JP2022552349A

JP2022552349A - Ｂリンパ球特異的アマトキシン抗体コンジュゲート

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Publication number: JP2022552349A
Application number: JP2022522578A
Authority: JP
Inventors: トルシュテンヘヒラー; アンドレアスパール; ミヒャエルクルケ; クリシュトフミュラー
Original assignee: ハイデルベルクファルマリサーチゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 2019-10-15
Filing date: 2020-10-15
Publication date: 2022-12-15
Also published as: MX2022004416A; KR20220082846A; EP4045091A1; CA3151578A1; AR120218A1; WO2021074261A1; IL291581A; CO2022004606A2; CN114845737A; BR112022006283A2; AU2020367014A1

Abstract

本出願は、アマトキシン、標的がＣＤ２０である標的結合部分、すなわちＣＤ２０結合部分、および任意選択で前記アマトキシンおよび前記ＣＤ２０結合部分を連結するリンカーを含むコンジュゲートに関する。本発明はさらに、前記コンジュゲートの合成に関する。さらに、本発明は特に、Ｂ細胞および／またはリンパ腫関連疾患および／または悪性腫瘍の治療における使用のための、このようなコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。【選択図】図１

Description

本出願は、アマトキシン、標的がＣＤ２０である標的結合部分、すなわちＣＤ２０結合部分、および任意選択で前記アマトキシンと前記ＣＤ２０結合部分とを連結するリンカーを含むコンジュゲートに関する。本発明はさらに、前記コンジュゲートの合成に関する。さらに、本発明は特に、Ｂ細胞および／またはリンパ腫関連疾患および／または悪性腫瘍の治療における使用のための、このようなコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。

ＣＤ２０は、特定のＢ細胞前駆体（プレＢリンパ球）および成熟Ｂリンパ球に特徴的な、細胞表面の膜に埋め込まれた３５－３７ｋＤａの非グリコシル化リン酸化タンパク質である。ＣＤ２０抗原は形質細胞上にも、造血幹細胞や初期プロＢリンパ球上にも発現しない。天然のＣＤ２０リガンドはこれまで同定されていない。ＣＤ２０はＢ細胞の形質細胞への発生、成長および分化において役割を果たし、特にＴ非依存性抗原に対する最適なＢ細胞免疫応答を可能にする。
いくつかのデータはＣＤ２０が細胞内Ｃａ²⁺濃度を維持し、Ｂ細胞の活性化を可能にするＣａ²⁺膜チャンネルとして機能し得ることを示した（Winiarska et al, 2007）。

ＣＤ２０抗原は、膜貫通型４Ａタンパク質ファミリーのメンバーである。その構造がアミノ末端とカルボキシ末端の両方が細胞質内に位置する４つの膜貫通ドメインからなる（したがって、ＣＤ２０はMS4A1- membrane spanning 4 domain subfamily A, membrane 1-とも呼ばれる）。ＣＤ２０には２つの細胞外ループがある。小さいほう（第１膜貫通領域と第２膜貫通領域の間にある７個のアミノ酸からなる部分）は、おそらく細胞膜を越えているわけではない。このループはＭＳ４Ａファミリーのすべてのメンバーで同一である。より大きなループ、第３および第４の膜貫通領域の間の４３アミノ酸のセグメントはジスルフィド結合を有し、そして抗ＣＤ２０抗体の大部分によって認識される。ＣＤ２０分子の細胞質領域のいずれにもチロシン残基や認識されたシグナル伝達モチーフは生じないが、セリンとトレオニンのリン酸化には多くのコンセンサス部位がある。

ＣＤ２０は、少なくとも１つのさらなるタンパク質成分と複合して二量体および四量体として存在し得る。ＣＤ２０タンパク質は、膜貫通アダプタータンパク質ｐ７５／８０（Ｃ末端ｓｒｃキナーゼ結合タンパク質Ｃｂｐとも呼ばれる）、ＣＤ４０および主要組織適合性複合体クラスＩＩタンパク質（ＭＨＣＩＩ）と密接に関連していることが報告されている。ＣＤ２０抗原はＢリンパ球の分化過程でコンホメーション変化を起こし、ＣＤ２０のコンホメーションアイソフォームが少なくとも２種類存在する（Ｗｉｎｉａｒｓｋａｅｔａｌ，２００７）。

特定の特徴により、ＣＤ２０抗原は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）治療の魅力的な標的となっている。ＣＤ２０抗原は最も安定したリンパ球抗原の一つと考えられる。モノクローナル抗体がリンパ腫細胞に結合するのを競合的に阻害しうる遊離タンパク質として血漿中を循環することはなく、抗体結合後にＣＤ２０陽性細胞の表面から放出されることもなく、大多数のインビボおよびインビトロ試験において、ＣＤ２０表面分子の内部移行またはＣＤ２０発現のダウンレギュレーションは検出されなかった。

抗ＣＤ２０、Ｂ細胞特異的キメラモノクローナル抗体リツキシマブは、非ホジキンＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病および関節リウマチなどの様々な癌および自己免疫疾患の治療のために規制当局により承認された最初のモノクローナル抗体である。リツキシマブは、ＣＤ２０を発現するヒトリンパ系細胞株の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を促進すること（ＴａｙｌｏｒａｎｄＬｉｎｄｏｒｆｅｒ，２００８）、並びにＣＤ２０結合後の細胞シグナル伝達経路及び細胞膜に直接的な影響を及ぼすことが明らかにされている。リツキシマブ結合の影響を受ける事象は、脂質ラフト改変、キナーゼおよびカスパーゼの活性化、転写因子への影響など、多数同定されている（Ｗｅｉｎｅｒ２０１０；Ｂｅｚｏｍｂｅｓｅｔａｌ，２０１１）。

リツキシマブに加えて、イブリツモマブ、トシツモマブ（両方とも放射性同位体とコンジュゲートされている）、オファツムマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、およびウブリツキシマブを含む他の抗ＣＤ２０抗体が報告されてきており、これらはすべて、Ｂ細胞リンパ腫、白血病、およびＢ細胞性自己免疫疾患の治療を目的とする活性薬剤である（Falchi et al, 2018）。

リツキシマブは、以下の適応症で欧州でＭａｂＴｈｅｒａ（ロシュ）の商品名で成人について承認されている：非ホジキンリンパ腫、ＮＨＬ（化学療法との併用による未治療のステージＩＩＩ～ＩＶの濾胞性リンパ腫患者の治療；寛解導入療法に反応する濾胞性リンパ腫患者の治療のための維持療法；化学療法抵抗性であるかまたは化学療法後に２回目またはその後に再発したステージＩＩＩ～ＩＶの濾胞性リンパ腫患者の治療のための単剤療法；ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾロン）化学療法との併用によるＣＤ２０陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫患者の治療；慢性リンパ性白血病ＣＬＬ（未治療及び再発・難治性のＣＬＬ患者に対する化学療法との併用）、関節リウマチ（１つ以上の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤療法を含む他の疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）に対して不十分な反応または不耐性を示した、重度の活動性関節リウマチの成人患者に対するメトトレキサートとの併用）、多発血管炎および微視的多発血管炎を伴う肉芽腫症（多発血管炎（Ｗｅｇｅｎｅｒ’ｓ）（ＧＰＡ）および顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）を伴う重度で活動性の肉芽腫症の成人患者の治療のためのグルココルチコイドとの併用）；および尋常性天疱瘡（中等度から重度の尋常性天疱瘡患者の治療のための）（ＭａｂＴｈｅｒａ、生成物特性の要約）。

しかしながら、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の構築のために抗ＣＤ２０抗体を使用する試みについては、限られた成功しかなかった。

抗ＣＤ２０抗体の毒素コンジュゲートを用いた陰性結果は、Ｌａｍｂｅｒｔら（１９８５）によって報告され、ＣＤ２０に対する抗体抗Ｂ１を含む免疫毒素はヒトリンパ系細胞上の３つの他の抗原と反応性であったＩｇＧクラスの種々の他のモノクローナル抗体を含む免疫毒素とは対照的に、細胞毒性を示さなかったことが見出された。この研究で使用された免疫毒素は、リボソーム不活性化タンパク質ゲロニンまたは３つの公知のヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を含んでいた。

フィリップス（Phillips）のA.G. Polsonによって開示されている（２０１３年）ように、ＣＤ２０は、抗体結合時に非常に十分に内部移行せず、したがってＡＤＣ標的としてあまり適していないことが見出された点で、標的として使用される他のＢ細胞表面タンパク質とは異なる。初期の研究では、抗ＣＤ２０抗体は非内部移行性とみなされていたため、このようなコンジュゲートは有望ではないと考えられていたとすでに結論づけられていた。ＣＤ２０が非内部移行性または不十分な内部移行性抗原であるという知見は文献において広く確認されている（Press et al, 1989; Vangeepuram et al, 1997; Winiarska et al, 2007; Kim and Kim, 2015; Staudacher and Brown, 2017）。

DiJosephら（２００７年）は非ホジキンＢ細胞リンパ腫細胞に関する研究から、抗体結合ＣＤ２０の細胞内移行がないため、リツキシマブのアミド結合コンジュゲートは細胞内区画に、細胞毒性活性をもたらす毒素カリケアマイシンを送達しないと結論づけた。

他の研究は標的化部分として抗ＣＤ２０抗体、毒素としてＮ（２’）－デアセチル－Ｎ（２’）－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）－メイタンシン（ＤＭ１）、および非切断性リンカーを含むＡＤＣがＣＤ２０陽性標的細胞に対して無効であったが、切断性リンカーを有する対応する構築物はそのような細胞に対していくらかの細胞毒性効果を生じたことを開示した（Polson et al, 2009）。Lawら（２００４年）は使用される毒素に依存してＣＤ２０標的ＡＤＣの異なる効果を見出した：ドキソルビシン（Ｄｏｘ）にコンジュゲートした抗ＣＤ２０抗体が薬物を送達しなかったか、または抗腫瘍活性を実証しなかったが、抗有糸分裂剤モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を使用する抗ＣＤ２０抗体－薬物コンジュゲートは強力な抗腫瘍活性を発揮した。

さらに、使用される毒素の性質およびそのような毒素への標的結合部分のコンジュゲートに使用されるリンカーの性質に加えて、特定の抗ＣＤ２０抗体の特異的特性は、最近の研究によるそのような抗体コンジュゲートの治療効力を決定するために関連するようであった。いわゆる「タイプＩＩ」ＣＤ２０特異的抗体はＣＤ２０陽性の標的細胞によりほとんど取り込まれないことが示されているのに対し、他のいわゆる「タイプＩ」ＣＤ２０特異的抗体は、それらが相互作用する標的細胞上の活性化型および抑制型ＦｃγＲの発現レベルに依存して、ある程度細胞内に取り込まれ分解されることがわかっている。特に、特定のタイプのＢ細胞悪性腫瘍上で発現される抑制型ＦｃＲ、ＦｃγＲＩＩｂは、この文脈において重要な役割を果たすことが記載されている。タイプＩおよびタイプＩＩ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の示差的ＦｃγＲ媒介内部移行応答の基礎となるメカニズムは、まだ詳細には定義されていない（Boross and Leussen, 2012; Dransfield 2014; Vaughan et al. 2014）。

標的の内部移行は細胞傷害性癌治療のために抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を使用する文脈において非常に望ましい（例えば、Boross and Leussen, 2012）。細胞傷害性ペイロードは、典型的には細胞内標的に作用するので、標的への結合時のＡＤＣの内部移行はしばしば、ＡＤＣの最適な効力のために必要である（Kim and Kim, 2015）。これは特に、アマニチンおよびそれらの誘導体（「アマトキシン」）を含むアマニチンベースのＡＤＣに当てはまると考えることができ、それはこれらのアマトキシンがＡＤＣの産生のために使用されてきた他の毒素分子より疎水性が低く、したがって、例えばＭＭＡＥのような拡散性薬物と比較して細胞膜を透過する能力が低いからである（Staudacher and Brown, 2017）。上記のように、文献におけるそれぞれの偏見、および抗ＣＤ２０抗体およびそれを使用するＡＤＣの内部移行および細胞毒性効果に関する異なる研究の矛盾する結果を考慮すると、本願の発明者らは、抗体アマトキシンコンジュゲートの文脈において抗ＣＤ２０抗体を使用するとき、有意な細胞毒性効果に関して成功の期待を有さなかった。アマニチンまたはアマニチンアナログまたは誘導体は、ＣＤ２０標的結合部分を含むＡＤＣの合成および評価にはこれまで使用されていなかった。

驚くべきことに、本発明者らは、抗ＣＤ２０抗体、または抗体フラグメントもしくは抗体誘導体をアマトキシンに連結する非切断性または切断性のリンカーを有する抗ＣＤ２０抗体を含むアマトキシンベースＡＤＣがインビトロおよびインビボでＣＤ２０陽性標的細胞に対して有意な細胞毒性効果を発揮することを見出した。これらの結果は、特に非切断性リンカーを含むアマトキシンベースＡＤＣについては、活性毒素分子の放出のためにリソソーム区画内での細胞内分解を必要とすると考えられるので、予想外であった。

従って、先行技術を考慮して、本発明の１つの目的は本出願に記載されるように、ＣＤ２０に結合する標的結合部分、少なくとも１つのアマトキシン、および任意に、標的結合部分を前記少なくとも１つの毒素と連結する少なくとも１つのリンカーを含み、標的細胞における細胞毒性効果を媒介するコンジュゲートを提供することであった。

本発明のさらなる目的の１つは、ＣＤ２０に結合する標的結合部分、少なくとも１つのアマトキシン、および任意選択で少なくとも１つのリンカーを含み、前記標的結合部分がＣＤ２０に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメント、またはその抗原結合誘導体、または抗体様タンパク質である、コンジュゲートを提供することであった。

本発明の１つのさらなる目的は、そのようなコンジュゲートを含む医薬組成物を提供することであった。

本発明のさらなる目的は、癌および自己免疫疾患の治療のための方法における使用のための化合物を提供することであった。

本発明のさらなる目的の１つは、Ｂリンパ球関連悪性腫瘍またはＢ細胞媒介性自己免疫疾患の治療において、特に非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、リヒター（Ｒｉｃｈｔｅｒ）症候群、関節リウマチ、多発血管炎を伴う肉芽腫症、ならびに顕微鏡的多発血管炎および尋常性天疱瘡の治療において使用するための、ＣＤ２０に結合する標的結合部分、少なくとも１つのアマトキシン、および任意選択で少なくとも１つのリンカーを含むコンジュゲートを提供することであった。

