KR20220082846A - B-림프구 특이적 아마톡신 항체 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 아마톡신, 표적이 CD20인 표적-결합 부분, 즉 CD20-결합 부분, 및 임의로 상기 아마톡신과 상기 CD20-결합 부분을 연결하는 링커를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 접합체의 합성에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특히 B-세포 및/또는 림프종 관련 질병 및/또는 악성종양의 치료에 사용하기 위한 이러한 접합체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

B-림프구 특이적 아마톡신 항체 접합체
본 출원은 아마톡신, 표적이 CD20인 표적-결합 부분, 즉 CD20-결합 부분, 및 임의로 상기 아마톡신과 상기 CD20-결합 부분을 연결하는 링커를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 접합체의 합성에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특히 B-세포 및/또는 림프종 관련 질병 및/또는 악성 종양의 치료에 사용하기 위한 이러한 접합체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
CD20은 특정 B 세포 전구체(pre-B 림프구) 및 성숙한 B 림프구에 대해 특징적인 세포 표면의 막 내장 35-37 kDa 비당화 인단백질이다. CD20 항원은 형질 세포나 조혈 줄기 세포 및 초기 pro-B 림프구에서 발현되지 않는다. 지금까지 천연 CD20 리간드가 확인되지 않았다. CD20은 B 세포의 발달, 성장 및 형질 세포로의 분화에 역할을 하며 특히 T 비의존성 항원에 대한 최적의 B 세포 면역 반응을 가능하게 한다. 일부 데이터에 따르면 CD20은 세포 내 Ca2+ 농도를 유지하고 B 세포의 활성화를 허용하는 Ca2+ 막 채널로 기능할 수 있다(Winiarska et al, 2007).
CD20 항원은 멤브레인 스패닝 4A 단백질 패밀리의 구성원이다. 그 구조는 아미노 및 카르복시 말단이 모두 세포질 내에 위치한 4개의 막 스패닝 도메인으로 구성된다(즉, CD20은 MS4A1이라고도 하며 4개 도메인 서브패밀리 A, 구성원 1에 걸쳐 있는 막). CD20에는 2개의 세포외 루프가 있다. 더 작은 것(첫 번째와 두 번째 막관통 영역 사이의 7개 아미노산의 한 부분)은 세포막 너머로 확장되지 않을 수 있다. 이 루프는 MS4A 제품군의 모든 구성원에서 동일하다. 더 큰 루프, 세 번째와 네 번째 막횡단 영역 사이의 43개 아미노산 부분은 이황화 결합을 가지며 대다수의 항-CD20 항체에 의해 인식된다. 세린 및 트레오닌 인산화에 대한 다수의 공통 부위가 있지만 티로신 잔기 또는 인식된 신호 전달 모티프는 CD20 분자의 세포질 영역에서 발생하지 않는다.
CD20은 적어도 하나의 추가 단백질 성분과 복합체로 이량체 및 사량체로 존재할 수 있다. CD20 단백질은 막관통 어댑터 단백질 p75/80(C-말단 src 키나제 결합 단백질 Cbp라고도 함), CD40 및 주요 조직적합성 복합체 클래스 II 단백질(MHC II)과 밀접하게 관련된 것으로 보고되었다. CD20 항원은 B 림프구 분화 동안 구조적 변화를 겪고 CD20의 적어도 두 가지 구조적 동형이 존재한다(Winiarska et al , 2007).
특정 특성으로 인해 CD20 항원은 단일클론항체(mAb) 요법에 대한 매력적인 표적이 되었다. CD20 항원은 가장 안정적인 림프구 항원 중 하나일 수 있다. 모노클로날 항체가 림프종 세포에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 수 있는 유리 단백질로서 혈장에서 순환하지 않으며, 항체 결합 후 CD20-양성 세포의 표면에서 흘리지 않으며, 대부분의 생체내 및 시험관 연구에서 CD20 표면 분자의 내재화 또는 CD20 발현의 하향 조절이 검출되었다.
항-CD20, B-세포 특이적, 키메라 단일클론 항체 리툭시맙(chimeric monoclonal antibody rituximab)은 비호지킨 B-세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병 및 류마티스 관절염과 같은 다양한 암 및 자가면역 질환의 치료를 위해 규제 당국에 의해 승인된 최초의 단일클론 항체였다. 리툭시맙은 CD20을 발현하는 인간 림프 세포주의 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 촉진할 뿐만 아니라 세포 신호 전달 경로 및 CD20 결합 후 세포막에 직접적인 영향을 미치는 것으로 입증되었다(Taylor and Lindorfer, 2008). 지질 뗏목 변형, 키나제 및 카스파제 활성화, 전사 인자에 대한 영향을 포함하여 리툭시맙 결합에 의해 영향을 받는 많은 이벤트가 확인되었다(Weiner 2010; Bezombes et al , 2011).
리툭시맙(rituximab) 외에도 이브리투모맙(ibritumomab), 토시투모맙(tositumomab)(둘 모두 방사성 동위원소와 접합됨), 오파투무맙(ofatumumab), 오크렐리주맙(ocrelizumab), 오비누투주맙(obinutuzumab) 및 유블리툭시맙(ublituximab)을 포함한 다른 항-CD20 항체가 기술되어 있으며, 이들은 모두 B 세포 림프종, 백혈병 및 B 세포 매개 자가면역 질환의 치료를 위한 활성제이다(Falchi et al, 2018).
리툭시맙은 다음 적응증에 대해 MabThera(Roche)라는 상품명으로 유럽에서 성인용으로 승인되었다: 비호지킨 림프종, NHL(화학요법과 병용하여 이전에 치료받은 적이 없는 III-IV기 여포성 림프종 환자의 치료; 유도 요법에 반응하는 여포성 림프종 환자의 치료를 위한 유지 요법; 화학 내성이 있거나 화학 요법 후 두 번째 또는 후속 재발이 있는 III-IV기 여포성 림프종 환자의 치료를 위한 단일 요법, CHOP(시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니솔론) 화학요법과 병용하여 CD20 양성 미만성 거대 B 세포 비호지킨 림프종 환자의 치료; 만성 림프구성 백혈병, CLL(이전에 치료받지 않은 재발성/불응성 CLL 환자 치료를 위한 화학요법과 병용), 류마티스 관절염(하나 이상의 종양 괴사 인자(TNF) 억제제 요법을 포함한 다른 질병 조절 항류마티스 약물(DMARD)에 부적절한 반응 또는 불내성을 보이는 중증 활동성 류마티스 관절염 성인 환자의 치료를 위해 메토트렉세이트와 병용); 다발혈관염 및 현미경적 다발혈관염을 동반한 육아종증(다발혈관염(베게너)(GPA) 및 현미경적 다발혈관염(MPA)을 동반한 중증의 활동성 육아종증 성인 환자의 치료를 위해 글루코코르티코이드와 병용); 및 심상성 천포창(중등도 내지 중증 심상성 천포창 환자의 치료용)(MabThera, 제품 특성 요약).
그러나 항체-약물 접합체(ADC)의 구성을 위해 항-CD20 항체를 사용하려는 시도는 제한적인 성공을 거두었다.
항-CD20 항체의 독소 접합체에 대한 음성 결과는 Lambert et al (1985)에 의해 보고되었는데, 그는 CD20에 대해 지시된 항체 항-B1을 함유하는 면역독소가 세포독성을 나타내지 않는다는 것을 발견했으며, 이는 항체는 인간 림프 세포 상의 3개의 다른 항원과 반응성인 IgG 클래스의 다양한 다른 단일클론 항체를 포함하는 면역독소와 대조적이다. 이 연구에 사용된 면역독소는 리보솜 불활성화 단백질인 젤로닌 또는 알려진 3가지 포크위드(pokeweed) 항바이러스 단백질로 구성되었다.
AG Polson이 Phillips(2013)에서 공개한 바와 같이, CD20은 항체 결합 시 매우 열악하게 내재화되어 ADC 표적으로 적합하지 않은 것으로 밝혀졌다는 점에서 표적으로 사용되는 다른 B 세포 표면 단백질과 다르다. 초기 연구에서는 항-CD20 항체가 비-내재화(non-internalizing)로 간주되기 때문에 그러한 접합체가 유망한 것으로 간주되지 않는다는 결론을 이미 내렸다. CD20이 비내재화 또는 불충분하게 내재화 항원이라는 발견은 문헌에서 널리 확인되었다(Press et al, 1989; Vangeepuram et al, 1997; Winiarska et al, 2007; Kim and Kim, 2015; Staudacher and Brown, 2017).
DiJoseph et al. (2007)은 비호지킨 B 세포 림프종 세포에 대한 연구에서 항체 결합 CD20의 내재화 부족으로 인해 리툭시맙의 아미드 결합 접합체가 세포 내 구획에서 독소 칼리케아미신을 전달하여 세포 독성 활성을 일으키지 못했다는 결론을 내렸다.
다른 연구에서는 표적 부분으로서 항-CD20 항체, 독소로서 N(2')-데아세틸-N(2')-(3-메르캅토-1-옥소프로필)-메이탄신(DM1) 및 절단 불가능한 링커를 포함하는 ADC가 효과가 없다고 밝혔다. CD20-양성 표적 세포에 대한 반면, 절단 가능한 링커가 있는 각각의 구축물은 그러한 세포에 대해 약간의 세포독성 효과를 나타냈다(Polson et al, 2009). Law et al.(2004)는 사용된 독소에 따라 CD20 표적 ADC의 다른 효과를 발견했다: 독소루비신(Dox)에 접합된 항-CD20 항체는 약물을 전달하거나 항종양 활성을 나타내지 못한 반면, 항-CD20 항체-약물 접합체는 항-유사분열제 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)는 강력한 항종양 활성을 나타냈다.
또한, 사용된 독소의 특성 및 이러한 독소에 대한 표적-결합 모이어티의 접합을 위해 사용되는 링커의 특성에 더하여, 최근 연구에 따르면 특정 항-CD20 항체의 특정 특성은 이러한 항체 접합체의 치료 효능을 결정하는 데 관련이 있는 것으로 나타났다. 소위 "유형 II" CD20 특이적 항체가 CD20 양성 표적 세포에 의해 제대로 내재화되지 않는 것으로 나타난 반면, 다른 소위 "유형 I" CD20 특이적 항체는 내재화되어 일부로 분해되는 것으로 밝혀졌으며, 범위는 상호작용하는 표적 세포에 대한 활성 및 억제 FcγR 의 발현 수준에 따라 다르다. 특히, 특정 유형의 B 세포 악성종양에서 발현되는 억제성 FcR인 FcγRIIb는 이러한 맥락에서 중요한 역할을 하는 것으로 기술되었다. I형 및 II형 항-CD20 단일클론 항체의 차등 FcγR 매개 내재화 반응의 기초가 되는 메커니즘은 아직 자세히 정의되지 않았다(Boross and Leussen, 2012; Dransfield 2014; Vaughan et al. 2014).
표적의 내재화는 세포독성 암 치료에 항체-약물 접합체(ADC)를 사용하는 맥락에서 매우 바람직하다(예: Boross and Leussen, 2012). 세포독성 페이로드는 일반적으로 세포 내 표적에 작용하기 때문에 표적에 결합할 때 ADC의 내부화는 ADC 의 최적 효능을 위해 종종 필요하다(Kim and Kim, 2015). 이것은 특히 아마니틴 및 그 유도체("아마톡신")를 포함하는 아마니틴 기반 ADC에 해당하는 것으로 간주될 수 있는데, 왜냐하면 이러한 아마톡신은 ADC 생산에 사용된 다른 독소 분자보다 덜 소수성이어서, 따라서 예를 들어, MMAE(Staudacher 및 Brown, 2017)와 같은 확산성 약물에 비해 세포막을 투과하는 능력이 적기 때문이다. 항-CD20 항체 및 이를 사용하는 ADC의 내재화 및 세포독성 효과에 관한 문헌의 각각의 편견 및 상충되는 연구의 결과를 고려할 때, 상기 기재된 바와 같이, 본 출원의 발명자들은 항체 아마톡신 접합체의 맥락에서 항-CD20 항체를 사용할 때 상당한 세포독성 효과의 면에서 성공을 기대하지 않았다. 아마니틴 또는 아마니틴 유사체 또는 유도체는 이전에 CD20 표적 결합 부분을 포함하는 ADC의 합성 및 평가에 사용되지 않았다.
놀랍게도, 본 발명자들은 항-CD20 항체, 또는 항체 단편 또는 항체 유도체를 아마톡신에 연결하는 비절단성 또는 절단성 링커를 갖는 항-CD20 항체를 포함하는 아마톡신 기반 ADC가 시험관내 및 생체내에서 CD20-양성 표적 세포에 대해 상당한 세포독성 효과를 발휘한다는 것을 발견하였다. 이러한 결과는 활성 독소 분자의 방출을 위해 리소좀 구획 내에서 세포내 분해가 필요한 것으로 간주되기 때문에 특히 절단 불가능한 링커를 포함하는 아마톡신 기반 ADC의 경우 예상치 못한 것이었다.
선행 기술의 관점에서, 따라서 본 발명의 일 목적은, 본 출원에 기재된 바와 같이, CD20에 결합하는 표적 결합 부분, 적어도 하나의 아마톡신 및 선택적으로 상기 표적 결합 부분을 표적 세포에서 세포독성 효과를 매개하는 상기 적어도 하나의 독소와 연결하는 적어도 하나의 링커를 포함하는 접합체를 제공하는 것이다
본 발명의 또 다른 목적은 CD20에 결합하는 표적 결합 부분, 적어도 하나의 아마톡신, 및 선택적으로 적어도 하나의 링커를 포함하는 접합체를 제공하는 것이며, 여기서 상기 표적 결합 모이어티는 CD20에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 항원-결합 유도체, 또는 항체-유사 단백질이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이러한 접합체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 및 자가면역 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 B 림프구 관련 악성종양 또는 B 세포 매개 자가면역 질병의 치료에 사용하기 위한 CD20에 결합하는 표적 결합 부분, 하나 이상의 아마톡신, 및 임의로 하나 이상의 링커를 포함하는 접합체를 제공하는 것이며. 특히 비호지킨 림프종, 여포성 림프종, 미만성 거대 B 세포 비호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 리히터 증후군, 류마티스 관절염, 다발혈관염을 동반한 육아종증 및 현미경적 다발혈관염 및 심상 천포창의 치료에 사용한다.
놀랍게도, CD20에 결합하는 표적 결합 모이어티, 적어도 하나의 아마톡신, 및 임의로 적어도 하나의 링커, 특히 항-CD20 항체를 포함하는 아마톡신 기반 ADC를 포함하는 접합체가 아마톡신에 대한 항-CD20 항체, 또는 항체 단편 또는 항체 유도체는 시험관내 및 생체내에서 CD20 양성 표적 세포에 상당한 세포독성 효과를 발휘했다. 이러한 결과는 활성 독소 분자의 방출을 위해 리소좀 구획 내에서 세포내 분해가 필요한 것으로 간주되기 때문에 특히 절단 불가능한 링커를 포함하는 아마톡신 기반 ADC의 경우 예상치 못한 것이었다.
이들 및 추가 목적은 본 발명의 독립 청구항에 따른 방법 및 수단에 의해 충족된다. 종속항은 특정 실시예와 관련된다.
본 발명에 따르면 B-림프구 특이적 아마톡신 항체 접합체가 제공된다.
본 발명 및 그 특징의 일반적인 이점은 아래에서 상세히 논의될 것이다.
도 1은 다양한 아마톡신의 구조식. 굵은 글씨체의 숫자(1~8)는 아마톡신을 구성하는 8개 아미노산의 표준 번호를 나타낸다. 아미노산 1, 3, 4에 있는 원자의 표준 명칭도 표시된다(각각 그리스 문자 α ~ γ, 그리스 문자 α ~ δ 및 숫자 1' ~ 7').
도 2는 항-CD20 모노클로날 항체 리툭시맙의 CD20-양성 인간 만성 B 세포 백혈병 세포주 (A) MEC-1 및 (B) MEC-2 및 인간 버킷 림프종 세포주 (C) Raji에 대한 결합 FACS 분석이다.
도 3은 72시간 배양 후 BrdU 분석에서 CD20-양성 MEC-1 세포에 대한 세포독성 연구 결과이다.
도 4는 72시간 배양 후 BrdU 분석에서 CD20 음성 SK-Hep-1 세포에 대한 세포 독성 연구 결과이다.
도 5는 (A) 비자극 PBMC에서의 세포독성 연구 결과 및 (B) WST-1 분석에서 항-CD20 항체-(Rtx-30.0643) 및 항-EGFR-항체-(Her-30.0643, Pan-30.0643) 아마톡신 접합체를 사용하여 CD20-인리치(enriched) 비자극 PBMC에서의 세포독성 연구 결과이다.
도 6은 리툭시맙-아마톡신 접합체 Rtx-30.0643, 리툭시맙 -F(ab')2 단편 아마톡신 접합체 Rtx-F(ab')2 -30.0643 및 접합되지 않은 리툭시 맙을 사용하여 72시간 배양 후 BrdU 분석에서 CD20-양성 MEC-1 세포에 대한 세포독성 연구 결과이다.
도 7은 생체 내 결과 SCID 베이지 기반 마우스에서 P493-6 이종이식 모델(인간 Burkitt 림프종, B 세포 림프종)에서 리툭시맙-아마톡신 접합체 Rtx-30.0643을 사용한 효능 연구이다.
도 8은 리툭시맙-아마톡신 접합체 Rtx-30.0643(IgG 분자당 3.2개의 아마니틴 부분의 페이로드 포함)을 사용한 시노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis)에서 상당한 B 세포 고갈을 나타내는 탐색적 독성 연구 결과이다; 비접합 리툭시맙을 참조(대조군)로 사용하였다.
도 9는 리툭시맙-아마톡신 접합체 Rtx-30.0643(IgG 분자당 3.2개의 아마니틴 부분의 페이로드 포함)을 사용한 시노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis) 에 대한 탐색적 독성 연구 결과는 두 연구 그룹에서 체중에 유의미한 변화가 없음을 보여준다.
도 10은 리툭시맙 아마톡신 접합체 Rtx-DSC-30.0353, Rtx-DSC-30.0354 및 Rtx-DSC-30.0355 를 사용한 시험관 내 BrdU 분석에서 CD20 양성 MEC-1 세포에 대한 세포 독성 연구 결과이다.
도 11은 리툭시맙 아마톡신 접합체를 사용한 WST-1 분석에서 CD20-양성 MEC-1 세포 (A) Rtx-30.0643, Rtx-30.748, Rtx-30.1214, (B) Rtx-30.1215, Rtx-30.121730, Rtx-30.1216 및 (C) Rtx-30.1218 에 대한 세포 독성 연구 결과이다.
도 12는 리툭시맙 아마톡신 접합체 Rtx-30.1699 및 Rtx-30.2115 각각의 (A) SDS-PAGE 분석 및 (B) 웨스턴 블롯(항-아마니틴 항체를 사용하여 개발)의 결과이다.
도 13은 접합체 Rtx-30.1699(상단 패널) 및 Rtx-30.2115(하단 패널)의 SEC HPLC 분석이다.
도 14는 96시간 CTG 분석에서 리툭시맙-아마톡신 접합체 Rtx -30.1699 및 Rtx -30.2115 를 사용한 인간 만성 B 세포 백혈병 세포주 (A) MEC-1 및 (B) MEC-2 에 대한 세포 독성 연구 결과이다. 비접합 리툭시맙을 참조 화합물로 사용했다.
도 15는 96시간 CTG 분석에서 리툭시맙 아마톡신 접합체 Rtx-30.1699 및 Rtx-30.2115를 사용하여 접합되지 않은 α-아마니틴과 비교하여, (A) MEC-1-, (B) MEC-2-, (C) Raji-, (D) Nalm-6- 및 (E) Ramos 세포주에 대한 각각의 세포독성 연구 결과이다.
도 16은 96시간 CTG 분석에서 오비누투주맙 아마톡신 접합체 Obi-30.1699 및 Obi-30.2115를 사용하여 접합되지 않은 α-아마니틴과 비교하여, (A) MEC-1-, (B) MEC-2-, (C) Raji-, (D) Nalm-6-, (E) Ramos 세포주에 대한 각각의 세포 독성 연구 결과이다.
도 17은 Scid 마우스 Raji 이종이식 모델 시스템에서 생체내 항-CD20 아마톡신 접합체 Rtx-30.2115 및 Obi-30.2115 를 사용한 세포독성 연구 결과이다.
도 18은 RS9737 및 RS1316 세포에서 CD20의 발현이다. RNA-seq 분석(전체 전사체 산탄총 시퀀싱)의 데이터는 TPM(백만 분의 전사자)으로 표시된다.
도 19는 (A) 낮은 수준의 CD20을 발현하는 RS9737 세포 및 높은 수준의 CD20을 발현하는 RS1316 세포가 있는 리히터 증후군의 환자 유래 종양 이종이식 모델에서 생체내 항-CD20 아마톡신 접합체 Obi-30.1699 를 사용한 효능 연구 결과이다.
