CN115894696A

CN115894696A - 抗ptk7单域抗体及其应用

Info

Publication number: CN115894696A
Application number: CN202110950740.1A
Authority: CN
Inventors: 黄仲廉; 丁航海
Original assignee: Nanomab Technology Ltd
Current assignee: Nanomab Technology Ltd
Priority date: 2021-08-18
Filing date: 2021-08-18
Publication date: 2023-04-04
Also published as: WO2023020551A1; AU2022329227A1

Abstract

本发明涉及抗体药物技术领域，提供了一组针对PTK7的特异性单域抗体编码序列及其应用。本发明提供的抗PTK7单域抗体能有效与PTK7抗原结合，为靶向PTK7的药物包括核素偶联药物，抗体偶联药物及多特异性抗体药物等研发提供了基础。

Description

抗PTK7单域抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体领域，具体地涉及针对PTK7的特异性单域抗体，更具体地涉及其编码序列和其在疾病诊断和治疗中的应用。

背景技术

蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)，又名结肠癌激酶4(CCK4)，是一种高度保守、无催化活性的跨膜蛋白酪氨酸激酶(PTK)，参与造血细胞，体细胞祖细胞以及干细胞发育过程的非标准Wnt信号转导收体(Peradziryi，2012)。

研究表明，PTK7在多种肿瘤组织中过度表达，包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌，其过度表达与预后不良和转移风险增加有关。另外，PTK7也被证实病人源性肿瘤组织中的肿瘤启动细胞(TIC)或肿瘤干细胞高度富集。因此，靶向PTK7不单消除一般癌细胞，更能消除负责肿瘤复发的TIC，成为靶向治疗的一个天然候选靶点(Damelin，2017)。然而，由于PTK7没有催化活性，因此对此开发典型酪氨酸激酶抑制剂是不切实际的，以其为靶点的不同抗体偶联物以及不用型式的等多种药物正处于临床研发中。其中新型抗体偶联药物(ADC)，利用人源化抗体hu6M024作为靶向载体与金盏花素微管抑制剂Aur0101偶联而成的cofetuzumab pelidotin，已于转移性三阴性乳腺癌，铂耐药卵巢癌和非小细胞肺癌进行首次人体临床试验。其中早期研究数据证明，每3周一次2.8mg/kg cofetuzumabpelidotin是安全的，并在接受治疗的患者中观察到抗肿瘤活性，总体客观有效率分別为铂耐药卵巢癌27％(n＝63)，非小细胞肺癌19％(n＝31)和三阴性乳腺癌21％(n＝29)(Maitland,2021)。此外，利用F-18标记的Aptamer核酸适体作为靶向PTK7的免疫显像示踪剂能够在种肿瘤细胞系(HCT116和UMG)的异种移植模型中特异性、选择性和高亲和力地监察PTK7表达，并可能进一步开发PTK7靶向治疗(Jacobson,2015)。

截至目前，市场上尚未有针对PTK7靶点的单域抗体药物。单域抗体即骆驼重链单域抗体VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)，是目前可以得到的具有完整功能的稳定的可结合抗原的最小单位。单域抗体其分子量是传统抗体的1/10,具有稳定性高、水溶性好、人源化简单、靶向性高、穿透性强等特点，作为放射性同位素靶向载体，能够快速、特异性地穿透肿瘤组织结合靶标，而无结合抗体能很快从血液清除，减低身体放射性剂量，对比传统抗体用于开发放射免疫成像及放射免疫疗法具有众多明显优势(D’Huyvetter,2014)。

因此，本领域需要开发一种抗PTK7单域抗体，尤其是能够单一有效地结合PTK7的特异性单域抗体，开发新一代放射免疫成像及放射免疫疗法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具备良好的PTK7抗原结合性的抗PTK7单域抗体。

本发明的第一方面，提供了一种抗PTK7单域抗体VHH链的互补决定区CDR，所述VHH链的互补决定区CDR包含：

SEQ ID NO:9-11所示的CDR1；

SEQ ID NO:12-14所示的CDR2；和

SEQ ID NO:15-18所示的CDR3。

在另一优选例中，所述的CDR1、CDR2和CDR3由VHH链的框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。

在另一优选例中，所述VHH链的互补决定区CDR包含：

SEQ ID NO:9所示的CDR1；

SEQ ID NO:12所示的CDR2；和

SEQ ID NO:15所示的CDR3。

在另一优选例中，所述VHH链的互补决定区CDR包含选自下组的CDR1、CDR2和CDR3：

组	CDR1序列编号	CDR2序列编号	CDR3序列编号
				1	9	12	15
2	10	13	16
				3	10	13	17
4	11	14	18。.