驚くべきことに、ＣＤ２０に結合する標的結合部分、少なくとも１つのアマトキシン、および任意選択で少なくとも１つのリンカーを含むコンジュゲート、特に、抗ＣＤ２０抗体と、抗ＣＤ２０抗体もしくは抗体フラグメントもしくは抗体誘導体をアマトキシンに連結する非切断性または切断性のリンカーとを含むアマトキシンベースのＡＤＣが、ＣＤ２０陽性標的細胞に対して、インビトロおよびインビボで有意な細胞毒性効果を及ぼすことが見出された。これらの結果は、活性毒素分子の放出のためにリソソーム区画内での細胞内分解を必要とすると考えられるので、特に非切断性リンカーを含むアマトキシンベースＡＤＣについては予想外であった。

これらおよびさらなる目的は、本発明の独立請求項に記載の方法および手段によって達成される。従属請求項は、特定の実施形態に関連する。

本発明及びその特徴の一般的な利点を以下に詳細に説明する。

種々のアマトキシンの構造式。太字の数字（１～８）は、アマトキシンを形成する８個のアミノ酸の標準的な番号付けを示す。アミノ酸１、３、および４における原子の標準的な名称も示す（それぞれ、ギリシャ文字α～γ、ギリシャ文字α～δ、および１’～７’の数字）。ＦＡＣＳ分析により示された、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブの、ＣＤ２０陽性ヒト慢性Ｂ細胞白血病細胞株（Ａ）ＭＥＣ－１及び（Ｂ）ＭＥＣ－２並びにヒトバーキットリンパ腫細胞株（Ｃ）Ｒａｊｉに対する結合性。７２時間のインキュベーション後のＢｒｄＵアッセイにおけるＣＤ２０陽性ＭＥＣ－１細胞に対する細胞毒性試験の結果。７２時間のインキュベーション後のＢｒｄＵアッセイにおけるＣＤ２０陰性ＳＫ－Ｈｅｐ－１細胞に対する細胞毒性試験の結果。ＷＳＴ－１アッセイにおける抗ＣＤ２０抗体（Ｒｔｘ－３０．０６４３）および抗ＥＧＦＲ抗体（Ｈｅｒ－３０．０６４３、Ｐａｎ－３０．０６４３）アマトキシンコンジュゲートを用いた、非刺激ＰＢＭＣ（Ａ）およびＣＤ２０富化非刺激ＰＢＭＣ（Ｂ）に対する細胞毒性試験の結果。リツキシマブアマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－３０．０６４３、リツキシマブ－Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントアマトキシンコンジュゲートＲｔｘＦ（ａｂ’）₂－３０．０６４３、およびコンジュゲートしていないリツキシマブを用いた７２時間のインキュベーション後のＢｒｄＵ試験におけるＣＤ２０陽性ＭＥＣ－１細胞の細胞毒性試験の結果。ＳＣＩＤベージュ系マウスを用いたＰ４９３－６異種移植モデル（ヒトバーキットリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫）におけるリツキシマブアマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－３０．０６４３を用いたインビボ有効性試験の結果。リツキシマブアマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－３０．０６４３（ＩｇＧ分子あたり３．２アマニチン部分のペイロード量）を用いたカニクイザル（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）における探索的毒性試験の結果。有意なＢ細胞枯渇を示した；コンジュゲートしていないリツキシマブを参照（対照）として用いた。リツキシマブ・アマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－３０．０６４３（ＩｇＧ分子あたり３．２アマニチン部分のペイロード量）を用いたカニクイザル（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）における探索的毒性試験の結果。２つの試験群で体重に有意な変化は認められなかった。リツキシマブアマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－ＤＳＣ－３０．０３５３、Ｒｔｘ－ＤＳＣ－３０．０３５４、およびＲｔｘ－ＤＳＣ－３０．０３５５を用いたインビトロのＢｒｄＵアッセイにおけるＣＤ２０陽性ＭＥＣ－１細胞に対する細胞毒性試験の結果。リツキシマブアマトキシンコンジュゲート（Ａ）Ｒｔｘ－３０．０６４３、Ｒｔｘ－３０．７４８、Ｒｔｘ－３０．１２１４、（Ｂ）Ｒｔｘ－３０．１２１５、Ｒｔｘ－３０．１２１６、Ｒｔｘ－３０．１２１７および（Ｃ）Ｒｔｘ－３０．１２１８を用いたＷＳＴ－１アッセイにおけるＣＤ２０陽性ＭＥＣ－１細胞に対する細胞毒性試験の結果。リツキシマブアマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－３０．１６９９およびＲｔｘ－３０．２１１５それぞれの（Ａ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析および（Ｂ）ウェスタンブロット（抗アマニチン抗体を用いて開発）の結果。コンジュゲートＲｔｘ－３０．１６９９（上のパネル）およびＲｔｘ－３０．２１１５（下のパネル）のＳＥＣＨＰＬＣ分析。９６時間ＣＴＧアッセイにおけるリツキシマブ－アマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－３０．１６９９及びＲｔｘ－３０．２１１５を用いたヒト慢性Ｂ細胞白血病細胞株（Ａ）ＭＥＣ－１及び（Ｂ）ＭＥＣ－２に対する細胞毒性試験結果。コンジュゲートしていないリツキシマブ（Rituximab）を参照化合物として使用した。コンジュゲートしていないα－アマニチン（α-amanitin）と比較した９６時間ＣＴＧアッセイにおけるリツキシマブアマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－３０．１６９９およびＲｔｘ－３０．２１１５を用いた（Ａ）ＭＥＣ－１－、（Ｂ）ＭＥＣ－２－、（Ｃ）Ｒａｊｉ－、（Ｄ）Ｎａｌｍ－６－、および（Ｅ）Ｒａｍｏｓ細胞株に対する細胞毒性試験の結果。オビヌツズマブ（obinutuzumab）アマトキシンコンジュゲートＯｂｉ－３０．１６９９およびＯｂｉ－３０．２１１５を用いた（Ａ）ＭＥＣ－１－、（Ｂ）ＭＥＣ－２－、（Ｃ）Ｒａｊｉ－、（Ｄ）Ｎａｌｍ－６－、および（Ｅ）Ｒａｍｏｓ細胞株に対する細胞毒性試験の結果（コンジュゲートしていないα－アマニチンと比較した９６時間ＣＴＧアッセイ）。ＳｃｉｄマウスＲａｊｉ異種移植モデルシステムにおけるインビボでの抗ＣＤ２０アマトキシンコンジュゲートＲｔｘ‐３０．２１１５およびＯｂｉ‐３０．２１１５を用いた細胞毒性試験の結果。ＲＳ９７３７およびＲＳ１３１６細胞におけるＣＤ２０の発現。ＲＮＡ－ｓｅｑ分析（全トランスクリプトームショットガン配列決定）からのデータを、ＴＰＭ（１００万当たりの転写物）としてプロットする。低レベルのＣＤ２０を発現するＲＳ９７３７細胞（Ａ）および高レベルのＣＤ２０を発現するＲＳ１３１６細胞（Ｂ）を有するリヒター症候群の患者由来腫瘍異種移植モデルにおけるインビボでの抗ＣＤ２０アマトキシンコンジュゲートＯｂｉ－３０．１６９９を用いた有効性試験の結果。

発明の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、デバイスおよび方法は変化し得るので、本発明は、説明されたデバイスの特定の構成要素部分、または説明された方法のプロセス工程に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は文脈が明白に別段の規定をしない限り、単数形および/または複数の対象を含むことに留意しなければならない。さらに、数値で区切られたパラメータ範囲が与えられた場合、その範囲はこれらの制限値を含むものとみなされることも理解されるべきである。

さらに、本明細書に開示される実施形態は、互いに関連しない個々の実施形態として理解されることを意味しないことを理解されたい。一実施形態で論じられた特徴は、本明細書に示された他の実施形態に関連しても開示されることが意図される。１つの場合において、特定の特徴が１つの実施形態で開示されず、別の実施形態で開示される場合、当業者は、前記特徴が前記他の実施形態で開示されることを意図しないことを必ずしも意味しないことを理解するであろう。当業者は他の実施形態についても前記特徴を開示することが本出願の要旨であるが、明確性の目的のために、および明細書を管理可能なボリュームに保つために、これは行われていないことを理解するであろう。

さらに、本明細書で参照される先行技術文献の内容は、参照により組み込まれる。これは、特に、標準的または慣用的な方法を開示する先行技術文献を指す。その場合、参照による組み込みは、主に、十分な可能な開示を提供し、長い繰り返しを回避する目的を有する。

本発明の第１の態様によれば、本発明は（ｉ）標的結合部分、（ｉｉ）少なくとも１つの毒素、および（ｉｉｉ）任意選択で、前記標的結合部分を前記少なくとも１つの毒素と連結する少なくとも１つのリンカーを含み、前記標的結合部分がＣＤ２０に結合し、前記少なくとも１つの毒素がアマトキシンであるコンジュゲートに関する。

アマトキシンは、タマゴテングタケ（Amanita phalloides mushrooms）から見出される、８アミノ酸から構成される環状ペプチドである（図１参照）。アマトキシンは哺乳動物細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩを特異的に阻害し、それによって、影響を受けた細胞の転写およびタンパク質生合成も阻害する。細胞内での転写の阻害は、成長と増殖の停止を引き起こす。共有結合ではないが、アマニチンとＲＮＡポリメラーゼＩＩとの間の複合体は非常に緊密である（ＫＤ＝３ｎＭ）。酵素からのアマニチンの解離は非常に遅いプロセスであり、したがって、影響を受けた細胞の回復は起こりそうにない。転写の阻害が十分に続くと、細胞はプログラムされた細胞死（アポトーシス）を起こすことになる。

本発明の文脈において、用語「アマトキシン」は、Ａｍａｎｉｔａ属から単離され、Wieland, T.およびFaulstich H.（Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. 5(1978)185-260）に記載されているような８個のアミノ酸から構成されるすべての環状ペプチド；さらにそのすべての化学誘導体；さらにそのすべての半合成アナログ；天然化合物（環状、８個のアミノ酸）のマスター構造に従って構築されたビルディングブロックから構築されたそのすべての合成アナログ；さらに、ヒドロキシ化アミノ酸の代わりに非ヒドロキシ化アミノ酸を含有するすべての合成または半合成アナログ；さらに、スルホキシド部分がスルホン、チオエーテル、または硫黄とは異なる原子、例えば、アマニチンのカルボアナログにおけるような炭素原子によって置換されているすべての合成または半合成アナログを包含する。

本明細書中で使用される場合、ある化合物の「誘導体」は上記化合物に類似する化学構造を有するが、上記化合物中に存在しない少なくとも１つの化学基を含むか、および／または上記化合物中に存在する少なくとも１つの化学基を欠損している種を指す。誘導体が比較される化合物は、「親」化合物として知られている。典型的には、「誘導体」が１つ以上の化学反応工程において親化合物から生成され得る。

本明細書中で使用される場合、ある化合物の「アナログ」は構造的に関連するが、上記化合物と同一ではなく、上記化合物の少なくとも１つの活性を示す。アナログが比較される化合物は、「親」化合物として知られている。前述の活性には別の化合物への結合活性;阻害活性（例えば、酵素阻害活性）;毒性効果;活性化活性（例えば、酵素活性化活性）が含まれるが、これらに限定されない。アナログが親化合物と同程度にそのような活性を示す必要はない。化合物は親化合物の活性の少なくとも１％（より好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％）の程度まで関連する活性を示す場合、本出願の文脈内でアナログとみなされる。したがって、「アマトキシンのアナログ」とは、本明細書で使用される場合、α－アマニチン、β－アマニチン、γ－アマニチン、ε－アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、およびアマヌリン酸のいずれか１つに構造的に関連し、α－アマニチン、β－アマニチン、γ－アマニチン、ε－アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、およびアマヌリン酸の少なくとも１つと比較して、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する阻害活性の少なくとも１％（より好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％）を示す化合物を指す。本発明での使用に適した「アマトキシンのアナログ」は、α－アマニチン、β－アマニチン、γ－アマニチン、ε－アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、またはアマヌリン酸のいずれか１つよりも、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対してより大きな阻害活性さえも示し得る。阻害活性は、５０％の阻害が起こる濃度（ＩＣ₅₀）を測定することによって測定することができる。哺乳類ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する阻害活性は、細胞増殖に対する阻害活性を測定することにより間接的に測定することができる。

「半合成アナログ」は出発材料として天然源（例えば、植物材料、細菌培養物、真菌培養物または細胞培養物）からの化合物を使用する化学合成によって得られた類似体を指す。典型的には、本発明の「半合成アナログ」がＡｍａｎｉｔａｃｅａ科のキノコから単離された化合物から出発して合成された。対照的に、「合成アナログ」とは、小さい（典型的には石油化学）構成単位からいわゆる全合成によって合成されるアナログをいう。通常、この全合成は、生物学的プロセスの助けを借りずに行われる。

本発明のいくつかの態様によれば、アマトキシンは、α－アマニチン、β－アマニチン、アマニン、アマニンアミドおよびそれらのアナログ、誘導体および塩からなる群から選択することができる。

機能的には、アマトキシンは哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害するペプチドまたはデプシペプチドとして定義される。好ましいアマトキシンは下記で定義したリンカー分子または標的結合部分と反応させることができる官能基（例えば、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオールまたはチオール捕捉基）を有するものである。

本発明の文脈では、用語「アマニチン」は、特に、１位のアスパラギン酸又はアスパラギン残基、２位のプロリン残基、特にヒドロキシプロリン残基、３位のイソロイシン、ヒドロキシイソロイシン、又はジヒドロキシイソロイシン、４位のトリプトファン又はヒドロキシトリプトファン残基、５及び７位のグリシン残基、６位のイソロイシン残基、並びに８位のシステイン残基、特にスルホキシド又はスルホン誘導体に酸化されているシステインの誘導体に基づく二環式構造を指し（アマニチンのナンバリング及び代表例に関しては図１参照）、その全化学誘導体；さらなるその全半合成アナログ；天然化合物（環状、８アミノ酸）のマスター構造に従ってビルディングブロックから作製されたさらなるその全合成アナログ、ヒドロキシ化アミノ酸の代わりに非ヒドロキシ化アミノ酸を含むさらなる全合成又は半合成アナログ、さらなる全合成又は半合成アナログをさらに含み、各場合において、あらゆるそのような誘導体又はアナログは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害することにより機能的に活性である。

