CN101939028A - 针对蛋白酪氨酸激酶7(ptk7)的单克隆抗体伴侣分子偶联物 - Google Patents

针对蛋白酪氨酸激酶7(ptk7)的单克隆抗体伴侣分子偶联物 Download PDF

Info

Publication number
CN101939028A
CN101939028A CN200880118641XA CN200880118641A CN101939028A CN 101939028 A CN101939028 A CN 101939028A CN 200880118641X A CN200880118641X A CN 200880118641XA CN 200880118641 A CN200880118641 A CN 200880118641A CN 101939028 A CN101939028 A CN 101939028A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
seq
sequence
variable region
ptk7
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200880118641XA
Other languages
English (en)
Inventor
J·A·特雷特
C·潘
C·拉奥-奈克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bristol Myers Squibb Co
ER Squibb and Sons LLC
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of CN101939028A publication Critical patent/CN101939028A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia

Abstract

本发明涉及针对PTK7的抗体-伴侣分子偶联物。还说明了使用该抗体-伴侣分子偶联物来治疗或预防以表达PTK的肿瘤细胞生长为特征的疾病的方法。

Description

针对蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)的单克隆抗体伴侣分子偶联物
背景技术
受体酪氨酸激酶(RTK)是可将细胞外环境的生物信号传递至细胞内部的跨膜信号传导蛋白。RTK信号的调节对于调节细胞生长、分化、轴突生长、上皮生长、发育、粘附、迁移和凋亡都很重要(Prenzel et al.(2001)Endocr.Relat.Cancer 8：11-31；Hubbard and Till(2000)Annu.Rev.Biochem.69：373-98)。已知RTK参与多种形式的癌症的发生和发展。在大多数的RTK相关癌症中都存在受体蛋白的扩增，而不是该基因的突变(Kobus and Fleming(2005)Biochemistry 44：1464-70)。
蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)是受体蛋白酪氨酸激酶家族的一个成员，它最初从正常人黑色素细胞中分离并通过RT-PCR克隆得到(Lee et al.，(1993)Oncogene 8：3403-10；Park et al.，(1996)J.Biochem 119：235-9)。该基因还独立地从人结肠癌来源的细胞系中克隆得到，并被命名为结肠癌激酶4(CCK4)(Mossie et al.(1995)Oncogene 11：2179-84)。PTK7属于缺乏可检测的酪氨酸激酶催化活性、但保留了信号传导活性的RTK亚类，它被认为可能起到细胞粘附分子的作用。
PTK7的mRNA被发现在结肠癌来源的细胞系中不定地表达，但在成人结肠组织中未发现表达(Mossie et al.，见上文)。在某些黑色素瘤细胞系和黑色素瘤活检组织中也发现有PTK7表达(Easty，et al.(1997)Int.J.Cancer 71：1061-5)。在肝细胞瘤和结肠癌细胞中还发现了其另一剪接形式的表达(Jung et al.(2002)Biochim Biophys Acta 1579：153-63)。此外，还发现PTK7在急性髓细胞性白血病样本中高度过量表达(Muller-Tidowet al.，(2004)Clin.Cancer Res.10：1241-9)。如PCT公开文本WO04/17992中所述，借助免疫组织化学方法，在乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌和膀胱癌中均观察到PTK7的肿瘤特异性染色。
因此，需要可识别PTK7的药剂和使用该药剂的方法。
发明内容
本发明提供了可结合PTK7并表现出多种所需特性的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。上述特性包括与人PTK7结合以及与Wilms肿瘤细胞结合的高亲和力。还提供了使用本发明的抗体和组合物治疗多种PTK介导的疾病的方法。
一方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体：
(a)与人PTK7特异性结合，并且
(b)与Wilms肿瘤细胞系(ATCC保藏号CRL-1441)结合。
所述抗体优选地为人类抗体，但在其它实施方案中，所述抗体可以是鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在更优选的实施方案中，所述抗体以等于或小于4.0nM的EC50与Wilms肿瘤细胞结合，或者以等于或小于3.5nM的EC50与Wilms肿瘤细胞结合。
在另一实施方案中，所述抗体与选自下列的癌细胞系结合：A-431(ATCC保藏号CRL-1555)、Saos-2(ATCC保藏号HTB-85)、SKOV-3(ATCC保藏号HTB-77)、PC3(ATCC保藏号CRL-1435)、DMS 114(ATCC保藏号CRL-2066)、ACHN(ATCC保藏号CRL-1611)、LNCaP(ATCC保藏号CRL-1740)、DU 145(ATCC保藏号HTB-81)、LoVo(ATCC保藏号CCL-229)和MIA PaCa-2(ATCC保藏号CRL-1420)细胞系。
在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体交叉竞争结合PTK7上可被参考抗体识别的表位，其中所述参考抗体：
(a)与人PTK7特异性结合，并且
(b)与Wilms肿瘤细胞系(ATCC保藏号CRL-1441)结合。
在不同实施方案中，所述参考抗体包括：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的重链可变区；和
(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：5的轻链可变区；
或者，所述参考抗体包括：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的重链可变区；和
(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：6的轻链可变区；
或者，所述参考抗体包括：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的重链可变区；和
(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的轻链可变区；
或者，所述参考抗体包括：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：3的重链可变区；和
(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的轻链可变区；
或者，所述参考抗体包括：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：3的重链可变区；和
(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：9的轻链可变区；
或者，所述参考抗体包括：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的重链可变区；和
(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的轻链可变区。
在一方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括作为人VH 3-30.3基因的产物或来自该基因的重链可变区，其中所述抗体与PTK7特异性结合。本发明还提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括作为人VH DP44基因的产物或来自该基因的重链可变区，其中所述抗体与PTK7特异性结合。本发明还提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括作为人VH 3-33基因的产物或来自该基因的重链可变区，其中所述抗体与PTK7特异性结合。本发明还提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括作为人Vk L15基因的产物或来自该基因的轻链可变区，其中所述抗体与PTK7特异性结合。本发明还提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括作为人Vk A10基因的产物或来自该基因的轻链可变区，其中所述抗体与PTK7特异性结合。本发明还提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括作为人Vk A27基因的产物或来自该基因的轻链可变区，其中所述抗体与PTK7特异性结合。本发明还提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括作为人Vk L6基因的产物或来自该基因的轻链可变区，其中所述抗体与PTK7特异性结合。
一种优选的组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：11的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：15的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：19的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：23的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：29的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：35的轻链可变区CDR3。
另一优选的组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：11的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：15的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：19的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：24的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：30的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：36的轻链可变区CDR3。
另一优选的组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：12的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：20的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：25的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：31的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：37的轻链可变区CDR3。
另一优选的组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：13的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：17的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：21的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：26的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：32的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：38的轻链可变区CDR3。
另一优选的组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：13的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：17的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：21的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：27的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：33的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：39的轻链可变区CDR3。
另一优选的组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：14的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：18的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：22的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：28的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：34的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：40的轻链可变区CDR3。
本发明的其它优选抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的重链可变区；和
(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：5的轻链可变区。
另一优选的组合包括：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的重链可变区；和
(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：6的轻链可变区。
另一优选的组合包括：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的重链可变区；和
(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的轻链可变区。
另一优选的组合包括：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：3的重链可变区；和
(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的轻链可变区。
另一优选的组合包括：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：3的重链可变区；和
(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：9的轻链可变区。
另一优选的组合包括：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的重链可变区；和
(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的轻链可变区。
本发明的抗体可以是例如全长抗体(例如IgG1或IgG4同种型)。作为替代，所述抗体也可以是例如Fab或Fab’2片段的抗体片段，或单链抗体。
本发明还提供一种抗体-伴侣分子偶联物(antibody-partner moleculeconjugate)，所述偶联物包含与治疗剂(例如细胞毒素或放射性同位素)相连的本发明抗体或其抗原结合部分。在特别优选的实施方案中，本发明提供一种抗体-伴侣分子偶联物，所述偶联物包含(例如经巯基连接)与化合物N(图28)相连的本发明的抗体或其抗原结合部分。例如，在各个实施方案中，本发明提供以下优选的抗体-伴侣分子偶联物：
(i)包含抗体或其抗原结合部分的抗体-伴侣分子偶联物，所述抗体或其抗原结合部分包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的轻链可变区，其中所述抗体或抗原结合部分与化合物N(图28)相连，该化合物在美国专利申请No.60/882,461中有详细论述，该申请通过引用的方式全文纳入本文；
(ii)包含与化合物N(图28)相连的如下抗体或其抗原结合部分的抗体-伴侣分子偶联物，所述抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包含SEQ ID NO：14的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：18的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：22的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：28的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：34的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：40的轻链可变区CDR3。
在一个具体的实施方案中，所述抗体-伴侣分子偶联物的所述抗体或其抗原结合部分具有包括以下序列分别所示的氨基酸序列的重链和轻链可变区：SEQ ID NO：4和10，SEQ ID NO：1和5，SEQ ID NO：1和6，SEQID NO：2和7，SEQ ID NO：3和8，或SEQ ID NO：3和9。
本发明还提供这样的抗体-伴侣分子偶联物，其中所述抗体可结合与被本发明的任何抗体结合的表位相同或与其重叠的表位。例如，在一个实施方案中，所述抗体-伴侣分子偶联物的所述抗体或其抗原结合部分可结合被参考抗体(例如交叉竞争)识别的PTK-7上的表位，所述参考抗体具有以下序列分别所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：4和10，SEQ IDNO：1和5，SEQ ID NO：1和6，SEQ ID NO：2和7，SEQ ID NO：3和8，或SEQ ID NO：3和9。
本发明的抗体-伴侣分子偶联物可经由例如本申请通篇所描述的以及本领域已知的多种连接物(linker)相连。在一个实施方案中，所述伴侣分子经由化学连接物(即，巯基连接物、肽基连接物、肼连接物或二硫化物连接物)与抗体偶联。
另一方面，本发明提供了编码本发明的前述抗体-伴侣分子偶联物的所述抗体(或其抗原结合部分)的分离的核酸，以及表达载体和宿主细胞。
如本申请通篇所述，本发明的抗体-伴侣分子偶联物可用于许多种诊断和治疗应用。例如，可将有效量的本发明的抗体-伴侣分子偶联物给予受试者以治疗或预防一种疾病(例如一种癌症)，所述疾病以表达PTK7的肿瘤细胞生长为特征。可治疗或预防的癌症包括但不限于：结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、急性髓样白血病、肾癌、膀胱癌、卵巢癌和前列腺癌。
本发明还提供包括本发明的抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，所述抗体或其抗原结合部分与具有不同于该抗体或其抗原结合部分的结合特异性的第二功能部分相连。
还提供了含有本发明的抗体或其抗原结合部分或免疫偶联物或双特异性分子以及药学可接受的载体的组合物。
本发明还提供了以高亲和力与PTK7特异性结合的分离的抗PTK7抗体-伴侣分子偶联物，特别是包含人单克隆抗体的那些偶联物。这类抗体-伴侣分子偶联物中的某些偶联物能被内化至表达PTK7的细胞中，并且能介导抗原依赖性细胞毒性。本发明还提供了使用本文公开的抗PTK7抗体-伴侣分子偶联物治疗癌症的方法，所述癌症例如是间皮瘤、直肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、急性髓样白血病、肾癌、膀胱癌、卵巢癌和前列腺癌。
还提供了含有本文公开的与伴侣分子偶联的抗体或其抗原结合部分的组合物。在本文公开的抗体伴侣分子偶联物中，可与抗体有利偶联的伴侣分子包括但不限于，药物分子、毒素、标记分子(例如放射性同位素)、蛋白质和治疗剂。本文还公开了含有抗体-伴侣分子偶联物和药学可接受的载体的组合物。
在一方面，这类抗体-伴侣分子偶联物经由化学连接物偶联。在某些实施方案中，所述连接物为肽基连接物，它在本文中以(L4)p-F-(L1)m表示。其它连接物包括肼和二硫化物连接物，它们在本文中分别以(L4)p-H-(L1)m或(L4)p-J-(L1)m表示。除与伴侣分子连接的连接物外，本发明还提供了适于与基本上任何分子种类连接的可裂解连接臂。
本发明还包括编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及含有该核酸的表达载体和含有该表达载体的宿主细胞。此外，本发明还提供了包含人类免疫球蛋白重链和轻链转基因的转基因小鼠，其中所述小鼠表达本发明的抗体，以及由该小鼠制备的杂交瘤，其中所述杂交瘤可产生本发明的抗体。
在另一方面，本发明提供了一种治疗或预防以表达PTK7的肿瘤细胞生长为特征的疾病的方法，包括将有效量的本发明抗体或其抗原结合部分给予受试者以治疗或预防该疾病。所述疾病可以是例如癌症，例如结肠癌(包括小肠癌)、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤)、急性髓样白血病、肾癌、膀胱癌、卵巢癌和前列腺癌。
在一个优选的实施方案中，本发明提供一种使用抗PTK7抗体体内治疗癌症的方法。所述抗PTK7抗体可以是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。可使用本发明的方法治疗的其它癌症的实例包括肾癌(例如肾细胞癌)、成胶质细胞瘤、脑瘤、慢性或急性白血病(包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、慢性髓样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、淋巴瘤(例如，何杰金氏(Hodgkin)和非何杰金氏淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特(Burkitt)淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large-cell lymphomas，ALCL)、皮肤T淋巴细胞瘤、结节状小分裂细胞淋巴瘤(nodular small cleaved-celllymphomas)、周围T细胞淋巴瘤、伦南德氏淋巴瘤(Lennert′slymphomas)、免疫母细胞性淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、中心母细胞性/中心细胞性(cb/cc)滤泡性淋巴瘤(entroblastic/centrocytic(cb/cc)follicular lymphomas cancers)、B谱系弥散性大细胞淋巴瘤(diffuselarge cell lymphomas of B lineage)、血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤和HIV相关的基于体腔的淋巴瘤)、胚胎性癌、未分化的鼻咽癌(例如施明克氏(Schmincke)瘤)、卡斯尔曼氏(Castleman)病、卡波济氏(Kaposi)肉瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症和其它B细胞淋巴瘤、鼻咽癌、骨癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、直肠癌、肛区癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴门癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、肿瘤血管发生、脊椎肿瘤(spinal axis tumor)、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、表皮样癌症、鳞状细胞癌、包括那些由石棉诱发的环境诱发性癌症(例如间皮瘤)，以及所述癌症的组合。
本发明的其它特征和优点从下文的详述和实施例中将会明显看出，该详述和实施例不应解释为对本发明的限制。本申请通篇引用的所有的文献、Genbank登记号、专利和公开的专利申请均通过引用的方式明确地纳入本文。
附图说明
图1A示出了3G8和3G8a人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：41)和氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。标出了CDR1(SEQ IDNO：11)、CDR2(SEQ ID NO：15)和CDR3(SEQ ID NO：19)区域，并指明了V、D和J种系来源。
图1B示出了3G8人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：45)和氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。标出了CDR1(SEQ ID NO：23)、CDR2(SEQ ID NO：29)和CDR3(SEQ ID NO：35)区域，并指明了V和J种系来源。
图1C示出了3G8a人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：46)和氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。标出了CDR1(SEQ ID NO：24)、CDR2(SEQ ID NO：30)和CDR3(SEQ ID NO：36)区域，并指明了V和J种系来源。
图2A示出了4D5人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：42)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。标出了CDR1(SEQ ID NO：12)、CDR2(SEQ ID NO：16)和CDR3(SEQ ID NO：20)区域，并指明了V、D和J种系来源。
图2B示出了4D5人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：47)和氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。标出了CDR1(SEQ ID NO：25)、CDR2(SEQ ID NO：31)和CDR3(SEQ ID NO：37)区域，并指明了V和J种系来源。
图3A示出了12C6人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：43)和氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。标出了CDR1(SEQ ID NO：13)、CDR2(SEQ ID NO：17)和CDR3(SEQ ID NO：21)区域，并指明了V、D和J种系来源。
图3B示出了12C6人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：48)和氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。标出了CDR1(SEQ ID NO：26)、CDR2(SEQ ID NO：32)和CDR3(SEQ ID NO：38)区域，并指明了V和J种系来源。
图3C示出了12C6a人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：49)和氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。标出了CDR1(SEQ ID NO：27)、CDR2(SEQ ID NO：33)和CDR3(SEQ ID NO：39)区域，并指明了V和J种系来源。
图4A示出了7C8人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：44)和氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。标出了CDR1(SEQ ID NO：14)、CDR2(SEQ ID NO：18)和CDR3(SEQ ID NO：22)区域，并指明了V、D和J种系来源。
图4B示出了7C8人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：50)和氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。标出了CDR1(SEQ ID NO：28)、CDR2(SEQ ID NO：34)和CDR3(SEQ ID NO：40)区域，并指明了V和J种系来源。
图5示出了3G8(SEQ ID NO：1)和3G8a(SEQ ID NO：1)重链可变区的氨基酸序列与人种系VH 3-30.3氨基酸序列(SEQ ID NO：51)(如SEQID NO：59公开的JH4b种系)的比对。
图6示出了4D5重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)与人种系VH 3-30.3氨基酸序列(SEQ ID NO：51)(如SEQ ID NO：60公开的JH4b种系)的比对。
图7示出了12C6(SEQ ID NO：3)和12C6a(SEQ ID NO：2)重链可变区的氨基酸序列与人种系VH DP44氨基酸序列(SEQ ID NO：52)(如SEQ ID NO 61-63分别公开的3-7、3-23和JH4b种系)的比对。
图8示出了7C8重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)与人种系VH 3-33氨基酸序列(SEQ ID NO：53)(如SEQ ID NO：64公开的JH6b种系)的比对。
图9示出了3G8(SEQ ID NO：5)和3G8a(SEQ ID NO：6)轻链可变区的氨基酸序列与人种系Vk L15氨基酸序列(SEQ ID NO：54)(如SEQID NO：65公开的JK1种系)的比对。
图10示出了4D5轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)与人种系Vk A10氨基酸序列(SEQ ID NO：55)(如SEQ ID NO：66公开的JK5种系)的比对。
图11示出了12C6轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)与人种系Vk A27氨基酸序列(SEQ ID NO：56)(如SEQ ID NO：67公开的JK2种系)的比对。
图12示出了12C6a轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)与人种系Vk L15氨基酸序列(SEQ ID NO：54)(如SEQ ID NO：68公开的JK2种系)的比对。
图13示出了7C8轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)与人种系Vk L6氨基酸序列(SEQ ID NO：57)(如SEQ ID NO：69公开的JK3种系)的比对。
图14示出了流式细胞术实验的结果，该结果证明针对人PTK7的人单克隆抗体7C8与全长人PTK7转染的HEK3细胞的细胞表面结合。
图15示出了ELSIA实验的结果，该结果证明针对人PTK7的人单克隆抗体特异性结合PTK7。
图16示出了流式细胞术实验的结果，该结果证明针对人PTK7的抗体与Wilms肿瘤细胞的细胞表面结合。
图17示出了流式细胞术实验的结果，该结果证明针对人PTK7的抗体与多种癌细胞系的细胞表面结合。
图18示出了流式细胞术实验的结果，该结果证明针对人PTK7的抗体与树突细胞的细胞表面结合。
图19示出了流式细胞术实验的结果，该结果证明针对人PTK7的抗体与CD4+和CD8+T淋巴细胞结合，但不与B淋巴细胞结合。
图20示出了Hum-Zap内化实验的结果，该结果证明针对人PTK7的人单克隆抗体可内化至PTK7+细胞中。(A)人抗体3G8、4D5和7C8内化至Wilms肿瘤细胞中。(B)人抗体12C6内化至Wilms’肿瘤细胞中。(C)人类抗体7C8和12C6内化至A-431肿瘤细胞中。(D)人抗体7C8和12C6内化至PC3肿瘤细胞中。
图21示出了细胞增殖测定的结果，该结果证明毒素偶联的人单克隆抗PTK7抗体可杀伤人肾癌细胞系。
图22示出了细胞增殖测定的结果，该结果证明毒素偶联的人单克隆抗PTK7抗体可杀伤表达低水平至高水平PTK7的细胞系。
图23示出了侵袭测定的结果，该结果证明抗PTK7抗体抑制细胞表面表达PTK7的细胞的侵袭活动。
图24示出了在体内异种移植模型中，偶联有毒素的抗PTK7抗体减缓了胰腺肿瘤的发展进程。
图25示出了在体内异种移植模型中，偶联有毒素的抗PTK7抗体减缓了乳腺癌的发展进程。
图26A和26B为示出使用7C8-式(m)偶联物使体内模型中上皮来源的A431和小细胞肺来源的DMS79肿瘤减小的图示。在图26A，测量了仅用载体、用未修饰的同种型匹配的对照抗体、同种型匹配的式(m)偶联物和7C8-式(m)处理的小鼠体内的肿瘤体积中位数。图26B表明7C8-式(m)处理可导致SCID小鼠体内的DMS79小细胞肺癌肿瘤完全消退。
图27为表明在SCID异种移植小鼠体内模型中，7C8-式(m)偶联物不导致体重显著减轻的图示。
图28为式(m)的化学结构图。
发明详述
在一方面，本发明涉及一种分离的特异性结合PTK7的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体具有一或多种所需的功能性质，例如以高亲和力结合PTK7和/或能够在体内或体外抑制肿瘤细胞的生长。在某些实施方案中，本发明的抗体来源于特定的重链和轻链种系序列和/或包含特定的结构特征，例如含有特定氨基酸序列的CDR区域。本发明提供了分离的抗体、制备这类抗体的方法、包含这类抗体的免疫偶联物和双特异性分子和包括本发明的抗体、免疫偶联物或双特异性分子的药物组合物。本发明还涉及使用所述抗体来例如治疗疾病例如癌症的方法。
为了可以更容易理解本发明，首先对一些术语进行定义。其它定义则在整个详述中阐明。
术语“PTK7”和“CCK4”在本文中可以互换使用，包括人PTK7的变体、同种型和物种同系物。因此，本发明的人抗体在一些情况下可以与来自人之外的其它物种的PTK7交叉反应。在某些实施方案中，这些抗体可以对一种或更多种人PTK7具有完全特异性，并且可能不显示非人类交叉反应性的物种或其它类型。示例性的人PTK7的完整氨基酸序列为Genbank编号为NM_002821的氨基酸序列(SEQ IDNO：58)。
术语“免疫应答”指的是诸如淋巴细胞、抗原递呈细胞、吞噬细胞、粒细胞和由以上细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，该作用可导致侵入性病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或者(在自身免疫或病理炎症情况下)正常的人细胞或组织的选择性损害、破坏或从人体清除。
“信号转导途径”指的是各种负责将信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分的信号转导分子之间的生物化学关系。在本文中所使用的术语“细胞表面受体”包括例如能够接受信号并将该信号穿过细胞的质膜传递的分子和分子的复合物。本发明中“细胞表面受体”的一个实例是PTK7受体。
在本文中使用的术语“抗体”包括完整的抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”指的是包含以二硫键互相连接的至少两条重链(H链)和两条轻链(L链)的糖蛋白或其抗原结合部分。每一条重链都包括重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。该重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每一条轻链都包括轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。该轻链恒定区包含一个结构域，CL.VH和VL区域还可再细分为具有超变性的多个区，被称为互补决定区(CDR)，其间散布有更为保守的被称为框架区(FR)的多个区域。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR构成，按照以下序列从氨基端至羧基端排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的这些可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主的组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q))的结合。
本文中所使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)指的是保留了与抗原(例如PTK7)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已经证实抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实现。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，即包括由一个二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab’片段：它实质上是带有一部分铰链区的Fab片段(参见FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul ed.，3rd ed.1993)；(iv)由VH和CH1结构域构成的Fd片段；(v)由抗体的一个臂的VL和VH结构域构成的Fv片段；(vi)由VH结构域构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vii)分离的互补决定区(CDR)；和(viii)纳米抗体(nanobody)，即含有一个可变域和两个恒定域的重链可变区。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由分离的基因编码的，但是可以使用重组方法经由合成连接物将它们连接起来，使它们能够形成单蛋白链，其中VL和VH区域配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。术语抗体的“抗原结合部分”也意在涵盖这类单链抗体。这些抗体片段可通过使用本领域技术人员已知的常规方法获得，并且可以筛选这些片段从而能够以与完整抗体相同的方式应用它们。
本文中使用的术语“分离的抗体”意指一种抗体，它基本上没有其它的具有不同抗原特异性的抗体(例如，特异性结合PTK7的分离的抗体基本上没有特异性结合PTK7之外的其它抗原的抗体)。然而，特异性结合PTK7的分离的抗体对于其它抗原，例如来自其它物种的PTK7分子，可具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本上没有其它细胞材料和/或化学物质。
本文中所使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指的是具有单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物对于特定表位显示单一的结合特异性和亲和力。