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 설명된 장치의 특정 구성 부품 또는 이러한 장치와 방법이 다를 수 있는 설명된 방법의 공정 단계에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시예를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 단수 및/또는 복수 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 또한 수치 값으로 구분되는 매개변수 범위가 제공되는 경우 범위는 이러한 제한 값을 포함하는 것으로 간주된다.
본 명세서에 개시된 실시예는 서로 관련되지 않는 개별적인 실시예로서 이해되도록 의도되지 않는다는 것이 또한 이해되어야 한다. 일 실시예와 함께 논의된 특징은 또한 여기에 도시된 다른 실시예와 관련하여 개시되도록 의도된다. 한 경우에, 특정 특징이 한 실시예에서는 개시되지 않고 다른 실시예에서는 개시된다면, 그것이 반드시 상기 특징이 상기 다른 실시예에서 개시되는 것을 의미하지 않는다는 것을 의미하지는 않는다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 당업자는 다른 실시예에 대해서도 상기 특징을 개시하는 것이 본 출원의 요지이지만, 명료성을 목적으로 하고 사양을 관리 가능한 양으로 유지하기 위해 이것이 수행되지 않았다는 것을 이해할 것이다.
또한, 여기에 언급된 선행 기술 문서의 내용은 참조로 포함된다. 이것은 특히 표준 또는 일상적인 방법을 공개하는 선행 기술 문서를 참조한다. 이 경우 참조에 의한 통합은 주로 충분한 공개를 제공하고 긴 반복을 피하기 위한 목적을 갖는다.
본 발명의 제1 측면에 따르면, 본 발명은 (i) 표적 결합 부분, (ii) 적어도 하나의 독소, 및 (iii) 선택적으로 상기 표적 결합 부분을 상기 표적 결합 부분과 연결하는 적어도 하나의 링커를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 적어도 하나의 독소, 여기서 상기 표적 결합 부분은 CD20에 결합하고, 상기 적어도 하나의 독소는 아마톡신이다.
Amanita phalloides 버섯에서 발견되는 8개의 아미노산으로 구성된 고리형 펩티드이다(도 1 참조). 아마톡신은 포유동물 세포의 DNA-의존성 RNA 중합효소 II를 특이적으로 억제하여 영향을 받은 세포의 전사 및 단백질 생합성을 억제한다. 세포에서 전사의 억제는 성장과 증식을 멈추게 한다. 공유 결합은 아니지만 아마니틴과 RNA-중합효소 II 사이의 복합체는 매우 단단하다(KD = 3 nM). 효소에서 아마니틴의 해리는 매우 느린 과정이므로 영향을 받은 세포의 회복이 거의 불가능하다. 전사 억제가 충분히 오래 지속되면 세포는 예정된 세포 사멸(아폽토시스)을 겪을 것이다.
본 발명의 맥락에서 용어 "아마톡신"은 Amanita 속으로부터 단리되고 Wieland, T. 및 Faulstich H.(Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem 5(1978) 185-260)에 기재된 바와 같은 8개의 아미노산으로 구성된 모든 고리형 펩티드, 추가로 그의 모든 화학적 유도체; 추가로 이의 모든 반합성 유사체; 추가로 천연 화합물(사이클릭, 8개 아미노산)의 마스터 구조에 따른 빌딩 블록으로부터 구축된 그의 모든 합성 유사체, 추가로 히드록실화 아미노산 대신에 비-히드록실화 아미노산을 함유하는 모든 합성 또는 반합성 유사체, 추가로 설폭사이드 모이어티가 설폰, 티오에테르 또는 황과 다른 원자로 대체된 모든 합성 또는 반합성 유사체이다, 예를 들어 아마니틴의 카르바날로그에서와 같은 탄소 원자이다.
본원에 사용된 바와 같이, 화합물의 "유도체"는 화합물과 유사한 화학 구조를 갖지만 화합물에 존재하지 않는 적어도 하나의 화학기를 함유하고/하거나 화합물에 존재한다. 유도체가 비교되는 화합물은 "모체(parent)" 화합물로 알려져 있다. 전형적으로, "유도체"는 하나 이상의 화학 반응 단계에서 모체 화합물로부터 생성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 화합물의 "유사체"는 구조적으로 관련되어 있지만 화합물과 동일하지 않으며 화합물의 적어도 하나의 활성을 나타낸다. 유사체가 비교되는 화합물은 "모체" 화합물로 알려져 있다. 상기 언급된 활성은 제한 없이 다음을 포함한다: 다른 화합물에 대한 결합 활성; 억제 활성, 예를 들어, 효소 억제 활성; 독성 효과; 활동 활성화, 예를 들어, 효소 활성화 활성. 유사체가 모체 화합물과 동일한 정도로 그러한 활성을 나타낼 필요는 없다. 화합물이 관련 활성을 적어도 1%(보다 바람직하게는 적어도 5%, 보다 바람직하게는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 50%) 정도로 나타내는 경우, 본 출원의 맥락 내에서 유사체로 간주된다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 "아마톡신의 유사체"는 α- 아마니틴, β- 아마니틴, γ- 아마니틴, ε- 아마니틴, 아마닌, 아마닌아마이드, 아마눌린, 및 아마눌린산은 적어도 1%(보다 바람직하게는 적어도 5%, 보다 바람직하게는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%)를 나타낸다. α- 아마니틴, β- 아마니틴, γ- 아마니틴, ε- 아마니틴, 아마닌, 아마닌아마이드, 아마눌린 및 아마눌린산 중 적어도 하나와 비교하여 포유동물 RNA 폴리머라제 II에 대한 억제 활성의 적어도 50%). 본 발명에 사용하기에 적합한 "아마톡신의 유사체"는 α- 아마니틴, β- 아마니틴, γ- 아마니틴, ε- 아마니틴, 아마닌, 아마닌아마이드, 아마눌린 또는 아마눌린산. 억제 활성은 50% 억제가 발생하는 농도(IC50 값)를 결정하여 측정할 수 있다. 포유동물 RNA 폴리머라제 II에 대한 억제 활성은 세포 증식에 대한 억제 활성을 측정함으로써 간접적으로 결정할 수 있다.
"반합성 유사체"는 천연 공급원(예: 식물 재료, 박테리아 배양, 곰팡이 배양 또는 세포 배양)의 화합물을 출발 물질로 사용하여 화학적 합성에 의해 얻은 유사체를 나타낸다. 전형적으로, 본 발명의 "반합성 유사체"는 Amanitaceae과의 버섯으로부터 분리된 화합물로부터 출발하여 합성되었다. 대조적으로, "합성 유사체"는 작은(일반적으로 석유화학) 빌딩 블록으로부터 소위 전체 합성에 의해 합성된 유사체를 의미한다. 일반적으로 이러한 전체 합성은 생물학적 과정의 도움 없이 수행된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드 및 이들의 유사체, 유도체 및 염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
기능적으로 아마톡신은 포유류 RNA 중합효소 II를 억제하는 펩티드 또는 뎁시펩티드로 정의된다. 바람직한 아마톡신은 하기에 정의된 바와 같은 링커 분자 또는 표적-결합 모이어티와 반응할 수 있는 작용기(예를 들어, 카르복실기, 아미노기, 히드록시기, 티올 또는 티올-포획기)를 갖는 것들이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "아마니틴"은 특히 위치 1의 아스파라긴산 또는 아스파라긴 잔기, 프롤린 잔기, 특히 위치 2의 히드록시프롤린 잔기, 이소류신, 히드록시이소류신 또는 디히드록시이소류신을 기반으로 하는 이환식 구조를 지칭한다. 위치 3에서 트립토판 또는 히드록시트립토판 잔기, 위치 5 및 7에서 글라이신 잔기, 위치 6에서 이소류신 잔기, 및 위치 8에서 시스테인 잔기, 특히 설폭사이드 또는 설폰 유도체로 산화되는 시스테인 유도체 (아마니틴의 번호 매기기 및 대표적인 예는 도 1 참조), 또한 이의 모든 화학적 유도체를 포함한다. 추가로 이의 모든 반합성 유사체; 추가로 천연 화합물(사이클릭, 8개 아미노산)의 마스터 구조에 따라 빌딩 블록으로부터 구축된 그의 모든 합성 유사체, 추가로 히드록실화 아미노산 대신 비히드록실화 아미노산을 함유하는 모든 합성 또는 반합성 유사체, 추가로 모든 합성 또는 반합성 유사체, 각각의 경우 이러한 유도체 또는 유사체는 포유동물 RNA 폴리머라제 II를 억제함으로써 기능적으로 활성이다.
본원에 사용된 용어 "표적-결합 모이어티"는 표적 분자 또는 표적 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 본 출원의 맥락에서 바람직한 표적-결합 모이어티는 (i) 항체 또는 그의 항원-결합 단편; (ii) 항체-유사 단백질; 및 (iii) 핵산 앱타머이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 "표적 결합 모이어티"는 전형적으로 40,000 Da(40 kDa) 이상의 분자량을 갖는다.
본 출원의 맥락에서 "링커"는 RNA 폴리머라제 II와 상호작용하는 아마톡신의 능력을 달리 감소시킬 수 있는 2개의 성분, 예를 들어 표적 결합 부분과 아마톡신 사이의 입체 간섭을 완화하기 위해, 사이의 거리를 증가시키는 분자를 지칭한다. 링커는 표적 결합 모이어티에 의해 표적화되는 세포에서 특이적으로 아마톡신의 방출을 촉진할 수 있기 때문에 다른 목적을 제공할 수 있다. 링커, 바람직하게는 한쪽의 링커와 아마톡신 사이의 결합 및 다른 쪽의 링커와 표적 결합 모이어티 또는 항체 사이의 결합은 세포 내부(예를 들어, 암세포), 특히 표적 세포 내부에서, 절단될 수 있는 동안 세포 외부(예를 들어, 혈액)의 생리학적 조건 하에서 안정한 것이 바람직하다. 이러한 선택적 안정성을 제공하기 위해, 링커는 바람직하게는 pH 민감성 또는 프로테아제 민감성 작용기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 링커를 표적 결합 모이어티에 연결하는 결합은 선택적 안정성을 제공할 수 있다. 바람직하게는 링커는 적어도 1, 바람직하게는 1 내지 30개의 원자 길이(예를 들어 , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 원자)의 길이를 가지며, 여기서 링커의 한쪽은 아마톡신과 반응하고 다른 쪽은 표적-결합 부분과 반응한다. 본 발명의 맥락에서, 링커는 바람직하게는 C1-30 -알킬, C1-30 -헤테로 알킬, C2-30 - 알케닐, C2-30 - 헤테로 알케닐, C 2-30 -알키닐, C2-30 -헤테로알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 또는 헤테로아르알킬 기(임의로 치환됨). 링커는 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 이황화물, 탄화수소 모이어티 등과 같은 하나 이상의 구조적 요소를 함유할 수 있다. 링커는 또한 이러한 구조적 요소 중 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 구조적 요소 각각은 링커에 1회 이상, 예를 들어 두 번, 세 번, 네 번, 다섯 번, 여섯 번 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서 링커는 이황화 결합을 포함할 수 있다. 링커는 단일 단계 또는 2개 이상의 후속 단계에서 아마톡신 및 표적 결합 모이어티에 부착되어야 하는 것으로 이해된다. 이를 위해 링커는 바람직하게는 근위 및 원위 말단에 2개의 기를 보유할 것이며, 이는 (i) 기, 바람직하게는 아마톡신 또는 표적 결합-펩티드 상의 활성화된 기에 공유 결합을 형성할 수 있거나 (ii) 이는 아마톡신의 그룹과 공유 결합을 형성하도록 활성화되거나 활성화될 수 있다. 따라서, 링커가 존재하는 경우, 화학 그룹은 링커의 말단 및 근위 말단에 있는 것이 바람직하며, 이는 커플링 반응, 예를 들어, 에스테르, 에테르, 우레탄, 펩티드 결합 등의 결과이다. "링커"의 존재는 선택적이며, 즉 독소는 표적-결합 부분 독소 접합체의 일부 실시양태에서 표적-결합 부분의 잔기에 직접 연결될 수 있다.
본 발명은 추가로 CD20에 결합하는 표적 결합 부분, 적어도 하나의 아마톡신 및 임의로 링커를 포함하는 접합체에 관한 것으로, 여기서 상기 표적 결합 부분은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
(i) 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체,
(ii) 그의 항원 결합 단편, 바람직하게는 가변 도메인(Fv), Fab 단편 또는 F(ab)2 단편,
(iii) 이의 항원 결합 유도체, 바람직하게는 단쇄 Fv(scFv), 및
(iv) 항체-유사 단백질,
각각은 CD20에 결합한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편 또는 이로부터 유래된 cDNA에 의해 암호화된 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 단백질을 지칭할 것이다. 상기 면역글로불린 유전자는 경쇄 카파, 람다 및 중쇄 알파, 델타, 입실론, 감마 및 뮤 불변 영역 유전자 뿐만 아니라 많은 상이한 가변 영역 유전자를 포함한다.
기본 면역글로불린(항체) 구조 단위는 일반적으로 두 개의 동일한 폴리펩타이드 사슬 쌍인, 경쇄(L, 분자량 약 25kDa) 및 중쇄(H, 분자량 약 50 -70kDa)으로 구성된 사량체이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역( VH 또는 VH로 약칭) 및 중쇄 불변 영역(CH 또는 CH로 약칭)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL 또는 VL로 약칭) 및 경쇄 불변 영역(CL 또는 CL로 약칭)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더 보존된 영역이 산재된 상보성 결정 영역(CDR)이라고도 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL 영역은 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개 FR로 이루어진다. 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 항원과 상호작용하는 결합도메인을 형성한다.
CDR은 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 결합에 가장 중요하다. 항원 결합에 필요한 3차원 구조가 유지된다면 FR은 다른 서열로 대체될 수 있다. 구조물의 구조적 변화는 대부분 항원에 대한 충분한 결합의 손실을 초래한다.
(모노클로날) 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어는 그의 천연 형태로 CD20 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 상기 CD20 항원은 포유동물, 비영장류, 영장류, 특히 인간 CD20 항원일 수 있다. "CD20"은 본 명세서에서 서열번호 6에 따른 아미노산 서열, 또는 서열번호 6과 적어도 90%, 92.5%, 95%, 또는 적어도 97% 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된 단백질을 의미한다. 항체의 항원 결합 부분의 예로는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편, F(ab')2 단편, 힌지 영역의 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, 및 VH 도메인 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)으로 구성된 dAb 단편이 있다.
본 발명에 따른 서열 동일성은 예를 들어, 각각의 참조 서열(소위 "전역 정렬")과 비교되는 각 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정되고, 이는 동일하거나 유사한 길이의 시퀀스에 특히 적합하며, 또는 더 짧고 정의된 길이(소위 "로컬 정렬")에 걸쳐 결정되고, 이는 길이가 다른 시퀀스에 더 적합하다. 상기 문맥에서, 질의 아미노산 서열에 대해 적어도, 예를 들어, 95%의 "서열 동일성"을 갖는 아미노산 서열은 대상 아미노산 서열의 서열이 질의 서열과 동일한 것을 의미하는 것으로 의도된다 단, 대상 아미노산 서열은 질의 아미노산 서열의 각 100개 아미노산당 최대 5개의 아미노산 변경을 포함할 수 있다. 다시 말해서, 질의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성의 서열을 갖는 아미노산 서열을 얻기 위해, 대상 서열에서 아미노산 잔기의 최대 5%(100개 중 5개)가 대상 서열에서 다른 아미노산으로 삽입 또는 치환되거나 결실될 수 있다. 2개 이상의 서열의 동일성 및 상동성을 비교하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 두 시퀀스가 동일한 비율은 예를 들어 수학적 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다. 사용될 수 있는 수학적 알고리즘의 선호되지만 이에 제한되지 않는 예는 Karlin et al.(1993), PNAS USA, 90:5873-5877의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 프로그램의 BLAST 패밀리에 통합되어 있다(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410 또는 Altschul et al.(1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402 참조), NCBI 홈페이지(월드 와이드 웹 사이트 ncbi.nlm.nih.gov) 및 FASTA(Pearson(1990), Methods Enzymol. 83, 63-98; Pearson and Lipman(1988), Proc. Natl. Acad.Sci.US A 85, 2444-2448.)를 통해 액세스 할 수 있다. 이러한 프로그램은 다른 시퀀스와 어느 정도 동일한 시퀀스를 식별할 수 있다. 또한, 위스콘신 서열 분석 패키지(Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Res., 387-395; Womble Methods Mol Biol. 2000;132:3-22)에서 사용 가능한 프로그램, 예를 들어 프로그램 BESTFIT 및 GAP를 사용하여 2개의 폴리펩타이드 서열 사이의 % 동일성을 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 항체, 또는 항체 단편 또는 항체 유도체는 모노클로날 항체일 수 있다. 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 이소타입일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단클론 항체(mAb)"는 균질한 항체 집단, 즉 전체 면역글로불린, 또는 이의 단편 또는 유도체로 이루어진 균질한 집단을 갖는 항체 조성물을 지칭할 것이다. 특히 바람직하게는, 이러한 항체는 IgG, IgD, IgE, IgA 및/또는 IgM, 또는 이들의 단편 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 모노클로날 항체는 예를 들어 문헌 Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있고; 유로 J. Immunol. 6:511 (1976), 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있고, 또는 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "단편" 또는 "항체 단편"은 표적 결합 능력을 보유하는 이러한 항체의 단편, 예를 들어 CDR(상보성 결정 영역), 초가변 영역, 가변 도메인(Fv), IgG 중쇄(VH, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역으로 구성), IgG 경쇄(VL 및 CL 영역으로 구성), 및/또는 Fab 및/또는 F(ab)2 을 지칭할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "유도체"는 구조적으로 상이하지만 여전히 일반적인 항체 개념, 예를 들어 scFv, Fab 및/또는 F(ab)2 와 일부 구조적 관계를 갖는 단백질 작제물뿐만 아니라 이중, 삼중 또는 더 높은 특이적 항체 작제물을 지칭할 것이다. 이 모든 항목은 아래에 설명되어 있다.