用語「標的結合部分」は、本明細書中で使用される場合、標的分子または標的エピトープに特異的に結合し得る任意の分子または分子の一部をいう。本出願の文脈における好ましい標的結合部分は、（ｉ）抗体またはその抗原結合フラグメント；（ｉｉ）抗体様タンパク質；および（ｉｉｉ）核酸アプタマーである。本発明で使用するのに適した「標的結合部分」は、典型的には４万Ｄａ（４０ｋＤａ）以上の分子量を有する。

本出願の文脈における「リンカー」とは、例えば、標的結合部分とアマトキシンとの間の立体障害を緩和するために、２つの成分間の距離を増加させる分子をいい、これがないと、アマトキシンがＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用する能力を減少させ得る。リンカーは、標的結合部分によって標的化される細胞において特異的にアマトキシンの放出を促進し得るので、別の目的に役立ち得る。リンカーおよび好ましくは一方の側のリンカーとアマトキシンとの間の結合、および他方の側のリンカーと標的結合部分または抗体との間の結合は細胞、例えば血液の外側の生理学的条件下で安定であるが、細胞の内側、特に標的細胞、例えば癌細胞の内側で切断することができることが好ましい。この選択的安定性を提供するために、リンカーは、好ましくはｐＨ感受性またはプロテアーゼ感受性である官能基を含み得る。あるいは、リンカーを標的結合部分に連結する結合が選択的安定性を提供し得る。好ましくは、リンカーが少なくとも１、好ましくは１～３０原子長（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０原子）の長さを有し、ここで、リンカーの一方の側はアマトキシンと反応し、他方の側は標的結合部分と反応している。本発明の文脈において、リンカーは好ましくはＣ_1-30－アルキル、Ｃ_1-30－ヘテロアルキル、Ｃ_2-30－アルケニル、Ｃ_2-30－ヘテロアルケニル、Ｃ_2-30－アルキニル、Ｃ_2-30－ヘテロアルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはヘテロアラルキル基であり、任意で置換されている。リンカーは、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、炭化水素部分などのような１つ以上の構造要素を含み得る。リンカーはまた、これらの構造要素の２つ以上の組み合わせを含み得る。これらの構造要素の各々はリンカー中に２回以上、例えば、２回、３回、４回、５回、または６回存在し得る。いくつかの実施形態では、リンカーはジスルフィド結合を含んでいてもよい。リンカーはアマトキシンおよび標的結合部分に、単一工程または２つ以上の後続工程いずれかで結合されなければならないことが理解される。その目的のために、リンカーは、好ましくは近位および遠位末端において、（ｉ）基、好ましくはアマトキシンまたは標的結合ペプチド上の活性化基への共有結合を形成し得るか、または（ｉｉ）活性化されてアマトキシン上の基と共有結合を形成し得る２つの基を有する。従って、リンカーが存在する場合、化学基はリンカーの遠位末端および近位末端にあることが好ましく、これは、このようなカップリング反応の結果であり、例えば、エステル、エーテル、ウレタン、ペプチド結合などである。「リンカー」の存在は任意であり、すなわち、標的結合部分毒素コンジュゲートのいくつかの実施形態において、毒素は標的結合部分の残基に直接連結されてもよい。

本発明はさらに、ＣＤ２０に結合する標的結合部分と、少なくとも１つのアマトキシンと、任意選択でリンカーとを含むコンジュゲートであって、前記標的結合部分が、
それぞれＣＤ２０に結合する
（ｉ）抗体、好ましくはモノクローナル抗体、
（ｉｉ）その抗原結合フラグメント、好ましくは可変領域（Ｆｖ）、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ）₂フラグメント、
（ｉｉｉ）その抗原結合誘導体、好ましくは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、および
（ｉｖ）抗体様タンパク質
からなる群より選択されるコンジュゲートに関する。

本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントまたはそれに由来するｃＤＮＡによってコードされる１つ以上のポリペプチド鎖からなるタンパク質をいう。前記免疫グロブリン遺伝子は、軽鎖κ、λおよび重鎖α、δ、ε、γおよびμ定常領域遺伝子、ならびに多くの異なる可変領域遺伝子のいずれかを含む。

基本的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、通常、軽鎖（Ｌ、約２５ｋＤａの分子量を有する）および重鎖（Ｈ、約５０～７０ｋＤａの分子量を有する）の２つの同一の対のポリペプチド鎖から構成される四量体である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨまたはＶ_Hと略す）と重鎖定常領域（ＣＨまたはＣ_Hと略す）で構成されている。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖には、軽鎖可変領域（ＶＬまたはＶ_Lと略す）と軽鎖定常領域（ＣＬまたはＣ_Lと略す）が含まれている。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる、超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬ領域は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを形成する。

ＣＤＲは、抗体またはその抗原結合部分の結合に最も重要である。ＦＲは抗原の結合に必要な三次元構造が保持されるならば、他の配列で置き換えることができる。構築物の構造変化は、ほとんどの場合、抗原への十分な結合の損失をもたらす。

（モノクローナル）抗体の「抗原結合部分」という用語は、そのネイティブ型でＣＤ２０抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントをいう。前記ＣＤ２０抗原は、哺乳動物、非霊長類、霊長類、および特にヒトＣＤ２０抗原であり得る。「ＣＤ２０」は、本明細書において、配列番号６に従うアミノ酸配列、または配列番号６と少なくとも９０％、９２．５％、９５％、もしくは少なくとも９７％同一である配列を含むか、またはそれらからなるタンパク質をいう。抗体の抗原結合部分の例には、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、ならびにＶＨドメインおよび単離相補性決定領域（ＣＤＲ）からなるｄＡｂフラグメントが含まれる。

本発明による配列同一性は例えば、同じまたは類似の長さの配列に特に適しているそれぞれの参照配列（いわゆる「グローバルアラインメント」）と比較される各配列の全長にわたって、または等しくない長さの配列により適している、より短い定義された長さ（いわゆる「ローカルアラインメント」）にわたって決定されてもよい。上記の文脈において、クエリーアミノ酸配列に対して少なくとも、例えば、９５％の「配列同一性」を有するアミノ酸配列は、対象アミノ酸配列がクエリーアミノ酸配列の各１００アミノ酸あたり最大５つのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、対象アミノ酸配列の配列がクエリー配列と同一であることを意味することが意図される。言い換えれば、クエリーアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性の配列を有するアミノ酸配列を得るために、対象配列中のアミノ酸残基の５％（１００のうち５）までが、別のアミノ酸で挿入または置換され得るか、または欠失され得る。２つ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法は、当該分野で周知である。２つの配列が同一であるパーセンテージは例えば、数学的アルゴリズムを使用することによって決定され得る。使用することができる数学的アルゴリズムの好ましい例はKarlin et al(1993), PNAS USA, 90:5873-5877のアルゴリズムであるが、これに限定されるものではない。このようなアルゴリズムはプログラムのＢＬＡＳＴファミリーに組み込まれ（Altschul et al.1990, J. Mol. Biol.215,403-410またはAltschul et al.(1997)， Nucleic Acids Res,25:3389-3402も参照のこと）、これは、ワールドワイドウェブサイトncbi.nlm.nih.govにおけるＮＣＢＩのホームページおよびＦＡＳＴＡ（Pearson(1990), Methods Enzymol. 83, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448）を介してアクセス可能である。ある程度他の配列と同一である配列は、これらのプログラムによって同定することができる。さらに、Wisconsin Sequence Analysis Package(Devereux et al. 1984, Nucleic Acids Res., 387-395; Womble Methods Mol Biol.2000; 132:3-22）において入手可能なプログラム、例えば、プログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを用いて、２つのポリペプチド配列間の％同一性を決定してもよい。

本発明による抗体、またはその抗体フラグメントもしくは抗体誘導体は、モノクローナル抗体であり得る。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプであり得る。

本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」は均質な抗体集団（すなわち、全免疫グロブリン、またはそのフラグメントもしくは誘導体からなる均質な集団）を有する抗体組成物をいう。特に好ましくは、このような抗体がＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ、またはそのフラグメントもしくは誘導体からなる群より選択される。モノクローナル抗体は例えば、Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975); Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって，組換えＤＮＡ技術によって、作製されてもよく、またはファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。

本明細書中で使用される場合、「フラグメント」または「抗体フラグメント」という語は標的結合能力を保持するこのような抗体のフラグメント、例えば、ＣＤＲ（相補性決定領域）、超可変領域、可変ドメイン（Ｆｖ）、ＩｇＧ重鎖（ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる）、ＩｇＧ軽鎖（ＶＬおよびＣＬ領域からなる）、ならびに／またはＦａｂおよび／もしくはＦ（ａｂ）₂）をいう。

本明細書中で使用される場合、「誘導体」という語は一般的な抗体コンセプト、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ）₂、ならびに二重、三重またはそれ以上の特異的抗体構築物とは構造的に異なっているが、それでもいくらかの構造的関連性を有する蛋白質構築物を指すものとする。以下、これらの事項について説明する。

当業者に公知の他の抗体誘導体は、二重特異性抗体、ラクダ科動物抗体、ドメイン抗体、ｓｃＦｖｓからなる２つの鎖を有する二価ホモダイマー、ＩｇＡｓ（Ｊ鎖および分泌成分によって連結された２つのＩｇＧ構造）、サメ抗体、新規世界霊長類フレームワークおよび非新規世界霊長類ＣＤＲからなる抗体、ＣＨ３＋ＶＬ＋ＶＨを含む二量体化構築物、ＣＤＲを含む他の足場タンパク質フォーマット、および抗体コンジュゲート（例えば、薬物、毒素、サイトカイン、アプタマー、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸、治療用ポリペプチド、放射性同位体または標識に連結された、抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体）である。前記足場タンパク質フォーマットは例えば、アンキリンおよびアフィリンタンパク質などの抗体様タンパク質などを含み得る。

本明細書中で使用される場合、用語「抗体様タンパク質」は標的分子に特異的に結合するように（例えば、Ｉｇループの突然変異誘発によって）操作されたタンパク質をいう。典型的には、このような抗体様タンパク質が両端がタンパク質足場に付着した少なくとも１つの可変ペプチドループを含む。この二重構造的拘束は、抗体様タンパク質の結合親和性を、抗体の結合親和性に匹敵するレベルまで大幅に増加させる。可変ペプチドループの長さは、典型的には１０～２０アミノ酸からなる。足場タンパク質は、良好な溶解特性を有する任意のタンパク質であり得る。好ましくは、足場タンパク質は小球状タンパク質である。抗体様タンパク質としてはアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、および設計されたアンキリン反復タンパク質（Binz et al., 2005）が挙げられるが、これらに限定されない。抗体様タンパク質は例えば、大きなファージディスプレイライブラリーからのパニングによって、突然変異体の大きなライブラリーから誘導することができ、通常の抗体と同様に単離することができる。また、抗体様結合タンパク質は、球状タンパク質中の表面露出残基のコンビナトリアル突然変異誘発によって得ることができる。

本明細書中で使用される場合、用語「Ｆａｂ」は抗原結合領域を含むＩｇＧフラグメントに関連し、このフラグメントは、抗体の各重鎖および軽鎖由来の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインから構成される。

本明細書で使用される「Ｆ（ａｂ）₂」という用語は、ジスルフィド結合によって互いに連結された２つのＦａｂフラグメントからなるＩｇＧフラグメントに関する。

本明細書中で使用される場合、用語「ｓｃＦｖ」は、短いリンカー（通常、セリン（Ｓ）および／またはグリシン（Ｇ）残渣を含む）と一緒に連結された、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合物である単鎖可変フラグメントに関する。このキメラ分子は、定常領域の除去およびリンカーペプチドの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。

改変された抗体形式は例えば、二重または三重特異性抗体構築物、抗体ベースの融合タンパク質、免疫コンジュゲートなどである。

ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ）₂は、当業者に周知の形態である。関連する可能化技術は、それぞれの教科書から入手可能である。

本発明の好ましい実施形態によれば、前記抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは抗原結合誘導体は、それぞれ、マウス、キメラ、ヒト化もしくはヒト抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは抗原結合誘導体である。

マウス由来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は抗体を誘発し得る別の種由来のタンパク質を含むという事実のために、望ましくない免疫学的副作用を引き起こし得る。この問題を克服するために、理想的には非ヒト親抗体の特異性および親和性をなお保持しながら、ヒトに適用した場合に最小の免疫原性を有する抗体分子を生成するように、抗体ヒト化および成熟方法が設計されている（レビューとしてはAlmagroおよびFransson 2008を参照のこと）。これらの方法を使用して、例えば、マウスｍＡｂのフレームワーク領域は、対応するヒトフレームワーク領域によって置換される（いわゆるＣＤＲ移植）。ＷＯ２００９０７８６１は、組換えＤＮＡ技術によって非ヒト抗体のＣＤＲ領域をヒト定常領域に連結することによる、ヒト化形態のマウス抗体の生成を開示する。Medical Research CouncilによるＵＳ６５４８６４０はＣＤＲ移植技術を記載し、CelltechによるＵＳ５８５９２０５は、ヒト化抗体の産生を記載する。

本明細書中で使用される場合、用語「ヒト化抗体」は抗体、そのフラグメントまたは誘導体に関し、ここで、抗体の定常領域および／またはフレームワーク領域の少なくとも一部、および場合によりＣＤＲ領域の一部は、ヒト免疫グロブリン配列に由来するか、またはそれに調節される。

本明細書中に開示される抗体、その抗体フラグメントまたは抗体誘導体はヒト化配列、特に、適切なリガンド親和性を維持する好ましいＶＨおよびＶＬベースの抗原結合領域を含み得る。前記ヒト化配列を得るためのアミノ酸配列改変は、元の抗体のＣＤＲ領域および／またはフレームワーク領域および／または抗体定常領域配列において起こり得る。

前記抗体、またはその抗体フラグメントもしくは抗体誘導体は、グリコシル化することができる。グリカンは、重鎖のアスパラギン２９７におけるＮ結合オリゴ糖鎖であり得る。

本発明の抗体またはフラグメントまたは誘導体は、本発明による抗体のコード配列を含む発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクションすることによって産生され得る。発現ベクターまたは組換えプラスミドはプロモーターおよびエンハンサー配列（例えば、ＣＭＶプロモーターなど）を含む、適切な調節遺伝子エレメントの制御下にコード抗体配列を置くことによって産生される。重鎖および軽鎖配列は同時トランスフェクトされる個々の発現ベクターから、または二重発現ベクターから発現され得る。前記トランスフェクションは、一過性トランスフェクションまたは安定トランスフェクションであってもよい。トランスフェクトされた細胞は、続いて、トランスフェクトされた抗体構築物を産生するために培養される。安定なトランスフェクションが行われる場合、次いで、適切に会合した重鎖および軽鎖を有する抗体を分泌する安定なクローンが適切なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）でスクリーニングすることによって選択され、サブクローニングされ、そして将来の製造のために増殖される。

