ES2856927T3 - Conjugados de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 - Google Patents

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Puja Sapra
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AbbVie Stemcentrx LLC
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Abstract

Conjugado anticuerpo-fármaco de fórmula: Ab-(L-D), en el que: Ab es un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 37 y una cadena ligera que tiene una secuencias de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 47; y L es un enlazador y D es una auristatina, en el que el enlazador y la auristatina tienen la fórmula: **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de fármaco-anticuerpo anti-PTK7
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación se refiere a anticuerpos contra proteína tirosina quinasa 7 (PTK7) y conjugados anticuerpofármaco. La presente divulgación se refiere además a los procedimientos de uso de dichos anticuerpos y conjugados anticuerpo-fármaco para el tratamiento del cáncer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La proteína tirosina quinasa 7 (PTK7), también conocida como quinasa 4 de carcinoma de colon (CCK4), es un receptor tirosina quinasa originalmente clonado a partir de melanocitos humanos normales y por separado de tejido de carcinoma de colon. Se han identificado altos niveles de PTK7 en varias células tumorales, incluidos cánceres de vejiga, mama, colorrectal, riñón y pulmón y melanoma. La expresión de PTK7 también se ha observado en células de leucemia mieloide adulta (LMA) y leucemia linfoblástica aguda (LLA).
El tratamiento del cáncer ha mejorado en la última década con la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia como las opciones de tratamiento primario. Dichos tratamientos pueden prolongar la supervivencia y/o aliviar los síntomas en muchos pacientes, pero no es probable que produzcan una cura para muchos pacientes. En consecuencia, sigue existiendo una necesidad significativa de opciones terapéuticas adicionales para los cánceres.
Con este fin, la presente invención proporciona nuevos conjugados anticuerpo-fármaco que reconocen cánceres PTK7-positivos. Los conjugados fármaco-anticuerpo anti-PTK7 descritos pueden ejercer un efecto citotóxico clínicamente útil sobre células tumorales que expresan PTK7 sin ejercer efectos indeseables sobre células que no expresan PTK7.
El documento US 2013/0129753 A1 se refiere a péptidos citotóxicos y conjugados de fármacos-anticuerpos de los mismos. El documento US 2013/0122020 A1 se refiere a anticuerpos específicos para el antígeno 2 de superficie celular del trofoblasto y sus usos.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
En base a la divulgación de este documento, la presente invención proporciona el objeto definido en las reivindicaciones adjuntas.
La presente divulgación proporciona conjugados fármaco-anticuerpo anti-PTK7 y su uso en la detección, la profilaxis y terapia de trastornos asociados PTK7. Un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la divulgación tiene generalmente la fórmula: Ab-(L-D), en la que Ab es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a PTK7, o un fragmento de unión a PTK7 del mismo; y L-D es un resto enlazador-fármaco, en el que L es un enlazador y D es un fármaco.
El Ab del conjugado anticuerpo-fármaco descrito puede ser cualquier anticuerpo de unión a PTK7. En algunos aspectos de la divulgación, el Ab es un anticuerpo quimérico, injertado con CDR, humanizado o humano recombinante, o un fragmento de unión a PTK7 del mismo. En algunos aspectos de la invención, el Ab es un anticuerpo internalizante y/o un anticuerpo neutralizante.
La presente divulgación también proporciona conjugados fármaco-anticuerpo anti-PTK7 y su uso en la detección, la profilaxis y la terapia de trastornos asociados PTK7. Un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la divulgación tiene generalmente la fórmula: Ab-(L-D), en la que Ab es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a PTK7, o un fragmento de unión a PTK7 del mismo; y L-D es un resto enlazador-fármaco, en el que L es un enlazador y D es un fármaco.
En aspectos particulares de la divulgación, el Ab es un anticuerpo hu23, hu24, o hu58, o un anticuerpo que compite por la unión a PTK7 humana con hu23, hu24, o hu58, y/o un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo hu23, hu24 o hu58. Por ejemplo, el Ab puede competir por la unión a PTK7 humana con y/o unirse al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende (a) una región variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 15; (b) una región variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 25 y una región variable de cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 39; o (c) una región variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 49 y una región variable de cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 63.
Entre los Abs que compiten por unirse a la PTK7 humana con hu23, y/o se unen al mismo epítopo que hu23, los Abs representativos útiles para preparar conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la divulgación incluyen anticuerpos que comprenden al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en la que al menos una región variable de cadena pesada comprende tres CDR definidas por SEQ ID NO: 3, 7 y 11. Los Abs adicionales incluyen anticuerpos que comprenden al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, donde la al menos una región variable de cadena ligera comprende tres CDR definidas como SEQ ID NO: 17, 19 y 21. Los Abs adicionales incluyen anticuerpos que comprenden (a) una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR establecidas como SEQ ID NO: 3, 7 y 11;y (b) una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR establecidas como SEQ ID NO: 17, 19 y 21.
En otros conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la divulgación, el Ab comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 1 y una variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 15, por ejemplo, una región variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 15.
Entre los Abs que compiten por unirse a la PTK7 humana con hu24, y/o se unen al mismo epítopo que hu24, los Abs representativos útiles para preparar conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la divulgación incluyen anticuerpos que comprenden al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en la que al menos una región variable de cadena pesada comprende tres CDR definidas por SEQ ID NO: 27, 31 y 35. Los Abs adicionales incluyen anticuerpos que comprenden al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, donde la al menos una región variable de cadena ligera comprende tres CDR definidas como SEQ ID NO: 41, 43 y 45. Los Abs adicionales incluyen anticuerpos que comprenden (a) una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR establecidas como SEQ ID NO: 27, 31 y 35; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR establecidas como SEQ ID NO: 41, 43 y 45.
En otros conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la divulgación, el Ab comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 25 y una variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a SEQ ID NO: 39, por ejemplo, una región variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 25 y una región variable de cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 39.
Entre los Abs que compiten por unirse a la PTK7 humana con hu58, y/o se unen al mismo epítopo que hu58, los Abs representativos útiles para preparar conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la divulgación incluyen anticuerpos que comprenden al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en la que al menos una región variable de cadena pesada comprende tres CDR definidas por SEQ ID NO: 51, 55 y 59. Los Abs adicionales incluyen anticuerpos que comprenden al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, donde la al menos una región variable de cadena ligera comprende tres CDR definidas como SEQ ID NO: 65, 67 y 69. Los Abs adicionales incluyen anticuerpos que comprenden (a) una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR establecidas como SEQ ID NO: 51, 55 y 59; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR establecidas como SEQ ID NO 65, 67 y 69.
En otros conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la divulgación, el Ab comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 49 y una variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 63, por ejemplo, una región variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 49 y una región variable de cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 63.
En algunos aspectos de la divulgación, los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco comprenden un Ab que comprende una región constante de cadena pesada de IgG1, una región constante de cadena ligera kappa o una región constante de cadena pesada de IgG1 y una región constante de cadena ligera kappa. Por ejemplo, los Abs útiles para preparar conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la divulgación incluyen anticuerpos que comprenden una cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 13, una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 23, o una cadena pesada establecida como SEQ. ID NO: 13 y una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 23. Ejemplos adicionales incluyen anticuerpos que comprenden una cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 37, una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 47, o una cadena pesada como SEQ ID NO: 37 y una cadena ligera como SEQ ID NO: 47. Otros ejemplos adicionales incluyen anticuerpos que comprenden una cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 61, una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 71, o una cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 61 y una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 71.
En otros aspectos de la divulgación, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la divulgación comprende un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 1, 25, o 49. En otros aspectos de la divulgación, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la divulgación comprende un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 15, 39 o 63.
En aspectos particulares de la divulgación, el Ab es un anticuerpo hu23, hu24 o hu58, o un anticuerpo que compite por la unión a PTK7 humana con un anticuerpo hu23, hu24 o hu58 y/o un anticuerpo que se une al mismo epítopo que anticuerpo hu23, hu24 o hu58. Por ejemplo, el Ab puede competir por la unión a PTK7 humana con y/o unirse al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende (a) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 13 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 23; (b) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 25 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 39; o (c) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 49 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 63.
En otro aspecto de la divulgación, el Ab es un anticuerpo humanizado monoclonal, tal como un anticuerpo hu23, hu24 o hu58.
Cualquiera de los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco según la invención puede prepararse con un enlazador que es escindible o no escindible. En un aspecto, el enlazador escindible puede ser maleimidocaproil-valina-citrulinap-aminobenciloxicarbonilo (vc). En otro aspecto, el enlazador escindible puede ser ácido 4 (4'acetilfenoxi)butanoico (AcBut). En otro aspecto, el enlazador no escindible puede ser maleimidocaproilo (mc).
Cualquiera de los conjugados de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 descritos en este documento se pueden preparar con un fármaco que es auristatina. En un aspecto, la auristatina puede ser 0101 (2-Metilalanil-N-[(3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1 -{(2S)-2-[(1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il] -N-metil-L-valinamida). En otro aspecto, la auristatina puede ser 8261 2-Metilalanil-N-[(3R, 4S, 5S)-1-{(2S)-2-[(1R, 2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida.
Cualquiera de los conjugados de fármacos-anticuerpos anti-PTK7 descritos en este documento se pueden preparar con un fármaco que es caliqueamicina, incluyendo derivados de N-acetilo de caliqueamicina, tal como N-acetil-ycaliqueamicina y N-acetil-y-caliqueamicina dimetil hidrazida (CM).
Cualquiera de los anticuerpos de PTK7 descritos en el presente documento puede usarse en un conjugado anticuerpofármaco mediante conjugación con un resto enlazador-fármaco (LD). En un aspecto, el LD puede ser vc0101 (N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il) hexanoil] -L-valil-N- {4 -[( 21S, 24S, 25R) -24 -[(2S) -butan-2-il] -25-(2 - {(2S) -2 - [(1R, 2R) -1-metoxi-2-metil-3- oxo-3 - {[(1S) -2-fenil-1- (1,3-tiazol-2-il) etil] amino} propil] pirrolidin-1 -il} -2-oxoetil) -18,18,23 -trimetil-3,16,19,22-tetraoxo-21-(propan-2-il) -2,7,10,13,26-pentaoxa-4,17,20,23-tetraazaheptacos-1-il] fenilo } -N~5—carbamoil-L-ornitinamida). En otro aspecto, el LD puede ser mc8261 (N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il) hexanoil] -2-metilalanil-N -[(3R, 4S , 5S) -1 -{(2S) -2 -[(1R, 2R) -3 -{[(1S) -1-carboxi-2-feniletil] amino} -1-metoxi-2- metil-3-oxopropilo ] pirrolidin-1-il} -3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il] -N-metil-L-valinamida). En otro aspecto más, la LD puede ser AcButCM (ácido 4 (4'acetilfenoxi) butanoico N-acetil-Y-caliqueamicina dimetilhidrazida). Cualquiera de los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco descritos en el presente documento puede tener una relación fármacoanticuerpo (DAR) de 1 a 8.
En un aspecto particular de la divulgación, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la fórmula Ab-(L-D) comprende (a) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, Ab, que comprende una cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 23; y (b) un resto enlazadorfármaco, L-D, donde L es un enlazador y D es un fármaco, donde el enlazador es maleimidocaproil-valina-citrulina-paminobenciloxicarbonilo (vc), y donde el fármaco es 0101.
En otro aspecto de la invención, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la fórmula Ab-(L-D) comprende (a) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, Ab, que comprende una cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 37 y una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 47; y (b) un resto enlazador-fármaco, L-D, donde L es un enlazador y D es un fármaco, donde el enlazador es maleimidocaproil-valina-citrulina-paminobenciloxicarbonilo (vc), y donde el fármaco es 0101.
En otro aspecto de la divulgación, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la fórmula Ab-(L-D) comprende (a) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, Ab, que comprende una cadena pesada establecida como SEQ ID NO : 61 y una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 71; y (b) un resto enlazador-fármaco, L-D, donde L es un enlazador y D es un fármaco, donde el enlazador es maleimidocaproil-valina-citrulina-paminobenciloxicarbonilo (vc), y donde el fármaco es 0101.
En otro aspecto de la divulgación, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la fórmula Ab-(L-D) comprende (a) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, Ab, que comprende una cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 23; y (b) un resto enlazador-fármaco, L-D, en el que L es un enlazador y D es un fármaco, en el que el enlazador es maleimidocaproilo (mc) y en el que el fármaco es 8261.
En otro aspecto de la divulgación, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la fórmula Ab-(L-D) comprende (a) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, Ab, que comprende una cadena pesada establecida como SEQ ID NO : 37 y una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 47; y (b) un resto enlazador-fármaco, L-D, en el que L es un enlazador y D es un fármaco, en el que el enlazador es maleimidocaproilo (mc) y en el que el fármaco es 8261.
En otro aspecto de la divulgación, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la fórmula Ab-(L-D) comprende (a) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, Ab, que comprende una cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 61 y una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 71; y (b) un resto enlazador-fármaco, L-D, en el que L es un enlazador y D es un fármaco, en el que el enlazador es maleimidocaproilo (mc) y en el que el fármaco es 8261.
En otro aspecto de la divulgación, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la fórmula Ab-(L-D) comprende (a) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, Ab, que comprende una cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 23; y (b) un resto enlazador-fármaco, L-D, donde L es un enlazador y D es un fármaco, donde el enlazador es AcBut (ácido 4 (4'acetilfenoxi)butanoico) y donde el fármaco es CM (N-acetil-Y-caliqueamicina dimetilhidrazida).
En otro aspecto de la divulgación, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la fórmula Ab-(L-D) comprende (a) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, Ab, que comprende una cadena pesada establecida como SEQ ID NO : 37 y una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 47; y (b) un resto enlazador-fármaco, L-D, donde L es un enlazador y D es un fármaco, donde el enlazador es AcBut (ácido 4 (4'acetilfenoxi) butanoico) y donde el fármaco es CM (N-acetil-Y-caliqueamicina dimetilhidrazida).
En otro aspecto de la divulgación, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la fórmula Ab-(L-D) comprende (a) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, Ab, que comprende una cadena pesada establecida como SEQ ID NO : 61 y una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 71; y (b) un resto enlazador-fármaco, L-D, donde L es un enlazador y D es un fármaco, donde el enlazador es AcBut (ácido 4 (4'acetilfenoxi) butanoico) y donde el fármaco es CM (N-acetil-Y-caliqueamicina dimetilhidrazida).
La presente divulgación proporciona composiciones que comprenden una pluralidad de conjugados anticuerpofármaco descrito en el presente documento y opcionalmente un portador farmacéutico, en el que la composición tiene un DAR promedio dentro del intervalo de 1 a 8. En un aspecto particular de la divulgación, la composición de puede tener un DAR promedio dentro del inrtervalo de 3 a 5. En otro aspecto de la divulgación, la composición puede tener un DAR promedio dentro del intervalo de 3 a 4. En otro aspecto de la divulgación, la composición puede tener un DAR promedio de alrededor de 4.
La presente divulgación proporciona además una composición que comprende una pluralidad de un conjugado de anticuerpo-fármaco descrito en el presente documento y opcionalmente un vehículo farmacéutico, en la que la composición tiene al menos 50% de conjugados anticuerpo-fármaco que tienen un DAR de 3 a 5. En otro aspecto de la divulgación, la composición tiene al menos un 60% de conjugados anticuerpo-fármaco que tienen un DAR de 3 a 5.
La presente divulgación proporciona además un conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco que es generalmente de la fórmula: Ab-(LD), en la que Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a PTK7 o un fragmento de unión a PTK7 del mismo; y L-D es un resto enlazador-fármaco, en el que L es vc o mc o AcBut, y D es un fármaco.
La presente divulgación proporciona además un conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco que generalmente es de la fórmula: Ab-(L-D), en la que Ab es un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a PTK7, o un fragmento de unión a PTK7 del mismo; y L-D es un resto enlazador-fármaco, en el que L es un enlazador y D es una auristatina (tal como 0101 u 8261) o c M.
La presente divulgación proporciona además procedimientos para preparar un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 descrito en el presente documento. Por ejemplo, un proceso para producir un conjugado anticuerpo-fármaco puede incluir las etapas de (a) unir el enlazador al fármaco; (b) conjugar el resto enlazador-fármaco con el anticuerpo; y (c) purificar el conjugado anticuerpo-fármaco.
Otro aspecto de la divulgación incluye procedimientos de fabricación, procedimientos de preparación, procedimientos de síntesis, procedimientos de conjugación y procedimientos de purificación de los conjugados anticuerpo-fármaco descritos en este documento y los intermedios para la preparación, síntesis y conjugación de los conjugados de anticuerpo-fármaco descritos en el presente documento.
Además se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco descrito en este documento y un portador farmacéuticamente aceptable.
En otros aspectos, se proporcionan procedimientos para tratar un trastorno asociado a PTK7 mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 descrito en el presente documento. Los trastornos representativos asociados a PTK7 incluyen trastornos hiperproliferativos, como trastornos neoplásicos, como tumores sólidos (por ejemplo, cáncer de mama, tal como cáncer de mama triple negativo (TNBC), cáncer de mama con receptor de progesterona positivo (PR +), cáncer de mama con receptor de estrógeno positivo (ER+) y cáncer de mama doble positivo; cáncer de ovario; cáncer colorrectal; cáncer de esófago; cáncer gástrico; melanoma; sarcoma; cáncer de riñón; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer de hígado, tal como carcinoma hepatocelular (HCC); y cáncer de pulmón, tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), etc. ) y neoplasias malignas hematológicas (por ejemplo, leucemia, tal como leucemia mieloide del adulto (AML) o leucemia linfoblástica aguda (ALL), etc.). También se proporcionan usos de los conjugados de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 descritos para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno asociado a PTK7 en un sujeto. También se proporcionan conjugados de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado a PTK7.
En otros aspectos, la presente divulgación proporciona procedimientos para tratar un trastorno asociado a PTK7 en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco descrito en este documento y un agente quimioterapéutico.
Otro aspecto de la divulgación incluye procedimientos de tratamiento de un trastorno caracterizado por la sobreexpresión de PTK7 en un paciente con un conjugado de anticuerpo-fármaco descrito en este documento. En otros aspectos, la presente divulgación proporciona procedimientos para tratar el cáncer caracterizados por la sobreexpresión de PTK7 en un paciente con un conjugado anticuerpo-fármaco descrito en el presente documento.
En otros aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimiento para reducir las células iniciadoras de tumores en una población de células tumorales. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender poner en contacto una población de células tumorales, en el que la población comprende células iniciadoras de tumores y células tumorales distintas de las células iniciadoras de tumores, con un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7; por lo que se reduce la frecuencia de células iniciadoras de tumores en la población de células tumorales. La etapa de contacto puede realizarse in vitro o in vivo.
Otro aspecto de la divulgación incluye los usos de diagnóstico y terapéuticos para los compuestos y composiciones descritos en este documento.
Otros aspectos de la divulgación incluyen artículos de fabricación, es decir, kits, que comprenden un conjugado de anticuerpo-fármaco descrito en el presente documento, un recipiente, y un prospecto o etiqueta que indica un tratamiento.
Estos y otros aspectos de la divulgación se entenderán mediante una revisión de la solicitud como un todo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 proporciona la secuencia de aminoácidos de una proteína PTK7 de longitud completa representativa (SEQ ID NO. 73)
Las figuras 2A-B muestran que la unión a hu24 se correlaciona con la expresión celular de PTK7. (A) Inmunotransferencia de lisados de células enteras con anticuerpos anti-PTK7 y anti-GAPDH. La señal de inmunotransferencia se había validado previamente al demostrar la pérdida de señal cuando la expresión del gen de PTK7 fue inhibida por siARN. (B) Valores medios de intensidad de fluorescencia de la citometría de flujo con anti-PTK7 (hu24) en las mismas líneas de células cancerosas que en la inmunotransferencia. La línea de puntos representa la señal cuando el anticuerpo primario era un anticuerpo de control negativo en lugar de hu24.
La figura 3 muestra la expresión de PTK7 en muestras de tejido de siete modelos PDX mediante inmunohistoquímica. La tinción indica PTK7. Se muestran micrografías representativas para cada modelo. Barra de escala, 100 |jM.
Las figuras 4A-C son gráficos que muestran la expresión de ARNm de PTK7 en tumores primarios. Se muestran (A) cánceres de mama; (B) cánceres de NSCLC y (C) cáncer de ovario.
La figura 5 es un gráfico que muestra una correlación entre una mayor expresión de ARNm de PTK7 y peores tasas de supervivencia global en pacientes con NSCLC.
La figura 6 es un gráfico que muestra los niveles de proteína PTK7 en suero de humanos sanos y pacientes con cáncer que representan 8 tipos de tumores diferentes. Las líneas horizontales indican el valor medio de cada grupo.
La figura 7 proporciona el análisis de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) de hu24-vc0101.
La figura 8 es un gráfico que muestra la eficacia de los ADC anti-PTK7-vc0101 en la PDX de cáncer de mama triple negativo (TNBC) Breast-l3 (BR13).
La figura 9 es una tabla de datos que muestra la eficacia de los ADC hu24-vc0101 y anti-PTK7-mc8261 en elPDX de TNBC de BR13.
La figura 10 es un gráfico de los datos de la figura 9 que muestra la eficacia de los ADC hu24-vc0101 y anti-PTK7-mc8261 en el PDX de TNBC BR13.
La figura 11 es un gráfico que muestra la eficacia de los ADC anti-PTK7-vc0101 en el PDX de TNBC Breast-22 (BR22).
La figura 12 es una tabla de datos que muestra la eficacia de los ADC hu23-vc0101 y anti-PTK7-mc8261 en el PDX de TNBC BR22.
La figura 13 es un gráfico de los datos de la figura 12 que muestra la eficacia de los ADC hu23-vc0101 y anti-PTK7-mc8261 en el PDX de TNBC BR22.
La figura 14 es un gráfico que muestra la eficacia de los ADC anti-PTK7-vc0101 en el PDX de TNBC Breast-31 (BR31).
La figura 15 es un gráfico que muestra la eficacia de ADC hu24-vc0101 en el PDX de TNBC Breast-64 (BR64). La figura 16 es un gráfico que muestra la eficacia de ADC hu24-vc0101 en el PDX de TNBC BR5.
La figura 17 es un gráfico que muestra la eficacia de ADC hu24-vc0101 en PDX de PR TNBC de BR36.
Las figuras 18A-B es un gráfico que muestra la eficacia de hu24-vc0101 y hu23-AcBut CM en dos modelos PDX SCLC diferentes (A) modelo PDX H1048 y (B) modelo PDX SCLC 95.
Las figuras 19A-B es un gráfico que muestra la eficacia de hu24-AcButCM en dos modelos PDX SCLC diferentes (A) un modelo PDX SCLC 117 y (B) un modelo PDX SCLC 102.
La figura 20 es un gráfico que muestra la eficacia de ADC hu24-vc0101 en el PDX de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) Lung-135 (LU135).
La figura 21 es un gráfico que muestra la eficacia de ADC hu24-vc0101 en el PDX de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) Lung-176 (LU176).
La figura 22 muestra micrografías de la estructura de los microtúbulos después del tratamiento con 4 pg/ml de ADC hu24-vc0101, 4 pg/ml de mAb hu24 no conjugado, 4 pg/ml de ADC de control negativo o 0,1 nM de auristatina 0101 libre. Las células H661 se trataron durante 48 horas y luego se tiñeron con antitubulina y DAPI para visualizar el ADN.
La figura 23 muestra el efecto de ADC hu24-vc0101 sobre células endoteliales in vitro.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación proporciona conjugados anticuerpo-fármaco que se unen a PTK7, procedimientos para preparar los conjugados usando anticuerpos anti-PTK7, enlazadores, y fármacos. Los conjugados anticuerpo-fármaco de la invención son útiles para la preparación y fabricación de composiciones, tales como medicamentos que pueden usarse en el diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento de trastornos hiperproliferativos caracterizados por la expresión de PTK7. En algunos aspectos de la divulgación, los conjugados de anticuerpo-fármaco divulgados pueden reducir la frecuencia de células iniciadoras de tumores (TIC), que abarcan tanto células de perpetuación de tumores (TPC) como células progenitoras de tumores altamente proliferativos (TProg).
I. Fisiología de PTK7
La proteína tirosina quinasa (PTK7), también conocida como quinasa 4 de carcinoma de colon (CCK4), es un receptor tirosina quinasa originalmente clonado a partir de melanocitos humanos normales (Lee et al., Oncogene 8 (12): 3403­ 3410, 1993) y por separado del tejido de carcinoma de colon (Mossie et al., Oncogene 11 (10): 2179-2184, 1995). El gen de PTK7 está ubicado en 6p21.1-pl2.2. Se han clonado cinco isoformas de corte y empalme de PTK7 humana a partir de ADNc de testículo (Jung et al., Biochim Biophys Acta 1579, 2002). La abundancia relativa de las isoformas entre sí difiere entre las líneas de testículo y hepatoma o carcinoma de colon, pero se desconoce la importancia funcional de estas isoformas, si las hay. Los análisis bioinformáticos han sugerido que el ratón puede expresar una isoforma de PTK7 soluble a partir de ARNm empalmados alternativamente (Forrest, Taylor et al., Genome Biol 7, 2006).
La proteína PTK7 de longitud completa es una proteína transmembrana de tipo I, con un dominio extracelular de 674 aminoácidos (ECD), seguido por una porción que abarca TM corto y un dominio citoplásmico de 345 aminoácidos. En la Figura 1 se muestra una secuencia de aminoácidos representativa de longitud completa de PTK7 (SEQ ID NO.
73). Las secuencias de aminoácidos de las isoformas representativas de PTK7 se encuentran en los números de acceso de GenBank EAX04154.1 (isoforma a), EAX04155.1 (isoforma b), EAX04156.1 (isoforma c), EAX04157.1 (isoforma d), EAX04158.1 (isoforma e), EAX04159.1 (isoforma f) y EAX04160.1 (isoforma g). Todas las isoformas codifican el mismo dominio intracelular. Una secuencia de ácido nucleico completa de una isoforma representativa de PTK7 humana (es decir, la variante de transcripción PTK7-1), tiene el número de acceso de Genbank NM_002821.
El ECD de PTK7 de longitud completa maduro comprende siete dominios de tipo inmunoglobulina, mientras que las diversas variantes de empalme codifican isoformas PTK7 que difieren en su estructura de ECD. Todas las isoformas contienen un dominio citoplasmático con una homología sustancial al encontrado en la clase general de tirosina quinasas. Sin embargo, PTK7 carece de actividad de tirosina quinasa detectable y, como tal, pertenece a una subfamilia de pseudokinasas en la que varios cambios de aminoácidos en varios subdominios de quinasas conservados conducen a una unión deteriorada de ATP (Boudeau, et al., Trends Cell Biol. 16, 2006). Específicamente, los residuos clave en los subdominios I y VII están alterados en PTK7 de manera que se verían afectadas las interacciones directas con los fosfatos no transferibles de ATP, así como la quelación del cofactor Mg 2+ que une estos fosfatos.
La importancia biológica de la función de PTK7 se puede inferir de la presencia de ortólogos conservados desde Hydra hasta Drosophila hasta pollos y humanos, cada uno de los cuales, mediante análisis de secuencia, se predice que carece de actividad quinasa. Sobre la base de la alta conservación de un motivo de dominio de TM específico asociado con una propensión a la asociación hélice-hélice, se ha sugerido que el dominio de TM puede mediar la dimerización de PTK7. No se espera que el propio dominio de pseudoquinasa de PTK7 transmita directamente la señal, pero puede interactuar como un andamio para otras moléculas en la vía de señalización, o puede reclutar otras tirosina cinasas. Se ha demostrado que PTK7 puede funcionar en la adhesión celular, la migración celular, la polaridad celular, la proliferación, la reorganización del citoesqueleto de actina y la apoptosis para regular la embriogénesis, la organización del tejido epitelial, el cierre del tubo neuronal, la formación de la cresta neuronal, y la guía del axón (Peradziryi, H. et al. Arch Biochem Biophys 524, 2012).
Los tejidos y células normales que se ha descrito que expresan PTK7 incluyen pulmón, tiroides, ovario, CD4 células T de emigrantes tímicos recientes, y los progenitores mieloides normales y células de médula ósea CD34 CD38. Con respecto a los tejidos cancerosos, también se ha encontrado expresión de PTK7 en células de carcinoma de colon, muestras de leucemia mieloide adulta (LMA), células CD34-pre-TALL y carcinoma gástrico. PTK7 puede perderse en ciertos cánceres de mama que contienen deleciones del cromosoma 6p21, aunque la expresión es variable en las líneas celulares de cáncer de mama. PTK7 también se expresa en adenocarcinoma de pulmón. El mapeo fino de las amplificaciones de la región 6pl 2-p21 en osteosarcomas ha demostrado que los aumentos en el número de copias de genes no necesariamente dan como resultado una sobreexpresión de PTK7, según lo determinado por qRT-PCR.
El ligando o ligandos de PTK7 no se conocen, aunque PTK7 se ha relacionado con una variedad de vías de señalización biológica y procesos de desarrollo. Por ejemplo, PTK7 actúa como un correceptor tanto en las vías de señalización no canónicas (también conocidas como señalización de polaridad celular Wnt/planar) como en las vías de señalización Wnt canónicas. En la vía Wnt no canónica, PTK7 activa la señalización aguas abajo mediante la interacción directa con RACK1 y el reclutamiento de DSH en el complejo del receptor localizado en la membrana. PTK7 ejerce un efecto inhibidor sobre la transducción de señales de la vía Wnt canónica a través de la competencia por la unión del receptor encrespado en la superficie de la membrana. La expresión del gen PTK7 está regulada por Cdx, mientras que la estabilidad de la proteína está regulada por la degradación de proteinasa asociada a la membrana. PTK7 está dirigido a la degradación proteolítica y desprendimiento de dominios extracelulares por las metaloproteinasas MMP14 y Adam17, lo que conduce a una mayor proliferación celular, migración y facilita la invasión de células cancerosas (Peradziryi, et al. Arch Biochem Biophys. 524, 2012). Se usó PTK7 soluble (sPTK7) para mostrar un papel de PTK7 en la angiogénesis inducida por VEGF, así como en la formación, migración e invasión de tubos in vitro de células endoteliales humanas.
Dentro de los tejidos cancerosos, además de su potencial para la modulación de las vías de Wnt, PTK parece transmitir señales anti-apoptóticas y pro-proliferación y en la línea de carcinoma de colon HCT116, fenotipos que podría ser revertidos por knock-down de PTK7 mediada por ARNi (Meng, et al., 2010, PLoS One 5 (11): e14018). Las señales apoptóticas anti-PTK7 transmitían resistencia a la muerte celular mediada por antraciclinas en blastos de leucemia mieloide (LMA) adulta, que podría revertirse utilizando una proteína PTK7-Fc soluble (Prebet, et al., 2010, Blood 116 (13): 2315-23). La sobreexpresión de PTK7 por células cancerosas específicas se ha aprovechado en una estrategia para dirigir la liberación de daunorrubicina a células T-ALL en cultivo utilizando aptámeros que se unen a PTK7 y posteriormente se internalizan.
II. Conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco
La presente divulgación proporciona conjugados anticuerpo-fármaco de fórmula Ab-(L-D), en la que (a) Ab es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a PTK7, y (b) L-D es un resto enlazadorfármaco, donde L es un enlazador y D es un fármaco. También se proporcionan procedimientos para preparar y fabricar tales conjugados de anticuerpo-fármaco, y el uso de los mismos en aplicaciones clínicas. "Conjugado anticuerpo-fármaco" o "ADC" se refiere a anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, incluidos los derivados de anticuerpos que se unen a PTK7 y se conjugan con un fármaco, tal como un agente citotóxico, citostático y/o terapéutico, como se describe más adelante a continuación. Por ejemplo, un agente citotóxico se puede unir o conjugar a un anticuerpo anti-PTK7 como se describe en el presente documento para la administración local dirigida del agente citotóxico a tumores (por ejemplo, tumores que expresan PTK7).
Tal como se usa en este documento, el término "PTK7" incluye variantes, isoformas, homólogos, ortólogos y parálogos. PTK7 también se conoce en la técnica como quinasa 4 de carcinoma de colon (CCK4 o CCK-4). Para los propósitos de la presente solicitud, se entenderá que los términos "PTK7" y "CCK4" se usan indistintamente e incluyen variantes de empalme, isoformas, ortólogos y homólogos de especies de PTK7 humana o CCK4 humana. Se entenderá además que los términos también pueden referirse a cualquier derivado o fragmento de una forma nativa o variante de PTK7 o CCK4 que contenga un epítopo al que se pueda unir específicamente un anticuerpo anti-PTK7.
En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos y los conjugados anticuerpo-fármaco reaccionan de forma cruzada con PTK7 de especies distintas de la humana, tal como PTK7 de ratón, rata o primate, así como diferentes formas de PTK7 (por ejemplo, PTK7 glicosilada). En otros aspectos, los anticuerpos y los conjugados anticuerpofármaco pueden ser completamente específicos para PTK7 humana y pueden no exhibir reactividad cruzada de especies u otros tipos de reactividad cruzada. Como se usa en este documento, el término PTK7 se refiere a PTK7 humana de origen natural a menos que el contexto indique lo contrario. Por lo tanto, un "anticuerpo anti-PTK7" o "anticuerpo anti-PTK7" u otra designación similar, significa cualquier anticuerpo (como se define en el presente documento) que se asocia, se une o reacciona con la PTK7 humana, o un fragmento o derivado de la misma. Además, un "conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7" o "conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7" significa cualquier conjugado anticuerpo-fármaco o ADC (tal como se define en el presente documento) que se asocia, une o reacciona con PTK7 humana o fragmento o derivado de la misma.
"Enlazador (L)" describe el enlace directo o indirecto del anticuerpo al fármaco. La unión de un enlazador a un anticuerpo se puede lograr de diversas formas, tal como mediante lisinas de superficie, acoplamiento reductor a carbohidratos oxidados, residuos de cisteína liberados al reducir los enlaces disulfuro entre cadenas, residuos de cisteína reactivos diseñados en sitios específicos y etiqueta que contiene glutamina donante de acilo o una glutamina endógena que se vuelve reactiva por modificación de polipéptidos en presencia de transglutaminasa y una amina. Se conocen en la técnica una variedad de sistemas de enlace ADC, que incluyen enlaces basados en hidrazona, disulfuro y péptido.
"Fármaco (D)" es cualquier sustancia que tiene actividad biológica o detectable, por ejemplo, agentes terapéuticos, marcadores detectables, agentes, etc., y profármacos, que se metabolizan a un agente activo in vivo. Los términos fármaco, carga útil y compuesto se utilizan indistintamente.
"L-D" es un resto enlazador-fármaco resultante de un fármaco (D) unido a un enlazador (L).
Los términos científicos y técnicos adicionales usados en conexión con la presente invención, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, tendrán los significados que se entienden comúnmente por los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. Generalmente, la nomenclatura usada en relación con las técnicas de cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en el presente documento son bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica.
En un aspecto particular de la divulgación, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la fórmula Ab-(L-D) comprende (a) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, Ab, que comprende una región variable de la cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 15; y (b) un resto enlazador-fármaco, L-D, donde L es un enlazador y D es un fármaco, donde el enlazador es maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilo (vc), y donde el fármaco es 0101.
En otro aspecto de la divulgación, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la fórmula Ab-(L-D) comprende (a) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, Ab, que comprende una cadena pesada establecida como SEQ ID NO : 13 y una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 23; y (b) un resto enlazador-fármaco, L-D, donde L es un enlazador y D es un fármaco, donde el enlazador es maleimidocaproil-valina-citrulina-paminobenciloxicarbonilo (vc), y donde el fármaco es 0101.
En otro aspecto de la divulgación, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la fórmula Ab-(L-D) comprende (a) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, Ab, que comprende una región variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 25 y una región variable de cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 39; y (b) un resto enlazador-fármaco, L-D, donde L es un enlazador y D es un fármaco, donde el enlazador es maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilo (vc), y donde el fármaco es 0101.
En otro aspecto de la invención, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la fórmula Ab-(L-D) comprende (a) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, Ab, que comprende una cadena pesada establecida como SEQ ID NO : 37 y una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 47; y (b) un resto enlazador-fármaco, L-D, donde L es un enlazador y D es un fármaco, donde el enlazador es maleimidocaproil-valina-citrulina-paminobenciloxicarbonilo (vc), y donde el fármaco es 0101.
En otro aspecto de la divulgación, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la fórmula Ab-(L-D) comprende (a) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, Ab, que comprende una región variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 49 y una región variable de cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 63; y (b) un resto enlazador-fármaco, L-D, donde L es un enlazador y D es un fármaco, donde el enlazador es maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilo (vc), y donde el fármaco es 0101.