本发明的第二方面，提供了一种抗PTK7单域抗体的VHH链，所述VHH链包括框架区FR和本发明第一方面所述的互补决定区CDR。

在另一优选例中，所述框架区由选自下组的FR1、FR2、FR3和FR4组成：

组	FR1序列编号	FR2序列编号	FR3序列编号	FR4序列编号
					1	19	22	25	29
2	20	23	26	30
					3	20	23	27	29
4	21	24	28	31。

在另一优选例中，所述的框架区由：

SEQ ID NO:19所示的FR1，SEQ ID NO:22所示的FR2，SEQ ID NO:25所示的FR3，和SEQ ID NO:29所示的FR4组成。

在另一优选例中，所述的抗PTK7单域抗体的VHH链具有如SEQ ID NO:1-4任一所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的抗PTK7单域抗体的VHH链具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本发明的第三方面，提供了一种抗PTK7单域抗体，所述单域抗体是针对PTK7蛋白的单域抗体，并且具有如SEQ ID NO:1-4任一所示的氨基酸序列的VHH链。

在另一优选例中，所述单域抗体具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VHH链。

本发明的第四方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：本发明第一方面所述的CDR区、本发明第二方面所述的抗PTK7单域抗体的VHH链、或本发明第三方面所述的抗PTK7单域抗体。

在另一优选例中，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.:5-8任一所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的多核苷酸包括DNA、cDNA或RNA。

本发明的第五方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第四方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述表达载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

本发明的第六方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第五方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第四方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞。

本发明的第七方面，提供了一种产生抗PTK7单域抗体的方法，包括步骤：

(a)在适合产生单域抗体的条件下，培养本发明第六方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗PTK7单域抗体的培养物；以及(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗PTK7单域抗体。

在另一优选例中，所述的抗PTK7单域抗体具有如SEQ ID NO:1-4任一所示的氨基酸序列。

本发明的第八方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：

(a)如本发明第二方面所述的抗PTK7单域抗体的VHH链、或如本发明第三方面所述的抗PTK7单域抗体；和(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。

在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。

在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明第二方面所述的抗PTK7单域抗体的VHH链、如本发明第三方面所述的抗PTK7单域抗体。

在另一优选例中，所述多价是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本发明第二方面所述的抗PTK7单域抗体的VHH链、本发明第三方面所述的抗PTK7单域抗体。

本发明的第九方面，提供了如本发明第二方面所述的VHH链，如本发明第三方面所述的抗PTK7单域抗体，或如本发明第八方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备(a)用于检测PTK7分子的试剂；(b)用于治疗肿瘤的药物。

在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。

在另一优选例中，所述肿瘤为PTK7高表达的肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌，或其组合。

本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：(i)如本发明第三方面所述的单域抗体或如本发明第八方面所述的免疫偶联物；和(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌，或其组合。

本发明的第十一方面，提供了一种体外(诊断和非诊断性)检测样品中PTK7蛋白的方法，包括步骤：

(1)将样品与本发明第三方面所述的单域抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在PTK7蛋白。

本发明的第十二方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，包括向需要的对象施用如本发明第三方面所述的单域抗体，如本发明第八方面所述的免疫偶联物，或如本发明第十方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述肿瘤为PTK7高表达的肿瘤。

在另一优选例中，所述对象包括人或非人类哺乳动物。

本发明的第十三方面，提供了一种放射性免疫成像方法，包括使用如本发明第三方面所述的单域抗体，或如本发明第八方面所述的免疫偶联物进行成像。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是人PTK7-Fc蛋白抗原的检测结果。结果表明，该蛋白在SDS-PAGE纯度达到90％以上。

图2是两个抗PTK7单域抗体噬菌体展示文库的构建和质量检测结果。图A为两个文库第一次和第二次PCR扩增产物的PCR鉴定图，结果表明，最终获得大小约为400bp的VHH基因片段；图B为两个文库的库容检测图，结果表明，两个文库库容分別为2.2x10⁹和3.4x10⁹CFU；图C为两个文库的插入率检测图，结果表明，两个文库的VHH插入率分別为96％和100％；图D为两个文库的富集检测图，结果表明，两个文库的特异性噬菌体经三轮筛选后分別达到60和84倍富集。