本発明の好ましい実施形態によれば、前記抗体、またはその抗原結合フラグメント、またはその抗原結合誘導体は、それぞれ、リツキシマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、トシツモマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、およびウブリツキシマブからなる群より選択される。本明細書中で使用される国際非独占的名称（ＩＮＮ）はまた、４２ＵＳＣ §２６２サブセクション（ｉ）または他の管轄区域における同等の規則に従って、上記に開示されるようなオリジネーター抗体と同一または実質的に同一のアミノ酸配列および／またはグリコシル化パターンを有するすべてのバイオシミラー抗体を包含することを意味する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される抗体は重鎖１１８Ｃｙｓ、重鎖２３９Ｃｙｓ、または重鎖２６５ＣｙｓをＥＵ番号付けシステム（例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1969,63,78-85を参照のこと）、好ましくはＥＵ番号付けシステムによる重鎖２６５Ｃｙｓを含むように遺伝子操作され、ここで、存在する場合前記リンカー、または前記アマトキシンは、それぞれ、前記重鎖１１８Ｃｙｓ、または前記重鎖２３９Ｃｙｓ、または重鎖２６５Ｃｙｓ残基を介して前記抗体に連結される。例えば、ＷＯ２００６／０３４４８８Ａ２は、システインで操作された抗体の対応する製造方法を開示している。

本発明の一実施形態によれば、前記抗体は、ＥＵ番号付けシステムに従って重鎖２６５Ｃｙｓを含むように遺伝子操作されたリツキシマブである。

本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子工学的に操作された」または「遺伝子工学」は、遺伝子技術的方法による、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸置換、挿入、欠失もしくは復帰、またはそれらの任意の組み合わせの意味での、所与のまたは天然のポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列またはその一部の改変に関する。

本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸置換」はタンパク質のアミノ酸配列の改変に関連し、ここで、１つ以上のアミノ酸は、同じ数の異なるアミノ酸で置換され、元のタンパク質とは異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を産生する。保存的アミノ酸置換は類似のサイズ、電荷、極性および／またはコンホメーションのために、タンパク質の構造および機能に有意に影響を及ぼさない置換に関連すると理解される。その意味での保存的アミノ酸の基は例えば、非極性アミノ酸Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕ；芳香族アミノ酸Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒ；正に荷電したアミノ酸Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓ；ならびに負に荷電したアミノ酸ＡｓｐおよびＧｌｕを表す。

本発明の好ましい実施形態によれば、前記リンカー（存在する場合）、または前記アマトキシン、または前記リンカーに結合した前記アマトキシンは、前記抗体の天然に存在するＣｙｓ残基のいずれかを介して、好ましくはジスルフィド結合を介して前記抗体に結合している。本明細書中で使用される用語「天然に存在するＣｙｓ残基」はリツキシマブのようなネイティブ抗体中に存在し、そして抗体の軽鎖および重鎖中に鎖内ジスルフィド結合を形成するか、または重鎖と軽鎖との間および／または抗体の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合（例えば、ＩｇＧ免疫グロブリンのヒンジ領域中のジスルフィド結合）を形成するシステイン残基をいう。前記リンカー（存在する場合）を連結またはカップリングするための好ましい天然に存在するＣｙｓ残基、または本明細書に開示される前記リンカーにカップリングされる前記アマトキシンまたは前記アマトキシンは、ネイティブＩｇＧ免疫グロブリンのヒンジ領域において両方の重鎖を連結する鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基である。従って、本明細書中に開示されるようなリンカーに結合されたアマトキシン、リンカー、またはアマトキシンは、例えば鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を介して抗体に結合される。ネイティブ抗体における鎖間ジスルフィド結合に寄与するシステイン残基へのカップリングは例えば、mAbs 6:1,46-53(2014)、またはClinical Cancer Research Vol.10,7063-7070, October 15,2004に開示されている方法に従って行うことができる。

本発明の特に好ましい実施形態によれば、前記抗体はリツキシマブである。

好ましい実施形態では前記コンジュゲートの抗体、またはその抗体フラグメントもしくは抗体誘導体はＣＤ２０分子の細胞外ドメインに結合する。

好ましい実施形態において、本発明は、上記の抗体、またはその抗体フラグメントもしくは抗体誘導体を含むコンジュゲートであって、ＣＤ２０の細胞外ドメインに結合するコンジュゲートに関する。

さらに、本発明によるコンジュゲートは、１０×１０^-9Ｍ、９×１０^-9Ｍ、８×１０^-9Ｍ、７×１０^-9Ｍ、６×１０^-9Ｍ、５×１０^-9Ｍ、４×１０^-9Ｍ、３×１０^-9Ｍ、２×１０^-9Ｍ以上、好ましくは１０×１０^-10Ｍ、９×１０^-10Ｍ、８×１０^-10Ｍ、７×１０^-10Ｍ、６×１０^-10Ｍ、５×１０^-10Ｍ、４×１０^-10Ｍ、３×１０^-10Ｍ、２×１０^-10Ｍ以上、より好ましくは１０×１０^-11Ｍ、９×１０^-11Ｍ、８×１０^-11Ｍ、７×１０^-11Ｍ、６×１０^-11Ｍ、５×１０^-11Ｍ、４×１０^-11Ｍ、３×１０^-11Ｍ、２×１０^-11Ｍ、または１×１０^-11Ｍ以上の細胞毒性を有しうる。

本発明の好ましい実施形態において、記載の前記コンジュゲートは、（ｉ）６’－デオキシ位を有するアミノ酸４および（ｉｉ）Ｓ－デオキシ位を有するアミノ酸８を含むアマトキシンを含む。

本発明の好ましい実施形態によれば、記載の前記コンジュゲートはリンカーを含み、前記リンカーは、非切断性または切断性のリンカーである。

前記切断性リンカーは、酵素的に切断可能なリンカー、好ましくはプロテアーゼで切断可能なリンカー、および化学的に切断可能なリンカー、好ましくはジスルフィド架橋を含むリンカーからなる群より選択することができる。

「切断性リンカー」は、少なくとも１つの切断部位を含むと理解される。本明細書中で使用される場合、用語「切断部位」は、特定の条件下で規定された位置で特異的切断に感受性である部分をいう。前記条件は例えば、特定の身体または細胞区画における特定の酵素または還元的環境である。

本発明の実施形態によれば、切断部位は、２つ以上のアミノ酸を含む酵素的に切断可能な部分である。好ましくは、前記酵素的に切断可能な部分は、バリンーアラニン（Ｖａｌ－Ａｌａ）、バリンーシトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、バリンーリジン（Ｖａｌ－Ｌｙｓ）、バリンーアルギニン（Ｖａｌ－Ａｒｇ）ジペプチド、フェニルアラニンーリジンーグリシンープロリンーロイシンーグリシン（ＰｈｅＬｙｓＧｌｙＰｒｏＬｅｕＧｌｙ）またはアラニンーアラニンープロリンーバリン（ＡｌａＡｌａＰｒｏＶａｌ）ペプチド、またはβ－グルクロニドまたはβ－ガラクトシドを含む。

いくつかの実施形態によれば、前記切断部位は、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、およびアスパラギン酸プロテアーゼからなる群より選択される少なくとも１つのプロテアーゼによって切断可能であり得る。

チオールプロテアーゼとしても知られるシステインプロテアーゼは、触媒トリアドまたはダイアド中の求核システインチオールを含む共通の触媒メカニズムを共有するプロテアーゼである。

メタロプロテアーゼは、触媒メカニズムが金属を含むプロテアーゼである。ほとんどのメタロプロテアーゼは亜鉛を必要とするが、コバルトを使用するものもある。金属イオンは、３つのリガンドを介してタンパク質に配位する。金属イオンを配位するリガンドは、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、およびアルギニンによって変化し得る。第４の配位位置は、不安定な水分子によって取り込まれる。

セリンプロテアーゼはタンパク質中のペプチド結合を切断する酵素であり、セリンは酵素の活性部位で求核アミノ酸として働く。セリンプロテアーゼはその構造に基づいて大きく２つのカテゴリーに分類される：キモトリプシン様（トリプシン様）またはスブチリシン様。

トレオニンプロテアーゼは、活性部位内にトレオニン（Ｔｈｒ）残渣を有するタンパク質分解酵素のファミリーである。このクラスの酵素の原型メンバーはプロテアソームの触媒サブユニットであるが、アシルトランスフェラーゼは同じ活性部位の幾何学とメカニズムとを収束的に進化させた。

アスパラギン酸プロテアーゼは、それらのペプチド基質の触媒作用のために１つ以上のアスパラギン酸残基に結合した活性化水分子を使用する触媒型のプロテアーゼ酵素である。一般に、それらは、活性部位に２つの高度に保存されたアスパラギン酸を有し、酸性ｐＨで最適に活性である。ほとんど全ての既知のアスパルチルプロテアーゼは、ペプスタチンによって阻害される。

本発明の特定の実施形態において、切断性部位は、カテプシンＡまたはＢ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、エラスターゼ、β－グルクロニダーゼおよびβ－ガラクトシダーゼからなる群より選択される少なくとも１つの薬剤によって切断可能である。

本発明の特定の実施形態では、切断部位はジスルフィド結合であり、特異的切断は還元的環境、例えば、細胞内還元的環境、例えば、酸性ｐＨ条件によって行われる。

本発明の好ましい実施形態によれば、記載された前記コンジュゲートにおいて、前記リンカー（存在する場合）、または前記標的結合部分は、（ｉ）アマトキシンアミノ酸１のγＣ原子、または（ｉｉ）アマトキシンアミノ酸３のδＣ原子、または（ｉｉｉ）アマトキシンアミノ酸４の６’－Ｃ原子を介して前記アマトキシンに連結される。

本発明の特に好ましい実施形態によれば、前記コンジュゲートは、リンカー－アマトキシン部分として、それぞれ式（Ｉ）～（ＸＩＩ）の以下の化合物のいずれかを含む：

さらに、本発明の特に好ましい実施形態によれば、前記コンジュゲートは、式ＸＩＩＩ～ＸＸＩＩのいずれか１つに従い、抗体をアマトキシンリンカー部分にコンジュゲートした標的結合部分として含む。

式中、アマトキシンリンカー部分は前記抗体の天然に存在するリジン残基のε－アミノ基に結合し、ｎは好ましくは１～７である。

さらに、本発明の特に好ましい実施形態によれば、前記コンジュゲートは、式ＸＸＩＩＩおよびＸＸＩＶのいずれか１つに従い、抗体をアマトキシンリンカー部分にコンジュゲートした標的結合部分として含む。

ここで、アマトキシンリンカー部分は、前記抗体のシステイン残基のチオール基に結合し、ｎは好ましくは１～７である。

本発明のさらに特に好ましい実施形態によれば、前記コンジュゲートは以下からなる群から選択される。
（ｉ）抗体リツキシマブを、リツキシマブの少なくとも１つの天然に存在するＣｙｓ残渣、例えば、リツキシマブの鎖間ジスルフィド結合に寄与する少なくとも１つのＣｙｓ残渣へのチオエーテル結合を介して式（ＸＩ）の少なくとも１つのアマトキシン－リンカー部分にコンジュゲートした標的結合部分として含む、式ＸＸＶに従うコンジュゲート；

（ｉｉ）ＥＵ番号付けシステムによる重鎖２６５Ｃｙｓを含むように遺伝子操作された抗体リツキシマブを、前記遺伝子操作されたリツキシマブの前記重鎖２６５Ｃｙｓ残基へのチオエーテル結合を介して式（ＸＩ）のアマトキシンリンカー部分にコンジュゲートした標的結合部分として含む、式ＸＸＶＩに従うコンジュゲート；

（ｉｉｉ）抗体リツキシマブを、チオエーテル結合を介して式（ＸＩＩ）の少なくとも１つのアマトキシン－リンカー部分に、またはリツキシマブの少なくとも１つの天然に存在するＣｙｓ残渣、例えば、式ＸＸＶＩＩによるリツキシマブの鎖間ジスルフィド結合に寄与する少なくとも１つのＣｙｓ残基に、コンジュゲートした標的結合部分として含む、式ＸＸＶＩＩに従うコンジュゲート；

（ｉｖ）ＥＵ番号付けシステムによる重鎖２６５Ｃｙｓを含むように遺伝子操作された抗体リツキシマブを、前記遺伝子操作されたリツキシマブの前記重鎖２６５Ｃｙｓ残基へのチオエーテル結合を介して式（ＸＩＩ）のアマトキシンリンカー部分にコンジュゲートした標的結合部分として含む、式ＸＸＶＩＩＩに従うコンジュゲート；

式中、（ｉ）、（ｉｉｉ）についてｎは１～７であり、（ｉｉ）、（ｉｖ）についてｎは１～２である。

本発明の別の態様によれば、本発明は、記載された前記コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。

前記医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される緩衝剤、界面活性剤、希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、滑沢剤、崩壊剤、吸着剤、および／または防腐剤を含み得る。

水性形態では前記医薬製剤が投与の準備ができているが、凍結乾燥形態では前記製剤が例えば、ベンジルアルコール、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、レチニルパルミテート、およびセレンのような抗酸化剤、アミノ酸のシステインおよびメチオニン、クエン酸およびクエン酸ナトリウム、パラベンのメチルパラベンおよびプロピルパラベンのような合成防腐剤などの防腐剤を含んでいても含んでいなくてもよい注射用水の添加によって、投与前に液体形態に移すことができる。

前記医薬製剤は例えば、アミノ酸、糖ポリオール、二糖、および／または多糖であり得る１つ以上の安定剤をさらに含み得る。前記医薬製剤は、１つ以上の界面活性剤、１つ以上の等張化剤、および／または１つ以上の金属イオンキレート剤、および／または１つ以上の防腐剤をさらに含み得る。

本明細書に記載の医薬製剤は、少なくとも静脈内、筋肉内、または皮下投与に適し得る。あるいは、本発明による前記コンジュゲートは、一定期間にわたる生物学的に活性な薬剤の持続的放出を可能にするデポ製剤で提供され得る。