당업자에게 알려진 다른 항체 유도체는 디아바디(Diabodies), 낙타과(Camelid) 항체, 도메인 항체, scFv로 구성된 2개의 사슬을 갖는 2가 동종이량체, IgA(J 사슬 및 분비 성분에 의해 연결된 2개의 IgG 구조), 상어 항체, 신세계영장류 프레임워크 및 비신세계 영장류 CDR로 구성된 항체, CH3+VL+VH를 포함하는 이량체화된 구축물, CDR을 포함하는 기타 스캐폴드 단백질 형식, 및 항체 접합체(예를 들어, 약물, 독소, 사이토카인, 앱타머, 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)과 같은 핵산에 연결된 항체 또는 이의 단편 또는 유도체, 치료용 폴리펩티드, 방사성 동위원소 또는 표지)를 포함한다. 상기 스캐폴드 단백질 형식은 예를 들어, 안키린 및 아필린 단백질 등과 같은 항체-유사 단백질을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체-유사 단백질"은 표적 분자에 특이적으로 결합하도록 (예를 들어, Ig 루프의 돌연변이유발에 의해) 조작된 단백질을 지칭한다. 전형적으로, 이러한 항체-유사 단백질은 단백질 스캐폴드에 양 말단에 부착된 적어도 하나의 가변 펩티드 루프를 포함한다. 이러한 이중 구조적 제약은 항체 유사 단백질의 결합 친화도를 항체와 유사한 수준으로 크게 증가시킨다. 가변 펩타이드 루프의 길이는 일반적으로 10~20개의 아미노산으로 구성된다. 스캐폴드 단백질은 용해도 특성이 좋은 모든 단백질일 수 있다. 바람직하게는, 스캐폴드 단백질은 작은 구형 단백질이다. 항체-유사 단백질은 제한 없이 어피바디, 안티칼린, 및 설계된 안키린 반복 단백질을 포함한다(Binz et al ., 2005). 항체 유사 단백질은 돌연변이체의 큰 라이브러리에서, 예를 들어 대형 파지 디스플레이 라이브러리에서 패닝하여, 파생될 수 있으며, 일반 항체와 유사하게 분리할 수 있다. 또한, 항체-유사 결합 단백질은 구형 단백질에서 표면 노출된 잔기의 조합 돌연변이 유발에 의해 수득될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "Fab"는 항원 결합 영역을 포함하는 IgG 단편에 관한 것으로, 상기 단편은 항체의 각각의 중쇄 및 경쇄로부터의 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인으로 구성된다.
본원에 사용된 용어 "F(ab)2 "는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 2개의 Fab 단편으로 구성된 IgG 단편에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "scFv"는 짧은 링커와 함께 연결된 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 융합인 단일쇄 가변 단편에 관한 것으로, 일반적으로 세린(S) 및/또는 글라이신(G) 잔기를 포함한다. 이 키메라 분자는 불변 영역을 제거하고 링커 펩타이드를 도입함에도 불구하고 원래 면역글로불린의 특이성을 유지한다.
변형된 항체 형식은 예를 들어 이중특이성 또는 삼중특이성 항체 작제물, 항체 기반 융합 단백질, 면역접합체 등이다.
IgG, scFv, Fab 및/또는 F(ab)2 는 당업자에게 잘 알려진 항체 형식이다. 관련 활성화 기술은 해당 텍스트북으로부터 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 항체, 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 항원 결합 유도체는 각각 이의 뮤린, 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항원 결합 유도체이다.
마우스에서 유래한 단클론항체(mAb)는 항체를 유발할 수 있는 다른 종의 단백질을 포함하고 있기 때문에 원치 않는 면역학적 부작용을 일으킬 수 있다. 이 문제를 극복하기 위해 항체 인간화 및 성숙 방법이 인간에게 적용될 때 최소한의 면역원성을 가진 항체 분자를 생성하는 동시에 이상적으로는 비인간 모항체의 특이성과 친화성을 유지하도록 하도록 설계되었다(검토는 Almagro and Fransson 2008 참조). 이러한 방법을 사용하여, 예를 들어, 마우스 mAb의 프레임워크 영역은 상응하는 인간 프레임워크 영역으로 대체된다(소위 CDR 이식). WO200907861은 재조합 DNA 기술에 의해 인간 불변 영역에 비인간 항체의 CDR 영역을 연결함으로써 인간화 형태의 마우스 항체를 생성하는 것을 개시하고 있다. 의학 연구 협의회(Medical Research Council)의 US6548640은 CDR 이식 기술을 기술하고 있으며, 셀텍(Celltech)의 US5859205는 인간화 항체의 생산을 기술하고 있다.
본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는 항체, 그의 단편 또는 유도체에 관한 것으로, 여기서 항체의 불변 영역 및/또는 프레임워크 영역의 적어도 일부, 및 임의로 CDR 영역의 일부가, 항체는 인간 면역글로불린 서열에서 유래하거나 그에 맞게 조정된다.
본원에 개시된 항체, 항체 단편 또는 그의 항체 유도체는 인간화 서열, 특히 적절한 리간드 친화성을 유지하는 바람직한 VH- 및 VL-기반 항원-결합 영역을 포함할 수 있다. 상기 인간화 서열을 얻기 위한 아미노산 서열 변형은 CDR 영역 및/또는 원래 항체의 프레임워크 영역 및/또는 항체 불변 영역 서열에서 발생할 수 있다.
상기 항체, 또는 이의 항체 단편 또는 항체 유도체는 글리코실화될 수 있다. 글리 칸은 중쇄의 아스파라긴 297에서 N-연결된 올리고당 사슬일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 단편 또는 유도체는 본 발명에 따른 항체에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포의 형질감염에 의해 생성될 수 있다. 발현 벡터 또는 재조합 플라스미드는 예를 들어, CMV 프로모터와 같은 프로모터 및 인핸서 서열을 포함하는 적합한 조절 유전 요소의 제어하에 코딩 항체 서열을 배치함으로써 생산된다. 중쇄 및 경쇄 서열은 동시 형질감염된 개별 발현 벡터 또는 이중 발현 벡터로부터 발현될 수 있다. 상기 형질감염은 일시적 형질감염 또는 안정 형질감염일 수 있다. 형질감염된 세포는 후속적으로 배양되어 형질감염된 항체 작제물을 생성한다. 안정한 형질감염이 수행될 때, 적절하게 연관된 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체를 분비하는 안정한 클론은 적절한 검정, 예를 들어 ELISA와 같은 스크리닝에 의해 선택되고, 서브클로닝되고, 향후 생산을 위해 증식된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 그의 항원 결합 유도체는 각각 리툭시맙, 오비누투주맙, 이브리투모맙, 토시투모맙, 오파투무맙 , 오크렐리주맙 및 유블리툭시맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 여기에 사용된 국제 비독점 명칭(INN)은 42 USC §262 하위섹션(subsection) (i) 또는 기타 관할권의 동등한 규정에 따라, 또한 위에 기술된 바와 같은 오리지네이터 항체와 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열 및/또는 글리코실화 패턴을 갖는 모든 바이오시밀러 항체를 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 일부 실시양태에 따르면, 본원에 개시된 항체는 EU 넘버링 시스템에 따라 중쇄 118Cys, 중쇄 239Cys, 또는 중쇄 265Cys를 포함하도록 유전적으로 조작되고(예를 들어, Proc. Natl. Acad. Sci USA 1969, 63, 78-85 참조), 바람직하게는 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys이고, 존재하는 경우 상기 링커 또는 상기 아마톡신은 상기 중쇄 118Cys 또는 상기 중쇄 239Cys, 또는 중쇄 265Cys 잔기 각각을 통해 상기 항체에 연결된다. 예를 들어, WO2006/034488 A2는 시스테인-조작된 항체의 상응하는 제조 방법을 개시하고 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 항체는 EU 넘버링 시스템에 따라 중쇄 265Cys를 포함하도록 유전적으로 조작된 리툭시맙이다.
본원에 사용된 용어 "유전적으로 조작된" 또는 "유전적 조작"은 주어진 아미노산 서열 또는 이의 일부의 변형 또는 유전자 기술 방법에 의한 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 복귀, 또는 이들의 임의의 조합의 의미에서 천연 폴리펩타이드 또는 단백질에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "아미노산 치환"은 하나 이상의 아미노산이 동일한 수의 상이한 아미노산으로 대체되어 상이한 아미노산 서열을 함유하는 단백질을 생성하는 단백질의 아미노산 서열의 변형에 관한 것이다. 원래 단백질보다 보존적 아미노산 치환은 유사한 크기, 전하, 극성 및/또는 형태로 인해 단백질의 구조 및 기능에 유의미한 영향을 미치지 않는 치환과 관련된 것으로 이해된다. 이러한 의미에서 보존적 아미노산 그룹은, 예를 들어 비극성 아미노산 Gly, Ala, Val, Ile 및 Leu; 방향족 아미노산 Phe, Trp 및 Tyr; 양전하를 띤 아미노산 Lys, Arg 및 His; 음으로 하전된 아미노산 Asp 및 Glu를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 존재하는 경우 상기 링커, 또는 상기 아마톡신, 또는 상기 링커에 커플링된 상기 아마톡신은 상기 항체의 임의의 자연 발생 Cys 잔기를 통해, 바람직하게는 이황화 결합을 통해, 상기 항체에 연결된다. 본원에 사용된 용어 "자연(천연) 발생 Cys 잔기"는 리툭시맙과 같은 천연 항체에 존재하는 시스테인 잔기를 지칭하며, 예를 들어 리툭시맙은 항체의 경쇄 및 중쇄에서 쇄내 이황화 결합을 형성하거나 중쇄와 경쇄 사이 및/또는 항체의 중쇄 사이에 사슬간 이황화 결합을 형성하며, 예를 들면 IgG 면역글로불린의 힌지 영역에 있는 이황화 결합과 같은 것이다. 본원에 개시된 바와 같이 상기 링커 또는 상기 아마톡신 또는 상기 링커에 커플링된 상기 아마톡신을 연결 또는 커플링하기 위한 바람직한 천연 발생 Cys 잔기는 천연 IgG 면역글로불린의 힌지 영역에서 중쇄 둘 모두를 연결하는 사슬간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 아마톡신, 링커, 또는 링커에 커플링된 아마톡신은 예를 들어 사슬간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 통해 항체에 커플링된다. 천연 항체에서 사슬간 이황화 결합에 기여하는 시스테인 잔기에 대한 커플링은 예를 들어 mAb 6:1, 46-53(2014) 또는 임상 암 연구(Clinical Cancer Research), Vol. 10, 7063-7070, 2004년 10월 15일)에 개시된 방법에 따라 수행할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항체는 리툭시맙이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 접합체의 항체, 또는 그의 항체 단편 또는 항체 유도체는 CD20 분자의 세포외 도메인에 결합한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 CD20의 세포외 도메인에 결합하는 상기 기재된 바와 같은 항체, 또는 그의 항체 단편 또는 항체 유도체를 포함하는 접합체에 관한 것이다.
또한, 본 발명에 따른 접합체는 10x10-9 M, 9x10-9 M, 8x10-9 M, 7x10-9 M, 6x10-9 M, 5x10-9 M, 4x10-9 M, 3x10-9 M, 2x10-9 M, 바람직하게는 10x10-10 M, 9x10-10 M, 8x10-10 M, 7x10-10 M, 6x10-10 M, 5x10-10 M, 4x10-10 M, 3x10-10 M , 2x10-10M , 보다 바람직하게는 10x10-11M, 9x10-11M, 8x10-11M, 7x10-11M, 6x10-11M, 5x10-11M, 4x10-11M, 3x10-11M, 2x10-11M 또는 1x10 -11M 보다 우수한 IC50의 세포독성 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 기재된 바와 같은 상기 접합체는 (i) 6'-데옥시 위치를 갖는 아미노산 4 및 (ii) S-데옥시 위치를 갖는 아미노산 8을 포함하는 아마톡신을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 기재된 바와 같은 상기 접합체는 링커를 포함하고, 여기서 상기 링커는 절단 불가능한 또는 절단가능한 링커이다.
상기 절단가능한 링커는 효소적으로 절단가능한 링커, 바람직하게는 프로테아제-절단가능한 링커, 및 화학적으로 절단가능한 링커, 바람직하게는 이황화 가교를 포함하는 링커로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
"절단가능한 링커"는 적어도 하나의 절단 부위를 포함하는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 용어 "절단 부위"는 특정 조건 하에 정의된 위치에서 특정 절단에 민감한 모이어티를 지칭할 것이다. 상기 조건은 예를 들어 특정 효소 또는 특정 신체 또는 세포 구획의 환원 환경이다.
본 발명의 구현예에 따르면, 절단 부위는 2개 이상의 아미노산을 포함하는 효소적으로 절단가능한 모이어티이다. 바람직하게는, 상기 효소적으로 절단 가능한 모이어티는 발린-알라닌(Val-Ala), 발린-시트룰린(Val-Cit), 발린-라이신(Val-Lys), 발린-아르기닌(Val-Arg) 디펩티드, 페닐알라닌-라이신- 글라이신-프롤린-류신-글라이신(Phe Lys Gly Pro Leu Gly) 또는 알라닌-알라닌-프롤린-발린(Ala Ala Pro Val) 펩티드, 또는 β- 글루쿠로나이드 또는 β-갈락토사이드를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 절단 부위는 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 및 아스파르트산 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프로테아제에 의해 절단될 수 있다.
티올 프로테아제로도 알려진 시스테인 프로테아제는 촉매 트라이어드 또는 다이어드에서 친핵성 시스테인 티올을 포함하는 공통 촉매 메커니즘을 공유하는 프로테아제이다.
메탈로프로테아제는 촉매 메커니즘이 금속을 포함하는 프로테아제이다. 대부분의 메탈로프로테아제에는 아연이 필요하지만 일부는 코발트를 사용한다. 금속 이온은 3개의 리간드를 통해 단백질에 배위된다. 금속 이온을 배위하는 리간드는 히스티딘, 글루타메이트, 아스파르테이트, 라이신 및 아르기닌에 따라 다를 수 있다. 네 번째 배위 위치는 불안정한 물 분자가 차지한다.
세린 프로테아제는 단백질의 펩티드 결합을 절단하는 효소이다. 세린은 효소의 활성 부위에서 친핵성 아미노산으로 작용한다. 세린 프로테아제는 구조에 따라 키모트립신 유사(트립신 유사) 또는 서브틸라이신 유사의 두 가지 광범위한 범주로 나뉜다.
트레오닌 프로테아제는 활성 부위 내에 트레오닌(Thr) 잔기를 보유하는 단백질 분해 효소 계열이다. 이 부류의 효소의 원형 구성원은 프로테아좀의 촉매 서브유닛이지만, 아실트랜스퍼라제는 동일한 활성 부위 기하학 및 메커니즘을 수렴적으로 진화시켰다.
아스파르트산 프로테아제는 펩타이드 기질의 촉매 작용을 위해 하나 이상의 아스파르테이트 잔기에 결합된 활성화된 물 분자를 사용하는 촉매 유형의 프로테아제 효소이다. 일반적으로 활성 부위에 2개의 고도로 보존된 아스파르트산염이 있으며 산성 pH에서 최적으로 활성화한다. 거의 모든 알려진 아스파틸 프로테아제는 펩스타틴에 의해 억제된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 절단가능한 부위는 카텝신 A 또는 B, 기질 금속단백분해효소(MMP), 엘라스타제, β-글루쿠로니다제 및 β-갈락토시다제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 제제에 의해 절단가능하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 절단 부위는 이황화 결합이고 특정 절단은 환원성 환경, 예를 들어, 산성 pH 조건과 같은 세포내 환원성 환경에 의해 수행된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 기재된 바와 같은 상기 접합체에서, 존재하는 경우 상기 링커, 또는 상기 표적 결합 부분은 (i) 아마톡신 아미노산 1 의 γC-원자, 또는 아마톡신 아미노산 3 의 δC-원자, 또는 (iii) 아마톡신 아미노산 4의 6'-C-원자를 통해 아마톡신에 연결된다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 접합체는 링커-아마톡신 부분으로서 각각 하기 화학식 I 내지 XII의 화합물 중 임의의 것을 포함한다:
Figure pct00001
(Ⅰ)
Figure pct00002
(Ⅱ)
Figure pct00003
(Ⅲ)
Figure pct00004
(IV)
Figure pct00005
(V)
Figure pct00006
(VI)
Figure pct00007
(VII)
Figure pct00008
(VIII)
Figure pct00009
(IX)
Figure pct00010
(X)
Figure pct00011
(XI)
Figure pct00012
(XII).
또한, 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 접합체는 화학식 XIII 내지 XXII 중 어느 하나에 따른 아마톡신 링커 부분에 접합된 표적 결합 부분으로서 항체를 포함한다.
Figure pct00013
(XIII)
Figure pct00014
(XIV)
Figure pct00015
(XV)
Figure pct00016
(XVI)
Figure pct00017
(XVII)
Figure pct00018
(XVIII)
Figure pct00019
(XIX)
Figure pct00020
(XX)
Figure pct00021
(XXI)
Figure pct00022
(XXII)
여기서 아마톡신 링커 모이어티는 상기 항체의 천연 발생 라이신 잔기의 ε-아미노기에 커플링되고, 여기서 n은 바람직하게는 1 내지 7이다 .
또한, 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 접합체는 화학식 XXIII 및 XXIV 중 어느 하나에 따른 아마톡신 링커 부분에 접합된 표적 결합 부분으로서 항체를 포함한다.
Figure pct00023
(XXIII)
Figure pct00024
(XXIV)
여기서 아마톡신 링커 모이어티는 항체의 시스테인 잔기의 티올기에 커플링되고, 여기서 n은 바람직하게는 1 내지 7이다.
