를 상기 실시예 7 에 기재된 바와 같이 셀타이터-글로®(프로메가(Promega))를 사용하여 계산하였다. 비-처리된 세포를 함유하는 배양물을 사용하여 원래의 발광 카운트를 100% 기준 값으로서 셋팅하고, 모든 기타 다른 카운트를 기준 값에 대한 백분율로서 계산하였다.
시험관 내 분석에 대한 결과를 본원에 첨부된 도 7a 내지 7c에 나타내었다. 보다 구체적으로, 도 7a는 항원 발현 세포를 제거하는 hSC17ss1-vc의 능력을 나타내며, 도 7b는 hSC17ss1-va에 대한 것, 또한 도 7c는 hSC17ss1-ox에 대한 것을 나타낸다. 각 경우, SEZ6을 과발현하도록 변환된 293T-SEZ6 세포는 모 라인(293T)에 비해 상당히 더 낮은 ADC 농도에서 더 많이 사멸되었고, 이는 SEZ6에 대한 ADC에서의 특이성을 나타낸다. 도 7a 내지 7c에 나타낸 데이터는, 항SEZ6 ADC의 내재화 및 세포독성 칼리케아마이신 페이로드의 전달 능력을 입증하고, 이는 ADC 성분으로서의 개시된 칼리케아마이신-링커 구성체의 사용을 지지하는 것이다.
적절한 표적 발현 세포주를 사용한 동일한 절차를 사용하여, N149, SC27 및 SC57의 후속 칼리케아마이신 컨쥬게이트의 세포 사멸 능력을 측정하였고, 그에 따른 결과를 표 8에 요약하였다.
전체적 표적 특이적 ADC는, 비교적 낮은 IC50 값을 나타내며 높은 효율로 표적 발현 세포를 사멸시킨다. 이러한 값은, 비-표적 발현 세포의 사멸 부재와 조합되어, 치료적으로 유용한 화합물의 지표가 된다.
실시예
12
칼리케아마이신
ADC는
생체 내에서 항원 발현 세포를 사멸시킴
상기 실시예 11에서 입증된 칼리케아마이신 ADC hSC17ss1-vc 및 hSC17ss1-va의 세포 사멸 특성을 확인하기 위해 생체 내 실험을 수행하였다. 이를 위해 상기 실시예에 기재된 바와 같이 제조된 자리-특이적 SC17-표적화된 ADC를, 내인성 SEZ6 세포 표면 단백질 발현을 갖는 피하 환자-유래 이종이식(PDX) 소세포 폐암(SCLC) 종양을 갖는 면역손상된 NODSCID 마우스에서의 생체 내 치료 효과에 대해 시험하였다. 보다 구체적으로, 항SEZ6 ADC를 각각 3종의 상이한 SCLC 모델에서 시험하였다.
SCLC-PDX 라인, LU64, LU95, 및 LU149를 각각 유방 지방 패드 영역 근처의 피부 하에 해리된 세포 접종물로서 주입하고, 캘리퍼로 매주 측정하였다(타원체부피 = a × b2/2, 여기서 a는 타원의 장축 직경이고, b는 단축 직경임). 종양이 200 ㎣(범위, 100 ㎣ 내지 300 ㎣)의 평균 크기로 성장한 후, 마우스를 동일한 종양 부피 평균의 처리 그룹(그룹 당 n=5 마우스)으로 랜덤화하였다. 마우스(그룹 당 5 마리)를, 전체 용량으로 4 일마다 1 회(Q4Dx4) 복강내 주사(300 ㎕ 부피)를 통해 비히클(멸균수 중 5% 글루코스), 또는 hSC17ss1-vc 및 hSC17ss1-va 칼리케아마이신 제조물(0.1 mg/kg 내지 1 mg/kg)로 처리하고, 매주 종양 부피(상기와 같은 캘리퍼) 및 중량 측정에 의해 치료 효과를 평가하였다. 개개의 마우스 또는 처리 그룹에 대한 종점 기준은, 건강 평가(임의의 질병 징후), 체중 손실(연구 개시로부터 20% 초과의 체중 손실), 및 종양 적재(종양 부피 1000 ㎣ 초과)를 포함하였다. 그룹이 대략 800 ㎣ 내지 1000 ㎣의 평균에 도달할 때까지 매주 종양 부피 측정(㎣)에 의해 효능을 모니터링하였다. 종양 부피는 처리 그룹에서의 모든 마우스에 대한 표준 오차 평균과 함께 평균치로서 계산하였고, 이를 초기 치료 이래로 시간(일)에 대해 플롯팅하였다. 치료 결과를 도 8a 내지 8c에 나타내었고, 여기에는 처리 그룹 당 5 마리의 마우스에서의 표준 오차 평균(SEM)과 함께 평균 종양 부피가 나타나 있다.