本文中所使用的术语“人抗体”意在包括这样一类抗体：它的可变区中的框架区和CDR区均来自人类种系免疫球蛋白序列。此外，如果该抗体包含恒定区，则该恒定区也来自人类种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包含不是由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由体外随机诱变或定点诱变引入的突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，此处使用的术语“人抗体”并非旨在包括以下抗体：其中来自另一哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人框架区序列上。
术语“人单克隆抗体”是指显示出单一结合特异性的抗体，该抗体具有的可变区中的框架区和CDR区均来自人类种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，该人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括与无限增殖化细胞融合的由具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(例如转基因小鼠)得到的B细胞。
本文中所使用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如：(a)从含有人类免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)中分离的抗体或从上述转基因动物制备的杂交瘤中分离的抗体(下文将进一步说明)；(b)从被转染而能表达人抗体的宿主细胞(例如转染瘤)分离的抗体；(c)从重组的组合人抗体文库分离的抗体；以及(d)通过任何包括将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的其它方法制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体的可变区中的框架区和CDR区均来源于人类种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，这类重组人抗体也可能经过体外诱变(或者当使用含有人类Ig序列的转基因动物时为体内体细胞诱变)，这样，所述重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列虽然来源于人类种系VH和VL序列并与人类种系VH和VL序列相关，但并不天然存在于体内人抗体种系所有组成成分(repertoire)之中。
此处使用的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”此处可以与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
术语“人抗体衍生物”指的是人抗体的任何经修饰的形式，例如，所述抗体与另一试剂或抗体的偶联物。
术语“人源化抗体”是指以下抗体，其中来自另一哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人框架区序列上。可以在人框架区序列中进行额外的框架区修饰。
术语“嵌合抗体”是指以下抗体，其中的可变区序列来自一个物种而恒定区序列来自另一物种，例如其中的可变区序列来自小鼠抗体而恒定区序列来自人抗体的抗体。
术语“抗体模拟物”是指能够模拟抗体与抗原结合的能力，但并不限于天然抗体结构的分子。此类抗体模拟物的实例包括但不限于Affibodies、DARPins、Anticalins、Avimers和Versabodies，所有这些抗体模拟物均采用在模拟常规抗体结合时产生于不同的机理并经由这些机理起作用的结合结构。
本文中所使用的术语“伴侣分子”是指在抗体-伴侣分子偶联物中与抗体偶联的实体。伴侣分子的实例包括药物、细胞毒素、标记分子(包括但不限于肽和小分子标记物如荧光染料标记物，以及单原子标记物如放射性同位素)、蛋白质和治疗剂。
此处使用的“特异性结合人PTK7”的抗体是指以1×10-7或更小，更优选为5×10-8M或更小，更优选为1×10-8M或更小，更优选为5×10-9M或更小的KD结合人PTK7的抗体。
本文中所使用的术语“基本上不结合”蛋白质或细胞是指抗体不与所述蛋白质或细胞结合，或者不以高亲和力结合到蛋白质或细胞上，即，以1×10-6M或更大，更优选为1×10-5M或更大，更优选为1×10-4M或更大，更优选为1×10-3M或更大，甚至更优选为1×10-2M或更大的KD结合到蛋白质或细胞上。
此处使用的术语“Kassoc”或“Ka”意指特定的抗体-抗原相互作用的缔合速率，而此处使用的术语“Kdis”或“Kd，”意指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。此处使用的术语“KD”意指解离常数，它是由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)得到的，并被表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可使用本领域已良好确认的方法测定。测定抗体的KD的优选方法是使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统，如Biacore
Figure GPA00001143083600181
系统。
本文中所使用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指抗体对于靶抗原具有的KD为10-8M或更小，更优选为10-9M或更小，甚至更优选为10-10M或更小。然而，“高亲和力”结合对于其它的抗体同种型可以发生变化。例如，对于IgM同种型的“高亲和力”结合是指抗体具有的KD为10-7M或更小，更优选为10-8M或更小，甚至更优选为10-9M或更小。
此处使用的术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、犬、猫、马、牛、鸡、两栖类、爬行类、等等。
符号“-”在用作表示一个键或表示为与一个键垂直时，都标示出了所显示的部分与分子的其它部分或固体载体等相连接的点的位置。
除非另作说明，术语“烷基”就其自身或作为另一取代基的一部分，是指具有指定的碳原子数(即C1-C10是指一至十个碳原子)的直链或支链，或环烃基团，或其组合，它可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，并且可以包括二价和多价基团。饱和烃基团的实例包括但不限于以下基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、以及例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物或异构体。不饱和烷基是具有一个或多个双键或叁键的基团。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基，以及高级同系物和异构体。除非另作说明，术语“烷基”还应包括将在下面更详细定义的烷基的衍生物，如“杂烷基”。限于烃基的烷基被称为“同烷基(homoalkyl)”。
术语“亚烷基”就其自身或作为另一取代基的一部分时，都表示由烷衍生的二价基团，例如但不限于-CH2CH2CH2CH2-，并且还包括以下描述为“杂亚烷基”的那些基团。通常烷基(或亚烷基)基团应含有1至24个碳原子，但本发明中优选含有10个或更少的碳原子的基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”为链较短的烷基或亚烷基，通常含有8个或更少的碳原子。
除非另作说明，术语“杂烷基”就其自身或与另一术语结合时指的是稳定的直链或支链，或环烃基团，或其组合，由一定数目的碳原子和选自由O、N、Si和S组成的组的至少一个杂原子构成，其中，氮原子、碳原子和硫原子可以任选被氧化，并且氮杂原子可以任选被季铵化。一个或多个杂原子O、N、S和Si可位于杂烷基内部的任何位置，也可以位于烷基与分子的其余部分连接的位置。其实例包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。可以连续有多达两个杂原子，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”就其自身或作为另一取代基的一部分是指由杂烷基衍生的二价基团，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基，杂原子也可占据链末端的任一端或两端(例如，亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷基氨基和亚烷基二氨基等)。术语“杂烷基”和“杂亚烷基”包括聚(乙二醇)及其衍生物(例如，参见Shearwater Polymers Catalog，2001)。进而，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团的分子式的书写方向并不表示连接基团的方向，例如，结构式-C(O)2R’-可以代表-C(O)2R’-和-R’C(O)2-。
与术语“烷基”或“杂烷基”结合的术语“低级”指的是具有1-6个碳原子的部分。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”、“烷基磺酰基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)此处使用它们的常用含义，并且指的是那些与分子的其余部分分别经由氧原子、氨基、SO2基团或硫原子连接的烷基。术语“芳基磺酰基”指的是与分子的其余部分经由SO2基团连接的芳基，术语“巯基”指的是SH基团。
通常，“酰基取代基”也选自上述的基团。本文中所使用的术语“酰基取代基”是指与羰基碳连接并满足其原子价的基团，该羰基碳与本发明的化合物的多环核直接或间接相连。
除非另作说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”就其自身或结合其它术语时分别指的是被取代的或未被取代的“烷基”的环形变体以及被取代的或未被取代的“杂烷基”的环形变体。另外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环与分子其余部分连接处的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基、等等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、等等。环结构的杂原子和碳原子可以任选被氧化。
除非另外指明，术语“卤代”或“卤素”就其自身或作为另一取代基的一部分是指氟、氯、溴或碘原子。另外，术语诸如“卤代烷基”意在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”意在包括但不限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等等。
除非另作说明，术语“芳基”是指被取代的或未被取代的多不饱和芳香族烃取代基，它可为单环或为稠合在一起或共价连接在一起的多环(优选1-3个环)。术语“杂芳基”是指包含一至四个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中，氮原子、碳原子和硫原子可以任选被氧化，并且氮原子可以任选被季铵化。杂芳基可经由杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基(purinyl)、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。以上提到的每一芳基和杂芳基环体系的取代基选自下述的可接受的取代基的组。“芳基”和“杂芳基”也包括以下环体系：其中一个或多个非芳香环体系与芳基或杂芳基体系稠合或另外结合。
简而言之，术语“芳基”在结合其它术语(例如芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)使用时包括如上所述的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”包括芳基与烷基连接的基团(如苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述烷基包括碳原子(如亚甲基)已经被例如氧原子取代的那些烷基(如苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基和3-(1-萘氧基)丙基等)。
以上每一个术语(如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)都包括所指明的基团被取代和未被取代的形式。以下提供每一类型基团的优选取代基。
用于烷基和杂烷基(包括常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基通常分别称为“烷基取代基”和“杂烷基取代基”，它们可以是多种基团中的一个或多个，这些基团选自但不限于：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2，取代基数目的范围从0到(2m’+1)，其中m’是该基团中的碳原子的总数。R’、R”、R”’和R””各自优选独立地表示氢、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基如被1-3个卤素取代的芳基、被取代的或未被取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或者芳基烷基。当本发明的化合物包含多于一个R基团时，例如，这些R基团的每一个均独立地选择，当R’、R”、R”’和R””基团中的每一个存在一个以上时，也同样独立地选择。当R’和R”与同一氮原子相连时，它们可以与氮原子结合以形成5、6或7元环。例如，-NR’R”包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从以上对取代基的讨论，本领域的技术人员可以理解术语“烷基”包括含有与氢基团之外的基团连接的碳原子的基团，例如卤代烷基(如-CF3和-CH2CF3)和酰基(如-C(＝O)CH3、-C(＝O)CF3、-C(＝O)CH2OCH3等)。
类似于对烷基基团说明的取代基，芳基取代基和杂芳基取代基通常分别被称为“芳基取代基”和“杂芳基取代基”，它们变化并选自，例如：卤原子、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)-烷氧基、和氟(C1-C4)烷基，数目的范围从0至该芳环体系上开放价数的总数；其中R’、R”、R”’和R””优选独立地选自氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未被取代的芳基和杂芳基、(未被取代的芳基)-(C1-C4)烷基、和(未被取代的芳基)氧-(C1-C4)烷基。当本发明的化合物包含多于一个R基团时，例如，其中每一个R基团可以独立选择，R’、R”、R”’或R””中的每一个当存在一个以上的这些基团时，也同样独立选择。
在芳基或杂芳基环上的两个相邻原子上的两个芳基取代基可以任选地被结构式为-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代基所代替，其中T和U分别独立地为-NR-、-O-、-CRR’-或单键，q为0至3的整数。或者，在芳基或杂芳基环上的相邻原子上的两个取代基可以任选地被结构式为-A-(CH2)r-B-的取代基所代替，其中A和B分别独立地为-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，r为1至4的整数。这样形成的新环上的一个单键可以任选地被一个双键所代替。或者，在芳基或杂芳基环上的相邻原子上的两个取代基可以任选地被结构式为-(CRR’)s-X-(CR”R”’)d-的取代基所代替，其中s和d分别独立地为0至3的整数，并且X为-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’。所述取代基R、R’、R”和R”’优选地独立地选自氢原子或被取代的或未被取代的(C1-C6)烷基。
此处使用的术语“二磷酸酯”包括但不限于含有两个磷酸基团的磷酸的酯。术语“三磷酸酯”包括但不限于含有三个磷酸基团的磷酸的酯。例如，含有二磷酸酯或三磷酸酯的具体药物包括：
Figure GPA00001143083600231
此处使用的术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。
符号“R”是一通用的缩写，它表示一个取代基，该取代基选自被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基和被取代或未被取代的杂环基。
在以下各部分中详细说明本发明的不同方面。
抗PTK7抗体
本发明抗体的特征在于抗体的特定的功能性特征或性质。例如，所述抗体特异性地结合人PTK7。优选地，本发明的抗体以高亲和力结合人PTK7，例如其KD为1×10-7M或更低。本发明的抗PTK7抗体优选地具有下述特征中的一种或多种：
(a)特异性结合人PTK7；或
(b)结合Wilms肿瘤细胞系(ATCC编号No.CRL-1441)。
优选地，抗体与人PTK7蛋白结合的KD为5×10-8M或更低、与人PTK7蛋白结合的KD为1×10-8M或更低、与人PTK7蛋白结合的KD为5×10-9M或更低、或者与人PTK7蛋白结合的KD为在1×10-8M至1×10-10M之间或更低。优选地，所述抗体与Wilms肿瘤细胞系结合的EC50为4.0nM或更低或与Wilms肿瘤细胞系结合的EC50为3.5nM或更低。评估抗体对PTK7的结合亲和力的标准测试方法是本领域中已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹法和RIA。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域中已知的标准测试方法来评估，例如通过ELISA，Scatchard和Biacore分析。作为另一实例，本发明的抗体可以结合肾癌肿瘤细胞系，例如Wilms肿瘤细胞系。适用于评估上述任一特征的分析方法在实施例中都有详述。
单克隆抗体3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8
优选的本发明抗体为人单克隆抗体3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8，它们如实施例1和2所述进行分离和结构表征。本领域技术人员能够理解，抗体3G8和3G8a具有相同的重链序列而轻链序列不同；同样地，抗体12C6和12C6a也具有相同的重链序列而轻链序列不同，3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8的VH氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1(3G8和3G8a)、2(4D5)、3(12C6和12C6a)和4(7C8)。3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8的VL氨基酸序列分别示于SEQID NO：5、6、7、8、9和10。
由于每一种上述抗体均可结合PTK7，因此可将VH和VL序列进行“混合与匹配”，从而产生本发明的其它的抗PTK7结合分子。可以使用上文以及实施例中所述的结合分析(例如ELISA)来检测这类“混合与匹配”的抗体与PTK7的结合。优选地，当VH和VL链被混合与匹配时，来自某一特定VH/VL对的VH序列被另一结构相似的VH序列代替。类似地，优选地来自某一特定VH/VL对的VL序列被另一结构相似的VL序列代替。
因此，在一方面，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括：
(a)包含选自SEQ ID NO：1、2、3和4的氨基酸序列的重链可变区，和
(b)包含选自SEQ ID NO：5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的轻链可变区；
其中所述抗体特异性结合PTK7，优选地结合人PTK7。
优选的重链和轻链组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的轻链可变区；或
(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区；或
(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQID NO：7的氨基酸序列的轻链可变区；或
(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区；或
(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQID NO：9的氨基酸序列的轻链可变区；或
(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一方面，本发明提供了包含3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合的抗体。3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8的VH CDR1的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：11(3G8和3G8a)、12(4D5)、13(12C6和12C6a)和14(7C8)。3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8的VH CDR2的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：15(3G8和3G8a)、16(4D5)、17(12C6和12C6a)和18(7C8)。3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8的VH CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：19(3G8和3G8a)、20(4D5)、21(12C6和12C6a)和22(7C8)。3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8的Vk CDR1的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：23、24、25、26、27和28。3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8的Vk CDR2的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：29、30、31、32、33和34。3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8的Vk CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：35、36、37、38、39和40。CDR区用Kabat系统进行了标示(Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。
由于上述人抗体的每一种都能够结合PTK7，并且抗原结合特异性主要由CDR1、CDR2和CDR3区域提供，因此VH的CDR1、CDR2和CDR3序列和Vk的CDR1、CDR2和CDR3序列可以被“混合与匹配”(即来源于不同抗体的CDR可以被混合和匹配，尽管每种抗体都必须含有VH CDR1、CDR2和CDR3以及Vk CDR1、CDR2和CDR3)，从而产生本发明的其它的抗PTK7结合分子。可以使用上文及实施例所述的结合分析(例如ELISA、Biacore分析)来检测这类“混合与匹配”的抗体与PTK7的结合。优选地，当VHCDR被混合与匹配时，来自某一特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被另一结构相似的CDR序列代替。类似地，当VkCDR被混合与匹配时，来自某一特定Vk序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选地被另一结构相似的CDR序列代替。对于本领域技术人员显而易见的是，对于单克隆抗体3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8而言，可以通过将一个或多个VH和/或VL CDR区域序列替换为结构相似的来源于本文公开的CDR序列的序列，来产生新的VH和VL序列。
因此，在另一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括：
(a)包含选自SEQ ID NO：11、12、13和14的氨基酸序列的重链可变区CDR1；
(b)包含选自SEQ ID NO：15、16、17和18的氨基酸序列的重链可变区CDR2；
(c)包含选自SEQ ID NO：19、20、21和22的氨基酸序列的重链可变区CDR3；
(d)包含选自SEQ ID NO：23、24、25、26、27和28的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；
(e)包含选自SEQ ID NO：29、30、31、32、33和34的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和
(f)包含选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39和40的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
其中所述抗体特异性结合PTK7，优选地结合人PTK7。
在一个优选的实施方案中，所述抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：11的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：15的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：19的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：23的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：29的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：35的轻链可变区CDR3。
在另一优选的实施方案中，所述抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：11的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：15的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：19的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：24的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：30的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：36的轻链可变区CDR3。
在另一优选的实施方案中，所述抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：12的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：20的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：25的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：31的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：37的轻链可变区CDR3。
在另一优选的实施方案中，所述抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：13的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：17的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：21的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：26的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：32的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：38的轻链可变区CDR3。
在另一优选的实施方案中，所述抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：13的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：17的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：21的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：27的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：33的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：39的轻链可变区CDR3。
在另一优选的实施方案中，所述抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：14的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：18的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：22的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：28的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：34的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：40的轻链可变区CDR3。
在本领域中公知的是，CDR3结构域可以独立于CDR1和/或CDR2结构域而独自决定抗体对于同源抗原的结合特异性，并且多种抗体可以基于共同的CDR3序列而可预期地产生相同的结合特异性。参见例如，Klimka et al.，British J.of Cancer 83(2)：252-260(2000)(描述了仅使用鼠抗CD30抗体Ki-4的重链可变结构域CDR3来产生人源化抗CD30抗体)；Beiboer et al.，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)(描述了仅使用亲代鼠MOC-31抗EGP-2抗体的重链CDR3序列的重组上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗体)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)(描述了使用鼠抗整联蛋白αvβ3抗体LM609的重链和轻链可变CDR3结构域产生一系列的人源化抗整联蛋白αvβ3抗体，其中每一抗体成员在CDR3结构域之外的序列均不相同，但都能与亲代鼠抗体结合相同的表位，并且其结合亲和力与亲代鼠抗体相似或比亲代鼠抗体更高)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)(公开了CDR3结构域对抗原结合的贡献度最大)；Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)(描述了将三个针对人胎盘DNA的Fab(SI-1、SI-40和SI-32)的重链CDR3序列移植到抗破伤风类毒素Fab的重链上，由此替换原先的重链CDR3，并证实了仅有CDR3结构域就能够赋予结合特异性)；以及Ditzel et al.，J.Immunol.157：739-749(1996)(描述了移植研究，其中仅将亲代多特异性Fab LNA3的重链CDR3移植到单特异性IgG破伤风类毒素结合Fab p313抗体的重链上，就足以保留亲代Fab的结合特异性)；Berezov et al.，BIAjournal8：Scientific Review 8(2001)(描述了基于抗HER2单克隆抗体的CDR3的肽模拟物)；Igarashi et al.，J.Biochem(Tokyo)117：452-7(1995)(描述了对应于抗磷脂酰丝氨酸抗体的CDR3结构域的12个氨基酸的合成多肽)；Bourgeois et al.，J.Virol 72：807-10(1998)(显示了来源于抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体的重链CDR3结构域的单个肽能够在体外中和所述病毒)；Levi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：4374-8(1993)(描述了基于鼠抗HIV抗体的重链CDR3结构域的一种肽)；Polymenis andStoller，J.Immunol.152：5218-5329(1994)(描述了通过移植Z-DNA结合抗体的重链CDR3区域使得能够结合scFv)；以及Xu and Davis，Immunity 13：37-45(2000)(描述了重链CDR3的多样性足以使得其它部分相同的IgM分子区分各种半抗原和蛋白质抗原)。还可参见美国专利No.6,951,646、6,914,128、6,090,382、6,818,216、6,156,313、6,827,925、5,833,943、5,762,905和5,760,185，它们描述了由单个CDR结构域定义的获得专利权的抗体。上述每一篇文献均通过引用全文纳入本文。
因此，本发明提供了包括来源于人或非人动物的抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体能够特异性结合PTK7。在某些方面，本发明提供了包括来源于非人抗体(例如小鼠或大鼠抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体能够特异性结合PTK7。在一些实施方案中，这类包括来源于非人抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的本发明抗体：(a)能够与其相应的亲代非人抗体竞争结合；(b)保留了其相应的亲代非人抗体的功能特性；(c)与其相应的亲代非人抗体结合相同的表位；和/或(d)与其相应的亲代非人抗体具有相似的结合亲和力。
在其它方面，本发明提供了包括来源于人抗体(例如由非人类的动物获得的人抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，其中所述人抗体能够特异性结合PTK7。在其它方面，本发明提供了包括来源于第一人抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，所述第一人抗体例如是获自非人类动物的人抗体，其中所述第一人抗体能够特异性结合PTK7，并且其中所述来源于所述第一人抗体的CDR3结构域替换了不具有PTK7结合特异性的人抗体中的CDR3结构域，以产生能够特异性结合PTK7的第二人抗体。在一些实施方案中，这类包括来源于第一人抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的本发明抗体：(a)能够与其相应的亲代第一人抗体竞争结合；(b)保留了其相应的亲代第一人抗体的功能特性；(c)与其相应的亲代第一人抗体结合相同的表位；和/或(d)与其相应的亲代第一人抗体具有相似的结合亲和力。在优选的实施方案中，所述第一人抗体为3G8、#g8a、4D5、12C6、12C6a或7C8。
具有特定种系序列的抗体
在某些实施方案中，本发明的抗体包括来源于特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来源于特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
例如，在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括来源于人VH 3-30.3基因或者为人VH3-53基因的产物的重链可变区，其中所述抗体特异性结合PTK7，优选结合人PTK7。在另一优选的实施方案中，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括来源于人VH DP44基因或者为人VH DP44基因的产物的重链可变区，其中所述抗体特异性结合PTK7，优选结合人PTK7。在另一优选的实施方案中，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括来源于人VH 3-33基因或者为人VH 3-33基因的产物的重链可变区，其中所述抗体特异性结合PTK7，优选结合人PTK7。在另一优选的实施方案中，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括来源于人Vk L15基因或者为人Vk L15基因的产物的轻链可变区，其中所述抗体特异性结合PTK7，优选结合人PTK7。在另一优选的实施方案中，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括来源于人Vk A10基因或者为人Vk A10基因的产物的轻链可变区，其中所述抗体特异性结合PTK7，优选结合人PTK7。在另一优选的实施方案中，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括来源于人Vk A27基因或者为人Vk A27基因的产物的轻链可变区，其中所述抗体特异性结合PTK7，优选结合人PTK7。在另一优选的实施方案中，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括来源于人Vk L6基因或者为人VkL6基因的产物的轻链可变区，其中所述抗体特异性结合PTK7，优选结合人PTK7。在又另一优选的实施方案中，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体：
(a)包括一个重链可变区，所述重链可变区来源于人VH 3-30.3、DP44或3-33基因或者为上述基因的产物(上述基因所编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：51、52和53)；
(b)包括一个轻链可变区，所述轻链可变区来源于人Vk L15、A10、A27或L6基因或者为上述基因的产物(上述基因所编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：54、55、56和57)；并且
(c)特异性结合PTK7。
分别具有VH 3-30.3和Vk L15的VH和Vk的抗体的实例为3G8和3G8a。分别具有VH 3-30.3和Vk A10的VH和Vk的抗体的实例为4D5。分别具有VH DP44和Vk A27的VH和Vk的抗体的实例为12C6。分别具有VH DP44和Vk L15的VH和Vk的抗体的实例为12C6a。分别具有VH 3-33和Vk L6的VH和Vk的抗体的实例为7C8。
如此处所用，如果一种人抗体的可变区由使用人类种系免疫球蛋白基因的系统获得，则所述人抗体包含“来源于”特定种系序列或者为其“产物”的重链或轻链可变区。该系统包括用所关注的抗原对携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫或者用所关注的抗原对在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库进行筛查。“来源于”某一人类种系免疫球蛋白序列或为其“产物”的人抗体可以通过下述方式进行识别：将所述人抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列相比较，并选择在序列上与所述人抗体最接近(即同一性百分数最高)的人类种系免疫球蛋白序列。“来源于”特定人类种系免疫球蛋白序列或为其“产物”的人抗体可能含有与种系序列不同的氨基酸，这可能是由于例如自然产生的体细胞突变或有意引入的定点突变。然而，所选择的人抗体通常与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比有至少90％的氨基酸序列相同，而且所述人抗体在与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)进行比较时，其含有的氨基酸残基将其鉴定为人的抗体。在一些情况中，人抗体与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比可以有至少95％、至少96％、97％、98％或99％的氨基酸序列相同。通常，来源于特定人类种系序列的人抗体不会显现超过10个与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不同的氨基酸。在一些情况中，人抗体可以显现不超过5个，乃至不超过4、3、2或1个与由该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不同的氨基酸。