본 발명의 훨씬 더 특히 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 접합체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) 화학식 XXV에 따른 리툭시맙의, 예를 들어 리툭시맙의 사슬간 이황화 결합에 기여하는 하나 이상의 Cys 잔기, 하나 이상의 자연 발생 Cys 잔기에 대한 티오에테르 연결을 통해 화학식 XI의 하나 이상의 아마톡신-링커 부분에 접합된 표적 결합 부분으로서 항체 리툭시맙을 포함하는 접합체,
Figure pct00025
(XXV)
(ii)화학식 XXVI에 따라, 상기 유전자 조작된 리툭시맙의 상기 중쇄 265Cys 잔기에 대한 티오에테르 연결을 통해, 화학식 XI의 아마톡신 링커 부분에 접합된 표적 결합 부분으로서 EU 넘버링 시스템에 따라 중쇄 265Cys를 포함하도록 유전적으로 조작된 항체 리툭시맙을 포함하는 접합체,
Figure pct00026
(XXVI)
(iii) 화학식 XXVII에 따라, 티오에테르 연결을 통해, 또는 리툭시맙의 하나 이상의 자연 발생 Cys 잔기에, 예를 들어 리툭시맙의 사슬간 이황화 결합에 기여하는 하나 이상의 Cys 잔기, 화학식 XII의 하나 이상의 아마톡신-링커 부분에 접합된 표적 결합 부분으로서 항체 리툭시맙을 포함하는 접합체,
Figure pct00027
(XXVII),
(iv) 화학식 XXVIII에 따라, 상기 유전자 조작된 리툭시맙의 상기 중쇄 265Cys 잔기에 대한 티오에테르 연결을 통해, 화학식 XII의 아마톡신 링커 부분에 접합된 표적 결합 부분으로서 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys를 포함하도록 유전적으로 조작된 항체 리툭시맙을 포함하는 접합체
Figure pct00028
(XXVIII),
n은 (i), (iii)에 대해 1 내지 7이고, (ii), (iv)에 대해 n은 1 내지 2이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 기재된 바와 같은 상기 접합체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
상기 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 완충제, 계면활성제, 희석제, 담체, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡착제, 및/또는 보존제를 포함할 수 있다.
수성 형태에서, 상기 약제학적 제형은 투여 준비가 될 수 있는 반면, 동결건조된 형태에서 상기 제형은 투여 전에 액체 형태로 전환될 수 있고, 예를 들어, 벤질 알코올, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C, 레티닐 팔미테이트 및 셀레늄과 같은 항산화제와 같은 방부제를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 주사용수의 첨가에 의해 아미노산 시스테인 및 메티오닌, 구연산 및 구연산 나트륨, 파라벤 메틸 파라벤 및 프로필 파라벤과 같은 합성 방부제가 있다.
상기 약제학적 제형은 예를 들어 아미노산, 당 폴리올, 이당류 및/또는 다당류일 수 있는 하나 이상의 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적 제형은 하나 이상의 계면활성제, 하나 이상의 등장화제, 및/또는 하나 이상의 금속 이온 킬레이트제, 및/또는 하나 이상의 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 제형은 적어도 정맥내, 근육내 또는 피하 투여에 적합할 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 상기 접합체는 특정 기간에 걸쳐 생물학적 활성제의 지속 방출을 허용하는 데포(depot) 제형으로 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 이전 양태에 따른 제형을 포함하는 사전충전된 주사기 또는 펜, 바이알 또는 주입 백과 같은 1차 포장이 제공된다.
사전충전된 주사기 또는 펜은 동결건조된 형태(그러면 가용화되어야 하며, 예를 들어, 투여 전에 주사용수와 함께) 또는 수성 형태의 제형을 함유할 수 있다. 상기 주사기 또는 펜은 종종 1회용 일회용 물품이고 0.1 내지 20 ml의 부피를 가질 수 있다. 그러나, 주사기 또는 펜은 다회용 또는 다회 용량 주사기 또는 펜일 수도 있다.
상기 바이알은 또한 동결건조된 형태 또는 수성 형태의 제형을 함유할 수 있고 단일 또는 다중 사용 장치로서 작용할 수 있다. 다중 사용 장치로서, 상기 바이알은 더 큰 부피를 가질 수 있다. 상기 주입 백은 일반적으로 수성 형태의 제제를 함유하고 20 내지 5000 ml의 부피를 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 B 림프구-관련 악성종양 또는 B 세포-매개 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위해 기재된 바와 같은 상기 접합체 또는 제약 조성물에 관한 것으로, 특히 비호지킨 림프종, 여포성 림프종, 미만성 거대 B 세포 비호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 리히터 증후군, 류마티스 관절염, 다발혈관염을 동반한 육아종증, 현미경적 다발혈관염 및 심상 천포창의 치료에 사용한다.
본 발명은 B 림프구 관련 악성종양 또는 B 세포 매개 자가면역 질환의 치료를 위한 상기 접합체 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것으로, 특히 비호지킨 림프종, 여포성 림프종, 미만성 거대 B 세포 비호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 리히터 증후군, 류마티스 관절염, 다발혈관염을 동반한 육아종증 및 현미경적 다발혈관염 및 심상 천포창의 치료에 사용된다.
리히터 증후군은 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종이 공격성 림프종, 가장 일반적으로 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL)으로의 변형으로 정의된다. CLL 환자의 약 2-10%에서 발생하는 리히터 증후군은 매우 공격적이며 종종 치료에 불응하며 약 8-14개월의 나쁜 결과를 보인다. 사례의 약 80%는 기본 CLL과 클론 관련이 있는 반면, 나머지 20%의 환자는 클론 관련이 없는 DLBCL을 가지고 있으며 새로운 DLBCL과 유사한 더 나은 예후를 보인다(Vaisitti et al 2018). 생식계열 유전적 특징, 임상적 특징, CLL B 세포의 생물학적 및 체세포 유전적 특징, 특정 CLL 요법의 조합은 리히터 증후군의 더 높은 위험과 관련이 있다.
본 발명은 또한 유효량의 상기 접합체 또는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 , B 림프구 관련 악성종양 또는 B 세포 매개 자가면역 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 B 림프구 관련 악성종양 또는 B 세포 매개 자가면역 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법은 상기 환자에게 상기 환자에게 약 0.1mg/kg 체중 내지 약 25mg/kg 체중을 투여하는 것을 포함한다 . 접합체 또는 제약 조성물을 상기 환자에게 제공하고, 이로써 상기 접합체 또는 제약 조성물은 상기 환자에게 1회 이상 투여된다. 상기 접합체 또는 약제학적 조성물의 바람직한 투여 경로는 예를 들어 치료 유효량의 정맥내(iv) 투여, 또는 피하(sc) 투여를 포함할 수 있다.
시퀀스
표 1 : 본 발명의 바람직한 항체 서열인 아미노산 서열
SEQ ID No. Sequence Description
SEQ ID No. 1 QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVS
YIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVR
FSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQW
TSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS
DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD
NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL
SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR
GEC		 Rituximab light chain
SEQ ID No. 2 QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSY
NQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSED
SAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVS
AASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV
KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS
SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP
SNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD
ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K		 Rituximab heavy chain
SEQ ID No. 3 QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSY
NQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSED
SAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVS
AASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV
KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS
SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP
SNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVCV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD
ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K		 Rituximab 265Cys heavy chain
SEQ ID No. 4 QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSY
NQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSED
SAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVS
ACSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV
KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS
SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP
SNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD
ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K		 Rituximab 118Cys heavy chain
SEQ ID No. 5 QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSY
NQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSED
SAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVS
AASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV
KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS
SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP
SNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD
ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K		 Rituximab 239Cys heavy chain
SEQ ID NO: 6 MTTPRNSVNGTFPAEPMKGPIAMQSGPKPLFRRMSSLVGPTQSFFMRESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLWGGIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSIMDILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNIVLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIEIIPIQEEEEEETETNFPEPPQDQESSPIENDSSP human CD20
실시예
본 발명이 도면 및 전술한 설명에서 상세하게 예시되고 설명되었지만, 그러한 예시 및 설명은 예시적이거나 예시적인 것으로 간주되어야 하며 제한적이지 않아야 하며; 본 발명은 개시된 실시예로 제한되지 않는다. 개시된 실시예에 대한 다른 변형은 도면, 개시내용 및 첨부된 청구범위의 연구로부터 청구된 발명을 실시함에 있어 당업자에 의해 이해되고 영향을 받을 수 있다. 청구범위에서 "포함하는"이라는 단어는 다른 요소나 단계를 배제하지 않으며, 부정관사 "a" 또는 "an"은 복수를 배제하지 않는다. 특정 조치가 서로 다른 종속항에 인용되어 있다는 사실이 이러한 조치의 조합이 유리하게 사용될 수 없다는 것을 나타내지는 않는다. 청구범위의 참조 부호는 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 개시된 모든 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 표시되며; 본원에 개시된 모든 핵산 서열은 5'->3'으로 표시된다.
실시예 1: 림프종 세포주에 대한 리툭시맙의 결합
CD20-양성 인간 만성 B-세포 백혈병 세포주 MEC-1 및 MEC-2 뿐만 아니라 인간 버킷 림프종 세포주 Raji에 대한 항-CD20 단일클론 항체 리툭시맙의 결합을 FACS 분석에 의해 시험하였다. 리툭시맙은 CD20-양성 MEC-1, MEC-2 및 Raji 세포주에 강력하게 결합하는 것으로 나타났다(도 2).
실시예 2: 절단 불가능한 링커를 갖는 항-CD20 아마톡신 접합체
예 2.1: 절단 불가능한 링커를 갖는 항-CD20 아마톡신 접합체의 합성
단계 1: 6'-O-(6-Boc-아미노헥실)-α-아마니틴(HDP 30.0132)
Figure pct00029
α-아마니틴 HDP 30.0132
DMSO(3.5mL) 중 α-아마니틴(105mg, 114μmol) 및 6-(Boc-amino)-헥실 브로마이드(128mg, 457μmol) 용액을 아르곤 분위기에서 2M 수산화리튬(LiOH) 용액( 68.6 μl, 137.1 μmol)으로 처리하였다. 주위 온도에서 40분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 AcOH(7.84㎕)를 첨가하여 산성화한 다음, 혼합물을 원하는 에테르 중간체를 침전시키기 위해 MTBE(40mL)를 함유하는 플라스크에 적가하였다. 상청액을 따라내고 버렸다. 침전물을 분취용 RP-HPLC[λ= 305nm; 구배: 0-5분 5% B; 20-25분 100% B; 27-35분 5% B; A= 물; B= 메탄올] 백색 분말로서 HDP 30.0132(84.37 mg, 66%)를 제공하였다.
MS(ESI+): m/z 실측치: 1118.5 계산치: 1119.29 [M+H]+.
단계 2: 6'-O-(6-아미노헥실)-α-아마니틴(HDP 30.0134)
Figure pct00030
HDP 30.0132 HDP 30.0134
HDP 30.0132 ( 152 mg, 136 μmol)에 TFA(5 mL)를 첨가하고 반응 혼합물을 주위 온도에서 2분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하고, 조 생성물을 분취용 RP-HPLC로 정제하였다[λ= 305nm; 그레디언트: 0분 5% B; 0-1분 30% B; 1-10분 39% B; 10-13분 100% B; 13-18분 5% B; A = 0.05% TFA 함유 물; B = 0.05% TFA를 포함하는 메탄올]. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 농축하고, 동결건조하여 유도체 HDP 30.0134 (118.67 mg, 86%)를 산출하였다.
MS(ESI+): m/z 실측치: 1018.5 계산치: 1019.17 [M+H] + .
단계 3: 6'- O -(6-아미노헥실)- α- 아마니틴 N- 숙신이미딜 카바메이트 HDP 30.0643
Figure pct00031
HDP 30.0134 HDP 30.0643
단계 2 산물, 207mg(183μmol) HDP 30.0134를 용해하고 4000μl 건조 디메틸포름아미드(DMF)가 포함된 50ml 원추형 원심분리 튜브로 옮겼다.
N,N'-디숙신이미딜 카보네이트의 0.2M 용액은 128mg(500μmol) DSC를 2500μl DMF에 용해시키고 생성된 용액 1828μl(366μmol = 2당량)을 HDP 30.0134에 이어서 50. 7μl(366μmol = 2당량) 트리에틸아민에 첨가함으로써 제조하였다.
볼텍싱 후, 원심분리기 튜브를 주위 온도의 오비탈 쉐이커에 놓았다. 5분 후 TLC 제어는 출발 물질의 완전한 소모를 나타내었다. 이어서 40ml의 얼음으로 냉각된 MTBE 및 20μl의 TFA를 튜브에 첨가하였다. 격렬한 볼텍싱 후 튜브를 빙욕에 10분 동안 두고 침전물을 4000xg에서 3분 동안 원심분리했다. 상청액을 따라내고 펠렛을 재현탁 및 침강을 통해 MTBE 중 10 ml의 얼음으로 냉각된 0.05% TFA로 세척하였다. 고체를 진공에서 건조시키고, 정제용 HPLC에 의해 정제된 2400μl 물/메탄올 5:95 + 0.05% TFA에 재용해시켰다.
생성물 함유 분획을 합하고 증발시켰다. 잔류물을 0.05% TFA를 함유하는 tert-부탄올과 물의 4:1 혼합물 10ml에 용해시킨다. 용액을 시린지 필터(나일론 0.2μm, Ø30mm)에 통과시키고 동결 건조시켰다:
170mg(80%) 무색 분말
MS(ESI+): 1159.42; MH+에 대한 계산.(C50H71N12O18S): 1159.47.
단계 4a: 6'-O-(6-아미노헥실)-α-아마니틴과 리툭시맙의 접합
Figure pct00032
(Rtx-DSC-30.0134)
변형 A : DSC 및 HDP 30.0134를 사용한 현장 활성화
항-CD20 단일클론 항체 리툭시맙은 커플링 시약 DSC( N,N'- 디숙신이미딜-카르보네이트)를 사용하여 화합물 I에 접합되어 아마톡신의 아미노산 4의 인돌 시스템의 6'-위치를 리툭시맙(Rtx-DSC-30.0134)의 라이신 잔기에 연결하는 절단 불가능한 링커가 있는 리툭시맙-아마톡신 접합체를 다음과 같이 생성했다:
0.66 mg 6'-(-6-아미노헥실)-α-아마니틴 HDP 30.0134를 72 μl 건조 디메틸포름아미드(DMF)에 용해했다. 아르곤 하에 실온에서 교반하면서 DMF 중의 디히드록시숙신이미도 카보네이트(DSC) 용액 6.7㎕(100 ㎕ DMF 중 2.56 mg) 및 트리에틸아민 1.3㎕를 한번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 12시간 후, 차가운 디에틸 에테르 30ml를 첨가하였다. 아마니틴-6'-(-6-아미노헥실-6-히드록시숙신이미딜 카보네이트)의 침전물을 수집하고 디에틸 에테르로 여러 번 세척하고 진공 건조시켰다. 나머지 고체를 100μl DMF에 녹였다.