本発明のさらに別の態様では、本発明の先の態様による前記製剤を含む、予め充填されたシリンジまたはペン、バイアル、または注入バッグなどの一次包装が提供される。

予め充填されたシリンジまたはペンは凍結乾燥形態（これは、次いで、例えば注射用水で、投与の前に溶解しなければならない）、または水性形態のいずれかで、前記製剤を含み得る。前記シリンジまたはペンはしばしば、単回使用のみのための使い捨て物品であり、０．１～２０ｍｌの体積を有し得る。しかしながら、注射器又はペンは、複数回使用又は複数回用量の注射器又はペンであってもよい。

前記バイアルはまた、凍結乾燥形態または水性形態の製剤を含有していてもよく、単回または複数回使用デバイスとして使用してもよい。複数回使用デバイスとして、前記バイアルは、より大きな体積を有することができる。前記注入バッグは通常、水性形態の製剤を含み、２０～５０００ｍｌの体積を有し得る。

本発明の別の態様によると、本発明は、Ｂリンパ球関連悪性腫瘍またはＢ細胞媒介性自己免疫疾患の治療での使用のための、特に、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、リヒター症候群、関節リウマチ、多発血管炎および顕微鏡的多発血管炎を伴う肉芽腫症および尋常性天疱瘡の治療での使用のための、記載された前記コンジュゲートまたは医薬組成物に関する。

本発明は、Ｂリンパ球関連悪性腫瘍またはＢ細胞媒介性自己免疫疾患の治療のための、特に非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、リヒター症候群、関節リウマチ、多発血管炎および顕微鏡的多発血管炎を伴う肉芽腫症および尋常性天疱瘡の治療のための、前記コンジュゲートまたは医薬組成物の使用に関する。

リヒター症候群は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫の侵攻性リンパ腫、最も一般的にはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）への形質転換と定義される。ＣＬＬ患者の約２％～１０％に発生し、リヒター症候群は非常に侵攻性で、治療に抵抗性であることが多く、治療成績は約８～１４ヵ月と不良である。症例の約８０％は基礎疾患であるＣＬＬにクローン的に関連しているが、残りの２０％の患者はクローン的に関連しないＤＬＢＣＬを有し、ｄｅｎｏｖｏＤＬＢＣＬと同様に予後が良好である（Ｖａｉｓｉｔｔｉｅｔａｌ２０１８）。ＣＬＬＢ細胞の生殖細胞系遺伝学的特性、臨床的特性、生物学的および体細胞の遺伝学的特性と特定のＣＬＬ治療法との組み合わせは、リヒター症候群のより高いリスクと関連している。

本発明はまた、有効量の前記コンジュゲートまたは医薬組成物を患者に投与することを含む、Ｂリンパ球関連悪性腫瘍またはＢ細胞媒介性自己免疫疾患に罹患している患者を治療する方法に関する。例えば、本明細書に開示されるようなＢリンパ球関連悪性腫瘍またはＢ細胞媒介性自己免疫疾患に罹患している患者を治療する方法は約０．１ｍｇ／ｋｇ体重～約２５ｍｇ／ｋｇ体重の前記コンジュゲートまたは医薬組成物を前記患者に投与することを含み、それによって、前記コンジュゲートまたは医薬組成物は、前記患者に少なくとも１回投与される。前記コンジュゲートまたは医薬組成物の好ましい投与経路は例えば、治療的有効量での静脈内（ｉ．ｖ．）投与または皮下（ｓ．ｃ．）投与を含み得る。

配列

本発明は図面および前述の説明において詳細に図示および説明されてきたが、そのような図示および説明は例示的または例示的であり、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明は開示された実施形態に限定されない。開示された実施形態に対する他の変形は図面、開示、および添付の特許請求の範囲の検討から、特許請求された発明を実施する際に当業者によって理解され、実施されることができる。特許請求の範囲において、単語「含む」は他の要素又は工程を排除するものではなく、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は複数を排除するものではない。特定の手段が相互に異なる従属請求項に記載されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせが有利に使用されることができないことを示すものではない。特許請求の範囲におけるいかなる参照符号も、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

本明細書中に開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端へ示され；本明細書中に開示される全ての核酸配列が５’－＞３’で示される。

実施例１：リツキシマブのリンパ腫細胞株への結合
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブのＣＤ２０陽性ヒト慢性Ｂ細胞白血病細胞株ＭＥＣ－１及びＭＥＣ－２並びにヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉへの結合をＦＡＣＳ分析により調べた。リツキシマブは、ＣＤ２０陽性ＭＥＣ－１、ＭＥＣ－２およびＲａｊｉ細胞株に強く結合することが示された（図２）。

実施例２：切断性リンカーを有する抗ＣＤ２０アマトキシンコンジュゲート
実施例２．１：非切断性リンカーを有する抗ＣＤ２０アマトキシンコンジュゲートの合成

工程１：６’－Ｏ－（６－Ｂｏｃ－アミノヘキシル）－α－アマニチン（ＨＤＰ３０．０１３２）

ＤＭＳＯ（３．５ｍＬ）中のα－アマニチン（１０５ｍｇ、１１４μｍｏｌ）および６－（Ｂｏｃ－アミノ）－ヘキシルブロミド（１２８ｍｇ、４５７μｍｏｌ）の溶液を、アルゴン雰囲気下で２Ｍ水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）溶液（６８．６μｌ、１３７．１μｍｏｌ）で処理した。周囲温度で４０分間撹拌した後、反応混合物をＡｃＯＨ（７．８４μｌ）の添加によって酸性化し、次いで、混合物を、所望のエーテル中間体を沈殿させるために、ＭＴＢＥ（４０ｍＬ）を含有するフラスコに滴下式で添加した。上清をデカントし、廃棄した。沈殿物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ［λ＝３０５ｎｍ；濃度勾配：０～５分５％Ｂ；２０～２５分１００％Ｂ；２７～３５分５％Ｂ；Ａ＝水；Ｂ＝メタノール］によって精製して、ＨＤＰ３０．０１３２（８４．３７ｍｇ、６６％）を白色粉末として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ実測値：１１１８．５計算値：１１１９．２９［Ｍ＋Ｈ］⁺

工程２：６’－Ｏ－（６－アミノヘキシル）－α－アマニチン（ＨＤＰ３０．０１３４）

ＨＤＰ３０．０１３２（１５２ｍｇ、１３６μｍｏｌ）にＴＦＡ（５ｍＬ）を加え、反応混合物を周囲温度で２分間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、粗生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ［λ＝３０５ｎｍ；濃度勾配：０分５％Ｂ；０～１分３０％Ｂ；１～１０分３９％Ｂ；１０～１３分１００％Ｂ；１３～１８分５％Ｂ；Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水；Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むメタノール］によって精製した。生成物を含有する画分を合わせ、濃縮し、凍結乾燥して、誘導体ＨＤＰ３０．０１３４（１１８．６７ｍｇ、８６％）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ実測値：１０１８．５計算値：１０１９．１７［Ｍ＋Ｈ］⁺

工程３：６’－Ｏ－（６－アミノヘキシル）－α－アマニチンＮ－スクシンイミジル
カルバメートＨＤＰ３０．０６４３

工程２の生成物、２０７ｍｇ（１８３μｍｏｌ）のＨＤＰ３０．０１３４を溶解し、４０００μｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含む５０ｍｌ円錐遠心管に移した。

Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネートの０．２Ｍ溶液を、１２８ｍｇ（５００μｍｏｌ）のＤＳＣを２５００μｌのＤＭＦに溶解することによって調製し、得られた溶液１８２８μｌ（３６６μｍｏｌ＝２当量）をＨＤＰ３０．０１３４に添加し、続いて５０，７μｌ（３６６μｍｏｌ＝２当量）のトリエチルアミンを添加した。

ボルテックス後、遠心管を周囲温度のオービタルシェーカー上に置いた。５分後のＴＬＣコントロールは、出発物質の完全な消費を示した。続いて、４０ｍｌの氷冷ＭＴＢＥおよび２０μｌのＴＦＡを遠心管に添加した。激しくボルテックスした後、遠心管を氷浴中に１０分間置き、沈殿物を４０００×ｇで３分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを、再懸濁および沈降の手段により、１０ｍＬの氷冷０．０５％ＴＦＡ／ＭＴＢＥで洗浄した。固体を真空中で乾燥させ、分取ＨＰＬＣによって精製した２４００μｌの水／メタノール５：９５＋０．０５％ＴＦＡに再溶解した。

生成物含有画分を合わせ、蒸発させた。残渣を、０．０５％ＴＦＡを含有するｔｅｒｔ－ブタノールおよび水４：１の混合物１０ｍｌに溶解する。溶液をシリンジフィルター（ナイロン０．２μｍ、３０ｍｍ）に通し、凍結乾燥した：
１７０ｍｇ（８０％）無色の粉末
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：１１５９．４２；ＭＨ＋．に対するｃａｌｃ（Ｃ５０Ｈ７１Ｎ１２Ｏ１８Ｓ）：１１５９．４７。

工程４ａ：６’－Ｏ－（６－アミノヘキシル）－α－アマニチンのリツキシマブへのコンジュゲート

変形例Ａ：ＤＳＣおよびＨＤＰ３０．０１３４を用いたＩｎｓｉｔｕ活性化
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブを、カップリング試薬ＤＳＣ（Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート）の使用によって化合物Ｉにコンジュゲートさせ、以下のように、リツキシマブのリジン残基にアマトキシンのアミノ酸４のインドール系の６’－位を連結する非切断性リンカーを有するリツキシマブ－アマトキシンコンジュゲート（Ｒｔｘ－ＤＳＣ－３０．０１３４）を得た：

０．６６ｍｇの６’－（－６－アミノヘキシル）－α－アマニチンＨＤＰ３０．０１３４を７２μｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。アルゴン下、室温で撹拌しながら、ＤＭＦ（１００μｌのＤＭＦ中２．５６ｍｇ）中のジヒドロキシスクシンイミドカーボネート（ＤＳＣ）の溶液６．７μｌおよびトリエチルアミン１．３μｌを一度に添加した。反応混合物を室温にて撹拌した。１２時間後、３０ｍｌの冷ジエチルエーテルを添加した。α－アマニチン－６’－（－６－アミノヘキシル－６－ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート）の沈殿を集め、ジエチルエーテルで数回洗浄し、真空乾燥した。残った固体を１００μｌのＤＭＦに溶解した。

上記で調製したＤＭＦ溶液の４．０μｌを、リツキシマブ（Ｒｏｃｈｅ）溶液（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の２．０ｍｇ／ｍｌ）２２５μｌに添加した。
混合物を４℃で１４時間振盪し、ＰＤ－１０カラム上でＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５ゲル濾過により分離した。タンパク質画分をＵＶ吸収により検出し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮遠心機（３０００ｇ）で濃縮した。タンパク質濃度を、ＲｏｔｉＱｕａｎｔ－Ａｓｓａｙ（ＣａｒｌＲｏｔｈ；ドイツ）によって決定し、２．０ｍｇ／ｍｌに調節した。リツキシマブのアマニチンペイロードを、抗体およびα－アマニチンの吸光係数を用いて、２８０ｎｍおよび３１０ｎｍでのＵＶ吸収によって決定し、２．６の薬物抗体比（ＤＡＲ）を得た。

変形例Ｂ：予め活性化されたＨＤＰ３０．０６４３の使用
０．９０ｍｇの６’－Ｏ－（６－アミノヘキシル）－α－アマニチンＮ－スクシンイミジルカルバメートＨＤＰ３０．０６４３を１８０μｌの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、得られた溶液１６５μｌを直ちに２ｍｌのリツキシマブ（ＰＢＳ中６ｍｇ／ｍｌ）に添加した。

混合物を４℃で一晩振盪し、続いてＰＤ－１０カラム上でＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５ゲル濾過により分離した。タンパク質画分をＵＶ吸収により検出し、Ａｍｉｃｏｎｓｐｉｎ濃縮遠心機（２０００ｇ）で濃縮した。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ－Ａｓｓａｙによって測定し、３．０ｍｇ／ｍｌに調整した。

リツキシマブのアマニチンペイロードを、抗体およびα－アマニチンの吸光係数を用いて、２８０ｎｍおよび３１０ｎｍでのＵＶ吸収によって決定し、４．６の薬物抗体比（ＤＡＲ）を得た。

工程４ｂ：還元性ＤＳＰリンカーを有する６’－Ｏ－（６－アミノヘキシル）－α－アマニチンのリツキシマブへのコンジュゲート

抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブはまた、カップリング試薬ＤＳＰ（ジチオビス－スクシンイミジル－プロピオネート）の使用によって工程２の生成物（ＨＤＰ３０．０１３４）にコンジュゲートされ、リツキシマブのアミノ酸４のインドール系の６’位をリツキシマブのリジン残基に連結するジスルフィド含有リンカーを有するリツキシマブ－アマトキシンコンジュゲート（Ｒｔｘ－ＤＳＰ－３０．０１３４）を以下のように得た：

１．０ｍｇの６’－（－６－アミノヘキシル）－α－アマニチンＨＤＰ３０．０１３４を５６．６μｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。アルゴン下、室温で撹拌しながら、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート（ＤＳＰ））のＤＭＦ溶液（１００μｌのＤＭＦ中３．７ｍｇ）１２μｌおよび２．８μｌのトリエチルアミンの溶液を一度に添加した。反応混合物を室温にて撹拌した。１８時間後、３０ｍｌの冷ジエチルエーテルを添加した。沈殿を集め、ジエチルエーテルで数回洗浄し、真空中で乾燥させた。残った固体を１００μｌのＤＭＦに溶解した。

リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の５００μｌのリツキシマブ（Ｒｏｃｈｅ）溶液（２．０ｍｇ／ｍｌ）の３つの試料を、１倍、３．５倍および７．０倍モル過剰の毒素リンカーに対応する、４．２、１４．７および２９．４μｌの上記で調製したＤＭＦ溶液で処理した。

混合物を４℃で一晩振盪し、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５ゲル濾過クロマトグラフィー（ＸＫ－１６カラム；２ｍｌ／分）によってそれぞれ分離した。コンジュゲート画分をＵＶ吸収により検出し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮遠心機（３０００ｇ）で濃縮した。タンパク質濃度を、ＲｏｔｉＱｕａｎｔ－Ａｓｓａｙ（ＣａｒｌＲｏｔｈ；ドイツ）によって決定し、３．０ｍｇ／ｍｌに調節した。

リツキシマブのアマニチンペイロードを、抗体およびα－アマニチンの吸光係数を用いて２８０ｎｍおよび３１０ｎｍでのＵＶ吸収によって決定し、薬物抗体比（ＤＡＲ）０．９、４．４および７．０を得た。