同源抗体
在另一实施方案中，本发明的抗体包括含有与此处说明的优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区，其中，该抗体保留本发明所需的抗PTK7抗体的功能性质。
例如，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括一个重链可变区和一个轻链可变区，其中：
(a)所述重链可变区包括与选自SEQ ID NO：1、2、3和4的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；
(b)所述轻链可变区包括与选自SEQ ID NO：5、6、7、8、9和10的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；并且
其中所述抗体具有下列一种或多种性质：
(c)所述抗体与人PTK7的结合的KD为1×10-7M或更低；
(d)所述抗体能够结合Wilms肿瘤细胞系。
在其它实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与前述序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。具有与前述序列的VH和VL区有高同源性(即，80％或更大)的VH和VL区的抗体可以如下获得：诱导编码SEQ ID NO：41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的核酸分子发生突变(例如，定点诱变或PCR介导的诱变)，然后使用此处说明的功能测定方法测试编码的改变的抗体的保留功能(即上述的(c)和(d)中所述的功能)。
如本文中所使用，两个氨基酸序列的同源性百分比等同于两个序列的同一性百分比，两个序列之间的同一性百分比为两序列共有的相同位置的数目的函数(即，同源性％＝相同的位置数/位置总数×100)，并需要考虑空位(gap)数目，和每个空位的长度，这些空位需要被引入用于两条序列的优化比对。正如在以下的非限制性实施例中所述，通过数学算法可以完成两条序列的序列比较和同一性百分比的测定。
两条氨基酸序列的同一性百分比的测定可以运用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988)的算法来进行，此算法已经结合在ALIGN程序(版本2.0)中，该算法采用PAM120权重残基表(weight residue table)、等于12的空位长度罚分(gap length penalty)和等于4的空位罚分。此外，两条氨基酸序列的同一性百分比的测定还可使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))的算法进行，此算法已结合在GCG软件包的GAP程序中(可从www.gcg.com获得)，此算法应用了Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。
另外或者替代性地，本发明的蛋白质序列能被进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行检索，以便(例如)鉴定相关序列。此检索可采用Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(版本2.0)进行。BLAST蛋白质检索可采用得分为50，字长为3的XBLAST程序进行，从而获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较的空位比对，可使用Altschul et al.((1997)Nucleic AcidsRes.25(17)：3389-3402)所述的空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。(参见www.ncbi.nlm.nih.gov)。
具有保守性修饰的抗体
在某些实施方案中，本发明的抗体包括含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中一个或多个上述CDR序列包括基于本文所述的优选抗体(例如，3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a或7C8)的特定氨基酸序列或其保守性修饰，并且其中所述抗体保留了本发明的抗PTK7抗体的所需功能性质。本领域技术人员可以理解，可以进行某些保守性序列修饰而不会失去其抗原结合能力。参见例如Brummell et al.(1993)Biochem32：1180-8(描述了沙门氏菌(Salmonella)特异性抗体的重链CDR3结构域的突变分析)；de Wildt et al.(1997)Prot.Eng.10：835-41(描述了抗UA1抗体的突变研究)；Komissarov et al.(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870(证实在HCDR3中间的突变可导致亲和力的减弱或消失)；Hall et al.(1992)J.Immunol.149：1605-12(描述了在CDR3区域中单个氨基酸的改变会消除结合活性)；Kelley and O’Connell(1993)Biochem.32：6862-35(描述了Tyr残基对于抗原结合的作用)；Adib-Conquy et al.(1998)Int.Immunol.10：341-6(描述了疏水性对于结合的影响)和Beers et al.(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43(描述了HCDR3氨基酸突变体)。因此，本发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体或其抗原结合部分包括含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)所述重链可变区CDR3序列包括选自SEQ ID NO：19、20、21和22的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列；
(b)所述轻链可变区CDR3序列包括选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39和40的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列；并且
其中所述抗体具有下列一种或多种性质：
(c)所述抗体能够特异性结合人PTK7；
(d)所述抗体能够结合Wilms肿瘤细胞系(ATCC编号No.CRL-1441)。
在一个优选的实施方案中，所述重链可变区CDR2序列包括选自SEQ ID NO：15、16、17和18的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列；并且所述轻链可变区CDR2序列包括选自SEQ ID NO：29、30、31、32、33和34的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列。在另一优选的实施方案中，所述重链可变区CDR1序列包括选自SEQ IDNO：11、12、13和14的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列；并且所述轻链可变区CDR1序列包括选自SEQ ID NO：23、24、25、26、27和28的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列。
在不同实施方案中，所述抗体可为例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如本文中所使用的术语“保守性序列修饰”意指不会明显影响或改变含有所述氨基酸序列的所述抗体的结合特性的氨基酸修饰。这类保守性修饰包括氨基酸的置换、插入和缺失。修饰可通过例如定点诱变和PCR介导的诱变等本领域已知的标准技术引入本发明的抗体中。保守氨基酸置换是其中的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。在本领域中已经确定具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有未带电的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-支化侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，和具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替代，并且可以使用此处所述的功能分析方法对变化的抗体的保留功能(即上述的(c)和(d)中所述的功能)进行测试。
与本发明的抗PTK7抗体结合相同表位的抗体
在另一实施方案中，本发明提供了结合被任何本发明的PTK7单克隆抗体所识别的人PTK7上的表位的抗体(即能够与任何本发明单克隆抗体交叉竞争结合PTK7的抗体)。在优选的实施方案中，所述在交叉竞争研究中使用的参照抗体可为：单克隆抗体3G8(其VH和VL序列分别示于SEQ ID NO：1和5)，或单克隆抗体3G8a(其VH和VL序列分别示于SEQ ID NO：1和6)，或单克隆抗体4D5(其VH和VL序分别列示于SEQ ID NO：2和7)，或单克隆抗体12C6(其VH和VL序列分别示于SEQ ID NO：3和8)，或单克隆抗体12C6a(其VH和VL序列分别示于SEQ ID NO：3和9)，或单克隆抗体7C8(其VH和VL序列分别示于SEQ ID NO：4和10)。
可以使用标准的PTK7结合分析基于它们与3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a或7C8交叉竞争的能力来识别这类交叉竞争抗体。例如，可以使用BIAcore
Figure GPA00001143083600361
分析、ELISA测定或流式细胞术来证明与本发明抗体的交叉竞争。如果待测抗体能够抑制例如3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a或7C8与人PTK7的结合，则证明该待测抗体能够与3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a或7C8竞争结合人PTK7，从而证明该待测抗体与3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a或7C8结合人PTK7上的相同表位。在一个优选的实施方案中，所述抗体能够结合被3G8(其VH和VL序列分别示于SEQ ID NO：1和5)或3G8a(其VH和VL序列分别示于SEQ IDNO：1和6)或4D5(其VH和VL序分别列示于SEQ ID NO：2和7)或12C6(其VH和VL序列分别示于SEQ ID NO：3和8)或12C6a(其VH和VL序列分别示于SEQ ID NO：3和9)或7C8(其VH和VL序列分别示于SEQ ID NO：4和10)所识别的人PTK7上的相同表位。在一个优选的实施方案中，所述能够结合被3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a或7C8所识别的人PTK7上的相同表位的抗体为人单克隆抗体。可以按照实施例中所述制备和分离这类单克隆抗体。
工程化的和修饰的抗体
还可以通过下述方式制备本发明的抗体：使用具有一个或多个本文公开的VH和/或VL序列的抗体作为起始材料，以对修饰的抗体进行工程化，这种修饰的抗体可能具有与起始抗体不同的性质。可以通过改变一个或两个可变区(即VH和/或VL)中的一个或多个残基来对抗体进行工程化，例如可以改变一个或多个CDR区和/或一个或多个框架区中的残基。另外地或可替代地，也可以通过改变恒定区中的残基来对抗体进行工程化，(例如)以改变所述抗体的效应功能。
可以进行的一种类型的可变区工程化是CDR移植。抗体与靶抗原主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基进行相互作用。为此原因，CDR中的氨基酸序列在各单独抗体之间比在CDR之外的序列更具有多样性。因为CDR序列负责绝大多数抗体-抗原相互作用，这使得通过构建包含来自被移植到框架序列(来自具有不同性质的不同抗体)上的特异性天然抗体的CDR序列的表达载体，表达模拟特异性天然抗体性质的重组抗体成为可能。(参见例如，Riechmann，L.et al.(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.et al.(1986)Nature 321：522-525；Queen，C.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利No.5,225,539，以及Queen等人的美国专利No.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。)
因此，本发明的另一实施方案涉及包含重链可变区和轻链可变区的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区中含有的CDR1、CDR2和CDR3序列分别包括选自SEQ ID NO：11、12、13和14；SEQ ID NO：15、16、17和18；和SEQ ID NO：19、20、21和22的氨基酸序列；所述轻链可变区中含有的CDR1、CDR2和CDR3序列分别包括选自SEQ ID NO：23、24、25、26、27和28；SEQ ID NO：29、30、31、32、33和34；和SEQ ID NO：35、36、37、38、39和40的氨基酸序列。因此，这类抗体含有单克隆抗体3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a或7C8的VH和VL CDR序列，但可能含有与上述抗体不同的框架序列。
这类框架序列可以获自含有种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开出版的文献。例如，人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人类种系序列数据库中找到(可以获自互联网网站www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)，以及在下述文献中找到：Kabat，E.A.，etal.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242；Tomlinson，I.M.，et al.(1992)，“The Repertoire of HumanGermline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of V-H Segments withDifferent Hypervariable Loops”J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.etal.(1994)“A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a StrongBias in their Usage”Eur.J.Immunol.24：827-836；在此明确将各文献的内容通过引用结合在到本文中。作为另一实例，人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中找到。例如，下列在HCo7 HuMAb小鼠体内发现的重链种系序列可以从以下的所附Genbank登录号获得：1-69(NG_0010109、NT_024637和BC070333)，3-33(NG_0010109和NT_024637)和3-7(NG_0010109和NT_024637)。作为另一实例，下列在HCo12 HuMAb小鼠体内发现的重链种系序列可以从以下的所附Genbank登录号获得：1-69(NG_0010109、NT_024637和BC070333)、5-51(NG_0010109和NT_024637)、4-34(NG_0010109和NT_024637)、3-30.3(CAJ556644)和3-23(AJ406678)。也可以与上述VBASE相类似的方式检索其它的人类种系序列数据库，例如可获自IMGT(http://imgt.cines.fr)的数据库。
使用本领域中公知的被称为空位BLAST的序列相似性检索方法(Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Research 25：3389-3402)，将抗体蛋白质序列与汇编的蛋白质数据库进行比较。BLAST是启发式算法，其中抗体序列与数据库序列之间的统计学显著性比对有可能包括比对字符的高得分片段对(HSP)。其得分不能通过扩展或修正加以提高的片段对被称为命中记录(hit)。简言之，VBASE来源的核苷酸序列(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)可被翻译，并且FR1至FR3框架区之间的区域(包括FR1至FR3框架区)被保留。数据库序列具有的平均长度为98个残基。蛋白质全长上的精确匹配的重复序列被剔除。使用除了已被关闭的低复杂性过滤器和BLOSUM62的置换矩阵以外采用缺省的标准参数的程序blastp进行蛋白质的BLAST检索，该检索滤出实现序列相配的前5个命中记录。核苷酸序列在全部六个框架中被翻译，在数据库序列的匹配片段中不具有终止密码子的框架被视为潜在的命中记录。这反过来采用BLAST程序tblastx进行确认，该程序翻译了在全部六个框架中的抗体序列，并且将这些翻译与在全部六个框架中动态翻译的VBASE核苷序列进行比较。可以如上所述地与VBASE类似地检索其它人类种系序列数据库，例如可以获自IMGT(http://imgt.cines.fr)的数据库。
同一性是在抗体序列和蛋白质数据库之间在序列全长上存在的精确的氨基酸匹配。阳性(同一性+取代匹配)并不相同，但氨基酸取代是由BLOSUM62取代矩阵所引导的。如果抗体序列以一样的同一性匹配数据库序列中的两条序列，则具有最大阳性的命中记录将被判定为匹配序列命中记录。
优选的可用于本发明抗体的框架序列为与所选择的本发明抗体所用的框架序列结构上类似的那些框架序列，例如类似于本发明优选的单克隆抗体所用的下列框架序列：VH 3-30.3框架序列(SEQ ID NO：51)和/或VH DP44框架序列(SEQ ID NO：52)和/或VH 3-33框架序列(SEQID NO：53)和/或Vk L15框架序列(SEQ ID NO：54)和/或Vk A10框架序列(SEQ ID NO：55)和/或Vk L15框架序列(SEQ ID NO：54)和/或Vk A27框架序列(SEQ ID NO：56)和/或Vk L15框架序列(SEQ ID NO：54)和/或VkL6框架序列(SEQ ID NO：57)。VH CDR1、CDR2和CDR3序列，以及Vk CDR1、CDR2和CDR3序列可被移植到具有与由其得到骨架序列的种系免疫球蛋白基因中发现的相同的序列的框架区，或者CDR序列可被移植到与种系序列相比包括一个或多个突变的框架区。例如，已经发现在一些情况中，使框架区内的残基突变从而保留或增强抗体的抗原结合能力是有益的(例如，参见Queen et al.的美国专利No.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一类型的可变区修饰是使VH和/或Vk CDR1、CDR2和/或CDR3区中的氨基酸残基突变，由此改进目的抗体的一种或多种结合性质(例如亲和力)。可以进行定向诱变或PCR介导的诱变来引入突变，对抗体结合或其它所关注的功能性质的影响可以通过本文所述的和实施例中提供的体内或体外分析来进行评估。优选地引入保守性修饰(如上所述)。所述突变可为氨基酸置换、添加或缺失，但优选地为置换。此外，通常在一个CDR区域中改变不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
因此，在另一实施方案中，本发明提供了分离的抗PTK7单克隆抗体其抗原结合部分，其包括重链可变区，该重链可变区包括：(a)VHCDR1区域，该区域包括选自SEQ ID NO：11、12、13和14的氨基酸序列，或包括与SEQ ID NO：11、12、13和14相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区域，该区域包括选自SEQ ID NO：15、16、17和18的氨基酸序列，或包括与SEQ ID NO：15、16、17和18相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区域，该区域包括选自SEQ ID NO：19、20、21和22的氨基酸序列，或包括与SEQ ID NO：19、20、21和22相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)Vk CDR1区域，该区域包括选自SEQ ID NO：23、24、25、26、27和28的氨基酸序列，或包括与SEQ ID NO：23、24、25、26、27和28相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VkCDR2区域，该区域包括选自SEQ ID NO：29、30、31、32、33和34的氨基酸序列，或包括与SEQ ID NO：29、30、31、32、33和34相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)Vk CDR3区域，该区域包括选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39和40的氨基酸序列，或包括与SEQ ID NO：35、36、37、38、39和40相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列。
本发明的工程化抗体包括这样的抗体：它们对VH和/或Vk内的框架残基进行了修饰，从而例如改进所述抗体的性质。通常，进行这类框架修饰是为了降低所述抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”为相应的种系序列。更具体而言，已经经历体细胞突变的抗体可包含与得到该抗体的种系序列不同的框架残基。这样的残基可以通过将抗体框架序列与从中衍生出该抗体的种系序列进行比较而进行鉴定。
例如，对于3G8(和3G8a)而言，VH的氨基酸残基#28(在FR1内)为异亮氨酸，而在相应的VH 3-30.3种系序列中这一残基为苏氨酸。为了使框架区域序列变回它们的种系构型，可以通过例如定向诱变或者PCR介导的诱变将这体细胞突变“回复突变”为种系序列(例如3G8(和3G8a)的VH中FR1的残基#28可以从异亮氨酸“回复突变”为苏氨酸)。
作为另一实例，对于12C6(和12C6a)而言，VH的氨基酸残基#44(在FR2内)为苏氨酸，而在相应的VH DP44种系序列中这一残基为甘氨酸。为了使框架区域序列变回它们的种系构型，例如可以将12C6(和12C6a)的VH中的残基#44(FR2的残基#9)从苏氨酸再“回复突变”为甘氨酸。本发明的范围也意图涵盖这类“回复突变”的抗体。
另一类型的框架修饰涉及将框架区域或者甚至一个或多个CDR区域内的一个或多个残基进行突变，以除去T细胞表位从而降低所述抗体的潜在的免疫原性。这种方法也被称为“去免疫(deimmunization)”，在Carr等人的美国专利公布No.20030153043中有更详细的描述。
作为在框架区或CDR区域内进行修饰的附加手段或替代手段，还可以对本发明的抗体进行工程化，以使其在Fc区域内也包含修饰，通常可以改变所述抗体的一种或多种功能性质，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体可以进行化学修饰(例如，一个或多个化学物部分可以与抗体连接)，或进行修饰以改变其糖基化，从而再次改变该抗体的一种或多种功能性质。下面将对这些实施方案中的每一个进行更详细的说明。Fc区中的残基的编号为Kabat的EU索引的编号。
在一个实施方案中，CH1的铰链区被修饰从而改变了(例如，增加或减少)铰链区中的半胱氨酸残基的数目。在Bodmer等人的美国专利No.5,677,425中进一步说明了该方法。将CH1的铰链区中的半胱氨酸残基的数目加以改变，例如以便于组装轻链和重链或者增加或减小抗体的稳定性。
在另一实施方案中，抗体的Fc铰链区发生突变以减小抗体的生物半衰期。更具体而言，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链域片段的CH2-CH3结构域的界面区域，以致相对于天然Fc铰链域的SpA结合，该抗体削弱与葡萄球菌蛋白A(SpA)的结合。Ward等人的美国专利No.6,165,745更详细地说明了该方法。
在另一实施方案中，对该抗体进行修饰以增大其生物半衰期。不同的方法是可能的。例如，可以引入一个或多个下列突变：如Ward的美国专利No.6,277,375中说明的T252L、T254S、T256F。作为替代，为增大生物半衰期，该抗体可以在CH1或CL区域中发生变化以包含从IgG的Fc区域的CH2结构域的两个环获得的补救受体(salvage receptor)结合表位，如Presta等人的美国专利No.5,869,046和6,121,022所述。
在其它实施方案中，通过用不同的氨基酸残基取代至少一个氨基酸残基以改变Fc区，从而改变抗体的效应功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基取代，从而使抗体对于效应配体而言具有改变的亲和力力，但仍保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力变化的效应配体可以是，例如Fc受体或补体的C1成分。均为授予给Winter等人的美国专利No.5,624,821和5,648,260更详细地说明了该方法。
在另一实例中，选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸残基取代，以使抗体具有改变的C1q结合和/或减少的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。Idusogie等人的美国专利No.6,194,551更详细地说明了该方法。
在另一实例中，氨基酸位置231和239中的一个或多个氨基酸残基可被改变，从而改变所述抗体结合补体的能力。这种方法在Bodmer等人的PCT申请公布WO 94/29351中有更详细的描述。
在又另一实例中，为了提高所述抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高所述抗体对Fcγ受体的亲和力，通过修饰下列位置的一个或多个氨基酸对Fc区域进行了修饰：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。这种方法在Presta的PCT申请公布WO 00/42072有更详细的描述。此外，还做出了人IgG1对FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点的图谱，并描述了具有改进的结合能力的变体(参见Shields，R.L.et al.(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。已证明在256、290、298、333、334和339位置的具体突变能够改进对FcγRIII的结合能力。另外，已证明下列组合突变体能够改进对FcγRIII的结合能力：T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
在又一实施方案中，如美国临时申请No.60/957,271(其全部内容通过引用结合于本文中)所述，通过引入半胱氨酸残基来修饰本发明的抗体的C末端。该修饰包括但不限于在全长重链序列的C端处或附近取代现有的氨基酸残基，以及将包含半胱氨酸的延长序列(extension)引入至全长重链序列的C端。在优选的实施方案中，包含半胱氨酸的延长序列包括序列丙氨酸-丙氨酸-半胱氨酸(从N端至C端)。
在优选的实施方案中，这类C末端半胱氨酸修饰的存在为伴侣分子例如治疗剂或标记物分子的偶联提供了位点。具体而言，因为C末端半胱氨酸修饰而出现的反应性巯基基团可被用于经由二硫化物连接物与伴侣分子相偶联，这将在下文详述。所述抗体与伴侣分子的这种方式的偶联使得可以增强对连接的具体位点的控制。此外，通过在C末端或其附近引入连接位点可优化偶联，使其减少或者消除了对于抗体的功能性质的干扰，并且简化了对偶联物制品的分析和质量控制。
在又另一实施方案中，对抗体的糖基化进行了修饰。例如，可以制备去糖基化的抗体(即所述抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以(例如)提高所述抗体对抗原的亲和力。例如可以通过在抗体序列中改变一个或多个糖基化位点来实现这类糖修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸的置换，从而除去一个或多个可变区框架中的糖基化位点，由此在该位点消除糖基化。这类糖基化能够提高所述抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等人的美国专利No.5,714,350和6,350,861中有更详细的描述。下述文献还详细描述了另外一些改变糖基化的方法：Hanai等人的美国专利7,214,775、Presta的美国专利No.6,737,056、Presta的美国专利公布No.20070020260、Dickey等人的PCT申请公布No.WO/2007/084926、Zhu等人的PCT申请公布No.WO/2006/089294和Ravetch等人的PCT申请公布No.WO/2007/055916，上述文献的每一篇都以援引的方式全文纳入本文。
作为附加的或替代的手段，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有较少的岩藻糖残基含量的低岩藻糖化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已证实这种改变的糖基化模式能提高抗体的ADCC能力。例如可以在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达所述抗体来实现这类糖基化修饰。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域中是已知的，并可被用作表达本发明的重组抗体的宿主细胞，由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Ms704、Ms705和Ms709细胞系缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)岩藻糖基转移酶)，因此在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其糖上就没有岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系是通过使用两种替换载体对CHO/DG44细胞中的FUT8基因进行靶向破坏而产生的(参见Yamane等人的美国专利公布No.20040110704和Yamane-Ohnuki et al.(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。作为另一实例，Hanai等人的EP 1,176,195描述了带有被功能性破坏的FUT8基因的细胞系，由于FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，因此在这种细胞系中表达的抗体通过减少或消除α1，6键相关的酶而表现出低岩藻糖化。Hanai等人还描述了这样一种细胞系，它具有较低的将岩藻糖添加至结合抗体Fc区域的N-乙酰基葡糖胺的酶活性，或者不具有该酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。Presta的PCT申请公布WO 03/035835描述了变异CHO细胞系Lec13，该细胞系将岩藻糖连接到与Asn(297)相连的糖上的能力较低，这也导致在该宿主细胞系中表达的抗体的低岩藻糖化(还可参见Shields，R.L.et al.(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT申请公布WO 99/54342描述了经过工程化而表达糖蛋白改变的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，在这种工程化细胞系中表达的抗体具有增多的二等分GlcNac结构，这可导致抗体的ADCC活性提高(还可参见Umana et al.(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。作为替代，可以使用岩藻糖苷酶切去所述抗体的岩藻糖残基。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶能够从抗体上切去岩藻糖残基(Tarentino，A.L.et al.(1975)Biochem.14：5516-23)。
作为附加的或替代的手段，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，其中改变涉及所述抗体的唾液酸化水平。这类改变在Dickey等人的PCT申请公布No.WO/2007/084926和Ravetch等人的PCT申请公布No.WO/2007/055916中有所描述，上述两篇文献均以援引的方式全文纳入本文。例如，可以使用例如产脲节杆菌(Arthrobacter ureafacens)唾液酸酶的唾液酸酶来进行酶反应。这种反应的条件综述于美国专利No.5,831,077中，该文献以援引的方式全文纳入本文。合适的酶的其它非限制性实例为神经氨酸酶和N-糖苷酶F，它们分别描述于Schloemer et al.，J.Virology，15(4)，882-893(1975)和Leibiger et al.，Biochem J.，338，529-538(1999)中。去唾液酸化的抗体可以通过亲和色谱进一步纯化。作为替代，可以使用例如唾液酸转移酶的方法来提高唾液酸化的水平。这种反应的条件在Basset et al.，Scandinavian Journalof Immunology，51(3)，307-311(2000)中概述。
本发明还考虑到的抗体的另一修饰类型为聚乙二醇化。对抗体进行聚乙二醇化可以例如增加所述抗体的生物半衰期(例如血清半衰期)。为了对抗体进行聚乙二醇化，通常在能够使得一个或多个聚乙二醇(PEG)基团连接到所述抗体或抗体片段的反应条件下，将所述抗体或抗体片段与PEG反应，例如与PEG的反应性酯或醛衍生物反应。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰基化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。本文中所使用的术语“聚乙二醇”意在涵盖可用于衍生其它蛋白质的PEG的任一形式，例如单(C1-C10)烷氧基聚乙二醇或(C1-C10)芳基氧基聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体为未被糖基化的抗体。对蛋白质进行聚乙二醇化的方法是本领域中已知的，并可应用于本发明的抗体。参见例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。
抗体片段和抗体模拟物
本文公开的本发明并不限于常规的抗体例如抗原结合部分，可以通过使用抗体片段和抗体模拟物进行实践。如今已经开发了多种抗体片段和抗体模拟物技术，且这些技术在本领域中公知。
单域抗体(domain antibody，dAb)是抗体的最小功能结合单位，分子量约为13kDa，相当于抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可变区。关于单域抗体及其制造方法的更多的细节可在US 6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；和6,696,245；US 2004/0110941；EP 1433846、0368684和0616640；WO 2005/035572、2004/101790、2004/081026、2004/058821、2004/003019和2003/002609中找到，其全部内容均通过引用结合在本文中。
纳米抗体是包含天然重链抗体的独特结构及功能性质的源自抗体的蛋白质。这些重链抗体包括单一可变域(VHH)和两个恒定域(CH2和CH3)。重要的是，克隆并分离的VHH域是携带原始重链抗体的全部抗原结合能力的稳定多肽。纳米抗体与人抗体的VH域具有高同源性，可进一步人源化而不会损失任何活性。重要的是，纳米抗体具有较低的免疫原性潜力。
纳米抗体将传统抗体的优点与小分子药物的重要特征相结合。与传统抗体类似，纳米抗体显示出很高的靶特异性和亲和性及较低的固有毒性。此外，纳米抗体极为稳定，可以通过注射之外的方法施用(例如，参见WO 2004/041867)，并且易于制造。纳米抗体的其它优点包括由于其尺寸小而能够识别罕见的或隐藏的表位，由于其独特的三维、药物形式的灵活性所致而以高亲和性和选择性结合入蛋白靶标的空腔或活性位点、适应药物发现的半衰期和容易性及速度。
纳米抗体被单基因编码，并在几乎全部的原核宿主和真核宿主中被有效产生，所述宿主例如为大肠杆菌(E.coli)(例如，参见US 6,765,087，其全部内容通过引用结合在本文中)、霉菌(例如曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma))和酵母(例如酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia))(例如，参见US 6,838,254，其全部内容通过引用结合在本文中)。
纳米克隆方法(例如，参见WO 06/079372，其全部内容通过引用结合在本文中)基于B细胞的自动高通量选择产生抗所需靶标的纳米抗体，并且能够在本发明中应用。
UniBodies是另一抗体片段技术，基于移除IgG4抗体的铰链区。删除铰链区得到基本上为传统IgG4抗体一半尺寸的分子，并且该分子具有单价结合区而非二价结合区。此外，因为UniBodies较小，因此它们可以在较大的实体瘤上显示出更好的分布，具有潜在的有利功效。关于UniBodies的更多细节可参考WO 2007/059782获得，其全部内容通过引用结合在本文中。
Affibody分子是高亲和力蛋白质，基于来自葡萄球菌蛋白A的三螺旋束IgG结合结构域的58氨基酸残基蛋白域。该域已被用作构建组合噬菌粒文库的框架，使用噬菌体展示技术可从该文库中选择针对目标靶分子的Affibody变体(Nord et al.，Nat Biotechnol 1997；15：772-7；Ronmarket al.，Eur J Biochem 2002；269：2647-55)。Affibody分子的简单坚固结构和低分子量(6kDa)使得它们适于各种广泛的用途，如受体相互作用的检测试剂和抑制剂。关于Affibody的更多的细节可在US 5,831,012中找到，其全部内容通过引用结合在本文中。标记的Affibody在用于检测同种型的丰度的成像应用中也是有用的。
DARPin(设计的锚蛋白重复蛋白)体现了DRP(设计重复蛋白)抗体模拟技术，该技术利用非抗体多肽的结合能力。重复蛋白，例如锚蛋白和富含亮氨酸的重复蛋白，是普遍存在的结合分子，与抗体不同，其出现在细胞内和细胞外。它们独特的模块结构以重复结构单元(重复)为特征，这些单元堆栈在一起以形成展示可变的、模块靶结合表面的伸长的延长重复域。基于该模块性，可以生成具有高度多样性的结合特异性的多肽的组合文库。该策略包括对展示可变表面残基自相容重复序列(self-compatible repeat)的共有设计和将它们随意组装进重复域中。关于DARPin和其它DRP技术的更多信息可以在US 2004/0132028和WO02/20565中找到，其全部内容均通过引用结合在本文中。
Anticalins是另一抗体模拟技术。在该情况中，结合特异性源自脂质运载蛋白，其属于在人体组织和体液中天然地丰富地表达的低分子量蛋白质家族。脂质运载蛋白已经发展为在体内执行与生理运输和化学敏感或不溶化合物的存储有关的各种功能。脂质运载蛋白具有坚固的内部结构，其包括在蛋白质的一端支持四个环(loop)的高度保守的β-桶。这些环形成结合口袋的入口，并且分子在这一部分的构象差异解释了各个脂质运载蛋白之间的结合特异性的变化。
尽管由保守的β-折叠框架支持的超变环的整体结构能够让人联想起免疫球蛋白，然而脂质运载蛋白与抗体在大小上存在显著差异，其由160-180个氨基酸的单一多肽链构成，略大于单一的免疫球蛋白结构。
