BR112021011900A2

BR112021011900A2 - Anticorpos para pmel17 e conjugados dos mesmos

Info

Publication number: BR112021011900A2
Application number: BR112021011900-0A
Authority: BR
Inventors: Matthew Burger; Joseph Anthony D'Alessio; Tony Fleming; Vivek Rauniyar; Eusebio Manchado ROBLES
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2021-09-08
Also published as: CL2021001607A1; UY38520A; CA3234463A1; AU2019409132A1; WO2020128612A3; CN113195541A; SG11202106629PA; JP2022515760A; EP3898697A2; CR20210324A; US11779649B2; CA3123996A1; IL284027A; KR20210107731A; WO2020128612A2; MX2021007593A; US20200197528A1; PE20211296A1; ECSP21044421A; JOP20210159A1

Abstract

anticorpos para pmel17 e conjugados dos mesmos. a presente invenção refere-se de anticorpos anti-pmel17, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, e conjugados de anti-corpo e fármaco dos ditos anticorpos ou fragmentos de ligação ao an-tígeno conjugados a um inibidor de gnaq/gna11. a invenção tam-bém se refere a métodos de tratamento ou prevenção de câncer que usam os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e conjugados de anticorpo e fármaco. também são descritos no presente documento métodos de produção dos anticorpos, fragmentos de ligação ao antí-geno e conjugados de anticorpo e fármaco, e métodos de uso dos an-ticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno como reagentes de diag-nóstico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS PARA PMEL17 E CONJUGADOS DOS MESMOS". Listagem de Sequências

[0001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi enviada eletronicamente em formato ASCII e está incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 6 de dezembro de 2019, é denominada PATO58359-WO-PCT SL.txt e tem 285253 bytes de tamanho. Campo da Invenção

[0002] A presente invenção se refere, de modo geral, a anticorpos anti-PMEL 17, ou fragmentos dos mesmos, conjugados dos mesmos, incluindo conjugados de inibidor de GNAQ/GNA11 dos mesmos, e os seus usos para o tratamento ou prevenção de câncer. Antecedentes da Invenção

[0003] PMEL17 (também chamado de gp100 e SILV) é uma prote- ína transmembranar Tipo | de passagem única produzida por melanó- citos e envolvida na síntese de melanina. Ao longo de sua maturação, PMEL17 é temporariamente expresso na superfície celular antes de ser trafegado para melanossomas, em que PMEL17 é degradado em vários domínios que se multimerizam para formar folhas fibrilares. Tal padrão, então, serve como um suporte para captura de melanina. À expressão de PMEL17 de melanossomas é regulada por MITF, um oncogene de linhagem, e foi considerada regulada positivamente em uma variedade de melanomas subcutâneos e uveais primários e me- tastáticos. A expressão temporária de superfície celular e internaliza- ção subsequente de PMEL17 o torna um alvo adequado para o de- senvolvimento de conjugado de anticorpo e fármaco (ADC) para o tra- tamento de melanoma. PMEL17 e Câncer

[0004] Ao longo de sua maturação, o PMEL17 é fortemente pro-

cessado por convertases pró-proteínas. A proteína é clivada entre V467/K468 formando dois subdomínios, Ma no N-term e MB no C- term, supostamente mantidos através de uma ponte dissulfeto. Após deixar o aparato de golgi, algumas moléculas PMEL17 são temporari- amente expressas na superfície da célula. A maior parte do PMEL1I7 é, então, redirecionada para um melanócito para maturação adicional, enquanto parte do PMEL17 parece ter sido perdida. Após clivagens en- zimáticas adicionais, PMEL17 é degradado em vários domínios que se reorganizam e formam folhas fibrilares em que a melanina se polimeriza (Valencia JC, et al. Sorting of Pmel17 to melanosomes through the plas- ma membrane by AP1 and AP?2: evidence for the polarized nature of melanocytes. J Cell Sci. 2006 Mar 15;119(Pt 6): 1080-91; Theos AC, et al. The Silver locus product Pmel17/9gp100/Silv/ME20: controversial in name and in function. Pigment Cell Res. 2005 Oct;18(5):322-36).

[0005] PMEL17 constitui um alvo terapêutico potencial para o tra- tamento de melanoma. PMEL17 é um alvo transcricional direto de MITF, um oncogene de linhagem em melanoma, como observado por estudos de expressão de mMRNA (Du J, et al. MMANA/MART1 and SILV/PMEL17/GP100 are transcriptionally regulated by MITF in mela- nocytes and melanoma. Am J Pathol. julho de 2003;163(1):333-43). À expressão do PMEL17 é restrita à linhagem de melanócitos, que inclui melanócitos da pele, melanócitos do bulbo capilar, epitélio pigmentar da retina, epitélio ciliar pigmentado e possivelmente os melanócitos co- roides na retina. PMEL17 é também altamente expresso em tumores da linhagem de melanócitos, como melanoma subcutâneo e uveal. Em con- traste, estudos de MRNA demonstraram que a expressão de PMEL17 é limitada em outros tipos de tumor e tecidos normais (Wagner SN, Wag- ner C, Schultewolter T, Goos M. Analysis of Pmel17/9p100 expression in primary human tissue specimens: implications for melanoma immuno- and gene-therapy. Cancer Immunol Immunother. junho de 1997;44(4):

239-47). Além disso, os compostos ADC e IMmMTAC que alvejam PMEL 17 foram descritos anteriormente para induzir especificamente o extermínio de melanoma in vivo e in vitro e são avaliados atualmente em ensaios clínicos (Chen Y, et al. The melanosomal protein PMEL17 as a target for antibody drug conjugate therapy in melanoma. J Biol Chem. 13 de julho de 2012;287(29):24082-91. doi:10.1074/jbc.M112.361485. Epub 21 de maio de 2012). GNAQ/GNA11 e Câncer

[0006] Os genes GNAQ e GNA11 codificam a subunidade alfa das proteínas G heterotriméricas Gq/11, que são quase ubiquamente ex- pressas e atuam como interruptores moleculares binários que circulam entre os estados ligados a trifosfato de guanosina (GTP) ativos e os estados ligados a difosfato de guanosina (GDP) inativos. Gaq ligado a GTP e Ga11 ativam isoformas B de fosfolipase C, que ativa uma série de vias de transdução de sinal através da geração de segundos men- sageiros IP3 e DAG. A terminação da sinalização é ativada pela hidró- lise de GTP mediada pela atividade GTPase intrínseca dessas proteí- nas Ga. Gq e G11 descreveram estar envolvidos em uma vasta gama de funções fisiológicas, incluindo ativação de plaquetas, hipertrofia mi- ocárdica e tônus do músculo liso.

[0007] Ocorrem mutações oncogênicas em GNAQ ou GNA11 em até 90% de casos de melanoma uveal (UM) e em —-2-3% de melanoma cutâneo. Aproximadamente 95% dessas mutações afetam os códons 209 (Q209) no domínio semelhante a Ras, resultando na perda total ou parcial da atividade da GTPase e, assim, retendo GNAQ/11 em seu estado ativo. 0209 GNAQ/11 são oncogenes de ação dominante que transformam melanócitos, disparando a ativação de várias vias, inclu- indo PKC/MAPK, Rho/Rac, B-catenina e YAP. Embora a via PKC / MAPK tenha sido mostrada como um fator contribuinte para a oncogê- nese mediada por GNAQ, várias linhas de evidência sugerem que

GNAQ/11 mutante governa vias adicionais que também podem exer- cer uma função na tumorigênese UM (ou seja, YAP, B-catenina) Curio- samente, outra mutação de ativação somática em GNAQ (R183Q) foi recentemente descrita como sendo a causa da síndrome de Sturge- Weber (SWS), um distúrbio neurocutâneo caracterizado por malforma- ção capilar (manchas em vinho do porto) e malformações vasculares coroidais e leptomeníngeas. Dessa forma, GNAQ e GNA11 constituem potenciais alvos terapêuticos para o tratamento de melanoma uveal e cutâneo. Conjugados de Anticorpo e Fármaco

[0008] Conjugados de anticorpo e fármaco ("ADCs") vêm sendo usados para a entrega local de agentes citotóxicos no tratamento de câncer (consultar, por exemplo, Lambert, Curr. Opinion In Pharmaco- logy 5:543-549, 2005). Os ADCs permitem a entrega alvejada da por- ção química de fármaco com a qual pode ser alcançada eficácia má- xima com toxicidade mínima. Os ADCs incluem um anticorpo selecio- nado quanto à capacidade de se ligar a uma célula alvejada para in- tervenção terapêutica, ligada a um fármaco selecionado quanto à sua atividade citostática ou citotóxica. A ligação do anticorpo à célula alve- jada entrega assim o fármaco ao local em que seu efeito terapêutico é necessário.

[0009] Muitos anticorpos que reconhecem e se ligam seletivamen- te a células alvejadas, por exemplo, células cancerígenas, foram des- critas para uso em ADCs. Apesar do extenso trabalho sobre ADCSs, a ligação de anticorpos a um alvo específico de interesse não é suficien- te para prever o sucesso em aplicações de ADC. Exemplos de fatores que podem afetar a eficácia terapêutica de ADCs (além de caracterís- ticas intrínsecas ao alvo) incluem vários aspectos que necessitam de ajuste fino personalizado, como a afinidade de anticorpo ideal como um equilíbrio entre disposição mediada pelo alvo (TMDD) e exposição promotora de eficácia, avaliação de funções mediadas por Fc (citotoxi- cidade mediada por células dependentes de anticorpo, ADCC), méto- do de conjugação (sítio-específico ou não), a razão do fármaco/molé- culas de carga útil que se conjugam a cada anticorpo ("DAR” ou "razão entre fármaco e anticorpo”), a clivabilidade ou estabilidade do ligante, estabilidade do ADC e a tendência de agregação de um ADC.

[0010] Existe uma necessidade por anticorpos, métodos de fixação e cargas úteis citotóxicas com propriedades aprimoradas para uso como composições e métodos terapêuticos eficazes de ADC. Sumário da invenção

[0011] Em uma modalidade, o presente pedido descreve um anti- corpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a PMEL17 que compreende: a. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada (Região Determinante de Complementa- ridade 1) da SEQ ID NO:1, 4, 5 ou 7, uma CDR2 de cadeia pesada (Região Determinante de Complementaridade 2) da SEQ ID NO:2, 6 ou 8, e uma CDR3 de cadeia pesada (Região Determinante de Com- plementaridade 3) da SEQ ID NO:3 ou 9; e uma região variável de ca- deia leve que compreende uma CDR1 de cadeia leve (Região Deter- minante de Complementaridade 1) da SEQ ID NO:14, 17 ou 20, uma CDR?2 de cadeia leve (Região Determinante de Complementaridade 2) da SEQ ID NO:15 ou 18 e uma CDR3 de cadeia leve (Região Deter- minante de Complementaridade 3) da SEQ ID NO:16 ou 19; b. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:33, 36, 37 ou 39, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:34, 38 ou 40; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:35 ou 41; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:46, 49 ou 52; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 ou 50; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:48 ou 51;

c. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:5, 7, 57 ou 60, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:58, 61 ou 62; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:59 ou 63; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:68, 71 ou 74; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:69 ou 72; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:70 ou 73;

d. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:79, 82, 83 ou 85, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:80, 84 ou 86; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:81 ou 87; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:92, 95 ou 98; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:93 ou 96; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:94 ou 97;

e. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:103, 106, 107 ou 109, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:104, 108 ou 110; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:105 ou 111; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, 52 ou 116; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 ou 50; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:117 ou 118;

f.. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:123, 126, 127 ou 129, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:124, 128 ou 130; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:125 ou 131; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:136, 139 ou 142; uma CDR?2 de cadeia le- ve da SEQ ID NO:137 ou 140; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:138 ou 141;

g. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:123, 126, 127 ou 129, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:124, 128 ou 130; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:147 ou 148; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:153, 156 ou 158; uma CDR?2 de cadeia le- ve da SEQ ID NO:50 ou 154; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:155 ou 157;

h. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:103, 106, 107 ou 109, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:104, 108 ou 110; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:163 ou 164; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, 52 ou 116; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 ou 50; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:169 ou 170;

i. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:175, 178, 179 ou 181, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:176, 180 ou 182; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:177 ou 183; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, 52 ou 116; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 ou 50; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:188 ou 189;

j. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 103, 106, 107 ou 109, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 104, 108 ou 110; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:194 ou 195; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 49, 52 ou 116; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 47 ou 50; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:200 ou 201;

k. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:206, 209, 210 ou 212, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:207, 211 ou 213; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:208 ou 214; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:153, 156 ou 158; uma CDR?2 de cadeia le- ve da SEQ ID NO:50 ou 154; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID

NO:219 ou 220;

|. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 206, 209, 210 ou 212, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 207, 211 ou 213; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:225 ou 226; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:136, 139 ou 142; uma CDR?2 de cadeia le- ve da SEQ ID NO:137 ou 140; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:231 ou 232;

m. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 206, 209, 210 ou 212, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207, 211 ou 213 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:237 ou 238; e uma re- gião variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:243, 245 ou 247, uma LCDR2 da SEQ ID NO:47 ou 50 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:244 ou 246;

n. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 206, 209, 210 ou 212, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207, 211 ou 213 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:252 ou 253; e uma re- gião variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:153, 156 ou 158, uma LCDR2 da SEQ ID NO:50 ou 154 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:258 ou 259;

o. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:1, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:2, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:3, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:14, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:15 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:16;

p. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 4, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:2, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:3, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:14,

uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:15 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:16;

q. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:5, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:6, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:3, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:17, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 18, e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 19;

r. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:7, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:8, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:9, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:20, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:18 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:16;

s. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:33, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:34, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:35, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:46, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:48;

t. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:36, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:34, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:35, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:46, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:48;

u. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:37, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:38, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:35, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:51;

v. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 39, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:40, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:41, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:52,

uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:48;

w. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:57, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:58, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:59, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:68, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:69 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:70;

x. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:60, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:58, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:59, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:68, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:69 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:70;

y. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:5, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:61, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:59, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:71, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:72 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:73;

z. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:7, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:62, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:63, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:74, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:72 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:70;

aa. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:79, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:80, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:81, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:92, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:93 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:94;

bb. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:82, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:80, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:81, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:92,

uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:93 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:94;

cc. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:83, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:84, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:81, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:95, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:96 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 97;

dd. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 85, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:86, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:87, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:98, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:96 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:94;

ee. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:103, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:105, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 116; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:117;

ff.. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:106, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:105, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de ca- deia leve da SEQ ID NO:117;

gg. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:107, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:108, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:105, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:118;

hh. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:109, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:110, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:111, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID

NO:52, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:117;

ii. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:123, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:124, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:125, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:136, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:137 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:138;

jj. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:126, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:124, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:125, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:136, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:137 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:138;

kk. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:127, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:128, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:125, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:139, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:140 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 141;

ll. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 129, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:130, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:131, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:142, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:140 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:138;

mm. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:123, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:124, uma CDR3 de ca- deia pesada da SEQ ID NO:147, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:153, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:154 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:155;

nn. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:126, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:124, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:147, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID

NO:153, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 154 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:155;

oo. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:127, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:128, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:147, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:156, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:157;

pp. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 129, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:130, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:148, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:158, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:155;

qq. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:103, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:163, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de ca- deia leve da SEQ ID NO:169;

rr. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:106, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:163, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:169;

ss. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:107, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:108, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:163, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:170;

tt. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 109, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:110, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:164, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID

NO:52, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:169;

uu. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:175, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:176, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:177, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:188;

vv. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:178, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:176, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:177, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:188;

WWW. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:179, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:180, uma CDR3 de ca- deia pesada da SEQ ID NO:177, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:189;

xx. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 181, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:182; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:183, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:52, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:188;

yy. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 103, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:194, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:200;

zz. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 106, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:194, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:

116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:200;

aaa. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 107, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 108, uma CDR3 de ca- deia pesada da SEQ ID NO:194, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 49, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 50, e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 201;

bbb. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 109, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 110, uma CDR3 de ca- deia pesada da SEQ ID NO:195, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 52, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:200;

cce. “uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:206, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:207, uma CDR3 de ca- deia pesada da SEQ ID NO:208, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:153, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:154 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:219;

ddd. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:209, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:207, uma CDR3 de ca- deia pesada da SEQ ID NO:208, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:153, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 154 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:219;

eee. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:210, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:211, uma CDR3 de ca- deia pesada da SEQ ID NO:208, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:156, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:220;

fff. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 212, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:213, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:214, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID

NO:158, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:219;

ggg. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 206, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 207, uma CDR3 de ca- deia pesada da SEQ ID NO:225, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:136, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:137 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO0:231;

hhh. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 209, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 207, uma CDR3 de ca- deia pesada da SEQ ID NO:225, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:136, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:137 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO0:231;

iii. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 210, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 211, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:225, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:139, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:140 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 232;

jjj.- uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 212, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 213, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 226, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:142; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 140; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO0:231;

kkk. “uma região variável de cadeia pesada que compre- ende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 206, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:237, e uma região variável de ca- deia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:243, uma LCDR?2 da SEQ ID NO:47 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:244;

Ill. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 209, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:237, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:243, uma LCDR2 da SEQ ID NO:47 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:244; mmm. uma região variável de cadeia pesada que compre- ende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 210, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 211 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:237, e uma região variável de ca- deia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:245, uma LCDR?2 da SEQ ID NO:50 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:246; nnn. uma região variável de cadeia pesada que compre- ende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 212, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 213 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:238; e uma região variável de ca- deia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:247, uma LCDR?2 da SEQ ID NO: 50 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:244;

000. uma região variável de cadeia pesada que compre- ende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 206, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:252, e uma região variável de ca- deia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:153, uma LCDR?2 da SEQ ID NO: 154 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:258; ppp. uma região variável de cadeia pesada que compre- ende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 209, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:252, e uma região variável de ca- deia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:153, uma LCDR?2 da SEQ ID NO:154 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:258; qgq. uma região variável de cadeia pesada que compre- ende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 210, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 211 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:252, e uma região variável de ca- deia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:156, uma LCDR?2 da SEQ ID NO:50 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:259; ou rrr. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 212, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 213 e uma HCDR3 da SEQ ID NO: 253; e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:158, uma LCDR2 da SEQ ID NO:50 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:258.

[0012] Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a PMEL17 do presente pedido pode também com- preender: a. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:21; b. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:25; c. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:29; d. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:53; e. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:64 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:75; f.. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:88 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:99; g. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com-

preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:112 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:119;

h.

Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:132 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:143;

i.

Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:149 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:159;

j.

Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:165 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:171;

k.

Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:184 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:190;

|. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:196 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:202;

m.

Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:215 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:221;

n.

Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:227 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá-

cidos da SEQ ID NO:233; o. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:239 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:248; ou p. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:254 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:260.

[0013] Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a PMEL17 compreende: a. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; b. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27; c. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31; d. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:44 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:55; e. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:66 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:77; f.. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:90 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:101; g. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:114 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:121; h. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:134 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:145; i. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:151 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:161; j: Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:167 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:173; k. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:186 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:192; |. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:198 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:204; m. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:217 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:223; n. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:229 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:235; o. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:241 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:250; ou p. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:256 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:262.

[0014] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mes-

mo, como descrito no presente documento, pode compreender uma ou mais substituições de cisteína. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma ou mais substituições de cisteína selecionadas dentre S152C, S375C, ou ambas S152C e S375C da cadeia pesada do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que a posição é numerada de acordo com o sistema EU. Um anticorpo como descrito no presente documento pode ser um anticorpo monoclonal.

[0015] Em um aspecto, o Conjugado de Anticorpo e Fármaco da invenção é um conjugado da Fórmula (C): Ab-(LA-(D)N)y (C) em que: D é um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um inibidor de GNAQ e GNA11; Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; La é um ligante; né 1,2,3ou4,e yé1,2,30ou4, em que a porção química de Ligante-Fármaco -(La-(D)n) é covalente- mente fixada ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0016] Em outro aspecto dos Conjugados de Anticorpo e Fármaco da Fórmula (C), La é um ligante clivável que compreende um ou mais componentes ligantes selecionados dentre um espaçador autoimolati- vo, um grupo fosfato, um grupo carbonato e um ligante peptídico biva- lente.

[0017] Em outro aspecto, o Conjugado de Anticorpo e Fármaco da Fórmula (C) é um conjugado da Fórmula (C-1):

fee y (1) em que: D é um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um ini- bidor de GNAQ e GNA11; Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; X1 é um grupo de acoplamento bivalente; X2 é um espaçador autoimolativo; 1 a ão ax Pã Y1é OH, OH , OH OH é O, oo, Sem * ok ou o , em que o * de Y1 indica o ponto de fixação a X2 e 0** de Y1 indica o ponto de fixação a D; L, é um ligante peptídico bivalente; L2 é uma ligação ou um ligante, e yé1,2,3ou4.

[0018] O presente pedido descreve também composições farma- cêuticas que compreendem os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, descritos no presente documento e um transportador farmaceuticamente aceitável. O presente pedido descre- ve também composições farmacêuticas que compreendem os conju- gados de anticorpo e fármaco como descrito no presente documento e um transportador farmaceuticamente aceitável.

[0019] O presente pedido descreve também métodos de tratamen- to ou prevenção de câncer em um paciente com necessidade dos mesmos, que compreende administrar ao dito paciente os conjugados de anticorpo e fármaco ou as composições farmacêuticas descritas no presente documento, em que o câncer expressa PMEL17, contém uma mutação do gene GNAQ ou GNAT11, ou o câncer expressa PMEL17 e contém uma mutação de GNAQ, GNA11, ou ambos.

[0020] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento ou prevenção de câncer, o conjugado de anticorpo e fármaco ou compo- sição farmacêutica são administrados ao paciente em combinação com um ou mais compostos terapêuticos adicionais. Em uma modali- dade, o um ou mais compostos terapêuticos adicionais são seleciona- dos dentre um padrão de cuidado quimioterápico, um inibidor de MDM?2, inibidor de MRC?2, inibidor de PKC, inibidor de MAPK, uma mo- lécula coestimuladora ou um inibidor de ponto de verificação. Em uma modalidade, a molécula coestimuladora é selecionada dentre um ago- nista de ligante OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD30, CDA40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7- H3, STING, ou CD83. Em outra modalidade, o inibidor de ponto de ve- rificação é selecionado dentre um inibidor de PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLAA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e/ou TGFR beta.

[0021] O presente pedido descreve também os conjugados de an- ticorpo e fármaco ou as composições farmacêuticas no presente do- cumento descritas, para uso como um medicamento. Em uma modali- dade, os conjugados de anticorpo e fármaco ou as composições far- macêuticas descritas no presente documento se destinam ao uso no tratamento ou prevenção de um câncer que expressa PMEL17 ou um câncer que contém uma mutação do gene GNAQ ou GNA11 em um paciente com necessidade do mesmo.

[0022] Em uma modalidade, o pedido descreve o uso dos anticor- pos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, os conjuga- dos de anticorpo e fármaco ou a composição farmacêutica como des-

crito no presente documento, para tratar ou prevenir um câncer que expressa PMEL17 em um paciente com necessidade dos mesmos.

[0023] Em uma modalidade, o pedido descreve o uso dos anticor- pos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, os conjuga- dos de anticorpo e fármaco ou as composições farmacêuticas, como descrito no presente documento, para tratar ou prevenir um câncer que expressa PMEL1I7 em um paciente com necessidade dos mes- mos. Em uma modalidade, o pedido descreve o uso dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, os conjugados de anticorpo e fármaco ou as composições farmacêuticas, como descrito no presente documento, na fabricação de um medicamento.

[0024] Em uma modalidade, o câncer expressa PMEL17 ou con- tém uma mutação do gene GNAQ ou GNA11. Em uma modalidade, o câncer é melanoma uveal, melanoma subcutâneo, carcinoma hepato- celular ou um câncer metastático dos mesmos.

[0025] Esse pedido descreve também ácidos nucleicos que codifi- cam os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, como des- crito no presente documento. Em uma modalidade, o ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 13, 24, 28, 32, 45, 56, 67, 78, 91, 102, 115, 122, 135, 146, 152, 162, 168, 174, 187, 193, 199, 205, 218, 224, 230, 236, 242, 251, 257, ou 26. Esse pedido descreve também vetores que compreendem os ácidos nuclei- cos e células hospedeiras que compreendem os vetores ou ácidos nu- cleicos. Esse pedido descreve também um processo para produzir os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos no presente documento que compreendem o cultivo da célula hospedeira e recupe- ração do anticorpo a partir da cultura celular. Em uma modalidade, o processo de recuperação do anticorpo a partir da cultura celular com- preende as etapas de: a) remover células e filtrar a cultura;

b) purificar a cultura por cromatografia de afinidade; c) inativar quaisquer vírus na cultura ajustando o pH para 3,4-3,6, então reajustando o pH para 5,8-6,2 e filtrando a cultura; d) purificar a cultura por meio de cromatografia de troca ca- tiônica e realizar redução da cultura dentro da coluna; e) realizar cromatografia de troca aniônica na cultura; f) remover vírus por nanofiltração; g) filtrar a cultura contendo o anticorpo; e h) obter anticorpo purificado.

[0026] O presente pedido descreve também um processo para a produção de um conjugado de anticorpo anti-PMEL17 e fármaco que compreende: (a) pré-formar uma porção química de ligante-fármaco da seguinte Fórmula (B): Rº-Lg-(D)n (B) em que: D é um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um ini- bidor de GNAQ e GNA11; Rô é um grupo reativo; Lg é um ligante clivável ou não clivável, e né 1,2,3oud4; (b) conjugar a dita porção química de ligante-fármaco ao anticorpo recuperado da cultura celular usando o processo para pro- duzir um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento para produzir um conjugado de anticorpo e fár- maco; e (c) purificar o conjugado de anticorpo e fármaco.

[0027] Esse pedido descreve também um reagente de diagnóstico que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como descrito no presente documento. Em algumas modali-

dades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é marcado com um radiomarcador, um fluoróforo, um cromóforo, um agente de imageamento ou um íon metálico. Breve Descrição dos Desenhos

[0028] As Figuras 1A-1B mostram dados exemplificativos sobre a atividade anti-UM in vitro de Composto (A1) e Composto (A2) inibido- res de GNAQ/11.

[0029] A Figura 2 mostra dados exemplificativos sobre a atividade de Composto (A1) e Composto (A2) Inibidores de GNAQ/11 para indu- zir apoptose em células de melanoma uveal.

[0030] As Figuras 3A-3C mostram dados exemplificativos sobre a Inibição de GNAQ/11 pelo Composto (A1) e Composto (A2). O Com- posto (A1) e o Composto (A2) reduziram os níveis de IP1 (Figura 3A) e a proliferação relativa (Figura 3B) em células 92.1. Immunoblots de células 92.1 tratadas com o Composto (A1) e o Composto (A2) mostra- ram sinalização da ERK reduzida (Figura 3C).

[0031] As Figuras 4A-4D mostram dados exemplificativos sobre a estabilidade metabólica e as propriedades PK do Composto (A1). Tan- to o desaparecimento do Composto (A1) (Figura 4A) como o apareci- mento da forma de anel aberto do Composto (A8) (Figura 4B) foram monitorados durante 24h. Com exceção do rato, a adição da % de Composto (A1) restante e a % de Composto (A8) formado mostra es- tequiometria ao longo de 24h (Figura 4C). A PK do Composto (A1) após a dosagem intravenosa em camundongo é caracterizada por uma depuração muita alta e volume moderado a alto de distribuição (Figura 4D).

[0032] As Figuras 5A-5D mostram dados exemplificativos sobre a estabilidade metabólica e as propriedades PK do Composto (A1) e do Composto (A2). A estabilidade in vitro do Composto (A2) foi testada no plasma e sangue de espécies diferentes (Figura 5A). O Composto (A2)

mostrou estabilidade química satisfatória em três sistemas diferentes (Figura 5B). A PK do Composto (A2) em camundongos balb/c fêmeas mostrou alta depuração e uma meia-vida de eliminação curta (Figura 5C). O Composto (A1) e o Composto (A2) eram estáveis em tampão a pH 5,6 e em lisossomas ao longo de 4h (Figura 5D).

[0033] As Figuras 6A-6B mostram dados exemplificativos sobre a atividade de melanoma anti-uveal in vitro de ADCs anti-PMEL17-(B1) Dados apresentados como média de 3 réplicas independentes e relati- vos às células tratadas com PBS (controle).

[0034] A Figura 7 mostra dados exemplificativos sobre ADCs anti- PMEL17-(B1) que induzem apoptose em células de melanoma uveal. Dados apresentados como média de 3 réplicas independentes.

[0035] As Figuras 8A-8B mostram dados exemplificativos sobre a atividade de melanoma anti-uveal in vitro de ADCs anti-PMEL17-(B2) e mAbs anti-PMEL17. Dados apresentados como média de 3 réplicas independentes e relativos às células tratadas com PBS (controle).

[0036] A Figura 9 mostra dados exemplificativos sobre a Inibição de GNAQ/11 por ADCs anti-PMEL17-(B1) e antic-PMEL17-(B2) em cé- lulas de melanoma uveal. Os níveis de IP1 (nM) são apresentados como média de 3 réplicas independentes.

[0037] As Figuras 10A-10D mostram dados exemplificativos so- bre a atividade de ligação de anticorpos anti-PMEL17 a plaquetas in- tactas e células de melanoma uveal.

[0038] As Figuras 11A-11C mostram dados exemplificativos so- bre o impacto do Composto (A1) e ADCs anti-PMEL17-(B1) sobre a agregação de plaquetas humanas.

[0039] As Figuras 12A-12E mostram dados exemplificativos sobre a atividade de antitumoral in vitro de ADCs anti-PMEL17-(B1) G1-(B1) inibiu o crescimento de tumor de maneira dose-dependente (Figura 12A). Os valores são média + DPM; tamanho da amostra, (n=5-12 ca-

mundongos por grupo). Os volumesO volume de tumor inicial no dia O foi de aproximadamente 200-250 mm?. Nenhuma perda de peso cor- poral foi observada por até 14 dias após o tratamento (Figura 12B). Os valores são média + DPM; tamanho da amostra, (n=4 camundongos por grupo). O tratamento com G1-(B1) resultou na inibição da sinaliza- ção de GNAQ e na inibição da proliferação de células tumorais, como indicado por níveis reduzidos de pERK e Ki67, respectivamente (Figu- ra 12C). Além disso, G1-(B1) induziu apoptose celular em comparação com camundongos tratados com veículo e controle de isótipo 3207- (B1), que se correlacionou com a acumulação de células tumorais de G1-(B1) ADC como detectado por coloração com IgG (Figura 12C). Nenhuma alteração foi observada nos níveis de MITF e PMEL17 após a inibição de GNAQ (Figura 12C). Nenhuma inibição da agregação de plaquetas foi observada em camundongos tratados com G1-(B1) por até 7 dias (Figuras 12D & E).

[0040] As Figuras 13A-13C mostram dados exemplificativos so- bre o efeito de ADC G1-(B1) sobre um modelo de camundongo com metástase hepática e pulmonar de melanoma uveal Imagens individu- ais de cada camundongo são apresentadas no dia 45 após injeção i.v. de células 92.1-luciferase (pouco antes do início do tratamento) e 12 dias após o tratamento (Figuras 13A e 13B); tamanho da amostra, (n = 6 camundongos por grupo). A BLI inicial para metástase hepática no dia O foi de aproximadamente 2,8 *109 p/seg/cm2. Os tumores de pulmão (sinal de bioluminescência) na Figura 13B são indicados por uma seta preta. A modulação do peso corporal correspondente (% vs dia 15) foi avaliada 2-3 vezes por semana antes e após o tratamento com G1-(B1) 20 mg/kg (círculos cinzas). Os valores na Figura 13C são média + DPM; tamanho da amostra, (n=5-6 camundongos por grupo). O peso corporal inicial no dia 15 era de aproximadamente 21 g.

[0041] As Figuras 14A-14E mostram dados exemplificativos sobre as propriedades PK de ADCs G1-(B1). O perfil farmacocinético (níveis de IgG totais) de G1-(B1) mostrou um aumento ligeiramente despro- porcional de exposição com dose entre 7,5 e 30 mg/kg em camundon- gos nus (Figura 14A). Em camundongos com tumor, as concentrações de carga útil livre foram medidas após a dosagem de G1-(B1) de liga- ção ao alvo ou controle de isótipo 3207-(B1). Um aumento evidente (> 4 vezes) na distribuição do tumor da carga útil do Composto (A1) po- deria ser observado usando o ADC alvejado (Figura 14B). A conversão do Composto (A1) (círculos abertos) em sua forma de anel aberto do Composto (A8) , (círculos preenchidos) enquanto é conjugado ao anti- corpo foi mostrada in vivo em camundongos (Figura 14C). As exposi- ções em um estudo de eficácia in vivo, comparando dois formatos DAR? diferentes com o formato DAR4 de G1-(B1) e com o formato DARA4 Fc silencioso, mostraram menor depuração para os ADCs de DAR?2 (E152C) e DARA4 Fc-silencioso, enquanto a exposição a DAR2 (S375C) diminui mais rapidamente (Figura 14D). A Figura 14E mostra a concentração de conjugados de 3207 (anticorpo de controle de isóti- po)-(B1) DAR4 (E152C, S375C) e 3207 (anticorpo de controle de isóti- po)-(B1) DARA4 Fc-silencioso ao longo do tempo.

[0042] As Figuras 15A-15C mostram dados exemplificativos so- bre a estabilidade in vitro de ADCs anti-PMEL17-GNAQ/11i em tam- pão, plasma de camundongo, rato e humano e estabilidade in vivo de ADOCs anti-PMEL17-GNAQ/11i em camundongo.

[0043] As Figuras 16A-16B mostram dados exemplificativos so- bre a eficácia in vivo de G1-E152C-DAR2-(B1), G1-S375C-DARZ2-(B1), Fc-silencioso G1-(B1) em um modelo de xenoenxerto de melanoma uveal. Os valores representam a média + DPM; tamanho da amostra, (n=5-6 camundongos por grupo). Os volumes de tumor inicial no dia O foi de aproximadamente 300-325 mm.

[0044] As Figuras 17A-17B mostram dados exemplificativos so-

bre a atividade de melanoma anti-uveal in vitro de ADCs anti-PMEL 17- (B1) Dados apresentados como média de 3 réplicas independentes e relativos às células tratadas com PBS (controle).

[0045] A Figura 18 mostra dados exemplificativos sobre a ativida- de de antitumoral in vitro de ADCs anti-PMEL17-(B1)

[0046] As Figuras 19A-19B mostram dados exemplificativos sobre uma análise imunoistoquímica de biópsias tumorais de pacientes com melanoma uveal metastático.

[0047] As Figuras 20A-20C mostram dados de sensorgrama para avaliar o escaneamento de epítopos de anticorpos anti-PMEL. A Figu- ra 20A ilustra as etapas de ligação. A Figura 20B mostra o sensorgra- ma quando o anticorpo G1 3J LC é imobilizado primeiro e 17A9 é flui- do. A Figura 20C mostra o sensorgrama quando 17A9 é imobilizado primeiro e G1 3J LC é fluido.** Em ambos os casos, a ligação é obser- vada quando o segundo anticorpo flui, sugerindo que G1 3J LC e 17A9 se ligam a diferentes epítopos de PMEL humano. Descrição Detalhada da invenção Definições

[0048] Exceto onde especificado em contrário, os seguintes ter- mos e frases, como usado no presente documento devem ter os se- guintes significados:

[0049] O termo "alquila" se refere a uma cadeia de hidrocarboneto saturado monovalente que tem o número especificado de átomos de carbono. Por exemplo, C1-Cs alquila se refere a um grupo alquila que tem de 1 a 6 átomos de carbono. Os grupos alquila podem ser lineares ou ramiíficados. Os grupos alquila ramíificados representativos têm uma, duas ou três ramificações. Exemplos de grupos alquila incluem, porém sem limitação, metila, etila, propila (n-propila e isopropila), butila (n-butila, isobutila, sec-butila e t-butila), pentila (n-pentila, isopentila e neopentila) e hexila.

[0050] "Clivável", como usado no presente documento, se refere a um grupo de ligação ou componente ligante que conecta duas porções químicas por conexões covalentes, porém quebra para romper a co- nexão covalente entre as porções químicas sob condições fisiologica- mente relevantes, tipicamente um grupo de ligação clivável é rompida in vivo mais rapidamente em um ambiente intracelular do que quando fora de uma célula, fazendo com que a liberação da carga útil ocorra, de preferência, dentro de uma célula alvejada. A clivagem pode ser enzimática ou não enzimática, porém, de modo geral, libera uma carga útil de um anticorpo sem degradar o anticorpo. A clivagem pode deixar alguma porção de um grupo de ligação ou componente ligante fixada à carga útil ou pode liberar a carga útil sem qualquer resíduo do grupo de ligação.

[0051] "Não clivável", como usado no presente documento, se re- fere a um grupo de ligação ou componente ligante que não é especi- almente suscetível à ruptura sob condições fisiológicas, por exemplo, é pelo menos tão estável quanto a porção de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do conjugado. Tais grupos de ligação são algumas vezes denominados "estáveis”, o que significa que são suficientemente resistentes à degradação para manter a carga útil conectada ao anti- corpo ou fragmento de ligação a antígeno até o próprio anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ser pelo menos parcialmente degra- dado, isto é, a degradação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno precede a clivagem do grupo de ligação in vivo. A degrada- ção da porção de anticorpo de um ADC que tem um grupo de ligação estável ou não clivável pode deixar parte ou todo o grupo de ligação, por exemplo, um ou mais grupos de aminoácidos de um anticorpo, fi- xado à carga útil ou porção química de fármaco que é entregue in vivo.

[0052] O termo "anticorpo" como usado no presente documento se refere a um polipeptídeo da família das imunoglobulinas que tem ca-

pacidade de se ligar a um correspondente antígeno de forma não co- valente, reversível, e de maneira específica. Por exemplo, um anticor- po IgG de ocorrência natural é um tetrâmero que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconec- tadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável da cadeia pesada (abreviada no presente do- cumento como VH) e uma região constante da cadeia pesada. A regi- ão constante de cadeia pesada é compreendida por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeia leve (abreviada no presente documento como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, de- nominadas regiões determinantes da complementaridade (CDR), in- tercaladas com regiões que estão mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas, a patir da terminação amino para a terminação carbóxi, na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FRA4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve podem conter um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões cons- tantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a te- cidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imu- ne (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

[0053] O termo "anticorpo" inclui, porém sem limitação, anticorpos monoclonais, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticor- pos quiméricos e anticorpos anti-idiotípicos (anti-ld) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-ld para anticorpos da invenção). Os anticor- pos podem ser de qualquer isotipo/classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), ou subclasse (por exemplo, I9G1, IgG2, I19G3, 1gGA4,

IgA1 e IgA2).

[0054] "Domínios determinantes de complementaridade" ou "regi- ões determinantes de complementaridade" ("CDR") se referem de for- ma intercambiável às regiões hipervariáveis de VL e VH. As CDRs são o sítio de ligação à proteína-alvo das cadeias de anticorpo que abri- gam especificidade para tal proteína-alvo. Há três CDR (CDR1-3, nu- meradas sequencialmente a partir da terminação N) em cada VL ou VH humana, constituindo cerca de 15 a 20% dos domínios variáveis. As CDR são estruturalmente complementares ao epítopo da proteína- alvo e são, dessa forma, diretamente responsáveis pela especificidade de ligação. Os trechos restantes da VL ou VH, as assim chamadas re- giões de estrutura, exibem menos variação em sequência de aminoá- cidos (Kuby, Immunology, 4º edição, Capítulo 4. W.H. Freeman & Co., Nova lorque, 2000).

[0055] As posições das CDR e regiões de estrutura podem ser de- terminadas usando várias definições bem conhecidas na técnica, por exemplo, Kabat, Chothia, banco de dados international InMunoGene- Tics (IMGT) (disponível na web em www.imgt.org/) e ADM (consultar, por exemplo, Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al, Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et a/l., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997)). Definições de sítios de combinação de antígenos são também descritas na se- guinte descrição: Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219—221 (2000); e Lefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996); e Martin et a/., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991); e Rees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141—172 (1996).

[0056] Ambas as cadeias leve e pesada são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos "constante" e "variável" são usados funcionalmente. Nesse sentido, será entendido que os domínios variáveis de ambas as porções de cadeia leve (VL) e pesada (VH) determinam o reconhecimento e a especificidade de antígeno. Consequentemente, os domínios constantes da cadeia leve (CL) e da cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem propriedades biológicas importantes, como secreção, mobilidade transplacentária, ligação a receptor Fc, ligação a complemento e similares. Por convenção, a nu- meração dos domínios da região constante aumenta à medida que se tornam mais distais do sítio de ligação ao antígeno ou terminação ami- no do anticorpo. A terminação N é uma região variável e a terminação C é uma região constante; os domínios CH3 e CL realmente compre- endem os domínios carbóxi-terminais da cadeia pesada e leve, res- pectivamente.

[0057] O termo "fragmento de ligação ao antígeno", como usado no presente documento, se refere a uma ou mais porções de um anti- corpo que mantêm a capacidade de interagir especificamente com (por exemplo, por ligação, impedimento estérico, estabilização/desestabi- lização, distribuição espacial) um epítopo de um antígeno. Exemplos de fragmentos de ligação incluem, porém sem limitação, Fvs de cadeia única (scFv); anticorpos de camelídeos, Fvs ligados a dissulfeto (sdFv); fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; um fragmento F(ab)2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; um frag- mento dAB (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), que consiste em um domínio VH; e uma região determinante de complementaridade isolada (CDR) ou outros fragmentos de ligação a epítopo de um anti-

corpo.

[0058] Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, os mesmos podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que os mesmos sejam preparados como uma única cadeia de proteína em que as regiões VL e VH são pareadas para formar molé- culas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); consultar, por exemplo, Bird et al. Science 242: 423-426, 1988; e Hus- ton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879- 5883, 1988). Tais anticorpos de cadeia única se destinam também a serem abrangidos pelo termo "fragmento de ligação a antígeno”. Estes fragmentos de ligação a antí- geno são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas pelos versados na técnica, e os fragmentos são analisados quanto à utilida- de da mesma maneira que os anticorpos intatos.

[0059] Fragmentos de ligação ao antígeno podem também ser in- corporados em anticorpos de domínio único, maxicorpos, minicorpos, anticorpos de domínio único, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetra- corpos, v-NAR e bis-scFv (consultar, por exemplo, Hollinger e Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Fragmentos de ligação ao antígeno podem ser enxertados em arcabouços baseados em polipep- tídeos como fibronectina tipo Ill (Fn3) (consultar a Patente U.S.

6.703.199, que descreve monocorpos polipeptídicos de fibronectina).

[0060] Fragmentos de ligação ao antígeno podem ser incorpora- dos em moléculas de cadeia única que compreendem um par de seg- mentos de Fv em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que, juntamente com po- lipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação ao antígeno (Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062, 1995; e Patente U.S. nº 5.641.870).

[0061] O termo "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticor- po monoclonal", como usado no presente documento, se refere a poli-

peptídeos, incluindo anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que têm sequência de aminoácidos substancialmente idêntica ou são derivados da mesma fonte genética. Esse termo inclui também prepa- rações de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma única especifici- dade e afinidade de ligação a um epítopo específico.

[0062] O termo "anticorpo humano", como usado no presente do- cumento, inclui anticorpos que têm regiões variáveis em que tanto as regiões de estrutura quanto CDR são derivadas de sequências de ori- gem humana. Além disso, se o anticorpo contiver uma região constan- te, a região constante é também derivada de tais sequências huma- nas, por exemplo, sequências de linha germinativa humana, ou ver- sões mutadas de sequências de linha germinativa humana ou anticor- po contendo sequências de estrutura consenso derivadas de análise de sequências de estrutura humanas, por exemplo, como descrito em Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000). São também incluídos anticorpos derivados de sequências humanas em que uma ou mais CDR foram mutadas para maturação de afinidade ou para propósitos de conjugação de fabricação/carga útil. Consultar Kilpatrick et al., "Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS", Hybridoma. Agosto de 1997;16(4):381-9.

[0063] Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo, ou uma substituição conservati- va para promover estabilidade ou fabricação).

[0064] O termo "reconhecer", como usado no presente documento, se refere a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que encontra e interage (por exemplo, se liga) com seu epíto- po, seja esse epítopo linear ou conformacional. O termo "epítopo" se refere a um sítio em um antígeno ao qual um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção se liga especificamente. Os epíto- pos podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos quanto aminoácidos não contíguos justapostos por enovelamento ter- ciário de uma proteína. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente mantidos em exposição para desnaturar solventes, enquanto os epítopos formados por enovelamento terciário são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos em uma conformação espacial exclusiva. Métodos para determinar a conformação espacial de epítopos incluem técnicas na técnica, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonân- cia magnética nuclear bidimensional (consultar, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Volume 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).

[0065] O termo "afinidade", como usado no presente documento, se refere à força de interação entre anticorpo e antígeno em sítios an- tigênicos únicos. Dentro de cada sítio antigênico, a região variável do "braço" de anticorpo interage através de forças não covalentes fracas com antígeno em diversos sítios; quanto mais interações, mais forte a afinidade.

[0066] O termo "anticorpo isolado" se refere a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos que têm especificidades antigênicas diferentes. Um anticorpo isolado que se liga especifica- mente a um antígeno pode, no entanto, ter reatividade cruzada a ou- tros antígenos. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substanci- almente isento de outro material celular e/ou produtos químicos.

[0067] O termo "sequência de linha germinativa humana corres- pondente" se refere à sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência ou subsequência de aminoácidos de região variável huma-

na que compartilha a identidade de sequência de aminoácidos deter- minada mais alta com uma sequência ou subsequência de aminoáci- dos de região variável de referência em comparação com todas as ou- tras sequências de aminoácidos de região variável conhecidas codifi- cadas por sequências de região variável de imunoglobulina de linha germinativa humanas. A sequência de linha germinativa humana cor- respondente pode também se referir à sequência ou subsequência de aminoácidos de região variável humana com a identidade de sequên- cia de aminoácidos mais alta com uma sequência ou subsequência de aminoácidos de região variável de referência em comparação com to- das as outras sequências de aminoácidos de região variável avaliadas. A sequência de linha germinativa correspondente podem ser apenas regiões de estrutura, apenas regiões determinantes de complementa- ridade, regiões determinantes de complementaridade e de estrutura, um segmento variável (como definido acima), ou outras combinações de sequências ou subsequências que compreendam uma região vari- ável. A identidade de sequência pode ser determinada com o uso dos métodos descritos no presente documento, por exemplo, alinhar duas sequências usando BLAST, ALIGN ou outro algoritmo de alinhamento conhecido na técnica. O ácido nucleico de linha germinativa humana correspondente ou sequência de aminoácidos podem ter pelo menos cerca de 90%, 91, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com o ácido nucleico de região vari- ável de referência ou sequência de aminoácidos. Sequências de linha germinativa humanas podem ser determinadas, por exemplo, através do banco de dados internacional ImMunoGeneTics publicamente dis- ponível (IMGT) (na web em www.imgt.org/) e base V (na web em vba- se.mrc-cpe.cam.ac.uk).

[0068] A expressão "se liga especificamente" ou "se liga seletiva- mente," quando usado no contexto de descrição da interação entre um antígeno (por exemplo, uma proteína) e um anticorpo, fragmento de anticorpo ou agente de ligação derivado de anticorpo, se refere a uma reação de ligação que é determinativa da presença do antígeno em uma população heterogênea de proteínas e outros produtos biológi- cos, por exemplo, em uma amostra biológica, por exemplo, uma amos- tra de sangue, soro, plasma ou tecido. Dessa forma, sob certas condi- ções de imunoensaio designadas, os anticorpos ou agentes de ligação com uma especificidade de ligação específica se ligam a um antígeno específico pelo menos duas vezes o antecedente e não se ligam subs- tancialmente em uma quantidade significativa a outros antígenos pre- sentes na amostra. Em uma modalidade, sob condições de imunoen- saio designadas, o anticorpo ou agente de ligação com uma especifi- cidade de ligação específica se liga a um antígeno específico pelo me- nos dez (10) vezes o antecedente e não se liga substancialmente em uma quantidade significativa a outros antígenos presentes na amostra. A ligação específica a um anticorpo ou agente de ligação sob tais con- dições pode exigir que o anticorpo ou agente seja selecionado quanto à sua especificidade para uma proteína específica. Como desejado ou adequado, essa seleção pode ser atingida subtraindo-se anticorpos que sofrem reação cruzada com moléculas de outras espécies (por exemplo, camundongo ou rato) ou outros subtipos. Alternativamente, em algumas modalidades, são selecionados anticorpos ou fragmentos de anticorpo que sofrem reação cruzada com certas moléculas dese- jadas.

[0069] Pode ser usada uma variedade de formatos de imunoen- saios para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos com uma proteína específica. Por exemplo, imunoensaios ELISA de fase sólida são rotineiramente usados para selecionar anticorpos especifi- camente imunorreativos com uma proteína (consultar, por exemplo, Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998), para uma descrição de formatos de imunoensaios e condições que podem ser usados para determinar imunorreatividade específica). Tipicamen- te, uma reação de ligação específica ou seletiva produzirá um sinal pelo menos duas vezes o sinal de fundo e mais tipicamente pelo me- nos 10 a 100 vezes maior que o fundo.

[0070] A expressão "constante de dissociação de equilíbrio (KD, M)" se refere à constante de taxa de dissociação (kd, tempo-1) dividida pela constante de taxa de associação (ka, tempo-1, M-1). As constan- tes de dissociação em equilíbrio podem ser medidas com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Os anticorpos da presente in- venção têm, em geral, uma constante de dissociação de equilíbrio me- nor que cerca de 107 ou 108 M, por exemplo, menor que cerca de 10º M ou 107º, em algumas modalidades, menor que cerca de 10º M, 10º 12 Mou10'ºM.

[0071] O termo "biodisponibilidade" se refere à disponibilidade sis- têmica (isto é, níveis de sangue/plasma) de uma determinada quanti- dade de fármaco administrada a um paciente. A biodisponibilidade é um termo absoluto que indica medição tanto do tempo (taxa) quanto da quantidade total (extensão) de fármaco que atinge a circulação ge- ral de uma forma de dosagem administrada.

[0072] Como usado no presente documento, a frase "que consiste essencialmente em" se refere aos gêneros ou espécies de agentes farmacêuticos ativos incluídos em um método ou composição, bem como quaisquer excipientes inativos para o propósito destinado dos métodos ou composições. Em algumas modalidades, a expressão "que consiste essencialmente em" exclui expressamente a inclusão de um ou mais agentes ativos adicionais diferentes de um conjugado de anticorpo e fármaco da invenção. Em algumas modalidades, a expres- são "que consiste essencialmente em" exclui expressamente a inclu- são de um ou mais agentes ativos adicionais diferentes de um conju-

gado de anticorpo e fármaco da invenção e um segundo agente co- administrado.

[0073] O termo "aminoácido" se refere a aminoácidos de ocorrên- cia natural, sintéticos e não naturais, bem como análogos de aminoá- cido e miméticos de aminoácido que funcionam de maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência na- tural são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidro- xiprolina, y-carboxiglutamato e O-fosfosserina. Os análogos de amino- ácido se referem a compostos que têm a mesma estrutura química bá- sica que um aminoácido de ocorrência natural, isto é, um a-carbono que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homosserina, norleucina, sulfóxido de meti- onina, metionina metilsulfônio. Tais análogos têm grupos R modifica- dos (por exemplo, norleucina) ou cadeias principais peptídicas modifi- cadas, porém mantêm a mesma estrutura química básica que um ami- noácido de ocorrência natural. Miméticos de aminoácido se referem a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutu- ra química geral de um aminoácido, porém que funciona de maneira similar a um aminoácido de ocorrência natural.

[0074] O termo "variante conservativamente modificado" se aplica tanto a sequências de aminoácidos quanto de ácidos nucleicos. Em relação a sequências de ácidos nucleicos específicas, variantes con- servativamente modificadas se referem àqueles ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente, ou em que o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, às sequências essencialmente idênticas. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcional- mente idênticos codifica qualquer proteína. Por exemplo, todos os có- dons GCA, GCC, GCG e GCU codificam o aminoácido alanina. Desse modo, em cada posição em que uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons cor- respondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais va- riações de ácido nucleico são "variações silenciosas", que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Cada sequência de ácidos nucleicos no presente documento que codifica um polipeptí- deo descreve também toda cada variação silenciosa possível do ácido nucleico. O versado na técnica reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é comumente o único códon para metionina, e TGG, que é comumente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idên- tica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nuclei- co que codifica um polipeptídeo está implícita em cada sequência des- crita.

[0075] Para sequências de polipeptídeos, "variantes conservati- vamente modificadas" incluem substituições, deleções ou adições indi- viduais a uma sequência de polipeptídeos que resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmen- te similares são bem conhecidas na técnica. Tais variantes conservati- vamente modificadas são além de, e não excluem variantes polimórfi- cas, homólogos interespécies e alelos da invenção. Os oito grupos se- guintes contêm aminoácidos que são substituições conservativas entre si: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (1), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Ciste- ína (C), Metionina (M) (consultar, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)). Em algumas modalidades, o termo "modificações de sequên- cias conservativas” é usado para se referir a modificações de aminoá-

cidos que não afetam nem alteram significativamente as característi- cas de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoácidos.

[0076] O termo "otimizado" como usado no presente documento se refere a uma sequência de nucleotídeos que foi alterada para codi- ficar uma sequência de aminoácidos usando códons que são prefe- renciais na célula ou organismo de produção, de modo geral, uma cé- lula eucariótica, por exemplo, uma célula de levedura, uma célula de Pichia, uma célula fúngica, uma célula de Trichoderma, uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou uma célula humana. A sequência de nucleotídeos otimizada é geneticamente modificada para manter completamente ou o máximo possível a sequência de aminoácidos originalmente codificada pela sequência de nucleotídeos de partida, que é também conhecida como a sequência "parental".

[0077] Os termos "porcentagem de identidade” ou "porcentagem de identidade”, no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nu- cleicos ou polipeptídeos, se referem até o ponto em que duas ou mais sequências ou subsequências são iguais. Duas sequências são "idên- ticas" se tiverem a mesma sequência de aminoácidos ou nucleotídeos sobre a região que é comparada. Duas sequências são "substancial- mente idênticas" se duas sequências tiverem uma percentagem espe- cificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são iguais (isto é, 60% de identidade, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99% de identidade ao longo de uma região especifica- da, ou, quando não especificado, ao longo de toda a sequência), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação, ou região designada, como me- dido usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequên- cias ou por alinhamento manual e inspeção visual. Opcionalmente, a identidade existe ao longo de uma região que tem pelo menos cerca de 30 nucleotídeos (ou 10 aminoácidos) de comprimento, ou com mais preferência, ao longo de uma região que tem 100 até 500 ou 1000 ou mais nucleotídeos (ou 20, 50, 200 ou mais aminoácidos) de compri- mento.

[0078] Para comparação de sequências, tipicamente uma sequên- cia atua como uma sequência de referência com a qual sequências de teste são comparadas. Com o uso de um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, são designadas coordenadas de subsequências, se necessário, e são designados parâmetros de programa de algoritmo de sequências. Parâmetros predefinidos do programa podem ser usa- dos, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência, então, calcula o percentual de identidades de sequência para as sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa.

[0079] Uma "janela de comparação", como usado no presente do- cumento, inclui a referência a um segmento de qualquer uma das di- versas posições contíguas selecionadas dentre o grupo que consiste em de 20 a 600, geralmente cerca de 50 a cerca de 200, mais geral- mente cerca de 100 a cerca de 150, em que uma sequência pode ser comparada com uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem idealmente ali- nhadas. Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de ho- mologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c (1970), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa por método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BEST- FIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Ge-

netics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) ou por alinha- mento manual e inspeção visual (consultar, por exemplo, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, 2003).

[0080] Dois exemplos de algoritmos que são adequados para de- terminar a porcentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et a/., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990, respectivamente. O software para realizar análises BLAST está publicamente disponível através do Nati- onal Center for Biotechnology Information. Esse algoritmo envolve identificar primeiramente pares de sequência de elevada pontuação (HSP) identificando palavras pequenas de comprimento W na sequên- cia de consulta, que correspondem ou satisfazem alguma pontuação T de limiar de valor positivo quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados. T é de- nominado o limiar de pontuação de palavra de vizinhança (Altschul et al., supra). Essas correspondências de palavra de vizinhança iniciais atuam como sementes para a iniciação de buscas para encontrar HSP mais longos contendo as mesmas. Os acertos de palavra se estendem em ambas as direções ao longo de cada sequência na medida em que a pontuação de alinhamento cumulativa pode ser aumentada. As pon- tuações acumulativas são calculadas usando, para sequências de nu- cleotídeos, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (pontuação de penali- dade para resíduos não correspondentes; sempre < 0). Para sequên- cias de aminoácidos, é usada uma matriz de pontuação para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acertos de palavra em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulati- va diminui pela quantidade X a partir do seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai para zero ou menos devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou a extremidade de cada sequência é alcançada. Os parâmetros de algo- ritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 11, uma expec- tativa (E) ou 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas das fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como pa- drões um comprimento de palavra de 3 e expectativa (E) de 10, e os alinhamentos de matriz de pontuação BLOSUMG6?2 (consultar Henikoff e Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) (B) de 50, ex- pectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as fitas.

[0081] O algoritmo BLAST realiza também uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (consultar, por exemplo, Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Uma me- dida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor proba- bilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotí- deos ou aminoácidos poderia ocorrer ao acaso. Por exemplo, um áci- do nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nucleico de referência for menor que cerca de 0,2, com mais preferência, menor que cerca de 0,01 e, com a máxima preferência, menor que cerca de 0,001.

[0082] A porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser também determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller, Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988) que foi incor- porado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resí- duos de peso PAM 120, uma penalidade por comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade por lacuna de 4. Adicionalmente, a porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser deter-

minada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970), que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em www.gceg.com), usando uma matriz BLOSUMG62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3,4, 5o0u6.