実施例２．２：非切断性リンカーを有する抗ＣＤ２０アマトキシンコンジュゲートのインビトロでの細胞毒性
リツキシマブ－アマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－ＤＳＣ－３０．０１３４およびＲｔｘ－ＤＳＰ－３０．０１３４の細胞毒性活性を、製造業者（Ｒｏｃｈｅ）のプロトコールに従って、化学発光ＢｒｄＵ－ＥＬＩＳＡ取り込みアッセイを使用して、ヒト慢性Ｂ細胞白血病細胞株ＭＥＣ－１についてインビトロで評価した。コンジュゲートしていないリツキシマブを対照として使用した。結果を図３に図示する。

リツキシマブ‐アマトキシンコンジュゲートＲｔｘ‐ＤＳＣ‐３０．０１３４およびＲｔｘ‐ＤＳＰ‐３０．０１３４（それぞれ非切断性リンカーおよびジスルフィド含有リンカー）はともに、インビトロでＣＤ２０陽性細胞に対して有意な細胞毒性活性を示した。

実施例２．３：抗ＥＧＦ－Ｒアマトキシンコンジュゲートと比較した、非切断性リンカーを有する抗ＣＤ２０アマトキシンコンジュゲートのインビトロでの細胞毒性
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブを、カップリング試薬ＤＳＣ（Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート）の使用によって化合物Ｉにコンジュゲートさせ（実施例２．２参照）、アマトキシンのアミノ酸４のインドール系の６’－位置をリツキシマブのリジン残基に連結する非切断性リンカーを有するリツキシマブ－アマトキシンコンジュゲート（Ｒｔｘ－３０．０６４３）を得た。このコンジュゲートは、類洞内皮由来の肝癌細胞株であるＣＤ２０陰性細胞株ＳＫ－Ｈｅｐ－１で調べたところ、有意な細胞毒性を示さなかった（図４）。

さらに、抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）モノクローナル抗体トラスツズマブおよびパニツムマブを、それぞれ、カップリング試薬ＤＳＣ（Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート）を用いて化合物Ｉ（実施例２．２参照）にコンジュゲートさせ、アマトキシンのアミノ酸４のインドール系の６’－位をトラスツズマブおよびパニツムマブのリジン残基にそれぞれ連結する非切断性リンカーを有する抗体－アマトキシンコンジュゲートを得た（それぞれ、Ｈｅｒ－３０．０６４３およびＰａｎ－３０．０６４３）。

リツキシマブ、トラスツズマブおよびパニツムマブーアマトキシンコンジュゲートのそれぞれの細胞毒性活性を、ＷＳＴ－１アッセイを用いて非刺激末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対して、インビトロで評価した。すべての３つのコンジュゲート（Ｒｔｘ－３０．０６４３、Ｈｅｒ－３０．０６４３およびＰａｎ－３０．０６４３）はＷＳＴ－１アッセイにおいて細胞毒性効果を示し、３つのコンジュゲートすべての用量応答曲線は、かなり広い濃度範囲をカバーすることが見出された（図５、上のパネル）。Ｈｅｒ－３０．０６４３は、最も強い細胞毒性をもたらすことが見出された。

種々のコンジュゲートの細胞毒性活性をＣＤ２０富化非刺激ＰＢＭＣで評価したとき（図５、下図）、ＣＤ２０特異的コンジュゲートＲｔｘ－３０．０６４３は、それぞれ約３×１０^-7ＭのＩＣ₅₀を有する２つの他のコンジュゲートＨｅｒ－３０．０６４３およびＰａｎ－３０．０６４３よりも、約２×１０^-10ＭのＩＣ₅₀を有し、かなりより細胞毒性であった。

実施例２．４：抗ＣＤ２０－Ｆ（ａｂ’） ₂ フラグメントアマトキシンコンジュゲートと比較した、非切断性リンカーを有する抗ＣＤ２０アマトキシンコンジュゲートのインビトロでの細胞毒性
リツキシマブ－アマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－３０．０６４３に加えて、リツキシマブ－Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントアマトキシンコンジュゲート（ＲｔｘＦ（ａｂ’）₂－３０．０６４３）を、実施例２．２の工程４に記載のように生成した。コンジュゲートおよびコンジュゲートしていないリツキシマブの両方を、化学発光ＢｒｄＵ－ＥＬＩＳＡ取り込みアッセイを用いて、ＣＤ２０陽性ＭＥＣ－１細胞に対する細胞毒性についてインビトロで評価した。結果を図６に図示する。どちらのコンジュゲートも、ＭＥＣ－１細胞に対して、４．６×１０^-10Ｍ（Ｒｔｘ－３０．０６４３）および４×１０^-9Ｍ（ＲｔｘＦ（ａｂ’）₂－３０．０６４３）のＩＣ₅₀を有する顕著な細胞毒性効果を示した。

ＭＥＣ－１細胞に対するＷＳＴ－１細胞毒性アッセイを用いた試験は同様の成果をもたらし、約４．１ｘ１０^-10Ｍ（Ｒｔｘ－３０．０６４３）および２．９ｘ１０^-9Ｍ（ＲｔｘＦ（ａｂ’）₂－３０．０６４３）のＩＣ₅₀を示した。

実施例２．５：インビボでの非切断性リンカーを有する抗ＣＤ２０アマトキシンコンジュゲートの抗腫瘍活性
非切断性リンカーを有するリツキシマブ－アマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－３０．０６４３についても、ＳＣＩＤベージュベースのマウス腫瘍モデルにおいてインビボで細胞毒性について調べた（図７）。使用した用量は、６００μｇ／ｋｇのアマニチンの用量に関連して、２８ｍｇ／ｋｇのリツキシマブ－アマトキシンコンジュゲートであった。コンジュゲートは、試験期間にわたって腫瘍量のいかなる有意な増加も防止する細胞毒性効果を示した。

実施例３：非切断性リンカーを有する抗ＣＤ２０アマトキシンコンジュゲートのカニクイザルにおける探索的毒性試験
非切断性リンカーを有するリツキシマブ－アマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－３０．０６４３（ＩｇＧ分子当たり３．２個のアマニチン部分のペイロードを有する）を、カニクイザル（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）における探索的毒性試験において調べた；コンジュゲートしていないリツキシマブを参照（対照）として使用した。３．６～４．２歳で、初回投与時の体重が３．６～４．２ｋｇの６匹の雄動物を使用した。試験で評価したパラメータは、局所耐性、死亡率、臨床徴候、体重、血液学的検査（ＨＧＢ、ＲＢＣ、ＷＢＣ、示差血球数（ｒｅｌ、ａｂｓ．）、Ｒｅｔｉ、ＰＣＴ、ＨＣＴ、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ）、凝固（ＴＰＴ、ａＰＴＴ、ＥＳＲ）、臨床生化学検査（アルブミン、グロブリン、アルブミン／グロブリン比、コレステロール（総）、ビリルビン（総）、クレアチニン、ブドウ糖、タンパク質（総）、尿素、トリグリセリド、電解質、ＡＬＡＴ、ａＰ、ＡＳＡＴ、ＬＤＨ、ＣＫ、γ－ＧＴ、ＧＬＤＨ）を含んでいた。

リツキシマブ－アマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－３０．０６４３を投与され、リツキシマブを投与した試験群１ではない試験群２では、有意なＢ細胞枯渇が認められ、その後、最終治療後にＢ細胞数が回復した。試験の結果を図８に示す。

体重は、試験期間中、両方の試験群において一定のままであった（図９）。器官重量、組織病理学的検査（心臓、肝臓、脾臓、腎臓、尿管）および肉眼的剖検所見については、試験期間中に所見は認められなかった。

血液学的検査では、ａＰＴＴ、単球および好塩基性顆粒球の増加が試験第１３日、３μｇ／ｋｇの用量での治療の５日後に観察された；試験終了まで、ａＰＴＴは正常に戻った；単球および好塩基性顆粒球が試験第１群と比較して試験第２群で増加した。

臨床生化学的検査では、酵素活性（ＡＬＡＴ、ＡＳＡＴ、ＬＤＨ、ＣＫ、ＧＧＴ、ＧＬＤＨ）の増加が試験１３で３μｇ／ｋｇの用量で治療の５日後に、ＡＬＡＴでは試験２０日目に、アマニチン９μｇ／ｋｇの用量で治療の５日後に認められた。研究の終了時までに、これらのパラメータは正常に戻った。

実施例４：ジスルフィドリンカーを有する抗ＣＤ２０アマトキシンコンジュゲート
実施例４．１：ジスルフィドリンカーを有する抗ＣＤ２０アマトキシンコンジュゲートの合成
Ａ．Ｉｎ－ｓｉｔｕ結合方法
工程１：

実施例２．１の工程１と同様に、５．６７ｍｍｏｌα－アマニチンを２－（２－ブロモ－エチルジスルファニル）－エチル］－カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチルエステルで変換して、１．２９ｍｇ（１５％）のＨＤＰ３０．０３４１を白色粉末として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ⁺）：ｍ／ｚ実測値：１１５５．２計算値：１１５４．３．５［Ｍ＋Ｈ］⁺

実施例２．１の工程１と同様に、５．６７ｍｍｏｌのα－アマニチンを［２－（３－ブロモ－プロピルジスルファニル）－エチル］－カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチルエステルで変換して、４．８３（６７％）のＨＤＰ３０．０３４９を白色粉末として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ⁺）：ｍ／ｚ実測値：１１６８．６計算値：１１６８．５［Ｍ＋Ｈ］⁺

実施例２．１の工程１と同様に、５．６７ｍｍｏｌのα－アマニチンを［２－（３－ブロモ－１，１－ジメチル－プロピルジスルファニル）－エチル］－カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチルエステルで変換して、０．５１ｍｇ（７％）のＨＤＰ３０．０３５０を白色粉末として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ⁺）：ｍ／ｚ実測値：１１９６．７計算値：１１９６．５［Ｍ＋Ｈ］⁺

工程２：
実施例２．１の工程２と同様に、工程１の生成物を遊離アミンに脱保護した。

工程３：
アマニチンリンカーアミンＨＤＰ３０．０３５３－５をｉｎｓｉｔｕで予備活性化し、実施例２、工程４変形例Ａに記載の方法に従ってリツキシマブと結合させて、コンジュゲートＲｔｘ－３０．０３５３［１．６］、Ｒｔｘ－３０．０３５５［０．７］およびＲｔｘ－３０．０３５５［０．２］を得た。

Ｂ．分枝リンカー
工程１：６’－Ｏ－（３－Ｓ－トリチルスルファニルプロピル）－α－アマニチン（ＨＤＰ３０．０５１７）

アルゴン下で、４６ｍｇ（５０μｍｏｌ）の真空乾燥α－アマニチンを２５００μｌの乾燥ＤＭＳＯに溶解した。３－（Ｓ－トリチル）－メルカプトプロピル－１－臭化物（１５９ｍｇ、８当量）、続いて６０μｌの１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液を添加した。室温で１．５時間後、反応混合物をＤＭＳＯ中の５０μｌの１ＭＡｃＯＨでｐＨ５に酸性化し、溶媒を蒸発させた。残渣を２００μｌのＭｅＯＨに溶解し、１０ｍｌのＭＴＢＥで満たした遠心管に滴下した。得られた沈殿物を０℃に１０分間冷却し、遠心分離（４０００×ｇ）によって単離し、続いて１０ｍｌのＭＴＢＥで洗浄した。上清を廃棄し、ペレットを７５０μｌのＭｅＯＨに溶解し、Ｃ１８カラム（２５０×２１．２ｍｍ、ＬｕｎａＲＰ－１８、１０μｍ、１００Å）上の分取ＨＰＬＣで３回に分けて精製した［濃度勾配：０分５％Ｂ；５分５％Ｂ２０分１００％Ｂ；２５分１００％Ｂ；２７分５％Ｂ、３５分５％Ｂ；フロー３０ｍｌ／分］。２１．１～２１．８分の保持時間を有する画分を集め、溶媒を蒸発させて３６．５ｍｇ（５９％）のＨＤＰ３０．０５１７を無色固体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ⁺）：ｍ／ｚ実測値：１２３４．８計算値：１２３６．４５［Ｍ＋Ｈ］⁺；実測値：１２５７．３計算値：１２５８．４５［Ｍ＋Ｎａ］⁺

６’－Ｏ－（３－Ｓ－トリチルスルファニルブチル）－αアミニチン（ＨＤＰ３０．１１６８）

３－（Ｓ－トリチル）－メルカプトブチル－１－臭化物を用いて上記の手順を繰り返すことにより、表題生成物を収率６４％で得た。
ＭＳ（ＥＳＩ⁺）：ｍ／ｚ実測値：１２７１．５計算値：１２７１．５［Ｍ＋Ｎａ］⁺

工程２：６’－Ｏ－（３－（３－アミノ－１－メチルプロピルジスルファニル）－プロピル）－α－アマニチン（ＨＤＰ３０．１２１４）

工程１の生成物（１０ｍｇ）を１５ｍｌの遠心管に秤量し、ＴＦＡ中の０．５ＭＤＴＮＰ溶液（８０．９４μｌ、５当量）に溶解した。反応混合物を室温で４分間撹拌した。次に、反応混合物をＭＴＢＥ／ｎ－ヘキサン（１：１、１０ｍｌ）で希釈した。沈殿物を０℃に１０分間冷却し、遠心分離（４０００×ｇ）によって単離し、続いてＭＴＢＥ（１０ｍｌ）で洗浄した。上清を捨て、ペレットを５００μｌのＭｅＯＨに溶解した。４－アミノ－チオールＨＤＰ３０．１１５７（１７ｍｇ、９当量）を添加した。１時間後、混合物を０．０５％ＴＦＡを含むＭＴＢＥ（１０ｍｌ）で粉砕し、エーテルをデカントし、０．０５％ＴＦＡを含む新鮮なＭＴＢＥ（１０ｍｌ）で置き換えた。得られた沈殿をＭｅＯＨ（２００μｌ）に溶解し、Ｃ１８カラム（２５０×２１．２ｍｍ、ＬｕｎａＲＰ－１８、１０μｍ、１００Å）上の分取ＨＰＬＣで精製した［λ＝３０５ｎｍ；濃度勾配：０～５分５％Ｂ；２０～２５分１００％Ｂ；２７～３５分５％Ｂ；Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水；Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むメタノール］。生成物に対応する画分を集め、溶媒を蒸発させて８．０５ｍｇ（８１％）のＨＤＰ３０．１１７２を白色粉末として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ⁺）：ｍ／ｚ実測値：１１１０．３９計算値：１１１０．４４［Ｍ＋Ｈ］⁺