4.0 μl의 상기 제조된 DMF 용액을 225 μl의 리툭시맙(Roche) 용액(인산염 완충 식염수(PBS) 중 2.0 mg/ml)에 첨가하였다.
혼합물을 4℃에서 14시간 동안 진탕하고 PD-10 컬럼에서 Sephadex G25 겔여과에 의해 분리하였다. 단백질 분획은 UV 흡수에 의해 검출되었고 Vivaspin Centrifugal Concentrators에서 3000g으로 농축되었다. 단백질 농도는 RotiQuant-Assay(Carl Roth, Germany)에 의해 결정되었고 2.0 mg/ml로 조정되었다. 리툭시맙(Rituximab)의 아마니틴 페이로드는 280 nm 및 310 nm에서의 UV 흡수에 의해 결정되었으며, 2.6의 약물 항체 비율(DAR)을 산출하기 위해 항체 및 α-아마니틴의 흡광 계수를 사용했다.
변형 B : 사전 활성화된 HDP 30.0643 사용
0.90 mg 6'-O-(6-아미노헥실)-α-아마니틴 N-숙신이미딜 카바메이트 HDP 30.0643을 180 μl 건조 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고 165 μl의 생성 용액을 2 ml의 리툭시맙(6 PBS 중 mg/ml)에 즉시 첨가하였다.
혼합물을 4℃에서 밤새 진탕한 후 PD-10 컬럼에서 Sephadex G25 겔여과에 의해 분리하였다. 단백질 분획은 UV 흡수에 의해 검출되었고 Amiconspin Centrifugal Concentrators에서 2000g으로 농축되었다 . 단백질 농도는 Bradford-Assay에 의해 결정되었고 3.0 mg/ml로 조정되었다.
리툭시맙의 아마니틴 페이로드는 항체 및 α-아마니틴의 흡광 계수를 사용하여 280 nm 및 310 nm에서의 UV 흡수에 의해 결정되었다. 4,6의 약물 항체 비율(DAR)을 산출한다.
단계 4b: 6'-O-(6-아미노헥실)-α-아마니틴과 리툭시맙에 대한 환원성 DSP 링커의 접합
Figure pct00033
(Rtx-DSP-30.0134)
항-CD20 모노클로날 항체 리툭시맙은 또한 커플링 시약 DSP(디티오비스-숙신이미딜-프로프리오네이트)를 사용하여 단계 2 생성물(HDP 30.0134)에 접합되어 다음과 같이 아마톡신의 아미노산 4의 인돌 시스템의 6' 위치를 리툭시맙(Rtx-DSP-30.0134)의 라이신 잔기에 연결하는 이황화물 함유 링커를 갖는 리툭시맙-아마톡신 접합체를 생성했다:
1.0 mg 6'-(-6-아미노헥실)-α-아마니틴 HDP 30.0134 를 56.6 μl 건조 디메틸포름아미드(DMF)에 용해시켰다. 아르곤 하에 실온에서 교반하면서, DMF(100㎕ DMF 중 3.7mg) 중의 디티오비스(숙신이미딜 프로피오네이트(DSP)) 용액 12㎕ 및 트리에틸아민 2.8㎕를 한번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 18시간 후 차가운 디에틸 에테르 30ml를 첨가하였다. 침전물을 수집하고 디에틸 에테르로 여러 번 세척하고 진공에서 건조시켰다. 남은 고체를 100μl DMF에 녹였다.
인산염 완충 식염수(PBS)에 녹인 500㎕ 리툭시맙(Roche) 용액(2.0mg/ml)의 3개 샘플을 1-, 3.5- 및 7,0-배 독소 링커의 몰 과량에 해당하는 상기 제조된 DMF 용액 4.2, 14.7 및 29.4㎕로 처리하였다.
혼합물을 4℃에서 밤새 진탕하고 Sephadex G25 겔여과 크로마토그래피(XK-16 컬럼; 2 ml/분)로 각각 분리하였다. 접합체 분획은 UV 흡수에 의해 검출되었고 Vivaspin 원심 농축기에서 3000g으로 농축되었다. 단백질 농도는 RotiQuant-Assay(Carl Roth, Germany)에 의해 결정되었고 3.0 mg/ml로 조정되었다.
리툭시맙의 아마니틴 페이로드는 0.9, 4.4 및 7.0의 약물 항체 비율(DAR)을 산출 하기 위해 항체 및 α- 아마니틴의 흡광 계수를 사용하여 280 nm 및 310 nm에서의 UV 흡수에 의해 결정되었다.
예 2.2: 시험관내에서 절단 불가능한 링커를 갖는 항-CD20 아마톡신 접합체의 세포독성
리툭시맙-아마톡신 접합체 Rtx-DSC-30.0134 및 Rtx-DSP-30.0134의 세포독성 활성은 제조사(로슈)의 프로토콜에 따라 화학발광 BrdU-ELISA 통합 분석을 사용하여 인간 만성 B-세포 백혈병 세포주 MEC-1에 대해 시험관내에서 평가되었다. 비접합 리툭시맙을 대조군으로 사용했다. 결과는 도 3에 도시된다.
리툭시맙-아마톡신 접합체 Rtx-DSC-30.0134 및 Rtx-DSP-30.0134(각각 비절단 링커 및 이황화물 함유 링커)는 시험관 내에서 CD20-양성 세포에 대해 상당한 세포독성 활성을 나타냈다.
예 2.3: 항-EGF-R 아마톡신 접합체와 비교 한 시험관내 비-절단성 링커를 갖는 항-CD20 아마톡신 접합체의 세포독성
항-CD20 모노클로날 항체 리툭시맙은 커플링 시약 DSC( N,N'- 디숙신이미딜-카르보네이트)를 사용하여 화합물 I(실시예 2.2 참조)에 접합되어 아마톡신의 아미노산 4의 인돌 시스템의 6'-위치를 리툭시맙(Rtx-30.0643)의 라이신 잔기에 연결하는 절단 불가능한 링커가 있는 리툭시맙-아마톡신 접합체를 생성했다. 이 접합체는 사인파-내피 기원의 간종 세포주인 CD20-음성 세포주 SK-Hep-1에 대해 시험했을 때 어떠한 유의한 세포독성을 나타내지 않았다(도 4).
또한, 항-표피 성장 인자 수용체(EGF-R) 모노클로날 항체인 트라스투주맙(trastuzumab) 및 파니투무맙(panitumumab) 각각은, 아마톡신의 아미노산 4의 인돌 시스템의 6'-위치를 트라스투주맙 및 파니투무맙의 라이신 잔기에 각각 연결하는 절단 불가능한 링커가 있는 항체-아마톡신 접합체(각각 Her-30.0643 및 Pan-30.0643)를 생성하는 커플링 시약 DSC( N,N'- 디숙신이미딜-카보네이트)를 사용하여 화합물 I(실시예 2.2 참조)에 접합되었다.
리툭시맙-, 트라스투주맙- 및 파니투무맙-아마톡신 접합체 각각의 세포독성 활성은 WST-1 분석을 사용하여 자극되지 않은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 에서 시험관 내 에서 평가되었다. 3개의 접합체(Rtx-30.0643, Her-30.0643 및 Pan-30.0643) 모두 WST-1 분석에서 세포독성 효과를 나타냈으며, 여기서 3개의 접합체 모두의 용량-반응 곡선은 다소 넓은 농도 범위를 포함하는 것으로 밝혀졌다(도 5, 상부 패널). Her-30.0643은 가장 강력한 세포독성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
상이한 접합체의 세포독성 활성이 CD20-풍부 비자극 PBMC에서 평가되었을 때(도 5, 하부 패널), ca.2x10-10 M의 IC50을 가진 CD20-특이적 접합체 Rtx-30.0643은 각각ca.3x10-10 M의 IC50을 가진 두 개의 다른 접합체 Her-30.0643 및 Pan-30.0643보다 상당히 더 세포독성이었다.
예 2.4: 항-CD20-F(ab') 2 단편 아마톡신 접합체와 비교한 시험관내 비-절단성 링커를 갖는 항-CD20 아마톡신 접합체의 세포독성
리툭시맙-아마톡신 접합체 Rtx-30.0643에 추가하여, 리툭시맙-F(ab')2 단편 아마톡신 접합체(Rtx-F(ab')2-30.0643)가 실시예 2.2 단계 4에 기재된 바와 같이 생성되었다. 접합체 및 비접합체 모두 리툭시맙은 둘 모두는 화학 발광 BrdU-ELISA 통합 분석을 사용하여 시험관 내에서 CD20-양성 MEC-1 세포에 대한 세포독성에 대해 평가되었다. 결과는 도 6에 도시되어 있다. 두 접합체 모두 ca. 4.6x10-10 M(Rtx-30.0643) 및 4x10-9 M(Rtx-F(ab')2 -30.0643)의 IC50 을 갖는 MEC-1 세포에 대해 상당한 세포독성 효과를 나타내었다.
MEC-1 세포에 대한 WST-1 세포독성 분석을 사용한 연구에서도 ca. 4.1x10-10 M(Rtx-30.0643) 및 2.9x10-9 M(Rtx-F(ab')2-30.0643)의 IC50 을 갖는 유사한 결과가 나타났다.
실시예 2.5: 생체내에서 절단 불가능한 링커를 갖는 항-CD20 아마톡신 접합체의 항종양 활성
절단 불가능한 링커를 갖는 리툭시맙-아마톡신 접합체 Rtx-30.0643도 SCID 베이지 기반 뮤린 종양 모델에서 생체내 세포독성에 대해 시험하였다(도 7). 사용된 용량은 600μg/kg의 아마니틴과 관련하여 28mg/kg의 리툭시맙-아마톡신 접합체였다. 접합체는 연구 기간 동안 종양 부피의 유의한 증가를 방지하는 세포독성 효과를 나타냈다.
실시예 3: 사이노몰구스 원숭이에서 절단 불가능한 링커를 갖는 항-CD20 아마톡신 접합체의 탐색적 독성 연구
절단 불가능한 링커를 갖는 리툭시맙-아마톡신 접합체 Rtx-30.0643(IgG 분자당 3.2개의 아마니틴 모이어티의 페이로드 포함)은 사이노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스( Macaca fascicularis ))에 대한 탐색적 독성 연구에서 테스트되었으며; 비접합 리툭시맙을 참조(대조군)로 사용했다. 3.6~4.2세의 수컷 6마리 및 첫 번째 투여 시 체중이 3.6~4.2kg인 동물을 사용했다. 연구에서 평가된 매개변수에는 국소 내성, 사망률, 임상 징후, 체중, 혈액학(HGB, RBC, WBC, 차등 혈구 수(상대, 절대), Reti, PCT, HCT, MCV, MCH, MCHC), 응고(TPT, aPTT, ESR), 임상 생화학(알부민, 글로불린, 알부민/글로불린 비율, 콜레스테롤(총), 빌리루빈(총), 크레아티닌, 포도당, 단백질(총), 요소, 트리글리세리드, 전해질, ALAT, aP, ASAT , LDH, CK, 감마-GT, GLDH)이 포함되었다.
표 2 : 실험군
Figure pct00034
표 3 : 연구 일정
Figure pct00035
리툭시맙-아마톡신 접합체 Rtx-30.0643을 투여받은 연구 그룹 2에서, 그러나 리툭시맙을 투여받은 연구 그룹 1에서는 그렇지 않은, 유의한 B 세포 고갈이 관찰되었으며 마지막 처리 후 B 세포 수의 회복이 뒤따랐다. 연구 결과는 도 8에 도시된다.
체중은 연구 기간 동안 두 연구 그룹에서 일정하게 유지되었다(도 9). 장기 무게, 조직병리학(심장, 간, 비장, 신장, 요관) 및 육안적 사후 관찰과 관련하여 연구 과정에서 어떠한 발견도 이루어지지 않았다.
혈액학과 관련하여 aPTT, 단핵구 및 호염기성 과립구의 증가가 연구 13일째, 3 μg/kg의 투여량으로 처리한 후 5일째에 관찰되었다. 연구가 끝날 때까지 PTT는 정상으로 돌아왔다. 연구 그룹 1과 비교하여 연구 그룹 2에서 단핵구 및 호염기성 과립구가 증가했다.
임상 생화학과 관련하여 연구 13에서 증가된 효소 활성(ALAT, ASAT, LDH, CK, GGT, GLDH)이 연구 20일, 5일에 ALAT에 대해 3μg/kg의 용량으로 처리한 지 5일 후에 관찰되었다. 9μg/kg 아마니틴의 투여량으로 치료 후. 연구가 끝날 때까지 이러한 매개변수는 정상으로 돌아왔다.
실시예 4: 이황화 링커를 갖는 항-CD20 아마톡신 접합체
실시예 4.1: 이황화 링커를 갖는 항-CD20 아마톡신 접합체의 합성
A. 인 시투(In-situ) 결합 방법
단계 1:
Figure pct00036
실시예 2.1 단계 1과 유사하게, 5.67mmol α-아마니틴을 [2-(2-브로모-에틸디설파닐)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르로 전환하여 1.29mg(15%)의 HDP 30.0341을 백색 분말로서 수득하였다.
MS(ESI + ): m/z 실측치: 1155.2 계산치: 1154.3.5 [M+H]+.
Figure pct00037
실시예 2.1 단계 1과 유사하게, 5.67mmol - 아마니틴을 [2-(3-브로모-프로필디설파닐)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르로 전환하여 4.83mg(67%)의 HDP 30.0349을 백색 분말로서 수득하였다.
MS(ESI + ): m/z 실측치: 1168.6 계산치: 1168.5 [M+H]+.
Figure pct00038
실시예 2.1 단계 1과 유사하게, 5.67mmol - 아마니틴을 [2-(3-브로모-1,1-디메틸-프로필디설파닐)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르로 전환하여 0.51mg(7%)의 HDP 30.0350의 백색 분말을 수득하였다. .
MS(ESI + ): m/z 실측치: 1196.7 계산치: 1196.5 [M+H]+ .
단계 2:
실시예 2.1 단계 2와 유사하게, 단계 1 생성물을 유리 아민으로 탈보호하였다:
표 4 : 공정 단계의 수율
Figure pct00039
단계 3:
실시예 2에 기술된 상기 방법에 따른 아마니틴-링커 아민 HDP 30.0353-5를 인 시투(in situ) 사전 활성되고 리툭시맙에 커플링되며, 단계 4 변이체 A를 사용하여 접합체 Rtx-30.0353[1.6], Rtx-30.0355[0.7] 및 Rtx-0355[0.2]를 생성한다.
B. 분지형 링커
단계 1: 6'-O-(3 - S- 트리틸설파닐-프로필)-α-아마니틴(HDP 30.0517)
Figure pct00040
아르곤 하에서 46mg(50μmol)의 진공 건조된 α-아마니틴을 2500μl 건조 DMSO에 용해시켰다. 3-( S- 트리틸)-메르캅토프로필-1-브로마이드(159 mg, 8 eq.)를 첨가한 다음, 60 μl의 1M 수산화나트륨(NaOH) 용액을 첨가하였다. 실온에서 1.5시간 후, 반응 혼합물을 DMSO 중 1M AcOH 50μl를 사용하여 pH 5로 산성화하고 용매를 증발시켰다. 잔류물을 200μl의 MeOH에 용해시키고 10ml의 MTBE로 채워진 원심분리 튜브에 적가하였다. 생성된 침전물을 10분 동안 0℃로 냉각시키고 원심분리(4000xg)에 의해 단리하고 후속적으로 10ml MTBE로 세척하였다. 상층액을 버리고 펠렛을 MeOH 750μl에 용해시키고 C18 컬럼(250x21.2mm, Luna RP-18, 10μm, 100
Figure pct00041
의 분취용 HPLC에서 3부분으로 정제했다[그래디언트: 0분 5% B; 5분 5% B 20분 100% B; 25분 100% B; 27분 5% B, 35분 5% B; 유속 30ml/min]. 체류 시간이 21.1-21.8분인 분획을 수집하고 용매를 증발시켜 HDP 30.0517 36.5mg (59%)을 무색 고체로 얻었다.
MS(ESI+ ): m/z 실측치: 1234.8 계산치: 1236.45 [M+H]+ ; 실측치: 1257.3 계산치: 1258.45 [M+Na]+ .
6'-O-(3 - S- 트리틸설파닐-부틸)-α-아마니틴(HDP 30.1168)
Figure pct00042
3-( S- 트리틸)-머캅토부틸-1-브로마이드로 상기 절차를 반복하여, 표제 생성물을 64% 수율로 얻었다.
MS(ESI + ): m/z 실측치: 1271.5 계산치: 1271.5 [M+Na]+.
단계 2: 6'-O-(3-(3-아미노-1-메틸-프로필디설파닐)-프로필)-α-아마니틴(HDP 30.1214)
Figure pct00043
단계 1 생성물(10mg)을 15ml 원심분리 튜브에 칭량하고 TFA(80.94μl, 5당량) 중 0.5M DTNP 용액에 용해시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 4분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 MTBE/n-헥산(1:1, 10 ml)으로 희석하였다. 침전물을 10분 동안 0Ž로 냉각시키고, 원심분리(4000xg)에 의해 단리하고, 후속적으로 MTBE(10 ml)로 세척하였다. 상층액을 버리고 펠렛을 MeOH 500μl에 용해시켰다. 4-아미노-티올 HDP 30.1157(17 mg, 9 당량)을 첨가하였다. 1시간 후, 혼합물을 0.05% TFA(10ml)가 포함된 MTBE로 분쇄하고, 에테르를 따라내고, 0.05% TFA(10ml)가 포함된 새로운 MTBE로 교체했다. 얻어진 침전물을 MeOH(200 μl)에 용해하고 C18 컬럼(250x21.2mm, Luna RP-18, 10μm, 100
Figure pct00044
에서 분취용 HPLC로 정제했다[λ= 305nm; 그래디언트: 0-5분 5% B; 20-25분 100% B; 27-35분 5% B; A = 0.05% TFA 함유 물; B = 0.05% TFA를 포함하는 메탄올]. 생성물에 상응하는 분획을 수집하고 용매를 증발시켜 HDP 30.1172 8.05 mg(81%)의 백색 분말로 증발시켰다.
MS(ESI+ ): m/z 실측치: 1110.39 계산치: 1110.44 [M+H]+ .
단계 1 생성물 HDP 30.0517 및 HDP 30.1168을 적절한 티올과 조합하여 상기 절차를 반복함으로써 하기 추가 화합물을 수득하였다:
표 5 : 공정 단계의 수율
Figure pct00045
단계 3: 6' - O- (3-(3-아미노-1-메틸-프로필디설파닐)-프로필) -α-아마니틴 N- 숙신이미딜 카바메이트 HDP 30.1214
Figure pct00046
2단계 산물 HDP 30.1171, 7.60mg(6.28μmol)을 용해하고 200μl 건조 디메틸포름아미드(DMF)가 포함된 15ml 원추형 원심분리 튜브로 옮겼다. N,N'-디숙신이미딜 카보네이트의 0.2M 용액은 128mg(500μmol) DSC를 2500μl DMF에 용해하고 생성된 용액 314μl(10당량)을 HDP 30.0134에 첨가한 다음 DMF 중 1M 트리에틸아민 12.56μl(366μmol= 2 당량)을 첨가하여 제조했다. 볼텍싱 후, 원심분리기 튜브를 주위 온도의 오비탈 쉐이커에 놓았다. 5분 후 TLC 제어는 출발 물질의 완전한 소모를 나타내었다. 이어서 10 ml의 얼음으로 냉각된 MTBE와 5 μl의 TFA를 튜브에 첨가했다. 격렬한 볼텍싱 후 튜브를 얼음 배트에 10분 동안 놓고 침전물을 4000xg에서 3분 동안 원심분리했다. 상청액을 따라내고 펠렛을 재현탁 및 침강에 의해 MTBE 중 10 ml의 얼음으로 냉각된 0.05% TFA로 세척하였다. 고체를 진공에서 건조시키고 정제용 HPLC에 의해 정제된 2400μl 물/메탄올 5:95 + 0.05% TFA 에 재용해시켰다. 생성물 함유 분획을 합하고 증발시켰다. 잔류물을 0.05% TFA를 함유하는 tert-부탄올과 물의 4:1 혼합물 3ml에 용해시켰다. 용액을 시린지 필터(나일론 0,2 μm, φ 13 mm) 에 통과시키고 동결 건조한다:
4.68mg(60%) 무색 분말
MS(ESI+ ): 1237.25; MH+.(C50 H71N12O18S)에 대한 계산: 1237.43 (C51H73N12O18S 3)
단계 2의 변형으로 위의 절차를 반복하여 다음과 같은 추가 화합물을 얻었다.
표 6 : 공정 단계의 수율
Figure pct00047
단계 4: 분지형 이황화 링커를 갖는 리툭시맙-아마니틴 유도체의 합성
단계 3의 각 석신이미딜 카보네이트 유도체 1.00 mg을 100 μl 건조 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고 생성된 각 용액 30 μl(10배 과량)을 394 μl의 리툭시맙 용액(9.5 PBS 중 mg/ml)에 즉시 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 밤새 진탕한 다음 PD-10 컬럼에서 Sephadex G25 겔여과로 분리했다. 단백질 분획은 UV 흡수에 의해 검출되었고 Slide-A-LyzerTM 투석 카세트(MWCO 20'000) 에서 4℃에서 1리터의 PBS pH 7.4에 대해 밤새 투석되었다. 단백질 농도는 RotiQuant-Assay(Carl Roth, Germany)에 의해 결정되었고, Amiconspin Centrifugal Concentrators에서 2000g으로 농축되었으며 3.0mg/ml로 조정되었다. Rituximab의 Amanitin 페이로드는 280 nm 및 310 nm에서의 UV 흡수에 의해 결정되었으며, 항체의 흡광 계수와 α-아마니틴을 사용하여 다음 접합체를 생성했다.
표 7 : 제품 특성
