CN107849146A - 卡奇霉素构建体和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了包含卡奇霉素的抗体药物缀合物(ADC)及使用其来治疗增生性疾病的方法。

Description

卡奇霉素构建体和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年4月21日提交的美国临时申请62/150,693号的权益，其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本申请总体上涉及新颖化合物，所述新颖化合物包括与靶向剂连接的卡奇霉素(本文中也称为卡奇霉素-接头构建体)。所述靶向剂可以是由此提供抗体药物缀合物(ADC)的抗体。ADC可用于例如治疗、诊断或预防癌症及其任何复发或转移。
背景技术
干细胞和祖细胞的分化和增殖是在器官发生、细胞修复和细胞替代期间一致地支持组织生长的正常进行过程。该系统受到严格监管，以确保根据生物体的需要仅产生适当的信号。细胞增殖和分化通常仅仅视受损或死亡的细胞的替代或者视生长的需要而发生。然而，这些过程的破坏可以由许多因素触发，包括各种信号化学物质的不足或过量、存在改变的微环境、遗传突变或其组合。正常细胞增殖和/或分化的破坏可导致各种疾病，包括增生性疾病如癌症。
常规的癌症治疗方法包括化疗、放疗和免疫治疗。这些治疗通常是无效的，且手术切除可能无法提供可行的临床替代方案。目前护理标准中的局限性在患者接受一线治疗及随后复发的病例中特别明显。在这种情况下，经常会出现难治性肿瘤，其常常具有侵略性和不可治疗性。许多实体瘤的总体存活率多年来基本保持不变，至少部分原因在于现有治疗方法不能预防复发、肿瘤再现和转移。因此，仍然需要开发对增生性疾病更有针对性和有效的疗法。本发明解决了这一需要。
发明内容
在第一方面，提供了一种化合物，例如抗体药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物具有式(I)：
Ab-[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]z3
(I)。
在式I的抗体药物缀合物中，Ab是靶向剂。w是连接基团。M是可裂解部分。L3和L4独立地是接头(例如间隔子)。P是二硫键保护基。D是卡奇霉素(calicheamicin)或其类似物。符号z1、z2和z3独立地是从0至10的整数。在实施例中，z3是从1至10的整数。
在式I的一个实施例中，提供了一种化合物，例如抗体药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物具有式(Ia)：
在式(Ia)的化合物中，R1为氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)R1E、-OR1A、-NR1BR1C、-C(O)OR1A、-C(O)NR1BR1C、-SR1D、-SOn1R1B或-SOv1NR1BR1C。R1A、R1B、R1C、R1D和R1E独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-N(O)2、-SH、-S(O)3H、-S(O)4H、-S(O)2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHS(O)2H、-NHC(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基；并且与同一个氮原子键合的R1B和R1C取代基可以任选地连接以形成取代或未取代的杂环烷基或取代或未取代的杂芳基。符号n1独立地是从0至4的整数。符号v1独立地是1或2。符号表示式I中在P上的附接点。
在式I的一个实施例中，提供了一种化合物，例如抗体药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物具有式(II)：
在式(II)的化合物中，Ab是靶向部分，例如抗体。L3是键、-O-、-S-、-NR3B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2、-C(O)NR3B-、-NR3BC(O)-、-NR3BC(O)NH-、-NHC(O)NR3B-、取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基。L4是键、-O-、-S-、-NR4B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR4B-、-NR4BC(O)-、-NR4BC(O)NH-、-NHC(O)NR4B-、取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基。R1是氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)R1E、-OR1A、-NR1BR1C、-C(O)OR1A、-C(O)NR1BR1C、-SR1D、-SOn1R1B或-SOv1NR1BR1C。P是-O-、-S-、-NR2B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR2B-、-NR2BC(O)-、-NR2BC(O)NH-、-NHC(O)NR2B-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。M是-O-、-S-、-NR5B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5B-、-NR5BC(O)-、-NR5BC(O)NH-、-NHC(O)NR5B-、-[NR5BC(R5E)(R5F)C(O)]n2-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基或M1A-M1B-M1C。w是-O-、-S-、-NR6B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR6B-、-NR6BC(O)-、-NR6BC(O)NH-、-NHC(O)NR6B-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基或w1A-w1B-w1C。M1A键合至L3。M1C键合至L4。M1A是键、-O-、-S-、-NR5AB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5AB-、-NR5ABC(O)-、-NR5ABC(O)NH-、-NHC(O)NR5AB-、-[NR5ABCR5AER5AFC(O)]n3-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。M1B是键、-O-、-S-、-NR5BB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5BB-、-NR5BBC(O)-、-NR5BBC(O)NH-、-NHC(O)NR5BB-、-[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。M1C是键、-O-、-S-、-NR5CB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5CB-、-NR5CBC(O)-、-NR5CBC(O)NH-、-NHC(O)NR5CB-、-[NR5CBCR5CER5CFC(O)]n5-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。W1A键合至Ab。W1C键合至L3。W1A是键、-O-、-S-、-NR6BA-、-C(O)-、C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR6BA-、-NR6BAC(O)-、-NR6BAC(O)NH-、-NHC(O)NR6BA-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。W1B是键、-O-、-S-、-NR6BB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR6BB-、-NR6BBC(O)-、-NR6BBC(O)NH-、-NHC(O)NR6BB-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。W1C是键、-O-、-S-、-NR6BC-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR6BC-、-NR6BCC(O)-、-NR6BCC(O)NH-、-NHC(O)NR6BC-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。R1A、R1B、R1C、R1D、R1E、R2b、R3B、R4B、R5B、R5E、R5F、R5AB、R5AE、R5AF、R5BB、R5BE、R5BF、R5CB、R5CE、R5CF、R6B、R6BA、R6BB和R6BC独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-N(O)2、-SH、-S(O)3H、-S(O)4H、-S(O)2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHS(O)2H、-NHC(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHl2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基；并且与同一个氮原子键合的R1B和R1C取代基可以任选地连接以形成取代或未取代的杂环烷基或取代或未取代的杂芳基。符号n1是从0至4的整数。符号v1是1或2。符号n2、n3、n4和n5独立地是从1至10的整数。符号z1和z2独立地是从1至10的整数。符号z3独立地是从1至10的整数。
在另一方面，提供了式(IV)的化合物：
在式(IV)的化合物中，L3是键、-O-、-S-、-NR3B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR3B-、-NR3BC(O)-、-NR3BC(O)NH-、-NHC(O)NR3B-、取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基。L4是键、-O-、-S-、-NR4B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR4B-、-NR4BC(O)-、-NR4BC(O)NH-、-NHC(O)NR4B-、取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基。R1是氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)R1E、-OR1A、-NR1BR1C、-C(O)OR1A、-C(O)NR1BR1C、-SR1D、-SOn1R1B或-SOv1NR1BR1C。P是-O-、-S-、-NR2B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR2B-、-NR2BC(O)-、-NR2BC(O)NH-、-NHC(O)NR2B-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。M是-O-、-S-、-NR5B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5B-、-NR5BC(O)-、-NR5BC(O)NH-、-NHC(O)NR5B-、-[NR5BC(R5E)(R5F)C(O)]n2-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基或M1A-M1B-M1C。W1是反应性部分、氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-N3、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)R7E、-OR7A、-NR7BR7C、-C(O)OR7A、-C(O)NR7BR7C、-NO2、-SR7D、-SOn7R7B、-SOv7NR7BR7C、-NHNR7BR7C、-ONR7BR7C或-NHC(O)NHNR7BR7C。M1A键合至L3。M1C键合至L4。M1A是键、-O-、-S-、-NR5AB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5AB-、-NR5ABC(O)-、-NR5ABC(O)NH-、-NHC(O)NR5AB-、-[NR5ABCR5AER5AFC(O)]n3-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。M1B是键、-O-、-S-、-NR5BB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5BB-、-NR5BBC(O)-、-NR5BBC(O)NH-、-NHC(O)NR5BB-、-[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。M1C是键、-O-、-S-、-NR5CB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5CB-、-NR5CBC(O)-、-NR5CBC(O)NH-、-NHC(O)NR5CB-、-[NR5CBCR5CER5CFC(O)]n5-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。R1A、R1B、R1C、R1D、R1E、R2B、R3B、R4B、R5B、R5E、R5F、R5AB、R5AE、R5AF、R5BB、R5BE、R5BF、R5CB、R5CE、R5CF、R6B、R7A、R7B、R7C、R7D、R7E独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-N(O)2、-SH、-S(O)3H、-S(O)4H、-S(O)2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHS(O)2H、-NHC(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHl2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基；并且与同一个氮原子键合的R1B和R1C取代基可以任选地连接以形成取代或未取代的杂环烷基或取代或未取代的杂芳基。符号n1和n7独立地是0至4的整数。符号n7和v7独立地是1或2。符号n2、n3、n4和n5独立地是从1至10的整数。
在另一个方面，提供了制备一种抗体药物缀合物的方法。该方法包括使卡奇霉素构建体与抗体的氨基酸例如半胱氨酸或赖氨酸接触，该卡奇霉素构建体具有如本文所定义的式W1-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D。W1是与如赖氨酸侧链或半胱氨酸侧链等氨基酸反应的官能团。M是可裂解部分。L3和L4独立地是接头。P是二硫键保护基。D是卡奇霉素或其类似物。符号z1和z2独立地是从0至10的整数。符号z3独立地是从1至10的整数。
本文还提供了药物组合物。一方面是包含此处所述的化合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。另一方面是包含此处所述的抗体药物缀合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本文还提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法。该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的此处所述的药物组合物或化合物(例如抗体药物缀合物)。
附图说明
图1示出了根据本发明制造的示例性卡奇霉素-接头构建体的化学结构，进行了注释以显示构建体的某些组分。
图2A-2C提供了证明本发明披露的卡奇霉素-接头构建体有效裂解以提供活性卡奇霉素的数据。
图3A-3D显示卡奇霉素(图3A)和示例性卡奇霉素-接头构建体(图3B-3D)在体外有效地杀死细胞同时推断出IC50值。
图4A和4B提供了质谱数据，其证实使用所披露的方法，本发明的卡奇霉素-接头构建体有效地缀合到示例性抗体上。
图5显示了使用RP-HPLC测定的两个示例性位点特异性抗体轻链和重链缀合到两个不同的卡奇霉素-接头构建体的缀合百分比。hSC17ss1-vc是在式4′中指示的附接点处附接于hSC17抗体的式4′；抗体是通过一个或多个半胱氨酸侧链连接到缀合物/分子的剩余部分的hSC17ss1(IgG抗体)。hSC17ss1-va是在式5′中指示的附接点处附接于hSC17抗体的式5′；抗体是通过一个或多个半胱氨酸侧链连接到缀合物/分子的剩余部分的hSC17ss1(IgG抗体)。hSC1ss1-vc是在式4′中指示的附接点处附接于hSC1抗体的式4′；抗体是通过一个或多个半胱氨酸侧链连接到缀合物/分子的剩余部分的hSC1ss1(IgG抗体)。
图6提供了显示使用HIC确定的使用本文披露的方法缀合的示例性位点特异性抗体构建体的DAR分布的图示。
图7A-7C证明了包含卡奇霉素-vc接头(图7A)、卡奇霉素-va接头(图7B)或卡奇霉素-肟接头(图7C)的示例性抗体药物缀合物在体外杀死细胞的能力。
图8A-8C提供了显示本发明的示例性抗体药物缀合物能够在体内有效杀死肿瘤细胞的数据。hSC17ss1-ox是在式14′中指示的附接点处附接于hSC17抗体的式14′；抗体是通过一个或多个半胱氨酸侧链连接到缀合物/分子的剩余部分的hSC17ss1(IgG抗体)。
图9提供了显示本发明的示例性抗体药物缀合物可以在体内有效杀死肿瘤细胞的数据。
图10提供了显示示例性抗体药物缀合物在食蟹猴中的药物代谢动力学数据。hSC27ss1-vc是在式4′中指示的附接点处附接于hSC27抗体的式4′；抗体是通过一个或多个半胱氨酸侧链连接到缀合物/分子的剩余部分的hSC27ss1(IgG抗体)。
具体实施方式
本发明能以许多不同的形式实施。本文披露了本发明的非限制性的说明性实施例，其例示了本发明的原理。在此使用的任何章节标题只是出于组织的目的，而不应解释为限制所描述的主题内容。通常，本文使用的命名法和下文所述的细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验室程序是本领域中公知和常用的那些。标准技术用于核酸和肽合成。通常，酶反应和纯化步骤根据制造商的规格进行。除非另外指出，否则出于本披露的目的，所有标识的序列登录号都可以见于NCBI参考序列(RefSeq)数据库和/或NCBI档案序列数据库。本文中使用的命名法和下文所述的分析化学以及有机合成中的实验室程序是本领域公知和常用的那些。标准技术或其变化用于化学合成和化学分析。
I.定义
术语“可裂解部分”旨在表示在所选靶位点处被裂解的部分。优选地，“可裂解部分”允许通过裂解或将其与靶向剂分离来分离和/或活化卡奇霉素。操作上定义的是，接头(如下所定义)优选通过生理效应器在靶位点上通过可裂解部分的分叉来裂解。裂解可以没有限制地来自任何方法，例如酶解、还原、pH等。优选地，可裂解部分被选择并整合在接头中，使得活化发生在所需的作用部位，其优选地位于靶细胞(例如癌细胞)或组织中或附近。在选择的实施例中，可裂解部分可以包含肽键、腙部分、肟部分、酯键和二硫键。在特别优选的实施例中，这种裂解是酶促的，其中示例性可酶促裂解的基团包括天然氨基酸或以天然氨基酸结束并且被结合到接头中的肽序列。优选地，可结合的裂解部分是其中至少约10％的卡奇霉素在给药24小时内被活化和释放，并且更优选25％被释放的那些。
术语“多肽”、“肽”以及“蛋白”在此可互换地使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在氨基酸的一种人工化学模拟物，并且应用于天然存在的氨基酸聚合物以及非天然存在的氨基酸聚合物。这些术语也包括术语“抗体”。
术语“氨基酸”是指天然存在的以及合成的氨基酸，连同氨基酸类似物以及氨基酸模拟物(它们以一种类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用)。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，连同随后被修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸酯、以及O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指化合物，它们具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，即，α碳，该碳结合到氢、羧基基团、氨基基团、以及R基团上，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的通用化学结构的结构，但是以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的化合物。术语“非天然氨基酸”旨在表示上述20种天然存在的氨基酸的“D”立体化学形式。还应理解，术语非天然氨基酸包括天然氨基酸的同系物和天然氨基酸的合成修饰形式。合成修饰形式包括但不限于具有缩短或延长至多2个碳原予的亚烷基链的氨基酸、包含任选取代的芳基的氨基酸和包含卤代基团的氨基酸，优选卤代烷基和芳基。当附接到本发明的接头或缀合物时，氨基酸是“氨基酸侧链”的形式，其中氨基酸的羧酸基团被酮(C(O))基团取代。因此，例如，丙氨酸侧链是-C(O)-CH(NH2)-CH3等。
“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及它们的单链或双链形式的聚合体。该术语包括含有已知核苷酸类似物或经修饰的主链残基或键的核酸，其是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参比核酸相似的结合特性，并且以类似于参比核苷酸的方式代谢。这些类似物的实例包括但不限于：硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另外表明，特定的核酸序列还暗示性地涵盖它的保守地修饰的变体(例如，简并密码子取代)以及互补序列、以及明确地指明的序列。确切地说，简并密码子取代可通过产生以下序列来实现，在这些序列中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代。
“脂肪族”是指具有特定数目碳原子(例如“C3脂肪族”、“C1-C5脂肪族”、或“C1至C5脂肪族”，后两个短语是具有从1至5个碳原子的脂肪族部分的同义词)或其中碳原子数目是未明确规定(从1至4个碳原子(在不饱和脂肪族部分的情况下为2至4个碳))的直链或支链、饱和或不饱和的非芳族烃部分。
除非另作说明，术语“烷基”，就其本身或作为另一个取代基的部分，是指一个直链或支链、或环烃基、或它们的组合，它可能是完全饱和的、单不饱和的、或多不饱和的，并且能包括二价以及多价基，具有所指定的碳原子数目(即C1-C10是指1至10个碳原予)。除非另有说明，术语“烷基”也意在包括下文更详细定义的烷基的那些衍生物，例如“杂烷基”。限于烃基的烷基被称为“同系烷基(homoalkyl)”。在实施例中，烷基不包括环烃基。在实施例中，本文所用的术语“烷基”是指具有1-20个碳原子的饱和直链或支链单价烃基。饱和烃基的实例包括但不限于以下基团，例如：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、以及如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基、以及更高级同系物和异构体。“单价”是指烷基与分子的剩余部分有一个附接点。烷基的实例包括但不限于：甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、-CH2CH(CH3)2、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2，3-二甲基-2-丁基、3，3-二甲基-2-丁基、1-庚基、1-辛基等。具体地，所述烷基具有1-10个碳原子。更具体地，所述烷基具有1-4个碳原子。
术语“亚烷基”，本身或作为另一取代基的一部分，是指衍生自烷烃的二价基团，其例示为但不限于-CH2CH2CH2CH2-，并且还包括下述为“杂亚烷基”的那些基团。通常，烷基(或亚烷基)基团具有1至24个碳原子，在本发明中优选具有10个或更少碳原子的基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是通常具有8个或更少碳原子的较短链烷基或亚烷基。
除非另有说明，术语“杂烷基”，本身或与另一术语组合，是指由所述数目的碳原子和至少一个杂原子组成的稳定的直链或支链或环状烃基或其组合，其中所述杂原子选自由O、N、Si和S组成的组，并且其中所述氮、碳和硫原子可以任选地被氧化并且所述氮杂原子可以任选地被季铵化。一个或多个杂原子O、N和S以及Si可以置于杂烷基的任何内部位置或置于烷基附接于分子剩余部分的位置处。实例包括但不限于：-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。多达两个杂原子可以是连续的，像例如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”，本身或作为另一取代基的一部分，是指衍生自杂烷基的二价基团，如例示但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基，杂原子也可以占据链末端的任一端或两端(例如，亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。术语“杂烷基”和“杂亚烷基”包括聚(乙二醇)及其衍生物。此外，对于亚烷基以及杂亚烷基链接基团，书写链接基团的式的方向并不表示所述链接基团的取向。例如，式-C(O)2R′-表示-C(O)2R′-和-R′C(O)2-两者。
术语“低级”与术语“烷基”或“杂烷基”组合是指具有1至6个碳原子的部分。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规意义使用，并且是指通过氧原子、氨基或硫原予与分子的剩余部分分别附接的那些烷基。
通常，“酰基取代基”也选自上述基团。如本文所用，术语“酰基取代基”是指附接于羰基碳(本发明化合物的多环核直接或间接与其附接)并且实现了其化合价的基团。
除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”，本身或与其他术语组合，分别表示取代或未取代的“烷基”和取代或未取代的“杂烷基”的环状形式。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环与分子剩余部分附接于此的位置。环烷基的实例包括但不限于：环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于：1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。所述环状结构的杂原子和碳原子任选地被氧化。
除非另有说明，术语“卤代”或“卤素”，本身或作为另一取代基的一部分，是指氟、氯、溴或碘原予。另外，诸如“卤代烷基”的术语意指包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”是指包括但不限于：三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
指除非另有说明，术语“芳基”(缩写Ar)是取代或未取代的多不饱和芳族烃取代基，其可以是单环或多环(优选1至3个环)，这些环稠合在一起或以共价键相连接。术语“杂芳基”是指含有1至4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮、碳和硫原子任选地被氧化，并且所述一个或多个氮原子任选地被季铵化。杂芳基可以通过杂原子附接到分子的剩余部分上。芳基和杂芳基基团的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、和6-喹啉基。每个上述芳基和杂芳基环系统的取代基选自下述可接受的取代基的组。“芳基”和“杂芳基”还包括其中一个或多个非芳香族环系统与芳基或杂芳基系统稠合或以其他方式结合的环系统。
为了简洁起见，当与其他术语(例如芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)组合使用时，术语“芳基”包括如上定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”意在包括其中芳基附接到烷基(例如苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等)上的那些基团，所述烷基基团包括其中碳原子(例如亚甲基基团)已被例如氧原子(例如苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)取代的那些。
上述术语中的每一个(例如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)包括所指定基团的取代和未取代的形式。下面提供了每种类型的基团的优选取代基。
烷基、和杂烷基的取代基(包括通常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)通常分别被称为“烷基取代基”和“杂烷基取代基”并且它们可以是选自但不限于以下多个基团中的一种或多种：-O′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-S′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)′、-C(O)′、-CO2′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)2′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)′、-S(O)2′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2′、-CN和-NO2，其数量范围为从0至(2m′+1)，其中m′是这种基团中碳原子的总数。R′、R″、R″′和R″″各自优选独立地表示氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基，例如被1-3个卤素取代的芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或芳基烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当这些基团中多于一个基团存在时，每个R基团各自被独立地选为R′、R″、R″′和R″″基团。当R′和R″附接到同一个氮原子时，它们可以与氮原子结合以形成5元、6元或7元环。例如，-NR′R″意在包括但不限于：1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上述取代基的讨论中，本领域技术人员将理解，术语“烷基”意在包括含与除氢基团以外的基团结合的碳原子的基团，例如卤代烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
类似于对于烷基所述的取代基，芳基取代基和杂芳基取代基通常分别被称为“芳基取代基”和“杂芳基取代基”，并且可发生变化并选自例如：卤素、-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基、和氟(C1-C4)烷基，其数量范围为芳香族环系统的开放化合价(open valence)的从0至总数；并且其中R′、R′、R″′和R″″优选地独立地选自氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基和(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当这些基团中多于一个基团存在时，每个R基团各自被独立地选为R′、R″、R″′和R″″基团。
芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个芳基取代基可以任选地被式-T-C(O)-(CRR′)q-U-的取代基替代，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR′-或单键，并且q为从0至3的整数。可替代地，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-A-(CH2)r-B-的取代基替代，其中A和B独立地是-CRR′-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR′-或单键并且r为从1至4的整数。如此形成的新环的单键中的一个可以任选地被双键替代。可替代地，芳基或杂芳基环的相邻原予上的两个取代基可以任选地被式-(CRR′)n-X-(CR″R″′)d-的取代基取代，其中s和d独立地是从0至3的整数，并且X为-O-、-NR′-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、或-S(O)2NR′-。取代基R、R′、R″和R″′优选地独立地选自氢或取代或未取代的(C1-C6)烷基。
如本文所用，术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。
符号“R”是一个通用缩写，它代表选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、和取代或未取代的杂环基的取代基。
如本文所用的，“亚烷基”是指具有1-20个碳原子的饱和直链或支链二价烃基，其实例包括但不限于具有与上述例举的烷基相同的核心结构的那些。“二价”是指亚烷基与分子的剩余部分具有两个附接点。具体地，所述亚烷基具有1-10个碳原子。更具体地，所述亚烷基具有1-4个碳原子。
术语“碳环”、“碳环基”、“碳环的”和“碳环”是指具有3至12个碳原予的单环或7至12个碳原子的双环的单价非芳香族、饱和或部分不饱和环。例如，具有7至12个原子的双环碳环可以被安排为双环[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]系统，并且具有9或10个环原子的双环碳环可以被安排为双环[5，6]或[6，6]系统，或被安排为桥联系统如双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷和双环[3.2.2]壬烷。单环碳环的实例包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基、环十二烷基等。
术语“环烷基烷基”是指通过亚烷基与另一个基团连接的环烷基。环烷基烷基的实例包括但不限于：环己基甲基、环己基乙基、环戊基甲基、环戊基乙基等。
如果一个组被描述为“任选取代”，则该组可以是(1)未被取代的、或(2)取代的。如果基团的碳被描述为被取代基列表中的一个或多个任选地取代，则该碳(在一定程度上，存在任意数量)上的一个或多个氢原予可以单独地和/或一起被独立地选择的任选的取代基替代。
术语“靶向剂”和“细胞结合剂”可以互换使用，并且意指一个部分，该部分(1)能够将其附接的实体(例如卡奇霉素)引导至靶细胞，例如特定类型的肿瘤细胞，或(2)优先在靶组织例如肿瘤处被活化。所述靶向剂可以是小分子，其旨在包括非肽和肽。所述靶向剂也可以是大分子，其包括糖、凝集素、受体、受体配体、蛋白质如BSA、抗体等。最优选地，所述靶向剂应包含抗体或其免疫反应性片段。在实施例中，所述靶向剂是抗体或其免疫反应性片段。
如本文所用的，术语“盐”是指本发明化合物的有机或无机盐。具体地，盐是药学上可接受的盐。其他非药学上可接受的盐也包括在本发明中(例如分子或大分子)。所述盐包括通过使包含碱性基团的本发明化合物与无机酸或有机酸(例如羧酸)反应形成的盐和通过使包含酸性基团的本发明化合物与无机碱或有机碱(例如胺)反应形成的盐。示例性的盐包括下面所述的药学上可接受的那些盐。
当本发明的化合物含有相对酸性的官能团时，可以通过使此类化合物的中性形式与足够量的所需碱(纯的或处于合适的惰性溶剂中)接触来获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物含有相对碱性的官能团时，可以通过使此类化合物的中性形式与足够量的所需酸(纯的或处于合适的惰性溶剂中)接触来获得酸加成盐。
药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸(如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、单氢碳酸、磷酸、单氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、单氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸)的那些，以及衍生自相对无毒的有机酸(如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等)的盐。还包括氨基酸如精氨酸盐等的盐，以及诸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等有机酸的盐(参见例如Berge等人，“Pharmaceutical Salts”[药用盐]，Journal of Pharmaceutical Science[药物科学杂志]，1977，66，1-19)。本发明的某些具体化合物含有使化合物转化为碱或酸加成盐的碱性和酸性官能团。
术语“药学上可接受的盐”是指分子或大分子的有机或无机盐。取决于此处所述化合物上发现的具体取代基，药学上可接受的盐包括用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐。可以与氨基形成酸加成盐。示例性的盐包括但不限于：硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化盐、溴化盐、碘化盐、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酸式酒石酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1，1′亚甲基双-(2-羟基3-萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可以包括另外的分子的包含物，例如醋酸盐离子、琥珀酸盐离子或其他平衡离子。所述平衡离子可以是使母体化合物上的电荷稳定的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可以具有多于一个的带电原子。当多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分时，该盐可以具有多个平衡离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电原子和/或一个或多个平衡离子。
化合物的中性形式优选通过使盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物来再生。所述化合物的母体形式与所述各种盐形式在某些物理性质上是不同，例如在极性溶剂中的溶解度，但是另外地，为了本发明的目的，所述盐相当于所述化合物的母体形式。
“药学上可接受的溶剂合物”或“溶剂合物”是指一种或多种溶剂分子和分子或大分子的缔合物。形成药学上可接受的溶剂合物的溶剂的实例包括但不限于：水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸、和乙醇胺。
术语“接头”、“生物缀合物接头”和“间隔子”可互换使用，并且如本文所用，描述了将一个化学部分共价连接到另一个化学部分的二价化学基团。本文描述了接头的具体实例。接头可以是聚乙烯(PEG)接头或生物缀合物接头或其组合。
术语“附接基团”或“生物缀合部分”是指允许将靶向剂附接到接头的部分。如下文更详细讨论的，示例性连接基团，以说明性地而非限制性地方式，包括：烷基、氨基烷基、氨基羰基烷基、羧基烷基、羟基烷基、烷基-马来酰亚胺、烷基-N-羟基琥珀酰亚胺、聚(乙二醇)-马来酰亚胺和聚(乙二醇)-N-羟基琥珀酰亚胺，所有这些可以进一步被取代。所述接头还可以使附接部分实际地附加于靶向基团。
本文所用的“反应性官能团”、“反应性部分”、“反应性基团”是指在化学部分之间发生反应形成接头的基团。所描述的反应性基团包括通常用于生物缀合物技术的反应性官能团，如此处所述。在实施例中，所述反应性部分可以是与氨基酸(例如氨基酸侧链)如赖氨酸侧链或半胱氨酸侧链反应的官能团。反应性基团包括但不限于：烯烃、炔烃、醇、酚、醚、氧化物、卤化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸酯、异氰酸酯、硫氰酸盐、异硫氰酸盐、胺、肼、腙、酰肼、偶氮基、重氮基、硝基、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亚砜、砜、磺酸、亚磺酸、缩醛、缩酮、酸酐、硫酸盐、次磺酸异腈、脒、酰亚胺、亚氨酸酯、硝酮、羟胺、肟、异羟肟酸硫代异羟肟酸、丙二烯、原酸酯、亚硫酸盐、烯胺、炔胺、脲、假脲、氨基脲、碳二亚胺、氨基甲酸酯、亚胺、叠氮化物、偶氮化合物、偶氮氧基化合物和亚硝基化合物。反应性官能团还包括用于制备生物缀合物的那些，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺等。制备这些官能团中的每一个的方法是本领域熟知的，并且它们对于特定目的的应用或针对特定目的的修改在本领域技术人员的能力范围内。
如本文所用，术语“缀合物”是指原子或分子之间的缔合。所述缔合可以是直接或间接的。例如，如本文所提供的核酸(例如核糖核酸)和化合物部分的缀合可以是直接的，例如通过共价键；或者可以是间接的，例如通过非共价键。任选地，使用缀合化学形成缀合物，所述缀合化学包括但不限于：亲核取代(例如，胺和醇与酰基卤、活性酯的反应)、亲电子取代(例如烯胺反应)以及对碳-碳和碳-杂原子多重键的加成(例如，迈克尔反应(Michaelreaction)，狄尔斯-阿尔德加成(Diels-Alder addition))。这些和其他有用的反应在例如：March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY[高等有机化学]，第三版，John Wiley&Sons[约翰威立父子出版社]，纽约，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES[生物缀合技术]，Academic Press[学术出版社]，圣地亚哥，1996；和Feeney等人，MODIFICATION OFPROTEINS[蛋白质改性]；Advances in Chemistry Series[化学进展系列]，第198卷，American Chemical Society[美国化学学会]，华盛顿特区，1982中进行了讨论。因此，所述核酸可以通过其主链附接到化合物部分。任选地，所述核糖核酸包括促进核糖核酸与化合物部分的相互作用的一个或多个反应性部分，例如氨基酸反应性部分。
本文中用于缀合化学的有用的反应性部分或反应性官能团包括，例如：
(a)羧基及其各种衍生物，其包括但不限于：N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰基卤、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基和芳族酯；
(b)可以转化成酯、醚、醛等的羟基；
(c)卤代烷基，其中卤化物可以稍后用亲核基团例如像胺、羧酸根阴离子、硫醇阴离子、碳负离子、或醇盐离子替换，由此导致新基团共价附接于卤素原子的位置处；
(d)能够参与狄尔斯-阿尔德反应的亲二烯体基团，例如像马来酰亚胺基；
(e)醛或酮基，其通过形成羰基衍生物例如像亚胺、腙、缩氨基脲或肟，或通过诸如格氏加成或烷基锂加成等的此类机制，使得后续的衍生化成为可能；
(f)磺酰卤化物基团，其用于随后与胺的反应，例如来形成磺酰胺；
(g)可转化为二硫化物的硫醇基，其与酰基卤反应，或与金属如金键合；
(h)胺或巯基，其可以是例如酰化、烷基化或氧化的；
(i)烯烃，其可经历例如环加成作用、酰化作用、迈克尔加成等；
(j)可与例如胺和羟基化合物反应的环氧化物；
(k)亚磷酰胺和其他用于核酸合成的标准官能团；
(l)键合的金属硅氧化物；
(m)键合到反应性磷基团(例如膦)以形成例如磷酸二酯键的金属；和
(n)砜，例如乙烯基砜。
通过使用缀合(“点击”)化学连接小模块单元的组合物的化学合成是本领域已知的，并可见描述于例如H.C.Kolb，M.G.Finn和K.B.Sharpless ((2001).“Click Chemistry：Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions”[点击化学：来自若干良好反应的不同化学功能].Angewandte Chemie International Edition[德国应用化学国际版]40(11)：2004-2021)；R.A.Evans ((2007).“The Rise of Azide-Alkyne 1，3-Dipolar‘Click’Cycloaddition and its Application to Polymer Science and SurfaceModification”[叠氮化物-炔烃1，3-两极‘点击’环加成作用及其在聚合物科学和表面改性中的应用之崛起].Australian Journal of Chemistry[澳大利亚化学杂志]60(6)：384-395；W.C.Guida等人，Med.Res.Rev.[医药研究评论]第3页，1996；Spiteri，Christian和Moses，John E.((2010).“Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition：Regioselective Synthesis of 1，4，5-Trisubstituted 1，2，3-Triazoles”[铜催化的叠氮化物-炔烃环加成作用：1，4，5-三取代的1，2，3-三唑的区域选择性合成].AngewandteChemie International Edition[德国应用化学国际版]49(1)：31-33)；Hoyle，CharlesE.and Bowman，Christopher N.((2010).“Thiol-Ene Click Chemistry”[硫醇-烯点击化学].Angewandte Chemie International Edition[德国应用化学国际版]49(9)：1540-1573)；Blackman，Melissa L.and Royzen，Maksim and Fox，Joseph M.((2008).“Tetrazine Ligation：Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-DemandDiels-Alder Reactivity”[四嗪连接：基于逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应性的快速生物缀合].Journal of the American Chemical Society[美国化学会志]130(41)：13518-13519；Devaraj，Neal K.和Weissleder，Ralph和Hilderbrand，Scott A.((2008).“Tetrazine Based Cycloadditions：Application to Pretargeted Live CellLabeling”[基于四嗪的环加成作用：在预靶向活细胞标记中的应用].BioconjugateChemistry [生物缀合化学]19(12)：2297-2299)；Henning；Neves，Andre；Stairs，Shaun；Brindle，Kevin；Leeper，Finian((2011).“Exploring isonitrile-basedclick chemistry for ligation with biomolecules”[用于生物分子连接的基于异氰化物的点击化学探索].Organic&Biomolecular Chemistry[有机和生物分子化学]中，所有这些都通过引用整体并入本文并用于所有目的。
可以选择反应性官能团，使得它们不参与或干扰此处所述的蛋白质的化学稳定性。举例来说，所述核酸可以包括乙烯基砜或其他反应性部分。任选地，所述核酸可以包括具有式S-S-R的反应性部分。R可以是例如保护基。任选地，R是己醇。如本文所用，术语己醇包括具有式C6H13OH的化合物，并且包括1-己醇、2-己醇、3-己醇、2-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、2-甲基-2-戊醇、3-甲基-2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊醇、3-甲基-3-戊醇、2，2-二甲基-1-丁醇、2，3-二甲基-1-丁醇、3，3-二甲基-1-丁醇、2，3-二甲基-2-丁醇、3，3-二甲基-2-丁醇和2-乙基-1-丁醇。任选地，R是1-己醇。
“抗体”是指多肽，该多肽包括来自特异性结合和识别抗原的免疫球蛋白基因或其片段的框架区。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，它们依次分别限定免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，在结合的特异性和亲和力方面，抗体的抗原结合区域是最关键的。在一些实施例中，抗体或抗体片段可衍生自不同生物体，包括人、小鼠、大鼠、仓鼠、骆驼等。本发明的抗体可以包括在一个或多个氨基酸位置被修饰或突变以改善或调节抗体的所需功能的抗体(例如，糖基化、表达、抗原识别、效应子功能、抗原结合、特异性等)。