图3是抗PTK7单域抗体与PTK7阳性表达HCT116细胞结合活性的流式细胞术检测结果。结果表明，4株单域抗体均能够有效结合HCT116细胞表面的PTK7蛋白。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次成功地研发出了一组抗PTK7单域抗体。实验结果表明，本发明获得的4株PTK7单域抗体均能以高亲和力特异性结合人或猴PTK7蛋白。

具体地，本发明利用人源的PTK7胞外段抗原蛋白免疫骆驼，获得高质量的免疫单域抗体基因文库。然后将PTK7蛋白分子偶联在酶标板上，展示PTK7蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫单域抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了PTK7特异性的单域抗体基因。再将此基因转至大肠杆菌中，从而获得了能在大肠杆菌中高效表达的、且特异性高的单域抗体株。

术语

如本文所用，术语“本发明单域抗体”、“本发明的抗PTK7单域抗体”、“本发明PTK7单域抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于PTK7(包括人、小鼠和猴PTK7)的单域抗体。本发明包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4任一项所述的的单域抗体，特别优选的是VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的单域抗体。

如本文所用，术语“单域抗体”、“VHH”、“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义并可互换使用，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

如本文所用，术语“重链可变区”与“V_H”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(Complementarity DeterminingRegion，CDR)”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合PTK7蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有PTK7蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含单域抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明单域抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；9.疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于结合PTK7蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单域抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

标记的单域抗体

在本发明的一个优选例中，所述单域抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。

胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗PTK7的单域抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的单域抗体。在本发明的另一个优选的方案中，抗PTK7的单域抗体用放射性同位素标记，得到同位素标记的单域抗体。

本发明的抗PTK7单域抗体具有很好的特异性，很高的效价，可用于针对PTK7的临床诊断。

检测方法

本发明还涉及检测PTK7蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中PTK7蛋白的水平。

在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。

试剂盒

本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

本发明还提供了用于检测PTK7水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别PTK7蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

应用

如上所述，本发明的单域抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与PTK7相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对PTK7的临床诊断和靶向治疗。

本发明提供了抗PTK7单域抗体在诊断和治疗肿瘤中的应用，所述肿瘤为PTK7异常高表达(包括mRNA和/或蛋白水平)的肿瘤，具体地，所述肿瘤包括但不限于：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌等。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明首次研发了针对PTK7靶点的单域抗体；

(b)本发明的单域抗体与PTK7蛋白结合的亲和力高；

(c)本发明的单域抗体特异性好，可以与人、鼠和恒河猴PTK7结合；

(d)本发明的单域抗体能够于PTK7高表达肿瘤模型有效积聚，可应用于PTK7靶向的癌症诊断及疗效评估，同时用于开发新一代PTK7靶向治疗；

(e)本发明的单域抗体制备方法简单，易于大量生产。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1：人PTK7-Fc蛋白抗原表达

利用哺乳动物细胞HEK293F瞬转表达人PTK7胞外段蛋白：将人PTK7胞外段基因克隆至pFUSE-IgG重组质粒，与转染试剂PEI 1:3混合后转染至HEK293F细胞；37℃，6％CO2摇床培养箱中培养6天；随后收集细胞上清，与Protein A珠子在室温下结合1h；再用磷酸盐缓冲液pH 7.0洗涤珠子后，用0.1M pH3.0甘氨酸溶液洗脱蛋白；再将洗脱的蛋白超滤至PBS溶液中，测定产量后取样进行SDS-PAGE检测。

检测结果如图1所示，PTK7-Fc蛋白抗原的纯度大于90％，可用于骆驼免疫及抗体筛选。

实施例2：人PTK7胞外段蛋白免疫文库构建及筛选

将纯化的PTK7-Fc蛋白蛋白免疫2只新疆双峰驼，7次免疫结束后从骆驼外周血中分离total RNA，经反转录和PCR扩增出VHH基因(图2A)，再将VHH基因克隆至噬菌体载体pMECS上，转化至TG1宿主细胞中构建成噬菌体展示文库。两个构建文库被梯度稀释后涂板并测定库容，同时每个构建文库随机挑取24颗克隆进行菌落PCR检测。