[0083] Além da porcentagem de identidade de sequência observa- da acima, outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos são substancialmente idênticas é que o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico tem reativreatividade imunoló- gica cruzada com os anticorpos que surgem contra o polipeptídeo co- dificado pelo segundo ácido nucleico, como descrito abaixo. Dessa forma, tipicamente, um polipeptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas pelas substituições conservativas. Outra indicação de que du- as sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas ou seus complementos se hibridizam uns aos outros sob condições estringentes, como descrito abaixo. Ainda outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substanci- almente idênticas é que os mesmos iniciadores podem ser usados pa- ra amplificar a sequência.

[0084] O termo "ácido nucleico" é usado no presente documento de forma intercambiável com o termo "polinucleotídeo" e se refere a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos em forma de fita única ou dupla. O termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos de nucleotídeo conhecidos ou resíduos ou ligações de cadeia principal modificados, que são sintéticos, de ocorrência na- tural e de ocorrência não natural, que têm propriedades de ligação si- milares como o ácido nucleico de referência e que são metabolizados de maneira similar aos nucleotídeos de referência. Os exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos,

fosfonatos de metila, fosfonatos de metila quiral, 2-O-metil ribonucleo- tídeos, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs).

[0085] Exceto onde indicado em contrário, uma sequência de áci- dos nucleicos específica abrange também implicitamente variantes conservativamente modificadas dos mesmo (por exemplo, substitui- ções de códons degenerados) e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, como de- talhado abaixo, podem ser obtidas substituições de códons degenera- dos gerando sequências em que a terceira posição de um ou mais (ou todos) códons selecionados é substituída por resíduos de bases mis- tas e/ou desóxi-inosina (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et a/., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; e Ros- solini et a/., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98).

[0086] A expressão "ligado de maneira funcional" no contexto de ácidos nucleicos se refere a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de polinucleotídeo (por exemplo, DNA). Tipicamente, a mesma se refere à relação funcional de uma sequência reguladora transcricional e uma sequência transcrita. Por exemplo, uma sequên- cia promotora ou intensificadora é ligada de maneira funcional a uma sequência de codificação se a mesma estimular ou modular a transcri- ção da sequência de codificação em uma célula hospedeira adequada ou outro sistema de expressão. De modo geral, sequências regulado- ras transcricionais promotoras que são ligadas de maneira funcional a uma sequência transcrita são fisicamente contíguas à sequência transcrita, isto é, são cis-atuantes. Entretanto, algumas sequências reguladoras transcricionais, como intensificadores, não precisam ser fisicamente contíguas ou localizadas em estreita proximidade às se- quências de codificação cuja transcrição as mesmas intensificam.

[0087] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados de forma intercambiável no presente documento para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido são um mi- mético químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural cor- respondente, assim como a polímeros de aminoácido de ocorrência natural e polímero de aminoácido de ocorrência não natural. Exceto onde indicado em contrário, uma sequência de polipeptídeos específi- ca abrange também implicitamente variantes conservativamente modi- ficadas da mesma.

[0088] A expressão "conjugado de anticorpo e fármaco" ou "imu- noconjugado”, como usado no presente documento, se refere à liga- ção de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com outro agente, como um agente quimioterápico, uma toxi- na, um agente imunoterapêutico, uma sonda de imageamento e simila- res. As ligações podem ser ligações covalentes ou interações não co- valentes, como através de forças eletrostáticas. Vários ligantes, co- nhecidos na técnica, podem ser usados para formar o conjugado de anticorpo e fármaco. Adicionalmente, o conjugado de anticorpo e fár- maco pode ser fornecido sob a forma de uma proteína de fusão que pode ser expressa a partir de um polinucleotídeo que codifica o imu- noconjugado. Como usado no presente documento, "proteína de fu- são" se refere a proteínas criadas através da união de dois ou mais genes ou fragmentos de gene que originalmente codificavam proteínas separadas (incluindo peptídeos e polipeptídeos). A tradução do gene de fusão resulta em uma única proteína com propriedades funcionais derivadas de cada uma das proteínas originais.

[0089] O termo "sujeito" inclui animais humanos e não humanos. Os animais não humanos incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, como primatas não humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios e répteis. Exceto quando indicado, os termos "paciente" ou "sujeito" são usados no presente documento de forma intercambiável.

[0090] O termo "citotoxina" ou "agente citotóxico", como usado no presente documento, se refere a qualquer agente que seja prejudicial ao crescimento e proliferação de células e possa atuar para reduzir, inibir ou destruir uma célula ou malignidade.

[0091] A expressão "agente anticâncer", como usado no presente documento, se refere a qualquer agente que possa ser usado para tra- tar ou prevenir um distúrbio de proliferação celular, como câncer, inclu- indo, porém sem limitação, agentes citotóxicos, agentes quimioterápi- cos, radioterapia e agentes radioterapêuticos, agentes anticâncer alve- jados e agentes imunoterapêuticos.

[0092] A expressão "porção química de fármaco" ou "carga útil", como usado no presente documento, se refere a uma porção química que é conjugada a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção e pode incluir qualquer agente terapêutico ou diagnóstico, por exemplo, um agente anticâncer, anti-inflamatório, anti-infeccioso (por exemplo, antifúngico, antibacteriano, antiparasítico, antiviral) ou anestésico. Por exemplo, a porção química de fármaco pode ser um agente anticâncer, como uma citotoxina. Em certas modalidades, uma porção química de fármaco é um composto inibidor alvo. Adicional- mente, uma carga útil pode ser uma sonda biofísica, um fluoróforo, uma etiqueta spin, uma sonda infravermelha, uma sonda de afinidade, um quelante, uma sonda espectroscópica, uma sonda radioativa, uma molécula de lipídio, um polietilenoglicol, um polímero, uma etiqueta spin, DNA, RNA, uma proteína, um peptídeo, uma superfície, um anti- corpo, um fragmento de anticorpo, uma nanopartícula, um ponto quân- tico, um lipossomo, uma partícula PLGA, um sacarídeo ou um polissa- carídeo.

[0093] Em algumas modalidades, a porção química de fármaco ou carga útil é um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um inibi-

dor de GNAQ e GNA11 (inibidor de GNAQ/GNA11). Em algumas mo- dalidades, um inibidor de GNAQ/11 é uma molécula que inibe a produ- ção mediada por GNAQ/11 de IP3 e/ou exibe um efeito antiproliferativo de resposta à dose em células dependentes de sinalização de GNAQ/11 (ou seja, células de melanoma uveal mutantes GNAQ/11). Em algumas modalidades, um inibidor de GNAQ/11 é um composto que estabiliza GNAQ/11 no estado ligado a GDP inativo e impede a liberação de GDP, ou se liga ao estado ligado a GTP ativo e impede a interação de GNAQ/11 com efetores a jusante. Em algumas modalida- des, um inibidor de GNAQ/11 funciona inibindo um GNAQ e/ou GNA11 mutante, como um que compreende uma mutação de Q209L/P. Méto- dos para fixar tais porções químicas de fármaco a um ligante compatí- vel com a porção química de alvejamento são fornecidos na presente revelação, juntamente com os métodos conhecidos na técnica. Con- sultar, por exemplo, Singh et a/., (2009) Therapeutic Antibodies: Me- thods and Protocols, volume 525, 445 a 457.

[0094] GNAQ (subunidade alfa da proteína G (q) de ligação a nu- cleotídeo de guanina, também conhecida como CMC1, G-ALPHA-q, GAQ, SWS e subunidade alfa q da proteína G) e GNA11 (subunidade alfa-11 da proteína de ligação a nucleotídeo de guanina, também co- nhecida como FBH, FBH2, FHH2, GNA-11, HHC2, HYPOC? e subuni- dade alfa 11 da proteína G) são GTPases intimamente relacionadas que constituem subunidades a de proteínas G heterotriméricas atuan- do a jusante de receptores acoplados à proteína G (GPCRs). As subu- nidades a atuam como um interruptor para ativação de proteínas G trocando-se o difosfato de guanosina (GDP) por trifosfato de guanosi- na (GTP), levando à ativação de efetores a jusante diferentes. A ativa- ção é interrompida pela ativação intrínseca de GTPase, visto que GTP é hidrolisado para GDP (Van Raamsdonk et a/., 2010, N Engl J Med.; 363(23):2191-9). A ativação clássica de cascata de proteínas Gq ocor-

re através de fosfolipase C-B (PLC-B), que hidrolisa fosfatidilinositol 4,5-bifosfato fosfolipídico para liberar dois segundos mensageiros po- tentes: 1,4,5-Trifosfato de D-mio-inositol (IP3) e diacilglicerol (DAG). Após o aumento temporário de Ca?* intracelular, IP3 é rapidamente transformado em IP2, IP1 e mio-inositol. Por outro lado, DAG ativa a proteína quinase C (PKC), levando a uma cascata de fosforilação de RAF, MEK e ERK, que se transloca para o núcleo de modo a regular a proliferação e a sobrevivência celular (Krantz et al. 2017, Clin Ophthalmol.; 11:279-289).

[0095] As sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos de GNAQ humano foram publicadas no GenBank com os seguintes nú- meros de acesso:

[0096] NP 002063 (SEQ ID NO:268) 1 mtlesimacc Iseeakearr indeierglr rdkrdarrel kllllgtges gkstfikgmr 61 iihgsgysde dkraftklvy qgniftamgam iramdtlkip ykyehnkaha qlvrev- dvek 121 vsafenpyvd aikslwndpg igecydrrre yalsdstkyy Indidrvadp aylpt- qgqadvl 181 rvrvpttgii eypfdlagsvi frmvdvggagr serrkwihcf envtsimflv alseydqvlv 241 esdnenrmee skalfrtiit ypwfgnssvi Ifinkkdlle ekimyshlvd yfpeydgpar 301 dagaarefil kmfvdlnpds dkiiyshftc atdtenirfv faavkdtilg Inlkeynlv

[0097] NM 002072 (SEQ ID NO:269) 1 agactatccg cteccacege gececeggec cacetggtag ceceggecet ggeeg- cegec 61 ccegeggegg ttccoggage tegtcecegga cgegegeceg ggcggegggg geteggegge 121 cacecgcectgce tegggggage gagggceggga gagtatatat gcgcactata ag- cagggggt 181 gcceggegggAg ctgcagegga gacactttag aagaatgact ctggagtcca tcatggcgta

241 ctgcctgage gaggaggeca aggaageceg geggatrcaac gacgagateg agcggcagcet

301 ccegcagggac aagcgggacg ccegecggga gcteaageta ctactgcteg ggacaggaga

361 gagtggcaag agtacgttta traagcagat gagaatcatc catgggtcag gatac- tctga

421 tgaagataaa aggggcttica ccaagctagt gtatcagaac atcttcacgg ccatg- caggc

481 catgatcaga gccatggaca cactcaagat cccatacaag tatgagcaca ataaggctca

541 tgcacaatta gttegagaag ttgatgtgga gaaggtatet gcttttgaga atccatatgt

601 agatgcaata aagagtttat ggaatgatcc tagaatccag gaatgactatg ataga- cgacg

661 agaatatcaa ttatctgact ctaccaaata ctatcttaat gacttagacc gcegtag- ctga

721 cectgectac ctagcctacge aacaagatat gcttagagtt cgagtcceca ccaca- gggat

781 catcgaatac ccectttgact tacaaagtgt cattttcaga atggtegatg taggggg- cca

841 aaggtcagag agaagaaaat ggatacactg ctttgaaaat gtcacctcta tcatg- tttct

901 agtagcagctt agtgaatatg atcaagttct cgtggagtca gacaatgaga accgaa- tgga

961 ggaaagcaag gctcetettta gaacaattat cacatacccc tagttccaga ac- tecteggt

1021 tattctgttc ttaaacaaga aagatcttet agaggagaaa atcatgtatt cccatc- tagt

1081 cgactacttc ccagaatatg atggacccca gagagatgcc caggcagece gagaattcat

1141 tctgaagatg ttegtagacc taaaccecaga cagtgacaaa attatctact cccac-

ttcac

1201 gtgcgccaca gacacegaga atatcegoett tatetttact gccgtrcaagg acac- catcct

1261 ccagttgaac ctgaaggagt acaatctggt ctaattgtgc ctectagaca cccg- cectge

1321 ccttecctagg tagactatig aagatacaca agagggactg tatttctata gaaaa- caatt

1381 tacataatac taatttatta ccgtectaga ctetatataa gegtatecac agagtttgta

1441 gtaaatatta tgattttatt taaactattc agaggaaaaa cagaggatgc tgaag- tacag

1501 teccagcaca tttectetet atcettttttt taggcaaaac cttgtgactc agtgtatttt

1561 aaattctcag teatgcacte acaaagataa gacttgtttc tttetgtoto tetototttt

1621 tcttttetat ggagcaaaac aaagctgatt teccetttttt cttececege taattcatac

1681 ctcccetectg atgatttttec caggttacaa tagcectttat cctagtteca ttettagtea

1741 agtttttctc teaaatgata cagtcaggac acategtteg atttaageca teateag- ctt

1801 aatttaagtt tatagttttt gotgaaggat tatatgtatt aatacttacg gttttaaatg

1861 tattgacttta gatacacaca tagtttcttt tttaatagaa tatactgtct tateteactt

1921 tagactagga cagtggatgc ccatctaaaa gttaagtatc atttetttta gatoatt- tace

1981 ttcagccata gcttgattgc trcagagaaat atgcagaagg caggatcaaa ga- cacacagg

2041 agtcctttet tttyaaatgc cacgtaccat tatetttect cecttettta cttettttto

2101 ttaccctetc ttteaattgc agatgccaaa aaagatgcca acagacacta cattac- ceta

2161 atggctacta cccagaacct ttttataggt tattcttaat ttttttatta ttattattca

2221 agcttttcct ttcttttttt tettggtatt taggccacga ttttaaaatg acttttatta

2281 tgggtatata tigoccaaage tagctttttg tcoaaataaaa tgaatacgaa cttaaaaaat

2341 aaaagctggt atcttaaaat gtaagagagt aagactgtga agcctaaaat gac-

tggctga

2401 gaatgaacca gaaatgccat ttgccaaaca gttgtaacta gaaatttgat tct- cacggtc

2461 cattcttttc tttgtoctta agatgacatt gttagtattc acgteccatg tteagtgtec

2521] aaaccggcaa tgtaaaaagt atcctgatata gtttaacagg aaatctattt atg- tetettt

2581 atttgaaacc agttttactc teagtagtte titaagttca atgaagtctg ccaggaa- cat

2641 tagttggtag tattattcog acacctttaa tttecaaaat ctgaagttcc tactagttta

2701 ccaccttcat gatcttetta aactagtaac tgattaggtt gaacttatgg aagatttata

2761 gacttaactc aaaagtaacc tctcagtatt ctatagaaca tgtatttgtg taac- tgaacc

2821 taccaggaga aatgtttigga attictatatg tocaattttt caacaaatgc aaaaaaaata

2881 cagcacatgt attgacaagc ttctgtcaag cagcttgagt tgaaatttga tttaagaaaa

2941 taaatcatga ttgtticaaag ctgctgggac gttagaatta ggccatgata ctggtct- cat

3001 tttaactaca gtggtatttg gcactagtgt aaacttccat ataaatcact cttttggaac

3061 aacaaagggg gagggagaaa aatcacggcc tattaaatga gtaccaaage cgcccaacag

3121 taatgagatg ttctcatcct tgatteteco agecteaaac aacacagott actttttttt

3181 tecettgcte agaaagtacc tgtaatttaa caaacagact gcctgtagagt atagto- caat

3241 tacaaatgct ctaatcattg tacatacatc tctettgata ttgcagcate catactggct

3301 ttgtaatcat taattttttg gcagattgaa tgtgctgtat tgatatgtat ctatgtaatt

3361 gtattgtatg tcetatagcta attcacgttt tgaataatgt tattttattt acttttttaa

3421 gagaggagaa tgtaaatttg tcagtttatt tetgactagg gatattttct ttecatttag

3481 aaaagaagaa aaaaaaaaaa ccttactgtc atacagageg gtactagcgt cgtactatat

3541 aaaatcattt gcacattcct gagtagaggt atactgatta taagacccaa aggtaa- ttte

3601 atagcaaaat acataaaatc agtcggagct tttatacaaa catggaaacc aac- tttgtag

3661 aacttttgcc atttgatcta ggattggaat atgagctttt atacaattca tattcttatt

3721 tggcaaatgc acagtttagt attacctctc tgatggcctt tactagaaag gcagttt- tag

3781 aagctattgt gatccactaa ggaaatgttt taacagctag agaccactgac ttg- cctgaaa

3841 gggcgttctt aaatttggtg cagcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ttaaacaaca

3901 acatttgaag gcctacagtg tatatagaga aaacctcatc acaagatcat aagto- ttaca

3961 gttttaggga atcaagatat tctatttaat agagctatag taaatgtagt caat- taaacc

4021 tgatctcaaa gcttgaagaa gctgagcaaa acagggaaag attgttatat ttg- tectttat

4081 gaaattigaga tagaatttac tatgcagaat tgagatttat ggcttcgcta ttccta- tagg

4141 gtgcatgaca agatccecttc tettgagaaa ggaaaaaatt gatcaccecta gcag- cagtga

4201 tgcatagaaa cctaatttta gccacaccag tceaatogaag ctaaaggatt ttctttttt

4261 tttetteggg gttttattiga aggggctagg ggcgggacagag gattetttto agttttatat

4321 aaaaacaaag tttactcatg ctttatatta tattgtgatt gcaagcgtta taagcgtata

4381 ccactagoct ccetattgtta atacttaggt aatgagaggcc tatagtgagt tttatgg- tga

4441 cttgggcatg tcttattcaa aaacaaaaac ataaaacaca gaaacctttc tteag- catac

4501 caaggcaagc agccatttica tgactcactt aacacattgc agtgtaccag ttta-

cagatg 4561 atttttccct ttttgcgtga cataggcagtt ctaaceccca gagaattect tatttataaa 4621 ttggaagttt ctactatgcc ttacagagct taaattcaga agtttatacc teatatetga 4681 aacaaaggga aataacacac ccattcaaaa gtaaataaat ctcctagaag tttttotttt 4741 taacatttcc atataaagag ctctgttgaa totcatgaat agactggaaa aaaaaatttt 4801 aagaacctgc atatgttatt tactagcaga tgacaactac aaaaggaatc tgaagaacac 4861 gtaaaacttg tatttttttt tttttagtag attaactagc aggcctattt taaaaaggta 4921 attcagctaa agggcaattt acttttttat acttcagact atcttgatta teaaagtata 4981 cgaactgtaa ttttaaaatt tatactgcca catgattgta aattttagtt gtcttaagtt 5041 aggaattggt gaaaagctat ttatactgga tttaggtcaa aatgacttat ttg- caaaaaa 5101 ataaataatg ggaagaaagg gctatataat gaaatactgc aagactcaca ta- ttggttgg 5161 aaatttccct caaatcacct acegattace cttgatttec ctttatttto agtttcteaa 5221 aacgaatgaa atgaaatata gcagaatgtt aacccatata aaaataaagt gtac- ccaaat 5281 attgtaatgt atattgctac tettettcaa attaaataag ggtttaaaac cacttaattg 5341 gtaatcaaca tctcaattga tacaaataag gtgtacttgg tatacattaa tattttetto 5401 caaagatata tctttagtta gaaacacaaa aaaataaaac tagtaatatt gtatott- tat 5461 ctatctctac atatttecag catatgtagc gttaatagat ctgtcctagt aactgatatct 5521 ttaggatttc attttagtte catcaaatta ggaaaagaaa tagcttagtt gtatatgatt 5581 agctagagat ttttggagcc agacacctac tatttagtag ataacttagt acagac- ceta 5641 aacttgtcat ttgtttttet cacagaatag ccatttectg ctatettcco aatgatcact 5701 gcccttteaa taacactett gcctetagaa teatatgttc aaagtatgaa tacacac- cta

5761 gcacatagta ggtactcaaa tattaatttc ctecttgect tecttateta ccctgtgtec 5821 tccatttcce cgtatgattic caacccaata tagcaaatga catttacatg tta- tgaaaac 5881 atctattggg taaaatcaga tcttagataa agaaattctg acttttatat aagcttttag 5941 tagacagaaa aaacagaaag gtattcatta gtagaacatt tttaagttca gga- aagaaag 6001 ctggaataat actacgtaac tttgtccagg ttactttgac tagaaacacgt ttttagta- ga 6061 tttcttttoo teaaagaact ctetaaatgc aactecttagc tagattecte acccateate 6121 ctgttagaaa cocttactag acctatgtat ttagggagtt ttateagaaa acatttttaa 6181 cttacagtat ttaaaagaat atttactatt cctaaaatgt cattcaaatg catgtactgt 6241 ctattatttg gagatgggaa ctagttttgc aaaaaacacc taatgttgta taataa- tgcc 6301 ccaatgatct tactggttaa aaatacagta tttttagoca taa

[0098] As sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos de GNA11 humano foram publicadas no GenBank com os seguintes nú- meros de acesso:

[0099] NP 002058 (SEQ ID NO:270) 1 mtlesmmacc Isdevkeskr inaeiekqlr rdkrdarrel kllllgtges gkstfikamr 61 iihgagysee dkrgftklvy qniftamgam irametIkil ykyegnkana Ilirevdvek 121 vttfehayvs aiktlwedpg igecydrrre yalsdsakyy Itdvdriatl gylptagdvl 181 rvrvpttgii eypfdlenii frmvdvggar serrkwihcf envtsimflv alseydqvlv 241 esdnenrmee skalfírtiit ypwfanssvi Ifinkkdlile dkilyshlvd yfpefdgpar 301 dagaarefil kmfvdlnpds dkiiyshftc atdtenirfv faavkdtilg Inlkeynlv

[00100] NM 002067 (SEQ ID NO:271) 1 aggtigtccg gegetatege tegatigegg cagetacagt tageggtage tacgg- cggeg 61 gegegageta agigeggecg cgcgggagte cgcggctage geggecegag cggggacceg 121 geggeteges aggeggegge cgaggegggg cgggceggec cggggeegag ggcceggtage

181 cgaggccgga gggcegegge ggageggegge cgaggeggact ceggecaggg cegggecgIgg

241 ggccgggggg cggeggeggg caggeggceeg cgteggcegg ggcegggacg atgactctgg

301 agtccatgat ggcgtatigc ctgagegatg aggtgaagga gtccaagegg at- caacgccg

361 agatcgagaa gcagctgcgg cgggacaage gegacgeceg gegegagete aagctagctge

421 tgcteggcac gggegagage gggaagagoca cgttcateaa gcagatacgc at- catccacg

481 gegeceggcta cteggaggag gacaagegeg gcetteaceaa gcetegtetac ca- gaacatct

541 tcaccegccat gcaggccatg atcegggeca tggagacgct caagatcctc ta- caagtacg

601 agcagaacaa ggccaatgcg ctectgatee gggagataga cgtggagaag gtgaccacct

661 tcgagcatca gtacgtcagt gcecatraaga ccecctgtagga ggacceeggge atccaggaat

721 gctacgacceg caggegegag taccagcetet cegactetgc caagtactac ctgac- cgacg

781 ttgaccgcat cgccaccettg ggctacetgo ccacecagea ggacgtactg cggg- tcecgeg

841 tgcccaccac cggcatcatc gagtaccectt tegacetgga gaacatcatc ttecg- gatgg

901 tggatatagg gggcecagegg tceggagegga ggaagiggat ccactgcttt gagaacgtga

961 catccatcat gtttetegte gecctrageg aatacgacca agtcctagta gagtcg- gaca

1021 acgagaaccg gatggaggag agcaaagecc tatteecggac catcatcace taccectggt

1081 tccagaacte ctecgteate ctettectea acaagaagga ccetgctagag ga- caagatcc

1141 tgtactegca cctggtggac tactteceeg agttegatag tececcagegg gacg- cccagg

1201 caggcgcggga gttcatccta aagatgatteg tagacctgaa cccegacage ga- caagatca

1261 tctactcaca cttceacgtgt gccacegaca cggagaacat cegcettegta tteg- cggeeg

1321 tgaaggacac catcctgcag cteaaccetea aggagtacaa ccetagtetga gceg- cccagge

1381 ccagggagac gggatggaga cacggggcag gaccticett ccacggagec tgcggctgce

1441 gaggcagatag cactgcegag teegggecgg ggaccetetace cgcgggagga gatttttttt

1501 tttcatattt ttaacaaatg gtttttattt cacagttatc aggggatata catctetece

1561 tccgtacact tegegeacet teteacettt tateaacgge aaaggcagoc ttttt- ctgge

1621 ctigacttat goctcegcttt tttotaaaaa aaaaaaaaaa agaaagaaag aaaaaaagca

1681 acgaaacata aaacacacaa gcegcecegtg cecccagtga ctetgggcect ca- cagagcce

1741 cegecageca gcataggggec cegecetgea gecagicacg cgcececeaca cecgceagecec

1801 cegtggcetat cettecaace ceacgtgctt tttetttete ctaceegott cttttettea

1861 tcacaaaagg cgtggagact cggagacgga cgttttteoc cttttttaag ttattga- cge

1921 ccagegegec tegectettc acccatraac gcetgatacttt geceactaga ctcctgaaga

1981 gggggtaggag gactecetog gtegeecace ctaggaagtg cctaaccttt tattt-

tattt

2041 tatttttttg aggaaaaaga acgcctgact cacaggttga agaaacaccc tagg- cectet

2101 ctcatggcceg gatteceegt cectetacag aggctgaggaa gggtecccegg gceta- gagcca

2161 cgggggcttc tetaggactat gccteegggg ccaacactag ctacttigggg ctg- ccegggg

2221 actccagagg gctgcacgge caccecectgece tagctagage gcecaceceace ggagcecacg

2281 tgggctaggc gactagagag atggtccocc ggatgacacta ggagaaaggc cacttggatg

2341 goagacatttc tattttattc cactttatga tatcaccaat ttggaaacag cgaggg- tagg

2401 tggggacttit tacagaatat tctcaggtgt gtaccecgaga ggcagagaga ggga- cgtgge

2461 cgogcagctet gtgcgtagec ttgtcccaag cacttigegec cgececegag cgcegecece

2521 ggggagcggg aagccagcac tegcactttg gccaggggeg cgatagaagat ggtggcagge

2581 accggcctag gcagettcea ggectggetg gecacgaceca cggcecegagg gggagecege

2641 caggccacgc cgcactgage cacageceeg ggggcegect cceggggece cttgaggcac

2701 tgaggcaccg agactagttc teccegagag acteggaagg tggggaacga ggggacigtg

2761 tttgggagagg tagcettttto gtctactatt gactgaacac tacagegecc tatagtt- ccg

2821 ggocttcgcac agctgtecca gggatagatc gcectatacta ccettegeceg ceg- ccacacc

2881 gagaccctgc acggctgactt ctggcctega cagatgacaa aagaaacagc cccaaaatac

2941 gaccactcca accagcagtt ccegectgee tgccegecac tatcaggccet gecetggect

3001 cctegtcege agggctatet gctaggettct ggggageagaa gagcggggag ccecegtggaa

3061 gogtcagggg agaccaggtc agggcageta catttctggt gatcageceo atggggagac

3121 ggggctageg ggatacccec cececeggrett ccecacaccea cttetatete ac- cceggaage

3181 gtcetttttt tatgccaggt gtctacctaa gagggttagt gccagaagec ccecatggeg

3241 agtgctggag cceggcegagta ccctaggagga gcagataggg ccacceectgg cagggcegcet

3301 acaacctttt ccagcagegg agcccetetag gagaccetata cttgtggcat ctctgaggge

3361 ctagattgca caaggtgacc tggccegtage ctgagggtag agitcgcccag cacgcaggce

3421 ggggcgctac gaggctaagt attaggcctt ccecagggagg gggegtgcca ag- catcccag

3481 agccegggcta ggacegecaa aacgtegtgg ccetagatect ctagggatetga gtg- cetgatec

3541 ccecectgecoco caaaaaagca gaggtaggata ttgcaggece agggcaggagg tgcctgecee

3601 aggagagtcc caggcagtag ttctegtgace agtggcaccc aggggcaagg acagccaacc

3661 ccecacecetta ccacgtatag ggccacgtag gcatatagag tatatatttt tac- cttggtg

3721 aatctcacct gccaacgatt tetegtgagt gecegacceace tteteegace atgt- tacgcc

3781 cgggcggcag cagceceegg ccactgcaaa ccecatgecet gggtcececg gctececeag 3841 ggaggcatcc cegtgccaat gtccccecagt gatagcagea gatcectatag ceggectgge 3901 ggacgggacc cagtgatact tatatattac acagtcctga tttcagacaa ttt- caacctt 3961 aatctattta aaaaagaata ttctatacaa gctgttttta agccttttac catttgaaat 4021 gcatgtatta tacacattag ggataggagg aggggctgag gagceggctea gtat- cacete 4081 ccacagccac cggcecectgac cettaateca gacacegatag gaagtegact ttt- catatct 4141 ttctcctgaa atgaactctg ttttaaatta gaataaattt tattectaaa

[00101] "Tumor" se refere a crescimento e proliferação celular neo- plásica, maligno ou benigno, e todas as células e tecidos pré- Cancerosos e cancerosos.

[00102] A expressão "atividade antitumoral" significa uma redução na taxa de proliferação, viabilidade ou atividade metastática da célula tumoral. Por exemplo, atividade antitumoral pode ser evidenciada por um declínio na taxa de crescimento de células anormais que surge du- rante a terapia ou estabilidade ou redução do tamanho do tumor, ou sobrevivência prolongada devido à terapia, em comparação com con- trole sem terapia. Tal atividade pode ser avaliada usando modelos tu- morais in vitro ou in vivo aceitos, incluindo, porém sem limitação, mo- delos de xenoenxerto, modelos de aloenxerto, modelos MMTV e ou- tros modelos conhecidos, conhecidos na técnica de investigação da atividade antitumoral.

[00103] O termo "malignidade" se refere a um tumor não benigno ou um câncer. Como usado no presente documento, o termo "câncer" inclui uma malignidade caracterizada por crescimento celular desregu- lado ou descontrolado. Exemplos de câncer incluem: carcinomas, sar- comas, leucemias e linfomas.

[00104] O termo "câncer" inclui tumores malignos primários (por exemplo, aqueles cujas células não migraram para locais do corpo do sujeito diferentes do local do tumor original) e tumores malignos se- cundários (por exemplo, aqueles que surgem a partir de metástase, da migração de células tumorais para locais secundários diferentes do local do tumor original).

[00105] O termo "PMEL1I7” (também chamado de proteína pré- melanossoma (PMEL), D12S53E, ME20, MEZ20-M, MEZ2OM, P1, P100, gp100, SI, SIL e homólogo de proteína de locus de prata (SILV)) se refe- re a uma proteína transmembranar Tipo | de passagem única produzida por melanócitos e envolvida na síntese de melanina. As sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos de PMEL17 humano foram publicadas no GenBank com os seguintes números de acesso: NP 008859, NP 001307050, NP 001307051, NP 001186982, NP 001186983 (sequências de aminoácidos) e NM 006928, NM 001200053, NM 001200054, NM 001320121, NM 001320122 (sequências de nu- cleotídeos). Como usado no presente documento, o termo "PMEL17" é usado para se referir coletivamente a todas as isoformas de ocorrência natural de proteína PMEL17 ou uma variante da mesma.

[00106] NP 008859 (SEQ ID NO:272) 1 mdilvlkrcll hlavigalla vgatkvprng dwlgvsrqlr tkawnrqlyp ewteagqrlde 61 wragavslkv sndgptliiga nasfsialnf posqkvipda qviwvnntii ngsqvwggqap 121 vypgetddac ifpdggpcps gswsqkrsfv yvwktwgqgyw qviggpvsal sig- tgramlg 181 thtmevtvyh rrasrsyvpl ahsssaftit dgvpfísvsvs glraldggnk hflrngpltf 241 alqglhdpsgy laeadisytw dfgdssgtli sralvvthty lepgpvtaqv vigaaiplts 301 cagsspvpgatt dghrptaeap nttagqgvptt evvatipgga ptaepsgttis vqvpt- tevis 361 tapvamptae stgmtpekvp vsevmgttla emstpeatgm tpaevsivvl sgt-

taaqvtt 421 tewvettare Ipipepegpd assimstesi taslaplidg tatlirlvkra vpldevlyry 481 gsfsvtidiv qgiesaeilg avpsgegdaf eltvscaggl pkeacmeiss pgcappaqr! 541 cqapvlpspac qlvlhgailkg gsgtyclnvs ladtnslavv staglimpgge aglgqv- pliv 601 gillvimavv lasliyrrrl mkgdfsvpal phssshwlrl prifescpig ensplisggqg 661v

[00107] NP 001307050 (SEQ ID NO:273) 1 mdilvlkrcll hlavigalla vgatkvprng dwlgvsrqlr tkawnrqlyp ewteagqrlde 61 wragavslkv sndgptliiga nasfsialnf posqkvipda qviwvnntii ngsqvwggqap 121 vypgetddac ifpdggpcps gswsqkrsfv yvwktwgqgyw qviggpvsal sig- tgramlg 181 thtmevtvyh rrasrsyvpl ahsssaftit dgvpfísvsvs glraldggnk hflrngpltf 241 alqglhdpsgy laeadisytw dfgdssgtli sralvvthty lepgpvtaqv vigaaiplts 301 cagsspvpgatt dghrptaeap nttagqgvptt evvatipgga ptaepsgttis vqvpt- tevis 361 tapvamptae staagqvttte wvettarelp ipepegpdas simstesitg slg- plldgta 421 tIrlvkrqvp Idcvlyrygs fsvtidivag iesaeilgav psgegdafel tvscagglpk 481 eacmeisspg cappaqricq pvipspacal vihgailkggs gtyclnvsla dtns- lavvst 541 qlimpvpgil Itageagiga vplivaillv Imavvlasli yrrrimkqadf svpalphsss 601 hwlrlprife scpigenspl Isggqv

[00108] NP 001307051 (SEQ ID NO:274) 1 mdilvlkrcll hlavigalla vgatkvprnq dwlgvsrqlr tkawnrqglyp ewteaqride 61 wragavslkv sndgptliiga nasfsialnf posqkvipda qviwvnntii ngsqvwggqap 121 vypgetddac ifpdggpcps gswsqkrsfv yvwktwgqgyw qviggpvsal sig-

tgramlg 181 thtmevtvyh rrasrsyvpl ahsssaftit dgvpfísvsvs glraldggnk hflrngpltf 241 alqglhdpsgy laeadisytw dfgdssgtli sralvvthty lepgpvtaqv vigaaiplts 301 cagsspvpgatt dghrptaeap nttagqgvptt evvatipgga ptaepsgttis vqvpt- tevis 361 tapvamptae staagqvttte wvettarelp ipepegpdas simstesitg slg- plldgta 421 tIrlvkrqvp Idcvlyrygs fsvtidivag iesaeilgav psgegdafel tvscagglpk 481 eacmeisspg cappaqricq pvipspacal vihgailkggs gtyclnvsla dtns- lavvst 541 qlimpggeag Igqvplivgi Ilvimavvla sliyrrrimk qdfsvpalph ssshwlrlpr 601 ifescpigen splisggqv

[00109] NP 001186982 (SEQ ID NO:275) 1 mdlvlkrcll hlavigala vgatkgsqvw ggqgpvypget ddacifpdgg pcpsgswsqk 61 rsfvyvwktw gqaywavlggp vsglsigtagr amlgthtmev tvyhrrasrs yv- plahsssa 121 ftitdqvpfs vsvsalrald ggnkhflrng pltfalglhd psgylaead! sytwdfgdss 181 gtlisralvv thtylepgpv taqvvigaai pltscgsspv pattdghrpt aeapnttagq 241 vpttevvatt pggaptaeps gttsvqavptt evistapvgm ptaestamtp ekv- pvsevmg 301 ttlaemstpe atgmtpaevs ivvIsgttaa qvtttewvet tarelpipep egpdas- sims 361 tesitaslgp Ildgtatlrl vkrqgvpldev Iyrygsfsvt Idivagiesa eilgavpsge 421 gdafeltvsc qgglpbkeacm eisspgcapp aqricgpvip spacalviha ilkgagsgtyc 481 Invsladtns lavvstglim pggeaglggv plivgillvi mavvlasliy rrimkgdfs 541 vpalphsssh wiIrlprifes cpigenspll sagqv

[00110] NP 001186983 (SEQ ID NO:276) 1 mdilvlkrcll hlavigalla vgatkvprng dwlgvsrqlr tkawnrqlyp ewteagqrlde

61 wragavslkv sndgptliiga nasfsialnf posqkvipda qviwvnntii ngsqvwggqap 121 vypgetddac ifpdggpcps gswsqkrsfv yvwktwgqgyw qviggpvsal sig- tgramlg 181 thtmevtvyh rrasrsyvpl ahsssaftit dgvpfísvsvs glraldggnk hflrngpltf 241 alqglhdpsgy laeadisytw dfgdssgtli sralvvthty lepgpvtaqv vigaaiplts 301 cagsspvpgatt dghrptaeap nttagqgvptt evvatipgga ptaepsgttis vqvpt- tevis 361 tapvamptae stgmtpekvp vsevmgttla emstpeatgm tpaevsivvl sgt- taaqvtt 421 tewvettare Ipipepegpd assimstesi taslaplidg tatlirlvkra vpldevlyry 481 gsfsvtidiv qgiesaeilg avpsgegdaf eltvscaggl pkeacmeiss pgcappaqr! 541 capvlpspac qlvlhailkg gsgtyclnvs ladtnslavv stglimpvpg illtageag! 601 gavplivgil Ivimavvlas liyrrrimkq dfsvpalphs sshwlIrlpri fescpigens 661 pllsagqv

[00111] NM 006928 (SEQ ID NO:277) 1 cccagegete cteceegeaa atgatecege cceaggggoec tatcecagte cececag- tge 61 ctttagttaoc tagagggaag aacacaatgg atctggtgct aaaaagatgac cttett- catt 121 taggctataat aggtacttta ctagctatag gggctacaaa agtacccaga aacca- ggact 181 gocttggtgt ctcaaggcaa ctcagaacca aagcctggaa caggcagceta ta- tccagagt 241 ggacagaagc ccagagactt gactgctgga gaggtagtca agtgtecctce aagg- tcagta 301 atgatgggcc tacactgatt ggtgcaaatg cctecttete tattgceetta aactteccta 361 gaagccaaaa ggtattgcca gataggcagg ttatctgggt caacaatacc atcat- caatg

421 ggagccaggt gtggagagga cagccagtgt atccccagga aactgacgat gcctgcatet

481 tccctgatag tagaccttgc ccatetaget cttggtetea gaagagaagc tttatttatg

541 tctggaagac ctggggccaa tactggcaag ttcetaggggg cccagtatct ggg- ctgagca

601 ttgggacagg cagggcaatg ctgggcacac acaccatgga agtgactgatc tac- catcgec

661 ggggatcceg gagctatata cctettacete atteccagete agecttcace attac- tgacc

721 aggtgaccttt ctecgtgage gtgteccagt tacagacctt ggatagaggg aacaag- cact

781 tcctgagaaa tcagcectetg accetttacee tecageteca tgaceccagt ggacta- tctgg

841 ctgaagctga ccteteetac acctgggact tiggagacag tagtggaace ctgatctcte

901 gggcacttgat ggtcactcat acttacctgg agcctggecoc agtcactgce caggtag- tee

961 tgcaggctac cattccetete acetectgta getectecoc agttecagge accaca- gatg

1021 ggcacaggcc aactgcagag gcecccetaaca ccacagetgg ccaagtgccet actacagaag

1081 ttgtaggtac tacacctggt caggegecaa ctgcagagec ctetggaace aca- tctgtge

1141 aggtgccaac cactgaagtc ataagcactg cacctgtgca gatgccaact gca- gagagca

1201 caggtatgac acctgagaag gtgccagttt cagaggtcat gggtaccaca ctgg- cagaga

1261 tgtcaactcc agaggctaca ggtatgacac ctgcagagagt atcaattagta gtg- ctttcta

1321 gaaccacagc tgcacaggta acaactacag agtgggtaga gaccacagct agagagctac 1381 ctatccctga gcctgaaggt ccagatgcca gcteaatceat gtctacggaa agtat- tacag 1441 gttcectagg cecectgcta gatggtacag ccaccttaag gctagtgaag aga- caagtce 1501 cectggattg tattctatat cgatatggtt ccttttecgt cacccetaggac attgtecagg 1561 gtattgaaag tgccgagatc ctgcaggactg taccgtcegg tgagagagat gcatttgagec 1621 tgactgtgtc ctgccaagge gagcetgcecca aggaagectg catggagatc tcatcgecag 1681 ggtgccagec cectgeecag cagetatace agcctatact acccagecea gcectgecage 1741 toagttctaca ccagatactg aagggtagct cgggagacata ctgcctcaat gtg- tctetgg 1801 ctgataccaa cagcctagca gtggtcagca cecagcettat catgcctggt caa- gaagcag 1861 gccttaggca gatteegcta atcgtgggca tettgctagt gttgataget gtgg- tecttg 1921 catctctgat atataggcgc agacttatga agcaagactt ctccegtacec cagttg- ccac 1981 atagcagcag tcactagcta cgtetacece goeatetteta ctettateco attgg- tgaga 2041 acagcceceeoct cceteagtagg cagcaggtet gagtactete atatgatgact gtgattttcc 2101 tggagtigac agaaacacct atatttcccc cagtettece taggagacta ctat- taactg 2161 aaataaatac tcagagcctg aaaaaaaaaa aaaaa

[00112] NM 001200053 (SEQ ID NO:278) 1 gggcctatco cagtececec agtaccttta gttactggag ggaagaacac aatgga- teta

7T1/344

61 gtgctaaaaa gatgccttct teatttaget gtgataggtga ctttactage tatagggact

121 acaaaaggga gccaggtata gggaggacag ccagtatate cccaggaaac tgacgatgcc

181 tgcatcttcc ctgatagtgg accttgecoca tetggctett ggteteagaa gagaagottt

241 gtttatatct ggaagacctg gggccaatac tggcaagttc tagggggecc agtg- tctggg

301 ctgagcattg ggacaggcag ggcaatgctg ggcacacaca ccatggaagt gac- tatcetac

361 catcgceggg gatccceggag ctatagtacct cttgcteatt ccagcteage ctteac- catt

421 actgaccagg tgcctttcte cgatagagegta teccagttgc gggectigga tagagg- gaac

481 aagcacttcc tgagaaatca gectetgace tttgceeteo agetecatga ceccag- tgge

541 tatctggctg aagctgacct ctectacace taggacttta gagacagtag tggaac- cctg

601 atctcteggg cacttgtggt cactcatact tacctggage ctggcccagt cactg- cccag

661 gtagtcctac aggctgccat tecteteace tectataget ccetececagt tecagg- cacc

721 acagatgggc acaggccaac tgcagaggcc cetaacacca cagcectggeca ag- tgcctact

781 acagaagttg taggtactac acctggtcag gegecaactg cagagceccete taga- accaca

841 tctgtacagg tgccaaccac tgaagicata agcactgcac ctgtgcagat gcecaactgca

901 gagagcacag gtatgacacc tgagaaggtg ccagttteag aggtcatggg tac- cacactg

961 gcagagatgt caactccaga ggctacaggt atgacacctg cagaggtatc aattg- tagtg

1021 ctttctggaa ccacagctgc acaggtaaca actacagagt gggtggagac ca- cagctaga 1081 gagctaccta tccctgagec tagaaggteca gatgccagcet caatcatgte tacg- gaaagt 1141 attacaggtt ccctgggece cctactggat ggtacageca ccttaaggact ggtgaagaga 1201 caagtceeccc tggattgtat tetatatega tatggttoct tttecgteac ccetagacatt 1261 gtccagggta ttgaaagtgc cgagatccta caggctatac cgtecggtaa gggg- gatgca 1321 tttgagctga ctgtgtcctga ccaaggeggg ctgcccaagg aagcctgcat gga- gatctca 1381 tegeccagggt gecagececoe tacecagegg ctgtgccago ctatactacc cag- cccagece 1441 tgccagctgg ttctgcacca gatactgaag ggtaggctegg ggacatactg cct- caatgato 1501 tctetggctag ataccaacag cctagcagtg gtcagcaccec agcettateat gectgg- tcaa 1561 gaagcaggcc ttgaggcagat tecgctgatce gtaggcatet tactagtatt gatgg- ctgtg 1621 gtccttacat ctctgatata taggcgcaga cttatgaage aagacttctc cgtac- cccag 1681 ttgccacata gcagcagtca ctagctgcgt ctacccegca toettetacte ttg- teccatt 1741 ggtgagaaca gccceceetect cagtigggeag caggtetgag tacteteata tgatgctata 1801 attttcctgg agttgacaga aacacctata tttcceccag tettecetag gagac- tacta 1861 ttaactgaaa taaatactca gagcctgaaa aaaaaaaaaa aa

[00113] NM 001200054 (SEQ ID NO:279)

1 ggagcctatco cagtcecece agtaccettta gttactggag ggaagaacac aatgga- teta

61 gtgctaaaaa gatgccttct teatttaget gtgataggtga ctttactage tatagggact

121 acaaaagtac ccagaaacca ggactgagcett ggtatctcaa ggcaactcag aac- caaagcc

181 tggaacaggc agctgtatcc agagtggaca gaagcccaga gacttigacta ctg- gagaggt

241 ggtcaagtgt cccteaaggt cagtaatgat gggcctacac tgattagtgc aaatg- cetec

301 ttctcetattg ccttgaactt ccctggaage caaaaggtat taccagatag gcagat- tatc

361 tgggtcaaca ataccatcat caatagggagc caggtatagg gaggacagcec agta- tatcce

421 caggaaactg acgatgcctg catctteect gatagtagac cttgcccatc tgg- ctcttgg

481 tctcagaaga gaagctttat ttatatetgg aagacctggg gccaatactg gcaagtt- cta

541 gggggcecag tatetaggct gagcattagg acaggcaggg caatgctggg ca- cacacacc

601 atggaagtga ctgtctacca tegeegggga teceggaget atgtacctet tact- cattcc

661 agctcagccet teaccattac tagaccaggta ccetttetecg taagegtate ccagttg- cgg

721 gcctiggatga gagagaacaa gcacttcctg agaaatcage ctetgacett tgcectecag

781 ctccatgace ccagtageta tetggctgaa gctgaccetet ccetacaceta ggac- tttgga

841 gacagtagtg gaaccctgat ctctegggca cttgtagtca cteatactta cctagag- cet

901 ggcccagtca ctgcccaggt gatectacag goetgccattc cteteacete ctatag-

T4/344 ctec

961 tcecccagtte caggcaccac agatgggcac aggcecaactg cagaggcccoc taa- caccaca

1021 gctggccaag tgacctactac agaagttatga ggatactacac ctaggtcagge gcecaactgca

1081 gagccctetg gaaccacatc tatacaggtg ccaaccactg aagtcataag cac- tgcacct

1141 gtgcagatgc caactgcaga gagcacaggt atgacacctg agaaggtacc ag- tttcagag

1201 gtcataggta ccacactggc agagatgtca actccagagg ctacaggtat ga- cacctgca

1261 gaggtatcaa ttgtggtact ttectggaacc acagctgcac aggtaacaac taca- gagtgg

1321 gtggagacca cagctagaga gctacctatc ccectgagectg aaggtecaga tgccagctca

1381 atcatgtcta cggaaagtat tacaggttcce ctaggeeecec tactggatag tacag- ccacc

1441 ttaaggctgg tgaagagaca agtcececetga gattatattc tatategata tagtt- coettt

1501 tecgteacec tagacattgt ccagggtatt gaaagtgcceg agatcctgca ggcta- tgcceg

1561 tccggtaagg gogatacatt tgagctgact gtgtcctace aaggeggget gcccaaggaa

1621 gcctagcatgg agatctcatc gccagggtagc cagcececeecetg cceageggct gta- ccagccet

1681 gtgctaccca gceccagectg ccagcetagtt ctacaccaga tactgaaggag tgg- ctegggg

1741 acatactgcc tcaatgtgtc tetggctgat accaacagcc taggcagtggt cag- cacccag

1801 cttatcatgc ctatacctag gattcttete acaggtcaag aagcaggcct taggca-

gatt 1861 cegcetgatcg tagacatett gctagtatta atggctatag tecttgcato tetgatatat 1921 aggcgcagac ttatgaagca agacttcetcc gtaccecagt taccacatag cag- cagtcac 1981 tggctgcatce tacccegceat cttcetactet totcocattg gigagaacag cecectecte 2041 agtgggcagc aggtctgagt actctcatat gatgctatga ttttcctgga gttgaca- gaa 2101 acacctatat ttcccecagt cttecctagg agactactat taactgaaat aaatact- cag 2161 agcctgaaaa aaaaaaaaaa a

[00114] NM 001320121 (SEQ ID NO:280) 1 ggagcctatco cagtcecece agtaccettta gttactggag ggaagaacac aatgga- teta 61 gtgctaaaaa gatgccttct teatttaget gtgataggtga ctttactage tatagggact 121 acaaaagtac ccagaaacca ggactgagcett ggtatctcaa ggcaactcag aac- caaagcc 181 tggaacaggc agctgtatcc agagtggaca gaagcccaga gacttigacta ctg- gagaggt 241 ggtcaagtgt cccteaaggt cagtaatgat gggcctacac tgattagtgc aaatg- cetec 301 ttctcetattg ccttgaactt ccctggaage caaaaggtat taccagatag gcagat- tatc 361 tgggtcaaca ataccatcat caatagggagc caggtatagg gaggacagcec agta- tatcce 421 caggaaactg acgatgcctg catctteect gatagtagac cttgcccatc tgg- ctcttgg 481 tctcagaaga gaagctttat ttatatetgg aagacctggg gccaatactg gcaagtt- cta 541 gggggcecag tatetaggct gagcattagg acaggcaggg caatgctggg ca-

cacacacc

601 atggaagtga ctgtctacca tegeegggga teceggaget atgtacctet tact- cattcc

661 agctcagccet teaccattac tagaccaggta ccetttetecg taagegtate ccagttg- cgg

721 gcctiggatga gagagaacaa gcacttcctg agaaatcage ctetgacett tgcectecag

781 ctccatgace ccagtageta tetggctgaa gctgaccetet ccetacaceta ggac- tttgga

841 gacagtagtg gaaccctgat ctctegggca cttgtagtca cteatactta cctagag- cet

901 ggcccagtca ctgcccaggt gatectacag goetgccattc cteteacete ctatag- ctec

961 tcecccagtte caggcaccac agatgggcac aggcecaactg cagaggcccoc taa- caccaca

1021 gctggccaag tgacctactac agaagttatga ggatactacac ctaggtcagge gcecaactgca

1081 gagccctetg gaaccacatc tatacaggtg ccaaccactg aagtcataag cac- tgcacct

1141 gtgcagatgc caactgcaga gagcacagct gcacaggtaa caactacaga gtgggtagag

1201 accacagcta gagagctacc tatccectgag ccectgaaggtc cagatgccag ctcaatcatg

1261 tctacggaaa gtattacagg ttecctagggc cecetgcetag atggtacage cacct- taagg

1321 ctggtgaaga gacaagtecc cetggattgt gttctatatc gatatggttc cttttecgte

1381 accctaggaca ttgtccaggg tattgaaagt gccegagatcc tacaggctat gccg- tcecggt

1441 gagggggatg catttgagct gactatatec taccaaggeg ggctgcecaa gga- agccetge

TTI344 1501 atggagatct catcgccagg gtgccageco cctgeccage ggctatgcca gectatacta 1561 cccagcececag cetgecagcet gattctacac cagatactga agggtagete ggg- gacatac 1621 tacctcaatg tatctetagc tgataccaac agcctggcag tagtcagcac ceagcet- tatc 1681 atgcctgtagc ctaggattct teteacaggt caagaagcag gcecttaggca gatt- cegetg 1741 atcgtgggca tettgctagt gttgatggct gtggtcctta catctetgat atataggege 1801 agacttatga agcaagactt ctcegtacec cagttgccac atagcagcag teac- tagctg 1861 cgtctacecc gcatetteta ctettateco attggtgaga acagcececcecet ceteag- tagg 1921 cagcaggtct gagtactctc atatgatgct gtgattttcc tagagttgac agaaaca- cet 1981 atattteccc cagtettece taggagacta ctattaactg aaataaatac tcagag- cctg 2041 a

[00115] NM 001320122 (SEQ ID NO:281) 1 gggcctatco cagtececec agtaccttta gttactggag ggaagaacac aatgga- teta 61 gtgctaaaaa gatgccttct teatttaget gtgataggtga ctttactage tatagggact 121 acaaaagtac ccagaaacca ggactgagcett ggtatctcaa ggcaactcag aac- caaagcc 181 tggaacaggc agctgtatcc agagtggaca gaagcccaga gacttigacta ctg- gagaggt 241 ggtcaagtgt cccteaaggt cagtaatgat gggcctacac tgattagtgc aaatg- cetec 301 ttctcetattg ccttgaactt ccctggaage caaaaggtat taccagatag gcagat- tatc

361 tgggtcaaca ataccatcat caatagggagc caggtatagg gaggacagcec agta- tatcce

421 caggaaactg acgatgcctg catctteect gatagtagac cttgcccatc tgg- ctcttgg

481 tctcagaaga gaagctttat ttatatetgg aagacctggg gccaatactg gcaagtt- cta

541 gggggcecag tatetaggct gagcattagg acaggcaggg caatgctggg ca- cacacacc

601 atggaagtga ctgtctacca tegeegggga teceggaget atgtacctet tact- cattcc

661 agctcagccet teaccattac tagaccaggta ccetttetecg taagegtate ccagttg- cgg

721 gcctiggatga gagagaacaa gcacttcctg agaaatcage ctetgacett tgcectecag

781 ctccatgace ccagtageta tetggctgaa gctgaccetet ccetacaceta ggac- tttgga

841 gacagtagtg gaaccctgat ctctegggca cttgtagtca cteatactta cctagag- cet

901 ggcccagtca ctgcccaggt gatectacag goetgccattc cteteacete ctatag- ctec

961 tcecccagtte caggcaccac agatgggcac aggcecaactg cagaggcccoc taa- caccaca

1021 gctggccaag tgacctactac agaagttatga ggatactacac ctaggtcagge gcecaactgca

1081 gagccctetg gaaccacatc tatacaggtg ccaaccactg aagtcataag cac- tgcacct

1141 gtgcagatgc caactgcaga gagcacagct gcacaggtaa caactacaga gtgggtagag

1201 accacagcta gagagctacc tatccectgag ccectgaaggtc cagatgccag ctcaatcatg

1261 tctacggaaa gtattacagg ttecctagggc cecetgcetag atggtacage cacct- taagg 1321 ctggtgaaga gacaagtecc cetggattgt gttctatatc gatatggttc cttttecgte 1381 accctaggaca ttgtccaggg tattgaaagt gccegagatcc tacaggctat gccg- tcecggt 1441 gagggggatg catttgagct gactatatec taccaaggeg ggctgcecaa gga- agccetge 1501 atggagatct catcgccagg gtgccageco cctgeccage ggctatgcca gectatacta 1561 cccagcececag cetgecagcet gattctacac cagatactga agggtagete ggg- gacatac 1621 tacctcaatg tatctetagc tgataccaac agcctggcag tagtcagcac ceagcet- tatc 1681 atgcctagtc aagaagcagg ccettgggcag gttecgcetga tegtaggcat ctta- ctggtg 1741 ttgatagcta tagtcctigc atctetgata tataggcgca gacttatgaa gcaagac- tte 1801 tceegtacecc agttgccaca tagcagcagt cactggctgc gtctaceceog catett- ctge 1861 tcttgtocca ttggtgagaa cageccececete cteagtggge agcaggteta agtac- tetea 1921 tatgatactg tgattttcct ggagttgaca gaaacaccta tatttecccoc agtettecet 1981 gggagactac tattaactga aataaatact cagagcctga

[00116] O termo "variante" se refere a um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica a um poli- peptídeo de referência ou que é codificado por uma sequência de nu- cleotídeos substancialmente idêntica e tem capacidade para ter uma ou mais atividades do polipeptídeo de referência. Por exemplo, uma variante pode ter cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com um polipeptídeo de referência, mantendo ao mesmo tempo uma ou mais atividades do polipeptídeo de referência.

[00117] Como usado no presente documento, os termos "tratar”, "que trata” ou "tratamento" de qualquer doença ou distúrbio se refe- rem, em uma modalidade, a melhorar a doença ou distúrbio (isto é, retardar, parar ou reduzir o desenvolvimento da doença ou pelo menos de um dos sintomas clínicos da mesma). Em outra modalidade, "tra- tar”, "que trata” ou "tratamento" se refere a aliviar ou melhorar pelo menos um parâmetro físico, incluindo aqueles que podem não ser dis- cerníveis pelo paciente. Em ainda outra modalidade, "tratar", "que tra- ta” ou "tratamento" se refere à modulação da doença ou distúrbio, fisi- camente (por exemplo, estabilização de um sintoma discernível), fisio- logicamente (por exemplo, estabilização de um parâmetro físico) ou ambas.

[00118] Como usado no presente documento, o termo "prevenir”, "que previne” ou "prevenção" de qualquer doença ou distúrbio se refe- re ao tratamento profilático da doença ou distúrbio; ou retardo do apa- recimento ou progressão da doença ou distúrbio.

[00119] A expressão "quantidade terapeuticamente aceitável" ou "dose terapeuticamente eficaz" se refere de forma intercambiável a uma quantidade suficiente para provocar o resultado desejado (isto é, uma redução do tamanho do tumor, inibição de crescimento do tumor, prevenção de metástase, inibição ou prevenção de infecção viral, bac- teriana, fúngica ou parasítica). Em algumas modalidades, uma quanti- dade terapeuticamente aceitável não induz nem provoca efeitos cola- terais indesejáveis. Em algumas modalidades, uma quantidade tera- peuticamente aceitável induz ou provoca efeitos colaterais, porém apenas os que são aceitáveis pelos prestadores de serviços de saúde tendo em vista o estado de saúde do paciente. Uma quantidade tera- peuticamente aceitável pode ser determinada primeiramente adminis-

trando-se uma baixa dose e, então, aumentando-se de modo incre- mental essa dose até o efeito desejado ser obtido. Uma "dosagem pro- filaticamente eficaz" e uma "dosagem terapeuticamente eficaz” das moléculas da invenção podem impedir o início ou resultar em uma di- minuição da gravidade, respectivamente, de sintomas da doença, in- cluindo sintomas associados a câncer.