抗体是具有复杂的内部结构的大的络合分子(分子量为约15万或约1320个氨基酸)。天然抗体分子含有两条相同的多肽链对，每对具有一条轻链和一条重链。每个轻链和重链又由两个区域组成：参与结合靶抗原的可变(“V”)区域和与免疫系统的其他成分相互作用的恒定(“C”)区域。轻链和重链可变区在三维空间中一起形成结合抗原(例如，细胞表面上的受体)的可变区。在每个轻链或重链可变区内，有称为互补决定区(“CDR”)的三个短片段(长度平均为10个氨基酸)。抗体可变结构域中的6个CDR(3个来自轻链，3个来自重链)在3维空间中一起折叠，以形成对接在靶抗原上的实际抗体结合位点。CDR的位置和长度已由卡巴特，E.等人，在Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫相关蛋白质序列]，U.S.Department of Health and Human Services[美国卫生与公共服务部]，1983，1987中精确地定义。不包含在CDR中的可变区的部分称为框架(“FR”)，其构成CDR的环境。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体是由多肽链的两个相同对组成的，每一对具有一个“轻链”(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端限定具有约100个至110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。Fc(即片段可结晶区域)是免疫球蛋白的“碱基”或“尾”，并且通常由根据抗体类型形成两个或三个恒定域的两个重链组成。通过结合至特定蛋白质，所述Fc区域确保每个抗体会针对给定的抗原产生适当的免疫应答。所述Fc区还结合各种细胞受体，如Fc受体和其他免疫分子，如补体蛋白。
例如，抗体作为完整的免疫球蛋白存在，或作为许多通过用各种肽酶消化产生的良好表征的片段而存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区域中消化在二硫键以下的抗体以产生F(ab)’2，为Fab的二聚体，本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)’2可以在温和条件下被还原以破坏铰链区中的二硫键，从而将所述F(ab)’2二聚体转化成Fab′单体。Fab′单体基本上是具有部分铰链区的抗原结合部分(参见Fundamental Immunology[基础免疫学](Paul编，第三版1993)。虽然根据完整抗体的消化来定义各种抗体片段，但是本领域技术人员将理解，可以通过化学方法或通过使用重组DNA方法从头合成此类片段。因此，如本文所用的，术语抗体还包括通过全抗体修饰产生的抗体片段，或者使用重组DNA方法(例如单链Fv)从头合成的那些或使用噬菌体展示文库鉴定的那些(参见例如，McCafferty等人，Nature[自然]348：552-554(1990))。
术语“治疗有效量”是指在受试者中引起所需生物反应的活性卡奇霉素或抗体药物缀合物的量。此类反应包括缓解所治疗的疾病或病症的症状，预防、抑制或延缓疾病症状或疾病本身的复发，受试者的寿命与不治疗相比的增加，或预防、抑制或延缓疾病的症状或疾病本身的进展。有效量的确定是完全在本领域的普通技术人员的能力之内，尤其是根据于此提供的具体披露内容。所披露的化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养和实验动物的标准制药程序来确定。本发明的化合物或缀合物或其他施用于受试者的治疗剂的有效量将取决于多发性骨髓瘤的阶段、类别和状态以及受试者的特征，例如总体健康状况、年龄、性别、体重和耐药性。本发明化合物或缀合物或其他治疗剂的有效量也将取决于给药途径和剂型。可以单独调整剂量和间隔以提供足以维持所需治疗效果的活性化合物的血浆水平。
特别地，本文提供的是提供表现出有利的药物代谢动力学和药效学特征的卡奇霉素-接头构建体的新颖方法、化合物、组合物和制品。本文提供的益处可广泛应用于抗体药物缀合物领域，并且可与与多种靶标反应的抗体结合使用。在实施例中，所披露的化合物(例如抗体药物缀合物)包括具有可裂解部分的新颖卡奇霉素-接头构建体，其允许细胞毒性卡奇霉素种类在靶位点处以减少的非特异性毒性有效地呈递。此外，在实施例中，所披露的卡奇霉素-接头构建体用于提供位点特异性缀合物制剂，所述位点特异性缀合物制剂与常规缀合制剂相比相对稳定，并且就平均DAR分布和有效负荷位置而言是基本同质的。如所附实例所示，此类位点特异性卡奇霉素缀合物的稳定性和均匀性(关于平均DAR分布和卡奇霉素定位)提供了有助于改善的治疗指数的有利毒性特征。
在一个实施例中，本发明涉及包含一个或多个可裂解部分的卡奇霉素-接头构建体。本领域技术人员将理解，可裂解的卡奇霉素有效负荷允许激活的弹头(warhead)选择性地和受控地递送到靶位点(例如，肿瘤细胞)。
在实施例中，所披露的化合物将与肿瘤发生细胞上存在的抗原决定簇发生免疫特异性反应。相应地，在特别优选的实施例中，本发明涉及包含可裂解的卡奇霉素有效负荷的抗体药物缀合物，其中所述抗体与已知与各种肿瘤相关的SEZ6决定簇发生免疫特异性反应。
II.组合物
本文提供了式2的化合物(例如抗体药物缀合物)或其药学上可接受的盐：
Ab-[W-(X1)a-CM-(X2)b-P-D]n
(式2)。
Ab是一种靶向剂。W是连接基团或接头。CM是可裂解部分。P是二硫键保护基。X1和X2包括任选的间隔子或接头部分。D是卡奇霉素。符号a和b独立地是0或1。符号n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一方面，提供了式(I)的化合物(例如抗体药物缀合物)、或其药学上可接受的盐：
Ab-[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]z3
(I)。
Ab是一种靶向剂。W是连接基团或接头基团。M是可裂解部分。L3和L4独立地是接头或间隔子。P是二硫键保护基。D是卡奇霉素或其类似物。符号z1、z2和z3独立地是从0至10的整数。在实施例中，符号z3是从1至10的整数。
当D是本文中提供的任一式的卡奇霉素或其类似物时，可以理解D(所述卡奇霉素或类似物)包括本领域已知的卡奇霉素类的任何成员，其中末端-S-S-S-CH3部分被替换，其中符号表示附接至P的点。卡奇霉素是一类来源于细菌棘孢小单孢菌的烯二炔抗肿瘤抗生素，其包括但不限于卡奇霉素γI、卡奇霉素β1 Br、卡奇霉素γ1 Br、卡奇霉素α2 I、卡奇霉素α3 I、卡奇霉素β1 i和卡奇霉素δ1 i。
在实施例中，靶向剂是抗体。
在实施例中，D具有式(Ia)：
R1是氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)R1E、-OR1A、-NR1BR1C、-C(O)OR1A、-C(O)NR1BR1C、-SR1D、-SOn1R1B或-SOv1NR1BR1C。
R1A、R1B、R1C、R1D和R1E独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-N(O)2、-SH、-S(O)3H、-S(O)4H、-S(O)2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHS(O)2H、-NHC(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基。
在实施例中，与同一个氮原子键合的R1B和R1C取代基可以任选地连接以形成取代或未取代的杂环烷基或取代或未取代的杂芳基。符号n1独立地是从0至4的整数。符号v1独立地是1或2。
在另一个方面，提供了具有式(II)的化合物(例如抗体药物缀合物)：
Ab是靶向剂例如抗体。在实施例中，抗体是嵌合抗体、CDR接枝抗体、人源化抗体或人类抗体或其免疫反应性片段。在实施例中，所述抗体是抗SEZ6抗体。
L3是键、-O-、-S-、-NR3B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2、-C(O)NR3B-、-NR3BC(O)-、-NR3BC(O)NH-、-NHC(O)NR3B-、取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基。
L4是键、-O-、-S-、-NR4B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR4B-、-NR4BC(O)-、-NR4BC(O)NH-、-NHC(O)NR4B-、取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基。
R1是氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)R1E、-OR1A、-NR1BR1C、-C(O)OR1A、-C(O)NR1BR1C、-SR1D、-SOn1R1B或-SOv1NR1BR1C。
P是-O-、-S-、-NR2B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR2B-、-NR2BC(O)-、-NR2BC(O)NH-、-NHC(O)NR2B-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。
M是-O-、-S-、-NR5B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5B-、-NR5BC(O)-、-NR5BC(O)NH-、-NHC(O)NR5B-、-[NR5BC(R5E)(R5F)C(O)]n2-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基或M1A-M1B-M1C。
W是-O-、-S-、-NR6B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR6B-、-NR6BC(O)-、-NR6BC(O)NH-、-NHC(O)NR6B-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基或W1A-W1B-W1C。
M1A键合至L3。M1C键合至L4。
M1A是键、-O-、-S-、-NR5AB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5AB-、-NR5ABC(O)-、-NR5ABC(O)NH-、-NHC(O)NR5AB-、-[NR5ABCR5AER5AFC(O)]n3-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。
M1B是键、-O-、-S-、-NR5BB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5BB-、-NR5BBC(O)-、-NR5BBC(O)NH-、-NHC(O)NR5BB-、-[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。
M1C是键、-O-、-S-、-NR5CB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5CB-、-NR5CBC(O)-、-NR5CBC(O)NH-、-NHC(O)NR5CB-、-[NR5CBCR5CER5CFC(O)]n5-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。
W1A键合至Ab。W1C键合至L3。
W1A是键、-O-、-S-、-NR6BA-、-C(O)-、C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR6BA-、-NR6BAC(O)-、-NR6BAC(O)NH-、-NHC(O)NR6BA-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。
W1B是键、-O-、-S-、-NR6BB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR6BB-、-NR6BBC(O)-、-NR6BBC(O)NH-、-NHC(O)NR6BB-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。
W1C是键、-O-、-S-、-NR6BC-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、C(O)NR6BC、NR6BCC(O)、NR6BCC(O)NH、-NHC(O)NR6BC、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。
R1A、R1B、R1C、R1D、R1E、R2B、R3B、R4B、R5B、R5E、R5F、R5AB、R5AE、R5AF、R5BB、R5BE、R5BF、R5CB、R5CE、R5CF、R6B、R6BA、R6BB和R6BC独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-N(O)2、-SH、-S(O)3H、-S(O)4H、-S(O)2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHS(O)2H、-NHC(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基。
在实施例中，与同一个氮原子键合的R1B和R1C取代基可以任选地连接以形成取代或未取代的杂环烷基或取代或未取代的杂芳基。
符号n1是从0至4的整数。在实施例中，n1是0。在实施例中，n1是1。在实施例中，n1是2。在实施例中，n1是3。在实施例中，n1是4。符号n7是从0至4的整数。在实施例中，n7是0。在实施例中，n7是1。在实施例中，n7是2。在实施例中，n7是3。在实施例中，n1是4。符号v1是1或2。符号n2、n3、n4、n5和z3独立地是从1至10的整数。符号z1和z2独立地是从0至10的整数。在实施例中，n2是1。在实施例中，n2是2。在实施例中，n2是3。在实施例中，n2是4。在实施例中，n2是5。在实施例中，n2是6。在实施例中，n2是7。在实施例中，n2是8。在实施例中，n2是9。在实施例中，n2是10。在实施例中，n3是1。在实施例中，n3是2。在实施例中，n3是3。在实施例中，n3是4。在实施例中，n3是5。在实施例中，n3是6。在实施例中，n3是7。在实施例中，n3是8。在实施例中，n3是9。在实施例中，n3是10。在实施例中，n4是1。在实施例中，n4是2。在实施例中，n4是3。在实施例中，n4是4。在实施例中，n4是5。在实施例中，n4是6。在实施例中，n4是7。在实施例中，n4是8。在实施例中，n4是9。在实施例中，n4是10。在实施例中，n5是1。在实施例中，n5是2。在实施例中，n5是3。在实施例中，n5是4。在实施例中，n5是5。在实施例中，n5是6。在实施例中，n5是7。在实施例中，n5是8。在实施例中，n5是9。在实施例中，n5是10。在实施例中，z2是1。在实施例中，z2是2。在实施例中，z2是3。在实施例中，z2是4。在实施例中，z2是5。在实施例中，z2是6。在实施例中，z2是7。在实施例中，z2是8。在实施例中，z2是9。在实施例中，z2是10。在实施例中，z1是1。在实施例中，z1是2。在实施例中，z1是3。在实施例中，z1是4。在实施例中，z1是5。在实施例中，z1是6。在实施例中，z1是7。在实施例中，z1是8。在实施例中，z1是9。在实施例中，z1是10。。在实施例中，z3是1。在实施例中，z3是2。在实施例中，z3是3。在实施例中，z3是4。在实施例中，z3是5。在实施例中，z3是6。在实施例中，z3是7。在实施例中，z3是8。在实施例中，z3是9。在实施例中，z3是10。
在实施例中，W共价附接至抗体内的半胱氨酸残基上。在实施例中，所述半胱氨酸残基是在卡巴特(Kabat)位置C214处。在实施例中，W共价附接至抗体内的赖氨酸残基上。
在实施例中，M是M1A-M1B-M1C，其中M1A键合至L3且M1C键合至L4。
在实施例中，M1A是键、取代或未取代的杂亚烷基或-[NR5ABC(R5AE)(R5AF)C(O)]n3。在实施例中，M1B是键、取代或未取代的杂亚烷基或-[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-。在实施例中，M1C是键或取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。在实施例中，M1A是氨基酸。在实施例中，M1B是氨基酸。在实施例中，M1A或M1B中至少一个是缬氨酸(val)。在实施例中，M1A或M1B中至少一个是丙氨酸(ala)。在实施例中，M1A或M1B中至少一个是瓜氨酸(cit)。在实施例中，M1A、M1B或M1C中的一个是取代的亚芳基。
在实施例中，M1A、M1B或M1C中至少一个具有式(III)：
其中Y是-NH-、-O-、-C(O)NH-或-C(O)O-；并且n6是从0至3的整数。
在实施例中，W是W1A-W1B-W1C，其中W1A键合至Ab并且W1C键合至L3。
在实施例中，P是取代或未取代的烷基。
在实施例中，z3是1或2。
在实施例中，L3是取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基。
在实施例中，L4是取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基。
在实施例中，W是取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。
在实施例中，W是5元或6元的取代或未取代的杂环亚烷基。
在实施例中，W具有式：
在实施例中，M包括一种肽。
在实施例中，-[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]是：
在实施例中，-[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]具有式：
在另外一个方面中，提供了具有式(IV)的化合物：
n1、z1、z2、L3、L4、R1、P和M是如本文中所描述的。
W1是氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-N3、CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)R7E、-OR7A、-NR7BR7C、-C(O)OR7A、-C(O)NR7BR7C、-NO2、-SR7D、-SOn7R7B、-SOv7NR7BR7C、-NHNR7BR7C、-ONR7BR7C、-NHC(O)NHNR7BR7C。
符号n7是从0至4的整数。符号v7是1或2。
在实施例中，式(IV)的化合物具有式：
在实施例中，R1是氢、取代或未取代的烷基或-C(O)R1E。在实施例中，R1是氢或-C(O)R1E。在实施例中，R1是-C(O)R1E。在实施例中，R1是-C(O)CH3、-C(O)CH2CH3、-C(O)CH2CH2CH3或-C(O)CH2CH2CH2CH3。在实施例中，R1是-C(O)CH3。
在实施例中，L3独立地是键、-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、R3G-取代或未取代的亚烷基或R3G-取代或未取代的杂亚烷基。在实施例中，L3独立地是键、-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、R3G-取代或未取代的C1-C6亚烷基或R3G-取代或未取代的2至6元的杂亚烷基。
R3G独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R3H-取代或未取代的烷基、R3H-取代或未取代的杂烷基、R3H-取代或未取代的环烷基、R3H-取代或未取代的杂环烷基、R3H-取代或未取代的芳基、或R3H-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R3G独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R3H-取代或未取代的C1-C6烷基、R3H-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R3H-取代或未取代的C3-C6环烷基、R3H-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R3H-取代或未取代的苯基、或R3H-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，L4独立地是键、-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、R4G-取代或未取代的亚烷基或R4G-取代或未取代的杂亚烷基。在实施例中，L4独立地是键、-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、R4G-取代或未取代的C1-C6亚烷基或R4G-取代或未取代的2至6元的杂亚烷基。
R4G独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R4H-取代或未取代的烷基、R4H-取代或未取代的杂烷基、R4H-取代或未取代的环烷基、R4H-取代或未取代的杂环烷基、R4H-取代或未取代的芳基、或R4H-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R4G独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R4H-取代或未取代的C1-C6烷基、R4H-取代或未取代的2至6元杂烷基、R4H-取代或未取代的C3-C6环烷基、R4H-取代或未取代的3至6元杂环烷基、R4H-取代或未取代的苯基、或R4H-取代或未取代的5至6元杂芳基。
在实施例中，R1独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)H、-OH、-NH2、-C(O)OH、-C(O)NH2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、R1G-取代或未取代的烷基、R1G-取代或未取代的杂烷基、R1G-取代或未取代的环烷基、R1G-取代或未取代的杂环烷基、R1G-取代或未取代的芳基、或R1G-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R1独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)H、-OH、-NH2、-C(O)OH、-C(O)NH2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、R1G-取代或未取代的C1-C6烷基、R1G-取代或未取代的2至6元杂烷基、R1G-取代或未取代的C3-C6环烷基、R1G-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R1G-取代或未取代的苯基、或R1G-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
R1G独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R1H-取代或未取代的烷基、R1H-取代或未取代的杂烷基、R1H-取代或未取代的环烷基、R1H-取代或未取代的杂环烷基、R1H-取代或未取代的芳基、或R1H-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R1G独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R1H-取代或未取代的C1-C6烷基、R1H-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R1H-取代或未取代的C3-C6环烷基、R1H-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R1H-取代或未取代的苯基、或R1H-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，P独立地是-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、R2G-取代或未取代的烷基、R2G-取代或未取代的杂烷基、R2G-取代或未取代的环烷基、R2G-取代或未取代的杂环烷基、R2G-取代或未取代的芳基、或R2G-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，P独立地是-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、R2G-取代或未取代的C1-C6烷基、R2G-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R2G-取代或未取代的C3-C6环烷基、R2G-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R2G-取代或未取代的苯基、或R2G-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
R2G独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R2H-取代或未取代的烷基、R2H-取代或未取代的杂烷基、R2H-取代或未取代的环烷基、R2H-取代或未取代的杂环烷基、R2H-取代或未取代的芳基、或R2H-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R2G独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R2H-取代或未取代的C1-C6烷基、R2H-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R2H-取代或未取代的C3-C6环烷基、R2H-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R2H-取代或未取代的苯基、或R2H-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，M独立地是-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、-[NHCH2C(O)]-、-[NHCH2C(O)]2-、-[NHCH2C(O)]3-、-[NHCH2C(O)]4-、-[NHCH2C(O)]5-、-[NHCH2C(O)]6-、-[NHCH2C(O)]7-、-[NHCH2C(O)]8-、-[NHCH2C(O)]9-、-[NHCH2C(O)]10-、R5G-取代或未取代的烷基、R5G-取代或未取代的杂烷基、R5G-取代或未取代的环烷基、R5G-取代或未取代的杂环烷基、R5G-取代或未取代的芳基、R5G-取代或未取代的杂芳基或M1A-M1B-M1C。在实施例中，M独立地是-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、-[NHCH2C(O)]-、-[NHCH2C(O)]2-、-[NHCH2C(O)]3-、-[NHCH2C(O)]4-、-[NHCH2C(O)]5-、-[NHCH2C(O)]6-、-[NHCH2C(O)]7-、-[NHCH2C(O)]8-、-[NHCH2C(O)]9-、-[NHCH2C(O)]10-、R5G-取代或未取代的C1-C6烷基、R5G-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5G-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5G-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5G-取代或未取代的苯基、R5G-取代或未取代的5至6元的杂芳基或M1A-M1B-M1C。
R5G独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5H-取代或未取代的烷基、R5H-取代或未取代的杂烷基、R5H-取代或未取代的环烷基、R5H-取代或未取代的杂环烷基、R5H-取代或未取代的芳基、或R5H-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R5G独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5H-取代或未取代的C1-C6烷基、R5H-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5H-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5H-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5H-取代或未取代的苯基、或R5H-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，W独立地是-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、R6G-取代或未取代的烷基、R6G-取代或未取代的杂烷基、R6G-取代或未取代的环烷基、R6G-取代或未取代的杂环烷基、R6G-取代或未取代的芳基、R6G-取代或未取代的杂芳基或W1A-W1B-W1C。在实施例中，W独立地是-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、R6G-取代或未取代的C1-C6烷基、R6G-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R6G-取代或未取代的C3-C6环烷基、R6G-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R6G-取代或未取代的苯基、或R6G-取代或未取代的5至6元的杂芳基或W1A-W1B-W1C。在实施例中，W是-[(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]或-[(L3′)z1′-M′-(L4′)z2′-P′-D′]，其中-[(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]与-[(L3′)z1′-M′-(L4′)z2′-P′-D′]相同或任选地不同。z1、z2、L3、L4、P、M和D独立地与z1′、z2′、L3′、L4′、P′、M’和D’相同或独立地是任选地不同的。z1、z2、L3、L4、P、M和D是如本文中所描述的。z1′、z2′、L3′、L4′、P′、M’和D’独立地对应于z1、z2、L3、L4、P、M和D并且像这样的是如本文中所定义的。
R6G独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6H-取代或未取代的烷基、R6H-取代或未取代的杂烷基、R6H-取代或未取代的环烷基、R6H-取代或未取代的杂环烷基、R6H-取代或未取代的芳基、或R6H-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R6G独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6H-取代或未取代的C1-C6烷基、R6H-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R6H-取代或未取代的C3-C6环烷基、R6H-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R6H-取代或未取代的苯基、或R6H-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，W1是氢、卤素、-N3、CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)H、-OH、-NH2、-C(O)OH、-C(O)NH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、R7G-取代或未取代的烷基、R7G-取代或未取代的杂烷基、R7G-取代或未取代的环烷基、R7G-取代或未取代的杂环烷基、R7G-取代或未取代的芳基或R7G-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，W独立地是-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、R7G-取代或未取代的C1-C6烷基、R7G-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R7G-取代或未取代的C3-C6环烷基、R7G-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R7G-取代或未取代的苯基、或R7G-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
R7G独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R7H-取代或未取代的烷基、R7H-取代或未取代的杂烷基、R7H-取代或未取代的环烷基、R7H-取代或未取代的杂环烷基、R7H-取代或未取代的芳基、或R7H-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R7G独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R7H-取代或未取代的C1-C6烷基、R7H-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R7H-取代或未取代的C3-C6环烷基、R7H-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R7H-取代或未取代的苯基、或R7H-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，M1A独立地是键-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、-[NHCH2C(O)]-、-[NHCH2C(O)]2-、-[NHCH2C(O)]3-、-[NHCH2C(O)]4-、-[NHCH2C(O)]5-、-[NHCH2C(O)]6-、-[NHCH2C(O)]7-、-[NHCH2C(O)]8-、-[NHCH2C(O)]9-、-[NHCH2C(O)]10-、R5AG-取代或未取代的烷基、R5AG-取代或未取代的杂烷基、R5AG-取代或未取代的环烷基、R5AG-取代或未取代的杂环烷基、R5AG-取代或未取代的芳基、R5AG-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，M1A独立地是键、-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、-[NHCH2C(O)]-、-[NHCH2C(O)]2-、-[NHCH2C(O)]3-、-[NHCH2C(O)]4-、-[NHCH2C(O)]5-、-[NHCH2C(O)]6-，-[NHCH2C(O)]7-、-[NHCH2C(O)]8-、-[NHCH2C(O)]9-、-[NHCH2C(O)]10-、R5AG-取代或未取代的C1-C6烷基、R5AG-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5AG-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5AG-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5AG-取代或未取代的苯基、或R5AG-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
R5AG独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5AH-取代或未取代的烷基、R5AH-取代或未取代的杂烷基、R5AH-取代或未取代的环烷基、R5AH-取代或未取代的杂环烷基、R5AH-取代或未取代的芳基、或R5AH-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R5AG独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCl3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5AH-取代或未取代的C1-C6烷基、R5AH-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5AH-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5AH-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5AH-取代或未取代的苯基、或R5AH-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，M1B独立地是键-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、-[NHCH2C(O)]-、-[NHCH2C(O)]2-、-[NHCH2C(O)]3-、-[NHCH2C(O)]4-、-[NHCH2C(O)]5-、-[NHCH2C(O)]6-、-[NHCH2C(O)]7-、-[NHCH2C(O)]8-、-[NHCH2C(O)]9-、-[NHCH2C(O)]10-、R5BG-取代或未取代的烷基、R5BG-取代或未取代的杂烷基、R5BG-取代或未取代的环烷基、R5BG-取代或未取代的杂环烷基、R5BG-取代或未取代的芳基、R5BG-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，M1B独立地是键、-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、-[NHCH2C(O)]-、-[NHCH2C(O)]2-、-[NHCH2C(O)]3-、-[NHCH2C(O)]4-、-[NHCH2C(O)]5-、-[NHCH2C(O)]6-、-[NHCH2C(O)]7-、-[NHCH2C(O)]8-、-[NHCH2C(O)]9-、-[NHCH2C(O)]10-、R5BG-取代或未取代的C1-C6烷基、R5BG-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5BG-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5BG-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5BG-取代或未取代的苯基、或R5BG-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
R5BG独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5BH-取代或未取代的烷基、R5BH-取代或未取代的杂烷基、R5BH-取代或未取代的环烷基、R5BH-取代或未取代的杂环烷基、R5BH-取代或未取代的芳基、或R5BH-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R5BG独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5BH-取代或未取代的C1-C6烷基、R5BH-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5BH-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5BH-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5BH-取代或未取代的苯基、或R5BH-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，M1C独立地是键-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、-[NHCH2C(O)]-、-[NHCH2C(O)]2-、-[NHCH2C(O)]3-、-[NHCH2C(O)]4-、-[NHCH2C(O)]5-、-[NHCH2C(O)]6-、-[NHCH2C(O)]7-、-[NHCH2C(O)]8-、-[NHCH2C(O)]9-、-[NHCH2C(O)]10-、R5CG-取代或未取代的亚烷基、R5CG-取代或未取代的杂亚烷基、R5CG-取代或未取代的环亚烷基、R5CG-取代或未取代的杂环亚烷基、R5CG-取代或未取代的芳基、R5CG-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，M1C独立地是键、-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、-[NHCH2C(O)]-、-[NHCH2C(O)]2-、-[NHCH2C(O)]3-、-[NHCH2C(O)]4-、-[NHCH2C(O)]5-、-[NHCH2C(O)]6-、-[NHCH2C(O)]7-、-[NHCH2C(O)]8-、-[NHCH2C(O)]9-、-[NHCH2C(O)]10-、R5CG-取代或未取代的C1-C6亚烷基、R5CG-取代或未取代的2至6元的杂亚烷基、R5CG-取代或未取代的C3-C6环亚烷基、R5CG-取代或未取代的3至6元的杂环亚烷基、R5CG-取代或未取代的苯基、或R5CG-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
R5CG独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5CH-取代或未取代的烷基、R5CH-取代或未取代的杂烷基、R5CH-取代或未取代的环烷基、R5CH-取代或未取代的杂环烷基、R5CH-取代或未取代的芳基、或R5CH-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R5CG独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5CH-取代或未取代的C1-C6烷基、R5CH-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5CH-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5CH-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5CH-取代或未取代的苯基、或R5CH-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，W1A独立地是键、-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、R6AG-取代或未取代的亚烷基、R6AG-取代或未取代的杂亚烷基、R6AG-取代或未取代的环亚烷基、R6AG-取代或未取代的杂环亚烷基、R6AG-取代或未取代的芳基、R6AG-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，W1A独立地是键、-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、R6AG-取代或未取代的C1-C6亚烷基、R6AG-取代或未取代的2至6元的杂亚烷基、R6AG-取代或未取代的C3-C6环亚烷基、R6AG-取代或未取代的3至6元的杂环亚烷基、R6AG-取代或未取代的苯基、或R6AG-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
R6AG独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6AH-取代或未取代的烷基、R6AH-取代或未取代的杂烷基、R6AH-取代或未取代的环烷基、R6AH-取代或未取代的杂环烷基、R6AH-取代或未取代的芳基、或R6AH-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R6AG独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6AH-取代或未取代的C1-C6烷基、R6AH-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R6AH-取代或未取代的C3-C6环烷基、R6AH-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R6AH-取代或未取代的苯基、或R6AH-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，W1B独立地是键、-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、R6BG-取代或未取代的亚烷基、R6BG-取代或未取代的杂亚烷基、R6BG-取代或未取代的环亚烷基、R6BG-取代或未取代的杂环亚烷基、R6BG-取代或未取代的芳基、R6BG-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，W1B独立地是键、-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、R6BG-取代或未取代的C1-C6亚烷基、R6BG-取代或未取代的2至6元的杂亚烷基、R6BG-取代或未取代的C3-C6环亚烷基、R6BG-取代或未取代的3至6元的杂环亚烷基、R6BG-取代或未取代的苯基、或R6BG-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
R6BG独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6BH-取代或未取代的烷基、R6BH-取代或未取代的杂烷基、R6BH-取代或未取代的环烷基、R6BH-取代或未取代的杂环烷基、R6BH-取代或未取代的芳基、或R6BH-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R6BG独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6BH-取代或未取代的C1-C6烷基、R6BH-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R6BH-取代或未取代的C3-C6环烷基、R6BH-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R6BH-取代或未取代的苯基、或R6BH-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，W1C独立地是键、-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、R6CG-取代或未取代的亚烷基、R6CG-取代或未取代的杂亚烷基、R6CG-取代或未取代的环亚烷基、R6CG-取代或未取代的杂环亚烷基、R6CG-取代或未取代的芳基、R6CG-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，W1C独立地是键、-O-、-S-、-NH-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-NHC(O)NH-、R6CG-取代或未取代的C1-C6亚烷基、R6CG-取代或未取代的2至6元的杂亚烷基、R6CG-取代或未取代的C3-C6环亚烷基、R6CG-取代或未取代的3至6元的杂环亚烷基、R6CG-取代或未取代的苯基、或R6CG-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