구체적으로 hSC17ss1-vc, hSC17ss1-va, 및 hSC17ss1-옥심(화학식 14') ADC를, 선택된 투여량으로 SCLC PDX-LU149(도 8a), PDX-LU95(도 8b) 또는 PDX-LU64(도 8c)를 갖는 마우스에서 평가하여 이들의 종양 성장 지연 능력을 측정하였다. 대상 도면에 나타낸 데이터는, hSC17ss1-vc 및 hSC17ss1-va ADC가, 중간 용량 수준(0.3 내지 0.6 mg/kg; 단일 용량 또는 Q4Dx4 투여 방식)에서 유사한(hSC17ss1-vc와 hSC17ss1-va 비교) 또는 변화된(hSC17ss1-옥심과 hSC17ss1-vc 비교) 치료 효과를 가짐을 입증하였다. 또한, 본 실시예에서 사용된 것과 같은 적절한 용량 수준(예를 들어, 1 mg/kg; Q4Dx4)은 SCLC PDX-보유 마우스에서 50일 이상 동안 지속되는 반응을 달성할 수 있는 것으로 또한 나타났다.
이들 모델에서, 또한 주어진 용량에서, hSC17ss1-vc 및 hSC17ss1-va ADC 제조물은, SCLC PDX의 3 개의 마우스 모델에서 시험시 유사한 생체 내 효능을 가졌다. hSC17ss1-옥심 ADC 제조물은 일부 치료 효과를 가졌지만, 2 개의 SCLC PDX 모델에서 동일한 용량에서 평가시, hSC17ss1-vc에 비해 낮았다. SCLC-PDX 종양을 갖는 마우스에서 SC17-결합 ADC의 생체 내 효능은 용량 수준 의존적이고, 보다 높은 용량 수준에서 강력하였다. 이와 함께 고려시, 데이터는, SC17 칼리케아마이신 ADC가 유사한, 또한 강력한 생체 내 치료 효능을 제공함을 나타낸다.
실시예
13
마우스
용인성
연구
이전 실시예에 기재된 바와 같이 제조된 hSC17ss1-vc 칼리케아마이신 ADC의 생체 내 용인성을 면역손상된 NODSCID 마우스에서 시험하였다. 나이브 5 내지 7주령 마우스를 칭량하고(21 g 내지 28 g), 동일한 평균 동물 체중의 처리 그룹(그룹 당 n=3 내지 4 마우스)으로 랜덤화하였다. 마우스를 정맥내 주사(100 ㎕ 부피)를 통해 단일 용량의 hSC17ss1-vc 칼리케아마이신 제조물(2 mg/kg 내지 16 mg/kg)로 처리하고, 마우스 체중 측정치를 2 주 내지 3 주 동안 매주 2 회 내지 3 회 모니터링하였다. 개개의 마우스에 대한 종점 기준은, 체중 손실(연구 개시로부터 10% 초과) 및 신체적 건강(자세, 활동, 체온, 호흡률, 또는 임의의 기타 다른 질병 징후)의 평가를 포함하였다. 결과를 도 9에 나타내었고, 여기에는 연구 개시로부터의 퍼센트(%) 체중 변화가 시간에 따라 모니터링되어 있다. 도 9에 나타낸 데이터는, hSC17ss1-vc가 면역손상된 NODSCID 마우스에서 8 mg/kg 이하의 단일 용량으로 잘 용인되었음을 입증하였다. 8 mg/kg 용량 수준에서 치료 후 제5일에 초기 체중 손실로부터의 회복이 나타났지만; 16 mg/kg 용량 수준로 처리된 동물은 회복되지 않았고, 이는 불량한 건강으로 인해 배제되었다(종점 기준).