[00120] O termo "coadministrar" se refere à presença de dois agen- tes ativos no sangue de um indivíduo. Os agentes ativos que são co- administrados podem ser simultânea ou sequencialmente entregues.

[00121] A presente invenção fornece anticorpos, fragmentos de an- ticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) e conjuga- dos de anticorpo dos mesmos, isto é, conjugados de anticorpo e fár- maco ou ADC's, que se ligam a PMEL17. Em particular, a presente in- venção fornece anticorpos e fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se ligam a PMEL17, e se in- ternalizam após tal ligação. Os anticorpos e fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) da presente inven- ção podem ser usados para produzir conjugados de anticorpo e fár- maco. Além disso, a presente invenção fornece conjugados de anti- corpo e fármaco que têm características farmacocinéticas desejáveis e outros atributos desejáveis e, dessa forma, podem ser usados para tratar ou prevenir um câncer que expressa PMEL17. A presente inven- ção fornece adicionalmente composições farmacêuticas que compre- endem os conjugados de anticorpo e fármaco da invenção e métodos de produção e uso de tais composições farmacêuticas para o trata- mento ou prevenção de câncer. Porção Química de Fármaco (D)

[00122] Em um aspecto, a porção química de Fármaco (D) do Con- jugado de Anticorpo e Fármaco da invenção é um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um inibidor de GNAQ e GNA11 (inibidor de

GNAQ/GNA11).

[00123] Em outro aspecto, a porção química de Fármaco (D) do Conjugado de Anticorpo e Fármaco da invenção é um inibidor de GNAQ.

[00124] Em outro aspecto, a porção química de Fármaco (D) do Conjugado de Anticorpo e Fármaco da invenção é um inibidor de GNA11.

[00125] Em outro aspecto, a porção química de Fármaco (D) do Conjugado de Anticorpo e Fármaco da invenção é um inibidor de GNAQ e GNA11 (inibidor de GNAQ/GNA11).

[00126] Em outro aspecto, a porção química de Fármaco do Conju- gados de Anticorpo e Fármaco da invenção é um composto que tem a estrutura da Fórmula (A): fi e, “. NH | Oo Sh A . + o e Ro

E o - (A), em que Ro, é metila ou etila, R: é metila ou i-propila, e R2 é metila ou etila.

[00127] Em outro aspecto, a porção química de Fármaco do Conju- gados de Anticorpo e Fármaco da invenção é um composto (A1) que tem a seguinte estrutura:

o

AA J mn NH | O O & 2

NO OR O

LX HO |

ES So (A1).

[00128] Em outro aspecto, a porção química de Fármaco do Conju- gados de Anticorpo e Fármaco da invenção é um composto (A2) que tem a seguinte estrutura: o

AA J mn, NH | O O

E v O 5 O o E O | . (A2).

[00129] Em outro aspecto, a porção química de Fármaco do Conju- gados de Anticorpo e Fármaco da invenção é um composto (A3) que tem a seguinte estrutura: o od, m. NH | Oo “ko ú Ás v Neo E o A HN,, ele. Ho |: ..s. o o (A3). A Tabela 1 fornece a atividade inibitória de compostos (A1), (A2) e (A3) obtida usando o ensaio descrito no Exemplo 5.

Tabela 1 " em atenção oo Porção Química de Ligante-Fármaco (La-(D)n)

[00130] Em um segundo aspecto, a porção química de Ligante- Fármaco, ((La-(D)n))), do Conjugados de Anticorpo e Fármaco da in- venção compreende uma ou mais porções químicas de Fármaco cova- lentemente fixadas a um ligante (La), em que a uma ou mais porções químicas de Fármaco são, cada uma, independentemente seleciona- das dentre um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um inibidor de GNAQ e GNA11 (inibidor de GNAQ/GNA11).

[00131] Em outro aspecto, a porção química de Ligante-Fármaco, ((La-(D)n))), do Conjugados de Anticorpo e Fármaco da invenção com- preende uma ou mais porções químicas de Fármaco covalentemente fixadas a um ligante (La), em que a uma ou mais porções químicas de Fármaco são, cada uma, independentemente selecionadas dentre um inibidor de GNAQ.

[00132] Em outro aspecto, a porção química de Ligante-Fármaco, ((La-(D)n))), do Conjugados de Anticorpo e Fármaco da invenção com- preende uma ou mais porções químicas de Fármaco fixadas a um |i- gante (La), em que a uma ou mais porções químicas de Fármaco são, cada uma, independentemente selecionadas dentre um inibidor de GNA11.

[00133] Em outro aspecto, a porção química de Ligante-Fármaco, ((La-(D)n))), do Conjugados de Anticorpo e Fármaco da invenção com-

preende uma ou mais porções químicas de Fármaco covalentemente fixadas a um ligante (La), em que a uma ou mais porções químicas de Fármaco são, cada uma, independentemente selecionadas dentre um inibidor de GNAQ e GNA11 (inibidor de GNAQ/GNA11).

[00134] Em outro aspecto, a porção química de Ligante-Fármaco, ((La-(D)n))), do Conjugados de Anticorpo e Fármaco da invenção com- preende uma ou mais porções químicas de Fármaco covalentemente fixadas a um ligante (La), em que o ligante (La) é um ligante clivável e a uma ou mais porções químicas de Fármaco são, cada uma, independen- temente selecionadas dentre um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um inibidor de GNAQ e GNA11 (inibidor de GNAQ/GNA11).

[00135] Em outro aspecto, a porção química de Ligante-Fármaco, ((La-(D)n))), do Conjugados de Anticorpo e Fármaco da invenção com- preende uma ou mais porções químicas de Fármaco covalentemente fixadas a um ligante (La), em que o ligante (La) é um ligante clivável e a uma ou mais porções químicas de Fármaco são, cada uma, inde- pendentemente selecionadas dentre um inibidor de GNAQ.

[00136] Em outro aspecto, a porção química de Ligante-Fármaco, ((La-(D)n))), do Conjugados de Anticorpo e Fármaco da invenção com- preende uma ou mais porções químicas de Fármaco covalentemente fixadas a um ligante (La), em que o ligante (La) é um ligante clivável e a uma ou mais porções químicas de Fármaco são, cada uma, inde- pendentemente selecionadas dentre um inibidor de GNA11.

[00137] Em outro aspecto, a porção química de Ligante-Fármaco, ((La-(D)n))), do Conjugados de Anticorpo e Fármaco da invenção com- preende uma ou mais porções químicas de Fármaco covalentemente fixadas a um ligante (La), em que o ligante (La) é um ligante clivável e a uma ou mais porções químicas de Fármaco são, cada uma, inde- pendentemente selecionadas dentre um inibidor de GNAQ e GNA11 (inibidor de GNAQ/GNA11).

[00138] Em outro aspecto, a porção química de Ligante-Fármaco, ((La-(D)n))), do Conjugados de Anticorpo e Fármaco da invenção com- preende uma ou mais porções químicas de Fármaco covalentemente fixadas a um ligante (La), em que o ligante (La) é um ligante não clivá- vel e a uma ou mais porções químicas de Fármaco são, cada uma, independentemente selecionadas dentre um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um inibidor de GNAQ e GNA11 (inibidor de GNAQ/GNA11).

[00139] Em outro aspecto, a porção química de Ligante-Fármaco, ((La-(D)n))), do Conjugados de Anticorpo e Fármaco da invenção com- preende uma ou mais porções químicas de Fármaco covalentemente fixadas a um ligante (La), em que o ligante (La) é um ligante não clivá- vel e a uma ou mais porções químicas de Fármaco são, cada uma, independentemente selecionadas dentre um inibidor de GNAQ.

[00140] Em outro aspecto, a porção química de Ligante-Fármaco, ((La-(D)n))), do Conjugados de Anticorpo e Fármaco da invenção com- preende uma ou mais porções químicas de Fármaco covalentemente fixadas a um ligante (La), em que o ligante (La) é um ligante não clivá- vel e a uma ou mais porções químicas de Fármaco são, cada uma, independentemente selecionadas dentre um inibidor de GNA11.

[00141] Em outro aspecto, a porção química de Ligante-Fármaco, ((La-(D)n))), do Conjugados de Anticorpo e Fármaco da invenção com- preende uma ou mais porções químicas de Fármaco covalentemente fixadas a um ligante (La), em que o ligante (La) é um ligante não clivá- vel e a uma ou mais porções químicas de Fármaco são, cada uma, independentemente selecionadas dentre um inibidor de GNAQ e GNA11 (inibidor de GNAQ/GNA11).

[00142] Em um aspecto, o ligante (La) da porção química de Ligan- te-Fármaco, ((La-(D)n))), do Conjugado de Anticorpo e Fármaco da in- venção tem a seguinte fórmula:

REDE A em que: X1 é um grupo de acoplamento bivalente; X2 é um espaçador autoimolativo; | x EL E xx QE xx To E E &odeo te i tz h=O0 Nono oo 7 h=0 Y é OoH OH OH ; OH ; AE | xx QE xx x MTO x A A = * “So ; Po Ro, “oo ou xo , em que o * de Y, indica o ponto de fixação a X> e o ** de Y1 indica o outro ponto de fixação; L, é um ligante peptídico bivalente; e L2 é uma ligação ou um ligante.

[00143] Em um aspecto, a porção química de Ligante-Fármaco, ((La-(D)n))), do Conjugado de Anticorpo e Fármaco da invenção tem a seguinte fórmula: E Mg x np em que: D é um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um ini- bidor de GNAQ e GNA11; X1 é um grupo de acoplamento bivalente; X2 é um espaçador autoimolativo; | A | RA E xx xx MANSA * ATA * | | —P= W P=o x —P= —P= Ao *grhzo Ag h=o to Y é OoH OH OH ; OH ; AE | xx QE xx x MTO x * Dx RR D A * “o ; Po Ro, “oo ou ão , em que o * de Y, indica o ponto de fixação a X> e o ** de Y1 indica o ponto de fixação a D; L, é um ligante peptídico bivalente; e L2 é uma ligação ou um ligante.

Compostos de Ligante-Fármaco (L-(D)n)

[00144] Em um aspecto, o Ligante-Fármaco da invenção é um composto que tem uma estrutura da Fórmula (B), ou estereoisômeros ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, Rº-Lg-(D)n (B) em que: D é um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um ini- bidor de GNAQ e GNA11; Rô é um grupo reativo; Lg é um ligante clivável ou ligante não clivável, e né 1,2,30ou4.

[00145] Em um aspecto, o Ligante-Fármaco da invenção que tem uma estrutura da Fórmula (B), ou estereoisômeros ou sais farmaceuti- camente aceitáveis do mesmo, em que D é um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um ini- bidor de GNAQ e GNA11; R$ é um grupo reativo; Lg é um ligante clivável que compreende um ou mais com- ponentes ligantes selecionados dentre um espaçador autoimolativo, um grupo fosfato, um grupo carbonato e um ligante peptídico bivalen- te,e né 1,2,30ou4.

[00146] Em um aspecto, o Ligante-Fármaco da invenção é um composto que tem uma estrutura da Fórmula (B-1), ou estereoisôme- ros ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, E o E) em que: D é um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um ini- bidor de GNAQ e GNA11; Rô é um grupo reativo;

X2 é um espaçador autoimolativo; No ue Es SARA * * Yi é o ; Porto ; oa ; ba ; AEE | + SE xx Qu * O * “Ro ; Ao o, o ou “o , em que o * de Y, indica o ponto de fixação a X> e o ** de Y1 indica o ponto de fixação a D; L, é um ligante peptídico bivalente; e L2 é uma ligação ou um ligante.

[00147] —Determinados aspectos e exemplos dos compostos de Li- gante-Fármaco da invenção são fornecidos na seguinte listagem de modalidades adicionais enumeradas. Será reconhecido que as carac- terísticas especificadas em cada modalidade podem ser combinadas com outras características especificadas para fornecer modalidades adicionais da presente invenção.

[00148] Modalidade 1. O composto da Fórmula (B) ou Fórmula (B- 1), ou estereoisômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que D é um inibidor de GNAQ.

[00149] “Modalidade 2. O composto da Fórmula (B) ou Fórmula (B- 1), ou estereoisômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que D é um inibidor de GNA11.

[00150] Modalidade 3. O composto da Fórmula (B) ou Fórmula (B- 1), ou estereoisômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que D é um inibidor de GNAQ e GNA11.

[00151] “Modalidade 4. O composto da Fórmula (B) ou Fórmula (B- 1), ou estereoisômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que D é o "C& | oo “Não e : E o A E Nº Ox se O Y” o “?

RETO em que Rº é metila ou etila, R' é metila ou isopropila, R? é metila ou etila, e o *** indica o ponto de fixação a Lg ou Y1.

[00152] Modalidade 5. O composto da Fórmula (B) ou Fórmula (B- 1), ou estereoisômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que D é o ol, mm. NH | Oo SO E, ”* eo oo A

NA O nº |: Ow" o "S xx do em que *** indica o ponto de fixação a Lg ou Y1.

[00153] “Modalidade 6. O composto da Fórmula (B) ou Fórmula (B- 1), ou estereoisômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que D é o À, CS oo Não ” Ty: ho E A

HINO H o [NS Y 1 o "S

RA em que *** indica o ponto de fixação a Lg ou Y1.

[00154] “Modalidade 7. O composto da Fórmula (B) ou Fórmula (B- 1), ou estereoisômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que D é o o, CE | oo >NnSo “e . Neo E A

ANA O Hg Oo | DÊ o o

ER TO em que *** indica o ponto de fixação a Lg ou Y1.

[00155] “Modalidade 8. O composto da Fórmula (B) ou Fórmula (B- 1), ou estereoisômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que tem a estrutura da Fórmula (B-2), ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo:

o A, mm. NH | Oo kR « >NSo sy. o o EE

HI AA O o | " : 2 RN o "e REL — E xo OH (B-2), em que: Rº é metila ou etila,; R' é metila ou isopropila; R? é metila ou etila, e X2, L1, Lo e Rô são como definido nos compostos da Fórmu- la (B-1) acima.

[00156] Modalidade 9. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-2), ou estereoisômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que tem a estrutura da Fórmula (B-2a), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: o e, “C | oo No das ho o CO

HI A O RH o [NS Afro " RS ZH P=o 2 om (B-2a), em que:

X2, L1, Lo e Rô são como definido nos compostos da Fórmu- la (B-1) acima.

[00157] “Modalidade 10. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-2), ou estereoisômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que tem uma estrutura de Fórmula (B-2b), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: o e, "1, NH | O O ek e us “ Se oo s HN,, elo. np ? |: DA: " RA bh, P=o POXA (B-2b), em que: X2, L1, Lo e Rô são como definido nos compostos da Fórmu- la (B-1) acima.

[00158] “Modalidade 11. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-2), ou estereoisômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que tem uma estrutura de Fórmula (B-2c), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: o

AA J PA NH | OO * O OO HN,, À TOS. à" o rã

TAS "q Rh P=o É <Q (B-20), em que:

X2, L1, Lo e Rô são como definido nos compostos da Fórmu- la (B-1) acima.

[00159] “Modalidade 12. O composto da Fórmula (B) ou Fórmula (B- 1), ou estereoisômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que tem a estrutura da Fórmula (B-3), ou um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo:

Í A y 1, NH | O. Oo ko sy e O ha HN,, NO Hg o | sh º Oo Peão (8-3), em que: Rº é metila ou etila,; R' é metila ou isopropila; R? é metila ou etila, e X2, L1, Lo e Rô são como definido nos compostos da Fórmu- la (B-1) acima.

[00160] Modalidade 13. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-3), ou estereoisômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que tem a estrutura da Fórmula (B-3a), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

XT “ko des No E o A i SS o RIA, (B-3a), em que: X2, L1, Lo e Rô são como definido nos compostos da Fórmu- la (B-1) acima.

[00161] “Modalidade 14. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-3), ou estereoisômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que tem a estrutura da Fórmula (B-3b), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: o

XT “vbho “ha No o CÊ A

HI AO Yo do RA, (8-3), em que: X2, L1, Lo e Rô são como definido nos compostos da Fórmu- la (B-1) acima.

[00162] Modalidade 15. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-3), ou estereoisômeros ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que tem a estrutura da Fórmula (B-3c), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: o e, CS | oo >NOSo sr so E o A

HI AO H o |: OA o, o

TX RE bi, TE xÊ ão (B-3o), em que: X2, L1, Lo e Rô são como definido nos compostos da Fórmu- la (B-1) acima.

[00163] “Modalidade 16. O composto da Fórmula (B-2) da Modalida- de 8, Fórmula (B-3) da Modalidade 12, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: em que: Rº é metila ou etila; R' é metila ou isopropila; R? é metila ou etila; XxX: é um espaçador autoimolativo selecionado den- > o x ID x O kt x [Da * *y *, tre H , H , H , * H H í K a 3 O a SN $ fx xd C fa %* DJ o o o o OH EA OH A or o HO. oH HO. OH HO. OH OH ; O OH ; OH e ud x o ot

TI o OH HO. OH O OH , em que o * de X> indica o ponto de fixação a Ly e o rs. | 37 h=0 ** de X2> indica o ponto de fixação ao grupo — OH ouo ponto de fixa- Sã ção ao grupo o. L, é um ligante peptídico bivalente que compreende 2 a 4 resíduos de aminoácidos; L2 é um ligante, o +O Rº é selecionado dentre O , -Nã -ONH - NRºC(=0)CH=CH, SH, -SSR'3, -S(=O0)(CH=CH>), - NRºS(=0)(CH=CH>), -NRºC(=0)CH2Br, -NRºC(=O0)CH2l, - Rº

NH

SEA NHC(=O)CH2Br, -NHC(=O0)CH2l, -C(=O)NHNH,>, O , -CO2H, -

F F. x F o” o O H já o N. O. AX o F A N AXO dn NH, OX É XR SO 2 temem

OR OR ak = OT OD Dre = R = Í ) Vo) TR 1-2 (Doo Cx + O N XxX é DAN:

(R)1.2 1 mm ou o ,em que: cada Rº é independentemente selecionado dentre H e C+1. Cealquila; cada Rº é independentemente selecionado dentre H, C1- Cealquila, F, Cl e -OH; cada R$ é independentemente selecionado dentre H, C1-C6 alquila, F, CI, -NH2, -OCH3, -OCH2CHs3, -N(CH3)2, -CN, -NO> e -OH, e cada R' é independentemente selecionado dentre H, Cr. salquila, fluoro, benzilóxi substituído por -C(=O0)OH, benzila substituída por —C(=O0)OH, Cair4alcóxi substituído por -C(=O0)OH e Crialquila substituída por -C(=0)OH.

[00164] “Modalidade 17. O composto de qualquer uma das Modali- dades 1 a 16, em que X> é um espaçador autoimolativo selecionado Oo x DI x SO x SIS Ay É * dentre H ; H , H , * | ; *H A Woo Es a à da í EA OH A or EH HO. oH HO. OH HO. OH OH ; O OH ; OH e 28 aa o o

TS o oH HO. OH O OH , em que o * de X> indica o ponto de fixação a Ly e o ** de X2 indica o ponto de fixação a Y1, o ponto de fixação ao grupo Sã - E o % e À OH ouo ponto de fixação ao grupo o.

[00165] “Modalidade 18. O composto de qualquer uma das Modali- *%. Ds dades 1 a 17, em que X? é H , em que o * de X> indica o ponto de fixação a L: e o ** de X> indica o ponto de fixação a Y1, o

AS ão ponto de fixação ao grupo “OH ouo ponto de fixação ao grupo o o.

[00166] Modalidade 19. O composto de qualquer uma das modali- dades 1 a 18, em que L, é um ligante peptídico bivalente que compre- ende 2 a 4 resíduos de aminoácidos.

[00167] “Modalidade 20. O composto de qualquer uma das Modali- dades 1 a 18, em que L, é um ligante peptídico bivalente que compre- ende um resíduo de aminoácido selecionado dentre valina, citrulina, lisina, isoleucina, fenilalanina, metionina, asparagina, prolina, alanina, leucina, triptofano e tirosina.

[00168] “Modalidade 21. O composto de qualquer uma das Modali- dades 1 a 18, em que L, é um ligante peptídico bivalente que compre- ende pelo menos um resíduo de valina (Val) ou citrulina (Cit).

[00169] Modalidade 22. O composto de qualquer uma das Modali- dades 1 a 18, em que L, é um ligante dipeptídico bivalente selecionado dentre ValCit, PheLys, ValAla e ValLys.

[00170] Modalidade 23. O composto de qualquer uma das Modali- dades 1 a 18, em que L, é um ligante dipeptídico bivalente selecionado * H O xx Woo Ma

NH dentre Nº (ValCit), Em (PheLys),

IEA Ho: Ho: (ValAla), NH2 (ValLys) e DA O ** FÊNTANAA, Hó:i wa O NHe(LeuCit), em que o * de L, indica o ponto de fixação a L2 e o ** de L1 indica o ponto de fixação a X>.

[00171] “Modalidade 24. O composto de qualquer uma das Modali- dades 1 a 18, em que L, é ValCit.

[00172] “Modalidade 25. O composto de qualquer uma das Modali- dades 1 a 18, em que

RAS Ho: Au L é NH (ValCit), em que o * de L; indica o ponto de fixa- ção a L2 e o ** de L1 indica o ponto de fixação a X..

[00173] Modalidade 26. O composto de qualquer uma das Modali- dades 1 a 25, em que L> é um ligante.

[00174] Modalidade 27. O composto de qualquer uma das Modali- dades 1 a 25, em que L> é um ligante selecionado dentre: -*C(=O)((CH2)mO))(CHa)wm**-, — -*C(=O)(CHa)J0m**-, — -*C(=O)(CH2)NHC (=O)(CH2)IÔ**-, -*C(=0)(CH2)mNHC(=O)((CH2)mO)p(CH2)m**-, - ((CH2)mO))(CH2)Im**-, -* ((CH2)mO))(CH2o)>w**-, -(CHa)Im-, -(CH2)m3NHC (=O)(CHa)9»W"*-, —-* (CHo)9mNHC(=O)(CH2)MC(=O)NH(CHa)9IW"*-, —-* ((CH2)mO))(CH2)mnNHC(=O)(CH2)Im**-, - *((CH2)mO),CH2)nmC(=O) NH(CH2)9JWw"*-, -* (CH2)MmC(R3)2**-, e -* (CHo)MC(R3):SS(CH2) NHC (=O)(CH2)m**-, em que o * de L> indica o ponto de fixação a Lr e 0 ** de L2 indica o ponto de fixação a Re;

e em que: cada R3 é independentemente selecionado dentre H e C1. Cealquila; cada m é independentemente selecionado dentre 1, 2, 3,4, 5,6,7,8,9e 10,e cada p é independentemente selecionado dentre 1, 2,3, 4, 5,6,7,8,9, 10, 11,12, 13 e 14.

[00175] “Modalidade 28. O composto de qualquer uma das Modali- dades 1 a 25, em que L> é -*C(=O)((CH2)mMO))(CH2)W**- ou - *C(=O)(CH2)Im**-, em que o * de L> indica o ponto de fixação a L1 e o ** de L2 indica o ponto de fixação a Re, e em que cada m é independentemente selecionado dentre 1,2,3,4,5,6,7,8,90u 10epé1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ou 14.

[00176] Modalidade 29. O composto de qualquer uma das Modali- * Arno” Fo *. dades 1 a 25, em que Lé O No ; * Fcis ou O , em que o * de L2 indica o ponto de fixação a L1 e o ** de L2 indica o ponto de fixação a Re.

[00177] Modalidade 30. O composto de qualquer uma das Modali- o + dades 1 a 29, em que Rº é O , -N3 -ONH2, -NRÍC(=O0)CH=CH,, SH, -SSR'"?, -S(=0)((CH=CH>), -NRÍS(=0).(CH=CH>), - NRºC(=O0)CH>2Br, -NRºC(=0)CH2l, -NHC(=0)CH2Br, -NHC(=O0)CHal, - Ré N H r F F e EA AOS O. C(=O)NHNH,>, o , -CO2H, -NH>, Fo, Fo

— RR ENTRE == EX. H P Y ANOO. (Ro, ÀON XE do LS (> 12 o o 2 eme AX RO ,

AR APNR JA JE (Ri2 (OX () É Xe JA Ou O N Ú( Y or Vo yr R , R ; Õ ou o ,em que: cada Rº é independentemente selecionado dentre H e C+1. Cealquila; cada Rº é independentemente selecionado dentre H, C1- Cealquila, F, Cl e -OH; cada Rº é independentemente selecionado dentre H, C1- Csealquila, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3, -N(CH3)2, -OCN, -NO> e -OH, e cada R' é independentemente selecionado dentre H, Cr. salquila, fluoro, benzilóxi substituído por -C(=O0)OH, benzila substituída por —C(=O0)OH, Cair4alcóxi substituído por -C(=O0)OH e Crialquila substituída por -C(=0)OH.

[00178] Modalidade 31. O composto de qualquer uma das Modali- o

F F +O PN. F oF , X o F Ao F dades 1 a 29, emque Ré — O ,-ONH>, E, F ou o à 1? o o.

[00179] “Modalidade 32. O composto de qualquer uma das Modali- o +O dades 1a29,emqueRºé O .

[00180] “Modalidade 33. O composto da Fórmula (B-2) da Modalida- de 8, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:

em que: Rº é metila ou etila; R' é metila ou isopropila; R? é metila ou etila; * Sr Xo É ÃO , em que o * de X> indica o ponto de o Ã£o fixação a L1 e o ** de X> indica o ponto de fixação ao grupo — OH ;

NH Li é nho (ValCit), em que o * de L1 indica o ponto de fixação a L2 e o ** de L1 indica o ponto de fixação a X>; x * SAPATO AOS o Lé o ou O , em que o * de L> indi- ca o ponto de fixação a L: e o ** de L> indica o ponto de fixação a Ra, e o + Ré O.

[00181] “Modalidade 34. O composto da Fórmula (B-3) da Modalida- de 12, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: em que: Rº é metila ou etila; R' é metila ou isopropila; R? é metila ou etila; . O *y Xé H , em que o * de X> indica o ponto de o fixação a L1 e o ** de X> indica o ponto de fixação ao grupo o. * H Oo

ELA Ho À o L é O NH2 (ValCit), em que o * de Li, indica o ponto de fixação a L2 e o ** de L1 indica o ponto de fixação a X>; * ek * AoA Ap Lé O ou O , em que o * de L> indica o ponto de fixação a L: e o ** de L2 indica o ponto de fixação a Ra, e o + Ré O.

[00182] “Modalidade 35. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-2), em que o composto é o o, CC | O 70 No duo v Neo o o

HAN ANO no |: OW" o “ o Ps, h o no DS” são CA, 9 o no Ss 8

HN mano (B1).

[00183] “Modalidade 36. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1)

ou Fórmula (B-2), em que o composto é o al, 1, NH | OO “ho Ve eu " Neo o o A HN,, elos nº? |

TA 9 o h º o nu 9 Da ns RA, o no 3 n

HN tndo (B2).

[00184] “Modalidade 37. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-2), em que o composto é o A, m. NH | Oo Sh ” Ás No o Oo A HN,, eles no |

A Y. ; o o o SI CA LA, o no > n

HN mao (B3).

[00185] “Modalidade 38. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-2), em que o composto é o e, m. NH | Quo “ko D. us ”* Ne oo A HN,, no nº? | O-“re" o E. Ps o o o DD” 1 AAA, o SN Ho o 2 mo HAN“ÃO (B4).

[00186] Modalidade 39. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-2), em que o composto é o ol, mm. NH | Oo ko Ve Ty ve Neo o o A

ANA O n 9 | NÃo o Ps o o o oo

RIAA LT Y H E io H . D

HN Ho (B5).

[00187] “Modalidade 40. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-2), em que o composto é o ed, m. NH | Oo “ho ” Ty - Neo E Oo A

ANA O no | O“fY o “e o o E) SP X o º 7 és HANÃO (B6).

[00188] Modalidade 41. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-3), em que o composto é 9 a, m NH | Oo “kh . DS ç Ne o o A HN, elo. nº | Oo“rf" o

A o 9 no O» o A IA, o no 3 À mm HAN “O (B7).

[00189] “Modalidade 42. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-3), em que o composto é o o, Mn, NH ! O O “ko ” Ds " Seo o o A HN,, elo no | ÃO: o o o À, o o oO “Oo

CAI LAIO o no > A

HN mando (B8).

[00190] “Modalidade 43. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-3), em que o composto é o A, tn, NH | OO “bo ” us v" Se o o A HN,, elo. no |

AO 9 o o A, A o H o Oo “o

CAIXAS o no S n

HN tmnÃão (B9).

[00191] “Modalidade 44. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-3), em que o composto é o el, “. NH | Oo “vo . eu ” Neo o o A HN,, ele. nu 9 |

AV

Ã o o O “o

AI q H o z H o > s HANTTO (B10).

[00192] “Modalidade 45. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-3), em que o composto é o od, “CS | oo no “ek = Leo E o A HN, o. E) |: Yo

AX o o o o “o

ASTRA Wi HD EH > J is HNÍTO (B11).

[00193] “Modalidade 46. O composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1) ou Fórmula (B-3), em que o composto é o a, m.Q NH | Oo Sho ” DO Neo o O HN,, NO Ox nn O 1

AI Oo

À o o Oo “o o " HaNTTO (B12). Conjugados de Anticorpo e Fármaco

[00194] Em um aspecto, o Conjugado de Anticorpo e Fármaco da invenção é um conjugado da Fórmula (C): Ab-(LA-(D)N)y (C) em que: D é uma porção química de fármaco; Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; La é um ligante; né 1,2,3ou4,e yé1,2,30ou4, em que a porção química de Ligante-Fármaco (La-(D)n) é covalentemente fixada ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo.

[00195] Em um aspecto, o Conjugado de Anticorpo e Fármaco da invenção que tem a estrutura da Fórmula (C), em que: D é um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um ini- bidor de GNAQ e GNA11; Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; La é um ligante clivável que compreende um ou mais com- ponentes ligantes selecionados dentre um espaçador autoimolativo, um grupo fosfato, um grupo carbonato e um ligante peptídico bivalen- te; né 1,2,3ou4,e yé1,2,30ou4, em que a porção química de Ligante-Fármaco (La-(D)n) é covalente- mente fixada ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[00196] Em um aspecto, o Conjugado de Anticorpo e Fármaco da Fórmula (C) é um conjugado da Fórmula (C-1): af) V e) em que: D é um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um ini- bidor de GNAQ e GNA11; Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; X1 é um grupo de acoplamento bivalente; X2 é um espaçador autoimolativo; | | QE xx SE xx Yié OH, OH , OH oH , O, | RA E xx 0 um * MO Por Ro, Ko ou o , em que o * de Y; indica o ponto de fixação a X> e o ** de Y1 indica o ponto de fixação a D; L, é um ligante peptídico bivalente; L2 é uma ligação ou um ligante, e yé1,2,30ou4.

[00197] Nos conjugados da Fórmula (C), uma ou mais porções químicas de Ligante-Fármaco (Lg-(D)n)) podem ser covalentemente fi- xadas ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, Ab, fixando assim covalentemente uma ou mais porções químicas de fármaco, D, ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, Ab, através do ligante, La. La é qualquer porção química que tem capacidade de ligar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, Ab, a uma ou mais porções químicas de fármaco, D. Os conjugados da Fórmula (C), em que uma ou mais porções quími- cas de fármaco, D, são covalentemente ligadas a um anticorpo ou fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo, Ab, podem ser formados usando um reagente de ligante bifuncional ou multifuncional que tem um ou mais grupos funcionais reativos que são iguais ou diferentes. Um dos grupos funcionais reativos do reagente de ligante bifuncional ou multifuncional é usado para reagir com um grupo no anticorpo ou fragmento de antígeno do mesmo, Ab, a título de exemplo, um tiol ou uma amina (por exemplo, uma cisteína, uma terminação N ou cadeia lateral de aminoácido como lisina) para formar uma ligação covalente com uma extremidade do ligante La. Tais grupos funcionais reativos do reagente de ligante bifuncional ou multifuncional incluem, porém sem limitação, uma maleimida, um tiol e um éster NHS. O outro grupo ou grupos funcionais reativos do reagente de ligante bifuncional ou multi- funcional são usados para fixar covalentemente uma ou mais porções químicas de fármaco, D, ao ligante La.

[00198] Em um aspecto, La é um ligante clivável. Em outro aspecto, La é um ligante não clivável. Em alguns aspectos, La é um ligante lábil a ácido, ligante fotolábila, ligante clivável por peptidase, ligante clivável por esterase, ligante clivável por glicosidase, ligante clivável por fosfo- diesterase, um ligante clivável por ligação de dissulfeto, um ligante hi-

drofílico ou um ligante à base de ácido dicarboxílico.

[00199] Em um aspecto, La é um ligante clivável que compreende um ou mais componentes ligantes selecionados dentre um espaçador autoimolativo, um grupo fosfato, um grupo carbonato e um ligante pep- tídico bivalente.

[00200] Em um aspecto, La é um ligante clivável que compreende um ou mais componentes ligantes selecionados dentre um espaçador autoimolativo, um grupo fosfato, um grupo carbonato, um grupo peptí- dico bivalente e um grupo de acoplamento bivalente.

[00201] Em um aspecto, La é um ligante clivável que compreende um ou mais componentes ligantes selecionados dentre um espaçador autoimolativo, um grupo fosfato e um ligante peptídico bivalente.

[00202] Em um aspecto, La é um ligante clivável que compreende um ou mais componentes ligantes selecionados dentre um espaçador autoimolativo, um grupo fosfato, um ligante peptídico bivalente e um grupo de acoplamento bivalente.

[00203] Em outro aspecto, o ligante (La) tem a seguinte fórmula:

ESSA em que: X1 é um grupo de acoplamento bivalente; X2 é um espaçador autoimolativo; Eis E não alo A * 2 P= E = SA = —P=: Yi é * e de, o da ; a o. eo eo QN xo MM x Ao o, oo ou o , em que o * de Y: indica o ponto de fixação a X>, e o ** de Y1 indica o outro ponto de fixação; L, é um ligante peptídico bivalente; e L2 é uma ligação ou um ligante.

[00204] Em outro aspecto, o ligante (La) tem a seguinte fórmula: Eng OA em que: X1 é um grupo de acoplamento bivalente; X2 é um espaçador autoimolativo; | A | RA Saba Es mm RO * =o =o P=: * 2 P=: x h=o Po o Ro o 37 h=0 Yé OH , OH , OH ou oH , em que o * de Y' indica o ponto de fixação a X>; L, é um ligante peptídico bivalente; e L2 é uma ligação ou um ligante.

[00205] Em outro aspecto, o ligante (La) tem a seguinte fórmula:

EDER em que: X1 é um grupo de acoplamento bivalente; X2 é um espaçador autoimolativo; AEE EL E xx 0% em xo MM x * > À rs E * Yné é 9, Foro, o o ou x&o , em que o * de Y' indica o ponto de fixação a X>; L, é um ligante peptídico bivalente; e L2 é uma ligação ou um ligante.

[00206] Embora a razão de fármaco para anticorpo tenha um valor inteiro exato para uma molécula de conjugado específica (por exem- plo, o produto de n e y na Fórmula (C), é entendido que o valor será frequentemente um valor médio quando usado para descrever uma amostra contendo muitas moléculas, devido a algum grau de hetero- geneidade, tipicamente associado à etapa de conjugação. O carrega- mento médio para uma amostra de um conjugado é referido no pre- sente documento como a razão entre fármaco e anticorpo ou "DAR".

Em alguns aspectos, a DAR está entre cerca de 1 e cerca de 5 e, tipi- camente, é cerca de 1, 2, 3 ou 4. Em alguns aspectos, pelo menos 50% de uma amostra em peso são compostos que tem a DAR médio mais ou menos 2 e, de preferência, pelo menos 50% da amostra são um conjugado que contém a DAR média mais ou menos 1. Outros as- pectos incluem conjugados em que a DAR é cerca de 2. Em alguns aspectos, uma DAR de "cerca de y” significa que o valor medido para DAR está dentro de 20% do produto de n e y na Fórmula (1). Em al- guns aspectos, uma DAR de "cerca de nº significa que o valor medido para DAR está dentro de 20% de n na Fórmula (ll).

[00207] Em um aspecto, a razão molar média do fármaco para o anticorpo nos conjugados da Fórmula (C) (ou seja, valor médio do produto de n e y, também conhecida como razão de fármaco para an- ticorpo (DAR)) é cerca de 1 a cerca de 10, cerca de 1 a cerca de 6 (por exemplo, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0), cerca de 1 a cerca de 5, cerca de 1,5 a cer- ca de 4,5, ou cerca de 2 a cerca de 4.

[00208] Em um aspecto fornecido pela revelação, o conjugado tem pureza substancialmente alta e tem uma ou mais das seguintes carac- terísticas: (a) maior que cerca de 90% (por exemplo, maior ou igual a cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%), de preferência, mais de cerca de 95%, de espécies de conju- gados são monoméricas, (b) nível de ligante não conjugado na prepa- ração de conjugado é menor que cerca de 10% (por exemplo, menor ou igual a cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou 0%) (em relação ao ligante total), (c) menos que cerca de 10% de espécies de conjugado são reticuladas (por exemplo, menor que ou igual a cer- ca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou 0%), (d) nível de fármaco livre (inibidor de agregação de plaquetas induzida por ADP, por exemplo, um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um ini- bidor de GNAQ e um inibidor de GNA11) na preparação de conjugado é menor que cerca de 2% (por exemplo, menor ou igual a cerca de 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1,0%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, ou 0%) (mol/mol em relação ao fármaco to- tal).

[00209] “Determinados aspectos e exemplos dos Conjugados de An- ticorpo-Fármaco da invenção são fornecidos na seguinte listagem de modalidades adicionais enumeradas. Será reconhecido que as carac- terísticas especificadas em cada modalidade podem ser combinadas com outras características especificadas para fornecer modalidades adicionais da presente invenção.

[00210] “Modalidade 47. O conjugado da Fórmula (C) ou Formula (C-1), em que D é um inibidor de GNAQ.

[00211] “Modalidade 48. O conjugado da Fórmula (C) ou Formula (C-1), em que D é um inibidor de GNA11.

[00212] “Modalidade 49. O conjugado da Fórmula (C) ou Fórmula (C-1), em que D é um inibidor de GNAQ e GNA11.

[00213] “Modalidade 50. O conjugado da Fórmula (C) ou Fórmula (C-1), em que D é

E o, e O O Sho DA * e o EO HN,, Nº O nO | o og a em que Rº é metila ou etila, R: é metila ou isopropila, R2 é metila ou etila, e o *** indica o ponto de fixação a La ou Y1.

[00214] “Modalidade 51. O conjugado da Fórmula (C) ou Fórmula (C-1), em que D é o À, “NH | Oo kh ). Tu ç Neo o o A

ANA O nO | Ooºr€” o "3 ae em que o *** indica o ponto de fixação a La ou Y1.

[00215] “Modalidade 52. O conjugado da Fórmula (C) ou Fórmula (C-1), em que D é o A, mM NH | Oo “ko v” D v Neo E Ro A

HI ANO nO? | E" o “o Aee | em que o *** indica o ponto de fixação a La ou Y1.

[00216] Modalidade 53. O conjugado da Fórmula (C) ou Fórmula (C-1), em que D é o a es | do nO So ” Lu Ne o CO

HI A O H o |: Ox o o “

ARE em que o *** indica o ponto de fixação a La ou Y1.

[00217] Modalidade 54. O conjugado da Fórmula (C) ou Fórmula (C-1), que tem a estrutura da Fórmula (C-2): o “o | oo NO So R ps ho E o A go

ANA RºN x o Yo " x. L =. ab Ig go

OH y (C-2), em que: Rº é metila ou etila; R' é metila ou isopropila; R? é metila ou etila; Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana;

X1 é um grupo de acoplamento bivalente; X2 é um espaçador autoimolativo; L, é um ligante peptídico bivalente; L2 é uma ligação ou um ligante, e yé1,2,3ou4.

[00218] “Modalidade 55. O conjugado da Fórmula (C) ou Fórmula (C-1), que tem a estrutura da Fórmula (C-2a): >.

XX ho Jd

ECO

HI A O A úro sl Ab go h=o

OH y (C-2a), em que: Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; X1 é um grupo de acoplamento bivalente; X2 é um espaçador autoimolativo; L, é um ligante peptídico bivalente; L2 é uma ligação ou um ligante, e yé1,2,3ou4.

[00219] “Modalidade 56. O conjugado da Fórmula (C) ou Formula (C-1), que tem a estrutura da Fórmula (C-2b):

o A A ; m. NE | Oo

E - O 9º | LX n o | DÃO:

O " ag Ãão ? OH , (C-2b), em que: Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; X1 é um grupo de acoplamento bivalente; X2 é um espaçador autoimolativo; L, é um ligante peptídico bivalente; L2 é uma ligação ou um ligante, e yé1,2,3ou4.

[00220] “Modalidade 57. O conjugado da Fórmula (C) ou Formula (C-1), que tem a estrutura da Fórmula (C-2c): Oo

AA J m. NH | Oo " Oo o OR O o | | HN,, eles np o 1

VI 9 o aa

OH y (C-2c), em que: Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; X1 é um grupo de acoplamento bivalente; X2 é um espaçador autoimolativo; L, é um ligante peptídico bivalente; L2 é uma ligação ou um ligante, e yé1,2,3ou4.

[00221] “Modalidade 58. O conjugado da Fórmula (C) ou Fórmula (C-1), que tem a estrutura da Fórmula (C-3): 7

XT bo R Tu: ho o PECA

ANA O E : o Ab Na o y (0-3), em que: Rº é metila ou etila; R' é metila ou isopropila; R? é metila ou etila; Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; X1 é um grupo de acoplamento bivalente; X2 é um espaçador autoimolativo; L, é um ligante peptídico bivalente; L2 é uma ligação ou um ligante, e yé1,2,3ou4.

[00222] “Modalidade 59. O conjugado da Fórmula (C) ou Fórmula (C-1), que tem a estrutura da Fórmula (C-3a):

E / NF. À Dog) | Ee | | TA / ed / y (C-3a), em que: Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; X1 é um grupo de acoplamento bivalente; X2 é um espaçador autoimolativo; L, é um ligante peptídico bivalente; L2 é uma ligação ou um ligante, e yé1,2,3ou4.

[00223] “Modalidade 60. O conjugado da Fórmula (C) ou Formula (C-1), que tem a estrutura da Fórmula (C-3b): o | H SSAA

DÃO o o ss | y (C-3b), em que:

Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; X1 é um grupo de acoplamento bivalente; X2 é um espaçador autoimolativo; L, é um ligante peptídico bivalente; L2 é uma ligação ou um ligante, e yé1,2,3ou4.

[00224] “Modalidade 61. O conjugado da Fórmula (C) ou Formula (C-1), que tem a estrutura da Fórmula (C-3c): Di eh ” we

LRC no | o o

A CAN , (C-3c), em que: Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; X1 é um grupo de acoplamento bivalente; X2 é um espaçador autoimolativo; L, é um ligante peptídico bivalente; L2 é uma ligação ou um ligante, e yé1,2,3ou4.

[00225] “Modalidade 62. O conjugado da Fórmula (C-2) da Modali- dade 54 ou do conjugado da Fórmula (C-3) da Modalidade 58: em que:

Rº é metila ou etila; R' é metila ou isopropila; R? é metila ou etila; Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; XxX: é um espaçador autoimolativo selecionado den- o x Ds x TOSA x Ão *. *. É tre H ; H , H , * H x H x H —N Jet 3 om 3 N Ao * 1º Sor A oH o Ho. oH Ho. oH Ho. oH OH ; O OH ; OH e 28 Fe

TI o oH HO. OH O OH , em que o * de X> indica o ponto de fixação aL; e o rs. | x h7o ** de X2 indica o ponto de fixação ao grupo — OH ouo ponto de fixa- o ção ao grupo o. L, é um ligante peptídico bivalente que compreende 2 a 4 resíduos de aminoácidos; L2 é um ligante; X' é um grupo de acoplamento bivalente selecionado den- ! o TO o o O * x FÊ x ste MON % N é i NH NH (e A AN AN $ axo * Ho ARNS Sia tre o ; O ; o ; o ; ;

E í no o e , -*“NRÍIC(=O)CH2**-, -“-NHC(=0)CH2**-, -*S(=0)2CH2CH2**-, -* (CH2)2S(=0)2CH2CH2**-, -“NRIS(=0)-CH2CH2**-, - *NRÍºC(=O)CH2CH2**-, -NH-, -C(=O)-, -“NHC(=O) **-, - x NES RR e *CHaNHCH2C0H>2**-, -““NHCH2CH2"**-, -S-, ; Rê

PAR A NS tok |) nO"

DO AV O Rô > À > )

AESA DA SSI O | ON o x OZ A tt PF dd x N , R , , Rº , 1 À *. E $$

PQ N NOR O So FND o CR 2 . NEN (R)1-2 Aa AR AE ADA RSA aa Li sx ARA o , , , o , **. em que o * de X; indica o ponto de fixação a L2 e o ** de X' indica o ponto de fixação a Ab; e em que: cada Rº é independentemente selecionado dentre H e C+1. Cealquila; cada Rº é independentemente selecionado dentre H, C1- Cealquila, F, Cl e -OH; cada Rº é independentemente selecionado dentre H, C1- Csalquila, F, CI, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3, -N(CH3)2, -OCN, -NO> e -OH, e cada R' é independentemente selecionado dentre H, Cr. salquila, fluoro, benzilóxi substituído por -C(=O0)OH, benzila substituída por —C(=O0)OH, Cair4alcóxi substituído por -C(=O0)OH e Crialquila substituída por -C(=O0)OH, e yé1,2,3ou4.

[00226] Modalidade 63. O conjugado de qualquer uma das Modali- dades 54 a 62, em que X> é um espaçador autoimolativo selecionado o

WO WO NO ns ty É dentre H ; H ; H ; * H x H x H —N Jet 32 N ST 32 N Aa & o Sor A oH EP OH no. oH no. OH Ho oH OH ; O OH ; OH e 28 Fe

TI o oH HO. OH O OH , em que o * de X> indica o ponto de fixação aL; e o ** de Xo indica o ponto de fixação a Y: ou o ponto de fixação ao grupo

PS

C 7P=O o) OH ouo ponto de fixação ao grupo o.

[00227] “Modalidade 64. O conjugado de qualquer uma das Modali- * *.

ÃO dades 54 a 63, em que X) é H , em que o * de X? indica o ponto de fixação a L; e o ** de X> indica o ponto de fixação a Y1 ou o ” | To ponto de fixação ao grupo “OH ouo ponto de fixação ao grupo s o.

[00228] “Modalidade 65. O conjugado de qualquer uma das modali- dades 54 a 64, em que L: é um ligante peptídico bivalente que com- preende 2 a 4 resíduos de aminoácidos.

[00229] “Modalidade 66. O conjugado de qualquer uma das Modali- dades 54 a 65, em que L: é um ligante peptídico bivalente que com- preende um resíduo de aminoácido selecionado dentre valina, citruli- na, lisina, isoleucina, fenilalanina, metionina, asparagina, prolina, ala- nina, leucina, triptofano e tirosina.

[00230] “Modalidade 67. O conjugado de qualquer uma das Modali- dades 54 a 64, em que L: é um ligante peptídico bivalente que com- preende pelo menos um resíduo de valina (Val) ou citrulina (Cit).

[00231] “Modalidade 68. O conjugado de qualquer uma das Modali- dades 54 a 64, em que L: é um ligante dipeptídico bivalente seleciona- do dentre ValCit, PheLys, ValAla e ValLys.

[00232] “Modalidade 69. O conjugado de qualquer uma das Modali- dades 54 a 64, em que L: é um ligante dipeptídico bivalente seleciona- * O FRA ' ST 2º x Hoi x» À do dentre O NH2 (ValCit), NH2 (PheLys),

IRA Ho: a AL X Ho: (ValAla), NH2 (ValLys) e DA E x* xo NA Hoi

RM SC NH (LeuCib, em que o * de L1 indica o ponto de fixação a

L2 e o ** de L1 indica o ponto de fixação a X>.

[00233] “Modalidade 70. O conjugado de qualquer uma das Modali- dades 54 a 64, em que L; é ValCit.

[00234] “Modalidade 71. O conjugado de qualquer uma das Modali- dades 54 a 64, em que

RNA Hoi Ava L é o Nro (ValCit), em que o * de L; indica o ponto de fixação a L2 e o ** de L1 indica o ponto de fixação a X..

[00235] “Modalidade 72. O conjugado de qualquer uma das Modali- dades 54 a 71, em que L> é um ligante.

[00236] Modalidade 73. O conjugado de qualquer uma das Modali- dades 54 a 71, em que L> é um ligante selecionado dentre: -*C(=O)((CH2)MmO))(CH2a)JWm**-, — -*C(=O)(CHa)m**-, — -“C(=O)(CH2))NHC (=O)(CH2)Jn**-, -“C(=O0)(CH2)maNHC(=O)((CH2)mO))(CH2)m**-, -* ((CH2)m O)(CHa)J0W**-, -* ((CHo)MO)(CHa)>wm**-, -(CHo)m-, -*(CHo)MNHC(=O) (CHa)w**-, -* (CHo)mNHC(=O)(CH2)mC(=O)NH(CH2)wm**-, -* ((CH2)mO), (CH2)MmNHC(=O)(CH2)wm**-, -* *((CH2)MmMO),CH2)mC(=O)NH(CH2)“wW**-, -* (CH2)mC(R3)2**-, e -* (CHo)MC(R3):SS(CH2)aNHC(=O)(CH2)1**-, em que o * de L2 indica o ponto de fixação a L, e o ** de L2 indica o ponto de fixação a X:; e em que: cada R3 é independentemente selecionado dentre H e C1. Cealquila; cada m é independentemente selecionado dentre 1, 2, 3,4, 5,6,7,8,9e 10,e cada p é independentemente selecionado dentre 1, 2,3, 4, 5,6,7,8,9, 10, 11,12, 13 e 14.

[00237] “Modalidade 74. O conjugado de qualquer uma das Modali-

dades 54 a 71, em que L2 é -*C(=O)((CH2)MO))(CH2)m**- ou - *C(=O)(CH2)Im**-, em que o * de L> indica o ponto de fixação a L1 e o ** de L2 indica o ponto de fixação a X:, e em que cada m é independentemente selecionado dentre 1,2,3,4,5,6,7,8,90u 10epé1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ou 14.

[00238] “Modalidade 75. O conjugado de qualquer uma das Modali- * Arno” Fo ** dades 54 a 71, em que L é O No ; * Ap ou O , em que o * de L> indica o ponto de fixação a Lr e o ** de L2 indica o ponto de fixação a X:.

[00239] Modalidade 76. O conjugado de qualquer uma das Modali- dades 54 a 75, em que X; é um grupo de acoplamento bivalente selecio- o o g Ho Rs "” “ q As NH * . Mm x Ho nado dentre o ; O ; o ; o ; alo neo * E | ) A nº ARNS Siga ok ; , “NRÍC(=0)CH2**-, -“-NHC(=0)CH2**-, -*S(=O), CHICH2**-, -* (CH2)S(=0)aCH2CH2**-, -“-NRS(=0)2CH2CH2**-, --NRºC (=O)CH2CH2**-, -NH-, -C(=O)-, -“-NHC(=O) **-, -“CHANHCH2C0H2**-, - nexo OR “NS E Y AN x Ro A (O refaam O RES | ON Ro a *NHCH2CH2**-, -S-, ; N PR ;

x Rº to A +o Õ PAN VR HD) -N

AR NEN NA NEN * ( X EO ( X EM DR OE Ta, OE TA ROSA RA E dd Eee RODA So dg tes , R , , ,

VR Fo UR): (CR 2 No Ri2 4 “O QN 7 ** Da ek eo ; O ,**, em que o * de X, indica o ponto de fixação a Lo e o ** de X1 indica o ponto de fixação a Ab; e em que: cada Rº é independentemente selecionado dentre H e C+1. Cealquila; cada Rº é independentemente selecionado dentre H, C1- Cealquila, F, Cl e -OH; cada Rº é independentemente selecionado dentre H, C1- Csalquila, F, CI, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3, -N(CH3)2, -OCN, -NO> e -OH, e cada R' é independentemente selecionado dentre H, Cr. salquila, fluoro, benzilóxi substituído por -C(=O0)OH, benzila substituída por —C(=O0)OH, Cair4alcóxi substituído por -C(=O0)OH e Crialquila substituída por -C(=0)OH.

[00240] “Modalidade 77. O conjugado de qualquer uma das Modali- dades 54 a 75, em que X; é um grupo de acoplamento bivalente selecionado dentre ; o mm O ** o [o - O * 1 * 2% s.ixx HO 2% ” N so AT A deh, Asi A o * Ho ARTS Six ha oO 2º ; o, e ; em que o * de X; indica o ponto de fixação a L2 e o ** de X' indica o ponto de fixação a Ab.

[00241] “Modalidade 78. O conjugado de qualquer uma das Modali- dades 54 a 75, em que X; é um grupo de acoplamento bivalente selecio- o e FS e x Ho nado dentre — O ; o e oO ,emqueo*de X, indica o ponto de fixação a L2 e o ** de X' indica o ponto de fixação a Ab.

[00242] “Modalidade 79. O conjugado da Fórmula (C-2) da Modali- dade 54 em que: Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; Rº é metila ou etila; R' é metila ou isopropila; R? é metila ou etila; X' é um grupo de acoplamento bivalente selecionado den- xx ? o oi FS E x Ho: tre O ; o e o ,emqueo*de X, indica o ponto de fixação a Lo e o ** de X1 indica o ponto de fixação a Ab * DX *q Xoé H , em que o * de X> indica o ponto de s hão fixação a L1 e o ** de X> indica o ponto de fixação ao grupo — OH ;

RNA Hoi Je L é NH (ValCit), em que o * de L; indica o ponto de fixação a L2 e o ** de L1 indica o ponto de fixação a X>; * ÁFot ” Foca Lé O ou O , em que o * de L> indica o ponto de fixação a L: e o ** de L2 indica o ponto de fixação a Re, e yé1,2,3ou4.

[00243] “Modalidade 80. O conjugado da Fórmula (C-3) da Modali- dade 58 em que: Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; Rº é metila ou etila; R' é metila ou isopropila; R? é metila ou etila; X' é um grupo de acoplamento bivalente selecionado den- xe ? o oi FS E x Ho. tre O ; o e o ,emqueo*de X, indica o ponto de fixação a Lo e o ** de X1 indica o ponto de fixação a Ab x ISO *v Xoé H , em que o * de X> indica o ponto de o fixação a L1 e o ** de X> indica o ponto de fixação ao grupo o.

ANNA Hoi ve L é o Nro (ValCit), em que o * de L; indica o ponto de fixação a L2 e o ** de L1 indica o ponto de fixação a X>;

* ek * ROO A As Lé O ou O , em que o * de L> indica o ponto de fixação a L: e o ** de L2 indica o ponto de fixação a Ra, e yé1,2,3ou4.

[00244] “Modalidade 81. O conjugado da Fórmula (C), Fórmula (C-1) ou Fórmula (C-2) que tem a estrutura: / O Í seo Al Í vs Leo ERA | l or | | A T Í PResuunesNear / » YO | N no / em que: yé2oud4e Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana.

[00245] “Modalidade 82. O conjugado da Fórmula (C), Fórmula (C-1) ou Fórmula (C-2) que tem a estrutura: / O Í Í x A À | i EEE | no Vê | Fém Vo ET | Let LARA o? j SAIAS ) NV » / N “e " /y em que:

yé2oud4e Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana.

[00246] Modalidade 83. O conjugado da Fórmula (C), Fórmula (C-1) ou Fórmula (C-2) que tem a estrutura: / Aa / , Se Í ão e À Í sl o ao | | “x Lelo. | a) Lo: | so | | º | Ve E. o Í AGIA 2 | o o » não y em que: yé2oud4e Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana.

A ev NX nao y em que: yé2oud4e

Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana.

Y em que: yé2oud4e Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana.

[00249] “Modalidade 86. O conjugado da Fórmula (C), Fórmula (C-1) ou Fórmula (C-2) que tem a estrutura: o A A J il mNH | o

E | ho OO |

O tanto y em que: yé2oud4e Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana.

[00251] “Modalidade 88. O conjugado da Fórmula (C), Fórmula (C-1) ou Fórmula (C-3) que tem a estrutura: 2

[00252] Modalidade 89. O conjugado da Fórmula (C), Fórmula (C-1) ou Fórmula (C-3) que tem a estrutura: Í mA NH | Oo À E) | ho eo f

TIXÉ nu? VÊ | o | + . j SAIAS O '

Ç Y 2 / N Ns / em que: yé2oud4e Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana.

[00254] “Modalidade 91. O conjugado da Fórmula (C), Fórmula (C-1) ou Fórmula (C-3) que tem a estrutura: o ; od, A fr, ANH OO | "” O O O À | CX | | no PG | SO | [| 9 | A, o o o “o % ILEAA J o A o mo rafão

[00255] “Modalidade 92. O conjugado da Fórmula (C), Fórmula (C-1) ou Fórmula (C-3) que tem a estrutura: o A A J il mNH | o

E | ho OO |

[00256] Além disso, os anticorpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) ou equivalentes funcio- nais da presente invenção podem ser conjugados com uma porção química de fármaco que modifica uma determinada resposta biológica. As porções químicas de fármaco não devem ser interpretadas como limitadas a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção química de fármaco pode ser uma proteína, peptídeo ou poli- peptídeo que tem uma atividade biológica desejada. Tais proteínas incluem, por exemplo, uma toxina como abrina, ricina A, exotoxina pseudomonas, toxina da cólera ou toxina da difteria, uma proteína co- mo fator de necrose tumoral, interferon a, interferon B, fator de cresci- mento dos nervos, fator de crescimento plaquetário, ativador de plas- minogênio tecidual, uma citocina, um agente apoptótico, um agente antiangiogênico ou um modificador de resposta biológica como, por exemplo, uma linfocina.