R6CG独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6CH-取代或未取代的烷基、R6CH-取代或未取代的杂烷基、R6CH-取代或未取代的环烷基、R6CH-取代或未取代的杂环烷基、R6CH-取代或未取代的芳基、或R6CH-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R6CG独立地是氧代、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6CH-取代或未取代的C1-C6烷基、R6CH-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R6CH-取代或未取代的C3-C6环烷基、R6CH-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R6CH-取代或未取代的苯基、或R6CH-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R1A独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R1.1-取代或未取代的烷基、R1.1-取代或未取代的杂烷基、R1.1-取代或未取代的环烷基、R1.1-取代或未取代的杂环烷基、R1.1-取代或未取代的芳基、或R1.1-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R1A独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R1.1-取代或未取代的C1-C6烷基、R1.1-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R1.1-取代或未取代的C3-C6环烷基、R1.1-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R1.1-取代或未取代的苯基、或R1.1-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R1B独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R1.2-取代或未取代的烷基、R1.2-取代或未取代的杂烷基、R1.2-取代或未取代的环烷基、R1.2-取代或未取代的杂环烷基、R1.2-取代或未取代的芳基、或R1.2-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R1B独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R1.2-取代或未取代的C1-C6烷基、R1.2-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R1.2-取代或未取代的C3-C6环烷基、R1.2-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R1.2-取代或未取代的苯基、或R1.2-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R1C独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R1.3-取代或未取代的烷基、R1.3-取代或未取代的杂烷基、R1.3-取代或未取代的环烷基、R1.3-取代或未取代的杂环烷基、R1.3-取代或未取代的芳基、或R1.3-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R1C独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R1.3-取代或未取代的C1-C6烷基、R1.3-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R1.3-取代或未取代的C3-C6环烷基、R1.3-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R1.3-取代或未取代的苯基、或R1.3-取代或未取代的5至6元的杂芳基。键合至同一个氮原子上的R1B和R1C可以任选结合以形成R1.3-取代或未取代的3至6元的杂环烷基或R1.3-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R1D独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R1.4-取代或未取代的烷基、R1.4-取代或未取代的杂烷基、R1.4-取代或未取代的环烷基、R1.4-取代或未取代的杂环烷基、R1.4-取代或未取代的芳基、或R1.4-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R1D独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R1.4-取代或未取代的C1-C6烷基、R1.4-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R1.4-取代或未取代的C3-C6环烷基、R1.4-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R1.4-取代或未取代的苯基、或R1.4-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R1E独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R1.5-取代或未取代的烷基、R1.5-取代或未取代的杂烷基、R1.5-取代或未取代的环烷基、R1.5-取代或未取代的杂环烷基、R1.5-取代或未取代的芳基、或R1.5-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R1E独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R1.5-取代或未取代的C1-C6烷基、R1.5-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R1.5-取代或未取代的C3-C6环烷基、R1.5-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R1.5-取代或未取代的苯基、或R1.5-取代或未取代的5至6元的杂芳基。在实施例中，R1E是未取代的烷基。在实施例中，R1E是未取代的C1-C6烷基。在实施例中，R1E是甲基、乙基、丙基或丁基。在实施例中，R1E是甲基。
在实施例中，R2B独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R2.2-取代或未取代的烷基、R2.2-取代或未取代的杂烷基、R2.2-取代或未取代的环烷基、R2.2-取代或未取代的杂环烷基、R2.2-取代或未取代的芳基、或R2.2-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R2B独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R2.2-取代或未取代的C1-C6烷基、R2.2-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R2.2-取代或未取代的C3-C6环烷基、R2.2-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R2.2-取代或未取代的苯基、或R2.2-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R3B独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R3.2-取代或未取代的烷基、R3.2-取代或未取代的杂烷基、R3.2-取代或未取代的环烷基、R3.2-取代或未取代的杂环烷基、R3.2-取代或未取代的芳基、或R3.2-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R3B独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R3.2-取代或未取代的C1-C6烷基、R3.2-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R3.2-取代或未取代的C3-C6环烷基、R3.2-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R3.2-取代或未取代的苯基、或R3.2-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R4B独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R4.2-取代或未取代的烷基、R4.2-取代或未取代的杂烷基、R4.2-取代或未取代的环烷基、R4.2-取代或未取代的杂环烷基、R4.2-取代或未取代的芳基、或R4.2-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R4B独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R4.2-取代或未取代的C1-C6烷基、R4.2-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R4.2-取代或未取代的C3-C6环烷基、R4.2-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R4.2-取代或未取代的苯基、或R4.2-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R5B独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.2-取代或未取代的烷基、R5.2-取代或未取代的杂烷基、R5.2-取代或未取代的环烷基、R5.2-取代或未取代的杂环烷基、R5.2-取代或未取代的芳基、或R5.2-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R5B独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.2-取代或未取代的C1-C6烷基、R5.2-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5.2-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5.2-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5.2-取代或未取代的苯基、或R5.2-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R5E独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.5-取代或未取代的烷基、R5.5-取代或未取代的杂烷基、R5.5-取代或未取代的环烷基、R5.5-取代或未取代的杂环烷基、R5.5-取代或未取代的芳基、或R5.5-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R5E独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.5-取代或未取代的C1-C6烷基、R5.5-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5.5-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5.5-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5.5-取代或未取代的苯基、或R5.5-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R5F独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.6-取代或未取代的烷基、R5.6-取代或未取代的杂烷基、R5.6-取代或未取代的环烷基、R5.6-取代或未取代的杂环烷基、R5.6-取代或未取代的芳基、或R5.6-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R5F独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.6-取代或未取代的C1-C6烷基、R5.6-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5.6-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5.6-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5.6-取代或未取代的苯基、或R5.6-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R5AB独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.7-取代或未取代的烷基、R5.7-取代或未取代的杂烷基、R5.7-取代或未取代的环烷基、R5.7-取代或未取代的杂环烷基、R5.7-取代或未取代的芳基、或R5.7-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R5AB独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.7-取代或未取代的C1-C6烷基、R5.7-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5.7-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5.7-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5.7-取代或未取代的苯基、或R5.7-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R5AF独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.8-取代或未取代的烷基、R5.8-取代或未取代的杂烷基、R5.8-取代或未取代的环烷基、R5.8-取代或未取代的杂环烷基、R5.8-取代或未取代的芳基、或R5.8-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R5AF独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.8-取代或未取代的C1-C6烷基、R5.8-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5.8-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5.8-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5.8-取代或未取代的苯基、或R5.8-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R5AF独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.9-取代或未取代的烷基、R5.9-取代或未取代的杂烷基、R5.9-取代或未取代的环烷基、R5.9-取代或未取代的杂环烷基、R5.9-取代或未取代的芳基、或R5.9-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R5AF独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.9-取代或未取代的C1-C6烷基、R5.9-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5.9-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5.9-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5.9-取代或未取代的苯基、或R5.9-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R5BB独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.10-取代或未取代的烷基、R5.10-取代或未取代的杂烷基、R5.10-取代或未取代的环烷基、R5.10-取代或未取代的杂环烷基、R5.10-取代或未取代的芳基、或R5.10-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R5BB独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.10-取代或未取代的C1-C6烷基、R5.10-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5.10-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5.10-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5.10-取代或未取代的苯基、或R5.10-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R5BE独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.11-取代或未取代的烷基、R5.11-取代或未取代的杂烷基、R5.11-取代或未取代的环烷基、R5.11-取代或未取代的杂环烷基、R5.11-取代或未取代的芳基、或R5.11-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R5BE独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.11-取代或未取代的C1-C6烷基、R5.11-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5.11-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5.11-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5.11-取代或未取代的苯基、或R5.11-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R5BF独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.12-取代或未取代的烷基、R5.12-取代或未取代的杂烷基、R5.12-取代或未取代的环烷基、R5.12-取代或未取代的杂环烷基、R5.12-取代或未取代的芳基、或R5.12-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R5BF独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.12-取代或未取代的C1-C6烷基、R5.12-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5.12-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5.12-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5.12-取代或未取代的苯基、或R5.12-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R5CB独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.13-取代或未取代的烷基、R5.13-取代或未取代的杂烷基、R5.13-取代或未取代的环烷基、R5.13-取代或未取代的杂环烷基、R5.13-取代或未取代的芳基、或R5.13-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R5CB独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.13-取代或未取代的C1-C6烷基、R5.13-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5.13-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5.13-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5.13-取代或未取代的苯基、或R5.13-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R5CE独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.14-取代或未取代的烷基、R5.14-取代或未取代的杂烷基、R5.14-取代或未取代的环烷基、R5.14-取代或未取代的杂环烷基、R5.14-取代或未取代的芳基、或R5.14-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R5CE独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.14-取代或未取代的C1-C6烷基、R5.14-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5.14-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5.14-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5.14-取代或未取代的苯基、或R5.14-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R5CF独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.15-取代或未取代的烷基、R5.15-取代或未取代的杂烷基、R5.15-取代或未取代的环烷基、R5.15-取代或未取代的杂环烷基、R5.15-取代或未取代的芳基、或R5.15-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R5CF独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R5.15-取代或未取代的C1-C6烷基、R5.15-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R5.15-取代或未取代的C3-C6环烷基、R5.15-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R5.15-取代或未取代的苯基、或R5.15-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R6A独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6.1-取代或未取代的烷基、R6.1-取代或未取代的杂烷基、R6.1-取代或未取代的环烷基、R6.1-取代或未取代的杂环烷基、R6.1-取代或未取代的芳基、或R6.1-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R6A独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6.1-取代或未取代的C1-C6烷基、R6.1-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R6.1-取代或未取代的C3-C6环烷基、R6.1-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R6.1-取代或未取代的苯基、或R6.1-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R6B独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6.2-取代或未取代的烷基、R6.2-取代或未取代的杂烷基、R6.2-取代或未取代的环烷基、R6.2-取代或未取代的杂环烷基、R6.2-取代或未取代的芳基、或R6.2-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R6B独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6.2-取代或未取代的C1-C6烷基、R6.2-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R6.2-取代或未取代的C3-C6环烷基、R6.2-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R6.2-取代或未取代的苯基、或R6.2-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R6AB独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6.7-取代或未取代的烷基、R6.7-取代或未取代的杂烷基、R6.7-取代或未取代的环烷基、R6.7-取代或未取代的杂环烷基、R6.7-取代或未取代的芳基、或R6.7-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R6AB独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6.7-取代或未取代的C1-C6烷基、R6.7-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R6.7-取代或未取代的C3-C6环烷基、R6.7-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R6.7-取代或未取代的苯基、或R6.7-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R6BB独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6.10-取代或未取代的烷基、R6.10-取代或未取代的杂烷基、R6.10-取代或未取代的环烷基、R6.10-取代或未取代的杂环烷基、R6.10-取代或未取代的芳基、或R6.10-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R6BB独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6.10-取代或未取代的C1-C6烷基、R6.10-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R6.10-取代或未取代的C3-C6环烷基、R6.10-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R6.10-取代或未取代的苯基、或R6.10-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
在实施例中，R6BC独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6.13-取代或未取代的烷基、R6.13-取代或未取代的杂烷基、R6.13-取代或未取代的环烷基、R6.13-取代或未取代的杂环烷基、R6.13-取代或未取代的芳基、或R6.13-取代或未取代的杂芳基。在实施例中，R6BC独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、R6.13-取代或未取代的C1-C6烷基、R6.13-取代或未取代的2至6元的杂烷基、R6.13-取代或未取代的C3-C6环烷基、R6.13-取代或未取代的3至6元的杂环烷基、R6.13-取代或未取代的苯基、或R6.13-取代或未取代的5至6元的杂芳基。
R1H、R2H、R3H、R4H、R5H、R6H、R7H、R5AH、R5BH、R5CH、R6AH、R6BH、R6CH、R1.1、R1.2、R1.3、R1.4、R1.5、R2.2、R3.2、R4.2、R5.2、R5.5、R5.6、R5.7、R5.8、R5.9、R5.10、R5.11、R5.12、R5.13、R5.14、R5.15、R6.1、R6.2、R6.7、R6.10和R6.13独立地是氧代、卤素、CF3、CN、OH、NH2、COOH、CONH2、NO2、SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC＝(O)NHNH2、-NHC＝(O)NH2、NHSO2H、-NHC＝(O)H、-NHC(O)-OH、NHOH、OCF3、OCHF2、未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、或未取代的杂芳基。在实施例中，R1H、R2H、R3H、R4H、R5H、R6H、R7H、R5AH、R5BH、R5CH、R6AH、R6BH、R6CH、R1.1、R1.2、R1.3、R1.4、R1.5、R2.2、R3.2、R4.2、R5.2、R5.5、R5.6、R5.7、R5.8、R5.9、R5.10、R5.11、R5.12、R5.13、R5.14、R5.15、R6.1、R6.2、R6.7、R6.10和R6.13独立地是氧代、卤素、CF3、CN、OH、NH2、COOH、CONH2、NO2、SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC＝(O)NHNH2、-NHC＝(O)NH2、-NHSO2H、-NHC＝(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCHF2、未取代的C1-C6烷基、未取代的2至6元的杂烷基、未取代的C3-C6环烷基、未取代的3至6元的杂环烷基、未取代的苯基、或未取代的5至6元的杂芳基。
III.药物组合物
本文还提供了药物制剂。一方面，是包含此处所述的化合物或抗体药物缀合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
IV.方法
本文提供了方法。在一个方面，提供了制备一种抗体药物缀合物的方法。所述方法包括使卡奇霉素构建体与抗体的半胱氨酸或赖氨酸接触，所述卡奇霉素构建体具有式W1-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D，其中W1是与赖氨酸侧链或半胱氨酸侧链反应的官能团，M是可裂解部分，L3和L4独立地是接头，P是二硫键保护基，并且D是卡奇霉素或其类似物。
在实施例中，所述卡奇霉素构建体与抗体的特定半胱氨酸接触。在实施例中，所述特定半胱氨酸衍生自天然二硫桥键。在实施例中，所述抗体是工程化抗体，并且所述特定半胱氨酸不是衍生自天然二硫桥键。在实施例中，特定半胱氨酸在接触之前被选择性地还原。在实施例中，选择性地还原抗体的步骤包括使抗体与稳定剂接触的步骤。
在其他优选的实施例中，所披露的卡奇霉素-接头构建体用于制备抗体药物缀合物，该抗体药物缀合物具有下式：
Ab-[W-(X1)a-CM-(X2)b-P-D]n
或者其药学上可接受的盐，其中：
a)Ab包含靶向剂；
b)W包含连接基团或链接基团；
c)CM包含可裂解部分；
d)P包含二硫键保护基；
e)X1和X2包含任选的间隔子部分；
f)D包含卡奇霉素；
a和b独立地是0或1；并且
n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在选择的实施例中，靶向剂将包含具有一个或多个游离半胱氨酸的位点特异性抗体。在选择的实施例中，可裂解部分可以包含肽键、腙部分、肟部分、酯键和二硫键。在又其他优选实施例中，所述连接基团将与靶向剂上的半胱氨酸部分反应，以将卡奇霉素-接头构建体共价连接到靶向剂上。
除了上述抗体药物缀合物之外，本发明还提供通常包含所披露的ADC的药物组合物和使用此类ADC来诊断或治疗患者中的病症(包括癌症)的方法。在特别优选的实施例中，所披露的缀合物将与SEZ6决定簇缔合。
在另一个实施例中，所述靶向剂将包括包含至少一个未配对半胱氨酸残基的位点特异性工程化IgG1同种型抗体。在一些实施例中，与重/重链链间残基相反，该一个或多个未配对半胱氨酸残基将包含重/轻链链间残基。在其他实施例中，未配对半胱氨酸残基将由链内二硫桥键产生。
在另一个实施例中，所述靶向剂将包括工程化抗体，其中包含所述位点特异性工程化抗体的轻链的C214残基(根据卡巴特的EU索引编号)被另一残基取代或缺失。在另一个实施例中，所述靶向剂包括工程化抗体，其中包含工程化抗体的重链的C220残基(根据卡巴特的EU索引编号)被另一残基取代或缺失。
在相关实施例中，本发明针对杀死肿瘤细胞或肿瘤发生细胞、降低其频率或抑制其增殖的方法，该方法包括用本发明的卡奇霉素ADC处理所述肿瘤细胞或肿瘤发生细胞。在相关实施例中，本发明提供了治疗癌症的方法，该方法包括向受试者给予包含本发明的卡奇霉素缀合物的药物组合物。
在另一个实施例中，本发明包括制备本发明的抗体药物缀合物的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供包含可裂解接头的卡奇霉素构建体；
b)还原靶向剂以提供活化的残基；和
c)将选择性还原的靶向剂缀合至卡奇霉素构建体。
在选择的实施例中，靶向剂将包含具有一个或多个游离半胱氨酸的位点特异性抗体。在其他实施例中，所述位点特异性抗体将被选择性还原。在相关的优选实施例中，选择性地还原抗体的步骤包括使抗体与稳定剂接触的步骤。在又另一个实施例中，该方法还可以包括使抗体与温和还原剂接触的步骤。
另一方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法。该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求所述的药物组合物或本文披露的抗体药物缀合物。在实施例中，癌症选自胰腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和胃癌。在实施例中，所述方法还包括向所述受试者施用另外的化学治疗剂。
一方面，提供了向细胞递送卡奇霉素细胞毒素的方法。所述方法包括使所述细胞与本文所披露的抗体药物缀合物接触。
如所指示的，所披露的缀合物可用于治疗、管理、改善或预防增生性病症或其复发或进展。本发明的所选实施例提供了此类卡奇霉素缀合物的用途，用于恶性肿瘤的免疫治疗性治疗，优选地包括肿瘤起始细胞的频率的降低。所披露的ADC可以单独或联合多种抗癌化合物使用，这些抗癌化合物如化学治疗剂或免疫治疗剂(例如治疗性抗体)或生物反应改良剂。在其他所选实施例中，可以组合使用两种或更多种离散的卡奇霉素缀合物以提供增强的抗赘生效果。
本发明还提供使用此处披露的卡奇霉素缀合物的试剂盒或装置和相关方法，以及此处披露的卡奇霉素缀合物的药物组合物，该药物组合物可用于治疗增生性病症如癌症。为此，本发明优选地提供一种用于治疗此类病症的制品，该制品包含含有本发明的抗体药物缀合物的容器及有关使用该缀合物治疗、减轻或预防增生性病症或者其进展或复发的指导材料。在所选实施例中，这些装置和相关方法将包括与至少一种癌症干细胞接触的步骤。
以上是一个概述，因此必然地包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将理解，该概述仅仅是说明性的，而不是以任何方式进行限制。在此描述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题内容的其他方面、特征及优势将于在此所陈述的传授内容而变得显而易见。提供的概述以一种简化的形式介绍了众多观念的一种选择，以下在详细说明中将对其作进一步描述。这一概述不意在鉴别要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不意在被用作确定要求保护的主题范围的一种辅助手段。
I卡奇霉素
卡奇霉素是一类来源于细菌棘孢小单孢菌的烯二炔类抗肿瘤抗生素，其包括已被分离并表征的卡奇霉素γ1 I、卡奇霉素β1 Br、卡奇霉素γ1 Br、卡奇霉素α2 I、卡奇霉素α3 I、卡奇霉素β1 i和卡奇霉素δ1 i。前述卡奇霉素类似物中的每一种的结构在本领域中是公知的(例如，参见Lee等人，Journal of Antibiotics[抗生素杂志]，1989年7月，其全部内容通过引用并入本文)，并且与本文披露的卡奇霉素构建体和抗体药物缀合物是相容的。通常，卡奇霉素γ1含有两个不同的结构区域，每个在化合物的生物活性中起特殊作用。两者中较大的一个由扩展的糖残基组成，其包括四个单糖单元和一个六取代的苯环；这些是通过非常不寻常的一系列糖苷键、硫酯碱和羟胺键连接在一起的。第二个结构区域，糖苷配基(称为卡奇霉素酮)，包含一个紧凑的、高度功能化的双环核心，其在桥接的10元环内容纳应变的烯二炔类单元。该糖苷配基亚单元进一步包含烯丙基三硫化物，其如下所述用作产生细胞毒性形式的分子的活化剂。
通过实例，三硫化物卡奇霉素γ1 I的结构如下所示：
如本文所用，术语“卡奇霉素”应被认为意指卡奇霉素γ1 I、卡奇霉素β1 Br、卡奇霉素γ1 Br、卡奇霉素α2 I、卡奇霉素α3 I、卡奇霉素β1 i和卡奇霉素δ1连同N-乙酰基衍生物、硫化物类似物及其类似物中的任意一个。如本文所用，术语“卡奇霉素”将被理解为涵盖自然界中发现的卡奇霉素以及终止于具有与另一分子(例如抗体药物缀合物)的附接点的二硫化物的卡奇霉素部分及其类似物。通过实例，如本文所使用的，卡奇霉素γI应被理解为：
应当理解，任何前述化合物与本文的教导相容，并且可用于制备所披露的卡奇霉素构建体和抗体药物缀合物。在某些实施例中，所披露的抗体药物缀合物的卡奇霉素组分将包含N-乙酰基卡奇霉素γ1 I。
卡奇霉素靶向核酸并导致链断裂，从而杀死靶细胞。更具体地，已经发现卡奇霉素会结合DNA的小沟，然后它们进行类似于伯格曼环化的反应以产生双基物质。在这方面，芳基四糖亚基用于将药物递送至其靶标，其紧密结合双螺旋DNA的小沟槽，如Crothers等人所证实的(1999年)。当亲核试剂(例如谷胱甘肽)攻击三硫基团的中心硫原子时，它会导致结构几何形状的显著变化，并对10元的烯二炔环施加了大量的应变。该应变被经受环芳构化反应的烯二炔完全解除，从而产生高反应性的1，4-苯环型双基并最终通过从脱氧核糖DNA骨架上吸引氢原子导致DNA裂解，因此导致链断裂。要注意，在本发明的卡奇霉素二硫化物类似物构建体中，亲核试剂裂解受保护的二硫键以产生所需的双基(见图1)。
在2000年，包含N-乙酰基二甲基酰肼卡奇霉素的CD33抗原靶向免疫缀合物被开发了出来并作为针对急性骨髓性白血病(AML)的靶向疗法出售。由于疗效和毒性问题，该药物随后就被撤回。相比之下，本发明的抗体卡奇霉素缀合物显示出有利的治疗情况，这表明它们可以有效地用于治疗许多增生性疾病。
II抗体缀合物
在优选的实施例中，与本发明相容的靶向剂与新颖卡奇霉素构建体缀合以形成“抗体药物缀合物”(ADC)或“抗体缀合物”。术语“缀合物”被广泛使用，并且意指任何可裂解的卡奇霉素部分与和本发明兼容的靶向剂(例如，抗体)的共价或非共价缔合，其与精确的缔合方法无关。在某些优选的实施例中，缔合是通过靶向剂的半胱氨酸残基实现。在特别优选的实施例中，卡奇霉素可以通过可裂解的接头经由一个或多个位点特异性游离半胱氨酸与抗体缀合。所披露的ADC可用于治疗目的，其包括治疗癌症。
本发明的ADC可用于将细胞毒素或其他有效负荷递送至靶位置(例如，表达SEZ6的肿瘤发生细胞)。如本文所用，术语“药物”或“弹头”可以互换使用，并且将意味着上述任何卡奇霉素或卡奇霉素类似物。在优选的实施例中，所披露的ADC将在释放和激活弹头之前将包含卡奇霉素弹头的结合的有效负荷以相对不反应的无毒状态引导到靶位点。弹头的靶向释放优选通过有效负荷和ADC制剂的相对均匀的组合物的稳定缀合(例如通过抗体上的一个或多个半胱氨酸)来辅助，使经缀合的毒性物质最少化。与可裂解的药物接头相联接，所述接头被设计为一旦在已被递送到肿瘤部位时大量释放包含有效负荷的卡奇霉素，本发明的抗体药物缀合物可以显著减少不希望的非特异性毒性。这有利地在肿瘤部位提供相对高水平的活性卡奇霉素，同时使非靶向细胞和组织的暴露最小化，从而提供增强的治疗指数。
在任何情况下，包含卡奇霉素的所选有效负荷可以与该抗体共价或非共价连接，并且至少部分(取决于用于实现该缀合的方法)地展现不同的化学计量的摩尔比率。在优选的实施例中，本发明的缀合物可以由下式表示：
Ab-[W-(X1)a-CM-(X2)b-P-D]n
(式2)
或其药学上可接受的盐，其中
a)Ab包含靶向剂；
b)W包含连接基团；
c)CM包含可裂解部分；
d)P包含二硫键保护基
e)X1和X2包含任选的间隔子部分；并且
f)D包含卡奇霉素；
其中a和b独立地是0或1并且n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
出于本披露的目的，组分W-(X1)a-CM-(X2)b-P通常可以被称为“接头”或“接头单元”，并且将被理解为将卡奇霉素弹头链接或连接(例如，通过一系列共价键)到靶向剂中。合起来，卡奇霉素和接头包含与此处所述的靶向剂缀合的有效负荷。
在某些实施例中，接头可以包含支链接头。在其他优选的实施例中，靶向剂将包含抗体。在特别优选的实施例中，D将包含如紧跟在下面的式3中所示的N-乙酰基卡奇霉素：
其中符号*表示与接头的剩余部分及最终和靶向剂(Ab)共价结合的二硫键保护基。下面将更详细地讨论其他优选实施例和接头组分和接头构型。
对于式3，可以理解的是所示的化合物包含与二硫键保护基(由*表示)结合的二硫化物N-乙酰基卡奇霉素类似物，其与接头的剩余部分共价结合。如下文实例所示，二硫键保护基改善血流中二硫键的稳定性，并允许有效合成所披露的卡奇霉素-接头构建体。在到达靶标(例如，癌细胞)后，可裂解部分(CM)将被切断以释放通过二硫键保护基附接到接头部分(例如，X2-参见图2)的卡奇霉素。一旦接头最初在CM处被裂解，附接到卡奇霉素的接头的剩余部分将在生理条件下降解至二硫键切断(优选细胞内)的位置，随后活性双基卡奇霉素种重排并形成。正是所述卡奇霉素弹头的这种形式会与细胞DNA的小沟结合并诱导所需的细胞毒性作用(参见Walker等人，Biochemistry[生物化学]89：4608-4612，5/92，其全部内容通过引用并入本文)。图1提供了描述本发明的二肽卡奇霉素-接头构建体的注释化学结构，其中出于解释的目的对各个组分进行注释。
在任何情况下，根据前述式2的缀合物可以使用多种不同的可裂解接头进行制备，并且缀合方法将根据组分的选择而变化。因此，与卡奇霉素和所披露的靶向剂的反应性残基(例如，半胱氨酸)缔合的式2的任何可裂解的接头化合物与本文的教导兼容。类似地，允许所选择的卡奇霉素接头与抗体的缀合(包括位点特异性缀合)的任何反应条件都在本发明的范围内。尽管如前所述，本发明的特别优选的实施例包括使用稳定剂与如此处所述的温和还原剂组合，卡奇霉素-接头与游离半胱氨酸的选择性缀合。这种反应条件倾向于提供更均匀的制剂，其具有较少的非特异性缀合和污染物以及相应较少的毒性。
III决定簇
最初重要的是要注意到，本发明的卡奇霉素构建体和相应的抗体药物缀合物不限于任何特定的靶标或抗原。相反，由于任何靶向剂(包括任何现有的抗体或此处所述可能产生的任何抗体)可以与新颖卡奇霉素-接头构建体缀合，本发明赋予的优点是广泛适用的，并且可以与任何靶抗原(或决定簇)结合使用。更具体地，通过使用新颖卡奇霉素-接头构建体(例如，潜在位点特异性缀合、增强的缀合物稳定性和降低的非特异性毒性)赋予的有益特性广泛地适用于治疗性抗体，其与特定靶标无关。因而，虽然针对选择的决定簇的某些非限制性靶向剂已被用于解释和证明本发明的益处的目的，但是它们对其范围绝不是限制性的。
相应地，本领域技术人员将理解，本发明的抗体药物缀合物可以合并特异性识别或与任何选定的决定簇缔合的任何靶向剂(例如，抗体)。如在此所使用，“决定簇”意指与特定细胞、细胞群或组织可鉴定地缔合或在其中或其上特异性发现的任何可检测的性状、特性、标记物或因子。决定簇可以是形态性的、功能性的或生物化学性的，并且通常是表型的。在某些优选实施例中，该决定簇是针对其物理结构和/或化学组成进行了差异性修饰的蛋白质或由特定细胞类型或由细胞在某些条件下(例如在该细胞周期的特定时间点期间或在特定小生境中的细胞)差异性表达(上调或下调)的蛋白质。出于本发明的目的，决定簇优选包含细胞表面抗原或一种或多种由异常细胞差异表达的蛋白质，如通过化学修饰、呈递形式(例如剪接变体)、时程或量所证明的。在某些实施例中，决定簇可以包含SEZ6蛋白，或它们的任何变体、同工型或家族成员及其特定结构域、区域或表位。“免疫原性决定簇”或“抗原决定簇”或“免疫原”或“抗原”意指当引入免疫活性动物时可刺激免疫应答，并被免疫应答产生的抗体识别的多肽的任何片段、区域或结构域。此处涵盖的决定簇可以通过其存在(阳性决定簇)或不存在(阴性决定簇)鉴定细胞、细胞亚群或组织(例如肿瘤)。
在特别优选的实施例中，所披露的抗体药物缀合物将包含针对SEZ6的抗体。SEZ6(又称为癫痫相关的6同系物)是一种最初克隆自用惊厥剂戊四唑(pentylentetrazole)处理的小鼠大脑皮质衍生的细胞的I型跨膜蛋白(清水-西川(Shimizu-Nishikawa)，1995；PMID：7723619)。SEZ6具有两个同工型，一种是编码994个氨基酸蛋白质(NP_849191)的约4210个碱基(NM_178860)并且一种是编码993个氨基酸蛋白质(NP_001092105)的约4194个碱基(NM_001098635)。这些的差异仅在其ECD中的最后10个氨基酸残基中。SEZ6具有另外两个家庭成员：SEZ6L和SEZ6L2。术语“SEZ6家族”是指SEZ6、SEZ6L、SEZ6L2及其各种同工型。成熟的SEZ6蛋白由一系列结构性结构域组成：胞质结构域、跨膜结构域和胞外结构域，该胞外结构域包含独特的N末端结构域，随后是两个交替的Sushi和CUB样结构域，以及三个另外的串联Sushi结构域重复序列。已经将人类SEZ6基因中的突变与热性癫痫相关联，热性癫痫是与体温升高和儿童中最常见类型的癫痫有关的一种惊厥(于(Yu)等，2007，PMID：17086543)。由同源性和序列分析所鉴别的SEZ6蛋白质的结构模块回顾表明在信号传导、细胞间通讯以及神经发育中的可能作用。从用SEZ6抗原免疫的小鼠中分离的抗原中产生了与本发明相容的抗SEZ6人源化抗体，如WO 2015/031541中所述，其全部内容并入本文。
IV靶向剂
A.试剂结构
如以上暗指的，本发明的特别优选的实施例包含所披露的与优选处于抗体或其免疫反应性片段形式的靶向剂的缀合物，该靶向剂优先与所选决定簇上的一个或多个表位缔合。包括接受的命名法和编号系统的抗体及其变体及其衍生物已经广泛描述于例如Abbas等人(2010)，Cellular and Molecular Immunology(6th Ed.)，W.B.Saunders Company[细胞和分子免疫学(第6版)，W.B.桑德公司]；或Murphey等人(2011)，Janeway′sImmunobiology(8th Ed.)，Garland Science[简氏免疫生物学(第8版)，加兰德科学]。
如本文所用，“抗体”或“完整抗体”典型是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两个重(H)多肽链和两个轻(L)多肽链的Y型四聚蛋白。每个轻链由一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)组成。每个重链包含一个可变结构域(VH)和恒定区，在IgG、IgA和IgD抗体的情形中，其包含三个称为CH1、CH2和CH3的结构域(IgM和IgE具有第四结构域CH4)。在IgG、IgA和IgD类别中，CH1和CH2结构域被柔性铰链区域分离，该铰链区域是具有可变长度(在不同IgG亚类中从约10至约60个氨基酸)的富含脯氨酸和半胱氨酸的区段。轻链和重链中的可变区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接到恒定结构域，并且重链也具有约10个另外的氨基酸的“D”区。每类抗体进一步包含由配对半胱氨酸残基形成的链间和链内二硫键。
如在此使用的，术语“抗体”包括多克隆抗体(polyclonal antibody)、多株抗体(multiclonal antibody)、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体及灵长类化抗体、CDR接枝抗体、人类抗体、重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗独特型抗体、合成抗体(包括突变蛋白及其变体)；免疫特异性抗体片段，如Fd、Fab、F(ab′)2、F(ab′)片段、单链片段(例如ScFv和ScFvFc)；及其衍生物，包括Fc稠合物和其他修饰，及任何其他免疫活性分子，只要它展现与决定簇的优先缔合或结合即可。另外，除非上下文约束另外规定，否则该术语另外包含抗体的所有类别(即，IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及所有亚类(即，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。对应于不同类别的抗体的重链恒定结构域对应地由相应的小写希腊字母α、δ、ε、γ及μ典型地表示。相似地，来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以被分配到两种明显相异的类型之一，称为κ和λ。两条轻链与本文的教导相容，并且可用于制备所披露的抗体药物缀合物。
抗体的可变结构域显示出从一种抗体到另一种抗体的氨基酸组成的显著变化，并且主要负责抗原识别和结合。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的IgG抗体具有两个结合位点(即它是二价的)。VH和VL结构域包含具有极端变异性的三个区域，其被称为高变区，或更通常地，称为由称为框架区(FR)的四个较少可变区框架化和分离的互补决定区(CDR)。VH和VL区域之间的非共价缔合形成Fv片段(对于“片段变量”)，其含有抗体的两个抗原结合位点之一。可以通过基因工程获得的ScFv片段(对于单链片段变量)在单个多肽链中缔合由肽接头分离的抗体VH和VL区域。
如在此所使用，氨基酸与每个结构域、框架区和CDR的分配可以根据由卡巴特等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th Ed.)，US Dept.ofHealth and Human Services，PHS，NIH，NIH Publication no.91-3242[具有免疫学兴趣的蛋白的序列(第5版)，美国健康与人类服务部，PHS，NIH，NIH公开号91-3242]；乔西亚等人，1987，PMID：3681981；乔西亚等人，1989，PMID：2687698；麦卡勒姆等人，1996，PMID：8876650；或Dubel编(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies，3rd Ed.，Wily-VCHVerlag GmbH and Co or AbM(Oxford Molecular/MSI Pharmacopia)[治疗性抗体手册，第3版，德国威利出版公司或AbM(牛津大学分子/MSI药典)]提供的编号方案之一，除非另有注解。以下示出了包含由卡巴特、乔西亚(Chothia)、麦卡勒姆(MacCallum)(也称为Contact)定义的CDR的氨基酸残基和从阿拜斯(Abysis)网站数据库(下文)获得的AbM。
表1
抗体序列中的可变区和CDR可以根据本领域已经开发的一般规则(如以上所示出的，例如卡巴特编号系统)或通过将序列与已知可变区的数据库比对来鉴定。用于鉴定这些区域的方法描述于Kontermann和Dubel编，Antibody Engineering，Springer，New York，NY，2001[抗体工程，施普林格，纽约州纽约，2001]和Dinarello等人，Current Protocolsin Immunology，John Wiley and Sons Inc.，Hoboken，NJ，2000[当前免疫学方案，约翰·威利父子出版公司，新泽西州霍博肯市，2000]中。抗体序列的示例性数据库描述于“阿拜斯”网站(www.bioinf.org.uk/abs)(由A.C.Martin在英国伦敦的伦敦大学生物化学和分子生物学学院维护)和VBASE2网站(www.vbase2.org)中，并可通过其进行访问，如Retter等人，Nucl Acids Res，33(Database issue)：D671-D674(2005)[核酸研究，33(数据库发行号)：D671-D674(2005)]所述的。优选地，使用阿拜斯数据库(Abysis database)分析这些序列，其将来自卡巴特、IMGT和蛋白质数据库(Protein Data Bank，PDB)的序列数据与来自PDB的结构数据进行整合。参见Andrew C.R.Martin博士的书，章节Protein Sequence andStructure Analysis of Antibody Variable Domains[抗体可变区的蛋白质序列和结构分析].于Antibody Engineering Lab Manual[抗体工程实验室手册](Ed.：Duebel，S.andKontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg，ISBN-13：978-3540413547[编辑：Duebel，S.和Kontermann，R.，斯普林格出版社，海德堡]，ISBN-13：978-3540413547]，也可在网站bioinforg.uk/abs上获得)。阿拜斯数据库网站还包括已经开发用于鉴定可以根据此处的传授内容使用的CDR的一般规则。除非另有说明，此处陈述的任何CDR均根据卡巴特等人的阿拜斯数据库网站获得。