실시예
14
hSC17ss1
-vc 및
hSC27ss1
-vc
칼리케아마이신의
시노몰구스
몽키
약동학(PK)에서의 약동학
이전 실시예에 기재된 바와 같이 제조된 ADC를 시노몰구스 몽키에서 평가하였다. 시노몰구스 몽키(그룹 당 n=3 수컷)를, 총 2 개 용량으로 3 주마다 1 회(Q3Wx2) 20 분 정맥 내 투입을 통해 1.5 mg/kg hSC17ss1-vc, 2.5 mg/kg hSC17ss1-vc, 또는 1.5 mg/kg hSC27ss1-vc로 처리하였다. 독성 연관 노출을 확인하기 위해 약동학을 평가하였다(실시예 15 참조). 각각의 투여 후 다양한 시점에 혈장 샘플을 수집하고, 전 항체(TAb) 및 ADC 피분석물 농도를 샌드위치 ELISA 분석-유형 방법에 의해 평가하였다. TAb 및 ADC 농도 대 시간 데이터를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 데이터(화학식 4')는, 칼리케아마이신 ADC의 PK가 용량-선형적임을 입증한다. MAb 노출은 예상과 같이 ADC 노출보다 크다. ADC의 축적은 거의 또는 전혀 나타나지 않았다. 이와 함께 고려시, 시노몰구스 몽키에서 칼리케아마이신 ADC의 PK는 항체 및/또는 ADC에 대한 예상 PK와 일치된다.
실시예
15
몽키
독성학 연구
연구 디자인:
시노몰구스 몽키(3/용량 수준)에 총 2 개 용량으로 3 주 떨어져 1.5 mg/kg 및 2.5 mg/kg 용량 수준으로 SC17ss1LD19.4를 투여하였다. 최종 투여 3주 후에 동물을 해부하였다. 종점은 임상 관찰, 체중, 혈액학, 임상 화학, 응고, 요검사, 장기 중량, 총 병리학. 및 조직병리학을 포함하였다.
결과:
1.5 mg/kg/용량의 SC17ss1LD19.4
연속 정맥내 투입에 의해 3 주마다 2 개 용량으로 투여된 1.5 mg/kg/용량의 SC17ss1LD19.4의 투여가 용인되었다. 시험 물품 관련 변화가 임상 화학 및 조직병리학에서 나타났다. 총 병리학, 장기 중량, 혈액학, 응고 및 요검사에서는 시험 물품 관련 변화가 나타나지 않았다.
임상 화학 변화는 일반적으로 용량-관계적이고, 이는 AST에서의 상승에 의해 특성화되었다. 조직병리학 변화는, 신장, 피부, 식도, 혀, 방광 및 흉선에서의 변화와 미약하게 불일치적으로 용량-관계적이었다.
2.5 mg/kg/용량의 SC17ss1LD19.4
연속 정맥내 투입에 의해 3 주마다 2 개 용량으로 투여된 2.5 mg/kg/용량의 SC17ss1LD19.4의 투여가 용인되었다. 시험 물품 관련 변화가 장기 중량, 혈액학, 임상 화학 및 조직병리학에서 나타났다. 총 병리학, 응고 및 요검사에서는 시험 물품 관련 변화가 나타나지 않았다.
장기 중량 변화는 감소된 흉선 및 증가된 고환 중량에 의해 특성화되었다. 혈액학 변화는 혈소판 및 망상적혈구 카운트의 감소에 의해 특성화되었다. 임상 화학 변화는 미약하게 용량-관계적이었고, AST, ALT, 총 단백질, 글로불린의 상승, 및 알부민의 감소에 의해 특성화되었다. 조직병리학 변화는, 신장, 상피(피부, 식도, 혀, 방광), 흉선, 및 고환에서의 변화와 미약하게 불일치적으로 용량-관계적이었다.
시험 화합물의 전체적 독성 프로파일은, 이들이 포유류에서 잘 용인되고, 치료적으로 유용할 수 있음을 나타낸다.
당업자는, 본 발명의 취지 또는 중심 속성으로부터 벗어나지 않으면서, 본 발명이 기타 다른 구체적 형태로 구현될 수 있음을 추가로 인지할 것이다. 본 발명의 상기 설명은 단지 그의 예시적 구현예를 개시하는 것이라는 점에서, 기타 다른 변형 또한 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려됨을 이해하여야 한다. 따라서, 본 발명은 본원에 상세히 기재된 특정 구현예로 제한되지 않는다. 그보다는, 본 발명의 범위 및 내용에 대한 지표로서, 첨부된 청구범위를 참조하여야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> ABBVIE STEMCENTRX, INC.