En otro aspecto de la divulgación, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la fórmula Ab-(L-D) comprende (a) un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, Ab, que comprende una cadena pesada establecida como SEQ ID NO : 61 y una cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 71; y (b) un resto enlazador-fármaco, L-D, donde L es un enlazador y D es un fármaco, donde el enlazador es maleimidocaproil-valina-citrulina-paminobenciloxicarbonilo (vc), y donde el fármaco es 0101.
El DAR (relación de fármaco a anticuerpo) o la carga de fármaco, que indica el número de moléculas de fármaco conjugadas por anticuerpo, puede ser de 1 a 8. Las composiciones, lotes y/o formulaciones de una pluralidad de conjugados anticuerpo-fármaco pueden caracterizarse por un DAR promedio. El DAR y el DAR promedio se pueden determinar mediante diversos medios convencionales, tales como espectroscopia UV, espectroscopia de masas, ensayo ELISA, procedimientos radiométricos, cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), electroforesis y HPLC.
En aspectos particulares de la invención, los ADC anti-PTK7 purificados pueden no tener anticuerpos no conjugados (anticuerpos libres) presentes. En otros aspectos de la invención, los ADC anti-PTK7 purificados pueden ser ADC monoméricos y los agregados y dímeros están ausentes. En otros aspectos de la invención, los ADC anti-PTK7 purificados pueden no tener presente fármaco libre. En aspectos adicionales de la invención, los ADC anti-PTK7 purificados pueden ser ADC monoméricos y no tener presente fármaco libre.
IIA. Anticuerpos anti-PTK7
Para la preparación de conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la divulgación, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser cualquier anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a PTK7. Los anticuerpos de la presente divulgación se describen y caracterizan además en la Publi­ cación Internacional PCT No. WO 2012/112943, más particularmente, las secuencias de anticuerpos anti-PTK7 des­ critos en la misma, incluyendo cadenas ligeras y pesadas completas, regiones variables de las mismas y CDR de las mismas.
Para el uso en la preparación de conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser aislado, purificado, o derivatizado.
Un "anticuerpo" o "Ab" es una molécula de inmunoglobulina capaz de reconocer y unirse a una diana o antígeno específico, tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, que se encuentra en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" puede abarcar cualquier tipo de anticuerpo, incluidos, entre otros, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, "fragmentos de unión a antígeno" (o porción), tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, Fc, etc. de anticuerpos intactos que mantienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno determinado (por ejemplo, PKT7), una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos heteroconjugados, mutantes de los mismos, proteínas de fusión que tienen un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, (por ejemplo, un anticuerpo de dominio), anticuerpos de cadena única (ScFv) y de dominio único (por ejemplo, anticuerpos de tiburón y camélido), maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (ver, por ejemplo, Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23 (9): 1126-1136), anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que incluye un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, incluida variantes de glicosilación de anticuerpos, variantes de secuencias de aminoácidos de anticuerpos y anticuerpos modificados covalentemente. Los anticuerpos puede ser murino, de rata, humano o de cualquier otro origen (incluidos los anticuerpos quiméricos o humanizados). En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco descritos es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano recombinante, o fragmento de unión a PTK7 del mismo.
Un anticuerpo, un conjugado de anticuerpo-fármaco o un polipéptido que "se une específicamente" o "se une preferentemente" (usado indistintamente en el presente documento) a una diana o antígeno (por ejemplo, Proteína PTK7) es un término bien entendido en la técnica, y los procedimientos para determinar dicha unión específica o preferencial también son bien conocidos en la técnica. Se dice que una molécula exhibe "unión específica" o "unión preferencial" si reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia particular que con células o sustancias alternativas. Un anticuerpo "se une específicamente" o "se une preferentemente" a una diana o antígeno si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de la que se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente o preferentemente a un epítopo PTK7 es un anticuerpo que se une a este epítopo con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de la que se une a otros epítopos PTK7 o epítopos no PTK7.
El término "afinidad de unión" o "Kd", tal como se utiliza aquí, pretende referirse a la constante de equilibrio de disociación de una interacción particular anticuerpo-antígeno. La Kd es la relación entre la velocidad de disociación, también llamada "off-rate" o "Kd", y la velocidad de asociación, o "on-rate" o "Ka". Por tanto, Kd es igual a Kd/Kay se expresa como una concentración molar (M). De ello se deduce que cuanto más pequeña es la Kd, más fuerte es la afinidad de unión. Por tanto, una Kd de 1 |jM indica una afinidad de unión débil en comparación con una Kd de 1 nM. Los valores de Kd de anticuerpos se pueden determinar usando procedimientos bien establecidos en la técnica. Un procedimiento para determinar la Kd de un anticuerpo es mediante el uso de resonancia de plasmón de superficie, típicamente usando un sistema biosensor, tal como un sistema BIACORE®.
La unión específica de los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco dados a conocer se refiere a una unión preferencial de un conjugado anticuerpo-fármaco al antígeno PTK7 humana en una muestra heterogénea que tiene múltiples antígenos diferentes. Típicamente, la unión específica tiene lugar si la afinidad de unión del conjugado anticuerpo-fármaco, o la porción de anticuerpo (Ab) del mismo, es al menos aproximadamente 10'7 M o mayor, tal como al menos aproximadamente 10'8 M o mayor, incluyendo al menos aproximadamente 10'9 M o mayor, al menos aproximadamente 10'1° M o mayor, al menos aproximadamente 10'11 M o mayor, o al menos aproximadamente 10'12 M o mayor. Por ejemplo, la unión específica de un conjugado de anticuerpo-fármaco, o porción de anticuerpo (Ab) del mismo, de la invención a un antígeno PTK7 humano incluye la unión en el intervalo de al menos aproximadamente 1 X 10 '7 M a aproximadamente 1 X 10'12M, tal como dentro del intervalo de aproximadamente 1 X 10 '8 M a aproximadamente 1 X 10'12 M, o dentro del intervalo de aproximadamente 1 X 10'8 M a aproximadamente 1 X 10'11 M, o dentro del intervalo de aproximadamente 1 X 10'8 M a aproximadamente 1 X 10'1°M, o dentro del intervalo de aproximadamente 1 X 10-9M a aproximadamente 1 X 10 -10M. La unión específica también se refiere al direccionamiento selectivo de un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco, o una porción de anticuerpo (Ab) del mismo, a células que expresan PTK7 después de la administración del anticuerpo a un sujeto.
También se entiende que un anticuerpo (o resto o epítopo) que específicamente o preferencialmente se une a una primera diana puede o no específicamente o preferentemente unirse a una segundo diana. Como tal, la "unión específica" o la "unión preferencial" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) una unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a unión significa unión preferencial.
Tal como se usa en este documento, "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T o, en cualquier caso, interactua con una molécula. Los determinantes epitópicos generalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como cadenas laterales de aminoácidos o carbohidratos o azúcares y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser "lineal" o "conformacional". En un epítopo lineal, todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula que interactúa (tal como un anticuerpo) tienen lugar linealmente a lo largo de la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción incluyen residuos de aminoácidos en la proteína que están separados entre sí. Una vez que se determina un epítopo deseado en un antígeno, es posible generar anticuerpos contra ese epítopo, por ejemplo, usando las técnicas descritas en la presente divulgación. Alternativamente, durante el proceso de descubrimiento, la generación y caracterización de anticuerpos puede dilucidar información sobre epítopos deseables. A partir de esta información, es posible cribar de manera competitiva anticuerpos para la unión al mismo epítopo. Un enfoque para lograr esto es realizar estudios de competencia cruzada para encontrar anticuerpos que se unan competitivamente entre sí, es decir, los anticuerpos compiten por unirse al antígeno. En la publicación internacional PCT n° WO 03/48731 se describe un proceso de alto rendimiento para "agrupar" anticuerpos en función de su competencia cruzada. Como se usa en este documento, el término "agrupar" se refiere a un procedimiento para agrupar anticuerpos basándose en sus características de unión a antígeno y la competición entre sí.
Un "anticuerpo aislado", tal como se usa aquí, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a PTK7 está sustancialmente libre de anticuerpos que específicamente se unen a antígenos distintos de PTK7). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente exento de otro material celular y/o productos químicos. Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a PTK7 puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de PTK7 de otras especies (es decir, un ortólogo) o con más de una isoforma de PTK7.
En algunos aspectos de la divulgación, un conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco incluye un anticuerpo que compite por la unión a PTK7 humana con, y/o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene (a) una región variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 15; o (c) una región variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 25 y una región variable de cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 39; o (c) una región variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 49 y una región variable de cadena ligera establecida como SEQ ID NO: 63.
El término "competir", tal como se usa en este documento con respecto a un anticuerpo, significa que un primer anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo de una manera suficientemente similar a la unión de un segundo anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de modo que el resultado de la unión del primer anticuerpo con su epítopo análogo disminuye de forma detectable en presencia del segundo anticuerpo en comparación con la unión del primer anticuerpo en ausencia del segundo anticuerpo. La alternativa, en la que la unión del segundo anticuerpo a su epítopo también disminuye de forma detectable en presencia del primer anticuerpo, puede ser el caso, pero no necesariamente. Es decir, un primer anticuerpo puede inhibir la unión de un segundo anticuerpo a su epítopo sin que ese segundo anticuerpo inhiba la unión del primer anticuerpo a su epítopo respectivo. Sin embargo, cuando cada anticuerpo inhibe de forma detectable la unión del otro anticuerpo con su epítopo o ligando afín, ya sea en el mismo, mayor o menor grado, se dice que los anticuerpos “compiten de forma cruzada” entre sí por la unión de su epítopo o epítopos respectivos. Tanto los anticuerpos que compiten como los que compiten de forma cruzada están incluidos en la presente divulgación. Independientemente del mecanismo por el cual se produzca dicha competencia o competencia cruzada (por ejemplo, impedimento estérico, cambio conformacional o unión a un epítopo común, o parte del mismo), el experto en la materia entendería, basándose en las enseñanzas proporcionadas en este documento, que dichos anticuerpos de competición y/o anticuerpos de competencia cruzada se incluyen y pueden ser útiles para los procedimientos descritos en este documento.
Los anticuerpos nativos o de origen natural, y las inmunoglobulinas nativas, son típicamente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en el otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que determinados residuos de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y pesada. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos.
Los anticuerpos y los dominios de anticuerpos mencionados anteriormente pueden describirse como "polipéptidos", "oligopéptidos", "péptidos" y "proteínas", es decir, cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, preferiblemente, relativamente cortas (por ejemplo, 10-100 aminoácidos). La cadena puede ser lineal o ramificada, puede comprender aminoácidos modificados y/o puede estar interrumpida por no aminoácidos. Se entiende además que los polipéptidos pueden presentarse como cadenas simples o cadenas asociadas. Se puede hacer referencia a los aminoácidos en el presente documento por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidas o por los símbolos de una letra recomendados por IUPAC-IUB Biochemical. Los términos "polipéptidos", "oligopéptidos", "péptidos" y "proteínas" también abarcan una cadena de aminoácidos que ha sido modificada de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con un componente de marcaje. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Las modificaciones de aminoácidos se pueden realizar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica y muchos de estos procedimientos son bien conocidos y rutinarios para el experto en la materia. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, las sustituciones, deleciones e inserciones de aminoácidos pueden realizarse usando cualquier técnica basada en PCR bien conocida. Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse mediante mutagénesis dirigida al sitio (véase, por ejemplo, Zoller y Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10: 6487-6500; y Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82: 488).
Una "región constante" de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena ligera del anticuerpo o la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Las regiones constantes de anticuerpos anti-PTK7 quiméricos y humanizados pueden derivarse de regiones constantes de cualquiera de IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, cualquier isotipo de los mismos (por ejemplo, isotipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de IgG), así como subclases y versiones mutadas de las mismas. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la región constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tal como la unión al receptor Fc (FcR), la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo, la opsonización, el inicio de la citotoxicidad dependiente del complemento y desgranulación de mastocitos. Tal como se conoce en la técnica, el término "región Fc" se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. La "región Fc" puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define habitualmente para que se extienda desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta su extremo carboxilo. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice UE como en Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland, 1991. La región Fc de una inmunoglobulina tiene generalmente dos regiones constantes, CH2 y CH3.
Tal como se usa en la técnica, "receptor Fc" y "FcR" describen un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRM y FcyRIII, que incluyen variantes alélicas y formas empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores de FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos. Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9: 457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4: 25-34, 1994; y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41, 1995. "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587-593 (1976); y Kim et al. European J. Immunol., 24: 2429-2434 (1994)).
Se ha descrito anteriormente de que ciertos residuos presumiblemente presentes en la superficie del dominio CH2 o CH3 de la cadena pesada de anticuerpos, o en el dominio constante de la cadena ligera, o de otro modo accesible, son adecuados para la sustitución del aminoácido de tipo salvaje de origen natural con, por ejemplo, cisteína, y por lo tanto son útiles para diseñar un sitio capaz de conjugarse con varios agentes.
Por "polipéptido Fc modificado", "región Fc modificada" y "Fc modificado" como los términos se usan indistintamente en el presente documento, se entiende como un polipéptido de Fc, o parte del mismo, que comprende al menos una mutación, por ejemplo, una sustitución de aminoácido, introduciendo un sitio para la conjugación. La mutación introduce una cisteína en lugar del residuo de aminoácido de origen natural en esa posición, donde la mutación crea un sitio reactivo (por ejemplo, un grupo sulfhidrilo reactivo) para la conjugación de un resto al Fc.
El término "etiqueta que contiene glutamina donador de acilo" o "etiqueta glutamina" tal como se utiliza aquí se refiere a un polipéptido o una proteína que contiene uno o más residuos de Gln que actúan como un aceptor de amina de transglutaminasa.
Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Como se conoce en la técnica, las regiones variables de la cadena pesada y ligera consisten en cuatro regiones marco (FR) conectadas por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad mediante las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Hay al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) un enfoque basado en la variabilidad de secuencia entre especies (es decir, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Al-Lazikani et al. J. Molec. Biol. 273: 927-948 (1997). Tal como se utiliza en el presente documento, una CDR puede referirse a CDR definidas por cualquiera de los enfoques o por una combinación de ambos.
Una CDR de un dominio variable son residuos de aminoácidos dentro de la región variable que se identifican de acuerdo con las definiciones de Kabat, Chothia, la acumulación de Kabat y Chothia, VBASE2, AbM, contacto y/o definiciones conformacionales o cualquier procedimiento de determinación de CDR bien conocida en la técnica. Las CDR de anticuerpos pueden identificarse como las regiones hipervariables originalmente definidas por Kabat et al. Véase, por ejemplo, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, NIH, Washington DC. Las posiciones de las CDR también pueden identificarse como las estructuras de bucle estructural descritas originalmente por Chothia y otros. Véase, por ejemplo, Chothia et al., Nature 342: 877-883, (1989). Las posiciones de CDR también pueden derivarse de un análisis de la base de datos VBASE2. (Véase, por ejemplo, Retter et al., 2005, Nucleic Acids Res.
Otros enfoques para la identificación de CDR incluyen la "definición de AbM", que es un compromiso entre Kabat y Chothia y se obtiene utilizando el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (ahora ACCELRYs®), o la "definición de contacto" de CDR basada en contactos de antígeno observados, expuesto en MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262: 732 - 745, (1996). En otro enfoque, denominado en el presente documento como la "definición conformacional" de las CDR, las posiciones de las CDR pueden identificarse como los residuos que hacen contribuciones entálpicas a la unión del antígeno. Véase, por ejemplo, Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283: 1156-1166, 2008. Es posible que otras definiciones de límites de CDR no sigan estrictamente uno de los enfoques anteriores, pero no obstante se superpondrán con al menos una parte de las CDR de Kabat, aunque pueden acortarse o alargarse a la luz de la predicción o los hallazgos experimentales de que residuos o grupos de residuos particulares o incluso CDR enteras no impactan significativamente en la unión del antígeno. Como se usa en este documento, una CDR puede referirse a las CDR definidas por cualquier enfoque conocido en la técnica, incluidas combinaciones de enfoques. Los procedimientos usados en este documento pueden utilizar CDR definidas de acuerdo con cualquiera de estos enfoques. Para los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco descritos en el presente documento, las CDR se pueden definir de acuerdo con cualquiera de Kabat, Chothia, extendido, VBASE2, AbM, contacto y/o definiciones conformacionales.
En otros aspectos de la divulgación, el anticuerpo anti-PTK7, o fragmento de unión a antígeno del mismo, incluye una o más CDR del anticuerpo (tal como una, dos, tres, cuatro, cinco o todas las seis CDR).
Para la presente divulgación, las CDR de hu23, hu24, y hu58 expuestas en la Tabla 1 a continuación (SEQ ID NOS: 1-72) se obtuvieron utilizando Kabat y Chothia. Las CDR como se expone en la FIG. 6 de la publicación internacional PCT n° WO 2012/112943 se derivaron de un análisis de la base de datos VBASE2. Por consiguiente, los anticuerpos que tienen CDR definidas por toda esta nomenclatura se incluyen expresamente dentro del alcance de la presente divulgación. De manera más amplia, la expresión "residuo de aminoácido de CDR de región variable" incluye aminoácidos en una CDR identificada usando cualquier procedimiento basado en secuencia o estructura, tal como se establece anteriormente.
En algunos aspectos de la divulgación, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 incluye un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene CDR de un anticuerpo hu23. Por ejemplo, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que incluye al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en donde la al menos una región variable de cadena pesada tiene tres CDR establecidas como SEQ ID NO: 3, 7 y 11. En algunos aspectos de la divulgación, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 incluye un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en la que al menos una región variable de cadena ligera tiene tres CDR establecidas como SEQ ID NO: 17, 19 y 21. Un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la divulgación también puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que incluye (a) una región variable de cadena pesada que tiene tres CDR indicadas como SEQ ID NO: 3, 7 y 11; y (b) una región variable de cadena ligera que tiene tres CDR establecidas como SEQ ID NO: 17, 19 y 21.
En otros aspectos de la divulgación, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 incluye un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una o más CDR de hu23 definidas según Chothia o derivadas de un análisis de la base de datos VBASE2. Por ejemplo, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en donde la al menos una región variable de cadena pesada incluye tres CDR de hu23 definidas por Chothia (ver Tabla 1) o tres CDR de hu23 derivadas de un análisis de la base de datos VBASE2 (ver Publicación Internacional PCT No. WO 2012/112943). Como otro ejemplo, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en la que la al menos una región variable de cadena ligera incluye tres CDR de hu23 definidas por Chothia (ver Tabla 1) o tres CDR de hu23 derivadas de un análisis de la base de datos VBASE2 (véase la publicación internacional PCT n° WO 2012/112943). En algunos aspectos de la divulgación, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la divulgación puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene (a) una región variable de cadena pesada que tiene tres CDR de hu23 definidas según Chothia (ver Tabla 1); y (b) una región variable de cadena ligera que tiene tres CDR de hu23 definidas según Chothia (ver Tabla 1). En algunos aspectos de la divulgación, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la divulgación puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene (a) una región variable de cadena pesada que incluye tres CDR de hu23 derivadas de un análisis de la base de datos VBASE2 (véase la publicación internacional PCT n° WO 2012/112943); y (b) una región variable de cadena ligera que incluye tres CDR de hu23 derivadas de un análisis de la base de datos VBASE2 (véase la publicación internacional PCT n° WO 2012/112943).
En otros aspectos de la divulgación, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 incluye un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene CDR de un anticuerpo hu24. Por ejemplo, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en donde la al menos una región variable de cadena pesada incluye tres CDR establecidas como SEQ ID NO: 27, 31 y 35. En algunos aspectos de la divulgación, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 incluye un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en la que al menos una región variable de cadena ligera incluye tres CDR establecidas como SEQ ID NO: 41, 43 y 45. Un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la divulgación también puede incluir (a) una región variable de cadena pesada que tiene tres CDR establecidas como SEQ ID NO: 27, 31 y 35; y (b) una región variable de cadena ligera que tiene tres CDR establecidas como SEQ ID NO: 41, 43 y 45.
En otros aspectos de la divulgación, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 incluye un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una o más CDR de hu24 definidas según Chothia o derivadas de un análisis de la base de datos VBASE2. Por ejemplo, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en donde la al menos una región variable de cadena pesada incluye tres CDR de hu24 definidas por Chothia (ver Tabla 1) o tres CDR de hu24 derivadas de un análisis de la base de datos VBASE2 (ver Publicación Internacional PCT No. W o 2012/112943). Como otro ejemplo, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en la que la al menos una región variable de cadena ligera incluye tres CDR de hu24 definidas por Chothia (ver Tabla 1) o tres CDR de hu24 derivadas de un análisis de la base de datos VBASE2 (véase la publicación internacional PCT n° WO 2012/112943). En algunos aspectos de la divulgación, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la divulgación puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene (a) una región variable de cadena pesada que tiene tres CDR de hu24 definidas según Chothia (ver Tabla 1); y (b) una región variable de cadena ligera que tiene tres CDR de hu24 definidas según Chothia (ver Tabla 1). En algunos aspectos de la divulgación, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la divulgación puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene (a) una región variable de cadena pesada que incluye tres CDR de hu24 derivadas de un análisis de la base de datos VBASE2 (véase la publicación internacional PCT n° WO 2012/112943); y (b) una región variable de cadena ligera que incluye tres CDR de hu24 derivadas de un análisis de la base de datos VBASE2 (véase la publicación internacional PCT n° WO 2012/112943).
En otros aspectos de la divulgación, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 incluye un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene CDR de un anticuerpo hu58. Por ejemplo, un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en donde la al menos una región variable de cadena pesada incluye tres CDR expuestas como SEQ ID NO: 51, 55 y 59. En algunos aspectos de la divulgación, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 incluye un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en la que la al menos una región variable de cadena ligera incluye tres CDR establecidas como SEQ ID NO: 65, 67 y 69. Un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la divulgación también puede incluir (a) una región variable de cadena pesada que tiene tres CDR establecidas como SEQ ID NO: 51, 55 y 59; y (b) una región variable de cadena ligera que tiene tres CDR establecidas como SEQ ID NO: 65, 67 y 69.
En otros aspectos de la divulgación, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 incluye un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una o más CDR hu58 definidas según Chothia o derivadas de un análisis de la base de datos VBASE2. Por ejemplo, un conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en donde la al menos una región variable de cadena pesada incluye tres hu58 CDR definidas por Chothia o tres CDR hu58 derivadas de un análisis de la base de datos VBASE2. Como otro ejemplo, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en el que al menos una región variable de cadena ligera incluye tres CDR hu58 definidas por Chothia o tres CDR hu58 derivadas de un análisis de la base de datos VBASE2. En algunos aspectos de la divulgación, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la divulgación puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene (a) una región variable de cadena pesada que tiene tres CDR hu58 definidas según Chothia; y (b) una región variable de cadena ligera que tiene tres CDR hu58 definidas según Chothia. En algunos aspectos de la divulgación, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la divulgación puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene (a) una región variable de cadena pesada que incluye tres CDR hu58 derivadas de un análisis de la base de datos VBASE2.
En algunos aspectos de la invención, los anticuerpos usados para preparar conjugados de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la invención serán anticuerpos monoclonales. El término "anticuerpo monoclonal" o "mAb" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante del antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizarán de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975), o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante como los descritos en la patente de EE. UU. N° 4.816.567. Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse de bibliotecas de fagos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990), por ejemplo.
En algunos aspectos de la invención, los anticuerpos usados para preparar conjugados anticuerpo-fármaco de la invención serán monovalentes, es decir, tendrán un sitio de unión al antígeno por molécula (por ejemplo, IgG o Fab). En algunos casos, un anticuerpo monovalente puede tener más de un sitio de unión al antígeno, pero los sitios de unión son de diferentes antígenos. En algunos aspectos de la invención, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de un conjugado anticuerpo-fármaco de la invención puede incluir un "anticuerpo bivalente", es decir, que tiene dos sitios de unión a antígeno por molécula (por ejemplo, IgG). En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades de antígeno. Alternativamente, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos. Un anticuerpo "biespecífico", "dual-específico" o "bifuncional" es un anticuerpo híbrido que tiene dos sitios de unión de antígeno diferentes. Los dos sitios de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico se unen a dos epítopos diferentes, que pueden residir en las mismas o diferentes dianas de proteínas.
El término "anticuerpo quimérico" pretende hacer referencia a anticuerpos en los que parte o la totalidad de las secuencias de la región variable se derivan de una especie y las secuencias de la región constante son derivadas de otras especies, tales como un anticuerpo en el que las secuencias de región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de la región constante se derivan de un anticuerpo humano.
Como se usa en el presente documento, anticuerpo "humanizado" o "CDR injertado" se refiere a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) que son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Preferiblemente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una o más regiones determinantes complementarias (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una o más CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como el ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas.
En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede incluir residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de marco o CDR importadas, pero que se incluyen para refinar y optimizar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado incluirá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR. son los de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también incluirá de manera óptima al menos una porción de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. En algunos aspectos de la invención, los anticuerpos tienen regiones Fc modificadas, tal como se describe en la Publicación Internacional PCT No. WO 99/58572. Otras formas de anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 o CDR H3) que pueden estar alteradas con respecto al anticuerpo original, que también se denominan una o más CDR "derivadas de" una o más CDR del anticuerpo original.
La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al. Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al. Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias CDR o CDR de roedores o roedores mutantes por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Véanse también las Patentes de Estados Unidos N° 5.225.539; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5.859.205. En algunos casos, los residuos dentro de las regiones marco de una o más regiones variables de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n° 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762 y 6.180.370). Además, los anticuerpos humanizados pueden incluir residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo (por ejemplo, para obtener la afinidad deseada). En general, el anticuerpo humanizado incluirá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también incluirá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para obtener más detalles, consulte Jones et al. Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al. Nature 332: 323 - 327 (1988); y Presta Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593 - 596 (1992). En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" pueden incluir anticuerpos en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de marco se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.225.539; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5.859.205. Véase también la Patente de Estados Unidos N° 6.180.370 y la Publicación Internacional PCT N° WO 01/27160, donde se describen anticuerpos humanizados y técnicas para producir anticuerpos humanizados que tienen una afinidad mejorada por un antígeno predeterminado.
"Anticuerpo humano recombinante" o "anticuerpo completamente humano" se refiere a aquellos anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o que se ha elaborado usando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos conocidos por los expertos. en la técnica o se describe en este documento. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos que tienen al menos un polipéptido de cadena pesada humana o al menos un polipéptido de cadena ligera humana. Un ejemplo de este tipo es un anticuerpo que tiene polipéptidos de cadena ligera murina y de cadena pesada humana. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14: 309-314, (1996); Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (Estados Unidos) 95: 6157-6162, (1998); Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227 (2): 381 - 388 (1992); Marks et al., J. Mol. Biol., 222 (3): 581 - 597 (1991)). Los anticuerpos humanos también se pueden preparar mediante la inmunización de animales en los que se han introducido transgénicamente loci de inmunoglobulina humana en lugar de los loci endógenos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena se han inactivado parcial o completamente. Este enfoque se describe en las Patentes de Estados Unidos N° 5.545.807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5.661.016. Alternativamente, el anticuerpo humano puede prepararse inmortalizando linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (tales linfocitos B pueden recuperarse de un individuo o de la clonación de células individuales del ADNc, o pueden haber sido inmunizados in vitro). Véase, por ejemplo, Cole et al. Anticuerpos monoclonales y terapia contra el cáncer, Alan R. Liss, p. 77, (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1): 86 - 95, (1991); y la patente de EE.UU. N° 5.750.373.
Los anticuerpos de la divulgación se pueden producir usando técnicas bien conocidas en la técnica, por ejemplo, tecnologías recombinantes, tecnologías de presentación de fagos, tecnologías sintéticas o combinaciones de dichas tecnologías u otras tecnologías fácilmente conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Jayasena, SD, Clin Chem., 45: 1628-50 (1999) y Fellouse, FA, et al., J. Mol. Biol., 373 (4): 924-40 (2007)). Puede encontrarse orientación adicional en Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2000); Ausubel et al., Protocolos cortos en biología molecular: un compendio de procedimientos de protocolos actuales en biología molecular, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow y Lane usando anticuerpos: un manual de laboratorio, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); y Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). También se describen procedimientos representativos en el Ejemplo 1 a continuación.
En general, para la producción de líneas celulares de hibridoma, la vía y programación de inmunización del animal huésped son generalmente de acuerdo con técnicas establecidas y convencionales para la estimulación y producción de anticuerpos. Se contempla que cualquier sujeto mamífero, incluidos los seres humanos o las células productoras de anticuerpos a partir del mismo, puede manipularse para que sirva como base para la producción de líneas celulares de mamíferos, incluidos humanos y de hibridoma. Normalmente, el animal huésped se inocula por vía intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutánea, intraplantar y/o intradérmica con una cantidad de inmunógeno, incluido como se describe en el presente documento.
Los hibridomas se pueden preparar a partir de linfocitos y células de mieloma inmortalizadas usando la técnica general de hibridación de células somáticas de Kohler, B. y Milstein, C., Nature 256: 495-497, 1975 o según lo modificado por Buck, DW, et al., In Vitro, 18: 377-381, 1982. Las líneas de mieloma disponibles, que incluyen pero no se limitan a X63-Ag8.653 y las del Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, CA, EE.UU., pueden usarse en la hibridación. Generalmente, la técnica implica fusionar células de mieloma y células linfoides usando un fusógeno, tal como polietilenglicol, o por medios eléctricos bien conocidos por los expertos en la técnica. Después de la fusión, las células se separan del medio de fusión y se cultivan en un medio de crecimiento selectivo, tal como medio hipoxantinaaminopterina-timidina (HAT), para eliminar las células parentales no hibridadas. Cualquiera de los medios descritos en el presente documento, complementado con o sin suero, puede usarse para cultivar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales. Como otra alternativa a la técnica de fusión celular, pueden usarse células B inmortalizadas con EBV para producir los anticuerpos monoclonales anti-PTK7 de la divulgación. Los hibridomas se expanden y subclonan, si se desea, y los sobrenadantes se analizan para determinar la actividad antiinmunógena mediante procedimientos de inmunoensayo convencionales (por ejemplo, radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático o inmunoensayo de fluorescencia). Los hibridomas que pueden usarse como fuente de anticuerpos abarcan todos los derivados, las células progenitoras de los hibridomas parentales que producen anticuerpos monoclonales específicos para PTK7, o una parte de los mismos.
Los hibridomas que producen tales anticuerpos pueden cultivarse in vitro o in vivo usando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse de los medios de cultivo o fluidos corporales, mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales, tales como precipitación con sulfato de amonio, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía y ultrafiltración, si se desea. La actividad no deseada, si está presente, puede eliminarse, por ejemplo, pasando la preparación sobre adsorbentes hechos del inmunógeno unido a una fase sólida y eluyendo o liberando los anticuerpos deseados del inmunógeno. La inmunización de un animal huésped con una pTK7 humana, o un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos diana conjugada con una proteína que es inmunogénica en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, Hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de las residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCh, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes, pueden producir una población de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales).
Si se desea, el anticuerpo anti-PTK7 (monoclonal o policlonal) de interés se puede secuenciar y la secuencia de polinucleótidos se puede clonar en un vector para expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula huésped y la célula huésped puede entonces expandirse y congelarse para uso futuro. La producción de anticuerpos monoclonales recombinantes en cultivo celular se puede llevar a cabo mediante la clonación de genes de anticuerpos de células B por medios conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Tiller et al., J. Immunol. Methods 329: 112-124 (2008); Patente de Estados Unidos N° 7.314.622.
Una "célula huésped" incluye una célula individual o cultivo celular que puede ser o ha sido un receptor para el vector o vectores para la incorporación de insertos de polinucleótidos. Las células hospedadoras incluyen la progenie de una sola célula hospedadora, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN genómico) a la célula parental original debido a una mutación natural, accidental o deliberada. Una célula huésped incluye células transfectadas in vivo con uno o varios polinucleótidos de esta divulgación.
El término "vector" se refiere a una construcción, que es capaz de liberar, y, preferiblemente, expresar, uno o más genes o secuencias de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores de plásmidos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucariotas, como las células productoras.
El término "secuencia de control de expresión" significa una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Una secuencia de control de la expresión puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. La secuencia de control de la expresión está operativamente ligada a la secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir.
Alternativamente, la secuencia de polinucleótidos puede usarse para la manipulación genética para "humanizar" el anticuerpo o para mejorar la afinidad, u otras características del anticuerpo. Por ejemplo, la región constante puede diseñarse para que se parezca más a las regiones constantes humanas para evitar la respuesta inmune si el anticuerpo se usa en ensayos clínicos y tratamientos en humanos. Puede ser deseable manipular genéticamente la secuencia del anticuerpo para obtener una mayor afinidad por PTK7 y una mayor eficacia en la inhibición de PTK7.
Hay cuatro etapas generales que se pueden usar para humanizar un anticuerpo monoclonal: (1) determinar el nucleótido y predecir la secuencia de aminoácidos de los dominios variables ligeros y pesados de anticuerpo de partida (2) diseñar el anticuerpo humanizado, es decir, decidir qué región marco del anticuerpo usar durante el proceso de humanización (3) las metodologías/técnicas de humanización reales y (4) la transfección y expresión del anticuerpo humanizado. Véanse, por ejemplo, las patentes US n° 4.816.567; 5.807.715; 5,866,692; 6,331,415; 5,530,l0 l; 5,693,761; 5,693,762; 5,585,089; y 6.180.370.
Los anticuerpos humanizados se pueden preparar usando cualquiera de una variedad de procedimientos que incluyen recubrimiento, injerto de regiones determinantes de complementariedad (CDR), injerto de CDR abreviadas, injerto de regiones determinantes de especificidad (SDR) y ensamblaje de Frankenstein, como se describe a continuación. Los anticuerpos humanizados también incluyen anticuerpos sobrehumanizados, en los que se han introducido uno o más cambios en las CDR. Por ejemplo, los residuos humanos pueden sustituirse por residuos no humanos en las CDR. Estos enfoques generales pueden combinarse con técnicas estándar de mutagénesis y síntesis para producir un anticuerpo anti-PTK7 de cualquier secuencia deseada.
El recubrimiento se basa en el concepto de reducir las secuencias de aminoácidos potencialmente inmunogénicas en un roedor u otro anticuerpo no humano mediante la reaparición del exterior accesible al disolvente del anticuerpo con secuencias de aminoácidos humanas. Por tanto, los anticuerpos recubiertos parecen menos extraños para las células humanas que el anticuerpo no humano no modificado. Véase Padlan (1991) Mol. Immunol. 28: 489-98. Un anticuerpo no humano se recubre identificando los residuos de la región del marco exterior expuestos en el anticuerpo no humano, que son diferentes de los que se encuentran en las mismas posiciones en las regiones del marco de un anticuerpo humano, y el reemplazo de los residuos identificados por aminoácidos que normalmente ocupan estas mismas posiciones en anticuerpos humanos.
El injerto de CDR se realiza reemplazando una o más CDR de un anticuerpo aceptor (por ejemplo, un anticuerpo humano u otro anticuerpo que tiene residuos estructurales deseados) por CDR de un anticuerpo donante (por ejemplo, un anticuerpo no humano). Los anticuerpos aceptores pueden seleccionarse basándose en la similitud de los residuos marco entre un anticuerpo aceptor candidato y un anticuerpo donante. Por ejemplo, de acuerdo con el enfoque de Frankenstein, las regiones marco humanas se identifican por tener una homología de secuencia sustancial con cada región marco del anticuerpo no humano relevante, y las CDR del anticuerpo no humano se injertan en el compuesto de las diferentes regiones marco humanas. Un procedimiento relacionado también útil para la preparación de anticuerpos de la divulgación se describe en la Patente de Estados Unidos N° 7.321.026.
El injerto de CDR abreviados es un enfoque relacionado. Las CDR abreviadas incluyen los residuos determinantes de la especificidad y los aminoácidos adyacentes, incluidos los de las posiciones 27d-34, 50-55 y 89-96 de la cadena ligera, y las posiciones 31-35b, 50-58 y 95-101 de la cadena pesada (convención de numeración de (Kabat et al. (1987)). Véase (Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-9). El injerto de residuos determinantes de la especificidad (SDR) se basa en el entendimiento de que la especificidad y afinidad de unión de un sitio de combinación de anticuerpos está determinada por los residuos más variables dentro de cada una de las regiones determinantes de complementariedad (CDR). El análisis de las estructuras tridimensionales de los complejos anticuerpoantígeno, combinado con el análisis de los datos de la secuencia de aminoácidos disponibles, puede usarse para modelar la variabilidad de la secuencia en base a la disimilitud estructural de los residuos de aminoácidos que aparecen en cada posición dentro de la CDR. Los SDR se identifican como secuencias polipeptídicas mínimamente inmunogénicas que consisten en residuos de contacto. Ver Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-139.