对于本发明中论述的重链恒定区氨基酸位置，编号是根据Edelman等人，1969，Proc，Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]63(1)：78-85中首先描述的EU索引，描述了骨髓瘤蛋白质Eu的氨基酸序列，据报道它是第一个测序的人类IgG1。Edelman的EU索引也在卡巴特等人，1991(同上)中陈述。因此，术语“如卡巴特中陈述的EU索引”或“卡巴特的EU索引”或“EU索引”在重链背景下是指基于如卡巴特等人，1991(同上)所陈述的Edelman等人的人类IgG1Eu抗体的残基编号系统。用于轻链恒定区氨基酸序列的编号系统类似地在卡巴特等人，(同上)中陈述。紧跟在下面阐述的是与本发明兼容的示例性κ轻链恒定区氨基酸序列(C214位置(其可能包含如下所述的游离半胱氨酸)加了下划线)。
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：1)。
类似地，紧跟在下面阐述的是与本发明兼容的示例性IgG1重链恒定区氨基酸序列(C220位置(其可能包含如下所述的游离半胱氨酸)加了下划线)。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：2)。
所披露的恒定区序列或其变体或衍生物可以使用标准分子生物学技术与所披露的重链和轻链可变区可操作地关联，以提供可并入本发明的ADC的全长抗体。
本领域的技术人员将理解的是，免疫球蛋白分子中有两种类型的二硫桥键或二硫键：链间和链内二硫键。众所周知，链内二硫键的位置和数量根据免疫球蛋白类别和种类而变化。虽然本发明不限于抗体的任何特定类别或亚类，但是为了说明的目的，本披露一般性地将使用IgG1免疫球蛋白。在野生型IgG1分子中存在十二个链内二硫键(每个重链上四个，每个轻链上两个)和四个链间二硫键。通常，链内二硫键是受到一定保护的，并且相对于链间键更不容易被还原。相反，链间二硫键位于免疫球蛋白的表面，可溶于溶剂，并且通常相对容易被还原。重链之间存在两个链间二硫键，从每个重链至其各自的轻链各有一个。已经证明了，链间二硫键不是对重链和轻链的缔合而言必不可少的。IgG1铰链区包含形成链间二硫键的重链中的半胱氨酸，其提供结构支持以及促进Fab移动的柔性。重/重IgG1链间二硫键位于残基C226和C229(Eu编号)，而IgG1(重/轻)的轻链和重链之间的IgG1链间二硫键在κ或λ轻链的C214和重链的上部铰链区的C220之间形成。
B.抗体生成和生产
本发明的抗体可以使用本领域已知的多种方法生产。
1.在宿主动物中产生多克隆抗体
在各种宿主动物中产生多克隆抗体是本领域公知的(参见例如Harlow和Lane(编辑)(1988)Antibodies：A Laboratory Manual[抗体：实验室手册]，CSH出版社；和Harlow等人(1989)Antibodies[抗体]，纽约，Cold Spring Harbor Press[冷泉港实验室出版社])。为了产生多克隆抗体，免疫活性动物(例如小鼠、大鼠、兔、山羊、非人灵长类动物等)用抗原蛋白或包含抗原蛋白的细胞或制剂进行免疫。一段时间后，含有多克隆抗体的血清是通过对该动物进行抽血或将其处死来获得的。该血清可以呈从该动物获得的形式，或这些抗体可以部分地或完全地纯化以提供免疫球蛋白部分或分离的抗体制剂。
可以使用任何形式的抗原、或含有抗原的细胞或制剂来产生对决定簇具有特异性的抗体。术语“抗原”广义地使用，并且可以包括所选择的靶标的任何免疫原性片段或决定簇，其包括单个表位、多个表位、单个或多个结构域或整个细胞外结构域(ECD)。抗原可以是分离的全长蛋白质、细胞表面蛋白质(例如，用在表面上表达至少一部分抗原的细胞来免疫)或可溶性蛋白质(例如，仅用蛋白质的ECD部分来免疫)。抗原可以在遗传修饰的细胞中产生。任何前述抗原可以单独使用或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强佐剂组合使用。编码抗原的DNA可以是基因组或非基因组(例如cDNA)，并且可以编码至少一部分ECD，其足以引发免疫原性应答。可以使用任何载体来转化其中表达抗原的细胞，这包括但不限于腺病毒载体、慢病毒载体、质粒、和非病毒载体，例如阳离子脂质。
2.单克隆抗体
在选择的实施例中，本发明还涵盖单克隆抗体的使用。“单克隆抗体”或“mAb”是指获得自基本上均质的抗体群体的抗体，即构成该群体的单个抗体是相同的，除了可能的突变(例如天然存在的突变)可能以较小的量存在外。
单克隆抗体可以使用多种技术制备，包括杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物(例如，)或其中某一组合。例如，在优选的实施例中，可以使用杂交瘤以及生物化学和遗传工程技术来产生单克隆抗体，如以下各项中更详细地描述：An，Zhigiang(编)Therapeutic Monoclonal Antibodies：From Bench to Clinic，John Wileyand Sons，1st ed.[治疗性单克隆抗体：从工作台到诊所，约翰威立公司，第1版]2009；Shire等人(编)Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing，Springer Science+Business Media LLC，1st ed.[当前单克隆抗体开发和制造的趋势，施普林格科学+商业媒体公司，第1版]2010；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.[抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社，第2版]1988；Hammerling等人：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)[单克隆抗体及T细胞杂交瘤563-681(纽约爱思唯尔，1981)]。在产生与决定簇特异性结合的许多单克隆抗体之后，可以通过各种筛选方法，基于例如对决定簇的亲和力或内化率来选择特别合适的抗体。在特别优选的实施例中，如此处所述产生的单克隆抗体可用作“源”抗体，并进一步修饰以例如改善对靶标的亲和力，改善其在细胞培养中的产生，降低体内免疫原性，产生多特异性构建体等。
3.人类抗体
这些抗体可以包含完全人类抗体。术语“人类抗体”是指这样一种抗体(优选单克隆抗体)，它具有对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列和/或已经使用如下所描述的任何用于制备人类抗体的技术来产生。
在一个实施例中，可以通过使用噬菌体展示对制备的重组组合抗体文库进行筛选来分离重组人类抗体。在一个实施例中，该文库是使用由从B细胞分离的mRNA制备的人类VL和VH cDNA产生的一种scFv噬菌体或酵母展示文库。
还可以通过将人类免疫球蛋白基因座引入转基因动物中来制备人类抗体，这些转基因动物例如为已经使内源免疫球蛋白基因部分地或完全地失活并且引入了人类免疫球蛋白基因的小鼠。在激发之后，观察到抗体的产生，这在所有方面都紧密地类似于在人类中所见，包括基因重排、组装及全人类抗体谱系。这一方法描述于例如U.S.P.N.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；及关于技术的U.S.P.N.6,075,181和6,150,584；以及Lonberg和Huszar，1995，PMID：7494109中。作为替代方案，可以经由产生针对靶抗原的抗体的人类B淋巴细胞(这些B淋巴细胞可以从罹患赘生性病症的个体回收或可以已经在体外进行免疫接种)进行永生化来制备人类抗体。参见，例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy[单克隆抗体和癌症疗法]，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等人，1991，PMID：2051030；及U.S.P.N.5,750,373。与其他单克隆抗体一样，可以使用人类抗体作为源抗体。
4.衍生的抗体：
一旦如上所述产生、选择并分离源抗体，它们可进一步改变，以提供具有改进的药物特征的与本发明相容的抗体。优选地，使用已知的分子工程技术修饰或改变源抗体以提供具有所需治疗性质的衍生抗体。
4.1嵌合和人源化的抗体
本发明的选择的实施例包括免疫特异性结合至选择的决定簇(例如SEZ6)的鼠单克隆抗体，并且为了本披露的目的，可以将其视为“源”抗体。在选择的实施例中，可以通过任选修饰源抗体的恒定区和/或抗原结合氨基酸序列从此类的源抗体中衍生与本发明相容的抗体。在某些实施例中，如果源抗体中所选择的氨基酸通过缺失、突变、取代、整合或组合改变，则抗体是从源抗体“衍生的”。在另一个实施例中，“衍生”抗体是其中源抗体(例如，一个或多个CDR或整个重链和轻链变区)的片段与受体抗体序列组合或并入其中以提供衍生抗体(例如嵌合、或人源化抗体)。这些衍生的抗体可以使用如下所述的标准分子生物学技术产生，例如像提高对决定簇的亲和力，提高抗体稳定性，提高细胞培养的生产和产量，降低体内的免疫原性，减少毒性，促进活性部分的缀合，或产生多特异性抗体。此类抗体也可以通过化学手段或翻译后修饰来修饰成熟分子(例如糖基化模式或聚乙二醇化)而衍生自源抗体。
在一个实施例中，本发明的嵌合抗体包含衍生自已经共价连接的至少两种不同种类或类别的抗体的蛋白质片段的嵌合抗体。术语“嵌合”抗体是针对这样的构建体，其中重和/或轻链的一部分与来自特定物种的或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源，而这个或这些链的剩余部分与来自另一物种的或属于另一个抗体类别或亚类的抗体、以及这类抗体的片段中的相应序列一致或同源(U.S.P.N.4,816,567；Morrison等人，1984，PMID：6436822)。在一些优选的实施例中，本发明的嵌合抗体可以包含可操作地连接到人轻链和重链恒定区的所有或大部分选择的鼠重链和轻链可变区。在其他特别优选的实施例中，与本发明相容的抗体可以从本文披露的小鼠抗体中“衍生”。
在其他实施例中，本发明的嵌合抗体是“CDR接枝”抗体，其中CDR(使用卡巴特、乔西亚、McCallum等定义)源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类，而抗体的剩余部分源自另一物种的抗体或属于另一抗体类别或亚类。对于在人类中使用，一种或多种所选啮齿动物CDR(例如鼠CDR)可以接枝到人类受体抗体中，替代该人类抗体的一个或多个天然存在的CDR。这些构建体一般具有以下益处：提供全强度人类抗体功能(例如，补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))，同时减少了受试者对该抗体的不想要的免疫应答。在特别优选的实施例中，CDR接枝抗体将包含从并入人框架序列的小鼠中获得的一个或多个CDR。
与该CDR接枝抗体类似的是“人源化”抗体。如本文所用，“人源化”抗体是包含一种或多种衍生自一种或多种非人类抗体(供体或源抗体)的氨基酸序列(例如CDR序列)的人类抗体(受体抗体)。在某些实施例中，可以将“回复突变”引入人源化抗体，其中受体人类抗体可变区的一个或多个FR中的残基被来自非人物种供体抗体的相应残基替代。此类回复突变可能有助于维持接枝CDR的适当的三维构型，从而提高亲和力和抗体的稳定性。可以使用来自各种供体物种的抗体，其包括但不限于小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。另外，人源化抗体可以包含在接受者抗体中或在供体抗体中未发现的新残基，从而，例如，进一步改善抗体性能。与本发明相容并且包含下文实例中所述的源鼠抗体的CDR接枝和人源化抗体因此可以容易地使用此处所述的现有技术不经过多的实验来提供。
可以进一步使用各种本领域公认的技术来确定用作受体抗体的人序列以提供根据本发明的人源化构建体。相容的人种系序列的编译和确定其作为受体序列的适合性的方法披露于例如Tomlinson，I.A.等人(1992)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]227：776-798；Cook，G.P.等人(1995)Immunol.Today[今日免疫学]16：237-242；乔西亚，D.等人(1992)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]227：799-817；和Tomlinson等人(1995)EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]14：4628-4638，其各项的全部内容并入本文。V-BASE名录(VBASE2-瑞特(Retter)等人，Nucleic Acid Res.[核酸研究]33；671-674，2005)(其提供了人类免疫球蛋白可变区序列的一个全面名录(由Tomlinson，I.A.等人汇编，MRC Centre for ProteinEngineering，Cambridge，UK[MRC蛋白质工程中心，英国剑桥]))也可以用于鉴定相容的受体序列。另外，例如在U.S.P.N.6,300,064中描述的共有人框架序列也可以被证明是兼容的受体序列并且可以按照本教导使用。通常，基于与鼠源框架序列的同源性以及源抗体和受体抗体的CDR典型结构的分析来选择人框架受体序列。然后可以使用本领域公认的技术合成衍生抗体的重链和轻链可变区的衍生序列。
作为示例，CDR接枝和人源化抗体以及相关方法可见描述于U.S.P.N.6,180,370和5,693,762。有关进一步细节，参见例如，Jones等人，1986，PMID：3713831)；及U.S.P.N.6,982,321和7,087,409。
CDR接枝或人源化抗体可变区与人受体可变区的序列同一性或同源性可以如本文所讨论的那样来测定，并且如果这样测定，则其优选地具有至少60％或65％的序列同一性，更优选至少70％、75％、80％、85％、或90％的序列同一性，甚至更优选至少93％、95％、98％或99％的序列同一性。优选地，不一致的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是一个氨基酸残基被具有化学特性(例如，电荷或疏水性)类似的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。总体来说，保守氨基酸取代不会实质上改变一种蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情形中，序列一致性百分比或相似性程度可以向上调整以校正该取代的保守性质。
4.2位点特异性抗体
本发明的抗体可以被工程化以促进与卡奇霉素-接头构建体的缀合。根据细胞毒素在抗体上的位置和药物抗体比(DAR)，抗体药物缀合物制剂包含ADC分子的均匀群体是有利的。如在此所描述，基于本披露，本领域技术人员可以容易地制备位点特异性工程化构建体并且将它们选择性地缀合到所述卡奇霉素-接头构建体。如在本申请中所使用的，“位点特异性抗体”或“位点特异性构建体”意指如下抗体或其免疫反应性片段，其中重链或轻链中的至少一个氨基酸被缺失、改变或取代(优选被另一种氨基酸取代)以提供至少一个游离半胱氨酸。类似地，“位点特异性缀合物”应保持意指包含位点特异性抗体和至少一种与一个或多个未配对半胱氨酸缀合的卡奇霉素化合物的ADC。在某些实施例中，未配对半胱氨酸残基将包含未配对的链内残基。在其他优选实施例中，游离半胱氨酸残基将包含未配对的链间半胱氨酸残基。在仍然其他优选的实施例中，并且如将在以下更详细论述的，未配对或游离半胱氨酸可以被工程化到存在于所选抗体或其免疫反应性片段中的任何残基位点中(即，这些位点不需要破坏天然存在的天然二硫键)。所述工程化抗体可以是不同同种型，例如IgG、IgE、IgA或IgD；并且在那些类别内，抗体可以是不同亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。对于IgG构建体，抗体的轻链可以包含κ或λ同种型，其各自并入C214，在优选的实施例中，可能由于IgG1重链中缺少C220残基而未配对。
无论是在预先选择的位点引入游离半胱氨酸还是破坏天然二硫键，在此所述抗体的工程化提供了允许药物抗体比例(“DAR”)在很大程度上被精确固定从而产生DAR基本均匀的制剂的卡奇霉素调节化学计量缀合。此外，所披露的位点特异性构建体进一步提供了就有效负荷在抗体上的位置来说基本均匀的制剂。使用如在此所述的稳定剂的工程化构建体的选择性缀合增加了希望的DAR种类百分比，并且与制造的未配对或游离半胱氨酸位点一起赋予了缀合稳定性和均匀性，这降低由卡奇霉素的偶然浸出引起的非特异性毒性。通过游离半胱氨酸的选择性缀合和制剂的相对均匀性(缀合位置和DAR两者)提供的这种毒性降低也提供增强的治疗指数，其允许在肿瘤部位增加卡奇霉素有效负荷水平。另外，可以任选地使用各种色谱方法纯化得到的位点特异性缀合物，以提供高度均匀的位点特异性缀合物制剂，其包含大于75％、80％、85％、90％或甚至95％的所希望的DAR种类(例如DAR＝2)。通过限制可能增加毒性的不想要的较高DAR缀合物杂质(其可能相对不稳定)，这种缀合物均匀性可进一步增加所披露制剂的治疗指数。
应当理解，所披露的工程化缀合物制剂展现的有利特性至少部分地基于特异性引导缀合的能力，并且在卡奇霉素位置和绝对DAR方面上大大限制所制造的缀合物。与大多数常规ADC制剂不同，本发明的优选实施例不完全依赖于抗体的部分或全部还原以提供随机缀合位点和相对不受控制的DAR种类的产生。相反，本发明的选择的实施例通过工程化靶向抗体来破坏一个或多个天然存在的(即，“天然”)链间或链内二硫桥键或者在任何位置引入半胱氨酸残基来提供一个或多个预定的未配对(或游离)半胱氨酸位点。在后一种情况下，应当理解，在所选实施例中，可以使用标准分子工程技术将半胱氨酸残基沿着抗体(或其免疫反应性片段)重链或轻链的任何位置并入或附加到其上。在又其他优选实施例中，天然二硫键的破坏可以与引入非天然半胱氨酸组合实现，以便提供多个游离半胱氨酸，然后可以将其用作缀合位点。
关于引入或添加一个或多个半胱氨酸残基以提供游离半胱氨酸(与破坏天然二硫键相反)，本领域技术人员可以容易地辨别抗体或抗体片段上的一个或多个相容位置。相应地，在选择的实施例中，根据所需的DAR、抗体构建体、所选的卡奇霉素-接头和抗体靶标，可将一个或多个半胱氨酸引入CH1结构域、CH2结构域或CH3结构域或其任何组合。在其他优选的实施例中，半胱氨酸可以被引入到κ或λCL结构域中，并且在特别优选的实施例中可以引入CL结构域的c末端区域。在每个情形中，邻近半胱氨酸插入位点的其他氨基酸残基可以被改变、去除或取代，以促进分子稳定性、缀合效率或为卡奇霉素有效负荷(一旦附接)提供保护环境。在具体实施例中，取代的残基出现在抗体的任何可接近位点处。通过用半胱氨酸取代这些表面残基，从而反应性硫醇基团被定位在抗体上容易接近的位置，并且可以如在此进一步描述的那样被选择性地还原。
如在此所使用的，术语“游离半胱氨酸”或“未配对半胱氨酸”可以互换使用，除非上下文另有规定，并且应意指抗体的任何半胱氨酸成分，无论是天然存在还是使用分子工程技术特异性地并入所选残基位置的，不与另一半胱氨酸在同一抗体上形成天然二硫桥键。因此，在某些优选实施例中，游离半胱氨酸可以包含天然存在的半胱氨酸，其天然链间或链内二硫桥键配偶体已经被取代、消除或以其他方式改变以在生理条件下破坏天然存在的二硫桥键，从而使未配对半胱氨酸适合于位点特异性缀合。在其他优选实施例中，游离或未配对半胱氨酸将包含半胱氨酸残基，其选择性地位于抗体重链或轻链氨基酸序列内的预定位点。可以理解，在缀合之前，游离或未配对半胱氨酸可以作为硫醇(经还原的半胱氨酸)、作为封端半胱氨酸(经氧化的)或作为非天然分子内二硫键(经氧化的)存在，与存在于相同抗体上的另一个游离半胱氨酸一起，这取决于该系统的氧化态。如以下更详细论述的，该抗体构建体的温和还原将提供可用于位点特异性缀合的硫醇。在特别优选的实施例中，游离或未配对半胱氨酸(无论是天然存在的或并入的)将经受选择性还原和随后的卡奇霉素缀合以提供所披露的均匀DAR组合物。
在一些实施例中，链间半胱氨酸残基缺失。在其他实施例中，链间半胱氨酸取代另一个氨基酸(例如，天然存在的氨基酸)。例如，氨基酸取代可导致链间半胱氨酸被中性(例如丝氨酸、苏氨酸或甘氨酸)或亲水性(例如甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)残基替换。在一个特别优选的实施例中，链间半胱氨酸被丝氨酸替换。
在本发明涵盖的一些实施例中，半胱氨酸残基的缺失或取代在轻链(κ或λ)上，从而在重链上留下游离半胱氨酸。在其他实施例中，半胱氨酸残基的缺失或取代在重链上，在轻链恒定区上留下游离半胱氨酸。组装后，应当理解，完整抗体的轻链或重链中的单个半胱氨酸的缺失或取代产生了具有两个未配对半胱氨酸残基的位点特异性抗体。
在一个特别优选的实施例中，IgG轻链(κ或λ)的第214位的半胱氨酸(C214)缺失或被取代。在另一个优选的实施例中，IgG重链上的位置220处的半胱氨酸(C220)缺失或被取代。在另外的实施例中，重链上位置226或位置229处的半胱氨酸缺失或被取代。在一个实施例中，重链上的C220被丝氨酸取代(C220S)，以在轻链中提供所希望的游离半胱氨酸。这样的工程化构建体用于下面的实例中以提供与本文教导相容的新颖抗体药物缀合物。在另一个实施例中，轻链中的C214被丝氨酸取代(C214S)，以在重链中提供所希望的游离半胱氨酸。这些优选构建体的总结展示在紧跟在下面的表2中，其中所有编号均按照如卡巴特中陈述的EU索引，并且WT代表“野生型”或无改变的天然恒定区序列，并且δ(Δ)指示氨基酸残基的缺失(例如，C214Δ指示位置214的半胱氨酸已缺失)。
表2
关于引入或添加一个或多个半胱氨酸残基以提供游离半胱氨酸(与破坏天然二硫键相反)，本领域技术人员可以容易地辨别抗体或抗体片段上的一个或多个相容位置。相应地，在选择的实施例中，可以根据期望的DAR、抗体构建体、所选择的有效负荷和抗体靶标将半胱氨酸引入CH1结构域、CH2结构域或CH3结构域或其任何组合中。在其他优选的实施例中，半胱氨酸可以被引入到κ或λCL结构域中，并且在特别优选的实施例中可以引入CL结构域的c末端区域。在每个情形中，邻近半胱氨酸插入位点的其他氨基酸残基可以被改变、去除或取代，以促进分子稳定性、缀合效率或为有效负荷(一旦附接)提供保护环境。在具体实施例中，取代的残基出现在抗体的任何可接近位点处。通过用半胱氨酸取代这些表面残基，从而反应性硫醇基团被定位在抗体上容易接近的位置，并且可以如在此进一步描述的那样被选择性地还原。在具体实施例中，取代的残基出现在抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位在抗体的可接近位点，并且可以用于选择性地缀合抗体。在某些实施例中，任何一个或多个以下残基可以被半胱氨酸取代：轻链的V205(卡巴特编号)；重链的A118(Eu编号)；和重链Fc区的S400(Eu编号)。额外的取代位置和制备相容的位点特异性抗体的方法陈述于U.S.P.N.7,521,541，其全部内容结合在此。
一旦提供了位点特异性构建体，则可以使用此处披露的新技术选择性地还原所得游离半胱氨酸，而基本上不破坏完整的天然二硫桥键，以便主要在所选择的半胱氨酸位点上提供反应性硫醇。然后这些制备的硫醇经受与所披露的卡奇霉素-接头构建体的定向缀合，而没有实质上非特异的缀合。也就是说，此处披露的工程化构建体和任选地选择性还原技术可用于很大程度上消除卡奇霉素有效负荷的非特异性随机缀合。值得注意的是，这提供了在靶向抗体上的DAR种类分布和卡奇霉素位置两者基本均匀的制剂。如以下所论述的，消除DAR相对较高的污染物本身可以降低非特异性毒性并扩大制剂的治疗指数。此外，这种选择性允许卡奇霉素有效负荷大部分位于特别有利的预定位置(例如轻链恒定区的末端区域)，其中卡奇霉素-接头构建体某种程度上被保护直到其到达肿瘤，而递送后就被适当地呈递并被处理。因此，用以促进特定卡奇霉素有效负荷定位的工程化抗体的设计也可用于降低所披露制剂的非特异性毒性。最后，选择性地和可重复地引导抗体缀合的能力大大简化了所得组合物的表征，从而促进药物开发。
应当理解，这些预定的游离半胱氨酸位点的产生可以使用本领域公认的分子工程技术实现，在抗体的预选位点引入半胱氨酸或者去除、改变或替换二硫键的构成半胱氨酸残基中的一个。使用这些技术，本领域技术人员将理解，可以将任何抗体类别或同种型工程化以展现能够根据本发明选择性缀合的一个或多个游离半胱氨酸。此外，所选择的抗体可以根据希望的DAR进行工程改造以特异性展现1、2、3、4、5、6、7、或甚至8个游离半胱氨酸。更优选地，所选择的抗体将被工程化以含有2或4个游离半胱氨酸，并且甚至更优选含有2个游离半胱氨酸。还将理解，游离半胱氨酸可定位于工程化抗体中，以便于将缀合的卡奇霉素递送至靶标，同时降低非特异性毒性。在这方面，包含IgG1抗体的本发明的所选实施例将卡奇霉素有效负荷定位于CH1结构域上，并且更优选地定位在结构域的C末端。在其他优选实施例中，抗体构建体将被工程化以将卡奇霉素定位在轻链恒定区上，更优选在恒定区的C末端。
值得注意的是，通过使用以下所陈述的新颖稳定剂和卡奇霉素-接头构建体来选择性地还原构建体也可以促进有效负荷与工程化游离半胱氨酸的缀合的限制。如在此所使用的“选择性还原”将意指将工程化构建物暴露于还原游离半胱氨酸(从而提供反应性硫醇)而不实质上破坏完整天然二硫键的还原条件。总体而言，可以使用提供所希望的硫醇而不破坏完整的二硫键的任何还原剂或其组合来实现选择性还原。在某些优选实施例中，并且如以下实例中所陈述，可以使用稳定剂和温和还原条件进行选择性还原，以制备用于缀合的工程化构建体。如在此更详细论述的，相容的稳定剂通常有利于游离半胱氨酸的还原，并允许希望的缀合在较不严格的还原条件下进行。这允许绝大多数天然二硫键保持完整，并显著减少非特异性缀合的量，从而限制不希望的污染物和潜在的毒性。相对温和的还原条件可以通过使用多种系统来实现，但优选地包含使用含硫醇化合物。应当理解，鉴于本披露，本领域技术人员可以容易地获得相容还原系统。
4.3恒定区修饰和改变的糖基化
本发明的选择的实施例还可以包括恒定区(即Fc区)的取代或修饰，包括但不限于氨基酸残基取代、突变和/或修饰，其产生了具有优选特性的化合物，这些特性包括但不限于：药物代谢动力学的改变、血清半衰期的增加、结合亲和力的提高、免疫原性的降低、产量增加、改变的与Fc受体(FcR)的Fc配体结合、增强的或减弱的ADCC或CDC、改变的糖基化或修饰的恒定区结合特异性。
举例来说，可以通过涉及Fc结构域与Fc受体(例如，FcγRI、FcγRIIA和B、FcγRIII及FcRn)之间的相互作用的氨基酸残基的变化(可以导致细胞毒性增加和/或药物代谢动力学改变，如血清半衰期增加(参见例如，Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol[疫学年鉴]9：457-92(1991)；Capel等人Immunomethods[免疫方法]4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.[实验与临床医学杂志]126：330-41(1995))来产生具有改善的Fc效应子功能的化合物。
在所选实施例中，具有增加的体内半衰期的抗体可以通过对鉴别为涉及Fc结构域与FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基进行修饰(例如，取代、缺失或添加)来产生(参见例如，国际公开号WO 97/34631；WO 04/029207；U.S.P.N.6,737,056和U.S.P.N.2003/0190311)。就这些实施例来说，Fc变体可以在哺乳动物，优选人类中提供超过5天、超过10天、超过15天、优选超过20天、超过25天、超过30天、超过35天、超过40天、超过45天、超过2个月、超过3个月、超过4个月或超过5个月的半衰期。半衰期的增加引起更高的血清滴度，由此使抗体药物缀合物给与的频率降低或使有待给与的抗体的浓度降低。可以例如在表达人类FcRn的转基因小鼠或转染的人类细胞系中，或在给与了具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中，对人类FcRn高亲和力结合多肽在体内与人类FcRn的结合及血清半衰期进行检验。WO2000/42072描述了与FcRn的结合改善或减少的抗体变体。也参见例如，谢尔德(Shields)等，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)9(2)：6591-6604(2001)。
在其他实施例中，Fc变化可以引起ADCC或CDC活性的增强或减弱。如本领域中所知，CDC是指在补体存在下靶细胞的溶解，并且ADCC是指一种细胞毒性形式，其中结合到存在于某些细胞毒性细胞(例如，自然杀手细胞、中性粒细胞及巨噬细胞)上的FcR的分泌型Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合到带有抗原的靶细胞并且随后用细胞毒素杀死靶细胞。在本发明的上下文中，提供了具有“变化的”FcR结合亲和力的抗体变体，如与亲本或未修饰抗体或与包含天然序列FcR的抗体相比较，它具有增强或减少的结合。呈现出减少的结合的这些变体可以具有极少或没有可感知的结合，例如与天然序列相比较，0％-20％结合到FcR，例如，如通过本领域中众所周知的技术所测定。在其他实施例中，如与天然免疫球蛋白Fc结构域相比较，该变体将展现增强的结合。应理解的是，这些类型的Fc变体可以有利地用于增强所披露的抗体的有效抗赘生特性。在又其他实施例中，这些变化引起结合亲和力的增加、免疫原性的降低、产量增加、糖基化和/或二硫键(例如，对于缀合位点)变化、结合特异性改良、胞噬作用增加，和/或细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)下调等。
又其他实施例包含一种或多种工程改造的糖型，例如，位点特异性抗体，其包含改变的糖基化模式或共价附接到该蛋白质(例如，在Fc结构域中)的改变的碳水化合物组成。参见例如，谢尔德R.L.等(2002)，生物化学杂志277：26733-26740。工程改造的糖型可以用于多种目的，包括但不限于，增强或减弱效应子功能、增加抗体对靶的亲和力或促进抗体的产生。在希望降低效应子功能的某些实施例中，该分子可以工程改造成表达一种去糖基化的形式。可以引起一个或多个可变区构架糖基化位点的消除以借此消除该位点处的糖基化的取代是众所周知的(参见例如，U.S.P.Ns.5,714,350和6,350,861)。相反地，可以通过在一个或多个另外的糖基化位点中进行工程改造来赋予含Fc分子增强的效应子功能或改善的结合。
其他实施例包括一种具有变化的糖基化组成的Fc变体，如具有减少的岩藻糖基残基量的低岩藻糖基化抗体或具有增加的对分GlcNAc结构的抗体。已证明这些变化的糖基化模式可增加抗体的ADCC能力。工程改造过的糖型可以通过本领域的普通技术人员已知的任何方法产生，例如，通过使用工程化或变体表达株、通过与一种或多种酶(例如，N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII))共表达、通过在不同生物体或来自不同生物体的细胞系中表达一种包含Fc区的分子、或通过在表达了包含Fc区的分子之后对碳水化合物进行修饰(参见例如，WO 2012/117002)。
4.4片段
无论选择何种形式的抗体(例如，嵌合、人源化等形式)来实行本发明，应理解的是，其免疫反应性片段(作为抗体药物缀合物的靶向剂)都可以根据在此的传授内容使用。“抗体片段”包含完整抗体的至少一部分。如在此所使用，术语抗体分子的“片段”包括抗体的抗原结合片段，并且术语“抗原结合片段”或“免疫反应性片段”是指免疫球蛋白或抗体中与所选抗原或其免疫原性决定子免疫特异性结合或反应，或与衍生这些片段的完整抗体竞争特异性抗原结合的多肽片段。
示例性位点特异性片段包括：可变轻链片段(VL)、可变重链片段(VH)、scFv、F(ab′)2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体片段、微型双功能抗体、线性抗体、单链抗体分子及由抗体片段形成的多特异性抗体。此外，活性位点特异性片段包含该抗体中保持它与抗原/底物或受体相互作用的能力并且以类似于完整抗体的方式(不过可能具有略微降低的效率)对其进行修饰的一部分。这样的抗体片段可进一步被工程化为包含一个或多个游离半胱氨酸。
在其他实施例中，抗体片段是包含Fc区并且保持当存在于完整抗体中时通常与Fc区相关的至少一种生物功能(如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能及补体结合)的抗体片段。在一个实施例中，抗体片段是具有的体内半衰期实质上类似于完整抗体的一种单价抗体。例如，此类抗体片段可以包含一个连接到能够赋予该片段体内稳定性的Fc序列(包含至少一个游离半胱氨酸)的抗原结合臂。
如本领域的普通技术人员将充分认识到的，片段可以通过分子工程或经由化学或酶处理(如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)完整或完全抗体或抗体链，或者通过重组手段获得。有关抗体片段的更详细说明，参见例如，《基础免疫学》(Fundamental Immunology)，W.E.鲍尔(W.E.Paul)编，纽约瑞文出版社(Raven Press，N.Y.)(1999)。
4.5多价构建体
在其他实施例中，本发明的抗体药物缀合物可以是单价或多价(例如二价、三价等)的。如在此所使用，术语“价态”是指与一种抗体缔合的潜在靶结合位点的数目。每一靶结合位点特异性结合一个靶分子或在靶分子上的特定位置或基因座。当一种抗体是单价时，该分子的每个结合位点将特异性结合到单一抗原位置或表位。当一种抗体包含超过一个靶结合位点(多价)时，每个靶结合位点可以特异性结合相同或不同的分子(例如，可以结合到不同的配体或不同的抗原，或在同一抗原上的不同表位或位置)。参见例如，U.S.P.N.2009/0130105。
在一个实施例中，这些抗体是双特异性抗体，其中两条链具有不同的特异性，如米尔斯坦(Millstein)等，1983，《自然》，305：537-539中所描述。其他实施例包括具有另外的特异性的抗体，如三特异性抗体。其他更复杂的可相容多特异性构建体及其制造方法陈述于U.S.P.N.2009/0155255，以及WO 94/04690；Suresh等人，1986，Methods in Enzymology[酶学方法]，121：210；及WO 96/27011中。
多价抗体可以免疫特异性结合到所希望的靶分子的不同表位或可以免疫特异性结合到靶分子以及异源表位，如异源多肽或固体支撑材料。尽管优选实施例仅结合两个抗原(即，双特异性抗体)，但本发明也涵盖具有另外的特异性的抗体，如三特异性抗体。双特异性抗体还包括交联或“异种缀合”抗体。举例来说，在该异种缀合物中的一种抗体可以偶合到抗生物素蛋白，另一种偶合到生物素。已经例如提出这些抗体使免疫系统细胞靶向不想要的细胞(U.S.P.N.4,676,980)，并且用于治疗HIV感染(WO 9I/00360、WO 92/200373及EP 03089)。异种缀合抗体可以使用任何常规的交联方法制备。适合的交联剂以及多种交联技术是本领域中众所周知的，并且披露于U.S.P.N.4,676,980中。
5.抗体的重组产生
可以使用从抗体产生细胞和重组技术获得的遗传物质来产生或修饰抗体及其片段(参见例如Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods inEnzymology vol.152Academic Press，Inc.，San Diego，CA[分子克隆技术指南，酶学方法第152卷，学术出版公司，圣地亚哥，加州]；Sambrook和Russell(编)(2000)MolecularCloning：A Laboratory Manual(3rd Ed.)，NY，Cold Spring Harbor Laboratory Press[分子克隆：实验室手册(第3版)，纽约，冷泉港实验室出版社]；Ausubel等人(2002)ShortProtocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology，Wiley，John and Sons，Inc.[精编分子生物学实验指南：当代分子生物学实验指南的方法概要，约翰威立公司]；和U.S.P.N.7,709,611)。核酸可以存在于全细胞、细胞裂解物或部分纯化或基本上纯的形式中。当通过标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl条带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和本领域众所周知的其他)从其他细胞成分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)分离时，核酸是“分离的”或“呈现为基本上纯的”。本发明的核酸可以是例如DNA(例如基因组DNA、cDNA)、RNA及其人工变体(例如，肽核酸)，无论其是单链还是双链，并且可以或可以不含内含子。在优选的实施例中，核酸是cDNA分子。
可以使用标准分子生物学技术来获得核酸。对于由杂交瘤表达的抗体，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码抗体轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库(例如使用噬菌体展示技术)获得的抗体，可使用标准技术认可的技术从文库中回收编码抗体免疫反应性片段的核酸。
编码VH和VL区段的DNA片段可以通过标准重组DNA技术进一步操纵这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操纵中，编码VL或VH编码DNA片段可操作地连接到编码另一种蛋白质的另一个DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头。如本上下文中使用的术语“可操作地连接”意指连接两个DNA片段，使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保留在框架内。
编码VH区的分离的DNA可通过将VH编码DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子可操作地连接而转化为全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如卡巴特，E.A.等人(1991)(同上))，并且通过标准PCR扩增可以获得包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgG1或IgG4恒定区。示例性IgG1恒定区如SEQ ID NO：2中所示。对于Fab片段重链基因，VH编码DNA可以可操作地连接到仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
通过将VL编码DNA与编码轻链恒定区(CL)的另一DNA分子可操作地连接，可以将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如卡巴特，E.A.等人(1991)(同上))，并且通过标准PCR扩增可以获得包含这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但最优选是κ恒定区。在这方面，示例性的相容的κ轻链恒定区如SEQ ID NO：1中所示。
与本发明相容的抗体可以使用包含可以可操作地连接到启动子的上述这样的核酸(参见例如WO 86/05807；WO 89/01036；和U.S.P.N.5,122,464)和真核分泌途径的其他转录调节和加工控制元件的载体来生产。然后使用本领域认可的技术培养携带这种载体和宿主表达系统的宿主细胞以提供所需的抗体。
如在此所使用，术语“宿主表达系统”包括可被工程化以产生与本发明相容的核酸或多肽和抗体的任何种类的细胞系统。这种宿主表达系统包括但不限于用重组噬菌体DNA或质粒DNA转化或转染的微生物(例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)；用重组酵母表达载体转染的酵母(例如酵母属)；或具有重组表达构建体的哺乳动物细胞(例如，COS、CHO-S、HEK-293T、3T3细胞)，构建体含有来源于哺乳动物细胞或病毒基因组的启动子(例如，腺病毒晚期启动子)。该宿主细胞可以用两个表达载体共转染，例如，第一载体编码一个重链衍生的多肽并且第二载体编码一个轻链衍生的多肽。
转化哺乳动物细胞的方法是本领域中众所周知的。参见例如，U.S.P.Ns.4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455。宿主细胞也可以被工程化以允许产生具有不同特征的抗原结合分子(例如经修饰的糖形式或具有GnTIII活性的蛋白质)。
对于长期高产率产生重组蛋白来说，稳定表达是优选的。因此，稳定地表达所选抗体的细胞系可以使用标准的本领域认可的技术进行工程化，并形成本发明的一部分。除使用含有病毒复制起点的表达载体外，可以用通过适当表达控制元件(例如启动子或增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸位点等)和可选择标记物控制的DNA来转化宿主细胞。可以使用本领域中众所周知的任何选择系统，包括谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)，该系统提供了一种用于在某些条件下增强表达的有效方法。GS系统是完整或部分结合EP 0 216846、EP 0 256 055、EP 0 323 997和EP 0 338 841以及U.S.P.N.5,591,639和5,879,936进行论述。开发稳定细胞系的另一个优选的表达系统是FreedomTM CHO-S Kit(LifeTechnologies[生命技术公司])。
一旦与本发明相容的抗体已经通过重组表达或所披露技术中的任何其他技术产生，则可以通过本领域已知的方法纯化或分离，这意味着它是从天然环境和会干扰包括ADC的抗体的治疗用途的污染物中鉴别，分离和/或回收的。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。
可以使用不同的本领域认可的技术，例如离子交换和尺寸排阻色谱、透析、渗滤和亲和色谱，特别是蛋白A或蛋白G亲和色谱，来纯化这些分离的制剂。
6.生产后选择
不管如何获得，都可以针对所希望的特征(包括稳固生长、高抗体产量及所希望的抗体特性例如对所关注的抗原的高亲和力)对抗体产生细胞(例如，杂交瘤、酵母集落等)进行选择、克隆并且进一步筛选。杂交瘤可以在细胞培养中在体外或在同系的免疫受损的动物体内扩增。选择、克隆并扩增杂交瘤和/或集落的方法是本领域的普通技术人员众所周知的。一旦鉴定出了所希望的抗体，相关遗传物质可以使用常见的、本领域认可的分子生物学和生物化学技术进行分离，操作和表达。
由天然文库(自然或合成的)产生的抗体可能具有适度亲和力(KA为约106至107M-1)。为了增强亲和力，可以通过构建抗体文库(例如，通过使用易错聚合酶在体外引入随机突变)并从那些第二文库中再选择对抗原具有高亲和力的抗体(例如通过使用噬菌体或酵母呈现)在体外模拟亲和力成熟。WO 9607754描述了一种用于在免疫球蛋白轻链的CDR中诱导诱变以建立轻链基因文库的方法。
可以使用各种技术来选择抗体，其包括但不限于噬菌体或酵母展示，其中在噬菌体或酵母上合成人组合抗体或scFv片段文库(所述文库用所关注的抗原或其抗体结合部分来筛选)，并且分离了结合抗原的噬菌体或酵母，从中可以获得抗体或免疫反应性片段(Vaughan等人，1996，PMID：9630891；Sheets等人，1998，PMID：9600934；Boder等人，1997，PMID：9181578；Pepper等人，2008，PMID：18336206)。用于产生噬菌体或酵母展示文库的试剂盒是可商购的。还存在其他方法和试剂可以用于产生并筛选抗体展示文库(参见U.S.P.N.5,223,409；WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；及Barbas等人，1991，PMID：1896445)。这些技术有利地允许进行大量候选抗体的筛选并且提供对序列的相对容易的操作(例如，通过重组改组)。
V抗体特征
在所选实施例中，可以针对有利的特性，包括例如稳固生长、高抗体产量及如以下更详细地论述的所希望的抗体药物缀合物特征，对抗体产生细胞(例如，杂交瘤或酵母集落)进行选择、克隆并且进一步筛选。在其他情形中，可以通过选择用于接种动物的特定抗原(例如，特定蛋白质结构域)或靶抗原的免疫反应性片段来赋予该抗体的特征。在又其他实施例中，所选抗体可以如以上所描述进行工程改造以增强或精制免疫化学特征，如亲和力或药物代谢动力学。
A.中和抗体
在选择的实施例中，与本发明相容的抗体可以是“拮抗剂”或“中和”抗体，这意味着抗体可以与决定簇缔合，并直接阻断或抑制所述决定簇的活性，或通过阻止决定簇与结合配偶体例如配体或受体的缔合来阻断或抑制所述决定簇的活性，从而中断否则会由分子相互作用导致的生物反应。当如例如通过靶分子活性所测量或在体外竞争性结合测定中所测量，过量的抗体将与决定簇结合的结合配偶体的量减少至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更高时，中和或拮抗剂抗体将实质上抑制决定簇与其配体或底物的结合。应理解的是，这一修饰的活性可以使用本领域认可的技术直接地测量，或可以通过改变的活性的下游影响(例如，瘤发生、细胞存活)来测量。
B.内化抗体
在许多情况下，所选的决定簇仍然与肿瘤发生细胞表面缔合，借此允许所披露的ADC的定位和内化。在优选的实施例中，这样的抗体将与在内化之后杀死细胞的一种或多种卡奇霉素有效负荷缔合或缀合。在特别优选的实施例中，本发明的ADC将包含具有卡奇霉素有效负荷的内化位点特异性ADC。
如在此所使用，“内化”的抗体是在结合到所缔合的抗原或受体之后被细胞吸收(以及任何细胞毒素)的抗体。对于治疗应用，内化将优选在有需要的受试者中在体内发生。内化的ADC的数量可以足以杀死抗原表达细胞，尤其是抗原表达癌症干细胞。取决于卡奇霉素或ADC作为整体(例如，基于DAR)的效力，将单个抗体分子吸收到细胞中足以杀死该抗体所结合的靶细胞。例如，随着附接的卡奇霉素的更高的DAR和有效递送，一些ADC能如此高度有效以致几个分子的内化足以杀死肿瘤细胞。抗体在结合到哺乳动物细胞之后是否内化可以通过不同的领域认可的检验来测定(例如，像Mab-Zap和Fab-Zap的皂草素测定；AdvancedTargeting Systems[高级靶向系统公司])。检测一种抗体是否内化到细胞中的方法也描述于U.S.P.N.7,619,068中。
C.耗竭抗体
在其他实施例中，本发明的抗体是耗竭抗体。术语“耗竭”抗体是指优选地与在细胞表面之上或附近的抗原结合并且诱导、促进或引起该细胞的死亡(例如，通过CDC、ADCC或引入细胞毒性剂)的一种抗体。在优选的实施例中，所选的耗竭抗体将与一种细胞毒素缀合。优选地，耗竭抗体将能够杀死在预定的细胞群中的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％的SEZ6表达细胞。在一些实施例中，该细胞群可以包含富集、分割、纯化或分离的肿瘤发生细胞，包括癌症干细胞。在其他实施例中，该细胞群可以包含完整肿瘤样品或异种肿瘤提取物，它们包含癌症干细胞。可以使用标准生物化学技术，根据此处的教导对肿瘤发生细胞的耗竭进行监测并定量。
D.结合亲和力
与本发明相容的抗体优选对所选择的决定簇(例如SEZ6)具有高结合亲和力。术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数或表观亲和力。当解离常数KD(koff/kon)≤10-6M时，与本发明相容的抗体被认为免疫特异性地结合其靶抗原。当KD≤5x 10-9M时，该抗体以高亲和力特异性结合抗原，并且当KD≤5x 10-10M时，以极高亲和力特异性结合抗原。在本发明的一个实施例中，该抗体具有≤10-9M的KD及约1x 10-4/sec的解离速率。在本发明的一个实施例中，解离速率＜1x 10-5/sec。在本发明的其他实施例中，这些抗体将以介于约10-7M与10-10M之间的KD结合到决定簇，并且在又另一实施例中，它将以KD≤2x 10-10M结合。本发明的仍然其他的所选择的实施例包括如下抗体，该抗体具有的KD(koff/kon)小于10-6M，小于5x 10-6M，小于10-7M，小于5x 10-7M，小于10-8M，小于5x 10-8M，小于10-9M，小于5x 10-9M，小于10-10M，小于5x 10-10M，小于10-11M，小于5x 10-11M，小于10-12M，小于5x 10-12M，小于10- 13M，小于5x 10-13M，小于10-14M，小于5x 10-14M，小于10-15M或小于5x 10-15M。
在某些实施例中，与本发明相容的抗体免疫特异性地结合到决定簇的缔合速率常数或kon(或ka)速率(抗体+抗原(Ag)k on←抗体-Ag)为至少105M-1s-1、至少2x 105M-1s-1、至少5x 105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5x 106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5x 107M-1s-1或至少108M- 1s-1。
在另一个实施例中，与本发明相容的抗体免疫特异性地结合到决定簇的解离速率常数或koff(或kd)速率(抗体+抗原(Ag)k off←抗体-Ag)为小于10-1s-1、小于5x 10-1s-1、小于10-1s-1、小于5x 10-2s-1、小于10-3s-1、小于5x 10-3s-1、小于10-4s-1、小于5x 104s-1、小于10-5s-1、小于5x 10-5s-1、小于10-6s-1、小于5x 10-6s-1、小于10-7s-1、小于5x 10-7s-1、小于10-8s-1、小于5x 10-8s-1、小于10-9s-1、小于5x10-9s-1或小于10-10s-1。
可以使用本领域已知的不同技术来确定结合亲和力，例如表面等离子体共振、生物层干涉法、双偏振干涉法、静态光散射、动态光散射、等温滴定量热法、ELISA、分析超速离心法和流式细胞术。
E.分仓和表位定位
如在此所使用，术语“分仓”是指用于基于其抗原结合特征及其是否彼此竞争而将抗体分组成“仓”的方法。可以通过如此处所述的表位定位和其他技术进一步改进和确认仓的初始测定。然而，应当理解，抗体对个体仓的经验性分配提供可以指示所披露的抗体药物缀合物的治疗潜力的信息。