Figure pct00048
실시예 4.2: 시험관내 이황화 링커를 갖는 항-CD20 아마톡신 접합체의 세포독성
항-CD20 모노클로날 항체 리툭시맙은 커플링 시약 DSC(N,N'- 디숙신이미딜-카르보네이트)를 사용하여 화합물 III, IV 및 V에 각각 접합되어 리툭시맙(Rtx-DSC-30.0353, Rtx-DSC-30.0354 및 Rtx-DSC-30.0355)의 라이신 잔기에 아마톡신의 아미노산 4의 인돌 시스템 6'-위치를 연결하는 이황화 링커가 있는 리툭시맙-아마톡신 접합체를 생성했다.
Figure pct00049
(Ⅲ)
Figure pct00050
(Ⅳ)
Figure pct00051
(Ⅴ)
리툭시맙-아마톡신 접합체 Rtx -DSC-30.0353, Rtx-DSC-30.0354 및 Rtx-DSC-30.0355 의 세포독성 활성은 제조사(Roche)의 프로토콜에 따른 화학발광 BrdU-ELISA 통합 분석을 사용하여 인간 만성 B-세포 백혈병 세포주 MEC-1에 관해 시험관 내에서 평가 되었다. 결과는 도 10에 도시된다.
리툭시맙-아마톡신 접합체 Rtx-DSC-30.0353은 시험관 내 CD20 양성 세포에서 가장 높은 세포독성 활성을 보였다.
또한, 항-CD20 단일클론 항체 리툭시맙을 실시예 4.1의 DSC-예비활성화된 화합물에 접합시켜 아마톡신의 아미노산 4의 인돌 시스템의 6' 위치를 리툭시맙(Rtx-30.0748, Rtx-30.1214, Rtx-30.1215, Rtx-30.1216, Rtx-30.1217 및 Rtx-30.1218)의 라이신 잔기에 연결하는 이황화 링커를 갖는 리툭시맙-아마톡신 접합체를 생성하였다.
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
리툭시맙-아마톡신 접합체 Rtx-30.0748, Rtx-30.1214, Rtx-30.1215, Rtx-30.1216, Rtx-30.1217 및 Rtx-30.1218의 세포독성 활성은 WST 분석을 사용하여 인간 만성 B 세포 백혈병 세포주 MEC-1에 대하여 시험관내에서 평가 되었다. 결과는 도 11에 도시된다.
MEC-1 세포를 사용한 WST 분석에서, 사용된 모든 접합체에 대해 세포독성이 나타날 수 있었다. 접합체 Rtx-30.1214, Rtx-30.1215, Rtx-30.1216, Rtx-30.1217 및 Rtx-30.1218의 EC50 값은 2개의 참조 화합물 Rtx-30.0643 및 Rtx-30.0748 와 거의 동일한 범위였으며, 여기서 모든 접합체는 Rtx-30.0643보다 더 세포독성이 있다(표 3 참조).
각 면에 1개 이하의 차폐 메틸기를 보유하는 덜 안정화된 이황화물(즉, Rtx-30.0748, Rtx-30.1217, Rtx-30.1216 및 Rtx-30.1214)이 가장 높은 세포독성을 나타낸 반면, 고도로 안정화된 Rtx-30.1215 및 Rtx-30.1218은 절단 불가능한 링커가 있는 Rtx-30.0643보다 약간 더 세포독성이 있었고, 이는 이러한 화합물의 제한된 환원 절단을 나타낸다.
표 8 : 이황화 링커를 갖는 리툭시맙-아마톡신 접합체 의 EC50 값[M]
Figure pct00058
실시예 5: 효소적으로 절단가능한 링커를 갖는 리툭시맙 아마톡신 접합체
실시예 5.1: 효소적으로 절단가능한 링커를 갖는 리툭시맙 아마톡신 접합체의 합성
A: 6'-[(3-말레이미도프로판아미도)-Val-Ala-PAB]-α-아마니틴(HDP 30.1699)
단계 1: 6'-[Boc-Val-Ala(SEM)-PAB]-α- 아마니틴(HDP 30.1698)
Figure pct00059
아르곤 및 실온에서 진공 건조된 α-아마니틴 57mg(62.02μmol)을 3000μl 건조 디메틸 아세트아미드(DMA)에 용해시켰다. Boc-Val-Ala(SEM)-4-아미노벤질 브로마이드(EP 17192686에 개시됨) (145.5 mg, 248.1 μμmol) 및 0.2M 탄산세슘 (Cs2 CO3 ) (372.2 μl, 74.43 μmol)을 첨가했다. 실온에서 4시간 후, 반응 혼합물을 AcOH 10μl를 사용하여 pH = 5로 산성화시켰다. 용매를 진공에서 제거하고 잔류물을 C18 컬럼에서 분취용 HPLC로 정제하였다[λ= 305nm; 그래디언트: 0-5분 5% B; 20-25분 100% B; 27-35분 5% B; A= 물; B= 메탄올]. 생성물을 함유하는 분획을 증발시켜 HDP 30.1698 54.46mg(62%)을 얻었다.
MS(ESI+ ): m/z 실측치: 1425,23 계산치: 1424,6
단계 2: 6'-[H-Val-Ala-PAB]-α- 아마니틴(HDP 30.1702)
Figure pct00060
Boc- 및 SEM- 보호된 단계 5 생성물(134.29 mg, 94.25 μmol)을 5 ml의 TFA에 용해시켰다. 2분 후, 혼합물을 실온에서 증발 건조시키고, 5 ml의 물에 재용해시키고, 3.2% 암모니아를 적가하여 pH 10으로 조정하였다. 생성된 현탁액을 동결 건조하고 RP18-HPLC [λ= 305 nm; 그래디언트: 0-2분 5% B; 2-10분 20% B; 10-10.5분 25% B; 10.5-13분 100% B; 13-14분 5% B; A = 0.05% TFA 함유 물; B= 아세토니트릴] 및 순수한 분획을 증발시키고 동결건조하여 68.59mg(55%)의 무색 분말을 얻었다.
MS(ESI+ ): m/z 실측치: 1194.8 계산치: 1194.53 [M+H]+ ; 실측치: 1217.8 계산치: 1216.51 [M+Na]+ .
단계 3: 6'-[(3-말레이미도프로판아미도)-Val-Ala-PAB]-α- 아마니틴(HDP 30.1699)
Figure pct00061
HDP 30.1702 (17.09mg, 14.3μmol)를 건조 DMF(350μl)에 용해했다. 3-(말레이미도)-프로판산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(BMPS)(7.62mg, 28.6μmol, 2.0당량)를 DMF(350μl)에 용해하고 희석하지 않은 DIPEA(9.79μl, 57.2μmol, 4.0당량)를 첨가했다. 아르곤 하에 실온에서 1시간 30분 동안 교반한 후, 혼합물을 40 ml의 차가운 MTBE에 적하하고 0℃에서 원심분리하였다. 침전물을 수집하고 40 ml의 MTBE로 세척하고 다시 원심분리하였다. 조 생성물(crude product)을 건조시키고 RP18-HPLC에 의해 정제하였다[λ= 305nm; 그래디언트: 0-5분 5% B; 20-25분 100% B; 27-35분 5% B; A = 0.05% TFA 함유 물; B = 0.05% TFA를 포함하는 메탄올]. 순수한 분획을 동결건조하여 12.51 mg(65%)의 표제 생성물 6'-[ (3-말레이도프로판아미도)-Val-Ala-PAB]-α-아마니틴을 백색 분말로서 수득하였다.
MS(ESI+ ): m/z 실측치: 1367.50 계산치: 1368.45 [M+Na]+ .
B: S-데옥시아마닌 (3-말레이미도프로판아미도)-Val-Ala-p-아미노벤질아미드(HDP 30.2115)
Figure pct00062
S- 데옥시아마닌(15.0 mg, 16.5 μmol)은 실온에서 (3-말레이미도프로판아미도)-Val-Ala-p-아미노벤질 아민(25.2 μmol, 1.5 eq)의 0.1 M 용액 429 μl, 0.1 M TBTU(25.2 μmol, 1.5 eq)의 492 μl 및 0.2M DIEA(49.1μmol, 3.0eq) 492μl 로 RT에서 처리되었다. 반응을 RP-HPLC로 모니터링하였다. 완료 후 반응을 15분 동안 교반한 100μl H2O로 켄칭하고 분취용 RP-HPLC에 주입했다.
수율: 12.2mg, 56%
질량 분석: 1313.2 [M+H]+ , 1335.5 [M+Na]+
C: 리툭시맙에 대한 HDP 30.1699 및 HDP 30.2115 의 접합
리툭시맙에 대한 말레이미드-아마톡신 유도체 HDP 30.1699 및 HDP 30.2115의 접합을 위해, 링커 독소의 스톡 용액을 DMSO에서 10 mg/ml로 제조하였다. 4.4ml 항체 용액(PBS 중 9.5mg/ml)에 44μl 1mM EDTA pH 8.0 및 16.7 μl TCEP 용액( 3eqs.)을 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 환원을 수행하였다. 환원된 항체를 2개의 2.2μl 분취량으로 나누고 HDP 30.1699 112.5μl 또는 HDP 30.2115 μl 스톡 용액 109.8μl로 각각 처리했다. 4℃에서 30분 동안 진탕한 후 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 16.7 μl 100mM N-에틸말레이미드를 첨가하여 나머지 티올을 캡핑하였다. 이어서, 100mM N-아세틸-L-시스테인 27.9 μl 를 첨가하고, 추가로 15분 동안 진탕을 계속하였다. 아마톡신-ADC는 1x PBS pH 7.4로 평형화된 PD-10 컬럼을 사용하는 겔여과 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 단백질 함유 분획을 4 리터의 PBS pH 7.4에 대해 Slide-A-Lyzer 투석 카세트(MWCO 20'000)에서 4℃에서 밤새 투석했다. 단백질 농도는 280 nm에서 흡수 측정에 의해 결정되었고 5.0 mg/ml로 조정되었고, 샘플은 멸균 여과되었다(Millex-GV) .
표 9 : 질량 분석법 에 의해 결정된 ADC의 약물 항체 비율(DAR) :
Figure pct00063
리툭시맙(사슬간 접합)의 천연 시스테인 잔기 중 하나를 아마톡신의 아미노산 4의 인돌 시스템의 6'-위치에 연결하는 효소적으로 절단 가능한 링커를 포함하는 접합체 Rtx-30.1699, 및 리툭시맙(rituximab)의 천연 시스테인 잔기 중 하나(interchain conjugation)를 아마토신(amatoxin)의 아미노산 1에 연결하는 효소적으로 절단 가능한 링커는 SDS-PAGE 분석 및 항-아마니틴 항체를 사용하여 개발된 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다. 결과는 도 12에 도시되어 있다. 접합체 Rtx-30.1699의 약물/항체 비율(DAR)은 3.70으로 결정되었고, 접합체 Rtx-30.2115의 DAR은 3.75로 결정되었다.
실시예 5.2: 시험관내 효소적으로 절단가능한 링커를 갖는 리툭시맙 아마톡신 접합체의 세포독성
리툭시맙 아마톡신 접합체 Rtx-30.1699 및 Rtx-30.2115 의 세포독성 활성은 96시간 CTG 분석을 사용하여 각각 인간 만성 B 세포 백혈병 세포주 MEC-1 및 MEC-2에 대해 시험관 내에서 평가 되었다. 비접합 리툭시맙을 참조 화합물로 사용했다. 결과는 도 14에 도시되어 있다. 두 접합체 모두 두 세포주에 대해 강한 세포독성 효과를 유도한 반면, 접합되지 않은 리툭시맙은 세포독성 효과를 전혀 나타내지 않았다.
또한, 리툭시맙 아마톡신 접합체 Rtx-30.1699 및 Rtx-30.2115 의 세포독성 활성도 96시간 CTG 분석을 사용하여, 각각 MEC-1, MEC-2, Raji, Nalm-6 및 Ramos 세포주에서 시험관 내에서 비접합 α-아마니틴과 비교하여 평가 되었다. 결과는 도 15에 도시되어 있다. 두 접합체는 CD20-음성인 Nalm-6 세포를 제외하고 모든 세포주에서 낮은 나노몰 범위에서 강한 세포독성 효과를 나타냈다. 대조적으로, 비접합 α-아마니틴은 피노사이토시스에 의한 비특이적 흡수로 인해 밀리몰 범위에서만 모든 세포주에 대해 세포독성 효과를 나타냈다.
실시예 6: 효소적으로 절단 가능한 링커를 갖는 오비누투주맙 아마톡신 접합체
실시예 6.1: 효소적으로 절단가능한 링커를 갖는 오비누투주맙 아마톡신 접합체 의 합성
실시예 5에 기재된 방법을 사용하여 항체 오비누투주맙으로 하기 ADC를 얻었다:
표 10 : 질량 분광법에 의해 결정된 ADC의 약물 항체 비율(DAR):
Figure pct00064
실시예 6.2: 시험관내에서 효소적으로 절단가능한 링커를 갖는 오비누투주맙 아마톡신 접합체의 세포독성
오비누투주맙 아마톡신 접합체 Obi-30.1699 및 Obi-30.2115의 세포독성 활성은 96시간 CTG 분석을 사용하여 MEC-1, MEC-2, Raji, Nalm-6 및 Ramos 세포주에 대해 각각 시험관 내 에서 결합되지 않은 α-아마니틴과 비교하여 평가 되었다. 결과는 도 16에 도시되어 있다. 두 접합체는 CD20-음성인 Nalm-6 세포를 제외하고 모든 세포주에 대해 강력한 세포독성 효과를 나타내었다. 대조적으로, 비접합 α-아마니틴은 피노사이토시스에 의한 비특이적 흡수로 인해 밀리몰 범위에서만 모든 세포주에 대해 세포독성 효과를 나타냈다.
실시예 7: 생체내에서 효소적으로 절단가능한 링커를 갖는 항-CD20 아마톡신 접합체의 세포독성 활성
생체내 항-CD20 아마톡신 접합체 Rtx-30.2115 및 Obi-30.2115(실시예 6 참조)의 세포독성 효과를 Scid 마우스 이종이식 모델 시스템에서 평가하였다. 마우스당 2.5x106 라지(Raji) 세포는 CB17 Scid 마우스에 정맥(i.v.) 주입되었다. Rtx-30.2115 및 Obi-30.2115는 각각 1 mg/kg 및 3 mg/kg의 용량으로 치료에 사용되었다. 결과는 도 17에 도시된다.
52일의 연구 기간 동안, 두 접합체는 처리된 연구 동물에서 3mg/kg의 투여량에서 100%-생존율 및 1mg/kg의 투여량에서 90%-생존율을 산출했다. 대조적으로 PBS 대조군에서는 동물의 10%만이 28일 이상 생존했다.
또한, 항-CD20 아마톡신 접합체 Obi-30.1699의 생체내 효능은 각각 RS9737 및 RS1316 세포를 기반으로 하는 리히터 증후군의 2개의 환자 유래 종양 이종이식 모델에서 평가되었다. 이러한 세포를 기반으로 한 리히터 증후군 이종이식편은 유전적으로 형태학적으로, 그리고 표현형적으로 안정하고 해당 원발성 종양(Vaisitti et al 2018)에 유사하다.
RS9737 및 RS1316 세포에서 CD20의 발현은 RNA-seq 분석(전체 전사체 샷건 시퀀싱)에 의해 평가되었다. 결과는 도 18에 나와 있다. 데이터는 TPM(백만분의 기록)으로 표시된다. RS9737 세포는 RS1316 세포보다 상당히 낮은 수준의 CD20을 발현하는 것으로 나타났다.
환자 유래 종양 이종이식편 RS1316 및 RS9737 세포의 세포 현탁액을 암컷 NOG 마우스의 꼬리 정맥에 각각 주사하였다. 동물을 단일 용량의 오비누투주맙 아마톡신 접합체 Obi-30.1699 i.v.로 그룹 할당일(RS1316의 경우 21일, RS9737의 경우 10일)에 처리하였다.
표 11 : 연구 세부사항 리히터 증후군의 환자 유래 종양 이종이식 모델
Figure pct00065
오비누투주맙 아마톡신 접합체 Obi-30.1699를 사용한 마우스 치료는 테스트된 두 환자 유래 종양 이종이식 모델 모두에서 전체 생존에 상당한 영향을 미쳤다. 결과는 도 19에 도시 된다. 시간 경과에 따른 RS9737 기반 이종이식 모델(A) 및 RS1316 기반 이종이식 모델(B)에 대한 생존율이 표시된다. RS9737 및 RS1316 세포에서 각각 다른 CD20 발현 수준에 상응하여, 대조군에 비해 Obi-30.1699의 연장된 생존이 RS9737 기반 이종이식 모델(A)에서 관찰되었고, RS1316 기반 이종이식 모델(B)에서 급격히 연장된 생존이 관찰되었다; 후자의 경우 항-CD20-ADC-처리 동물의 100%가 90일까지 여전히 살아 있었고 항-CD20-ADC-처리 동물의 50%가 98일째 관찰 기간 종료시까지 여전히 살아 있고 질병이 없었다(FACS 분석에 의해 나타난 바와 같이).
표 12 : 리히터 증후군 이종이식편의 전체 생존 요약
Figure pct00066
+++: 전체 생존(OS)의 >100% 증가; ++: OS에서 >70% 증가; +: OS가 >20% 증가
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SEQUENCE LISTING <110> Heidelberg Pharma Research GmbH <120> B-Lymphocyte Specific Amatoxin Antibody Conjugates <130> HD 41137 <160> 5 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> >Rituximab Light Chain <400> 1 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 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Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 3 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> >Rituximab 265Cys Heavy Chain <400> 3 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser 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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 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185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Cys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 6 <211> 297 <212> PRT <213> Human <220> <223> >Human CD20 <400> 6 Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro 1 5 10 15 Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg 20 25 30 Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu 35 40 45 Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile 50 55 60 Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile 65 70 75 80 Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile 85 90 95 Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu 100 105 110 Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile 115 120 125 Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser 130 135 140 His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro 145 150 155 160 Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn 165 170 175 Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly 180 185 190 Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile 195 200 205 Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys 210 215 220 Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile 225 230 235 240 Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro 245 250 255 Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu 260 265 270 Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser 275 280 285 Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro 290 295