En general, los marcos aceptores humanos se seleccionan sobre la base de que son sustancialmente similares a las regiones marco de los anticuerpos donantes, o que son más similares a la secuencia consenso de la subfamilia de la región variable. Después del injerto, se pueden realizar cambios adicionales en las secuencias del donante y/o aceptor para optimizar la unión del anticuerpo, la funcionalidad, el uso de codones, los niveles de expresión, etc., incluida la introducción de residuos no humanos en las regiones marco. Véase, por ejemplo, la publicación internacional PCT n° WO 91/09967.
Para el injerto de CDR en una región marco variable de cadena pesada, las secuencias de marco útil se pueden derivar de un DP-21 (VH7), DP-54 (VH3-07), DP-47 (VH3-23), DP- 53 (VH-74), DP-49 (VH3-30), DP-48 (VH3-13), DP-75, DP-8 (VH1-2), DP-25, VI-2b y VI-3 ( VH1-03), DP-15 y V1-8 (VH1-08), DP-14 y V1-18 (VH1-18), DP-5 y V1-24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45), DP-7 (VH1-46), DP-10, DA-6 y YAC-7 (VH1-69), DP-88 (VH1-e), DP-3 y DA-8 (VH1-f). Para el injerto de CDR en una región marco variable de cadena ligera, se pueden derivar secuencias marco útiles de un clon de línea germinal del subgrupo IV de DPK24, un subgrupo de Will (DPK23, DPK22, DPK20, DPK21) o un clon de línea germinal del subgrupo VkI (DPK9, DPK1, O2, DPK7).
Los fragmentos de unión a antígenos o los fragmentos de anticuerpos se pueden producir mediante degradación proteolítica o de otro tipo de los anticuerpos, mediante procedimientos recombinantes (es decir, polipéptidos únicos o de fusión), tal como se describe anteriormente o mediante síntesis química. Los polipéptidos de los anticuerpos, especialmente los polipéptidos más cortos de hasta aproximadamente 50 aminoácidos, se preparan convenientemente mediante síntesis química. Los procedimientos de síntesis química son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo podría producirse mediante un sintetizador de polipéptidos automático empleando el procedimiento de fase sólida. Véanse también las Patentes de Estados Unidos N° 5.807.715; 4.816.567; y 6.331.415.
En otros aspectos de la divulgación, los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco incluyen un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una región variable de cadena pesada y/o cadena ligera de hu23, hu24, o hu58, o una región variable sustancialmente similar a una región variable de cadena pesada o cadena ligera de hu23, hu24 o hu58.
Como se aplica a polipéptidos, el término "identidad sustancial" o "similitud sustancial" significa que dos secuencias de aminoácidos, cuando se alinean óptimamente, tales como mediante los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto tal como se suministra con los programas, comparten al menos 70%, 75% u 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90% o 95% de identidad de secuencia, y más preferiblemente al menos 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia. En algunas secuencias de aminoácidos sustancialmente similares, las posiciones de los residuos que no son idénticos difieren en sustituciones conservadoras de aminoácidos.
Los polipéptidos sustancialmente similares también incluyen variantes sustituidas de forma conservadora en las que uno o más residuos han sido conservativamente sustituidos por un residuo funcionalmente similar. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrófobo), tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro; la sustitución de un residuo polar (hidrófilo) por otro, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina; la sustitución de un residuo básico, tal como lisina, arginina o histidina por otro; o la sustitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro.
Otra indicación de que dos proteínas son sustancialmente idénticas es que comparten una estructura tridimensional global, o son biológicamente equivalentes funcionales.
En algunos aspectos de la divulgación, un conjugado de anticuerpo-fármaco, que se une a PTK7, incluye un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una región variable de cadena pesada establecida como cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 25 o 49 y/o una región variable de cadena ligera establecida como cualquiera de las SEQ ID NO: 15, 39 o 63. Por ejemplo, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la divulgación puede incluir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 15; o un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una región variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 15. Como otro ejemplo, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la divulgación puede incluir un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 25 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 39; o un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una región variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 25 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 39. Como otro ejemplo, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la divulgación puede incluir un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 49 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 63; o un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una región variable de cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 49 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 63.
Los anticuerpos también pueden ser modificados, por ejemplo, en los dominios variables de las cadenas pesada y/o ligeras, por ejemplo, para alterar una propiedad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, puede realizarse una mutación en una o más de las regiones CDR para aumentar o disminuir la Kd del anticuerpo por PTK7, para aumentar o disminuir la Koff, o para alterar la especificidad de unión del anticuerpo. Las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. y Ausubel et al., supra.
Una modificación o mutación también se pueden realizar en una región marco o región constante para aumentar la vida media de un anticuerpo anti-PTK7. Véase, por ejemplo, la publicación internacional PCT n° WO 00/09560. También se puede realizar una mutación en una región marco o región constante para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proporcionar un sitio para la unión covalente o no covalente a otra molécula, o para alterar propiedades, tales como la fijación del complemento, la unión de FcR y la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo. De acuerdo con la invención, un solo anticuerpo puede tener mutaciones en alguna o más de las CDR o regiones marco del dominio variable o en la región constante.
En un proceso conocido como "germlining", ciertos aminoácidos en las secuencias VH y VL se pueden mutar para que coincidan con los que se encuentran de forma natural en las secuencias VH y VL de la línea germinal. En particular, las secuencias de aminoácidos de las regiones marco en las secuencias VH y VL pueden mutarse para coincidir con las secuencias de la línea germinal para reducir el riesgo de inmunogenicidad cuando se administra el anticuerpo. Como se usa en el presente documento, el término "línea germinal" se refiere a las secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos de los genes de anticuerpos y segmentos de genes a medida que pasan de padres a descendientes a través de las células germinales. Esta secuencia de la línea germinal se distingue de las secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos en células B maduras que han sido alteradas por eventos de recombinación e hipermutación durante el curso de la maduración de las células B. Un anticuerpo que "utiliza" una línea germinal en particular tiene una secuencia de nucleótidos o aminoácidos que se alinea más estrechamente con esa secuencia de nucleótidos de la línea germinal o con la secuencia de aminoácidos que especifica. Estos anticuerpos con frecuencia están mutados en comparación con la secuencia de la línea germinal. Las secuencias de ADN de la línea germinal para los genes VH y VL humanos se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "Vbase"; véase también Kabat, EA, et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, EE.UU. Departamento de Salud y Servicios Humanos, Publicación de los NIH No. 91-3242; Tomlinson et al., J. Mol. Biol. 227: 776-798, 1992; y Cox et al., Eur. J. Immunol. 24: 827- 836, 1994.
Otro tipo de sustitución de aminoácidos que pueda hacerse es eliminar los posibles sitios proteolíticos en el anticuerpo. Dichos sitios pueden aparecer en una CDR o región marco de un dominio variable o en la región constante de un anticuerpo. La sustitución de residuos de cisteína y la eliminación de sitios proteolíticos pueden disminuir el riesgo de heterogeneidad en el producto de anticuerpo y, por tanto, aumentar su homogeneidad. Otro tipo de sustitución de aminoácidos es eliminar pares de asparagina-glicina, que forman sitios potenciales de desamidación, alterando uno o ambos residuos. En otro ejemplo, se puede escindir la lisina C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo anti-PTK7 de la divulgación. En varios aspectos de la invención, las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos anti-PTK7 pueden incluir opcionalmente una secuencia señal.
Para expresar los anticuerpos anti-PTK7 de la presente divulgación, los fragmentos de ADN que codifican las regiones VH y VL se pueden obtener primero usando cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente. Como se conoce en la técnica, "polinucleótido", "ácido nucleico/nucleótido" y "oligonucleótido" se usan indistintamente en el presente documento e incluyen formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, análogos de los mismos, o cualquier sustrato que pueda ser incorporado en una cadena por ADN o ARN polimerasa. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADN, ADNc, ADN genómico, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Los polinucleótidos pueden ser de origen natural, sintéticos, recombinantes o cualquier combinación de los mismos. Un polinucleótido puede incluir nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación de la estructura de nucleótidos puede impartirse antes o después del ensamblaje de la cadena. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, tal como por conjugación con un componente de marcaje. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "bloqueantes", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas, tales como, por ejemplo, aquellos con enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), los que contienen restos colgantes, como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido o polinucleótidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilo normalmente presentes en los azúcares puede ser reemplazado, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse por grupos protectores estándar, o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o pueden conjugarse con soportes sólidos. El OH terminal 5' y 3' puede fosforilarse o sustituirse con aminas o restos de grupos de bloqueo orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. También se pueden derivar otros hidroxilos a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que se conocen generalmente en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alilo, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares alfa o beta anoméricos, azúcares epiméricos, tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosa, azúcares furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos, tales como metil ribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden reemplazarse por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, características en las que el fosfato se reemplaza por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en el que cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucleótido sean idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en este documento, incluidos el ARN y el ADN.
Los ADN representativos que codifican las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera del anticuerpo anti-PTK7 se establecen como SEQ ID NO: 2 (ADN de VH de hu23), SEQ ID NO: 16 (ADN de VL de hu23), SEQ ID NO: 26 (ADN de VH de hu24), SEQ ID NO: 40 (ADN de VL de hu24), SEQ ID NO: 50 (ADN de VH de hu58) y SEQ ID NO: 64 (ADN de VL de hu58). Los ADN representativos que codifican cadenas pesadas y cadenas ligeras de anticuerpos anti-PTK7 se establecen como s Eq ID NO: 14 (ADN de HC de hu23), Se Q ID NO: 24 (ADN de LC de hu23), SEQ ID NO: 38 (ADN de HC de hu24), SEC. ID NO: 48 (ADN de LC de hu24), SEQ ID NO: 62 (ADN de HC de hu58) y SEQ ID NO: 72 (ADN de LC de hu58).
Diversas modificaciones, por ejemplo, mutaciones, sustituciones, deleciones, y/o adiciones pueden también ser introducidos en las secuencias de ADN de hu23, hu24, y hu58 utilizando procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la mutagénesis se puede llevar a cabo usando procedimientos estándar, tales como mutagénesis mediada por PCR, en la que los nucleótidos mutados se incorporan en los cebadores de PCR de manera que el producto de PCR contenga las mutaciones deseadas o mutagénesis dirigida al sitio.
Por consiguiente, basándose en la divulgación de la presente solicitud, un experto en la técnica reconocería fácilmente las secuencias de ADN sustancialmente similares a los ADN de hu23, hu24 y hu58. El término "similitud sustancial" o "similitud sustancial de secuencia", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, significa que cuando se alinea de manera óptima con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 85%, preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las bases de nucleótidos, medidas mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap.
El término "porcentaje de identidad de secuencia" en el contexto de secuencias de ácido nucleico significa los residuos en dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser sobre un tramo de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, generalmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos, más generalmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 32 nucleótidos, y preferiblemente al menos aproximadamente 36, 48 o más nucleótidos. Hay varios algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de la secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos se pueden comparar usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, proporciona alineaciones y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y búsqueda (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63 - 98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185 - 219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227 - 258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71 - 84 (1998). A menos que se especifique lo contrario, se utilizan los parámetros predeterminados para un programa o algoritmo en particular. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico se puede determinar usando FASTA con sus parámetros predeterminados (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) o usando Gap con sus parámetros predeterminados como se proporciona en GCG Versión 6.1.
Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las proteínas codificadas por los ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas, comparten una estructura tridimensional global, o son biológicamente equivalentes funcionales. Estos términos se definen más adelante en el presente documento. Las moléculas de ácido nucleico que no se hibridan entre sí en condiciones rigurosas siguen siendo sustancialmente idénticas si las proteínas correspondientes son sustancialmente idénticas. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando dos secuencias de nucleótidos comprenden variantes sustituidas de forma conservadora según lo permita el código genético.
Las variantes sustituidas de forma conservadora son secuencias de ácido nucleico que tienen sustituciones de codones degenerados en el que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) están sustituidos con de base mixta y/o residuos desoxiinosina. Ver Batzer et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; y Rossolini et al. (1994) Mol. Cell Probes 8: 91-98.
Un tipo de sustitución, por ejemplo, que se puede realizar es cambiar una o más cisteínas en el anticuerpo, que pueden ser químicamente reactivas, a otro residuo, tales como, sin limitación, alanina o serina. Por ejemplo, puede haber una sustitución de una cisteína no canónica. La sustitución se puede realizar en una CDR o región marco de un dominio variable o en la región constante de un anticuerpo. Como otro ejemplo, la cisteína puede ser canónica.
Una vez que se obtienen fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL de la presente divulgación, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente por técnicas de ADN recombinante convencionales, por ejemplo para convertir los genes de la región variable en genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, a genes de fragmentos Fab, o a un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se une operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. El término "operativamente unido", como se utiliza en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN se unen de manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanezcan en el marco.
El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse en un gen de cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN que codifica VH a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de genes de la región constante de la cadena pesada humana se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, EA, et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., Publicación de los NIH No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero lo más preferiblemente es una región constante de IgG1 o IgG2. La secuencia de la región constante de IgG puede ser cualquiera de los diversos alelos o alotipos que se sabe que ocurren entre diferentes individuos, tales como Gm (1), Gm (2), Gm (3) y Gm (17). Estos alotipos representan la sustitución de aminoácidos de origen natural en las regiones constantes de IgG1. Para un gen de cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica VH puede unirse operativamente a otra molécula de ADN que codifica sólo la región constante CH1 de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada de CH1 puede derivarse de cualquiera de los genes de la cadena pesada.
El ADN aislado que codifica la región VL se puede convertir en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como en un gen de cadena ligera Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de la región constante de la cadena ligera humana se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, EA, et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., Publicación de los NIH No. 91­ 3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda. La región constante kappa puede ser cualquiera de los diversos alelos que se sabe que ocurren entre diferentes individuos, como Inv (1), Inv (2) e Inv (3). La regió constante lambda puede erivar de cualquiera de los tres genes de lambda.
Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN VH y VL que codifican están unidas operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible de tal manera que las secuencias VH y VL pueden expresarse como una proteína monocatenaria contigua, con el VL y Regiones VH unidas por el enlazador flexible (véase, por ejemplo, Bird et al., 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al. ., 1990, Nature 348: 552 - 554. El anticuerpo monocatenario puede ser monovalente, si solo se usan un solo Vh y VL, bivalente, si se usan dos VH y VL, o polivalente, si se usan más de dos VH y VL Pueden generarse anticuerpos biespecíficos o polivalentes que se unan específicamente a PTK7 ya otra molécula.
En otro aspecto de la divulgación, se puede preparar un anticuerpo de fusión o inmunoadhesina que incluya todo o una parte de un anticuerpo PTK7 de la divulgación unido a otro polipéptido. En otro aspecto, solo los dominios variables del anticuerpo PTK7 están unidos al polipéptido. En otro aspecto, el dominio VH de un anticuerpo PTK7 está ligado a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo PTK7 está ligado a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de tal manera que los dominios VH y VL pueden interactuar entre sí para formar un sitio de unión al antígeno. En otro aspecto, el dominio VH está separado del dominio VL por un enlazador de modo que los dominios VH y VL pueden interactuar entre sí. A continuación, el anticuerpo VH-enlazador-VL se une al polipéptido de interés. Además, Se pueden crear anticuerpos de fusión en los que dos (o más) anticuerpos monocatenarios se unen entre sí. Esto es útil si se desea crear un anticuerpo divalente o polivalente en una única cadena polipeptídica, o si se desea crear un anticuerpo biespecífico.
Otros anticuerpos modificados pueden prepararse utilizando moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpo anti-PTK7. Por ejemplo, "Kappa bodies" (III et al., Protein Eng. 10: 949-57, 1997), "Minibodies" (Martin et al., Em Bo J., 13: 5303-9, 1994), "Diabodies" (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993), o "Janusins" (Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659, 1991 y Traunecker et al., Int. J. Cancer (Supl.) 7: 51-52, 1992) pueden prepararse usando técnicas de biología molecular estándar siguiendo las enseñanzas de la memoria.
Los anticuerpos biespecíficos o fragmentos de unión a antígeno se pueden producir por una variedad de procedimientos que incluyen fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321, 1990, Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553, 1992. Además, los anticuerpos biespecíficos pueden formarse como "diacuerpos" o "Janusinas". En algunos aspectos de la invención, un anticuerpo biespecífico se une a dos epítopos diferentes de PTK7. En otros aspectos, los anticuerpos modificados descritos anteriormente se preparan usando uno o más de los dominios variables o regiones CDR de los anticuerpos anti-PTK7 proporcionados en este documento.
Para el uso en la preparación de conjugados anticuerpo-fármaco, los anticuerpos anti-PTK7 descritos en este documento puede ser sustancialmente puros, es decir, al menos 50% puros (es decir, libre de contaminantes), más preferiblemente, al menos 90% puros, más preferiblemente, al menos un 95% puros, aún más preferiblemente, al menos un 98% puros y lo más preferiblemente, al menos 99% puros.
La Tabla 1 proporciona las secuencias de aminoácidos (proteínas) y las secuencias de ácidos nucleicos (ADN) asociadas de los anticuerpos anti-PTK7 humanizados de la presente divulgación.
Las CDR de hu23 VH, hu23 VL, hu24 VH, hu24 VL, hu58 VH y hu58 VL definidas por Kabat y por Chothia, se exponen como secuencias separadas.
Tabla 1. Secuencias de anticuer os anti-PTK7 humanizados
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II.B. Enlazadores
Los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la presente invención se pueden preparar usando un enlazador para unir o conjugar un fármaco a un anticuerpo anti-PTK7. Un enlazador es un compuesto bifuncional que se puede usar para enlazar un fármaco y un anticuerpo para formar un conjugado anticuerpo fármaco (ADC). Tales conjugados son útiles, por ejemplo, en la formación de inmunoconjugados dirigidos contra antígenos asociados a tumores. Dichos conjugados permiten la administración selectiva de fármacos citotóxicos a las células tumorales. Los enlazadores adecuados incluyen, por ejemplo, enlazadores escindibles y no escindibles. Un enlazador escindible es típicamente susceptible de escindirse en condiciones intracelulares. Los principales mecanismos por los cuales un fármaco conjugado se escinde de un anticuerpo incluyen la hidrólisis en el pH ácido de los lisosomas (hidrazonas, acetales y amidas similares al cis-aconitato), escisión de péptidos por enzimas lisosomales (las catepsinas y otras enzimas lisosomales) y reducción de disulfuros. Como resultado de estos diversos mecanismos de escisión, los mecanismos de unión del fármaco al anticuerpo también varían ampliamente y se puede usar cualquier enlazador adecuado.
Los enlazadores escindibles adecuados incluyen, por ejemplo, un péptido enlazador escindible por una proteasa intracelular, tal como la proteasa lisosómica o una proteasa endosómica. En aspectos de la divulgación, el enlazador puede ser un enlazador dipéptido, tal como un enlazador valina-citrulina (val-cit), un enlazador fenilalanina-lisina (phelys) o maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilo (vc) enlazador. En otro aspecto, el enlazador puede ser sulfosuccinimidil-4- [N-maleimidometil] ciclohexano-1-carboxilato (smcc). La conjugación sulfo-smcc ocurre a través de un grupo maleimida que reacciona con sulfhidrilos (tioles, -SH), mientras que su éster Sulfo-NHS es reactivo frente a aminas primarias (como se encuentra en la lisina y la proteína o péptido N-terminal). Además, el enlazador puede ser maleimidocaproilo (mc).
Otros enlazadores adecuados incluyen enlazadores hidrolizables a un pH específico o un intervalo de pH, tales como un enlazador de hidrazona. Los enlazadores escindibles adecuados adicionales incluyen enlazadores disulfuro. El enlazador puede unirse covalentemente al anticuerpo hasta tal punto que el anticuerpo debe degradarse intracelularmente para que el fármaco se libere, por ejemplo, el enlazador mc y similares.
En aspectos particulares de la divulgación, el enlazador de conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la divulgación puede ser maleimidocaproil-valina-citrulina -p-aminobenciloxicarbonilo (vc), maleimidocaproil (MC) o AcBut.
Un ejemplo de un procedimiento de conjugación adecuada se basa en la conjugación de hidrazidas y otros nucleófilos a los aldehídos generados por oxidación de los hidratos de carbono que se producen de forma natural en anticuerpos. Pueden prepararse conjugados que contienen hidrazona con grupos carbonilo introducidos que proporcionan las propiedades deseadas de liberación de fármaco. Los conjugados también se pueden preparar con un enlazador que tenga un disulfuro en un extremo, una cadena de alquilo en el centro y un derivado de hidrazina en el otro extremo. Las antraciclinas son un ejemplo de citotoxinas que pueden conjugarse con anticuerpos utilizando esta tecnología.
Los enlazadores que contienen grupos funcionales distintos de las hidrazonas tienen el potencial de escindirse en el medio ácido de los lisosomas. Por ejemplo, se pueden preparar conjugados a partir de enlazadores reactivos con tiol que contienen un sitio distinto de una hidrazona que se puede escindir intracelularmente, tales como ésteres, amidas y acetales/cetales. La camptotecina es un agente citotóxico que se puede conjugar usando estos enlazadores. También se pueden usar cetales fabricados a partir de un anillo de cetona de 5 a 7 miembros y que tiene uno de los oxígenos unido al agente citotóxico y el otro a un enlazador para la unión del anticuerpo. Las antraciclinas también son un ejemplo de una citotoxina adecuada para usar con estos enlazadores.
Otro ejemplo de una clase de enlazadores sensibles a pH son los cis-aconitatos, que tienen un ácido carboxílico yuxtapuesto a un enlace amida. El ácido carboxílico acelera la hidrólisis de amidas en los lisosomas ácidos. También se pueden usar enlazadores que logran un tipo similar de aceleración de la velocidad de hidrólisis con varios otros tipos de estructuras. Los maitansinoides son un ejemplo de una citotoxina que se puede conjugar con enlazadores unidos en C-9.
Otro procedimiento de liberación potencial de conjugados de fármaco es la hidrólisis enzimática de péptidos por las enzimas lisosomales. En un ejemplo, un péptido se une mediante un enlace amida al alcohol para-aminobencílico y a continuación se produce un carbamato o carbonato entre el alcohol bencílico y el agente citotóxico. La escisión del péptido conduce al colapso o autoinmolación del carbamato o carbonato de aminobencilo. Los agentes citotóxicos ejemplificados con esta estrategia incluyen antraciclinas, taxanos, mitomicina C y auristatinas. En un ejemplo, también se puede liberar un fenol por colapso del enlazador en lugar del carbamato. En otra variación, la reducción con disulfuro se usa para iniciar el colapso de un carbamato o carbonato de para-mercaptobencilo.
Muchos de los agentes citotóxicos conjugados con anticuerpos tienen poca, o ninguna, solubilidad en agua y limitan la carga de fármaco en el conjugado debido a la agregación del conjugado. Un enfoque para superar esto es agregar grupos solublizantes al enlazador. Se pueden usar conjugados fabricados con un enlazador que consiste en PEG y un dipéptido, incluidos aquellos que tienen un diácido de PEG, un tiolácido o un ácido maleimida unido al anticuerpo, un espaciador dipéptido y un enlace amida a la amina de un antraciclina o un análogo de duocarmicina. Otro ejemplo es un conjugado preparado con un enlazador disulfuro que contiene PEG unido a un agente citotóxico y una amida unida a un anticuerpo. Los enfoques que incorporan grupos de PEG pueden ser beneficiosos para superar la agregación y los límites en la carga de fármacos.
La Patente US 5.773.001 describe enlazadores que pueden usarse con fármacos nucleofílicos, particularmente hidrazidas y nucleófilos relacionados, preparados a partir de caliqueamicinas. Estos enlazadores son especialmente útiles en aquellos casos en los que se obtiene una mejor actividad cuando el enlace formado entre el fármaco y el enlazador es hidrolizable. Estos enlazadores contienen dos grupos funcionales, que incluyen (1) un grupo para la reacción con un anticuerpo (por ejemplo, ácido carboxílico) y (2) un grupo carbonilo (por ejemplo, un aldehído o una cetona) para la reacción con un fármaco. Los grupos carbonilo pueden reaccionar con un grupo hidrazida del fármaco para formar un enlace hidrazona. Este enlace es escindible e hidrolizable, lo que permite la liberación del agente terapéutico del conjugado después de unirse a las células diana. En aspectos particulares de la divulgación, el enlazador de conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la divulgación puede ser ácido 4- (4-acetilfenoxi) butanoico (AcBut). En otros aspectos de la divulgación, se pueden preparar conjugados de anticuerpo-fármaco usando ácido (3-acetilfenil) acético (AcPAc) o ácido 4-mercapto-4-metil-pentanoico (Amida) como molécula enlazadora.
Los ésteres de N-hidroxisuccinimida (OSu) u otros ésteres comparativamente activos pueden ser utilizados para generar el resto enlazador-fármaco hidrolizable activado. Ejemplos de otros ésteres de activación adecuados incluyen NHS (N-hidroxisuccinimida), sulfo-NHS (NHS sulfonado), PFP (pentafluorofenilo), TFP (tetrafluorofenilo) y DNP (dinitrofenilo).
En algunos aspectos de la divulgación, los conjugados anticuerpo-fármaco se preparan por reacción de caliqueamicina o derivados del mismo, el enlazador AcBut y un anticuerpo anti-PTK7 de la presente divulgación. Véase, por ejemplo, la patente US 5.773.001. El enlazador AcBut produce conjugados que son sustancialmente estables en circulación, liberando un 2% estimado de caliqueamicina por día cuando se analiza a 37 °C en plasma humano in vitro. Los conjugados liberan caliqueamicina en los lisosomas ácidos.
En algunos aspectos de la divulgación, el resto AcButCM se pueden generar utilizando procedimientos y procesos descritos en la técnica, tales como Publicación Internacional PCT N° WO 08/147765 y en la patente de Estados Unidos N° 8.273.862.
En algunos aspectos de la divulgación, el resto AcButCM se puede generar mediante un proceso de síntesis mejorada, tal como se describe en la solicitud provisional de Estados Unidos N° 61/899.682.
Los enlazadores representativos útiles para la conjugación de radioisótopos incluyen pentaacetato de dietilentriamina (DT-PA)-isotiocianato, clorhidrato de nicotinato de succinimidil 6-hidrazinio (SHNH) y hexametilpropilen amina oxima (HMPAO) (Bakker et al. (1990) J. Nucl. Med. 31: 1501 -1509, Chattopadhyay et al. (2001) Nucl. Med. Biol. 28: 741­ 744, Dewanjee et al. (1994) J. Nucl. Med. 35: 1054-63, Krenning et al. (1989) Lancet 1: 242-244, Sagiuchi et al. (2001) Ann. Nucl. Med. 15: 267-270); Patente US No. 6.024.938). Alternativamente, una molécula de direccionamiento puede derivatizarse de modo que un radioisótopo pueda unirse directamente a ella (Yoo et al. (1997) J. Nucl. Med. 38: 294­ 300). Los procedimientos de yodación también son conocidos en la técnica, y se pueden encontrar protocolos representativos, por ejemplo, en Krenning et al. (1989) Lancet 1: 242-4 y en Bakker et al. (1990) J. Nucl. Medicina. 31: 1501-9.
II.C. Fármacos
Los fármacos útiles en la preparación de los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco descritos incluyen cualquier sustancia que tenga actividad biológica o detectable, por ejemplo, agentes terapéuticos, marcadores detectables, agentes de unión, etc., y profármacos, que se metabolizan a un agente activo in vivo. Un fármaco también puede ser un derivado de fármaco, en el que un fármaco se ha funcionalizado para permitir la conjugación con un anticuerpo de la divulgación. De acuerdo con los procedimientos descritos, los fármacos se utilizan para preparar conjugados anticuerpo-fármaco de fórmula Ab-(LD), en la que (a) Ab es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a PTK7; y (b) LD es un resto enlazador-fármaco, en el que L es un enlazador y D es un fármaco. La proporción de fármaco a anticuerpo (DAR) o carga de fármaco indica el número de moléculas de fármaco (D) que se conjugan por anticuerpo. Los conjugados anticuerpo-fármaco de la presente invención tienen un DAR que está dentro del intervalo de 1 a 8. Por lo tanto, en aspectos de la invención, un conjugado anticuerpo-fármaco PTK7 puede incluir 1 molécula de fármaco (DAR de 1) o 2 moléculas de fármacos (DAR de 2), o 3 moléculas de fármacos (DAR de 3), o 4 moléculas de fármacos (DAR de 4), o 5 moléculas de fármacos (DAR de 5), o 6 moléculas de fármacos (DAR de 6), o 7 fármacos moléculas (DAR de 7) u 8 moléculas de fármacos (DAR de 8). El DAR se puede determinar por diversos medios convencionales, como espectroscopia UV, espectroscopia de masas, ensayo ELISA, procedimientos radiométricos, cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), electroforesis y HPLC.
Las composiciones, lotes y/o formulaciones de conjugado anticuerpo-fármaco (ADC), de fórmula Ab-(L-D), pueden incluir una pluralidad de anticuerpos, cada anticuerpo conjugado con un número particular de moléculas de fármaco (desde DAR 1 hasta 8). Las composiciones, lotes y/o formulaciones tienen un DAR promedio.
En aspectos particulares de la divulgación, una composición, lote y/o formulación de conjugados anticuerpo-fármaco puede caracterizarse por un DAR promedio en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 8, por ejemplo, un DAR promedio en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 7, o un DAR promedio en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 6, o un DAR promedio en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 5, o un DAR promedio en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 7, o un DAR promedio en el intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. En algunos aspectos, las composiciones, lotes y/o formulaciones de conjugado anticuerpo-fármaco pueden tener un DAR promedio de aproximadamente 1, o un DAR promedio de aproximadamente 2, o un DAR promedio de aproximadamente 3, o un DAR promedio de aproximadamente 4, o un DAR promedio de aproximadamente 5, o un DAR promedio de aproximadamente 6 , o un DAR promedio de aproximadamente 7, o un DAR promedio de aproximadamente 8. Tal como se usa en los intervalos anteriores de DAR promedio, el término "aproximadamente" significa /- 0,5%.
Además, una composición, por lotes, y/o formulación de conjugados anticuerpo-fármaco se pueden caracterizar por un intervalo preferido de DAR promedio, por ejemplo, un DAR promedio en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 5, un DAR promedio en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 4, o un DAR promedio en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 5. Además, una composición, lote y/o formulación de conjugados de anticuerpo-fármaco puede caracterizarse por un intervalo preferido de DAR promedio, por ejemplo, un DAR promedio en el intervalo de 3 a 5, un DAR promedio en el intervalo de 3 a 4, o un DAR promedio en el intervalo de 4 a 5.
Las composiciones, lotes y/o formulaciones de ADC de fórmula Ab-(L-D) pueden caracterizarse por una distribución de DAR. La distribución DAR proporciona el porcentaje o fracción de varias especies de ADC, por ejemplo, DAR 1 a 8 que pueden estar presentes en una composición, lote y/o formulación de ADC. La distribución de DAR de una composición, lote y/o formulación de ADC se puede determinar mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como enfoque isoeléctrico capilar (clEF).
En un aspecto de la divulgación, la distribución DAR de una composición, lote, y/o formulación de ADCs, de la fórmula Ab-(L-D), se puede caracterizar como una mezcla muy heterogénea de ADC con una amplia distribución de DAR, que generalmente contiene una amplia gama de especies de ADC con DAR 1 a 8.
En otro aspecto de la divulgación, la distribución DAR de una composición, lote, y/o formulación de ADC se puede caracterizar como una mezcla muy homogénea con una distribución DAR estrecha, que contiene generalmente un estrecho intervalo de especies de ADC que tiene un DAR particular, como DAR 3 a 5.
Por ejemplo, un agente terapéutico es un agente que ejerce un efecto citotóxico, citostático y/o inmunomodulador sobre las células cancerosas o células inmunes activadas. Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, agentes citostáticos y agentes inmunomoduladores. Los agentes quimioterapéuticos son compuestos químicos útiles en el tratamiento del cáncer.
Los agentes terapéuticos son composiciones que pueden usarse para tratar o prevenir un trastorno en un sujeto que lo necesite. Los agentes terapéuticos útiles en la divulgación incluyen agentes anticancerígenos, es decir, agentes que tienen actividad anticancerígena en células que expresan PTK7, tales como células cancerosas de cáncer de mama, tales como cáncer de mama triple negativo (TNBC), cáncer de mama positivo para receptores de progesterona. (PR+), cáncer de mama positivo para receptores de estrógenos (ER ) y cáncer de mama doble positivo; cáncer de ovarios; cáncer colonrectal; leucemias, como leucemia mieloide aguda (AML) y leucemia linfoblástica aguda (ALL); cáncer de esófago; cáncer gástrico; melanoma; sarcoma; Cancer de RIÑON; Cancer de pancreas; Cancer de prostata; cáncer de hígado, como carcinoma hepatocelular (HCC); y cáncer de pulmón, como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC).
Los agentes terapéuticos representativos incluyen citotoxinas, agentes citotóxicos y agentes citostáticos. Un efecto citotóxico se refiere al agotamiento, eliminación y/o muerte de una célula o células diana. Un agente citotóxico se refiere a un agente que tiene un efecto citotóxico y/o citostático en una célula. Un efecto citostático se refiere a la inhibición de la proliferación celular. Un agente citostático se refiere a un agente que tiene un efecto citostático en una célula, inhibiendo así el crecimiento y/o expansión de un subconjunto específico de células.
Los agentes terapéuticos representativos adicionales incluyen radioisótopos, agentes quimioterapéuticos, agentes inmunomoduladores, agentes antiangiogénicos, agentes antiproliferativos, agentes proapoptóticos y enzimas citolíticas (por ejemplo, ARNas). Un agente también puede incluir un ácido nucleico terapéutico, tal como un gen que codifica un agente inmunomodulador, un agente anti-angiogénico, un agente anti-proliferativo o un agente proapoptótico. Estos descriptores de fármacos no son mutuamente excluyentes y, por tanto, un agente terapéutico puede describirse utilizando uno o más de los términos indicados anteriormente. Por ejemplo, los radioisótopos seleccionados también son citotoxinas. Los agentes terapéuticos se pueden preparar como sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. En general, los conjugados que tienen un radioisótopo como fármaco se refieren como radioinmunoconjugados y los que tienen un agente quimioterapéutico como fármaco se refieren como quimioinmunoconjugados.
Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, una antraciclina, una auristatina, CC-1065, una dolastatina, una duocarmicina, un enediino, una geldanamicina, una maitansina, una puromicina, un taxano, un alcaloide de vinca, un SN-38, una tubulisina, una hemiasterlina y estereoisómeros, isósteres, análogos o derivados de los mismos. También se pueden usar agentes quimioterapéuticos, toxinas vegetales, otras proteínas bioactivas, enzimas (es decir, ADEPT), radioisótopos, fotosensibilizadores (es decir, para terapia fotodinámica). En un caso, el agente citotóxico no es una proteína inactivadora de ribosomas. En un caso más específico, el agente citotóico no es la saporina.
Las antraciclinas se derivan de bacterias S tre p to m yce s y se han utilizado para tratar una amplia gama de tipos de cáncer, tales como leucemias, linternas, cánceres de mama, útero, ovario y pulmón. Los ejemplos de antraciclinas incluyen, pero no se limitan a, daunorubicina, doxorrubicina (es decir, adriamicina), epirrubicina, idarrubicina, valrubicina y mitoxantrona.
Las dolastatinas y sus análogos y derivados peptídicos, las auristatinas, son agentes antimitóticos muy potentes que se ha demostrado que tienen actividad anticancerígena y antifúngica. Véase, por ejemplo, la patente US 5.663.149 y Pettit et al., Antimicrob. Agentes Chemother. 42: 2961 - 2965, (1998). Los ejemplos de dolastatinas y auristatinas incluyen, pero no se limitan a, dolastatina 10, auristatina E, auristatina EB (AEB), auristatina EFP (AEFP), MMAD (monometil auristatina D o monometil dolastatina 10), MMAF (monometil auristatina F o N-metilvalina-valinadolaisoleuina-dolaproina-fenilalanina), MMAE (monometil auristatina E o N-metilvalina-valina-dolaisoleuinadolaproina-norefedrina), éster de ácido 5-benzoilvalérico-AE (AEVB).