<120> CALICHEAMICIN CONSTRUCTS AND METHODS OF USE
<130> 48510-501001WO
<150> US 62/150,693
<151> 2015-04-21
<160> 5
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 2
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptides
<400> 3
Ala Leu Ala Leu
1
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptides
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> bAla
<400> 4
Ala Leu Ala Leu
1
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptides
<400> 5
Gly Phe Leu Gly
1
Claims (43)
- 하기 화학식 I을 갖는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염.
[화학식 I]
Ab-[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]z3
(여기서,
Ab는 표적화제이고;
W는 연결 기이고;
M은 절단가능한 모이어티이고;
L3 및 L4는 독립적으로 링커이고;
P는 디술피드 보호 기이고;
D는 칼리케아마이신 또는 그의 유사체이고;
z1 및 z2는 독립적으로 0 내지 10의 정수이고;
z3은 1 내지 10의 정수임) - 제1항에 있어서, D는 하기 화학식 Ia를 포함하는 것인 화합물.
[화학식 Ia]
(여기서,
R1은 수소, 할로겐, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)R1E, -OR1A, -NR1BR1C, -C(O)OR1A, -C(O)NR1BR1C, -SR1D, -SOn1R1B 또는 -SOv1NR1BR1C이고;
R1A, R1B, R1C, R1D 및 R1E는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3 , -CBr3, -CI3, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -N(O)2, -SH, -S(O)3H, -S(O)4H, -S(O)2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHS(O)2H, -NHC(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이고; 동일한 질소 원자에 결합된 R1B 및 R1C 치환체는 선택적으로 연결되어 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴을 형성할 수 있고;
n1은 0 내지 4의 정수이고;
v1은 1 또는 2임) - 제2항에 있어서, R1은 수소, 치환된 또는 비-치환된 알킬 또는 -C(O)R1E인 화합물.
- 제2항에 있어서, 상기 표적화제는 항체인 화합물.
- 제4항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체, CDR 그래프팅된 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체 또는 그의 면역반응성 단편인 화합물.
- 제4항에 있어서, 상기 항체는 항SEZ6 항체인 화합물.
- 제4항에 있어서, W는 항체 내에서 시스테인 잔기에 공유 부착된 것인 화합물.
- 제7항에 있어서, 상기 시스테인 잔기는 카바트 위치 C214에 있는 것인 화합물.
- 제4항에 있어서, W는 항체 내에서 리신 잔기에 공유 부착된 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, 하기 화학식 II를 갖는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염.
[화학식 II]
(여기서,
Ab는 항체이고;
L3은 결합, -O-, -S-, -NR3B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR3B-, -NR3BC(O)-, -NR3BC(O)NH-, -NHC(O)NR3B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이고;
L4는 결합, -O-, -S-, -NR4B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR4B-, -NR4BC(O)-, -NR4BC(O)NH-, -NHC(O)NR4B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이고;
R1은 수소, 할로겐, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)R1E, -OR1A, -NR1BR1C, -C(O)OR1A, -C(O)NR1BR1C, -SR1D, -SOn1R1B 또는 -SOv1NR1BR1C이고;
P는 -O-, -S-, -NR2B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR2B-, -NR2BC(O)-, -NR2BC(O)NH-, -NHC(O)NR2B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고;
M은 -O-, -S-, -NR5B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5B-, -NR5BC(O)-, -NR5BC(O)NH-, -NHC(O)NR5B-, -[NR5BC(R5E)(R5F)C(O)]n2-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌 또는 M1A-M1B-M1C이고;
W는 -O-, -S-, -NR6B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR6B-, -NR6BC(O)-, -NR6BC(O)NH-, -NHC(O)NR6B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌 또는 W1A-W1B-W1C이고;
M1A는 L3에 결합되고, M1C는 L4에 결합되고;
M1A는 결합, -O-, -S-, -NR5AB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5AB-, -NR5ABC(O)-, -NR5ABC(O)NH-, -NHC(O)NR5AB-, -[NR5ABCR5AER5AFC(O)]n3-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고;
M1B는 결합, -O-, -S-, -NR5BB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5BB-, -NR5BBC(O)-, -NR5BBC(O)NH-, -NHC(O)NR5BB-, -[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고;