结果表明，两个构建文库库容分別为2.2x10⁹和3.4x10⁹ CFU(图2B)，文库插入率为分別为96％和100％(图2C)。

随后利用噬菌体展示技术进行3轮“吸附-洗涤-富集”，最终两个文库的特异性噬菌体分別达到60和84倍富集(图2D)。从以上富集的噬菌体克隆中随机挑选400颗针对人PTK7-Fc进行PE-ELISA鉴定，将获得的阳性克隆(比值＞3)全部进行测序鉴定，将所有序列不同的单域抗体(107株)均作为候选对象。

实施例3：抗PTK7单域抗体的表达和純化

从实施例2测序分析所获得的抗体克隆挑选出40株，将各质粒电转至大肠杆菌WK6中，并将其涂布在LA+glucose的培养平板上，37℃培养过夜；挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；接种1mL的过夜菌种至330mL TB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD0.6-1时，加入IPTG，28℃摇床培养过夜；离心收菌，并利用渗透法获得抗体粗提液；经镍柱离子亲和层析制备纯化的单域抗体。经检测表达纯化的单域抗体纯度大于90％，用于候选功能活性研究，最终获得下列4株先导单域抗体。

表1PTK7单域抗体序列编号

抗体编号	氨基酸序列编号	核苷酸序列编号
			MY2132-4-22	SEQ ID NO：1	SEQ ID NO：5
MY2132-4-55	SEQ ID NO：2	SEQ ID NO：6
			MY2132-4-79	SEQ ID NO：3	SEQ ID NO：7
MY2132-5-51	SEQ ID NO：4	SEQ ID NO：8

4株单域抗体的序列如下，三个CDR区分别用下划线标出。

SEQ ID NO：1

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTASGFTFDDYDMVWYRQAPGNEYEWLSTVSRGGNLYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLNMSRVKPEDTAVYYCAADLRSVPSTYRARTCRGRYCRDYWGQGTQVTVSS

SEQ ID NO：2

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYIWSRYCMGWFRQAPGKAREGVARFNSDGNTRYVDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNNLQPEDTARYYCAADPRFDCGYDAVFNPTHFPYWGRGTQVTVSS

SEQ ID NO：3

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYIWSRYCMGWFRQAPGKAREGVARFNSDGNTRYVDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNNLQPEDTARYYCAADPRFDCGYDAVFNPTHFPYWGQGTQVTVSS

SEQ ID NO：4

QVQLQESGGGLVQPGGSLTLACAASGFAFSSYAMRWVRQAPGKGLEGVSSISAGGDETYYADFAKGRFTISRDNAKNTLYLQLNSLKTEDTAMYYCAKGDRNSPRYSSWPITPVGQGTQVTVSS

SEQ ID NO：5

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTACAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACTTTTGATGATTATGACATGGTCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAATGAGTACGAGTGGCTCTCAACTGTTAGTCGTGGTGGTAATTTATACTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTTAATATGAGCAGAGTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGCGCGGCAGACCTTCGCTCGGTTCCCTCGACGTATCGGGCGAGAACTTGTCGCGGTCGTTACTGCCGCGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO：6

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACATCTGGAGTAGGTACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGCGCGCGAGGGGGTCGCGCGCTTTAATAGTGATGGTAACACAAGGTACGTAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACAACCTGCAACCTGAGGACACTGCCAGGTACTACTGTGCGGCAGATCCTCGCTTCGATTGCGGCTATGACGCCGTGTTTAACCCGACGCACTTTCCTTACTGGGGCCGGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO：7

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACATCTGGAGTAGGTACTGCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGCGCGCGAGGGGGTCGCGCGCTTTAATAGTGATGGTAACACAAGGTACGTAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACAACCTGCAACCTGAGGACACTGCCAGGTACTACTGTGCGGCAGATCCTCGCTTCGATTGCGGCTATGACGCCGTGTTTAACCCGACGCACTTTCCTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO：8

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGACACTCGCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCCTTCAGTAGCTATGCCATGCGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTCGAGGGGGTCTCAAGTATTAGTGCTGGTGGTGATGAAACATACTATGCAGACTTCGCGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAATACGCTGTATTTGCAGCTGAACAGCCTGAAAACTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAAGGGGGATCGTAACTCCCCCAGATACAGTAGTTGGCCCATCACACCCGTAGGTCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