Claims (21)

  1. (i) 표적 결합 모이어티, (ii) 적어도 하나의 독소, 및 (iii) 선택적으로 상기 표적 결합 모이어티를 상기 적어도 하나의 독소와 연결하는 적어도 하나의 링커를 포함하고, 여기서 상기 표적 결합 모이어티는 CD20에 결합하고, 여기서 상기 적어도 하나의 독소는 아마톡신인, 접합체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 결합 모이어티는
    (i) 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체,
    (ii) 이의 항원 결합 단편, 바람직하게는 가변 도메인(Fv), Fab 단편 또는 F(ab)2 단편,
    (iii) 이의 항원 결합 유도체, 바람직하게는 단쇄 Fv(scFv), 및
    (iv) 항체-유사 단백질,
    로 구성된 상기 그룹으로부터 선택되고,
    각기 CD20에 각각 결합하는, 접합체.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 이의 항원 결합 유도체가 뮤린, 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 또는 항원 결합 단편 또는 항원 결합 유도체인, 접합체.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 항원 결합 유도체는 각각 리툭시맙, 오비누투주맙, 이브리투모맙, 토시투모맙, 오파투무맙, 오크렐리주맙 및 유블리툭시맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체.
  5. 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 118Cys, 중쇄 239Cys, 또는 중쇄 265Cys, 바람직하게는 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys를 포함하도록 유전자 조작되었으며, 상기 링커(존재하는 경우) 또는 상기 아마톡신은 각각 상기 중쇄 118Cys, 상기 중쇄 239Cys, 또는 중쇄 265Cys 잔기를 통해 상기 항체에 연결되는, 접합체.
  6. 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커(존재하는 경우) 또는 상기 아마톡신이 상기 항체의 임의의 천연 Cys 잔기를 통해, 바람직하게는 이황화 결합을 통해 상기 항체에 연결되는, 접합체.
  7. 청구항 4 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys를 포함하도록 유전적으로 조작된 리툭시맙 또는 리툭시맙인, 접합체.
  8. 청구항 4 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 리툭시맙이고, 상기 링커(존재하는 경우) 또는 상기 아마톡신이 리툭시맙의 사슬간 이황화 결합을 형성하는 임의의 자연 발생 Cys 잔기를 통해 리툭시맙에 연결되는, 접합체.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 비절단성 또는 절단성 링커인, 접합체.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 절단가능한 링커는 효소적으로 절단가능한 링커, 바람직하게는 프로테아제-절단가능한 링커, 및 화학적으로 절단가능한 링커, 바람직하게는 이황화 브릿지를 포함하는 링커로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아마톡신이 (i) 6'-데옥시 위치를 갖는 아미노산 4 및 (ii) S-데옥시 위치를 갖는 아미노산 8을 포함하는, 접합체.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우 상기 링커 또는 상기 표적 결합 부분이 (i) 아마톡신 아미노산 1 의 γC-원자, 또는 (ii) 아마톡신 아미노산 3의 δC-원자, 또는 (iii) 아마톡신 아미노산 4의 6'-C-원자 를 통해 상기 아마톡신에 연결되는, 접합체.
  13. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체가 링커-아마톡신 모이어티로서 각각 하기 화학식 I 내지 XII의 화합물 중 임의의 것을 포함하는, 접합체.
    Figure pct00067