En algunos aspectos de la divulgación, las auristatinas descritas en Publicación Internacional PCT N° WO 2013/072813 y procedimientos de producir esos auristatinas se utilizan en el presente documento.
Por ejemplo, la auristatina es 0101, (2-metilalanil-N-[(3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1 -(1,3-tiazol-2-il)etil]amino} propil] pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida), que tiene la siguiente estructura:
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En otro ejemplo, la auristatina es 8261, (8261 2-metilalanil-N-[(3R, 4S, 5S)-1-{(2S)-2-[(1R, 2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil] amino} -1-metoxi-2-metil-3-oxopropil] pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida),
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La duocarmicina y CC-1065 son agentes alquilantes de ADN con potencia citotóxica. Véase Boger y Johnson, PNAS 92: 3642-3649, 1995. Los ejemplos de dolastatinas y auristatinas incluyen, pero no se limitan a, (+) - docarmicina A y (+)-duocarmicina SA, y (+)-Cc -1065.
Los enodiinos son una clase de productos bacterianos antitumorales caracterizados por anillos de nueve y diez miembros o por la presencia de un sistema cíclico de enlaces triples-dobles-triples conjugados. Los enediinos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, caliqueamicina, esperamicina y dinemicina.
En algunos aspectos de la divulgación, el agente citotóxico es un antibiótico, tales como caliqueamicina, también llamado complejo LL-E33288, por ejemplo, p-caliqueamicina, Y-caliqueamicina o N-acetil-Y-caliqueamicina (gammacaliqueamicina (y i)). Se describen ejemplos de caliqueamicinas adecuadas para su uso en la presente divulgación, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 4.671.9584.970.198, 5.053.394, 5.037.651,5.079.233 y 5.108.912.
Estos compuestos contienen un trisulfuro de metilo que pueden hacerse reaccionar con tioles apropiados para formar disulfuros, al mismo tiempo, introduciendo un grupo funcional, tal como una hidrazida u otro grupo funcional que es útil para la conjugación de caliqueamicina a un anticuerpo anti-PTK7. También se pueden usar análogos disulfuro de caliqueamicina, por ejemplo, análogos descritos en las Patentes de Estados Unidos N° 5.606.040 y 5.770.710. En algunos aspectos de la divulgación, el análogo disulfuro es N-acetil-Y-caliqueamicina dimetilhidrazida (en lo sucesivo, "CM").
Las geldanamicinas son antibióticos de benzoquinona ansamicina que se unen a Hsp90 (Proteína 90 de choque térmico) y se han utilizado como fármacos antitumorales. Los ejemplos de geldanamicinas incluyen, pero no se limitan a, 17-AAG (17-N-alilamino-17-desmetoxigeldanamicina) y 17-DMAG (17-dimetilaminoetilamino-17-demetoxigeldanamicina).
Las maitansinas o sus derivados maitansinoides inhiben la proliferación celular inhibiendo la formación de microtúbulos durante la mitosis mediante la inhibición de la polimerización de tubulina. Véase Remillard et al., Science 189: 1002­ 1005, 1975. Ejemplos de maitansinas y maitansinoides incluyen, pero no se limitan a, mertansina (DM1) y sus derivados, así como ansamitocina.
Los taxanos son diterpenos que actúan como agentes anti-tubulina o inhibidores de la mitosis. Los taxanos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel (por ejemplo, TAXOL®) y docetaxel (TAXOTERE®).
Los alquiloides de vinca también son agentes anti-tubulina. Los alquiloides de vinca de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina.
En algunos aspectos de la divulgación, el agente es un agente inmunomodulador. Los ejemplos de un agente inmunomodulador incluyen, pero no se limitan a, ganciclovier, etanercept, tacrolimus, sirolimus, voclosporina, ciclosporina, rapamicina, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolgate mofetilo, metotrextrato, glucocorticoide y sus análogos xanthtocinas, factores de crecimiento de células madre, linfotoxinas, factor de necrosis tumoral (TNF), factores hematopoyéticos, interleucinas (por ejemplo, interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6 , IL-10, IL-12, IL-18 y IL-21), factores estimulantes de colonias (por ejemplo, Factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF)), interferones (por ejemplo, Interferones-a, -p y -y), el factor de crecimiento de células madre denominado "factor S 1", eritropoyetina y trombopoyetina, o una combinación de los mismos.
Los agentes inmunomoduladores útiles en la divulgación también incluyen antihormonas que bloquean la acción hormonal sobre tumores y agentes inmunosupresores que suprimen la producción de citocinas, regulan negativamente la expresión de autoantígeno o enmascaran los antígenos del MHC. Las antihormonas representativas incluyen antiestrógenos que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4 (5) -imidazoles inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapnstone y toremifeno; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y agentes anti-adrenales. Los agentes inmunosupresores representativos incluyen pirimidinas 2-amino-6-aril-5-sustituidas, azatioprina, ciclofosfamida, bromocriptina, danazol, dapsona, glutaraldehído, anticuerpos antiidiotípicos para antígenos MHC y fragmentos MHC, ciclosporina A, esteroides tales como glucocorticosteroides, antagonistas de citosinas o receptores ed citosinas (por ejemplo, anticuerpos anti-interferón, anticuerpos anti-IL10, anticuerpos anti-TNFa, anticuerpos anti-IL2), estreptoquinasa, TGFp, rapamicina, receptor de células T, fragmentos de receptores de células T, y anticuerpos de receptores de células T.
En algunos aspectos de la divulgación, el fármaco es una proteína terapéutica que incluyen, pero no se limita a, una toxina, una hormona, una enzima, y un factor de crecimiento.
Los ejemplos de una proteína (o polipéptido) toxina incluyen, pero no se limitan a, difteria (por ejemplo, cadena A de difteria), exotoxina y endotoxina de Pseudomonas, ricina (por ejemplo, cadena A de ricina), abrina (por ejemplo, cadena A de abrina). ), modecina (por ejemplo, modecina cadena A), alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, ribonucleasa (RNasa), DNasa I, enterotoxina A estafilocócica, proteína antiviral de hierba carmín, gelonina, toxina difterina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, tricotecenos, péptidos inhibidores del nudo de cistina (ICK) (por ejemplo, ceratotoxinas) y conotoxina (por ejemplo, KIIIA o Smllla).
Los ejemplos de hormonas incluyen, pero no se limitan a, estrógenos, andrógenos, progestinas y corticosteroides.
En algunos aspectos de la divulgación, el agente citotóxico se puede hacer usando un liposoma o polímero biocompatible. Los anticuerpos anti-PTK7 como se describen en el presente documento se pueden conjugar con el polímero biocompatible para aumentar la vida media y la bioactividad en suero, y/o prolongar las vidas medias in vivo. Los ejemplos de polímeros biocompatibles incluyen polímero soluble en agua, como polietilenglicol (PEG) o sus derivados y polímeros biocompatibles que contienen iones híbridos (por ejemplo, un polímero que contiene fosforilcolina).
En algunos aspectos de la divulgación, el fármaco es un oligonucleótido, tal como oligonucleótidos antisentido.
Los fármacos adicionales útiles en la divulgación incluyen agentes anti-angiogénicos que inhiben la formación de vasos sanguíneos, por ejemplo, inhibidores de famesiltransferasa, inhibidores de COX-2, inhibidores de VEGF, inhibidores de bFGF, inhibidores de esteroide sulfatasa (por ejemplo, 2-metoxiestradiol bis-sulfamato (2-MeOE2bisMATE)), interleucina-24, trombospondina, proteínas de metalospondina, interferones de clase I, interleucina 12, protamina, angiostatina, laminina, endostatina y fragmentos de prolactina.
Los agentes antiproliferativos y proapoptóticos incluyen activadores de PPAR-gamma (por ejemplo, prostaglandinas de ciclopentenona (cyPG)), retinoides, triterpinoides (por ejemplo, cicloartano, lupano, ursano, oleano, friedelano, dammarano, cucurbitacina y triterpenoides limonoides), inhibidores del receptor de EGF (por ejemplo, HER4), rampamicina, CALCITRIOL® (1,25-dihidroxicolecalciferol (vitamina D)), inhibidores de la aromatasa (FEMARA® (letrozona)), inhibidores de la telomerasa, quelantes de hierro (por ejemplo, 3-aminopiridina-2-carboxaldehído tiosemicarbazona (Triapina)), apoptina (proteína viral 3 - VP3 del virus de la anemia del pollo), inhibidores de Bcl-2 y Bcl-X (L), TNF-alfa, ligando FAS, ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL/Apo2L), activadores de la señalización del ligando inductor de apoptosis relacionado conTNF-alfa/ligando FAS/TNF (TRAIL/Apo2L) e inhibidores de la señalización de la vía de supervivencia PI3K-Akt (por ejemplo,UCN-01 y geldanamicina).
Los agentes quimioterapéuticos representativos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida; alquil sulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziidinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, cloofosfamida, estramustina, ifosfamida, mequioretamina, clorhidrato de óxido de mequioretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfarnida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, micofenolicina, ácido, olivlacinomicina, quefiromicina, nogalamicina , rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-EU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedores de ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldophospharnide; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; phenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2 -etilhidrazida; procarbazina; razoxano; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2 ,2 ', 2 -triclorotietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido (Ara-C); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology de Princeton, Nueva Jersey) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer de Antony, Francia); chiorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aininopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; y capecitabina.
Los agentes terapéuticos adicionales que pueden usarse de acuerdo con la presente divulgación incluyen agentes fotosensibilizantes, tales como la patente US 7.498.029 y 5.952.329 para la terapia fotodinámica; partículas magnéticas para termoterapia, tales como la patente US 6.997.863; agentes de unión, tales como péptidos, ligandos, ligandos de adhesión celular, etc., y profármacos, tales como profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos que contienen p-lactámicos, profármacos que contienen fenoxiacetamida sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo.
Para los procedimientos de diagnóstico que utilizan anticuerpos anti-PTK7, un fármaco puede incluir un marcador detectable utilizado para detectar la presencia de células que expresan PTK7 in vitro o in vivo. Los radioisótopos que son detectables in vivo, tales como los marcadores que son detectables mediante gammagrafía, formación de imágenes por resonancia magnética o ultrasonidos, pueden usarse en aplicaciones de diagnóstico clínico. Los marcadores gammagráficos útiles incluyen emisores de positrones y emisores y. Los agentes de contraste representativos para la obtención de imágenes de fuentes magnéticas son iones paramagnéticos o superparamagnéticos (por ejemplo, hierro, cobre, manganeso, cromo, erbio, europio, disprosio, holmio y gadolinio), partículas de óxido de hierro y agentes de contraste solubles en agua. Para la detección ultrasónica, los gases o líquidos pueden quedar atrapados en partículas inorgánicas porosas que se liberan como agentes de contraste de microburbujas. Para la detección in vitro, los marcadores detectables útiles incluyen fluoróforos, epítopos detectables o agentes de unión y marcadores radioactivos.
Por lo tanto, en algunos aspectos de la divulgación, el fármaco es un agente de formación de imágenes (por ejemplo, un fluoróforo o un marcador de PET (Tomografía por Emisión de Positrones), marcador de SPECT (tomografía computerizada de emisión de fotón único), o marcador de MRI (Resonancia Magnética Imágenes).
El término "marcador" cuando se usa en este documento se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo para generar un anticuerpo "marcado". El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que sea detectable. Los radionúclidos que pueden servir como marcadores detectables incluyen, por ejemplo, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212 y Pd-109. La etiqueta también puede ser una entidad no detectable, como una toxina.
Los ejemplos de fluoróforos incluyen, pero no se limitan a, isotiocianato de fluoresceína (FITC) (por ejemplo, 5-FITC), amidita de fluoresceína (FAM) (por ejemplo, 5-FAM), eosina, carboxifluoresceína, eritrosina, Alexa Fluor® (por ejemplo, Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 o 750), carboxitetrametilrodamina (TAMRA) (por ejemplo, 5-TAMRA), tetrametilrodamina (TMR) y sulforrodamina (SR) (por ejemplo, SR101).
Los radioisótopos terapéuticos o de diagnóstico u otros marcadores (por ejemplo, marcadores PET o SPECT) se pueden incorporar en el agente para la conjugación con los anticuerpos anti-PTK7, tal como se describe en el presente documento. El isótopo puede unirse directamente al anticuerpo, por ejemplo, en un residuo de cisteína presente en el anticuerpo, o puede usarse un quelante para mediar en la unión del anticuerpo y el radioisótopo. Los radioisótopos adecuados para radioterapia incluyen, pero no se limitan a, emisores a, emisores p y electrones auger. Para aplicaciones de diagnóstico, los radioisótopos útiles incluyen emisores de positrones y emisores y. Un anticuerpo anti-PTK7 de la divulgación se puede yodar adicionalmente, por ejemplo, en un residuo de tirosina del anticuerpo, para facilitar la detección o el efecto terapéutico del anticuerpo.
Los ejemplos de un radioisótopo u otros marcadores incluyen, pero no se limitan a, 3H, "C, 13N, 14C, 15N, 150 , 35S, 18F, 32P, 33P, 47Sc, 51Cr, 57Co, 58 Co, 59 Fe, 62 Cu, 64 Cu, 67 Cu, 67 Ga, 68 Ga, 75 Se, 76Br, 77Br, 86 Y, 89Zr, 90 Y, 94 Tc, 95 Ru, 97 Ru, 99 Tc, 103 Ru, 105 Rh, 105 Ru, 107 Hg, 109 Pd, 111 Ag, 111 In, 113 In, 121 Te, 122 Te, 1231, 1241, 1251, 125 Te, 1261, 131 I, 131 In, 1331, 142 Pr, 143 Pr, 153Pb, 153 Sm, 161 Tb, 165 Tm, 166 Dy, 166 H, 167 Tm, 168 Tm, 169 Yb, 177 Lu, 186 Re, 188 Re, 189 Re, 197 Pt, 198 Au, 199 Au , 201 TI, 203 Hg, 211 At, 212 Bi, 212 Pb, 213 Bi, 223 Ra, 224 Ac y 225 Ac.
II.D. Procedimientos de preparación del conjugado fármaco-anticuerpo anti- PTK7
También se proporcionan procedimientos para la preparación de conjugados anticuerpo-fármaco de la presente divulgación. Por ejemplo, un proceso para producir un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 como se describe en el presente documento puede incluir (a) unir el enlazador al fármaco; (b) conjugar el resto enlazador-fármaco con el anticuerpo; y (c) purificar el conjugado anticuerpo-fármaco. En el Ejemplo 9 se describen procedimientos representativos para la síntesis de vc0101 y mc8261, y en el Ejemplo 10 se describen procedimientos representativos para la conjugación de los ADC anti-PTK7-vc0101, anti-PTK7-mc8621 y ADC anti-PTK7-AcButCM.
En un aspecto, se puede preparar un conjugado anticuerpo-fármaco de fórmula Ab-(L-D) (a) añadiendo el resto enlazador-fármaco (por ejemplo, vc0101 o mc8261) a un anticuerpo anti-PTK7, o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde los anticuerpos anti-PTK7 pueden reducirse parcialmente en una solución que contiene: 2-10 exceso molar de tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP), 100 mM de tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) que tiene un pH de 6-9 y ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) 1 mM durante un período de tiempo que varía de aproximadamente 30 minutos a 16 horas a una temperatura que varía de aproximadamente 0-37°C. La carga útil de enlazador vc0101 o mc8261 se puede añadir a una relación molar de carga útil de enlazador/anticuerpo de aproximadamente 4-10 con dimetilacetamida (DMA) durante un período de tiempo de incubación que varía de aproximadamente 30 minutos a 16 horas a una temperatura que varía de aproximadamente 0-37 °C. Posteriormente, los tioles no reaccionados pueden bloquearse con N-etilmaleimida y la carga útil de enlazador no reaccionado se puede inactivar con L-Cys.
En otro aspecto, un conjugado anticuerpo-fármaco de la fórmula Ab-(L-D) se pueden preparar mediante (a) añadir el resto enlazador-fármaco (por ejemplo AcButCM) a un anticuerpo anti-PTK7, o antígeno-fragmento de unión del mismo, en el que la concentración de anticuerpo puede variar de 1 a 25 mg/ml y el resto enlazador-fármaco está en una relación molar que varía de aproximadamente 1-15 a 1 del anticuerpo anti-PTK7; (b) incubar el resto enlazadorfármaco y anticuerpo anti-PTK7 en una solución tamponada no nucleófila, compatible con proteínas que tiene un pH en un intervalo de aproximadamente 7 a 9 para producir un conjugado anticuerpo-fármaco monomérico, en el que la solución compromete además (i) un codisolvente orgánico adecuado, y (ii) un aditivo que tenga al menos un C 8 ­ C ^ácido carboxílico o su sal, y en el que la incubación se realiza a una temperatura que varía de aproximadamente 0°C a aproximadamente 45°C, durante un período de tiempo que varía de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 24 horas; y (c) someter el conjugado producido en la etapa (b) a un proceso de separación cromatográfica para separar conjugados anticuerpo-fármaco con un DAR de 1 a 8; y proporciona una fracción conjugada baja (LCF) por debajo del 10% de anticuerpo anti-PTK7 no conjugado, resto enlazador-fármaco y conjugados agregados.
Las condiciones de reacción óptimas para la formación de un conjugado se pueden determinar empíricamente mediante la variación de las variables de reacción, tales como temperatura, pH, entrada resto enlazador-carga útil, y la concentración de aditivo. Los expertos en la técnica pueden determinar las condiciones adecuadas para la conjugación de otros fármacos sin una experimentación excesiva.
En algunos aspectos, el fármaco puede modificarse para incluir un grupo reactivo con un punto de conjugación en un anticuerpo. Por ejemplo, un fármaco puede unirse mediante alquilación (por ejemplo, en el grupo épsilonamino de lisinas o en el extremo N-terminal de los anticuerpos), aminación reductora de carbohidratos oxidados, transesterificación entre grupos hidroxilo y carboxilo, amidación en grupos amino o grupos carboxilo y conjugación a los tioles. En algunas realizaciones, el número de moléculas de fármaco (D) conjugadas por molécula de anticuerpo varía de 1 a 8 ; 1 a 7, 1 a 6 , 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 o 1 a 2. En otras realizaciones, el número de moléculas de fármaco (D) conjugadas por anticuerpo es 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7 u 8. En algunos casos, las composiciones, lotes y/o formulaciones de una pluralidad de conjugados anticuerpo-fármaco pueden caracterizarse por un DAR promedio. El DAR promedio varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 , de aproximadamente 1 a aproximadamente 7, de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 , de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, de aproximadamente 1 a aproximadamente 4; de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2. En algunos casos, el DAR promedio para una composición, lote y/o formulación de una pluralidad de conjugados anticuerpo-fármaco varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 , aproximadamente 2 a aproximadamente 7, de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 , de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, de aproximadamente 2 a aproximadamente 4, de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 o de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. Tal como se usa en los intervalos anteriores de DAR promedio, el término "aproximadamente" significa /- 0,5%. Para ejemplos de químicas que se pueden usar para la conjugación, ver, por ejemplo, Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc.), Capítulo 15 (Modificaciones químicas de proteínas).
Se han descrito otros procedimientos para la preparación de conjugados anticuerpo-fármaco en diversas publicaciones. Por ejemplo, se puede realizar una modificación química en los anticuerpos mediante aminas de cadena lateral de lisina o mediante grupos sulfhidrilo de cisteína activados reduciendo los enlaces disulfuro entre cadenas para que se produzca la reacción de conjugación. Véase, por ejemplo, Tanaka et al., FEBS Letters 579: 2092­ 2096, 2005, y Gentle et al., Bioconjugate Chem. 15: 658-663, 2004. Además, también se han descrito residuos de cisteína reactivos diseñados en sitios específicos de anticuerpos para la conjugación de fármacos específicos con estequiometría definida. Véase, por ejemplo, Junutula et al., Nature Biotechnology, 26: 925-932, 2008.
Además, tal como se describe en la Publicación Internacional N° WO 2013/093809, ciertos residuos presumiblemente presentes en la superficie del dominio CH2 o CH3 de la cadena pesada de anticuerpos, o en el dominio constante de la cadena ligera, o de otro modo accesibles, son adecuados para la sustitución del aminoácido natural de tipo salvaje por, por ejemplo, cisteína y, por lo tanto, son útiles para diseñar un sitio capaz de conjugarse con varios agentes.
En algunos aspectos, un polipéptido Fc modificado de la divulgación puede usarse para preparar un conjugado de anticuerpo anti-PTK7 o anticuerpo-fármaco, tal que el anticuerpo o fragmento del mismo de este modo comprende una región Fc modificada que puede ser utilizada para conjugar, en el residuo modificado (es decir, el aminoácido sustituido en comparación con el Fc no modificado de tipo salvaje), una amplia variedad de agentes.
Los anticuerpos anti-PTK7 y conjugados anticuerpo-fármaco de la presente divulgación pueden abarcar un polipéptido Fc modificado donde 1, 2, o más aminoácidos seleccionados de entre posiciones: 347, 392, 398, 422 y 443 de la cadena pesada del anticuerpo (HC) de un anticuerpo parental, nativo o de tipo salvaje, sustituido con otro aminoácido (incluidos aminoácidos naturales y no naturales/sintéticos), en el que el sistema de numeración de la región constante es el del índice EU según Kabat.
Cabe señalar que una única sustitución en un polipéptido Fc, por ejemplo de un residuo de cisteína, normalmente resulta en la exposición de dos residuos correspondientes en el anticuerpo IgG resultante debido a la naturaleza homodimérica de moléculas de anticuerpos IgG. Por tanto, los anticuerpos IgG modificados resultantes de la divulgación pueden presentar al menos 1, 2, 3, 4 o más grupos reactivos con el fin de conjugarlos con un fármaco o compuesto. En un aspecto, una o más de las sustituciones es con un residuo de cisteína, y los anticuerpos modificados resultantes pueden presentar al menos 1, 2, 3, 4 o más grupos tiol con el fin de conjugarlos con un fármaco o compuesto.
En otro aspecto, un polipéptido Fc modificado de la divulgación puede comprender una o más sustituciones seleccionadas entre las posiciones 347, 392, 398, 422 y 443, de la cadena pesada (HC) de un anticuerpo, en el que el sistema de numeración de la región constante es el del índice EU, tal como se establece en Kabat, y en la que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 61.
Los anticuerpos anti-PTK7 y conjugados anticuerpo-fármaco de la presente divulgación puede abarcar una región de cadena ligera constante (LC) de anticuerpo modificado, o una porción de la misma, en donde 1 , 2 , o 3 aminoácidos escogidos de las posiciones 111, 183, o 188, de la cadena ligera del anticuerpo, en el que el sistema de numeración de la región constante de la cadena ligera es el de Kabat, de un anticuerpo parental, nativo o de tipo salvaje, está sustituido con otro aminoácido (incluidos los aminoácidos naturales y no naturales/sintéticos ácidos).
En algunos aspectos, el polipéptido LC modificado de la divulgación comprende una o más sustituciones de las posiciones 111, 183 o 188 de la cadena ligera del anticuerpo en la que la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera se selecciona del grupo que consiste en la SEC. ID n O: 23, Se Q ID NO: 47 y SEQ ID NO: 71.
En otros aspectos, debido a la naturaleza dimérica de muchos anticuerpos (por ejemplo, IgG comprenden dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada un polipéptido Fc), un anticuerpo de la divulga­ ción puede comprender al menos un polipéptido Fc modificado y puede comprender además al menos un polipéptido constante de cadena ligera modificado, proporcionando así al menos dos sitios de conjugación específicos de sitio -uno en el polipéptido Fc y otro en el polipéptido LC.
En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la PTK7 divulgada Los conjugados anticuerpo-fármaco incluyen una región constante de cadena pesada de IgG1, por ejemplo, una ca­ dena pesada hu23 establecida como SEQ ID NO: 13, una cadena pesada hu24 indicada como SEQ ID n O: 37, o una cadena pesada hu58 indicada como SEQ ID NO: 61. En otros aspectos, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de los conjugados de fármaco-anticuerpo de PTK7 descritos incluye una región constante de cadena ligera kappa, por ejemplo, una cadena ligera hu23 establecida como SEQ ID NO: 23, un conjunto de cadenas ligeras hu24 como SEQ ID NO: 47, o una cadena ligera hu58 expuesta como SEQ ID NO: 71. En aspectos particulares de la divulgación, una PTK7 El conjugado anticuerpo-fármaco puede incluir una región constante de cadena pesada de IgG1 y una región constante de cadena ligera kappa, para ejemplo, una cadena pesada indicada como SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera indicada como SEQ ID NO: 23; o como otro ejemplo, una cadena pesada indicada como SEQ ID NO: 37 y una cadena ligera indicada como SEQ ID NO: 47; o como otro ejemplo, un pesado cadena indicada como SEQ ID n O: 61 y una cadena ligera indicada como SEQ ID NO: 71.
Además, tal como se describe en la Publicación Internacional N° WO2012/059882, los procedimientos de conjugación incluyen el uso de una etiqueta que contiene glutamina donante de acilo o una glutamina endógena hecha reactiva (es decir, la capacidad de formar un enlace covalente como un donador de acilo) mediante modificación de polipéptidos en presencia de transglutaminasa y una amina (por ejemplo, un agente citotóxico que comprende o se une a una amina reactiva).
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PTK7 o conjugado anticuerpo-fármaco puede comprender una etiqueta que contiene glutamina donante de acilo modificado en un sitio específico del anticuerpo (por ejemplo, un extremo terminal carboxilo, un extremo amino terminal, o en otro sitio) del anticuerpo anti-PTK7. En algunos aspectos, la etiqueta comprende un aminoácido glutamina (Q) o una secuencia de aminoácidos GGLLQGG (SEQ ID NO: 74), LLQGA (SEQ ID NO: 75), GGLLQGA (SEQ ID NO: 76), LLQ, LLQGPGK ( SEQ ID NO: 77), LLQGPG (SEQ ID NO: 78), LLQGPA (SEQ ID NO: 79), LLQGP (SEQ ID NO: 80), LLQP (SEQ ID NO: 81), LLQPGK (SEQ ID NO: 82 ), LLQGAPGK (SEQ ID NO: 83), LLQGAPG (SEQ ID NO: 84), LLQGAP (SEQ ID NO: 85), LLQX1X2X3X4X5 , donde X-,es G o P, donde X2 es A, G, P, o está ausente, donde X3 es A, G, K, P, o está ausente, donde X4 es G, K o está ausente, y donde X5 es K o ausente (SEQ ID NO: 86 ), o LLQX1X2X3X4X5, donde X1 es cualquier aminoácido natural y donde X2, X3, X4 y X5 son cualquier aminoácido de origen natural o están ausentes (SEQ ID NO: 87). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PTK7 o el conjugado anticuerpo-fármaco puede comprender una sustitución de aminoácido de asparagina (N) a glutamina (Q) en la posición 297 del anticuerpo anti-PTK7.
En otro aspecto, el anticuerpo anti-PTK7 o conjugado anticuerpo-fármaco puede comprender una etiqueta que contiene glutamina donadora de acilo y una modificación de aminoácidos en la posición 222, 340, o 370 del anticuerpo (esquema de numeración UE), en el que la modificación es una deleción, inserción, sustitución, mutación de aminoácidos o cualquier combinación de los mismos. Por consiguiente, en algunos aspectos, el anticuerpo anti-PTK7 o el conjugado anticuerpo-fármaco puede comprender la etiqueta que contiene glutamina donante de acilo (por ejemplo, Q, GGLLQGG (SEQ ID NO: 74), LLQGA (SEQ ID NO: 75), GGLLQGA (SEQ ID NO: 76), LLQ, LLQGPGK (SEQ ID NO: 77), LLQGPG (SEQ ID NO: 78), LLQGPA (SEQ ID NO: 79), LLQGP (SEQ ID NO: 80), LLQP (SEQ ID NO: 81 ), LLQPGK (SEQ ID NO: 82), LLQGAPGK (SEQ ID NO: 83), LLQGAPG (SEQ ID NO: 84), LLQGAP (SEQ ID NO: 85), LLQX1X2X3X4X5, donde X1 es G o P, donde X2 es A, G, P, o está ausente, donde X3 es A, G, K, P, o está ausente, donde X4 es G, K o ausente, y donde X5 es K o está ausente (SEQ ID NO: 86), o LLQX1X2X3X4X5, donde X1 es cualquier aminoácido de origen natural y donde X2, X3, X4 y X5 son aminoácidos naturales o están ausentes (SEQ ID NO: 87) conjugados en un sitio específico (por ejemplo, en un extremo carboxilo de la cadena pesada o ligera o en otro sitio) del anticuerpo anti-PTK7 y una modificación de aminoácido en la posición 222,340 o 370 del anticuerpo (esquema de numeración de UE).
Para aumentar aún más el número de moléculas de fármaco por conjugado anticuerpo-fármaco, el fármaco puede estar conjugado a polietilenglicol (PEG), incluyendo polímeros y monómeros de polietilenglicol lineales o ramificados. Un monómero de PEG tiene la fórmula: -(CH2CH2O)-. Los fármacos y/o análogos de péptidos se pueden unir al PEG directa o indirectamente, es decir, a través de grupos espaciadores apropiados, tales como azúcares. Una composición de PEG-anticuerpo-fármaco también puede incluir restos lipófilos y/o hidrófilos adicionales para facilitar la estabilidad del fármaco y liberar a un sitio diana in vivo. Se pueden encontrar procedimientos representativos para preparar composiciones que contienen PEG en la patente US 6.461.603; 6.309.633; y 5.648.095, entre otros sitios.
Por ejemplo, para aumentar la cantidad de auristatina o caliqueamicina en conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco dados a concoer en el presente documento, el anticuerpo puede conjugarse con PEG antes de la conjugación con el fármaco, por ejemplo, usando PEG-SPA, PEG-SBA, o PEG-bismaleimida. Los conjugados anticuerpo-fármaco preparados usando PEG pueden mostrar una afinidad de unión reducida por el antígeno diana, pero siguen siendo eficaces como resultado de una mayor carga de fármaco.
Después de la conjugación, los conjugados se pueden separar y purificar de reactivos no conjugados y/o formas agregadas de los conjugados por procedimientos convencionales. Estos pueden incluir procesos tales como cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), ultrafiltración/diafiltración, cromatografía de intercambio iónico (IEC), cromatografíaenfoque (CF) HPLC, FPLC o cromatografía en Sephacryl S-200. La separación también se puede realizar mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). Los medios HIC adecuados incluyen medio cromatográfico de flujo rápido Fenil Sefarosa 6 , medio cromatográfico de flujo rápido Butil Sefarosa 4, medio cromatográfico de flujo rápido Octil Sefarosa 4, medio cromatográfico Toyopearl Ether-650M, medio Macro-Prep metil HIC o medio Macro-Prep t-Butil HIC.
En algunos aspectos de la divulgación, la separación se puede realizar usando un medio cromatográfico de flujo rápido de Butil Sefarosa 4. Cuando se utiliza un gradiente personalizado, se eliminan las especies de DAR superior que permanecen unidas a la columna. En algunos aspectos, el proceso de purificación puede incluir una etapa de extracción de células por centrifugación, opcionalmente una etapa de captura por afinidad de proteína A seguida de una o dos etapas de pulido cromatográfico ortogonal, una etapa de filtración de virus y una etapa de filtración de flujo tangencial para concentración y formulación.
III. Ensayos funcionales para la caracterización de conjugados fármaco-anticuerpo anti-PTK7
La presente divulgación describe además ensayos in vitro e in vivo para caracterizar las actividades de un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco, incluida la actividad de unión de PTK7, la internalización celular después de la unión al antígeno PTK7 presentado en una superficie celular y el direccionamiento a células que expresan PTK7 en un sujeto. En algunos aspectos de la invención, los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco se caracterizan por los aspectos neutralizantes o de depleción del anticuerpo, o su fragmento de unión al antígeno. En algunos aspectos de la invención, los conjugados de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 se caracterizan por la eficacia inesperada de un fármaco particular en comparación con la falta de eficacia de un fármaco alternativo. En algunos aspectos de la invención, los conjugados de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 se caracterizan por tener un rendimiento superior al de un agente terapéutico estándar de atención que tiene el mismo modo de acción que el fármaco.
Las técnicas para detectar la unión de conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco a un antígeno PTK7, u otro antígeno PTK7, son conocidos en la técnica, incluyendo por ejemplo, ensayos BIAcore®. Las técnicas representativas adicionales incluyen centrifugación, cromatografía de afinidad y otros procedimientos inmunoquímicos. Véase, por ejemplo, Manson (1992) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, Estados Unidos de América; Ishikawa (1999) Inmunoensayo enzimático rápido y ultrasensible, Elsevier, Amsterdam/Nueva York. Los ensayos de unión a antígeno se pueden realizar usando antígeno PTK7 aislado o células que expresan PTK7.
La especificidad de unión de conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco se puede describir adicionalmente por definición de un epítopo de unión, es decir, la identificación de residuos, incluyendo residuos no adyacentes que participan en la unión al antígeno, y/o definición de residuos que influyen en la unión a antígeno.
La internalización de conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco por células que expresan PTK7 puede ensayarse observando la cantidad de anticuerpos o conjugados unidos a la superficie de las células que expresan PTK7 a lo largo del tiempo. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 7. Los ligandos de PTK7 seleccionados o sus isoformas pueden estar presentes en forma soluble, y es probable que al menos algo de PTK7 permanezca asociado con la superficie celular, lo que permite la internalización de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por consiguiente, los conjugados de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la presente invención pueden ser internalizados por células que expresan PTK7. Por ejemplo, un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 que se une a PTK7 en la superficie de una célula que inicia el tumor puede ser internalizado por la célula que inicia el tumor. El número de moléculas de ADC internalizadas puede ser suficiente o adecuado para matar una célula que expresa PTK7, especialmente una célula tumoral que expresa PTK7. Dependiendo de la potencia del ADC, en algunos casos, la absorción de una sola molécula de ADC en la célula es suficiente para matar la célula diana a la que se une el ADC. Por ejemplo, ciertas toxinas son muy potentes para matar, de modo que la internalización de una molécula de la toxina conjugada con el anticuerpo es suficiente para matar la célula tumoral.
La intemalización de anticuerpos de PTK7 se puede evaluar usando un ensayo funcional en el que las células se incuban con el anticuerpo anti-PTK7 y un fragmento Fab de anticuerpo secundario que se conjuga con la toxina de saporina. A continuación, se mide la viabilidad celular mediante cualquier procedimiento adecuado, con citotoxicidad celular indicativa de intemalización de anticuerpos. Ver el ejemplo 7.
En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco divulgados es un "antagonista" como se usa en el sentido más amplio, es decir, cualquier molécula que bloquea, inhibe o inhibe parcial o totalmente neutraliza una actividad biológica de una diana nativa descrita en este documento o la transcripción o traducción de la misma. Los términos "inhibir" o "neutralizar" como se usan en este documento con respecto a la bioactividad de un anticuerpo de la divulgación significan la capacidad del anticuerpo para antagonizar sustancialmente, prohibir, prevenir, restringir, ralentizar, interrumpir, eliminar, detener, reducir o revertir, p. progresión o severidad de lo que se está inhibiendo, incluyendo, pero sin limitarse a, una actividad biológica. Por ejemplo, en algunos aspectos de la invención, El conjugado anticuerpofármaco anti-PTK7 facilita la muerte celular tras la internalización del conjugado anticuerpo-fármaco. Por ejemplo, un anticuerpo neutralizante o antagonista preferiblemente disminuirá la función de PTK7 en al menos aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% , 99% o más.
En otros aspectos de la divulgación los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la presente divulgación pueden ser anticuerpos de agotamiento. El término anticuerpo de agotamiento se refiere a un anticuerpo que se une o se asocia con PTK7 en o cerca de la superficie celular e induce, promueve o causa la muerte o eliminación de la célula (por ejemplo, por citotoxicidad dependiente del complemento o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). Preferiblemente, un anticuerpo de goatmiento podrá eliminar, eliminar o matar al menos el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99 % de células que perpetúan el tumor en una población celular definida.
Los ensayos funcionales también incluyen procedimientos para evaluar la actividad anti-cáncer de conjugados anticuerpo-fármaco, por ejemplo, una capacidad de destruir las células cancerosas existentes, o para retrasar o prevenir el crecimiento de células cancerosas. Los cánceres dirigidos por conjugados anticuerpo-fármaco de la invención incluyen tumores y carcinomas primarios y metastatizados de cualquier tejido en un sujeto, incluidos carcinomas y neoplasias malignas hematopoyéticas, tales como leucemias y linfomas.