可以克隆脂质运载蛋白，将它们的环进行工程化以产生Anticalin。结构多样性的Anticalin文库已经生成，Anticalin的展示允许对结合功能进行选择和筛查，随后在原核或真核体系中表达和生成可溶蛋白质以进行进一步的分析。研究表明Anticalin可以被开发使它们对于几乎任何人类靶蛋白都具有特异性并且可以获得纳摩尔或更高范围内的结合亲和力。关于Anticalin的其它信息可以在US 7,250,297和WO 99/16873中找到，其全部内容均通过引用结合在本文中。
Avimers是另一类型的可用于本发明的抗体模拟技术。Avimers由人细胞外受体域的大家族经过体外外显子改组和噬菌体展示发展而来，产生具有结合和抑制性质的多域蛋白。连接多重独立结合结构域已经显示出产生亲合力，与传统的单表位结合蛋白比较，其具有提高的亲和性和特异性。其它潜在的优点包括在大肠杆菌中简单且有效地生成多靶特异性分子，提高热稳定性和对蛋白酶的耐受性。已经得到了针对各种靶标的具有亚纳摩尔亲和力的Avimers。关于Avimers的其它信息可在US2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756中找到，其全部内容均通过引用结合在本文中。
Versabodies是另一可用于本发明的抗体模拟技术。Versabodies是具有大于15％的半胱氨酸的小蛋白质(3-5kDa)，其形成高密度二硫化物密度构架结构来替代典型蛋白质所具有的疏水核。这种替代使得蛋白质分子更小且更加亲水(即，不易发生凝集和非特异性结合)，对于热和蛋白酶具有更大的耐受性，具有较低密度的T细胞表位，这是因为对MHC的呈递贡献最多的残基是疏水性的。众所周知这些性质会影响免疫原性，而且预期它们会大幅度降低免疫原性。
由于Versabodies的结构，这些抗体模拟物提供了包括多价、多特异性、多样化的半衰期机理、组织靶向模块和抗体Fc区域的空缺等多种形式。此外，Versabodies可以从大肠杆菌中以高产率获得，由于它门的亲水性和小尺寸，Versabodies高度可溶，能够以高浓度配制。Versabodies极具热稳定性，并具有长的保质期。关于Versabodies的更多信息可在US 2007/0191272中找到，其全部内容通过引用结合在本文中。
以上关于抗体片段和模拟技术的说明不是全面的。各种其它的技术，包括基于选择性多肽的技术，如Qui et al.(Nature Biotechnology，25(8)921-929(2007))概述的互补决定区的融合，以及基于核酸的技术，如US5,789,157；5,864,026；5,712,375；5,763,566；6,013,443；6,376,474；6,613,526；6,114,120；6,261,774和6,387,620中说明的RNA核酸适体技术，都可用于本发明，这些文献均通过引用结合在本文中。
抗体的物理性质
本发明中所使用的抗体的特征在于具有多种物理性质。
所述抗体可在VL或VH含有一个或多个糖基化位点，这可导致所述抗体的免疫原性增高，或pK值发生变化(Marshall et al(1972)AnnuRev Biochem 41：673-702；Gala and Morrison(2004)J Immunol172：5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimuraet al.(2000)Mol Immunol 37：697-706)。已知糖基化会发生在含有N-X-S/T序列的基序中。可以使用Glycoblot测试来检测可变区的糖基化，在该测试中所述抗体被切割产生Fab，然后使用测量高碘酸盐氧化和Schiff碱形成的测试来检测糖基化。或者，可以使用Dionex光色谱(Dionex-LC)来检测可变区的糖基化，在该测试中将Fab上的糖切割为单糖并分析每种糖的含量。在某些情况下，优选使用不具有可变区糖基化的抗抗体。这可以通过筛选在可变区中不含有糖基化基序的抗体，或者通过使用标准技术突变糖基化基序中的残基来实现。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体不含有天冬酰胺异构位点。在N-G序列或D-G序列上有可能发生天冬酰胺的脱酰胺反应，并导致生成异天冬氨酸残基，这会在多肽链上引入缠绕结构从而降低抗体的稳定性(异天冬氨酸效应)。可以通过使用反相HPLC测试(等量测定)来测试异天冬氨酸的产生。
每种抗体都具有独特的等电点(pI)，但通常都落在pH6至9.5的范围内。IgG1抗体的pI通常落在pH7-9.5的范围内，IgG4抗体的pI通常落在pH6-8的范围内。推测pI在正常范围之外的抗体在体内条件下可能会一定程度地解折叠而不稳定。因此，优选使用pI值落在正常范围内的抗PTK7抗体。这可以通过筛选pI值在正常范围内的抗体或者通过突变带电的表面残基来实现。
每种抗体都有特征性的融解温度，融解温度越高表明抗体在体内的总体稳定性越好(Krishnamurthy R and Manning MC(2002)CurrPharm Biotechnol 3：361-71)。通常，优选地TM1(开始解折叠的温度)大于60℃，优选地大于65℃，甚至更优选地大于70℃。可以使用例如差示扫描量热法(Chen et al(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando etal(1999)Immunol Lett 68：47-52)或者圆二色性(Murray et al.(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)来测量抗体的融解温度。
在一个优选的实施方案中，选择不会快速降解的抗体。可以使用本领域公知的毛细管电泳(CE)和MALDI-MS来测量抗体的片段化(Alexander AJ and Hughes DE(1995)Anal Chem 67：3626-32)。
在另一优选的实施方案中，选择具有最少的聚集作用的抗体，聚集可能导致引发不需要的免疫反应和/或变化的或不良的药代动力学性质。通常，可接受的抗体的聚集度为25％或更低，优选地20％或更低，甚至更优选地为15％或更低，甚至更优选地为10％或更低，甚至更优选地为5％或更低。可以使用多种技术来测量聚集，所述技术包括尺寸排阻柱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)和光散射法。
工程化抗体的方法
如上所述，可以通过修饰VH和/或Vk序列或与其相连的恒定区的方式，使用具有本文公开的VH和Vk序列的抗PTK7抗体来产生新的抗PTK7抗体。因此，在本发明的另一方面，使用了本发明的抗PTK7抗体例如3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a或7C8的结构特征，用于产生结构相关的抗PTK7抗体，所述新产生的抗体保留了本发明抗体的至少一种功能性质，例如可结合人PTK7。例如如上文所述，可以将3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a或7C8的一个或多个CDR区或其突变体与已知的框架区和/或其它CDR重组组合，以产生另外的重组工程化的本发明抗PTK7抗体。其它类型的修饰包括上文所述的那些修饰。用于工程化方法的起始材料为本文提供的一个或多个VH和/或Vk序列或其一个或多个CDR区。为产生工程化的抗体，不一定要实际制备具有本文提供的一个或多个VH和/或Vk序列或其一个或多个CDR区的抗体(即不必表达为蛋白质)。而只使用其序列中含有的信息作为起始材料，就能产生来源于原始序列的“第二代”序列，然后再制备这种“第二代”序列并将其表达为蛋白。
因此，在另一实施方案中，本发明提供了一种制备抗PTK7抗体的方法，包括：
(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，所述重链可变区抗体序列包括选自SEQ ID NO：11、12、13和14的CDR1序列、选自SEQ ID NO：15、16、17和18的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO：19、20、21和22的CDR3序列；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，所述轻链可变区抗体序列包括选自SEQ ID NO：23、24、25、26、27和28的CDR1序列、选自SEQ ID NO：29、30、31、32、33和34的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39和40的CDR3序列；
(b)改变所述重链可变区抗体序列和/或所述轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基，以产生至少一个改变的抗体序列；以及
(c)将所述改变的抗体序列表达为蛋白质。
可以使用标准分子生物学技术来制备和表达所述改变的抗体序列。
优选地，由改变的抗体序列编码的所述抗体保留了本文所述的抗PTK7抗体的一种、几种或全部功能性质，所述功能性质包括但不限于：
(a)所述抗体以1×10-7M或更低的KD与人PTK7结合；
(b)所述抗体能结合Wilms肿瘤细胞系。
可以使用本领域已知的和/或本文所述的标准分析(例如实施例中所述的技术，例如流式细胞术和结合测定)来测试所述改变的抗体的功能性质。
在工程化本发明的抗体的方法的某些实施方案中，可以在抗PTK7抗体编码序列的全长或一部分中随机地或选择性地引入突变，并筛选所得的经修饰的抗PTK7抗体的结合活性和/或本文所述的其它性质。突变方法在本领域中已有记载。例如，Short的PCT申请公布WO02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接装配体或其组合方法来生成和筛选抗体突变的方法。此外，Lazar等人的PCT申请公布WO03/074679描述了使用计算筛选方法来优化抗体的生理化学性质的方法。
编码本发明抗体的核酸分子
本发明的另一方面涉及编码本发明的抗体的核酸分子。所述核酸可以存在于完整细胞或细胞裂解液中，或者以部分纯化的形式或基本上纯的形式存在。如果通过标准技术将核酸从其它细胞组分或其它污染物(例如其它的细胞核酸或蛋白质)纯化，那么所述核酸是“分离的”或“使得基本上纯的”，所述标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳及本领域的其它公知技术。见F.Ausubel等人编著.(1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishingand Wiley Interscience，New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以包含或不包含内含子序列。在一个优选的实施方案中，所述核酸为cDNA分子。
可以使用标准的分子生物学技术获得本发明的核酸。对于杂交瘤(例如下文进一步描述的从携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，可以通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，可以从所述文库回收编码所述抗体的核酸。
本发明优选的核酸分子是那些编码3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a或7C8单克隆抗体的VH和VL序列的核酸分子。编码3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8的VH序列的DNA序列分别显示于SEQ ID NO：41(3G8和3G8a)、42(4D5)、43(12C6和12C6a)和44(7C8)。编码3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8的VL序列的DNA序列分别显示于SEQ ID NO：45、46、47、48、49和50中。
一旦获得了编码VH和VL区段的DNA片段，那么可以通过标准的重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段有效地连接至另一条编码其它蛋白质的DNA片段例如抗体恒定区或柔性连接物(flexible linker)。本文使用的术语“有效连接”意指两条DNA片段连接起来，使得所述两条DNA片段编码的氨基酸序列保持在阅读框内。
可以通过将分离出的编码VH的DNA有效连接至另一编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的DNA分子，将编码VH区的分离DNA转化成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(见例如Kabat，E.A.，el al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH Publication No.91-3242)，并且通过标准的PCR扩增可以获得涵盖这些区域的DNA片段。所述重链恒定区可以为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以有效地连接至另一仅编码重链CH1恒定区的DNA分子。
可以通过将分离出的编码VL的DNA有效连接至另一编码轻链恒定区CL的DNA分子，将所述编码VL区的分离DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(见例如Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242)，并且通过标准的PCR扩增可以获得涵盖这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以为κ或λ恒定区，但最优选为κ恒定区。
为产生scFv基因，VH-和VL-编码DNA片段可有效地连接另一条编码柔性连接物的片段，如编码氨基酸序列(Gly4-Ser3)的片段，以使VL和VH序列可表达为连续的单链蛋白质，其中VH和VL区域经由柔性连接物连接(例如，参见Bird et al.(1988)Science 242：423-426；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty et al.，(1990)Nature348：552-554)。
本发明的单克隆抗体的产生
可以通过多种技术产生本发明的单克隆抗体(mAb)，所述技术包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交法，但原则上可以应用其它用于产生单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒转化或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是已经建立的公知的方法。用于分离用于融合的被免疫的脾细胞的免疫方案和技术在本领域中是已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。
可以基于上文的描述制备的鼠单克隆抗体的序列，制备本发明的嵌合抗体或人源化抗体。从所关注的鼠类杂交瘤可以获得编码所述重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并且使用标准的分子生物学技术可以对其进行设计以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了形成嵌合抗体，可以使用本领域中已知的方法(见例如Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)将鼠可变区连接至人恒定区。为了形成人源化抗体，可以使用本领域中已知的方法(见例如Winter的美国专利No.5,225,539的，以及Queen等人的美国专利No.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)将鼠CDR区插入至人的框架中。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠或转染色体小鼠，可以产生这类针对人PTK7的人单克隆抗体。这些转基因小鼠或转染色体小鼠包括本文分别称为HuMAb小鼠和KM miceTM的小鼠，它们在本文中统称为“人Ig小鼠”。
所述HuMAb mouse
Figure GPA00001143083600551
(Medarex，Inc.)含有编码非重排的人重链(μ和γ)及κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微基因座，并含有使内源性μ和κ链基因座失活的定向突变(见例如Lonberg，et al.(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，所述小鼠表现出小鼠IgM或κ表达降低，并且所述引入的人重链和轻链转基因响应于免疫反应经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力的人IgGκ单克隆(Lonberg，N.et al.(1994)，见上文；综述见Lonberg，N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.and Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93，和Harding，F.and Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb小鼠的制备和应用以及这种小鼠携带的基因组修饰还记载于Taylor，L.et al.(1992)NucleicAcids Research 20：6287-6295；Chen，J.et al.(1993)InternationalImmunology 5：647-656；Tuaillon et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：3720-3724；Choi et al.(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.etal.(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon et al.(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.et al.(1994)International Immunology 6：579-591；和Fishwild，D.et al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，所有这些文献的全文通过引用的方式明确地纳入本文。还可参见均为Lonberg和Kay的美国专利No.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；Surani等人的美国专利No.5,545,807；Lonberg和Kay的PCT申请公布WO 92/03918，WO 93/12227，WO94/25585，WO 97/13852，WO 98/24884和WO 99/45962；以及Korman等人的PCT申请公布WO 01/14424。
在另一实施方案中，可以使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，来生产本发明的人抗体。这类小鼠在本文中被称为“KM miceTM”，并详细记载于Ishida等人的PCT申请公布WO 02/43478中。
再者，替代性的表达人免疫球蛋白基因的转基因动物系统在现有技术中是可用的，并可用于生产本发明的抗PTK7抗体。例如，可以使用另一种被称作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的转基因系统；这种小鼠记载于例如Kucherlapat等人的美国专利No.5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中。
而且，替代性的表达人免疫球蛋白基因的转染色体动物系统在现有技术中是可用的，并可用于生产本发明的抗PTK7抗体。例如，可以使用另一种被称作“TC小鼠”的同时携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；这种小鼠记载于Tomizuka et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。再者，携带人重链和轻链转染色体的牛在现有技术(Kuroiwa et al.(2002)Nature Biotechnology 20：889-894)中有记载，并且可用于生产本发明的抗PTK7抗体。
也可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法制备本发明的人单克隆抗体。这种用于分离人抗体的噬菌体展示方法是现有技术中已知的。见例如Ladner等人的美国专利No.5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利No.5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利No.5,969,108和6,172,197；Griffiths等人的美国专利No.5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
也可以使用SCID小鼠制备本发明的人单克隆抗体，SCID小鼠体内已重建了人免疫细胞，使得在免疫时可产生人抗体应答。这种小鼠记载于例如Wilson等人的美国专利No.5,476,996和5,698,767中。
在另一实施方案中，可以使用如Buechler et al的美国专利No.6,794,132中描述的人Ig小鼠和噬菌体展示技术的结合制备人抗PTK7抗体。更具体地，该方法首先包括通过用一种或多种PTK7抗原免疫人Ig小鼠(例如上述的HuMab小鼠或KM小鼠)，在所述小鼠中产生抗PTK7抗体应答，随后从所述小鼠的淋巴细胞中分离编码人抗体链的核酸，然后将这些核酸导入展示载体(例如噬菌体)中以提供展示包装体(display package)文库。因此，每个文库成员包含编码人抗体链的核酸并且每种抗体链从所述展示包装体展示。然后用PTK7蛋白筛选所述文库以分离与PTK7特异性结合的文库成员。然后将所选文库成员中插入的核酸分离并经由标准的方法测序以确定所选PTK7结合成员的轻链和重链可变序列。通过标准的重组DNA技术可以将所述可变区转化成全长抗体链，所述技术例如将所述可变区克隆至携带人重链和轻链恒定区的表达载体中，使得所述VH区有效地连接至CH区并且VL区有效地连接至CL区。
人Ig小鼠的免疫
当人Ig小鼠用于生产本发明的人抗体时，可以用纯化的或富集的PTK7抗原制品和/或重组PTK7蛋白、或者PTK7融合蛋白免疫这种小鼠，如Lonberg，N.et al.(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.et al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851；以及PCT申请公布WO98/24884和WO 01/14424中所述。优选地，小鼠在初次输注时为6-16周龄。例如，纯化的或重组的PTK7抗原制品(5-50μg)可用于经腹膜内免疫人Ig小鼠。
用于产生抗PTK7的完全人单克隆抗体的详细步骤将在下文实施例1中描述。在多种抗原上积累的经验显示在以下条件下转基因小鼠会应答：开始时用完全弗氏佐剂中的抗原进行腹膜内免疫(IP)，之后每隔一周用不完全弗氏佐剂中的抗原进行IP免疫(可达总共6次)。然而，除弗氏佐剂之外的其它佐剂也显示是有效的。另外，在不存在佐剂的情况下全细胞显示出高度的免疫原性。在进行免疫过程中可以用眶后取血得到的血浆样品监测免疫应答。通过ELISA(如下文所述)可以筛选所述血浆，具有足够滴度的抗PTK7的人免疫球蛋白的小鼠可用于融合。可以在处死并取脾之前的3天，用抗原经静脉内对小鼠加强免疫。预计每个免疫需要进行2-3个融合。每种抗原一般免疫6-24只小鼠。通常使用HCo7和HCo12两个株。另外，可以将HCo7和HCo12两种转基因在一块培育成同时具有两种不同的人重链转基因(HCo7/HCo12)的小鼠。此外或另外，可以如实施例1所述使用KMmouseTM株。
产生本发明人单克隆抗体的杂交瘤的生成
为了生成产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，可从被免疫的小鼠分离脾细胞和/或淋巴结细胞并与合适的无限增殖化细胞系例如小鼠骨髓瘤细胞系融合。可以对形成的杂交瘤筛选抗原特异性抗体的产生。例如，可以用50％的PEG将来自被免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。作为替代，可以使用基于电场的电融合方法，使用CytoPulse大腔室细胞融合电穿孔仪(CytoPulse Sciences，Inc.，Glen Burnie Maryland)融合来自被免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液。将大约2×105的细胞种于平底微量滴定板上，之后在含有如下成分的选择性培养基中孵育2周：20％的胎克隆血清、18％的“653”条件培养液、5％的origen(IGEN)、4mM的L-谷氨酰胺、1mM的丙酮酸钠、5mM的HEPES、0.055mM的2-巯基乙醇、50单位/ml的青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml的庆大霉素和1×HAT(Sigma；在融合24小时后加入HAT)。在大约2周后，可以将细胞培养于以HT替代HAT的培养液中。然后可以通过ELISA筛选单个孔中的人单克隆IgM和IgG抗体。一旦出现杂交瘤的充分生长，即可以通常在10-14天后观察培养基。可以将抗体分泌杂交瘤再种板，再次筛选，并且如果其仍然是人IgG阳性的，那么可以通过有限稀释将所述单克隆抗体亚克隆至少2次。然后可以在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养液中产生少量抗体用于特征描述。
为了纯化人单克隆抗体，可以将选择的杂交瘤培养于2升的旋瓶中用于纯化单克隆抗体。可以将上清液过滤并浓缩，之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG以确保纯度。可以将所述缓冲液替换为PBS，且根据OD280使用1.43的消光系数确定其浓度。可以将所述抗体分成等份，置于-80℃下保存。
产生本发明单克隆抗体的转染瘤的生成
也可以使用例如重组DNA技术和基因转染方法的结合，在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体，这是本领域中公知的(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。
例如，为了表达所述抗体或其抗体片段，可以通过标准的分子生物学技术(例如，使用表达所需抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可将所述DNA插入至表达载体中，使得所述基因有效连接至转录和翻译调控序列。所述术语“有效连接的”在本文中意指抗体基因连接至载体，使得所述载体中的转录和翻译调控序列起到调节所述抗体基因转录和翻译的预期功能。对表达载体和表达调控序列进行选择以与所使用的表达宿主细胞兼容。可以将所述抗体轻链基因和所述抗体重链基因插入至不同的载体中，或者更通常地将两个基因插入至同一表达载体中。通过标准的方法(例如连接抗体基因片段和载体上的互补限制位点，或者如果不存在限制位点进行平端连接)将所述抗体基因插入至所述表达载体中。可以通过以下方法使用本文所述抗体的轻链和重链可变区形成任何抗体同种型的全长抗体基因：将所述轻链和重链可变区插入至已经编码所述需要的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得所述VH片段有效连接至所述载体中的CH片段且所述VK片段有效连接至所述载体中的CL片段。此外或替代地，所述重组的表达载体可以编码有利于所述抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。可以将所述抗体链基因克隆至所述载体中，使得所述信号肽在框架内连接至所述抗体链基因的氨基末端。所述信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或者异源的信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
本发明的重组表达载体除了携带抗体链基因之外，还携带调控所述抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”意指包括启动子、增强子及控制所述抗体链基因转录或翻译的其它表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这些调节序列记载于例如Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))中。本领域技术人员应了解，表达载体的设计(包括调节序列的选择)可能要依赖于这样的因素，如将要转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如衍生自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或者，可以使用非病毒调节序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。再者，调节元件可由不同来源的序列组成，例如包含来自SV40早期启动子和I型人T细胞白血病病毒的长末端重复的SRα启动子系统(Takebe，Y.et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
本发明的重组表达载体除了携带所述抗体链基因和调节序列之外，还可携带另外的序列——例如调节所述载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和可选择标记基因。所述可选择标记基因有利于对其中已导入所述载体的宿主细胞的选择(见例如Axel等人的美国专利No.4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，可选择标记基因一般赋予已导入所述载体的宿主细胞对药物例如G418、潮霉素或甲氨喋呤的抗性。优选的可选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于甲氨喋呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中)和neo基因(用于G418的选择)。
为了表达所述轻链和重链，通过标准技术将编码所述重链和轻链的表达载体转染至宿主细胞中。所述术语“转染”的各种形式涵盖很宽范围的多种技术，这些技术通常用于将外源DNA导入原核的或真核的宿主细胞，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。虽然在理论上可能在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但在真核细胞(且最优选在哺乳动物宿主细胞)中表达抗体是最优选的，这是因为这些真核细胞并且特别是哺乳动物细胞比原核细胞更有可能组装并分泌正确折叠且具有免疫活性的抗体。已经报导了抗体基因的原核表达对于高产率的活性抗体的产生是无效的(Boss，M.A.andWood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。
优选的用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr- CHO细胞，记载于Urlaub andChasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，使用DHFR可选择标记物，例如如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。具体地，对于使用NSO骨髓瘤细胞的情况，另一种优选的表达系统是记载于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841的GS基因表达系统。如果将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞，那么可通过培养所述宿主细胞一段时间产生所述抗体，所述时间足以使所述抗体在所述宿主细胞内表达，或者更加优选地使所述抗体分泌到培养所述宿主细胞的培养基中。可以使用标准的蛋白质纯化方法从所述培养基中回收抗体。
抗体与抗原结合的表征
可以通过例如标准ELISA测试本发明的抗体与PTK7的结合。简言之，将微量滴定板用PBS中0.25μg/ml的纯化PTK7包被，然后用PBS中5％的牛血清白蛋白封闭。在每个孔中加入稀释的抗体(例如稀释的PTK7免疫小鼠的血浆)，并于37℃下孵育1-2小时。将所述板用PBS/吐温洗涤，然后用偶接至碱性磷酸酶的二级试剂(例如对于人抗体，山羊抗人IgG Fc的特异性多克隆抗体试剂)于37℃下孵育1小时。在洗涤后，用pNPP底物(1mg/ml)对所述板进行显色，在OD405-650下进行分析。优选地将显示最高滴度的小鼠用于融合。
上文描述的ELISA测定还可用于筛选与PTK7免疫原显示阳性反应性的杂交瘤。将以高亲合力结合PTK7的杂交瘤亚克隆并进行进一步的特征描述。可以从每个杂交瘤选择一个保持所述母细胞反应性的克隆(通过ELISA)，用于制备5-10小瓶细胞库于-140℃保存，并用于抗体纯化。
为了纯化抗PTK7抗体，可以将选择的杂交瘤培养于2升的旋瓶中用于单克隆抗体纯化。可以将上清液过滤并浓缩，之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG以确保纯度。可以将所述缓冲液替换为PBS，且根据OD280使用1.43的消光系数确定其浓度。可以将所述单克隆抗体分成等份，置于-80℃下保存。
为了确定选择的抗PTK7单克隆抗体是否结合于独特表位，可使用市售试剂(Pierce，Rockford，IL)将每种抗体生物素化。使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究可以用上文描述的PTK7蛋白包被的ELISA板进行。可以使用链酶亲和素-碱性磷酸酶探针检测生物素化的mAb的结合。
为了确定纯化的抗体的同种型，可以使用对特定同种型的抗体特异的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，可以用1μg/ml的抗人免疫球蛋白于4℃下过夜包被微量滴定板的孔。用1％的BSA封闭后，所述板与1μg/ml或更低的测试单克隆抗体或者纯化的同种型对照在室温下反应1-2小时。所述孔然后可以与人IgG1或人IgM-特异的碱性磷酸酶连接的探针反应。如上文所述对板进行显色并分析。
可以通过蛋白质印迹法进一步测试抗PTK7的人IgG与PTK7抗原的反应性。简言之，可制备PTK7并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳后将分离的抗原转移至硝酸纤维素膜上，用10％的胎牛血清封闭，用待测试的单克隆抗体进行探测。人IgG的结合可以用抗人IgG碱性磷酸酶检测并用BCIP/NBT底物片显色(SigmaChem.Co.，St.Louis，Mo.)。
双特异性分子
在另一方面，本发明提供了含有本发明的抗PTK7抗体或其片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合部分可被衍生化或与另一功能分子相连接，例如与另一肽或蛋白质(例如另一抗体或受体的配体)相连接，以生成能够结合至少两种结合位点或靶分子的双特异性分子。实际上，本发明的抗体可被衍生化或与另外多于一种的功能分子相连接，生成能够结合多于两种结合位点和/或靶分子的多特异性分子；本文中所使用的术语“双特异性分子”也意图涵盖这类多特异性分子。为了生成本发明的双特异性分子，可将本发明的抗体与一个或多个其它的结合分子(例如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)功能性地连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价连接等等)，由此得到双特异性分子。
因此，本发明还包括双特异性分子，所述双特异性分子含有针对PTK7的至少一种第一结合特异性和针对第二靶表位的第二结合特异性。在本发明的一个具体实施方案中，所述第二靶表位为Fc受体，例如人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，本发明所包括的双特异性分子能够结合表达FcγR或FcαR的效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))，也能够结合表达PTK7的靶细胞。这些双特异性分子将表达PTK7的细胞靶向至效应细胞，并触发Fc受体介导的效应细胞活性，例如，表达PTK7的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子的释放或超氧化物阴离子的生成。
在双特异性分子为多特异性的本发明的实施方案中，所述分子除了含有抗-Fc结合特异性和抗PTK7结合特异性之外，还可以含有第三结合特异性。在一个实施方案中，第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如，与涉及细胞毒素活性的表面蛋白结合由此增强针对靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是结合给定分子(如抗原或受体)，由此增强Fc受体或靶细胞抗原的结合决定簇效果的抗体、功能抗体片段或配体。“抗增强因子部分”可以结合Fc受体或靶细胞抗原。或者，“抗增强因子部分”可以结合与第一和第二结合特异性结合的实体不同的实体。例如，抗增强因子部分可结合细胞毒性T细胞(如，经CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或导致针对靶细胞的免疫应答增强的其它免疫细胞)。
在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包括至少一种抗体或其抗体片段(包括如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链Fv)作为结合特异性。抗体还可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，如Fv或单链构建体，如Ladner等人的美国专利No.4,946,778所述，其内容通过引用结合在本文中。
在一个实施方案中，Fcγ受体的结合特异性由单克隆抗体提供，其结合并未被人免疫球蛋白G(IgG)所阻断。本文中所使用的术语“IgG受体”指的是位于1号染色体上的8个γ链基因中的任何一个。这些基因编码总共12种跨膜受体或可溶性受体同种型，它们被分为三个Fcγ受体类别：FcγRI(CD64)、FcγR II(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一个优选实施方案中，所述Fcγ受体为人类高亲和力FcγRI。人FcγRI为72kDa的分子，它对于单体IgG具有高亲和力(108-109M-1)。
在Fanger等人的PCT申请公布WO 88/00052和美国专利No.4,954,617中描述了某些优选的抗Fcγ单克隆抗体的制备和表征，上述文献的教导以援引的方式完全纳入本文。这些抗体结合FcγRI、FcγR II和FcγRIII表位的位点与受体上的Fcγ结合位点不同，因此它们的结合基本上不会被IgG的生理水平所阻碍。可用于本发明的特异性抗FcγRI抗体为mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62和mAb 197。产生mAb 32的杂交瘤可以获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，其保藏号为ATCC No.HB9469。在其它的实施方案中，所述Fcγ受体抗体为单克隆抗体22的人源化形式(H22)。H22抗体的制备和表征记载于Graziano，R.F.et al.(1995)J.Immunol 155(10)：4996-5002和PCT公布WO94/10332中。产生H22抗体的细胞系被命名为HA022CL1，保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC No.CRL 11177。
在另一优选的实施方案中，对于Fc受体的结合特异性由能结合人IgA受体如Fcα受体(FcαRI(CD89))的抗体提供，优选地，这种结合不会被人类免疫球蛋白A(IgA)所阻断。术语“IgA受体”意在包括位于19号染色体上的一α基因(FcαRI)的基因产物。已知这一基因编码几种55至110kDa的可变剪接跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞中组成型地表达，但在非效应细胞群体中不表达。FcαRI对于IgA1和IgA2都具有中等的亲和力(≈5×107M-1)，该亲和力在暴露于细胞因子例如G-CSF或GM-CSF时会提高(Morton，H.C.et al.(1996)Critical Reviews in Immunology 16：423-440)。已经描述了四种FcαRI特异性单克隆抗体，分别被命名为A3、A59、A62和A77，它们结合IgA配体结合域外的FcαRI(Monteiro，R.C.et al.(1992)J.Immunol.148：1764)。