实施例4：抗PTK7单域抗体与不同种属PTK7的酶联免疫法(ELISA)检测

利用人或鼠种属的PTK7-Fc或恒河猴种属的PTK7-His抗原蛋白包备酶标板，4℃过夜；第二天用PBS-T洗涤4次，加入1％BSA，室温下封闭2小时；用PBS-T洗涤4次，加入按梯度稀释的抗PTK7单域抗体，37℃放置1小时；用PBS-T洗涤4次，加入鼠抗His-HRP抗体或鼠抗HA-HRP抗体，37℃放置1小时；用PBS-T洗涤4次，加入TMB可溶性底物，室温下放置10分钟；在450nm波长读取吸收值，根据吸收值计算各单域抗体Kd值。

检测结果如表2所示，本发明的抗PTK7单域抗体可与人,鼠或恒河猴PTK7结合。

表2抗PTK7单域抗体ELISA结果

实施例5：抗PTK7单域抗体与人PTK7的蛋白结合动力学(Biacore 8K)检测

利用羧基氨基反应将固定相人PTK7-Fc抗原蛋白固定在CM-5传感芯片表面；将抗PTK7单域抗体用HBS缓冲液稀释成不同浓度，以30ul/分钟流速加入抗PTK7单域抗体，结合90s和解离600s，观察抗PTK7单域抗体与抗原结合过程；用10mM Glycine冲洗进行芯片再生，进行下一个抗PTK7单域抗体测定时。

检测结果如表3所示，本发明的抗PTK7单域抗体与PTK7-Fc蛋白的结合能够达到0.18～3.45nM。

表3抗PTK7单域抗体Biacore 8K结果

抗体编号	<![CDATA[K<sub>on</sub>(1/Ms)]]>	<![CDATA[K<sub>off</sub>(1/s)]]>	Kd(nM)
				MY2132-4-22	1.51E+07	3.22E-02	2.13
MY2132-4-55	1.76E+06	3.14E-04	0.18
				MY2132-4-79	1.64E+06	3.58E-04	0.22
MY2132-5-51	4.82E+05	1.66E-03	3.45

实施例6：抗PTK7单域抗体与人PTK7表位鉴定分组的ELISA检测

利用不同抗PTK7单域抗体包备酶标板，4℃过夜；第二天用PBS-T洗涤4次，加入13％BSA，室温下封闭1小时；用PBS-T洗涤5次，加入人PTK7-Fc和抗PTK7单域抗体，37℃放置1小时；加入抗人Fc-HRP抗体，37℃放置1小时；用PBS-T洗涤5次，加入TMB可溶性底物，室温下放置2分钟；在450nm波长读取吸收值，根据吸收值计算各单域抗体竞争结果。

检测结果如表5所示，本发明的抗PTK7单域抗体按结合表位能分成2组，其中MY2132-4-22为组1,MY2132-4-55、MY2132-4-79和MY2132-5-51为组2。

表4抗PTK7单域抗体表位鉴定ELISA结果

抗体编号	MY2132-4-22	MY2132-4-55	MY2132-4-79	MY2132-5-51	结论
						MY2132-4-22	竞争	非竞争	非竞争	非竞争	1
MY2132-4-55	非竞争	竞争	竞争	竞争	2
						MY2132-4-79	非竞争	竞争	竞争	竞争	2
MY2132-5-51	非竞争	竞争	竞争	竞争	2

实施例7：抗PTK7单域抗体与肿瘤细胞的流式细胞分析术(FACS)检测

利用高表达PTK7的肿瘤细胞HCT116进行抗体结合功能验证：将培养的BxPc3细胞用胰酶消化并用完全培养基中和后，用PBS洗涤细胞一次，然后收集细胞；平均分装至96孔板中，加入人Fc阻断抗体，4℃孵育15分钟；离心后用PBS洗涤细胞一次，加入抗PTK7单域抗体或非靶向单域抗体(阴性对照)，4℃孵育30分钟；离心后用PBS洗涤细胞一次，再加入anti-HA-Alexa Fluor488或鼠抗PTK7-FITC抗体(阳性对照)，4℃孵育20分钟；用PBS洗涤一次细胞后，4℃离心5分钟，弃上清，加入200ul PBS重悬细胞，流式检测每个样本AlexaFluor488信号。