更具体地说，可以通过使用本领域中已知的方法确定所选参比抗体(或其片段)是否与第二测试抗体(即，在同一分仓中)竞争结合。在一个实施例中，参比抗体在饱和条件下与所选择的抗原缔合，并且然后，使用标准免疫化学技术测定第二或测试抗体结合到同一抗原的能力。如果该测试抗体能够与参比抗体同时实质上结合到抗原，那么该第二或测试抗体结合到与第一或参比抗体不同的表位。然而，如果该测试抗体不能够同时实质上结合到抗原，那么该测试抗体结合到相同表位、重叠表位或与参照抗体所结合的表位紧密邻近(至少在空间上)的表位。也就是说，该测试抗体竞争抗原结合并且与参比抗体处于相同仓中。
当用于所披露的抗体的上下文中时，术语“竞争”或“竞争抗体”意指如通过一种检验所测定的抗体之间的竞争，在该检验中，测试抗体或免疫功能片段在测试时抑制参比抗体与共同抗原的特异性结合。典型地，此类检验涉及使用结合到固体表面或表达的细胞、未标记的测试抗体和标记的参比抗体的纯化抗原(或其结构域或片段)。竞争性抑制是通过在测试抗体存在下，测定结合到固体表面或细胞的标记的量来测量。通常，该测试抗体是以过量存在和/或允许首先结合。有关用于测定竞争性结合的方法的其他细节提供于在此的实例中。通常，当竞争抗体过量存在时，它将使参比抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些情况下，结合被抑制至少80％、85％、90％、95％或97％，或更多。
相反地，当参比抗体结合时，它将优选地使随后添加的测试抗体的结合抑制至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些情况下，测试抗体的结合被抑制至少80％、85％、90％、95％或97％，或更多。
通常可以使用本领域认可的不同技术来测定分仓或竞争性结合，例如像免疫测定如蛋白印迹、放射性免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定。这些免疫测定在本领域是常规的和已知的(参见Ausubel等人编辑，1994，Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法]，第1卷，John Wiley&Sons，Inc.[约翰威利父子公司]，纽约)。另外，可以使用交叉阻断测定法(参见例如WO 2003/48731；和Harlow等人(1988)Antibodies，A Laboratory Manual[抗体：实验室手册]，Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室出版社]，Ed Harlow和David Lane)。
用于确定竞争性抑制(因此和“仓”)的其他技术包括：使用例如BIAcoreTM 2000系统(GE Healthcare[GE医疗集团])的表面等离子体共振；使用例如Octet RED(ForteBio[福特生物有限公司])的生物层干涉法；或使用例如FACSCanto II(BDBiosciences[BD生物科学公司])或多重LUMINEXTM检测测定(Luminex[路明克斯])的流式细胞仪测定珠测定。
Luminex[路明克斯]是一种基于珠的免疫测定平台，其可实现大规模多重抗体配对。该测定比较了抗体对与靶抗原的同时结合模式。该对的一个抗体(捕获mAb)与Luminex珠结合，其中每个捕获mAb结合到不同颜色的珠上。另一抗体(检测器mAb)与荧光信号(例如藻红蛋白(PE))结合。该测定分析了抗体与抗原的同时结合(配对)，并将具有相似配对特征的抗体组合在了一起。检测器mAb和捕获mAb的相似特征表明两个抗体结合到了相同或密切相关的表位上。在一个实施例中，可以使用皮尔森(Pearson)相关系数确定配对特征，以鉴定与测试的抗体组上的任何特定抗体最紧密相关的抗体。在优选的实施例中，如果抗体对的皮尔森相关系数至少为0.9，则测试/检测器mAb将被确定为与参比/捕获mAb相同的仓。在其他的实施例中，皮尔森相关系数至少为0.8、0.85、0.87或0.89。在另外的实施例中，皮尔森相关系数至少为0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1。分析从Luminex测定获得的数据的其他方法描述于U.S.P.N.8,568,992中。Luminex同时分析100种不同类型的珠(或更多种)的能力提供了几乎无限的抗原和/或抗体表面，使得经生物传感器检验进行抗体表位谱分析的工作量和解决方案得以改善(Miller等人，2011，PMID：21223970)。
“表面等离子共振”是指一种光学现象，它允许通过检测生物传感器矩阵内蛋白质浓度的变化来分析实时特异性相互作用。
在其他的实施例中，可用于确定测试抗体是否竞争结合参比抗体的技术是“生物层干涉法”，这是一种分析从两个表面反射的白光的干涉图案的光学分析技术：生物传感器尖端上固定的蛋白质层和内部参考层。结合到生物传感器尖端的分子数量的任何改变都引起可以实时测量的干涉图案的转变。这样的生物层干涉测定法可以使用如下的Octet RED机器来进行。将参比抗体(Ab1)捕获到抗小鼠捕获芯片上，然后使用高浓度非结合抗体来阻断该芯片并且收集基线值。然后，通过特定抗体(Ab1)捕获单体的重组靶蛋白并且将尖端浸入一个具有与对照物相同的抗体(Ab1)的孔中或浸入一个具有不同测试抗体(Ab2)的孔中。如果如通过将结合水平与对照Ab1相比较所测定，未发生另外的结合，那么确定Ab1和Ab2为“竞争”抗体。如果用Ab2观察到另外的结合，则确定Ab1和Ab2不相互竞争。这一方法可以扩大到使用在96孔板中代表独特仓的一整行抗体来筛选较大的独特抗体文库。在优选的实施例中，如果参比抗体抑制了测试抗体与共同抗原的特异性结合的至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％，测试抗体将与参比抗体竞争。在其他的实施例中，结合被抑制至少80％、85％、90％、95％或97％，或更多。
一旦定义了包含一组竞争性抗体的仓，就可进行进一步的表征，以确定在仓中抗体结合的抗原上的特异性结构域或表位。可以使用Cochran等人，2004，PMID：15099763描述的方案的修改来进行结构域水平的表位定位。精细的表位作图是确定抗原上包含抗体结合决定簇表位的特异性氨基酸的过程。术语“表位”是以其常用的生物化学含义使用并且是指靶抗原的能够被特定抗体识别并特异性结合的部分。在某些实施例中，表位或免疫原性决定子包括化学活性表面分子群，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施例中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。在某些实施例中，当一种抗体优先地识别它在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的靶抗原时，认为它与抗原特异性结合。
当该抗原为一种多肽(如SEZ6)时，表位一般可以由通过蛋白质的三级折叠而并置的连续氨基酸和不连续氨基酸形成(“构象表位”)。在此类构象表位中，相互作用的点横过蛋白质上彼此线性地分开的氨基酸残基发生。由连续氨基酸形成的表位(有时称为“线性”或“连续”表位)在蛋白质变性之后典型地保留，而通过三级折叠形成的表位在蛋白质变性之后典型地丧失。抗体表位典型地在独特的空间构象中包括至少3个并且更通常，至少5个或8-10个氨基酸。表位测定或“表位作图”的方法是本领域熟知的，并且可以与本披露结合使用以鉴定由所披露的抗体药物缀合物结合的SEZ6上的表位。
可相容的表位定位技术包括丙氨酸扫描突变体、肽印迹(Reineke(2004)MethodsMol Biol[分子生物学方法]248：443-63)、或肽裂解分析。此外，可以采用如表位切除、表位提取及抗原的化学修饰等方法(汤莫(Tomer)(2000)《蛋白质科学》(Protein Science)9：487-496)。在其他实施例中，修饰辅助的谱分析(MAP)，又称为基于抗原结构的抗体谱分析(ASAP)提供了这样一种方法，该方法根据每一抗体与化学或酶促修饰的抗原表面的结合谱的相似性对针对相同抗原的大量单克隆抗体进行分类(U.S.P.N.2004/0101920)。这一技术允许对遗传上一致的抗体进行快速过滤，由此表征可以集中在遗传上相异的抗体。应理解的是，可以使用MAP将与本发明相容的抗体分选到结合不同表位的抗体组中。
一旦在抗原上确定了所希望的表位，就有可能例如通过使用本发明中所描述的技术，用包含该表位的肽进行免疫接种来产生针对该表位的抗体。作为替代方案，在该发现过程期间，抗体的产生和表征可以阐明有关位于特定结构域或基序中的所希望的表位的信息。从这一信息，然后有可能针对结合到同一表位竞争性筛选抗体。实现这一点的一种方法是进行竞争研究以发现与该抗原的结合竞争的抗体。基于交叉竞争对于抗体进行分仓划分的高通量方法描述于WO 03/48731中。本领域熟知分仓或结构域水平或表位定位的其他方法，包含抗体竞争或在酵母上进行抗原片段表达。
VI接头组分
可以使用通式[-W-(X1)a-CM-(X2)b-P-]的多个接头化合物将本发明的靶向剂与所选择的卡奇霉素弹头缀合。接头只需要与靶向剂(优选半胱氨酸或赖氨酸)和所选择的卡奇霉素或卡奇霉素类似物上的反应性残基共价结合。相应地，与靶向剂的所选择的残基反应的任何所披露的卡奇霉素-接头构建体可用于提供本发明的相对稳定的缀合物(位点特异性或非位点特异性)，并且是与此处的教导相容的。
在优选的实施例中，相容性接头将赋予细胞外环境中的ADC稳定性，防止ADC分子的聚集并保持ADC在水性介质中和单体状态下易于溶解。在运输或传递到细胞中之前，ADC优选地为可溶的并且保持完整，即，该靶向剂保持连接到该卡奇霉素。虽然这些接头在靶细胞外是稳定的，它们被专门设计成在靶标处或更优选地在细胞内部以某一有效速率裂解和/或降解。相应地，一种有效的接头将：(i)维持该靶向剂的特异性结合特性；(ii)促进该有效负荷或卡奇霉素弹头的细胞内递送；(iii)保持稳定和完整(即，未裂解或降解)，直到该弹头已经被递送或运输到其靶位点；并且(iv)维持所选择的卡奇霉素的细胞毒性、杀细胞作用或细胞生长抑制作用(在一些情况下，包括旁观者效应)。如在所附实例中所示，ADC的制造和稳定性可以通过标准分析技术，如HPLC/UPLC、质谱、HPLC及分离/分析技术LC/MS和LC/MS/MS来测量。
A.可裂解部分-(CM)
与本发明相容的接头可以广泛地分类为可裂解的，并且包含如此处所定义的至少一个可裂解部分。可裂解接头(可以包括酸不稳定性接头、蛋白酶可裂解接头和二硫化物接头)优选地被内化到靶细胞内并且在细胞内以内体-溶酶体途径被裂解。在这样的情况下，卡奇霉素弹头的释放和活化依赖于促进酸不稳定性化学键(如腙或肟)裂解的内体/溶酶体酸性区室。一个或多个溶酶体特异性蛋白酶裂解位点也可以被工程化到接头中，以优选地将卡奇霉素弹头其细胞内靶标附近释放。可替代地，含有可裂解的二硫化物部分的接头(包括在该卡奇霉素弹头附近的一个)提供了卡奇霉素在细胞内释放的方法，因为该二硫化物键在细胞的还原环境(而不是血流中的富氧环境)中被选择性地裂解。
因此，本发明的某些优选的实施例包含通过裂解剂可裂解的一种接头，该接头存在于细胞内环境中(例如，在溶酶体或核内体或细胞凹陷内)。该接头可以例如为一种肽基接头，它被细胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于，溶酶体或核内体蛋白酶)裂解。在一些实施例中，该肽基接头为至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。裂解剂可以包括组织蛋白酶B和D及纤溶酶，已知它们各自水解二肽药物衍生物，引起靶细胞内部活性卡奇霉素的释放。通过硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B可裂解的示例性肽基接头是包含Phe-Leu的肽，因为已经发现组织蛋白酶-B在癌组织中高度表达。这些接头的其他实例描述于例如U.S.P.N.6,214,345中。在一个特别优选的实施例，通过细胞内蛋白酶可裂解的肽基接头为Val-Cit接头、Val-Ala接头或Phe-Lys接头，如U.S.P.N.6,214,345中所描述。使用该治疗剂的细胞内蛋白水解释放的一个优势是当缀合时典型地衰减，并且该缀合物的血清稳定性典型地高。
因此，在特别优选的实施例中，可裂解部分包含肽键，其与通过血清中的蛋白酶被裂解相反，优选地通过蛋白酶在预期的作用位点被裂解。通常，可裂解部分的肽组分包含1至20个氨基酸，优选1至6个氨基酸，更优选1至3个氨基酸。所述一个或多个氨基酸可以是天然的和/或非天然的α-氨基酸。天然氨基酸是由遗传密码编码的那些，连同那些由此衍生的氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸酯、瓜氨酸以及O-磷酸丝氨酸。术语氨基酸还包括氨基酸类似物和模拟物。类似物是具有与天然氨基酸相同的H2N(R)CHCO2H一般结构的化合物，除了所述R基团不是在天然氨基酸中发现的基团。所述类似物的实例包括高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸-亚砜和甲硫氨酸甲基锍。氨基酸模拟物是具有与α-氨基酸的通用化学结构不同的结构，但是以与之类似的方式起作用的化合物。术语“非天然氨基酸”旨在表示“D”立体化学形式，天然氨基酸为“L”形式。
在特别优选的实施例中，相容性肽基接头将包括：
其中星号表示与任选的间隔子(或接头)X2或二硫键保护基的附接点，TA是如在此处披露的靶向剂，L1包括肽基可裂解部分，W是将L1连接到靶向剂上的反应性残基上的连接基团(任选地包括间隔子(或附接体)X1)，L2是共价键或与OC(＝O)一起形成自消接头。L1-L2-OC(O)-对应于式2中的-(X1)a-CM-和式(I/Ia)中的-(L3)Z1-M-。
作为肽基可裂解接头，L1优选地是引发接头降解，由此导致了二硫键的裂解和在靶位点产生活性双基卡奇霉素物质的触发剂。
应当理解的是，L1和L2的性质可以广泛变化。这些基团是基于其裂解特征来选择的，这些特征可以通过传递该缀合物的位点处的条件规定。虽然在酶的作用下被裂解的那些部分在某些情况下是优选的，但是必须强调的是，可通过pH变化(例如酸或碱不稳定性)、温度或照射(例如光不稳定性)可裂解的部分是与本发明相容的，并且可以作为CM使用。在还原或氧化条件下可裂解的部分也是相容的并且可以用作可裂解部分。
在特别优选的实施例中，L1可以包含一个连续的氨基酸序列。该氨基酸序列或可裂解的肽可以是酶裂解的靶底物，借此允许该药物释放。术语“可裂解肽”是指含有蛋白酶裂解识别序列的肽。蛋白酶的裂解识别序列是在蛋白水解裂解期间由蛋白酶识别的氨基酸序列。许多蛋白酶裂解位点是本领域已知的，并且这些和其他裂解位点可以包括接头、间隔子或接头部分。参见例如Matayoshi等人，Science[科学]247：954(1990)；Dunn等人，Meth.Enzymol.[酶学方法]241：254(1994)；Seidah等人，Meth.Enzymol.[酶学方法]244：175(1994)；Thornberry，Meth.Enzymol.[酶学方法]244：615(1994)；Weber等人，Meth.Enzymol.[酶学方法]244：595(1994)；Smith等人，Meth.Enzymol.[酶学方法]244：412(1994)；Bouvier等人，Meth.Enzymol.[酶学方法]248：614(1995)，Hardy等人，在AMYLOIDPROTEIN PRECURSOR IN DEVELOPMENT，AGING，AND ALZHEIMER’S DISEASE[发育、衰老和阿尔茨海默病中的淀粉样蛋白前体]，编辑：Masters等人，第190页-第198页(1994)中所述。
然后，在所选择的实施例中，L1是通过酶作用可裂解的。在其他所选择的实施例中，该酶可以包含酯酶或肽酶。在其他实施例中，肽序列是基于其被肿瘤相关蛋白酶例如在癌细胞表面或细胞外在肿瘤细胞附近发现的蛋白酶裂解的能力而被选择的。这些蛋白酶的实例包括thimet寡肽酶(TOP)、CDIO(脑啡肽酶)、基质金属蛋白酶(如MMP2或MMP9)、II型跨膜丝氨酸蛋白酶(如Hepsin、testisin、TMPRSS4或蛋白裂解酶/MT-SP1)和豆荚蛋白(legumain)。可以使用本领域已知的体外蛋白酶裂解测定来测试肽被肿瘤相关蛋白酶裂解的能力。
对于设计为被细胞内化的缀合物，可裂解部分优选地包含所选择的用于被核内体或溶酶体蛋白酶裂解的氨基酸序列。此类蛋白酶的非限制性实例包括组织蛋白酶B、C、D、H、L和S，尤其是组织蛋白酶B。组织蛋白酶B优先裂解序列-AA2-AA1-处的肽，其中AA1为碱性或强氢键结合性氨基酸(如赖氨酸、精氨酸或瓜氨酸)并且AA2为疏水性氨基酸(如苯丙氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)，例如Val-Cit(其中Cit表示瓜氨酸)或Val-Lys。(在此处，氨基酸序列如在H2N-AA2-AA1-CO2H以N-C方向记载，除非上下文另有明确说明)。有关组织蛋白酶裂解组的更多信息，请参见Dubowchik等人，Biorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]8，3341-3346(1998)；Dubowchik等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]，83347-3352(1998)；和Dubowchik等人，Bioconjugate Chem.[生物共轭化学]13，855-869(2002)；这些文献的披露通过引用结合在此。可用于裂解肽基接头的另一种酶是豆荚蛋白，一种优先在Ala-Ala-Asn处裂解的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。
相应地，在优选的实施例中，L1包含肽。在某些选定的实施例中，可以是表示为-NH-AA2-AA1-CO-的二肽，其中-NH-和-CO-分别代表氨基酸基团的N和C-末端。在其他实施例中，可裂解肽可以是三肽、四肽或五肽，其中每个氨基酸独立地是L或D异构体。
在某些实施例中，所述肽选自下组，该组由以下各项组成：Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Lle-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-tosyl-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：3)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ IDNO：4)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：5)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、和D-Ala-D-Ala、Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Val-Cit、和Ala-Val-Ala。在另一个替代方案中，所述肽选自下组，该组由以下各项组成：Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、和Ala-Val-Ala。可替代地，所述肽是Gly-Gly-Ala、Val-Ala、Glu-Ala、或Glu(OMe)-Ala。在相关实施例中，上文中的任何肽序列可以处于任一方向，如上定义的。
另外地，对于具有羧基或氨基侧链官能团的那些氨基酸，对应地例如Glu和Lys，CO和NH可以表示该侧链的官能团。
在一个实施例中，二肽-NH-AA2-AA1-CO-中的基团-AA2-AA1-选自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-、-Val-Cit-、-Phe-Cit-、-Leu-Cit-、-Ile-Cit-、-Phe-Arg-和-Trp-Cit-，其中Cit是瓜氨酸。
优选地，二肽-NH-AA2-AA1-CO-中的基团-AA2-AA1-选自：-Phe-Lys-、Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-、和-Val-Cit-。
最优选地，二肽-NH-AA2-AA1-CO-中的-AA2-AA1-基团是-Val-Cit-、-Phe-Lys-或Val-Ala-。
在某些优选的实施例中，L2是存在的并且连同-C(＝O)O-形成一种自消接头。在其他的实施例中，L2为酶活性的一种底物，借此进一步调控该药物释放。
在一个实施例中，在L1在酶作用下可裂解并且L2存在的情况下，该酶将L1与L2之间的键裂解。
在某些实施例中，L1和L2(在存在的情况下)可以通过选自以下各项的键连接：-C(＝O)NH-、-C(＝O)O-、-NHC(＝O)-、-NH(Ar)、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-、和-NHC(＝O)NH-。
L1中连接到L2的氨基可以是氨基酸的N末端，或可以衍生自氨基酸侧链的氨基，例如赖氨酸氨基酸侧链。
包含肽基可裂解部分的相容性的卡奇霉素-接头构建体的特别优选的实施例如紧跟在下面的式4-12所示。应当理解的是，式6-12的构建体可以如在实例3(式4，Val-Cit)和4(式5，Val-Ala)中所示通过仅在所需的二肽部分中取代而实质上地进行制备。此外，鉴于本披露，技术人员可以使用类似的合成方案容易地制备另外的肽基接头卡奇霉素构建体。
式4(ADC19.4-二肽)(Val-Cit二肽)
L1中连接到L2的羧基可以是氨基酸的C末端，或可以衍生自氨基酸侧链的羧基，例如谷氨酸氨基酸侧链。
L1中连接到L2的羟基可以衍生自氨基酸侧链的羟基，例如丝氨酸氨基酸侧链。
术语“氨基酸侧链”包括见于以下各项中的那些基团：(i)天然存在的氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸及缬氨酸；(ii)微量氨基酸，如鸟氨酸和瓜氨酸；(iii)非天然氨基酸、β-氨基酸、天然氨基酸的合成类似物和衍生物；及(iv)其所有对映异构体、非对映异构体、富集异构体、同位素标记(例如，2H、3H、14C、15N)、被保护形式及外消旋混合物。
在一个实施例中，C(＝O)O和L2一起形成以下基团：
其中星号表示与任选的间隔子X2或二硫键保护基的附接点，波浪线表示与可裂解部分的附接点，Y是N(H)、O、C(＝O)N(H)或C(＝O)O，并且n是0至3。亚苯基环任选地被一个、两个或三个如在此所描述的取代基取代。在一个实施例中，该亚苯基任选地被卤代、NO2、R或OR(其中R是如上所定义的)取代。
在一个实施例中，Y是NH。
在一个实施例中，n是0或1。优选地，n为0。
在Y为NH并且n为0时，自消接头可以称为对氨基苯甲基羰基接头(PABC)。
在特别优选的实施例中，该接头可包括自消接头且二肽一起形成基团NHValAla-CONHPABC(参见式5)，该基团图解于下：
其中星号表示与任选的间隔子或靠近卡奇霉素弹头的二硫键保护基的附接点，且波浪线表示与可缀合至抗体的接头的剩余部分(例如，任选的间隔子连接基团片段)的附接点。在酶促裂解该二肽之后，当远端位点活化时，该自消接头将允许完全释放被保护的化合物(即，卡奇霉素二硫化物类似物)，沿以下所示的线进行：
其中L*是包含现在裂解的肽基单元和靶向抗原的接头的剩余部分的形式。卡奇霉素类似物与二硫键保护基的清洁释放有利于剩余的接头片段的降解和所需的双基物质的产生。在其他特别优选的实施例中，所选择的接头将包含-NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-(参见式4)。
关于自消部分的其他披露内容，参见Carl等人，J.Med.Chem.[药物化学期刊]，24(3)，479-480(1981)；Carl等人，WO 81/01145(1981)；Dubowchik等人，Pharmacology&Therapeutics[药理学与治疗学]，83，67-123(1999)；Firestone等人，美国专利号6,214,345 B1(2001)；Toki等人，J.Org.Chem.[有机化学杂志]67，1866-1872(2002)；Doronina等人，Nature Biotechnology[自然生物技术]21(7)，778-784(2003)(勘误表，第941页)；Boyd等人，美国专利号7,691,962 B2；Boyd等人，US 2008/0279868 A1；Sufi等人，WO 2008/083312 A2；Feng，美国专利号7,375,078 B2；和Senter等人，US 2003/0096743 A1；这些文献的披露通过引用结合在此。
在其他的实施例中，可裂解的接头是pH敏感的(例如参见式13和式14)。典型地，该pH敏感性接头在酸性条件下将水解。举例来说，可以使用在溶酶体中可水解的酸不稳定性接头(例如，腙、肟、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺-乌头酰胺、原酸酯、乙缩醛、缩酮等)(参见例如，U.S.P.N.5,122,368；5,824,805；5,622,929)。这些接头在中性pH条件(如在血液中的那些)下相对稳定，但在低于pH 5.5或5.0(近似为溶酶体的pH值)下不稳定。因此，其裂解被酸催化的可裂解部分将在溶酶体内比以在血浆中的速率快几个数量级的速率裂解。合适的酸敏感基团的实例包括顺式-乌头酰胺和腙，如在Shen等人，美国专利号4,631,190(1986)；Shen等人，美国专利号5,144,011(1992)；Shen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化学和生物物理研究通讯]102，1048-1054(1981)和Yang等人，Proc.Natl Acad.Sci(USA)[美国国家科学院院刊]，85，1189-1193(1988)中所描述；将其披露内容通过引用结合在此。
在又其他实施例中，该接头在还原条件下为可裂解的(例如，二硫化物接头)。二硫化物可以通过硫醇-二硫化物交换机制裂解，速率取决于环境中的硫醇浓度。由于谷胱甘肽和其他硫醇的细胞内浓度高于其血清浓度，二硫化物的裂解速率在细胞内将会更高。此外，硫醇-二硫化物交换速率可以通过调节二硫化物的空间和电子特性(例如，烷基-芳基二硫化物对烷基-烷基二硫化物；芳基环上的取代等)来调控，使得能够设计具有增强血清稳定性或特定裂解速率的二硫键。本领域中已知多种二硫化物接头，包括例如，可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)及SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)形成的那些。关于缀合物中二硫键可裂解基团的其他披露内容，参见例如Thorpe等人，Cancer Res.[癌症研究]48，6396-6403(1988)；Santi等人，美国专利号7,541,530 B2(2009)；Ng等人，美国专利号6,989,452 B2(2006)；Ng等人，WO 2002/096910 A1；Boyd等人，美国专利号7,691,962 B2；和Sufi等人，US 2010/0145036A1；将其披露内容通过引用结合在此。
B.任进的间隔子-(X1和X2)
如前文所暗指的所披露的可裂解部分可以侧接一个或多个任选的间隔子(X1和X2)，或者可以与靶向剂或二硫键保护基直接缔合；也就是说，间隔子X1和X2可以不存在或独立存在。例如，如果可裂解部分包含二硫键，则两个硫中的一个可以是半胱氨酸残基或其替代物靶向剂。在其他实施例中，可裂解部分可以是与抗体的碳水化合物侧链上的醛键合的腙。在其他优选的实施例中，可裂解部分(潜在地与任选的自消基团一起)可以结合至所选择的构型的两个间隔子。
本文所用的术语“间隔子”包括插入任何两个化学基团之间的化学部分。例如，在一些实施例中，间隔子(例如，X1)的一端直接连接到靶向剂上，或者在其他的实施例中，直接连接到可以与细胞-结合剂形成共价键的反应性官能团(即，连接基团)上。在仍然其他的实施例中，间隔子(例如，X2)的一端连接到二硫键保护基或可与二硫键保护基形成共价键的反应性官能团上。在一些实施例中，间隔子的一端连接至支化的支架。在一些实施例中，间隔子插入(1)靶向剂或可与靶向剂形成共价键的反应性官能团、和(2)支化的支架之间。在一些实施例中，间隔子插入(1)二硫键保护基或可与二硫键保护基形成共价键的反应性官能团、和(2)支化的支架之间。在某些优选的实施例中，间隔子可以在一端附接到反应性官能团，以形成可进一步与靶向剂或保护性二硫基反应的接头部分。
此处所使用的术语“支化的支架”包括附接至两个或更多个间隔子的化学部分(即，“支化单元”)。支化的支架允许将两个或更多个卡奇霉素部分附接到靶向剂(式15)上。示例性的支化支架可以衍生自具有包含氨基(例如Lys)或羧基(如Glu或Asp)的侧链的氨基酸或包含两个或更多个这样的氨基酸的肽(例如，Lys-Lys二聚体等)。在其他的实施例中，支化单元可以衍生自或包含反应性部分，例如叔胺。
在某些实施例中，间隔子在两个化学基团之间产生期望的距离，例如以避免空间位阻或促进分子柔性。在某些实施例中，间隔子的存在不阻碍、抑制或以其他方式不利地影响侧翼化学基团的功能(例如，细胞结合剂结合细胞上的靶分子的能力或细胞毒性药物的细胞毒性)。在某些实施例中，间隔子赋予包含该间隔子的免疫缀合物或接头化合物额外的有益特征，例如增强的效力、溶解度、血清稳定性、和/或功效。在某些实施例中，间隔子可以包含一个或多个氨基酸残基(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个残基)，其可以或可以不对蛋白酶或肽酶(如细胞内/溶酶体肽酶)裂解具有抗性。在某些实施例中，间隔子可以包含聚乙二醇(PEG)单元-(CH2-CH2-0)-的一个或多个重复，例如1-1000个PEG单元、1-500个PEG单元、1-24个PEG单元、或2-8个PEG单元(2、4、6、或8个PEG单元)。在其他的实施例中，优选的间隔子将包含直链或支链的、取代或未取代的烷基或芳基部分。在仍然其他的实施例中，任选的间隔子X1或X2可以包含自消部分。
C.二氯化物保护基团-(P)
如前所述，卡奇霉素二硫化物基团优选由提供稳定性(例如，等离子体稳定性)的短链取代或未取代的双官能脂肪族或芳基(“二硫键保护基”)保护，直到ADC到达靶细胞。在这一方面，二硫键保护基由任选的间隔子X2共价连接卡奇霉素二硫化物基团，或者在不存在间隔子的情况下，直接与可裂解部分或任选的自消基团共价连接。在这样做时，二硫键保护基为二硫键提供一定程度的空间位阻，从而降低其通过硫醇-二硫化物交换反应裂解的易感性。鉴于本披露，本领域技术人员可以容易地选择提供所需稳定性并优化卡奇霉素ADC的治疗指数的相容性二硫键保护基(参见Kellogg等人，Bioconj.Chem[生物共轭化学]，2011，22，717-727)。提供稳定化的二硫键的其他方法可以在USPN20010036926中找到，其通过引用结合至此处。
在特别优选的实施例中，二硫键保护基将包含环状或无环的直链或支链C1-C12饱和或不饱和脂肪族部分。在某些优选的实施例中，脂肪族部分可以被取代。在其他优选的实施例中，脂肪族部分可以是未取代的。仍然其他的二硫键保护基的实施例包括具有与二硫化物部分近端的碳结合的一个或两个甲基的脂肪族部分。在仍然其他的实施例中，脂肪族部分将包含与二硫化物部分近端的碳结合的单个甲基。其他优选的实施例将包括具有一个或多个甲基、远离近端碳的一个、两个或三个碳的脂肪族部分。每种这样的构建体赋予的稳定性可以使用本领域认可的技术容易地测量。在每种情况下，所选择的二硫键保护基将发挥作用以增加二硫键的稳定性并延长卡奇霉素ADC在体内的半衰期。
D.连接基团-(W)
连接基团用于将所披露的卡奇霉素构建体与靶向剂缀合，以提供本发明的抗体药物缀合物。在优选的实施例中，此类连接剂可以包括已知参与蛋白质靶向剂(半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸)表面上的所选择的天然氨基酸的化学选择性修饰的部分；已知参与糖缀合的反应性官能团、适于与非天然氨基酸进行化学选择性反应的反应性部分；适于通过酶反应进行生物缀合的、具有特异性肽标签的反应性基团(对于这些方法的一般性描述，参见Bioconj.Chemistry[生物缀合化学]2015，26，176-192)。如本文详细讨论的，特别优选适用于产生位点特异性抗体药物缀合物的硫醇基连接基团。
许多相容性的接头可以有利地结合到亲核的还原的半胱氨酸和赖氨酸上。涉及还原的半胱氨酸和赖氨酸的缀合反应包括但不限于：硫醇-马来酰亚胺、硫醇-二溴马来酰亚胺、硫醇-卤代(酰卤)、硫醇-烯、硫醇-炔、硫醇-乙烯基砜、硫醇-双砜、硫醇-硫代磺酸酯、硫醇-吡啶基二硫化物和硫醇-对氟反应。如在此进一步论述的，硫醇-马来酰亚胺生物缀合是最广泛使用的方法之一，归因于其快速反应速率和温和的缀合条件。该方法的一个问题是反-迈克尔反应和来自抗体的马来酰亚胺连接的有效负荷损失或转移到等离子体中的其他蛋白质(例如人类血清白蛋白)的可能性。然而，在优选的实施例中，使用如在此处所陈述的实例8和9中的选择性还原和位点特异性抗体可用于稳定缀合物并减少这种不希望的转移。硫醇-酰卤反应提供了不能进行反-迈克尔反应并因此更稳定的生物缀合物。不幸地是，与基于马来酰亚胺的缀合相比，硫醇-卤化物反应通常具有较慢的反应速率，并且因此就提供不希望的药物抗体比而言效率不高。硫醇-吡啶基二硫化物反应是另一种流行的生物缀合途径。吡啶基二硫化物与游离硫醇进行快速交换，得到混合二硫化物和吡啶-2-硫酮的释放。混合二硫化物可以在释放有效负荷的还原性细胞环境中被裂解。在生物缀合中获得更多关注的其他方法是硫醇-乙烯基砜和硫醇-双砜反应，其中每一种都与此处的传授内容相容并且明确地包括在本发明的范围内。本领域技术人员将理解，前述缀合技术和试剂中的每一种与本发明相容并可用于提供所披露的抗体药物缀合物。
尽管有前述的方法，本发明的卡奇霉素接头优选与半胱氨酸上的活性硫醇亲核试剂(包括游离半胱氨酸提供的那些)连接。为此，靶向剂的半胱氨酸可以通过用不同还原剂如DTT或TCEP或如在此所陈述的温和还原剂进行处理而与接头试剂缀合反应。
在这方面，优选的连接基团含有用于与蛋白质靶向剂上的亲核官能团反应的亲电子官能团。在蛋白质上的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基；(ii)侧链胺基，例如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；及(iv)糖羟基或氨基，其中该抗体为糖基化的。胺、硫醇及羟基是亲核性的并且能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应形成共价键，这些接头部分和接头试剂包括：(i)顺丁烯二酰亚胺基；(ii)活化的二硫化物；(iii)活性酯，如NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯、HOBt(N-羟基苯并三唑)酯、卤代甲酸酯及酸卤化物；(iv)烷基和苯甲基卤化物，如卤代乙酰胺；及(v)醛、酮、和羧基。
优选的连接基团包括以下各项：
在所选择的实施例中，靶向剂和卡奇霉素-接头部分之间的连接是通过在靶向剂上的半胱氨酸(例如游离半胱氨酸)的硫醇残基和存在于接头上的末端马来酰亚胺基团(例如，连接基团)进行。在这些实施例中，蛋白质靶向剂和卡奇霉素-接头之间的连接如下：
其中星号表示与卡奇霉素-接头的剩余部分的附接点，并且波浪线表示与靶向剂的剩余部分的附接点。在所选择的实施例中，硫原子可优选地衍生自位点特异性的游离半胱氨酸。关于其他相容性接头，连接基团包含可与活化的残基反应以提供所希望的缀合物的末端碘乙酰胺。在任何情况下，鉴于本披露内容，本领域技术人员可以容易地将所披露的每一个卡奇霉素-接头构建体与相容性靶向剂(例如，位点特异性抗体)缀合。
除了活化的硫醇基之外，赖氨酸缀合可以通过各种活化酯进行，所述活化酯包括但不限于：N-羟基琥珀酰胺(NHS)酯、五氟苯酚酯、四氟苯酚酯、对硝基苯酚酯、羟基-苯并三唑(HOBt)酯和其他。在具有干扰的pKa的赖氨酸的某些情况下，可以通过与azatedinone部分和β-二酮反应产生位点特异性赖氨酸缀合物。
在其他的实施例中，酪氨酸和色氨酸抗体成分可以使用重氮盐、恶二唑3，5-二酮衍生物、环亚胺和其他官能团缀合。
其他实施例包括将所披露的卡奇霉素构建体缀合到存在于某些靶向剂(例如抗体)上的N-聚糖。一种常用的方法包括通过用高碘酸盐处理，用邻二醇氧化聚糖以产生醛。然后接头上的连接基团选自醛反应性官能团，例如肼、氨氧基化合物或适于还原胺化的胺。在其他优选的实施例中，接头上的连接基团选自各种应变环辛炔。其他相容性的方法涉及硫醇基官能化的聚糖在靶向剂的表面上的代谢表达。然后通过上述的半胱氨酸活性连接基团可以使硫醇基的缀合成为可能。
在其他相容性的实施例中，在靶向剂中并入非天然氨基酸允许将双正交化学官能团有效缀合到预先选择的位点。然后从互补的双正交反应性官能团中选择连接基团。例如，并入的对乙酰基苯丙氨酸残基可以使用酮反应性连接基团如肼、氨氧基化合物和适用于还原胺化的胺来缀合。可替代地，叠氮化物官能化的非天然氨基酸可以使用无铜点击化学试剂如应变环辛炔来并入和缀合。
还有的其他相容性的实施例包括卡奇霉素构建体与所披露的靶向剂的酶促介导的缀合。为此，生物素连接酶、转谷氨酰胺酶和硫辛酸连接酶可用于将小分子特异性地连接到蛋白质位点。例如，转谷氨酰胺酶催化在谷氨酰胺侧链与含有伯胺连接基团的小分子之间形成酰胺键。一个特别优选的实施例涉及通过转谷氨酰胺酶茂原轮链丝菌(Streptovertticillium mobaranese)对特异性肽标签(LLQGA)的修饰和随后的缀合。当将单个标签并入抗体的重链和轻链中时，已经显示该肽标签最有效地缀合。这样的构型在与MMAD-胺反应时可重复地提供约1.8-1.9的数量级的药物抗体比水平。作为替代性的策略，已经使用了产生甲酰甘氨酸的酶。该酶将肽标签CXPXR内的半胱氨酸残基转化成甲酰甘氨酸。甲酰甘氨酸虽然与具有适当的连接基团的肟和肼形成相容，但优选地通过Pictet-Spengler连接与氨氧基或肼官能化的色胺连接基团缀合。这些反应的产物在生理条件下已经显示非常稳定，并且可以容易地提供根据本发明的卡奇霉素ADC。
连接到一般性抗体的卡奇霉素-接头构建体的实例如紧跟在下面的式4′-12′和14′-17’所示。符号表示式I中与Ab的附接点。
鉴于本披露，技术人员可以使用类似的合成方案容易地制备另外的肽基接头卡奇霉素构建体
VII缀合制备
A.缀合程序
如上所暗指的可以使用许多众所周知的不同反应来将所披露的暗卡奇霉素-接头构建体附接到所选择的靶向剂上。例如，可以使用利用半胱氨酸的巯基的不同反应来缀合所需的有效负荷。特别优选的实施例将包括如下详述的包含一个或多个游离半胱氨酸的抗体缀合。在其他的实施例中，本发明的ADC可以通过将卡奇霉素与存在于所选择的抗体中的赖氨酸残基的暴露于溶剂中的氨基缀合而产生。又其他的实施例包括N-末端苏氨酸和丝氨酸残基的活化，然后可以使用所述N-末端苏氨酸和丝氨酸残基将所披露的有效负荷附接至所述抗体。优选地，将所选择的缀合方法进行裁剪来优化附接至抗体的药物的数量并提供相对高的治疗指数。
本领域已知用于将治疗性化合物与半胱氨酸残基缀合的不同方法，并且这些方法对本领域技术人员来说是显而易见的。在碱性条件下，半胱氨酸残基将被去质子化以产生硫醇盐亲核试剂，其可与软亲电子试剂如马来酰亚胺和碘乙酰胺反应。通常用于这种缀合的试剂可直接与半胱氨酸的半胱氨酸硫醇反应以形成缀合的蛋白质或与接头-药物反应形成接头-药物中间体。在接头的情况下，使用有机化学反应、条件和试剂的几种途径是本领域技术人员已知的，包括：(1)将本发明的蛋白质的半胱氨酸基团与接头试剂反应，通过共价键形成蛋白质-接头中间体，随后与活化的化合物反应；和(2)化合物的亲核基团与接头试剂反应，通过共价键形成药物-接头中间体，随后与本发明的蛋白质的半胱氨酸基团反应。在优选的实施例中，所披露的双功能接头可以包含用于与一个或多个半胱氨酸残基共价连接的硫醇修饰基团和用于与卡奇霉素共价或非共价连接的至少一个附接部分(例如第二硫醇修饰部分)。
在缀合之前，抗体可以通过用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)进行处理而与接头试剂缀合反应。在其他的实施例中，另外的亲核基团可以通过赖氨酸与试剂(包括但不限于：2-亚胺基硫杂环戊烷(托特氏试剂(Traut’s reagent))、SATA、SATP或SAT(PEG)4)反应，使得胺转变成硫醇而引入抗体中。
关于这种缀合，半胱氨酸硫醇或赖氨酸氨基是亲核的，并且能够与接头试剂或化合物-接头中间体或药物上的亲电子基团反应形成共价键，包括：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸盐和酰基卤；(ii)烷基和苯甲基卤化物，如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团；和(iv)通过硫化物交换的二硫化物，包括吡啶基二硫化物。化合物或接头上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼甲酸酯和能够与接头部分上的亲电子基团和接头试剂反应形成共价键的芳基酰肼基团。
优选的标记试剂包括马来酰亚胺、卤代乙酰基、碘乙酰胺琥珀酰亚胺基酯、异硫氰酸盐、磺酰氯、2，6-二氯三嗪基、五氟苯基酯和亚磷酰胺，但也可以使用其他官能团。在某些实施例中，方法包括例如使用马来酰亚胺、碘代乙酰亚胺或卤代乙酰基/烷基卤化物、氮丙啶、丙烯酰基衍生物与半胱氨酸的硫醇反应以产生与化合物反应的硫醚。游离硫醇与活化的吡啶二硫化物的二硫交换也可用于产生缀合物(例如，使用5-硫-2-硝基苯甲(TNB)酸)。优选使用马来酰亚胺。
如上所述，赖氨酸也可以用作反应性残基以实现如此处所述的缀合。亲核赖氨酸残基通常通过胺反应性琥珀酰亚胺基酯来靶向。为了获得脱质子赖氨酸残基的最佳数量，水溶液的pH必须低于赖氨酸铵基团的pKa(为约10.5)，因此反应的典型pH为约8和9。缀合反应的常见试剂是通过赖氨酸酰化机理与亲核赖氨酸反应的NHS-酯。经历类似反应的其他相容性试剂包括异氰酸酯和异硫氰酸酯，其也可与本文的教导结合使用以提供ADC。一旦赖氨酸被激活，许多前述的链接基团可用于将弹头共价结合至抗体。
本领域还已知用于将化合物与苏氨酸或丝氨酸残基(优选N-末端残基)缀合的方法。例如已经描述了其中羰基前体衍生自丝氨酸或苏氨酸的1，2-氨基醇的方法，其可以通过高碘酸盐氧化作用选择性且快速地转化为醛形式。所述醛和附接于本发明蛋白质的化合物中的半胱氨酸的1，2-氨基硫醇的反应形成了稳定的噻唑烷产物。该方法对于在N-末端丝氨酸或苏氨酸残基上标记蛋白质特别有用。
在特别优选的实施例中，所述反应性硫醇基团可以通过引入一个、两个、三个、四个或更多个游离半胱氨酸残基而被引入所选择的抗体(或其片段)中(例如，制备出包含一个或多个游离的非天然半胱氨酸氨基酸残基的抗体)。如上所论述，允许缀合制剂的此类位点特异性或工程化抗体展现增强的稳定性和基本均匀性，这至少部分地归因于提供一个或多个工程化游离半胱氨酸位点和/或在此所陈述的新颖缀合程序。不同于完全或部分地还原每个链内或链间抗体二硫键以提供缀合位点的常规缀合方法(并且是与本发明完全相容的)，本发明额外地提供某些制备的游离半胱氨酸位点的选择性还原和卡奇霉素-接头这样做的引导。由工程化位点促进的缀合特异性和选择性还原允许在所希望的位置的高百分比的定点缀合。值得注意的是，这些缀合位点中的一些(例如存在于轻链恒定区的末端区域中的那些)典型难以在趋向于与其他游离半胱氨酸交叉反应时有效缀合。然而，通过分子工程和选择性还原所得的游离半胱氨酸，可以获得有效的缀合速率，其显著减少不想要的高DAR污染物和非特异性毒性。更总体而言，工程化构建体和披露的包含选择性还原的新颖缀合方法提供了具有改善的药物代谢动力学和/或药效动力学和潜在地改善的治疗指数的ADC制剂。
如上所讨论的，位点特异性构建体展示一个或多个游离半胱氨酸，其在还原时包含亲核的且能够反应以与接头部分(例如上文所披露的那些)上的亲电子基团形成共价键的硫醇基团。本发明优选的抗体将具有可还原的未配对的链间或链内半胱氨酸，即提供这种亲核基团的半胱氨酸。因此，在某些实施例中，还原的未配对半胱氨酸的游离巯基与所披露的药物-接头的末端马来酰亚胺基或卤代乙酰胺基团的反应将提供所希望的缀合。在这个情况下，抗体的游离半胱氨酸可以通过用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)进行处理而与接头试剂缀合反应。因此，每个游离半胱氨酸因此将在理论上呈现活性硫醇亲核试剂。虽然这些试剂是相容的，但是应当理解，可以使用本领域技术人员已知的不同反应、条件和试剂来实现位点特异性抗体的缀合。
另外，已经发现，可以选择性地还原工程化抗体的游离半胱氨酸以提供增强的定点缀合和不想要的潜在毒性污染物的减少。更具体地，已经发现“稳定剂”如精氨酸可以调节蛋白质中分子内和分子间相互作用，并且可以与选择的还原剂(优选相对温和的)联合使用来选择性地还原游离半胱氨酸并促进如此处所陈述的位点特异性缀合。
如本文所用，术语“选择性还原”或“选择性地还原”可以互换使用，并且意指还原一个或多个游离半胱氨酸，而基本上不破坏工程化抗体中存在的天然二硫键。在所选择的实施例中，这可以由某些还原剂实现。在其他优选实施例中，工程化构建体的选择性还原将包含与还原剂(包括温和还原剂)组合使用稳定剂。应当理解，术语“选择性缀合”意指已经选择性地还原的工程化抗体与在此所述的卡奇霉素的缀合。在这方面，这种稳定剂与选择的还原剂的组合使用可以显著改善位点特异性缀合的效率，如通过抗体重链和轻链上缀合的程度和该制剂的DAR分布测定的。
虽然不希望受任何特定理论的束缚，但是这种稳定剂可以调节静电微环境和/或调节所希望的缀合位点处的构象变化，从而允许相对温和的还原剂(其不会实质上还原完整的天然二硫键)以促进所希望的游离半胱氨酸位点处的缀合。已知此类试剂(例如某些氨基酸)形成盐桥(通过氢键和静电相互作用)，并且可以此方式调节蛋白质-蛋白质的相互作用，以赋予稳定效果，这可能导致有利的构象变化和/或可能减少不利的蛋白质-蛋白质相互作用。此外，这些试剂可以抑制还原后不希望的分子内(和分子间)半胱氨酸键的形成，从而促进所希望的缀合反应，其中工程化位点特定半胱氨酸与药物结合(优选经由接头)。由于选择性还原条件不能显著还原完整的天然二硫键，所以随后的缀合反应自然地被驱动到游离半胱氨酸上的相对较少的反应性硫醇(例如，优选每个抗体2个游离硫醇)上。如前文所暗指的，这显著地降低了如在此所陈述制造的缀合物制剂中非特异性缀合和相应杂质的水平。
在所选实施例中，与本发明相容的稳定剂通常将包含具有至少一个具碱性pKa部分的化合物。在某些实施例中，部分将包含伯胺，而在其他优选实施例中，胺部分将包含仲胺。在仍然其他的优选实施例中，胺部分将包含叔胺或胍基。在其他所选实施例中，胺部分将包含氨基酸，而在其他相容的实施例中，胺部分将包含氨基酸侧链。在又其他实施例中，胺部分将包含蛋白质氨基酸。在再其他实施例中，胺部分包含非蛋白质氨基酸。在特别优选的实施例中，相容性稳定剂可以包含精氨酸、赖氨酸、脯氨酸和半胱氨酸。此外，相容性稳定剂可以包括胍和具有碱性pKa的含氮杂环。
在某些实施例中，相容性稳定剂包含具有至少一个pKa大于约7.5的胺部分的化合物，在其他实施例中，主题胺部分将具有大于约8.0的pKa，在又其他实施例中，胺部分将具有大于约8.5的pKa，并且在再其他实施例中，稳定剂将包含具有大于约9.0的pKa的胺部分。其他优选的实施例将包含稳定剂，其中胺部分将具有大于约9.5的pKa，而某些其他实施例将包含展现至少一个pKa大于约10.0的胺部分的稳定剂。在再其他优选实施例中，稳定剂将包含具有pKa大于约10.5的胺部分的化合物，在其他实施例中，稳定剂将包含具有pKa大于约11.0的胺部分的化合物，而在再其他实施例中，稳定剂将包含pKa大于约11.5的胺部分。在又其他实施例中，稳定剂将包含具有pKa大于约12.0的胺部分的化合物，而在再其他实施例中，稳定剂将包含pKa大于约12.5的胺部分。本领域技术人员将理解，可以使用标准技术容易地计算或确定相关的pKa，并用于确定使用所选化合物作为稳定剂的适用性。
显示在与某些还原剂组合时，所披露的稳定剂在靶向缀合到游离位点特定半胱氨酸上是特别有效的。为了本发明的目的，相容性还原剂可以包括任何化合物，其产生用于缀合的还原的游离位点特定半胱氨酸，而不显著地破坏工程化抗体天然二硫键。在由选择的稳定剂和还原剂的组合提供的这种条件下，活化的卡奇霉素接头在很大程度上限于结合所希望的游离位点特定半胱氨酸位点。特别优选以相对低浓度使用的相对温和的还原剂以提供温和的条件。如在此所使用，术语“温和还原剂”或“温和还原条件”应保持为意指在一个或多个游离半胱氨酸位点提供硫醇而基本上不破坏工程化抗体中存在的天然二硫键的还原剂(任选在稳定剂存在下)引起的任何试剂或状态。也就是说，温和还原剂或条件能够有效还原一个或多个游离半胱氨酸(提供硫醇)，而不会显著破坏蛋白质的天然二硫键。所希望的还原条件可以由许多基于巯基的化合物提供，这些化合物建立了用于选择性缀合的适当环境。在优选的实施例中，温和还原剂可以包含具有一个或多个游离硫醇的化合物，而在特别优选的实施例中，温和还原剂将包含具有单个游离硫醇的化合物。与本发明相容的还原剂的非限制性实例包含谷胱甘肽、正乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、2-氨基乙烷-1-硫醇和2-羟基乙烷-1-硫醇。
应当理解，上面陈述的选择性还原方法在与游离半胱氨酸的靶向缀合上特别有效。在这方面，可以通过不同的本领域接受的技术来确定缀合到位点特异性抗体中的希望靶位点的程度(在此定义为“缀合效率”)。可以通过评估在靶缀合位点(在本发明中为轻链的c末端上的游离半胱氨酸)上相对于所有其他的缀合位点的缀合百分比，来确定药物与抗体的位点特异性缀合的效率。在某些实施例中，此处的方法提供了有效地将药物缀合到包含游离半胱氨酸的抗体上。在一些实施例中，缀合效率是至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高，如通过靶缀合相对于所有其他缀合位点的百分比所测量的。
还应当理解，能够缀合的工程化抗体可以含有游离的半胱氨酸残基，其含有当产生或储存该抗体时被封闭或封端的巯基基团。这种封端包括与巯基相互作用并防止或抑制缀合物形成的小分子、蛋白质、肽、离子和其他材料。在一些情况下，未缀合的工程化抗体可以包含在相同或不同抗体上结合其他游离半胱氨酸的游离半胱氨酸。如此处所述，这种交叉反应性在制造程序中可导致不同的污染物。在一些实施例中，工程化抗体可能在缀合反应之前需要脱封端。在具体实施例中，此处的抗体未被封端，并展示了能够缀合的游离巯基。在具体实施例中，此处的抗体经受不干扰或重排天然存在的二硫键的脱封端反应。应当理解的是，在大多数情况下，脱封端反应将在正常还原反应(还原或选择性还原)期间发生。
B.DAR分布和纯化
本发明的位点特异性抗体的缀合的优点之一是产生包含狭窄的DAR分布的相对均匀的ADC制剂的能力。就此而言，所披露的构建体和/或选择性缀合以药物和工程化抗体之间的化学计量比提供样品内的ADC物质的均匀性。如上所简单论述，术语“药物与抗体比”或“DAR”是指药物与抗体的摩尔比。在一些实施例中，缀合物制剂相对于其DAR分布基本上可以是均匀的，这意味着在该制剂内是具有相对于负荷位点(即游离半胱氨酸)也一致的特定DAR(例如，2或4的DAR)的位点特异性ADC的主要种类。在本发明的某些实施例中，可以通过使用位点特异性抗体和/或选择性还原和缀合来实现所希望的均匀性。在其他优选实施例中，可以通过使用与选择性还原组合的位点特异性构建体来实现希望的均匀性。在又其他特别优选的实施例中，可以使用分析或制备色谱技术进一步纯化制剂。在这些实施例的每一个中，可以使用本领域已知的不同技术来分析ADC样品的均匀性，包括但不限于质谱法、HPLC(例如尺寸排阻HPLC、RP-HPLC、HIC-HPLC等)或毛细管电泳。