[00257] Em uma modalidade, os anticorpos, fragmentos de anticor- po (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) ou equivalentes funcionais da presente invenção são conjugados a uma porção quími- ca de fármaco, como citotoxina, um fármaco (por exemplo, um imu- nossupressor) ou uma radiotoxina. Exemplos de citotoxinas incluem, porém sem limitação, taxanos (consultar, por exemplo, os Pedidos de Patente Internacional (PCT) nº WO 01/38318 e nº PCT/US03/02675), agentes alquilantes de DNA (por exemplo, análogos de CC-1065), an- traciclinas, análogos de tubulisina, análogos de duocarmicina, aurista- tina E, auristatina F, maitansinoides e agentes citotóxicos que compre- endem uma porção química reativa de polietilenoglicol (consultar, por exemplo, Sasse et al., J. Antibiot. (Tóquio), 53, 879-85 (2000), Suzawa et al., Bioorg. Med. Chem., 8, 2175-84 (2000), Ichimura et a/l., J. Anti- biot. (Tóquio), 44, 1045-53 (1991), Francisco et a/., Blood (2003) (pu- blicação eletrônica anterior à publicação impressa), Patentes U.S. nº

5.475.092, nº 6.340.701, nº 6.372.738 e nº 6.436.931, Publicação de Pedido de Patente U.S. nº 2001/0036923 A1, Pedido de Patente pen- dente U.S. nº de série 10/024.290 e nº de série 10/116.053 e Pedido de Patente Internacional (PCT) nº WO 01/49698), taxona, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, t. colchicina, doxorrubicina, daunor- rubicina, di-hidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actino- micina D, 1-de-hidrotestosterona, glicocorticoides, procaína, tetracaí- na, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos. Agentes terapêuticos incluem também, por exemplo, antime- tabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes de ablação (por exem- plo, mecloretamina, tiotepa clorambucila, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromoma- nitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (Il) (DDP) cisplatina, antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anterior- mente conhecida como daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente conhecida como actinomi- cina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes antimi- tóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina). (Consultar, por exem- plo, Seattle Genetics US20090304721).

[00258] “Outros exemplos de citotoxinas que podem ser conjugados aos anticorpos, fragmentos de anticorpo (fragmentos de ligação ao an- tígeno) ou equivalentes funcionais da invenção incluem duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas e auristatinas e derivados das mesmas.

[00259] Vários tipos de citotoxinas, ligantes e métodos para conju- gar agentes terapêuticos a anticorpos são conhecidos na técnica, con-

sultar, por exemplo, Saito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199- 215; Trail et al/., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan e Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter e Springer, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-

264.

[00260] Os anticorpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, fra- gmentos de ligação ao antígeno) ou equivalentes funcionais da pre- sente invenção podem também ser conjugados a um isótopo radioati- vo para gerar radiofármacos citotóxicos, referidos como radioimu- noconjugados. Exemplos de isótopos radioativos que podem ser con- jugados a anticorpos para uso diagnóstico ou terapêutico incluem, po- rém sem limitação, iodo-131, índio-111, ítrio-90 e lutécio-177. Métodos para preparar radioimunoconjugados são estabelecidos na técnica. Exemplos de radioimunoconjugados comercialmente disponíveis in- cluem Zevalin""(DEC Pharmaceuticals) e Bexxar"" (Corixa Pharma- ceuticals), e métodos similares podem ser usados para preparar ra- dioimunoconjugados usando os anticorpos da invenção. Em certas modalidades, o quelante macrocíclico é ácido 1,4,7,10-tetra- azaciclododecano-N,N',N" N""'-tetra-acético (DOTA) que pode ser fixa- do ao anticorpo através de uma molécula ligante. Tais moléculas ligan- tes são comumente conhecidas na técnica e descritas em Denardo et al., (1998) Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et a/l., (1999) Bio- conjug. Chem. 10(4):553-7; e Zimmerman et a/., (1999) Nucl. Med. Bi- ol. 26(8):943-50, cada um incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00261] Os anticorpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, fra- gmentos de ligação ao antígeno) ou equivalentes funcionais da pre- sente invenção podem também ser conjugados a uma proteína ou po- lipeptídeo heterólogo (ou fragmento do mesmo, de preferência, a um polipeptídeo de pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90 ou pelo menos 100 aminoácidos) para gerar proteí- nas de fusão. Em particular, a invenção fornece proteínas de fusão que compreendem um fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmen- to de ligação ao antígeno) descrito no presente documento (por exem- plo, um fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmento F(ab)., um domínio VH, uma CDR VH, um domínio VL ou uma CDR VL) e uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo heterólogo.

[00262] Proteínas de fusão adicionais podem ser geradas através das técnicas de embaralhamento de gene, embaralhamento de motivo, embaralhamento de éxon e/ou embaralhamento de códon (coletiva- mente chamados de "embaralhamento de DNA"). O embaralhamento de DNA pode ser usado para alterar as atividades de anticorpos da invenção ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, anticorpos ou fra- gmentos dos mesmos com afinidades maiores e taxas de dissociação menores). Consultar, em geral, as patentes U.S. nº 5.605.793, nº

5.811.238, nº 5.830.721, nº 5.834.252 e nº 5.837.458; Patten et al, (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et a/l., (1999) J. Mol. Biol. 287:265- 76; e Lorenzo e Blasco, (1998) Biotechniques 24(2):308- 313 (todas essas patentes e pedidos estão incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade). Anticorpos ou fragmentos dos mesmos, ou os anticorpos codificados ou fragmentos dos mesmos, podem ser alterados ao serem submetidos à mutagênese aleatória por PCR propensa a erros, inserção aleatória de nucleotídeos ou outros métodos antes da recombinação. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a um antígeno pode ser recombinado com um ou mais componentes, moti- vos, seções, partes, domínios, fragmentos, etc. de uma ou mais molé-

culas heterólogas.

[00263] Além disso, os anticorpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) ou equivalentes funcio- nais da presente invenção podem ser conjugados a sequências de marcadores, como um peptídeo, para facilitar a purificação. Em moda- lidades preferenciais, a sequência de aminoácidos marcadores é um peptídeo de hexa-histidina (SEQ ID NO: 267), como a etiqueta forneci- da em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre outras, muitas das quais se encontram comercial- mente disponíveis. Como descrito em Gentz et a/l., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, por exemplo, a hexa-histidina (SEQ ID NO: 267) fornece purificação conveniente da proteína de fusão. Outras etiquetas de peptídeos úteis para purificação incluem, porém sem limi- tação, a etiqueta hemaglutinina ("HA”), que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina influenza (Wilson et a/l., (1984) Cell 37:767), e a etiqueta "FLAG" (A. Einhauer et a/., J. Biochem. Biophys. Methods 49: 455-465 2001 De acordo com a presente invenção, anti- corpos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem também ser con- jugados a peptídeos que penetram em tumores de modo a aumentar a sua eficácia.

[00264] Em outras modalidades, os anticorpos, fragmentos de anti- corpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) ou equivalen- tes funcionais da presente invenção são conjugados a um agente de diagnóstico ou agente detectável. Tais imunoconjugados podem ser úteis para monitoramento ou prognóstico do início, desenvolvimento, progressão e/ou gravidade de uma doença ou distúrbio como parte de um procedimento de ensaio clínico, como determinar a eficácia de uma terapia específica. Tal diagnóstico e detecção podem ser realiza- dos por acoplamento do anticorpo a substâncias detectáveis incluindo, porém sem limitação, várias enzimas, como, porém sem limitação, pe-

roxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetil- colinesterase; grupos protéticos, como, porém sem limitação, estrepta- vidina/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, como, porém sem limitação, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Ale- xa Fluor 488, Alexa Fluor 500, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, umbeliferona, fluoresceí- na, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluo- resceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; materiais luminescentes, como, porém sem limitação, luminol; materiais bioluminescentes, co- mo, porém sem limitação, luciferase, luciferina e aequorina; materiais radioativos, como, porém sem limitação, iodo (31, 1251, 123] e 121), car- bono (ºC), enxofre (*S), trítio (?H), índio (In, ln, 12In e ln), tecnécio (Toc), tálio (29Ti), gálio (Ga, 6”Ga), paládio (Pd), molib- dênio (Mo), xenônio (Xe), flúor (*SF), **Sm, “Lu, **ºGd, **Pm, 140 a, 17SY|, 186Ho, 20Y, “Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, RU, Ge, STCo, Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Y|, 51Cr, sMn, 75Se, S4Cu, 13Sn, e Sn; e me- tais emissores de pósitrons usando várias tomografias por emissão de pósitrons e íons metálicos paramagnéticos não radioativos.

[00265] Os anticorpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, frag- mentos de ligação ao antígeno) ou equivalentes funcionais da invenção podem também ser ligados a suportes sólidos, que são particularmente úteis para imunoensaios ou purificação do antígeno alvo. Tais suportes sólidos incluem, porém sem limitação, vidro, celulose, poliacrilamida, nái- lon, poliestireno, policloreto de vinila ou polipropileno.

3. Conjugação e Preparação de ADCS Processos para a Produção de conjugados de Anticorpo da Fórmula C), Fórmula (C-1) e Fórmula (C-2)

[00266] Um esquema de reação geral para a formação de conjuga-

dos da Fórmula (C) é mostrado no Esquema 1 abaixo: Esquema 1 AP A(RG;), + Y(RE-LE-(O)) —— Ab-(Lr(D)), (B) (C) em que: RG; é um grupo reativo no anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, Ab, a título de exemplo, apenas um tiol, amina ou cetona, que reage com um grupo reativo compatível, R3, fixado ao composto de ligante-fármaco ligando assim covalentemente o anticor- po ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, Ab, a uma ou mais porções químicas de ligante-fármaco. Exemplos não limitativos de tais reações de grupos RG, e Rº são uma maleimida (R$) que reage com um tiol (RG1) para gerar um anel succinimida, ou uma hidroxilamina (R8) que reage com uma cetona (RG1) para render uma oxima.

[00267] Em uma modalidade, D é um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA1I1I1 ou um inibidor de GNAQ e GNA11 (inibidor de GNAQ/GNA11), La ié um ligante que compreende adicionalmente um grupo de acoplamento bivalente formado quando RG e R$ reagem, n é 1,2,30u4,eyé 1,2,3ou4.

[00268] Um esquema de reação geral para a formação de conjuga- dos da Fórmula (C-1) é mostrado no Esquema 2 abaixo: Esquema 2 (B-1) (C1) y em que: RG; é um grupo reativo no anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, Ab, a título de exemplo, apenas um tiol, amina ou cetona, que reage com um grupo reativo compatível, Rô, fixado à por- ção química de ligante-fármaco ligando assim covalentemente o anticor- po ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, Ab, a uma ou mais porções químicas de ligante-fármaco. Exemplos não limitativos de tais reações de grupos RG, e Rº são uma maleimida (Rº) que reage com um tiol (RG1) para gerar um anel succinimida, ou uma hidroxilamina (Rº) que reage com uma cetona (RG:) para render uma oxima.

[00269] Em uma modalidade, D é um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11I, ou um inibidor de GNAQ e GNA11 (inibidor de GNAQ/GNA11), X: é um grupo de acoplamento bivalente formado quando RG; e Rº reagem (por exemplo, um anel succinimida ou uma oxima), Y: é um grupo fosfato, X- é um espaçador autoimolativo, L1 é um ligante peptídico bivalente, L2 é uma ligação ou um ligante, e y é 1, 2,3 ou4.

[00270] Um esquema de reação geral para a formação de conjuga- dos da Fórmula (C-2) é mostrado no Esquema 3 abaixo: Esquema 3 / O / | O À Í AMA V / oh A À [FEV / ZE) amoo, | - PSTEONNIA | - OE N / x / (8-2) 12) em que: RG; é um grupo reativo no anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, Ab, a título de exemplo, apenas um tiol, amina ou cetona, que reage com um grupo reativo compatível, Rô, fixado à porção química de ligante-fármaco ligando assim covalentemente o anti- corpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, Ab, a uma ou mais porções químicas de ligante-fármaco. Exemplos não limitativos de tais reações de grupos RG: e Rê são uma maleimida (Rº) que reage com um tiol (RG) para gerar um anel succinimida, ou uma hidroxilamina (Rº) que reage com uma cetona (RG) para render uma oxima.

[00271] No presente documento, Rº é metila ou etila, R' é metila ou isopropila, R? é metila ou etila, X1 é um grupo de acoplamento bivalen-

te formado quando RG; e Rê reagem (por exemplo, um anel succinimi- da ou uma oxima), X> é um espaçador autoimolativo, L: é um ligante peptídico bivalente, L2 é uma ligação ou um ligante, e y é 1,2, 3 ou 4.

[00272] Um esquema de reação geral para a formação de conjuga- dos da Fórmula (C-2) é mostrado no Esquema 4 abaixo: Esquema 4 / ON / Ex / MAES / ALAS (EE / HS) es EEE E EEE RE NE) Ve ú meo! / aa mão! / N / v / (83) tes em que: RG; é um grupo reativo no anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, Ab, a título de exemplo, apenas um tiol, amina ou cetona, que reage com um grupo reativo compatível, R8, fixado à por- ção química de ligante-fármaco ligando assim covalentemente o anticor- po ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, Ab, a uma ou mais porções químicas de ligante-fármaco. Exemplos não limitativos de tais reações de grupos RG; e Rº são uma maleimida (R$) que reage com um tiol (RG1) para gerar um anel succinimida, ou uma hidroxilamina (R$) que reage com uma cetona (RG1) para render uma oxima.

[00273] No presente documento, Rº é metila ou etila, R' é metila ou isopropila, R? é metila ou etila, X1 é um grupo de acoplamento bivalen- te formado quando RG; e Rê reagem (por exemplo, um anel succinimi- da ou uma oxima), X> é um espaçador autoimolativo, L: é um ligante peptídico bivalente, L2 é uma ligação ou um ligante, e y é 1,2, 3 ou 4. Processo para Conjugação com Resíduos de Anticorpo de Cisteína Manipulada

[00274] Os conjugados da invenção podem ser preparados usando resíduos de cisteína manipulados em um anticorpo, por exemplo, atra- vés de mutagênese dirigida ao local. Tais conjugados específicos do local são homogêneos e possuem propriedades melhoradas (Junutula JR, Raab H, Clark S, Bhakta S, Leipold DD, Weir S, Chen Y, Simpson M, Tsai SP, Dennis MS, Lu Y, Meng YG, Ng C, Yang J, Lee CC, Due- nas E, Gorrell J, Katta V, Kim A, McDorman K, Flagella K, Venook R, Ross S, Spencer SD, Lee Wong W, Lowman HB, Vandlen R, Sliw- kowski MX, Scheller RH, Polakis P, Mallet W. (2008) Nature Bio- technology 26:925-932.)

[00275] “Devido ao fato de cisteínas geneticamente modificadas em anticorpos expressos em células de mamíferos serem modificadas por adutos (dissulfetos), como glutationa (GSH) e/ou cisteína durante a sua biossíntese (Chen et a/. 2009), os resíduos de cisteína genetica- mente modificados no produto como inicialmente expresso não são reativos a reagentes reativos de tiol, como grupos maleimido ou bro- mo- ou iodo-acetamida. Para conjugar carga útil a uma cisteína gene- ticamente modificada após expressão, adutos de glutationa ou cisteína precisam ser removidos reduzindo estes adutos de dissulfetos, o que geralmente implica também reduzir dissulfetos nativos na proteína ex- pressa. A desproteção de cisteínas geneticamente modificadas prove- nientes de adução pode ser alcançada expondo primeiro o anticorpo a um agente redutor, por exemplo, ditiotreitol (DTT), TCEP ou cisteína reduzida, seguido de um procedimento que permite a reoxidação de todas as ligações de dissulfeto nativo de um anticorpo para restaurar e/ou estabilizar a estrutura de anticorpo funcional.

[00276] Podem ser usados vários métodos para reduzir e reoxidar anticorpos com resíduos de cisteína geneticamente manipulados para a preparação de conjugados de anticorpo e fármaco. Tentativas de seguir protocolos de reoxidação anteriormente descritos na literatura usando alta concentração de CuSO, resultaram na precipitação de proteína (Junutula JR, Raab H, Clark S, Bhakta S, Leipold DD, Weir S, Chen Y, Simpson M, Tsai SP, Dennis MS, Lu Y, Meng YG, Ng C, Yang J, Lee CC, Duenas E, Gorrell J, Katta V, Kim A, McDorman K, Flagella K, Venook R, Ross S, Spencer SD, Lee Wong W, Lowman HB, Vandlen R, Sliwkowski MX, Scheller RH, Polakis P, Mallet W. (2008) Nature Biotechnology 26:925). Foram preparados e obtidos com su- cesso conjugados de anticorpo e fármaco com vários métodos diferen- tes para a redução e reoxidação de anticorpos.

[00277] O seguinte é um método para reduzir e reoxidar anticorpos com resíduos de cisteína geneticamente manipulados para a prepara- ção de conjugados de anticorpo e fármaco: O DTT recentemente pre- parado é adicionado a anticorpos mutantes Cys purificados a uma concentração final de 10 mM. Após incubação com DTT à temperatura ambiente por 1 hora, a mistura é dialisada a 4ºC contra PBS por três dias com troca de tampão diária para remover DTT e reoxidar ligações de dissulfeto nativas do anticorpo. Um método alternativo é remover reagentes de redução através de uma coluna de dessalinização como Sephadex G-25, equilibrada com PBS. Uma vez que a proteína é to- talmente reduzida, ascorbato oxidado 1 mM (ácido de-hidro-ascórbico) é opcionalmente adicionado a amostras dessalinizadas e incubações de reoxidação são realizadas durante 20 a 24 horas.

[00278] Em outro método exemplificativo, a desproteção de resí- duos de CYS geneticamente modificados é obtida pela adição de cis- teína totalmente reduzida em uma concentração 20 mM a anticorpos ligados à resina de Proteína A-Sefarose. A redução dos adutos de Cys é obtida por incubação durante aproximadamente 30 a 60 minutos à temperatura ambiente, então, o redundante é rapidamente removido lavando a resina com 50 leitos de PBS. A reoxidação do anticorpo re- duzido é obtida incubando a pasta fluida lavada à temperatura ambien- te com ou sem adição de CuCl2 50 a 2000 nM como um acelerador. À exceção do uso de sulfato de cobre, os exemplos no presente docu- mento usam cada um dos protocolos descritos no presente documento com resultados similares. A reoxidação restaura dissulfetos intraca- deia, enquanto a diálise, dessalinização ou cromatografia de proteína A removem o agente redutor bem como cisteínas e glutationas inicial- mente conectadas à cisteína (ou cisteínas) geneticamente modificada do anticorpo. A cromatografia de fase reversa HPLC é tipicamente usada para monitorar o processo de reoxidação: Os anticorpos são carregados em uma coluna PLRP-S (4000 À, 50 mm x 2,1 mm, Agi- lent) aquecida até 80º C e eluídos usando um gradiente linear de 30- 45% de CH3CN em água contendo TFA a 0,1% em 1,5 ml/minuto e detecção de pico em 215, 254 e 280 nm.

[00279] Após a reoxidação, o anticorpo é conjugado a um composto de ligante e fármaco de, a título de exemplo, compostos da Fórmula (B), Fórmula (B-1), Fórmula (B-2) ou Fórmula (B-3) (consultar, os es- quemas 1-4). A título de exemplo, um composto da Fórmula (B), Fór- mula (B-1), Fórmula (B-2) ou Fórmula (B-3) é adicionado ao anticorpo mutante Cys reoxidado em 5-10 equivalentes molares em relação ao anticorpo no tampão PBS (pH 7,2). As incubações são realizadas por 1-2 horas. O processo de conjugação é monitorado por HPLC de fase reversa, o qual permite separar anticorpos conjugados de anticorpos não conjugados. As misturas de reação de conjugação foram analisa- das em uma coluna PRLP-S (4000Ã, 50 mm x 2,1 mm, Agilent) aque- cida até 80ºC e a eluição da coluna é realizada por meio de um gradi- ente linear de 30-60% de acetonitrila em água contendo TFA a 0,1% a uma fluidez de 1,5 ml/min. A eluição de proteínas da coluna é monito- rada em 280 nm, 254 nm e 215 nm.

[00280] &—Alternativamente, para anticorpos ligados a uma resina de Proteína A, uma vez que o anticorpo é reoxidado, a resina é lavada com 10 volumes de coluna de PBS e a resina é, então, ressuspensa em um volume de PBS igual e um excesso de 8x de um composto da Fórmula (B), Fórmula (B-1), Fórmula (B-2) ou Fórmula (B-3) (em DMSO) é adicionado e incubado à temperatura ambiente por 2 horas. A resina é, então, lavada com 50 volumes de coluna de PBS e o con- jugado de anticorpo e fármaco resultante é eluído da resina de Proteí- na A, neutralizado com 1/10 de volume de Tris 1 M pH 9,0 e tampão trocado em tampão adequado para realizar cromatografia preparativa de exclusão por tamanho (se necessário).

[00281] Os imunoconjugados são também caracterizados em ter- mos de carregamento médio de uma porção química de fármaco para porção química de ligação de anticorpo, geralmente denominado como razão de fármaco-para-anticorpo (DAR). O valor DAR é extrapolado, por exemplo, a partir de dados LC-MS para amostras reduzidas e des- glicosiladas. A LC/MS permite a quantificação do número médio de moléculas de carga útil (porção química de fármaco) fixadas a um an- ticorpo em um ADC. HPLC separa um anticorpo em cadeias pesadas e leves e também separa a cadeia pesada (HC) e a cadeia leve (LC) de acordo com o número de grupos de Ligante-Carga Útil por cadeia. Os dados espectrais de massa permitem a identificação da espécie de componente na mistura, por exemplo, LC, LC+1, LC+2, HC, HC+1, HC+2, etc. A partir do carregamento médio de cadeias LC e HC, a DAR média pode ser calculada para um ADC. A DAR para uma de- terminada amostra de imunoconjugado representa o número médio de moléculas de fármaco (carga útil) fixadas a um anticorpo tetramérico contendo duas cadeias leves e duas cadeias pesadas.

[00282] Ao longo de todo o texto desse pedido, caso exista uma discrepância entre o texto do relatório descritivo e a listagem de se- quências, o texto do relatório descritivo deverá prevalecer.

Tabela 2. Exemplos de Anticorpos Anti-PMEL17 da Presente Invenção [26 do tSRE sarse de ET ===" 5qq SEQ ID NO: 1 HCDR1 (Combina- | GGTFSDYAIT ss ss OU SEQ ID NO: 2 HCDR2 (Combina- | GIIPIFGTANYAQKFOG a us j SEQ ID NO: 3 HCDR3 (Combina- | EGGLLTDISYSRYWFAY A uv OU 8 Mm 2 * SEQ ID NO: 10 VH QVQLVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYAITWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYA

QKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGLLTDISYSRYWFAYWGQGTLV

TVSS SEQ ID NO: 11 DNA VH CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAG

TTAGCTGCAAAGCATCCGGAGGGACGTTTTCTGACTACGCTATCACTTGGGTGCGCCAG GCCCEGGGCCAGEGCCTCGAGTGGATGGGCGGTATCATCCCGATCTTCGGCACTGCG AACTACGCCCAGAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAAAGCACCAGCA CCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGC GCGTGAAGGTGGTCTGCTGACTGACATCTCTTACTCTCGTTACTGGTTCGCTTACTGGG

GCCAAGGCACCCTGGTGACTGTTAGCTCA SEQ ID NO: 12 Cadeia Pesada QVQALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYAITWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYA

QKFQOGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGLLTDISYSRYWFAYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN

STYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ br GNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK 8 SEQ ID NO: 13 DNA Cadeia Pesada | CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAG R

TTAGCTGCAAAGCATCCGGAGGGACGTTTTCTGACTACGCTATCACTTGGGTGCGCCAG GCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGGATGGGCGGTATCATCCCGATCTTCGGCACTGCG AACTACGCCCAGAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAAAGCACCAGCA CCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGC GCGTGAAGGTGGTCTGCTGACTGACATCTCTTACTCTCGTTACTGGTTCGCTTACTGGG GCCAAGGCACCCTGGTGACTGTTAGCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCC CCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGE AAGGACTACTTCCCCTGTCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGG CGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGT GGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACA

AGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCA CACCTGCCCCCCeTtecCccAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTC CCCCCcAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTG

GTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC GTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACA GGGTGGTEGTCCEGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAA

GTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCC AAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCcecAGCCGGGAGGAGATG

ACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGC

CGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGT GCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGG br TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACT &

ACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG É [ER BRR RIR O OOOCOÂxS—

FERE TERRE TRI CO O O áS0OCE << SEQ ID NO: 21 VvL DIELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDALRDKFVYWYQQKPGQAPVLVIYDDNNRPSGIPERFS Ms o a SEQ ID NO: 22 DNA VL GATATCGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGTGAGCCCGGGCCAGACCGCGAGCE

ATTACCTGTAGCGGCGATGCTCTGCGTGACAAATTCGTTTACTGGTACCAGCAGAAACC GGGCCAGGCEGCCGGTGCTGGTGATCTACGACGACAACAACCGTCCGAGCGGCATCCC GGAACGTTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACC CAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTACTGCCAGTCTTGGGACCATTCTTACTCTCTGGT

TGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACTGTCCTG SEQ ID NO: 23 Cadeia Leve DIELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDALRDKFVYWYQQKPGQAPVLVIYDDNNRPSGIPERFS br GSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSWDHSYSLVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPS Ss

SEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPE E

QWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO: 24 DNA Cadeia Leve GATATCGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGTGAGCCCGGGCCAGACCGCGAGCE

TGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACTGTCCTGGGACAACCTAAGGCCGCTCCCTCC GTGACCCTGTTCCCCCccAGCTCCGAGGAACTGCAGGCCAACAAGGCCACCCTGGTET

GCCTGATCAGCGACTTCTACCCTGGCGCCGTEACCEGTGGCCTGGAAGGCCGACAGCA GCCCCETGAAGGCCGGCGTEGAGACAACCACCCCCAGCAAGCAGAGCAACAACAAGT ACGCCGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACCCCCGAGCAGTGGAAGAGCCACAGAAGCTA CAGCTGCCAGGTCACCCACGAGGGCAGCACCGTGGAGAAAACCGTGGCCCCCACCGA

GTGCAGC |EEEIIICEINTIEEIC DA III 3 2 * SEQ ID NO: 10 VvH QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYAITWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYA

QKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGLLTDISYSRYWFAYWGQGTLV

TTAGCTGCAAAGCATCCGGAGGGACGTTTTCTGACTACGCTATCACTTGGGTGCGCCAG GCCCCGGGCCAGEGCCTEGAGTGGATGGGCGGTATCATCCCGATCTTCEGGCACTGCG AACTACGCCCAGAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAAAGCACCAGCA CCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGC GCGTGAAGGTGGTCTGCTGACTGACATCTCTTACTCTCGTTACTGGTTCGCTTACTGGG

QKFQOGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGLLTDISYSRYWFAYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT

KNQVSLTCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK a SEQ ID NO: 13 DNA Cadeia Pesada | CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAG 3

TTAGCTGCAAAGCATCCGGAGGGACGTTTTCTGACTACGCTATCACTTGGGTGCGCCAG R GCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGGATGGGCGGTATCATCCCGATCTTCGGCACTGCG AACTACGCCCAGAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAAAGCACCAGCA CCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGC GCGTGAAGGTGGTCTGCTGACTGACATCTCTTACTCTCGTTACTGGTTCGCTTACTGGG GCCAAGGCACCCTGGTGACTGTTAGCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCC CCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGE AAGGACTACTTCCCCTGTCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGG CGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTG GTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAA GCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCAC

ACCTGCCCCCCoTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCE

CCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGT GGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGG TGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTG

CAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAG GGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCccccAGCCGGGAGGAGATGACC

AAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCT

GGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGG CAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACA br

CCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG SS í [FR epa RIR CC OOOOCOOOZâ à

FR ER TRI O DECFDIOOO

SEQ ID NO: 25 VvL SYELTQPLSVSVALGQOTARITCESGDALRDKFVYWYQQKPGQAPVLVIYDDNNRPSGIPERFS me Ç essonmunataNanon castor mracenara SEQ ID NO: 26 DNA VL AGCTACGAGCTGACCCAGCCGCTGTCGGTETCAGTCGCCCTGGGACAAACTGCCAGGA

TCACTTGTTCCGGGGACGCATTGCGGGACAAGTTCGTGTACTGGTACCAGCAGAAGCC GGGTCAAGCCCCAGTGCTCGTGATCTACGACGACAACAACCGGCCTTCCGGTATCCCC GAACGCTTCTCCGGATCCAATAGCGGAAACACCGCCACCCTGACCATTTCGAGAGCTCA GGCCGGGGATGAAGCGGACTACTACTGCCAGTCATGGGATCACTCGTACTCCCTCGTC

GTGTTTGGAGGCGGCACGAAGCTTACTGTGCTG SEQ ID NO: 27 Cadeia Leve SYELTQPLSVSVALGQOTARITCESGDALRDKFVYWYQQKPGQAPVLVIYDDNNRPSGIPERFS GSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQSWDHSYSLVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPS br

SEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPE S

QWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS R SEQ ID NO: 28 DNA Cadeia Leve AGCTACGAGCTGACCCAGCCGCTGTCGGTETCAGTCGCCCTGGGACAAACTGCCAGGA

GTGTTTGGAGGCGGCACGAAGCTTACTGTGCTGGGCCAGCCTAAGGCCGCTCCCOTCCG TGACCCTGTTCCCCCCcAGCTCCGAGGAACTGCAGGCCAACAAGGCCACCCTGGTGEGTGE

CCTGATCAGCGACTTCTACCCTGGCGCCGTEACCGTGGCCTEGGAAGGCCGACAGCAGC CCCGTGAAGGCCGGCGTEGAGACAACCACCCCCAGCAAGCAGAGCAACAACAAGTACG CCGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACCCCCGAGCAGTGGAAGAGCCACAGAAGCTACAG

CTGCCAGEGTCACCCACGAGGGCAGCACCGTGGAGAAAACCGTGGCCCCCACCGAGTG ras the o oe |EEEIIICEINEITIIC DA AO : e * SEQ ID NO: 10 VvH QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYAITWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYA

QKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGLLTDISYSRYWFAYWGQGTLV

TTAGCTGCAAAGCATCCGGAGGGACGTTTTCTGACTACGCTATCACTTGGGTGCGCCAG GCCCCGGGCCAGEGCCTEGAGTGGATGGGCGGTATCATCCCGATCTTCEGGCACTGCG AACTACGCCCAGAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAAAGCACCAGCA CCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGC

GCGTGAAGGTGGTCTGCTGACTGACATCTCTTACTCTCGTTACTGGTTCGCTTACTGGG me au S0MS00NcSTocTartemenoa ** = ““““""SS SEQ ID NO: 12 Cadeia Pesada QVQALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYAITWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYA

QKFQOGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGLLTDISYSRYWFAYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG

NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 13 DNA Cadeia Pesada | CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAG s TTAGCTGCAAAGCATCCGGAGGGACGTTTTCTGACTACGCTATCACTTGGGTGCGCCAG =

GCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGGATGGGCGGTATCATCCCGATCTTCGGCACTGCG R AACTACGCCCAGAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAAAGCACCAGCA CCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGC GCGTGAAGGTGGTCTGCTGACTGACATCTCTTACTCTCGTTACTGGTTCGCTTACTGGG GCCAAGGCACCCTGGTGACTGTTAGCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCC CCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGE AAGGACTACTTCCCCTGTCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGG CGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTG GTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAA GCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCAC ACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCC CCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGT GGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGG TGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTG

AAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCT GGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGG

CAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACA CCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG >

S é [FR epa RIR CC OOOOCOOOZâ à [FR EEBRERED RR CO O IOOOxDXXAAA

SEQ ID NO: 29 VvL SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDALRDKFVYWYQQKPGQSPVLVIYDDNNRPSGIPERFS me MM )essonmunTaNDeoTcosmraramrcemara “= SEQ ID NO: 30 DNA VL TCGTACGAGCTCACTCAACCGCCTTCTGTGTCCGTGTCACCCGGGCAGACTGCCTCCAT

TACCTGTTCGGGAGATGCCCTGCGCGACAAGTTTGTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCC GGACAGTCGCCAGTGCTCGTCATCTATGACGACAACAACAGACCTTCCGGTATCCCGGA ACGGTTCAGCGGAAGCAATTCCGGCAACACCGCTACCCTGACCATTAGCGGCACTCAG GCCATGGACGAAGCGGATTACTACTGCCAATCCTGGGACCACTCATACTCCCTTGTGGT

GTTCGGTGGCGGAACGAAGCTGACCGTCCTG SEQ ID NO: 31 Cadeia Leve SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDALRDKFVYWYQQKPGQSPVLVIYDDNNRPSGIPERFS

GSNSGNTATLTISGTQOAMDEADYYCQSWDHSYSLVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPS SEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPE > QWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 8 SEQ ID NO: 32 DNA Cadeia Leve TCGTACGAGCTCACTCAACCGCCTTCTGTGTCCGTGTCACCCGGGCAGACTGCCTCCAT R

GTTCGGTGGCGGAACGAAGCTGACCGTCCTGGGCCAGCCTAAGGCCGCTCCCTCCGTG ACCCTGTTCCCCCccAGCTCCGAGGAACTGCAGGCCAACAAGGCCACCCTGGTGTGCC

TGATCAGCGACTTCTACCCTGGCGCCGTGACCGTGGCCTGGAAGGCCGACAGCAGCCC CGTGAAGGCCGGCETEGAGACAACCACCCCCAGCAAGCAGAGCAACAACAAGTACGCC GCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACCCCCGAGCAGTGGAAGAGCCACAGAAGCTACAGCT GCCAGGTCACCCACGAGGGCAGCACCGTGGAGAAAACCGTGGCCCCCACCGAGTGCA

Rss E E FE FE [ERR A OODODODTI SEQ ID NO: 33 HCDR1 (Combina-| GGTFSTYAIS

MM SEQ ID NO: 34 HCDR2 (Combina- | RIIPILGIANYAQKFOG a SEQ ID NO: 35 HCDR3 (Combina-| EVRMIFDY a 2 2 * SEQ ID NO: 42 VvH QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMBGRIIPILGIANYA e O aNe0NOToNSTSTAMELssinSEoTncIEmTa mada SEQ ID NO: 43 DNA VH CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAG

TTAGCTGCAAAGCATCCGGAGGGACGTTTTCTACTTACGCTATCTCTTGGGTGCGCCAG GCCCCGGGCCAGEGCCTEGAGTGGATGGGCCGTATCATCCCGATCCOTGGGCATCGCG AACTACGCCCAGAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAAAGCACCAGCA CCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGC GCGTGAAGTTCGTATGATCTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACTGTTAGCT

CA SEQ ID NO: 44 Cadeia Pesada QVQALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYA

QKFQOGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREVRMIFDYWGQGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL

VKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK > SEQ ID NO: 45 DNA Cadeia Pesada | CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAG Ss

TTAGCTGCAAAGCATCCGGAGGGACGTTTTCTACTTACGCTATCTCTTGGGTGCGCCAG R GCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGGATGGGCCGTATCATCCCGATCOTGGGCATCGCG AACTACGCCCAGAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATTACCGCCGATGAAAGCACCAGCA CCGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGC GCGTGAAGTTCGTATGATCTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACTGTTAGCT CAGCCTCTACGAAAGGCCCAAGCGTATTTCCCCTGGCTCCTTCTAGTAAATCAACCTCA GGTGGTACAGCAGCCCTTGGCTGCCTGGTCAAAGACTATTTCCCCTGTCCGGTGACCG TCTCATGGAACTCAGGTGCTTTGACATCTGGTGTGCATACATTCCCAGCTGTGCTGCAA AGTAGTGGACTGTACAGCCTTTCCAGCGTGGTCACGGTGCCAAGTAGCTCCTTGGGTAC TCAGACTTATATCTGCAATGTGAACCACAAGCCCTCTAACACGAAGGTGGACAAGCGCG TGGAGCCCAAATCTTGCGATAAGACGCATACTTGTCCCCCATGCCCTGCTCCTGAGCTG TTGGGAGGCCCGTCAGTGTTCTTGTTCCCTCCGAAGCCTAAGGACACTTTGATGATAAG TAGGACACCAGAGGTGACTTGCGTGGTGGTTGATGTGTCCCATGAAGATCCCGAGGTC AAATTTAATTGGTACGTAGATGGTGTCGAAGTTCACAATGCTAAGACTAAGCCAAGGGAA GAGCAGTACAACAGTACATATAGGGTAGTCTCCGTGCTGACAGTCCTCCACCAGGACTG GTTGAACGGCAAGGAATACAAATGTAAGGTGTCAAACAAAGCTCTGCCTGCTCCCATTG AGAAAACAATCTCTAAAGCCAAAGGCCAGCCGAGAGAGCCCCAAGTCTACACTTTGCCC CCGAGCAGGGAGGAAATGACCAAGAATCAGGTGAGTCTGACGTGCCTCGTCAAAGGAT TTTATCCATGCGATATTGCAGTTGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCAGAGAACAACTAT AAAACCACACCACCCGTGCTCGACTCTGATGGCAGCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTGAC

AGTCGATAAATCTCGCTGGCAGCAAGGCAATGTGTTCTCCTGCTCCGTCATGCACGAGG CTTTGCATAACCATTATACTCAAAAATCTCTGTCCCTGTCACCTGGTAAA >

S é

SEQ ID NO: 53 VvL DIQMTQOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLOSGVPSRF me QÇ Ses arEanmccas meat SEQ ID NO: 54 DNA VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATCGCGTG

ACCATTACCTGCAGAGCCAGCCAGTCTATTTCTTCTTACCTGGCTTGGTACCAGCAGAAA CCGGGCAAAGCGCCGAAACTATTAATCTACGCTGCTTCTTCTCTGCAAAGCGGCGTGCC GAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATTTCACCCTGACCATTAGCTCTCTG CAACCGGAAGACTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGTCTTACGACTACTACACCTTTGGC

CAGGGCACGAAAGTTGAAATTAAA SEQ ID NO: 55 Cadeia Leve DIQMTQOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLOSGVPSRF

SGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQSYDYYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE s KHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC 3 SEQ ID NO: 56 DNA Cadeia Leve GATATCCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGATCGCGTG R

ACCATTACCTGCAGAGCCAGCCAGTCTATTTCTTCTTACCTGGCTTGGTACCAGCAGAAA CCGGGCAAAGCGCCGAAACTATTAATCTACGCTGCTTCTTCTCTGCAAAGCGGCGTGCC GAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATTTCACCCTGACCATTAGCTCTCTG CAACCGGAAGACTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGTCTTACGACTACTACACCTTTGGC CAGGGCACGAAAGTTGAAATTAAACGTACGGTGGCAGCTCCGTCTGTTTTCATCTITTCC ACCTAGCGACGAGCAACTCAAAAGTGGTACAGCATCCGTGGTTTGTCTGCTGAACAATT TTTACCCCAGGGAGGCTAAGGTCCAGTGGAAAGTCGATAACGCTCTTCAGTCTGGCAAC AGTCAGGAGAGCGTCACAGAGCAGGACTCTAAGGATAGCACTTATAGTCTGTCCTCCAC GCTGACACTGTCTAAAGCGGATTATGAGAAGCACAAGGTTTACGCCTGTGAGGTAACGC ACCAAGGACTCTCCTCCCCAGTTACCAAATCTTTCAACAGAGGAGAATGT

REED áODODTTTTTA SEQ ID NO: 57 HCDR1 (Combina-| GGTFSDYAIS ia SEQ ID NO: 58 HCDR2 (Combina- | GIIPIFGDANYAQKFOG ia Ó SEQ ID NO: 59 HCDR3 (Combina-| EGSSYFYMAY a 3 2 * SEQ ID NO: 64 VvH QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGDANYA me O | aNe0NOToNSTSTAMELssinsEoTaYoEGsSramA cais SEQ ID NO: 65 DNA VH CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGG

TGTCCTGCAAAGCAAGCGGCGGCACCTTCAGCGATTACGCCATCTCTTGGGTCCGACA GGCCCCTGGACAAGGCTTGGAATGGATGGGCGGCATCATCCCCATCTTEGGCGACGCC AATTACGCCCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACGAGTCTACAAGCA CCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGC CAGAGAGGGCAGCAGCTACTTCTACATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACA

RR MA SEQ ID NO: 66 Cadeia Pesada QVQALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGDANYA

QKFQOGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGSSYFYMAYWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS

VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 67 DNA Cadeia Pesada | CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGG >

TGTCCTGCAAAGCAAGCGGCGGCACCTTCAGCGATTACGCCATCTCTTGGGTCCGACA S GGCCCCTGGACAAGGCTTGGAATGGATGGGCGGCATCATCCCCATCTTCGGCGACGECC R AATTACGCCCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACGAGTCTACAAGCA CCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGC CAGAGAGGGCAGCAGCTACTTCTACATGGCCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACA GTTAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGT CTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCTGTCC CGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCC GTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCT CTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTG GACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCA GCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACA CCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTEGGTGGTGGACGTEGTCCCACGA GGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAA GACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACC GTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGG

CCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGC CCCAGGTGTACACCCTGCCccccAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCT

GACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAC GGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGC TTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGT

TCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAG CCTGAGCCCCGGCAAG 3

S é

SEQ ID NO: 75 VvL SYELTQPLSVSVALGOQTARITCSGDNIGSKLASWYQQKPGQAPVLVIYDDSNRPSGIPERFS e Ç eSeonurvoNtoeumeoanTosonaa “““" SEQ ID NO: 76 DNA VL AGCTATGAGCTGACACAGCCTCTGTCCGTGTCTGTGGCTCTGGGACAGACCGCCAGAA

TCACCTGTAGCGGCGACAACATCGGCAGCAAGCTGGCCTCTTGGTATCAGCAGAAGCC TGGACAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTACGACGACAGCAATAGACCCAGCGGCATCCCC GAGAGATTCAGCGGCAGCAATAGCGGCAATACCGCCACACTGACCATCAGCAGAGCAC AGGCTGGCGACGAGGCCGATTACTATTGTGCTGCCACAGCCGGCGACAGATGGGCCTA

TGTTTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGACCGTGCTG SEQ ID NO: 77 Cadeia Leve SYELTQPLSVSVALGOQTARITCSGDNIGSKLASWYQQKPGQAPVLVIYDDSNRPSGIPERFS

GSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCAATAGDRWAYVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPS SEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPE 3 QWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS = SEQ ID NO: 78 DNA Cadeia Leve AGCTATGAGCTGACACAGCCTCTGTCCGTGTCTGTGGCTCTGGGACAGACCGCCAGAA R

TGTTTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGACCGTGCTGGGACAGCCTAAGGCCGCTCCCOTCC GTGACCCTGTTCCCCCccAGCTCCGAGGAACTGCAGGCCAACAAGGCCACCCTGGTGT

GCCTGATCAGCGACTTCTACCCTGGCGCCEGTEACCGTGGCCTGGAAGGCCGACAGCA GCCCCGTGAAGGCCGGCETEGGAGACAACCACCCCCAGCAAGCAGAGCAACAACAAGT ACGCCGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACCCCCGAGCAGTGGAAGAGCCACAGAAGCTA

CAGCTGCCAGGTCACCCACGAGGGCAGCACCGTGGAGAAAACCGTGGCCCCCACCGA rss A EGJEFFE LL gg EEE O A O hLDODTDDIDDODOXX SEQ ID NO: 79 HCDR1 (Combina-| GFTFSSFGMS

RM SEQ ID NO: 80 HCDR2 (Combina- | AISYSGSDTYYADSVKG in SEQ ID NO: 81 HCDR3 (Combina-| DVGVMDY it

S e * SEQ ID NO: 88 VvH QVQALLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSAISYSGSDTYY e O o9nNTSroAmn ano MeNvemMENTEATTE SEQ ID NO: 89 DNA VH CAGGTTCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC

TGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTTTGGCATGAGCTGGGTCCGACA GGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGCCATCAGCTACAGCGGCAGCGATACC TACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACA

CCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGC A Rs os os oo a oo SEQ ID NO: 90 Cadeia Pesada QVQALLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSAISYSGSDTYY

ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGVMDYWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV

MHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 91 DNA Cadeia Pesada | CAGGTTCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC 3 TGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTTTGGCATGAGCTGGGTCCGACA 8

GGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGCCATCAGCTACAGCGGCAGCGATACC R TACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAGAACA CCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGC CAGAGATGTGGGCGTGATGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTTAGCTCT GCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCG

GCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGEGTGAAGGACTACTTCCCCTGTCCCGTGACAGT GTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCoGceGTGCTGCAG

AGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAA

CCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAG AGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCoTGCCCAGCTCCAGAA CTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCcCAAGCCCAAGGACACCCTGATGA

TCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAG AGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCC CAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCAC CAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAG

CCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTA CACCCTGCCCCCcAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTG

GTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCG AGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTA CAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGC

GTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCG GCAAG 3 õ é

SEQ ID NO: 99 VvL SYELTQPLSVSVALGOQTARITCSGDNLGTYYAHWYQQKPGQAPVLVIYSQOSHRPSGIPERFS e Ç eseonTirvaNeoncomDrsavacemer — “SS SEQ ID NO: 100 DNA VL AGCTATGAGCTGACACAGCCTCTGTCCGTGTCTGTGGCTCTGGGACAGACCGCCAGAA

TCACCTGTAGCGGCGATAACCTGGGCACCTACTACGCCCACTGGTATCAGCAGAAGCC TGGACAGGCTCCCGTGCTGGTCATCTACAGCCAGTCTCACAGACCCAGCGGCATCCCC GAGAGATTCAGCGGCAGCAATAGCGGCAATACCGCCACACTGACCATCAGCAGAGCAC AGGCTGGCGACGAGGCCGATTACTATTGTGGCGCTTGGGACGCCCCATCTCCTGAGCT

TGTTTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGACAGTGCTG SEQ ID NO: 101 Cadeia Leve SYELTQPLSVSVALGOQTARITCSGDNLGTYYAHWYQQKPGQAPVLVIYSQOSHRPSGIPERFS

GSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCGAWDAPSPELVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPS SEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPE 3 QWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS Ss SEQ ID NO: 102 DNA Cadeia Leve AGCTATGAGCTGACACAGCCTCTGTCCGTGTCTGTGGCTCTGGGACAGACCGCCAGAA R

TGTTTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGACAGTGCTGGGACAGCCTAAGGCCGCTCCCOTCC GTGACCCTGTTCCCCCccAGCTCCGAGGAACTGCAGGCCAACAAGGCCACCCTGGTGT

GCCTGATCAGCGACTTCTACCCTGGCGCCEGTEACCGTGGCCTGGAAGGCCGACAGCA GCCCCGTGAAGGCCGGCETEGGAGACAACCACCCCCAGCAAGCAGAGCAACAACAAGT ACGCCGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACCCCCGAGCAGTGGAAGAGCCACAGAAGCTA CAGCTGCCAGGTCACCCACGAGGGCAGCACCGTGGAGAAAACCGTGGCCCCCACCGA

RA JEF LEE [ETR O E DT SEQ ID NO: 103 HCDR1 (Combina-| GFTFSSYAMS nn SEQ ID NO: 104 HCDR2 (Combina- | AISGSGGSTYYADSVKG nn GU SEQ ID NO: 105 HCDR3 (Combina- | AFRLYWLDV

RM 3 2 * SEQ ID NO: 112 VvH EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY e Ç /opNTSoIATInamsLIEoTA TENTO MmaNca TATA SEQ ID NO: 113 DNA VH GAAGTTCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC

TGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGACA GGCTCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGCCATCTCTGGCTCTGGCGGCAGCACA TATTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACAC CCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCC AGAGCCTTCCGGCTGTACTGGCTGGATGTTTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGTGT

CATCT SEQ ID NO: 114 Cadeia Pesada EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY

ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAFRLYWLDVWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT

CLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 3 SEQ ID NO: 115 DNA Cadeia Pesada | GAAGTTCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC 3

TGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGACA R GGCTCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGCCATCTCTGGCTCTGGCGGCAGCACA TATTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACAC CCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCC AGAGCCTTCCGGCTGTACTGGCTGGATGTTTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGTGT CATCTGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACT TCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGEGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCTGTCCCGTGA CAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCOGTECT GCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTG GGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACA AGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCC AGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTETTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTG ATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGETGGACGTGTCCCACGAGGAC CCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCEGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCA AGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTECT GCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTG CCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAG GTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCT GTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCETGGAGTGGGAGAGCAACGGCCA GCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTC

CTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCT GCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAG 2

CCCCGGCAAG SS É

SEQ ID NO: 119 VvL DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLOSGVPSRF MM O a SEQ ID NO: 120 DNA VL GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

CCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGAGCATCAGCAGCTACCTGAACTGGTATCAGCAGAA GCCCGGCAAGGCCCCTAAACTGCTGATCTATGCCGCCAGCTCTCTGCAGTCTGGCGTGE CCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCT GCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGTCTACAGCGCCCCTGTGACA

TTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG SEQ ID NO: 121 Cadeia Leve DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLOSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQVYSAPVTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL 3

KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY S

EKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC R SEQ ID NO: 122 DNA Cadeia Leve GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

TTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCA TCTTCCCCCcocAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCT

GAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAG AGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGC CTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCT

GCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCG meme AR [EEE O RR OD ODDDD— SEQ ID NO: 123 HCDR1 (Combina-| GFTFSNYWIS

RM SEQ ID NO: 124 HCDR2 (Combina- | RIKSKTYGGTTDYAEPVKG ns SEQ ID NO: 125 HCDR3 (Combina-| TSRRSYAFDY e ê e * SEQ ID NO: 132 VvH EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTYGGTT e | 9ASMrTERDoSAmamEITEoTAT CAR romcaoTamvas.

SEQ ID NO: 133 DNA VH GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC

TGAGCTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCAGCAACTACTGGATCAGCTGGGTCCGACA GGCCCCTGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGGACGGATCAAGAGCAAGACCTACGGCGG CACCACCGATTATGCCGAGCCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGC AAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGCECCAGAACCAGCAGAAGAAGCTACGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACACTG

GTTACCGTTAGCTCT SEQ ID NO: 134 Cadeia Pesada EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTYGGTT

DYAEPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARTSRRSYAFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR

VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS - CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK = SEQ ID NO: 135 DNA Cadeia Pesada | GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC R

TGAGCTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCAGCAACTACTGGATCAGCTGGGTCCGACA GGCCCCTGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGGACGGATCAAGAGCAAGACCTACGGCGG CACCACCGATTATGCCGAGCCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGC AAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGCECCAGAACCAGCAGAAGAAGCTACGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACACTG GTTACCGTTAGCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCA GCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCC

CTGTCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTC CCCGCEsGTECTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCC

TCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACAC

CAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCC CTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCccAAGCOCC

AAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTEGGTGGACGTGET CCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAA CGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTG CTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCA

ACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACG GGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCcceccAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT

GTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCGTGGAGTGGGAG AGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACG GCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAA & CGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCC S CTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG É

SEQ ID NO: 143 VvL DIQMTOSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRF MM a SEQ ID NO: 144 DNA VL GACATCCAGATGACACAGAGCCCCAGCACACTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

CCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGAGCATCTCCTCTTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAA GCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGATGCCAGCAGCCTGGAAAGCGGCGTG CCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGAGTTCACCCTGACCATATCTAGCCT GCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGATCACAAGATACCCCGTGACC

TTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG SEQ ID NO: 145 Cadeia Leve DIQMTOSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRF - SGSGSGTEFTLTISSLOPEDFATY YCQQITRYPVTFGQAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL 8

KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY E

EKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 146 DNA Cadeia Leve GACATCCAGATGACACAGAGCCCCAGCACACTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

GAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAG AGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGC CTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCT GCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCG

AGTGC [EEE O RR OD OIDIO— SEQ ID NO: 123 HCDR1 (Combina-| GFTFSNYWIS

RM A SEQ ID NO: 124 HCDR2 (Combina- | RIKSKTYGGTTDYAEPVKG rm a pon SEQ ID NO: 147 HCDR3 (Combina-| VSGYYSHSGGFDV e E :

S * SEQ ID NO: 149 VvH EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTYGGTT

DYAEPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARVSGYYSHSGGFDVWGQGTLV TVSS TGAGCTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCAGCAACTACTGGATCAGCTGGGTCCGACA GGCCCCTGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGGACGGATCAAGAGCAAGACCTACGGCGG CACCACCGATTATGCCGAGCCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGC AAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGCGCCAGAGTGTCTGGCTACTACTCTCACAGCGGCGGCTTTGATGTGTGGGGCCAG

GGAACACTGGTCACCGTTAGTTCT SEQ ID NO: 151 Cadeia Pesada EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTYGGTT

DYAEPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARVSGYYSHSGGFDVWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL

QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN & STYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT Ss

KNQVSLTCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ ER

GNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 152 DNA Cadeia Pesada | GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC

TGAGCTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCAGCAACTACTGGATCAGCTGGGTCCGACA GGCCCCTGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGGACGGATCAAGAGCAAGACCTACGGCGG CACCACCGATTATGCCGAGCCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGC AAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGCGCCAGAGTGTCTGGCTACTACTCTCACAGCGGCGGCTTTGATGTGTGGGGCCAG GGAACACTGGTCACCGTTAGTTCTGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGC CCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGAC TACTTCCCCTGTCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCA CACCTTCCCCEGCCGTECTECAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACA GTGCCCTCCAGCTCTETGGGAACCCAGACCTATATCETGCAACGTGAACCACAAGCCCAG

CAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGC CCCCCeTtecccAGCOTCECAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCEGTGTTCCTGTTCCCCCCCA

AGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGG ACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGT GCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGCTEGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAG

TCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCA GCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCcocAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAA CCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCGTGGAG - TGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACA 3

GCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCA É GGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAG AAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG

SEQ ID NO: 159 VvL DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLAOSGVPSRF e Ç SsesemTEsaronmcaqmPaTaemes SEQ ID NO: 160 DNA VL GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

CCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAA ACCCGGCAAGGTGCCCAAGCTGCTGATCTACGCTGCCAGCACACTGCAGAGCGGAGTG

CCTAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTCACCCTGACCATATCTAGCCT GCAGCCAGAGGACGTGGCCACCTACTACTGTCAGAAAACCTGGCGGACCCCTGGCACA > TTTGGCCAGGGAACAAAGGTGGAAATCAAG 3 SEQ ID NO: 161 Cadeia Leve DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLAOSGVPSRF R

SGSGSGTDFTLTISSLOPEDVATYYCAOKTWRTPGTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOQWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD

YEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 162 DNA Cadeia Leve GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

CCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAA ACCCGGCAAGGTGCCCAAGCTGCTGATCTACGCTGCCAGCACACTGCAGAGCGGAGTG CCTAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTCACCCTGACCATATCTAGCCT GCAGCCAGAGGACGTGGCCACCTACTACTGTCAGAAAACCTGGCGGACCCCTGGCACA

TTTGGCCAGGGAACAAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCA TCTTCCCCCcocAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCT

AGTGC [FREE O RR O DDLEFIPPÉÔU— SEQ ID NO: 103 HCDR1 (Combina-| GFTFSSYAMS

RM A SEQ ID NO: 104 HCDR2 (Combina- | AISGSGGSTYYADSVKG nn SEQ ID NO: 163 HCDR3 (Combina- | SRLIAPWLDY >

É SEQ ID NO: 165 VvH EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY O ovoeTSOIMMONEEoTMORSRAOTGDTTas.