FcαRI和FcγRI是可用于本发明的双特异性分子的优选的触发受体，因为它们：(1)主要在免疫效应细胞例如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞中表达；(2)高水平表达(例如5,000-100,000/细胞)；(3)是细胞毒性活性(例如ADCC和吞噬作用)的介质；(4)能够介导抗原例如自身抗原靶向于它们的增强的抗原呈递。
虽然人单克隆抗体是优选的，但可用于本发明的双特异性分子中的其它抗体是鼠、嵌合和人源化单克隆抗体。
可以使用本领域中已知的方法，通过将组分结合特异性(例如，抗FcR结合特异性和抗PTK7结合特异性)偶联起来而制备本发明的双特异性分子。例如，可以分别生成双特异性分子中的每一种结合特异性，然后再将它们偶联在一起。当所述结合特异性为蛋白质或肽时，可以使用多种偶联试剂或交联试剂来进行共价偶联。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-联硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky etal.(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其它方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan et al.(1985)Science 229：81-83，和Glennie et al.(1987)J.Immunol.139：2367-2375中所述的方法。优选的偶联试剂为SATA和磺基-SMCC，都可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)公司商购。
当所述结合特异性为抗体时，它们之间可以经由两个重链之间的C末端铰链区的二硫键相偶联。在一个特别优选的实施方案中，在偶联之前对铰链区进行修饰，使其含有奇数个巯基残基，优选地含有一个巯基残基。
作为替代，两种结合特异性可以由相同的载体编码并在同一宿主细胞中表达和组装。当所述双特异性分子为mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)2或配体×Fab融合蛋白时，这一方法特别有用。本发明的双特异性分子为含有一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或含有两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以含有至少两个单链分子。制备双特异性分子的方法记载于例如美国专利No.5,260,203、美国专利No.5,455,030、美国专利No.4,881,175、美国专利No.5,132,405、美国专利No.5,091,513、美国专利No.5,476,786、美国专利No.5,013,653、美国专利No.5,258,498和美国专利No.5,482,858中。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可以通过下列方法来确认，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹分析。上述每一种分析总体上都是通过使用特异性针对目的蛋白质-抗体复合物的标记试剂(例如抗体)，来检测所述特定复合物的存在。例如，可以使用能够识别和特异性结合所述抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。或者，可以使用任何各种其它免疫测定来检测所述复合物。例如，可对所述抗体进行放射性标记并用放射免疫测定(RIA)来检测(参见例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh TrainingCourse on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March，1986，该文献以援引的方式纳入本文)。可以使用例如γ计数器或闪烁计数器等装置或通过放射自显影来检测所述放射性同位素。
偶联物
本发明的偶联物中，该伴侣分子经由化学连接物(有时简称为“接头”)与抗体偶联。该伴侣分子可以是治疗剂或标记物。该治疗剂例如可以是细胞毒素、非细胞毒性药物(如免疫抑制剂)、放射性试剂、另一抗体或酶。伴侣分子优选地是细胞毒素。该标记物可以是产生可检测的信号的标记，如放射性标记、荧光标记或对催化底物的可检测修饰的酶。抗体具有靶向功能：通过与发现抗原所在处的靶组织或细胞结合，抗体使偶联物转向靶组织或细胞。在所述靶组织或细胞中，该连接物被切割，释放伴侣分子以执行其所需的生物学功能。
伴侣分子与抗体连接的比例可以随着诸如偶联反应过程中所用的伴侣分子的量和试验条件等因素而变化。伴侣分子与抗体的比例优选为1-3，更优选为1-1.5。本领域的技术人员将可以认为，抗体Z的各单独分子与整数个伴侣分子偶联，而偶联物制剂可以分析伴侣分子与抗体的非整数比，此显示为统计学平均值。
连接物
在一些实施方案中，连接物是肽基连接物，此处被表示为(L4)p-F-(L1)m。其它连接物包括肼和二硫化物连接物，此处分别被表示为(L4)p-H-(L1)m和(L4)p-J-(L1)m。F、H和J分别为肽基、肼和二硫化物部分，它们可以被切割从而将伴侣分子从抗体上释放出来，此时L1和L4为连接物。F、H、J、L1和L4，连同下标p和m一起在下文有更充分的定义。这些和其它连接物的制备和使用说明于WO 2005/112919中，其公开内容以引用的方式结合在本文中。
US 2006/0004081；2006/0024317；2006/0247295；6,989,452；7,087,600；和7,129,261；WO 2007/051081；2007/038658；2007/059404；和2007/089100说明了肽基和其它连接物在抗体-伴侣分子偶联物中的使用，所有这些文献通过引用结合在本文中。
US 6,214,345；2003/0096743；和2003/0130189；de Groot等人，J.Med.Chem.42，5277(1999)；de Groot等人J.Org.Chem.43，3093(2000)；deGroot等人，J.Med.Chem.66，8815，(2001)；WO 02/083180；Carl等人，J.Med.Chem.Lett.24，479，(1981)；Dubowchik等人，Bioorg & Med.Chem.Lett.8，3347(1998)说明了其它连接物，所有这些文献的公开内容通过引用结合在本文中。
除连接抗体和伴侣分子之外，连接物还可使伴侣分子具有稳定性，减小其体内毒性，或者对其药代动力学、生物利用度和/或药效学产生有利的影响。通常优选的是一旦偶联物被输送至其作用部位，连接物即被切割，释放出伴侣分子。同样优选的是，连接物无痕迹，使得一旦被切割，不留有连接物的存在痕迹。
在另一实施方案中，连接物的特征在于它们在靶细胞内或附近位点(例如在伴侣分子的治疗作用位点或标记活性位点)被切割的能力。该切割本质上具有酶促性。这一特点有助于减小伴侣分子的系统激活、减少毒性和系统副作用。用于酶促切割的优选的可切割基团包括肽键、酯键、二硫键，如前述的F、H和J部分。在其它的实施方案中，连接物对pH敏感，可通过改变pH而被切割。
一个重要的方面是控制连接物的切割速度的能力。一般需要快速切割的连接物。然而，在一些实施方案中，可能优选切割较慢的连接物。例如，在缓释制剂或同时具有快速释放成分和慢速释放成分的制剂中，提供较慢切割的连接物是有用的。前述的WO 2005/112919公开了肼连接物，它可以被设计为在一定速度范围内(从极快到极慢)切割。
在偶联物处在循环过程中时，在到达靶组织或细胞前，连接物还可用于稳定伴侣分子，防止其降解。这是重要的有利之处，因为它延长了伴侣分子的循环半衰期。连接物还可用于减弱伴侣分子的活性以使偶联物在循环时相对为良性，而伴侣分子在所需的作用位点活化后具有所需效果，例如具有细胞毒性。对于治疗剂偶联物而言，连接物这一特点可改善该试剂的治疗指数。
除了可切割的肽、肼或二硫化物基团(分别为F、H或J)之外，根据情况，一个或多个连接基团L1可任选被导入至伴侣分子和F、H或J之间。这些连接基团L1还可被称为间隔基团并包含至少两个官能团。依据下标m的值(即，存在的L1基团的个数)和特定基团L1的位置，根据情况，基团L1的化学官能团可以与F、H或J的伴侣分子的化学官能团结合，或者与另一连接基团L1的化学官能团键合(如果存在多于一个的L1基团的活)。用于间隔基团L1的适宜的化学官能团的例子包括羟基、巯基、羰基、羧基、氨基、酮、醛和巯基基团。
连接物L1可以是被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基或被取代的或未被取代的杂烷基。在一个实施方案中，烷基或芳基可包含1-20个碳原子。它们还可以包含聚乙二醇部分。
示例性基团L1包括例如6-氨基己醇、6-巯基己醇、10-羟基癸酸、甘氨酸和其它氨基酸、1，6-己二醇、β-丙氨酸、2-氨基乙醇、半胱胺(2-氨基乙硫醇)、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、3-马来酰亚胺基苯甲酸、苯酞(phthalide)、α-取代的苯酞、羰基、缩醛胺酯、核酸和肽等。
基团L1的一种功能是根据情况提供F、H或J与伴侣分子之间的空间分离，以免后者干扰(例如通过位阻效应或电效应)在F、H或J处的切割化学性。基团L1还可用于将额外的分子量和化学官能团引入偶联物。通常，额外的分子量和官能团影响偶联物的血清半衰期和其它性质。因此，通过仔细挑选间隔基团，可以制得血清半衰期在一定范围内的偶联物。可任选的是，一个或多个连接物L1可以是自消基团(self-immolativegroup)，如后所述。
下标m是选自0、1、2、3、4、5和6的整数。多个L1基团存在时，它们可为相同或不同。
L4是连接物部分，可根据情况提供F、H或J与抗体之间的空间分离的连接物，以免F、H或J干扰抗体与抗原的结合或者抗体干扰F、H或J的切割化学性。优选的是，L4利用包含所述部分或改变所述偶联物的水解速率的连接物，增大偶联物的溶解性或减小其凝集性。如在L1情况所示，L4任选地是自消基团。在一个实施方案中，L4为被取代的烷基、未被取代的烷基、被取代的芳基、未被取代的芳基、被取代的杂烷基或未被取代的杂烷基，所述基团的任一个都可以为直链、支链或环状。取代基例如可以是低级(C1-C6)烷基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基或者二烷基氨基。在一些实施方案中，L4包括非环状部分。在另一实施方案中，L4包括带正电或负电的氨基酸聚合物，如聚赖氨酸或聚精氨酸。L4可包括诸如聚乙二醇部分等聚合物。另外，L4可同时包括诸如聚合物部分和小分子部分。
在一个优选的实施方案中，L4包括聚乙二醇(PEG)部分。L4的PEG部分可为1到50个单元长。优选的是，PEG含有1到12个重复单元，更优选3到12个重复单元，更优选2到6个重复单元，或甚至更优选3到5个重复单元，最优选4个重复单元。L4可仅仅由PEG部分组成，或也可包括其它的未取代的或未被取代的烷基或杂烷基。将PEG作为L4部分的一部分进行组合可以用于提高复合物的水溶性。另外，PEG部分可以降低可能在药物和抗体偶联过程中发生的凝集的程度。
下标p为0或1；也就是说，L4的存在是任选的。当L4存在时，其至少具有两个功能团，根据情况，一个官能团结合F、H或J中的化学官能团，另一官能团结合抗体。基团L4的适宜化学官能团的实例包括羟基、巯基、羰基、羧基、氨基、酮、醛和巯基基团。由于抗体通常经巯基基团(例如来自未氧化的半胱氨酸残基，用亚氨基硫杂环戊烷使含有巯基的延伸部分添加到赖氨酸残基，或者二硫化物桥键的还原)、氨基(例如来自赖氨酸残基)、醛基(例如来自糖苷侧链的氧化)或羟基(例如来自丝氨酸残基)偶联，用于连接抗体的优选的化学官能团是与前述基团具有反应性的官能团，其实例为马来酰亚胺、巯基、醛基、肼基、氨基脲和羧基。优选抗体上的巯基与L4上的马来酰亚胺基的组合。
在一些实施方案中，L4包括与(AA1)c的N末端直接连接的
Figure GPA00001143083600711
R20选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基和酰基的基团。R25、R25’、R26和R26’各自独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基和被取代的或未被取代的杂环烷基；s和t独立地为1-6的整数。优选的是，R20、R25、R25’、R26和R26’是疏水性的。在一些实施方案中，R20是H或烷基(优选的是未被取代的低级烷基)。在一些实施方案中，R25、R25’、R26和R26’独立地为H或烷基(优选的是未被取代的C1-C4烷基)。在一些实施方案中，R25、R25’、R26和R26’均为H。在一些实施方案中，t为1，s为1或2。
肽连接物(F)
如上所述，本发明的肽基连接物可由通式(L4)p-F-(L1)m表示，其中F表示含有肽基部分的部分。在一个实施方案中，F部分包括可选的额外的自消连接物L2和羰基，从而对应于式(a)的偶联物：
在该实施方案中，L1、L4、p和m如上所述。X4为抗体，D为伴侣分子。下标o为0或1，L2如果存在，则表示自消连接物。AA1代表一个或多个天然氨基酸，和/或非天然α-氨基酸；c为1到20的整数。在一些实施方案中，c为2-5的整数，或c为2或3。
式(a)中，AA1在其氨基末端直接与L4相连，如果没有L4，则直接与X4相连。在一些实施方案中，如L4存在，L4不含直接与(AA1)c的N末端相连的羧酰基团。
在另一实施方案中，F部分包括氨基基团和可选的间隔基团L3，且L1不存在(即m为零)，从而对应于式(b)的偶联物：
Figure GPA00001143083600722
在该实施方案中，X4、D、L4、AA1、c和p如上所述。下标o为0或1。L3如果存在，则为含有伯胺或仲胺或羧基官能团的间隔基团，并且或者L3的胺基与D的侧链羧基官能团形成酰胺键，或者L3的羧基与D的侧链胺基官能团形成酰胺键。
自消连接物
自消连接物是双官能化合物部分，它能将两个间隔的化学部分共价连接成通常稳定的三节分子(tripartate molecule)，通过酶切割从该三节分子释放所述间隔的化学部分中的一个；在所述酶切割之后，从分子的残余部分中自发切割而释放所述间隔的化学部分中的另一个。根据本发明，自消间隔区在其一端和肽部分共价连接，而在其另一端与药物部分的化学反应位点共价连接，药物部分的衍生化会抑制药理活性，以间隔并将肽部分与药物部分共价连接成三节分子，所述分子在靶酶不存在的情况下是稳定的且无药理活性，但可被该靶酶在共价连接间隔区部分与肽部分的键处发生酶促切割，从而使肽部分从三节分子中释放出来。反过来，此酶促切割又能够激活间隔区部分的自消性质，且引发共价连接间隔区部分与药物部分的键的自发断裂，由此释放药理活性形式的药物。例如，参见Carl et al.，J.Med.Chem.，24(3)，479-480(1981)；Carl et al.，WO 81/01145(1981)；Toki et al.，J.Org.Chem.67，1866-1872(2002)；Boydet al.WO 2005/112919；以及Boyd et al.WO 2007/038658，其内容通过引用结合在本文中。
一种特别优选的自消间隔区可以由式(c)表示：
氨基苄基的芳环可由一个或多个“K”基团取代。“K”基团是芳环上的取代基，其取代原本与作为环结构部分的四个非取代碳之一相连的氢。“K”基团可以是单原子，如卤素，也可以是多原子基团，如烷基、杂烷基、氨基、硝基、羟基、烷氧基、卤代烷基和氰基。每个K独立地选自由被取代的烷基、未被取代的烷基、被取代的杂烷基、未被取代的杂烷基、被取代的芳基、未被取代的芳基、被取代的杂芳基、未被取代的杂芳基、被取代的杂环烷基、未被取代的杂环烷基、卤素，NO2、NR21R22、NR21COR22、OCONR21R22、OCOR21和OR21组成的组，其中R21和R22独立地选自由H、被取代的烷基、未被取代的烷基、被取代的杂烷基、未被取代的杂烷基、被取代的芳基、未被取代的芳基、被取代的杂芳基、未被取代的杂芳基、被取代的杂环烷基、和未被取代的杂环烷基组成的组。示例性的K取代基包括但不限于F、Cl、Br、I、NO2、OH、OCH3、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3和甲基。对于“Ki”，i为0、1、2、3或4中的整数。在一个优选实施方案中，i为0。
上述结构的醚氧原子与羰基(未示出)相连。NR24官能团与芳环相连的线表示胺功能团可以与成环的且未被-CH2-O-取代的5个碳中的任一个键合。优选的是，X的NR24官能团在相对于-CH2-O-的对位处与芳环共价结合。R24是选自由H，被取代的烷基、未被取代的烷基、被取代的杂烷基、和未被取代的杂烷基组成的组的基团。在一个具体的实施方案中，R24为H。
在一个实施方案中，本发明提供上式(a)的肽连接物，其中F包含以下结构：
Figure GPA00001143083600741
其中，R24、AA1、K、i和c的定义如前所述。
在另一实施方案中，式(a)的肽连接物包含具有以下结构的-F-(L1)m-：
Figure GPA00001143083600742
其中R24、AA1、K、i和c的定义如前所述。
在一些实施方案中，自消间隔区L1或L2包括：
Figure GPA00001143083600743
其中各R17、R18和R19独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、和被取代的或未被取代的芳基，其中w为0到4的整数。在一些实施方案中，R17和R18独立地为H或者烷基(优选未被取代的C1-C4烷基)。优选地，R17和R18为C1-4烷基，如甲基或乙基。在一些实施方案中，w为0。实验发现，该特定的自消间隔区成环速度相对较快。
在一些实施方案中，L1或L2包括：
Figure GPA00001143083600744
其中，R17、R18、R19、R24和K的定义如前所述。
间隔基团
间隔基团L3的特征在于包括伯胺或仲胺或羧基官能团，并且或者L3的胺与D的侧链羧基官能团形成酰胺键，或者L3的羧基与D的侧链胺官能团形成酰胺键。L3可选自由被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基或被取代的或未被取代的杂环烷基组成的组。在一个优选的实施方案中，L3包括芳香族基团。更优选L3包括苯甲酸基团、苯胺基团或吲哚基团。可以用作-L3-NH-间隔区的结构的非限制性实例包括下列结构：
Figure GPA00001143083600751
其中Z为选自O、S和NR23的成员，并且其中R23为选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、和酰基的基团。
包含L3的本发明连接物在切割时，L3部分仍然与药物D连接。因此，选择L3部分以使其与D的连接不显著改变D的活性。在另一实施方案中，药物D本身的一部分可用作L3间隔区。例如，在一个实施方案中，药物D是多卡米星(duocarmycin)的衍生物，其中药物的一部分作为L3间隔区起作用。该实施方案的非限制性实例包括其中的NH2-(L3)-D具有选自以下的结构的那些实例：
Figure GPA00001143083600752
其中，Z为O、S和NR23，其中R23为H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、或酰基；各结构上的NH2基团与(AA1)c反应形成-(AA1)c-NH-。
肽序列(AA 1 ) c
基团AA1表示单个氨基酸或多个经酰胺键连接在一起的氨基酸。氨基酸可以是天然氨基酸和/或非天然α氨基酸。它们可以为L或D构型。在一个实施方案中，使用至少三个不同的氨基酸。在另一实施方案中，仅仅使用两个氨基酸。
术语“氨基酸”指的是天然存在的氨基酸和合成氨基酸，以及氨基酸的类似物和氨基酸的模拟物，它们发挥作用的方式与天然存在的氨基酸类似。天然存在的氨基酸是被遗传密码编码的氨基酸，以及随后被修饰的那些氨基酸，如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸和邻磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指的是具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，其中α碳与氢、羧基、氨基和R基团连接，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有被修饰的R基团(如正亮氨酸)或被修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。一种尤其可以使用的氨基酸是瓜氨酸，它是精氨酸的前体，与肝脏中尿素的合成有关。氨基酸模拟物指的是这样的化学化合物，其具有与氨基酸的普通化学结构不同的结构，但发挥作用的方式与天然存在的氨基酸类似。术语“非天然氨基酸”表示上述的二十个天然存在的氨基酸的“D”立体化学形式。进一步而言，术语“非天然氨基酸”包括天然氨基酸的同系物，和天然氨基酸的合成修饰形式。合成修饰形式包括但不限于具有缩短或延长至最多2个碳原子的亚烷基链的氨基酸、包括任选取代的芳基的氨基酸和包括卤化基团(优选为卤化烷基和芳基)的氨基酸。当与本发明的连接物或偶联物相连时，氨基酸为“氨基酸侧链”形式，其中氨基酸的羧酸基团被酮(C(O))基团取代。因此，例如丙氨酸侧链为-C(O)-CH(NH2)-CH3等等。
肽序列(AA1)c在功能上是单个氨基酸(c＝1时)或多个经酰胺键连接在一起的氨基酸的酰胺化残基。肽序列(AA1)c优选选择用于利用生物系统中所关注位置的酶的酶催化切割。例如，对于靶向细胞但是并未被细胞内化的偶联物，选择被胞外基质中的蛋白酶(例如由附近濒于死亡的细胞释放的蛋白酶或与肿瘤有关的蛋白酶)切割的肽，由此使肽在细胞外被切割。对于经设计用于被细胞内化的偶联物，序列(AA1)c优选选择用于被内体或溶酶体蛋白酶切割。肽中氨基酸的数目可为1-20；然而更优选包含(AA1)c的1-8个氨基酸，1-6个氨基酸或1、2、3或4个氨基酸。对特定酶或酶组的切割敏感的肽序列在本领域中是公知的。
优选的是，(AA1)c包含为蛋白酶切割位点的氨基酸序列(“切割识别序列”)。许多蛋白酶切割序列在本领域中是公知的。例如，参见Matayoshiet al.Science 247：954(1990)；Dunn et al.Meth.Enzymol.241：254(1994)；Seidah et al.Meth.Enzymol.244175(1994)；Thomberry，Meth.Enzymol.244：615(1994)；Weber et al.Meth.Enzymol.244：595(1994)；Smith etal.Meth.Enzymol.244：412(1994)；Bouvier et al.Meth.Enzymol.248：614(1995)，Hardy et al.，in Amyloid Protein Precursor in Development，Aging，and Alzheimer′s，ed.Masters et al.pp.190-198(1994)。
肽通常包含3-12(或更多)个氨基酸。特定氨基酸的选择至少部分取决于将用于切割肽的酶，以及肽在体内的稳定性。合适的可切割肽的一个实例是β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：27)。它可以与稳定基团结合形成琥珀酰-β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：30)。其它合适的可切割肽的实例提供在下面引用的文献中。作为替代，可以使用包括单个氨基酸残基的连接物，如WO 2008/103693中所公开的，其公开内容通过引用结合在本文中。
在一个优选的实施方案中，基于被溶酶体蛋白酶切割的能力选择肽序列(AA1)c，所述蛋白酶的实例包括组织蛋白酶B、C、D、H、L和S。优选的是，肽序列(AA1)c在体外能够被组织蛋白酶B切割。虽然组织蛋白酶B是溶酶体蛋白酶，但在肿瘤组织周围的胞外基质中发现了一定浓度的组织蛋白酶B。
在另一实施方案中，基于被肿瘤相关蛋白酶(例如在肿瘤细胞附近胞外发现的蛋白酶)切割的能力选择肽序列(AA1)c，其实例包括巯基和金属依赖性寡肽酶(TOP)和CD10。或者，设计序列(AA1)c用于被尿激酶或类胰蛋白酶选择性切割。
作为一个说明性实例，CD10，也被称为肾胰岛素残基溶酶、中性内肽酶(NEP)、和常见急性淋巴母细胞白血病抗原(CALLA)，是II型细胞-表面锌依赖型金属蛋白酶。适宜使用CD10的可切割底物包括Leu-Ala-Leu和Ile-Ala-Leu。
另一个说明性实例基于基质金属蛋白酶(MMP)。可能是与肿瘤有关最佳表征的蛋白水解酶，在肿瘤微环境中MMP的活化作用具有明显的相关性。尤其是，已经对可溶性基质酶MMP2(明胶酶A)和MMP9(明胶酶B)进行了深入研究，它们在包括肿瘤生长在内的组织重构中显示被选择性激活。已设计出可被MMP2和MMP9切割的肽序列并测试下列物质的偶联物：葡聚糖和氨甲喋呤(Chau et al.，Bioconjugate Chem.15：931-941(2004))；PEG(聚乙二醇)和多柔比星(Bae et al.，Drugs Exp.Clin.Res.29：15-23(2004))；以及白蛋白和多柔比星(Kratz et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.11：2001-2006(2001))。使用MMP的合适序列的实例包括但不限于Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly(SEQ.ID NO：21)、Gly-Pro-Leu-Gly-Val(SEQ.ID NO：22)、Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln(SEQ.ID NO：23)、Pro-Leu-Gly-Leu(SEQ.ID NO：24)、Gly-Pro-Leu-Gly-Met-Leu-Ser-Gln(SEQ.ID NO：25)和Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-Gln(SEQ.ID NO：26)(例如，参见上文引用的文献以及Kline et al.，Mol.Pharmaceut.1：9-22(2004)和Liu et al.，Cancer Res.60：6061-6067(2000))。
又一实例是II型跨膜丝氨酸蛋白酶。这一组酶包括例如hepsin、睾蛋白(testisin)和TMPRSS4。Gln-Ala-Arg是一个底物序列，其用于蛋白裂解酶(matriptase)/MT-SP1(在乳腺癌和卵巢癌中过量表达)，Leu-Ser-Arg用于hepsin(在前列腺和其它一些肿瘤类型中过量表达)。(例如，参见Leeet al.，J.Biol.Chem.275：36720-36725以及Kurachi andYamamoto，Handbook of Proeolytic Enzymes Vol.2，2nd edition(Barrett AJ，Rawlings ND& Woessner JF，eds)pp.1699-1702(2004))。
适合在本发明的偶联物中使用的适宜的、但非限制性的肽序列的实例包括Val-Cit、Cit-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-tosyl-Arg、Phe-N9-nitro-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：27)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ.ID NO：28)、Val-Ala，Leu-Leu-Gly-Leu(SEQ IDNO：29)、Leu-Asn-Ala和Lys-Leu-Val。优选的肽序列是Val-Cit和Val-Lys。
在另一实施方案中，最接近药物部分位置的氨基酸选自由Ala、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val组成的组。在又一实施方案中，最接近药物部分位置的氨基酸选自由Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val组成的组。
本领域的技术人员可容易地评价大量肽序列以确定其在本发明中的效用，无需过度的试验。例如，参见Zimmerman，M.，et al.，(1977)Analytical Biochemistry 78：47-51；Lee，D.，et al.，(1999)Bioorganic andMedicinal Chemistry Letters 9：1667-72；和Rano，T.A.，et al.，(1997)Chemistry and Biology 4：149-55。
本发明的偶联物可任选地包含两个或两个以上的连接物。这些连接物可以相同或不同。例如，肽基连接物可用于连接药物和配体，第二肽基连接物可连接诊断剂和复合物。额外连接物的其它用途包括连接分析试剂、生物分子、靶向试剂和抗体-伴侣分子复合物的可检测标记。
肼连接物(H)
在另一实施方案中，本发明的偶联物包括肼自消连接物，其中所述偶联物具有以下结构：
                X4-(L4)p-H-(L1)m-D
其中，D、L1、L4、p、m和X4如上所限定，并在此处进一步说明，H是包含以下结构的连接物：
Figure GPA00001143083600801
其中n1是1-10的整数；n2是0、1或2；各R24是独立地选自由H、被取代的烷基、未被取代的烷基、被取代的杂烷基和未被取代的杂烷基组成的组的基团；I是键(即，骨架上的碳原子与临近氮之间的键)或以下结构：
Figure GPA00001143083600802
其中，n3为0或1，条件是当n3为0时，n2不是0；n4为1、2或3。
在一个实施方案中，苯环上的取代是对位取代。在优选的实施方案中，n1为2、3或4，或n1为3。在优选的实施方案中，n2为1。在优选的实施方案中，I是键(即，骨架上的碳原子与临近氮之间的键)。一方面，肼连接物H可在切割时形成6元自消连接物，例如当n3为0且n4为2时。另一方面，肼连接物H可在切割时形成两个5元自消连接物。在其它方面，切割时H形成5元自消连接物，H形成7元自消连接物，或H形成5元自消连接物和6元自消连接物。切割速率受切割时形成的环大小的影响。因此，依据所需的切割速率，可选择切割时形成的适宜大小的环。
另一肼结构H具有下式：
Figure GPA00001143083600811
其中q为0、1、2、3、4、5或6；各R24是独立地选自由H、被取代的烷基、未被取代的烷基、被取代的杂烷基和未被取代的杂烷基组成的组的基团。该肼结构也可形成五元、六元或七元环，可以加入其它成分以形成多个环。
WO 2005/112919公开了各种肼连接物的制备、切割化学性和环化动力学，所公开的内容通过引用结合在本文中。
二硫化物连接物(J)
在又一实施方案中，连接物包括可酶促切割的二硫化物基团。在一个实施方案中，本发明提供一种具有式(d)结构的细胞毒性抗体-伴侣分子化合物：
Figure GPA00001143083600812
其中，D、L1、L4、p、m和X4如上所限定，并在此处进一步说明，J是包括具有以下结构的基团的二硫化物连接物：
其中，各R24是独立地选自由H、被取代的烷基、未被取代的烷基、被取代的杂烷基和未被取代的杂烷基组成的组的基团；各K是独立地选自由被取代的烷基、未被取代的烷基、被取代的杂烷基、未被取代的杂烷基、被取代的芳基、未被取代的芳基、被取代的杂芳基、未被取代的杂芳基、被取代的杂环烷基、未被取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR21R22、NR21COR22、OCONR21R22、OCOR21和OR21组成的组的基团，其中，R21和R22独立地选自由H、被取代的烷基、未被取代的烷基、被取代的杂烷基、未被取代的杂烷基、被取代的芳基、未被取代的芳基、被取代的杂芳基、未被取代的杂芳基、被取代的杂环烷基和未被取代的杂环烷基组成的组；i为0、1、2、3或4中的整数；d为0、1、2、3、4、5或6中的整数。
二硫化物连接物的芳环可以被一个或多个“K”基团取代。“K”基团是取代基，取代原本与作为环结构部分的四个非取代碳之一相连的氢。“K”基团可以是单原子，如卤素，也可以是多原子基团，如烷基、杂烷基、氨基、硝基、羟基、烷氧基、卤代烷基和氰基。示例性的K取代基包括但不限于F、Cl、Br、I、NO2、OH、OCH3、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3和甲基。对于“Ki”，i为0、1、2、3或4中的整数。在一个具体的实施方案中，i为0。
在一个优选的实施方案中，连接物包含下式的可酶促切割的二硫化物连接物：
Figure GPA00001143083600821
其中，L4、X4、p和R24如上所限定，d为0、1、2、3、4、5或6。在一个特定的实施方案中，d为1或2。
更具体的二硫化物连接物如下式所示：
Figure GPA00001143083600822
优选的是，d为1或2，各K为H。
另一种二硫化物连接物如下式所示：
Figure GPA00001143083600823
优选的是，d为1或2，各K为H。
在各种实施方案中，二硫化物在胺的邻位。在另一具体的实施方案中，a为0。在优选的实施方案中，R24独立地选自H和CH3。
WO 2005/112919公开了诸如上述的二硫化物连接物的制备和使用，其公开内容通过引用结合在本文中。
关于细胞毒素、连接物和治疗剂与抗体偶联的类型的更多讨论，还可参见US 7,087,600；US 6,989,452；US 7,129,261；US 2006/0004081；US 2006/0247295；WO 02/096910；WO 2007/051081；WO 2005/112919；WO 2007/059404；WO 2008/083312；WO 2008/103693；Saito et al.(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail et al.(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan andKreitman(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter and Springer(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264，以上各文献通过引用结合在本文中。
作为伴侣分子的细胞毒素
在一方面中，本发明的特征在于与伴侣分子(如细胞毒素、药物(如免疫抑制剂)或放射性毒素)偶联的抗体。该偶联物也被称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害(如杀死细胞)的任何试剂。此处，“细胞毒素”包括前药形式并在体内转化为实际的毒性物种的化合物。
本发明的伴侣分子的实例包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽醌(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌、光辉霉素、放射菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。伴侣分子的实例还包括例如抗代谢物(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷基化试剂(如氮芥、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、tubulysin、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C、顺铂、蒽环类抗生素(如柔红比星(以前为柔红霉素)和多柔比星)、抗生素(如更生霉素(以前为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，以及抗有丝分裂剂(如长春新碱和长春碱)。其它可与本发明的抗体偶联的伴侣分子的优选实例包括卡奇霉素、美坦辛和阿里斯达汀(auristatin)及其衍生物。
伴侣分子的优选实例是CC-1065和结构相关的多卡米星的类似物和衍生物。虽然其具有强效而广泛的抗肿瘤活性，但因CC-1065可引起试验动物的迟发性死亡，故不能用于人类，这推动了对于具有更好治疗指数的类似物或衍生物的探索。
CC-1065和多卡米星的许多类似物和衍生物在本领域中是公知的。已经综述了对许多化合物的结构、合成和性质的研究。例如，参见Bogeret al.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：1438(1996)；和Boger et al.，Chem.Rev.97：787(1997)。关于CC-1065的类似物或衍生物的其它公开内容包括：US 5,101,038；US 5,641,780；US 5,187,186；US 5,070,092；US5,703,080；US 5,070,092；US 5,641,780；US 5,101,038；US 5,084,468；US 5,739,350；US 4,978,757、US 5,332,837和US 4,912,227；WO96/10405；以及EP 0,537,575 A1。
在特别优选的方面中，伴侣分子是具有下式(e)的结构的CC-1065/多卡米星类似物：
Figure GPA00001143083600841
其中，环系统A是选自被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基和被取代的或未被取代的杂环烷基的基团。示例性的环系统A包括苯基和吡咯基。
符号E和G独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、杂原子、单键，或者E和G任选地连接形成环系统，该环系统选自被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基和被取代的或未被取代的杂环烷基。
符号X表示选自O、S和NR23的基团。R23是选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、和酰基的基团。
符号R3表示选自(＝O)、SR11、NHR11和OR11的基团，其中，R11是H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、单磷酸、二磷酸、三磷酸、磺酸、酰基、C(O)R12R13、C(O)OR12、C(O)NR12R13、P(O)(OR12)2、C(O)CHR12R13、SR12或SiR12R13R14。符号R12、R13和R14独立地表示H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基和被取代的或未被取代的芳基，其中R12和R13及与之所连的氮原子或碳原子任选地连接形成被取代的或未被取代的杂环烷基环系统，该环系统为4-6元环系统并任选地包含2个或2个以上的杂原子。
R4、R4’、R5和R5’是独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、被取代的或未被取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16和O(CH2)nN(CH3)2的基团，其中，n为1-20的整数，或者R4、R4’、R5和R5’的任何相邻对与其所连的碳原子连接，形成具有4-6元环的被取代的或未被取代的环烷基或杂环烷基环系统。R15和R16独立地表示H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、被取代的或未被取代的杂环烷基和被取代的或未被取代的肽基，其中R15和R16及与其所连的氮原子任选地相连接，形成被取代的或未被取代的杂环烷基环系统，该环系统为4-6元环系统并任选地包含两个或更多的杂原子。一个示例性的结构是苯胺。
R3、R4、R4’、R5和R5’之一将细胞毒素与本发明的连接物或酶可切割底物连接，如此处所述，例如与L1或L3连接(如果存在)，或与F、H或J连接。
R6是存在或不存在的单键。R6存在时，R6和R7连接形成环丙基环。R7是CH2-X1或-CH2-。R7是-CH2-时，它是环丙烷环的成分。符号X1表示离去基团，如卤素(例如Cl、Br或F)。以不会违反化学价原理的方式解释R6和R7的组合。
X1可以是任何离去基团。有用的离去基团包括但不限于卤素、叠氮化物、磺酸酯(如烷基磺酰基、芳基磺酰基)、氧鎓离子、高氯酸烷基酯、氨基烷基磺酸酯、以及烷基氟代磺酸酯和氟化化合物(如三氟甲磺酸酯、全氟甲磺酸酯、三氟乙烷磺酸酯)等。特殊的可用作离去基团的卤素是F、Cl和Br。
六元环中的曲线表示该环可能具有一个或多个不饱和度，并且它可以是芳香族的。因此，环结构(如以下所示)及其相关结构在式(f)的范围内：
Figure GPA00001143083600861