工程１の生成物ＨＤＰ３０．０５１７およびＨＤＰ３０．１１６８を適切なチオールと組み合わせて上記手順を繰り返すことにより、以下の追加の化合物を得た：

工程３：６’－Ｏ－（３－（３－アミノ－１－メチルプロピルジスルファニル）－プロピル）－αアミニチンＮ－スクシンイミジルカルバメートＨＤＰ３０．１２１４

工程２の生成物ＨＤＰ３０．１１７１、７．６０ｍｇ（６．２８μｍｏｌ）を溶解し、２００μｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含む１５ｍｌ円錐遠心管に移した。Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネートの０．２Ｍ溶液を、１２８ｍｇ（５００μｍｏｌ）のＤＳＣを２５００μｌのＤＭＦに溶解することによって調製し、得られた溶液３１４μｌ（１０当量）をＨＤＰ３０．０１３４に添加し、続いて１２．５６μｌ（３６６μｍｏｌ＝２当量）のＤＭＦ中１Ｍトリエチルアミンを添加した。ボルテックス後、遠心管を周囲温度のオービタルシェーカー上に置いた。５分後のＴＬＣコントロールは、出発物質の完全な消費を示した。続いて、１０ｍｌの氷冷ＭＴＢＥおよび５μｌのＴＦＡを遠心管に添加した。激しくボルテックスした後、遠心管を１０分間アイスバットに入れ、沈殿物を４０００×ｇで３分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを、再懸濁および沈降の手段により、１０ｍＬの氷冷０．０５％ＴＦＡ／ＭＴＢＥで洗浄した。固体を真空中で乾燥させ、２４００μｌの水／メタノール５：９５＋０．０５％ＴＦＡに再溶解し、分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物含有画分を合わせ、蒸発させた。残渣を、０．０５％ＴＦＡを含有するｔｅｒｔ－ブタノールおよび水４：１との混合物３ｍｌに溶解した。溶液をシリンジフィルター（ナイロン０．２μｍ、１３ｍｍ）に通し、凍結乾燥する：
４．６８ｍｇ（６０％）の無色の粉末
ＭＳ（ＥＳＩ⁺）：１２３７．２５；ＭＨ⁺（Ｃ₅₀Ｈ₇₁Ｎ₁₂Ｏ₁₈Ｓ）についての計算値：１２３７．４３（Ｃ₅₁Ｈ₇₃Ｎ₁₂Ｏ₁₈Ｓ₃）

工程２の変法を用いて上記の手順を繰り返すことにより、以下の追加の化合物を得た：

工程４：分枝ジスルフィドリンカーを有するリツキシマブアマニチン誘導体の合成
工程３からのスクシンイミジルカーボネート誘導体の各々１．００ｍｇを乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１００μｌに溶解し、得られた溶液の各々３０μｌ（１０倍過剰）を直ちにリツキシマブ溶液（ＰＢＳ中９．５ｍｇ／ｍｌ）３９４μｌに添加した。混合物を４℃で一晩振盪し、続いてＰＤ－１０カラム上でＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５ゲル濾過により分離した。蛋白質画分を紫外線吸光度により検出し、１ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して、スライド－Ａ－Ｌｙｚｅｒ^TM透析カセット（ＭＷＣＯ２０’０００）中で４℃で一晩透析した。タンパク質濃度を、ＲｏｔｉＱｕａｎｔ－Ａｓｓａｙ（ＣａｒｌＲｏｔｈ；ドイツ）によって決定し、２０００ｇでＡｍｉｃｏｎｓｐｉｎ遠心濃縮器で濃縮し、３．０ｍｇ／ｍｌに調整した。リツキシマブのアマニチンペイロードを、抗体およびα－アマニチンの吸光係数を用いて、２８０ｎｍおよび３１０ｎｍでのＵＶ吸収によって決定し、以下のコンジュゲートを得た。

実施例４．２：ジスルフィドリンカーを有する抗ＣＤ２０アマトキシンコンジュゲートのインビトロでの細胞毒性
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブを、カップリング試薬ＤＳＣ（Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート）を用いて化合物ＩＩＩ、ＩＶおよびＶにそれぞれコンジュゲートさせ、リツキシマブのリジン残基にアマトキシンのアミノ酸４のインドール系の６’－位を連結するジスルフィドリンカーを有するリツキシマブ－アマトキシンコンジュゲートを得た（Ｒｔｘ－ＤＳＣ－３０．０３５３、Ｒｔｘ－ＤＳＣ－３０．０３５４、およびＲｔｘ－ＤＳＣ－３０．０３５５）。

リツキシマブ－アマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－ＤＳＣ－３０．０３５３、Ｒｔｘ－ＤＳＣ－３０．０３５４、およびＲｔｘ－ＤＳＣ－３０．０３５５の細胞毒性活性を、製造業者（Ｒｏｃｈｅ）のプロトコールに従って化学発光ＢｒｄＵ－ＥＬＩＳＡ取り込みアッセイを用いてヒト慢性Ｂ細胞白血病細胞株ＭＥＣ－１についてインビトロで評価した。結果を図１０に図示する。

リツキシマブ‐アマトキシンコンジュゲートＲｔｘ‐ＤＳＣ‐３０．０３５３はインビトロでＣＤ２０陽性細胞に対して最高の細胞傷害活性を示した。

さらに、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブを実施例４．１からのＤＳＣ前活性化化合物にコンジュゲートさせ、アマトキシンのアミノ酸４のインドール系の６’位をリツキシマブのリジン残基に連結するジスルフィドリンカーを有するリツキシマブ－アマトキシンコンジュゲートを得た（Ｒｔｘ－３０．０７４８、Ｒｔｘ－３０．１２１４、Ｒｔｘ－３０．１２１５、Ｒｔｘ－３０．１２１６、Ｒｔｘ－３０．１２１７およびＲｔｘ－３０．１２１８）。

リツキシマブ－アマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－３０．０７４８、Ｒｔｘ－３０．１２１４、Ｒｔｘ－３０．１２１５、Ｒｔｘ－３０．１２１６、Ｒｔｘ－３０．１２１７およびＲｔｘ－３０．１２１８の細胞毒性活性を、ＷＳＴアッセイを用いてヒト慢性Ｂ細胞白血病細胞株ＭＥＣ－１についてインビトロで評価した。結果を図１１に図示する。

ＭＥＣ－１細胞を使用するＷＳＴアッセイでは、使用したすべてのコンジュゲートについて細胞毒性を示すことができた。コンジュゲートＲｔｘ－３０．１２１４、Ｒｔｘ－３０．１２１５、Ｒｔｘ－３０．１２１６、Ｒｔｘ－３０．１２１７およびＲｔｘ－３０．１２１８のＥＣ₅₀は２つの参照化合物Ｒｔｘ－３０．０６４３およびＲｔｘ－３０．０７４８とほぼ同じ範囲であり、ここで、すべてのコンジュゲートはＲｔｘ－３０．０６４３よりも細胞毒性が高かった（表３参照）。

各側に１個以下の遮蔽メチル基（すなわち、Ｒｔｘ‐３０．０７４８、Ｒｔｘ‐３０．１２１７、Ｒｔｘ‐３０．１２１６およびＲｔｘ‐３０．１２１４）を有するより安定化されていないジスルフィドは最も高い細胞毒性を示したが、高度に安定化されたＲｔｘ‐３０．１２１５およびＲｔｘ‐３０．１２１８は非切断性リンカーを有するＲｔｘ‐３０．０６４３よりわずかに細胞毒性が強く、これらの化合物の限定された還元的切断を示した。

実施例５：酵素的に切断可能なリンカーを有するリツキシマブアンマトキシンコンジュゲート
実施例５．１：酵素的に切断可能なリンカーを有するリツキシマブアマトキシンコンジュゲートの合成
Ａ：６’－［（３－マレイミドプロパンアミド）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ］－α－アマニチン（ＨＤＰ３０．１６９９）

工程１：６’－［Ｂｏｃ－Ｖａｌ－Ａｌａ（ＳＥＭ）－ＰＡＢ］－α－アマニチン（ＨＤＰ３０．１６９８）

アルゴン下、室温で、５７ｍｇ（６２．０２μｍｏｌ）の真空乾燥α－アマニチンを３０００μｌの乾燥ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）に溶解した。Ｂｏｃ－Ｖａｌ－Ａｌａ（ＳＥＭ）－４－アミノベンジルブロミド（ＥＰ１７１９２６８６に開示されている）（１４５．５ｍｇ、２４８．１μｍｏｌ）および０．２Ｍ炭酸セシウム（Ｃｓ₂ＣＯ₃）（３７２．２μｌ、７４．４３μｍｏｌ）を添加した。室温で４時間後、反応混合物を１０μｌのＡｃＯＨでｐＨ＝５に酸性化した。溶媒を真空中で除去し、残渣をＣ１８カラム上の分取ＨＰＬＣによって精製した［λ＝３０５ｎｍ；濃度勾配：０～５分５％Ｂ；２０～２５分１００％Ｂ；２７～３５分５％Ｂ；Ａ＝水；Ｂ＝メタノール］。生成物を含有する画分を蒸発させて、５４．４６ｍｇ（６２％）のＨＤＰ３０．１６９８を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ⁺）：ｍ／ｚ（実測値）：１４２５，２３計算値：１４２４，６

工程２：６’－［Ｈ－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ］－α－アマニチン（ＨＤＰ３０．１７０２）

ＢｏｃおよびＳＥＭ保護した工程５の生成物（１３４．２９ｍｇ、９４．２５μｍｏｌ）を５ｍｌのＴＦＡに溶解した。２分後、混合物を室温で蒸発乾固し、５ｍｌの水に再溶解し、３．２％アンモニアを滴下して加えてｐＨ１０に調整した。得られた懸濁液を凍結乾燥し、ＲＰ１８－ＨＰＬＣ［λ＝３０５ｎｍ；濃度勾配：０～２分５％Ｂ；２～１０分２０％Ｂ；１０～１０．５分２５％Ｂ；１０．５～１３分１００％Ｂ；１３～１４分５％Ｂ；Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水；Ｂ＝アセトニトリル］に適用し、純粋な画分を蒸発させ、６８．５９ｍｇ（５５％）の無色粉末に凍結乾燥した。
ＭＳ（ＥＳＩ⁺）：ｍ／ｚ実測値：１１９４．８計算値：１１９４．５３［Ｍ＋Ｈ］⁺；実測値：１２１７．８計算値：１２１６．５１［Ｍ＋Ｎａ］⁺

工程３：６’－［（３－マレイミドプロパンアミド）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ］－α－アマニチン（ＨＤＰ３０．１６９９）

ＨＤＰ３０．１７０２（１７．０９ｍｇ、１４．３μｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（３５０μｌ）に溶解した。ＤＭＦ（３５０μｌ）に溶解した３－（マレイミド）－プロパン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）（７．６２ｍｇ、２８．６μｍｏｌ、２．０当量）、および希釈していないＤＩＰＥＡ（９．７９μｌ、５７．２μｍｏｌ、４．０当量）を添加した。アルゴン下で室温で１時間３０分間撹拌した後、混合物を４０ｍｌの冷ＭＴＢＥ中に滴下し、０℃で遠心分離した。沈殿を集め、４０ｍｌのＭＴＢＥで洗浄し、再び遠心分離した。粗生成物を乾燥し、ＲＰ１８－ＨＰＬＣ［λ＝３０５ｎｍ；濃度勾配：０～５分５％Ｂ；２０～２５分１００％Ｂ；２７～３５分５％Ｂ；Ａ＝０．０５％ＴＦＡを含む水；Ｂ＝０．０５％ＴＦＡを含むメタノール］によって精製した。純粋な画分を凍結乾燥して、１２．５１ｍｇ（６５％）の表題生成物６’ －［（３－マレイドプロパンアミド）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ］－α－アマニチンを白色粉末として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ⁺）：ｍ／ｚ実測値：１３６７．５０計算値：１３６８．４５［Ｍ＋Ｎａ］⁺

Ｂ：Ｓ－デオキシアマニン（３－マレイミドプロパンアミド）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ｐ－アミノベンジルアミド（ＨＤＰ３０．２１１５）

Ｓ－デオキシアマニン（１５．０ｍｇ、１６．５μｍｏｌ）を、（３－マレイミドプロパンアミド）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ｐ－アミノベンジルアミン（２５．２μｍｏｌ、１．５当量）の０．１Ｍ溶液４２９μｌ、０．１ＭＴＢＴＵ（２５．２μｍｏｌ、１．５当量）４９２μｌおよび０．２ＭＤＩＥＡ（４９．１μｍｏｌ、３．０当量）４９２μｌで室温で処理した。反応をＲＰ－ＨＰＬＣによってモニターした。完了後、１００μＬのＨ₂Ｏで反応を停止させ、１５分間撹拌し、分取ＲＰ－ＨＰＬＣに注入した。
収率：１２．２ｍｇ、５６％
質量分析：１３１３．２［Ｍ＋Ｈ］⁺、１３３５．５［Ｍ＋Ｎａ］⁺

Ｃ：ＨＤＰ３０．１６９９およびＨＤＰ３０．２１１５のリツキシマブへのコンジュゲート
マレイミド－アマトキシン誘導体ＨＤＰ３０．１６９９およびＨＤＰ３０．２１１５をリツキシマブにコンジュゲートさせるために、リンカー毒素のストック溶液をＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｍｌで調製した。４．４ｍｌの抗体溶液（ＰＢＳ中９．５ｍｇ／ｍｌ）に、４４μｌの１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０、および１６．７μｌの５０ｍＭＴＣＥＰ溶液（３当量）を添加し、還元を３７℃で２時間行った。還元抗体を２．２μｌ分注物に分割し、それぞれ１１２．５μｌのＨＤＰ３０．１６９９または１０９．８μｌのＨＤＰ３０．２１１５ストック溶液で処理した。４℃で３０分間振盪した後、１６．７μｌの１００ｍＭＮ－エチルマレイミドを加え、室温で１時間振盪することによって、残りのチオールをキャップした。続いて、２７．９μＬの１００ｍＭＮ－アセチル－Ｌ－システインを添加し、振盪をさらに１５分間続けた。アマトキシン－ＡＤＣを、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化したＰＤ－１０カラムを使用するゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質含有画分を、４リットルのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して、スライドＡ－ライザー透析カセット（ＭＷＣＯ２０’０００）中で４℃で一晩透析した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸収測定によって決定して５．０ｍｇ／ｍｌに調節し、そして試料を滅菌濾過した（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ）。