Los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco que tienen actividad inhibidora del crecimiento pueden eliminar las células que expresan PTK7 o prevenir o reducir la proliferación de células cancerosas que expresan PTK7. Los procedimientos representativos para la evaluación rápida in vitro de la inhibición del crecimiento celular se describen en Jones et al. (2001) J. Immunol. Methods 254: 85-98.
Los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco también pueden incluir una capacidad para inducir la muerte celular, por ejemplo, muerte celular programada caracterizada por degradación del ADN nuclear, degeneración y condensación nuclear, pérdida de integridad de la membrana y fagocitosis. Los ensayos representativos para evaluar las células se describen en Hoves et al. (2003) Methods 31: 127-34; Peng et al. (2002) Chin. Medicina. Sci. J. 17: 17­ 21; Yasuhara et al. (2003) J. Histochem. Cytochem. 51: 873-885.
Por ejemplo, para evaluar la citotoxicidad de conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco in vitro, las células cancerosas que expresan PTK7 y las células de control se cultivan en presencia de los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco y por separado con el fármaco libre. La citotoxicidad de cada agente se informa como ED50 (ng/ml), que es la cantidad de fármaco administrada como conjugado o como fármaco libre que provoca una reducción del 50% de un cultivo celular en relación con un control no tratado. El número de células en cultivo se determina usando un colorante vital (MTS) después de la exposición al fármaco. Ver el ejemplo 12.
Para evaluar la citotoxicidad de conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco in vivo, los tumores se preparan en ratones NOD/SCID, desnudos (nu/nu) u otra cepa de ratones inmuno-comprometidos mediante la inyección subcutánea de diversas células cancerosas. Los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco y los compuestos de control pueden administrarse a ratones portadores de tumores, por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal dos veces por semana durante dos semanas (q4dx4). Los resultados terapéuticos medibles incluyen la inhibición del crecimiento de células tumorales. Ver el ejemplo 13.
Además, la presente invención proporciona conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco que pueden agotar, silenciar, neutralizar, eliminar o inhibir el crecimiento, propagación o la supervivencia de las células tumorales, incluyendo las células iniciadoras de tumores (TIC), y/o neoplasia asociada a través de una una variedad de mecanismos, que incluyen agonizar o antagonizar vías seleccionadas o eliminar células específicas dependiendo, por ejemplo, del anticuerpo anti-PTK7, o la dosificación y el procedimiento de administración.
Tal como se usa en este documento, el término célula iniciadora de tumores (TIC) abarca tanto las células de perpetuación de tumores (TPC; es decir, células madre cancerosas o CSC) como las células progenitoras de tumores altamente proliferativas (TProg), que juntas generalmente incluyen una subpoblación única (es decir, 0,1 -40 %) de un tumor o masa en masa. Para los propósitos de la presente divulgación, los términos células que perpetúan el tumor y células madre cancerosas son equivalentes y pueden usarse indistintamente en el presente documento. Por el contrario, TPC se diferencia de TProg en que pueden recapitular completamente la composición de las células tumorales existentes dentro de un tumor y tienen una capacidad de autorrenovación ilimitada, como lo demuestra el trasplante en serie (dos o más pases a través de ratones) de un número reducido de células aisladas. Como se usa en el presente documento, el término "célula iniciadora de tumores" también se refiere a células madre cancerosas de diversas neoplasias hematológicas, que no se caracterizan por un turmo per se.
La presente invención proporciona conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco que se dirigen a células iniciadoras de tumores (TIC), y especialmente células de perpetuación de tumores (TPC), facilitando así el tratamiento, manejo o prevención de trastornos neoplásicos y trastornos hiperproliferativos. Más específicamente, las subpoblaciones de células tumorales específicas expresan PTK7 y probablemente modifican la coordinación localizada de la señalización del morfógeno importante para la autorrenovación de las células madre cancerosas y la supervivencia celular. Por tanto, pueden usarse conjugados de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 para reducir la frecuencia de TIC tras la administración a un sujeto. La reducción en la frecuencia de las células que inician el tumor puede ocurrir como resultado de a) eliminación, agotamiento, sensibilización, silenciamiento o inhibición de las células que inician el tumor; b) controlar el crecimiento, expansión o recurrencia de células iniciadoras de tumores; c) interrumpir la iniciación, propagación, mantenimiento o proliferación de células iniciadoras de tumores; o d) obstaculizando de otro modo la supervivencia, regeneración y/o metástasis de las células tumorigénicas. En algunos aspectos de la divulgación, la reducción en la frecuencia de células iniciadoras de tumores se produce como resultado de un cambio en una o más vías fisiológicas. El cambio en la vía, ya sea por reducción o eliminación de las células iniciadoras del tumor o modificando su potencial (por ejemplo, diferenciación inducida, disrupción de un nicho) o interfiriendo de otra manera con su capacidad para ejercer efectos sobre el entorno del tumor u otras células, a su vez permite para el tratamiento más eficaz de los trastornos asociados a PTK7 mediante la inhibición de la tumorigénesis, el mantenimiento del tumor y/o la metástasis y la recurrencia.
Entre los procedimientos que pueden utilizarse para evaluar dicha reducción en la frecuencia de células iniciadoras del tumor está el análisis de dilución limitante, ya sea in vitro o in vivo, seguido preferiblemente por la enumeración usando estadísticas de distribución de Poisson o la evaluación de la frecuencia de eventos definitivos predefinida, tal como la capacidad de generar tumores in vivo o no. También es posible determinar la reducción de los valores de frecuencia a través de procedimientos citométricos o inmunohistoquímicos de flujo bien conocidos. En cuanto a todos los procedimientos antes mencionados, véanse, por ejemplo, Dylla et al. 2008, PMCID: PMC2413402 y Hoey et al. 2009, PMID: 19664991.
Otros procedimientos compatibles con la presente divulgación que pueden usarse para calcular la frecuencia de las células que inician el tumor, incluyen técnicas de citometría de flujo cuantificables y procedimientos de tinción inmunohistoquímica.
Usando cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente, es posible entonces cuantificar la reducción en la frecuencia de TIC (o el TPC en el mismo) proporcionada por los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco descritos de acuerdo con las enseñanzas de este documento. En algunos casos, los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la presente divulgación pueden reducir la frecuencia de TIC (mediante una variedad de mecanismos mencionados anteriormente, que incluyen eliminación, diferenciación inducida, disrupción de nichos, silenciamiento, etc.) en un 10%, 15%, 20%, 25%, 30% o incluso 35%. En otros aspectos de la divulgación, la reducción en la frecuencia de las TIC puede ser del orden del 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65%. En ciertos aspectos de la divulgación, los compuestos divulgados pueden reducir la frecuencia de TIC en un 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o incluso 95%.
La acumulación de evidencia respalda la hipótesis de que el TPC controla el crecimiento tumoral, la resistencia a la terapia y la recaída del trastorno. La frecuencia de TPC puede variar en un tipo de tumor o entre pacientes con el mismo tipo de tumor como producto de la etapa del trastorno y/o el grado de diferenciación dentro del tumor. El TPC se puede identificar y enriquecer utilizando paneles de marcadores de superficie celular que a menudo se superponen en su expresión entre pacientes con ciertos tipos de cáncer. Los TPC se definen mejor por su capacidad funcional para iniciar tumores tras el trasplante en serie, mientras que las células no tumorigénicas (NTG) carecen de esta capacidad. Las células tumorales sólidas enriquecidas por su capacidad única de iniciación de tumores se identificaron por primera vez en el cáncer de mama; sin embargo, el cáncer de mama incluye un espectro de neoplasias. Hasta la fecha, la comunicac científica no ha conseguido asociar las identidades de TPC específicas con subtipos de trastornos particulares, lo que puede sustentar los resultados discrepantes a través y dentro de los grupos y también pueden icnrementar la probabilidad de la falta de éxito en la traducción a la clínica.
La presente divulgación proporciona una combinación de nuevos marcadores de la superficie celular que mejoran el enriquecimiento de TPC. En un aspecto particular, la divulgación proporciona una combinación de nuevos marcadores de superficie celular que facilitan el enriquecimiento de TPC de cáncer de mama triple negativo (TNBC). La presente divulgación proporciona además la identificación de PTK7 como una nueva diana terapéutica asociada a TPC en TNBC; cuyo nivel de expresión es significativamente mayor que en otros subtipos de cáncer de mama y tejido normal.
La farmacocinética de los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco puede evaluarse y compararse con la farmacocinética del anticuerpo no conjugado en varios animales. Por ejemplo, esto se puede hacer después de una única administración de bolo intravenoso en hembras NOD/SCID, desnudas (nu/nu) u otra cepa de ratones inmunodeprimidos, ratas macho Sprague-Dawley y hembras de monos cynomolgus. La farmacocinética de los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco se caracteriza generalmente por un aclaramiento bajo, un volumen de distribución bajo y una semivida terminal aparente prolongada en varias especies. Se espera que las concentraciones séricas de derivados de auristatina no conjugados estén por debajo del límite de cuantificación. Se espera que el perfil de toxicidad de estos conjugados en estudios de intervalo de toxicidad de dosis única sea similar al obtenido para otros conjugados de anticuerpo-fármaco en dosis comparables.
Un anticuerpo, conjugado anticuerpo-fármaco u otro agente que "induce apoptosis" es aquel que induce la muerte celular programada determinada mediante la unión de anexina V, la fragmentación de ADN, contracción celular, dilatación del retículo endoplasmático, la fragmentación celular, y/o formación de vesículas de membrana (llamadas cuerpos apoptóticos). La célula es una célula tumoral, por ejemplo, mama, ovario, colorrectal, próstata, hígado y pulmón. Hay varios procedimientos disponibles para evaluar los eventos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, la translocación de fosfatidil serina (PS) se puede medir mediante la unión de anexina; La fragmentación del ADN se puede evaluar mediante la escala del ADN; y la condensación nuclear/de cromatina junto con la fragmentación del ADN pueden evaluarse mediante cualquier aumento de las células hipodiploides.
Como se usa en el presente documento "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos, y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente causan la lisis de la célula diana. La actividad de ADCC de una molécula de interés se puede evaluar usando un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la patente de EE.UU. n° 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células NK. Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el que se describe en Clynes et al., PNAS (EE.UU.), 95: 652-656 (1998).
La “citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una diana en presencia de complemento. La vía de activación del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del complemento (C1 q) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) que forma un complejo con un antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163-171 (1997).
Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Las células pueden expresar FcyRIII y realizar una función efectora de citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (ADCC). Los ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen, pero no se limitan a, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, macrófagos, eosinófilos y neutrófilos, prefiriéndose las PBMC y las células NK. Los anticuerpos que tienen actividad ADCC son típicamente del isotipo IgG1 o IgG3. Dichos anticuerpos mediadores de ADCC también se pueden producir modificando una región variable a partir de un anticuerpo que no es de ADCC o un fragmento de región variable en una región constante de isotipo IgG1 o IgG3.
IV. Usos de los conjugados fármaco-anticuerpo PTK7
Los anticuerpos y los conjugados de anticuerpo-fármaco de la presente divulgación son útiles en diversas aplicaciones que incluyen, pero no se limitan a, procedimientos de tratamiento terapéuticos y procedimientos de tratamiento de diagnóstico.
IV.A. Aplicaciones in vitro
La presente divulgación proporciona procedimientos in vitro utilizando conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco. Por ejemplo, los anticuerpos descritos pueden usarse, ya sea solos o en combinación con agentes citotóxicos u otros fármacos, para unirse específicamente a células cancerosas positivas de PTK7 para agotar dichas células de una muestra de células. También se proporcionan procedimientos para inducir apoptosis y/o inhibición de la proliferación celular mediante el contacto de células que expresan PTK7 con un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7. Los procedimientos in vitro representativos se describen en el presente documento anteriormente bajo el título de "Ensayos funcionales para la caracterización de conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco".
Los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la invención también tienen utilidad en la detección de células positivas a PTK7 in vitro basándose en su capacidad para unirse específicamente al antígeno de PTK7. Un procedimiento para detectar células que expresan PTK7 puede incluir: (a) preparar una muestra biológica que tenga células; (b) poner en contacto un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco con la muestra biológica in vitro, en el que el fármaco es un marcador detectable; y (c) detectar la unión de los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco.
Los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco descritos en el presente documento también son útiles para reducir la frecuencia de células que inician tumores en una muestra de tumor. Por ejemplo, el procedimiento puede incluir las etapas de poner en contacto in vitro una población de células tumorales, en donde la población comprende células iniciadoras de tumores y células tumorales distintas de las células iniciadoras de tumores, con un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7; por lo que se reduce el porcentaje de células iniciadoras de tumores en la población celular. Como se usa en el presente documento, el término "célula iniciadora de tumores" también se refiere a células madre cancerosas de diversas neoplasias hematológicas malignas, que no se caracterizan por un tumor per se. Las muestras tumorales representativas incluyen cualquier muestra biológica o clínica que contenga células tumorales, por ejemplo, una muestra de tejido, una biopsia, una muestra de sangre, plasma, saliva, orina, fluido seminal, etc.
IV.B. Aplicaciones Terapéuticas
Los trastornos o afecciones asociados a PTK7 incluyen, entre otros, mesotelioma, carcinoma hepatobiliar (conducto hepático y biliar), carcinoma hepatocelular, un tumor primario o secundario del SNC, un tumor cerebral primario o secundario, cáncer de pulmón (NSCLC y SCLC), cáncer de hueso, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gastrointestinal (tal como gástrico, colorrectal y duodenal), cáncer de mama (tal como cáncer de mama triple negativo (TNBC), cáncer de mama con receptor de progesterona positivo (PR+), cáncer de mama con receptor de estrógeno positivo (ER+) y cáncer de mama doble positivo), cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de testículo, leucemias (tales como leucemia mieloide aguda (LMA) y leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide crónica), linfomas linfocíticos, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, linfoma no Hodgkin, tumores del eje espinal, glioma de tronco encefálico, adenoma hipofisario, cáncer adrenocortical, cáncer de vesícula biliar, mieloma múltiple, colangiocarcinoma, fibrosarcoma, neuroblastoma, retinoblastoma, y todos los cánceres representados por los tipos de células que expresan PTK7 mostrados en las Tablas 8 y 9 o una combinación de uno o más de los cánceres descritos en este documento.
La frase "cantidad eficaz", "dosis eficaz" o como se usa en este documento se refiere a una cantidad de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica necesaria para lograr uno o más resultados terapéuticos beneficiosos o deseados. Para uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar el inicio del trastorno, incluidos los síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales del trastorno, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo del trastorno. Para uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos, tales como reducir la incidencia o mejorar uno o más síntomas de varios trastornos asociados a PTK7, disminuir la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar el trastorno, aumentar el efecto de otro medicamento, y/o retrasar la progresión del trastorno asociado a PTK7 de pacientes.
En un aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar un trastorno asociado con la expresión de PTK7 en un sujeto. La divulgación también proporciona un conjugado de anticuerpo-fármaco, o una composición farmacéutica, tal como se describe en el presente documento, para su uso en un procedimiento para tratar un trastorno asociado con la expresión de PTK7 en un sujeto. La divulgación proporciona además el uso de un conjugado anticuerpo-fármaco, o una composición farmacéutica, tal como se describe en el presente documento, en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno asociado con la expresión de PTK7 en un sujeto.
En algunos aspectos de la divulgación, el procedimiento de tratamiento de un trastorno asociado con la expresión PTK7 en un sujeto incluye la administración al sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una composición (por ejemplo, composición farmacéutica) que tiene los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco, tal como se describe en este documento. Los trastornos asociados con la expresión de PTK7 incluyen, pero no se limitan a, expresión anormal de PTK7, expresión alterada o aberrante de PTK7, sobreexpresión de PTK7 y un trastorno proliferativo (por ejemplo, cáncer).
En un aspecto de la divulgación, el trastorno es cáncer, que incluye, pero sin limitación, mesotelioma, carcinoma hepatobiliar (conducto hepático y biliar), carcinoma hepatocelular, un tumor primario o secundario del SNC, un tumor cerebral primario o secundario, cáncer de pulmón (NSCLC y SCLC), cáncer de hueso, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gastrointestinal (tal como gástrico, colorrectal y duodenal), cáncer de mama (tal como cáncer de mama triple negativo (TNBC), cáncer de mama con receptor de progesterona positivo (PR+), cáncer de mama con receptor de estrógeno positivo (ER+) y cáncer de mama doble positivo), cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de testículo, leucemias (tales como leucemia mieloide aguda (LMA) y leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide crónica), linfomas linfocíticos, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, linfoma no Hodgkin, tumores del eje espinal, glioma de tronco encefálico, adenoma hipofisario, cáncer adrenocortical, cáncer de vesícula biliar, mieloma múltiple, colangiocarcinoma, fibrosarcoma, neuroblastoma, retinoblastoma, y todos los cánceres representados por los tipos de células que expresan PTK7 mostrados en las Tablas 8 y 9 o una combinación de uno o más de los cánceres descritos en este documento.
En otro ejemplo, los cánceres adecuados para el direccionamiento usando el conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco incluyen cánceres primarios y metastásicos que expresan PKT7, tales como el cáncer de mama (tales como cáncer de mama triple negativo (TNBC), cáncer de mama positivo del receptor de progesterona (PR+), cáncer de mama positivo para receptores de estrógeno (ER ) y cáncer de mama doble positivo); cáncer de ovarios; cáncer colorrectal; cáncer de esófago; cáncer gástrico; melanoma; sarcoma; cáncer de riñón; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer de hígado, tal como carcinoma hepatocelular (HCC); y cáncer de pulmón, tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC).
En un ejemplo más específico, los cánceres adecuados para la orientación utilizando anti-PTK7 conjugados anticuerpo-fármaco incluyen PTK7-expresión de cánceres primarios y metastásicos, tales como el cáncer de mama (tales como cáncer de mama triple negativo (TNBC), receptor de progesterona positivo cáncer de mama (PR ), cáncer de mama positivo para receptores de estrógeno (ER ) y cáncer de mama doble positivo) NSCLC, cáncer de próstata y cáncer de esófago. En un caso más específico, los cánceres adecuados para dirigirse utilizando conjugados anticuerpo-fármaco anti-PTK7 incluyen cánceres primarios y metastásicos que expresan PTK7, como el cáncer de mama (como el cáncer de mama triple negativo (TNBC)) y el NSCLC.
En algunos aspectos de la divulgación, se proporciona un procedimiento para inhibir el crecimiento o la progresión tumoral en un sujeto que tiene un tumor que expresa PTK7, incluida la administración al sujeto que lo necesita de una cantidad eficaz de una composición que tiene los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco como se describe. Aquí en. En otros aspectos de la divulgación, se proporciona un procedimiento para inhibir la metástasis de células cancerosas que expresan PTK7 en un sujeto, que incluye administrar al sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición que tiene los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco como se describe en el presente documento. En otros aspectos de la divulgación, se proporciona un procedimiento para inducir la regresión de una PTK7 que expresa regresión tumoral en un sujeto, incluyendo administrar al sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición que tiene los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco como se describe en el presente documento. En otros aspectos, la divulgación proporciona un conjugado de anticuerpo-fármaco, o una composición farmacéutica, como se describe en el presente documento, para su uso en un procedimiento como se describe anteriormente. En otros aspectos, la divulgación proporciona el uso de un conjugado de anticuerpo-fármaco, o una composición farmacéutica, como se describe en el presente documento, en la fabricación de un medicamento para su uso en los procedimientos descritos anteriormente.
Por lo tanto, los pacientes que se van a tratar con conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la invención pueden seleccionarse en función de la expresión de biomarcadores, que incluyen, entre otros, ARNm (qPCR) de muestras tumorales a granel y expresión elevada del antígeno PTK7 que da como resultado una población de pacientes seleccionada para expresión de la diana enriquecida en lugar del origen del tumor o la histología. La expresión de la diana se puede medir en función del número de células que se tiñen combinado con la intensidad de la tinción de las células. Por ejemplo, la clasificación de alta expresión de PTK7 incluye a aquellos pacientes con más del 30% (es decir, 40%, 50% o 60%) de las células analizadas mediante tinción inmunohistoquímica positiva para PTK7 a un nivel de 3+ (en una escala de 1 a 4), mientras que la expresión moderada de PTK7 puede incluir a aquellos pacientes con más del 20% de las células celulares teñidas de 1+ a 2+. La expresión de diana también se puede medir mediante la detección de la expresión de PTK7 en células iniciadoras de tumor (TIC), tal como se describen en el presente documento.
También se pueden usar biomarcadores distintos de la expresión de PTK7 para la selección de pacientes, incluida la caracterización del tumor basada en la resistencia a múltiples fármacos (MDR), por ejemplo. Casi el 50% de los cánceres humanos son completamente resistentes a la quimioterapia o responden solo de manera transitoria, después de lo cual ya no se ven afectados por los medicamentos contra el cáncer de uso común. Este fenómeno se conoce como MDR y es expresado inherentemente por algunos tipos de tumores, mientras que otros adquieren MDR después de la exposición al tratamiento de quimioterapia. La glucoproteína P de la bomba de eflujo del fármaco interviene en la mayoría de las MDR asociadas con los quimioterápicos citotóxicos. Se pueden realizar análisis fenotípicos y funcionales de los mecanismos MDR presentes en muestras de tumores de pacientes con cáncer para relacionar los mecanismos MDR específicos con la resistencia a la quimioterapia en tipos de tumores específicos.
El crecimiento del cáncer o la proliferación anormal se refiere a cualquiera de varios índices que sugieren un cambio dentro de las células a una forma de cáncer o estado de enfermedad más desarrollado. La inhibición del crecimiento de células cancerosas o células de un trastorno proliferativo no neoplásico puede ensayarse mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como crecimiento tumoral retardado e inhibición de metástasis. Otros índices para medir la inhibición del crecimiento del cáncer incluyen una disminución en la supervivencia de las células cancerosas, una disminución en el volumen o la morfología del tumor (por ejemplo, según se determina mediante tomografía computarizada (TC), ecografía u otro procedimiento de imágenes), destrucción de la vasculatura del tumor, mejoría rendimiento en la prueba cutánea de hipersensibilidad retardada, aumento de la actividad de los linfocitos T citolíticos y disminución de los niveles de antígenos específicos del tumor.
Los resultados deseados de los procedimientos terapéuticos descritos son generalmente medidas cuantificables en comparación con una medida de control o de referencia. Como se usa en este documento, términos relativos como "mejorar", "aumentar" o "reducir" indican valores relativos a un control, como una medición en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito en este documento, o una medición en un individuo de control (o múltiples individuos de control) en ausencia del tratamiento descrito en este documento. Un individuo de control representativo es un individuo que padece la misma forma de trastorno hiperproliferativo que el individuo que está siendo tratado, que tiene aproximadamente la misma edad que el individuo que está siendo tratado (para asegurar que las etapas del trastorno en el individuo tratado y el individuo de control sean comparable.
Los cambios o mejoras en la respuesta a la terapia son generalmente estadísticamente significativa. Como se usa en el presente documento, el término "significación" o "significativo" se refiere a un análisis estadístico de la probabilidad de que exista una asociación no aleatoria entre dos o más entidades. Para determinar si una relación es "significativa" o tiene "significación", las manipulaciones estadísticas de los datos pueden ser "valor p". Los valores p que caen por debajo de un punto de corte definido por el usuario se consideran significativos. Un valor p menor o igual a 0,1, menor que 0,05, menor que 0 ,01, menor que 0,005 o menor que 0,001 puede considerarse significativo.
Tal como se ha descrito anteriormente en este documento bajo el título "III. Ensayos funcionales para la caracterización de conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco", la presente divulgación también proporciona procedimientos para el reconcimiento de células iniciadoras de tumor. Más particularmente, los conjugados de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 de la invención pueden agotar, silenciar, neutralizar, eliminar o inhibir el crecimiento, la propagación o la supervivencia de las células tumorales, incluidas las células iniciadoras de tumores.
Por tanto, los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco descritos en el presente documento también son útiles para reducir la frecuencia de células iniciadoras de tumores en una muestra de tumor. Por ejemplo, el procedimiento puede incluir las etapas de poner en contacto una población de células tumorales, donde la población comprende células iniciadoras de tumores y células tumorales distintas de las células iniciadoras de tumores, con un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7; por lo que se reduce el porcentaje de células iniciadoras de tumores en la población celular. Como se usa en el presente documento, el término "célula iniciadora de tumores" también se refiere a células madre cancerosas de diversas neoplasias hematológicas malignas, que no se caracterizan por un tumor per se. La etapa de contacto se puede realizar in vitro, en el que la población de células tumorales está contenida en una muestra biológica, como se describe aquí anteriormente. Alternativamente, la etapa de contacto puede realizarse in vivo tal como tiene lugar después de la administración de un conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco a un sujeto.
IV.C. Detección y diagnóstico in vivo
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para detectar, diagnosticar, y/o monitorizar un trastorno asociado con la expresión de PTK7. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PTK7, tal como se describen en el presente documento, pueden marcarse con un resto detectable, tal como un agente de formación de imágenes y un marcador enzimasustrato. Los anticuerpos, tal como se describen en el presente documento, también se pueden usar para ensayos de diagnóstico in vivo, tales como formación de imágenes in vivo (por ejemplo, PET o SPECT), o un reactivo de tinción.
Después de la administración de un conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco a un sujeto, donde el fármaco es un marcador detectable, y después de un tiempo suficiente para la unión, la biodistribución de células que expresan PTK7 unido por el anticuerpo puede visualizarse. Los procedimientos de diagnóstico descritos pueden usarse en combinación con procedimientos de tratamiento. Además, los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la invención pueden administrarse con el doble propósito de detección y terapia.
Los procedimientos de detección no invasivos representativos incluyen gammagrafía (por ejemplo, SPECT (tomografía computarizada por emisión de fotón único), PET (tomografía por emisión de positrones), imágenes de cámara gamma y escaneo rectilíneo), imágenes de resonancia magnética (por ejemplo, imágenes de resonancia magnética convencional, imágenes de transferencia de magnetización (MTI), espectroscopia de resonancia magnética de protones (MRS), imágenes ponderadas por difusión (DWI) e imágenes de resonancia magnética funcional (fMRI) y ultrasonido.
IV.D. Formulación
La presente divulgación proporciona además composiciones farmacéuticas que incluyen cualquiera de los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco dados a conocer en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. Además, las composiciones pueden incluir más de un anticuerpo anti-PTK7 o un conjugado de fármacoanticuerpo anti-PTK7 (por ejemplo, una mezcla de anticuerpos anti-PTK7 que reconocen diferentes epítopos de PTK7). Otras composiciones de ejemplo incluyen más de un anticuerpo anti-PTK7 o conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco que reconocen el mismo epítopo o epítopos, o diferentes especies de anticuerpos anti-PTK7 o conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco que se unen a diferentes epítopos de PTK7 (por ejemplo, PTK7 humana).
La composición utilizada en la presente divulgación puede incluir además portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed., 2005, Lippincott Williams y Wilkins, Ed. KE Hoover), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones, y pueden incluir tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecil dimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextranos; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). "Sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en este documento, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de una molécula o macromolécula. Los excipientes farmacéuticamente aceptables se describen adicionalmente en el presente documento.
Diversas formulaciones del anticuerpo PTK7 o del conjugado anticuerpo-fármaco PTK7 se pueden usar para la administración. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo de PTK7 o el conjugado de fármaco y anticuerpo de PTK7 se pueden administrar puro. El anticuerpo de PTK7 o el conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 y un excipiente farmacéuticamente aceptable pueden estar en diversas formulaciones. Los excipientes farmacéuticamente aceptables se conocen en la técnica y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o actuar como diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, entre otros, agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, tampones y potenciadores de la penetración cutánea. Los excipientes así como las formulaciones para la administración de fármacos por vía parenteral y no parenteral se exponen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000.
En algunos aspectos de la divulgación, estos agentes se formulan para la administración por inyección (por ejemplo, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.). Por consiguiente, estos agentes pueden combinarse con vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y similares. El régimen de dosificación particular, es decir, la dosis, el momento y la repetición, dependerá del individuo en particular y del historial médico de ese individuo.
Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo anti-PTK7 o el conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco usados de acuerdo con la presente divulgación se preparan para su almacenamiento mezclando un anticuerpo que tiene un grado deseado de pureza, opcionalmente con vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes o estabilizantes (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a Ed. Mack Publishing (2.000)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, y pueden comprender tampones tales como el fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; sales tales como cloruro sódico; antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (tales como el cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol bencílico o butílico; alquilparabenos, tales como el metil o el propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol; 3-pentanol, y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como la seroalbúmina, la gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como la glicina, glutamina, asparagina, histidina, argininia o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares tales como la sacarosa, el manitol, la trehalosa o el sorbitol; iones que cuentan a la hora de formar sales, tales como el sodio, complejos metálicos (por ejemplo, complejos de proteína-Zn) ; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, PLUr On ICS™ o polietilenglicol (Pe G).
Los liposomas que contienen el anticuerpo anti-PTK7 o el conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco se preparan por procedimientos conocidos en la técnica, tales como los que se describen en Epstein, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1.985); Hwang, y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030 (1.980); y Patente de Estados Unidos Nos 4.485.045 and 4.544.545. Los liposomas que favorecen el tiempo de circulación se describen en la Patente de Estados Unidos N° 5.013.556. Se pueden generar liposomas particularmente útiles por el procedimiento de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado.
Los principios activos se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y de poli (metil-metacilato) respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se desvelan en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21a Ed. Mack Publishing (2.005).
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrofóbicos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices está en forma de artículos de ciertas formas, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2 -hidroxietil-metacrilato), o poli (vinilalcohol)), poliláctidos (Patente de Estados Unidos N° 3.773.919) , copolímeros de ácido L-glutámico y 7 etil-L-glutamato, acetato de vinil etileno no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico - ácido glicólico tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) , acetato isobutirato de sacarosa, y poli-D-(-) -3-ácido hidroxibutírico.
Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Las composiciones terapéuticas de anticuerpo anti-PTK7 o de conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco se colocan generalmente en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
Las composiciones según la presente divulgación pueden estar en formas de dosificación unitarias tales como comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones, o supositorios, para administración oral, parenteral o rectal, o administración por inhalación o insuflación.
Para preparar las composiciones sólidas tales como comprimidos, el principal principio activo se mezcla con un porta­ dor farmacéutico, por ejemplo, los ingredientes convencionales de los comprimidos, tales como el almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato magnésico, fosfato dicálcico o gomas, y otros diluyentes farmacéuticos, por ejemplo agua, para formar una pre-formulación sólida de una composición que contiene una mezcla homogénea de un compuesto de la presente invención, o una sal no tóxica farmacéuticamente aceptable del mismo. Cuando se refiere a estas pre-formulaciones de composiciones como homogéneas, significa que el principio activo está disperso por toda la composición de forma que la composición se puede fácilmente subdividir en formas unitarias de dosificación igualmente eficaces, tales como comprimidos, píldoras y cápsulas, Esta pre-formulación sólida de la composición se subdivide entonces en formas de dosificación unitarias del tipo descrito anteriormente que contienen de 0,1 a aproximadamente 500 mg del principio activo de la presente invención. Los comprimidos o píldoras de la nueva composición se pueden recubrir o componer de alguna otra manera para proporcionar una forma de dosificación que consiga la ventaja de una acción prolongada. Por ejemplo, el comprimido o la píldora pueden comprender una componente de dosificación interno y un componente de dosificación externo, este último está en forma de envoltura sobre el formador. Los dos componentes se pueden separar por una capa entérica que sirve para resistir la desinte­ gración en el estómago y permite al componente interno pasar intacto al duodeno o retrasarse su liberación. Una variedad de materiales se pueden utilizar para estas capas entéricas o revestimientos, tales materiales incluyen varios ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con tales materiales como goma laca, cetil alcohol y acetato de celulosa.
Los agentes activos de superficie adecuados incluyen, en particular, agentes no iónicos, tales como polioxitetilensorbitanos (por ejemplo Tween™ 20, 40, 60, 80 o 85) y otros sorbitanos (por ejemplo SpanTM 20, 40, 60, 80, o 85). Las composiciones con un agente activo de superficie comprenderán convenientemente entre 0,05 y el 5% de agentes activo de superficie, y puede ser entre el 0,1 y el 2,5%. Se apreciará que se pueden añadir otros ingredientes, por ejemplo el manitol u otros vehículos farmacéuticamente aceptables, si fuera necesario.
Las emulsiones adecuadas se pueden preparar utilizando emulsiones grasas disponibles comercialmente, tales como Intralipid™, Infonutrol™, Lipofundin™ y Lipiphysan™. El principio activo puede ser disuelto en una emulsión de la composición premezclada o de manera alternativa puede disolverse en un aceite (por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de algodón, aceite de sésamo, aceite de maíz o aceite de almendra) y una emulsión formada mez­ clando con un fosfolípido (por ejemplo, fosfolípidos del huevo, fosfolípidos de soja, o lecitina de soja) y agua. Se apreciará que otros ingredientes se pueden añadir, por ejemplo, glicerol o glucosa, para ajustar la tonicidad de la emulsión. Las emulsiones adecuadas típicamente contendrán hasta un 20% de aceite, por ejemplo, entre un 5 y un 20%. La emulsión de grasa puede comprenden gotitas de grasa entre 0,1 y 1,0 |im, particularmente 0,1 y 0,5 |im, y tiene un pH en el intervalo de 5,5 a 8,0.
Las composiciones de la emulsión pueden ser las preparadas mezclando un anticuerpo anti-PTK7 o un conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco con Intralipid™ o los componentes del mismo (aceite de soja, fosfolípidos de huevo, glicerol y agua).
Las composiciones por inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en un disolvente farmacéutica­ mente aceptable acuoso u orgánico, o mezclas de los mismos, y polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables como se expuso anteriormente. En algunas realizaciones, las composiciones se administran por vía oral o nasal respiratoria para un efecto local o sistémico. Las composiciones en disolventes estériles farmacéuticamente aceptables que pueden nebulizarse con la utilización de gases. Las composiciones para nebulizarse se pueden respirar directamente del dispositivo de nebulización o el dispositivo de nebuliza­ ción se puede acoplar a una máscara facial, una tienda o una máquina de respiración de presión positiva intermitente. Las composiciones en suspensión o en polvo se pueden administrar, preferiblemente por vía oral o nasal, a con dis­ positivos que suministran la formulación de una manera apropiada.
La divulgación también proporciona kits para su uso en los presentes procedimientos. Los kits de la divulgación incluyen uno o más recipientes que incluyen el anticuerpo anti-PTK7 o el conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco, tal como se describe en este documento e instrucciones de uso de acuerdo con cualquiera de los procedimientos de la divulgación descritos en este documento. Generalmente, estas instrucciones incluyen una divulgación de la administración del anticuerpo anti-PTK7 o del conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco para los tratamientos terapéuticos descritos anteriormente.
Las instrucciones relativas a la utilización de los anticuerpos anti-PTK7 o los conjugados de anticuerpos anti-PTK7, tal como se describen en el presente documento, generalmente incluyen información en cuanto a la dosificación, programa de dosificación, y vía de administración para el tratamiento pretendido. Los recipientes pueden ser dosis unitarias, paquetes a granel (por ejemplo, paquetes multidosis) o subunidades. Las instrucciones suministradas en los kits de la divulgación suelen ser instrucciones escritas en una etiqueta o prospecto (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el kit), pero también son aceptables instrucciones legibles por máquina (por ejemplo, Instrucciones en un disco de almacenamiento magnético u óptico).
Los kits de esta divulgación están en un envase adecuado. Los envases adecuados incluyen, pero no se limitan a, viales, botellas, frascos, envases flexibles (por ejemplo, bolsas de plástico o Mylar selladas) y similares. También se contemplan envases para su uso en combinación con un dispositivo específico, como un inhalador, un dispositivo de administración nasal (por ejemplo, un atomizador) o un dispositivo de infusión como una minibomba. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). El recipiente también puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-PTK7 o un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7.
Los kits pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales tales como tampones e información interpretativa. Normalmente, el kit incluye un recipiente y una etiqueta o prospecto(s) en el recipiente o asociados con él.
IV.E. Dosis y administración
Para aplicaciones in vitro e in vivo, los conjugados de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 se proporcionan o administran en una dosis eficaz. En un contexto clínico, una dosis eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para lograr un tratamiento profiláctico o terapéutico, ya sea directa o indirectamente. Se puede administrar una dosis eficaz en una o más administraciones. Una dosis eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede conseguirse o no junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por lo tanto, una "dosis eficaz" se puede considerar en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y un agente único. Se puede considerar que se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o más agentes, puede ser o se obtiene un resultado deseable. Para la detección de células positivas a PTK7 utilizando los conjugados de fármaco-anticuerpo de PTK7 descritos, Se administra a un sujeto una cantidad detectable de una composición de la divulgación, es decir, una dosis del conjugado tal que la presencia del conjugado puede determinarse in vitro o in vivo.