关于ADC制剂的纯化，应当理解，可以使用标准药物制备方法来获得所希望的纯度。如此处所述，液相色谱法如反相(RP)和疏水相互作用色谱(HIC)可以通过药物负荷值分离混合物中的化合物。在某些情形中，离子交换(IEC)或混合模式色谱(MMC)也可用于分离具有特定载药量的物质。
所披露的ADC及其制剂可以包含不同化学计量摩尔比的卡奇霉素和抗体部分，这取决于抗体的构型，并且至少部分地基于用于实现缀合的方法。在某些实施例中，每个ADC负荷的卡奇霉素可以包含1-20个弹头(即n为1-20)。其他所选择的实施例可以包括具有1至15个弹头的药物负荷的ADC。在仍然其他的实施例中，ADC可以包括1-12个弹头，或者更优选地，1-10个弹头。在某些优选的实施例中，ADC将包括1到8个弹头。
虽然理论药物负荷可能相对较高，但实际的限制如游离半胱氨酸交叉反应性和弹头疏水性倾向于限制由于凝集体和其他污染物而产生包含这种DAR的均匀制剂。也就是说，较高的药物负荷，例如＞10，可能导致某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶性、毒性或细胞通透性的丧失。鉴于这些问题，本发明提供的实际药物加载量范围优选是每个缀合物1至10个药物，即其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个药物共价附接到每一抗体(例如，对于IgG1，其他抗体可能具有取决于二硫键数量的不同负荷能力)。优选地，本发明的组合物的DAR将为约2、4或6，并且在特别优选的实施例中，DAR将包含约2或4。
尽管本发明提供相对高水平的均匀性，所披露的组合物实际上包含一系列卡奇霉素化合物(1至10，在IgG1的情形中)与缀合物的混合物。因此，所披露的ADC组合物包括缀合物的混合物，其中大部分组分抗体与一个或多个卡奇霉素部分共价连接，并且(尽管具有选择性还原的缀合特异性)其中卡奇霉素可以通过不同硫醇基团附接到抗体上。也就是说，在缀合之后，本发明的ADC组合物将包含不同浓度的具有不同的卡奇霉素负荷的缀合物(例如，每一IgG1抗体1至10个药物)的混合物(连同主要由游离半胱氨酸交叉反应性引起的某些反应污染物)。使用选择性还原和制造后纯化，缀合组合物可以被驱动到其中它们大部分含有单个主要的希望的ADC种类(例如，2或4的药物负荷)和相对低水平的其他ADC种类(例如，1、3、5等的药物负荷)的位置。平均DAR值表示组合物作为整体(即，所有ADC种类一起)负荷的卡奇霉素的加权平均值。由于所采用的量化方法的固有不确定性和在商业环境中完全去除非主要的ADC种类的难度，可接受的DAR值或规格通常表示为平均值、范围或分布(即，2+/-0.5的平均DAR)。优选地，在药物环境中使用包含在该范围(即1.5至2.5)内的测量平均DAR的组合物。
因此，在某些优选实施例中，本发明将包含平均DAR为1、2、3、4、5、6、7或8+/-0.5的组合物。在其他优选实施例中，本发明将包含2、4、6或8+/-0.5的平均DAR。最后，在所选优选实施例中，本发明将包含2+/-0.5的平均DAR。应当理解，在某些优选实施例中，范围或偏差可以小于0.4。因此，在其他实施例中，这些组合物将包含1、2、3、4、5、6、7或8各自+/-0.3的平均DAR，2、4、6或8+/-0.3的平均DAR，甚至更优选2或4+/-0.3的平均DAR，或甚至2+/-0.3的平均DAR。在其他实施例中，IgG1缀合物组合物优选包含1、2、3、4、5、6、7或8各自+/-0.4的平均DAR和相对较低水平(即，小于30％)的非主要的ADC种类。在其他优选实施例中，ADC组合物将包含2、4、6或8各自+/-0.4的平均DAR与相对较低水平(＜30％)的非主要的ADC种类。在特别优选实施例中，ADC组合物将包含2+/-0.4的平均DAR与相对较低水平(＜30％)的非主要的ADC种类。在又其他的实施例中，当针对其他DAR种类测量时，主要的ADC种类(例如，2或4的DAR)将以大于65％的浓度、以大于70％的浓度、以大于75％的浓度、以大于80％的浓度、以大于85％的浓度、以大于90％的浓度、以大于93％的浓度、以大于95％的浓度或甚至以大于97％的浓度存在。
如以下实例中详述的，可以通过常规手段如UV-Vis分光光度法、反相HPLC、HIC、质谱、ELISA和电泳，来表征来自缀合反应的ADC的制剂中的卡奇霉素/抗体分布。也可以确定依据药物/抗体的ADC定量分布。通过ELISA，可以确定ADC的特定制剂中药物/抗体的平均值。然而，通过抗体-抗原结合和ELISA检测限制不能辨别药物/抗体分布。此外，用于检测抗体-药物缀合物的ELISA测定法不能确定药物部分附接到抗体(例如重链或轻链片段)或特定氨基酸残基的位置。
VIII药物制剂和治疗应用
A.配制品和给药途径
本发明的卡奇霉素ADC可以使用本领域认可的技术以不同的方法来配制。在一些实施例中，本发明的治疗性ADC组合物能以纯净的组合物施用或与最少量的额外组分一起施用，而另一些可任选地被配制为含有合适的药学上可接受的载体。如此处所用，“药学上可接受的载体”包括本领域熟知的赋形剂、运载体、佐剂和稀释剂，并且可以从用于药物制剂的商业来源获得(参见，例如，Gennaro(2003)Remington：The Science and Practice ofPharmacy with Facts and Comparisons：Drugfacts Plus，20th ed.[雷氏制药科学与实践及药物事实与比较：药物事实，(2003)，第20版]，Mack Publishing[默克出版公司]；Ansel等人(2004)Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，7th ed.，Lippencott Williams and Wilkins[药物剂型与药物传递系统，第7版，利平科特威廉姆斯与威尔金斯]；Kibbe等人(2000)Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd ed.，Pharmaceutical Press[药物赋形剂手册，第3版，医药出版社])。
合适的药学上可接受的载体包括相对惰性的物质，并且可以促进ADC的施用或者可以帮助将活性化合物加工成药学上优化用于递送至作用部位的制剂。
这些药学上可接受的载体包括可以改变制剂的形式、稠度、粘度、pH、张力、稳定性、渗量、药物代谢动力学、蛋白质聚集或溶解度的试剂，并且包括缓冲剂、润湿剂、乳化剂、稀释剂、囊封剂和皮肤渗透增强剂。载体的某些非限制性实例包括盐水、缓冲盐水、右旋糖、精氨酸、蔗糖、水、甘油、乙醇、山梨糖醇、葡聚糖、羧甲基纤维素钠及其组合。用于全身给药的ADC可以被配制用于肠、肠胃外或局部给药。事实上，可以同时使用全部三种类型的配制品来实现活性成分的全身给药。赋形剂以及供肠胃外和非肠胃外药物传递的配制品陈述于Remington，The Science and Practice of Pharmacy(2000)20th Ed.Mack Publishing[雷氏制药科学与实践(2000)第20版，默克出版公司]中。
用于肠给药的适合配制品包括硬或软明胶胶囊、丸剂、片剂(包括包衣片剂)、酏剂、悬浮液、糖浆或吸入剂及其控制释放形式。
适用于胃肠外给药(例如通过注射)的配制品包括水性或非水性、等渗、无热原的无菌液体(例如溶液、悬浮液)，其中活性成分溶解、悬浮或以其他方式提供(例如，在脂质体或其他微粒中)。这些液体可以另外地含有其他药学上可接受的载体，例如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、悬浮剂、增稠剂和使配制品与预期的受体的血液(或其他相关的体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等。用于这种配制品的合适的等渗药学上可接受的载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或乳酸林格氏注射液。
在特别优选的实施例中，本发明的配制组合物可以被冻干以提供抗体或ADC的粉末形式，然后可以在施用前将其重构。用于制备注射溶液的无菌粉末可以通过将包含所披露的抗体或ADC的溶液冻干来产生包含活性成分的粉末以及任何任选的共溶解的生物相容性成分。通常，通过将活性化合物并入无菌载体中来制备分散体或溶液，该无菌载体包含基础分散介质或溶剂(例如稀释剂)和任选地其他的生物可溶性成分。相容性的稀释剂是药学上可接受的稀释剂(对人的施用是安全和无毒的)，并且可用于制备液体制剂，例如冻干后重构的配置品。示例性的稀释剂包括无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。在替代性的实施例中，稀释剂可包括盐和/或缓冲液的水溶液。
在某些优选的实施例中，抗体或ADC将与药学上可接受的糖组合冻干。“药学上可接受的糖”是当与感兴趣的蛋白质组合时显著地防止或减少储存时蛋白质的化学和/或物理不稳定性的分子。当配制品预期冻干时，然后进行重构。如此处所用，药学上可接受的糖也可以称为“冻干保护剂”。糖和它们相应的糖醇包括氨基酸，例如谷氨酸一钠或组氨酸；甲胺，例如甜菜碱；易溶盐，例如硫酸镁；多元醇，例如三元或更高分子量的糖醇，例如，甘油、葡聚糖、赤藓糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇、以及甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；以及其组合。另外的示例性的冻干保护剂包括甘油和明胶、以及糖类蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水苏糖。还原糖的实例包括葡萄糖、麦芽糖、乳糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖和乳果糖。非还原糖的实例包括选自糖醇和其他直链多元醇的多羟基化合物的非还原性糖苷。优选的糖醇是单糖苷，特别是通过还原二糖如乳糖、麦芽糖、半乳糖苷果糖和麦芽酮糖而获得的那些化合物。糖苷侧基可以是糖苷的或半乳糖苷的。糖醇的另外的实例是葡糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇和异麦芽酮糖。优选的药学上可接受的糖是非还原性糖海藻糖或蔗糖。将药学上可接受的糖以“保护量”(例如预冻干)添加到配制品中，这意味着蛋白质在储存期间(例如，在重构和储存之后)基本上保持了其物理和化学的稳定性和完整性。
本领域技术人员将理解，可以将相容性冻干保护剂添加到液体或冻干配制品中，浓度范围为约1mM至约1000mM、约25mM至约750mM、约50mM至约500mM、约100mM至约300mM、约125mM至约250mM、约150mM至约200mM或约165mM至约185mM。在某些实施例中，可添加一种或多种冻干保护剂以提供约10mM、约25mM、约50mM、约75mM、约100mM、约125mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约165mM、约170mM、约175mM、约180mM、约185mM、约190mM、约200mM、约225mM、约250mM、约300mM、约400mM、约500mM、约600mM、约700mM、约800mM、约900mM、或约1000mM的浓度。在某些优选的实施例中，一种或多种冻干保护剂可以包含药学上可接受的糖。在特别优选的方面，药学上可接受的糖将包含海藻糖或蔗糖。
在其他所选择的实施例中，本发明的液体和冻干配制品可以包含某些化合物，其包括氨基酸或其药学上可接受的盐，以用作稳定剂或缓冲剂。这样的化合物能以从约1mM到约100mM、从约5mM到约75mM、从约5mM到约50mM、从约10mM到约30mM或从约15mM到约25mM的范围的浓度添加。在某些实施例中，可以添加一种或多种缓冲剂以提供约1mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM或约100mM的浓度。在其他所选择的实施例中，可以添加缓冲剂以提供约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM或约100mM的浓度。在某些优选的实施例中，缓冲剂将包含组氨酸盐酸化物。
在仍然其他的所选择的实施例中，本发明的液体和冻干配制品可以包含非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80作为稳定剂。这样的化合物能以从约0.1mg/ml至约2.0mg/ml、从约0.1mg/ml至约1.0mg/ml、从约0.2mg/ml至约0.8mg/ml、从约0.2mg/ml至约0.6mg/ml或从约0.3mg/ml至约0.5mg/ml的范围的浓度添加。在某些实施例中，可以添加表面活性剂以提供约0.1mg/ml、约0.2mg/ml、约0.3mg/ml、约0.4mg/ml、约0.5mg/ml、约0.6mg/ml、约0.7mg/ml、约0.8mg/ml、约0.9mg/ml或约1.0mg/ml的浓度。在其他所选择的实施例中，可以添加表面活性剂以提供约1.1mg/ml、约1.2mg/ml、约1.3mg/ml、约1.4mg/ml、约1.5mg/ml、约1.6mg/ml、约1.7mg/ml、约1.8mg/ml、约1.9mg/ml或约2.0mg/ml的浓度。在某些优选的实施例中，表面活性剂将包含聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯40。
无论是从冻干粉末还是天然溶液中重构，用于肠胃外给药的所披露的抗体或ADC相容性配制品(例如静脉注射)可以包含从约10μg/mL至约100mg/mL的ADC或抗体浓度。在某些所选择的实施例中，抗体或ADC的浓度将包含20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300、μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL或1mg/mL。在其他的实施例中，ADC浓度将包含2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、14mg/mL、16mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL或100mg/mL。
在任何情况下，将会理解的是，本发明的化合物和组合物可以通过不同途径在体内给予有需要的受试者，包括但不限于，口服、静脉内、动脉内、皮下、肠胃外、鼻内、肌肉内、心脏内、室内、气管内、口腔、直肠、腹膜内、皮内、局部、透皮及胸内，或以其他方式通过植入或吸入给予。主题组合物可以被配制成呈固体、半固体、液体或气态形式的制剂；包括但不限于，片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、油膏、溶液、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂及气雾剂。适合的配制品和给药途径可以根据预定的应用和治疗方案选择。
B.剂量
特定的剂量方案，即，剂量、时程及重复，将取决于特定的个体，以及经验考虑，如药物代谢动力学(例如半衰期、清除率等)。给药频率的确定可以由本领域的技术人员(如主治医师)基于以下考虑来作出：所治疗的病症和所治疗的病症的严重程度、所治疗的受试者的年龄、一般健康状态等。可以根据所选择的组合物和给药方案的疗效评估，在治疗过程中调整给药频率。这种评估可以根据特定疾病、病症或病症的标志物做出。在个体患有癌症的实施例中，这些包括经由触诊或目测观察来直接测量肿瘤大小、通过x射线或其他成像技术来间接测量肿瘤大小；如通过直接肿瘤活检和肿瘤样品的显微镜检查所评估的改善；根据在此描述的方法间接肿瘤标记物(例如，对于前列腺癌的PSA)或鉴别的抗原的测量；增生细胞或肿瘤发生细胞的数量的减少、此类赘生性细胞的减少的维持；此类赘生性细胞的增生的减少；或转移发生的减缓。
本发明的卡奇霉素ADC可以在不同范围内给予。这些包括约5μg/kg体重至约100mg/kg体重/剂量；约50μg/kg体重至约5mg/kg体重/剂量；约100μg/kg体重至约10mg/kg体重/剂量。其他范围包括每剂每千克体重约100μg到每千克体重约20mg，和每剂每千克体重约0.5mg到每千克体重约20mg。在某些实施例中，该剂量为每千克体重至少约100μg、每千克体重至少约250μg、每千克体重至少约750μg、每千克体重至少约3mg、每千克体重至少约5mg、每千克体重至少约10mg。
在所选实施例中，这些ADC将以每剂每千克体重约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μg给予(优选静脉注射)。其他实施例可包含以约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000μg/kg体重/剂量给予ADC。在其他优选实施例中，所披露的缀合物将以2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.7、8、9或10mg/kg给予。在再其他实施例中，这些缀合物可以按每剂每千克体重12、14、16、18或20mg给予。在又其他实施例中，这些缀合物将以每剂每千克体重25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90或100mg给予。根据此处的教导，本领域的普通技术人员可以基于特定靶标、临床前动物研究、临床观察结果以及标准医疗和生物化学技术及测量容易地确定ADC的适当剂量。
其他给药方案可以根据体表面积(BSA)计算值判定，如U.S.P.N.7,744,877中所披露。如众所周知的，BSA是使用患者的身高和体重进行计算并且提供了如通过他或他的体表面积所表示的受试者的体格的量度。在某些实施例中，这些缀合物可以按从1mg/m2到800mg/m2、从50mg/m2到500mg/m2的剂量并且按100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2或450mg/m2的剂量给予。还应理解的是，可以使用本领域认可的并且凭经验的技术来确定适当剂量。
所披露的ADC能以特定的时间安排进行施用。总体而言，给予受试者一次或多次有效剂量的卡奇霉素缀合物。更具体地说，所披露的ADC的有效剂量施用为每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或至少每月一次。在某些实施例中，所选择的ADC的有效剂量可以施用多次，包括持续至少一个月、至少六个月、至少一年、至少两年的时间或若干年的时间。在又其他实施例中，所披露的抗体或ADC的给药之间可以间隔若干天(2、3、4、5、6或7)、若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)或若干月(1、2、3、4、5、6、7或8)，或甚至一年或若干年。
在某些优选实施例中，涉及缀合抗体的治疗过程将包含在一段数周或数月时间内多剂所选药品。更具体地说，本发明的抗体或ADC可以每天、每两天、每四天、每周、每十天、每两周、每三周、每个月、每六周、每两个月、每十周或每三个月一次给与。就这一点来说，应理解的是，基于患者反应和临床实践，这些剂量可以变化或该时间间隔可以调整。
对用于已经提供一次或多次给药的个体中所披露的治疗性组合物的剂量和方案也可以凭经验确定。举例来说，可以给个体递增剂量的如在此所描述制造的治疗性组合物。在所选实施例中，对应地基于凭经验确定或观察的副作用或毒性，可以使该剂量逐渐增加或减少或衰减。为了评估所选组合物的功效，可以如先前所描述，跟踪特定疾病、病症或病状的标记物。对于癌症，这些包括经由触诊或目测观察来直接测量肿瘤大小、通过x射线或其他成像技术来间接测量肿瘤大小；如通过直接肿瘤活检和肿瘤样品的显微镜检查所评估的改善；间接肿瘤标记物(例如，对于前列腺癌的PSA)根据在此描述的方法鉴定的肿瘤发生抗原的测量；疼痛或麻痹的减少；言语、视力、呼吸或与肿瘤相关的其他能力丧失的改善；食欲增加；或如通过公认的测试所测量的生活质量增加或存活期延长。本领域的普通技术人员应显而易见的是，该剂量将取决于个体、赘生性病状的类型、赘生性病状的阶段、该赘生性病状是否已经开始转移到个体中的其他位置以及过去和当前所使用的治疗而变化。
C.联合治疗
联合治疗可以特别适用于减少或抑制不想要的赘生性细胞增殖，减少癌症的发生，减少或预防癌症的复发，或者减少或预防癌症的扩散或转移。在这些情形中，本发明的抗体或ADC可以通过去除CSC而充当敏化剂或化学敏化剂，这些试剂将以其他方式支持并且维持肿块并借此允许更有效地使用当前的医疗标准减瘤剂或抗癌剂。也就是说，在某些实施例中，所披露的抗体或ADC可以提供一种增强的作用(例如，加和性或协同性)，由此加强了另一种给与的治疗剂的作用模式。在本发明的上下文中，“联合治疗”应当在广义上解释并且仅仅是指一种卡奇霉素抗体或ADC和一种或多种抗癌剂的给与，这些抗癌剂包括但不限于，细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减瘤剂、化学治疗剂、放射疗法及放射治疗剂、靶向性抗癌剂(包括单克隆抗体和小分子实体)、BRM、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、放射疗法以及抗转移剂和免疫治疗剂，包括特异性和非特异性方法。
这些组合的结果无需为当分开地进行每种治疗(例如卡奇霉素ADC和抗癌剂)时所观察的作用的加和。尽管至少加和作用一般是所希望的，但超出单一疗法之一的任何增加的抗肿瘤作用都是有益的。另外，本发明不需要联合治疗以展现出协同作用。然而，本领域的普通技术人员应理解，在包含优选实施例的某些所选组合情况下，可以观察到协同作用。
因此，在某些方面，在(i)单独使用了ADC，或(ii)单独使用了治疗性部分，或(iii)使用了治疗部分与另一个治疗部分组合而不添加ADC后，联合治疗具有治疗协同作用或改善了癌症治疗中可测量的治疗效果。如此处所用的术语“治疗协同作用”是指ADC与一种或多种治疗部分的组合，其具有大于ADC和一种或多种治疗部分的组合的加和作用的治疗效果。
通过与对照或基线测量的比较来量化所披露的组合的期望结果。如此处所使用的，诸如“改进”、“增加”或“减少”的相关术语表示相对于对照的值，例如在此处所述的治疗开始之前的同一个个体的测量值，或一个对照个体(或多个对照个体)在不存在此处所述的所披露的ADC但存在其他一种或多种治疗部分(例如标准护理治疗)的情况下的测量值。代表性的对照个体是患有与被治疗的个体相同形式的癌症的个体，其与被治疗的个体有大约相同的年龄(以确保被治疗个体和对照个体的疾病阶段是可比较的)。
对应于治疗的改变或改善通常具有统计学意义。如此处所用，术语“显著性”或“显著的”涉及在两个或更多个个体间非随机相关概率的统计学分析。为了确定一种联系是否“显著”或具有“显著性”，可以计算“p值”。低于使用者定义的临界点的那些P-值被认为是显著的。小于或等于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005、或小于0.001的p值可以被认为是显著的。
协同治疗效果可以高于由单一治疗部分或卡奇霉素ADC引起的治疗效果、或由ADC或给定组合的一个或多个的单一治疗部分引起的治疗效果的总和至少约两倍的效果，或高于至少约五倍，或高于至少约十倍，或高于至少约二十倍，或高于至少约五十倍，或高于至少约百倍。与单一治疗部分或ADC引起的治疗效果或ADC或给定组合的一个或多个单一治疗部分引起的治疗效果的总和相比，可以观察到协同治疗效果增加了至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或更高。协同效果也是当它们组合使用时允许治疗剂减量给药的一种效果。
在实行联合治疗时，可以向受试者以单一组合物形式或以两种或更多种相异的组合物形式使用相同或不同给药途径同时地施用卡奇霉素ADC和一种或多种治疗部分。可替代地，ADC的治疗可以在治疗部分治疗之前或之后以例如从数分钟到数周范围内的时间间隔进行。在一个实施例中，治疗部分与ADC是在彼此间隔约5分钟到约两周内施用。在又其他实施例中，该ADC与该治疗部分的给药之间可以间隔若干天(2、3、4、5、6或7)、若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)或若干月(1、2、3、4、5、6、7或8)。
可以施用联合治疗直到病情得到治疗、缓解或治愈为止，以不同的时间安排进行，例如，每日一次、两次或三次，每两天一次，每三天一次，每周一次，每两周一次，每月一次，每两个月一次，每三个月一次，每六个月一次，或者可以不间断地施用。所选择的ADC和治疗部分可以在隔日或几周内施用；或者可以给出一系列的ADC治疗，随后用另外的治疗部分进行一次或多次治疗。在一个实施例中，ADC与一个或多个治疗部分组合在短治疗周期施用。在其他的实施例中，联合治疗被施用于长治疗周期。该联合治疗可以经由任何途径给与。
在一些实施例中，卡奇霉素ADC可以与各种一线癌症治疗组合使用。在一个实施例中，联合治疗包括使用ADC和细胞毒剂，例如异环磷酰胺、丝裂霉素C、长春地辛、长春碱、依托泊苷、伊立替康、吉西他滨、紫杉烷类、长春瑞宾、甲氨蝶呤和培美曲塞和任选的一种或多种其他治疗部分。
在另一个实施例中，联合治疗包括使用ADC和基于铂的药物(例如卡铂或顺铂)和任选的一种或多种其他治疗部分(例如长春瑞宾、吉西他滨、紫杉烷类，例如多西他赛或紫杉醇、伊立替康、或培美曲塞)。
在所选择的实施例中，本发明的化合物和组合物可与检查点抑制剂如PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂联合使用。PD-1及其配体PD-L1是抗肿瘤T淋巴细胞反应的负调节物。在一个实施例中，联合治疗可以包含与抗PD-1抗体(例如，派姆单抗、纳武单抗、皮立珠单抗(pidilizumab))以及任选的一种或多种其他的治疗部分一起的卡奇霉素ADC的施用。在另一个实施例中，联合治疗可以包含与抗PD-1抗体(例如，avelumab、atezolizumab、durvalumab)以及任选的一种或多种其他的治疗部分一起的卡奇霉素ADC的施用。在仍然另一个实施例中，联合治疗可以包括向使用检查点抑制剂和/或靶向BRAF联合治疗(例如威罗菲尼或达拉菲尼)治疗后继续发展的患者施用卡奇霉素ADC与抗PD-1抗体或进行卡奇霉素ADC与抗PD-L1的施用。
在一个实施例中，例如，在BR-ERPR、BR-ER或BR-PR癌症的治疗中，联合治疗包括使用ADC和描述为“激素疗法”的一种或多种治疗部分。如此处所使用的“激素疗法”是指例如它莫西芬、促性腺激素或黄体化释放激素(GnRH或LHRH)、依维莫司和依西美坦、托瑞米芬、或芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、依西美坦或氟维司群)。
在另一个实施例中，例如，在BR-HER2的治疗中，联合治疗包括使用ADC和曲妥珠单抗或阿多-曲妥珠单抗恩他新以及任选的一种或多种其他的治疗部分(例如帕妥珠单抗和/或多西紫杉醇)。
在一些实施例中，例如，在转移性乳腺癌的治疗中，联合治疗包括使用所披露的ADC和紫杉烷(例如多西紫杉醇或紫杉醇)和任选的一种或多种另外的治疗部分(例如蒽环类抗生素例如阿霉素或表阿霉素)和/或艾日布林。
在另一个实施例中，例如，在转移性或复发性乳腺癌或BRCA-突变型乳腺癌的治疗中，联合治疗包括使用所披露的ADC和甲地孕酮以及任选的一种或多种另外的治疗部分。
在另外的实施例中，例如，在BR-TNBC的治疗中，联合治疗包括使用卡奇霉素ADC和多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂(例如BMN-673、奥拉帕尼、瑞卡帕布(rucaparib)和维利帕尼(veliparib))和任选的一种或多种另外的治疗部分。
在另一个实施例中，例如，在乳腺癌的治疗中，联合治疗包括使用所披露的ADC和环磷酰胺以及任选的一种或多种另外的治疗部分(例如阿霉素、紫杉烷、表阿霉素、5-FU和/或甲氨蝶呤)。
在另一个实施例中，用于治疗EGFR阳性NSCLC的联合治疗包括使用所披露的ADC和阿法替尼以及任选的一种或多种其他的治疗部分(例如埃罗替尼和/或贝伐单抗)。
在另一个实施例中，用于治疗EGFR阳性NSCLC的联合治疗包括使用ADC和埃罗替尼以及任选的一种或多种其他的治疗部分(例如贝伐单抗)。
在另一个实施例中，用于治疗ALK阳性NSCLC的联合治疗包括使用ADC和色瑞替尼以及任选的一种或多种其他的治疗部分。
在另一个实施例中，用于治疗ALK阳性NSCLC的联合治疗包括使用ADC和克唑替尼(crizotinib)以及任选的一种或多种其他的治疗部分。
在另一个实施例中，联合治疗包括使用ADC和贝伐单抗和任选的一种或多种其他的治疗部分(例如紫杉烷，例如像多西紫杉醇或紫杉醇，和/或铂类似物)。
在另一个实施例中，联合治疗包括使用ADC和贝伐单抗和任选的一种或多种其他的治疗部分(例如，吉西他滨和/或铂类似物)。
在具体的实施例中，用于治疗铂抗性肿瘤的联合治疗包括使用ADC和阿霉素和/或依托泊苷和/或吉西他滨和/或长春瑞宾和/或依弗酰胺和/或甲酰四氢叶酸调节的5-氟尿嘧啶(fluoroucil)和/或贝伐单抗和/或它莫西芬、和任选的一种或多种其他的治疗部分。
在另一个实施例中，联合治疗包括使用ADC和PARP抑制剂以及任选的一种或多种其他的治疗部分。
在另一个实施例中，联合治疗包括使用ADC和贝伐单抗和任选的环磷酰胺。
联合治疗可以包括对包含突变或异常表达的基因或蛋白质(例如BRCA1)的肿瘤有效的ADC和化学疗法的部分。
T淋巴细胞(例如，细胞毒性淋巴细胞(CTL))在宿主防御恶性肿瘤中起重要作用。通过在抗原递呈细胞上呈递肿瘤相关抗原来激活CTL。活性特异性免疫疗法是一种可用于通过用衍生自已知癌症相关抗原的肽接种患者来增加对癌症的T淋巴细胞反应的方法。在一个实施例中，联合治疗可以包含ADC和癌症相关抗原的疫苗(例如黑素细胞谱系特异性抗原酪氨酸酶、gp100、黑素细胞-A/MART-1或gp75)。在其他的实施例中，联合治疗可以包括施用ADC，以及自体CTL或天然杀死细胞的体外扩增、活化和过继性再引入。也可以通过抗原递呈细胞增强肿瘤抗原呈递的策略来促进CTL的活化。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)促进树突细胞的募集和树突细胞交叉敏化的活化。在一个实施例中，联合治疗可以包括抗原递呈细胞的分离、用刺激性细胞因子(例如GM-CSF)活化这些细胞、用肿瘤相关抗原引发、然后将抗原递呈细胞过继性再引入患者中(联合使用所披露的ADC和任选的一种或多种不同的治疗部分)。
在其他的实施例中，本发明的ADC可以与下述一种或多种抗癌剂组合使用。
如此处所使用的术语“抗癌剂”或“化学治疗剂”是“治疗性部分”的一个子集，“治疗性部分”进而是被描述为“药学活性部分”的药剂的一个子集。更具体地，“抗癌剂”意指可以用于治疗细胞增生性病症(如癌症)的任何药剂，并且包括但不限于，细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减瘤剂、化学治疗剂、放射疗法及放射治疗剂、靶向性抗癌剂、生物学反应修饰剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、抗转移剂和免疫治疗剂。应理解的是，在所选实施例中，如以上所论述，这些抗癌剂可以包含抗体药物缀合物并且可以在给药之前与抗体缔合。在某些实施例中，所得抗癌剂ADC可以与如此处所披露的本发明的ADC组合使用。
术语“细胞毒剂”(其可以是一种抗癌剂)意指对细胞有毒并且降低或抑制细胞功能和/或引起细胞破坏的一种物质。典型地，该物质是一种衍生自活生物体的天然存在的分子(或一种合成制备的天然产物)。细胞毒性剂的实例包括但不限于，以下各项的小分子毒素或酶活性毒素：细菌(例如白喉毒素、绿脓杆菌内毒素和外毒素、葡萄球菌肠毒素A)、真菌(例如，α-帚曲菌素、局限曲菌素)、植物(例如，相思豆毒素、篦麻毒素、葫莲根毒蛋白、槲寄生素、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草毒素、苦瓜毒素、天花粉毒素、大麦毒素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、米特格林(mitegellin)、局限曲菌素、酚霉素、新霉素及单端孢霉烯族毒素)或动物(例如，细胞毒性RNA酶，如细胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段和/或变体)。
抗癌剂可以包括抑制或设计成抑制癌细胞或可能变为癌细胞或产生肿瘤发生子代(例如肿瘤发生细胞)的细胞的任何化学试剂。这些化学试剂经常针对细胞生长或分裂必需的细胞内过程，并且因此针对一般迅速生长并且分裂的细胞特别有效。举例来说，长春新碱使微管蛋白解聚合，并由此抑制细胞进入有丝分裂。这些试剂例如在CHOP方案中经常组合施用并且经常是最有效的。又，在所选实施例中，这些抗癌症药剂可以缀合到所披露的抗体。
可以与本发明的卡奇霉素ADC组合使用的抗癌剂的实例包括但不限于：烷化剂、烷基磺酸酯、阿那曲唑、鹅膏菌素、氮丙啶、乙烯亚胺及甲基三聚氰胺、多聚乙酰、喜树碱、BEZ-235、硼替佐米、苔藓抑素、海绵他汀、CC-1065、色瑞替尼、克唑替尼、念珠藻环肽、海兔毒素、倍癌霉素、艾榴塞洛素、埃罗替尼、水鬼蕉碱、萨克丁特(sarcodictyin)、海绵素、氮芥、抗生素、烯二炔达内霉素(dynemicin)、双膦酸酯、埃斯波霉素、色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、坎磷酰胺坎磷酰胺、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡拉比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、环磷酰胺、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、依西美坦、氟尿嘧啶、氟维司群、吉非替尼、伊达比星、拉帕替尼、来曲唑、洛那法尼、马塞罗霉素、醋酸甲地孕酮、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、帕唑帕尼、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、雷帕霉素、罗多比星、索拉非尼、链黑霉素、链佐星、三苯氧胺、枸橼酸他莫昔芬、替莫唑胺、tepodina、替吡法尼、杀结核菌素、乌苯美司、凡德他尼、伏氯唑、XL-147、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗肾上腺素、叶酸补充剂(如甲酰四氢叶酸)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、贝斯特布斯(bestrabucil)、比生群、伊达曲沙、地磷酰胺、秋水仙胺、地吖醌、依氟鸟氨酸、依利醋铵、艾普塞隆、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、罗尼达宁(lonidainine)、类美登醇、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、尼曲瑞林(nitraerine)、喷司他丁、蛋氨氮芥、比柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸2-乙肼、丙卡巴肼、多糖复合物、雷佐生；根霉素；SF-1126、西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2＇，2＂-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素(T-2毒素、疣孢菌素A、漆斑菌素A及蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；盖克托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷、苯丁酸氮芥；吉西他宾；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲胺蝶呤；铂类似物、长春花碱；铂；依托泊苷；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；西罗达；伊班膦酸盐；伊立替康、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸；视黄醇；卡培他滨；康普瑞汀；亚叶酸；奥沙利铂；XL 518；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR及VEGF-A的抑制剂，这些抑制剂减少细胞增生；及以上任一项的药学上可接受的盐或溶剂合物、酸或衍生物。这一定义中还包括用于调控或抑制对于肿瘤的激素作用的抗激素剂，如抗雌激素和选择性雌激素受体抗体，抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂，这些抑制剂调控肾上腺中雌激素的产生，及抗雄激素；以及曲沙他滨(1，3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、核糖酶，如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗，rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；长春瑞宾和埃斯波霉素，及以上任一项的药学上可接受的盐或溶剂合物、酸或衍生物。
特别优选的抗癌剂包含商业上或临床上可用的化合物，例如埃罗替尼(基因技术公司(Genentech)/OSI制药公司(OSI Pharm.))、多西他赛(赛诺菲-安万特(Sanofi-Aventis))、5-FU(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，CAS号51-21-8)、吉西他滨(礼来公司(Lilly))、PD-0325901(CAS号391210-10-9，辉瑞公司)、顺铂(顺式二胺，二氯铂(II)、CAS号15663-27-1)、卡铂(CAS号41575-94-4)、紫杉醇(百时美施贵宝肿瘤学(Bristol-Myers Squibb Oncology)、新泽西州普林斯顿)、曲妥珠单抗(基因技术公司)、替莫唑胺(4-甲基-5-氧代2，3，4，6，8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2，7，9-三烯9-甲酰胺，CAS号85622-93-1，先灵葆雅公司(Schering Plough))、他莫昔芬((Z)-2-[4-(1，2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N，N-二甲基乙胺， )和多柔比星另外的商业上或临床上可用的抗癌剂包含奥沙利铂(赛诺菲公司(Sanofi))、硼替佐米(千禧制药公司(Millennium Pharm.))、索坦(sutent)(SU11248，辉瑞公司)、来曲唑(诺华公司(Novartis))、甲磺酸伊马替尼(诺华公司)、XL-518(Mek抑制剂，Exelixis，WO 2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制剂，AZD6244，数组生物制药公司(Array BioPharma)，阿斯利康公司)、SF-1126(PI3K抑制剂，萨马福尔制药公司(Semafore Pharmaceuticals))、BEZ-235(PI3K抑制剂，诺华公司)、XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis)、PTK787/ZK 222584(诺华公司)、氟维司群(阿斯利康公司)、亚叶酸(醛叶酸)、雷帕霉素(西罗莫司，惠氏公司)、拉帕替尼(GSK572016，葛兰素史克公司(Glaxo Smith Kline))、氯那法尼(lonafarnib)(SARASARTM，SCH 66336，先灵葆雅公司)、索拉非尼(BAY43-9006，拜耳实验室)、吉非替尼(阿斯利康公司)、伊立替康(CPT-11，辉瑞公司)、替吡法尼(ZARNESTRATM，强生公司(Johnson&Johnson))、ABRAXANETM(不含克列莫佛)、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒配制品(美国制药合作伙伴(American Pharmaceutical Partners)，伊利诺伊绍姆堡(Schaumberg，II))、凡德他尼(rINN，ZD6474，阿斯利康公司)、氯醌、AG1478、AG1571(SU 5271；苏根公司(Sugen))、替西罗莫司(惠氏公司)、帕唑帕尼(葛兰素史克公司)、坎磷酰胺(泰力克公司(Telik))、噻替派和环磷酰胺长春瑞滨卡培他滨(罗氏公司)、他莫昔芬(包括柠檬酸他莫昔芬)、(柠檬酸托他米芬)、(醋酸甲地孕酮)、(依西美坦，辉瑞公司)、甲霜灵、法多唑、(伏氯唑(vorozole))、(来曲唑；诺华公司)和(阿那曲唑；阿斯利康公司)。
在其他实施例中，本发明的ADC可以与目前临床试验中或可商购的多种抗体(或免疫治疗剂)中的任一种组合使用。所披露的抗体可以与选自下组的抗体组合使用，该组由以下各项组成：阿巴伏单抗、阿德木单抗、阿夫土珠单抗、阿仑单抗、阿妥莫单抗、阿托昔单抗、马安那莫单抗、阿西莫单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝伐单抗、比伐珠单抗、比纳托单抗、布妥昔单抗、坎妥珠单抗、卡妥索单抗、西妥昔单抗、西他珠单抗、西妥木单抗、利伐珠单抗(clivatuzumab)、坎妥木单抗(conatumumab)、达妥木单抗(daratumumab)、曲兹妥单抗(drozitumab)、杜利妥单抗(duligotumab)、杜昔妥单抗(dusigitumab)、地莫单抗、达西珠单抗、多妥珠单抗(dalotuzumab)、依美昔单抗、艾妥珠单抗(elotuzumab)、恩脱昔单抗(ensituximab)、厄妥索单抗、达珠单抗、法妥珠单抗(farletuzumab)、拉妥珠单抗(ficlatuzumab)、费妥木单抗(figitumumab)、法伏妥单抗(flanvotumab)、弗妥昔单抗(futuximab)、加尼妥单抗(ganitumab)、吉妥珠单抗、吉瑞昔单抗、来巴妥单抗(glembatumumab)、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、麦妥珠单抗(imgatuzumab)、印妥昔单抗(indatuximab)、伊珠单抗、英妥木单抗、伊匹单抗、伊妥木单抗、拉贝珠单抗、拉立珠单抗(Lambrolizumab)、来沙木单抗、林妥珠单抗、洛伐珠单抗(lorvotuzumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、曼妥木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗、米妥珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫妥木单抗(moxetumomab)、那妥单抗(narnatumab)、那莫单抗、尼妥木单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗、纳武单抗、诺莫单抗(nofetumomabn)、阿托珠单抗、卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥法木单抗、奥拉妥单抗(olaratumab)、奥拉帕尼、昂妥珠单抗(onartuzumab)、奥妥珠单抗(oportuzumab)、瑞戈伏单抗(oregovomab)、盘尼图单抗、帕图珠单抗(parsatuzumab)、帕托单抗(patritumab)、盘图莫单抗(pemtumomab)、帕妥珠单抗、皮立珠单抗(pidilizumab)、平妥单抗、普托木单抗、拉妥木单抗(racotumomab)、拉图单抗(radretumab)、雷莫芦单抗、利妥木单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗、罗妥木单抗、沙妥莫单抗、司美替尼、昔洛珠单抗、司妥昔单抗、司妥佐单抗(simtuzumab)、索利图单抗(solitomab)、他妥珠单抗(tacatuzumab)、他妥莫单抗(taplitumomab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替普莫单抗(teprotumumab)、加珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、托卡珠单抗(tucotuzumab)、乌妥昔单抗(ublituximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、沃妥珠单抗(vorsetuzumab)、沃图莫单抗(votumumab)、扎鲁木单抗、CC49、3F8、MDX-1105和MEDI4736及其组合。
其他特别优选的实施例包含被批准用于癌症疗法的抗体的使用，包括但不限于，利妥昔单抗、吉妥单抗、阿仑单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、盘尼图单抗、奥法木单抗、伊匹单抗及布妥昔单抗。本领域的普通技术人员将能够容易地鉴别与在此的传授内容可相容的另外的抗癌剂。
D.放射疗法
本发明还提供了ADC与放射疗法(即，用于在肿瘤细胞内诱导DNA损伤的任何机制，如γ照射、X射线、UV照射、微波、电子发射等)的组合。还涵盖了使用放射性同位素向肿瘤细胞的定向传递的联合治疗，并且该披露的ADC可以与靶向性抗癌剂或其他靶向手段联合使用。典型地，放射疗法是以脉冲方式经一段从约1到约2周的时间给与。该放射疗法可以给与患有头颈癌的受试者，持续约6到7周。任选地，该放射疗法可以按单次剂量或按多次连续剂量给与。
IX适应症
本发明提供了本发明的ADC用于诊断、治疗和/或预防各种疾病，包括肿瘤、炎症、血管原性的和免疫学的疾病和由病原体引起的疾病的用途。明确地说，供治疗的关键靶是赘生性病状(包含实体瘤)，不过血液系统恶性肿瘤在本发明的范围内。在某些实施例中，本发明的ADC将用于治疗表达特定决定簇(例如SEZ6)的肿瘤或肿瘤发生细胞。优选地，有待治疗的“受试者”或“患者”将为人类，不过如在此所使用，这些术语明确地被视作包含任何哺乳动物物种。
应当理解的是，本发明的化合物和组合物可以用于治疗疾病的各个阶段和在其治疗周期中的不同点上的受试者。相应地，在某些实施例中，本发明的抗体和ADC将用作前线治疗，并施用于以前未接受过癌性病症治疗的受试者。在其他实施例中，本发明的抗体和ADC将用于治疗第二和第三线患者(即，先前已经分别针对相同病症进行一次或两次治疗的那些受试者)。仍然其他的实施例包括对已经用披露的ADC或用不同的治疗剂治疗相同或相关病症三次或更多次的第四线或更高线的患者(例如SCLC患者)进行治疗。在其他的实施例中，本发明的化合物和组合物将用于治疗先前已经接受治疗(用本发明的抗体或ADC或用其他的抗癌剂)并且复发或被确定为对于以前的治疗属于难医治的受试者。在所选择的实施例中，本发明的化合物和组合物可用于治疗具有复发性瘤的受试者。
在某些方面中，该增生性病症将包含实体瘤，包括但不限于，肾上腺肿瘤、肝肿瘤、肾肿瘤、膀胱肿瘤、乳房肿瘤、胃肿瘤、卵巢肿瘤、子宫颈肿瘤、子宫肿瘤、食道肿瘤、结肠直肠肿瘤、前列腺肿瘤、胰腺肿瘤、肺(小细胞和非小细胞)肿瘤、甲状腺肿瘤、癌瘤、肉瘤、成胶质细胞瘤及多种头颈肿瘤。在其他优选实施例中，并且如以下实例中所示，所披露的ADC在治疗小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)(例如鳞状细胞非小细胞肺癌或鳞状细胞小细胞肺癌)方面尤其有效。在某些实施例中，肺癌是难治性、复发性或对基于铂的药剂(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂、拓扑替康)和/或紫杉烷(例如多西他赛、太平洋紫杉醇、洛他赛或卡巴他赛)具有抗性的。在另一个实施例中，待治疗的受试者患有大细胞神经内分泌癌(LCNEC)。在本发明的仍然其他的方面，所披露的抗体和ADC可用于治疗髓样甲状腺癌、成神经胶质细胞瘤、神经内分泌前列腺癌(NEPC)、高分级胃肠胰腺癌(GEP)和恶性黑素瘤。
更普遍地说，经历根据本发明的治疗的示例性赘生性病状可以是良性的或恶性的；是实体瘤或其他的血液肿瘤；并且可以选自下组，该组包括但不限于，肾上腺肿瘤、AIDS相关癌症、蜂窝状软部肉瘤、星形细胞源性肿瘤、自主神经节肿瘤、膀胱癌(鳞状细胞癌瘤和移行细胞癌瘤)、囊胚腔病症、骨癌(釉质上皮瘤、动脉瘤状骨囊肿、骨软骨瘤、骨肉瘤)、脑和脊髓癌、转移性脑肿瘤、乳癌、颈动脉体瘤、子宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、肾嫌色细胞癌瘤、肾透明细胞癌瘤、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维性组织细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、室管膜瘤、上皮细胞病变、尤文氏肿瘤(Ewing＇s tumor)、骨外黏液样软骨肉瘤、骨纤维生成不良、骨纤维异常增殖症、胆囊和胆管癌、胃癌(gastric cancer)、胃肠病变、妊娠滋养细胞病、生殖细胞肿瘤、腺体病变、头颈癌、下丘脑癌、肠癌、胰岛细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi＇s Sarcoma)、肾癌(肾母细胞瘤、乳头状肾细胞癌瘤)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪性肿瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪性肿瘤、肝癌(肝母细胞瘤、肝细胞癌瘤)、淋巴瘤、肺癌(小细胞癌瘤、腺癌、鳞状细胞癌瘤、大细胞癌瘤等)、巨噬细胞病症、髓母细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌瘤、甲状旁腺肿瘤、儿科癌症、周围神经鞘膜瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑素瘤(posterious unveal melanoma)、罕见血液性病症、肾转移性癌、横纹肌样肿瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃窦癌(stomach cancer)、胃病、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌瘤、胸腺瘤、甲状腺转移性癌症及子宫癌(子宫颈癌、子宫内膜癌瘤及平滑肌瘤)。
在特别优选的实施例中，受试者将患有胰腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌和胃癌。在优选的实施例中，受试者的胰腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌和胃癌将是难医治的。