リツキシマブの天然システイン残渣の１つをアマトキシンのアミノ酸４のインドール系の６’位に連結する酵素的に切断可能なリンカー（鎖間コンジュゲート）を含むコンジュゲートＲｔｘ－３０．１６９９、およびリツキシマブの天然システイン残渣の１つをアマトキシンのアミノ酸１に連結する酵素的に切断可能なリンカー（鎖間コンジュゲート）を含むＲｔｘ－３０．２１１５の完全性を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析および抗アマニチン抗体の使用によって開発されたウェスタンブロットによって確認した。結果を図１２に図示する。コンジュゲートＲｔｘ－３０．１６９９の薬物／抗体比（ＤＡＲ）は３．７０であると決定され、コンジュゲートＲｔｘ－３０．２１１５のＤＡＲは３．７５であると決定された。

実施例５．２：酵素的に切断可能なリンカーを有するリツキシマブアマトキシンコンジュゲートのインビトロでの細胞毒性
９６時間ＣＴＧアッセイを用いて、ヒト慢性Ｂ細胞白血病細胞株ＭＥＣ‐１およびＭＥＣ‐２に対するリツキシマブアマトキシンコンジュゲートＲｔｘ‐３０．１６９９およびＲｔｘ‐３０．２１１５の細胞毒性活性をインビトロで評価した。コンジュゲートしていないリツキシマブを参照化合物として使用した。結果を図１４に図示する。両コンジュゲートは両細胞系に対して強い細胞毒性効果を誘導したが、コンジュゲートしていないリツキシマブは全く細胞毒性効果を示さなかった。

さらに、リツキシマブアマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－３０．１６９９およびＲｔｘ－３０．２１１５の細胞毒性活性も、コンジュゲートしていないα－アマニチンと比較して、９６時間ＣＴＧ定量を用いて、それぞれＭＥＣ－１、ＭＥＣ－２、Ｒａｊｉ、Ｎａｌｍ－６およびＲａｍｏｓ細胞株でインビトロで評価した。結果を図１５に図示する。両コンジュゲートは、ＣＤ２０－ネガティブであるＮａｌｍ－６細胞を除いて、全ての細胞株に対して低いナノモル範囲で強い細胞毒性効果を示した。対照的に、コンジュゲートしていない＃－アマニチンは、飲作用による非特異的な取り込みのため、ミリモル範囲でのみ全ての細胞株に対して細胞毒性効果を示した。

実施例６：酵素的に切断可能なリンカーを有するオビヌツズマブアマトキシンコンジュゲート
実施例６．１：酵素的に切断可能なリンカーを有するオビヌツズマブアマトキシンコンジュゲートの合成
実施例５に記載した方法を用いて、抗体オビヌツズマブで、以下のＡＤＣを得た：

例６．２：酵素的に切断可能なリンカーを有するオビヌツズマブアマトキシンコンジュゲートのインビトロにおける細胞毒性
オビヌツズマブアマトキシンコンジュゲートＯｂｉ－３０．１６９９およびＯｂｉ－３０．２１１５の細胞毒性活性を、コンジュゲートしていないα－アマニチンと比較して、９６時間ＣＴＧ定量を用いて、それぞれＭＥＣ－１、ＭＥＣ－２、Ｒａｊｉ、Ｎａｌｍ－６およびＲａｍｏｓ細胞株でインビトロで評価した。結果を図１６に図示する。両コンジュゲートは、ＣＤ２０陰性であるＮａｌｍ－６細胞を除いて、全ての細胞株に対して強い細胞毒性効果を示した。対照的に、コンジュゲートしていない＃－アマニチンは、飲作用による非特異的な取り込みのため、ミリモル範囲でのみ全ての細胞株に対して細胞毒性効果を示した。

実施例７：酵素的に切断可能なリンカーを有する抗ＣＤ２０アマトキシンコンジュゲートのインビボにおける細胞毒性活性
抗ＣＤ２０アマトキシンコンジュゲートＲｔｘ－３０．２１１５およびＯｂｉ－３０．２１１５（実施例６を参照のこと）のインビボでの細胞毒性効果を、Ｓｃｉｄマウス異種移植モデル系において評価した。マウスあたり２．５×１０⁶ のＲａｊｉ細胞をＣＢ１７Ｓｃｉｄマウスに静脈内注射した。Ｒｔｘ－３０．２１１５およびＯｂｉ－３０．２１１５を、それぞれ１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇの用量での処理のために使用した。結果を図１７に図示する。

処理した試験動物では、５２日間の試験期間中、いずれのコンジュゲートも３ｍｇ／ｋｇの用量で１００％の生存率が得られ、１ｍｇ／ｋｇの用量で９０％の生存率が得られた。対照的に、ＰＢＳ対照では、２８日より長く生存した動物は１０％のみであった。

さらに、抗ＣＤ２０アマトキシンコンジュゲートＯｂｉ－３０．１６９９のインビボ有効性を、それぞれＲＳ９７３７およびＲＳ１３１６細胞に基づいて、リヒター症候群の２つの患者由来腫瘍異種移植モデルにおいて評価した。これらの細胞に基づくリヒター症候群異種移植片は遺伝学的、形態学的、表現型的に安定であり、対応する原発腫瘍と類似していると報告されている（Vaisitti et al 2018）。

ＲＳ９７３７およびＲＳ１３１６細胞におけるＣＤ２０の発現は、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析（全トランスクリプトームショットガンシークエンシング）により評価した。結果を図１８に示す；データをＴＰＭ（１００万当たりの転写物）としてプロットする。ＲＳ９７３７細胞はＲＳ１３１６細胞よりも有意に低いレベルのＣＤ２０を発現することが示された。

患者由来腫瘍異種移植片ＲＳ１３１６およびＲＳ９７３７細胞の細胞懸濁液を、それぞれ雌ＮＯＧマウスの尾静脈に注射した。動物は群割り付け日（２１日目にＲＳ１３１６、１０日目にＲＳ９７３７）にオビヌツズマブ・アマトキシンコンジュゲートＯｂｉ－３０．１６９９を静脈内に単回投与して処理された。

オビヌツズマブアマトキシンコンジュゲートＯｂｉ－３０．１６９９によるマウスの処理は、試験した患者由来腫瘍異種移植モデルの両方において、全生存に有意な効果を有した。結果を図１９に図示する。ＲＳ９７３７ベースの異種移植モデル（Ａ）およびＲＳ１３１６ベースの異種移植モデル（Ｂ）の経時生存パーセントを示す。ＲＳ９７３７およびＲＳ１３１６細胞におけるそれぞれ異なるＣＤ２０発現レベルに対応して、ＲＳ９７３７ベースの異種移植モデル（Ａ）では対照に対するＯｂｉ－３０．１６９９による生存期間の延長が観察され、ＲＳ１３１６ベースの異種移植モデル（Ｂ）では大幅な生存期間の延長が観察された；後者の場合、抗ＣＤ２０－ＡＤＣ処理動物の１００％は９０日目まで生存し、抗ＣＤ２０－ＡＤＣ処理動物の５０％は９８日目の観察期間終了時においても生存しまた無病（ＦＡＣＳ分析により示された）であった。

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Claims

（ｉ）標的結合部分、（ｉｉ）少なくとも１つの毒素、および（ｉｉｉ）任意選択で、前記標的結合部分を前記少なくとも１つの毒素と連結する少なくとも１つのリンカーを含み、前記標的結合部分がＣＤ２０に結合し、前記少なくとも１つの毒素がアマトキシンであるコンジュゲート。
前記標的結合部分が、
それぞれＣＤ２０に結合する
（ｉ）抗体、好ましくはモノクローナル抗体、
（ｉｉ）その抗原結合フラグメント、好ましくは可変領域（Ｆｖ）、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ）₂フラグメント、
（ｉｉｉ）その抗原結合誘導体、好ましくは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、および
（ｉｖ）抗体様タンパク質
からなる群より選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。
前記抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは抗原結合誘導体が、それぞれ、マウス、キメラ、ヒト化もしくはヒト抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは抗原結合誘導体である、請求項２に記載のコンジュゲート。
前記抗体、またはその抗原結合フラグメント、またはその抗原結合誘導体が、それぞれ、リツキシマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、トシツモマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、およびウブリツキシマブからなる群より選択される、請求項２に記載のコンジュゲート。
前記抗体がＥＵ番号付けシステムによる重鎖１１８Ｃｙｓ、重鎖２３９Ｃｙｓ、または重鎖２６５Ｃｙｓ、好ましくはＥＵ番号付けシステムによる重鎖２６５Ｃｙｓを含むように遺伝子操作されており、存在する場合前記リンカーまたは前記アマトキシンが、それぞれ、前記重鎖１１８Ｃｙｓ、または前記重鎖２３９Ｃｙｓ、または重鎖２６５Ｃｙｓ残基を介して前記抗体に連結されている、請求項２～４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
存在する場合前記リンカーまたは前記アマトキシンが、前記抗体の天然Ｃｙｓ残基のいずれかを介して、好ましくはジスルフィド結合を介して、前記抗体に連結されている、請求項２～４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
前記抗体が、リツキシマブまたはＥＵ番号付けシステムによる重鎖２６５Ｃｙｓを含むように遺伝子操作されたリツキシマブである、請求項４～６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
前記抗体がリツキシマブであり、存在する場合前記リンカーまたは前記アマトキシンが、リツキシマブの鎖間ジスルフィド結合を形成する天然に存在するＣｙｓ残基のいずれかを介してリツキシマブに連結されている、請求項４～６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
前記リンカーが非切断性または切断性リンカーである、請求項１～８のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
前記切断性リンカーが、酵素的に切断可能なリンカー、好ましくはプロテアーゼで切断可能なリンカー、および化学的に切断可能なリンカー、好ましくはジスルフィド架橋を含むリンカーからなる群より選択される、請求項９に記載のコンジュゲート。
前記アマトキシンが、（ｉ）６’－デオキシ位を有するアミノ酸４および（ｉｉ）Ｓ－デオキシ位を有するアミノ酸８を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
存在する場合前記リンカーまたは前記標的結合部分が、（ｉ）アマトキシンアミノ酸１のγＣ原子、または（ｉｉ）アマトキシンアミノ酸３のδＣ原子、または（ｉｉｉ）アマトキシンアミノ酸４の６’－Ｃ原子を介して、前記アマトキシンに結合している、請求項１～１１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
前記コンジュゲートが、リンカー－アマトキシン部分として、それぞれ、式（Ｉ）～（ＸＩＩ）の以下の化合物のいずれかを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
請求項２～５のいずれか１項に記載のコンジュゲートであって、前記コンジュゲートが抗体をアマトキシンリンカー部分にコンジュゲートした標的結合部分として含む、式ＸＩＩＩ～ＸＸＩＩのいずれか１つに従うコンジュゲート；

式中、前記アマトキシンリンカー部分は前記抗体の天然に存在するリジン残基のε－アミノ基に結合しており、ｎは好ましくは１～７である。
請求項２～５のいずれか１項に記載のコンジュゲートであって、前記コンジュゲートが抗体をアマトキシンリンカー部分にコンジュゲートした標的結合部分として含む、式ＸＸＩＩＩ～ＸＸＩＶのいずれか１つに従うコンジュゲート；

式中、前記アマトキシンリンカー部分は前記抗体のシステイン残基のチオール基に結合しており、ここで、ｎは好ましくは１～７である。
前記コンジュゲートが以下からなる群より選択される、請求項２に記載のコンジュゲート；
（ｉ）抗体リツキシマブを、リツキシマブの少なくとも１つの天然に存在するＣｙｓ残基へのチオエーテル結合を介して式（ＸＩ）の少なくとも１つのアマトキシン－リンカー部分にコンジュゲートした標的結合部分として含む、式ＸＸＶに従うコンジュゲート；

（ｉｉ）ＥＵ番号システムによる重鎖２６５Ｃｙｓを含むように遺伝子操作された抗体リツキシマブを、前記遺伝子操作リツキシマブの重鎖２６５Ｃｙｓ残渣とチオエーテル結合を介して式（ＸＩ）のアマトキシンリンカー部分にコンジュゲートした標的結合部分として含む、式ＸＸＶＩに従うコンジュゲート；

（ｉｉｉ）抗体リツキシマブを、リツキシマブの少なくとも１つの天然に存在するＣｙｓ残基へのチオエーテル結合を介して式（ＸＩＩ）の少なくとも１つのアマトキシン－リンカー部分にコンジュゲートした標的結合部分として含む、式（ＸＸＶＩＩ）に従うコンジュゲート；

（ｉｖ）ＥＵ番号付けシステムによる重鎖２６５Ｃｙｓを含むように遺伝子操作された抗体リツキシマブを、前記遺伝子操作されたリツキシマブの前記重鎖２６５Ｃｙｓ残基へのチオエーテル結合を介して式（ＸＩＩ）のアマトキシンリンカー部分にコンジュゲートした標的結合部分として含む、式（ＸＸＶＩＩＩ）に従うコンジュゲート；

式中、（ｉ）、（ｉｉｉ）についてｎは１～７であり、（ｉｉ）、（ｉｖ）についてｎは１～２である。
請求項１～１６のいずれか１項に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
１つ以上の薬学的に許容される緩衝剤、界面活性剤、希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、滑沢剤、崩壊剤、吸着剤、および／または防腐剤をさらに含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
Ｂリンパ球関連悪性腫瘍またはＢ細胞媒介性自己免疫疾患の治療における使用のための、特に非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、リヒター症候群、関節リウマチ、多発血管炎および顕微鏡的多発血管炎を伴う肉芽腫症および尋常性天疱瘡の治療における使用のための、請求項１～１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項１７～１８のいずれか一項記載の医薬組成物。
Ｂリンパ球関連悪性腫瘍またはＢ細胞媒介性自己免疫疾患の治療、特に非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、リヒター症候群、関節リウマチ、多発血管炎および顕微鏡的多発血管炎を伴う肉芽腫症および尋常性天疱瘡の治療のための、請求項１～１６のいずれか一項記載のコンジュゲートまたは請求項１７～１８のいずれか一項記載の医薬組成物の使用。
Ｂリンパ球関連悪性腫瘍またはＢ細胞媒介性自己免疫疾患に罹患している患者を治療する方法であって、有効量の請求項１～１６のいずれか１項に記載のコンジュゲートまたは請求項１７～１８のいずれか１項に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む方法。