Por ejemplo, cuando se administra a un sujeto portador de cáncer, una cantidad efectiva incluye una cantidad suficiente para provocar la actividad anti-cáncer, incluyendo la citólisis de células cancerosas, la inhibición de la proliferación de células cancerosas, la inducción de apoptosis de células de cáncer, la reducción de antígenos de células de cáncer, retraso del crecimiento tumoral y/o inhibición de la metástasis. La contracción del tumor está bien aceptada como un marcador sustituto clínico de eficacia. Otro marcador de eficacia bien aceptado es la supervivencia libre de progresión.
El anticuerpo contra PTK7 o los conjugados de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 se pueden administrar a un individuo a través de cualquier ruta adecuada. Los expertos en la técnica deben entender que los ejemplos descritos en este documento no pretenden ser limitantes, sino ilustrativos de las técnicas disponibles. Por consiguiente, en algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo contra PTK7 o el conjugado de anticuerpo contra PTK7 se administra a un individuo de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como la administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, intracraneal, transdérmico, subcutáneo, intraarticular, sublingual, intrasinovial, vía insuflación, intratecal, oral, inhalación o vía tópica. La administración puede ser sistémica, por ejemplo, intravenosa, o localizada. Los nebulizadores disponibles comercialmente para formulaciones líquidas, incluidos los nebulizadores de chorro y los nebulizadores ultrasónicos, son útiles para la administración. Las formulaciones líquidas se pueden nebulizar directamente y el polvo liofilizado se puede nebulizar después de la reconstitución. Alternativamente, el anticuerpo de PTK7 o el conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco se puede aerosolizar usando una formulación de fluorocarbono y un inhalador de dosis medida, o inhalar como un polvo liofilizado y molido.
En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo anti-PTK7 o el conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco se administra a través de técnicas de liberación de sitio específico o dirigidos. Ejemplos de técnicas de administración local específicas o dirigidas al sitio incluyen varias fuentes de depósito implantables del anticuerpo anti-PTK7 o el conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco o catéteres de administración local, como catéteres de infusión, catéteres permanentes o catéteres de aguja, injertos sintéticos, envolturas adventicias, derivaciones y stents u otros dispositivos implantables, portadores específicos del sitio, inyección directa o aplicación directa. Véase, por ejemplo, la publicación internacional PCT n° WO 2000/53211 y la patente US 5.981.568.
Los anticuerpos anti-PTK7 o los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco como se describen en el presente documento se pueden administrar usando cualquier procedimiento adecuado, incluyendo mediante inyección (por ejemplo, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.). El anticuerpo anti-PTK7 o el conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 también se puede administrar por inhalación, tal como se describe en el presente documento. Generalmente, para la administración de un anticuerpo anti-PTK7 y un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7, una dosis candidata inicial puede ser de aproximadamente 2 mg/kg. Para el propósito de la presente divulgación, una dosis diaria típica podría variar desde aproximadamente cualquiera de 3 pg/kg a 30 pg/kg a 300 pg/kg a 3 mg/kg, a 30 mg/kg, a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Por ejemplo, se pueden usar dosis de aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2,5 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg y aproximadamente 25 mg/kg. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo del trastorno, el tratamiento se mantiene hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas o hasta que se alcanzan niveles terapéuticos suficientes, por ejemplo, para inhibir o retrasar el crecimiento/progresión tumoral o metástasis de células cancerosas. Un régimen de dosificación ejemplar incluye la administración de una dosis inicial de aproximadamente 2 mg/kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 1 mg/kg del anticuerpo anti-PTK7 o del conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco, o seguida de una dosis de mantenimiento de aproximadamente 1 mg/kg cada dos semanas. Otros regímenes de dosificación de ejemplo incluyen la administración de dosis crecientes (por ejemplo, dosis inicial de 1 mg/kg y aumento gradual a una o más dosis más altas cada semana o un período de tiempo más largo). También pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, dependiendo del patrón de descomposición farmacocinética que el médico desee lograr. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, se contempla la dosificación de una a cuatro veces por semana. En otros aspectos, se contempla la dosificación una vez al mes o una vez cada dos meses o cada tres meses, así como semanal, quincenal y cada tres semanas. El progreso de esta terapia puede controlarse fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. El régimen de dosificación (incluido el anticuerpo anti-PTK7 o el conjugado fármaco-anticuerpo anti-PTK7 utilizado) puede variar con el tiempo.
Para el propósito de la presente divulgación, la dosis apropiada de un anticuerpo contra PTK7 o un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 dependerá del anticuerpo contra PTK7 o del conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 (o sus composiciones) empleados, el tipo y la gravedad de los síntomas tratado, ya sea que el agente se administre con fines terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al agente, la tasa de depuración del paciente para el agente administrado y la discreción del médico tratante. El médico puede administrar un anticuerpo contra PTK7 o un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 hasta que se alcance una dosis que logre el resultado deseado y más allá. La dosis y/o la frecuencia pueden variar durante el transcurso del tratamiento, pero también pueden permanecer constantes. Consideraciones empíricas, como la vida media, generalmente contribuirán a la determinación de la dosis. Por ejemplo, los anticuerpos que son compatibles con el sistema inmunológico humano, tales como anticuerpos humanizados o anticuerpos completamente humanos, pueden usarse para prolongar la vida media del anticuerpo y para prevenir que el anticuerpo sea atacado por el sistema inmunológico del huésped. La frecuencia de administración se puede determinar y ajustar durante el curso de la terapia, y generalmente, pero no necesariamente, se basa en el tratamiento y/o supresión y/o mejora y/o retraso de los síntomas, por ejemplo, inhibición o retraso del crecimiento tumoral, etc. Alternativamente, pueden ser apropiadas las formulaciones de liberación continua sostenida de anticuerpos de PTK7 o conjugados de fármaco-anticuerpo anti-PTK7. Se conocen en la técnica diversas formulaciones y dispositivos para lograr una liberación sostenida.
En algunos aspectos de la divulgación, las dosificaciones para un anticuerpo contra PTK7 o un conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco se pueden determinar empíricamente en individuos que han recibido una o más administraciones del anticuerpo contra PTK7 o el conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco. Los individuos reciben dosis incrementales de un anticuerpo contra PTK7 o un conjugado de fármaco y anticuerpo anti-PTK7. Para evaluar la eficacia, se puede seguir un indicador del trastorno.
La administración de un anticuerpo contra PTK7 o un conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco de acuerdo con el procedimiento de la presente divulgación puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, del trastorno fisiológico del receptor, si el propósito de la administración es terapéutico o profilácticos y otros factores conocidos por los médicos expertos. La administración de un anticuerpo contra PTK7 o un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 puede ser esencialmente continua durante un período de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis espaciadas.
IV.F. Terapias combinadas
En algunos aspectos de la divulgación, los procedimientos descritos en este documento incluyen además una etapa de tratamiento de un sujeto con una forma adicional de terapia. En algunos aspectos, la forma adicional de terapia es una terapia anticáncer adicional que incluye, pero no se limita a, quimioterapia, radiación, cirugía, terapia hormonal y/o inmunoterapia adicional.
Los conjugados anticuerpo contra PTK7-fármaco se pueden administrar como un tratamiento inicial, o para el tratamiento de trastornos que no responden a terapias convencionales. Además, los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco se pueden utilizar en combinación con otras terapias (por ejemplo, escisión quirúrgica, radiación, fármacos anticáncer adicionales, etc.) para provocar de ese modo efectos terapéuticos aditivos o potenciados y/o reducir la hepatocitotoxicidad de algunos agentes anti-cáncer. Los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la invención pueden coadministrarse o coformularse con agentes adicionales, o pueden formularse para la administración consecutiva con agentes adicionales en cualquier orden.
Los agentes representativos útiles para la terapia de combinación incluyen cualquiera de los fármacos descritos en el presente documento anteriormente como útiles para la preparación de conjugados de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 bajo el subtítulo "Fármacos". Los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco de la invención también pueden usarse en combinación con otros anticuerpos terapéuticos y conjugados de anticuerpo-fármaco, incluidos anticuerpos anti-PTK7 distintos de los anticuerpos anti-PTK7 descritos, así como anticuerpos y conjugados dirigidos a un antígeno diferente. Los anticuerpos representativos, que pueden usarse solos o como un conjugado anticuerpo-fármaco, inclu­ yen anticuerpos anti-5T4 (por ejemplo, A1, A2 y A3), anticuerpos anti-CD19, anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, RITUXAN®, ZEVALIN®, b Ex XAR®), anticuerpos anti-CD22, anticuerpos anti-CD33, conjugados anticuerpo-fármaco anti-CD33 (por ejemplo, MYLOTARG®), anticuerpos anti-Lewis Y (por ejemplo, Hu3S193, Mthu3S193, anti-HER-2 antibodies (e.g., HERCEPTIN ® (trastuzumab), MDX-210, OMNITARG® (pertuzumab, rhuMAb 2C4)), anti-CD52 antibodies (e.g., CAMPATH®), anti-EGFR antibodies (e.g., ERBITUX® (cetuximab), ABX-EGF (panitumumab)), anti-VEGF antibodies (e.g., Av As TIN® (bevacizumab)), anti-DNA/histone complex antibodies (e.g., ch-TNT-1/b), anti-CEA antibodies (e.g., CEA-Cide, YMB-1003) hLM609, anti-CD47 antibodies (e.g., 6H9), anti-VEGFR2 (or kinase insert domain-containing receptor, KDR) antibodies (e.g., IMC-1C11), anti-Ep-CAM antibodies (e.g., ING-1), anti-FAP antibodies (e.g., sibrotuzumab), anti-DR4 antibodies (e.g., TRAIL-R), anti-progesterone receptor antibodies (e.g., 2C5), anti-CA19.9 antibodies (e.g., GIVAREX®) and anti-fibrin antibodies (e.g., MH-1).
Los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco descritos también pueden administrarse junto con una o más combinaciones de agentes citotóxicos como parte de un régimen de tratamiento. Las preparaciones citotóxicas útiles para este propósito incluyen CHOPP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona y procarbazina); CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona); COP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona); CAP-BOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, procarbazina, bleomicina, vincristina y prednisona); m-BACOD (metotrexato, bleomicina, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona y leucovorina; ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, leucovorina, vincristina y propolatocrona); metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, leucovorina, citarabina, bleomicina y vincristina); MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina y leucovorina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona y procarbazina); ABVD (adriamicina/doxorrubicina, bleomicina, vinblastina y dacarbazina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona y procarbazina) alternando con ABV (adriamicina/doxorrubicina, bleomicina, vinblastina); MOPP (mecloetamina, vincristina, prednisona y procarbazina) alternando con ABVD (adriamicina/doxorrubicina, bleomicina, vinblastina y dacarbazina); ChIVPP (clorambucilo, vinblastina, procarbazina, prednisona); IMVP-16 (ifosfamida, metotrexato, etopósido); MIME (metil-gag, ifosfamida, metotrexato, etopósido); DHAP (dexametasona, citaribina y cisplatino en dosis altas); ESHAP (etopósido, metilpredisolona, citarabina HD, y cisplatino); CEPP (B) (ciclofosfamida, etopósido, procarbazina, prednisona y bleomicina); CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina y prednisona); y CVP-1 (ciclofosfamida, vincristina y prednisona); DHAP (cisplatino, citarabina y dexametasona en dosis altas); CAP (ciclofosfamida, doxorrubicina, cisplatino); PV (cisplatino, vinblastina o vindesina); CE (carboplatino, etopósido); EP (etopósido, cisplatino); MVP (mitomicina, vinblastina o vindesina, cisplatino); PFL (cisplatino, 5-fluorouracilo, leucovorina); IM (ifosfamida, mitomicina); IE (ifosfamida, etopósido); IP (ifosfamida, cisplatino); MIP (mitomicina, ifosfamida, cisplatino); ICE (ifosfamida, carboplatino, etopósido); PIE (cisplatino, ifosfamida, etopósido); Viorelbina y cisplatino; Carboplatino y paclitaxel; CAV (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina); CAE (ciclofosfamida, doxorrubicina, etopósido); CAVE (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, etopósido); EP (etopósido, cisplatino); y CMCcV (ciclofosfamida, metotrexato, lomustina, vincristina).
Los conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco pueden usarse en combinación con fármacos anticancerosos sistémicos, como epitilonas (BMS-247550, Epo-906), reformulaciones de taxanos (Abraxane, Xyotax), inhibidores de microtubulina (MST-997, TTI -237), o con citotoxinas dirigidas, tales como CMD-193 y SGN-15. Agentes anticancerígenos útiles adicionales incluyen TAXOTERE®, TARCEVA®, GEMZAR® (gemcitabina), 5-FU, AVASTIN® ERBITUX®, TROVAX®, anatumomab mafenatox, letrazol, docetaxel y antraciclinas.
Para las terapias de combinación, un conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco y/o uno o más agentes terapéuticos o de diagnóstico adicionales se administran dentro de cualquier período de tiempo conveniente para la acción de la terapia o diagnóstico deseado. Por tanto, los agentes individuales pueden administrarse sustancialmente de forma simultánea (es decir, como una formulación única o en minutos u horas) o consecutivamente en cualquier orden. Por ejemplo, los tratamientos de agente único se pueden administrar dentro de aproximadamente 1 año entre sí, como en aproximadamente 10, 8, 6 , 4 o 2 meses, o en 4, 3, 2 o 1 semana(s), o en aproximadamente 5, 4, 3, 2 o 1 días. La administración de un conjugado de fármaco-anticuerpo anti-PTK7 en combinación con un segundo agente terapéutico produce preferiblemente un efecto mayor que la administración de cualquiera de los dos solos.
En algunos aspectos de la divulgación, la forma adicional de terapia incluye la administración de uno o más agentes terapéuticos, además de los anticuerpos anti-PTK7 o los conjugados anticuerpo anti-PTK7-fármaco, tal como se describe en el presente documento. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, un segundo anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF, un anticuerpo anti-HER2, un anticuerpo anti-CD25 y/o un anticuerpo anti-CD20), un inhibidor de la angiogénesis, un agente citotóxico, un agente antiinflamatorio (por ejemplo, paclitaxel, docetaxel, cisplatino, doxorrubicina, prednisona, mitomicina, progesterona, tamoxifeno o fluorouracilo).
En algunos aspectos de la divulgación, más de un anticuerpo contra PTK7 o conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco puede estar presente. Pueden estar presentes al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o más anticuerpos contra PTK7 o conjugado de anticuerpo anti-PTK7-fármaco diferentes. Generalmente, esos anticuerpos contra PTK7 o conjugados de anticuerpo anti-PTK7-fármaco pueden tener actividades complementarias que no se afecten negativamente entre sí. Por ejemplo, se pueden usar uno o más de los siguientes anticuerpos contra PTK7: un primer anticuerpo contra PTK7 dirigido a un epítopo en PTK7 y un segundo anticuerpo contra PTK7 dirigido a un epítopo diferente en PTK7.
Las terapias de combinación descritas pueden provocar un efecto terapéutico sinérgico, es decir, un efecto mayor que la suma de sus efectos individuales o resultados terapéuticos. Los resultados terapéuticos medibles se describen en este documento. Por ejemplo, un efecto terapéutico sinérgico puede ser un efecto de al menos aproximadamente dos veces mayor que el efecto terapéutico provocado por un solo agente, o la suma de los efectos terapéuticos provocados por los agentes individuales de una combinación determinada, o al menos aproximadamente cinco veces mayor, o al menos aproximadamente diez veces mayor, o al menos aproximadamente veinte veces mayor, o al menos aproximadamente cincuenta veces mayor, o al menos aproximadamente cien veces mayor. También se puede observar un efecto terapéutico sinérgico como un aumento en el efecto terapéutico de al menos un 10 % en comparación con el efecto terapéutico provocado por un solo agente, o la suma de los efectos terapéuticos provocados por los agentes individuales de una combinación determinada, o al menos el 20%, o al menos el 30%, o al menos el 40%, o al menos el 50%, o al menos el 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 100%, o más. Un efecto sinérgico también es un efecto que permite una dosificación reducida de agentes terapéuticos cuando se usan en combinación.
Como se usa en toda la divulgación detallada, el término "aproximadamente" significa un valor /- 1% del valor siguiente al término "aproximadamente", a menos que se indique lo contrario.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para fines ilustrativos solamente y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.
Ejemplo 1
Generación y humanización de anticuerpos anti-PTK7
Los anticuerpos contra PTK-7 en forma de anticuerpos murinos se produjeron de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica y como se describe en la Publicación Internacional PCT N° WO 2012/112943. Los anticuerpos murinos generados se humanizaron usando injerto de región determinante de complementariedad (CDR). Los marcos humanos para las cadenas ligeras y pesadas se seleccionaron basándose en la similitud de secuencia y estructura con respecto a los genes funcionales de la línea germinal humana. La similitud estructural se evaluó comparando la estructura de CDR canónica de ratón con candidatos humanos con las mismas estructuras canónicas que se describen en Chothia et al. (supra).
Más particularmente, los anticuerpos murinos designados aquí mu23, mu24 y mu58 descritos en la Publicación Internacional PCT No. WO 2012/112943 se humanizaron usando un procedimiento de injerto de CDR asistido por ordenador (Base de datos de Abysis, UCL Business Plc.) y técnicas de ingeniería molecular estándar para proporcionar mu23, mu24 y mu58 humanizados, en adelante hu23, hu24 y hu58, respectivamente. Las regiones marco humanas de las regiones variables se seleccionaron basándose en su homología de secuencia más alta con la secuencia marco del ratón y su estructura canónica. Para los propósitos del análisis, la asignación de aminoácidos a cada uno de los dominios CDR fue de acuerdo con la numeración de Kabat et al. Se prepararon varias variantes de anticuerpos humanizados para generar el anticuerpo humanizado óptimo con los anticuerpos humanizados reteniendo generalmente las regiones determinantes de complementariedad de unión a antígeno (CDR) del hibridoma de ratón en asociación con regiones marco humanas. Los mAb hu23, hu24 y hu58 se unieron al antígeno contra PTK7 humano con una afinidad similar a sus homólogos murinos según se midió utilizando el sistema BIACORE®.
Los procedimientos de modificación molecular se llevaron a cabo usando técnicas reconocidas en la técnica. El ARNm total se extrajo de los hibridomas de acuerdo con el protocolo del fabricante (TRIZOL® Plus RNA Purification System, Life Technologies). Se usó un cebador de secuencia líder 5' específico de secuencia, diseñado para amplificar cada hibridoma, en combinación con Cylprimer humano 3' para amplificar y clonar las regiones variables de cada anticuerpo humanizado. De manera similar, se usó una secuencia líder 5'Vk diseñada específicamente para amplificar cada una de las regiones Vk combinadas con un cebador inverso único específico para la región constante kappa humana para amplificar y clonar la cadena ligera kappa. Los fragmentos amplificados se clonaron como cadenas gamma1/kappa humanas quiméricas y sirvieron como referencia para cada mAb humanizado.
A partir de la información de la secuencia de nucleótidos, se obtuvieron datos con respecto a segmentos de genes V, D y J de la cadena pesada y cadenas ligeras de anticuerpos murinos mu23, mu24, y mu58. Basándose en los datos de la secuencia, se diseñaron nuevos conjuntos de cebadores específicos para la secuencia líder de la cadena VH y Vk de Ig de los anticuerpos para la clonación del anticuerpo monoclonal recombinante. Posteriormente, las secuencias V-(D)-J se alinearon con las secuencias de la línea germinal de Ig de ratón.
Los genes de cadena pesada de mu23 fueron identificados como VH3609 (V), DSP2.3 (D) y JH3. Los genes de cadena pesada de mu24 se identificaron como VHJ558 (V), DSP2.7 (D) y JH4. Los genes de la cadena pesada de mu58 se identificaron como IGHV 4-1 (V), DFL 16.1 (D) y JH4. Las tres cadenas ligeras eran de clase k. Se identificaron genes de cadena ligera como IGKVI4-111 y JK5 para mu23, IGKV3-5 y JK1 para mu24, y secuencia de la línea germinal IGKV17-121 y JK4 para mu58. Estos resultados se resumen en la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2
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Las secuencias de cadena pesada y ligera obtenidas de los tres clones se alinearon con las secuencias de región variable humana funcionales y se revisó la homología y la estructura canónica. Los resultados del análisis de la cadena pesada y ligera humanizada se muestran a continuación en las Tablas 3 y 4, respectivamente, para los anticuerpos anti-PTK7 humanizados hu23, hu24 y hu58.
Tabla 3
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Tabla 4
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Las secuencias de aminoácidos y secuencia de ácido nucleico asociada de hu23, hu24 y hu58 se muestran anteriormente en la Tabla 1 anterior. Las secuencias de aminoácidos de la región VH para hu23, hu24 y hu58 se muestran en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 49, respectivamente, con las correspondientes secuencias de ácido nucleico establecidas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 50, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la región kappa VL de hu23, hu24 y hu58 se muestra en SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 63, respectivamente, con las correspondientes secuencias de ácido nucleico establecidas en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 64, respectivamente.
Tal como se demuestra en los Ejemplos a continuación, cada uno de los anticuerpos humanizados mencionados anteriormente funciona como un conjugado anticuerpo anti-PTK7-fármaco eficaz de acuerdo con las enseñanzas del presente documento.
Ejemplo 2
Expresión de anticuerpos humanizados
Los anticuerpos anti-PTK7 hu23, hu24, y hu58 se expresaron y aislaron usando técnicas reconocidas en el sector y como se describe en la Publicación Internacional PCT N° WO 2012/112943. Se clonaron fragmentos de ADN variable humanizado sintético (Integrated DNA Technologies) de las cadenas pesadas en vectores de expresión de IgG1 humana. Los fragmentos de cadena ligera variable se clonaron en vectores de expresión C-kappa humanos. Cada anticuerpo se expresó mediante cotransfección de las cadenas pesada y ligera correspondientes en células CHO.
Más particularmente, para la producción de anticuerpos, se llevó a cabo la clonación direccional de los productos de PCR del gen variable humanizado en vectores de expresión de inmunoglobulina humana. Todos los cebadores utilizados en las PCR específicas de genes de Ig incluyeron sitios de restricción, Agel y Xhol para IgH, Xmal y Dralll para Igk, que permitieron la clonación directa en vectores de expresión que contienen las regiones constantes de IgG 1 e Igk humana, respectivamente. En resumen, los productos de PCR se purificaron con el kit de purificación de PCR Qiaquick (Qiagen, Inc.) seguido de digestión con Agel y Xhol (IgH), Xmal y Dralll (Igk), respectivamente. Los productos de PCR digeridos se purificaron antes de la ligación en vectores de expresión. Las reacciones de ligación se realizaron en un volumen total de 10 |jl con 200 U de T4-ADN ligasa (New England Biolabs), 7,5 |jl de producto de PCR específico del gen digerido y purificado y 25 ng de ADN de vector linealizado. Se transformaron bacterias E. coli DHI0B competentes (Life Technologies) mediante choque térmico a 42 °C con 3 j l de producto de ligación y se sembraron en placas de ampicilina (100 jg/ml). El fragmento Agel-EcoRI de la región VH se insertó en los mismos sitios del vector de expresión pEE6.4HulgG1 (Lonza AG) mientras que el inserto sintético Xmal-Dralll Vk se clonó en los sitios Xmal-Dralll del respectivo vector de expresión pEE12.4Hu-Kappa.
Las células que producen anticuerpos humanizados se generaron mediante transfección de células HEK 293 con los plásmidos apropiados utilizando 293fectin. El ADN plasmídico se purificó con columnas QIAprep Spin (Qiagen). Se cultivaron células de riñón embrionario humano (HEK) 293T (ATCC No CRL-11268) en placas de 150 mm (Falcon, Becton Dickinson) en condiciones estándar en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con FCS inactivado por calor al 10%, 100 jglm l de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina G (todos de Life Technologies).
Para las transfecciones transitorias, las células se cultivaron hasta un 80% de confluencia. Se añadieron cantidades iguales de IgH y el correspondiente ADN vector de la cadena de IgL (12,5 jg de cada ADN vector) a 1,5 ml de OptiMEM mezclado con 50 j l de reactivo de transfección HEK 293 en 1,5 ml de opti-MEM. La mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente y se distribuyó uniformemente en la placa de cultivo. Los sobrenadantes se recolectaron tres días después de la transfección, se reemplazaron por 20 ml de DMEM fresco suplementado con FBS al 10% y se recolectaron nuevamente el día 6 después de la transfección. Los sobrenadantes del cultivo se eliminaron de los restos celulares mediante centrifugación a 800 xg durante 10 minutos y se almacenaron a 4 °C. Los anticuerpos recombinantes quiméricos y humanizados se purificaron con perlas de proteína G (GE Healthcare). Se requirió una purificación adicional de hu23 y hu24 mediante cromatografía de intercambio iónico para lograr una bioconjugación reproducible consistente a vc0101 y mc8261. Sin la etapa de purificación adicional, la eficacia de la reducción de tiol y, por tanto, la relación fármaco ADC-anticuerpo (DAR) resultante, descrita en el Ejemplo 10, fluctuaron de forma espectacular e impredecible. No se anticipó la necesidad de purificación adicional, pero se determinó empíricamente.
Ejemplo 3
Caracterización de la unión a hu24
Se determinó una comparación de mAb de locn 24 quiméricos y humanizados mediante SPR usando un Biacore ™ 2000 (GE Healthcare). Se usó un kit de captura de anticuerpos antihumanos para inmovilizar mAb de captura en un chip biosensor CM5. Antes de cada ciclo de inyección de antígeno, se capturó mAb humanizado a una concentración de 2 jg/m l en la superficie con un tiempo de contacto de 2 minutos y un caudal de 5 jl/minuto. La carga de mAb capturada desde la línea de base fue constante a 80-120 unidades de respuesta. Después de la captura del artículo de prueba y la línea de base de 1 minuto, la proteína PTK7 humana monomérica se hizo fluir sobre la superficie a concentraciones de 50, 25 y 12,5 nM durante una fase de asociación de 2 minutos seguida de una fase de disociación de 2 minutos a una velocidad de flujo de 5 jl/minuto. Después de cada ciclo, la superficie de captura antihumana se regeneró con 30 segundos de tiempo de contacto de MgCh 3 M a 10 jl/minuto.
Los datos de Biacore ™ se procesaron restando inicialmente una superficie de IgG de control de la superficie de unión de mAb específica. A continuación, los datos de respuesta se truncaron a la fase de asociación y disociación. Las curvas de respuesta resultantes con tres concentraciones de antígeno diferentes se utilizaron para ajustar un modelo de unión de Langmuir 1:1 y para generar una afinidad aparente mediante las constantes cinéticas Kon y K f calculadas, con la constante de disociación de equilibrio definida como Kd = Koff/Kon. Todos los pasos del análisis de datos se completaron en BiaEvaluation Software 3.1 (GE Healthcare).
La afinidad calculada y constantes cinéticas se determinaron para estar dentro de 2 veces entre los mAbs quiméricos y humanizados (Tabla 5).
T l . n n fini mA l n 24 im ri h m niz r PTK7 h m n
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Con el fin de determinar el epítopo reconocido por mAb hu24, se evaluó su unión a diversas variantes del ectodominio de PTK7. El ectodominio de PTK7 se compone de 7 dominios de Ig y las variantes se diseñaron para incluir dos o más dominios de Ig contiguos. Las variantes se expresaron como proteínas de fusión Fc y la unión a hu24 se determinó mediante ELISA.
Los constructos fueron diseñados con cebadores que amplificaban diversos dominios Ig de PTK7 Ig contiguos como se predijo por homología estructural. Las secuencias resultantes se fusionaron en marco con y dirección 5' del dominio Fc de inmunoglobulina humana G2 (IgG2) usando técnicas estándar de biología molecular. Las proteínas de fusión Fc se transfectaron en células de mamífero y los sobrenadantes se recogieron 72 horas después. El mAb hu24 anti-PTK7 se ensayó mediante ELISA para determinar su capacidad para unirse a las variantes de la proteína PTK7 con dominios Ig definidos.
Los resultados muestran que los dominios Ig 1-4 son necesarios para la unión de hu24 a PTK7 (Tabla 6 ) e implican que el mAb reconoce características estructurales terciarias de PTK7.
Tabla 6. Unión de mAb hu24 a dominios de PTK7
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Se realizaron experimentos para caracterizar las propiedades de unión celular de mAb hu24 anti-PTK7. Para confirmar la especificidad del antígeno, se evaluó la unión en líneas celulares con expresión de PTK7 sustancial o insignificante según se determina mediante inmunotransferencia.
Los extractos de células completas se resolvieron mediante electroforesis en gel y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se incubó con hu6M024 en solución salina tamponada con Tris con 0,1% de Tween-20 (TBST)) con leche desnatada al 5% peso/volumen, a continuación, se lavó con TBST, se incubó con anticuerpo anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Santa Cruz Biotechnology No sc-2453) y se lavó ampliamente antes de la exposición a un sustrato quimioluminiscente.
La inmunotransferencia indicó una expresión sustancial de PTK7 en las líneas celulares BxPC3 y MDAMB436 y una expresión insignificante de PTK7 en la línea celular ASPC1 (Figura 2A). Los resultados de unión celular basados en citometría de flujo con hu24 fueron totalmente consistentes con los datos de inmunotransferencia (Figura 2B) que demostraron la especificidad antigénica de hu24.
Se llevaron a cabo experimentos de citometría de flujo adicionales para evaluar la unión de mAb hu24 a líneas de células cancerosas con expresión endógena de PTK7. Brevemente, las células adherentes se disociaron con TrypLE ™ Express (Gibco® n° 12604-021) que a continuación se neutralizaron con medio de cultivo. Las células en suspensión se recogieron mediante centrifugación. Las células se resuspendieron en tampón de tinción (PBS con 3% de BSA) con la concentración establecida de mAb y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Las células se lavaron en tampón de tinción, se resuspendieron en tampón de tinción con anticuerpo antihumano marcado con ficoeritrina (PE) (Jackson ImmunoResearch n° 109-115-098) y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Las células se lavaron, se resuspendieron en tampón de tinción con tinción de viabilidad 7-AAD (BD Biosciences, Pharmingen n° 51-68981E) y se analizaron mediante citometría de flujo con un BD FACSCalibur ™. La intensidad de fluorescencia media (MFI) en el canal PE de la población de células viables se determinó para cada muestra.
El mAb hu24 mAb exhibió la unión a diversas líneas celulares de cáncer a la concentración más baja ensayada (0,1 |ig/ml). Por el contrario, el anticuerpo de control no mostró una unión apreciable a la concentración más alta probada (10 Mg/ml) (Tabla 7).
Tabla 7. Pro iedades de unión de mAb hu24 a líneas celulares cancerosas
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Ejemplo 4
Expresión de PTK7 en varias líneas celulares cancerosas
Los anticuerpos anti-PTK7 hu23 y hu24 exhibieron una unión específica a líneas de células cancerosas cultivadas que se establecieron a partir de una amplia gama de tipos de tumores, incluidas indicaciones sólidas y hematológicas, véase la Tabla 8 a continuación. Las células adherentes se disociaron usando TrypLE Express (GIBCO), se neutralizaron con medio de cultivo celular y se contaron. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos con fondo en U con 5 x 105 células/100 Ml de medio/pocillo. La placa se centrifugó a 300 xg, durante 5 minutos a 4°C para sedimentar las células y se desechó el sobrenadante. Cada sedimento se resuspendió en 10 Mg/ml de hu23, hu24 o anticuerpo de control sin unión en BSA al 3% en PBS, y la placa se incubó en hielo durante 30 minutos. La placa se centrifugó y los sedimentos celulares se lavaron en 200 Ml de BSA al 3% enfriada con hielo en PBS. Cada sedimento celular se resuspendió en 100 Ml de fragmento Fc de IgG antihumano de cabra conjugado con R-ficoeritrina (PE) que se había diluido 1:50 en BSA al 3% en PBS, y la placa se incubó en hielo durante 30 minutos. La placa se centrifugó y los sedimentos celulares se lavaron en 200 Ml de BSA al 3% en PBS a 4°C. Cada sedimento se resuspendió en 100 Ml de BSA al 3% en PBS y se transfirió a un tubo de policarbonato de 5 ml que contenía 250 Ml de BSA al 3% en PBS. Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo usando 5 Ml de solución de tinción de 7-aminoactinomicina D (7-AAD) por muestra como tinción de viabilidad. Las células no viables se excluyeron del análisis.
Los datos de la Tabla 8 muestran intensidades fluorescentes medias (MFI) de unión de anticuerpo a líneas celulares de cáncer por citometría de flujo. La unión celular con los anticuerpos humanizados hu23 y hu24 indica la expresión de PTK7 en numerosas líneas celulares. La expresión de PTK7 es prominente en varias líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), colon, mama, páncreas y cáncer eritroleucémico. Se usó un anticuerpo de control negativo que no se une a PTK7 para la comparación.
Tabla 8
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Los datos de “microarray” mostrados en la Tabla 9 para 29 líneas tumorales PDX se generó usando matrices Agilent SurePrint GE 8x60 v2 usando ARN total aislado de células tumorales PDX. El procesamiento de los datos de “microarrays” sin procesar recopilados con un solo color incluyó la sustracción de fondo y la normalización de cuantiles. Los datos normalizados se transformaron en base logarítmica 2, lo que generó valores de expresión génica para su uso en análisis posteriores. Estos datos reflejan la cantidad relativa de expresión de PTK7 asociada con la línea celular PDX indicada. BR=Mama, LU=Pulmón, OV=Ovario, SK=Melanoma, CR=Colorrectal, LIV=Hígado.
Tabla 9
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La expresión de PTK7 también se evaluó mediante inmunohistoquímica en siete modelos de PDX en ratones inmunocomprometidos: cuatro PDX de cáncer de mama triple negativo (BR13, BR22, BR31 y BR5); un PDX de cáncer de mama de receptor de progesterona positivo (PR+) (Br 36); y dos p Dx NSCLC (NSCLC135 y NSCLC176).
Brevemente, un fragmento de tejido de cada xenoinjerto se fijó con formalina, se procesó y se embebió en parafina (FFPE) usando procedimientos histológicos estándar. Se cortaron secciones de cinco micrómetros en portaobjetos cargados, se secaron, se desparafinaron en xileno y se rehidrataron con alcoholes graduados hasta agua destilada. La recuperación del epítopo inducida por calor se realizó en Borg Decloaker (Biocare Medical) usando una olla a presión Retriever 2100 (Electron Microscopy Sciences) y se enfrió a temperatura ambiente (TA) durante 20 minutos (min). La peroxidasa endógena se inactivó con Peroxidazed 1 (Biocare Medical) durante 10 min a TA. Las interacciones de proteínas no específicas se bloquearon con Background Punisher (Biocare Medical) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones de tejido se incubaron con anticuerpo primario a 0,5 pg/ml durante 1 hora a TA. Los anticuerpos primarios fueron mAb inmunoglobulina G (IgG) clon anti-PTK7 de conejo (Stem CentRx™ Inc) o control de isotipo de conejo (DA1E) XP® (Cell Signaling Technologies n° 3900). La unión del anticuerpo primario se detectó con SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (Cell Signaling Technologies n° 8114) durante 30 min a TA. La tinción se reveló con DAB (3',3'-Diaminobencidina; DAKO) durante 5 min a TA. Los portaobjetos se contratiñeron brevemente en hematoxilina CAT (Biocare Medical), se lavaron en agua, se deshidrataron en alcoholes graduados, se aclararon en xileno y se cubrieron con un cubreobjetos con medio de montaje Permount ™ (Fisher Chemicals).
PTK7 se observó en la membrana plasmática en todos los modelos PDX (Fig. 3).