在其他优选的实施例中，ADC在治疗肺癌方面特别有效，包括以下亚型：小细胞肺癌和非小细胞肺癌(例如鳞状细胞非小细胞肺癌或鳞状细胞小细胞肺癌)。在所选择的实施例中，抗体和ADC可以施用于展现出局限期疾病或扩散期疾病的患者。在其他优选实施例中，所披露的缀合抗体将施用于难医治性患者(即，在完成最初疗程期间或不久之后复发的那些)、敏感性患者(在主要疗法之后复发超过2-3个月的那些)、或对基于铂的药剂(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂)和/或紫杉烷(例如多西紫杉醇、紫杉醇、拉洛他赛或卡巴他赛)展现出抗性的患者。
在另一个特别优选的实施例中，所披露的ADC在治疗卵巢癌(包括卵巢浆液性癌和卵巢乳头状浆液性癌)是有效的。
本发明还提供了出现良性或癌前肿瘤的受试者的防治性或预防性治疗。没有特定类型的肿瘤或增生性紊乱是排除在使用本发明的抗体治疗之外的。
X制品
本发明包括药物包装和包含一个或多个容器的试剂盒，其中容器可以包含一个或多个剂量的本发明的ADC。在某些实施例中，包装或试剂盒含有单位剂量，意指预定量的组合物，该组合物包含例如具有或不具有一种或多种另外的试剂的本发明的ADC、和任选的一种或多种抗癌剂。
本发明的试剂盒一般会在一个适合容器中含有本发明的ADC的药学上可接受的配制品，并且在相同或不同容器中任选地含有一种或多种抗癌剂。这些试剂盒还可以含有其他药学上可接受的配制品或设备，用于诊断或联合治疗。装置或仪器的实例包括可用于检测、监测、定量或分型与增生性紊乱相关的细胞或标志物的那些。本发明考虑的试剂盒还可含有合适的试剂以将本发明的ADC与抗癌剂或诊断剂组合(例如参见U.S.P.N.7,422,739)。
当该试剂盒的组分是以一种或多种液体溶液形式提供时，该液体溶液可以是非水性的，不过优选是一种水性溶液，其中无菌水性溶液是特别优选的。试剂盒中的配制品也可以一种或多种干粉或冻干形式提供，其可以通过添加适当的液体来重新配制。用于重构的液体可以包含在独立的容器中。这样的液体可以包括一种或多种无菌的、药学上可接受的缓冲剂或一种或多种其他稀释剂，例如用于注射的抑菌水、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。当试剂盒包含与另外的治疗剂或药剂组合的本发明的ADC时，该溶液可以按摩尔当量组合或一种组分多于另一种的方式预混合。可替代地，本发明的ADC和任何任选的抗癌剂或其他的试剂在给与患者之前，可以分开地维持在相异的容器中。
所述试剂盒包括一个或多个容器和在所述一个或多个容器之内、之上或与其相联的标签或药品说明书，用于说明所装的组合物被用于诊断或治疗所选的疾病病状。适合的容器包括例如，瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由各种材料(如玻璃或塑料)形成。该一个或多个容器可包括无菌存取口，例如，该容器可以是一种静脉内溶液袋或具有通过皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶。
在一些实施例中，所述试剂盒可以含有通过其将该ADC和任何任选的组分给与患者的装置，例如，一个或多个针或注射器(预先装好的或空的)、眼滴管、移液管或其他此类装置，由该装置，可以将配制品注射或引入受试者中或施用到身体的患病区域。本发明的试剂盒还典型地包括一种用于容纳小瓶等及其他组分的紧密封闭的装置，以供商业销售，如例如吹塑的塑料容器，在其中放置并且保持所希望的小瓶和其他器件。
XI其他
除非在此另外定义，否则结合本发明使用的科技术语应当具有本领域的普通技术人员通常所了解的意义。此外，除非上下文另外要求，单数术语应该包括复数含义并且复数术语应该包括单数含义。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和这些端点之间的所有点。因此，2.0到3.0的范围包括2.0、3.0及2.0与3.0之间的所有点。
总体而言，在此所描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及化学的技术是本领域中众所周知并且常用的那些。在此使用的与这些技术相关的命名法也是本领域普遍使用的。除非另外指示，否则本发明的方法和技术一般是根据本领域中众所周知的常规方法并且如本说明书全篇所引用的不同参考文献中所描述来进行。
XII参考文献
在此援引的全部专利、专利申请、和出版物、和以电子方式可获得的材料(包括，例如，核苷酸序列提交，例如GenBank和RefSeq；和氨基酸序列提交，例如SwissProt、PIR、PRF、PDB；以及来自GenBank和RefSeq中经注释的编码区的翻译)的完整披露内容通过引用结合，无论短语“通过引用结合”是否相关于特定参考文献使用。已经仅出于清晰理解的目的给出前述发明详述和随后的实例。不应理解为由此构成任何不必要的限制。本发明不限于所显示和描述的具体细节。由权利要求书限定的本发明包括对于本领域技术人员而言显而易见的变化。在此使用的任何章节标题只是出于组织的目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
XIII序列表概述
附加到本申请的是包含多个核酸和氨基酸序列的附图。下表3提供了所包括的序列的概述。
表3
SEQ ID NO 描述
1 κ轻链恒定区蛋白
2 IgG1重链恒定区蛋白
3 可裂解肽
4 可裂解肽
5 可裂解肽
实施方式：
本文披露的实施例包括以下实施例P1至P27。
实施例P1.式Ab-[W-(X1)a-CM-(X2)b-P-D]n的抗体药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中a)Ab包含一种靶向剂；b)W包含连接基团；CM包含可裂解部分；d)P包含二硫键保护基；e)X1和X2包含任选的间隔子部分；并且f)D包含卡奇霉素；其中a和b独立地是0或1并且n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
实施例P2.如实施例P1所述的抗体药物缀合物，其中所述靶向剂包含抗体。
实施例P3.如实施例P2所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体包含嵌合、CDR接枝、人源化的或人类抗体或其免疫反应性片段。
实施例P4.如实施例P2或P3所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体包含抗SEZ6抗体。
实施例P5.如实施例P2至P4中任一项所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体包含位点特异性抗体。
实施例P6.如实施例P2至P5中任一项所述的一种抗体药物缀合物，其中所述抗体包含两个未配对的半胱氨酸。
实施例P7.根据实施例P6所述的抗体药物缀合物，其中每个抗体轻链包含未配对的半胱氨酸残基。
实施例P8.根据实施例P7所述的抗体药物缀合物，其中每个未配对的半胱氨酸残基在位置C214处。
实施例P9.如实施例P1至P8中任一项所述的抗体药物缀合物，其中n包含从2至8的整数。
实施例P10.如实施例P1至P9中任一项所述的抗体药物缀合物，其中n包含整数2。
实施例P11.如实施例P1至P10中任一项所述的抗体药物缀合物，其中D包含卡奇霉素γ1 I的类似物。
实施例P12.如实施例P1至P11中任一项所述的抗体/药物缀合物，其中所述卡奇霉素是卡奇霉素的N-乙酰基衍生物或二硫化物类似物。
实施例P13.如实施例P1至P12中任一项所述的抗体/药物缀合物，其中所述卡奇霉素是N-乙酰基-γ-卡奇霉素。
实施例P14.如实施例P1至P13中任一项所述的抗体药物缀合物，其中可裂解部分包含肽键、腙部分、肟部分、酯键或二硫键。
实施例P15.如实施例P1至P14中任一项所述的抗体药物缀合物，其中所述可裂解部分包含肽键。
实施例P16.一种药物组合物，其包含实施例P1至P15中任一项的抗体药物缀合物。
实施例P17.一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用实施例16所述的药物组合物。
实施例P18.如实施例P17所述的方法，其中所述癌症选自胰腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和胃癌。
实施例P19.如实施例P17或P18所述的方法，其还包括向所述受试者施用至少一种另外的治疗部分。
实施例P20.一种将卡奇霉素细胞毒素递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与实施例P1至P15中任一项所述的抗体药物缀合物接触。
实施例P21.一种制备抗体药物缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含可裂解接头的卡奇霉素构建体；b)还原靶向剂以提供活化的残基；和c)将还原的靶向剂缀合至卡奇霉素构建体。
实施例P22.如实施例P21所述的方法，其中所述靶向剂包含位点特异性抗体
实施例P23.如实施例P22所述的方法，其中所述位点特异性抗体包含衍生自天然二硫桥键的游离半胱氨酸。
实施例P24.如实施例P22所述的方法，其中所述工程化的抗体包含不衍生自天然二硫桥键的游离半胱氨酸。
实施例P25.如实施例P22所述的方法，其中所述游离半胱氨酸包含引入的半胱氨酸残基或取代的半胱氨酸残基。
实施例P26.如实施例P21至P25中任一项所述的方法，其中所述还原靶向剂的步骤包括选择性还原所述靶向剂。
实施例27.如实施例P26所述的方法，其中所述选择性还原抗体的步骤包括使抗体与稳定剂接触的步骤。
进一步的实施例包括下面的实施例1-44。
实施例1.一种化合物，或其药学上可接受的盐，其具有式(I)：Ab-[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]z3(I)，其中：Ab是靶向剂；W是连接基团；M是可裂解部分；L3和L4独立地是接头；P是二硫键保护基；D是卡奇霉素或其类似物；z1和z2独立地是从0至10的整数；并且z3是从1至10的整数。
实施例2.如实施例1所述的化合物，其中D包括式(Ia)：
其中：R1是氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)R1E、-OR1A、-NR1BR1C、-C(O)OR1A、-C(O)NR1BR1C、SR1D、-SOn1R1B或-SOnv1NR1BR1C；R1A、R1B、R1C、R1D和R1E独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-N(O)2、-SH、-S(O)3H、-S(O)4H、-S(O)2NH2、--NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHS(O)2H、-NHC(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基；并且与同一个氮原子键合的R1B和R1C取代基可以任选地连接以形成取代或未取代的杂环烷基或取代或未取代的杂芳基；n1是从0至4的整数；并且v1是1或2。
实施例3.如实施例2所述的化合物，其中R1是氢、取代或未取代的烷基或-C(O)R1E。
实施例4.如实施例2所述的化合物，其中所述靶向剂是抗体。
实施例5.如实施例4所述的化合物，其中所述抗体是嵌合抗体、CDR接枝抗体、人源化抗体或人类抗体或其免疫反应性片段。
实施例6.如实施例4所述的化合物，其中所述抗体是抗SEZ6抗体。
实施例7.如实施例4所述的化合物，其中W共价附接至抗体内的半胱氨酸残基上。
实施例8.如实施例7所述的化合物，其中所述半胱氨酸残基是在卡巴特(卡巴特)位置上。
实施例9.如实施例4所述的化合物，其中W共价附接至抗体内的赖氨酸残基上。
实施例10.如实施例1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其具有式(II)：
其中：Ab是抗体；L3是键、-O-、-S-、-NR3B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR3B-、-NR3BC(O)-、-NR3BC(O)NH-、-NHC(O)NR3B-、取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基；L4是键、-O-、-S-、-NR4B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR4B-、-NR4BC(O)-、-NR4BC(O)NH-、-NHC(O)NR4B-、取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基；R1是氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)R1E、-OR1A、-NR1BR1C、-C(O)OR1A、-C(O)NR1BR1C、-SR1D、-SOn1R1B或-SOv1NR1BR1C；P是-O-、-S-、-NR2B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR2B-、-NR2BC(O)-、-NR2BC(O)NH-、-NHC(O)NR2B-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；M是-O-、-S-、-NR5B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5B-、-NR5BC(O)-、-NR5BC(O)NH-、-NHC(O)NR5B-、-[NR5BC(R5E)(R5F)C(O)]n2-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基或M1A-M1B-M1C；W是-O-、-S-、-NR6B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR6B-、-NR6BC(O)-、-NR6BC(O)NH-、-NHC(O)NR6B-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基或W1A-W1B-W1C；M1A键合至L3并且M1C键合至L4；M1A是键、-O-、-S-、-NR5AB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5AB-、-NR5ABC(O)-、-NR5ABC(O)NH-、-NHC(O)NR5AB-、-[NR5ABCR5AER5AFC(O)]n3-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；M1B是键、-O-、-S-、-NR5BB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5BB-、-NR5BBC(O)-、-NR5BBC(O)NH-、-NHC(O)NR5BB-、-[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；M1C是键、-O-、-S-、-NR5CB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5CB-、-NR5CBC(O)-、-NR5CBC(O)NH-、-NHC(O)NR5CB-、-[NR5CBCR5CER5CFC(O)]n5-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；W1A键合至Ab并且W1C键合至L3；W1A是键、-O-、-S-、-NR6AB-、-C(O)-、C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR6AB-、-NR6ABC(O)-、-NR6ABC(O)NH-、-NHC(O)NR6AB-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；W1B是键、-O-、-S-、-NR6BB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR6BB-、-NR6BBC(O)-、-NR6BBC(O)NH-、-NHC(O)NR6BB-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；W1C是键、-O-、-S-、-NR6CB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR6CB-、-NR6CBC(O)-、-NR6CBC(O)NH-、-NHC(O)NR6CB-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；R1A、R1B、R1C、R1D、R1E、R2B、R3B、R4B、R5B、R5E、R5F、R5AB、R5AE、R5AF、R5BB、R5BE、R5BF、R5CB、R5CE、R5CF、R6B、R6AB、R6BB和R6CB独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-N(O)2、-SH、-S(O)3H、-S(O)4H、-S(O)2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHS(O)2H、-NHC(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基；并且与同一个氮原子键合的R1B和R1C取代基可以任选地连接以形成取代或未取代的杂环烷基或取代或未取代的杂芳基；n1是从0至4的整数；v1是1或2；n2、n3、n4和n5独立地是从1至10的整数；z1和z2独立地是从0至10的整数；并且z3是从1至10的整数。
实施例11.如实施例10所述的化合物，其中M是M1A-M1B-M1C，其中：M1A键合至L3并且M1C键合至L4。
实施例12.如实施例10所述的化合物，其中W是W1A-W1B-W1C，其中W1A键合至Ab并且W1C键合至L3。
实施例13.如实施例10所述的化合物，其中P是取代或未取代的烷基。
实施例14.如实施例10所述的化合物，其中z3是1或2。
实施例15.如实施例10所述的化合物，其中L3是取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基。
实施例16.如实施例10所述的化合物，其中L4是取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基。
实施例17.如实施例10所述的化合物，其中R1是氢或-C(O)R1E。
实施例18.如实施例10所述的化合物，其中W是取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。
实施例19.如实施例18所述的化合物，其中W是5元或6元的取代或未取代的杂环亚烷基。
实施例20.如实施例19所述的化合物，其中W具有式：
实施例21.如实施例10所述的化合物，其中M包含肽。
实施例22.如实施例10所述的化合物，其中：M1A是键、取代或未取代的杂亚烷基或-[NR5ABC(R5AE)(R5AF)C(O)]n3；M1B是键、取代或未取代的杂亚烷基或-[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-；并且M1C是键或取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。
实施例23.如实施例10所述的化合物，其中M1A和M1B独立地是氨基酸。
实施例24.如实施例10所述的化合物，其中M1A或M1B中至少一个是缬氨酸(val)。
实施例25.如实施例10所述的化合物，其中M1A或M1B中至少一个是丙氨酸(ala)。
实施例26.如实施例10所述的化合物，其中M1A或M1B中至少一个是瓜氨酸(cit)。
实施例27.如实施例10所述的化合物，其中M1A、M1B或M1C中至少一个是取代的亚芳基。
实施例28.如实施例10所述的化合物，其中M1A、M1B或M1C中至少一个具有式(III)：其中：Y是-NH-、-O-、-C(O)NH-或-C(O)O-；并且n6是从0至3的整数。
实施例29.如实施例10所述的化合物，其中-[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]是：
实施例30.如实施例10所述的化合物，其中-[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]具有式：
实施例31.一种药物组合物，其包含如实施例1至30中任一项所述的化合物。
实施例32.一种在对其有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如实施例31所述的药物组合物或如实施例1至30中一项所述的化合物。
实施例33.如实施例32所述的方法，其中所述癌症选自胰腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和胃癌。
实施例34.如实施例32所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用另外的化学治疗剂。
实施例35.一种将卡奇霉素细胞毒素递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与如实施例1至30中任一项所述的化合物接触。
实施例36.一种制备抗体药物缀合物的方法，所述方法包括使卡奇霉素构建体与抗体的半胱氨酸或赖氨酸接触，所述卡奇霉素构建体具有式W1-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D，其中W1是与赖氨酸侧链或半胱氨酸侧链反应的官能团，M是可裂解部分，L3和L4独立地是接头，P是二硫键保护基，并且D是卡奇霉素或其类似物。
实施例37.如实施例36所述的方法，其中所述卡奇霉素构建体与抗体的特定半胱氨酸接触。
实施例38.如实施例37所述的方法，其中所述特定半胱氨酸衍生自天然二硫桥键。
实施例39.如实施例37所述的方法，其中所述抗体是工程化抗体，并且所述特定半胱氨酸不是衍生自天然二硫桥键。
实施例40.如实施例36至39中任一项所述的方法，其中所述特定半胱氨酸在接触前被选择性还原。
实施例41.如实施例40所述的方法，其中所述选择性还原所述抗体的步骤包括使所述抗体与稳定剂接触的步骤。
实施例42.一种具有式(IV)：
的化合物，其中L3是键、-O-、-S-、-NR3B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR3B-、-NR3BC(O)-、-NR3BC(O)NH-、-NHC(O)NR3B-、取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基；L4是键、-O-、-S-、-NR4B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR4B-、-NR4BC(O)-、-NR4BC(O)NH-、-NHC(O)NR4B-、取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基；R1是氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)R1E、-OR1A、-NR1BR1C、-C(O)OR1A、-C(O)NR1BR1C、-SR1D、-SOn1R1B或-SOv1NR1BR1C；P是-O-、-S-，-NR2B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR2B-、-NR2BC(O)-、-NR2BC(O)NH-、-NHC(O)NR2B-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；M是-O-、-S-、-NR5B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5B-、-NR5BC(O)-、-NR5BC(O)NH-、-NHC(O)NR5B-、-[NR5BC(R5E)(R5F)C(O)]n2-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基或M1A-M1B-M1C；W1是氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-N3、CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、CN、-C(O)R7E、-OR7A、-NR7BR7C、-C(O)OR7A、-C(O)NR7BR7C、-NO2、-SR7D、-SOn7R7B、-SOv7NR7BR7C、-NHNR7BR7C、-ONR7BR7C、-NHC(O)NHNR7BR7C；M1A键合至L3并且M1C键合至L4；M1A是键、-O-、-S-、-NR5AB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5AB-、-NR5ABC(O)-、-NR5ABC(O)NH-、-NHC(O)NR5AB-、-[NR5ABCR5AER5AFC(O)]n3-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；M1B是键、-O-、-S-、-NR5BB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5BB-、-NR5BBC(O)-、-NR5BBC(O)NH-、-NHC(O)NR5BB-、-[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；M1C是键、-O-、-S-、-NR5CB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5CB-、-NR5CBC(O)-、-NR5CBC(O)NH-、-NHC(O)NR5CB-、-[NR5CBCR5CER5CFC(O)]n5-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；R1A、R1B、R1C、R1D、R1E、R2B、R3B、R4B、R5B、R5E、R5F、R5AB、R5AE、R5AF、R5BB、R5BE、R5BF、R5CB、R5CE、R5CF、R6B、R7A、R7B、R7C、R7D、R7E独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-N(O)2、-SH、-S(O)3H、-S(O)4H、-S(O)2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHS(O)2H、-NHC(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基；并且与同一个氮原子键合的R1B和R1C取代基可以任选地连接以形成取代或未取代的杂环烷基或取代或未取代的杂芳基；n1和n7独立地是从0至4的整数；v1和v7独立地是1或2；并且n2、n3、n4和n5独立地是从1至10的整数。
实施例43.如实施例42所述的化合物，其中所述化合物是：
XIV实例
通过参照以下实例将更容易地了解由此总体上在上文中描述的本发明，这些实例是通过说明方式而提供并且不意在作为本发明的限制。这些实例不意在表示以下实验是所进行的全部或唯一实验。除非另外指示，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是大气压或接近大气压。
PDX肿瘤细胞类型用后面跟着数字的缩写表示，数字表示特定的肿瘤细胞系。测试样品的传代次数是由p0-p#外加样品名称指示，其中p0指示直接地从患者肿瘤获得的未传代样品，并且p#指示在测试之前已经通过小鼠对肿瘤进行传代的次数。如在此处所使用的，肿瘤类型和亚型的缩写如在下面的表4中所示：
表4
关于分析和制备型HPLC方法的一般信息。
分析方法A：
MS：Acuity Ultra SQ检测仪ESI，扫描范围120-2040Da。
柱：沃特斯Acuity UPLC BEH C18，1.7μm，2.1x50mm
柱温：50℃
流速：0.6ml/min
流动相A：在水中的0.1％甲酸。
流动相B：在乙腈中的0.1％甲酸。
梯度：
时间，min ％A ％B
0 95 5
0.25 95 5
2 0 100
2.5 0 100
3 95 5
4 95 5
分析方法B：
MS：Acuity Ultra SQ检测仪ESI，扫描范围120-2040Da，
柱：沃特斯Acuity UPLC BEH C18，1.7μm，2.1x50mm
柱温：60℃
流速：0.4ml/min
流动相A：在水中的0.1％甲酸。
流动相B：在乙腈中的0.1％甲酸。
梯度：
时间，min ％A ％B
0 95 5
2 95 5
3 80 20
13 20 80
14 20 80
14.10 5 95
15 5 95
15.10 95 5
20 95 5
分析方法C：
HRMS：ABSciex 5600加上三倍飞行时间(TOF)，扫描范围250-2500Da
柱：沃特斯Acuity UPLC BEH C18，1.7μm，2.1x50mm
柱温：60℃
流速：0.4ml/min
流动相A：在水中的0.1％甲酸。
流动相B：在乙腈中的0.1％甲酸。
梯度：
时间，min ％A ％B
0 95 5
2 95 5
3 80 20
13 20 80
14 20 80
14.10 5 95
15 5 95
15.10 95 5
20 95 5
制备型HPLC方法A：
柱：沃特斯XBridge prep C18 5μm OBD，19x100mm
柱温度：环境温度
流速：15ml/min
流动相A：在水中的0.1％甲酸。
流动相B：在乙腈中的0.1％甲酸。
梯度：
时间，min ％A ％B
0 95 5
5 95 5
8 80 20
50 20 80
52.59 20 80
52.92 5 95
55.87 5 95
56.20 95 5
60 95 5
制备型HPLC方法B：
柱：沃特斯XBridge prep C18 5μm OBD，19x100mm
柱温度：环境温度
流速：15ml/min
流动相A：水。
流动相B：乙腈。
梯度：
时间，min ％A ％B
0 95 5
5 95 5
8 80 20
50 20 80
52.59 20 80
52.92 5 95
55.87 5 95
56.20 95 5
60 95 5
实例1
包含腙接头的卡奇霉素构建体的合成
根据式13的药物-接头化合物
使用如紧跟在下面所示的三种不同的方法合成。
合成路线1：
(i)S-((2R，3S，4S，6S)-6-((((2R，3S，4R，5R，6R)-5-(((2S，4S，5S)-5-(N-乙基乙酰氨基)-4-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-6-(((2S，5Z，9R，13E)-13-(2-((4-肼基-2-甲基-4-氧代丁-2-基)二磺酰基)亚乙基)-9-羟基-12-((甲氧基羰基)氨基)-11-氧代二环[7.3.1]十三-1(12)，5-二烯-3，7-二炔-2-基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氨基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)4-(((2S，3R，4R，5S，6S)-3，5-二羟基-4-甲氧基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3-碘代-5，6-二甲氧基-2-甲基苯并硫醇盐(3)。
将N-乙酰基卡奇霉素(2，20mg，14μmol)溶于2ml乙腈中并冷冻至-15℃。将3-巯基-3-甲基丁烷酰肼(21mg，0.14mmol，10当量)溶于0.5ml乙腈中，并缓慢添加至卡奇霉素的冷冻溶液中，然后添加三乙胺(18.8μL，0.14mmol，10当量)。允许反应升温至完成。3小时后，将反应浓缩并通过柱色谱(MeOH/DCM 1％至20％)在硅胶柱上纯化，得到呈白色固体的3(18.7mg，89％)。LCMS(分析方法A)：Rt＝1.80min，[M+H]+＝1478.57。
(ii)4-(4-((E)-1-(2-(3-(((E)-2-((1R，8S，Z)-8-(((2R，3R，4R，5S，6R)-5-((((2S，4S，5S，6R)-5-((4-(((2S，3R，4R，5S，6S)-3，5-二羟基-4-甲氧基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3-碘代-5，6-二甲氧基-2-甲基苯甲酰基)硫)-4-羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)氨基)-3-(((2S，4S，5S)-5-(N-乙基乙酰氨基)-4-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-1-羟基-10-（（甲氧基羰基)氨基)-11-氧代二环[7.3.1]十三-4，9-二烯-2，6-二炔-13-亚基）乙基）二磺酰基)-3-甲基丁酰基)亚肼基)乙基)苯氧基)丁酸(4)。
在分子筛存在下，将4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(3.8mg，17μmol，5当量)添加到在醇(100μL)中的化合物3(5mg，3.4μmol)中。添加乙酸(15μL，80当量)，并将反应在37℃下搅拌3天。之后，观察到80％的转化率，并将反应浓缩，并通过柱色谱(MeOH/DCM 1％至20％)在硅胶柱上纯化，得到4(1.1mg，20％)。LCMS(分析方法A)：Rt＝1.96min，[M+H]+＝1682.53。
(iii)S-((2R，3S，4S，6S)-6-((((2R，3S，4R，5R，6R)-6-(((2S，5Z，9R，13E)-13-(2-((4-(2-((E)-1-(4-(4-((2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)乙基)氨基)-4-氧代丁氧基)苯基)亚乙基)肼基)-2-甲基-4-氧代丁-2-基)二磺酰基)亚乙基)-9-羟基-12-((甲氧基羰基)氨基)-11-氧代二环[7.3.1]十三-1(12)，5-二烯-3，7-二炔-2-基)氧基)-5-(((2S，4S，5S)-5-(N-乙基乙酰氨基)-4-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氨基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)4-(((2S，3R，4R，5S，6S)-3，5-二羟基-4-甲氧基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3-碘代-5，6-二甲氧基-2-甲基苯并硫醇盐(1)。
将5μL的DIPEA(10当量)添加到500μL的N-(2-氨基乙基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(7mg/mL，14μmol，5当量)在DMF中的溶液中。将该溶液与5μL的DIPEA(10当量)添加到4(480μL的10mg/mL的DCM)的溶液中。最后添加11mg EDCI(11mg，28μmol，10当量)，并将混合物在室温下搅拌15小时。起始材料被消耗，并通过LCMS观察到了所需的产物。LCMS(分析方法A)：Rt＝1.98min，[M+H]+＝1918.29。
合成路线2：
(i)N-(2-(4-(4-乙酰基苯氧基)丁酰氨基)乙基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(6)
将N-(2-氨基乙基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(137mg，0.54mmol，1.2当量)添加到5(100mg，0.45mmol)在THF(2mL)中的溶液中，随后添加HATU(205.3mg，0.54mmol，1.2当量)和HOBt水合物(82.6mg，0.54mmol，1.2当量)。然后添加DIPEA(1.57mL，9.00mmol，20当量)，并且将反应在室温下搅拌15小时。蒸发溶剂，并将粗产物通过柱色谱纯化，得到呈白色固体的所需产物6(200mg，97％)。LCMS(分析方法A)：Rt＝1.60min，[M+H]+＝458.37。
(ii)S-((2R，3S，4S，6S)-6-((((2R，3S，4R，5R，6R)-6-(((2S，5Z，9R，13E)-13-(2-((4-(2-((E)-1-(4-(4-((2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)乙基)氨基)-4-氧代丁氧基)苯基)亚乙基)肼基)-2-甲基-4-氧代丁-2-基)二磺酰基)亚乙基)-9-羟基-12-((甲氧基羰基)氨基)-11-氧代二环[7.3.1]十三-1(12)，5-二烯-3，7-二炔-2-基)氧基)-5-(((2S，4S，5S)-5-(N-乙基乙酰氨基)-4-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氨基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)4-(((2S，3R，4R，5S，6S)-3，5-二羟基-4-甲氧基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3-碘代-5，6-二甲氧基-2-甲基苯并硫醇盐(1)。
将N-(2-(4-(4-乙酰基苯氧基)丁酰氨基)乙基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺6(0.3mg，0.6μmol，5当量)在20μL醇中的溶液添加至在DMF(20μL)中的化合物3(0.2mg，0.14μmol)中。添加乙酸(1μL，100当量)，并将反应在37℃下搅拌24小时。之后，观察到所需产物。LCMS(分析方法A)：Rt＝1.98min，[M+H]+＝1918.69。
合成路线3：
(i)(E)-4-(4-(1-(2-(3-巯基-3-甲基丁酰基)亚肼基)乙基)苯氧基)丁酸(8)。
将4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(5，750mg，3.37mmol，5当量)添加至在DMF(5mL)中的3-巯基-3-甲基丁烷酰肼(7，100mg，0.67mmol)。添加乙酸(3.0mL，80当量)，并将反应在37℃下搅拌3天。之后，观察到80％的转化率，并将反应浓缩，并通过柱色谱(MeOH/DCM 1％至20％)在硅胶柱上纯化，得到8(7.0mg，3％)。LCMS(分析方法A)：Rt＝1.74min，[M+H]+＝353.28。
(ii)4-(4-((E)-1-(2-(3-(((E)-2-((1R，8S，Z)-8-(((2R，3R，4R，5S，6R)-5-((((2S，4S，5S，6R)-5-((4-(((2S，3R，4R，5S，6S)-3，5-二羟基-4-甲氧基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3-碘代-5，6-二甲氧基-2-甲基苯甲酰基)硫)-4-羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)氨基)-3-(((2S，4S，5S)-5-(N-乙基乙酰氨基)-4-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-1-羟基-10-((甲氧基羰基)氨基)-11-氧代二环[7.3.1]十三-4，9-二烯-2，6-二炔-13-亚基)乙基)二磺酰基)-3-甲基丁酰基)亚肼基)乙基)苯氧基)丁酸(4)。
将N-乙酰基卡奇霉素(2，5mg，3.5μmol)溶解于50μL的乙腈中并冷冻至-15℃。将化合物8(6.2mg，17.7μmol，5当量)溶于50μL乙腈中，并缓慢添加到卡奇霉素的冷冻溶液中，然后添加三乙胺(2.3μL，17.7μmol，5当量)。允许反应升温至完成。3小时后，将反应浓缩并通过柱色谱(MeOH/DCM1％至20％)在硅胶柱上纯化，得到4。LCMS(分析方法A)Rt＝1.96min，[M+H]+＝1682.80。
(iii)S-((2R，3S，4S，6S)-6-((((2R，3S，4R，5R，6R)-6-(((2S，5Z，9R，13E)-13-(2-((4-(2-((E)-1-(4-(4-((2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)乙基)氨基)-4-氧代丁氧基)苯基)亚乙基)肼基)-2-甲基-4-氧代丁-2-基)二磺酰基)亚乙基)-9-羟基-12-((甲氧基羰基)氨基)-11-氧代二环[7.3.1]十三-1(12)，5-二烯-3，7-二炔-2-基)氧基)-5-(((2S，4S，5S)-5-(N-乙基乙酰氨基)-4-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氨基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)4-(((2S，3R，4R，5S，6S)-3，5-二羟基-4-甲氧基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3-碘代-5，6-二甲氧基-2-甲基苯并硫醇盐(1)
参见合成路线1。
实例2
包含肟接头的卡奇霉素构建体的合成
根据式14的药物-接头化合物
以如紧跟在下面所示的方法合成。
合成部分1：接头形成
(i)N-(2-(4-(4-乙酰基苯氧基)丁酰氨基)乙基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(6)。
与实例1/合成路线2的步骤相同
(ii)(Z)-(2-(((1-(4-(4-((2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)乙基)氨基)-4-氧代丁氧基)苯基)亚乙基)氨基)氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(10)。
将(2-(氨基氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(46.2mg，0.26mmol，1.2当量)添加至N-(2-(4-(4-乙酰基苯氧基)丁酰氨基)乙基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺6(100mg，0.22mmol)在二甲基甲酰胺(200μL)中的溶液中。在40℃下将反应物搅拌15小时。将反应物浓缩并通过柱色谱纯化，给出呈白色固体的所需产物10(65.5mg，50％)。LCMS(分析方法A)：Rt＝1.92min，[M+H]+＝616.44。
(iii)(Z)-N-(2-(4-(4-(1-((2-氨基乙氧基)亚氨基)乙基)苯氧基)丁酰氨基)乙基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(11)。
将(Z)-(2-(((1-(4-(4-((2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)乙基)氨基)-4-氧代丁氧基)苯基)亚乙基)氨基)氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯10溶解在10％TFA在二氯甲烷中的溶液里。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后蒸发溶剂。将所得粗混合物用于下一步骤。
合成部分2：接头-药物制备
(i)4-(((E)-2-((1R，8S，Z)-8-(((2R，3R，4R，5S，6R)-5-((((2S，4S，5S，6R)-5-((4-(((2S，3R，4R，5S，6S)-3，5-二羟基-4-甲氧基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3-碘代-5，6-二甲氧基-2-甲基苯甲酰基)硫)-4-羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)氨基)-3-(((2S，4S，5S)-5-(N-乙基乙酰氨基)-4-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-1-羟基-10-((甲氧基羰基)氨基)-11-氧代二环[7.3.1]十三-4，9-二烯-2，6-二炔-13-亚基)乙基)二磺酰基)-4-甲基戊酸(12)。
将N-乙酰基卡奇霉素γ1(0.2g，0.142mmol，1当量)溶于30ml乙腈中，并将溶液冷冻至-15℃。将4-巯基-4-甲基戊酸(0.420ml，2.837mmol，20当量)溶解在10ml乙腈中，并缓慢添加到N-乙酰基卡奇霉素的冷却的溶液中。将三乙胺(0.377ml，2.837mmol，20当量)添加到反应混合物中，并且使反应在3-18小时内升温至室温。反应完成后，将混合物浓缩并干加载到硅胶上进行快速色谱纯化。用DCM中的2％-20％MeOH快速色谱纯化，分离出呈玻璃状固体的所需产物(0.19g，90.5％产率)，其可从冷的二乙醚中以白色粉末形式沉淀出来。LCMS(分析方法A)：Rt＝1.92min，[M+H]+＝1478.64。
(ii)S-((2R，3S，4S，6S)-6-((((2R，3S，4R，5R，6R)-6-(((2S，5Z，9R，13E)-13-((Z)-2-(4-(4-((2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)乙基)氨基)-4-氧代丁氧基)苯基)-11，11-二甲基-8-氧代-4-氧杂-12，13-二硫杂-3，7-二氮杂十五碳-2-烯-15-亚基)-9-羟基-12-((甲氧基羰基)氨基)-11-氧代二环[7.3.1]十三-1(12)，5-二烯-3，7-二炔-2-基)氧基)-5-(((2S，4S，5S)-5-(N-乙基乙酰氨基)-4-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氨基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)4-(((2S，3R，4R，5S，6S)-3，5-二羟基-4-甲氧基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3-碘代-5，6-二甲氧基-2-甲基苯并硫醇盐(9)。
将(Z)-N-(2-(4-(4-(1-((2-氨基乙氧基)亚氨基)乙基)苯氧基)丁酰氨基)乙基)-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺11(2.1mg，4μmol，1.5当量)溶于100μL的二甲基甲酰胺中，并添加5μL DIPEA(10当量)。然后将该溶液和5μL DIPEA(10当量)添加到12(4.0mg，2.7μmol)在100μL二甲基甲酰胺中的溶液中。添加EDCI(2.6mg，13.5μmol，5当量)和HOBt水合物(4.1mg，27μL，10当量)，并且将反应在室温下搅拌20小时。观察到完全转化并在制备型HPLC(制备型HPLC方法B)上纯化之前浓缩反应，得到所需产物9(0.4mg，7.5％)。LC/HRMS(分析方法C)：Rt＝9.06min，M/Z观察到[M+2H]+＝988.3195。1H NMR(500MHz，氯仿-d)δ7.56(d，J＝8.8Hz，2H)，6.90(d，J＝8.8Hz，1H)，6.68(s，2H)，6.46(s，2H)，6.23(d，J＝65.9Hz，3H)，5.73(s，1H)，4.68(d，J＝11.6Hz，1H)，4.48(s，1H)，4.32(s，1H)，4.24(s，3H)，4.04(q，J＝6.3Hz，4H)，3.89(s，3H)，3.84(s，4H)，3.82-3.54(m，13H)，3.49(t，J＝7.1Hz，3H)，3.42-3.25(m，10H)，2.61(d，J＝17.7Hz，1H)，2.39(d，J＝21.7Hz，8H)，2.29(d，J＝7.6Hz，2H)，2.21(s，5H)，2.11(d，J＝8.0Hz，7H)，2.02(s，2H)，1.93(s，2H)，1.67-1.49(m，42H)，1.41(d，J＝6.3Hz，4H)，1.31(d，J＝6.2Hz，5H)，1.28-1.15(m，12H)。
实例3
包含Val-Cit二肽接头的卡奇霉素构建体的合成
根据式4(图1)的药物-接头化合物
以如紧跟在下面所示的方法合成。
合成部分1：接头形成
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊醛酰氨基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸盐14。
14的合成先前已经进行了描述(US 6,214,345 B1)。
(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊醛酰氨基)苯甲基)乙烷-1，2-二基二氨基甲酸叔丁酯15。
将4-硝基苯基碳酸盐14(100mg，0.136mmol，1当量)溶于5ml无水DMF中，冷却至0℃，并且用(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(21.4uL，0.136mmol，1当量)处理。将反应混合物搅拌2小时，浓缩并通过柱色谱(梯度2％-50％MeOH/DCM)纯化，得到灰白色固体(55mg，53％)。LCMS(分析方法A)：Rt＝1.73min，[M+H]+＝759.38。
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊醛酰氨基)苯甲基(2-氨基乙基)氨基甲酸酯16。
将Boc-胺接头15(50mg，0.066mmol，1当量)溶于10％TFA/DCM溶液(5ml)中，并在室温下搅拌30分钟。通过LCMS确认反应完成，并且在真空下除去溶剂。立即将所得到的游离胺的TFA盐用于下一步骤中。LCMS(分析方法A)：Rt＝1.36min，[M+H]+＝659.52。
合成部分2：药物-接头制备
S-((2R，3S，4S，6S)-6-((((2R，3S，4R，5R，6R)-6-(((2S，5Z，9R，13E)-13-(1-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊醛酰氨基)苯基)-11，11-二甲基-3，8-二氧代-2-氧杂-12，13-二硫杂-4，7-二氮杂十五烷-15-亚基)-9-羟基-12-((甲氧基羰基)氨基)-11-氧代二环[7.3.1]十三-1(12)，5-二烯-3，7-二炔-2-基)氧基)-5-(((2S，4S，5S)-5-(N-乙基乙酰氨基)-4-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氨基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)4-(((2S，3R，4R，5S，6S)-3，5-二羟基-4-甲氧基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3-碘代-5，6-二甲氧基-2-甲基苯并硫醇盐13。