SEQ ID NO: 166 DNA VH GAAGTTCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC

TGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGACA GGCTCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGCCATCTCTGGCTCTGGCGGCAGCACA TATTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACAC CCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCC AGAAGCAGACTGATCGCCCCTTGGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCG

TGTCATCT SEQ ID NO: 167 Cadeia Pesada EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY

ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSRLIAPWLDYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL - FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV S SVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL ER TCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC

SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 168 DNA Cadeia Pesada | GAAGTTCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC

TGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGACA GGCTCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGCCATCTCTGGCTCTGGCGGCAGCACA TATTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACAC CCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCC AGAAGCAGACTGATCGCCCCTTGGCTGGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCG TGTCATCTGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCT ACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCTGTCCCG

TGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGcesT

GCTGCAGAGCAGCGGCCTEGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCT CTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGG ACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCE TCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACC CTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTEGGACGTGTCCCACGAG GACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGA CCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGT GCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCC

CTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCC CAGGTGTACACCCTGCCCCCcAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGA o CCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGG Ss

CCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTC É TTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCA GCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCT GAGCCCCGGCAAG

SEQ ID NO: 171 VvL DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLOSGVPSRF e Ç SSeseomTEsaromm canoas te SEQ ID NO: 172 DNA VL GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

CCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGAGCATCAGCAGCTACCTGAACTGGTATCAGCAGAA

GCCCGGCAAGGCCCCTAAACTGCTGATCTATGCCGCCAGCTCTCTGCAGTCTGGCGTGE CCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCT o GCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGTCTACGGCAGCCCTCCTACA =

TTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG R SEQ ID NO: 173 Cadeia Leve DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLOSGVPSRF

SGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQVYGSPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY

EKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 174 DNA Cadeia Leve GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

CCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGAGCATCAGCAGCTACCTGAACTGGTATCAGCAGAA GCCCGGCAAGGCCCCTAAACTGCTGATCTATGCCGCCAGCTCTCTGCAGTCTGGCGTGE CCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCT GCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGTCTACGGCAGCCCTCCTACA TTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCA

TCTTCCCCCcocAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCT

AGTGC [TERRE O RR OODOIDIO— SEQ ID NO: 175 HCDR1 (Combina-| GYSFTSYWIG e an re SEQ ID NO: 176 HCDR2 (Combina- | IIYPGDSDTRYSPSFOG

RM SEQ ID NO: 177 HCDR3 (Combina- | GSSAASGLSGDL S me e

Eee E sFFEGOSRRSTATOSSSTTANTONCSSSCESSONTGaSTIVIVSS | SEQ ID NO: 185 DNA VH GAAGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCTGGCGAGAGCCTGAAGA

TCTCCTGCAAAGGCAGCGGCTACAGCTTCACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTCCGACA GATGCCTGGCAAAGGCCTTGAGTGGATGGGCATCATCTACCCCGGCGACAGCGACACC AGATACAGCCCTAGCTTTCAGGGCCAAGTGACCATCAGCGCCGACAAGAGCATCAGCA CAGCCTACCTGCAGTGGTCCAGCCTGAAGGCCTCTGACACCGCCATGTACTACTGTGC CAGAGGAAGCTCTGCCGCCTCTGGACTGTCTGGCGATCTTTGGGGACAGGGCACACTG

GTCACAGTGTCTAGT SEQ ID NO: 186 Cadeia Pesada EVOLVAOSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRY

SPSFQGQVTISADKSISTAYLOWSSLKASDTAMYYCARGSSAASGLSGDLWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSG o LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV 8

FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR ER VVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS

CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 187 DNA Cadeia Pesada | GAAGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCTGGCGAGAGCCTGAAGA

TCTCCTGCAAAGGCAGCGGCTACAGCTTCACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTCCGACA GATGCCTGGCAAAGGCCTTGAGTGGATGGGCATCATCTACCCCGGCGACAGCGACACC AGATACAGCCCTAGCTTTCAGGGCCAAGTGACCATCAGCGCCGACAAGAGCATCAGCA CAGCCTACCTGCAGTGGTCCAGCCTGAAGGCCTCTGACACCGCCATGTACTACTGTGC CAGAGGAAGCTCTGCCGCCTCTGGACTGTCTGGCGATCTTTGGGGACAGGGCACACTG GTCACAGTGTCTAGTGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCA GCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCC CTSGTCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTC CCCGCEGTECTGCAGAGCAGCGGCCTEGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCC TCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACAC

AAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTEGGTGGACGTGET CCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAA CGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTG

CTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCA ACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACG ra GGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCcceccAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT Ss

GTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCGTGGAGTGGGAG É AGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACG GCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAA CGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCC CTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG

SEQ ID NO: 190 VvL DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLOSGVPSRF

MM SEQ ID NO: 191 DNA VL GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

CCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGAGCATCAGCAGCTACCTGAACTGGTATCAGCAGAA GCCCGGCAAGGCCCCTAAACTGCTGATCTATGCCGCCAGCTCTCTGCAGTCTGGCGTGE o CCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCT Ss

GCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGACTACTACAGCCCCTTCACCT ER

TTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG SEQ ID NO: 192 Cadeia Leve DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLOSGVPSRF

SGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQDYYSPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY

EKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 193 DNA Cadeia Leve GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

CCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGAGCATCAGCAGCTACCTGAACTGGTATCAGCAGAA GCCCGGCAAGGCCCCTAAACTGCTGATCTATGCCGCCAGCTCTCTGCAGTCTGGCGTGE CCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCT GCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGACTACTACAGCCCCTTCACCT

TTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCAT CTTCCCCcoecAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTEGTGCCTGCT

GAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAG AGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGC CTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCT GCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCG AGTGC

FRETES O EDTA SEQ ID NO: 103 HCDR1 (Combina-| GFTFSSYAMS

RM SEQ ID NO: 104 HCDR2 (Combina- | AISGSGGSTYYADSVKG o SEQ ID NO: 194 HCDR3 (Combina- | AYKLSWLDL R

RM A

SEQ ID NO: 196 VvH EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY me nã eeTTSOSAmMana oro mancImE SEQ ID NO: 197 DNA VH GAAGTTCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC

TGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGACA GGCTCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGCCATCTCTGGCTCTGGCGGCAGCACA TATTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACAC CCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCC AGAGCCTACAAGCTGAGCTGGCTGGATCTTTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTGT

CATCT SEQ ID NO: 198 Cadeia Pesada EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAYKLSWLDLWGQGTLVTVSSAST o KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYS 3

LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF R PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS

VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 199 DNA Cadeia Pesada | GAAGTTCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC

TGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGACA GGCTCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGCCATCTCTGGCTCTGGCGGCAGCACA TATTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACAC CCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCC AGAGCCTACAAGCTGAGCTGGCTGGATCTTTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTGT CATCTGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACT

TCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCTGTCCCGTGA CAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCeGCCeT6CT

GCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTG

GGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACA AGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCoTGCCCAGCTCOC

AGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTG ATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTEGGTEGGACGTGTCCCACGAGGAC CCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCA

AGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCT GCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTG o CCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAG 38 GTGTACACCCTGCCCCCcAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCT É

GTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCA GCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTC CTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCT GCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAG CCCCGGCAAG

SEQ ID NO: 202 VvL DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLOSGVPSRF me | SsseserTSartanTccantunTaastaeã “SS SEQ ID NO: 203 DNA VL GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA CCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGAGCATCAGCAGCTACCTGAACTGGTATCAGCAGAA 8

GCCCGGCAAGGCCCCTAAACTGCTGATCTATGCCGCCAGCTCTCTGCAGTCTGGCGTGE S CCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCT PR GCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAAGTTTGGTACGCCCCTGTGACC

TTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG SEQ ID NO: 204 Cadeia Leve DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLOSGVPSRF

SGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQVWYAPVTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOQWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD

YEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 205 DNA Cadeia Leve GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

CCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGAGCATCAGCAGCTACCTGAACTGGTATCAGCAGAA GCCCGGCAAGGCCCCTAAACTGCTGATCTATGCCGCCAGCTCTCTGCAGTCTGGCGTGE CCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCT GCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAAGTTTGGTACGCCCCTGTGACC

AGTGC FERE O a OOCCOP9L»O——— SEQ ID NO: 206 HCDR1 (Combina- | GFTFSNAWMS Er o see SEQ ID NO: 207 HCDR2 (Combina- | RIKSKTDAGTTDYAAPVKG Ss rm o pe SEQ ID NO: 208 HCDR3 (Combina- | TIYPSAPSSSLDY ma e

SEQ ID NO: 215 VvH EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDAGT

TDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARTIYPSAPSSSLDYWGQGTLVT vssS SEQ ID NO: 216 DNA VH GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC

TGAGCTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCAGCAATGCCTGGATGAGCTGGGTCCGACA GGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAGTGGGTCGGACGGATCAAGAGCAAGACCGATGCCGG CACCACCGATTATGCTGCCCCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGC AAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGCGCCAGAACAATCTACCCCAGCGCTCCTAGCAGCAGCCTGGATTATTGGGGCCAG

GGCACACTGGTCACCGTGTCATCT S SEQ ID NO: 217 Cadeia Pesada EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDAGT =

TDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARTIYPSAPSSSLDYWGQGTLVT R VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG

NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 218 DNA Cadeia Pesada | GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC

TGAGCTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCAGCAATGCCTGGATGAGCTGGGTCCGACA GGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAGTGGGTCGGACGGATCAAGAGCAAGACCGATGCCGG CACCACCGATTATGCTGCCCCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGC AAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGCGCCAGAACAATCTACCCCAGCGCTCCTAGCAGCAGCCTGGATTATTGGGGCCAG GGCACACTGGTCACCGTGTCATCTGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGG CCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTEGCCTGGTGAAGGA CTACTTCCCCTGTCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGE CACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTEGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGA CAGTGCCCTCCAGCTCTETGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCC

AGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCT GCCCCCCeTEGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCC

CAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGE GACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG S GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGG S TGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAA É

AGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGC CAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCcccAGCCGGGAGGAGATGACCAAG

AACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCGTGGA GTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGA CAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAG CAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCC AGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG

SEQ ID NO: 221 VvL DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLAOSGVPSRF me Serem artpum cc meras CS a SEQ ID NO: 222 DNA VL GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA S

CCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAA P ACCCGGCAAGGTGCCCAAGCTGCTGATCTACGCTGCCAGCACACTGCAGAGCGGAGTG CCTAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTCACCCTGACCATATCTAGCCT GCAGCCAGAGGACGTGGCCACCTACTATTGCCAGCAGCTGATCTTCTTCCCTCTGACCOT

TTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG SEQ ID NO: 223 Cadeia Leve DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLAOSGVPSRF

SGSGSGTDFTLTISSLOPEDVATYYCQQLIFFPLTFGQAQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE

KHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 224 DNA Cadeia Leve GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA a VACUTOMGNGCOAGCCAGOBCATENCGMETAGOTOGCOTOGTATORGENCMS

ACCCGGCAAGGTGCCCAAGCTGCTGATCTACGCTGCCAGCACACTGCAGAGCGGAGTG CCTAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTCACCCTGACCATATCTAGCCT GCAGCCAGAGGACGTGGCCACCTACTATTGCCAGCAGCTGATCTTCTTCCCTCTGACCOT

AGTGC FREE 3 OO SEQ ID NO: 206 HCDR1 (Combina- | GFTFSNAWMS Ss rm e O SEQ ID NO: 207 HCDR2 (Combina- | RIKSKTDAGTTDYAAPVKG re E a SEQ ID NO: 225 HCDR3 (Combina- | ASHRLHSLFDV me a de

SEQ ID NO: 227 VvH EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDAGT

TDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARASHRLHSLFDVWGQGTLVTVY Ss SEQ ID NO: 228 DNA VH GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC

TGAGCTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCAGCAATGCCTGGATGAGCTGGGTCCGACA GGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAGTGGGTCGGACGGATCAAGAGCAAGACCGATGCCGG

CACCACCGATTATGCTGCCCCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGC AAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTA Ss CTGTGCCAGAGCCTCTCACAGACTGCACAGCCTGTTTGACGTGTGGGGCCAGGGAACA Ss

CTGGTCACCGTTAGTTCT R SEQ ID NO: 229 Cadeia Pesada EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDAGT

TDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARASHRLHSLFDVWGQGTLVTVY SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 230 DNA Cadeia Pesada | GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC va PO oroToccocTIcCOETTCA GE TICAGOMTSCOTOGNTOADOTEGGTOGENAA

GGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAGTGGGTCGGACGGATCAAGAGCAAGACCGATGCCGG CACCACCGATTATGCTGCCCCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGC AAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGTGCCAGAGCCTCTCACAGACTGCACAGCCTGTTTGACGTGTGGGGCCAGGGAACA CTGGTCACCGTTAGTTCTGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCA GCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTT CCCCTGTCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACC TTCCCCGCCGTGCTECAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTG CCCTCCAGCTCTCETGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAA

CACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCC CCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTEGTTCCTGTTCCCCCCCAAGC Ss CCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGT 3

GTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA É CAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCC GTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCT

CCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCC ACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCcccAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCA

GGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCGTGGAGTGEG GAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGC GACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGG GCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAA GTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG

S SEQ ID NO: 233 VvL DIQMTOSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRF S me SSeseTEmsRaremmimcana nara O É SEQ ID NO: 234 DNA VL GACATCCAGATGACACAGAGCCCCAGCACACTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

CCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGAGCATCTCCTCTTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAA GCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGATGCCAGCAGCCTGGAAAGCGGCGTG CCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGAGTTCACCCTGACCATATCTAGCCT GCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTATTGTCAGCAGGGCCTGTTCTACCCTCACACCT

TTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG SEQ ID NO: 235 Cadeia Leve DIQMTOSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRF

SGSGSGTEFTLTISSLOPEDFATY YCQQOGLFYPHTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 236 DNA Cadeia Leve — | GACATCCAGATGACACAGAGCCCCAGCACACTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

CCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGAGCATCTCCTCTTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAA GCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGATGCCAGCAGCCTGGAAAGCGGCETE CCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGAGTTCACCCTGACCATATCTAGCCT GCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTATTGTCAGCAGGGCCTGTTCTACCCTCACACCT TTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCAT CTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTECCTECT GAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAG AGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGC

CTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCT GCGAGGTGACCCACCAGGGCCTEGTCCAGCCCCGTEACCAAGAGCTTCAACAGEGGCG s AGTGC 8

CERA SEE É SEQ ID NO: 206 HCDR1 (Combina- | GFTFSNAWMS su uu SEQ ID NO: 207 HCDR2 (Combina- | RIKSKTDAGTTDYAAPVKG A a PP SEQ ID NO: 237 HCDR3 (Combina-| DEYPWGWFDV su a

SEQ ID NO: 239 VvH EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDAGT

TDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDEYPWGWFDVWGQOGTLVTV Ss SEQ ID NO: 240 DNA VH GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC

TGAGCTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCAGCAATGCCTGGATGAGCTGGGTCCGACA GGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAGTGGGTCGGACGGATCAAGAGCAAGACCGATGCCGG Ss

CACCACCGATTATGCTGCCCCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGC S AAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTA R CTGCGCCAGAGATGAGTACCCCTGGGGATGGTTCGATGTGTGGGGACAGGGAACCCTG

GTCACCGTTAGTTCT SEQ ID NO: 241 Cadeia Pesada EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDAGT

TDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDEYPWGWFDVWGQOGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 242 DNA Cadeia Pesada | GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC

TGAGCTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCAGCAATGCCTGGATGAGCTGGGTCCGACA GGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAGTGGGTCGGACGGATCAAGAGCAAGACCGATGCCGG CACCACCGATTATGCTGCCCCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGC AAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGCEGCCAGAGATGAGTACCCCTGGGGATGGTTCGATGTGTGGGGACAGGGAACCCTG GTCACCGTTAGTTCTGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCA GCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCC

TCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACAC N CAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCC Ss

CTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCC É AAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGET CCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAA CGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTG CTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCA

ACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACG GGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCccocAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT

GTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCGTGGAGTGGGAG AGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACG GCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAA CGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCC

E o ESSE 2 ê * SEQ ID NO: 248 VvL DIQMTOSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLOSGVPSRF me QÇ SSseserTS arena: — SEQ ID NO: 249 DNA VL GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCTCCGTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

CCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCTCTTCTTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAA GCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCTTCCAGTCTGCAGAGCGGCGTE CCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCT GCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACATCTTCTACCCTCTGACCOT

TCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG SEQ ID NO: 250 Cadeia Leve DIQMTOSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLOSGVPSRF a SoscsTorTSSrEDnATOVCOOnTUTGaS TREINAM SVMTPISDEALS

SGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE rm nua Sema ssrmentas “““=“""“""S SS SEQ ID NO: 251 DNA Cadeia Leve GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCTCCGTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

TCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCAT CTTCCCCcoecAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTEGTGCCTGCT

GAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAG AGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGC N CTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCT S GCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCG É

AGTGC FERE O a OOCCOOSDOTO SEQ ID NO: 206 HCDR1 (Combina- | GFTFSNAWMS rm SEQ ID NO: 207 HCDR2 (Combina- | RIKSKTDAGTTDYAAPVKG rea SEQ ID NO: 252 HCDR3 (Combina-| VASPSAPGGFDY me a e

SEQ ID NO: 254 VvH EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDAGT

TDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARVASPSAPGGFDYWGQGTLVT vssS SEQ ID NO: 255 DNA VH GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC N

TGAGCTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCAGCAATGCCTGGATGAGCTGGGTCCGACA S GGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAGTGGGTCGGACGGATCAAGAGCAAGACCGATGCCGG PR CACCACCGATTATGCTGCCCCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGC AAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGCGCCAGAGTGGCTTCTCCTTCTGCTCCCGGCGGATTCGATTATTGGGGCCAGGGA

ACACTGGTCACCGTGTCTAGT SEQ ID NO: 256 Cadeia Pesada EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDAGT

TDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARVASPSAPGGFDYWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK

NQVSLTCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG RA Rr SEQ ID NO: 257 DNA Cadeia Pesada | GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAACCTGGCGGCTCTCTGAGAC

TGAGCTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCAGCAATGCCTGGATGAGCTGGGTCCGACA GGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAGTGGGTCGGACGGATCAAGAGCAAGACCGATGCCGG CACCACCGATTATGCTGCCCCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGGGACGACAGC AAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGCEGCCAGAGTGGCTTCTCCTTCTGCTCCCGGCGGATTCGATTATTGGGGCCAGGGA ACACTGGTCACCGTGTCTAGTGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCC CCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTA CTTCCCCTGTCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCAC N ACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACA E GTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAG ER

CAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGC CCCCCeTGCCcAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCOTGTTCCCCCCCA

AGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTEGTEG ACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGT GCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTG TCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAG

TCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCA GCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCcccAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAA

CCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACA GCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCA GGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAG

AAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG 2 e * SEQ ID NO: 260 VvL DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLAOSGVPSRF ee O | SseseemaTsarouM caca menTcasneae: O SEQ ID NO: 261 DNA VL GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

CCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAA ACCCGGCAAGGTGCCCAAGCTGCTGATCTACGCTGCCAGCACACTGCAGAGCGGAGTG CCTAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTCACCCTGACCATATCTAGCCT GCAGCCAGAGGACGTGGCCACCTACTACTGTCAGCAGAGCCTGTTCGCCCCTTTCACC TTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG

SEQ ID NO: 262 Cadeia Leve DIQMTQOSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLOSGVPSRF

SGSGSGTDFTLTISSLOPEDVATY YCQQSLFAPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY

EKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 263 DNA Cadeia Leve GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGA

CCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAA ACCCGGCAAGGTGCCCAAGCTGCTGATCTACGCTGCCAGCACACTGCAGAGCGGAGTG CCTAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTCACCCTGACCATATCTAGCCT GCAGCCAGAGGACGTGGCCACCTACTACTGTCAGCAGAGCCTGTTCGCCCCTTTCACC

TTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCA TCTTCCCCcccAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCT N GAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAG 3

AGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGC ER CTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCT GCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCG AGTGC

[00283] “Outros anticorpos da invenção incluem aqueles em que os aminoácidos ou ácidos nucleicos que codificam os aminoácidos foram mutados, tendo ainda pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95 de porcenta- gem de identidade com as sequências descritas na Tabela 2. Em al- gumas modalidades, 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados nas regiões variáveis quando comparados com as regiões variáveis repre- sentadas na sequência descrita na Tabela 2, retendo ao mesmo tempo substancialmente a mesma atividade terapêutica que os anticorpos mencionados na Tabela 2.

[00284] Uma vez que cada um destes anticorpos se pode ligar a PMEL17, as sequências de cadeia pesada de comprimento total e de cadeia leve de comprimento total VH, VL (sequências de aminoácidos e as sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de ami- noácidos) podem ser "misturadas e correlacionadas" para criar outros anticorpos de ligação a PMEL17 da invenção. Tais anticorpos de liga- ção a PMEL17 "misturados e correlacionados” podem ser testados usando os ensaios de ligação conhecidos na técnica (por exemplo, ELISA e outros ensaios descritos na seção de Exemplos). Quando es- Sas cadeias são misturadas e correlacionadas, uma sequência VH de um pareamento VH/VL específico deve ser substituída por uma se- quência VH estruturalmente similar. De modo semelhante, uma se- quência de cadeia pesada de comprimento total de um pareamento específico de cadeia pesada de comprimento total / cadeia leve de comprimento total deve ser substituída por uma sequência de cadeia pesada de comprimento total estruturalmente similar. De modo seme- lhante, uma sequência VL de um pareamento VH/VL específico deve ser substituída por uma sequência VL estruturalmente similar. De mo- do semelhante, uma sequência de cadeia leve de comprimento total de um pareamento específico de cadeia pesada de comprimento total / cadeia leve de comprimento total deve ser substituída por uma se-

quência de cadeia leve de comprimento total estruturalmente similar. Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado ou região de ligação ao antígeno do mesmo que tem: uma região variável de cadeia pesada que compreende uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 10, 42, 64, 88, 112, 132, 149, 165, 184, 196, 215, 227, 239 ou 254; e uma região variável de cadeia leve que compreende uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 21, 25, 29, 53, 75, 99, 119, 143, 159, 171, 190, 202, 221, 233, 248 ou 260; em que o anticorpo se liga especificamente a PMEL17.

[00285] Em outro aspecto, a invenção fornece (i) um anticorpo mo- noclonal isolado que tem: uma cadeia pesada de comprimento total que compreende uma sequência de aminoácidos que foi otimizada pa- ra expressão na célula de um sistema de expressão de mamíferos se- lecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12, 44, 66, 90, 114, 134, 151, 167, 186, 198, 217, 229, 241 ou 256; e uma cadeia leve de comprimento total que compreende uma sequência de aminoácidos que foi otimizada para expressão na célula de um mamífero selecio- nado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 23, 27, 31, 55, 77, 101, 121, 145, 161, 173, 192, 204, 223, 235, 250 ou 262; ou (ii) uma proteí- na funcional que compreende uma porção de ligação da mesma.

[00286] Em outro aspecto, a presente invenção fornece anticorpos de ligação a PMEL17 que compreendem as CDR1s, CDR2s e CDR3s de cadeia pesada e cadeia leve, como descrito na Tabela 2, ou combi- nações das mesmas. As sequências de aminoácidos das CDR1s VH dos anticorpos são mostradas, por exemplo, em SEQ ID NOs: 1, 4,5, 7, 33, 36, 37, 39, 57, 60, 79, 82, 83, 85, 103, 106, 107, 109, 123, 126, 127, 129, 175, 178, 179, 181, 206, 209, 210, e 212. As sequências de aminoácidos das CDR2s VH dos anticorpos são mostradas, por exem- plo, em SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 34, 38, 40, 58, 61, 62, 80, 84, 86, 104,

108, 110, 124, 128, 130, 176, 180, 182, 207, 211, e 213. As sequên- cias de aminoácidos das CDR3s VH dos anticorpos são mostradas, por exemplo, em SEQ ID NOs: 3, 9, 35, 41, 59, 63, 81, 87, 105, 111, 125, 131, 147, 148, 163, 164, 177, 183, 194, 195, 208, 214, 225, 226, 237, 238, 252, e 253. As sequências de aminoácidos das CDR1s VL dos anticorpos são mostradas, por exemplo, em SEQ ID NOs: 14, 17, 20, 46, 49, 52, 68, 71, 74, 92, 95, 98, 116, 136, 139, 142, 153, 156, 158, 243, 245, e 247. As sequências de aminoácidos das CDR2s VL dos anticorpos são mostradas, por exemplo, em SEQ ID Nos: 15, 18, 47, 50, 69, 72, 93, 96, 137, 140, e 154. As sequências de aminoácidos das CDR3s VL dos anticorpos são mostradas, por exemplo, em SEQ ID NOs: 16, 19, 48, 51, 70, 73, 94, 97, 117, 118, 138, 141, 155, 157, 169, 170188, 189, 200, 201, 219, 220, 231, 232, 244, 246, 258, e 259.

[00287] Dado que cada um desses anticorpos pode se ligar a PMEL17 e que a especificidade de ligação ao antígeno é fornecida principalmente pelas regiõês CDR1, 2 e 3, as sequências CDR1, CDR?2 e CDR3 VH e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 VL podem ser "misturadas e correlacionadas" (ou seja, CDRs de anticorpos diferen- tes podem ser misturadas e correlacionadas). Tais anticorpos de liga- ção a PMEL17 "misturados e correlacionados” podem ser testados usando os ensaios de ligação conhecidos na técnica e os ensaios descritos em Exemplos (por exemplo, ELISA). Quando as sequências de CDR VH são misturadas e correlacionadas, a sequência de CDR1, CDR?2 e/ou CDR3 de uma sequência VH específica deve ser substituí- da por uma sequência (ou sequências) de CDR estruturalmente simi- lar. De modo semelhante, quando as sequências de CDR VL são mis- turadas e correlacionadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência VL específica deve ser substituída por uma se- quência (ou sequências) de CDR estruturalmente similar. Será pron- tamente evidente para o versado na técnica que sequências VH e VL inovadoras podem ser criadas substituindo-se uma ou mais sequên- cias de região CDR VH e/ou VL por sequências estruturalmente simila- res das sequências de CDR mostradas no presente documento para anticorpos monoclonais da presente invenção.

[00288] “Consequentemente, em algumas modalidades, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado ou região de liga- ção ao antígeno do mesmo que compreende uma CDR1 de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 4, 5, 7, 33, 36, 37, 39, 57, 60, 79, 82, 83, 85, 103, 106, 107, 109, 123, 126, 127, 129, 175, 178, 179, 181, 206, 209, 210, e 212; uma CDR2 de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 34, 38, 40, 58, 61, 62, 80, 84, 86, 104, 108, 110, 124, 128, 130, 176, 180, 182, 207, 211, e 213; uma CDR3 de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoá- cidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 9, 35, 41, 59, 63, 81, 87, 105, 111, 125, 131, 147, 148, 163, 164, 177, 183, 194, 195, 208, 214, 225, 226, 237, 238, 252, e 253; uma CDR1 de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 14, 17, 20, 46, 49, 52, 68, 71, 74, 92, 95, 98, 116, 136, 139, 142, 153, 156, 158, 243, 245, e 247; uma CDRZ?2 de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 15, 18, 47, 50, 69, 72, 93, 96, 137, 140, e 154; e uma CDR3 de cadeia leve que compre- ende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que con- siste em SEQ ID NOs: 16, 19, 48, 51, 70, 73, 94, 97, 117, 118, 138, 141, 155, 157, 169, 170, 188, 189, 200, 201, 219, 220, 231, 232, 244, 246, 258, e 259; em que o anticorpo se liga especificamente a PMEL17.

[00289] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma CDR1 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:1, 4, 5 ou 7, uma CDR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:2, 6 ou 8; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:3 ou 9; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:14, 17 ou 20; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:15 ou 18; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:16 ou 19.

[00290] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma CDR1 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:33, 36, 37 ou 39, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:34, 38 ou 40; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:35 ou 41; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:46, 49 ou 52; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 ou 50; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:48 ou 51.

[00291] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma CDR1 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:5, 7, 57 ou 60, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:58, 61 ou 62; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:59 ou 63; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:68, 71 ou 74; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:69 ou 72; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:70 ou 73.

[00292] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma CDR1 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:79, 82, 83 ou 85, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:80, 84 ou 86; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:81 ou 87; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:92, 95 ou 98; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:93 ou 96; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:94 ou 97.

[00293] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma CDR1 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:103, 106, 107 ou 109, uma CDR?2 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:104, 108 ou 110; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:105 ou 111; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, 52 ou 116; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 ou 50; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:117 ou 118.

[00294] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma CDR1 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:123, 126, 127 ou 129, uma CDR?2 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:124, 128 ou 130; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:125 ou 131; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:136, 139 ou 142; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:137 ou 140; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:138 ou 141.

[00295] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma CDR1 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:123, 126, 127 ou 129, uma CDR?2 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:124, 128 ou 130; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:147 ou 148; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:153, 156 ou 158; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 ou 154; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:155 ou 157.

[00296] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma CDR1 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:103, 106, 107 ou 109, uma CDR?2 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:104, 108 ou 110; uma CDR3 de cadeia pesada da

SEQ ID NO:163 ou 164; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, 52 ou 116; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 ou 50; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:169 ou 170.

[00297] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma CDR1 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:175, 178, 179 ou 181, uma CDR?2 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:176, 180 ou 182; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:177 ou 183; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, 52 ou 116; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 ou 50; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:188 ou 189.

[00298] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma CDR1 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO: 103, 106, 107 ou 109, uma CDR?2 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO: 104, 108 ou 110; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:194 ou 195; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 49, 52 ou 116; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 47 ou 50; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:200 ou 201.

[00299] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma CDR1 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:206, 209, 210 ou 212, uma CDR?2 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:207, 211 ou 213; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:208 ou 214; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:153, 156 ou 158; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 ou 154; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:219 ou 220.

[00300] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma CDR1 de cadeia pe-

sada da SEQ ID NO: 206, 209, 210 ou 212, uma CDR?2 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO: 207, 211 ou 213; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:225 ou 226; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:136, 139 ou 142; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:137 ou 140; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:231 ou 232.

[00301] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma HCDR1 de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 206, 209, 210 ou 212, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207, 211 ou 213, e uma HCDR3 da SEQ ID NO:237 ou 238; e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:243, 245 ou 247, uma LCDR?2 da SEQ ID NO:47 ou 50 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:244 ou

246.

[00302] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma HCDR1 de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 206, 209, 210 ou 212, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207, 211 ou 213, e uma HCDR3 da SEQ ID NO:252 ou 253; e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:153, 156 ou 158, uma LCDR?2 da SEQ ID NO:50 ou 154 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:258 ou 259.

[00303] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende sequências de CDR se- lecionadas dentre: a) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:1, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:2, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:3, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:14,

uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:15 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:16; b) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 4, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:2, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:3, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:14, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:15 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:16; c) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:5, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:6, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:3, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:17, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 18, e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 19; ou d) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:7, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:8, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:9, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:20, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:18 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:16.

[00304] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende sequências de CDR se- lecionadas dentre: a) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:33, uma CDRZ?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:34, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:35, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:46, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:48; b) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:36, uma CDRZ?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:34, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:35, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:46, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:48; c) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:37, uma CDRZ?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:38, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:35, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:51; ou d) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 39, uma CDRZ?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:40, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:41, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:52, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:48.

[00305] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende sequências de CDR se- lecionadas dentre: a) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:57, uma CDRZ?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:58, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:59, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:68, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:69, e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:70; b) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:60, uma CDRZ?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:58, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:59, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:68, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:69 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:70; c) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:5, uma CDRZ?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:61, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:59, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:71, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:72 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:73; ou d) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:7, uma CDRZ?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:62, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:63, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:74, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:72 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:70.

[00306] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende sequências de CDR se- lecionadas dentre: a) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:79, uma CDRZ?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:80, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:81, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:92, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:93 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:94; b) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:82, uma CDRZ?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:80, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:81, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:92, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:93 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:94; c) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:83, uma CDRZ?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:84, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:81, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:95, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:96 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 97; ou d) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 85, uma CDRZ?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:86, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:87, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:98, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:96 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:94.

[00307] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende sequências de CDR se- lecionadas dentre: a) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:103, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:105, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 116; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:117; b) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:106, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:105, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de ca- deia leve da SEQ ID NO:117; c) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:107, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:108, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:105, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:118; ou d) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:109, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:110, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:111, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:52, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:117.

[00308] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende sequências de CDR se- lecionadas dentre: a) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:123, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:124, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:125, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID

NO:136, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:137 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:138; b) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:126, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:124, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:125, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:136, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:137 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:138; c) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:127, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:128, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:125, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:139, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:140 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 141; ou d) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 129, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:130, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:131, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:142, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:140 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:138.

[00309] “Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende sequências de CDR se- lecionadas dentre: a) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:123, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:124, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:147, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:153, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:154 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:155; b) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:126, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:124, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:147, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:153, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 154 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:155; c) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:127, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:128, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:147, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:156, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:157; ou d) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 129, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:130, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:148, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:158, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:155.

[00310] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende sequências de CDR se- lecionadas dentre: a) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:103, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:163, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de ca- deia leve da SEQ ID NO:169; b) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:106, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:163, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:169; c) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:107, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:108, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:163, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:170; ou d) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 109, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:110, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:164, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:52, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:169.

[00311] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende sequências de CDR se- lecionadas dentre: a) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:175, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:176, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:177, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:188; b) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:178, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:176, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:177, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:188; c) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:179, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:180, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:177, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:189; ou d) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 181, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:182; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:183, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:52, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:188.

[00312] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende sequências de CDR se- lecionadas dentre: a) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 103, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:194, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:200; b) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 106, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:194, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:200; c) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 107, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 108, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:194, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 49, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 50, e uma CDR3 de ca- deia leve da SEQ ID NO: 201; ou d) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 109, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 110, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:195, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 52, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 50 e uma CDR3 de ca- deia leve da SEQ ID NO:200.

[00313] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende sequências de CDR se- lecionadas dentre: a) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:206, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:207, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:208, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID

NO:153, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:154 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:219; b) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:209, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:207, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:208, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:153, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 154 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:219; c) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:210, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:211, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:208, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:156, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:220; ou d) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 212, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:213, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:214, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:158, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:219.

[00314] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende sequências de CDR se- lecionadas dentre: a) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 206, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 207, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:225, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:136, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:137 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO0:231; b) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 209, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 207, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:225, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:136, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:137 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO0:231; c) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 210, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 211, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:225, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:139, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:140 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 232; ou d) uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 212, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 213, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 226, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:142; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 140; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO0:231.

[00315] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende sequências de CDR se- lecionadas dentre: a) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 206, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:237, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:243, uma LCDR2 da SEQ ID NO:47 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:244; b) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 209, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:237, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:243, uma LCDR2 da SEQ ID NO:47 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:244; Cc) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 210, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 211 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:237, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:245, uma LCDR2 da SEQ ID NO:50 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:246; ou d) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 212, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 213 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:238; e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:247, uma LCDR?2 da SEQ ID NO: 50 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:244.

[00316] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende sequências de CDR se- lecionadas dentre: a) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 206, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:252, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:153, uma LCDR2 da SEQ ID NO: 154 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:258; b) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 209, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:252, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:153, uma LCDR2 da SEQ ID NO:154 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:258; Cc) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 210, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 211 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:252, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:156, uma LCDR2 da SEQ ID NO:50 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:259; ou d) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 212, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 213 e uma HCDR3 da SEQ ID NO: 253; e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:158, uma LCDR2 da SEQ ID NO:50 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:258.

[00317] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmen-

to de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:21.

[00318] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:25.

[00319] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:29.

[00320] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:42, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:53.

[00321] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:64, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:75.

[00322] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:88, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:99.

[00323] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:112, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:119.

[00324] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:132, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:143.

[00325] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:149, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:159.

[00326] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:165, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:171.

[00327] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:184, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:190.

[00328] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:196, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:202.

[00329] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:215, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:221.

[00330] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:227, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:233.

[00331] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:239, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:248.

[00332] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:254, e uma região variável de cadeia leve (VL) compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:260.

[00333] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:23.

[00334] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:27.

[00335] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:31.

[00336] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:44, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:55.

[00337] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:66, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:77.

[00338] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:90, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:101.

[00339] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:114, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:121.

[00340] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:134, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:145.

[00341] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:151, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:161.

[00342] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:167, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:173.

[00343] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:186, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:192.

[00344] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:198, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:204.

[00345] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:217, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:223.

[00346] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:229, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:235.

[00347] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:241, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:250.

[00348] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se liga especificamente a PMEL17 compreende uma cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:256, e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:262.

[00349] Em certas modalidades, um anticorpo que se liga especifi- camente a PMEL17 é um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) que é descrito na Tabela

2.

1. Identificação de Epítopos e Anticorpos que se Ligam ao Mesmo Epí- topo

[00350] A presente invenção fornece também anticorpos e fragmen- tos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) que se ligam especificamente ao mesmo epítopo que os anticorpos anti- PMEL17 descritos na Tabela 2, ou competem de forma cruzada com os anticorpos descritos na Tabela 2. Anticorpos e fragmentos de anti- corpo adicionais (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) po- dem, portanto, ser identificados com base na sua capacidade para competir de forma cruzada (por exemplo, para inibir competitivamente a ligação de, de forma estatisticamente significativa) com outros anti- corpos da invenção em ensaios de ligação de PMEL17, por exemplo, por meio de BIACORE ou ensaios conhecidos pelos versados na téc- nica para medir a ligação. A capacidade de um anticorpo de teste inibir a ligação de anticorpos e fragmentos de anticorpo (por exemplo, frag-

mentos de ligação ao antígeno) da presente invenção a um PMEL17 (por exemplo, PMEL17 humano) demonstra que o anticorpo de teste pode competir com aquele anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) pela ligação a PMEL17; tal anticorpo pode, de acordo com a teoria não limitativa, se ligar ao mesmo epítopo ou a um epítopo relacionado (por exemplo, um epítopo estruturalmente similar ou espacialmente próximo ou sobreposto) na proteína PMEL1I7 como o anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) com o qual o mesmo compete. Em certas modalidades, os anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo em PMEL17 que os anticorpos ou fragmentos de anti- corpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) descritos na Tabela 2 são anticorpos monoclonais humanos ou humanizados. Tais anticorpos monoclonais humanos ou humanizados podem ser prepa- rados e isolados como descrito no presente documento.

2. Alteração Adicional da Estrutura de Região Fc

[00351] Os imunoconjugados da invenção podem compreender an- ticorpos modificados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mes- mos que compreendem adicionalmente modificações a resíduos de framework dentro de VH e/ou VL, por exemplo, para melhorar as pro- priedades do anticorpo. Em algumas modalidades, as modificações de framework são feitas para reduzir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é "mutação reversa" de um ou mais resí- duos de framework para a sequência de linha germinativa correspon- dente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somá- tica pode conter resíduos de framework que diferem da sequência de linha germinativa da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados comparando-se as sequências de framework de anti- corpo com as sequências de linha germinativa das quais o anticorpo é derivado. Para devolver as sequências de região de framework à sua configuração de linha germinativa, as mutações somáticas podem so- frer "mutação reversa" para a sequência de linha germinativa, por exemplo, por mutagênese sítio-dirigida. Tais anticorpos "com mutação reversa” são também destinados a serem abrangidos pela invenção.

[00352] — Outro tipo de modificação de framework envolve realizar a mutação de um ou mais resíduos dentro da região de framework ou mesmo dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover epítopos de célula T para, assim, reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Essa abordagem é também denominada "desimunização" e é descrita em mais detalhes na Publicação de Patente US nº 20030153043 de Carr et al.

[00353] Adicional ou alternativamente às modificações feitas dentro do framework ou regiões CDR, os anticorpos da invenção podem ser geneticamente modificados para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, como meia-vida de soro, fixação de complemento, ligação de receptor Fc e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno (ADCC). Além disso, um anticorpo da invenção pode ser quimicamen- te modificado (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser fixadas ao anticorpo) ou ser modificadas para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anti- corpo. Cada uma dessas modalidades é descrita em mais detalhes abaixo.

[00354] Em uma modalidade, a região de dobradiça de CH1 é modi- ficada de modo que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Essa abordagem é descrita adicionalmente na Patente US nº 5.677.425 de Bodmer et al. O número de resíduos de cisteína na região de dobradi- ça de CH1 é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das ca- deias leves e pesadas ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

[00355] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de an- ticorpo descrito no presente documento inclui resíduos de aminoácido modificados ou geneticamente modificados, por exemplo, um ou mais resíduos de cisteína, como sítios para a conjugação a uma porção química de fármaco (Junutula JR, et a/., Nat Biotechnol 2008, 26:925- 932). Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo ou frag- mento de anticorpo modificado que compreende uma substituição de um ou mais aminoácidos por cisteína nas posições descritas no pre- sente documento. Sítios para substituição de cisteína estão nas regi- ões constantes do anticorpo ou fragmento de anticorpo e são, assim, aplicáveis a uma variedade de anticorpos ou fragmentos de anticorpo, e os sítios são selecionados para fornecer conjugados estáveis e ho- mogêneos. Um anticorpo ou fragmento modificado pode ter uma, duas ou mais substituições de cisteína, e essas substituições podem ser usadas em combinação com outros métodos de modificação e conju- gação como descrito no presente documento. Métodos para inserir cis- teína em locais específicos de um anticorpo são conhecidos na técni- ca, consultar, por exemplo, Lyons et al., (1990) Protein Eng., 3:703- 708, nº WO 2011/005481, nº WO2014/124316, nº WO 2015/138615. Em certas modalidades, um anticorpo modificado compreende uma substituição de um ou mais aminoácidos por cisteína na sua região constante selecionada dentre as posições 117, 119, 121, 124, 139, 152, 153, 155, 157, 164, 169, 171, 174, 189, 191, 195, 197, 205, 207, 246, 258, 269, 274, 286, 288, 290, 292, 293, 320, 322, 326, 333, 334, 335, 337, 344, 355, 360, 375, 382, 390, 392, 398, 400 e 422 de uma cadeia pesada do anticorpo, e em que as posições são numeradas de acordo com o sistema EU. Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de anticorpo modificado compreende uma substituição de um ou mais aminoácidos por cisteína em sua região constante seleci-

onada dentre as posições 107, 108, 109, 114, 129, 142, 143, 145, 152, 154, 156, 159, 161, 165, 168, 169, 170, 182, 183, 197, 199, e 203 de uma cadeia leve do anticorpo ou fragmento de anticorpo, em que as posições são numeradas de acordo com o sistema EU, e em que a cadeia leve é uma cadeia leve kappa humana.

Em certas modalida- des, um anticorpo ou seu fragmento de anticorpo modificado compre- ende uma combinação de substituição de dois ou mais aminoácidos por cisteína em suas regiões constantes, em que as combinações compreendem substituições nas posições 375 de uma cadeia pesada de anticorpo, posição 152 de uma cadeia pesada de anticorpo, posi- ção 360 de uma cadeia pesada de anticorpo ou posição 107 de uma cadeia leve de anticorpo e em que as posições são numeradas de acordo com o sistema EU.

Em algumas modalidades, um anticorpo ou seu fragmento de anticorpo modificado compreende uma substituição de um aminoácido por cisteína nas suas regiões constantes, em que a substituição é na posição 375 de uma cadeia pesada de anticorpo, po- sição 152 de uma cadeia pesada de anticorpo, posição 360 de uma cadeia pesada de anticorpo, posição 107 de uma cadeia leve de anti- corpo, posição 165 de uma cadeia leve de anticorpo ou posição 159 de uma cadeia leve de anticorpo e em que as posições são numera- das de acordo com o sistema EU, e em que a cadeia leve é uma ca- deia kappa.

Em modalidades particulares, um anticorpo ou seu frag- mento de anticorpo modificado compreende uma combinação de subs- tituição de dois aminoácidos por cisteína em suas regiões constantes, em que as combinações compreendem substituições nas posições 375 de uma cadeia pesada de anticorpo e posição 152 de uma cadeia pesada de anticorpo, em que as posições são numeradas de acordo com o sistema EU.

Em modalidades particulares, um anticorpo ou seu fragmento de anticorpo modificado compreende uma substituição de um aminoácido por uma cisteína na posição 360 de uma cadeia pesa-

da de anticorpo, em que as posições são numeradas de acordo com o sistema EU. Em outras modalidades particulares, um anticorpo ou seu fragmento de anticorpo modificado compreende uma substituição de um aminoácido por cisteína na posição 107 de uma cadeia leve de an- ticorpo e em que as posições são numeradas de acordo com o siste- ma EU e em que a cadeia leve é uma cadeia kappa.

[00356] Em modalidades adicionais, anticorpos ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) úteis em imunoconjugados da invenção incluem anticorpos modificados ou ge- neticamente modificados, como um anticorpo modificado para introdu- zir um ou mais outros aminoácidos reativos (exceto cisteína), incluindo Pcl, pirrolisina, etiquetas peptídicas (como etiquetas S6, A1 e ybbR), e aminoácidos não naturais, em vez de pelo menos um aminoácido da sequência nativa, fornecendo assim um sítio reativo no anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno para conjugação a uma porção quíi- mica de fármaco ou uma porção química de ligante-fármaco com reati- vidade complementar. Por exemplo, os anticorpos ou fragmentos de anticorpo podem ser modificados para incorporar Pcl ou pirrolisina (W. Ou, et al/., (2011) PNAS 108 (26), 10437-10442; WO2014124258) ou aminoácidos não naturais (J.Y. Axup, et al., Proc Natl Acad Sci US A, 109 (2012), páginas 16101—16106; para revisão, consultar C.C. Liu e P.G. Schultz (2010) Annu Rev Biochem 79, 413-444; C.H. Kim, et al., (2013) Curr Opin Chem Biol. 17, 412-419) como sítios para conjuga- ção a um fármaco. De modo similar, etiquetas peptídicas para méto- dos de conjugação enzimática podem ser introduzidos em um anticor- po (Strop P., et al., Chem Biol. 2013, 20(2):161-7; Rabuka D., Curr Opin Chem Biol. 2010 Dec;14(6):790-6; Rabuka D, et a/., Nat Protoc. 2012, 7(6):1052-67). Um outro exemplo é o uso de 4'-fosfopantetoinil transferases (PPTase) para a conjugação de análogos da Co-enzima A (WO2013184514) e (Gruúnewald et al., (2015) Bioconjugate Chem.

26 (12), 2554-62). Métodos para conjugar tais anticorpos modificados ou geneticamente modificados com combinações de cargas úteis ou de ligante-carga útil são conhecidos da técnica.

[00357] Em outra modalidade, a região de dobradiça Fc de um anti- corpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introdu- zidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento de dobradiça Fc de modo que o anticorpo tenha ligação comprometida de Proteína Estafilocócica A (SpA) em relação a ligação de SpA de domí- nio de dobradiça Fc. Essa abordagem é descrita em maior detalhe na Patente US Nº 6,165,745 de Ward et al.

[00358] “Ainda em outras modalidades, a região Fc é alterada subs- tituindo-se pelo menos um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente para alterar as funções efetoras do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos por um re- síduo de aminoácido diferente de modo que o anticorpo tenha uma afinidade alterada para um ligante efetor, porém retenha a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo original. O ligante efetor ao qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor de Fc ou o componente C1 de complemento. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes US nº 5.624.821 e nº 5.648.260, ambas de Winter et al.

[00359] Em outra modalidade, um ou mais aminoácidos seleciona- dos dentre os resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente, de modo que o anticorpo tenha liga- ção a C1q alterada e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) reduzida ou eliminada. Essa abordagem é descrita, por exem- plo, na Patente US nº 6.194.551 de Idusogie et al.

[00360] Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácido são alterados para, assim, alterar a capacidade do anticorpo de se fi-

xar ao complemento. Esta abordagem está descrita, por exemplo, na Publicação PCT WO 94/29351 por Bodmer et al. Resíduos de aminoá- cidos alotípicos incluem, porém sem limitação, região constante de uma cadeia pesada das subclasses IgG1, IgG2 e IgG3 bem como re- gião constante de uma cadeia leve do isótipo kappa, como descrito por Jefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009).

[00361] Complexos de proteína de fusão de anticorpo que contêm tais mutações medeiam citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) reduzida ou inexistente ou citotoxicidade dependente do com- plemento (CDC). Em algumas modalidades, os resíduos de aminoáci- dos L234 e L235 da região constante de I9gG1 são substituídos por A234 e A235. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido N267 da região constante de IgG1 é substituído por A267. Em algu- mas modalidades, os resíduos de aminoácidos D265 e P329 da região constante de IgG1 são substituídos por A265 e A329. Outras muta- ções silenciosas de Fc de anticorpo podem também ser usadas.

[00362] Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácido são alterados para, assim, alterar a capacidade do anticorpo de se fi- xar ao complemento. Essa abordagem é descrita, por exemplo, na Pu- blicação PCT nº WO 94/29351 de Bodmer et al. Em uma modalidade específica, um ou mais aminoácidos de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção são substituídos por um ou mais resíduos de aminoácidos alotípicos. Resíduos de ami- noácidos alotípicos incluem também, porém sem limitação, a região constante da cadeia pesada das subclasses I9gG1, IgG2 e IgG3, bem como a região constante da cadeia leve do isótipo kappa, como des- crito por Jefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009).

[00363] Ainda em outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser produ- zido (ou seja, o anticorpo é desprovido de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, para aumentar a afinidade do anticor- po com o "antígeno”. Tais modificações de carboidrato podem ser rea- lizadas, por exemplo, alterando-se um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência de anticorpos. Por exemplo, podem ser feitas uma ou mais substituições de aminoácidos que resultam na eliminação de um ou mais sítios de glicosilação de framework de região variável para, assim, eliminar a glicosilação nesse sítio. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo com o antígeno. Tal abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes US nº 5.714.350 e nº 6.350.861 de Co et al.

[00364] Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para au- mentar sua meia-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzi- das: T252L, T254S, T256F, como descrito na Patente nº UJS.

6.277.375 de Ward. Em alternativa, para aumentar a meia-vida bioló- gica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epítopo de ligação ao receptor de salvamento retirado de duas alças de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, como descrito nas Patentes US nº 5.869.046 e nº 6.121.022 de Presta et al.

3. Produção dos Anticorpos anti-PMEL17

[00365] — Anticorpos anti-PMEL17 e fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) dos mesmos podem ser produzidos por quaisquer meios conhecidos na técnica, incluindo, po- rém sem limitação, expressão recombinante, síntese química e diges- tão enzimática de tetrâmeros de anticorpos, enquanto os anticorpos monoclonais de comprimento total podem ser obtidos, por exemplo, por hibridoma ou produção recombinante. A expressão recombinante pode ser de quaisquer células hospedeiras adequadas conhecidas na técnica, por exemplo, células hospedeiras de mamífero, células hos- pedeiras de bactérias, células hospedeiras de leveduras, células hos-

pedeiras de insetos, etc.

[00366] A invenção fornece adicionalmente polinucleotídeos que codificam os anticorpos descritos no presente documento, por exem- plo, polinucleotídeos que codificam regiões de cadeia pesada ou leve ou segmentos que compreendem regiões determinantes de comple- mentaridade como descrito no presente documento. Em algumas mo- dalidades, o polinucleotídeo que codifica as regiões variáveis de ca- deia pesada tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de ácidos nucleicos com um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 11, 43, 65, 89, 113, 133, 150, 166, 185, 197, 216, 228, 240, e 255. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica as regiões variáveis de cadeia leve tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%de identidade de sequência de ácidos nucleicos com um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 22, 26, 30, 54, 76, 100, 120, 144, 160, 172, 191, 203, 222, 234, 249, e 261.

[00367] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de ácidos nucleicos com um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 13, 45, 67, 91, 115, 135, 152, 168, 187, 199, 218, 230, 242, e 257. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a cadeia leve tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de ácidos nucleicos com um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 24, 28, 32, 56, 78, 102, 122, 146, 162, 174, 193, 205, 224, 236, 251, e 263.

[00368] Os polinucleotídeos da invenção podem codificar apenas a sequência de região variável de um anticorpo anti-PMEL17. Os mes- mos também podem codificar tanto uma região variável quanto uma região constante do anticorpo. Algumas das sequências de polinucleo- tídeos codificam um polipeptídeo que compreende regiões variáveis tanto da cadeia pesada quanto da cadeia leve de um dos anticorpos anti-PMEL17 de camundongo exemplificados. Alguns outros polinucle- otídeos codificam dois segmentos de polipeptídeos que, respectiva- mente, são substancialmente idênticos às regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de um dos anticorpos de camundongo.

[00369] As sequências de polinucleotídeos podem ser produzidas por síntese de DNA de fase sólida de novo ou por mutagênese por PCR de uma sequência existente (por exemplo, sequências, como descrito nos Exemplos abaixo) que codifica um anticorpo anti-PMEL17 ou seu fragmento de ligação. A síntese química direta de ácidos nu- cleicos pode ser realizada pelos métodos conhecidos na técnica, como o método de fosfotriéster de Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979; o método de fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979; o método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Te- tra. Lett., 22:1859, 1981; e o método de suporte sólido da Patente US nº 4.458.066. A introdução de mutações a uma sequência de polinu- cleotídeos por PCR pode ser realizada como descrito em, por exem- plo, POR Technology: Principles and Applications for DNA Amplifica- tion, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al/., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; e Eckert et al., POR Methods and Applications 1:17, 1991.

[00370] A invenção fornece também vetores de expressão e células hospedeiras para produzir os anticorpos anti-PMEL17 descritos acima. Vários vetores de expressão podem ser usados para expressar os po- linucleotídeos que codificam as cadeias de anticorpo anti-PMEL17 ou fragmentos de ligação. Vetores de expressão com base viral e não vi- rais podem ser usados para produzir os anticorpos em uma célula hospedeira de mamífero. Sistemas e vetores não virais incluem plas- mídeos, vetores epissômicos, tipicamente com um cassete de expres- são para expressar uma proteína ou RNA, e cromossomos artificiais humanos (consultar, por exemplo, Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997). Por exemplo, vetores não virais úteis para expressão dos poli- nucleotídeos e polipeptídeos anti-PMEL17 em células de mamíferos (por exemplo, seres humanos) incluem pThioHis A, B & C, pcD- NATVY3 1/His, peBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego, CA), vetores MPSV e inúmeros outros vetores conhecidos na técnica para expres- sar outras proteínas. Os vetores virais úteis incluem vetores com base em retrovírus, adenovírus, vírus adenoassociados, herpes vírus, veto- res com base em SV40, papilomavírus, vírus Epstein Barr HBP, veto- res de vírus da vaccínia e vírus da Floresta Semliki (SFV). Consultar Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; e Ro- senfeld et a/., Cell 68:143, 1992.

[00371] A escolha do vetor de expressão depende das células hos- pedeiras pretendidas nas quais o vetor deve ser expresso. Tipicamen- te, os vetores de expressão contêm um promotor e outras sequências reguladoras (por exemplo, intensificadores) que são ligadas de manei- ra funcional aos polinucleotídeos que codificam uma cadeia ou frag- mento de anticorpo anti-PMEL17. Em algumas modalidades, um pro- motor induzível é usado para evitar a expressão de sequências inseri- das exceto sob condições indutoras. Os promotores induzíveis inclu- em, por exemplo, arabinose, lacZ, promotor de metalotioneína ou um promotor de choque térmico. As culturas de organismos transformados podem ser expandidas sob condições não indutoras sem influenciar a população a codificar as sequências cujos produtos de expressão são mais bem tolerados pelas células hospedeiras. Além de promotores, outros elementos reguladores podem também ser exigidos ou deseja- dos para expressão eficiente de uma cadeia ou fragmento de anticorpo anti-PMEL17. Esses elementos incluem tipicamente um códon de ini- ciação de ATG e sítio de ligação a ribossomo adjacente ou outras se- quências. Além disso, a eficiência da expressão pode ser intensificada pela inclusão de intensificadores adequados para o sistema de célula em uso (consultar, por exemplo, Scharf et al., Results Probl. Cell Dif- fer. 20:125, 1994; e Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Por exemplo, o intensificador de SV40 ou intensificador de CMV pode ser usado para aumentar a expressão em células hospedeiras de mamífe- ros.

[00372] Os vetores de expressão podem também fornecer uma po- sição de sequência de sinal de secreção para formar uma proteína de fusão com polipeptídeos codificados por sequências de anticorpo anti- PMEL17 inseridas. Mais frequentemente, as sequências de anticorpo anti-PMEL17 inseridas são ligadas a uma sequência de sinal antes da inclusão no vetor. Os vetores a serem usados para receber sequên- cias que codificam domínios variáveis de cadeia leve e pesada de an- ticorpo anti-PMEL17 codificam também, às vezes, regiões constantes ou partes das mesmas. Tais vetores permitem a expressão das regi- ões variáveis como proteínas de fusão com as regiões constantes le- vando, assim, à produção de anticorpos intactos ou fragmentos dos mesmos. Tipicamente, tais regiões constantes são humanas.

[00373] As células hospedeiras para abrigar e expressar as cadeias de anticorpo anti-PMEL17 podem ser procarióticas ou eucarióticas. E. coli é um hospedeiro procariótico útil para clonar e expressar os poli- nucleotídeos da presente invenção. Outros hospedeiros microbianos adequados para uso incluem bacilos, como Bacillus subtilis e outras enterobacteriaceae, como Salmonella, Serratia e várias espécies de Pseudomonas. Nesses hospedeiros procarióticos, podem também ser produzidos vetores de expressão, que contêm tipicamente sequências de controle de expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Além disso, qualquer número dentre uma variedade de promotores bem conhecidos estará presente, como o sistema promotor de lactose, um sistema promotor de triptofa- no (trp), um sistema promotor de beta-lactamase ou um sistema pro- motor de fago lambda. Os promotores controlam tipicamente a expres- são, opcionalmente com uma sequência operadora, e têm sequências de sítio de ligação a ribossomo e similares, para iniciar e concluir a transcrição e a tradução. Outros micróbios, como levedura, podem também ser usados para expressar polipeptídeos anti-PMEL17 da in- venção. Podem também ser usadas células de inseto em combinação com vetores de baculovírus.

[00374] Em algumas modalidades preferidas, células hospedeiras de mamífero são usadas para expressar e produzir os polipeptídeos anti-PMEL17 da presente invenção. Por exemplo, as mesmas podem ser ou uma linhagem de células de hibridoma que expressa genes de imunoglobulina endógenos (por exemplo, os clones de hibridoma de mieloma como descrito nos Exemplos) ou uma linhagem de células de mamífero que abriga um vetor de expressão exógeno (por exemplo, as células de mieloma SP2/0 exemplificadas abaixo). Essas incluem qualquer célula humana ou animal mortal normal ou imortal normal ou anormal. Por exemplo, foram desenvolvidas várias linhagens de célu- las hospedeiras adequadas com a capacidade de secretar imunoglo- bulinas intactas, incluindo as linhagens de células CHO, várias linha- gens de células Cos, células HeLa, linhagens de células de mieloma, células B transformadas e hibridomas. O uso de cultura celular de te- cido de mamífero para expressar polipeptídeos é discutido, de modo geral, por exemplo, em Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publi- shers, N.Y., N.Y., 1987. Os vetores de expressão para células hospe- deiras de mamífero podem incluir sequências de controle de expres- são, como uma origem de replicação, um promotor e um intensificador

(consultar, por exemplo, Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 a 68, 1986), e sítios de informações de processamento necessários, como sítios de ligação a ribossomo, sítios de splicing de RNA, sítios de poli- adenilação e sequências terminadoras transcricionais. Esses vetores de expressão geralmente contêm promotores derivados de genes de mamíferos ou de vírus de mamíferos. Os promotores adequados po- dem ser constitutivos, específicos para tipo de célula, específicos para estágio e/ou moduláveis ou reguláveis. Os promotores úteis incluem, porém sem limitação, o promotor de metalotioneína, o promotor tardio principal de adenovírus constitutivo, o promotor de MMTV induzível por dexametasona, o promotor de SV40, o promotor de MRP pollll, o pro- motor de MPSV constitutivo, o promotor de CMV induzível por tetraci- clina (como o promotor de CMV precoce imediato humano), o promo- tor de CMV constitutivo e combinações de promotor-intensificador co- nhecidas na técnica.