M1C는 결합, -O-, -S-, -NR5CB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5CB-, -NR5CBC(O)-, -NR5CBC(O)NH-, -NHC(O)NR5CB-, -[NR5CBCR5CER5CFC(O)]n5-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고;
W1A는 Ab에 결합되고, W1C는 L3에 결합되고;
W1A는 결합, -O-, -S-, -NR6AB-, -C(O)-, C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR6AB-, -NR6ABC(O)-, -NR6ABC(O)NH-, -NHC(O)NR6AB-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고;
W1B는 결합, -O-, -S-, -NR6BB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR6BB-, -NR6BBC(O)-, -NR6BBC(O)NH-, -NHC(O)NR6BB-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고;
W1C는 결합, -O-, -S-, -NR6CB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR6CB-, -NR6CBC(O)-, -NR6CBC(O)NH-, -NHC(O)NR6CB-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고;
R1A, R1B, R1C, R1D, R1E, R2B, R3B, R4B, R5B, R5E, R5F, R5AB, R5AE, R5AF, R5BB, R5BE, R5BF, R5CB, R5CE, R5CF , R6B, R6AB, R6BB 및 R6CB는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -N(O)2, -SH, -S(O)3H, -S(O)4H, -S(O)2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHS(O)2H, -NHC(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이고; 동일한 질소 원자에 결합된 R1B 및 R1C 치환체는 선택적으로 연결되어 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴을 형성할 수 있고;
n1은 0 내지 4의 정수이고;
v1은 1 또는 2이고;
n2, n3, n4 및 n5는 독립적으로 1 내지 10의 정수이고;
z1 및 z2는 독립적으로 0 내지 10의 정수이고;
z3은 1 내지 10의 정수임) - 제10항에 있어서, M은 M1A-M1B-M1C이고, 여기서 M1A는 L3에 결합되고, M1C는 L4에 결합되는 것인 화합물.
- 제10항에 있어서, W는 W1A-W1B-W1C이고, 여기서 W1A는 Ab에 결합되고, W1C는 L3에 결합되는 것인 화합물.
- 제10항에 있어서, P는 치환된 또는 비-치환된 알킬인 화합물.
- 제10항에 있어서, z3은 1 또는 2인 화합물.
- 제10항에 있어서, L3은 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌인 화합물.
- 제10항에 있어서, L4는 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌인 화합물.
- 제10항에 있어서, R1은 수소 또는 -C(O)R1E인 화합물.
- 제10항에 있어서, W는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌인 화합물.
- 제18항에 있어서, W는 5-원 또는 6-원 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌인 화합물.
- 제19항에 있어서, W는 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
.
- 제10항에 있어서, M은 펩티드를 포함하는 것인 화합물.
- 제10항에 있어서,
M1A는 결합, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌 또는 -[NR5ABC(R5AE)(R5AF)C(O)]n3이고;
M1B는 결합, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌 또는 -[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-이고;
M1C는 결합 또는 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌인 화합물. - 제10항에 있어서, M1A 및 M1B는 독립적으로 아미노산인 화합물.
- 제10항에 있어서, M1A 또는 M1B 중 적어도 하나는 발린(val)인 화합물.
- 제10항에 있어서, M1A 또는 M1B 중 적어도 하나는 알라닌(ala)인 화합물.
- 제10항에 있어서, M1A 또는 M1B 중 적어도 하나는 시트룰린(cit)인 화합물.
- 제10항에 있어서, M1A, M1B 또는 M1C 중 적어도 하나는 치환된 아릴렌인 화합물.
- 제10항에 있어서, M1A, M1B 또는 M1C 중 적어도 하나는 하기 화학식 III을 갖는 것인 화합물.
[화학식 III]
(여기서,
Y는 -NH-, -O-, -C(O)NH- 또는 -C(O)O-이고;
n6은 0 내지 3의 정수임) - 제10항에 있어서, -[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]는 하기와 같은 것인 화합물:
- 제10항에 있어서, -[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]는 하기 화학식을 갖는 것인 화합물:
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
- 대상체에게 치료 유효량의 제31항의 제약 조성물 또는 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서의 암 치료 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 결장직장암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암 및 위암으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 대상체에게 추가의 화학요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 세포를 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 칼리케아마이신 세포독소를 세포로 전달하는 방법.