结果如图3所示，本发明的抗PTK7单域抗体能够有效结合肿瘤细胞表面的PTK7蛋白。

实施例8：抗PTK7单域抗体在小鼠肿瘤异种移植模型的SPECT/CT显像

在三羰基试剂盒，加入高锝酸盐，99℃孵育20分钟；冷却试剂瓶至室温，加入盐酸，中和三羰基锝至pH7-7.5；加入抗PTK7单域抗体，37℃孵育1小时；用薄层色谱法对锝标记抗PTK7单域抗体进行放射纯度鉴定。

在祼鼠右侧背部皮下接种1×10⁷个PTK7高表达(HCT116)细胞，待肿瘤长至150-200mm³用于正式实验研究；通过异氟烷麻醉荷瘤鼠，尾静脉注射锝标记抗PTK7单域抗体(～10ug,37MBq)；给药后90分钟进行扫描，采集方式为静态15分钟SPECT、中分辨率全身CT。

本发明的抗PTK7单域抗体能够于PTK7高表达肿瘤模型有效积聚，应用于PTK7靶向的癌症诊断及疗效评估，同时开发新一代PTK7靶向治疗。

本发明的氨基酸序列

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 和迈生物科技有限公司

<120> 抗PTK7单域抗体及其应用

<130> P2021-1822

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 130

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Asp Met Val Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Tyr Glu Trp Leu

35 40 45

Ser Thr Val Ser Arg Gly Gly Asn Leu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Asn Met Ser Arg Val Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Asp Leu Arg Ser Val Pro Ser Thr Tyr Arg Ala Arg Thr Cys Arg

100 105 110

Gly Arg Tyr Cys Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 2

<211> 127

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Trp Ser Arg Tyr

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Arg Phe Asn Ser Asp Gly Asn Thr Arg Tyr Val Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Asp Pro Arg Phe Asp Cys Gly Tyr Asp Ala Val Phe Asn Pro Thr

100 105 110

His Phe Pro Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 127

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Trp Ser Arg Tyr

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Arg Phe Asn Ser Asp Gly Asn Thr Arg Tyr Val Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Asp Pro Arg Phe Asp Cys Gly Tyr Asp Ala Val Phe Asn Pro Thr

100 105 110

His Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 4

<211> 124

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ala Gly Gly Asp Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Phe Ala

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Asp Arg Asn Ser Pro Arg Tyr Ser Ser Trp Pro Ile Thr

100 105 110

Pro Val Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 390

<212> DNA

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 5

caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtacagg ctggagggtc tctgagactc 60

tcctgtacag cctctggatt cacttttgat gattatgaca tggtctggta ccgccaggct 120

ccagggaatg agtacgagtg gctctcaact gttagtcgtg gtggtaattt atactatgca 180

gactctgtga agggccgatt caccatctcc cgagacaacg ccaagaacac ggtgtatctt 240

aatatgagca gagtgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actgcgcggc agaccttcgc 300

tcggttccct cgacgtatcg ggcgagaact tgtcgcggtc gttactgccg cgactactgg 360

ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 390

<210> 6

<211> 381

<212> DNA

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 6

caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggata catctggagt aggtactgca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg cgcgcgaggg ggtcgcgcgc tttaatagtg atggtaacac aaggtacgta 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc cgagacaacg ccaagaacac tctgtatctg 240

caaatgaaca acctgcaacc tgaggacact gccaggtact actgtgcggc agatcctcgc 300

ttcgattgcg gctatgacgc cgtgtttaac ccgacgcact ttccttactg gggccggggg 360

acccaggtca ccgtctcctc a 381

<210> 7

<211> 381

<212> DNA

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 7

caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggata catctggagt aggtactgca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg cgcgcgaggg ggtcgcgcgc tttaatagtg atggtaacac aaggtacgta 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc cgagacaacg ccaagaacac tctgtatctg 240

caaatgaaca acctgcaacc tgaggacact gccaggtact actgtgcggc agatcctcgc 300

ttcgattgcg gctatgacgc cgtgtttaac ccgacgcact ttccttactg gggccagggg 360

acccaggtca ccgtctcctc a 381

<210> 8

<211> 372

<212> DNA

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 8

caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgacactc 60

gcctgtgcag cctctggatt cgccttcagt agctatgcca tgcgctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gactcgaggg ggtctcaagt attagtgctg gtggtgatga aacatactat 180