Ejemplo 5
Expresión de PTK7 en diversos tejidos tumorales
La expresión de ARNm de PTK7 se determinó en tumores humanos primarios. Brevemente, el tumor congelado y los tejidos normales se fragmentaron y el ARNm se aisló con el kit Qiagen RNeasy Mini (Qiagen, cat # 74106). La cuantificación del ARN y la evaluación de la calidad se realizaron utilizando el ensayo LabChip microfluídico HT RNA y el instrumento de electroforesis capilar microfluídica LabChip GX (Perkin Elmer). El ARN de cada una de las muestras se diluyó de manera que la cantidad cayera dentro del intervalo lineal del instrumento (25 - 250 ng/pl). Las muestras de ARN aisladas se sometieron a transcripción inversa a ADNc usando el kit de ARN a ADNc de alta capacidad de Life Technologies (n° de cat. 4387406) siguiendo un protocolo descrito en las instrucciones del fabricante. La reacción qRT-PCR se realizó utilizando el análisis de expresión génica basado en sonda TaqMan y los sistemas de PCR en tiempo real ABI ViiA7 (Life Technologies). El gen diana y los controles endógenos se ejecutaron por cuadruplicado para cada conjunto de sondas en tarjetas de matriz de baja densidad TaqMan prefabricadas. Se utilizó el software ExpressionSuite v1.0.3 (Life Technologies) para generar valores de umbral automatizados para la amplificación de la señal para la mayoría de las muestras. Rara vez se ajustaron manualmente los umbrales automáticos. Los gráficos de amplificación que dieron como resultado valores de Ct > 35 se descartaron, al igual que los gráficos que generaron un valor de Ct pero no mostraron una tendencia de amplificación logarítmica. Todos los valores de Ct se exportaron desde el software ExpressionSuite y los cálculos de cuantificación relativa se realizaron en Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corporation, Inc).
Las figuras 4A-C muestran los niveles de ARNm de PTK7 en (A) mama, (B) NSLC y (C) cánceres de ovario. La cuantificación de la expresión de PTK7 se evaluó utilizando el procedimiento de diferencia de veces relativa (RQ) o el procedimiento Ct comparativo. El procedimiento (2-ññCt) utilizando la ecuación RQ = 2 'ññCt. Los datos de RQ representan la expresión de PTK7 en diferencia de veces con respecto a las muestras de ARN de control. Para las muestras de carcinoma de mama, se usó una muestra de ARN de mama normal comprada en BioChain (Newark, CA, n° de cat. R1234086-50, n° de lote B610189, mujer de 75 años) para generar datos de RQ. Para el cáncer de pulmón, los datos de RQ presentados representan diferencias de veces en la expresión de PTK7 en relación con el ARN de pulmón normal adquirido de Life Technologies (n° de cat. AM7968, lote n° 1308017, mujer de 80 años). Para las muestras de carcinoma de ovario, los datos de RQ presentados representan diferencias de veces en la expresión de PTK7 en relación con el ARN aislado de tejido de ovario normal (ID de tejido # 0204C011C) proporcionado por la Clínica Cleveland (Cleveland, OH). Los valores de RQ para todos los tumores también se calcularon en relación con un grupo de ARN de tejidos humanos normales (BioChain, cat # R4234565, lot # B611043), sí como con un grupo de ARN de referencia humano universal (Agilent, cat # 740000), que está comprendido de ARN a partes iguales de 10 líneas celulares de cáncer únicas.
Los tumores de mama, NSCLC y ováricos mostraron un aumento de la expresión de ARNm de PTK7 en comparación con el tejido normal correspondiente (Figuras 4A-C). La sobreexpresión en el TNBC fue más notable, mientras que la sobreexpresión en los tumores de ovario fue modesta.
La figura 5 muestra una correlación entre una mayor expresión de ARNm de PTK7 y una peor supervivencia global en pacientes con NSCLC. Para determinar si la expresión de PTK7 está asociada con el criterio de valoración de supervivencia en el cáncer de pulmón, se aplicó el análisis de Kaplan-Meier al conjunto de datos bioinformáticos con software gratuito http://kmplot.com/analysis (Gyorffy et al., 2013, PloS One. 18; 8 (l2): e82241). Se trazaron los niveles de ARNm de PTK7 y los datos de supervivencia del paciente para 719 pacientes con adenocarcinoma con NSCLC utilizando el mejor valor de corte de selección automática de la herramienta. La expresión alta de PTK7 se asoció con una supervivencia más corta (índice de riesgo HR = 4,06, intervalo logarítmico 1,1E-16).
La expresión de la proteína PTK7 se observó en el cáncer de esófago. Se utilizó una micromatriz de tejido (ES1502 de US Biomax) para inmunohistoquímica. Brevemente, se cortaron secciones de bloques tumorales incluidos en parafina fijados con formalina a 5 micrómetros y se hornearon sobre portaobjetos de vidrio. Los portaobjetos se aclararon en xileno y se rehidrataron en lavados con alcohol graduado que terminaron en agua desionizada. Los portaobjetos se recuperaron en tampón HIER de citrato de pH 6 en el Retriever 2100 (microscopía electrónica). Se aplicó una solución de bloque de peróxido de hidrógeno peroxidada (Biocare Medical) a los portaobjetos durante 10 min. Los portaobjetos se lavaron con TBST 2x, seguido de Background Punisher, un bloque de proteínas (Biocare Medical) durante 10 min. El anticuerpo primario, H.235 (número de lote: 110325MM, concentración madre: 12,7 mg/ml) se aplicó durante 60 min a una concentración de 2 ug/ml. Después de lavar con TBST (2x), el anticuerpo secundario, DAKO anti-ratón Envision+, se aplicó durante 30 min. Después de lavar de nuevo con TBST (2x), los portaobjetos se revelaron con Betazoid DAB (Biocare Medical) durante 5 min. A continuación, los portaobjetos se contratiñeron en hematoxilina CAT (Biocare Medical) durante 30 segundos y se cubrieron con un cubreobjetos.
Cuarenta de 70 muestras de tumor dieron un resultado positivo para la expresión de PTK7 en la membrana celular. De las 40 muestras que fueron positivas para PTK7, 1 exhibió una expresión alta, 11 exhibieron una expresión moderada y 28 exhibieron una expresión baja.
Se observó expresión de la proteína PTK7 en cáncer de próstata. Se usó una micromatriz de tejido (BC19013 de Biomax) para inmunohistoquímica, tal como se describió anteriormente para el cáncer de esófago. Once de las 26 muestras de tumor obtuvieron resultados positivos para la expresión de PTK7. De las 11 muestras que fueron positivas para PTK7, 2 exhibieron una expresión moderada y 9 exhibieron una expresión baja.
Ejemplo 6
Medición de la proteína PTK7 en suero
Los informes en la literatura han caracterizado la escisión de PTK7 en la membrana plasmática que resulta en la difusión de parte del dominio extracelular (Golubkov et al, 2010, J Biol Chem 285 (46):. 35740-9; Golubkov et al., 2012, J Biol Chem 287 (50): 42009-18; Na et al., 2012, J Biol Chem 287 (30): 25001-9). El antígeno circulante podría afectar la farmacocinética de compuestos terapéuticos, tales como un ADC de PTK7. Se evaluaron los niveles circulantes de PTK7 difundida de diversas fuentes de suero. Los niveles de proteína PTK7 se midieron con un ensayo cuantitativo utilizando la plataforma Meso Scale Discovery (MSD®).
Se adquirieron muestras de suero de seres humanos sanos del Banco de Sangre de la Universidad de Stanford. Se adquirieron muestras de suero de pacientes con cáncer de Asterand Inc y Bioreclamation Inc. Las muestras de suero de mono cynomolgus se adquirieron de Bioreclamation Inc.
Se obtuvieron muestras de suero de ratón de ratones inmuno-comprometidos que albergaba xenoinjertos de tumores humanos. Se compraron ratones hembra no obesos diabéticos con inmunodeficiencia combinada severa (NOD-scid) de Harlan Laboratories® y se alojaron de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC). Los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) se establecieron mediante la implantación directa de muestras de tumores humanos recién resecados y se propagaron mediante el paso de xenoinjertos en animales sin tratamiento previo. Los xenoinjertos se obtuvieron de muestras de resección de tumores primarios que se obtuvieron de sitios clínicos después de la aprobación de la Junta de Revisión Institucional para la Protección de Sujetos Humanos y de acuerdo con las regulaciones de la Ley de Responsabilidad y Portabilidad de Seguros de Salud (HIPAA).
El ensayo para medir los niveles de la proteína PTK7 utilizó dos anticuerpos monoclonales (mAb) anti-PTK7 específicos que se habían generado mediante tecnología de hibridomas. Los mAb se unen a la PTK7 humana y de mono cynomolgus, pero no a la PTK7 murina. El ensayo se desarrolló en la plataforma MSD® y se optimizó para una respuesta lineal. Se revistió una placa de alta unión MSD® con mAb H2.35 específico de PTK7 a 1 pg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La placa se incubó a 4 ° C durante la noche. Al día siguiente, se lavó la placa y se añadió el segundo mAb. Para muestras de humanos y monos, se añadieron 25 pl de mAb 6M38 específico de PTK7 sulfoetiquetado a 0,5 pg/ml en diluyente 2 de MSD® (MSD # R51 BB-4), y para muestras de ratones con tumores, se añadió 6M38 biotinilado en 0,5 pg/ml en MSD® Diluent 2 (MSD # R51 BB-4) seguido de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. La placa se incubó con agitación durante 30 minutos. Después de la incubación, sin lavar, se añadieron a los pocillos muestras de suero o cantidades variables de proteína PTK7 recombinante y se incubaron durante 2 horas en un agitador de placas. Las muestras de suero se diluyeron 4x al 25% final en m Sd® Diluent 2. Las placas se lavaron 3 veces con solución salina tamponada con fosfato con Tween-20 al 0,2%. Se añadió tampón de lectura MSD® 1x (MSD # R92TC-3) a las placas (150 pl por pocillo), y las placas se leyeron en el MSD® Sector Imager. Los valores de las muestras de suero se interpolaron a partir de la curva estándar basada en la proteína recombinante.
Se midieron los niveles de proteína PTK7 en suero humano en muestras de humanos sanos y pacientes con cáncer que representaban 8 tipos de tumores. Los resultados se resumen en la Tabla 10. El valor indicado en cada categoría indica la media de todas las muestras individuales. El valor medio de PTK7 en suero de seres humanos sanos fue de 12,4 ± 3,3 ng/ml. En general, los valores medios para los pacientes con cáncer fueron ligeramente superiores, variando hasta 24,6 ± 3,8 ng/ml y con una distribución más amplia de valores individuales (Figura 6 ).
T l 1 . Niv l r ín PTK7 n r h m n
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Los niveles de proteína PTK7 en el suero de mono cynomolgus sin tratar se midieron en muestras de 29 animales. El valor medio fue de 35,8 ± 13,4 ng/ml (Tabla 11), que es más alto que los valores correspondientes para humanos sanos y pacientes con cáncer.
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Se obtuvieron muestras de suero de ratón de ratones inmunocomprometidos que albergaba xenoinjertos de tumores humanos. Específicamente, los xenoinjertos eran PDX que típicamente conservan la arquitectura y el genotipo de los tumores humanos de los que se derivan (DeRose et al, 2011, Nat Med 17 (11): 1514-20). Los valores medios de la proteína PTK7 en suero para los 11 tipos de tumores fueron <1 ng/ml para todos los tipos de tumores (Tabla 12) y, por lo tanto, significativamente más bajos que los valores obtenidos para humanos y monos. Dado que los mAb usados en el ensayo no reaccionan de forma cruzada con la PTK7 murina, los valores se interpretan como proteína PTK7 humana que se desprendió de los xenoinjertos tumorales y no de tejidos murinos normales.
T l 12. Niv l r ín PTK7 n r r n r r m r
Figure imgf000061_0001
Ejemplo 7
Internalización
La internalización del anticuerpo es una característica crítica para la liberación de ADC para la citotoxicidad en células que expresan PTK7. Se observó que el anticuerpo anti-PTK7 hu24 se internalizaba en células cancerosas, lo que sugiere que el anticuerpo es un vehículo adecuado para administrar una toxina en las células. Las células adherentes se disociaron usando TrypLE Express (Gibco), se neutralizaron con medio de cultivo celular y a continuación se contaron. Las células se dividieron en alícuotas en una placa de 96 pocillos con fondo en U con 5 x 105 células/100 |jl de medio por pocillo. La placa se centrifugó a 300 xg, durante 5 minutos a 4°C para sedimentar las células y se aspiraron los sobrenadantes. Todos los reactivos se mantuvieron en hielo durante los siguientes pasos.
Cada sedimento celular se resuspendió en 3 jg/m l de hu24 o anticuerpo no ligante (IgG humana, Thermo Scientific) en 100 j l de BSA al 3% en PBS. La placa se incubó en hielo durante 30 minutos y a continuación se centrifugó y los sedimentos celulares se lavaron en 200 j l de BSA al 3% en PBS. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 |il de medio de cultivo celular precalentado a 37°C y se colocaron en una incubadora a 37°C durante 1 o 4 horas. Los sedimentos celulares a incubar a 4 ° C se resuspendieron de manera similar y a continuación se colocaron en hielo. Después de las incubaciones, las muestras se centrifugaron, los sobrenadantes se aspiraron y lavaron con 200 jL/pocillo de BSA al 3% helada en PBS y se resuspendieron en 100 jL/pocillo de BSA al 3% helada en PBS y se colocaron en hielo. A continuación, se centrifugaron todas las muestras, se aspiraron los sobrenadantes, cada sedimento celular se resuspendió en 100 j l de fragmento Fc anti-IgG humana conjugado con aloficocianina (APC) que se había diluido 1:50 en BSA al 3% helada en PBS. La placa se incubó en hielo durante 30 minutos y, a continuación, se centrifugó, y los sedimentos celulares se lavaron en 200 jL de BSA al 3% en PBS, se resuspendieron en 100 jL de BSA al 3% en PBS y se transfirieron a un tubo de policarbonato de 5 ml que contenía 250 jL de 3 % BSA en PBS. Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo usando 5 jL de 7-AAD por muestra como tinción de viabilidad. Se midió la intensidad fluorescente media (MFI) para cada muestra con las células no viables excluidas del análisis. El valor del "% internalizado" se calculó como (100% - [MFI después de la incubación/MFI antes de la incubación]). Los resultados de la Tabla 13 indican que el anticuerpo hu24 se internalizó en todas las líneas celulares probadas, y que la internalización era dependiente de la temperatura, reflejando así una internalización activa (no pasiva) por la célula.
Tabla 13
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Ejemplo 8
Citotoxicidad mediada por fragmento Fab antihumano conjugado con saporina
Se realizó un ensayo de citotoxicidad en vitro para determinar si el anticuerpo hu23 o hu24 puede mediar en la administración de un agente citotóxico a las líneas celulares. A este respecto, el fragmento Fab de IgG antihumano unido covalentemente a la toxina saporina (Advanced Targeting Systems) se combinó con Ab hu23, hu24 u 8.84 sin marcar (anticuerpo de control negativo no de unión) y a continuación se incubó con células durante 4 días (células H446 y DMS114 que expresan PTK7) o 7 días (células que expresan OE19, que no expresan PTK7; células que expresan OE21 PTK7) después de lo cual se midió la viabilidad celular.
En un experimento, las líneas celulares de cáncer H446 o DMS114 se sembraron en una placa de cultivo de tejidos de fondo plano claro a 9600 células por pocillo (H446) o 6400 células por pocillo (DMS114) en 100 |il de medio de cultivo celular. Las células se incubaron durante la noche a 37 °C en un incubador de CO2 al 5%. Al día siguiente, se añadieron 50 |jl de hu23, hu24 o 8.84 Ab premezclado con Fab anti-IgG humano conjugado con saporina (Fab-ZAP; Advanced Targeting Systems) en una proporción molar de 1:2 a las células en una curva de concentración de 10 puntos con muestras por triplicado comenzando con 1 jg/m l con diluciones 1:3 en medio de cultivo celular. La placa se incubó en una incubadora a 37 °C, 5 % CO2 durante 4 días. Para medir la viabilidad celular, se usó el ensayo MTS (Ensayo de proliferación celular no radiactiva acuosa de título 96 de células Promega) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se añadieron 30 j l del reactivo MTS combinado a cada pocillo. La placa se incubó en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 durante 2 horas. La densidad óptica (DO) se determinó a 490 nm con un lector de placas de 96 pocillos. La lectura promedio de los pocillos con medio solo se restó de las lecturas de los pocillos con células para controlar la DO de base. Los datos se sometieron a análisis de regresión logística no lineal (GraphPad Prism Software) para determinar la concentración de anticuerpo primario a la que se inhibió la viabilidad celular en un 50% (IC50).
Los datos en la Tabla 14 indican que los anticuerpos hu23 y hu24 anti-PTK7 confirieron citotoxicidad mediada por saporina contra las células H446 y DMS114, mientras que el anticuerpo de control negativo 8.84 no lo hizo. Los resultados demuestran que la actividad de hu23 y hu24 era específica para las células que expresan PTK7.
Tabla 14
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En otro experimento, el ensayo de saporina se realizó en dos líneas celulares derivadas de cánceres de esófago, OE19 y OE21 (Sigma Aldrich). Para determinar la expresión de PTK7 en las líneas celulares, se cultivaron las células y se aislaron suspensiones de células individuales usando Versene (Invitrogen). Las células se lavaron en PBS/FCS al 2% y se incubaron con anticuerpo hu24 o HulgG1 (control de isotipo) a una concentración de 5 jg/m l durante 30 minutos. Las células se lavaron de nuevo en PBS/FCS al 2%, a continuación, se incubaron a 1:200 con Alexa Fluor647 antihumana (Jackson Immunoresearch) durante 20 minutos. Las células se lavaron de nuevo, se resuspendieron en DAPI y a continuación se analizaron en un BD FACSCanto para determinar el cambio en la intensidad de fluorescencia media (AMFI). Las células OE19 no mostraron fluroescencia por tinción por encima del isotipo de control (AMFI = 0), mientras que las células OE21 mostraron un incremento logarítmico de casi dos veces en la intensidad de flureoscencia (AMFI = 5976), lo que indicó la expresión de PTK7 en la superficie de OE21, un carcinoma de células escamosas de esófago.
Para determinar si hu24 puede mediar en la administración de agentes citotóxicos, se sembraron 2500 células/pocillo de una suspensión de células individuales disociadas de OE21 u OE19 en placas de cultivo de tejidos BD (BD Biosciences) en medio de cultivo. Un día después de la siembra en placa, se añadieron a los cultivos diversas concentraciones de hu24 purificado y una concentración fija de fragmento Fab anti-HulgG 4 nM unido covalentemente a saporina (Advanced Targeting Systems). Después de una incubación de 7 días, se enumeraron los números de células viables usando CELL TITEr GLO® (Promega) según las instrucciones del fabricante. Los recuentos de luminiscencia en bruto utilizando cultivos que contienen células con el fragmento Fab de saporina se establecieron como valores de referencia del 100% y todos los demás recuentos se calcularon en consecuencia (denominados "RLU normalizados"). Utilizando este ensayo se demostró que la citotoxicidad mediada por hu24 contra células OE21, pero no células OE19, y el isotipo de control no afectó al recuento celular, tal como se muestra en la tabla 15. Estos resultados indican que la unión celular del anticuerpo hu24 es requerida para producir la citotoxicidad mediada por saporina a la célula que expresa PTK7, pero no tiene efecto en célula que no expresa PTK7.
Tabla 15
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Ejemplo 9
Síntesis de vc0101 y mc8261
La síntesis de vc0101 (vc es el enlazador y 0101 es el fármaco) y mc8261 (mc es el enlazador y 8261 es el fármaco) se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en la publicación internacional n° WO/2013/072813, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.
A. Procedimiento experimental para la síntesis de vc0101
Preparación de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil] -L-valil-N- {4-[(21 S, 24S, 25R)-24-[(2S)-butan-2-il] -25-(2-{(2S)-2-[(1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-2-oxoetil)-18,18,23-trimetil-3,16,19,22-tetraoxo-21-(propan-2-il)-2,7,10,13,26-pentaoxa-4,17,20,23-tetraazaheptacos-1 -
Figure imgf000063_0001
Etapa 1. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-2-metilalanil-N-[(3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil] pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n° 53). A una solución del compuesto n.° 32 (2,05 g, 2,83 mmol, 1 eq.) en diclorometano (20 ml, 0,1 M) y N, N-dimetilformamida (3 ml) se le añadió la amina n.° 19 (2,5 g, 3,4 mmol, 1,2 eq.), HATU (1,29 g, 3,38 mmol, 1,2 eq.) y trietilamina (1,57 ml, 11,3 mmol, 4 eq.). La mezcla se agitó a temperatura ambiente mientras se controlaba el progreso de la reacción mediante CL-EM y CCF. Una vez completada, la reacción se concentró al vacío, el residuo se destiló azeotrópicamente tres veces con heptanos y el producto bruto resultante se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% a 55% de acetona en heptano) produciendo el compuesto n° 53 (2,42 g, 74%) como un sólido. CL-EM: m/z 965,7 [M H+], 987,6 [M Na+], tiempo de retención = 1,04 minutos (Protocolo H a continuación); HPLC (Protocolo A-a continuación): m/z 965,4 [M H+], tiempo de retención = 11,344 minutos (pureza> 97%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d 6), se presume que es una mezcla de rotámeros, señales características: 67.86­ 7.91 (m, 2H), [7.77 (d, 3.3 Hz) y 7.79 (d, 3.2 Hz), total 1H], 7.67-7.74 (m, 2H), [7.63 (d, 3.2 Hz) y 7.65 (d, 3.2 Hz), total 1H], 7.38-7.44 (m, 2H), 7.30-7.36 (m, 2H), 7.11-7.30 (m, 5H) , [5.39 (ddd, 11.4, 8.4, 4.1 Hz) y 5.52 (ddd, 11.7, 8.8 , 4.2 Hz), total 1H], [4.49 (dd, 8.6 , 7.6 Hz) y 4.59 (dd, 8.6 , 6.8 Hz) , total 1H], 3.13, 3.17, 3.18 y 3.24 (4 s, total 6 H), 2.90 y 3.00 (2 sa, total 3H), 1.31 y 1.36 (2 sa, total 6 H), [1.05 (d, 6.7 Hz) y 1,09 (d, 6,7 Hz), total 3 H].
Etapa 2. Síntesis de 0101: 2-metilalanil-N-[(3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R, 2R) -1-metoxi-2-metil- 3-oxo-3-{[(1S) -2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1 -il}-5-metil-1 -oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n° 54).
A una solución del compuesto n.° 53 (701 mg, 0,726 mmol) en diclorometano (10 ml, 0,07 M) se le añadió dietilamina (10 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente mientras se monitorizaba el progreso de la reacción mediante LC-EM y TLC. Una vez completa, la reacción se concentró al vacío, el residuo se destiló azeotrópicamente tres veces con heptanos y el producto bruto resultante se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0% a 10% de metanol en diclorometano). El residuo se diluyó con éter dietílico y heptano y se concentró al vacío para proporcionar el n° 54 (406 mg, 75%) en forma de un sólido blanco. CL-EM: m/z 743,6 [M H+], tiempo de retención = 0,70 minutos (Protocolo F-a continuación); HPLC (Protocolo A-a continuación): m/z 743,4 [M H+], tiempo de retención = 6,903 minutos, (pureza> 97%); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d 6 ), se supone que es una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [8,64 (br d, 8,5 Hz) y 8,86 (br d, 8,7 Hz), 1H total], [8,04 ( br d, 9.3 Hz) y 8.08 (br d, 9.3 Hz), total 1H], [7.77 (d, 3.3 Hz) y 7.80 (d, 3.2 Hz), total 1H], [7.63 (d, 3.3 Hz) y 7,66 (d, 3,2 Hz), 1 H total], 7,13-7,31 (m, 5 H), [5,39 (ddd, 11, 8,5, 4 Hz) y 5,53 (ddd, 12, 9, 4 Hz), 1 H total], [4.49 (dd, 9, 8 Hz) y 4.60 (dd, 9, 7 Hz), total 1H], 3.16, 3.20, 3.21 y 3.25 (4 s, total 6H), 2.93 y 3.02 (2 sa, total 3H ), 1,21 (s, 3 H), 1,13 y 1,13 (2 s, total 3 H), [1,05 (d, 6,7 Hz) y 1,10 (d, 6,7 Hz), total 3 H], 0,73-0,80 (m, 3 H).
Etapa 3. Síntesis de vc0101: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il) hexanoil]-L-valil-N- {4-[(21S, 24S, 25R)-24-[(2S)-butan-2-il]-25-(2-{(2S)-2-[(1R, 2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil] pirrolidin-1 -il}-2-oxoetil)-18,18,23-trimetil-3,16,19,22-tetraoxo-21-(propan-2-il)-2,7,10,13,26-pentaoxa-4,17,20,23-tetraazaheptacos-1-il]fenil}-N~5—carbamoil-L-ornitinamida.
El acoplamiento del compuesto 0101 (# 54) para enlazarvc (N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)hexanoil]-L-valil-N5-carbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenoxi)carbonil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida) (MalcValCitPABC-PNP) se logró de acuerdo con el Procedimiento general E (a continuación) utilizando cantidades apropiadas de DMA como disolvente y HOAT y 2,6-lutidina como aditivos, y el material deseado en bruto resultante se purificó de acuerdo con el Procedimiento D (a continuación) para dar 33 mg (36%) del producto deseado. En las condiciones especificadas en el Protocolo A (a continuación) con la columna mantenida a 45 °C, este material dio un tiempo de retención de HPLC de 9,114 minutos (Protocolo A-a continuación); CL-EM: m/z 1342,6 [M H+], tiempo de retención 3,48 minutos (Protocolo H a continuación).
B. Procedimiento experimental para la síntesis de mc8261
Preparación de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-2-metilalanil-N-[(3R, 4S, 5S)-1-{(2S)-2-[(1R, 2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (mc8261).
Figure imgf000064_0001
Etapa 1. Síntesis de N-{(2R, 3R)-3-metoxi-2-metil-3-[(2S)-pirrolidin-2-il]propanoil}-L-fenilalaninato de metilo, sal de clorhidrato (n° 67). De acuerdo con el Procedimiento General C (a continuación), a partir del # 37 (2,39 g, 5.33 mmol, 1 eq.), dioxano (10 ml, 0,53 M) y una solución de ácido clorhídrico 4 M en dioxano (10 ml, 40 mmol, 7,5 eq.) se sintetizó # 67 (2,21 g) como un sólido blanco, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. CL-EM: m/z 349,2 [M H+], tiempo de retención = 0,53 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 89,45-9,58 (m ancho, 1H), 8,63 (d, 8,1 Hz, 1H), 8,51-8,62 (m ancho, 1H), 7,25-7,33 (m, 4H), 7,18-7,25 (m, 1H), 4,50 (ddd, 10,8, 8,1, 4,5 Hz, 1 H), 3,65 (s, 3 H), 3,54 (dd, 6 ,8 , 4,5 Hz, 1 H), 3,20 (s, 3 H), 3,11 (dd, 13,8, 4,5 Hz, 1 H ), 2.99-3.14 (br m, 3H), 2.89 (dd, 13.8, 10.9 Hz, 1H), 2.44-2.50 (m, 1H, asumido; parcialmente oscurecido por el pico del disolvente), 1.77-1.89 (m, 1H), 1,60-1,73 (m, 2 H), 1,46-1,57 (m, 1 H), 1,05 (d, 6,8 Hz, 3 H).
E ta p a 2. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil] -2-metilalanil-N-[(3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R, 2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil] pirrolidin-1-il}-5-metM-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n° 68). De acuerdo con el Procedimiento General D (abajo), de # 32 (353 mg, 0,488 mmol, 1 eq.),
Figure imgf000065_0001
en diclorometano (10 mL, 0,04 M), amina # 67 (271 mg, <0,588 mmol, 1,3 eq.), HATU (223 mg, 0,586 mmol, 1,2 eq.) y diisopropiletilamina (238 |jL, 1,71 mmol, 3,5 eq. ) se sintetizó el material deseado en bruto, que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (gradiente: acetona del 0% al 40% en heptano), proporcionando # 68 (404 mg, 88% en dos etapas) como un sólido. CL-EM: m/z 940,7 [M H+], 962,7 [M Na+], tiempo de retención = 1,04 minutos; HPLC (Protocolo C-a continuación): tiempo de retención = 9,022 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), se presume que es una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [8.25 (br d, 8 Hz) y 8.48 (br d, 8 Hz), total 1H], 7.89 (d, 7.4 Hz, 2H), 7.67-7.75 (m, 2H), 7.38-7.44 (m, 2H), 7.31-7.36 (m, 2H), 7.14-7.24 (m, 5H), 4.43-4.69 (m, 3H), 4.17-4.26 (m, 3H) , 3.91-3.99 (br m, 1H), 3.63 y 3.65 (2 s, total 3H), 3.19 y 3.24 (2 s, total 3H), 3.14 y 3.15 (2 s, total 3H), 2.90 y 2.99 (2 br s, total 3 H), 1,36 y 1,37 (2 s ancho, total 3 H), 1,30 y 1,32 (2 s, total 3 H), [1,02 (d, 6,8 Hz) y 1,06 (d, 6,6 Hz), total 3 H].
Etapa 3A. Síntesis de 8261: 2-metilalanil-N-[(3R, 4S, 5S)-1-{(2S)-2-[(1R, 2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletilo]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil] pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida, sal de ácido trifluoroacético (# 69).
A una solución de # 68 (143 mg, 0,152 mmol, 1 eq.) en tetrahidrofurano (5 ml, 0,02 M) se le añadió una solución de hidróxido de litio (9,10 mg, 0,378 mmol, 2,5 eq.) en agua (3 ml). Después de 5 horas, la reacción se concentró al vacío, se destiló azeotrópicamente tres veces con heptano, se disolvió en dimetilsulfóxido (2,2 ml) y se purificó mediante cromatografía de fase inversa (Procedimiento C-a continuación) para dar # 69 (56 mg, 52%). HPLC (Protocolo A inferior a 45 °C): 704,4 [M H+], tiempo de retención = 6,623 minutos; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), se supone que es una mezcla de rotámeros, señales características: 88.08-8.22 y 8.37-8.49 (2 m, total 5H), 7.12-7.28 (m, 5h ), 3.18, 3.20 y 3.24 (3 s, total 6H) , 2,95 y 3,04 (2 s, total 3 H), 1,52 y 1,53 (2 s, total 3 H), 1,39 y 1,41 (2 s, total 3 H), [1,02 (d, 6,8 Hz) y 1,05 (d, 6,6 Hz)), 3H total], 0,74-0,81 (m, 3H).
Etapa 4: Síntesis de mc8261: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-2-metilalanil-N-[(3R, 4S, 5S)-1-{(2S)-2-[(1R, 2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il] -N-metil-L-valinamida.
Figure imgf000065_0002
El acoplamiento del compuesto 8261 (# 69) al enlazador maleimidocaproil (mc):
Figure imgf000065_0003
se llevó a cabo según el Procedimiento general D (abajo) y el material deseado en bruto resultante se purificó según el Procedimiento C (a continuación) para dar 30,2 mg (24 %) del producto deseado. En las condiciones especificadas en el Protocolo A (a continuación) con la columna mantenida a 45 °C, este material produjo un tiempo de retención de HPLC de 9,058 minutos (Protocolo A-a continuación); CL-EM: m/z 897,7 [M H+], tiempo de retención de 0,81 minutos (Protocolo H a continuación).
C. Procedimientos, métodos y protocolos generales
P ro ce d im ie n to G e n e ra l C: eliminación de Boc o escisión de éster de terc-butilo (también se refiere a éster t-Bu) usando ácido clorhídrico en dioxano. A una solución de compuesto que contiene Boc o un compuesto que contiene éster tercbutílico en dioxano (o en algunos casos sin solución, u otro disolvente relevante) se añadió una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano. El progreso de la reacción se controló mediante CL-EM (o HPLC o CCF). La reacción se concentró al vacío y en algunos casos se destiló azeotrópicamente de una a cuatro veces con heptanos.
P ro ce d im ie n to g e n e ra l D: acoplamiento con hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N, N, N', N'-tetrametiluronio (HATU). A una solución con agitación de la amina (1,0 eq.) y ácido (1,0-2,0 eq.) en diclorometano, se añadió N, N-dimetilformamida (también denominada DMF), o una mezcla de ambos, HATU (1,0-2,0 eq.), seguido de trietilamina (2,0-4,0 eq.) o diisopropiletilamina (2,0-4,0 eq., también denominada base de Hunig). El progreso de la reacción se controló mediante LC-EM (o HPLC o CCF); la reacción normalmente se completaba en tres horas. Los disolventes se eliminaron al vacío. El residuo se purificó mediante gel de sílice o cromatografía de fase inversa o, en algunos casos, se destiló azeotrópicamente tres veces con heptanos, se diluyó con una cantidad pequeña de acetato de etilo antes de reducirse en sílice o sílice unido a C18 y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice o cromatografía en fase inversa.
P ro c e d im ie n to g e n e ra l E: acoplamiento con N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N5-carbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenoxi)carbonil]oxi)metil)fenil]-L-ornitinamida (MalcValCitPABC-PNP). A una mezcla de la amina de carga útil (1 eq.) y N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il) hexanoil]-L-valil-iN5-carbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenoxi)carbonil] oxi} metil)fenil]-L-ornitinamida (MalcValCitPABC-PNP, solicitud de patente europea (1994), e P624377, 1,0-2,0 eq.) en N, N-dimetilformamida o dimetilacetamida (también denominada DMA), piridina (0,0-4,0 eq.), diisopropiletilamina (0,0-4,0 eq.), 2,6-dimetilpiridina (0,0-4,0 eq., también denominada como 2,6-luditina) y 1-hidroxibenzotriazol hidratado (0,01­ 1,1 eq. también denominado h ObT) o 3H-[1,2,3] triazolo [4,5-b]piridin-3-ol (0,01-1,1 eq., también denominado HOAT). Después de agitar a 40 °C-50 °C durante 1-48 horas, la mezcla de reacción se concentró al vacío y se destiló azeotrópicamente tres veces con heptano. El material bruto se purificó mediante cromatografía de fase inversa de acuerdo con el procedimiento especificado para producir el material deseado.
P ro c e d im ie n to C: Columna: Phenomenex Luna C18, 100 x 30 mm, 10 um; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,02% en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,02% en metanol (v/v); Gradiente: 10% a 90% B durante 20 minutos; Velocidad de flujo: 20 ml/minuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 210 nm, 254 nm; Volumen de inyección: variable; Instrumento: Gilson.
P ro c e d im ie n to D: Columna: Phenomenex Synergi Max-RP, 150 x 21,2 mm, 4 micras; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1% en agua; Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo; Gradiente: 30% B durante 1,5 minutos, 30% a 60% B durante 8,5 minutos, 60 a 100% B durante 0,5 minutos y a continuación 100% B durante 2 minutos; Velocidad de flujo: 27 ml/minuto; Detección: DAD 210-360 nm; EM (+) intervalo 150-2000 daltons; Instrumento: Waters FractionLynx.
P ro to co lo A : Columna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 um; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1% en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5% B durante 1,5 minutos, 5% a 100% B durante 8,5 minutos, a continuación 100% B durante 1 minuto; Velocidad de flujo: 0,75 ml/minuto. Temperatura: 25 °C; Detección: DAD 215 nm; EM (+) intervalo 150-2000 daltons; Volumen de inyección: 10 |jl Instrumento: LCEM Agilent 1200.
P ro to c o lo C: Columna: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3,0 mm, 5 um; Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,02% en agua (v/v); Fase móvil B: ácido trifluoroacético al 0,02% en metanol (v/v); Gradiente: 50% a 100% B durante 10 minutos; Velocidad de flujo: 0,75 ml/minuto. Temperatura: no controlada; Detección: DAD 215 nm, 254 nm; Volumen de inyección: 10 jL ; Instrumento: HPLC Agilent 1100.
P ro to co lo F: Columna: Waters Acquity UPLC BEH, C18, 2,1 x 50 mm, 1,7 um; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1% en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 5% B durante 0,1 minutos, 5% a 95% B durante 0,7 minutos, 95% B durante 0,1 minutos; Velocidad de flujo: 1,25 ml/minuto. Temperatura: 60 °C; Detección: 200-450 nm; EM (+) intervalo 100-1200 daltons; Volumen de inyección: 5 jL ; Instrumento: Waters Acquity.
P ro to co lo H: Columna: Phenomenex Gemini-NX, C18, 4,6 x 50 mm, 3 |jm, 110 A; Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1% en agua (v/v); Fase móvil B: ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo (v/v); Gradiente: 0% a 100% B durante 4,10 minutos, lineal a continuación 100% B durante 0,4 minutos; Velocidad de flujo: 1,5 ml/minuto. Temperatura: 60 °C; Detección: DAD 200-450 nm; EM (+) intervalo 100-2000 daltons; Volumen de inyección: 5 jL ; Instrumento: Agilent.