[00375] Os métodos para introduzir vetores de expressão contendo as sequências de polinucleotídeos de interesse variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção de cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, enquanto o tratamento com fosfato de cálcio ou eletroporação pode ser usado pa- ra outros hospedeiros celulares (consultar de modo geral Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4º ed.). Outros métodos incluem, por exemplo, eletroporação, tratamento com fosfato de cálcio, transformação mediada por lipossoma, injeção e microinjeção, méto- dos balísticos, virossomas, imunolipossomas, conjugados de policá- tion:ácido nucleico, DNA nu, vírions artificiais, fusão à proteína estrutu- ral do vírus do herpes VP22 (Elliot e O'Hare, Cell 88:223, 1997), ab- sorção de DNA intensificada por agente e transdução ex vivo. Para produção de alto rendimento a longo prazo de proteínas recombinan- tes, a expressão estável será frequentemente desejada. Por exemplo,

linhagens celulares que expressam estavelmente cadeias de anticorpo ou fragmentos de ligação anti-PMEL17 podem ser preparadas usando vetores de expressão da invenção que contêm origens virais de repli- cação ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecionável. Após a introdução do vetor, as células podem ser deixa- das se proliferar por 1-2 dias em um meio enriquecido antes de serem trocadas para meios seletivos. O propósito do marcador selecionável é conferir resistência à seleção, e sua presença permite a proliferação de células que expressam com sucesso as sequências introduzidas em meios seletivos. Células resistentes estavelmente transfectadas podem ser proliferadas com o uso de técnicas de cultura de tecido adequadas para o tipo de célula. Usos Terapêuticos

[00376] Os anticorpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, fra- gmentos de ligação ao antígeno) e conjugados de anticorpo e fármaco da invenção são úteis em uma variedade de aplicações, incluindo, po- rém sem limitação, tratamento ou prevenção de câncer, como cânce- res sólidos ou neoplasias hematológicas. Em algumas modalidades, os anticorpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) e conjugados de anticorpo e fármaco da invenção são úteis para inibir o crescimento do tumor, induzir diferenciação, re- duzir o volume do tumor e/ou reduzir a tumorigenicidade de um tumor. Os métodos de uso podem ser métodos in vitro, ex vivo ou in vivo.

[00377] Em um aspecto, os anticorpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) e conjugados de anticorpo e fármaco da invenção são úteis para detectar a presença de PMEL17 em uma amostra biológica. O termo "detectar" como usado neste documento abrange a detecção quantitativa ou qualitativa. Em certas modalidades, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido. Em certas modalidades, tais tecidos incluem tecidos nor-

mais e/ou cancerígenos que expressam PMEL17 em níveis mais ele- vados relativamente a outros tecidos.

[00378] Em um aspecto, a invenção fornece um método de detectar a presença de PMEL17 em uma amostra biológica. Em certas modali- dades, o método compreende colocar a amostra biológica em contato com um anticorpo anti-PMEL17 sob condições que permitem a ligação do anticorpo ao antígeno e detectar se um complexo é formado entre o anticorpo e o antígeno.

[00379] Em um aspecto, a invenção fornece um método para diag- nosticar um distúrbio associado à expressão aumentada de PMEL17. Em algumas modalidades, o método compreende colocar uma célula de teste em contato com um anticorpo anti-PMEL17; determinar o ní- vel de expressão (quantitativa ou qualitativamente) de PMEL17 na cé- lula de teste pela detecção de ligação do anticorpo anti-PMEL17 ao antígeno PMEL17; e comparar o nível de expressão de PMEL17 na célula de teste com o nível de expressão de PMEL17 em uma célula de controle (por exemplo, uma célula normal com a mesma origem de tecido da célula de teste ou uma célula que expressa PMEL 17 a níveis comparáveis com uma tal célula normal), em que um nível superior de expressão de PMEL17 na célula de ensaio, em comparação com a célula de controle, indica a presença de um distúrbio associado ao aumento da expressão de PMEL17. Em algumas modalidades, a célu- la de teste é obtida a partir de um indivíduo suspeito de ter um distúr- bio associado ao aumento da expressão de PMEL17. Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio proliferativo celular, como um câncer ou um tumor. Em algumas modalidades, o método compreende a medição do número de cópia do gene PMEL17 em uma célula de teste.

[00380] Em algumas modalidades, um método de diagnóstico ou detecção, como os descritos acima, compreende detectar a ligação de um anticorpo anti-PMEL17 a PMEL17 expresso sobre a superfície de uma célula ou em uma preparação de membrana obtida a partir de uma célula que expressa PMEL17 sobre a sua superfície. Um exemplo de ensaio para detecção de ligação de um anticorpo anti-PMEL17 a PMEL17 expressa na superfície de uma célula é um ensaio "FACS".

[00381] Certos outros métodos podem ser usados para detectar |li- gação dos anticorpos anti-PMEL17 a PMEL17. Tais métodos incluem, porém sem limitação, ensaios de ligação ao antígeno que são bem co- nhecidos na técnica, como Western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio de imunossorvente ligado à enzima), imunoensaios "sanduí- che”, ensaios de imunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes, imu- noensaios de proteína A e imunoistoquímica (IHC).

[00382] Em certas modalidades, anticorpos anti-PMEL17 são mar- cados. Os marcadores incluem, porém sem limitação, marcadores ou porções químicas que são detectadas diretamente (como marcadores fluorescentes, cromofóricos, densos em termos de elétrons, quimiolu- minescentes e radioativos), bem como porções químicas, como enzi- mas ou ligantes, que são detectados indiretamente, por exemplo, atra- vés de uma reação enzimática ou interação molecular.

[00383] Em algumas modalidades, anticorpos anti-PMEL1I7 são imobilizados em uma matriz insolúvel. Imobilização implica separar o anticorpo anti-PMEL17 de qualquer proteína PMEL17 que permaneça livre na solução. Essa é realizada convencionalmente por insolubiliza- ção do anticorpo anti-PMEL17 antes do procedimento de ensaio, como por adsorção para uma matriz ou superfície insolúvel em água (Ben- nich et a/., Patente US nº 3.720.760), ou por ligação covalente (por exemplo, usando reticulação de glutaraldeído), ou por insolubilização do anticorpo anti-PMEL17 após a formação de um complexo entre o anticorpo anti-PMEL17 e a proteína PMEL17, por exemplo, por imuno- precipitação.

[00384] “Qualquer uma das modalidades de diagnóstico ou detecção pode ser realizada utilizando um imunoconjugado da invenção em lu- gar, ou além, de um anticorpo anti-PMEL17.

[00385] Em uma modalidade, a invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de uma doença que compreende administrar os anticorpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) ou conjugados de anticorpo e fármaco da inven- ção a um paciente. A invenção também fornece a utilização dos anti- corpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) ou conjugados de anticorpo e fármaco da invenção para o tratamento ou prevenção de uma doença em um paciente. Em algu- mas modalidades, a invenção fornece anticorpos, fragmentos de anti- corpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) ou conjuga- dos de anticorpo e fármaco da invenção para utilização no tratamento ou prevenção da doença em um paciente. Em outras modalidades, a invenção fornece a utilização de anticorpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) ou conjugados de anticorpo e fármaco da invenção no fabrico de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doença em um paciente.

[00386] Em certas modalidades, a doença tratada com os anticor- pos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) e conjugados de anticorpo e fármaco da invenção é um cân- cer. Em algumas modalidades, o câncer é caracterizado por células expressando PMEL17 aos quais os anticorpos, fragmentos de anticor- po (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) e conjugados de anticorpo e fármaco da invenção se ligam. Em algumas modalidades, o câncer se caracteriza por um aumento na expressão de PMEL17 em relação a um paciente saudável. Em algumas modalidades, a expres- são de PMEL17 pode ser medida por um aumento em RNA PMEL 17. Em outras modalidades, o câncer se caracteriza por um aumento no número de cópias de DNA de PMEL17. Outros métodos de medir ou determinar níveis de expressão de PMEL17 são conhecidos dos en- tendidos na técnica. Em certas modalidades, o câncer é caracterizado por uma mutação, por exemplo, uma mutação de ativação que afeta Q209 ou R183, no gene GNAQ e/ou GNA11. Exemplos de doenças que podem ser tratadas e/ou prevenidas incluem, porém sem limita- ção, melanoma, melanoma uveal, carcinoma hepatocelular e um cân- cer metastático dos mesmos.

[00387] A presente invenção fornece métodos de tratamento ou prevenção do câncer compreendendo administrar uma quantidade te- rapeuticamente eficaz de anticorpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) ou conjugados de anti- corpo e fármaco da invenção. Em certas modalidades, o câncer é um câncer sólido como melanoma, melanoma uveal, carcinoma hepatoce- lular ou um câncer metastático dos mesmos. Em certas modalidades, o sujeito é um humano. Em certas modalidades, o câncer é um câncer resistente e/ou câncer recidivado.

[00388] Em certas modalidades, a invenção fornece métodos de inibir o crescimento tumoral compreendendo administrar a um sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) ou conju- gados de anticorpo e fármaco da invenção. Em certas modalidades, o tumor é de um câncer sólido como melanoma, melanoma uveal, carci- noma hepatocelular ou um câncer metastático dos mesmos. Em certas modalidades, o sujeito é um ser humano. Em algumas modalidades, o sujeito tem um tumor ou foi submetido à cirurgia de remoção de tumor.

[00389] Em algumas modalidades, o tumor expressa o PMEL17 ao qual o anticorpo anti-PMEL17 se liga. Em certas modalidades, o tumor sobre-expressa PMEL17 humano. Em certas modalidades, o tumor tem um aumento no número de cópias do gene PMEL17. Em determi-

nadas modalidades, o tumor é caracterizado por uma mutação, por exemplo, uma mutação de ativação que afeta 0209 ou R183, no gene GNAQ e/ou GNA11.

[00390] A presente invenção também fornece métodos de seleção de pacientes para tratamento com anticorpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) ou conjugados de anticorpo e fármaco da invenção, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz dos referidos anticorpos, fragmen- tos de anticorpo (por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno) ou conjugados de anticorpo e fármaco. Em certos aspectos da invenção, os métodos compreendem selecionar um paciente medindo-se a ex- pressão de PMEL17. Em certos aspectos da invenção, os métodos compreendem selecionar um paciente identificando-se uma mutação, por exemplo, uma mutação de ativação que afeta 0209 ou R183, no gene GNAQ ou GNA11. Em certas modalidades, os métodos compre- endem medir o nível de expressão de PMEL17 no paciente bem como detectar o gene GNAQ e/ou GNA11.

[00391] Para o tratamento ou prevenção da doença, a dosagem adequada dos anticorpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, fra- gmentos de ligação ao antígeno) ou conjugados de anticorpo e fárma- co da presente invenção depende de vários fatores, como o tipo de doença a ser tratada, a gravidade e o curso da doença, a resposta da doença, terapia anterior, histórico clínico do paciente, e assim por di- ante. O anticorpo ou agente podem ser administrados uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos com duração de vários dias a vá- rios meses, ou até alcançar a cura ou uma diminuição do estado da doença (por exemplo, redução do tamanho do tumor). Esquemas po- sológicos ideais podem ser calculados a partir de medições de acúmu- lo de fármaco no organismo do paciente e variam de acordo com a po- tência relativa de um anticorpo individual, fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) ou conjugados de anticor- po e fármaco. O médico assistente pode avaliar as taxas de repetição para a dosagem com base em tempos de residência e concentrações do fármaco em tecidos ou fluidos corporais. Terapia de Combinação

[00392] Em certos casos, um anticorpo, fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno), ou conjugado de anticor- po e fármaco da presente invenção é combinado com outros tratamen- tos terapêuticos, como cirurgia e radioterapia, agentes terapêuticos, como outros agentes anticâncer, agentes antialérgicos, agentes anti- náusea (ou antieméticos), analgésicos, agentes citoprotetores e com- binações dos mesmos.

[00393] Em uma modalidade, um anticorpo, fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) ou conjugado de an- ticorpo e fármaco da presente invenção é combinado em uma formula- ção de combinação farmacêutica, ou regime de dosagem como terapia de combinação, com um segundo composto tendo propriedades anti- cancerígenas. O segundo composto da formulação de combinação farmacêutica ou regime de dosagem pode ter atividades complementa- res ao anticorpo ou imunoconjugado da combinação de modo que as mesmas não afetem adversamente uma à outra. Por exemplo, um an- ticorpo, fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) ou conjugado de anticorpo e fármaco da presente invenção pode ser administrado em combinação com, porém sem limitação, um agente quimioterápico, agentes imunomoduladores, um inibidor de ti- rosina quinase, um inibidor da via de sinalização a jusante de GNAQ/GNA11, inibidores de IAP, inibidores de BCL2, inibidores de Mcl1 e outros inibidores de GNAQ/GNA11.

[00394] O termo "combinação farmacêutica" como usado no pre- sente documento se refere a uma combinação fixa em uma forma uni-

tária de dosagem ou combinação não fixa ou um kit de partes da ad- ministração combinada em que dois ou mais agentes terapêuticos po- dem ser administrados independentemente ao mesmo tempo ou sepa- radamente dentro de intervalos de tempo, especialmente onde esses intervalos de tempo permitem que os parceiros de combinação mos- trem um efeito cooperativo, por exemplo, sinérgico.

[00395] O termo "terapia de combinação" se refere à administração de dois ou mais agentes terapêuticos para tratar ou prevenir uma afecção ou distúrbio terapêutico descrito na presente revelação. Tal administração abrange a coadministração desses agentes terapêuticos de maneira substancialmente simultânea, como em uma única cápsula que tem uma razão fixa de ingredientes ativos. Alternativamente, tal administração abrange a coadministração em recipientes múltiplos ou separados (por exemplo, cápsulas, pós e líquidos) para cada ingredi- ente ativo. Pós e/ou líquidos podem ser reconstituídos ou diluídos até uma dose desejada antes da administração. Além disso, tal adminis- tração abrange também o uso de cada tipo de agente terapêutico de um modo sequencial, aproximadamente ao mesmo tempo ou em dife- rentes momentos. Em qualquer dos casos, o regime de tratamento proporcionará efeitos benéficos da combinação de fármacos no trata- mento ou prevenção das condições ou distúrbios descritos no presente documento.

[00396] A terapia de combinação pode fornecer "sinergia" e se mos- tra "sinérgica", isto é, o efeito alcançado quando os ingredientes ativos usados em conjunto são maiores do que a soma dos efeitos que resul- ta do uso dos compostos separadamente. Um efeito sinérgico pode ser alcançado quando os ingredientes ativos são: (1) coformulados e administrados ou entregues simultaneamente em uma formulação de dosagem unitária combinada; (2) entregues por alternação ou em pa- ralelo como formulações separadas; ou (3) por algum outro regime.

Quando entregue na terapia de alternação, um efeito sinérgico pode ser alcançado quando os compostos são administrados ou entregues sequencialmente, por exemplo, por injeções diferentes em seringas separadas. Em geral, durante a terapia de alternação, uma dosagem eficaz de cada ingrediente ativo é administrada sequencialmente, isto é, em série, enquanto na terapia de combinação, dosagens eficazes de dois ou mais ingredientes ativos são administradas em conjunto.

[00397] Agentes quimioterápicos gerais considerados para uso em terapias de combinação incluem anastrozol (ArimidexO), bicalutamida (Casodexº), sulfato de bleomicina (Blenoxaneº), bussulfano (Myle- ranº), injeção de bussulfano (Busulfexº), capecitabina (Xelodaº), N4- pentoxicarbonil-5-desóxi-5-fluorocitidina, carboplatina (Paraplatinº), carmustina (BICNUº), clorambucila (Leukeranº), cisplatina (Platinolº), cladribina (Leustatinº), ciclofosfamida (Cytoxanº ou Neosarº), citarabi- na, citosina arabinosídeo (Cytosar-Uº), injeção de lipossomo de citara- bina (DepoCytº), dacarbazina (DTIC-Domeº), dactinomicina (Actinomi- cina D, Cosmegan), cloridrato de daunorrubicina (Cerubidineº), injeção de lipossomo de citrato de daunorrubicina (DaunoXomeº), dexameta- sona, docetaxel (Taxotereº), cloridrato de doxorrubicina (Adriamicinaº, Rubexº), etoposídeo (Vepesidº), fosfato de fludarabina (Fludaraº), 5- fluorouracila (Adrucilº, Efudexº), flutamida (Eulexinº), tezacitibina, Gencitabina (difluorodesoxicitidina), hidroxiureia (Hydreaº), Idarrubici- na (Idamycinº), ifosfamida (IFEXº), irinotecana (Camptosarº), L- asparaginase (ELSPARSº), cálcio de leucovorina, melfalano (Alkeranº), 6-mercaptopurina (Purinetolº), metotrexato (Folexº), mitoxantrona (Novantroneº), milotarg, paclitaxel (Taxolº), fênix (Ítrio90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosano 20 com implante de carmustina (Gliadelº), citrato de tamoxifeno (Nolvadexº), teniposídeo (Vumonº), 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazoneº), cloridrato de topotecano para injeção (Hycamptinº), vinblastina (Velbanº), vincristina (Oncovinº) e vinorelbi-

na (Navelbineº) e pemetrexede

[00398] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de câncer pela administração a um sujeito em necessidade de um conjugado de anticorpo e fármaco da presente invenção em combinação com um ou mais inibidores de MDM?2, inibi- dores de PKC, inibidores de PRC?2, inibidores de MAPK, GPCR inibi- dores, inibidores de tirosina quinase, incluindo, porém sem limitação, inibidores de BTK, inibidores de EGFR, inibidores de Her2, inibidores de Her3, inibidores de IGFR e inibidores de Met.

[00399] Por exemplo, os inibidores de MDM?2 incluem, porém sem limitação, RG7112 (RO5045337); RG7388 (RO5503781, Idasanutlin); MI-77301 (SAR405838); MK-8242 (SCH-900242); AMG232; CGMO97; DS3032b; HDM201; e ALRN-6924.

[00400] Por exemplo, os inibidores de PKC incluem, porém sem |li- mitação, Balanol; Riluzol; Estaurosporina; Enzastaurina; OV1-1 (KAl- 9803 ou Delcasertibe); eV1-2 (KAI-1678); Aprinocarseno; Midostaurina (PKC412); UCN-01 (7-hidróxi-estaurosporina); Rottlerin (5, 7, di- hidróxi-2,2-dimetil-6-(2,4,6-tri-hidróxi-3-metil-5-acetlibenzil)-8-cinamoil- 1,2-cromeno); e Briostatina 1.

[00401] Por exemplo, os inibidores de PRC2 incluem, porém sem limitação, El1; EPZ011989; EPZ005687; Benzamidas de Tetrametilpi- peridinila; UNC 1999; e GSK126.

[00402] Por exemplo, os inibidores de MAPK incluem, porém sem limitação, Vemurafenibe (Zelboraf);, dabrafenibe (Tafinlar); encorafeni- be (Braftovi); trametinibe (Mekinist); cobimetinibe (Cotellic); binimetini- be (Mektovi); e ulixertinibe.

[00403] Por exemplo, inibidores de tirosina quinase incluem, mas não se limitam a, Ibrutinibe (PCI-32765); cloridrato de Erlotinibe (Tar- cevab); Linifanibe (N-[4-(3-amino-1H-indazol-4-il)fenil]-N'-(2-fluoro-5- metilfenil)jureia, também conhecido como ABT 869, disponível junto à

Genentech); malato de Sunitinibe (Sutent&); Bosutinib (4-[(2,4-dicloro- 5-metoxifenil)amino]-6-metóxi-7-[3-(4-metilpiperazin-1- i)propóxilquinolina-3-carbonitrila, também conhecido como SKI-606 e descrito na Patente US nº 6.780.996); Dasatinibe (SprycelG&); Pazopa- nibe (Votrient&); Sorafenibe (NexavarO); Zactima (ZD6474); e Imatini- be ou mesilato de Imatinibe (GilvecO& e GleevecO).

[00404] Inibidores do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) incluem, mas não se limitam a, cloridrato de Erlotinibe (Tarce- vao), Gefitinibe (Iressa&); N-[4-[(3-Cloro-4-fluorofenil)amino]-7-[[(3"S") -tetra-hidro-3-furanil]óxi]l-6-quinazolinil]-4(dimetilamino)-2-butenamida, Tovok6); Vandetanibe (CaprelsaO); Lapatinibe (TykerbO); (SR,4R)-4- Amino-1-((4-((3-metoxifenil)amino)pirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-S-il)]metil) piperidin-3-ol (BMS690514); dicloridrato de Canertinibe (CI-1033); 6-[4- [(4-Etil-1-piperazinil)metil]fenil]-N-[(1R)-1-feniletil]- 7H-Pirrolo[2,3-d] pi- rimidin-4-amina (AEE788, CAS 497839-62-0); Mubritinibe (TAK165); Pelitinibe (EKB569); Afatinibe (BIBW2992); Neratinibe (HKI-272); ácido N-[4-[[1-[(3-Fluorofenil)metil]-1H-indazol-5-ilJamino]-5-metilpirrolo[2,1-f] [1,2 A]triazin-6-il]--carbâmico, — éster — (3S)-3-morfolinilmetílico — (BMS 599626); - N-(3,4-Dicloro-2-fluorofenil)-6-metóxi-7-[[(3aa,58B,6aag)-octa- hidro-2-metilciclopenta[c]pirrol-5-il]metóxil- 4-quinazolinamina (XL647, CAS 781613-23-8) e 4-[4-[[I1R)-1-FeniletilJamino]-7H-pirrolo[2,3- d]pirimidin-6-il]-fenol (PKI166, CAS 187724-61-4).

[00405] — Anticorpos EGFR incluem, mas não se limitam a, Cetuxi- mab (Erbitux&); Panitumumab (Vectibix&); Matuzumab (EMD-72000); Nimotuzumab (hR3); Zalutumumab; TheraCIM h-R3; MDX0447 (CAS 339151-96-1); e ch806 (mMAb-806, CAS 946414-09-1).

[00406] Inibidores do Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico 2 (receptor Her2) (também conhecido como Neu, ErbB-2, CD340 ou p185) incluem, mas não se limitam a, Trastuzumabe (HerceptinO); Pertuzumabe (OmnitargO); trastuzumabe emtansina (KadcylaG); Nera-

tinibe (HKI-272, (2E)-N-[4-[[3-cloro-4-[(piridin-2-il)metóxilfenilJamino]-3- ciano-7-etoxiquinolin-6-il]-4-(dimetilamino)but-2-enamida e descritos na Publicação PCT nº WO 05/028443); Lapatinibe ou ditosilato de Lapati- nibe (Tykerb6&); (SR,4R)-4-amino-1-((4-((3-metoxifenil)amino) pirro- lo[2,1-fI[1,2,4]triazin-5-il)]metil)piperidin-3-01l (BMS690514); (2E)-N-[4- [(3-Cloro-4-fluorofenil)amino]-7-[[(3S)-tetra-hidro-3-furanilJóxi]-6-quina- zolinil]-4-(dimetilamino)-2-butenamida (BIBW-2992, CAS 850140-72- 6); ácido N-[4-[[1-[(3-Fluorofenil)metil]-1H-indazol-5-ilJamino]-5-metilpir- rolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il]-carbâmico, éster (3S)-3-morfolinilmetílico (BMS 599626, CAS 714971-09-2); dicloridrato de Canertinibe (PD 183805 ou CI-1033); e N-(3,4-Dicloro-2-fluorofenil)-6-metóxi-7-[[(3aag, 5E8,6aa)-octa-hidro-2-metilciclopenta[c]pirrol-5-il]Jmetóxi]l-4-quinazolina- mina (XL647, CAS 781613-23-8).

[00407] Inibidores de Her3 incluem, mas não se limitam a, LIM716, MM-121, AMG-888, RG7116, REGN-1400, AV-203, MP-RM-1, MM- 111 e MEHD-7945A.

[00408] Os inibidores de MET incluem, porém sem limitação, Cabo- zantinibe (XL184, CAS 849217-68-1); Foretinibe (GSK1363089, ante- riormente XL880, CAS 849217-64-7); Tivantinibe (ARQ1I97, CAS 1000873-98-2); 1-(2-Hidróxi-2-metilpropil)-N-(5-(7-metoxiquinolin-4- ilóxi)piridin-2-il)-5-metil-3-0x0-2-fenil-2,3-di-hidro-1H-pirazol-4- carboxamida (AMG 458); Crizotinibe (Xalkori&, PF-02341066); (3Z)-5- (2,3-Di-hidro-1H-indol-1-ilsulfonil)-3-(13,5-dimetil-4-[(4-metilpiperazin-1- il)carbonil]-1H-pirrol-2-ilYmetileno)-1,3-di-hidro-2H-indol-2-ona (SU11271); (3Z)-N-(3-Clorofenil)-3-((3,5-dimetil-4-[(4-metilpiperazin-1- il)carbonil]-1H-pirrol-2-ilYmetileno)-N-metil-2-0xo0indolina-5-sulfonamida (SU11274); (3Z)-N-(3-Clorofenil)-3-1[3,5-dimetil-4-(3-morfolin-4-ilpropil)- 1H-pirrol-2-il]metileno)-N-metil-2-oxoindolina-5-sulfonamida (SU11606); 6-[Difluoro[6-(1-metil-1Hpirazol-4-i1)-1,2,4-triazolo[4,3- blpiridazin-3-il]metil]-quinolina (JNJ38877605, CAS 943540-75-8); 2-[4-

[1-(Quinolin-6-ilmetil)-1H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]pirazin-6-il]-1H-pirazol-1- iletanol (PFO4217903, CAS 956905-27-4); N-((2R)-1,4-Dioxan-2- ilmetil)- N-metil-N'-[3-(1-metil-1 H-pirazol-4-i1)-5-0x0-5H-benzo[4,5] ci- cloepta[1,2-b]piridin-7-il]lsulfamida (MK2461, CAS 917879-39-1); 6-[[6- (1-Metil-1H-pirazol-4-i1)-1,2,4-triazolo[4,3-b]piridazin3-il]Jtio]-quinolina (SGX523, CAS 1022150-57-7); e (3Z)-5-[[(2,6-Diclorofenil)metil] sulfo- nil]-3-[[3,5-dimetil-4-[[(2R)-2-(1-pirrolidinilmetil)-1-pirrolidinilJ|carbonil]- 1H-pirrol-2-il]lmetileno]-1,3-di-hidro-2H-indol-2-o0na/ (PHA665752, CAS 477575-56-7).

[00409] Inibidores de IGF1IR incluem, mas não se limitam a, BMS- 754807, XL-228, OSI-906, GSK0904529A, A-928605, AXL1717, KW- 2450, MKO646, AMGA479, IMCA12, MEDI-573 e BI836845. Consultar, por exemplo, Yee, JNCI, 104; 975 (2012) para análise.

[00410] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar ou prevenir câncer por administração a um sujeito com ne- cessidade do mesmo de um conjugado de anticorpo e fármaco da pre- sente invenção em combinação com um ou mais inibidores da via de sinalização a jusante de GNAQ/GNA11, incluindo, porém sem limita- ção, inibidores de B-arrestina, inibidores de GRK, inibidores de MAPK, inibidores de PISK, inibidores de JAK, etc.

[00411] Por exemplo, inibidores de fosfoinositida 3-quinase (PI3K) incluem, porém sem limitação, Idelalisibe (Zydelig, GS-1101, Cal-101), 4-[2-(1H-Indazol-4-i1)-6-[[4-(metilsulfonil )|piperazin-1-il]metilJtieno[3,2- d]Jpirimidin-4-il]morfolina (também conhecida como GDC 0941 e descri- ta nas Publicações PCT nº WO 09/036082 e nº WO 09/055730); 2- Metil-2-[4-[3-metil-2-0x0-8-(quinolin-3-il)-2,3-di-hidroimidazo[4,5- clquinolin-1-il]fenil]propionitrila (também conhecida como BEZ 235 ou NVP-BEZ 235, e descrita na Publicação PCT nº WO 06/122806); 4- (trifluorometil)-5-(2,6-dimorfolinopirimidin-4-il)piridin-2-amina — (também conhecida como BKM120 ou NVP-BKM120, e descrita na Publicação

PCT nº WOZ2007/084786); Tozasertib (VX680 ou MK-0457, CAS 639089-54-6); — (52Z)-5-[[4-(4-Piridinil)-6-quinolinil]metileno]-2,4-tiazoli- dinadiona (GSK1059615, CAS 958852-01-2); (16E,48,4aR,5R,6aS, 9aR)-5-(Acetilóxi)-1-[(di-2-propenilamino)metileno]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a- octaidro-11-hidróxi-4-(metoximetil)-4a,6a-dimetil-ciclopenta[5,6]nafto [1,2-c]piran-2,7,10(1H)-triona (PX866, CAS 502632-66-8); e 8-Fenil-2- (morfolin-4-il)-cromen-4-ona (LY 294002, CAS 154447-36-6).

[00412] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar ou prevenir o câncer por administração a um sujeito com necessidade do mesmo de um conjugado de anticorpo e fármaco da presente invenção em combinação com uma ou mais pró-apoptose, incluindo, porém sem limitação, inibidores de IAP, inibidores de Bcl2, inibidores de MCI1, inibidores de Trail, inibidores de Chk.

[00413] Por exemplo, inibidores de IAP, incluem, porém sem limita- ção, LCL161, GDC-0917, AEG-35156, AT406 e TL32711. Outros exemplos de inibidores de IAP incluem, porém sem limitação, os des- critos nos documentos nº WO0O4/005284, nº WO 04/007529, nº WOO05/097791, nº WO 05/069894, nº WO 05/069888, nº WO 05/094818, nº US2006/0014700, nº US2006/0025347, nº WO 06/069063, nº WO 06/010118, nº WO 06/017295 e nº WOO08/134679, todos os quais estão incorporados no presente documento a título de referência.

[00414] Inibidores de BCL-2 incluem, porém sem limitação, Veneto- clax (também conhecido como GDC-0199, ABT-199, RG7601); 4-[4- [[2-(4-Clorofenil)-5,5-dimetil-1-cicloexen-1-il]metil]-1-piperazinil]-N-[[4- [II R)-3-(4-morfolinil)-1-[(feniltio ) metil]propilJamino]-3- [(triluorometil |sulfonil]fenil]|sulfonil]benzamida (também conhecida co- mo ABT-263 e descrita na Publicação PCT nº WO 09/155386); Tetro- carcina A; Antimicina; Gossipol ((-)BL-193); Obatoclax; Etil-2-amino-6- ciclopentil-4-(1-ciano-2-etóxi-2-0x0etil)-4Hcromona-3-carboxilato

(HA14 — 1); Oblimersen (G3139, GenasenseG€); peptídeo Bak BH3; ácido (-)-Gossipol acético (AT-101); 4-[4-[(4'-Cloro[1,1'-bifenil]-2- il)]metil]-1-piperazinil]-N-[[4-[[(1R)-3-(dimetilamino)-1- [(feniltio)metil]propilJamino]-3-nitrofenil]sulfonil]-benzamida — (ABT-737, CAS 852808-04-9); e Navitoclax (ABT-263, CAS 923564-51-6).

[00415] —Agonistas de receptor pró-apoptóticos (PARAs), incluindo DR4 (TRAILR1I) e DR5 (TRAILR2), incluindo, porém sem limitação, Dulanermina (AMG-951, RhApo2L/TRAIL); Mapatumumabe (HRS- ETR1, CAS 658052-09-6); Lexatumumabe (HGS-ETR2, CAS 845816- 02-6); Apomabe (Apomab&O); Conatumumabe (AMG655, CAS 896731- 82-1); e Tigatuzumabe (CS1008, CAS 946415-34-5, disponível junto à Daiichi Sankyo).

[00416] Inibidores de quinase de ponto de verificação (CHK) inclu- em, porém sem limitação, 7-Hidroxistaurosporina (UCN-01); 6-Bromo- 3-(1-metil-1H-pirazol-4-i1)-5-(3R)-3-piperidinil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7- amina (SCH900776, CAS 891494-63-6); ácido 5-(3-Fluorofenil)-3- ureidotiofeno-2-carboxílico N-[(S)-piperidin-3-ilJamida (AZD7762, CAS 860352-01-8); 4-[((3S)-1-Azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)amino]-3-(1H- benzimidazol|-2-il)-6-cloroquinolin-2(1H)-ona (CHIR 124, CAS 405168- 58-3); 7-aminodactinomicina (7-AAD), Isogranulatimida, debromoime- nialdisina; — N-[5-Bromo-4-metil-2-[(2S)-2-morfolinilmetóxi]-fenil]-N'-(5- metil-2-pirazinil)ureia (LY2603618, CAS 911222-45-2); Sulforafano (CAS 4478-93-71, isotiocianato de 4-Metilsulfinilbutila); 9,10,11,12- Tetraidro- 9,12-epóxi-1H-di-indolo[1,2,3-fg:3',2',1'-KkNpirrolo[3,4- 11[1,6]benzodiazocina-1,3(2H)-diona (SB-218078, CAS 135897-06-2); e TAT-S216A (YGRKKRRQRRRLYRSPAMPENL), (SEQ ID NO: 282)), e CBP501 ((d-Bpa)sws(d-Phe-F5)(d-Cha)rrrgrr).

[00417] Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece um método de tratar ou prevenir o câncer por administração a um su- jeito com necessidade do mesmo de um conjugado de anticorpo e fármaco da presente invenção em combinação com um ou mais imu- nomoduladores (por exemplo, um ou mais dentre: um ativador de uma molécula coestimuladora ou um inibidor de uma molécula de ponto de verificação imune).

[00418] Em certas modalidades, o imunomodulador é um ativador de uma molécula coestimuladora. Em uma modalidade, o agonista da molécula coestimuladora é escolhido dentre um agonista (por exem- plo, um anticorpo agonístico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou uma fusão solúvel) de ligante OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, STING ou CD83.

[00419] Em certas modalidades, o imunomodulador é um inibidor de uma molécula do ponto de verificação imune. Em uma modalidade, o imunomodulador é um inibidor de PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLAA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e/ou TGFR beta. Em uma modalidade, o inibidor de uma molécula do ponto de verificação imune inibe PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3 ou CTLA4 ou qualquer sua combinação. O termo "inibição” ou "inibidor" inclui uma redução em um certo parâmetro, por exemplo, uma atividade, de uma determinada molécula, por exemplo, um inibidor do ponto de verificação imune. Por exemplo, a inibição de uma atividade, por exemplo, uma atividade de PD-1 ou PD-L1, de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou mais está incluída por este termo. Assim, a inibição não precisa ser de 100%.

[00420] A inibição de uma molécula inibidora pode ser realizada a nível do DNA, RNA ou da proteína. Em algumas modalidades, um áci- do nucleico inibidor (por exemplo, um dsRNA, shRNA ou siRNA), pode ser usado para inibir a expressão de uma molécula inibitória. Em ou- tras modalidades, o inibidor de um sinal inibitório é um polipeptídeo,

por exemplo, um ligante solúvel (por exemplo, PD-1-lg ou CTLA-4 lg), ou um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga à molécula inibitória; por exemplo, um anticorpo ou um frag- mento do mesmo (também chamado no presente documento de "mo- lécula de anticorpo"), que se liga a PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLAA, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e/ou TGFR beta ou uma combinação dos mesmos.

[00421] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo é um anticor- po completo ou seu fragmento (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab'), Fv ou Fv de cadeia única (scFv)). Ainda em outras modalida- des, a molécula de anticorpo tem uma região constante de cadeia pe- sada (Fc) escolhida dentre, por exemplo, regiões constantes de cadeia pesada de IgG1, IgG2, 1963, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE; particu- larmente, escolhidas dentre, por exemplo, regiões constantes de ca- deia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, mais particularmente, a regi- ão constante de cadeia pesada de IgG1 ou IgG4 (por exemplo, I9G1 ou IgG4 humana). Em uma modalidade, a região constante de cadeia pesada é IgG1 humana ou IgG4 humana. Em uma modalidade, a regi- ão constante é alterada, por exemplo, mutada, para modificar as pro- priedades da molécula de anticorpo (por exemplo, para aumentar ou diminuir um ou mais dentre: ligação de receptor Fc, glicosilação de an- ticorpo, o número de resíduos de cisteína, função de células efetoras ou função do complemento).

[00422] Em certas modalidades, a molécula de anticorpo está sob a forma de uma molécula de anticorpo biespecífica ou multiespecífica. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo biespecífica tem uma primeira especificidade de ligação a PD-1 ou PD-L1, e uma segunda especificidade de ligação, por exemplo, uma segunda especificidade de ligação a TIM-3, LAG-3 ou PD-L2. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo biespecífica se liga a PD-1 ou PD-L1 e TIM-3. Em outra modalidade, a molécula de anticorpo biespecífica se liga a PD-1 ou PD-L1 e LAG-3. Em outra modalidade, a molécula de anticorpo bies- pecífica se liga a PD-1 e PD-L1. Ainda em outra modalidade, a molé- cula de anticorpo biespecífica se liga a PD-1 e PD-L2. Em outra moda- lidade, a molécula de anticorpo biespecífica se liga a TIM-3 e LAG-3. Qualquer combinação das moléculas supracitadas pode ser feita em uma molécula de anticorpo multiespecífica, por exemplo, um anticorpo triespecífico que inclui uma primeira especificidade de ligação a PD-1 ou PD-1, e uma segunda e terceira especificidades de ligação a dois ou mais dentre: TIM-3, LAG-3 ou PD-L2.

[00423] Em certas modalidades, o imunomodulador é um inibidor de PD-1, por exemplo, PD-1 humano. Em outra modalidade, o imunomo- dulador é um inibidor de PD-L1, por exemplo, PD-L1 humano. Em uma modalidade, o inibidor de PD-1 ou PD-L1 é uma molécula de anticorpo para PD-1 ou PD-L1. O inibidor de PD-1 ou PD-L1 pode ser adminis- trado individualmente ou em combinação com outros imunomodulado- res, por exemplo, em combinação com um inibidor de LAG-3, TIM-3 ou CTLA4. Em uma modalidade exemplificativa, o inibidor de PD-1 ou PD-L1, por exemplo, a molécula de anticorpo anti-PD-1 ou PD-L1, é administrado em combinação com um inibidor de LAG-3, por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-LAG-3. Em outra modalidade, o inibi- dor de PD-1 ou PD-L1, por exemplo, a molécula de anticorpo anti-PD- 1 ou PD-L1, é administrado em combinação com um inibidor de TIM-3, por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-TIM-3. Ainda em outras modalidades, o inibidor de PD-1 ou PD-L1, por exemplo, a molécula de anticorpo anti-PD-1, é administrado em combinação com um inibidor de LAG-3, por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-LAG-3 e um inibidor de TIM-3, por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-TIM-3. Outras combinações de imunomoduladores com um inibidor de PD-1 (por exemplo, um ou mais de PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA,

BTLA, TIGIT, LAIR1I, CD160, 2B4 e/ou TGFR) estão também dentro do escopo da presente invenção. Qualquer uma das moléculas de an- ticorpo conhecidas na técnica ou descritas no presente documento po- de ser usada nas combinações supracitadas de inibidores de molécula de ponto de verificação.

[00424] Em uma modalidade, o inibidor de PD-1 é um anticorpo an- ti-PD-1 escolhido de Nivolumabe, Pembrolizumabe ou Pidilizumabe. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é Nivolumabe. No- mes alternativos para Nivolumabe incluem MDX-1106, MDX-1106-04, ONO-4538 ou BMS-936558. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é Nivolumabe (número de registro CAS: 946414-94-4). Nivo- lumabe é um anticorpo monoclonal I9gG4 totalmente humano que blo- queia especificamente PD-1. Nivolumabe (clone 5C4) e outros anticor- pos monoclonais humanos que se ligam especificamente a PD1 são descritos na Pat US nº 8.008.449 e Publicação PCT nº WOZ2006/121168.

[00425] Em outras modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é Pembroli- zumabe. Pembrolizumabe (Nome comercial KEYTRUDA, anteriormen- te conhecido como Lambrolizumabe,-também conhecido como Merck 3745, MK-3475 ou SCH-900475) é um anticorpo monoclonal I9gG4 hu- manizado que se liga a PD1. Pembrolizumabe é descrito, por exemplo, em Hamid, O. et al. (2013), New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44, Publicação PCT Nº WOZ2009/114335 e Patente US nº 8,354,509.

[00426] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é Pidilizu- mabe. Pidilizumabe (CT-011; Cure Tech) é um anticorpo monoclional IgG1k humanizado que se liga a PD1. Pidilizumabe e outros anticorpos monoclonais anti-PD-1 humanizados são descritos na Publicação PCT Nº WO2009/101611. Outros anticorpos anti-PD1 são descritos na Pa- tente US nº 8.609.089, Publicação US nº 2010028330 e/ou Publicação

US nº 20120114649. Outros anticorpos anti-PD1 incluem AMP 514 (Amplimmune).

[00427] Em algumas modalidades, o inibidor de PD-1 é PDRO01, também conhecido como espartalizumabe, ou qualquer outro anticorpo anti-PD-1 descrito no documento nº WO2015/112900.

[00428] Em algumas modalidades, o inibidor de PD-1 é uma imuno- adesina (por exemplo, uma imunoadesina compreendendo uma por- ção de ligação extracelular ou de PD-1 de PD-LI ou PD-L2 fundida com uma região constante (por exemplo, uma região de Fc de uma sequência de imunoglobulina)). Em algumas modalidades, o inibidor de PD-1 é AMP-224.

[00429] Em algumas modalidades, o inibidor de PD-LI é anticorpo anti-PD-LI. Em algumas modalidades, o inibidor de anti-PD-LI é seleci- onado de YW243.55.870, MPDL3280A, MEDI-4736 ou MDX- 1105MSB-0010718C (também referido como A09-246-2) descrito, por exemplo, no documento nº WO 2013/0179174, e tendo uma sequência descrita no presente documento (ou uma sequência substancialmente idêntica ou similar à mesma, por exemplo, uma sequência pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais idêntica à sequência especificada).

[00430] Em uma modalidade, o inibidor de PD-L1 é MDX-1105. MDX-1105, também conhecido como BMS-936559, é um anticorpo anti-PD-LI descrito na publicação PCT nº WO2007/005874.

[00431] Em uma modalidade, o inibidor de PD-L1 é YW243.55.S70. O anticorpo YW243.55.870 é um anti-PD-LI descrito na Publicação PCT nº WO 2010/077634 (sequências de região variável de cadeia pesada e leve mostradas nas SEQ ID Nos. 20 e 21, respectivamente).

[00432] Em uma modalidade, o inibidor de PD-L1 é MDPL3280A (Genentech / Roche). MDPL3280A é um anticorpo monoclonal I9G1 Fc humano otimizado que se liga a PD-L1. MDPL3280A e outros anti- corpos monoclonais humanos para PD-L1 são descritos na Patente

US nº 7.943.743 e Publicação US nº: 20120039906.

[00433] Em outras modalidades, o inibidor de PD-L2 é AMP-224. AMP-224 é um receptor solúvel de fusão Fc PD-L2 que bloqueia a in- teração entre PD1 e B7-H1 (B7-DClg; Amplimmune; por exemplo, descrito nas Publicações PCT nº WO2010/027827 e nº WO2011/ 066342).

[00434] Em uma modalidade, o inibidor de LAG-3 é uma molécula de anticorpo anti-LAG-3. Em uma modalidade, o inibidor de LAG-3 é BMS-986016. Em uma modalidade, o inibidor de LAG-3 é LAG525 ou qualquer anticorpo anti-LAG3 descrito no documento nº WO2015/

138920.

[00435] Em uma modalidade, o inibidor de TIM-3 é uma molécula de anticorpo anti-TIM3. Em uma modalidade, o inibidor de TIM-3 é MBG453 ou qualquer anticorpo anti-TIM3 descrito no documento nº WO?2015/117002. Composições Farmacêuticas

[00436] Para preparar composições farmacêuticas ou esterilizadas, incluindo imunoconjugados, os imunoconjugados da invenção são mis- turados com um transportador ou excipiente farmaceuticamente acei- tável. As composições podem conter adicionalmente um ou mais ou- tros agentes terapêuticos que são adequados para o tratamento ou prevenção de um câncer que expressa PMEL17 (incluindo, porém sem limitação, melanoma subcutâneo, melanoma uveal, carcinoma hepato- celular e um câncer metastático dos mesmos).

[00437] As formulações de agentes terapêuticos e diagnósticos po- dem ser preparadas por mistura com transportadores, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis na forma de, por exemplo, pós liofilizados, pastas fluidas, soluções aquosas, loções ou suspen- sões (consultar, por exemplo, Hardman et al., Goodman e Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nova lorque,

N.Y., 2001; Gennaro, Remington: The Science and Practice of Phar- macy, Lippincott, Williams, e Wilkins, Nova lorque, N.Y., 2000; Avis, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY, 1993; Lieberman, et al. (eds.), Pharmaceutical Do- sage Forms: tablets, Marcel Dekker, NY, 1990; Lieberman, et al. (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY, 1990; Weiner e Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dek- ker, Inc., Nova lorque, N.Y., 2000).

[00438] A seleção de um regime de administração para um produto terapêutico depende de vários fatores, incluindo a taxa de renovação de soro ou tecido da entidade, o nível de sintomas, a imunogenicidade da entidade e a acessibilidade das células-alvo na matriz biológica. Em certas modalidades, um regime de administração maximiza a quanti- dade de produto terapêutico entregue ao paciente compatível com um nível aceitável de efeitos colaterais. Consequentemente, a quantidade de produto biológico entregue depende, em parte, da entidade particu- lar e da gravidade da afecção que está sendo tratada. A orientação para selecionar doses adequadas de anticorpos, citocinas e moléculas pequenas está disponível (consultar, por exemplo, Wawrzynczak, An- tibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK, 1996; Kresi- na (ed.), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dek- ker, Nova lorque, N.Y., 1991; Bach (ed.), Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nova lor- que, N.Y., 1993; Baert et al., New Engl. J. Med. 348:601-608, 2003; Milgrom et a/., New Engl. J. Med. 341:1966-1973, 1999; Slamon et al., New Engl. J. Med. 344:783-792, 2001; Beniaminovitz et al., New Engl. J. Med. 342:613-619, 2000; Ghosh et al., New Engl. J. Med. 348:24- 32, 2003; Lipsky et al., New Engl. J. Med. 343:1594-1602, 2000).

[00439] A determinação da dose adequada é feita pelo médico, por exemplo, com o uso de parâmetros ou fatores conhecidos ou suspei-

tos na técnica por afetar o tratamento ou prevenção ou previstos para afetar o tratamento ou prevenção. Em geral, a dose começa com uma quantidade de algum modo menor do que a dose ideal e a mesma é aumentada por pequenos incrementos, posteriormente, até o efeito desejado ou ideal ser alcançado em relação a quaisquer efeitos colate- rais negativos. As medidas diagnósticas importantes incluem aquelas de sintomas, por exemplo, da inflamação ou nível das citocinas infla- matórias produzidas.

[00440] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de forma a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz pa- ra obter a resposta terapêutica desejada para um paciente específico, composição e modo de administração, sem ser tóxico ao paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições específicas da presente invenção usadas, ou éster, sal ou amida das mesmas, a via de administração, o momento de administração, a taxa de excreção do composto específico que está sendo usado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições específicas usadas, a idade, sexo, peso, condi- ção, saúde geral e histórico médico anterior do paciente que está sen- do tratado e fatores similares conhecidos nas técnicas médicas.

[00441] As composições que compreendem anticorpos ou fragmen- tos dos mesmos da invenção podem ser fornecidas por infusão contí- nua ou por doses em intervalos de, por exemplo, um dia, uma semana, ou 1-7 vezes por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez a cada cinco semanas, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada sete semanas ou uma vez a cada oito semanas. As doses podem ser for- necidas por via intravenosa, subcutânea, tópica, oral, nasal, retal, in-

tramuscular, intracerebral ou por inalação. Um protocolo de dose es- pecífico é um que envolve a dose ou frequência de dose máxima que evita efeitos colaterais indesejáveis significativos.

[00442] Para os imunoconjugados da invenção, a dosagem admi- nistrada a um paciente pode ser 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg do peso corporal do paciente. A dosagem pode ser entre 0,0001 mg/kg e 30 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 20 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 10 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 5 mg/kg, 0,0001 e 2 mg/kg, 0,0001 e 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 0,75 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 0,5 mg/kg, 0,0001 mg/kg a 0,25 mg/kg, 0,0001 a 0,15 mg/kg, 0,0001 a 0,10 mg/kg, 0,001 a 0,5 mg/kg, 0,01 a 0,25 mg/kg ou 0,01 a 0,10 mg/kg do peso corporal do paciente. A do- sagem dos anticorpos ou seus fragmentos da invenção pode ser cal- culada por meio do peso do paciente em quilogramas (kg) multiplicado pela dose a ser administrada em mg/kg.

[00443] As doses dos imunoconjugados da invenção podem ser re- petidas, e as administrações podem ser separadas por menos do que 1 dia, pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 di- as, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, 4 meses, 5 meses ou pelo menos 6 meses. Em algumas modalidades, os imunoconjugados da invenção podem ser administrados duas vezes por semana, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três se- manas, uma vez a cada quatro semanas ou com menos frequência. Em uma determinada modalidade, as doses de imunoconjugados da invenção são repetidas a cada 2 semanas.

[00444] Uma quantidade eficaz para um paciente específico pode variar dependendo de fatores, como a afecção que está sendo tratada, a saúde geral do paciente, o método, via e dose de administração e a gravidade de efeitos colaterais (consultar, por exemplo, Maynard et al., A Handbook of SOP's for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Bo- ca Raton, Fla., 1996; Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practi-

ce, Urch Publ., Londres, Reino Unido, 2001).

[00445] A via de administração pode ser, por exemplo, por aplica- ção tópica ou cutânea, injeção ou infusão por administração subcutâã- nea, intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocu- lar, intra-arterial, intracerebroespinhal, intralesional ou por sistemas de liberação sustentada ou um implante (consultar, por exemplo, Sidman et al., Biopolymers 22:547 a 556, 1983; Langer et al., J. Biomed. Ma- ter. Res. 15:167 a 277, 1981; Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982; Epstein et a/l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 77:4030-4034, 1980; Patente US nº

6.350.466 e nº 6.316.024). Quando for necessário, a composição pode também incluir um agente de solubilização ou um anestésico local, como lidocaina, para aliviar a dor no local da injeção ou ambos. Adici- onalmente, a administração pulmonar pode também ser usada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador e formulação com um agente de aerossolização. Consultar, por exemplo, as Patentes U.S. nº 6.019.968, nº 5.985.320, nº 5.985.309, nº 5.934.272, nº

5.874.064, nº 5.855.913, nº 5.290.540 e nº 4.880.078; e Publicações PCT nº WO 92/19244, nº WO 97/32572, nº WO 97/44013, nº WO 98/31346 e nº WO 99/66903, cada um dos quais está incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00446] Uma composição da presente invenção pode também ser administrada por meio de uma ou mais vias de administração usando uma ou mais dentre uma variedade de métodos conhecidos na técni- ca. Como será entendido pelo versado na técnica, a via e/ou modo de administração irá variar dependendo dos resultados desejados. As vi- as de administração selecionadas para os imunoconjugados da inven- ção incluem vias de administração endovenosa, intramuscular, intrape- ritoneal, subcutânea, intradérmica, medula ou outras vias de adminis- tração parenteral, por exemplo, por injeção ou infusão. A administra-

ção parenteral pode representar modos de administração diferentes de administração enteral e tópica, usualmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intra- peritoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, sub- capsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intraesternal. Alterna- tivamente, uma composição da invenção pode ser administrada por meio de uma via não parenteral, como uma via de administração tópi- ca, epidérmica ou mucosa, por exemplo, por via intranasal, oral, vagi- nal, retal, sublingual ou tópica. Em uma modalidade, os imunoconju- gados da invenção são administrados por infusão. Em outras modali- dades, os imunoconjugados da invenção são administrados subcuta- neamente.

[00447] Se os imunoconjugados da invenção forem administrados em um sistema de liberação controlada ou de liberação sustentada, pode ser usada uma bomba para obter a liberação controlada ou sus- tentada (consultar Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20, 1987; Buchwald et a/., Surgery 88:507, 1980; Saudek et a/., N. Engl. J. Med. 321:574, 1989). Podem ser usados materiais poliméricos para obter a liberação controlada ou sustentada das terapias da invenção (consultar, por exemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla., 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, Nova lorque, 1984; Ranger e Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1983; consultar também Levy et al., Science 228:190, 1985; During et a/., Ann. Neurol. 25:351, 1989; Howard et al., J. Neurosurg. 7 1:105, 1989; Pat. US nº

5.679.377, Patente US nº 5.916.597, Patente US nº 5.912.015, Paten- te US nº 5.989.463, Patente US nº 5.128.326; Publicação PCT nº WO 99/15154; e Publicação PCT nº WO 99/20253). Exemplos de políme-

ros usados em formulações de liberação sustentada incluem, porém sem limitação, poli(2-hidróxi metacrilato de etila), poli(metacrilato de metila), poli(ácido acrílico), polifacetato de etileno-co-vinila), polifácido metacrílico), poliglicolídeos (PLG), polianidridos, poli(N-vinil pirrolido- na), poli(álcool vinílico), poliacrilamida, poli(etilenoglicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicolídeos) (PLGA) e poliortoésteres. Em uma modalidade, o polímero usado em uma formulação de liberação sus- tentada é inerte, isento de impurezas lixiviáveis, estável no armaze- namento, estéril e biodegradável. Um sistema de liberação controlada ou sustentada pode ser colocado em proximidade do alvo profilático ou terapêutico, exigindo, portanto, apenas uma fração da dose sistêmica (consultar, por exemplo, Goodson, em Medical Applications of Con- trolled Release, supra, vol. 2, páginas 115-138, 1984).

[00448] Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão de Langer, Science 249:1527-1533, 1990. Qualquer técnica conhecida por um elemento versado na técnica pode ser usada para produzir formulações de liberação sustentada compreendendo um ou mais imunoconjugados da invenção. Consultar, por exemplo, as Pa- tentes US nº 4.526.938, Publicação PCT nº WO 91/05548, Publicação PCT nº WO 96/20698, Ning et a/l., Radiotherapy & Oncology 39:179- 189, 1996; Song et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, 1995; Cleek et al., Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 1997; e Lam et al., Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, 1997, cada uma das quais é incorporada no presente documento por referência na sua totalidade.

[00449] Se os imunoconjugados da invenção forem administrados topicamente, os mesmos podem ser formulados sob a forma de uma pomada, creme, emplastro transdérmico, loção, gel, spray, aerossol, solução, emulsão ou outra forma bem conhecida por um elemento ver- sado na técnica. Consultar, por exemplo, Remington's Pharmaceutical

Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19º ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Para formas de dosagem tópica não aspersíveis, são tipicamente usadas formas viscosas a semissóli- das ou sólidas que compreendem um transportador ou um ou mais excipientes compatíveis com a aplicação tópica e tendo uma viscosi- dade dinâmica, em alguns casos, maior do que a da água. Formula- ções adequadas incluem, sem limitação, soluções, suspensões, emul- sões, cremes, pomadas, pós, linimentos, unguentos, e afins, que são, se desejado, esterilizados ou misturados com agentes auxiliares (por exemplo, conservantes, estabilizantes, agentes umectantes, tampões ou sais) para influenciar várias propriedades, como, por exemplo, pressão osmótica. Outras formas de dosagem tópica adequadas inclu- em preparações aerossol pulverizáveis, onde o ingrediente ativo, em alguns casos, em combinação com um transportador inerte sólido ou líquido, é embalado em uma mistura com um volátil pressurizado (por exemplo, um propelente gasoso, como freon) ou em uma garrafa com- primível. Hidratantes ou umectantes podem também ser adicionados a composições farmacêuticas e formas de dosagem, se desejado. Exemplos de tais ingredientes adicionais são bem conhecidos na téc- nica.

[00450] Se as composições compreendendo os imunoconjugados forem administradas por via nasal, podem ser formuladas em forma de aerossol, spray, pulverização ou sob a forma de gotas. Em particular, os agentes profiláticos ou terapêuticos para uso de acordo com a pre- sente invenção podem ser convenientemente administrados na forma de uma apresentação de spray aerossol a partir de embalagens pres- surizadas ou um nebulizador, com o uso de um propelente adequado (por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetra- fluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado). No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determi-

nada fornecendo uma válvula para administrar uma quantidade cali- brada. Cápsulas e cartuchos (compostos de, por exemplo, gelatina) para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados conten- do uma mistura de pó do composto e uma base de pó adequada, co- mo lactose ou amido.

[00451] Os métodos para a coadministração ou tratamento com um segundo agente terapêutico, por exemplo, uma citocina, esteroide, agente quimioterápico, antibiótico ou radiação são conhecidos na téc- nica (consultar, por exemplo, Hardman et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10º edição, McGraw-Hill, Nova lorque, N.Y.; Poole e Peterson (eds.) (2001) Phar- macotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lip- pincott, Williams & Wilkins, Filadélfia, Pa.; Chabner e Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadélfia., Pa.). Uma quantidade eficaz do produto terapêutico pode diminuir os sintomas em pelo menos 10%; em pelo menos 20%; pelo menos cerca de 30%; pelo menos 40% ou pelo menos 50%.

[00452] Terapias adicionais (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) que podem ser administradas em combinação com os imunoconjugados da invenção, podem ser administradas com menos do que 5 minutos de diferença, menos do que 30 minutos de diferença, 1 hora de diferença, cerca de 1 hora de diferença, cerca de 1 a cerca de 2 horas de diferença, cerca de 2 horas a cerca de 3 horas de dife- rença, cerca de 3 horas a cerca de 4 horas de diferença, cerca de 4 horas a cerca de 5 horas de diferença, cerca de 5 horas a cerca de 6 horas de diferença, cerca de 6 horas a cerca de 7 horas de diferença, cerca de 7 horas a cerca de 8 horas de diferença, cerca de 8 horas a cerca de 9 horas de diferença, cerca de 9 horas a cerca de 10 horas de diferença, cerca de 10 horas a cerca de 11 horas de diferença, cer- ca de 11 horas a cerca de 12 horas de diferença, cerca de 12 horas a

18 horas de diferença, 18 horas a 24 horas de diferença, 24 horas a 36 horas de diferença, 36 horas a 48 horas de diferença, 48 horas a 52 horas de diferença, 52 horas a 60 horas de diferença, 60 horas a 72 horas de diferença, 72 horas a 84 horas de diferença, 84 horas a 96 horas de diferença ou 96 horas a 120 horas de diferença dos imu- noconjugados da invenção. As duas ou mais terapias podem ser ad- ministradas dentro de uma mesma consulta do paciente.