在一个实施方案中，R11包括X5部分，其不会自环化，并将药物与L1或L3(如果存在)连接，或与F、H或J连接。X5部分优选地可以使用酶进行切割，并在切割时提供活性药物。作为一个实例，R11可具有以下结构(其右侧与药物的其余部分偶联)：
Figure GPA00001143083600862
在一些实施方案中，R4、R4’、R5和R5’中的至少一个将所述药物与L1(如果存在)连接，或与F、H、J或X2连接，并且R3选自SR11、NHR11和OR11。R11选自-SO(OH)2、-PO(OH)2、-AAn、-Si(CH3)2C(CH3)3、-C(O)OPhNH(AA)m、
Figure GPA00001143083600863
Figure GPA00001143083600864
或任何其它糖或多种糖的组合、
Figure GPA00001143083600865
及其药学可接受的盐，其中n为1-10的任意整数，m为1-4的任意整数，p为1-6的任意整数，AA为任何天然或非天然氨基酸。当式(e)的化合物经R4、R4’、R5或R6偶联时，R3优选包括可切割阻断基团，该基团的存在可阻断化合物的细胞毒性活性，但是在见于预期作用位点的条件下通过与用于切割使细胞毒素与抗体偶联的连接物不同的机制可以切割。通过这种方法，如果在血浆中存在偶联物的偶然切割，阻断基团则可削弱所释放的细胞毒素的细胞毒性。例如，如果偶联物具有腙连接物或二硫化物连接物，则阻断基团可以是酶可切割的酰胺。或者，如果连接物是蛋白酶可切割的肽基，则阻断基团可以是羧酸酯酶可切割的酯或氨基甲酸酯。
例如，在一个优选的实施方案中，D为具有结构(j)的细胞毒素：
在该结构中，R3、R6、R7、R4、R4’、R5、R5’和X如以上式(e)中所述。Z为选自O、S和NR23的成员，其中R23为选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、和酰基的基团。
R1为H、被取代的或未被取代的低级烷基、C(O)R8或CO2R8，其中R8为选自NR9R10和OR9中的基团，其中R9和R10为独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基的基团。
R1’为H、被取代的或未被取代的低级烷基、或C(O)R8，其中R8为选自NR9R10和OR9的基团，其中R9和R10为独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基的基团。
R2为H、或被取代的或未被取代的低级烷基、或未被取代的杂烷基或氰基或烷氧基；R2’为H、或被取代的或未被取代的低级烷基或未被取代的杂烷基。
R3、R4、R4’、R5或R5’之一将细胞毒素与L1或L3(如果存在)连接，或与F、H或J连接。另一实施方案具有下式：
Figure GPA00001143083600881
在该结构中，A、R6、R7、X、R4、R4’、R5和R5’如以上式(e)所述。Z为选自O、S和NR23的成员，其中R23为选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、和酰基的基团。
R34为C(＝O)R33或C1-C6烷基，其中R33选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、被取代的或未被取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16和O(CH2)nN(CH3)2，其中n为1-20的整数。R15和R16独立地表示H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、被取代的或未被取代的杂环烷基和被取代的或未被取代的肽基，其中R15和R16及与之所连的氮原子任选地连接形成被取代的或未被取代的杂环烷基环系统，该环系统为4-6元环系统，并任选地包含两个或更多杂原子。
优选的是，A为被取代的或未被取代的苯基或被取代的或未被取代的吡咯基。此外，此处说明的用于R11的取代基的任何选择也适用于R33。
优选的伴侣分子具有由式(I)表示的结构
Figure GPA00001143083600882
式(I)中，PD表示前药基团(有时也称为保护基团)。化合物(I)在原位水解(优选为酶促)从而释放式(II)的化合物。本领域的技术人员可认识到化合物式(II)属于被称为CBI化合物的化合物种类((Boger et al.，J.Org.Chem.2001，66，6654-6661；和Boger et al.，US 2005/0014700 A1(2005))。CBI化合物原位(或者当施用于患者时为体内)转化成为它们的环丙基衍生物，如化合物(III)，与DNA的小沟结合，然后在腺嘌呤基团上烷基化DNA，所述环丙基衍生物被认为是实际的烷基化物质。
Figure GPA00001143083600891
合适的前药基团PD的非限制性实例包括酯、氨基甲酸酯、磷酸酯、和糖苷，如下图所示：
Figure GPA00001143083600892
优选的前药基团PD是氨基甲酸酯(以上述的前五个结构为例)，其可被羧基酯酶水解；磷酸酯(上述第六个结构)，其可被碱性磷酸酶水解；以及β-葡糖醛酸衍生物，其可被β-葡糖醛酸糖苷酶水解。特别优选的伴侣分子是由式(IV)表示的氨基甲酸酯前药基团：
Figure GPA00001143083600893
作为伴侣分子的标志物
伴侣分子为标志物时，它可以是任何具有或产生可被检测的物理或化学性质以表明其存在于特定组织或细胞中的部分。标志物(有时也称为报告基团)已经在免疫测定、生物医学研究和医疗诊断领域得到充分发展。标志物可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测。其实例包括磁珠(如DYNABEADSTM)、荧光染料(如荧光素异硫氰酸酯、得克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记(如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及常用于ELISA的其它酶)、和比色标记如胶体金或有色玻璃或塑料珠(如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)。
该标志物优选地是由放射性同位素、荧光剂、荧光剂前体、发色团、酶及其组合组成的组的成员。适宜的酶的实例是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。荧光剂包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光的化合物包括荧光素和2，3-二氢酞嗪二酮如鲁米诺。对于可以使用的各种标记或信号产生体系的评述，参见US 4,391,904。
标志物可以通过间接手段连接：配体分子(如生物素)与抗体共价结合。然后配体与另一分子(如链霉亲和素)结合，该分子或者本身即为可检测的，或者与信号系统(如可检测酶、荧光化合物或化学发光化合物)共价结合。
偶联物的实例
适合与本发明的抗体偶联的伴侣分子-连接物组合的具体实例如下所示：
Figure GPA00001143083600911
式(o)如下所示：
Figure GPA00001143083600912
Figure GPA00001143083600921
Figure GPA00001143083600931
式(p)如下所示：
Figure GPA00001143083600941
Figure GPA00001143083600951
在前述的化合物中，当式中存在下标r时，其为0-24的整数。R，无论在何种情况下出现，为
Figure GPA00001143083600962
每一前述化合物均具有马来酰亚胺基团，且容易经其上的巯基与抗体偶联。
药物组合物
另一方面，本发明提供包含本发明的偶联物与药学可接受的载体以及任选的其它活性或非活性组分配制在一起的药物组合物。
本发明的药物组合物还可以与其它试剂施用于组合疗法中。例如，所述组合疗法可以包括本发明的偶联物与至少一种其它抗炎或免疫抑制剂的组合。可用于组合疗法的治疗剂的实例将在下面进行更详细地说明。
此处使用的“药学可接受的载体”包括任何和全部的生理学上兼容性的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。优选的是，所述载体适合于静脉、肌内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮给药(例如经注射或输注)。根据给药途径，活性化合物可用某种材料包被以保护该化合物免受可能导致化合物失活的酸和其它自然条件的影响。
本发明的药物组合物可包含一种或更多种药学可接受的盐。“药学可接受的盐”指的是能够保持母体化合物所需的生物活性且不会产生任何不希望有的毒理学效应的盐(例如参见Berge，S.M.，et al.，(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。该盐的实例包括酸加成盐或碱加成盐。酸加成盐包括来自无毒无机酸的盐，所述无机酸例如为盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸和亚磷酸等，以及来自无毒有机酸的盐，所述有机酸例如为脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等。碱性加成盐包括来自碱土金属如钠、钾、镁和钙等的盐，以及来自无毒有机胺如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺和普鲁卡因等的盐。
本发明的药物组合物还可包含药学可接受的抗氧化剂。药学可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠和亚硫酸钠等；(2)脂溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)和丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯和α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸和磷酸等。
合适的载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和聚乙二醇等)及其混合物，植物油如橄榄油，以及可注射的有机酯如油酸乙酯。通过使用包衣材料(如卵磷脂)、在分散体情况下维持所需颗粒大小、和使用表面活性剂，可保持适当的流动性。
所述组合物还可包含佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌和添加抗细菌剂与抗真菌剂，例如尼泊金、三氯叔丁醇和苯酚山梨酸等，都可确保防止微生物的存在。该组合物中包含等渗剂(如糖和氯化钠等)可能也是理想的。另外，可注射的药物剂型吸收延长，可通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来实现。
药学可接受的载体包含无菌水溶液或分散液和用于无菌注射溶液或分散液的实时配制的无菌粉末。用于药学活性物质的该介质和试剂的使用方法在本领域中是公知的。除了与活性化合物物不兼容的任何传统介质或试剂外，可考虑使用于本发明的药学组合物中。还可以加入辅助性活性化合物。
所述治疗组合物通常必须是无菌的并且在制造和存储条件下是稳定的。该组合物可以配制成溶液、微乳剂、脂质体，或者其它适于高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质(例如包含水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等))，及其适宜的混合物。通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散体情况下维持所需颗粒大小、和使用表面活性剂，可保持适当的流动性。在许多情况中，优选在组合物中包含等渗试剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可注射组合物吸收延长可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸盐和明胶)来实现。
无菌注射液可通过将所需量的活性化合物加入必要时具有上述列举组分中的一种或其组合的适宜溶剂中，然后进行无菌微过滤而制备。通常，分散液通过将活性化合物加入至无菌媒介物(包含基础分散介质和所需的上述列举的其它组分)进行制备。在用于制备无菌注射液的无菌粉末时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，制得活性组分与任何来自预先无菌过滤溶液的其它所需组分的粉末。
可与载体组合制得单一剂型的活性组分的量随着待治疗的受试者和特定给药方式而变化，通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，在100％的范围内，与药学可接受载体组合的活性组分的量为从约0.01％到约99％，优选从约0.1％到约70％，最优选从约1％到约30％。
调节剂量方案以提供最佳的预期反应(如治疗效果)。例如，可以一次使用一大丸药，可以随时间分剂量使用，或者根据治疗情况的紧急程度所示按比例减少或增加剂量。为给药方便及剂量统一而配制肠胃外用组合物尤为有利。此处使用的剂量单位形式指的是作为单位剂量适用于治疗受试者的物理上的不连续单位；各单位包含经计算能产生预期疗效的预定量的活性化合物以及所需的药学载体。本发明的剂量单位形式的说明由以下因素决定并直接取决于以下因素：(a)活性组合物的特性和待实现的特定疗效，和(b)配制治疗个体敏感度的活性物质时该领域固有的局限性。
对于偶联物的施用，根据使用者的体重，剂量从约0.0001到100mg/kg，更常用为0.01到5mg/kg。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重，1mg/kg体重，3mg/kg体重，5mg/kg体重或10mg/kg体重，或者1-10mg/kg的范围内。示例性的治疗方案可以限定为每周给药一次，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每月一次，每三个月一次或每3到6个月一次。本发明偶联物的优选剂量方案包括静脉给药1mg/kg体重或3mg/kg体重，利用以下剂量方案之一使用偶联物：(i)每4周给予6个剂量，之后每3个月给药；(ii)每三周给药；(iii)每三周按3mg/kg体重一次给药然后按1mg/kg体重给药。在一些方法中，调整剂量使偶联物的血浆浓度为约1-1000μg/ml，在另一些方法中为约25-300μg/ml。
作为替代，抗体可以作为缓释制剂给药，在这种情况中需要以较低频率给药。剂量和频率随抗体在患者体内的半衰期而变。通常，人抗体半衰期最长，其次是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。给药的剂量和频率可随治疗是预防性的还是治疗性的而变。进行预防性应用时，在很长一段时间内以相对较低的频率给予相对较少的剂量。一些患者将终生一直接受治疗。进行治疗性应用时，有时需要在相对较短的间隔内给予相对较高的剂量直至病情缓解或终止，并优选直至患者表现出部分或完全的疾病症状的改善。之后，患者可以接受预防性方案。
为用于与细胞增殖异常有关的疾病预防和/或治疗，所给化合物的循环浓度优选为约0.001μM到20μM，其中优选约0.01μM到5μM。
此处所述的该化合物的患者口服剂量通常为从约1mg/天到约10,000mg/天，更通常为从约10mg/天到约1,000mg/天，最通常为从约50mg/天到约500mg/天。按照患者体重计，常用剂量为从约0.01到约150mg/kg/天，更常用从约0.1到约15mg/kg/天，最常用从约1到约10mg/kg/天，例如5mg/kg/天或3mg/kg/天。
在一些实施方案中，延迟或抑制肿瘤生长的患者剂量可以为1μmol/kg/天或更小。例如，患者剂量可以为0.9、0.6、0.5、0.45、0.3、0.2、0.15或0.1μmol/kg/天或更少(参照药物的摩尔数)。优选的是，当日剂量使用至少五天时抗体-药物偶联物延缓了肿瘤的生长。在至少一些实施方案中，肿瘤是SCID小鼠中的人型肿瘤。作为一个例子，SCID小鼠可以为CB17.SCID小鼠(可由Taconic，Germantown，NY获得)。
可以改变实际的剂量水平，以获得针对特定患者、组合物和给药方式获得实现预期疗效的有效的活性组分量，而对患者无毒。所选的剂量水平将取决于各种药物代谢动力学因素，包括采用的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、排泄速率、疗程、及与采用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、患者的年龄、性别、体重、状态、总体健康状态和病史等因素。
本发明的偶联物的“治疗有效剂量”优选减轻疾病症状的严重程度、延长无疾病症期的频率和持续时间、和/或防止由于病痛产生的损害或残疾。例如，为了治疗肿瘤，与未被治疗的受试者相比，“治疗有效剂量”优选抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，更优选至少约80％。偶联物抑制肿瘤生长的能力可在预测人肿瘤功效的动物模型系统中评价。作为替代，组合物的该性质可通过检验其抑制肿瘤生长的能力而评价，该能力可由有经验的从业者通过已知方法进行体外测定。治疗有效量的治疗化合物可减小肿瘤的大小，或者缓解受试者的症状。本领域的一般技术人员可根据受试者的大小、症状的严重程度和所选具体组合物或给药途径而确定该量。
本发明的偶联物可采用本领域中已知的一种或更多种方法，由一种或更多种途径给药。如本领域技术人员可以理解的，给药途径和/或方式随预期结果而变。本发明的抗体的优选给药途径包括静脉、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其它胃肠外途径(例如经注射或输注)。此处使用的短语“胃肠外给药”指的是除了肠内和局部给药外的其它给药方式，通常经注射，其包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼框内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬脑膜外和胸骨内注射及输注。作为替代，本发明的组合物可经非胃肠外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部途径给药。
活性化合物可以用载体制备，该载体可保护活性化合物免于提前释放，如控释制剂、植入剂、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用具有生物降解性、生物兼容性的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。参见，例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
治疗组合物可利用本领域中已知的医用装置给药。例如，在一个优选的实施方案中，本发明的治疗组合物可利用无针皮下注射装置给药，例如US 5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556公开的装置。其它适宜装置的实例包括US 4,487,603；US 4,486,194；US 4,447,233；US 4,447,224；US 4,439,196；和US 4,475,196公开的装置。这些专利通过引用结合在本文中。
在一些实施方案中，本发明的偶联物可以配制为确保其在体内分布适宜。例如，血脑屏障(BBB)阻止了许多高亲水性化合物。为确保本发明的治疗性化合物通过BBB(如果需要的话)，它们可以被配制成例如脂质体。配制脂质体的方法参见例如US 4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可包含一个或多个部分，该部分被选择性输送到特定的细胞或组织中，由此增强靶向药物的递送(参见，例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性和靶向部分包括叶酸盐(酯)或生物素(参见，例如US 5,416,016 to Low et al.)；甘露糖苷(Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman et al.(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier et al.(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；还可参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
本发明的用途和方法
本发明的抗体、抗体组合物和方法具有与诊断和治疗PTK7介导的病症相关的多种体外和体内诊断和治疗用途。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体为人抗体。例如，这些分子可在体外或离体地被给予至培养中的细胞，或者例如体内给予至人类受试者，以治疗、预防和诊断多种病症。本文所使用的术语“受试者”旨在包括人和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如，非人类灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物。优选的受试者包括患有由PTK7活性介导的病症的人类患者。所述方法特别地适于治疗患有与PTK7异常表达相关的病症的人类患者。当抗PTK7抗体与另一药剂联合给药时，这两种物质可相继或者同时给药。
考虑到本发明的抗体针对PTK7的特异性结合，本发明的抗体可用于特异地检测细胞表面的PTK7表达，并且还可用于通过免疫亲和纯化方法纯化PTK7。
本发明还提供用于检测样本中是否存在人PTK7抗原或者测量人PTK7抗原的量的方法，包括在一定条件下使所述样本和对照样本与特异性结合人PTK7的人单克隆抗体或其抗原结合部分相接触，所述条件允许所述抗体或其部分和人PTK7之间形成复合物。然后检测复合物的形成，其中与对照样本相比，与所述样本之间的复合物形成差异即可指示该样本中是否存在人PTK7抗原。
PTK7在结肠癌来源的细胞系中表达，但未发现在成人结肠组织中表达(Mossie et al.(1995)Oncogene 11：2179-84)。在一些黑色素瘤细胞系和黑色素瘤活检组织中也观察到了PTK7表达(Easty，et al.(1997)Int.J.Cancer 71：1061-5)。此外，还发现PTK7在急性髓样白血病样本中高度过量表达(Muller-Tidow et al.，(2004)Clin.Cancer Res.10：1241-9)。抗PTK7抗体可单独地使用，用来抑制癌性肿瘤的生长。或者，如下所述，抗PTK7抗体可与其它免疫原性药剂、标准癌症治疗法或其它抗体结合使用。
优选的使用本发明的抗体可抑制生长的癌症包括通常对免疫疗法有应答的癌症。优选的可治疗的癌症的非限制性实例包括结肠癌(包括小肠癌)、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤)、急性髓样白血病、肾癌、膀胱癌、卵巢癌和前列腺癌。可使用本发明的方法治疗的其它癌症的实例包括肾癌(例如肾细胞癌)、成胶质细胞瘤、脑瘤、慢性或急性白血病(包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、慢性髓样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、淋巴瘤(例如，何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞瘤(ALCL)、皮肤T淋巴细胞瘤、结节状小分裂细胞淋巴瘤、周围T细胞淋巴瘤、伦南德氏淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴结瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、中心母细胞性/中心细胞性(cb/cc)滤泡性淋巴瘤、B谱系弥散性大细胞瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤和HIV相关的基于体腔的淋巴瘤)、胚胎性癌、未分化的鼻咽癌(例如施明克氏瘤)、卡斯尔曼氏病、卡波济氏肉瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症和其它B细胞淋巴瘤、鼻咽癌、骨癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、直肠癌、肛区癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴门癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、肿瘤血管发生、脊椎肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、表皮样癌症、鳞状上皮细胞癌、包括那些由石棉诱发的环境诱发性癌症(例如间皮瘤)，以及所述癌症的组合。
此外，考虑到各种肿瘤细胞上的PTK7表达，本发明的人抗体、抗体组合物和方法可用于治疗患致瘤性病症的受试者，所述致瘤性病症例如为以存在表达PTK7的肿瘤细胞为特征的病症，包括例如，结肠癌(包括小肠癌)、黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤)、急性髓样白血病、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌。患有致瘤性病症的其它受试者的实例包括患有如下病症的受试者：肾癌(例如肾细胞癌)、成胶质细胞瘤、脑瘤、慢性或急性白血病(包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、慢性髓样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、淋巴瘤(例如，何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞瘤(ALCL)、皮肤T淋巴细胞瘤、结节状小分裂细胞淋巴瘤、周围T细胞淋巴瘤、伦南德氏淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴结瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、中心母细胞性/中心细胞性(cb/cc)滤泡性淋巴瘤、B谱系弥散性大细胞瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤和HIV相关的基于体腔的淋巴瘤)、胚胎性癌、未分化的鼻咽癌(例如施明克氏瘤)、卡斯尔曼氏病、卡波济氏肉瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症和其它B细胞淋巴瘤、鼻咽癌、骨癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、直肠癌、肛区癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴门癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、肿瘤血管发生、脊椎肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、表皮样癌症、鳞状上皮细胞癌、包括那些由石棉诱发的环境诱发性癌症(例如间皮瘤)，以及所述癌症的组合。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种抑制受试者体内肿瘤细胞生长的方法，包括向受试者给予治疗有效量的抗PTK7抗体或其抗原结合部分。优选地，所述抗体为人抗PTK7抗体(例如本文所述的任何人类抗人PTK7抗体)。此外或者再者，所述抗体可为嵌合的或人源化的抗PTK7抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体(例如，人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)可用于检测PTK7水平或在其细胞膜表面含有PTK7的细胞水平，之后可将这些水平与某些疾病症状相关联。或者，所述抗体可用于抑制或阻断PTK7功能，这转而又可与某些疾病症状的防止或缓解相关联，由此暗示了PTK7为该疾病的介质。这可通过使实验样本和对照样本在一定条件下与抗PTK7抗体相接触来实现，所述条件允许该抗体与PTK7之间形成复合物。检测该抗体与PTK7之间形成的任何复合物，并比较实验样本和对照样本的复合物。
在另一实施方案中，可初始测试本发明的抗体(例如，人抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)的与体外治疗或诊断用途相关的结合活性。例如，可用下文实施例中所述的流式细胞测定法测试本发明的组合物。
本发明的抗体(例如，人抗体、多特异性和双特异性分子、免疫偶联物和组合物)在PTK7相关疾病的治疗和诊断方面具有其它用途。例如，所述人单克隆抗体、多特异性或双特异性分子和免疫偶联物可用于在体内或体外引发以下一种或多种生物活性：抑制表达PTK7的细胞的生长和/或杀伤该细胞，在人效应细胞存在时介导表达PTK7的细胞的吞噬或ADCC效应，或者，阻断PTK7配体与PTK7结合。
在一个具体的实施方案中，所述抗体(例如，人抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)用于体内治疗、预防或诊断多种PTK7相关的疾病。PTK7相关的疾病的实例包括结肠癌(包括小肠癌)、黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤)、急性髓样白血病、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌等。
本发明的抗体组合物(例如，人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)的体内和体外的合适给药途径为本领域公知，并可由本领域普通技术人员选定。例如，所述抗体组合物可经(例如静脉内或皮下)注射给药。所用分子的合适剂量将取决于受试者的年龄和体重、所述抗体组合物的浓度和/或制剂。
如前所述，本发明的人抗PTK7抗体可与一种或其它多种治疗剂(例如细胞毒剂、放射性毒剂或免疫抑制剂)共同给药。所述抗体可与所述治疗剂相连接(作为免疫复合物)，或者可与所述治疗剂分开给药。对于后一情况(分开给药)，所述抗体可在所述治疗剂之前、之后或与其同时给药，或者可与其它已知疗法例如抗癌疗法(如辐射)共同给予。这类治疗剂包括其自身只在对患者有毒性或亚毒性的水平时有效的抗肿瘤剂，例如多柔比星(阿霉素)、顺铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和环磷酰胺羟基脲等。顺铂以每四周一次100mg/剂静脉内给药，阿霉素以每21天一次60-75mg/ml的剂量静脉内给药。本发明的人抗PTK7抗体或其抗原结合片段与化学治疗剂的共同给药可提供两种抗癌治疗剂，这两种抗癌治疗剂可经由不同的机制起作用，并获得针对人类肿瘤细胞的细胞毒效应。这种共同给药可解决肿瘤细胞产生药物抗性或者抗原性改变方面的问题，所述抗原性改变可能会导致肿瘤细胞与抗体间无反应。
当给予本发明的抗体-伴侣分子偶联物以用于预防和/或治疗与细胞异常增殖相关的疾病时，所给予的化合物的循环浓度优选为约0.001μM至20μM，并优选约0.01μM至5μM。
本文所述的化合物的口服给药患者剂量典型地为约1mg/日至约10,000mg/日，更典型地为约10mg/日至约1,000mg/日，最典型地为约50mg/日至约500mg/日。根据患者体重表示时，典型的剂量范围为约0.01至约150mg/kg/日，更典型地为约0.1至约15mg/kg/日，最典型地为约1至约10mg/kg/日，例如5mg/kg/日或3mg/kg/日。
在至少某些实施方案中，阻滞或抑制肿瘤生长的患者剂量可为1μmol/kg/日或者更少。例如，所述患者剂量可为0.9、0.6、0.5、0.45、0.3、0.2、0.15或0.1μmol/kg/日或者更少(指药物的摩尔数)。优选地，所述抗体-药物偶联物当在至少5天时间内以日剂量给药时阻滞肿瘤细胞的生长。在至少某些实施方案中，所述肿瘤为SCID小鼠体内的人类型的肿瘤。例如，所述SCID小鼠可以是CB17.SCID小鼠(获自Taconic，Germantown，NY)。
在一个实施方案中，本发明的免疫偶联物可通过将化合物与抗体相连，用于将这些化合物(例如，治疗剂、标记物、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)靶向具有PTK7细胞表面受体的细胞。例如，抗PTK7抗体可与美国专利6,281,354和6,548,530、美国专利申请公开文本20030050331、20030064984、20030073852和20040087497中所述的或者WO 03/022806中公开的任何毒素化合物相偶联，这些文献均通过引用的方式全文纳入本文。因此，本发明还提供了用于离体地或者在体内将表达PTK7的细胞(例如，具有可检测标记，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)限定在局部区域的方法。或者，所述免疫偶联物可用于通过将细胞毒素或放射性毒素靶向PTK7来杀伤具有PTK7细胞表面受体的细胞。
本发明的靶标特异性效应细胞，例如与组合物(例如，人抗体、多特异性和双特异性分子)相连的效应细胞，也可用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人白细胞，例如，巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其它细胞包括嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞和其它带有IgG-或IgA-受体的细胞。如果需要，效应细胞可从待治疗的受试者中获得。所述靶特异性效应细胞可作为生理上可接受溶液形式的细胞悬液来给药。给予的细胞数可以为108-109数量级，但会根据治疗目的变化。通常，该剂量足以使在靶细胞(例如表达PTK7的肿瘤细胞)处局部化，以通过吞噬作用产生细胞杀伤作用。给药途径也可以变化。
使用靶标特异性效应细胞的疗法可与其它去除靶细胞的技术联合实施。例如，使用本发明的组合物(例如，人抗体、多特异性和双特异性分子)和/或带有这些组合物的效应细胞的抗肿瘤疗法可以与化学疗法联合使用。此外，联合免疫疗法可用于指导两种不同的细胞毒性效应群体对肿瘤细胞的排斥作用。例如，与抗FcγRI或抗CD3相连的抗PTK7抗体可与IgG-或IgA-受体特异性结合剂联合使用。
本发明的双特异性和多特异性分子也可用于调节效应细胞上的FcγR或FcγR水平，例如可通过遮蔽和去除细胞表面的受体实现。抗Fcγ受体的混合物也可用于该目的。
还可在存在补体时使用具有补体结合位点的本发明的组合物(例如，人抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)，所述补体结合位点例如来自IgG1、-2或-3或IgM的可结合补体的部分。在一个实施方案中，可通过加入补体或含补体的血清来补充细胞群的离体处理，所述细胞包括带有本发明的结合剂和合适的效应细胞的靶细胞。被覆本发明的结合剂的靶细胞的吞噬作用可通过补体蛋白的结合而加强。在另一实施方案中，被覆本发明的组合物(例如，人抗体、多特异性和双特异性分子)的靶细胞也可经补体溶解。在又一实施方案中，本发明的组合物不活化补体。
本发明的组合物(例如，人抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)也可与补体一起给药。因此，本发明的范围内涵盖包括人抗体、多特异性或双特异性分子与血清或补体的组合物。这些组合物的优点在于补体位于接近人抗体、多特异性或双特异性分子的位置。或者，本发明的人抗体、多特异性或双特异性分子与补体或血清可分开给药。
因此，用本发明的抗体组合物治疗的患者还可(在给予本发明的人抗体之前、同时或之后)给予另一治疗剂，例如细胞毒剂或放射性毒剂，这样可加强或提高所述人抗体的治疗效果。
在其它的实施方案中，还用调节(例如增强或抑制)Fcγ或Fcγ受体表达或活性的药剂治疗受试者，例如用细胞因子治疗受试者。在用多特异性分子治疗过程中给予的优选的细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。
本发明的组合物(例如，人抗体、多特异性和双特异性分子)也可用于靶向表达FcγR或PTK7的细胞，例如用于标记该细胞。为此用途，可将所述结合剂与可检测的分子相连。因此，本发明提供了离体地或在体外将表达Fc受体(例如FcγR或PTK7)的细胞限定在局部区域的方法。可检测的标记可以是例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。
本发明的范围内还涵盖包括本发明的抗体组合物(例如，多种人抗体、双特异性或多特异性分子或免疫偶联物)及其使用说明的试剂盒。该试剂盒还可含有一种或多种其它试剂，例如，免疫抑制剂、细胞毒剂或放射性毒剂，或者一种或多种另外的本发明的人抗体(例如，具有与PTK7抗原中的不同于该第一人抗体的表位结合的互补活性的人抗体)。试剂盒通常包括表示该试剂盒内容物的既定用途的标志。术语标志包括任何试剂盒上或与试剂盒一起提供的，或者随附该试剂盒的书面或记录材料。
本发明通过以下实施例进一步得到说明，这些实施例不应解释为对本发明的进一步限制。本申请通篇引用的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容均通过引用的方式明确地全文纳入本文。
实施例
实施例1：抗PTK7的人单克隆抗体的生成
抗原
免疫方案使用(i)包含具有myc和his标签的PTK7胞外部分的重组融合蛋白和(ii)膜结合全长PTK7作为抗原。两种抗原均在CHO细胞系中通过重组转染法产生。
转基因HuMab和KM小鼠 TM
使用HuMab转基因小鼠的HCo7和HCo12株和转基因转染色体小鼠的KM株制备针对PTK7的完全人单克隆抗体，所述的每种小鼠均表达人抗体基因。在上述每一小鼠株中，按照Chen et al.(1993)EMBO J.12：811-820所述，纯合地破坏其内源性小鼠κ型轻链基因，按照PCT公开文本WO 01/09187的实施例1所述，纯合地破坏其内源性小鼠重链基因。上述每一小鼠株携带人κ型轻链转基因KCo5，如Fishwild et al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851中所述。所述HCo7株携带HCo7人重链转基因，如美国专利5,770,429、5,545,806、5,625,825和5,545,807中所述。所述HCo12株携带HCo12人重链转基因，如WO 01/09187的实施例2和WO 01/14424的实施例2中所述。所述KM株含有SC20转染色体，如PCT公开文本WO 02/43478中所述。
HuMab和KM免疫：
为产生针对PTK7的完全人单克隆抗体，用纯化的重组PTK7融合蛋白和PTK7转染的CHO细胞作为抗原免疫HuMab小鼠和KM小鼠TM。用于HuMab小鼠的一般免疫方案在Lonberg，N.et al(1994)Nature368(6474)：856-859；Fishwild，D.et al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851和PCT公开文本WO 98/24884中有描述。首次注入抗原时，所述小鼠为6-16周龄。使用PTK7融合蛋白抗原的纯化重组制剂(5-50μg)和5-10x106细胞经腹膜内、皮下(Sc)或经足底注射免疫HuMab小鼠和KM小鼠TM。
转基因小鼠用完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原IP免疫两次，然后用不完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原IP免疫3-21天(最多总共11次免疫)。经眶后取血监测免疫应答。用ELISA筛选血浆(如下所述)，将具有足够的抗PTK7人免疫球蛋白滴度的小鼠用于融合。用抗原静脉内加强免疫小鼠3天，然后处死并取脾。通常，对于每种抗原进行10-35次融合。对于每种抗原均免疫几十只小鼠。
产生抗PTK7抗体的HuMab或KM小鼠 TM 的筛选
为筛选产生可结合PTK7的抗体的HuMab或KM小鼠TM，按照Fishwild，D.et al.(1996)所述，用ELISA检测来自免疫小鼠的血清。简单来说，用来自转染CHO细胞的PBS溶液中1-2μg/ml的重组PTK7融合蛋白包被微量滴定板，每孔100μl，在4℃孵育过夜，然后用5％胎牛血清的PBS/吐温溶液(0.05％)以每孔200μl封闭。将PTK7免疫小鼠的血清稀释液加至每孔，并在室温下孵育1-2小时。用PBS/吐温清洗平板，然后与偶联辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG多克隆抗体在室温下孵育1小时。洗涤后，用ABTS底物(Sigma，A-1888，0.22mg/ml)对滴定板显色，并用分光光度计在OD 415-495处进行分析。产生最高滴度的抗PTK7抗体的小鼠用于融合。如下所述进行融合，并采用ELISA检测杂交瘤上清液的抗PTK7活性。