gcagacttcg cgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa tacgctgtat 240

ttgcagctga acagcctgaa aactgaggac acggccatgt attactgtgc aaagggggat 300

cgtaactccc ccagatacag tagttggccc atcacacccg taggtcaggg gacccaggtc 360

accgtctcct ca 372

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 9

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Asp Met Val

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 10

Gly Tyr Ile Trp Ser Arg Tyr Cys Met Gly

1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 11

Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Ala Met Arg

1 5 10

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 12

Thr Val Ser Arg Gly Gly Asn

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 13

Arg Phe Asn Ser Asp Gly Asn

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 14

Ser Ile Ser Ala Gly Gly Asp Glu

1 5

<210> 15

<211> 24

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 15

Ala Ala Asp Leu Arg Ser Val Pro Ser Thr Tyr Arg Ala Arg Thr Cys

1 5 10 15

Arg Gly Arg Tyr Cys Arg Asp Tyr

20

<210> 16

<211> 21

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 16

Ala Ala Asp Pro Arg Phe Asp Cys Gly Tyr Asp Ala Val Phe Asn Pro

1 5 10 15

Thr His Phe Pro Tyr

20

<210> 17

<211> 24

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 17

Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Pro Arg Phe Asp Cys Gly Tyr Asp Ala Val

1 5 10 15

Phe Asn Pro Thr His Phe Pro Tyr

20

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 18

Ala Lys Gly Asp Arg Asn Ser Pro Arg Tyr Ser Ser Trp Pro Ile Thr

1 5 10 15

Pro

<210> 19

<211> 25

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 19

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser

20 25

<210> 20

<211> 25

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 20

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 21

<211> 25

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ala Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 22

<211> 14

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 22

Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Tyr Glu Trp Leu Ser

1 5 10

<210> 23

<211> 14

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 23

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Gly Val Ala

1 5 10

<210> 24

<211> 14

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 24

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ser

1 5 10

<210> 25

<211> 39

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 25

Leu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

1 5 10 15

Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Asn Met Ser Arg Val Lys Pro Glu

20 25 30

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 26

<211> 39

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 26

Thr Arg Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

1 5 10 15

Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Gln Pro Glu

20 25 30

Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys

35

<210> 27

<211> 36

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 27

Thr Arg Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

1 5 10 15

Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Gln Pro Glu

20 25 30

Asp Thr Ala Arg

35

<210> 28

<211> 39

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 28

Thr Tyr Tyr Ala Asp Phe Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

1 5 10 15

Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu

20 25 30

Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 29

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 30

Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 31

<211> 11

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 31

Val Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

Claims

1.一种抗PTK7单域抗体VHH链的互补决定区CDR，其特征在于，所述VHH链的互补决定区CDR包含：

SEQ ID NO:9-11所示的CDR1；

SEQ ID NO:12-14所示的CDR2；和

SEQ ID NO:15-18所示的CDR3。

2.一种抗PTK7单域抗体的VHH链，所述VHH链包括框架区FR和权利要求1所述的互补决定区CDR。

3.一种抗PTK7单域抗体，其特征在于，所述单域抗体是针对PTK7蛋白的单域抗体，并且具有如SEQ ID NO:1-4任一所示的氨基酸序列的VHH链。

4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：权利要求1所述的CDR区、权利要求2所述的抗PTK7单域抗体的VHH链、或权利要求3所述的抗PTK7单域抗体。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。

7.一种产生抗PTK7单域抗体的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在适合产生单域抗体的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞，从而获得含所述抗PTK7单域抗体的培养物；以及(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗PTK7单域抗体。

8.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：

(a)如权利要求2所述的抗PTK7单域抗体的VHH链、或如权利要求3所述的抗PTK7单域抗体；和(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

9.如权利要求2所述的VHH链，如权利要求3所述的抗PTK7单域抗体，或如权利要求8所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备(a)用于检测PTK7分子的试剂；(b)用于治疗肿瘤的药物。

10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：(i)如权利要求3所述的单域抗体或如权利要求8所述的免疫偶联物；和(ii)药学上可接受的载体。