[00453] Em algumas modalidades, os imunoconjugados da inven- ção podem ser formulados para garantir uma distribuição adequada in vivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para garantir que os compostos te- rapêuticos da invenção atravessam a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomos. Para métodos de fabri- cação de lipossomos, consultar, por exemplo, as Patentes US nº

4.522.811; nº 5.374.548; e nº 5.399.331. Os lipossomas podem incluir uma ou mais porções químicas que são seletivamente transportadas para células ou órgãos específicos, dessa forma, para melhorar a dis- tribuição de fármaco alvejada (consultar, por exemplo, Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Exemplos de porções químicas dirigidas a alvo incluem ácido fólico ou biotina (consultar, por exemplo, a Patente US nº 5.416.016 de Low et al.); manosidas (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticorpos (Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; Owais et a/., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína A de tensoativo (Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p 120 (Schreier et a/l., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); consultar também K. Keinanen; M. L. Laukka- nen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; |. J. Fidler (1994) Immu- nomethods 4:273.

[00454] A invenção fornece protocolos para a administração da composição farmacêutica que compreende os imunoconjugados da invenção individualmente ou em combinação com outras terapias a um sujeito que precisa das mesmas. As terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) das terapias de combinação da presente invenção podem ser administradas concomitante ou sequencialmente a um sujeito. A terapia (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuti- cos) das terapias de combinação da presente invenção podem tam- bém ser administradas ciclicamente. A terapia de ciclagem envolve a administração de uma primeira terapia (por exemplo, um primeiro agente profilático ou terapêutico) por um período de tempo, seguida da administração de uma segunda terapia (por exemplo, um segundo agente profilático ou terapêutico) por um período de tempo e a repeti- ção dessa administração sequencial, isto é, o ciclo, a fim de reduzir o desenvolvimento de resistência a uma das terapias (por exemplo, agentes) para evitar ou reduzir os efeitos colaterais de uma das terapi- as (por exemplo, agentes) e/ou melhorar a eficácia das terapias.

[00455] As terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuti- cos) das terapias de combinação da presente invenção podem ser administradas concomitantemente a um sujeito.

[00456] O termo "concomitantemente" não se limita à administração de terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) exata- mente ao mesmo tempo, porém significa que uma composição farma- cêutica que compreende anticorpos ou fragmentos dos mesmos da invenção é administrada a um sujeito em uma sequência e dentro de um intervalo de tempo de modo que os conjugados de anticorpo e fármaco da invenção possam atuar em conjunto com a outra terapia (ou terapias) para fornecer um benefício aumentado em relação a se os mesmos forem administrados de outro modo. Por exemplo, cada terapia pode ser administrada a um sujeito ao mesmo tempo ou se- quencialmente em qualquer ordem em diferentes pontos no tempo; no entanto, se não for administrada ao mesmo tempo, deve ser adminis-

trada em tempo suficientemente próximo de modo a fornecer o efeito terapêutico ou profilático desejado. Cada terapia pode ser administra- da a um sujeito separadamente, em qualquer forma adequada e por qualquer via adequada. Em várias modalidades, as terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) são administradas a um indivíduo com menos do que 5 minutos de diferença, menos do que 15 minutos de diferença, menos do que 30 minutos de diferença, menos do que 1 hora de diferença, cerca de 1 hora de diferença, cerca de 1 hora a cerca de 2 horas de diferença, cerca de 2 horas a cerca de 3 horas de diferença, cerca de 3 horas a cerca de 4 horas de diferença, cerca de 4 horas a cerca de 5 horas de diferença, cerca de 5 horas a cerca de 6 horas de diferença, cerca de 6 horas a cerca de 7 horas de diferença, cerca de 7 horas a cerca de 8 horas de diferença, cerca de 8 horas a cerca de 9 horas de diferença, cerca de 9 horas a cerca de horas de diferença, cerca de 10 horas a cerca de 11 horas de dife- rença, cerca de 11 horas a cerca de 12 horas de diferença, 24 horas de diferença, 48 horas de diferença, 72 horas de diferença ou 1 sema- na de diferença. Em outras modalidades, duas ou mais terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) são administradas den- tro da mesma consulta do paciente.

[00457] Os agentes profiláticos ou terapêuticos das terapias de combinação podem ser administrados a um sujeito na mesma compo- sição farmacêutica. Alternativamente, os agentes profiláticos ou tera- pêuticos das terapias de combinação podem ser administrados con- comitantemente a um sujeito em composições farmacêuticas separa- das. Os agentes profiláticos ou terapêuticos podem ser administrados a um sujeito por vias de administração iguais ou diferentes. Os agen- tes profiláticos ou terapêuticos das terapias de combinação podem ser administrados a um sujeito na mesma composição farmacêutica. Al- ternativamente, os agentes profiláticos ou terapêuticos das terapias de combinação podem ser administrados concomitantemente a um sujeito em composições farmacêuticas separadas. Os agentes profiláticos ou terapêuticos podem ser administrados a um sujeito por vias de admi- nistração iguais ou diferentes. Exemplos Exemplo 1: Síntese de Compostos de Ligante-Fármaco Exemplifi- cativos Exemplo 1-1: Síntese de (2S8,3R)-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il )etóxi )|Dropanamido)-3-metilbutanamido)-5- ureiídopentanamido)benzil)óxi)(hidróxi)fosforil)óxi)-4-metil-2-propiona- midopentanoato de (R)-1-((3S,6S,9S,128S,18R,21S,22R)-21-acetamido -18-benzil-22-isopropil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16-pentametil-15- metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta- azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (B1) Etapa 1: Síntese de (2S,3R)-3-((hidróxi-hidrofosforil)óxi)-4-metil-2-pro- pionamidopentanoato de (R)-1-((3S,6S,9S,12S,18R,21S,22R)-21-ace- tamido-18-benzil-22-isopropil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16-penta- metil-15-metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16- penta-azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (1-1):

V dr So OOo mm, NH O o ImH, PCI . h dh ko day —— do OO Pd + o AO ACN : ' TORA R o LO ê AE A (A1) £o 1-1)

H

[00458] “Imidazol (102 mg, 1,49 mmol, 15 equiv.) foi dissolvido em acetonitrila (ACN) (1,4 ml) e resfriado em um banho de gelo (a degra- dação de ImH é observada e a mistura foi elevada do banho de gelo para solubilizar ImMH) enquanto ainda está fria.

Então, tricloreto de fós- foro (1,0 M em ACN) (499 ul, 0,499 mmol, 5 equiv.) foi adicionado por gotejamento (que resulta em uma suspensão branca) e a mistura foi agitada por 10 min.

Então, trietilamina (250 ul, 1,796 mmol, 18 equiv.) foi adicionada e a mistura foi agitada por 40 min, após isso, (2S,3R)-3- hidróxi-4-metil-2-propionamidopentanoato de (R)-1-((38,6S,9S,12S, 18R,218,22R)-21-acetamido-18-benzil-22-isopropil-3-((R)-1-metoxietil) -4,9,10,12,16-pentametil-15-metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19- dioxa-4,7,10,13,16-penta-azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (A1) (100 mg, 0,100 mmol, 1,0 equiv., o composto (A1) foi obtido usando-se o método descrito no Exemplo 3-1) em ACN (1,7 ml) foi adicionado.

À mistura heterogênea laranja amarelada foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por um total de 60 minutos.

A mistura foi tratada com água (0,2 ml) e o material purificado por cromatografia flash de fase reversa (ACN/Água a 0-100%, coluna C18 de 40 gramas, fase móvel neutra) e as frações de produto coletadas e liofiizadas para produzir o H-fosfonato (1-1) como um pó amorfo branco amarelado.

LCMS: MH+ = 1066,3, 0,78 min (Acquity UPLC BEH C18 1.7um Colu- na, 2-98% 2min conduzida com Água/MeCN +NH4OH a 0,1%, método básico). Etapa 2: Síntese de 28S,3R)-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-diox0-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)etóxi)propanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureído- pentanamido)benzil)óxi)(hidróxi)fosforil)óxi)-4-metil-2-propionamido- pentanoato de (R)-1-((3S,6S,9S,128S,18R,218S,22R)-21-acetamido-18- benzil-22-isopropil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16-pentametil-15- metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta- azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila ((B1):

oH ex, À O “NH | Oo L ox” no "CNH al NAS 1PNCLPY “ do cNIA + HN im OM 2. lodo, Água HN,, nO E h un 8º | NH VI » 9 o o N oH (11) o 5 o mA, Ox Oz: 7 o Ê£ "" ANTA A o Dre EA HW Ç o S NH o NA H e

AAA EA O TUA HN beto o h E % o (81)

[00459] —(2S,3R)-3-((hidróxi-hidrofosforil)óxi)-4-metil-2-propionamido- pentanoato de (R)-1-((3S,6S,9S,128S,18R,218S,22R)-21-acetamido-18- benzil-22-isopropil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16-pentametil-15- metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta- azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (1-1) (100 mg, 0,094 mmol, 1,0 equiv.) e (S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etóxi) propanamido)-3-metilbutanamido)-N-(4-(hidroximetil)fenil)-5-ureídopen- tanamida (108 mg, 0,188 mmol, 2,0 equiv., CAS* é 2055041-37-5) (ambos os pós liofilizados foram transferidos para um frasco de 10 ml) e dissolvidos em piridina (4 ml). Então, cloreto de pivaloíla (0,058 ml, 0,469 mmol, 5 equiv.) foi adicionado por gotejamento para render uma solução amarela fraca. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos e, então, 1,0 equiv. de cloreto de pivaloíla adicional foi adicionado. Uma solução de iodo recentemente preparada (47,6 mg, 0,188 mmol, 2,0 equiv.) em piridina-água (14:1, 750 ul) foi adicio-

nada para render uma solução límpida marrom-escura.

A mistura foi agitada por 25 minutos e diretamente purificada por cromatografia flash de fase reversa (coluna C-18 de 40 g, AC/MeCN a 0% por 3 mi- nutos, então, ACN/Água a 0-60% por 15 minutos, método neutro) para produzir (2S,3R)-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)etóxi)propanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanami- do)benzil)óxi)(hidróxi)fosforil)óxi)-4-metil-2-propionamidopentanoato de (R)-1-((3S,6S,98S,128,18R,21S, — 22R)-21-acetamido-18-benzil-22-iso- propil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10, 12,16-pentametil-15-metileno-2,5,8, 11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta-azaciclodocosan- 6-i1)-2-metilpropila (B-1). HRMS; MH+ = 1638,7700, 2,84 min.

Exemplo 1-2: Síntese de (2S8,3R)-2-acetamido-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3- (2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il )etóxi )Dropanamido)-3-metilbuta- namido)-5-ureidopentanamido)benzil)óxi)(hidróxi)fosforil)óxi)-4-metol- pentanoato de (R)-1-((3S,6S,9S,128S,18R,218S,22R)-21-acetamido-18- benzil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16,22-hexametil-15-metileno-2,5, 8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta-azaciclodoco- san-6-il)-2-metilpropila (B2) Etapa 1: Síntese de (2S8,3R)-2-acetamido-3-((hidróxi-hidrofosforil)óxi)- 4-metilpentanoato de (R)-1-((38,6S,9S,128,18R,218S,22R)-21-aceta- mido-18-benzil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16,22-hexametil-15- metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta- azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (1-2): o SO | Dá ImH.PCb e “e no NH A o O OO = CCO ACN : EEE to (A2) e. (1-2)

[00460] “Imidazol (85 mg, 1,25 mmol, 15 equiv.) foi dissolvido em acetonitrila (ACN) (2,5 ml) e resfriado em um banho de gelo (a degra- dação de ImH é observada e a mistura foi elevada do banho de gelo para solubilizar ImMH) enquanto ainda está fria.

Então, tricloreto de fós- foro (36,4 ul dissolvidos em 0,5 ml de MeCN) 0,417 mmol, 5 equiv.) foi adicionado por gotejamento (que resulta em uma suspensão branca) e a mistura foi agitada por 10 min.

Então, trietilamina (174 ul, 1,25 mmol, equiv.) foi adicionada e a mistura foi agitada por 40 min, após isso, (28,3R)-2-acetamido-3-hidróxi-4-metilpentanoato de (R)-1-((3S,6S, 98,128,18R,218,22R)-21-acetamido-18-benzil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9, 10,12,16,22-hexametil-15-metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19- dioxa-4,7,10,13,16-penta-azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (A2) (80 mg, 0,084 mmol, 1,0 equiv., o composto (A2) foi obtido usando-se o método descrito no Exemplo 3-2) em ACN (1,7 ml) foi adicionado.

À mistura heterogênea laranja amarelada foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por um total de 30 minutos.

A mistura foi tratada com água (1 ml) e o material purificado por cromatografia flash de fase reversa (ACN/Água a 0-100%, coluna C18 de 40 gramas, fase móvel neutra) e as frações de produto coletadas e liofilizadas para produzir o H-fosfonato (1-2) como um pó amorfo branco amarelado.

LCMS: MH+ = 1024,3, 0,78 min (Acquity UPLC BEH C18 1.7um Coluna, 2-98% 2min conduzida com Água/MeCN +NHaOH a 0,1%, método básico). Etapa 2: Síntese de (2S,3R)-2-acetamido-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2- (2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etóxi)Dropanamido)-3-metilbutana- mido)-5-ureidopentanamido)benzil)óxi)(hidróxi)fosforil)óxi)-4-metolpen- tanoato de (R)-1-((3S8,6S,9S,12S,18R,21S,22R)-21-acetamido-18-ben- Zil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16,22-hexametil-15-metileno-2,5,8,11, 14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta-azaciclodocosan-6- il)-2-metilpropila:

Da oH o de 6 EA + E. 2. todo, Água Ah es : o p oH 1-2) Y 0531 S * Dre A H Ç o

AE O PAS “eo o 7? S 4 (82)

[00461] — (2S8,3R)-2-acetamido-3-((hidróxi-hidrofosforil)óxi)-4-metil- pentanoato de (R)-1-((3S,6S,9S,128S,18R,218S,22R)-21-acetamido-18- benzil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16,22-hexametil-15-metileno-2,5, 8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta-azaciclodoco- san-6-il)-2-metilpropila (1-2) (50 mg, 0,049 mmol, 1,0 equiv.) e (S)-2- ((8)-2-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etóxi)Dropanamido)-3- metilbutanamido)-N-(4-(hidroximetil)fenil)-5-ureidopentanamida (CASH 2055041-37-5) (33,7 mg, 0,059 mmol, 1,2 equiv.) (ambos os pós liofili- zados foram transferidos para um frasco de 10 ml) e dissolvidos em piridina (1 ml). Então, cloreto de pivaloíla (0,042 ml, 0,342 mmol, 7 equiv.) foi adicionado por gotejamento para render uma solução ama- rela fraca. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 30 minu- tos. Uma solução de iodo recentemente preparada (49,6 mg, 0,195 mmol, 4 equiv.) em piridina-água (20:1, 500 ul) foi adicionada para render uma solução límpida marrom-escura. A mistura foi agitada por minutos e diretamente purificada por cromatografia flash de fase reversa (coluna C-18 de 40 g, AC/MeCN a 0% por 3 minutos, então, ACN/Água a 0-70% por 15 minutos, método neutro) para produzir (28,3R)-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)etóxi)propanamido)-3-metilbutanamido)-5- ureiídopentanamido)benzil)óxi)(hidróxi)fosforil)óxi)-4-metil-2-propiona- midopentanoato de (R)-1-((38S,6S,9S,12S,18R,21S,22R)-21-acetami- do-18-benzil-22-isopropil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16-pentametil- 15-metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta -azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (B2). HRMS; MH+ = 1595,7200, 2,25 min. Exemplo 1-3: Síntese de (2S8,3R)-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il )etóxi )|Dropanamido)-3-metilbutanamido)-5- ureiídopentanamido)benzil)óxi)(hidróxi)fosforil)óxi)-4-metil-2-propiona- midopentanoato de (R)-1-((38S,6S,9S,12S,18R,21S,22R)-21-acetami- do-18-benzil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16,22-hexametil-15-metile- no-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta-azaci- clodocosan-6-il)-2-metilpropila (B3) o od, m NH | Oo EX, - Se o CO

HN A O un o |: O“rf* o 9 o o, NA o no Ss A

HN renão (B3)

[00462] O composto (B3) pode ser obtido usando procedimentos similares aos métodos descritos no Exemplo 1-1, exceto na etapa 1 em que o composto (A3) (do Exemplo 3-3) é usado no lugar do com- posto (A1). Exemplo 1-4: Síntese de (2S,3R)-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2,5-dioxo0-2,5- di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-3-metilbutanamido)-5- ureiídopentanamido)benzil)óxi)(hidróxi)fosforil)óxi)-4-metil-2- propionamidopentanoato de (R)-1-((3S,6S,9S,128S,18R,218S,22R)-21- acetamido-18-benzil-22-isopropil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16- pentametil-15-metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa- 4,7,10,13,16-penta-azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (B4) foi kh À. De * Neo o O HN,, NES no | “e o o o oo

RAÇÃO À Ha à H o tão (B4)

[00463] O composto (B4) foi obtido usando procedimentos similares aos métodos descritos no Exemplo 1-1, exceto na etapa 2 em que (S)- 2-((S8)-2-(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)oropanamido)-3- metilbutanamido)-N-(4-(hidroximetil)fenil)-5-ureidopentanamida (CASH 1949793-46-7) foi usado no lugar de (S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-diox0-2,5- di-hidro-1H-pirrol-1-il)etóxi)propanamido)-3-metilbutanamido)-N-(4- (hidroximetil)fenil)-5-ureíidopentanamida (CASH é 2055041-37-5). HRMS; MH+ = 1594,5400, 2,88 min.

Exemplo 1-5: Síntese de (2S8,3R)-2-acetamido-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3- (2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)oropanamido)-3-metilbutanamido)- 5-ureidopentanamido)benzil)óxi)(hidróxi)fosforil)óxi)-4-metilpentanoato de (R)-1-((38S,6S,98S,128,18R,218,22R)-21-acetamido-18-benzil-3-((R)- 1-metoxietil)-4,9,10,12,16,22-hexametil-15-metileno-2,5,8,11,14,17,20- heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta-azaciclodocosan-6-il)-2- metilpropila (B5) at tn, NH | O O Ta o) | os Ps

RAE HaNTTO (B5)

[00464] O composto (B5) pode ser obtido usando procedimentos similares aos métodos descritos no Exemplo 1-1, exceto na etapa 1 em que o composto (A2) (do Exemplo 3-2) foi usado no lugar do com- posto (A1), e na etapa 2 em que (S)-2-((S)-2-(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro- 1H-pirrol-1-il)propanamido)-3-metilbutanamido)-N-(4- (hidroximetil)fenil)-5S-ureidopentanamida (CAS+*: 1949793-46-7) é usado no lugar de (S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)etóxi)propanamido)-3-metilbutanamido)-N-(4-(hidroximetil)fenil)-5- ureídopentanamida (CAS* é 2055041-37-5). Exemplo 1-6: Síntese de (2S,3R)-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2,5-dioxo-2,5- di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-3-metilbutanamido)-5- ureidopentanamido)benzil)óxi)(hidróxi)fosforil)óxi)-4-metil-2- propionamidopentanoato de (R)-1-((3S,6S,9S,128S,18R,218S,22R)-21-

acetamido-18-benzil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16,22-hexametil-15- metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta- azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (B6) ve “1, NH | O O E o Xã no 1: a o o o o

EAR HaNÍTOo (B6)

[00465] O composto (B6) pode ser obtido usando procedimentos similares aos métodos descritos no Exemplo 1-1, exceto na etapa 1 em que o composto (A3) (do Exemplo 3-3) foi usado no lugar do com- posto (A1), e na etapa 2 em que (S)-2-((S)-2-(3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro- 1H-pirrol-1-il)propanamido)-3-metilbutanamido)-N-(4- (hidroximetil)fenil)-5S-ureidopentanamida (CAS+*: 1949793-46-7) é usado no lugar de (S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)etóxi)propanamido)-3-metilbutanamido)-N-(4-(hidroximetil)fenil)-5- ureiídopentanamida (CAS* é 2055041-37-5). Exemplo 1-7: Síntese de (2S8,3R)-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il )etóxi )|Dropanamido)-3-metilbutanamido)-5- ureidopentanamido)benzil)óxi)carbonil)Óxi)-4-metil-2- propionamidopentanoato de (R)-1-((3S,6S,9S,128S,18R,218S,22R)-21- acetamido-18-benzil-22-isopropil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16- pentametil-15-metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa- 4,7,10,13,16-penta-azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (B7)

SE Xe ECA mm E À DS mi Ao, mo o A, A DO ' Seda

MET AE ão A va Ih do vo SE f j 4 ” ho 9 0 gh

FA SO E E) 1 " RA, do VI - P º Ao

CAGE " 3 em

[00466] O composto (B7) pode ser obtido pela reação de clorofor- mato (1-3) com (S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)etóxi)propanamido)-3-metilbutanamido)-N-(4-(hidroximetil)fenil)-5- ureídopentanamida (CASH é 2055041-37-5). Cloroformato (1-3) pode ser obtido pela reação do Composto (A1) com fosgênio. Exemplo 1-8: Síntese de (2S8,3R)-2-acetamido-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3- (2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il )etóxi)Dropanamido)-3- metilbutanamido)-5-ureíidopentanamido)benzil)óxi)carbonil)Óxi)-4- metilpentanoato de (R)-1-((3S,6S,9S,128,18R,218,22R)-21- acetamido-18-benzil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16,22-hexametil-15- metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta- azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (B8)

o ; ed, “NH | Oo são “ A

RN O O O

LX 4" o | ÃO: o o O o o oo

CA ILEIDE o ro “ n

HAN tao (B8)

[00467] O composto (B8) pode ser obtido usando-se o método des- crito no Exemplo 1-7, exceto que o Composto (A2) é usado no lugar do Composto (A1). Exemplo 1-9: Síntese de (2S8,3R)-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il )etóxi )|Dropanamido)-3-metilbutanamido)-5- ureiídopentanamido)benzil)óxi)carbonil)Óxi)-4-metil-2- propionamidopentanoato de (R)-1-((3S,6S,9S,128S,18R,218S,22R)-21- acetamido-18-benzil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16,22-hexametil-15- metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta- azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (B9) 7 X. sh oo & À

AROS no Vê

NT — e o o no

GAALAIÇO d Ss uno (B9)

[00468] O composto (B9) pode ser obtido usando-se o método des- crito no Exemplo 1-7, exceto que o Composto (A3) é usado no lugar do Composto (A1).

Exemplo 1-10: Síntese de (2S,3R)-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)|oropanamido)-3-metilbutanamido)-5- ureiídopentanamido)benzil)óxi)carbonil)Óxi)-4-metil-2- propionamidopentanoato de (R)-1-((3S,6S,9S,128S,18R,218S,22R)-21- acetamido-18-benzil-22-isopropil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16- pentametil-15-metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa- 4,7,10,13,16-penta-azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (B10)

O EA

A A, RARE" ro (B10)

[00469] O composto (B10) pode ser obtido usando-se o método descrito no Exemplo 1-7, exceto que (S)-2-((S)-2-(3-(2,5-dioxo0-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)oropanamido)-3-metilbutanamido)-N-(4- (hidroximetil)fenil)-S-ureíidopentanamida (CASH 1949793-46-7) é usa- do no lugar de (S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)etóxi)propanamido)-3-metilbutanamido)-N-(4-(hidroximetil)fenil)-5- ureídopentanamida (CAS* é 2055041-37-5). Exemplo 1-11: Síntese de (2S8,3R)-2-acetamido-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3- (2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)oropanamido)-3-metilbutanamido)- 5-ureidopentanamido)benzil)óxi)carbonil)óxi)-4-metilpentanoato de (R)- 1-((38S8,6S,98,128,18R,218,22R)-21-acetamido-18-benzil-3-((R)-1- metoxietil)-4,9,10,12,16,22-hexametil-15-metileno-2,5,8,11,14,17,20- heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta-azaciclodocosan-6-il)-2- metilpropila (B11)

o ; od, fr, NH OO

EE ” O OO

RX nO |:

TS o o o No) isa

RAÇA , o ”

HN nao (B11)

[00470] O composto (B11) pode ser obtido usando-se o método descrito no Exemplo 1-10, exceto que o Composto (A2) é usado no lugar do Composto (A1). Exemplo 1-12: Síntese de (2S,3R)-3-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)|oropanamido)-3-metilbutanamido)-5- ureiídopentanamido)benzil)óxi)carbonil)Óxi)-4-metil-2- propionamidopentanoato de (R)-1-((3S,6S,9S,128S,18R,218S,22R)-21- acetamido-18-benzil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16,22-hexametil-15- metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta- azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (B12) x são “NH | Oo &

RN O OO

E HQ 1: N.

E AÁ, o Oo o “o

EA À 1 Hà SS F º "” nao (B12)

[00471] O composto (B12) pode ser obtido usando-se o método descrito no Exemplo 1-10, exceto que o Composto (A3) é usado no lugar do Composto (A1). Exemplo 2: Geração de Anticorpos Anti-PMEL17 Exemplo 2-1: Preparação de linhagens celulares que expressam PMEL17

[00472] —“Genes PMEL17 humanos, de cyno e de rato de comprimen- to total foram sintetizados com base nas sequências de aminoácidos dos bancos de dados GenBank ou Uniprot. Todos os fragmentos de DNA sintetizados foram clonados em vetores de expressão adequa- dos.

[00473] —Linhagens celulares estáveis de expressão de PMEL17 ge- neticamente modificadas foram geradas e cultivadas sob condições de seleção adequadas para produzir linhagens celulares estáveis de ex- pressão de PMEL 17. Exemplo 2-2: Seleção (panning) de célula inteira contra PMEL1I7

[00474] As bibliotecas fagomídicas são baseadas nos conceitos HuCAL PLATINUMO (Knappik et al., 2000) e Ylanthia (Tiller et al., 2013) e usam a tecnologia CysDisplayTM para exibir o Fab sobre a superfície do fago (Lohning, 2001).

[00475] Para cada seleção, cerca de 4x10'? anticorpos de fago Hu- CAL PLATINUMO ou cerca de 1x10* anticorpos de fago Ylanthia& foram bloqueados em PBS/FCS a 5%. Em paralelo, 0,5 - 1,0 x 107 cé- lulas-alvo que expressam antígeno PMEL17 e 0,5 - 1,0 x 107 células de adsorção sem expressão de antígeno PMEL17 por grupo de fagos foram ressuspensas em 1 ml de PBS/FCS a 5% para bloqueio em ge- lo. As células alvo bloqueadas foram centrifugadas, ressuspensas nas partículas de fago pré-bloqueadas e incubadas por 2 h a 4ºC em um rotador. Os complexos fago-célula foram lavados três vezes em PBS/FCS a 5%. A eluição de fago especificamente ligado de células- alvo foi realizada por eluição ácida por 10 min com glicina-HCI 0,1 M/NaCl 0,5 M, pH 2,2. Após a centrifugação, o sobrenadante (eluato)

foi neutralizado pela adição de Tris não-tamponado 2 M. Para remoção de ligação de fagos a moléculas da superfície celular em vez do antí- geno-alvo, a pós-adsorção foi realizada três vezes com 0,5 - 1,0 x 107 células de adsorção cada. O sobrenadante final foi usado para infec- ção de 14 ml de cultura de TG1 E. coli desenvolvida a uma OD600 de 0,6 - 0,8. A cultura foi incubada por 45 min em um banho de água a 37ºC para infecção por fagos. Os péletes bacterianos foram ressus- pensos em meio 2xYT, plaqueadas em placas de ágar LB/Cam e incu- bados o/h a 30ºC. As colônias foram raspadas das placas e usadas para resgate de fago e amplificação de fago. Os fagos amplificados foram usados para a próxima rodada de seleção. A segunda e a tercei- ra rodadas da seleção de célula inteira foram realizadas de acordo com o protocolo da primeira rodada. Exemplo 2-3: Subclonagem, expressão e triagem de fragmentos Fab

[00476] Para facilitar a expressão rápida de Fab solúvel, os insertos que codificam Fab do fago HUCAL PLATINUMGO selecionado foram subclonados de vetor de exibição pMORPHO3O no vetor de expressão PMORPHOx11 FH. A subclonagem foi realizada por digestão tripla por meio de EcoRl, Xbal e Bmtl. Após a transformação de E. coli TG1-F-, a expressão de clone único e a preparação de extratos periplasmáti- cos contendo fragmentos HUCALG-Fab foram realizadas como des- crito anteriormente (Rauchenberger et a/., 2003).

[00477] Os insertos que codificam Fab do fago Ylanthia€& selecio- nado foram subclonados a partir de vetor de exibição de pYPdis10 no vetor de expressão pYBex10 Fab FH. A subclonagem foi realizada por digestão tripla por meio de Xbal, EcoRI-HF e Pstl-HF. Após a transformação de E. coli TG1-F-, a expressão de clone único e a pre- paração de extratos periplasmáticos contendo fragmentos Ylanthia&- Fab foram realizadas como descrito anteriormente (Rauchenberger et al., 2003).

[00478] A expressão de fragmentos Fab codificados por PMORPHºx11 Fab FH e pYBex10 Fab FH em células TG1 F de E. coli foi realizada em culturas de frasco agitado usando 500 ml de meio 2xYT suplementado com glicose a 0,1% e 34 ug/ml de cloranfenicol. As culturas foram agitadas a 30ºC até a ODsoo atingir um valor de 0,5. A expressão de Fab foi induzida pela adição de IPTG (isopropil-R&-D- tiogalactopiranosídeo) a uma concentração final de 0,75 mM e cultivo adicional por 20 h a 30ºC. As células foram coletadas e rompidas usando lisozima. Fragmentos Fab marcados com Hiss (SEQ ID NO: 267) foram isolados por meio de IMAC (Bio-Rad, Alemanha) e eluídos usando imidazol. A troca de tampão para 1x PBS de Dulbecco (pH 7,2) foi realizada com o uso de colunas PD10 (GE Healthcare, Alemanha). As amostras foram esterilizadas por filtração (0,2 um). As concentra- ções de proteína foram determinadas por espectrofotometria de UV. À pureza das amostras foi analisada durante a desnaturação, com redu- ção de 15% de SDS-PAGE. A homogeneidade de preparações de Fab foi determinada no estado nativo por cromatografia de exclusão por tamanho (HP-SEC) com padrões de calibração.

[00479] Na triagem de FACS, os Fabs purificados foram titulados em uma variedade de linhagens celulares que expressam PMEL17 e que não expressam PMEL17 (para controle). As células foram coleta- das usando Accutase, ajustadas para — 4x10º células/ml em tampão FACS (PBS, FCS a 3% e Na-Azida a 0,02%) e mantidas em gelo para evitar internalização. 15 ul de suspensão de células/poço foram trans- feridos para placas de 384 poços de fundo em V (Greiner, Cat 781280) e incubados com 15 ul de Fab em concentrações diferentes (mais comumente de 200 a 3,5x10*nm) por 1 hora a 4ºC, com agita- ção suave. Após a incubação, as células foram lavadas três vezes com tampão FACS. Após cada etapa de lavagem, as células foram centrifugadas (250x9g, 4 min, 4ºC) e cuidadosamente ressuspensas. 15 ul de anticorpo de detecção conjugado a PE (IgG anti-humana de ca- bra conjugada a PE, específica para fragmento F(ab')2, 1:150 em tampão FACS; Jackson Immuno Research, %109-116-097) ou Alexa Fluor (IgG anti-humana de cabra conjugada a Alexa Fluor, específica para fragmento F(ab')2, 1:150 em tampão FACS; Jackson Immuno Research, *%109-606-097) foram adicionados e as amostras foram in- cubadas por 45 minutos a 1 hora em gelo no escuro, com agitação su- ave. Após 3 etapas de lavagem, as células foram ressuspensas em 30 ul de tampão FACS e as amostras foram medidas usando o dispositivo IntelliCyt HTFC.

[00480] Para verificar adicionalmente a especificidade dos anticor- pos identificados, o antígeno foi imunocapturado do lisado celular e usado como material de revestimento para triagens baseadas em ELI- SA. Células que expressam PMEL17 e não expressam PMEL17 (usa- das como controle negativo) foram centrifugadas (250g, 5 min) e res- suspensas em tampão de lise (Tampão de Lise MSD Tris, Meso Scale Discovery, R60TX-2) contendo inibidores de protease (Coquetel de Inibidor de Protease isento de EDTA Completo, Roche, 11 873 580 001) em 1x107 a 1x10º células/ml e incubadas por 30 min a 4ºC. O |i- sado foi centrifugado a 13000 rpm por 5 minutos para descartar os res- tos de células e o sobrenadante foi dividido em alíquotas e armazena- do a -80ºC. Os testes preliminares demonstraram que o lisado pode ser congelado e descongelado 3 vezes sem grande perda de sinal em ELISA.

[00481] Para realizar a triagem ELISA, IgGs anti-His foram revesti- das de um dia para o outro em uma placa de 384 poços maxisorb (R&D systems, MABO50, 10 pg/ml, 20 ul por poço). As placas foram bloqueadas com BSA a 3% e 20 ul de Fab purificado foram transferi- dos em diferentes concentrações (mais comumente de 400 a 0,2 nM) para cada poço por 1 hora. A placa foi lavada 3 vezes e 20 ul de

PMEL17 contendo lisado celular foram adicionados a uma concentra- ção de 2x105 células lisadas/poço por 1 hora. Após 3 lavagens adicio- nais, a presença de PMEL17 foi descrita usando a ferramenta anticor- po PMEL17 biotinilado (5 pg/ml, 20 ul por poço) e estreptavidina-ECL (Dianova, 13MSA37, 1:1500, 20 ul por poço). 20 ul por poço de tam- pão de leitura MSD 1X (Meso Scale Discovery, R92TC-2) foram adici- onados à placa e os sinais foram detectados por meio de MSD Sector Imager 6000. Exemplo 2-4: Conversão em IgG

[00482] A conversão de Fabs selecionados em IgGs foi realizada por um método baseado em PCR em formato de 96 poços. Os vetores de expressão bacteriana Fab DpMORPHOx11 FH e pYBex10 Fab FH foram convertidos no vetor de expressão de IgG de mamífero PMORPHGOA4 e pYMex10 (para clones HuUCAL e Ylanthia, respectiva- mente).

[00483] O DNA do plasmídeo píMORPHx11 FH foi primeiro amplifi- cado por PCR usando um iniciador biotinilado específico para a região líder phoA e um iniciador não biotinilado específico para o domínio CL bacteriano. O produto amplificado foi capturado em microesferas de estreptavidina, digerido com BsiWI ou Hpal (para clones VLkappa ou VLlambda, respectivamente), lavado e, então, digerido novamente com Mfel. Esse procedimento resultou na liberação da cadeia principal de vetor purificado no sobrenadante, agora desprovido da região de cadeia leve constante bacteriana (CL) e do líder de cadeia pesada phoA. Um cassete de expressão de plN de mamífero específico kappa ou lambda foi, então, clonado na cadeia principal de vetor portador do CL de mamífero, sítio poliA, promotor de CMV e sequência líder de cadeia pesada de mamífero. Em uma segunda etapa de PCR, o inser- to Fab recentemente gerado foi amplificado novamente usando um iniciador biotinilado específico para a região CH1 e um iniciador não biotinilado que se liga dentro do líder ompA bacteriano. O produto de PCR foi capturado em microesferas de estreptavidina, digerido com EcoRV, lavado e digerido com Blp!l resultando na liberação do inserto purificado no sobrenadante. Os insertos foram finalmente clonados no vetor aceitador Fab Cys para expressão em células de mamíferos.

[00484] O DNA do plasmídeo pYBex10 Fab FH foi primeiro ampli- ficado por PCR usando um iniciador biotinilado específico para a regi- ão líder phoA e um iniciador não biotinilado específico para o domínio CL bacteriano. O produto amplificado foi capturado em microesferas de estreptavidina, digerido com Nhel, lavado e, então, digerido nova- mente com Kpnl. Esse procedimento resultou na liberação da cadeia principal de vetor purificado no sobrenadante, agora desprovido da re- gião de cadeia leve constante bacteriana (CL) e do líder de cadeia pe- sada phoA. Um cassete de expressão de plN de mamífero específico kappa ou lambda foi, então, clonado na cadeia principal de vetor por- tador do CL de mamífero, sítio poliA, promotor de CMV e sequência líder de cadeia pesada de mamífero. Em uma segunda etapa de PCR, o inserto Fab recentemente gerado foi amplificado novamente usando um iniciador biotinilado específico para a região CH1 e um iniciador não biotinilado que se liga dentro do líder ompA bacteriano. O produto de PCR foi capturado em microesferas de estreptavidina, digerido com Xhol, lavado e digerido com Ndel resultando na liberação do inserto purificado no sobrenadante. Os insertos foram finalmente clonados no vetor aceitador Fab Cys para expressão em células de mamíferos.

[00485] Após a transformação de células de E. coli XL-1 blue, clo- nes únicos foram controlados por PCR de colônia e sequenciamento de toda a região de inserção. Exemplo 2-5: Triagem confirmatória de IgG humana

[00486] As preparações de DNA de colônias únicas foram prepara- das usando um kit de preparação de DNA adequado em combinação com o dispositivo BioRobot&8000. Concentrações de DNA individuais foram determinadas por espectrofotometria UV. Células eucarióticas HEK293 c18 (ATCC tCRL-10852) foram usadas em um sistema de expressão de 96 poços para a geração de sobrenadantes de cultura de células condicionadas contendo IgG de comprimento total. As célu- las eucarióticas HEK293 c18 foram inoculadas em uma placa de fundo plano de 96 poços a uma densidade de — 4x10º células/50 ul/poço no dia anterior e transfectadas com quantidades iguais de DNA de vetor de expressão de lg. Após incubação por 40-50 h a 37ºC e CO?2 a 6%, os sobrenadantes da cultura foram transferidos para uma placa de fundo em U de 96 poços e limpos por centrifugação. Os sobrenadan- tes de lg resultantes foram testados por um ELISA de captura anti-Fd para cálculo da concentração de lg em referência a padrões conheci- dos e armazenados a -20ºC para uso posterior em ensaios de especi- ficidade e/ou triagem funcional.

[00487] O DNA de clones de interesse foi submetido a sequencia- mento com iniciador CMV HC for (CTC TAG CGC CAC CAT GAA ACA (SEQ ID NO: 264)) para domínio VH e IgG const for (AGC CCA GCA ACA CCA AGG (SEQ ID NO: 265)) para domínio Fc seguido de sequenciamento de cadeia leve com iniciador promotor T7 (TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG (SEQ ID NO: 266)) para obter informações de sequência completa de IgG.

[00488] A triagem FACS foi realizada no formato de placa de 384 poços usando a plataforma de triagem HTFC da IntelliCyt. As células foram coletadas usando Accutase, ajustadas para — 4x106 células/ml em tampão FACS (PBS, FCS a 3% e Na-Azida a 0,02%) e mantidas em gelo para evitar internalização. 15 ul de suspensão de células/poço foram transferidos para placas de 384 poços de fundo em V (Greiner, Cattt 781280) e incubados com 15 ul de IgG contendo sobrenadante (ou anticorpos de controle purificados diluídos) por 1 hora a 4ºC, com agitação suave. Após a incubação, as células foram lavadas três ve- zes com tampão FACS. Após cada etapa de lavagem, as células fo- ram centrifugadas (250xg, 4 min, 4ºC) e cuidadosamente ressuspen- sas. 15 ul de anticorpo de detecção conjugado a PE (IgG anti-humana de cabra conjugada a PE, específica para fragmento F(ab')2, 1:150 em tampão FACS; Jackson Immuno Research, %109-116-097) foram adicionados e as amostras foram incubadas por 45 minutos a 1 hora em gelo no escuro, com agitação suave. Após 3 etapas de lavagem, as células foram ressuspensas em 30 ul de tampão FACS e as amos- tras foram medidas usando o dispositivo IntelliCyt HTFC. Exemplo 2-6: Produção de IgG humana e Fab Cys humano

[00489] Células eucarióticas HKB11 foram transfectadas com DNA de vetor de expressão pMORPHOA4 ou pYMex10 que codifica as ca- deias pesadas e leves de IgGs. O sobrenadantes de cultura celular foi coletado no dia 3 ou 7 após a transfecção. O sobrenadante da cultura celular foi submetido à cromatografia de afinidade de Proteína A pa- drão (MabSelect SURE, GE Healthcare) e Capture Select IgG-CH1 (BAC) para IgG humana e Fab Cys humano, respectivamente. Exceto onde indicado em contrário, a troca de tampão foi realizada e 1x PBS de Dulbcecco (pH 7,2, Invitrogen) e amostras foram filtradas (0,2 um de tamanho de poro). A pureza da IgG foi analisada sob condições desnaturantes, redutoras e não redutoras usando um Sistema Labchip (GXII, Perkin Elmer, EUA) ou em SDS-PAGE. As concentrações de proteínas foram determinadas por espectrofotometria UV e HP-SEC foi realizada para analisar as preparações de IgG no estado nativo. Exemplo 2-7: Produção de anticorpos G1 e G4 anti-PMEL17

[00490] Para a primeira rodada de seleção, cerca de 4x10'? fago HuCAL PLATINUM?º foram bloqueados com PBS/FBS a 5%. Em para- lelo, 1,0 - 1,0 x 107 células-alvo que expressam antígeno PMEL17 e 1,5 - 3,0 x 107 células de adsorção sem expressão de antígeno

PMEL17 por grupo de fagos foram ressuspensas em 1 ml de PBS/FCS a 5% para bloqueio em gelo.

Para pré-clear da ligação não específica, os fagos foram incubados com 0,5 x 107 células de adsorção sem ex- pressão de antígeno PMEL17 por grupo de fagos por 30 minutos em gelo.

Após a incubação, as células foram peletizadas por centrifugação e o sobrenadante foi adicionado a uma amostra fresca com 0,5 x 107 células de adsorção sem expressão de antígeno PMEL17. As mesmas condições de incubação foram aplicadas e a pré-absorção foi nova- mente aplicada a uma amostra fresca de 0,5 x 107 células de adsorção sem expressão de antígeno PMEL17 para um total de três rodadas de pré-absorção.

Após a pré-absorção final, o sobrenadante foi adiciona- do a 1,0 x 10'células alvo que expressam o antígeno PMEL17 e incu- bado em gelo por 2 horas com mistura ocasional.

Os complexos fago- célula foram lavados três vezes em PBS/FCS a 5%. A eluição de fago especificamente ligado de células-alvo foi realizada por eluição ácida por 10 minutos com glicina-HCI 0,1 M/NaCIl 0,5 M, pH 2,5. Após a cen- trifugação, o sobrenadante (eluato) foi neutralizado pela adição de Tris não tamponado 2 M e esse eluato foi usado para infectar 14 ml de cul- tura de E. coli TG1 F' cultivada a uma ODseoo de 0,6 - 0,8. A cultura foi incubada por 20 minutos a 37ºC e, então, mais 25 minutos a 37ºC com agitação a 200 rpm para infecção por fago.

Os péletes bacterianos fo- ram ressuspensos em meio 2xYT, plaqueadas em placas de ágar LB/Cloranfenicol e incubados de um dia para o outro a 30ºC.

As colô- nias foram raspadas das placas e usadas para resgate de fago e am- plificação de fago.

Os fagos amplificados foram usados para a próxima rodada de seleção.

A segunda e a terceira rodadas de seleção foram realizadas de modo similar, exceto que apenas cerca de 1x10? fago HuCAL foi usado para reduzir o fundo genético e aprimorar a eficácia de pré-clearing.

Após a rodada final de seleção, o DNA de plasmídeo foi preparado a partir de cada saída de fago e os insertos contendo

Fab foram clonados em um vetor de expressão bacteriana. Após a li- gação e transformação, as colônias individuais foram coletadas em 2XT/cloranfenicol e cultivadas. A expressão de Fab foi induzida pela adição de IPTG 0,25 mM em culturas cultivadas de um dia para o ou- tro em placas de microtitulação de 96 poços a 25ºC. Os péletes celula- res foram lisados com lisozima 0,1% em PBS e, então, bloqueados pela adição de BSA a uma concentração final de 1%. A coloração FACS foi realizada em células de expressão de PMEL17 e de controle. Exemplo 2-8: Afinidades aparentes de anticorpos anti-PMEL17

[00491] As IlgGs purificadas foram tituladas em uma variedade de linhagens celulares que expressam PMEL17 e que não expressam PMEL17 (para controle) para determinar os valores de EC50. As célu- las foram coletadas usando Accutase, ajustadas para — 4x106 célu- las/ml em tampão FACS (PBS, FCS a 3% e Na-Azida a 0,02%) e man- tidas em gelo para evitar internalização. 15 ul de suspensão de célu- las/poço foram transferidos para placas de 384 poços de fundo em V (Greiner, Cattt 781280) e incubados com 15 ul de IgGs em concentra- ções diferentes (mais comumente de 200 a 3,5x10-3 nM) por 1 hora a 4ºC, com agitação suave. Após a incubação, as células foram lavadas três vezes com tampão FACS. Após cada etapa de lavagem, as célu- las foram centrifugadas (250xg, 5 min, 4ºC) e cuidadosamente ressus- pensas. 15 ul de anticorpo de detecção conjugado a PE (IgG anti- humana de cabra conjugada a PE, específica para fragmento F(ab')2, 1:150 em tampão FACS; Jackson Immuno Research, f109-116-097) ou Alexa Fluor (IgG anti-humana de cabra conjugada a Alexa Fluor, específica para fragmento F(ab')2, 1:150 em tampão FACS; Jackson Immuno Research, f109-606-097) foram adicionados e as amostras foram incubadas por 45 minutos a 1 hora em gelo no escuro, com agi- tação suave. Após 3 etapas de lavagem, as células foram ressuspen- sas em 30 ul de tampão FACS e as amostras foram medidas usando o dispositivo IntelliCyt HTFC.

Os valores EC50 foram calculados usando o software GraphPad Prism.

A linhagem celular de melanoma G-361 expressa PMEL17 humano em um nível mais baixo em comparação com a linhagem celular de superexpressão PMEL17 HKB11-humano e, portanto, permite uma classificação mais precisa dos clones depen- dendo de sua afinidade aparente em células.

Como ilustrado na Tabe- la 3, foi obtida uma variedade de EC50 que está na faixa de -200 pM a —-70 nM.

Tabela 3. Afinidades aparentes (FACS EC50 (nM)) e reatividade cruzada de anticorpos anti-PMEL17. 2 o Ti [ES mm een ane G-361 (PE) (camundongo) | UACC-62 (PE) | da (com base em ab de detec- Fluor) (Alexa Fluor) (Alexa Fluor) (Alexa Fluor) ção de C14)

RR RR E BR geo mam

RR E E ER E A ego Rm

RR E E E A ego Rm

RR Ti E Ta Tg ego Rm

RR TR OO RR ego Rm

RR E RR E Te ego Tr RE RO E E O geo RR RR TR RR a ego RR RR E ER E a Ter ego e RR E A TR ego Tm PER E E RR ego Ti

RR EB a ra e e

Exemplo 2-9: Reatividade cruzada de anticorpos anti-PMEL17

[00492] A especificidade cruzada das I|gGs foi avaliada na resposta FACS em G-361 (melanoma humano), HKB11-cyno-PMEL 17, HKB11- rato PMEL17 e B16-F10 (melanoma que expressa PMEL17 de ca- mundongo) (Tabela 3). O teste em G-361 foi realizado usando um an- ticorpo de detecção marcado para PE. Em contrapartida, um anticorpo de detecção marcado com Alexa-Fluor teve que ser usado para testar os candidatos nas outras linhagens celulares para alcançar sinais de- tectáveis.

[00493] As lgGs foram classificadas em vários grupos de epítopos de acordo com seus perfis de especificidade cruzada. Os vários perfis de reatividade cruzada das IgGs, no entanto, sugerem que seu alvo é de pelo menos 4 epítopos (humano/cyno/rato/camundongo, huma- no/cyno/rato, humano/cyno/camundongo e humano/cyno). Exemplo 2-10: Ensaios ADC

[00494] As lgGs foram testadas em resposta à dose quanto à sua capacidade de internalizar e induzir o extermínio de várias células que expressam PMEL17 em ambos os ensaios de "piggyback" com ADC e após conjugação direta.

[00495] Para o ensaio de "piggyback" com ADC, o composto Fab- ZAP (acoplado a anti-hu-mAb-saporina de cabra; ATS Biotechnology, Cat t 1T-51) foi usado que se liga especificamente a Fc humano e é acoplado a um elemento de citotoxina, a saporina. As células foram coletadas usando Accutase e ajustadas para 5x10º células/ml. 50 ul da suspensão de células foram transferidos por poço para uma placa branca de fundo plano e transparente de 96 poços (Corning, 3610) e incubados desmarcar a 37ºC, CO2 a 5%. No dia seguinte, os candida- tos a anticorpos foram incubados em concentrações diferentes (mais comumente de 44 a 7 x 10º nM) com o composto Fab-ZAP a 8 nM por minutos a 37ºC. 50 ul por poço dos complexos IgG — Fab-ZAP fo-

ram, então, adicionados às células-alvo. Para controles, poços apenas com células, células apenas incubadas com IgGs candidatos (= 100% de controle de viabilidade) e células apenas incubadas com Fab-ZAP (para verificar o extermínio inespecífico do reagente secundário) foram preparadas. A concentração final de IgGs foi de 22 a 3,5 x 10º nM e Fab-ZAP 4 nM. As placas foram incubadas por 72 h a 37ºC e CO2 a 5%. A quantidade de células viáveis foi avaliada usando CellTiter-Glo (PromegattG7571) e a luminescência detectada com Tecan Infinite

500. A viabilidade foi, então, normalizada para as células + controle apenas de IgG.

[00496] Quase todas as IgGs podem exterminar com eficiência o melanoma G-361 (> 80% de extermínio máximo) e mostraram exter- mínio limitado nas células 293T que não expressam PMEL17 (<30% de extermínio máximo). O extermínio de G-361 foi também obtido com uma faixa de EC50s que podem estar relacionadas à afinidade ou ao epítopo. A especificidade cruzada poderia também ser confirmada pa- ra a maioria das IgGs reativas a ser humano humano/cyno/rato/ ca- mundongo, ser humano/cyno/rato e ser humano/cyno/camundongo, ou seja, IgGs específicas para PMEL17 de camundongo podem também exterminar B16-F10 (melanoma de camundongo). Exemplo 2-11: Modificação genética de anticorpos Anti-PMEL17

[00497] Em geral, todos os processos de modificação genética, fo- ram realizados usando estratégias baseadas em PCR. Os processos de modificação genética envolveram os seguintes aspectos: Linhagem Germinativa, Remoção de sítios PTM, modificação genética de pl e otimização de códon. Após a síntese e montagem por PCR de exten- são de sobreposição, os fragmentos VH e VL novamente genetica- mente modificados foram subclonados nas cadeias principais de vetor adequadas para expressões de IgG subsequentes.

Exemplo 3: Síntese de Compostos A1-A3 Exemplo 3-1: Processo de isolamento de (2S,3R)-3-hidróxi-4-metil-2- propionamidopentanoato de (R)-1-((3S,6S,9S,128S,18R,218S,22R)-21- acetamido-18-benzil-22-isopropil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16-pen- tametil-15-metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13, 16-penta-azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (A1) de folhas secas de Ardisia crenata Ps e, m NH | Qo W ), Ts - DE o .W. H O 1: o. Ho (A1)

[00498] O Composto A1 foi isolado com base em métodos descritos na Publicação de patente japonesa nº JP62283999. Etapa 1: Extração: kg de folhas secas de Ardisia crenata foram moídas em pó fino e extraídas com 500 | de metanol. Após a filtração, o extrato foi evapo- rado até secar. O resíduo foi dissolvido em 100 | de acetato de etila e extraído cinco vezes com 100 | de água deionizada (cloreto de sódio foi adicionado para melhorar a separação de fases. A camada orgâni- ca foi evaporada até secar. O resíduo foi dissolvido em 50 | de acetoni- trila/água (9/1) e extraído com 50 | de heptano. A camada de acetoni- trila/água foi evaporada até que restasse apenas água. Este foi, então, extraído com 50 | de acetato de etila. A camada de acetato de etila foi evaporada até secar rendendo 109 g de extrato cru.

[00499] Etapa 2: Desengorduramento: O extrato cru foi dissolvido em 25 | de acetonitrila/água (9/1) e extraído três vezes com 25 | de heptano. A camada de acetonitrila/água foi evaporada até que restas-

se apenas água. Este foi, então, extraído com 25 | de acetato de etila. A camada de acetato de etila foi evaporada até secar rendendo 40 g de extrato cru.

[00500] Etapa 3: Cromatografia flash: O extrato cru foi dissolvido em acetona/metanol (1/1), adsorvido em 100 g de Isolute (terra diato- mácea) e evaporado até secar. A cromatografia flash em gel de sílica com um sistema de solvente ternário com cicloexano (eluente A), ace- tato de etila (eluente B) e metanol (eluente C) foi realizada (detalhes experimentais: coluna: RediSep Rf 120 g; fluidez: 85 mIl/min; gradiente: O min: 75 % A, 25 % B, 0 % C; 3 min: 75 % A, 25 % B, 0 % C; 10 min: 0 % A, 100 % B, 0 % C; 17,5 min: 0% A, 90% B 10 % C; 25 min: 0 % A, 50 % B, 50 % C; 30 min: 0 % A, 50 % B, 50 % C; os segmentos di- ferentes do gradiente são conectados por mudanças lineares ao longo do tempo). Quatro séries com 10 g de extrato cada foram realizadas. O fracionamento baseado no tempo foi aplicado e as frações coletadas foram analisadas por UPLC-UV-MS quanto à presença do Composto (A1). As frações contendo o Composto (A1) foram agrupadas e evapo- radas até secar resultando em uma fração de 25 g.

[00501] Etapa4: Cromatografia de exclusão por tamanho (SEC): À fração de 25 g foi dissolvida em 400 ml de metanol e adicionalmente fracionada por SEC em uma coluna (comprimento de 25 cm, diâmetro de 12,5 cm) embalada com Sephadex LH20 e metanol como eluente. As frações de 200 ml cada foram coletadas e as frações foram anali- sadas por UPLC-UV-MS quanto à presença do Composto (A1). As fra- ções contendo o Composto (A1) foram agrupadas e evaporadas até secar resultando em uma fração enriquecida de 6,2 g.

[00502] Etapa 5:1aHPLC preparativa: A fração enriquecida de 6,2 g foi dissolvida em 12 ml de metanol/sulfóxido de dimetila (1/1) e adici- onalmente fracionada por HPLC preparativa (detalhes experimentais: coluna: Sunfire C18, 30 x 150 mm, tamanho de partícula de 5 um; elu-

ente A: água deionizada com ácido fórmico a 0,1%, eluente B: metanol com ácido fórmico a 0,1%; fluidez de 60 ml/min; gradiente: O min: 35 % A, 65 % B; 0,5 min: 35 % A, 65 % B; 17 min: 15 % A, 85 % B; 15,0 min: O % A, 100 % B; 19 min: 0 % A, 100 % B; 19,1 min: 35 % A, 65 % B; 20 min: 35 % A, 65 % B; os segmentos diferentes do gradiente são conectados por mudanças lineares ao longo do tempo). O fraciona- mento foi ativado por espectrometria de massa. 15 séries com 410 mg de fração enriquecida, cada uma, foram realizadas. As frações con- tendo o Composto (A1) foram agrupadas e evaporadas até secar re- sultando em uma fração semipura de 488 mg com um teor estimado de 70% do Composto (A1).

[00503] Etapa 6: 2º HPLC preparativa: A fração semipura de 488 mg foi dissolvida em 4 ml de metanol e adicionalmente fracionada por HPLC preparativa (detalhes experimentais: coluna: X-Select PFP 19 x 250mm, tamanho de partícula de 5 um; eluente A: água deionizada com ácido fórmico a 0,1%, eluente B: acetonitrila com ácido fórmico a 0,1%; fluidez de 30 ml/min; gradiente: O min: 45 % A, 55 % B; 0,5 min: 45 % A, 55 % B; 24 min: 25% A, 75 % B; 24,0 min: 0 % A, 100 % B; 27,5 min: O % A, 100 % B; 27,6 min: 45 % A, 55 % B; 30,5 min: 45 % A, 55 % B; os segmentos diferentes do gradiente são conectados por mudanças lineares ao longo do tempo). O fracionamento foi ativado por espectrometria de massa. Cinco séries com 98 mg de fração se- mipura, cada uma, foram realizadas. As frações contendo o Composto (A1) foram agrupadas e evaporadas até secar resultando em 287 mg do Composto (A1) com uma pureza > 95 %.