产生抗PTK7的人单克隆抗体的杂交瘤的制备：
按照标准方法，用PEG将分离自HuMab小鼠的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后筛选所得杂交瘤以用于抗原特异性抗体的产生。用50％PEG(Sigma)使免疫小鼠的脾细胞的单细胞悬液与四分之一数目的SP2/0非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)融合。以约1x105/孔在平底微量滴定板中接种细胞，然后用含如下成分的选择性培养基孵育约两周：10％胎牛血清、10％P388D1(ATCC，CRL TIB-63)条件培养基、3-5％的Origen(IGEN)的DMEM(Mediatech，CRL 10013，含高水平葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠)溶液，以及5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50mg/ml庆大霉素和1x HAT(Sigma，CRL P-7185)。1-2周后，用其中HAT被HT替换的培养基培养细胞。然后采用ELISA(如上所述)针对各孔筛选人抗PTK7单克隆IgG抗体。当杂交瘤广泛生长后，通常在10-14天后监测培养基。再次接种分泌抗体的杂交瘤、再次筛选，并且，如果仍对人IgG呈阳性，则经限制性稀释将抗PTK7单克隆抗体亚克隆至少两次。然后体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量抗体用作进一步的表征之用。
选择杂交瘤克隆3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8进行进一步的分析。
实施例2：人单克隆抗体3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8的结构表征
编码3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8单克隆抗体的重链和轻链可变区的cDNA序列使用标准PCR技术分别从3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6a和7C8杂交瘤中获得，并采用标准DNA测序技术进行测序。
3G8的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图1A和SEQ IDNO：41和1所示。
3G8的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图1B和SEQ IDNO：45和5所示。
将3G8重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列相比较，证明了该3G8重链使用了来自人种系VH 3-30.3的VH区段、不确定的D区段和来自人种系JH 4b的JH区段。3G8VH序列与种系VH3-30.3序列的比对示于图5中。使用测定CDR区域的Kabat系统对3G8VH序列进一步分析，分别如图1A和5以及SEQ ID NO：11、15和19所示标出了重链CDR1、CDR2和CD3区域。
将3G8轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白轻链序列相比较，证明了该3G8轻链使用了来自人种系VK L15的VL区段和来自人种系JK 1的JK区段。3G8VL序列与种系VK L15序列的比对示于图9中。使用测定CDR区域的Kabat系统对3G8VL序列进一步分析，分别如图1B和9以及SEQ ID NO：23、29和35所示标出了轻链CDR1、CDR2和CD3区域。
3G8a的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图1A和SEQ IDNO：41和1所示。
3G8a的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图1C和SEQ IDNO：46和6所示。
将3G8a重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列相比较，证明了该3G8a重链使用了来自人种系VH 3-30.3的VH区段、不确定的D区段和来自人种系JH 4b的JH区段。3G8a VH序列与种系VH 3-30.3序列的比对示于图5中。使用测定CDR区域的Kabat系统对3G8a VH序列进一步分析，分别如图1A和5以及SEQ ID NO：11、15和19所示标出了重链CDR1、CDR2和CD3区域。
将3G8a轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白轻链序列相比较，证明了该3G8a轻链使用了来自人种系VK L15的VL区段和来自人种系JK 3的JK区段。3G8a VL序列与种系VK L15序列的比对示于图9中。使用测定CDR区域的Kabat系统对3G8a VL序列进一步分析，分别如图1C和9以及SEQ ID NO：24、30和36所示标出了轻链CDR1、CDR2和CD3区域。
4D5的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图2A和SEQ IDNO：42和2所示。
4D5的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图2B和SEQ IDNO：47和7所示。
将4D5重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列相比较，证明了该4D5重链使用了来自人种系VH 3-30.3的VH区段、不确定的D区段和来自人种系JH 4b的JH区段。4D5VH序列与种系VH3-30.3序列的比对示于图6中。使用测定CDR区域的Kabat系统对4D5VH序列进一步分析，分别如图2A和6以及SEQ ID NO：12、16和20所示标出了重链CDR1、CDR2和CD3区域。
将4D5轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白轻链序列相比较，证明了该4D5轻链使用了来自人种系VK A10的VL区段和来自人种系JK 5的JK区段。4D5VL序列与种系VK A10序列的比对示于图10中。使用测定CDR区域的Kabat系统对4D5VL序列进一步分析，分别如图2B和10以及SEQ ID NO：25、31和37所示标出了轻链CDR1、CDR2和CD3区域。
12C6的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图3A和SEQ IDNO：43和3所示。
12C6的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图3B和SEQ IDNO：48和8所示。
将12C6重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列相比较，证明了该12C6重链使用了来自人种系VH DP44的VH区段、不确定的D区段和来自人种系JH 4b的JH区段。12C6VH序列与种系VH DP44序列的比对示于图7中。使用测定CDR区域的Kabat系统对12C6VH序列进一步分析，分别如图3A和7以及SEQ ID NO：13、17和21所示标出了重链CDR1、CDR2和CD3区域。
将12C6轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白轻链序列相比较，证明了该12C6轻链使用了来自人种系VK A27的VL区段和来自人种系JK 2的JK区段。12C6VL序列与种系VK A27序列的比对示于图11中。使用测定CDR区域的Kabat系统对12C6VL序列进一步分析，分别如图3B和11以及SEQ ID NO：26、32和38所示标出了轻链CDR1、CDR2和CD3区域。
12C6a的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图3A和SEQ IDNO：43和3所示。
12C6a的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图3C和SEQ IDNO：49和9所示。
将12C6a重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列相比较，证明了该12C6a重链使用了来自人种系VH DP44的VH区段、不确定的D区段和来自人种系JH 4b的JH区段。12C6a VH序列与种系VH DP44序列的比对示于图7中。使用测定CDR区域的Kabat系统对12C6a VH序列进一步分析，分别如图3A和7以及SEQ ID NO：13、17和21所示标出了重链CDR1、CDR2和CD3区域。
将12C6a轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白轻链序列相比较，证明了该12C6a轻链使用了来自人种系VK L15的VL区段和来自人种系JK 2的JK区段。12C6a VL序列与种系VK L15序列的比对示于图12中。使用测定CDR区域的Kabat系统对12C6a VL序列进一步分析，分别如图3C和12以及SEQ ID NO：27、33和39所示标出了轻链CDR1、CDR2和CD3区域。
7C8的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图4A和SEQ IDNO：44和4所示。
7C8的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别如图4B和SEQ IDNO：50和10所示。
将7C8重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列相比较，证明了该7C8重链使用了来自人种系VH 3-33的VH区段、来自人种系3-10的D区段和来自人种系JH 6b的JH区段。7C8VH序列与种系VH 3-33序列的比对示于图8中。使用测定CDR区域的Kabat系统对7C8VH序列进一步分析，分别如图4A和8以及SEQ ID NO：14、18和22所示标出了重链CDR1、CDR2和CD3区域。
将7C8轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白轻链序列相比较，证明了该7C8轻链使用了来自人种系VK L6的VL区段和来自人种系JK 3的JK区段。7C8VL序列与种系VK L6序列的比对示于图13中。使用测定CDR区域的Kabat系统对7C8VL序列进一步分析，分别如图4B和13以及SEQ ID NO：28、34和40所示标出了轻链CDR1、CDR2和CD3区域。
实施例3：mAb 12C6的突变和替代种系的使用
如以上实施例2所述，单克隆抗体12C6和12C6a使用了来自HuMab小鼠
Figure GPA00001143083601141
株的HCo7转基因中存在的人DP-44种系序列的重链可变区。由于DP-44并非是天然人类免疫球蛋白所有组分中使用的种系序列，因此将12C6和12C6a的VH序列突变以减小潜在的免疫原性是有利的。优选地，将12C6或12C6a VH序列的一个或多个框内残基突变为结构上相关的VH种系序列的框架内存在的一个或多个残基，所述VH种系序列是天然人类免疫球蛋白所有组分中使用的种系序列。例如，图7显示了12C6和12C6a VH序列与DP44种系序列、以及与两个结构上相关的人种系序列VH3-23和VH3-7的比对。鉴于这些序列的相关性，本领域技术人员可预测到他们可选择出特异性结合人PTK7，并使用来自VH 3-23或VH3-7种系序列的VH区域的人抗体。此外，本领域技术人员还可将12C6或12C6a VH序列内、与VH 3-23或VH 3-7序列相应位置的残基不同的一个或多个残基，突变成VH 3-23或VH 3-7中存在的残基，或者突变成其保守的氨基酸置换。
实施例4：抗PTK7人单克隆抗体的结合特异性和结合动力学的表征
在本实施例中，用Biacore分析法测定抗PTK7抗体的结合亲和力和结合动力学。用流式细胞术检测结合特异性和交叉竞争性。
经流式细胞术检测的结合特异性
形成了在细胞表面表达重组人PTK7的HEK3细胞系，并用来通过流式细胞术测定PEK7人单克隆抗体的特异性。用含编码跨膜形式的PTK7的全长cDNA的表达质粒转染HEK3细胞。通过使转染细胞与浓度为10μg/ml的抗PTK7人单克隆抗体一起孵育来评估7C8抗PTK7人单克隆抗体的结合。洗涤细胞并用FITC标记的抗人IgG Ab检测结合。采用FACScan流式细胞术(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。其结果如图14所示。抗PTK7人单克隆抗体7C8与转染有PTK7的HEK3细胞结合，但不与未转染人PTK7的HEK3细胞结合。该数据表明了抗PTK7人单克隆抗体对PTK7的特异性。
经ELISA测定的结合特异性
还用标准ELISA测定了抗PTK7抗体的结合，以检测其结合PTK7的特异性。
检测了重组的PTK7胞外域针对不同浓度的抗PTK7人单克隆抗体3G8、4D5、12C6和12C6a的结合。进行标准ELISA步骤。加入抗PTK7人单克隆抗体，初始浓度为10μg/ml，并以1∶2的稀释度系列稀释。使用偶联辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG(κ链特异性)多克隆抗体作为第二抗体。结果如图15所示。抗PTK7人单克隆抗体3G8、4D5、12C6和12C6a均与PTK7结合。该数据表明了抗PTK7人单克隆抗体对PTK7的特异性。
抗PTK7抗体的表位作图
采用流式细胞术确定抗PTK7HuMAb的表位分型。用含编码跨膜形式的PTK7的全长cDNA的表达质粒转染Wilms肿瘤细胞G-401(ATCC保藏号CRL-1441)。通过将1x105个转染细胞与10μg/ml冷的抗PTK7人单克隆抗体一起孵育，然后洗涤并加入10μg/ml偶联荧光素的抗PTK7人单克隆抗体来测定每种抗PTK7人单克隆抗体的表位结合。用FITC标记的抗人IgG Ab检测结合。用FACScan流式细胞术(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。分析数据后，将抗PTK7抗体分为3类表位——A类，包括7D11；B类，包括3G8和3G8a；以及C类，包括7C8、12C6和12C6a。
实施例5：抗PTK7抗体与表达于人癌细胞表面的PTK7结合的表征
用肾母细胞瘤Wilms肿瘤细胞系G-401(ATCC保藏号CRL-1441)测定不同浓度的HuMAb抗PTK7人单克隆抗体12C6和7C8的结合。通过将1x105个细胞与抗体一起孵育来测定抗PTK7人单克隆抗体的结合，所述抗体起始浓度为30μg/ml，并以1∶10的比例连续稀释。洗涤细胞，并用PE标记的抗人IgG Ab检测结合。采用FACScan流式细胞术(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果如图16所示。根据平均染色荧光强度(MFI)测得，抗PTK7单克隆抗体12C6和7C8浓度依赖性地与肾母细胞瘤Wilms肿瘤细胞系结合。抗PTK7单克隆抗体12C6和7C8的EC50值分别为4.0nM和3.4nM。
这些数据表明抗PTK7 HuMAb与肾癌细胞系结合。
实施例6：人抗PTK7抗体与癌细胞系的结合
经流式细胞术测量抗PTK7抗体与多种癌细胞系的结合。
通过将癌细胞系与浓度为10μg/ml的抗PTK7人单克隆抗体一起孵育来评估3G8、12C6a、4D5和12C6抗PTK7人单克隆抗体与一组癌细胞系的结合。测试的癌症细胞系为A-431(ATCC保藏号CRL-1555)、Wilms肿瘤细胞G-401(ATCC保藏号CRL-1441)、Saos-2(ATCC保藏号HTB-85)、SKOV-3(ATCC保藏号HTB-77)、PC3(ATCC保藏号CRL-1435)、DMS 114(ATCC保藏号CRL-2066)、ACHN(ATCC保藏号CRL-1611)、LNCaP(ATCC保藏号CRL-1740)、DU 145(ATCC保藏号HTB-81)、LoVo(ATCC保藏号CCL-229)和MIA PaCa-2(ATCC保藏号CRL-1420)。使用同种型对照抗体作为阴性对照。洗涤细胞，并用FITC标记的抗人IgG Ab检测结合。使用FACScan流式细胞术(BectonDickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果示于图17中。根据平均染色荧光强度(MFI)测得，抗PTK7单克隆抗体3G8、12C6a、4D5和12C6与癌细胞系A-431、Wilms肿瘤细胞G-401、Saos-2、SKOV-3、PC3、DMS 114、ACHN、LNCaP、DU 145、LoVo和MIA PaCa-2结合。这些数据表明抗PTK7HuMAb与多种表达细胞表面PTK7的癌细胞结合。
实施例7：抗PTK7与人T、B和树突细胞的结合
采用流式细胞术检测抗PTK7抗体与细胞表面表达PTK7的CD4+、CD8+T细胞、CD19+ B细胞和人血液髓样树突细胞的结合。
抗CD3抗体活化人T细胞以诱导T细胞上的PTK7表达，然后与人抗PTK7单克隆抗体结合。通过将细胞与浓度为10μg/ml的抗PTK7人单克隆抗体一起孵育来测定7c8抗PTK7人单克隆抗体的结合。在一些实验中，使用已知的可结合T和B细胞特异性标记物的已知抗体作为阳性对照。洗涤细胞，并用FITC标记的抗人IgG Ab检测结合。采用FACScan流式细胞术(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果如图18(被活化的人T细胞和B细胞)和19(树突细胞)所示。根据平均染色荧光强度(MFI)测得，抗PTK7单克隆抗体7C8结合被活化的人CD4+和CD8+ T细胞以及树突细胞，但不结合B细胞。这些数据表明了该抗PTK7 HuMAb与人T细胞和树突细胞结合。
实施例8：抗PTK7单克隆抗体的内化
采用Hum-Zap内化测定法测量抗PTK7 HuMAb内化至表达PTK7的细胞系中的能力。Hum-Zap测定法可通过对与细胞毒素皂草素偶联的人IgG具有亲和力的第二抗体的结合来测量人第一抗体的内化。
在100μl的孔中以1x104细胞/孔直接接种表达PTK7的癌细胞系Wilms肿瘤G-401(ATCC保藏号CRL-1441)、A-431(ATCC保藏号CRL-1555)和PC3(ATCC保藏号CRL-1435)。向各孔中加入抗PTK7HuMAb抗体3G8、4D5、12C6或7C8，起始浓度为30nM，以1∶3比例连续稀释。用对PTK7非特异性的同种型对照抗体作为阴性对照。以11nM的浓度加入Hum-Zap(Advanced Targeting Systems，San Diego，CA，IT-22-25)，将板孵育72小时。然后用1.0μCi的3H-胸苷对板脉冲24小时，收集并用Top Count闪烁计数器(Packard Instruments，Meriden，CT)读数。结果示于图20 A-D中。抗PTK7抗体3G8、4D5、12C6和7C8可抗体浓度依赖性地降低表达PTK7的Wilms肿瘤癌细胞系中3H-胸苷的掺入量。抗PTK7抗体12C6和7C8可抗体浓度依赖性地降低表达PTK7的癌细胞系A-431和PC3中3H-胸苷的掺入量。抗PTK7抗体3G8、4D5、12C6和7C8在Wilms肿瘤细胞中的EC50值分别为0.6nM、0.3nM、0.2nM和0.2nM。抗PTK7抗体12C6和7C8在A-431细胞中的EC50值分别为0.2nM和0.2nM。抗PTK7抗体12C6和7C8在PC3肿瘤细胞中的EC50值分别为0.3nM和0.3nM。该数据表明了抗PTK7抗体3G8、4D5、12C6和7C8可被内化至肿瘤细胞内。
实施例9：偶联细胞毒素的抗PTK7抗体对人癌细胞系的细胞杀伤的评估
在本实施例中，在细胞增殖测定中，偶联细胞毒素的抗PTK7单克隆抗体显示出对PTK7+人癌细胞系的杀伤。抗PTK7抗体可能经连接物与细胞毒素偶联，所述连接物如肽基、腙或二硫化物连接物。可与本发明的抗体以及连接物偶联的细胞毒素化合物的实例在本申请和2005年9月26日提交的美国专利申请No.60/720,499中均有描述，该文献通过引用的方式全文纳入本文。
抗PTK7抗体1F12(SEQ ID NO：84-98)与本文公开的式(q)偶联，生成1F12-式(q)。偶联方法如下：在100mM磷酸钠，50mM NaCl，2mMDTPA(pH 8.0)中约5mg/ml的抗体，用摩尔数过量15倍的2-亚氨硫醇室温连续混合进行硫醇化(thiolated)1小时。硫醇化后，用偶联缓冲液(50mM HEPES、5mM甘氨酸、3％甘油，pH 6.0)经PD10柱(SephadexG-25)对硫醇化的1F12进行缓冲液交换。测定硫醇化抗体的浓度和硫醇浓度。以每抗体巯基3倍过量的摩尔数加入5mM式(q)的DMSO储液，室温混合90分钟。用0.2μm滤膜过滤偶联的抗体。经由分子排阻色谱法，将得到的偶联物在Sephacryl-200分子大小排阻柱上用50mMHEPES，5mM甘氨酸，100mM NaCl(pH 7.2)的溶液过柱纯化。收集含单体抗体偶联物的部分，并超滤浓缩。测量280和340nm处的吸收度，测定抗体偶联物浓度和取代比例。
将表达PTK7的Wilms肿瘤人肾癌细胞系G-401(ATCC保藏号CRL-1441)以104细胞/孔接种于100μl孔中3小时。向孔中加入1F12-式(p)，初始浓度为100nM，并以1∶3的比例连续稀释。将板孵育48小时。然后用1μCi的3H-胸苷对板脉冲24小时，之后终止培养、收集并用Top Count闪烁计数器(Packard Instruments)读数。图21表明随着1F12-式(p)浓度增加，表达PTK7的Wilms肿瘤人肾癌细胞系中3H-胸苷的掺入量减少。这些资料证明了与细胞毒素偶联的抗PTK7抗体显示出了对人肾癌细胞具有特异的细胞毒性。
实施例10：细胞毒素偶联的抗PTK7抗体的细胞杀伤的评价
在本实施例中，与细胞毒素偶联的抗PTK7单克隆抗体在细胞增殖测定中被证明，可杀伤在细胞表面低、中或高表达PTK7的PTK7+人肿瘤细胞系。
将抗PTK7 HuMAb抗体12C6a与式(p)偶联，得到在此以12C6a-式(p)表示的抗体偶联物。12C6a与式(p)的偶联如下进行：用摩尔过量15倍的2-亚氨基硫杂环戊烷(iminothiolane)对100mM磷酸钠，50mMNaCl，2mM DTPA(pH 8.0)中约5mg/ml的12C6a硫醇化。硫醇化反应在室温下连续搅拌进行1小时。硫醇化后，用偶联缓冲液(50mMHEPES，5mM甘氨酸，3％甘油，pH 6.0)经PD10柱(Sephadex G-25)对抗体进行缓冲液交换。测定硫醇化抗体的浓度和硫醇浓度。
以每抗体巯基3倍过量的摩尔数加入5mM式(p)的DMSO储存液，室温混合90分钟。用0.2μm滤膜过滤偶联的抗体。经分子排阻色谱法，将得到的偶联物在Sephacryl-200分子大小排阻柱上用50mM HEPES，5mM甘氨酸，100mM NaCl(pH 7.2)的溶液过柱纯化。收集含单体抗体偶联物的部分，并超滤浓缩。测量280和340nm处的吸收度，测定抗体偶联物浓度和取代比例。
将表达PTK7的人肿瘤癌细胞系A-431、SKOV3和LoVo以104细胞/孔接种于100μl的孔中。该细胞系预先用标准FACS测定法检测PTK7的细胞表面表达。A-431细胞系具有最高水平的PTK7细胞表面表达，LoVo细胞系具有最低水平的PTK7细胞表面表达。向孔中加入12C6a-式(p)，起始浓度为20nM，并以1∶2的比例连续稀释。使用同种型对照抗体作为阴性对照。将板孵育3小时，洗去未结合的(无)抗体-细胞毒素偶联物。将板继续孵育96小时，采用CellTiter-Glo
Figure GPA00001143083601201
发光测定法(Promega，WI，USA，Technical bulletin No.288)和BIO-TEK读数仪(Bio-Tek Instruments，Inc，VT，USA)测量杀细胞活性(FU，荧光单位)。结果如图22所示。12C6a-式(p)在所有三种细胞系中均显示出活细胞呈浓度依赖性减少，这证明了与细胞毒素偶联的抗PTK7抗体显示出了对各种人癌细胞的特异性细胞毒性。
实施例11：3G8、12C6a、2E11和7C8的免疫组织化学
用来自以下癌症的临床活检组织，经免疫组织化学测定抗PTK7HuMAb 3G8、12C6a、2E11和7C8识别PTK7的能力：肺癌、乳腺癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、小肠癌、前列腺癌、黑色素瘤和头颈癌。
使用5μm的冷冻切片进行免疫组织化学测定(Ardais Inc，USA)。干燥30分钟后，用丙酮固定切片(室温下10分钟)，风干5分钟。将玻片用PBS漂洗，然后用含10％的正常山羊血清的PBS液预孵育玻片20min，并随后在10％正常山羊血清的PBS液中用10μg/ml的FITC化(fitcylated)的3G8、12C6a或2E11抗体在室温下孵育30min。然后，用PBS洗涤玻片3次，并在室温下与小鼠抗FITC(10μg/ml DAKO)孵育30分钟。再用PBS洗涤玻片，并在室温下与山羊抗小鼠HRP偶联物(DAKO)孵育30分钟。再用PBS洗涤玻片3次。使用二氨基联苯(Sigma)作为底物，得到棕色染色。用蒸馏水洗涤后，用苏木精对玻片进行复染1min。随后，用流动的蒸馏水洗涤玻片10秒钟，并用Glycergel(DAKO)封固。肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、小肠癌和前列腺癌切片的临床活检组织免疫组织化学染色显示出阳性染色。正常组织对于PTK7染色始终为阴性，但在恶性组织中，癌激活的成纤维细胞和癌性上皮细胞均被观察到对PTK7染色呈阳性。通过使用成纤维细胞活化蛋白抗体(FAP，Alexis Biochemicals，San Diego，USA)染色，证实了在膀胱癌和乳腺癌切片中存在癌活化的成纤维细胞。FAP是已知的癌活化的成纤维细胞的标记物(Hofheinz et al.(2003)Oncologie 26：44-48)。
预先将7C8与FITC标记的山羊抗人Fab(Jackson # 109-097-003)复合，使7C8终浓度为5μg/ml。然后，用标准IHC法使用该复合物测定结合。7C8结合卵巢癌、胰腺癌、肺癌(小细胞和非小细胞)、黑色素瘤、肾癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌和头颈癌。
实施例12：侵袭测定
在本实施例中，测定了抗PTK7抗体在PTK7转染的CHO细胞系中影响细胞侵袭的能力。
使用HTS 96-Multiwell Insert System(Cat# 351162，BD Biosciences，CA)根据其方案进行测定。将CHO母细胞系、转染有全长PTK7的CHO细胞或对照HEK293细胞系与抗PTK7 HuMab混合物或同种型对照抗体混合，然后将细胞加至插入孔中。将混合物(细胞+抗体混合物)加入至侵袭板的插入孔中。在37℃、5％CO2条件下孵育24小时后，用荧光染料标记细胞，并使用荧光板读数仪对侵袭至膜底部的细胞定量。结果示于图23中。该数据证明了抗PTK7抗体可抑制细胞表面表达PTK7的细胞的侵袭活动。
实施例13：使用未修饰的和细胞毒素偶联的抗PTK7抗体对体内胰腺癌细胞异种移植模型的治疗
本实施例证明，偶联细胞毒素的抗PTK7抗体在移植有胰腺癌细胞肿瘤的小鼠中可抑制肿瘤生长。可与本发明的抗体偶联的细胞毒素化合物的实例在未决的美国专利申请11/134,826中有描述，该文献通过引用的方式全文纳入本文。测定了本文所述的两种HuMAb抗PTK7抗体-毒素偶联物：7C8-式(o)和7C8-式(p)。
使用上文实施例10所述的方法将式(p)与7C8偶联。式(o)与7C8的偶联方法如下：对于溶于100mM磷酸钠，50mM NaCl，2mM DTPA(pH 8.0)中的约5mg/ml的抗体7C8，用摩尔过量15倍的2-亚氨基硫杂环戊烷通过在室温下连续混合进行硫醇化1小时。然后，用偶联缓冲液(50mM HEPES，5mM甘氨酸，0.5％聚维酮(10K)，2mM DTPA，pH 5.5)经PD10柱(Sephadex G-25)对抗体进行缓冲液交换。测定硫醇化抗体的浓度和硫醇浓度。以每抗体巯基3倍过量的摩尔数加入5mM式(o)的DMSO储液(r＝4)，室温混合90分钟。用0.2μm滤膜过滤偶联的抗体。偶联后，以每抗体巯基10倍过量的摩尔数加入100mM N-己基顺丁烯二酰亚胺的DMSO液，以终止未反应的巯基。该终止反应在室温下连续混合进行1小时。在NEM的存在下孵育后，经分子排阻色谱法，将得到的偶联物在Sephacryl-200分子大小排阻柱上用50mM HEPES、5mM甘氨酸、100mM NaCl(pH 6.0)的溶液过柱纯化。汇集含单体抗体偶联物的级分，并超滤浓缩。经测量280和340nm处的吸光度测定抗体偶联物浓度和取代比例。
多种胰腺癌细胞类型可用于证明抗PTK7抗体可抑制肿瘤。在本实施例中，选择HPAC(人胰腺癌，ATCC保藏号CRL-2119)并使用标准实验室方法进行体外扩增。在每只6-8周龄的雄性Ncr无胸腺裸鼠(Taconic，Hudson，NY)右侧皮下植入0.2ml含2.5x106HPAC细胞的PBS/基质胶(Matrigel)(1∶1)。对小鼠称重，并在植入后，用电子测径器每两周对肿瘤进行三维测量。肿瘤体积以高×宽×长/2来计算。将荷有平均90mm3的HPAC肿瘤的小鼠随机分入处理组。如图24所示，在第0天，以所述剂量(μmol/kg)静脉内给予小鼠单剂量的PBS载体、未修饰的抗PTK7抗体、7C8-式(o)或7C8-式(p)。给药后监测小鼠的肿瘤生长61天。当肿瘤达到肿瘤终点(2000mm3)或溃烂时，将小鼠无痛致死。7C8抑制肿瘤生长进展，并且7C8偶联物被证明可显著提高抑制率(图24)。7C8偶联物的抗肿瘤效应为剂量依赖性的，剂量为0.3μmol/kg时观察到最大效应。抗体偶联物的治疗被良好耐受，受试者的体重减轻中位数不会高于5％(数据未显示)。因此，抗PTK7抗体-细胞毒素偶联物的治疗对胰腺癌肿瘤生长有直接的体内抑制效果。
实施例14：使用未修饰的和细胞毒素偶联的抗PTK7抗体对体内乳腺癌细胞异种移植模型的治疗
本实施例证明了，抗PTK7抗体偶联物可抑制体内乳腺癌肿瘤生长。使用标准实验室方法，扩增MCF7-adr细胞，该细胞为对阿霉素具有抗性的人乳腺癌细胞。对6-8周龄的雌性CB17.SCID小鼠(Taconic，Hudson，NY)皮下植入1.7mg的90天内释放的雌激素药丸，其大小为3.0mmm(Innovative Research of America，Sarasota，FL)。在颈部给予雌激素，1天后每只小鼠在右侧皮下植入0.2ml含10×106MCF7-Adr细胞的PBS/基质胶(1∶1)。对小鼠称重，并在植入后，用电子测径器每两周对肿瘤进行三维测量。肿瘤体积以高×宽×长/2来计算。将荷有平均160mm3的MCF7-adr肿瘤的小鼠随机分入处理组。在第0天，对小鼠给予PBS载体、静脉内给予0.1μmol/kg单剂量的未修饰的7C8或7C8-式(o)。给药后监测小鼠的肿瘤生长63天。当肿瘤溃烂时，将小鼠无痛致死。结果示于图25中。7C8-式(o)抑制肿瘤生长。因此，应用抗PTK7抗体-细胞毒素偶联物的治疗对乳腺癌肿瘤生长有直接的体内抑制效果。
实施例15：7C8毒素偶联物的体内肿瘤抑制作用
在本实施例中，证明了毒素偶联的7C8在体内SCID小鼠模型中可抑制上皮细胞和肺肿瘤生长。在本实施例中，将7C8与式(m)偶联。式(m)的结构示于图28中。式(m)及其制备在2006年12月28日提交的美国专利申请60/882,461中有进一步的描述，该文献通过引用的方式特别地全文纳入本文。7C8-式(m)偶联物如下制备：
将抗PTK7抗体7C8浓缩至约5mg/ml，用100mM磷酸盐缓冲液，50mM NaCl，2mM DTPA(pH 8.0)交换缓冲液，加入摩尔过量8-10倍的2-亚氨基硫杂环戊烷在室温下硫醇化60分钟。硫醇化后，用含5mM甘氨酸、2mM DTPA和0.5％聚维酮(10K)的50mM HEPES缓冲液(pH5.5)对抗体进行缓冲液交换。用4，4”-联硫基二吡啶(dithiodipyridine)经测量324nM处的吡啶硫醇(thiopyridine)释放来量化硫醇化。以药物/巯基3∶1的摩尔比加入含式(m)的马来酰亚胺来进行偶联。在室温下孵育60分钟，然后向反应混合物中以N-己基顺丁烯二酰亚胺(NEM)/硫醇10∶1的摩尔比加入NEM，以猝灭任何未反应的巯基。该猝灭反应在室温连续混合下进行1小时。
然后将抗体药物偶联物进行0.2μm过滤，之后进行阳离子交换色谱纯化。用5CV(柱体积)的50mM HEPES，5mM甘氨酸，1M NaCl(pH5.5)再生SP Sepharose高效阳离子交换柱(CEX)。再生后，用3CV的平衡缓冲液(50mM HEPES，5mM甘氨酸，pH 5.5)平衡柱子。载入7C8-式(m)偶联物，用平衡缓冲液洗柱一次。用50mM HEPES，5mM甘氨酸，230mM NaCl(pH 5.5)洗脱偶联物。收集洗脱液级分。用50mM HEPES，5mM甘氨酸，1M NaCl(pH 5.5)再生柱子以除去蛋白聚集体和所有未反应的式(m)。洗脱级分的汇集基于聚集水平和取代比例(SR)，即每摩尔抗体的药物摩尔数。汇集标准为经SEC-HPLC测得单体≥95％且SR范围为1-2。经带有PES膜的10NMWCO平层(flat-sheet)TFF盒，用大量透析缓冲液(30mg/ml蔗糖，10mg/ml甘氨酸，pH 6.0)对纯化的CEX洗脱汇集液进行缓冲液交换。通过将蛋白浓度稀释至5mg/ml，并向透析过滤(diafilter)后的偶联物溶液中加入终浓度为10mg/ml的Dextran40制备批量制剂。配制的制剂经0.2μm PES滤膜过滤至无菌PETG中，并于2℃至8℃下保存。
然后测定7C8和7C8-式(m)对小鼠模型体内A431异种移植肿瘤的生长的作用。A431是表达PTK-7的上皮细胞系，因此代表了表达PTK-7蛋白质的上皮细胞癌症，包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌、肾癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌和胰腺癌。此外，已经通过FACS和IHC证明7C8可结合代表这些疾病的细胞系和癌症。PTK7有时还在活化的上皮癌间质上表达。抗PTK7抗体药物偶联物例如7C8-式(m)在这些癌症中会具有抗癌活性。这一点与抗RG1毒素偶联物的活性类似。RG-1也在细胞间质上表达。美国专利申请60/991,690中记载了抗RG-1抗体药物在前列腺癌异种移植模型中的抗癌活性。
在A431异种移植模型中，将A431细胞植入SCID小鼠(CB17 SCID，Taconic Farms，Germantown，NY)，并使其生长至肿瘤达到约90mm3。然后将小鼠随机化，并用单剂量的载体、0.3μmol/kg的同种型匹配的人IgG抗体连接的式(m)(异-式(m))、未修饰的7C8或7C8-式(m)偶联物(0.3μmol/kg)进行腹膜内处理。35天后定期测量肿瘤体积(图26)。
未修饰的7C8抗体或同种型匹配的式(m)抗体的处理未显示出对A431肿瘤细胞体积有影响(即不抑制肿瘤生长)，而7C8-式(m)偶联物的处理显著地抑制肿瘤生长，如图26A所示。而且，根据体重测量，当将7C8-式(m)偶联物给予小鼠时，该偶联物与毒性不相关(图27)。
在第二组分析中，7C8-式(m)偶联物可抑制小鼠异种移植模型中DMS79细胞来源的小细胞肺癌生长。在该异种移植模型中，对每只SCID小鼠植入5x106DMS79细胞，并使其生长至平均肿瘤体积为约200mm3。然后将小鼠随机化，并用7C8-式(m)偶联物(0.3μmol/kg)进行腹膜内处理。如图27C所示，在81天时间内，7C8-式(m)偶联物处理在所有小鼠中均导致肿瘤完全消退。
总而言之，抗PTK7抗体毒素偶联物显著抑制上皮肿瘤和肺部肿瘤的体内生长，并且在小鼠中并未显示出明显毒性。
实施例16：7C8-式(m)对短尾猴(Cynomolgus Monkey)的毒性测定
短尾猴和人显示出有相似的PTK7表达模式。免疫组织化学分析显示，在短尾猴中，7C8结合的组织与在人类中结合的组织相同。因此，短尾猴适用于评价7C8-式(m)对靶标的毒性。
对两只雄性和两只雌性短尾猴静脉内给予7C8-式(m)。在第1天和第15天给予两个0.4μmol/kg的剂量。观察动物的行为改变、毒性表现，并采血分析。未观察到行为改变。血细胞和化学分析显示无药物相关改变。已知表达ptk7的组织(例如卵巢成纤维细胞)的病理检查显示，没有7C8-式(m)诱导的毒性现象。因此，在短尾猴中未检测到7C8-式(m)毒性。
 SEQ ID NO：   序列  SEQ ID NO：   序列
 1   VH a.a.3G8，3G8a  22   VH CDR3 a.a.7C8
 2   VH a.a.4D5  23   VK CDR1 a.a.3G8
 3   VH a.a.12C6，12C6a  24   VK CDR1 a.a.3G8a
 4   VH a.a.7C8  25   VK CDR1 a.a.4D5
 5   VK a.a.3G8  26   VK CDR1 a.a.12C6
 6   VK a.a.3G8a  27   VK CDR1 a.a.12C6a
 7   VK a.a.4D5  28   VK CDR1 a.a.7C8
 8   VK a.a.12C6  29   VK CDR2 a.a.3G8
 9   VK a.a.12C6a  30   VK CDR2 a.a.3G8a
  SEQ ID NO：   序列  SEQ ID NO：   序列
  10   VK a.a.7C8  31   VK CDR2 a.a.4D5
  11   VH CDR1 a.a.3G8  32   VK CDR2 a.a.12C6
  12   VH CDR1 a.a.4D5  33   VK CDR2 a.a.12C6a
  13   VH CDR1 a.a.12C6  34   VK CDR2 a.a.7C8
  14   VH CDR1 a.a.7C8  35   VK CDR3 a.a.3G8
  15   VH CDR2 a.a.3G8  36   VK CDR3 a.a.3G8a
  16   VH CDR2 a.a.4D5  37   VK CDR3 a.a.4D5
  17   VH CDR2 a.a.12C6  38   VK CDR3 a.a.12C6
  18   VH CDR2 a.a.7C8  39   VK CDR3 a.a.12C6a
  19   VH CDR3 a.a.3G8  40   VK CDR3 a.a.7C8
  20   VH CDR3 a.a.4D5  41   VH n.t.3G8，3G8a
  21   VH CDR3 a.a.12C6  42   VH n.t.4D5
  43   VH n.t.12C6，12C6a  71   肽连接物
  44   VH n.t.7C8  72   肽连接物
  45   VK n.t.3G8  73   肽连接物
  46   VK n.t.3G8a  74   肽连接物
  47   VK n.t.4D5  75   肽连接物
  48   VK n.t.12C6  76   肽连接物
  49   VK n.t.12C6a  77   肽连接物
  50   VK n.t.7C8  78   肽连接物
  51   VH 3-30.3种系a.a.  79   肽连接物
  52   VH DP44种系a.a.  80   肽连接物
  53   VH 3-33种系a.a.  81   肽连接物
  54   VK L15种系a.a.  82   肽连接物
  55   VK A10种系a.a.  83   肽连接物
  56   VK A27种系a.a.  84   VH a.a.1F12
  57   VK L6种系a.a.  85   VK1 a.a.1F12
  58   PTK7 a.a.  86   VK2 a.a.1F12
  SEQ ID NO：   序列  SEQ ID NO：   序列
  59   JH4b种系a.a  87   VH CDR1 a.a.1F12
  60   JH4b种系a.a.  88   VH CDR2 a.a.1F12
  61   3-7种系a.a.  89   VH CDR3 a.a.1F12
  62   3-23种系a.a.  90   VK1 CDR1 a.a.1F12
  63   JH4b种系a.a  91   VK1 CDR2 a.a.1F12
  64   JH6b种系a.a.  92   VK1 CDR3 a.a.1F12
  65   JK1种系a.a.  93   VK2 CDR1 a.a.1F12
  66   JK5种系a.a.  94   VK2 CDR2 a.a.1F12
  67   JK2种系a.a.  95   VK2 CDR3 a.a.1F12
  68   JK2种系a.a.  96   VH n.t.1F12
  69   JK3种系a.a.  97   VK1 n.t.1F12
  70   肽连接物  98   VK2 n.t.1F12
序列表
<110>Medarex，Inc.
     TERRETT，Jonathan A.
     CARDARELLI，Josephine M.
     RAO-NAIK，Chetana
     CHEN，Bingliang
     KING，David J.
 