将卡奇霉素-酸衍生物10(108mg，0.073mmol，1当量)溶解在20ml无水DMF中，然后添加EDCI(140.1mg，0.731mmol，10当量)、HOBt(111.8mg，0.731mmol，10当量)和干燥的DIPEA(0.253ml，1.46mmol，20当量)。将反应在室温下搅拌10分钟。将接头胺16(144.2mg，0.219mmol，3当量)溶于3ml无水DMF中，并将干燥的DIPEA(0.253ml，1.46mmol，20当量)添加到接头溶液中。然后将接头-胺溶液添加到活化的酸溶液中。将反应在37℃下搅拌过夜，并通过LCMS监测。反应完成后，在真空下除去DMF，并且将得到的残余物溶于1∶1的乙腈：水中进行制备型HPLC纯化(方法A)。将所需产物通过制备型HPLC方法A分离为白色粉末(20mg，12.9％)。LCMS：Rt(分析方法A或C)＝8.52min，M/Z观察到[M+H]+＝2118.7134。1H NMR(500MHz，氯仿-d)δ7.52(d，J＝8.1Hz，2H)，7.26(d，J＝8.1Hz，2H)，6.95-6.86(m，2H)，6.68(s，2H)，6.44-6.36(m，1H)，6.23(s，1H)，5.91(d，J＝9.4Hz，1H)，5.82-5.73(m，2H)，5.67(d，J＝1.7Hz，2H)，5.03(dd，J＝16.4，7.7Hz，4H)，4.73-4.49(m，5H)，4.46(d，J＝2.9Hz，1H)，4.27(s，2H)，4.24-4.14(m，3H)，3.88(s，4H)，3.83(d，J＝2.5Hz，4H)，3.81(d，J＝3.2Hz，1H)，3.77-3.59(m，9H)，3.57(s，4H)，3.49(q，J＝8.2，7.4Hz，3H)，3.42-3.20(m，13H)，3.18-3.04(m，3H)，2.44-2.33(m，6H)，2.29(t，J＝9.8Hz，2H)，2.23(t，J＝7.2Hz，3H)，2.20-1.96(m，31H)，1.87(d，J＝7.2Hz，4H)，1.80-1.47(m，11H)，1.46-1.35(m，5H)，1.35-1.14(m，18H)，0.92(dd，J＝6.7，3.2Hz，6H)。
实例4
包含Val-Ala二肽接头的卡奇霉素构建体的合成
根据式5的药物-接头化合物
以如紧跟在下面所示的方法合成。
合成部分1：接头形成
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯甲基(4-硝基苯基)碳酸盐18。
4-硝基苯基碳酸盐18的合成先前已经进行了描述(US 6,214,345 B1)。
(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯甲基)乙烷-1，2-二基二氨基甲酸叔丁酯19。
使用与制备接头15相同的合成步骤进行合成。分离的产物68mg(63％)，LCMS(分析方法A)：Rt＝1.85min，[M+H]+＝673.39。
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯甲基(2-氨基乙基)氨基甲酸酯20。
与制备接头16的合成步骤相同。LCMS(分析方法A)：Rt＝1.38min，[M+H]+＝573.44。
合成部分2.药物-接头制备
S-((2R，3S，4S，6S)-6-((((2R，3S，4R，5R，6R)-6-(((2S，5Z，9R，13E)-13-(1-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯基)-11，11-二甲基-3，8-二氧代-2-氧杂-12，13-二硫杂-4，7-二氮杂十五烷-15-亚基)-9-羟基-12-((甲氧基羰基)氨基)-11-氧代二环[7.3.1]十三-1(12)，5-二烯-3，7-二炔-2-基)氧基)-5-(((2S，4S，5S)-5-(N-乙基乙酰氨基)-4-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氨基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)4-(((2S，3R，4R，5S，6S)-3，5-二羟基-4-甲氧基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3-碘代-5，6-二甲氧基-2-甲基苯并硫醇盐17。
与制备13的合成步骤相同。分离为白色固体。LCMS(分析方法B或C)Rt＝8.93min，LC/HRMS M/Z观察到[M+2H]+＝1016.88101H NMR(500MHz，氯仿-d)δ7.50(d，J＝8.2Hz，3H)，7.26(s，4H)，6.68(s，2H)，6.25(s，3H)，5.83-5.75(m，2H)，5.73(s，2H)，5.64(d，J＝14.1Hz，2H)，5.06(t，J＝12.7Hz，4H)，4.75-4.52(m，6H)，4.48(s，2H)，4.32(s，3H)，4.20(dd，J＝9.4，6.1Hz，2H)，4.05(s，4H)，3.89(s，4H)，3.84(d，J＝1.6Hz，5H)，3.77(dd，J＝15.6，9.1Hz，4H)，3.73-3.60(m，7H)，3.58(s，4H)，3.49(t，J＝7.2Hz，4H)，3.43-3.22(m，13H)，3.18(d，J＝17.2Hz，2H)，2.98(s，3H)，2.37(s，7H)，2.33-2.13(m，8H)，2.10(s，7H)，1.90(s，3H)，1.59(s，19H)，1.50-1.37(m，10H)，1.35-1.13(m，22H)，0.93(d，J＝6.8Hz，7H)。
实例5
含有双-Val-Cit二肽接头的卡奇霉素构建体的合成
根据式15的药物-接头化合物
以如紧跟在下面所示的方法合成。
合成部分1：接头形成。
((((2S，5S，15S，18S)-10-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)-5，15-二异丙基-4，7，13，16-四氧代-2，18-双(3-脲基丙基)-3，6，10，14，17-五氮杂十九二酰)-双(氮烷二募))-双(4，1-亚苯基))-双(亚甲基)-双(4-硝基苯基)-双(碳酸盐)22。
4-硝基苯基碳酸盐22的合成以与碳酸盐18相似的方法合成。
((((2S，5S，15S，18S)-10-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)-5，15-二异丙基-4，7，13，16-四氧代-2，18-双(3-脲基丙基)-3，6，10，14，17-五氮杂十九二酰)-双(氮烷二基))双(4，1-亚苯基))双(亚甲基)双((2-氨基乙基)氨基甲酸酯)的双叔-丁基羧酸盐23。
使用与制备接头15和19相同的合成步骤进行合成。分离的产物13mg(51％)，LCMS(分析方法A)：Rt＝1.68min，[M+H]+＝1379.85。
((((2S，5S，15S，18S)-10-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)-5，15-二异丙基-4，7，13，16-四氧代-2，18-双(3-脲基丙基)-3，6，10，14，17-五氮杂十九二酰)-双(氮烷二基))-双(4，1-亚苯基))-双(亚甲基)-双((2-氨基乙基)氨基甲酸酯)24。
与制备接头16和20的合成步骤相同。LCMS(分析方法A)：Rt＝1.52min，[M+H]+＝1179.67。
合成部分2.接头-药物制备
马来酰亚胺双-Val-Cit-PABA-卡奇霉素γ1衍生物21。
与制备13和17的合成步骤相同。分离为白色固体。LCMS(分析方法B或C)Rt＝7.80min，LC/HRMS M/Z观察到[M+3H]+＝1366.7897。
实例6
包含具有可变PEG间隔子的Val-Cit二肽接头的卡奇霉素接头-药物的合成
以如紧跟在下面所示的方法合成
合成部分1：接头形成。
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊醛酰氨基)苯甲基(2，2-二甲基-4-氧代-3，9，12，15-四氧杂-5-氮杂十八碳-18-基)氨基甲酸酯(26)。
使用与制备接头15相同的合成步骤进行合成LCMS(分析方法A)：Rt＝1.81min，[M+H]+＝919.36。
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊醛酰氨基)苯甲基(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)氨基甲酸酯(27)
与制备接头16的合成步骤相同。LCMS(分析方法A)：Rt＝1.46min，M/Z观察到[M+H]+＝819.36。
合成部分2.药物-接头制备
S-((2R，3S，4S，6S)-6-((((2R，3S，4R，5R，6R)-6-(((2S，5Z，9R，13Z)-13-(1-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊醛酰氨基)苯基)-22，22-二甲基-3，19-二氧代-2，8，11，14-四氧杂-23，24-二硫杂-4，18-二氮杂二十六碳-26-亚基)-9-羟基-12-((甲氧基羰基)氨基)-11-氧代二环[7.3.1]十三-1(12)，5-二烯-3，7-二炔-2-基)氧基)-5-(((2S，4S，5S)-5-(N-乙基乙酰氨基)-4-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氨基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)4-(((2S，3R，4R，5S，6S)-3，5-二羟基-4-甲氧基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3-碘代-5，6-二甲氧基-2-甲基苯并硫醇盐(25)
与制备13和17的合成步骤相同。分离为白色固体。LCMS(分析方法B或C)Rt＝8.62min，LC/HRMS M/Z观察到[M+2H]+＝1139.9088。
以如紧跟在下面所示的方法合成。
合成部分1：接头形成。
(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊醛酰氨基)苯甲基)(3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33-十一氧杂三十五烷-1，35-二基)双氨基甲酸叔丁酯(29)。
使用与制备接头15相同的合成步骤进行合成LCMS(分析方法A)：Rt＝1.80min，M/Z观察到[M+H]+＝1243.69。
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊醛酰氨基)苯甲基(35-氨基-3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33-十一氧杂三十五碳)氨基甲酸酯(30)。
与制备接头16的合成步骤相同。LCMS(分析方法A)：Rt＝1.50min，M/Z观察到[M+H]+＝1143.50。
合成部分2.药物-接头制备
S-((2R，3S，4S，6S)-6-((((2R，3S，4R，5R，6R)-6-(((2S，5Z，9R，13Z)-13-(1-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊醛酰氨基)苯基)-44，44-二甲基-3，41-二氧代-2，7，10，13，16，19，22，25，28，31，34，37-十二氧杂-45，46-二硫杂-4，40-二氮杂四十八烷-48-亚基)-9-羟基-12-((甲氧基羰基)氨基)-11-氧代二环[7.3.1]十三-1(12)，5-二烯-3，7-二炔-2-基)氧基)-5-(((2S，4S，5S)-5-(N-乙基乙酰氨基)-4-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氨基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)4-(((2S，3R，4R，5S，6S)-3，5-二羟基-4-甲氧基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-3-碘代-5，6-二甲氧基-2-甲基苯并硫醇盐(28)。
与制备13和17的合成步骤相同。分离为白色固体。LCMS(分析方法B或C)Rt＝8.61min，LC/HRMS M/Z观察到[M+2H]+＝1302.0007。
实例7
二肽接头-卡奇霉素构建体在体外有效裂解
进行了组织蛋白酶B测定以证明在前述实例中制备的二肽接头-药物构建体是易于酶裂解的。在组织蛋白酶B处理之前，首先将来自实例3和4的接头药物构建体用1M N-乙酰半胱氨酸溶液处理以淬灭马来酰亚胺官能团。过量的N-乙酰半胱氨酸用于活化组织蛋白酶B。
更具体地，将在1∶1的乙腈∶水溶液(20μl)中淬灭的接头药物用20mM HisCl pH6.0稀释至10％v/v(80μl)的最终乙腈含量。添加组织蛋白酶B酶以得到相对于接头药物为2.5mol％、5mol％或10mol％的酶。将反应物轻轻涡旋并保持在室温下。在15、30、60和90分钟的时间点上，将3μl反应混合物放入含有5μL Tris pH 9、2μl 100mM二羟基抗坏血酸(DHAA)、15μl水的总回收小瓶中。使用上述分析方法B分析样品。基于起始材料峰面积的减少计算转化率。结果示于图2A-2C中。
Val-Cit卡奇霉素构建体通常比Val-Ala二肽基构建体裂解更迅速，尽管这两种构建体都会被组织蛋白酶B有效地裂解。通过质谱表征显示[MH]+离子为1520.53证实了预期的有效负荷胺的释放。在近似于在细胞中发现的那些的电离作用条件下，二硫键裂解和重排的产物也被观察到(图1)[MH]+离子为1334.39。
前述的结果清楚地表明，接头裂解过程提供了卡奇霉素有效负荷的完全释放。该数据表明示例性二肽基药物接头具有期望的治疗特征，并且可以有效地并入所披露的抗体药物缀合物中。
实例8
卡奇霉素-接头构建体在体外展现出治疗有效的细胞毒性
进行进一步的测定以证明例如如上所述的卡奇霉素-接头构建体保留了细胞杀死能力并且可以作为抗体药物缀合物的一部分发挥作用。与包含从ATCC购买的子宫肉瘤系的MES SA和MES SA/Dx细胞一起使用293T细胞。MES SA/Dx细胞系是由增加量的阿霉素培养的MES SA细胞产生的，其产生了对阿霉素的100倍的抗性和MDR1的上调。此外，阿霉素MES-SA/Dx细胞对许多其他化学治疗剂(包括柔红霉素、更生霉素、长春新碱、紫杉醇、秋水仙碱)表现出显著的交叉抗性，以及对丝裂霉素C和美法仑的中等交叉抗性。
将细胞在T75烧瓶中培养至约50％-80％融合，并用胰蛋白酶收获为单细胞悬浮液。将每孔五百(500)个细胞接种在50μL/孔培养基中的组织培养板中，并在37C下孵育18-24小时。化合物以DMSO中的400倍最终期望浓度稀释。然后将DMSO中的连续稀释液稀释在培养基中，最终DMSO浓度为0.25％，并且将50μL/孔的最后稀释液添加至细胞(Vf＝100μL)中。电镀和处理后，将细胞再次放回到培养箱中放置另外的72小时。CellTiter-Glo试剂根据制造商的说明书制备，并以100μL/孔添加到培养物中。CellTiter-Glo允许通过定量细胞内ATP浓度的代谢活性细胞的相对计数。在室温下用CellTiter-Glo孵育5分钟后，将125μL/孔的细胞滴度Glo/细胞裂解物溶液转移到黑色测定板中，然后在30分钟内在发光计中读取其数值。从不接受0.25％DMSO以外的任何处理的培养物获得的发光读数被设定为100％对照，并将所有其他的发光值归一化为这些对照(例如，归一化RLU、相对发光单位)。
测定结果示于图3A-3D中且所选的IC50值从下表5中给出的相同数据所得。更具体地，图3A-3D描绘了上述实例3(图3B)的卡奇霉素(图3A)、Val-Cit卡奇霉素(式3)，上述实施4(图3C)的Val-Ala卡奇霉素(式4)和包含上述实例1的肟接头(式1)的卡奇霉素的体外细胞杀死曲线。确定了每种代表性化合物的MES细胞、MES SA/DX细胞和293T对照细胞的细胞杀死能力。
如图3A-3D所示的曲线所示，卡奇霉素和每种接头药物化合物表现出了药学上可接受的活性，并以相对低的浓度杀死了MES SA细胞和293T对照细胞。在这方面，裸露的卡奇霉素在各种浓度下表现出的活性大约比所述接头-药物构建体提供的活性低一个数量级。此外，如所预期，MES SA/DX细胞更具抗性，并且需要较高毒素浓度的裸露毒素和药物-接头构建体来诱导细胞死亡。
关于表5，衍生的IC50值表明裸露的卡奇霉素和细胞毒素对照具有皮摩尔范围内的活性，而卡奇霉素-接头构建体具有纳摩尔范围内的活性。应当理解的是，通过添加接头部分提供的细胞毒性的降低是期望的，因为在药物接头以某种方式与靶向部分分离的情况下，导致了降低的非局部毒性。因此，图3A-3D所示的数据表明所披露的卡奇霉素-接头是被包含在抗体药物缀合物中的有利候选物。
表5.卡奇霉素和卡奇霉素接头构建体的衍生的IC50值
小分子IVK(10nM起始，5X稀释物)
接头药物IVK(1000nM起始，10X稀释物)
实例9
卡奇霉素-接头构建体与细胞结合剂的缀合
为了进一步表征本发明的卡奇霉素-接头构建体，使用包含稳定剂(例如L-精氨酸)和温和还原剂(例如谷胱甘肽)的选择性还原方法将如上述实例3和4中所示制备的二肽基药物-接头化合物与位点特异性抗SEZ6抗体缀合。如上所述，选择性缀合优先将卡奇霉素-接头构建体与抗体上的工程化的游离半胱氨酸缀合，所述缀合具有小的非特异性缀合。
在这方面，hSC17ss1构建体的靶缀合位点是位置214(C214)每个轻链上的未配对半胱氨酸。为了实现这些工程化位点的缀合，在含有1M L-精氨酸/8mM谷胱甘肽、还原(GSH)/5mM EDTA，pH 8.0的缓冲液中，将hSC17ss1的制剂在室温下部分还原最少两个小时。然后将制剂使用30kDa膜(Millipore Amicon Ultra)缓冲液交换到20mM Tris/3.2mM EDTA(pH 7.0)缓冲液中。所得到的部分还原的制剂具有在1.9和2.3之间的游离硫醇浓度，并且然后将所有制剂在4℃下过夜，通过马来酰亚胺基部分缀合到Val-Ala卡奇霉素(hSC17ss1-va)和Val-Cit卡奇霉素(hSC17ss1-vc)。然后使用在水中制备的10mM储备溶液，通过添加1.2摩尔过量的NAC来淬灭反应。在20分钟的最小淬灭时间之后，然后使用30kDa膜(Millipore Amicon Ultra)通过渗滤将抗体-卡奇霉素的制剂渗滤到20mM组氨酸氯(pH6.0)中。
实例10
卡奇霉素ADC的表征
通过AB Sciex 5600三倍飞行时间质谱仪(HR Triple TOF MS)和布鲁克(Bruker)maXis II超高分辨率飞行时间质谱仪(UHR-TOF MS)测定卡奇霉素抗体-药物缀合物的非还原质量。两者都配备了电喷射离子化作用(ESI)来源，其直接偶合到超高效液相层析(UHPLC)系统上。样品首先稀释至1mg/mL，然后以非还原形式进行分析。将蛋白质在具有变性流动相系统的反相柱(Poroshell 300SB-C3，5um，1.0×75mm，安捷伦P/N 661750-909；Acquity BEH300C4，1.7μm，2.1×50mm，沃特斯P/N 186004495)上分离。流动相A是在水中的0.1％(v/v)的甲酸。流动相B是在80％(v/v)2-丙醇、10％(v/v)乙腈、10％(v/v)水(流动相B)中的0.1％(v/v)的甲酸。对每种蛋白质的MS谱(例如，图4A和4B)进行平均化，并且然后解卷积以获得平均质量和单一同位素质量。下表5总结了具有相应缀合的卡奇霉素接头-药物的SC17ss1LC的理论上的和观察到的平均和单一同位素质量。
表6.
该数据表明卡奇霉素-接头构建体成功地缀合到了工程化的抗SEZ6抗体的游离半胱氨酸上。
来自先前实例的抗体药物制剂(以及与其他的制剂(hSC1ss1-vc)，其与CD46免疫特异性地结合并且基本上以与在其他的制剂中相同的方式缀合)进一步通过反相(RP-HPLC)分析表征以量化重链与轻链缀合位点。更具体地，如图5所示，RP-HPLC用于确定hSC17ss1-vc(式4′)、hSC17ss1-va(式5′)和hSC1ss1-vc(式4′)的中靶轻链缀合的百分比(图5)。使用Aeris WIDEPORE 3.6μm C4柱(菲罗门公司(Phenomenex))以及在水中的0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)作为流动相A和在90％(v/v)乙腈中的0.1％(v/v)TFA作为流动相B进行分析。分析之前将样品用DTT完全还原，并且然后注射到柱上，在柱上经15分钟施加30％-70％的流动相B梯度。收集214nm下的UV信号并且然后将其用于计算重链和轻链缀合的程度。
通过将先前建立的峰(轻链、轻链+1种药物、重链、重链+1种药物、重链+2种药物等)的RP-HPLC曲线下的面积积分并且分别计算每条链的缀合百分比来确定重链和轻链上的缀合百分比。如图5所示，对于与Val-Cit和Val-Ala卡奇霉素构建体的缀合，hSC17位点特异性轻链上的缀合百分比为＞80％。与Val-Cit卡奇霉素缀合的hSC1ss1位点特异性也产生＞80％的轻链缀合。上述样品的重链上的缀合百分比对于hSC17位点特异性缀合物为＜15％，对于hSC1ss1位点特异性缀合为＜30％，这是由于与hSC17位点特异性Val-Cit和Val-Ala缀合物各自获得的1.9和1.8的DAR相比，该样品获得了2.3的较高的DAR。在所有情况下，可以进一步优化缀合参数以增加轻链上的缀合百分比，同时减少重链上的缀合百分比。
还使用基于疏水作用层析(HIC)HPLC的方法分析相同的hSC17ss1-vc、hSC17ss1-va和hSC1ss1-vc制剂，以确定相对于ADC的不需要的DAR＞2种类，DAR＝2种类的量。在此方面，使用PolyPropyL A柱(PolyLC公司)进行HIC，水中的1.5M硫酸铵和25mM磷酸钾作为流动相A，并且水中的0.25％w/v CHAPS和25mM磷酸钾作为流动相B。将样品直接注射到柱上，在柱上经15分钟施加0-100％的流动相B梯度。收集280nm下的UV信号，并且分析未缀合的抗体和较高DAR种类的色谱图。通过将先前建立的峰(DAR＝0、DAR＝1、DAR＝2、DAR＝4等)的HIC曲线下面积积分并且计算每个峰的％来进行DAR计算。所得到的hSC17ss1-vc和hSC1ss1-vc的DAR分布如图6所示。由hSC17位点特异性缀合物制剂(未显示hSC17ss1-va的数据)确定的DAR分布表明所有三种缀合物产生了＞65％的DAR＝2。缀合物制剂还产生了小于25％的DAR＜2以及小于15％的DAR＞2。
使用相同的步骤分析了N149、SC27和SC57(IgG1位点特异性抗体与不同决定簇)的随后缀合，如下结果总结在表7中。使用上述HIC方法或下述的尺寸排阻色谱法进行DAR计算。
尺寸排阻色谱法(SEC)用于表征卡奇霉素抗体-药物缀合物的尺寸异质性。分析采用Acquity 1.7μm，4.6×300mm的UPLC BEH200SEC柱，以及在水中的25mM磷酸钠，pH 6.5，500mM L-精氨酸和10％异丙醇(IPA)作为流动相。将样品净注入，并且将流动相以0.2mL/min等度地施用22分钟。收集280nM处的UV信号，并使用峰面积来计算ADC的聚集和分裂程度。
表7.
相对紧密的平均DAR和较低的聚集或分裂速率强烈地表明所得制剂将显示出有利的治疗指数和相对较低的非特异性毒性。
实例11
卡奇霉素ADC在体外杀死抗原表达细胞
为了确定本发明的抗SEZ6 ADC是否能够内化和介导细胞毒性剂向活肿瘤细胞的递送，使用所选择的抗SEZ6 ADC(例如实例9中提供的那些)进行体外细胞杀死测定。
一般如上述实例8所述培养和铺板所述细胞。一天后，将肿瘤细胞以0pM至1000pM的不同浓度暴露于人源化抗SEZ6ADC(hSC17ss1-va、hSC17ss1-vc和包含式1的肟药物-接头的hSC17ss1-ox)。孵育96小时后，如上述实例7所述，使用(Promega公司)计数活细胞。将使用含有未处理细胞的培养物的原始发光计数设为100％参考值，并且将所有其他计数计算为参考值的百分比。
体外测定的结果显示于随附的图7A-7C中。更具体地，图7A显示了hSC17ss1-vc消除抗原表达细胞的能力而图7B和图7C显示hSC17ss1-va和hSC17ss1-ox也是如此。在每一种情况下，转导以过表达SEZ6的293T-SEZ6细胞在显著低于亲本品系(293T)的ADC浓度下被更多地杀死，这表明了ADC对于SEZ6的特异性。图7A-7C中给出的数据证明了抗SEZ6ADC内化并递送细胞毒性卡奇霉素有效负荷的能力，从而支持了所披露的卡奇霉素-接头构建体作为ADC组分的用途。
将使用了适当的靶标表达细胞系的相同程序用于确定N149、SC27和SC57的后续卡奇霉素缀合物的细胞杀死能力，如下结果总结在表8中。
表8：
总体上，靶标特异性ADC以高效率杀死靶标表达细胞，其表现的IC50值相对较低。这些值，与缺乏非靶标表达细胞的杀死结合，指示了治疗上有用的化合物。
实例12
卡奇霉素ADC在体内杀死抗原表达细胞
进行体内实验以确认刚刚在上面的实例11中证实的卡奇霉素ADCshSC17ss1-vc和hSC17ss1-va的细胞杀死性质。为此，在携带具有内源性SEZ6细胞表面蛋白质表达的皮下患者来源的异种移植物(PDX)小细胞肺癌(SCLC)肿瘤的免疫受损的NODSCID小鼠中测试如先前实例所述制备的位点特异性SC17靶向的ADC的体内治疗效果。更具体地说，抗SEZ6ADC在三种不同的SCLC模型中各自进行了测试。
SCLC-PDX系(LU64、LU95和LU149)各自作为解离的细胞接种物被注射在乳腺脂肪垫区附近的皮肤下，并用卡尺每周测量(椭球体积＝a×b2/2，其中a是椭圆的长直径，并且b是短直径)。肿瘤生长至平均尺寸200mm3(范围，100-300mm3)之后，将小鼠随机分到具有相同肿瘤体积平均值的处理组(n＝5只小鼠/组)中。通过腹膜内注射(300μL体积)载体(无菌水中5％葡萄糖)或hSC17ss1-vc和hSC17ss1-va卡奇霉素制剂(0.1-1mg/kg)处理小鼠(每组5只)，全部剂量每4天注射一次(Q4Dx4)，并且通过每周肿瘤体积(用如上所述的卡尺)和体重测量评估治疗效果。单独的小鼠或处理组的终点标准包括健康评估(任何疾病征兆)、体重减轻(从研究开始体重减轻超过20％)和肿瘤负荷(肿瘤体积＞1000mm3)。通过每周肿瘤体积测量值(mm3)监测功效，直到组达到大约800-1000mm3的平均值。将肿瘤体积计算为处理组中所有小鼠的平均值与标准误差均值，并且相对于自初次处理的时间(天)进行绘图。处理结果被描绘在图8A-8C中，其中展示了每个处理组5只小鼠的平均肿瘤体积与标准误差均值(SEM)。
具体地，在所选择的剂量下，在携带SCLC PDX-LU149(图8A)、PDX-LU95(图8B)或PDX-LU64(图8C)的小鼠中评估了hSC17ss1-vc、hSC17ss1-va和hSC17ss1-肟(式14′)ADC以确定其延缓肿瘤生长的能力。在主题附图中呈现的数据证明hSC17ss1-vc和hSC17ss1-vaADC在中等剂量水平(0.3-0.6mg/kg；单次剂量或Q4Dx4给药方案)下具有相似的(hSC17ss1-vc，与hSC17ss1-va相比)或不同的(hSC17ss1-肟，与hSC17ss1-vc相比)治疗效果。此外，还示出了适合的剂量水平，例如本实例中使用的那些(例如，1mg/kg；Q4Dx4)，其可以在携带SCLC PDX的小鼠中实现50天或更长时间的持续反应。
在这些模型中且在给予的剂量下，在SCLC PDX的3只小鼠模型中测试时，hSC17ss1-vc和hSC17ss1-va ADC制剂具有相当的体内疗效。hSC17ss1-肟ADC制剂具有一定的治疗效果，但是在两种SCLC PDX模型中以相同的剂量评估时，其治疗效果小于hSC17ss1-vc。在携带SCLC-PDX肿瘤的小鼠中结合SC17的ADC的体内疗效是剂量水平依赖性的并且在较高剂量水平下更有效。总之，这些数据表明SC17卡奇霉素ADC提供了相当且有力的体内治疗功效。
实例13
小鼠耐受性研究
在免疫受损的NODSCID小鼠中测试了如先前实例中所述制备的hSC17ss1-vc卡奇霉素ADC的体内耐受性。将初试的5-7周龄的小鼠称重(21-28g)，并将其随机分入具有相同平均动物体重的治疗组(n＝每组3-4只小鼠)。通过用静脉内注射(100μL体积)单次剂量的hSC17ss1-vc卡奇霉素制剂(2-16mg/kg)来处理小鼠，并且每周2-3次监测小鼠体重测量数值，持续2至3周。单独的小鼠的终点标准包括体重减轻(从研究开始超过10％)和身体健康(姿态、活动、体温、呼吸频率或任何其他疾病征兆)的评估。结果示于图9，其中随着时间的推移监测了从研究开始的重量百分比(％)的变化。图9中呈现的数据证明，在免疫受损的NODSCID小鼠中，单次剂量为8mg/kg或更低的hSC17ss1-vc耐受性良好。8mg/kg剂量水平的小鼠在治疗后第5天初始体重的减轻开始恢复；然而，用16mg/kg剂量水平治疗的动物未恢复，并且由于健康状况不佳(终点标准)而生病。
实例14
食蟹猴的药物代谢动力学hSC17ss1-vc和hSC27ss1-vc卡奇霉素的药物代谢动力学(PK)
在食蟹猴中评估了如在前面实例中所示制备的ADC。用1.5mg/kg hSC17ss1-vc、2.5mg/kg hSC17ss1-vc、或1.5mg/kg hSC27ss1-vc，通过20分钟静脉内输注每3周一次处理食蟹猴(每组n＝3只雄性)，总共2个剂量(Q3Wx2)。评估药物代谢动力学以确定与毒性相关的暴露(参见实例15)。在每个剂量后的不同时间点上收集血浆样品，并通过夹心ELISA测定模式法测量总抗体(TAb)和ADC分析物浓度。TAb和ADC浓度对比时间数据显示在图10中。
图10中呈现的数据(式4′)证明了卡奇霉素ADC的PK是剂量线性的。MAb暴露大于如期望的ADC暴露。观察到了少量的ADC积累或几乎没有ADC积累。总之，食蟹猴中卡奇霉素ADC的PK与抗体和/或ADC的预期的PK是一致的。
实例15
猴毒物学研究
研究设计：
对食蟹猴(3只/剂量水平)以1.5和2.5mg/kg的剂量水平施用SC17ss1LD19.4，间隔3周，总共2个剂量。最后一次给药3周后将动物进行尸体剖检。终点包括临床观察、体重、血液学、临床化学、凝血、尿液分析、器官重量、宏观病理学和组织病理学。
结果：
在1.5mg/kg/剂量下的SC17ss1LD19.4
通过静脉内连续输注以每3周2次剂量施用1.5mg/kg/剂量的SC17ss1LD19.4的给药是可以耐受的。临床化学和组织病理学中存在测试品相关的变化。在宏观病理学、器官重量、血液学、凝血和尿液分析中没有出现与测试品相关的变化。
临床化学变化通常与剂量有关，并以AST升高为特征。组织病理学变化与肾、皮肤、食道、舌头、膀胱和胸腺的变化有略微而且不一致的剂量相关性。
在2.5mg/kg/剂量下的SC17ss1LD19.4
通过静脉内连续输注以每3周2次剂量施用2.5mg/kg/剂量的SC17ss1LD19.4的给药是可以耐受的。器官重量、血液学、临床化学和组织病理学中出现了测试品相关的变化。宏观病理学、凝血和尿液分析中没有出现测试品相关的变化。
器官重量变化的特征在于胸腺减小和睾丸重量增加。血液学变化的特征在于血小板和网状红血细胞计数的减少。临床化学变化是略微剂量相关的，并且特征在于AST、ALT、总蛋白、球蛋白升高，和白蛋白减少。组织病理学变化与肾、上皮(皮肤、食道、舌头、膀胱)、胸腺和睾丸的变化有略微而且不一致的剂量相关性。
总的来说，所测试的化合物的毒性曲线表明它们在哺乳动物中可以良好耐受并且具有治疗用途。
本领域的普通技术人员应进一步理解，本发明能以其他特定形式实施而不脱离其精神或中心属性。因为本发明的前述描述仅披露了其示例性实施例，所以应理解，应想到其他变化在本发明的范围内。因此，本发明并不局限于在此已经详细描述的具体实施例。而是，应该参考所附权利要求书用于指示本发明的范围和内容。
序列表
<110> 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司
<120> 卡奇霉素构建体和使用方法
<130> 48510-501001WO
<150> US 62/150,693
<151> 2015-04-21
<160> 5
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 2
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
Ala Leu Ala Leu
1
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> bAla
<400> 4
Ala Leu Ala Leu
1
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
Gly Phe Leu Gly
1

Claims (43)

1.一种化合物，或其药学上可接受的盐，其具有式(I)：
Ab-[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]z3
(I)，
其中：
Ab是靶向剂；
W是连接基团；
M是可裂解部分；
L3和L4独立地是接头；
P是二硫键保护基；
D是卡奇霉素或其类似物；
z1和z2独立地是从0至10的整数；并且
z3是从1至10的整数。
2.如权利要求1所述的化合物，其中D包括式(Ia)：
其中：
R1是氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)R1E、-OR1A、-NR1BR1C、-C(O)OR1A、-C(O)NR1BR1C、-SR1D、-SOn1R1B或-SOv1NR1BR1C；
R1A、R1B、R1C、R1D和R1E独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-N(O)2、-SH、-S(O)3H、-S(O)4H、-S(O)2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHS(O)2H、-NHC(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基；并且与同一个氮原子键合的R1B和R1C取代基可以任选地连接以形成取代或未取代的杂环烷基或取代或未取代的杂芳基；
n1是从0至4的整数；并且
v1是1或2。
3.如权利要求2所述的化合物，其中R1是氢、取代或未取代的烷基或-C(O)R1E。
4.如权利要求2所述的化合物，其中所述靶向剂是抗体。
5.如权利要求4所述的化合物，其中所述抗体是嵌合抗体、CDR接枝抗体、人源化抗体或人类抗体或其免疫反应性片段。
6.如权利要求4所述的化合物，其中所述抗体是抗SEZ6抗体。
7.如权利要求4所述的化合物，其中W共价附接至所述抗体内的半胱氨酸残基上。
8.如权利要求7所述的化合物，其中所述半胱氨酸残基是在卡巴特(Kabat)位置C214处。
9.如权利要求4所述的化合物，其中W共价附接至所述抗体内的赖氨酸残基上。
10.如权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其具有式(II)：
其中：
Ab是抗体；
L3是键、-O-、-S-、-NR3B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR3B-、-NR3BC(O)-、-NR3BC(O)NH-、-NHC(O)NR3B-、取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基；
L4是键、-O-、-S-、-NR4B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR4B-、-NR4BC(O)-、-NR4BC(O)NH-、-NHC(O)NR4B-、取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基；
R1是氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)R1E、-OR1A、-NR1BR1C、-C(O)OR1A、-C(O)NR1BR1C、-SR1D、-SOn1R1B或-SOv1NR1BR1C；
P是-O-、-S-、-NR2B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR2B-、-NR2BC(O)-、-NR2BC(O)NH-、-NHC(O)NR2B-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；
M是-O-、-S-、-NR5B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5B-、-NR5BC(O)-、-NR5BC(O)NH-、-NHC(O)NR5B-、-[NR5BC(R5E)(R5F)C(O)]n2-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基或M1A-M1B-M1C；
W是-O-、-S-、-NR6B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR6B-、-NR6BC(O)-、-NR6BC(O)NH-、-NHC(O)NR6B-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基或W1A-W1B-W1C；
M1A键合至L3并且M1C键合至L4；
M1A是键、-O-、-S-、-NR5AB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5AB-、-NR5ABC(O)-、-NR5ABC(O)NH-、-NHC(O)NR5AB-、-[NR5ABCR5AER5AFC(O)]n3-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；
M1B是键、-O-、-S-、-NR5BB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5BB-、-NR5BBC(O)-、-NR5BBC(O)NH-、-NHC(O)NR5BB-、-[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；
M1C是键、-O-、-S-、-NR5CB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5CB-、-NR5CBC(O)-、-NR5CBC(O)NH-、-NHC(O)NR5CB-、-[NR5CBCR5CER5CFC(O)]n5-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；
W1A键合至Ab并且W1C键合至L3；
W1A是键、-O-、-S-、-NR6AB-、-C(O)-、C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR6AB-、-NR6ABC(O)-、-NR6ABC(O)NH-、-NHC(O)NR6AB-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；
W1B是键、-O-、-S-、-NR6BB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR6BB-、-NR6BBC(O)-、-NR6BBC(O)NH-、-NHC(O)NR6BB-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；
W1C是键、-O-、-S-、-NR6CB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR6CB-、-NR6CBC(O)-、-NR6CBC(O)NH-、-NHC(O)NR6CB-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；
R1A、R1B、R1C、R1D、R1E、R2B、R3B、R4B、R5B、R5E、R5F、R5AB、R5AE、R5AF、R5BB、R5BE、R5BF、R5CB、R5CE、R5CF、R6B、R6AB、R6BB和R6CB独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-N(O)2、-SH、-S(O)3H、-S(O)4H、-S(O)2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHS(O)2H、-NHC(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基；并且与同一个氮原子键合的R1B和R1C取代基可以任选地连接以形成取代或未取代的杂环烷基或取代或未取代的杂芳基；
n1是从0至4的整数；
v1是1或2；
n2、n3、n4和n5独立地是从1至10的整数；
z1和z2独立地是从0至10的整数；并且
z3是从1至10的整数。
11.如权利要求10所述的化合物，其中M是M1A-M1B-M1C，其中：
M1A键合至L3并且M1C键合至L4。
12.如权利要求10所述的化合物，其中W是W1A-W1B-W1C，其中W1A键合至Ab并且W1C键合至L3。
13.如权利要求10所述的化合物，其中P是取代或未取代的烷基。
14.如权利要求10所述的化合物，其中z3是1或2。
15.如权利要求10所述的化合物，其中L3是取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基。
16.如权利要求10所述的化合物，其中L4是取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基。
17.如权利要求10所述的化合物，其中R1是氢或-C(O)R1E。
18.如权利要求10所述的化合物，其中W是取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。
19.如权利要求18所述的化合物，其中W是5元或6元的取代或未取代的杂环亚烷基。
20.如权利要求19所述的化合物，其中W具有式：
21.如权利要求10所述的化合物，其中M包含肽。
22.如权利要求10所述的化合物，其中：
M1A是键、取代或未取代的杂亚烷基或-[NR5ABC(R5AE)(R5AF)C(O)]n3-；
M1B是键、取代或未取代的杂亚烷基或-[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-；并且
M1C是键或取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基。
23.如权利要求10所述的化合物，其中M1A和M1B独立地是氨基酸。
24.如权利要求10所述的化合物，其中M1A或M1B中至少一个是缬氨酸(val)。
25.如权利要求10所述的化合物，其中M1A或M1B中至少一个是丙氨酸(ala)。
26.如权利要求10所述的化合物，其中M1A或M1B中至少一个是瓜氨酸(cit)。
27.如权利要求10所述的化合物，其中M1A、M1B或M1C中至少一个是取代的亚芳基。
28.如权利要求10所述的化合物，其中M1A、M1B或M1C中至少一个具有式(III)：
其中：
Y是-NH-、-O-、-C(O)NH-或-C(O)O-；并且
n6是从0至3的整数。
29.如权利要求10所述的化合物，其中-[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]是：
30.如权利要求10所述的化合物，其中-[W-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D]具有式：
31.一种药物组合物，其包含如权利要求1至30中任一项所述的化合物。
32.一种在对其有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求31所述的药物组合物或如权利要求1至30中一项所述的化合物。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述癌症选自胰腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和胃癌。
34.如权利要求32所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用另外的化学治疗剂。
35.一种将卡奇霉素细胞毒素递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与如权利要求1至30中任一项所述的化合物接触。
36.一种制备抗体药物缀合物的方法，所述方法包括使卡奇霉素构建体与抗体的半胱氨酸或赖氨酸接触，所述卡奇霉素构建体具有式W1-(L3)z1-M-(L4)z2-P-D，其中W1是与赖氨酸侧链或半胱氨酸侧链反应的官能团，M是可裂解部分，L3和L4独立地是接头，P是二硫键保护基，并且D是卡奇霉素或其类似物。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述卡奇霉素构建体与所述抗体的特定半胱氨酸接触。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述特定半胱氨酸衍生自天然二硫桥键。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述抗体是工程化抗体，并且所述特定半胱氨酸不是衍生自天然二硫桥键。
40.如权利要求36至39中任一项所述的方法，其中所述特定半胱氨酸在所述接触前被选择性还原。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述选择性还原所述抗体的步骤包括使所述抗体与稳定剂接触的步骤。
42.一种化合物，其具有式(IV)：
L3是键、-O-、-S-、-NR3B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR3B-、-NR3BC(O)-、-NR3BC(O)NH-、-NHC(O)NR3B-、取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基；
L4是键、-O-、-S-、-NR4B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR4B-、-NR4BC(O)-、-NR4BC(O)NH-、-NHC(O)NR4B-、取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的杂亚烷基；
R1是氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)R1E、-OR1A、-NR1BR1C、-C(O)OR1A、-C(O)NR1BR1C、-SR1D、-SOn1R1B或-SOv1NR1BR1C；
P是-O-、-S-、-NR2B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR2B-、-NR2BC(O)-、-NR2BC(O)NH-、-NHC(O)NR2B-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；
M是-O-、-S-、-NR5B-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5B-、-NR5BC(O)-、-NR5BC(O)NH-、-NHC(O)NR5B-、-[NR5BC(R5E)(R5F)C(O)]n2-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基或M1A-M1B-M1C；
W1是氢、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-N3、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)R7E、-OR7A、-NR7BR7C、-C(O)OR7A、-C(O)NR7BR7C、-NO2、-SR7D、-SOn7R7B、-SOv7NR7BR7C、-NHNR7BR7C、-ONR7BR7C、-NHC(O)NHNR7BR7C；
M1A键合至L3并且M1C键合至L4；
M1A是键、-O-、-S-、-NR5AB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5AB-、-NR5ABC(O)-、-NR5ABC(O)NH-、-NHC(O)NR5AB-、-[NR5ABCR5AER5AFC(O)]n3-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；
M1B是键、-O-、-S-、-NR5BB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5BB-、-NR5BBC(O)-、-NR5BBC(O)NH-、-NHC(O)NR5BB-、-[NR5BBC(R5BE)(R5BF)C(O)]n4-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；
M1C是键、-O-、-S-、-NR5CB-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)NR5CB-、-NR5CBC(O)-、-NR5CBC(O)NH-、-NHC(O)NR5CB-、-[NR5CBCR5CER5CFC(O)]n5-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的杂亚芳基；
R1A、R1B、R1C、R1D、R1E、R2B、R3B、R4B、R5B、R5E、R5F、R5AB、R5AE、R5AF、R5BB、R5BE、R5BF、R5CB、R5CE、R5CF、R6B、R7A、R7B、R7C、R7D、R7E独立地是氢、卤素、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-N(O)2、-SH、-S(O)3H、-S(O)4H、-S(O)2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHS(O)2H、-NHC(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3、-OCCl3、-OCBr3、-OCI3、-OCHF2、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基；并且与同一个氮原子键合的R1B和R1C取代基可以任选地连接以形成取代或未取代的杂环烷基或取代或未取代的杂芳基；
n1和n7独立地是从0至4的整数；
v1和v7独立地是1或2；并且
n2、n3、n4和n5独立地是从1至10的整数。
43.如权利要求42所述的化合物，其中所述化合物是：
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