Ejemplo 10
Bioconjugación de los anticuerpos anti-PTK7
A. Conjugados anticuerpo-fármaco anti-PTK7-vc0101
En la presente divulgación, los anticuerpos anti-PTK7 hu23, hu24 y hu58 se conjugaron con vc0101 para generar ADC hu23-vc0101, ADC hu24-vc0101 y Ad C hu58-vc0101, o se conjugaron con mc8261 para generar ADC hu23-mc8261, ADC hu24- mc8261 y ADC hu58-mc8261. La conjugación de hu23, hu24 y hu58 con vc0101 mc8261 se logró mediante derivatizaciones de las cadenas laterales de residuos de cisteína. Estas cisteínas normalmente se emparejan como puentes de disulfuro de cisteína entre cadenas, de los cuales hay 4 pares conservados (que involucran 8 residuos de cisteína) en un anticuerpo IgG1. La reducción parcial de estos enlaces disulfuro proporciona una distribución de tioles libres que pueden funcionalizarse con el mango maleimida en el enlazador vc. Específicamente, un anticuerpo anti-PTK7 de la presente divulgación se redujo parcialmente mediante la adición de un exceso molar de 2,4 tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) en HEPES 100 mM (tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico), pH 7,0 y ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) 1 mM durante 2 horas a 37 ° C. A continuación, se añadió la carga útil de enlazador vc0101 o mc8261 a la mezcla de reacción en una relación molar de carga útil de enlazador/anticuerpo de 7 y se hizo reaccionar durante 1 hora más a 25 °C en presencia de 15% v/v de dimetilacetamida (DMA). Después del período de incubación de 1 hora, se añadió un exceso de 3 veces de N-etilmaleimida para bloquear los tioles que no habían reaccionado y se dejó reaccionar durante 15 minutos, seguido de la adición de un exceso de 6 veces de L-Cys para inactivar cualquier carga útil de enlazador sin reaccionar.
La mezcla de reacción se dializó durante la noche a 4 °C en tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4, y se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC; explorador AKTA, Superdex 200). La sustancia farmacológica de ADC final se formuló en histidina 20 mM, sacarosa 85 mg/ml, tampón pH 5,8.
Los conjugados de anticuerpo-fármaco anti-PTK se caracterizaron adicionalmente mediante SEC para la pureza y cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y cromatografía líquida-espectrometría de masas de ionización por electrospray (LC-ESI MS) que se usó para calcular la proporción de fármaco-anticuerpo (carga de fármaco). La concentración de proteína se determinó mediante espectrofotometría ultravioleta (UV). Este procedimiento proporciona un conjugado de anticuerpo-fármaco como una mezcla heterogénea de anticuerpos funcionalizados que contienen una relación media de fármaco a anticuerpo (DAR) de aproximadamente 4 mol/mol.
El perfil de distribución del fármaco se evaluó a través de HIC para hu24-vc0101 y se presentó en el cromatograma en la figura. 7. Brevemente, la HIC analítica se realizó en una columna TSK gel butil-NPR. El ADC se unió a la columna en sulfato de amonio 1,5 M, fosfato dibásico de potasio 50 mM, pH 7 y se eluyó con fosfato dibásico de potasio 50 mM e isopropanol (IPA) al 20%, pH 7.
B. Conjugados anticuerpo-fármaco anti-PTK7-AcBut CM
En la presente divulgación, los anticuerpos anti-PTK7 hu23, hu24 y hu58 se conjugaron con éster de AcBut-N-acetil-Y-caliqueamicina dimetil hidrazida (AcButCM) OSu para generar hu23-AcButCM ADC, hu24-AcButCM ADC y hu58-AcButCM ADC, tal como se muestra a continuación, en el que X puede ser cualquier anticuerpo, tal como hu23, hu24 y hu58.
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La mezcla de reacción incluía 10 mg/ml o menos anticuerpo anti-PTK7 y éster AcButCM OSu a una relación molar de 4-4,5 a 1. Se llevó a cabo una alta agitación durante la adición de AcButCM a un vórtice de mezcla. El pH de la reacción fue de 8,3 y las concentraciones de otros componentes de la reacción fueron las siguientes: tampón HEPES 180 mM, decanoato de sodio 41 mM y etanol al 8% (v/v). La reacción se llevó a cabo a 33 °C durante 5 minutos. Una vez completada la reacción de conjugación, la mezcla de reacción se diluyó lentamente con 1,3 volúmenes de K2HPO4 1 M ajustado a pH 8,5 con mezcla.
Para purificar, la mezcla de reacción anterior diluida se cargó en dos lotes en una columna de Butil Sepharose-4 Fast Flow HIC (GE Healthcare) que se equilibró previamente en cinco volúmenes de columna (vc) de tampón de fosfato de 0.52m de potasio, pH 8,5. La proteína cargada en la columna fue de 3,5 mg/ml de volumen del lecho. El caudal fue de 15 ml/minuto a través de la carga de la muestra y de 22 ml/minuto a lo largo de la fase de lavado y elución de la cromatografía. Este gradiente mejorado elimina los ADC de DAR más altos que estaban unidos a la columna.
La fracción no unida durante la carga fue predominantemente reactivos de reacción y la mayor parte del anticuerpo no conjugado, que se descartó. A continuación, la columna se lavó con 0,3 vc de tampón fosfato potásico 0,52 M, pH 8,5, para eliminar los reactivos restantes. A continuación, se utilizó un gradiente escalonado con 1 cv de tampón de fosfato de potasio de 0,52 M a 0,4 M, pH 8,5 para eluir cualquier anticuerpo no conjugado débilmente unido junto con anti-PTK7-AcButCM de baja carga, si estaba presente. A continuación, la fracción principal se eluyó usando un gradiente escalonado de 1 cv de tampón de fosfato de potasio de 0,4 M a 5 mM, pH 8,5, para proporcionar anti-PTK7-AcButCM que tiene un DAR en el intervalo de 3 a 5, hacia el final del gradiente. Si estaban presentes conjugados anti-PTK7-AcButCM con un DAR más alto, la fracción se eluyó usando un gradiente de 2 cv de tampón de fosfato de potasio 5 mM, pH 8,5, y a continuación una elución de agua pura desionizada. Cualquier conjugado anti-PTK7-AcButCM con un DAR superior que permaneciera unido después de la elución con agua desionizada se eluyó usando 2 cv de hidróxido de sodio 10 mM que contenía etanol al 20%. Los lotes purificados contenían conjugados anti-PTK7-AcButCM con un DAR de 3 a 5.
Estos procesos de conjugación y purificación mejorados generaron ADC que tenían un DAR menor de 6 , y en algunos aspectos en el intervalo de 3 a 5. Además, los procesos generaron una distribución más estrecha de carga, por ejemplo, menos heterogeneidad dentro del producto. Las mejoras en los procesos de conjugación y purificación incluyeron además: 1) disminuir la relación de AcButCM a anticuerpo anti-PTK7 a 4-4,5 a 1 para generar un ADC que tenga un DAR más bajo, 2) realizar una alta agitación durante la adición de AcButCM al anticuerpo anti-PTK7 para generar ADC con bajas cantidades de anticuerpo no conjugado (anticuerpo libre), 3) reducir el tiempo de incubación a 5 minutos, en comparación con 60-90 minutos, para proporcionar pocos agregados y 4) una reducción en la cantidad de etanol al 6-8% para proporcionar pocos agregados. Los picos reunidos purificados de ambos lotes se dializaron dos veces frente a un tampón formulado para facilitar el almacenamiento en estado congelado. La composición de tampón formulada era Tris 20 mM, sacarosa al 7,5%, polisorbato 80 al 0,01%, NaCl 10 mM, pH 8,0.
Ejemplo 11
Características de unión de mAb hu24 y ADC hu24
Para determinar si mAb hu24 y ADc hu24-vc0101 se unen al ortólogo de mono cynomolgus de PTK7, la proteína PTK7 de mono cynomolgus fue clonada y expresada. El análisis de secuencia reveló que la proteína es 97,9% idéntica a la proteína pTK7 humana.
Se realizó un análisis de resonancia de plasmón de superficie (SPR) para caracterizar las características de unión del mAb y ADC para ectodominios de proteína PTK7 de mono cynomolgus y humano. Se determinó que la unión era comparable mediante análisis SPR. No hubo diferencias significativas en las afinidades entre mAb y ADC por la proteína PTK7 humana o de mono cynomolgus (Tabla 16). Todas las mediciones de Kon están dentro de 3 veces y todas las mediciones de K f están dentro de 2 veces, intervalos que se consideran en el campo dentro del error sistemático típico y, por lo tanto, no es probable que sean fisiológicamente significativos.
T l 1 . n n fini h 24 h 24-v 1 1 r PTK7 h m n PTK7 m n n m l
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La capacidad de los mAb anti-PTK7 para unirse a ortólogos PTK7 también se evaluó mediante ELISA de tipo sándwich. Brevemente, la proteína marcada con PTK7-His humana, de mono cynomolgus, de rata o de ratón se capturó en una placa de ELISA mediante recubrimiento directo. Todos los antígenos se capturaron a 1 pg/ml, 100 pl/pocillo. El mAb Hu24 y el ADC hu24-vc0101 se diluyeron en serie comenzando con 810 ng/ml y se añadieron a los pocillos lavados y bloqueados para probar la unión al antígeno. La unión de mAb y ADC se detectó mediante conjugado policlonal de peroxidasa de rábano picante anti-IgG humana y se leyó con sustrato TMB.
Tanto mAb y ADC se unieron de forma comparable a las proteínas PTK7 de mono cynomolgus y humanos mediante ELISA (Tabla 17). Junto con los resultados de SPR, estos resultados confirmaron la reactividad cruzada con la PTK7 de mono cynomolgus y demostraron que el proceso de bioconjugación no cambió las características de unión observadas del mAb. Sin embargo, ni mAb ni ADC mostraron unión detectable a la proteína PTK7 de rata o ratón a una concentración de antígeno 100 veces mayor que la necesaria para observar la unión a PTK7 humana (Tabla 17). Se confirmó que los antígenos de rata y ratón estaban correctamente plegados mediante la unión a anticuerpos de reacción cruzada conocidos (datos no mostrados).
-
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Se compararon hu24 no conjugado y hu24 conjugado con vc0101 por su capacidad para unirse a células que expresan PTK7 por citometría de flujo usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 3. Brevemente, se recogieron las células H1975 o EKVX cultivadas y se incubaron a 4 °C con ADC hu24-vc0101 o mAb hu24 no conjugado seguido de mAb secundario conjugado con fluoróforo y una tinción de viabilidad y, a continuación, se analizaron por citometría de flujo.
La Tabla 18 proporciona la fluorescencia media del canal de la población de células viables. Se obtuvieron datos comparables en un experimento de replicación independiente, por lo que la conjugación de hu24 a la carga útil del enlazador no altera su unión a las células que expresan PTK7.
T l 1 . ni n l l r m r l h 24 n n n
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Ejemplo 12
Ensayos de citotoxicidad in vitro
La citotoxicidad del conjugado anticuerpo-fármaco hu24-vc0101 se evaluó en líneas de células que expresan el PTK7 objetivo. La línea celular que sobreexpresa HEK293T-PTK7 diseñada se sembró en una placa de cultivo de tejidos de fondo plano transparente (BD Falcon) a 500 células por 180 |jl de medio de cultivo celular por pocillo. Las líneas celulares de cáncer humano también se probaron en este ensayo y se sembraron en placas a una densidad que se determinó previamente como óptima para cada línea celular según su tasa de crecimiento (H661 1500 células/pocillo y H446 9600 células/pocillo en 150 jl). Las células se incubaron durante la noche a 37 ° C en un 5% de CO 2incubadora. Al día siguiente, el ADC hu24-vc0101 y el ADC 8.84 Ab-vc0101 (control negativo) se agregaron a las células en una curva de concentración de 10 puntos en muestras triplicadas comenzando con 3 o 10 jg/mL con diluciones 1: 3 en el medio de cultivo celular. La placa se incubó en una incubadora de CO2 al 5% a 37°C durante 4 días. Se utilizó el ensayo MTS (Ensayo de proliferación de células no radiactivas acuosas Promega CellTiter 96) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se agregaron 30 jL (H446, H661) o 40 jL (HEK293T-PTK7) del reactivo MTS combinado a cada pocillo, y la placa se incubó a 37 ° C, 5% de CO2 incubadora durante 2 horas. La DO se determinó a 490 nm con un lector de placas de 96 pocillos. La lectura promedio de los pocillos con medio solo se restó de las lecturas de los pocillos con células para controlar la DO de fondo. Los datos se sometieron a análisis de regresión logística no lineal (GraphPad Prism Software) para determinar la concentración de conjugado anticuerpofármaco a la que la viabilidad celular se inhibía en un 50% (IC50).
La Tabla 19 proporciona valores de IC50 para el ADC hu24-vc0101 en el ensayo de citotoxicidad. En las tres líneas celulares, hu24-vc0101 provocó una potente citotoxicidad, mientras que el 8.84 Ab-vc0101 no de uni'n no lo hizo; estos datos demuestran que la potente citotoxicidad de hu24-vc0101 dependía del anticuerpo anti-PTK7.
Tabla 19
| Línea celular | Valores IC50 (ng/ml) ~|
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Ejemplo 13
Eficacia in vivo de los conjugados fármaco-anticuerpo anti-PTK7
Los efectos de los conjugados anticuerpo-fármaco anti-PTK7 se evaluaron adicionalmente sobre el crecimiento in vivo de xenoinjertos derivados de pacientes con tumores humanos (PDX). Las muestras de resección de tumores primarios se obtuvieron de sitios clínicos siguiendo la aprobación de la Junta de Revisión Institucional para la Protección de Sujetos Humanos y de acuerdo con las regulaciones de HIPAA. Los fragmentos de tumor se almacenaron y enviaron en Hypothermasol (Biolife Solutions) en hielo y se incrustaron en Matrigel (BD) que contenía una mezcla patentada de factores de crecimiento y se implantaron por vía subcutánea en la almohadilla grasa mamaria de ratones hembra NOD/SCID en las 24 horas posteriores a la resección. Se controló el estado de salud de los ratones diariamente y el crecimiento del tumor inicialmente mediante inspección visual dos veces por semana. Una vez que los tumores fueron palpables, las mediciones del volumen del tumor comenzaron para rastrear el crecimiento del tumor y estimar el tiempo de duplicación. El volumen del turmo se estimó utilizando la ecuación V = (A*B2)/2, donde A es el eje largo y B es el eje corto. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 500 mm 3 a 1.500 mm3, que se recogieron para el estudio y para re-trasplante como un xenoinjerto derivado del paciente (PDX). Dependiendo de la línea, se puede usar disociación mecánica y/o química para separar las células individuales para el paso. Se inocularon células vivas en animales sin experiencia con 10,000 a 50,000 células por animal.
Para los estudios de eficacia, los tumores se recogieron de pases estudios y las células se disociaron en suspensión de células individuales. Las preparaciones se contaron para células vivas usando exclusión de azul tripán y se inocularon de 10,000 a 50,000 células por ratón en Matrigel. Para tener en cuenta las tasas de crecimiento diferenciales de PDX, se inició al menos un 25% más de animales para permitir una variación mínima del volumen tumoral en la aleatorización. El crecimiento del tumor fue seguido inicialmente por la palpabilidad y las mediciones comenzaron una vez que los volúmenes del tumor alcanzaron aproximadamente 30 mm3. Los estudios se asignaron al azar en función del tamaño del tumor una vez que una cohorte de ratones portadores de tumores alcanzó los 140 mm 3 a 180 mm 3 Los animales se dosificaron mediante inyección intraperitoneal dos veces por semana durante dos semanas (q4dx4). Se siguió a los grupos de estudio hasta que los ratones individuales o las mediciones de tumores del grupo completo alcanzaron 1200 mm 3cuando el sacrificio estaba indicado de acuerdo con el protocolo IACUC. Para estudios de dosificación seleccionados, se realizaron hemorragias submandibulares farmacocinéticas a las 2 horas, 36 horas y 72 horas. Se pipeteó inmediatamente un volumen de 10 |jl de sangre en 90 |jl de HBS-P (GE Healthcare). Las muestras se almacenaron a -80 ° C antes del análisis. Para cada medición de tumor se proporciona el volumen tumoral ± error estándar de la media (SEM). GT = Grupo terminado debido al gran tamaño del tumor. Todos los estudios incluyeron un conjugado de fármaco de anticuerpo de control compuesto por un anticuerpo hIgG1 no vinculante conjugado con la misma carga útil de enlazador que se analiza y con una proporción de fármaco a anticuerpo (DAR) y distribución de carga comparables.
Las tablas 20-37 demuestran la eficacia de los conjugados anticuerpo-fármaco hu23-vc0101, hu24-vc0101, hu58-vc0101, hu23-AcButCM, hu24-AcButCM y hu58-AcButCM en modelos PDX establecidos utilizando diversas células tumorales humanas que tienen una expresión relativa de PTK7 determinada como baja, media o alta.
A. Cáncer de mama (BR)
La Tabla 20 y FIG. 8 muestran que los ADC hu23-vc0101, hu24-vc0101 y hu58-vc0101 son todos efectivos en un modelo PDX usando el modelo PDX de cáncer de mama triple negativo (TNBC) Breast-13 humano (BR13) (alta expresión de PTK7) en comparación con controles de vehículos y fármaco. El ADC hu24-vc0101 fue más eficaz que hu23-vc0101 y hu58-vc0101 en el modelo PDX BR13. Todos los ADC de PTK7 probados fueron más efectivos que la doxorrubicina, que es un tratamiento estándar para el TNBC.
Tabla 20 Eficacia de ADC anti-PTK7-vc0101 en PDX de TNBC BR13
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Las figuras 9 y 10 muestran la eficacia de los ADC hu23-mc8261, hu24-mc8261 y hu58-mc8261 en el modelo PDX de TNBC BR13 (alta expresión de PTK7) en comparación con hu24-vc0101. El tratamiento con hu24-vc0101 produjo una regresión tumoral sostenida durante más de 200 días y demostró una mayor inhibición del crecimiento tumoral en comparación con los ADC anti-PTK7-mc8261.
La Tabla 21 y la figura 11 muestran que los ADC hu23-vc0101, hu24-vc0101 y hu58-vc0101 son todos efectivos en un modelo p Dx usando el modelo PDX de TNBC Breast-22 (BR22) humano (alta expresión de PTK7) en comparación con controles de vehículo y fármaco. En este modelo, los ADC hu23-vc0101 y hu24-vc0101 fueron más efectivos que hu58-vc0101, demostrando que anticuerpos similares contra la misma diana (PTK7) tienen diversos grados de eficacia. Todos los ADC de PTK7 probados fueron más efectivos que el docetaxel, que es un tratamiento estándar para el TNBC. En particular, el docetaxel y el componente farmacológico de los ADC, auristatina 0101, tienen mecanismos de acción similares en el sentido de que inhiben la polimerización de tubulina.
Tabla 21 Eficacia de ADC anti-PTK7-vc0101 en PDX de TNBC BR22
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La Tabla 22 muestra que los ADC hu23-AcButCM, hu24-AcButCM y hu58-AcButCM fueron todos eficaces en el modelo PDX de TNBC BR22 (alta expresión de PTK7) en comparación con controles de vehículo y fármaco. Sin embargo, hu58-AcButCM fue más eficaz que hu23-AcButCM y hu24-AcButCM, lo que ilustra la naturaleza impredecible del uso de varias cargas útiles con anticuerpos similares contra la misma diana. Los ADC hu23-vc0101 y hu24-vc0101 fueron más efectivos que hu58-vc0101, mientras que hu58-AcButCM fue más efectivo que los ADC hu23-AcButCM y hu24-AcButCM. Todos los ADC de PTK7 probados fueron más efectivos que la doxorrubicina, que es un tratamiento estándar para el TNBC.
Tabla 22. Eficacia de ADC en PDX de TNBC BR22
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Las figuras 12 y 13 muestran la eficacia de los ADC hu23-mc8261, hu24-mc8261 y hu58-mc8261 en el modelo de PDX de TNBC BR22 (alta expresión de PTK7) en comparación con hu23-vc0101. El tratamiento con hu23-vc0101 produjo regresiones tumorales sostenidas durante más de 200 días y demostró una mayor inhibición del crecimiento tumoral en comparación con los ADC anti-PTK7-mc8261.
Las Tablas 23-25 y FIG. 14 muestran la eficacia de los ADC hu23-vc0101, hu24-vc0101, hu58-vc0101, hu23-mc8261 y hu24-mc8261, hu58-mc8261 y hu23-AcButCM, hu24-AcButCM, hu58-AcButCM en el modelo de PDX de TNBC Breast-31 (BR31) (alta expresión de PTK7). En este modelo, los tres ADC con carga útil de enlazador vc0101 fueron más efectivos que los ADC con AcButCM o mc8261. Este resultado fue inesperado ya que la carga útil del enlazador AcButCM era generalmente más potente que la carga útil del enlazador vc0101 en los modelos PDX in vivo probados. Además, los ADC PTK7-vc0101 fueron más efectivos que el docetaxel y los ADC PTK7-AcButCM fueron más efectivos que la doxorrubicina. Tanto el docetaxel como la doxorrubicina son tratamientos estándares para TNBC.
Tabla 23. Eficacia de ADc anti-PTK7-vc0101 en PDX de TNBC BR31
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(continuación)
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Tabla 24. Eficacia de ADC anti-PTK7-mc8261 en PDX de TNBC BR31
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Tabla 25 Eficacia de ADC anti-PTK7-AcButCM en PDX de TNBC BR31
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La Tabla 26 y la FIG. 15 muestran que el ADC hu24-vc0101 fue eficaz en el modelo de PDX de TNBC Breast-64 (BR64) humano (expresión media de PTK7) en comparación con controles de vehículo y fármaco. Los datos demuestran que un modelo PDX que tiene una expresión moderada de la diana PTK7 fue dirigido de manera efectiva con hu24-vc0101. Hu24-vc0101 fue más eficaz que docetaxel, un tratamiento estándar para TNBC.
Tabla 26. Eficacia de hu24-vc0101 en PDX de TNBC BR64
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La figura 16 muestra la eficacia de hu24-vc0101, y la falta de eficacia de hu24 no conjugado, en el modelo PDX de TNBC BR5. Los ratones que albergan xenoinjertos de cáncer de mama humano Br5 se dosificaron cada cuatro días durante cuatro ciclos (Q4Dx4) con ADC hu24-vc0101, mAb hu24 no conjugado o vehículo. Las mediciones de los tumores se registraron dos veces por semana usando calibradores digitales y se muestran como Media ± SEM. La dosis de 3 mg/kg de ADC hu24-vc0101 provocó la regresión del tumor sin crecimiento del tumor hasta el día 49. Por el contrario, el mAb hu24 no conjugado no inhibió el crecimiento del tumor (Figura 16). Por tanto, la eficacia observada depende de la liberación de la carga útil del enlazador.
La figura 17 muestra la eficacia de hu24-vc0101 en comparación con paclitaxel en el modelo PDX de PR TNBC BR36. A los ratones que albergaban xenoinjertos de cáncer de mama humano BR36 se les administró Q4Dx4 con ADC hu24-vc0101, paclitaxel, ADC de control negativo o vehículo. Las mediciones de los tumores se registraron dos veces por semana usando calibradores digitales y se muestran como Media ± SEM. La dosis de 3 mg/kg de ADC hu24-vc0101 provocó la regresión del tumor sin crecimiento tumoral hasta el día 103. Hu24-vc0101 salió del paclitaxel preformado administrado en el MTD. El ADC de control negativo exhibió solo una actividad modesta (Figura 17).
B. Cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC)
Los datos en las Tablas 27-28 ilustran la eficacia de los ADC hu24-vc0101 y hu24-AcButCM en el modelo de PDX de cáncer de pulmón de células pequeñas-64 (LU64) (baja expresión de PTK7). En este modelo, se demostró que ambos ADC eran efectivos en este PDX de baja expresión de PTK7, aunque los ADC que tenían una carga útil de enlazador AcButCM eran más efectivos que los ADC que tenían una carga útil de enlazador vc0101. Tanto hu24-vc0101 como hu24-AcButCM fueron más eficaces que el tratamiento estándar para el SCLC (que es cisplatino más etopósido).
Tabla 27. Eficacia de ADC hu24-vc0101 en PDX LÜ64
Figure imgf000076_0001
(continuación)
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Tabla 28. Eficacia de ADC hu24-AcButCM en PDX LU64
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La Tabla 29 muestra la eficacia de los ADC hu23-mc8261, hu24-mc8261 y hu58-mc8261 en el modelo PDX LU64 (baja expresión de PTK7). El tratamiento con hu24-vc0101 demostró una mayor inhibición del crecimiento tumoral que los ADC anti-mc8261 en este modelo.
Tabla 29. Eficacia de ADC anti-PTK7-mc8261 en PDX LU64
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(continuación)
Figure imgf000077_0002
Las tablas 30-31 muestran la eficacia de los ADC hu24-vc0101, hu23-vc0101 y hu24-AcButCM en el modelo PDX de cáncer de pulmón de células pequeñas-86 (LU86) (alta expresión de PTK7). En este modelo, tanto hu24-vc0101 como hu23-vc0101 fueron eficaces para suprimir el crecimiento tumoral. Hu24-vc0101 fue más eficaz que el ADC controlvc0101. Sin embargo, el ADC hu24-AcButCM era más potente que los dos ADC que tenían una carga útil de enlazador vc0101 (Tabla 22), lo que proporciona un ejemplo más de la potencia general mayor de AcButCM en comparación con vc0101 en modelos SCLC. Hu24-AcButCM fue más eficaz que cisplatino más etopósido, que es un tratamiento estándar para SCLC.
Tabla 30. Eficacia de ADc anti-PTK7-vc0101 en PDX LU8S
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Tabla 31. Eficacia de ADC hu24-AcButCM en PDX LU86
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La Tabla 32 muestra la eficacia de los ADC hu23-mc8261, hu24-mc8261 y hu58-mc8261 en el modelo PDX LU86 (alta expresión de PTK7). El tratamiento con hu23-vc0101 produjo una regresión tumoral sostenida en el modelo PDXLU86 y demostró una mayor inhibición del crecimiento tumoral en comparación con los ADC anti-PTK7-mc8261
Tabla 32. Eficacia de ADC anti-PTK7-mc8261 en PDX LU86
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Las figuras 18A-B muestran la eficacia de los ADC de PTK7 conjugados con 0101 o CM en dos modelos PDX de SCLC diferentes, un modelo PDX de H1048 (alta expresión de PTK7) y un modelo PDX SCLC 95 (alta expresión de PTK7), respectivamente. La figura 19A-B muestra la eficacia de hu24-AcBut CM en dos modelos PDX de SCLC diferentes, un modelo PDX de SCLC 117 (expresión moderada de PTK7) y un modelo PDX de SCLC 102 (baja expresión de PTK7), respectivamente. Los resultados demuestran que los ADC hu24-AcButCM o hu23-AcButCM son más eficaces que los ADC hu24-vc0101 contra el SCLC. Este hallazgo es inesperado a la luz de la fuerte actividad antitumoral de hu24-vc0101 en modelos PDX de otros tipos de tumores, tales como TNBC y NSCLC. Además, los resultados sugieren que la actividad del ADC se correlaciona con la expresión de PTK7, ya que ADC hu24-AcButCM provocó la respuesta más débil en SCLC 102 que tiene baja expresión de PTK7.
C.Cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)
La tabla 33 y figura 20 muestran que el ADC hu24-vc0101 fue eficaz en el modelo PDX de cáncer de pulmón de células no pequeñas 135 (LU135) humano (alta expresión de PTK7) en comparación con controles de vehículo y fármaco. Estos datos demuestran la eficacia de hu24-vc0101 en la supresión del crecimiento tumoral en un PDX de NSCLC PDX. Hu24-vc0101 fue más eficaz que el paclitaxel, que es un tratamiento estándar para NSCLC.
Tabla 33. Eficacia de hu24-vc0101 en PDX LU135
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La Tabla 34 y figura 21 muestran que el ADC hu24-vc0101 fue eficaz en el modelo PDX de cáncer de pulmón de células no pequeñas 176 (LU176) humano (alta expresión de PTK7) en comparación con controles de vehículo y fármaco. Estos datos demuestran la eficacia de hu24-vc0101 en la supresión del crecimiento tumoral en un PDX NSCLC. Hu24-vc0101 fue más eficaz que el cisplatino, que es un tratamiento estándar para NSCLC.
Tabla 34. Eficacia de hiu24-vc0101 en PDX LU176
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(continuación
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D. Cáncer de ovario (VO)
La Tabla 35 muestra la eficacia de los ADC hu24-vc0101 y hu24-AcButCM en el modelo de PDX ovárico-55 (OV55) (expresión media de PTK7) en comparación con controles de vehículo y fármaco. Estos datos demuestran que un modelo de PDX ovárico que tiene una expresión moderada de la diana de PTK7 es reconocido de manera eficaz por ambos ADC. Sorprendentemente, los animales tratados con hu24-vc0101 estaban libres de tumores cuando se terminó el experimento y el ADC hu24-AcButCM fue menos eficaz en este modelo.
Tabla 35. Eficacia de ADC hu24 en PDX OV55
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E. Melanoma (SK)
La Tabla 36 muestra que el ADC hu24-vc0101 fue eficaz en el modelo PDX de melanoma-23 humano (SK23) (expresión media de PTK7) en comparación con los controles de vehículo y fármaco. Estos datos demuestran la eficacia de hu24-vc0101 en un modelo PDX de melanoma que tiene una expresión moderada de la diana de PTK7, lo que proporciona una indicación potencial para el uso del ADC.
Tabla 36. Eficacia de hu24-vc0101 en PDX SK23
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(continuación)
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F. Inhibición del crecimiento tumoral en modelos PDX de mama y NSCLC
Los animales se dosificaron cada cuatro días durante cuatro ciclos (q4dx4) por inyección intraperitoneal, excepto el estudio BR5 que era por inyección intravenosa en el mismo horario. Las mediciones de los tumores se registraron una o dos veces por semana usando calibradores digitales y el volumen del tumor se estimó usando la ecuación V=(A x B2)/2 donde A es el eje largo y B es el eje corto. Se midieron y registraron los pesos corporales de los animales al menos una vez a la semana. Se siguió a los grupos de estudio hasta que las mediciones de los tumores de los ratones individuales o del grupo completo alcanzaron 1200 mm3 en el que se indicó el sacrificio de acuerdo con el protocolo IACUC. Para el estudio BR5, los animales se sacrificaron una vez que el volumen del tumor se acercó al 15% del peso corporal en la estadificación de acuerdo con el protocolo IACUC.
La inhibición del crecimiento del tumor (TGI) se calculó usando la ecuación% [1- (volumen tumoral medio del tratado)/(volumen tumoral medio del vehículo)]. El TGI se calculó en el último punto de tiempo posible, que normalmente era la última medición antes de que se suspendiera el grupo de control como se describió anteriormente. La regresión del tumor se definió como una reducción en el volumen medio del tumor después de la dosificación. En los casos en los que los tumores retrocedieron, el tiempo hasta la progresión (TTP) indica el número de días entre las primeras veces y el momento en el que el volumen tumoral medio aumentó desde la medición anterior a un grado estadísticamente significativo. Si el tumor no volvió a crecer durante el curso del experimento, TTP es el número de días entre la primera dosis y el final del experimento.
Para confirmar la exposición del ADC hu24-vc0101 en los estudios de eficacia, se determinaron las concentraciones plasmáticas de ADC y el anticuerpo total para dos modelos de PDX, PDX BR13 y PDX BR22. Las muestras se recogieron en tres puntos de tiempo después de la tercera administración de ADC y las concentraciones se midieron mediante el ensayo de unión de ligando (LBA) (datos no mostrados). Los datos indican que las exposiciones a fármacos fueron comparables en estos modelos de tumores.
El ADC Hu24-vc0101 provocó una actividad antitumoral en modelos tumorales de cáncer de mama y NSCLC. Los tumores retrocedieron con el tratamiento y, por lo general, no volvieron a crecer durante meses después de la última administración de ADC. El mAb hu24 no conjugado no provocó actividad antitumoral en el modelo probado, lo que demostró el mecanismo de acción dependiente de auristatina. Los resultados se resumen en la Tabla 37.
Tabla 37. Resumen de estudios de farmacolo ía in vivo con ADC hu24-vc0101
Figure imgf000082_0001
Figure imgf000083_0001
Ejemplo 14
Mecanismo de acción de 0101
Para estudiar el mecanismo de acción del ADC hu24-vc0101, las células fueron tratadas con el ADC y, a continuación se evaluó su estructura de microtúbulos. La auristatina es un inhibidor pentapéptido basado en dolastatina totalmente sintética de la polimerización de tubulina que induce la detención del ciclo celular G2/M y la muerte celular a concentraciones intracelulares picomolares bajas (Sapra et al., 2011, Expert Opin Investig Drugs 20 (8): 1131-49 y Turner et al., 1998, Prostate 34 (3): 175-81).
Se sembraron células de cáncer de pulmón H661 en un sistema de portaobjetos de cámara de 4 pocillos con una superficie de crecimiento recubierta de CC2 (Thermo Scientific) y se trataron durante 48 horas con hu24-vc0101, ADC de control negativo, hu24mAb no conjugado a 0 - 4 |jg/ml o 0101 libre auristatina a 0,1 - 10 nM. A continuación, las células se fijaron en paraformaldehído al 3%, se lavaron con PBS, se permeabilizaron con Triton-X® al 0,5% (Sigma Chemical) en PBS, se lavaron con PBS y se incubaron con tampón de bloqueo (suero de cabra normal al 5% y Tween-20 al 0,2%). en PBS). Las células se incubaron con el anticuerpo primario anti-a-tubulina (Sigma NoT9026, clon DM1A) en tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se lavaron con PBS y se incubaron durante 30 minutos con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor® 488 (Invitrogen Corp) y 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para teñir el ADN. Las células se visualizaron en un microscopio confocal Zeiss LSM 510 Meta.
El tratamiento de células con 0101 libre o ADC hu24-vc0101 alteró la estructura de los microtúbulos y condujo a la detención del ciclo celular G2/M. Por el contrario, ni el mAb hu24 no conjugado ni el mAb de control negativo provocaron estas respuestas (Figura 22). Estos resultados demuestran que el ADC hu24-vc0101 puede provocar citotoxicidad de una manera dependiente del antígeno al alterar la estructura de los microtúbulos y provocar la detención de G2/M. Este mecanismo es consistente con estudios previos sobre auristatinas no conjugadas.
Ejemplo 15
Efecto del ADC hu24-vc0101 sobre células endoteliales
La figura 23 muestra que hu24-vc0101 ADC inhibe la angiogénesis en un ensayo estándar de brotación de HUVEC in vitro. Brevemente, las células HUVEC (Lonza- # CC-2517) se usaron para recubrir perlas Cytodex (Sigma # C0646-5G) en una proporción de aproximadamente 1x106 células/2500 perlas, y luego se coloca durante la noche en un CO2 37 ° C/5% incubadora con medio de crecimiento de células endoteliales (Lonza # CC-3162). Al día siguiente, las perlas se lavaron con medio de crecimiento de células endoteliales y se resuspendieron en una solución de 2,0 mg/ml de fibrinógeno tipo I (esterilizado por filtración) en DPBS y 0,15 unidades/ml de aprotinina. En cada pocillo de una placa de 24 pocillos, se añadieron 0,3125 unidades de trombina antes de la adición de 500 ul de la solución de perlas. Para facilitar la coagulación, las placas se colocaron en un 37 incubadora C durante 15 minutos. Por último, se colocaron cuidadosamente células de fibroblasto de piel (Detroit 551 - ATCC # CCL-110), suspendidas en medio de crecimiento de células endoteliales, encima del coágulo de fibrinógeno formado. Las células se alimentaron, con su respectivo tratamiento farmacológico, día por medio y se cultivaron durante 8 días. Se observó el grado de brotación de HUVEC y la formación de vasos ramificados.
ADC Hu24-vc0101 inhibió la germinación de la angiogénesis en este ensayo a 1 mg/ml, mientras que el ADC de control negativo no lo hizo. Este resultado demuestra que el ADC anti-PTK7 puede inhibir la angiogénesis de una manera específica para la diana.
Ejemplo 16

Claims (2)

REIVINDICACIONES
1. Conjugado anticuerpo-fármaco de fórmula: Ab-(L-D), en el que:
Ab es un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 37 y una cadena ligera que tiene una secuencias de aminoácidos establecida como SEQ ID NO: 47; y
Figure imgf000120_0001
2. Conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en el que el conjugado anticuerpo-fármaco tiene una relación de fármaco con respecto a anticuerpo (DAR) de 1 a 8.
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