<120>抗-B7H4单克隆抗体-药物偶联物及其使用方法
 
<130>MEDX-0199PC1
 
<140>WO 00/000,000
<141>2008-11-26
 
<150>US 60/991693
<151>2007-11-30
 
<160>76
 
<170>PatentIn version 3.5
 
<210>1
<211>119
<212>PRT
<213>人
 
<400>1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Leu Ser Ser Trp Ser Asn Trp Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
 
<210>2
 
<211>115
<212>PRT
<213>人
 
<400>2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Gly Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Thr Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
 
<210>3
<211>116
<212>PRT
<213>人
 
<400>3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Val Ser Arg Asn
            20                  25                  30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Gly Ser Gly Arg Thr Asp Cys Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Gly Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
 
<210>4
<211>126
<212>PRT
<213>人
 
<400>4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15     
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Lys Ala Leu Tyr Gly Ser Gly Ser Ser Asp Phe Tyr Tyr Tyr Gly
            100                 105                 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ala Val Ser Ser
        115                 120                 125
 
<210>5
<211>122
<212>PRT
<213>人
 
<400>5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1                   5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Lys Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Glu Leu Arg Tyr Phe Glu Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
    <210>6   <211>108   <212>PRT   <213>人
    <400>6   Glu Ile Val Leu Thr Gln Phe Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
 
<210>7
<211>109
<212>PRT
<213>人
 
<400>7
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
 
<210>8
<211>109
<212>PRT
<213>人
 
<400>8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
 
<210>9
<211>103
<212>PRT
<213>人
 
<400>9
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Thr Phe Gly Gln
                85                  90                  95
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100
 
<210>10
<211>108
<212>PRT
<213>人
 
<400>10
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
 
<210>11
<211>5
<212>PRT
<213>人
 
<400>11
Asp Tyr Phe Trp Thr
1               5
 
<210>12
<211>6
<212>PRT
<213>人
 
<400>12
Ser Asn Tyr Met Asn Trp
1               5
 
<210>13
<211>5
<212>PRT
<213>人
 
<400>13
Arg Asn Tyr Met Asn
1               5
 
<210>14
<211>5
<212>PRT
<213>人
 
<400>14
Asp Tyr Ala Met His
1               5
 
<210>15
<211>5
<212>PRT
<213>人
 
<400>15
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1               5
 
<210>16
<211>16
<212>PRT
<213>人
 
<400>16
Glu Ile Asn His Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
 
<210>17
<211>16
<212>PRT
<213>人
 
<400>17
Val Ile Tyr Gly Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1               5                   10                  15
 
<210>18
<211>16
<212>PRT
<213>人
 
<400>18
Val Ile Tyr Gly Ser Gly Arg Thr Asp Cys Ala Asp Ser Val Lys Gly
1               5                   10                  15
 
<210>19
<211>17
<212>PRT
<213>人
 
<400>19
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>20
<211>16
<212>PRT
<213>人
 
<400>20
Lys Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
 
<210>21
<211>11
<212>PRT
<213>人
 
<400>21
Leu Ser Ser Trp Ser Asn Trp Ala Phe Glu Tyr
1               5                   10
 
<210>22
<211>7
<212>PRT
<213>人
 
<400>22
Asp Thr Tyr Ala Met Asp Val
1               5
 
<210>23
<211>8
<212>PRT
<213>人
 
<400>23
Asp Gly Asp Tyr Gly Met Asp Val
1               5
 
<210>24
<211>16
<212>PRT
<213>人
 
<400>24
Leu Tyr Gly Ser Gly Ser Ser Asp Phe Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10                  15
 
<210>25
<211>14
<212>PRT
<213>人
 
<400>25
Glu Leu Arg Tyr Phe Glu Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10
 
<210>26
<211>12
<212>PRT
<213>人
 
<400>26
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu Ala
1               5                   10
 
<210>27
<211>12
<212>PRT
<213>人
 
<400>27
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
 
<210>28
<211>12
<212>PRT
<213>人
 
<400>28
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
 
<210>29
<211>11
<212>PRT
<213>人
 
<400>29
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>30
<211>12
<212>PRT
<213>人
 
<400>30
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
 
<210>31
<211>7
<212>PRT
<213>人
 
<400>31
Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr
1               5
 
<210>32
<211>7
<212>PRT
<213>人
 
<400>32
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
 
<210>33
<211>7
<212>PRT
<213>人
 
<400>33
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
 
<210>34
<211>7
<212>PRT
<213>人
 
<400>34
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1               5
 
<210>35
<211>7
<212>PRT
<213>人
 
<400>35
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
 
<210>36
<211>9
<212>PRT
<213>人
 
<400>36
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr
1               5
<210>37
<211>10
<212>PRT
<213>人
 
<400>37
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Met Tyr Thr
1               5                   10
 
<210>38
<211>10
<212>PRT
<213>人
 
<400>38
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Tyr Thr
1               5                   10
 
<210>39
<211>5
<212>PRT
<213>人
 
<400>39
Gln Gln Arg Arg Thr
1               5
 
<210>40
<211>9
<212>PRT
<213>人
 
<400>40
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Thr
1               5
 
<210>41
<211>357
<212>DNA
<213>人
 
<400>41
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc       60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt gattacttct ggacctggat ccgccagccc      120
ccagggaagg gcctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaaccac caactacaac      180
ccgtccctca agagtcgagt caccatttca gcagacacgt ccaagaacca gttctccctg      240
aggctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag actcagcagc      300
tggtcgaact gggcctttga gtactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca         357
 
<210>42
<211>345
<212>DNA
<213>人
 
<400>42
gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc       60
tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcagt agcaactaca tgaactgggt ccgccaggct      120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatggca gtggtagaac atattacgca      180
gactccgtga agggccgagt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt      240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatacctac      300
gctatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctct                      345
 
<210>43
<211>348
<212>DNA
<213>人
 
<400>43
gaggtgcagt tggtggagtc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc       60
tcctgtgcag cctctgggtt catcgtcagt agaaactaca tgaactgggt ccgccaggct      120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatggca gtggtaggac agactgcgca      180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt      240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatggggac      300
tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctca                   348
 
<210>44
<211>378
<212>DNA
<213>人
 
<400>44
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc       60
tcctgtgtag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct      120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat      180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat      240
ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtac aaaagccctc      300
tatggttcgg ggagttctga cttctactac tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc      360
acggtcgccg tctcctca                                                    378
 
<210>45
<211>366
<212>DNA
<213>人
 
<400>45
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc       60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc      120
ccagggaagg ggctggagtg gattgggaaa atcaatcata gcggaagtac caactacaac      180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg      240
aaactaaact ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agaattacga      300
tattttgaaa actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc      360
tcctca                                                                 366
 
<210>46
<211>324
<212>DNA
<213>人
 
<400>46
gaaattgtgt tgacgcagtt tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc    60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcacctact tagcctggta ccagcagaaa      120
cctggccagg ctcccagggt cctcatctat ggtgcatcca gaagggccac tggcatccca      180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag      240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct cactttcggc      300
ggagggacca aggtggagat caaa                                             324
 
<210>47
<211>327
<212>DNA
<213>人
 
<400>47
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc       60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa      120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca      180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag      240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacccat gtacactttt      300
ggccagggga ccaagctgga gatcaaa                                          327
 
<210>48
<211>327
<212>DNA
<213>人
 
<400>48
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc       60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa      120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca      180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag      240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctct gtacactttt      300
ggccagggga ccaagctgga gatcaaa                                          327
 
<210>49
<211>309
<212>DNA
<213>人
 
<400>49
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc       60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct      120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc      180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct      240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtaggacgt tcggccaagg gaccaaggtg      300
gaaatcaaa                                                              309
 
<210>50
<211>324
<212>DNA
<213>人
 
<400>50
gaaattgtgt  tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc    60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa      120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca      180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag      240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcg gacgttcggc      300
caagggacca aggtggaaat caaa                                             324
 
<210>51
<211>97
<212>PRT
<213>人
 
<400>51
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
 
<210>52
<211>97
<212>PRT
<213>人
 
<400>52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
 
<210>53
<211>99
<212>PRT
<213>人
 
<400>53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp
 
<210>54
<211>96
<212>PRT
<213>人
 
<400>54
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
 
<210>55
<211>94
<212>PRT
<213>人
<400>55
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp
                85                  90
 
<210>56
<211>282
<212>PRT
<213>人
 
<400>56
Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile
1               5                   10                  15
Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser
            20                  25                  30
Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile
        35                  40                  45
Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu
    50                  55                  60
Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val
65                  70                  75                  80
His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met
                85                  90                  95
Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr
        115                 120                 125
Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu
    130                 135                 140
Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn
145                 150                 155                 160
Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln
                165                 170                 175
Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser
            180                 185                 190
Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met
        195                 200                 205
Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser
    210                 215                 220
Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val
225                 230                 235                 240
Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser
                245                 250                 255
Lys Ala Ser Leu Cys Val Ser Ser Phe Phe Ala Ile Ser Trp Ala Leu
            260                 265                 270
Leu Pro Leu Ser Pro Tyr Leu Met Leu Lys
        275                 280
 
<210>57
<211>4
<212>PRT
<213>人
 
<400>57
Ala Leu Ala Leu
1
 
<210>58
<211>4
<212>PRT
<213>人
 
<220>
<221>MOD RES
<222>(1)..(1)
<223>Xaa is beta-alanine
 
<400>58
Xaa Leu Ala Leu
1
 
<210>59
<211>4
<212>PRT
<213>人
 
<400>59
Gly Phe Leu Gly
1
 
<210>60
<211>4
<212>PRT
<213>人
 
<400>60
Leu Leu Gly Leu
1
 
<210>61
<211>4
<212>PRT
<213>人
 
<400>61
Pro Arg Phe Lys
1
 
<210>62
<211>4
<212>PRT
<213>人
 
<400>62
Thr Arg Leu Arg
1
 
<210>63
<211>4
<212>PRT
<213>人
 
<400>63
Ser Lys Gly Arg
1
 
<210>64
<211>4
<212>PRT
<213>人
 
<400>64
Pro Asn Asp Lys
1
 
<210>65
<211>6
<212>PRT
<213>人
 
<400>65
Pro Val Gly Leu Ile Gly
1               5
 
<210>66
<211>5
<212>PRT
<213>人
 
<400>66
Gly Pro Leu Gly Val
1               5
 
<210>67
<211>8
<212>PRT
<213>人
 
<400>67
Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln
1               5
 
<210>68
<211>4
<212>PRT
<213>人
 
<400>68
Pro Leu Gly Leu
1
 
<210>69
<211>8
<212>PRT
<213>人
 
<400>69
Gly Pro Leu Gly Met Leu Ser Gln
1               5
 
<210>70
<211>8
<212>PRT
<213>人
 
<400>70
Gly Pro Leu Gly Leu Trp Ala Gln
1               5
 
<210>71
<211>22
<212>PRT
<213>人
 
<400>71
Leu Ser Ser Trp Ser Asn Trp Ala Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
1               5                   10                  15
Leu Val Thr Val Ser Ser
            20
 
<210>72
<211>14
<212>PRT
<213>人
 
<400>72
Glu Leu Arg Tyr Phe Glu Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10
 
<210>73
<211>5
<212>PRT
<213>人
 
<400>73
Tyr Gly Ser Gly Ser
1               5
 
<210>74
<211>20
<212>PRT
<213>人
 
<400>74
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
1               5                   10                  15
Thr Val Ser Ser
            20
 
<210>75
<211>11
<212>PRT
<213>人
 
<400>75
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
 
<210>76
<211>12
<212>PRT
<213>人
 
<400>76
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10

Claims (17)

1.一种抗体-伴侣分子偶联物，包括特异性结合PTK-7的抗体或其抗原结合部分以及伴侣分子，其中该伴侣分子选自式(m)、式(n)、式(o)、式(p)以及式(q)。
2.如权利要求1所述的抗体-伴侣分子偶联物，其中所述抗体或其抗原结合部分结合到被参考抗体识别的PTK-7上的表位上，其中该参考抗体包括分别在SEQ ID NO：4和10，SEQ ID NO：1和5，SEQ ID NO：1和6，SEQ ID NO：2和7，SEQ ID NO：3和8，SEQ ID NO：3和9，SEQ ID NO：84和85，或者SEQ ID NO：84和86中示出的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的抗体-伴侣分子偶联物，其中所述抗体或其抗原结合部分包括以下重链和轻链可变区，这些可变区包括分别在SEQ ID NO：4和10，SEQ ID NO：1和5，SEQ ID NO：1和6，SEQ ID NO：2和7，SEQ ID NO：3和8，SEQ ID NO：3和9，SEQID NO：84和85，或者SEQ ID NO：84和86中示出的氨基酸序列。
4.如权利要求1或2所述的抗体-伴侣分子偶联物，其中所述抗体或其抗原结合部分包括
a)包含SEQ ID NO：14的重链可变区CDR1；
b)包含SEQ ID NO：18的重链可变区CDR2；
c)包含SEQ ID NO：22的重链可变区CDR3；
d)包含SEQ ID NO：28的轻链可变区CDR1；
e)包含SEQ ID NO：34的轻链可变区CDR2；和
f)包含SEQ ID NO：40的轻链可变区CDR3。
5.一种抗体-伴侣分子偶联物，包括特异性结合PTK-7的抗体或其抗原结合部分以及伴侣分子，其中该抗体包括重链和轻链可变区，这些可变区包括分别在SEQ ID NO：4和10中示出的氨基酸序列，并且该伴侣分子为式(m)(图28)。
6.一种抗体-伴侣分子偶联物，包括抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分包括分别在SEQ ID NO：4和10中示出的氨基酸序列。
7.如以上权利要求中任一项所述的抗体-伴侣分子偶联物，其中该抗体-伴侣分子偶联物是由连接物与所述抗体偶联的，该连接物选自：巯基连接物、肽基连接物、肼连接物、以及二硫化物连接物。
8.一种组合物，包含以上权利要求中任一项所述的抗体-伴侣分子偶联物和药学可接受的载体。
9.编码如权利要求2、3或4所述的抗体或其抗原结合部分的分离的核酸分子。
10.一种表达载体，包含权利要求10所述的核酸分子。
11.一种宿主细胞，包含权利要求11所述的表达载体。
12.一种治疗或预防以表达PTK7的肿瘤细胞生长为特征的疾病的方法，包括对受试者施用治疗或预防该疾病有效量的权利要求1-7中任一项的抗体-伴侣分子偶联物。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述疾病为癌症。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述癌症选自：结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、急性髓样白血病、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、以及上皮细胞癌。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述癌症为胰腺癌。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述癌症为肺癌。
CN200880118641XA 2007-11-30 2008-11-26 针对蛋白酪氨酸激酶7(ptk7)的单克隆抗体伴侣分子偶联物 Pending CN101939028A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US503407P 2007-11-30 2007-11-30
US61/005,034 2007-11-30
PCT/US2008/084949 WO2009073546A2 (en) 2007-11-30 2008-11-26 Monoclonal antibody partner molecule conjugates directed to protein tyrosine kinase 7 (ptk7)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101939028A true CN101939028A (zh) 2011-01-05

Family

ID=40718460

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880118641XA Pending CN101939028A (zh) 2007-11-30 2008-11-26 针对蛋白酪氨酸激酶7(ptk7)的单克隆抗体伴侣分子偶联物

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20120027782A1 (zh)
EP (1) EP2229187A2 (zh)
JP (1) JP2011505146A (zh)
KR (1) KR20100101124A (zh)
CN (1) CN101939028A (zh)
AR (1) AR069903A1 (zh)
AU (1) AU2008334076A1 (zh)
CL (1) CL2008003527A1 (zh)
MX (1) MX2010005966A (zh)
TW (1) TW200938223A (zh)
WO (1) WO2009073546A2 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103547597A (zh) * 2011-02-18 2014-01-29 施特姆森特Rx股份有限公司 新型调节剂及使用方法
US9777070B2 (en) 2014-04-30 2017-10-03 Pfizer Inc Anti-PTK7 antibody-drug conjugates
CN110845480A (zh) * 2019-11-22 2020-02-28 荣昌生物制药（烟台）有限公司 一种双功能细胞毒素及其用途
WO2023020551A1 (zh) * 2021-08-18 2023-02-23 和迈生物科技有限公司 抗ptk7单域抗体及其应用

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA017812B1 (ru) 2005-12-08 2013-03-29 Медарекс, Инк. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые связываются с протеинтирозинкиназой 7 ( ptk7) человека, и их применение
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
WO2010062171A2 (en) 2008-11-03 2010-06-03 Syntarga B.V. Novel cc-1065 analogs and their conjugates
ES2660428T3 (es) 2010-04-21 2018-03-22 Syntarga B.V. Conjugados de análogos de CC-1065 y conectores bifuncionales
EP2380909A1 (en) * 2010-04-26 2011-10-26 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. PTK-7 protein involved in breast cancer
US8852599B2 (en) * 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
CA2843504C (en) * 2011-08-12 2020-08-25 Ascendis Pharma A/S Protein carrier-linked prodrugs
UY34887A (es) 2012-07-02 2013-12-31 Bristol Myers Squibb Company Una Corporacion Del Estado De Delaware Optimización de anticuerpos que se fijan al gen de activación de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
NZ721877A (en) * 2013-12-19 2022-07-29 Seagen Inc Methylene carbamate linkers for use with targeted-drug conjugates
MY177390A (en) 2014-01-10 2020-09-14 Byondis Bv Method for purifying cys-linked antibody-drug conjugates
DK3151921T3 (da) 2014-06-06 2019-12-02 Bristol Myers Squibb Co Antistoffer mod glucocorticoid-induceret tumornekrosefaktor- receptorer (gitr) og anvendelser deraf
LT3221346T (lt) 2014-11-21 2020-11-10 Bristol-Myers Squibb Company Antikūnai, apimantys modifikuotas sunkiosios grandinės pastoviąsias sritis
SI3221363T1 (sl) 2014-11-21 2020-09-30 Bristol-Myers Squibb Company Protitelesa proti CD73 in njihova uporaba
TN2017000267A1 (en) 2014-12-23 2018-10-19 Bristol Myers Squibb Co Antibodies to tigit
WO2017087678A2 (en) 2015-11-19 2017-05-26 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof
IL295230A (en) 2016-03-04 2022-10-01 Bristol Myers Squibb Co Combination therapy with anti-cd73 antibodies
BR112019016374A2 (pt) 2017-02-17 2020-04-07 Bristol-Myers Squibb Company anticorpos para alfa-sinucleína e usos dos mesmos
KR20200006115A (ko) 2017-05-16 2020-01-17 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-gitr 효능제 항체에 의한 암의 치료
WO2018218056A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Birstol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
WO2022015113A1 (ko) * 2020-07-16 2022-01-20 연세대학교 산학협력단 Ptk7에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2023180484A1 (en) * 2022-03-23 2023-09-28 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing ptk7
GB202212077D0 (en) 2022-08-18 2022-10-05 Tribune Therapeutics Ab Agents that inhibit ccn ligand-induced signalling for treating disease
WO2024054030A1 (ko) * 2022-09-06 2024-03-14 연세대학교 산학협력단 항-ptk7 항체 및 이의 용도

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050014700A1 (en) * 2001-09-07 2005-01-20 Boger Dale L. Cbi analogues of cc-1065 and the duocarmycins
GB0219776D0 (en) * 2002-08-24 2002-10-02 Oxford Glycosciences Uk Ltd A protein involved in carcinoma
US7691962B2 (en) * 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
NZ550934A (en) * 2004-05-19 2010-05-28 Medarex Inc Chemical linkers and conjugates thereof
US20080279868A1 (en) * 2005-09-26 2008-11-13 Medarex, Inc. Antibody-Drug Conjugates and Methods of Use
EA017812B1 (ru) * 2005-12-08 2013-03-29 Медарекс, Инк. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые связываются с протеинтирозинкиназой 7 ( ptk7) человека, и их применение

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103547597A (zh) * 2011-02-18 2014-01-29 施特姆森特Rx股份有限公司 新型调节剂及使用方法
US9409995B2 (en) 2011-02-18 2016-08-09 Stemcentrx, Inc. PTK7 modulators and methods of use
CN103547597B (zh) * 2011-02-18 2017-03-15 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司 新型调节剂及使用方法
CN107056945A (zh) * 2011-02-18 2017-08-18 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司 新型调节剂及使用方法
US9914784B2 (en) 2011-02-18 2018-03-13 Abbvie Stemcentrx Llc PTK7 modulators and methods of use
US10836831B2 (en) 2011-02-18 2020-11-17 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-PTK7 antibodies and methods of use
US9777070B2 (en) 2014-04-30 2017-10-03 Pfizer Inc Anti-PTK7 antibody-drug conjugates
CN110845480A (zh) * 2019-11-22 2020-02-28 荣昌生物制药（烟台）有限公司 一种双功能细胞毒素及其用途
CN110845480B (zh) * 2019-11-22 2022-03-15 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 一种双功能细胞毒素及其用途
WO2023020551A1 (zh) * 2021-08-18 2023-02-23 和迈生物科技有限公司 抗ptk7单域抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CL2008003527A1 (es) 2009-10-09
US20120027782A1 (en) 2012-02-02
TW200938223A (en) 2009-09-16
WO2009073546A3 (en) 2009-12-30
MX2010005966A (es) 2010-06-15
EP2229187A2 (en) 2010-09-22
KR20100101124A (ko) 2010-09-16
JP2011505146A (ja) 2011-02-24
AU2008334076A1 (en) 2009-06-11
AR069903A1 (es) 2010-03-03
WO2009073546A2 (en) 2009-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101939028A (zh) 针对蛋白酪氨酸激酶7(ptk7)的单克隆抗体伴侣分子偶联物
CN101626782B (zh) 结合cd22的人抗体及其用途
JP5401639B2 (ja) タンパク質チロシンキナーゼ７（ｐｔｋ７）に対するヒトモノクローナル抗体およびそれらの使用
CN101951946B (zh) 结合间皮素的人抗体及其应用
CN101356195B (zh) 抗岩藻糖基-gm1的人单克隆抗体及使用抗岩藻糖基-gm1抗体的方法
US8865875B2 (en) Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with C-terminal extensions
US20110085970A1 (en) Anti-b7h4 monoclonal antibody-drug conjugate and methods of use
DK2403878T3 (en) CADM1-SPECIFIC FULLY HUMAN ANTIBODIES
CN101605906A (zh) 结合cd70的人类抗体及其用途
KR20090088940A (ko) 씨디19에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도
CN103897058A (zh) 结合cxcr4的人类抗体及其用途
KR20090088946A (ko) 씨디70에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도
MX2007009878A (es) Anticuerpos monoclonales para antigeno de membrana especifica para prostata (amep).
CN105330741A (zh) 抗程序性死亡配体1（pd-l1）的人单克隆抗体
CN101636502B (zh) 结合cd19的人类抗体及其用途
US20090162372A1 (en) Fibronectin ed-b antibodies, conjugates thereof, and methods of use
CN101951960A (zh) 抗rg-1抗体之偶联物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20110105