[00504] — Composto (A1): Tempo de retenção: 4,73 min, fórmula mo- lecular [M+H]+: C49H76N7015+, massa monoisotópica calculada [M+H]+: 1002,5394 Da, massa observada: 1002,5391 Da. Detalhes experimentais: coluna: ACQUITY UPLC BEH C18, 2,1 x 100mm, ta- manho de partícula de 1,7 um; eluente A: água deionizada com ácido fórmico a 0,1%, eluente B: acetonitrila com ácido fórmico a 0,1%; flui- dez de 0,9 ml/min; gradiente: O min: A a 95%, Ba 5% a 6,A min: Aa O %, B a 100 %. 'H RMN (600 MHz, Acetonitrila-d3) 5 8,36 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 7,38 — 7,22 (m, 6H), 6,94 (d, J= 4,4 Hz, 1H), 6,77 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 5,39 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 5,34 (dd, J= 8,8, 3,8 Hz, 1H), 5,31 — 5,25 (m, 2H), 5,21 — 5,15 (m, 2H), 5,11 (dd, J= 9,9, 1,9 Hz, 1H), 4,90 — 4,84 (m, 1H), 4,70 (q, J = 6,9 Hz, 1H), 4,39 (dd, J = 7,7, 21 Hz, 1H), 4,10 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 3,82 — 3,74 (m, 1H), 3,60 (ddd, J = 9,8, 4,4, 2,0 Hz, 1H), 3,38 (s, 3H), 3,23 (s, 3H), 3,16 — 3,11 (m, 1H), 2,94 — 2,85 (m, 1H), 2,84 (s, 3H), 2,66 (s, 3H), 2,55 — 2,43 (m, 2H), 2,16 (s, 3H), 1,96 — 1,90 (m, 1H), 1,89 — 1,74 (m, 2H), 1,37 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,32 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 1,19 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 1,17 (d, J=6,0 Hz, 3H), 1,12 (d, J = 7,7 Hz, 3H), 1,06 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,96 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,88 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,85 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 0,77 (d, J = 6,5 Hz, 3H). Exemplo 3-2: Processo de geração de (2S,3R)-2-acetamido-3-hidróxi- 4-metilpentanoato de (R)-1-((38,6S,9S,128,18R,218S,22R)-21- acetamido-18-benzil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16,22-hexametil-15- metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta- azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (A2) 7 Sho ” ee

NRO , O Ox Li: %o (A2) O Composto (A2) foi obtido com o uso dos métodos descritos em [M. Taniguchi et al. Tetrahedron 59 (2003) 4533-4538]. O isolamento foi realizado com o uso dos métodos descritos para o Composto (A1) no Exemplo 3-1. O material foi, então, caracterizado por experimentos UPLC-UV-HRMS, 1D-NMR e 2D-NMR. Composto (A2): Tempo de re- tenção: 4,20 min, fórmula molecular [M+H]+: C46H70N7015+, massa monoisotópica calculada [M+H]+: 960,4924 Da, massa observada: 960,4914 Da. *H RMN (600 MHz, 1,4-Dioxano-ds) 5 8,36 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,37 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 7,31 — 7,21 (m, 4H), 7,21 — 7,16 (m, 2H), 6,79 — 6,72 (m, 2H), 5,40 — 5,37 (m, 1H), 5,36 — 5,33 (m, 1H), 5,30 — 5,28 (m, 2H), 5,20 (dd, J = 9,0, 3,7 Hz, 1H), 5,413 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 5,04 (dd, J = 9,9, 1,4 Hz, 1H), 4,89 — 4,82 (m, 1H), 4,73 (q, J= 6,9 Hz, 1H), 4,39 (dd, J = 8,0, 2,0 Hz, 1H), 4,04 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 3,80 — 3,73 (m, 1H), 3,65 (ddd, J = 9,8, 4,3, 1,9 Hz, 1H), 3,37 (s, 3H), 3,21 (s, 3H), 3,11 (dd, J = 14,7, 3,7 Hz, 1H), 2,89 (dd, J = 14,7, 8,9 Hz, 1H), 2,84 (s, 3H), 2,62 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,12 (s, 3H), 1,99 — 1,90 (m, 1H), 1,75 — 1,69 (m, 1H), 1,35 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,30 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 1,18 — 1,14 (m, 6H), 1,11 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 1,04 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,86 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,78 (d, J = 6,6 Hz, 4H). Exemplo 3-3: Processo de geração de (2S,3R)-3-hidróxi-4-metil-2- propionamidopentanoato de (R)-1-((3S,6S,9S,128S,18R,218S,22R)-21- acetamido-18-benzil-3-((R)-1-metoxietil)-4,9,10,12,16,22-hexametil-15- metileno-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,19-dioxa-4,7,10,13,16-penta- azaciclodocosan-6-il)-2-metilpropila (A3) Ps kh ” Ts - + o CO H Oo |

E Ho (A3)

O Composto (A3) foi obtido com o uso dos métodos descritos em [M. Taniguchi et al. Tetrahedron 59 (2003) 4533-4538]. O isolamento foi realizado com o uso dos métodos descritos para o Composto (A1) no Exemplo 3-1. O material foi, então, caracterizado por experimentos de UPLC-UV-HRMS, RMN 1D e RMN 2D. Composto (A3): Tempo de re- tenção: 4,42 min, fórmula molecular [M+H]+: C47H72N7015+, massa monoisotópica calculada [M+H]+: 974,5081 Da, massa observada: 974,5098 Da. *H RMN (600 MHz, 1,4-Dioxano-ds) 5 8,37 (d, J= 9,1 Hz, 1H), 7,38 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 7,31 — 7,23 (m, 4H), 7,22 — 7,16 (m, 1H), 7,12 (d, J= 7,7 Hz, 1H), 6,78 — 6,72 (m, 2H), 5,41 — 5,33 (m, 2H), 5,32 — 5,26 (m, 2H), 5,20 (dd, J = 8,8, 3,7 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 5,04 (dd, J = 9,9, 1,7 Hz, 1H), 4,89 — 4,81 (m, 1H), 4,72 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 4,40 (dd, J = 7,8, 2,1 Hz, 1H), 4,04 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 3,81 — 3,73 (m, 1H), 3,68 — 3,64 (m, 1H), 3,38 (s, 3H), 3,21 (s, 3H), 3,11 (dd, J = 14,6, 3,7 Hz, 1H), 2,89 (dd, J = 14,7, 8,9 Hz, 1H), 2,83 (s, 3H), 2,62 (s, 3H), 2,51 — 2,41 (m, 2H), 2,14 (s, 3H), 1,99 — 1,89 (m, 1H), 1,78 — 1,68 (m, 1H), 1,34 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 1,30 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 1,18 — 1,14 (m, 6H), 1,13 — 1,08 (m, 6H), 1,04 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,86 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,78 (d, J = 6,6 Hz, 3H).

Exemplo 4: Processo para a produção de conjugados de anticor- po anti-PMEL17 e fármaco

[00505] O anticorpo foi incubado com resina de Proteína A RMP (GE) a uma razão de 10 mg de Ab para 1 ml de resina em PBS por 15 minutos com mistura em uma coluna descartável adequadamente di- mensionada. HCI de cisteína foi adicionado a uma concentração final de 20 mM e incubada com agitação por 30 min à temperatura ambien- te para permitir que as cisteínas reativas sejam desbloqueadas. A re- sina foi rapidamente lavada com 50 volumes de coluna PBS em uma tubulação de vácuo. A resina foi, então, ressuspensa em um volume igual de PBS contendo CuCl2 250 nM. A reformação dos dissulfetos intercadeias de anticorpos foi monitorada tomando pontos de tempo. Em cada ponto de tempo, 25 ul de pasta fluida de resina foram removidos, 1 ul de 20 mM de Composto (B1) ou Composto (B2) foi adicionado, e o tu- bo sacudido várias vezes. A resina foi centrifugada, o sobrenadante re- movido e, então, eluída com 50 ul de tampão de eluição de Anticorpo (Thermo). A resina foi peletizada e o sobrenadante analisado por croma- tografia de fase reversa usando uma coluna Agilent PLRP-S 4000A 5um, 4,6x50 mm (Tampão A é água, TFA a 0,1%, Tampão B Acetonitrila, TEA a 0,1%, coluna mantida a 80 C, Fluidez 1,5 ml/min).

[00506] Uma vez constatado que o anticorpo reformou suas liga- ções dissulfeto intercadeias, a resina foi lavada com 10 volumes de coluna de PBS e a resina foi ressuspensa em um volume igual de PBS e 8 equivalentes de carga útil de ligante (20 mM) em DMSO foram adi- cionados e, então, incubados à temperatura ambiente por 2 horas. À resina foi, então, lavada com 50 volumes de coluna PBS. O ADC foi eluído da resina de proteína A com tampão de eluição de Anticorpo e neutralizado com 1/10 do volume de Tris 1 M pH 9,0. O ADC foi então trocado por tampão em PBS ou outro tampão adequado e cromatogra- fia de exclusão por tamanho preparativa para remover agregados foi realizada (S200 Increase; GE), se necessário. As seguintes análises foram realizadas - SEC analítica para determinar a porcentagem de monômero, espectroscopia de massa para determinar DAR, teste LAL para determinar a carga de endotoxina e a concentração de proteína foi determinada por A280 utilizando o coeficiente de extinção e o peso molecular do anticorpo. Exemplo 5: Atividade de melanoma anti-uveal in vitro de Inibido- res de GNAQ/11, Composto (A1) e Composto (A2)

[00507] Células de melanoma uveal e MIAPACA de adenocarcino- ma ductal pancreático 92.1 foram inoculadas em baixa densidade celu- lar em placas de 96 poços e tratadas com concentrações crescentes de Composto (A1) ou Composto (A2) como indicado. Após o tratamen- to com fármaco por 96 ou 120 horas, a viabilidade e proliferação celu- lar foram determinadas usando um ensaio de viabilidade baseado em resazurina. Brevemente, as células foram incubadas com uma solução à base de resazurina e a mudança de cor foi detectada por absorbân- cia com um espectrofotômetro e usada como uma leitura da viabilida- de celular. Dados apresentados como média de 3 réplicas indepen- dentes e relativos às células tratadas com PBS (controle). A Tabela 4 mostra a inibição do crescimento a 50% (Glso) de Composto (A2) e Composto (A1). O Composto (A2) e o Composto (A1) exibiram ativida- de anti-UM dependente de alvo potente (Figura 1). Tabela 4. Atividade inibitória de crescimento de Composto (A1) e Composto (A2) em células UM Linhagem Mutação Composto (A1) Composto (A2) o a ema Jam Exemplo 6: O Composto (A1) e o Composto (A2) induziram apop- tose em células de melanoma uveal

[00508] “Células 92.1e MIAPACA foram inoculadas em placas de 96 poços (5000 células por poço) e tratadas com concentrações crescen- tes do Composto (A1), Composto (A2), e uma dose fixa de Estauros- porina (100 nM, controle positivo) como indicado. Após o tratamento com fármaco para 96, as células foram submetidas à citometria de fluxo ativa- da por fluorescência usando um anticorpo de Anexina V conjugado a um corante fluorescente. Dados apresentados como média de 3 réplicas in- dependentes. O Composto (A2) e o Composto (A1) induziram apoptose em células UM de maneira dependente de GNAQ/11 (Figura 2). Exemplo 7: Análise de inibição de GNAQ/11 por Composto (A1) e Composto (A2) em células de melanoma uveal

[00509] — Melanoma uveal 92.1 foi tratado com concentrações cres- centes de Composto (A1) ou Composto (A2) como indicado. Após o tratamento com fármaco de um dia para o outro, as células foram pro- cessadas para determinação de níveis de IP1 usando TR-FRET (trans- ferência de energia de ressonância fluorescente resolvida no tempo) ou níveis de proteína por western-blotting. A Figura 3A mostra níveis de IP1 (nM) em células 92.1 tratadas com DMSO (controle), Composto (A2) ou Composto (A1). A Figura 3B mostra a correlação entre os ní- veis de IP1 e a proliferação relativa nas células 92.1 tratadas com Composto (A1). A Figura 3C mostra immunoblots de células 92.1 tra- tadas com o Composto (A1) e Composto (A2) para determinar o efeito sobre a sinalização ERK. Exemplo 8: Estabilidade metabólica e propriedades PK do Com- posto (A1)

[00510] A estabilidade plasmática do Composto (A1) foi investigada no plasma de camundongo, rato, maco e humano e comparada com o tampão. Tanto o desaparecimento do Composto (A1) (Figura 4A) co- mo o aparecimento da forma de anel aberto do Composto (A1) que seo A,

LAO tem a estrutura do Composto (A4) e , Composto (A6)

S AO eh ea mta | o " Ss a o ou Composto (A8) —“º , (Figura 4B) foram monitorados durante 24h. A transformação parece ser um pouco mais rápida no plasma humano quando comparada com as outras es- pécies. Com exceção do rato, a adição da % de Composto (A1) res- tante e a % de Composto (A8) formado mostra estequiometria ao lon- go de 24h, indicando que nenhuma outra transformação parece exer- cer uma função significativa (Figura 4C).

[00511] A PK do Composto (A1l) após a dosagem intravenosa em camundongo foi caracterizada por uma depuração muita alta e volume moderado a alto de distribuição. Um aumento ligeiramente despropor- cional de exposição com a dose foi observado na faixa de 0,2-0,8 mg/kg (Figura 4D). A Tabela 5 resumindo todos os valores PK é mos- trada abaixo. Tabela 5. Propriedades PK do Composto (A1) esse — po BR pao be EFE e e e Exemplo 9: Estabilidade metabólica e propriedades PK do Com- posto (A2)

[00512] A estabilidade in vitro do Composto (A2) foi testada no plasma e sangue de espécies diferentes (Figura 5A). O Composto (A2) mostrou estabilidade química satisfatória em três sistemas diferentes (Figura 5B). A PK do Composto (A2) em camundongos balb/c fêmeas mostrou alta depuração e uma meia-vida de eliminação curta (Figura

5C). A Tabela 6 resume alguns valores PK. O Composto (A2) mostrou alta depuração intrínseca em microssomas de fígado de camundongo, rato e humano, porém baixa depuração em hepatócitos, provavelmen- te devido à permeabilidade da membrana limitada (Tabela 7). As incu- bações do Composto (A2) na fração S9 hepática e no plasma mostra- ram meias-vidas similares. O Composto (A2) e o Composto (A1) eram estáveis em tampão a pH 5,6 e em lisossomas ao longo de 4h (Figura 5D). Tabela 6. Propriedades PK do Composto (A2) em camundongos balb/c fêmeas (1 mg/kg iv) CL (ml:min-kg 175 + 29 ti2 (h) (0,4 + 0,01 AUC i.v. d.n. (nM-h) 101 +16 Tabela 7. Estabilidade de Composto (A2) Co [eres ee] Microssomas hepáticos | 107 33 44 (ul/min/kg) Hepatócitos (ul/min/10º células) co 8 je S9 hepática (+/- NADPH) t1/2 (h) | 1,9/>2 1,9/>2 Exemplo 10: Atividade de melanoma anti-uveal in vitro de ADCs anti-PMEL17-(B1)

[00513] Controle parental e não alvejado (NT) - ou células 92.1 transduzidas por PMEL17-shRNA foram inoculadas em baixa densida- de celular em placas de 96 poços e tratadas com concentrações cres- centes de 3207-(B1) (controle de isótipo), G4-(B1), e G1-(B1) na pre- sença ou ausência de doxiciclina como indicado. Após o tratamento com fármaco por 96 ou 120 horas, a viabilidade e proliferação celular foram determinadas usando um ensaio de viabilidade baseado em re- sazurina. Brevemente, as células foram incubadas com uma solução à base de resazurina e a mudança de cor foi detectada por absorbância com um espectrofotômetro e usada como uma leitura da viabilidade celular. Dados apresentados como média de 3 réplicas independentes e relativos às células tratadas com PBS (controle) (Figura 6). ADCs anti-PMEL17-(B1) inibem a proliferação de células de melanoma uveal de maneira dependente de PMEL17 e de dose. Exemplo 11: ADCs anti-PMEL17-(B1) induzem apoptose em célu- las de melanoma uveal

[00514] Células 92.1 foram inoculadas em placas de 96 poços (5000 células por poço) e tratadas com concentrações crescentes do Composto (A1), 3207-(B1) (Controle de isótipo), G4-(B1) e G1-(B1) como indicado. Após o tratamento com fármaco para 96, as células foram submetidas à citometria de fluxo ativada por fluorescência usan- do um anticorpo de Anexina V conjugado a um corante fluorescente. Dados apresentados como média de 3 réplicas independentes. Tanto G4-(B1) como G1-(B1) induziram apoptose em células 92.1 de manei- ra dose-dependente (Figura 7). Exemplo 12: Atividade de melanoma anti-uveal in vitro de ADCs anti-PMEL17-(B2) e mAbs anti-PMEL17

[00515] Células de melanoma uveal 92.1 foram inoculadas em bai- xa densidade celular em placas de 96 poços e tratadas com concen- trações crescentes de 3207-(B2) (controle de isótipo), G4-(B2), e G1- (B2) e mAbs anti-PMEL17-B1 e G4, como indicado. Após o tratamento com fármaco por 96 ou 120 horas, a viabilidade e proliferação celular foram determinadas usando um ensaio de viabilidade baseado em re- sazurina. Dados apresentados como média de 3 réplicas independen- tes e relativos às células tratadas com PBS (controle) (Figura 8). ADCs anti-PMEL17-(B2) e mAbs anti-PMEL17 exibem efeito antiproliferativo mínimo em células de melanoma uveal. Exemplo 13: Análise de Inibição de GNAQ/11 por ADCs anti- PMEL17-(B1) e anti-PMEL17-(B2) em células de melanoma uveal

[00516] Melanoma uveal 92.1 foi tratado com DMSO, Composto (A1) (8 nM) e concentrações crescentes de Isótipo-(B1), ADCs anti- PMEL17- (B1) e anti-PMEL17-(B2), como indicado. Após o tratamento com fármaco por 2 dias, as células foram processadas para determi- nação de níveis de IP1 usando TR-FRET (transferência de energia de ressonância fluorescente resolvida no tempo). Os níveis de IP1 (nM) são apresentados como média de 3 réplicas independentes. Como in- dicado por níveis reduzidos de IP1, tanto G1-(B1) como G1-(B2) ini- bem GNAQ mutante e GNA11 de maneira dose-dependente (Figura 9). Exemplo 14: Análise de ligação de anticorpos anti-PMEL17 a pla- quetas intactas e células de melanoma uveal

[00517] A linhagem celular de melanoma uveal 92.1 e as plaquetas isoladas de Plasma Rico em Plaquetas Humanas (PRP de 3 doadores humanos) foram submetidas à citometria de fluxo ativada por fluores- cência usando anticorpos anti-PMEL17 G1 (linha preta) e G4 (linha cinza), e anticorpo secundário de IgG anti-humano conjugado a um corante fluorescente, ou apenas o anticorpo secundário conjugado (li- nha cinza claro) (Figura 10). Ao contrário de células de melanoma uveal 92.1, as plaquetas humanas não apresentam expressão de PMEL17 na superfície celular. Exemplo 15: Impacto do Composto (A1) e ADCs anti-PMEL17-(B1) sobre a agregação de plaquetas humanas

[00518] O Plasma Rico em Plaquetas Humanas (PRP) foi incubado com ADC 17A9-(B1), um Ab anti-PMEL conjugado a B1,ou Composto (A1) (0,1, 1, e 150 nM) por 4, 16 ou 24h. A agregação de plaquetas foi, então, medida após tratamento com o Peptídeo 6 de Ativação do Re-

ceptor de Trombina (TRAP6) a 32 uM. Enquanto o Composto (A1) in- duziu a agregação de plaquetas, o anti-PMEL17- (B1) não induziu a agregação de plaquetas em até 24 horas (Figura 11). Exemplo 16: ADCs anti-PMEL17-(B1) inibem o crescimento de tu- mor em modelo de camundongo

[00519] — Camundongos nus fêmeas com xenoenxertos subcutâneos de 92.1-luciferase foram tratados com uma única injeção i.v. de 3207- (B1), G1- (B1) ou veículo nas doses indicadas. O tratamento (injeção i.v. em dose única) foi realizado 17 dias após a inoculação do tumor. Os valores são média + DPM; tamanho da amostra, (n=5-12 camun- dongos por grupo). Os volumes de tumor inicial no dia O foi de aproxi- madamente 200-250 mm?. G1-(B1) inibiu o crescimento de tumor de maneira dose-dependente (Figura 12A).

[00520] A mudança de peso corporal de camundongos nus fêmeas naive após o tratamento com G1-(B1) foi monitorada nas doses indi- cadas. Os tratamentos (injeção i.v. em dose única) foram realizados no dia O. Os valores são média + DPM; tamanho da amostra, (n=4 ca- mundongos por grupo). O peso corporal inicial no dia O era de aproxi- madamente 24 g. O peso corporal foi medido todos os dias durante 14 dias após o tratamento com fármaco. Nenhuma perda de peso corpo- ral foi observada por até 14 dias após o tratamento (Figura 12B).

[00521] — Foirealizada análise imunoistoquímica de tecido tumoral de xenoenxertos subcutâneos de 92.1-luciferase tratados com veículo, 3207- (B1) (7,5 mg/kg de peso corporal), ou G1-(B1) (7,5 mg/kg de pe- so corporal). Os tumores foram fixados em formalina tamponada neu- tra a 10% (vol/vol) por 24 h à temperatura ambiente, então, enxagua- dos em PBS, processados para desidratação, removidos e embebidos em parafina. Seções de 3 um foram preparadas e processadas para coloração com hematoxilina e eosina (H&E) para imunoistoquímica. A coloração imunohistoquímica foi realizada em seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina usando um sistema Bond-RX (Leica) totalmente automatizado para coloração anti-hlgG (ThermoFis- cher) e anti-gp100 (PMEL17) (clone EP4863; Abcam) e um sistema totalmente automatizado Discovery XT (Ventana Medical System) para coloração anti-Ki67 (clone Sp6; NeoMarkers), anti-pERK1/2 (clone D13.14.4E; Cell Signaling), anti-MITF (Sigma) e Caspase-3 anti- clivada (Cell Signaling). Brevemente, o tratamento com G1-(B1) resul- tou na inibição da sinalização de GNAQ e na inibição da proliferação de células tumorais, como indicado por níveis reduzidos de pERK e Ki67, respectivamente (Figura 12C). Além disso, G1-(B1) induziu apoptose celular em comparação com camundongos tratados com ve- ículo e com 3207-(B1), que se correlacionou com a acumulação de células tumorais de G1-(B1) ADC como detectado por coloração com IgG (Figura 12C). Nenhuma alteração foi observada nos níveis de MITF e PMEL17 após o tratamento com G1-(A1) (Figura 12C).

[00522] A agregação de plaquetas no sangue total de camundon- gos naive tratados com veículo, G1-(B1) (20 mg/kg de peso corporal), ou Composto (A1) (0,01, 0,03, 0,1 e 0,3 mg/kg de peso corporal) foi testada. Os animais foram submetidos à eutanásia 5 min após a dosa- gem única i.v. e o sangue foi coletado por meio da veia cava. Após 1h, a agregação no sangue total foi medida após a ativação das plaquetas com ADP a 6,5 uM (Figura 12D). Ao contrário do Composto (A1), G1- (B1) não teve nenhum efeito significativo sobre a agregação de pla- quetas induzida por ADP in vivo.

[00523] A agregação de plaquetas no sangue total de camundon- gos naive tratados com veículo e G1-(B1) (7,5 e 30 mg/kg de peso corporal) em 24 h ou 7 dias após a dosagem foi medida. Os camun- dongos foram submetidos à eutanásia 24h ou 7 dias após a dosagem única i.v. e o sangue foi coletado por meio da veia cava. Após 1h, a agregação no sangue total foi medida após a ativação das plaquetas com ADP a 6,5 uM. Nenhuma inibição da agregação de plaquetas foi observada em camundongos tratados com G1-(B1) por até 7 dias (Fi- gura 12E). Exemplo 17: Efeito de G1-(B1) sobre um modelo de camundongo com metástase hepática e pulmonar de melanoma uveal

[00524] — Camundongos NOD-Scid fêmeas foram injetados por via intravenosa com células 92.1-luciferase (aproximadamente 2 milhões de células por animal) e a bioluminescência foi medida duas vezes por semana para avaliar a formação de tumor. Após 45 dias, todos os ca- mundongos injetados desenvolveram metástases hepáticas e pulmo- nares, como detectado pelo sinal de bioluminescência (BLI) (Figuras 13A e 13B). Camundongos portadores de tumor foram tratados com uma única injeção i.v. de G1-(B1) (20 mg/kg de peso corporal) e a bio- luminescência foi monitorada ao longo do tempo como uma leitura da progressão do tumor. Imagens individuais de cada camundongo são apresentadas no dia 45 após injeção i.v. de células 92.1-luciferase (pouco antes do início do tratamento) e 12 dias após o tratamento (Fi- guras 13A e 13B); tamanho da amostra, (n = 6 camundongos por gru- po). A BLI inicial para metástase hepática no dia O foi de aproximada- mente 2,8 *10º p/seg/cm?. Os tumores de pulmão (sinal de biolumines- cência) na Figura 13B são indicados por uma seta preta. Como indica- do por bioluminescência in vivo e ex vivo reduzida, G1-(B1) induziu a regressão de metástases hepáticas e pulmonares após uma única do- se i.v. de 20 mg/kg.

[00525] A modulação do peso corporal correspondente (% vs dia 15) foi avaliada 2-3 vezes por semana antes e após o tratamento com G1-(B1) 20 mg/kg (círculos cinzas). Os valores são média + DPM; ta- manho da amostra, (n=5-6 camundongos por grupo). O peso corporal inicial no dia 15 era de aproximadamente 21 g. O tratamento com G1- (B1) resultou na restauração do peso corporal em um modelo de me-

tástase hepática e pulmonar de melanoma uveal. Exemplo 18: Propriedades PK de ADCs de G1-(B1).

[00526] O perfil farmacocinético de G1-(B1) mostrou um aumento ligeiramente desproporcional de exposição com dose entre 7,5 e 30 mg/kg em camundongos nus (Figura 14A). A depuração, o volume de distribuição e a meia-vida estão na faixa típica para ADCs. A Tabela 8 resume alguns valores PK.

[00527] Em camundongos com tumor, as concentrações de carga útil livre foram medidas após a dosagem de G1-(B1) de ligação ao alvo ou controle de isótipo 3207-(B1). Um aumento evidente (> 4 vezes) na distribuição do tumor da carga útil do Composto (A1) poderia ser ob- servado usando o ADC alvejado (Figura 14B). A conversão do Com- posto (A1) (círculos abertos) em sua forma de anel aberto do Compos- NU) Tr Afro to (A1) que tem a estrutura do Composto (A4) “o ; 7 TB ao HN,, ele. o) | Composto — (A6) to ou Composto (A8)

o 1 oh >. Pp Y MINHO no Sho

NO O OH n 2 |:

ES to , (círculos preenchidos) enquanto é conjugado ao anticorpo foi mostrada in vivo em camundongos (Figura 14C). As exposições em um estudo de eficácia in vivo, comparando dois forma- tos DAR2 diferentes com o formato DAR4 de G1-(B1) e com o formato DARA4 Fc silencioso, mostraram menor depuração para os ADCs de DAR?2 (E152C) e DARA4 Fc-silencioso, enquanto a exposição a DAR2 (S375C) diminui mais rapidamente (Figura 14D). A partir da compara- ção da PK dos 3207-ADCs não alvejados (Figura 14E), pode-se dedu- zir que o Fce-silencing tem um efeito significativo sobre a redução da depuração do formato DARA4. Tabela 8. Propriedades PK de ADCs de G1-(B1) Camundongos nus - dose |7,5 (mg/kg) AUCast (ug/mMI*h) 6779 + 1061 45346 + 3'785 Normaliz. de dose de AUCas: 1511 (ug/ml*h) AUCint (ug/mI*h) 9211 + 2337 73680 + 9867 CL (ml/h/kg) 0,9 + 0,3 0,4 + 0,05 Vz (L/kg) 0,21 + 0,01 0,15 + 0,01 app. teim (h) 176 + 37 259 +25

Exemplo 19: Estabilidade in vitro de ADCs anti-PMEL17-GNAQ/11i em tampão, plasma de camundongo, rato e humano e estabilidade in vivo de ADCs anti-PMEL17-GNAQ/11i em camundongo

[00528] (G1-(B2) anticPMELI7G1 E152C S375C (B2)) foi quanti- ficado em 100 ug/ml na respectiva matriz e incubado a 37 ºC. As amostras foram coletadas em 0, 1, 2 e 4 h por congelamento instantãà- neo a -70 ºC. Alíquotas de cada amostra foram imunoprecipitadas usando microesferas Capture Select FcXL e foram incubadas com tampão contendo papaína para liberar a carga útil do ADC capturado com microesferas. A carga útil liberada foi, então, analisada por HPLC MS para determinar os níveis relativos do Composto (A2)-PO. (ou se- o Ad, o CE Oo ed. São o es m. NH | Oo ao EX HN. lo, NRO o 8 7 1 HN,, e NT” nu o Po ” NÃO: HO-E-OH o ja, de +“ consultar Exemplo 1.2), e o Composto (A2)-PO. de anel aberto que tem a estrutura do Com- o ; a fr NH O NO OO!

LR eo TX

TO

O o HO-E-OH posto (A5)-PO.s (ou seja, Composto (A5)-PO.s 0 o a

1. NH OO o Ar ' e Aus tn, NH O o - O O O! A ç . XL “ E o Ts "No "NH HN,, Nº Ox O no Q : HN... o Ox N,, ES HO-P-oH de ), Composto (A7)-POs, O

CQ 1 o o nr - LL mm NH 2) No ho

NO O OH no | :

TO o o HO-p-OH ou Composto (A9)-POs, o , (em que o Composto (A2)-PO. de anel aberto — carga útil inativa). O gráfico representa a porcentagem de carga útil liberada que estava presente como o Com- posto (A2)-PO, ao longo do tempo do experimento (Figura 15A).

[00529] (G1-(B1) AntiPMELI7G1 E152C S375C (B1)) (G1- E152C-DAR2-(B1) Anti-PMEL17G1 E152C (B1)), (G1-S375C-DAR2- (B1) Anti-PMEL1I7G1 S375C (B1)) e (Fe-silencioso G1-(B1)) Fc- silencioso Anti-PMEL17G1 E152C S375C (B1) foram quantificados em 100 ug/ml na respectiva matriz e incubados a 37 ºC. As amostras foram coletadas em 0, 2, 4 e 6 h por congelamento instantâneo a -70 ºC. Alíquotas de cada amostra foram imunoprecipitadas usando micro- esferas Capture Select FCXL e foram incubadas com tampão contendo papaína para liberar a carga útil do ADC capturado com microesferas. As cargas úteis liberadas foram, então, analisadas por HPLC MS para determinar os níveis relativos do Composto (A1)-PO.,

o AA ; tn, NH | O O & 2 vs O OO

CX neo Po eoe Oo (9) HO-p-OH o , e do Composto de anel aberto (A1)-PO. que o vd. NH o sl o ao Y o 1: Ho-b-o tem a estrutura do Composto (A4)-PO2, o , Composto o

AA J CC Da Ão FJejNº ho OA

LX no 1

LS (9) Oo HO-E-OH (A6)-POa., Ô ou Composto (A8)-PO:, o 1 o

SN ANEEAAE

CC no NO n OR OH HQ |:

CS o o HO-p-OH Ô , (em que os compostos de anel aberto do x ex A ; mm NH | Oo Sh LO sho ao H o 1: ” ss. Hof-o Composto (A1)-PO:, Ô , São — cargas úteis inativas). O gráfico representa a porcentagem de carga útil liberada que estava presente como o Composto (A1)-PO. ao longo do tempo do experi- mento para cada um dos diferentes construtos de ADC (Figura 15B).

[00530] (G1-(B1) Anti-PMEL1I7G1 E152C S375C (B1)) (G1- E152C-DAR2-(B1) Anti-PMEL17G1 E152C (B1)), (G1-S375C-DAR2- (B1) Anti-PMEL1I7G1 S375C (B1)) e (Fe-silencioso G1-(B1)) Fc- silencioso Anti-PMEL17G1 E152C S375C (B1) foram, cada um, inje- tados por via intravenosa em camundongos nus em 20 mg/kg (peso corporal). Nove camundongos foram dosados com cada um dos cons- trutos de ADC descritos acima. Três animais por grupo (construto de ADC) foram sangrados terminalmente para coletar amostras de soro para análise 24 h, dia 7 e dia 14 após a dose. Alíquotas de cada amos- tra foram imunoprecipitadas usando microesferas Capture Select FoXL e foram incubadas com tampão contendo papaína para liberar a carga útil do ADC capturado com microesferas. As cargas úteis liberadas fo- ram, então, analisadas por HPLC MS para determinar os níveis relati- o

AA J “NH | Quo & 2

RO OO

IX no |: Rio o o HO-p-OH vos do Composto (A1)-PO:, o , e do Composto de anel aberto (A1)-PO. que tem a estrutura do Composto (A4)-PO:,

o AA ; .. ” el, “ E Sho dd Wo NH so RA “é CLEO Ps jeha mm dolo, ao E Ho Lê No

AE AS so 1o£o o , Composto (A6)-POs, ou Com- 1 .”

EA PR mm NH ú Fal ho v O n, OR OH K. 1:

AS

S Ho-p-oH posto (A8)-POs, o , (em que os compostos de anel aberto do Composto (A1)-PO,. — são cargas úteis inativas). O gráfico mostra a porcentagem de carga útil presente nos ADCs sob a forma ativa do Composto (A1)-PO. (assumindo o Composto (A1)-PO. + Composto (A8)-PO. = 100%) (Figura 15C). Valores iniciais foram esti- mados com base em resultados experimentais in vitro Exemplo 20: Eficácia in vivo de G1-E152C-DAR2-(B1), G1-S8375C- DAR2-(B1), Fc-silencioso G1-(B1) em um modelo de xenoenxerto de melanoma uveal

[00531] —Camundongos nus fêmeas portadores de xenoenxertos subcutâneos de 92.1-luciferase foram tratados com 3207-E152C S375C-DAR4- (B1), G1-E152C S375C-DARA4- (B1), G1-E152C-DAR2- (B1), G1-S375C-DAR2- (B1), Fc silencioso 3207- (B1) e Fc silencioso G1-DAR4 em 7,5 mg/kg. Os tratamentos (injeção i.v. em dose única) foram realizados 17 dias após a inoculação do tumor. Os valores re- presentam a média + DPM; tamanho da amostra, (n=5-6 camundon- gos por grupo). Os volumes de tumor inicial no dia O foi de aproxima-

damente 300-325 mmº?. (Figura 16) G1-E152C-DAR2-(B1), Fc- silencioso G1-DARA4, and G1-E152C S375C-DARA4-(B1) exibem ativi- dade antitumoral comparável no modelo de xenoenxerto 92.1 de me- lanoma uveal, enquanto G1-S375C-DAR2-(B1) e 3207-ADCs não alve- jados não tem efeito sobre o crescimento tumoral. Exemplo 21: Atividade in vitro de G1-3J-DAR4-(B1), G1-3R-DAR4- (B1), G1-DARA4-(B1), G1-3J-DAR2 (E152C)-(B1), Fc Silencioso G1- 3J -DAR2 (E152C)-(B1), 3207-DAR2 (E152C)-(B1) e G1-DAR2 (E152C)-(B1)

[00532] Na Figura 17A, as células 92.1 (painel esquerdo) e MP41 (painel direito) foram inoculadas em baixa densidade celular em placas de 96 poços e tratadas com concentrações crescentes de G1-3J- DARA4-(B1), G1-3R-DARA4-(B1), G1-DARA4-(B1), como indicado. Após o tratamento com fármaco por 96 ou 120 horas, a viabilidade e prolifera- ção celular foram determinadas usando um ensaio de viabilidade ba- seado em resazurina. Brevemente, as células foram incubadas com uma solução à base de resazurina e a mudança de cor foi detectada por absorbância com um espectrofotômetro e usada como uma leitura da viabilidade celular. Dados apresentados como média de 3 réplicas independentes e relativos às células tratadas com PBS (controle). Um valor de GI50 (é a concentração para 50% de inibição máxima de proli- feração celular) para cada ADC e a linhagem celular é mostrada na Tabela 9. ADCs anti-PMEL17-(B1) inibem a proliferação de células de melanoma uveal de maneira dependente de PMEL17 e de dose. Tabela 9. Atividade inibitória de crescimento de G1-3J-DARA4-(B1), G1- 3R-DARA4-(B1), G1-DARA4-(B1) em células UM Linhagem | G1-3J-DAR4-(B1) | G1-38R-DAR4-(B1) | G1-DAR4-(B1)

[00533] A Figura 17B representa os resultados de um ensaio de proliferação celular na linhagem celular 92.1 com G1-3J-DAR2 (E152C)-(B1), Fc Silencioso G1-3J-DAR2 (E152C)-(B1), 3207-DAR2 (E152C)-(B1) e G1-DAR2 (E152C)-(B1) como descrito na Figura 17A. GI50 é mostrado na Tabela 10. Tabela 10. Atividade inibitória de crescimento G1-3J-DAR2 (E152C)- (B1), Fc Silencioso G1-3J -DAR2 (E152C)-(B1), 3207-DAR2 (E152C)- (B1) e G1-DAR2 (E152C)-(B1) em células UM. celular (E152C)-(B1) | DAR2 (E152C)-(B1) (E152C)-(B1) | (E152C)-(B1) Glso nM Glso nM Glso nM Glso nM Exemplo 22: ADCs anti-PMEL17-(B1) inibem o crescimento de tu- mor em modelo de camundongo

[00534] —Camundongos nus fêmeas com xenoenxertos subcutâneos de 92.1-luciferase foram tratados com uma única injeção i.v. de 3207- (B1), G1-3J(E152C), G1-3J-DAR2 (E152C)-(B1), Fc Silencioso G1-3J- DAR?2 (E152C)-(B1), G1-DAR2 (E152C)-(B1) ou veículo nas doses in- dicadas. O tratamento (injeção i.v. em dose única) foi realizado 14-17 dias após a inoculação do tumor. Os valores são média + DPM; tama- nho da amostra, (n=5-12 camundongos por grupo). Os volumes de tu- mor inicial no dia O foi de aproximadamente 200-250 mm3. G1-3J- DAR2 (E152C)-(B1) e Fc Silencioso G1-3J-DAR2 (E152C)-(B1) inibi- ram o crescimento tumoral de maneira dose-dependente (Figura 18). Exemplo 23: Análise imunoistoquímica de biópsias tumorais de pacientes com melanoma uveal metastático

[00535] Os tumores foram fixados em formalina tamponada neutra a 10% (vol/vol) por 24 h à temperatura ambiente, então, enxaguados em PBS, processados para desidratação, removidos e embebidos em parafina. Seções de 3 um foram preparadas e processadas para imu- noistoquímica. A coloração imunohistoquímica foi realizada em seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina usando um sistema Bond-RX (Leica) totalmente automatizado para coloração anti- gp100 (PMEL17) (HMB45 monoclonal de camundongo). Amostras de melanoma uveal metastático exibem expressão alta e relativamente homogênea de PMEL17 (Figura 19A). Quantificação de níveis de ex- pressão de PMEL17 e proporção de células positivas para PMEL17 em amostras de pacientes com melanoma uveal metastático (Figura 19B, Figura 19C). Exemplo 24: Ensaio de Ligação Competitiva

[00536] SPR foi usado para avaliar o escaneamento de epítopos para anticorpos anti-PMEL em um instrumento T200 Biacore (número de catálogo 28975001, GE Healthcare Life Sciences).

[00537] A ressonância plasmônica de superfície (SPR) é uma técni- ca para medir as interações bimoleculares em tempo real em um am- biente isento de identificação. As moléculas são imobilizadas em uma superfície de sensor sobre a qual uma solução de amostra flui. A inte- ração entre a molécula imobilizada e a amostra que flui causa uma mudança no índice de refração. A mudança do índice de refração é uma alteração do ângulo no qual a luz polarizada de intensidade redu- zida é refletida do plano de vidro de suporte. Essa mudança de ângulo é causada pela ligação ou dissociação de moléculas da superfície do sensor e é proporcional à massa do material ligado e é registrada pelo instrumento em um sensorgrama. O sensorgrama mostra uma respos- ta crescente à medida que as moléculas interagem, a resposta perma- nece constante se a interação atingir o equilíbrio e a resposta diminui quando a amostra é substituída por tampão e os parceiros de intera- ção se dissociam. A partir das respostas de eventos de associação e dissociação, uma taxa de associação (ka), uma taxa de dissociação (kd) e uma afinidade geral (KD) são determinadas. Para escaneamen- to de epítopos, Kds não são determinadas.

[00538] Na primeira etapa, os anticorpos G1 LC 3J e 17A9 foram imobilizados diretamente sobre a superfície de um chip CM5 por meio de Acoplamento de Amina para atingir aproximadamente 2000RU res- pectivamente em Fc2 e Fc3. A célula de fluxo 1 não tinha um anticorpo imobilizado na mesma e serviu como o Fc de referência. Os anticorpos imobilizados em Fc2 e Fc3 são os anticorpos de base no experimento

[00539] Após a imobilização, o PMEL humano fluiu na segunda etapa a 20 nM sobre todas as células de fluxo por 60 segundos a 30ul/min.

[00540] A terceira e última etapa tem o anticorpo G1 LC 3J indivi- dualmente ou o anticorpo G1 LC 3J mais o anticorpo 17A9 que flui so- bre Fc2 ou o anticorpo 17A9 individualmente ou o anticorpo 17A9 mais o anticorpo G1 LC 3J que flui sobre Fc3 (Figura 20A). Os anticorpos fluíram em concentração total de 500 nM sobre ambas as células de fluxo por 120 segundos a 30ul/min para associação seguida de uma fase de dissociação de 120 segundos a 30ul/min com tampão de corri- da.

[00541] — Como esperado, quando G1 LC 3J era o anticorpo de base, nenhum sinal de ligação foi observado quando G13J fluiu. A ligação de 100RU foi observada quando 17A9 fluiu, o que sugere que o mesmo se liga a um epítopo diferente de G1 LC 3J (Figura 20B). Tendências similares foram observadas quando 17A9 era o anticorpo de base. Na etapa 3, nenhuma ligação foi observada com o mesmo, porém a liga- ção foi observada quando G1 LC 3J fluiu (Figura 20C). Isto indicou que G1 LC 3J e 17A9 se ligam a epítopos diferentes.

[00542] A regeneração foi realizada no final de cada ciclo em todas as células de fluxo. O tampão de regeneração era Glycine 2.0 que fluiu a 30 ul/min por 30 segundos.

[00543] Os dados foram analisados com o Software de Avaliação Biacore T200 versão 3.0.

[00544] Entende-se que os exemplos e as modalidades descritos no presente documento têm apenas propósitos ilustrativos e que vá- rias modificações ou mudanças à luz dos mesmos serão sugeridas aos versados na técnica e podem ser incluídas no espírito e âmbito desse pedido e escopo das reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo que se liga a PMEL17, caracterizado pelo fato de que compreende: a. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada (Região Determinante de Complementa- ridade 1) da SEQ ID NO:1, 4, 5 ou 7, uma CDR2 de cadeia pesada (Região Determinante de Complementaridade 2) da SEQ ID NO:2, 6 ou 8 e uma CDR3 de cadeia pesada (Região Determinante de Com- plementaridade 3) da SEQ ID NO:3 ou 9; e uma região variável de ca- deia leve que compreende uma CDR1 de cadeia leve (Região Deter- minante de Complementaridade 1) da SEQ ID NO:14, 17 ou 20, uma CDR?2 de cadeia leve (Região Determinante de Complementaridade 2) da SEQ ID NO:15 ou 18 e uma CDR3 de cadeia leve (Região Deter- minante de Complementaridade 3) da SEQ ID NO:16 ou 19; b. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:33, 36, 37 ou 39, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:34, 38 ou 40; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:35 ou 41; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:46, 49 ou 52; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 ou 50; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:48 ou 51; c. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:5, 7, 57 ou 60, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:58, 61 ou 62; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:59 ou 63; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:68, 71 ou 74; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:69 ou 72; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:70 ou 73; d. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:79, 82, 83 ou 85, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:80, 84 ou 86; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:81 ou 87; uma CDR1 de cadeia leve da

SEQ ID NO:92, 95 ou 98; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:93 ou 96; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:94 ou 97;

e. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:103, 106, 107 ou 109, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:104, 108 ou 110; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:105 ou 111; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, 52 ou 116; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 ou 50; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:117 ou 118;

f. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:123, 126, 127 ou 129, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:124, 128 ou 130; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:125 ou 131; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:136, 139 ou 142; uma CDR?2 de cadeia le- ve da SEQ ID NO:137 ou 140; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:138 ou 141;

g. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:123, 126, 127 ou 129, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:124, 128 ou 130; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:147 ou 148; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:153, 156 ou 158; uma CDR?2 de cadeia le- ve da SEQ ID NO:50 ou 154; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:155 ou 157;

h. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:103, 106, 107 ou 109, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:104, 108 ou 110; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:163 ou 164; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, 52 ou 116; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 ou 50; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:169 ou 170;

i. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:175, 178, 179 ou 181, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:176, 180 ou 182; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:177 ou 183; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, 52 ou 116; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 ou 50; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:188 ou 189;

j. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 103, 106, 107 ou 109, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 104, 108 ou 110; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:194 ou 195; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 49, 52 ou 116; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 47 ou 50; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:200 ou 201;

k. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:206, 209, 210 ou 212, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:207, 211 ou 213; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:208 ou 214; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:153, 156 ou 158; uma CDR?2 de cadeia le- ve da SEQ ID NO:50 ou 154; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:219 ou 220;

|. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 206, 209, 210 ou 212, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 207, 211 ou 213; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:225 ou 226; uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:136, 139 ou 142; uma CDR?2 de cadeia le- ve da SEQ ID NO:137 ou 140; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:231 ou 232;

m. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 206, 209, 210 ou 212, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207, 211 ou 213, e uma HCDR3 da SEQ ID NO:237 ou 238; e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:243, 245 ou 247, uma LCDR2 da SEQ ID NO:47 ou 50 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:244 ou 246;

n. uma região variável de cadeia pesada que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 206, 209, 210 ou 212, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207, 211 ou 213, e uma HCDR3 da SEQ ID NO:252 ou 253; e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:153, 156 ou 158, uma LCDR2 da SEQ ID NO:50 ou 154 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:258 ou 259;

o. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:1, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:2, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:3, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:14, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:15 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:16;

p. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 4, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:2, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:3, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:14, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:15 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:16;

q. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:5, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:6, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:3, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:17, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 18 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 19;

r. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:7, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:8, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:9, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:20,

uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:18 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:16;

s. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:33, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:34, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:35, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:46, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:48;

t. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:36, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:34, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:35, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:46, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:48;

u. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:37, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:38, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:35, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:51;

v. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 39, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:40, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:41, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:52, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:48;

w.uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:57, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:58, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:59, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:68, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:69 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:70;

x. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:60, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:58, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:59, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:68,

uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:69 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:70;

y. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:5, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:61, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:59, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:71, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:72 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:73;

z. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:7, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:62, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:63, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:74, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:72 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:70;

aa. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:79, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:80, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:81, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:92, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:93 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:94;

bb. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:82, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:80, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:81, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:92, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:93 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:94;

cc. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:83, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:84, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:81, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:95, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:96 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 97;

dd. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 85, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:86, uma CDR3 de cadeia pe- sada da SEQ ID NO:87, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:98,

uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:96 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:94;

ee. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:103, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:105, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 116; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:117;

ff. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:106, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:105, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de ca- deia leve da SEQ ID NO:117;

gg. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:107, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:108, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:105, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:118;

hh. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:109, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:110, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:111, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:52, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:117;

ii. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:123, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:124, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:125, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:136, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:137 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:138;

jj. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:126, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:124, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:125, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID

NO:136, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:137 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:138;

kk. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:127, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:128, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:125, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:139, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:140 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 141;

ll. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 129, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:130, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:131, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:142, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:140 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:138;

mm. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:123, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:124, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:147, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:153, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:154 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:155;

nn. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:126, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:124, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:147, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:153, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 154 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:155;

oo. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:127, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:128, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:147, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:156, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:157;

pp. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 129, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:130, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:148, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID

NO:158, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:155;

qq. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:103, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:163, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de ca- deia leve da SEQ ID NO:169;

rr. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:106, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:163, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:169;

ss. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:107, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:108, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:163, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:170;

tt. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 109, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:110, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:164, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:52, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:169;

uu. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:175, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:176, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:177, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:188;

vv. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:178, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:176, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:177, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID

NO:116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:188;

ww. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:179, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:180, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:177, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:49, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:189;

xx. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 181, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:182; uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:183, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:52, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:188;

yy. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 103, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:194, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:200;

zz. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 106, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 104, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:194, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 116, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 47 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:200;

aaa. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 107, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 108, uma CDR3 de ca- deia pesada da SEQ ID NO:194, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 49, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 50, e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 201;

bbb. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 109, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 110, uma CDR3 de ca- deia pesada da SEQ ID NO:195, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID

NO: 52, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:200;

ccc. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:206, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:207, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:208, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:153, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:154 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:219;

ddd. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:209, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:207, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:208, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:153, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 154 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:219;

eee. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO:210, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:211, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:208, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:156, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:220;

fff.. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 212, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO:213, uma CDR3 de ca- deia pesada da SEQ ID NO:214, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:158, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:50 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO:219;

ggg. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 206, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 207, uma CDR3 de ca- deia pesada da SEQ ID NO:225, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:136, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:137 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO0:231;

hhh. uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 209, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 207, uma CDR3 de ca- deia pesada da SEQ ID NO:225, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID

NO:136, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:137 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO0:231;

iii .uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 210, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 211, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO:225, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:139, uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO:140 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 232;

jj- uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 212, uma CDR?2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 213, uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 226, uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO:142; uma CDR?2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 140; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO0:231;

kkk. uma região variável de cadeia pesada que compreen- de uma HCDR1 da SEQ ID NO: 206, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:237, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:243, uma LCDR2 da SEQ ID NO:47 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:244;

lll.uma região variável de cadeia pesada que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 209, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:237, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:243, uma LCDR2 da SEQ ID NO:47 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:244;

mmm. uma região variável de cadeia pesada que compre- ende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 210, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 211 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:237, e uma região variável de ca- deia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:245, uma LCDR?2 da SEQ ID NO:50 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:246;

nnn. uma região variável de cadeia pesada que compreen- de uma HCDR1 da SEQ ID NO: 212, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 213 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:238; e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:247, uma LCDR2 da SEQ ID NO: 50 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:244;

000. uma região variável de cadeia pesada que compreen- de uma HCDR1 da SEQ ID NO: 206, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:252, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:153, uma LCDR2 da SEQ ID NO: 154 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:258; ppp. uma região variável de cadeia pesada que compreen- de uma HCDR1 da SEQ ID NO: 209, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 207 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:252, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:153, uma LCDR2 da SEQ ID NO:154 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:258; qqgq. uma região variável de cadeia pesada que compreen- de uma HCDR1 da SEQ ID NO: 210, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 211 e uma HCDR3 da SEQ ID NO:252, e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:156, uma LCDR2 da SEQ ID NO:50 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:259; ou rr. uma região variável de cadeia pesada que compreen- de uma HCDR1 da SEQ ID NO: 212, uma HCDR2 da SEQ ID NO: 213 e uma HCDR3 da SEQ ID NO: 253; e uma região variável de cadeia leve que compreende uma LCDR1 da SEQ ID NO:158, uma LCDR2 da SEQ ID NO:50 e uma LCDR3 da SEQ ID NO:258.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo que se liga a PMEL17, caracterizado pelo fato de que compreende: a. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10 e uma região va- riável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO:21; b. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10 e uma região va-

riável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO:25;

c.

Uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10 e uma região va- riável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO:29;

d.

Uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:42 e uma região va- riável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO:53;

e.

Uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:64 e uma região va- riável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO:75;

f.

Uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:88 e uma região va- riável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO:99;

g.

Uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:112 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:119;

h.

Uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:132 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:143;

i.

Uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:149 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:159;

j. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:165 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:171; k. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:184 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:190; |. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:196 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:202; m. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:215 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:221; n. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:227 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:233; o. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:239 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:248; ou p. Uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:254 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO:260.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo que se liga a PMEL17, caracterizado pelo fato de que compreende:

a. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:23; b. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:27; c. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31; d. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:44 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:55; e. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:66 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:77; f. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:90 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:101;

9. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:114 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:121; h. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:134 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:145; i. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:151 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:161; j. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:167 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:173;

k. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:186 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:192; |. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:198 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:204; m. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:217 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:223; n. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:229 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:235; o. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:241 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:250; ou p. Uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:256 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:262.

4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais substituições de cisteína.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma ou mais substituições de cisteína selecionadas a partir de S152C, S375C ou ambas S152C e S375C da cadeia pesada do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que a posição é numerada de acordo com o sistema EU.

6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo monoclonal.

7. Conjugado de anticorpo e fármaco, caracterizado pelo fa- to de que compreende a fórmula (C)

Ab-(LA-(D)N)y (C) em que: D é um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um ini- bidor de GNAQ e GNA11; Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; La é um ligante; né 1,2,3ou4,e yé1,2,3ou4.

8. Conjugado de anticorpo e fármaco, de acordo com a rei- vindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito né 1.

9. Conjugado de anticorpo e fármaco, de acordo com a rei- vindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que y é cerca de 1 a cer- cade4.

10. Conjugado de anticorpo e fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o dito ligante é um ligante clivável ou um ligante não clivável.

11. Conjugado de anticorpo e fármaco, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende um ligante peptídico ValCit.

12. Conjugado de anticorpo e fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que a dita porção química de fármaco é um inibidor de GNAQ e GNA11.

13. Conjugado de anticorpo e fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que o D é o o E >. x NO nO cz EL, e) |: ...

O 7 ana

14. Conjugado de anticorpo e fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que D é o e A J mA NH Oo * O OO HN, x TS. (NT o q

AA

15. Conjugado de anticorpo e fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 14, caracterizado pelo fato de que tem a seguinte estrutura, / Aa / xd, À Í tn NH Oo À | Es 2 | | 26 7 08o | | TER | | a To | | AI | [| “e Í VÊ q S / dA AAA DO Por / ve no / Vo /

HNOC Yo.

16. Conjugado de anticorpo e fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 14, caracterizado pelo fato de que tem a seguinte estrutura, / a / AA / mem de À E) | ho oo | | PERSON "no Po | Í si | | “eg | VA s | ML AI AA LIA | vº Sê" |

NA Á une oo

17. Conjugado de anticorpo e fármaco, caracterizado pelo fato de que tem a seguinte Fórmula (C-2): o o, “E | oo “não Rº Ás v Neo 9 o Ao

HI A O Rê K v | Y fo º Ab go

OH , (C-2), em que: Rº é metila ou etila; R' é metila ou isopropila; R? é metila ou etila; Ab é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína PMEL17 humana; X1 é um grupo de acoplamento bivalente; X2 é um espaçador autoimolativo;

L1 é um ligante peptídico bivalente; L2 é uma ligação ou um ligante, e yé1,2,30ou4.

18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um transportador farmaceuticamente aceitável.

19. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado de anticorpo e fármaco, como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 17, e um transportador far- maceuticamente aceitável.

20. Método de tratamento ou prevenção de câncer em um paciente com necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao dito paciente o conjugado de anticorpo e fármaco, como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 17, ou a composição farmacêutica, como definida em a reivindicação 18 ou 19, em que o câncer expressa PMEL17, contém uma mutação do gene GNAQ ou GNA11, ou o câncer expressa PMEL17 e contém uma mutação de GNAQ, GNA11, ou ambos.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do pelo fato de que o conjugado de anticorpo e fármaco ou composi- ção farmacêutica é administrado ao paciente em combinação com um ou mais compostos terapêuticos adicionais.

22. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do pelo fato de que o um ou mais compostos terapêuticos adicionais são selecionados dentre um padrão de cuidado quimioterápico, um inibidor de MDM?2, inibidor de MRC?2, inibidor de PKC, inibidor de MAPK, uma molécula coestimuladora ou um inibidor de ponto de veri- ficação.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracteriza-

do pelo fato de que a molécula coestimuladora é selecionada dentre um agonista de ligante OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD30, CDA40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7- H3, STING ou CD83.

24. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracteriza- do pelo fato de que o inibidor de ponto de verificação é selecionado dentre um inibidor de PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLAA4, TIM3, LAG3, VIS- TA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e/ou TGFR beta.

25. Conjugado de anticorpo e fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 17, ou a composição farmacêuti- ca, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que se destina ao uso como um medicamento.

26. Conjugado de anticorpo e fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 17, ou a composição farmacêuti- ca, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que se destina ao uso no tratamento ou prevenção de um câncer que expressa PMEL17 ou um câncer que contém uma mutação do gene GNAQ ou GNA11 em um paciente com necessidade do mesmo.

27. Uso do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, do conjugado de anticorpo e fármaco, como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 17, ou da composição farmacêutica, como defi- nida na reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que se des- tina a tratar ou prevenir um câncer que expressa PMEL17 ou um cân- cer que contém uma mutação do gene GNAQ ou GNA11 em um paci- ente com necessidade do mesmo.

28. Uso do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, do conjugado de anticorpo e fármaco, como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 17, ou da composição farmacêutica, como defi- nida na reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que se des- tina à fabricação de um medicamento.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 20 a 24, o conjugado de anticorpo e fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 26, ou o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 28, caracterizado pelo fato de que o câncer expressa PMEL17 ou contém uma mutação do gene GNAQ ou GNA11.

30. Método, conjugado de anticorpo e fármaco ou uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o cân- cer é melanoma uveal, melanoma subcutâneo, carcinoma hepatocelu- lar ou um câncer metastático dos mesmos.

31. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

32. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 31, ca- racterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 13, 24, 28, 32, 45, 56, 67, 78, 91, 102, 115, 122, 135, 146, 152, 162, 168, 174, 187, 193, 199, 205, 218, 224, 230, 236, 242, 251, 257 ou 263.

33. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 31 ou 32.

34. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o vetor, como definido na reivindicação 33, ou o ácido nucléi- co, como definido na reivindicação 31 ou 32.

35. Processo para produzir um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que com- preende cultivar a célula hospedeira, como definido na reivindicação 34, e recuperar o anticorpo da cultura celular.

36. Processo, de acordo com a reivindicação 35, caracteri- zado pelo fato de que a recuperação do anticorpo da cultura celular compreende as etapas de: a) remover células e filtrar a cultura; b) purificar a cultura por cromatografia de afinidade; c) inativar quaisquer vírus na cultura ajustando o pH para 3,4-3,6, então reajustando o pH para 5,8-6,2 e filtrando a cultura; d) purificar a cultura por meio de cromatografia de troca ca- tiônica e realizar redução da cultura dentro da coluna; e) realizar cromatografia de troca aniônica na cultura; f) remover vírus por nanofiltração; g) filtrar a cultura contendo o anticorpo; e h) obter anticorpo purificado.

37. Processo para a produção de um conjugado de anticor- po anti-PMEL17 e fármaco, caracterizado pelo fato de que compreen- de: (a) pré-formar uma porção química de ligante-fármaco da seguinte Fórmula (B): Rº-Lg-(D)n (B) em que: D é um inibidor de GNAQ, um inibidor de GNA11 ou um ini- bidor de GNAQ e GNA11; Rô é um grupo reativo; Lg é um ligante clivável ou não clivável, e né 1,2,30ou4; (b) conjugar a dita porção química de ligante e fármaco ao anticorpo recuperado da cultura celular, como definido na reivindica- ção 35, para produzir um conjugado de anticorpo e fármaco; e (c) purificar o conjugado de anticorpo e fármaco.

38. Reagente de diagnóstico, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

39. Reagente de diagnóstico, de acordo com a reivindica- ção 38, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é marcado com um radiomarcador, um fluoróforo, um cromóforo, um agente de imageamento ou um íon metá- lico.