- 칼리케아마이신 구성체를 항체의 시스테인 또는 리신과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 칼리케아마이신 구성체는 화학식 W1-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D(여기서, W1은 리신 측쇄 또는 시스테인 측쇄와 반응성인 관능기이고, M은 절단가능한 모이어티이고, L3 및 L4는 독립적으로 링커이고, P는 디술피드 보호 기이고, D는 칼리케아마이신 또는 그의 유사체임)를 갖는 것인, 항체 약물 컨쥬게이트의 제조 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 칼리케아마이신 구성체는 항체의 특이적 시스테인과 접촉되는 것인 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 특이적 시스테인은 고유적 디술피드 브릿지로부터 유래되는 것인 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 항체는 조작된 항체이고, 상기 특이적 시스테인은 고유적 디술피드 브릿지로부터 유래되지 않은 것인 방법.
- 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특이적 시스테인은 접촉 전에 선택적으로 환원되는 것인 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 항체를 선택적으로 환원시키는 단계는, 항체를 안정화제와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 하기 화학식 IV를 갖는 화합물.
[화학식 IV]
(L3은 결합, -O-, -S-, -NR3B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR3B-, -NR3BC(O)-, -NR3BC(O)NH-, -NHC(O)NR3B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이고;
L4는 결합, -O-, -S-, -NR4B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR4B-, -NR4BC(O)-, -NR4BC(O)NH-, -NHC(O)NR4B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌이고;
R1은 수소, 할로겐, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)R1E, -OR1A, -NR1BR1C, -C(O)OR1A, -C(O)NR1BR1C, -SR1D, -SOn1R1B 또는 -SOv1NR1BR1C이고;
P는 -O-, -S-, -NR2B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR2B-, -NR2BC(O)-, -NR2BC(O)NH-, -NHC(O)NR2B-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고;
M은 -O-, -S-, -NR5B-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5B-, -NR5BC(O)-, -NR5BC(O)NH-, -NHC(O)NR5B-, -[NR5BC(R5E)(R5F)C(O)]n2-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌 또는 M1A-M1B-M1C이고;
W1은 수소, 할로겐, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴, -N3, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -CN, -C(O)R7E, -OR7A, -NR7BR7C, -C(O)OR7A, -C(O)NR7BR7C, -NO2, -SR7D, -SOn7R7B, -SOv7NR7BR7C, -NHNR7BR7C, -ONR7BR7C, -NHC(O)NHNR7BR7C이고;
M1A는 L3에 결합되고, M1C는 L4에 결합되고;
M1A는 결합, -O-, -S-, -NR5AB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5AB-, -NR5ABC(O)-, -NR5ABC(O)NH-, -NHC(O)NR5AB-, -[NR5ABCR5AER5AFC(O)]n3-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고;
M1B는 결합, -O-, -S-, -NR5BB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5BB-, -NR5BBC(O)-, -NR5BBC(O)NH-, -NHC(O)NR5BB-, -[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고;
M1C는 결합, -O-, -S-, -NR5CB-, -C(O)-, -C(O)O-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)NR5CB-, -NR5CBC(O)-, -NR5CBC(O)NH-, -NHC(O)NR5CB-, -[NR5CBCR5CER5CFC(O)]n5-, 치환된 또는 비-치환된 알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비-치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴렌이고;
R1A, R1B, R1C, R1D, R1E, R2B, R3B, R4B, R5B, R5E, R5F, R5AB, R5AE, R5AF, R5BB, R5BE, R5BF, R5CB, R5CE, R5CF, R6B, R7A, R7B, R7C, R7D, R7E는 독립적으로 수소, 할로겐, -CF3, -CCl3, -CBr3, -CI3, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -N(O)2, -SH, -S(O)3H, -S(O)4H, -S(O)2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHS(O)2H, -NHC(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCCl3, -OCBr3, -OCI3, -OCHF2, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, 치환된 또는 비-치환된 알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비-치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비-치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴이고; 동일한 질소 원자에 결합된 R1B 및 R1C 치환체는 선택적으로 연결되어 치환된 또는 비-치환된 헤테로시클로알킬 또는 치환된 또는 비-치환된 헤테로아릴을 형성할 수 있고;
n1 및 n7은 독립적으로 0 내지 4의 정수이고;
v1 및 v7은 독립적으로 1 또는 2이고;
n2, n3, n4 및 n5는 독립적으로 1 내지 10의 정수임) - 제42항에 있어서, 상기 화합물은
인 화합물.
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