    (Ⅰ)
    Figure pct00068

    (Ⅱ)
    Figure pct00069

    (Ⅲ)
    Figure pct00070

    (IV)
    Figure pct00071

    (V)
    Figure pct00072

    (VI)
    Figure pct00073

    (VII)
    Figure pct00074

    (VIII)
    Figure pct00075

    (IX)
    Figure pct00076

    (X)
    Figure pct00077

    (XI)
    Figure pct00078

    (XII)
  14. 청구항 2 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 화학식 XIII 내지 XXII 중 어느 하나에 따른 아마톡신 링커 부분에 접합된 표적 결합 부분으로서 항체를 포함하고,
    Figure pct00079

    (XIII)
    Figure pct00080

    (XIV)
    Figure pct00081

    (XV)
    Figure pct00082

    (XVI)
    Figure pct00083

    (XVII)
    Figure pct00084

    (XVIII)
    Figure pct00085

    (XIX)
    Figure pct00086

    (XX)
    Figure pct00087

    (XXI)
    Figure pct00088

    (XXII)

    여기서 상기 아마톡신 링커 모이어티는 상기 항체의 자연 발생 라이신 잔기의 ε-아미노기에 커플링되고, 여기서 n은 바람직하게는 1 내지 7인, 접합체.
  15. 청구항 2 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 화학식 XXIII 내지 XXIV 중 어느 하나에 따른 아마톡신 링커 부분에 접합된 표적 결합 부분으로서 항체를 포함하고,
    Figure pct00089

    (XXIII)
    Figure pct00090

    (XXIV)
    상기 아마톡신 링커 모이어티는 항체의 시스테인 잔기의 티올기에 커플링되고, 여기서 n은 바람직하게는 1 내지 7인, 접합체.
  16. 청구항 2에 있어서, 상기 접합체는 다음으로 구성된 그룹에서 선택되고,
    (i) 화학식 XXV에 따른 리툭시맙의 하나 이상의 자연 발생 Cys 잔기에 대한 티오에테르 연결을 통해 화학식 XI의 하나 이상의 아마톡신-링커 부분에 접합된 표적 결합 부분으로서 항체 리툭시맙을 포함하는 접합체,
    Figure pct00091

    (XXV)

    (ii)화학식 XXVI에 따라, 상기 유전자 조작된 리툭시맙의 상기 중쇄 265Cys 잔기에 대한 티오에테르 연결을 통해, 화학식 XI의 아마톡신 링커 부분에 접합된 표적 결합 부분으로서 EU 넘버링 시스템에 따라 중쇄 265Cys를 포함하도록 유전적으로 조작된 항체 리툭시맙을 포함하는 접합체,
    Figure pct00092

    (XXVI)

    (iii) 화학식 XXVII에 따라, 티오에테르 연결을 통해, 또는 리툭시맙의 하나 이상의 자연 발생 Cys 잔기에, 예를 들어 리툭시맙의 사슬간 이황화 결합에 기여하는 하나 이상의 Cys 잔기, 화학식 XII의 하나 이상의 아마톡신-링커 부분에 접합된 표적 결합 부분으로서 항체 리툭시맙을 포함하는 접합체,
    Figure pct00093

    (XXVII),

    (iv) 화학식 XXVIII에 따라, 상기 유전자 조작된 리툭시맙의 상기 중쇄 265Cys 잔기에 대한 티오에테르 연결을 통해, 화학식 XII의 아마톡신 링커 부분에 접합된 표적 결합 부분으로서 EU 넘버링 시스템에 따른 중쇄 265Cys를 포함하도록 유전적으로 조작된 항체 리툭시맙을 포함하는 접합체,
    Figure pct00094

    (XXVIII),
    여기서 n은 (i), (iii)의 경우 1 내지 7이고, (ii), (iv)의 경우 n은 1 내지 2인, 접합체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 접합체를 포함하는 약학적 조성물.
  18. 청구항 17에 있어서, 하나 이상의 제약상 허용되는 완충제, 계면활성제, 희석제, 담체, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡착제 및/또는 보존제를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  19. 특히 비호지킨 림프종, 여포성 림프종, 미만성 거대 B 세포 비호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 리히터 증후군, 류마티스 관절염, 다발혈관염을 동반한 육아종증, 현미경적 다발혈관염 및 심상 천포창의 치료에 사용하는,
    B 림프구 관련 악성 종양 또는 B 세포 매개 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항의 접합체 또는 청구항 17 내지 청구항 18 중 어느 한 항의 약학적 조성물.
  20. 특히 비호지킨 림프종, 여포성 림프종, 미만성 거대 B 세포 비호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 리히터 증후군, 류마티스 관절염, 다발혈관염을 동반한 육아종증 및 현미경적 다발혈관염 및 심상 천포창의 치료에 사용되는,
    B 림프구 관련 악성종양 또는 B 세포 매개 자가면역 질환의 치료를 위한 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항의 접합체 또는 청구항 17 내지 청구항 18 중 어느 한 항의 약학적 조성물의 용도.
  21. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 따른 접합체 또는 청구항 17 내지 청구항 18항 어느 한 항의 약학적 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는,
    B 림프구 관련 악성종양 또는 B 세포 매개 자가면역 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.
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