BR112019016374A2

BR112019016374A2 - anticorpos para alfa-sinucleína e usos dos mesmos

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Publication number: BR112019016374A2
Application number: BR112019016374A
Authority: BR
Inventors: K. Ahlijanian Michael; Ernest Meredith Jere Jr.; DEVIDZE Nino; David Graef John; L. Halk Edward
Original assignee: Bristol-Myers Squibb Company
Priority date: 2017-02-17
Filing date: 2018-02-16
Publication date: 2020-04-07
Also published as: AU2018222743B2; EA201991720A1; JP2020513791A; CN110506057A; KR20190117622A; SG11201906947SA; SG10201913011WA; US20210221878A1; EP3583124A1; MX2019009117A; KR102573778B1; WO2018151821A1; US20200231661A1; JP7136790B2; US11827695B2; WO2018151821A8; CA3051839A1; US11142570B2; AU2018222743A1; IL268243A

Abstract

são descritos aqui anticorpos anti-a-sinucleína que preferencialmente se ligam à a-sinucleína oligomérica mais do que a-sinucleína monomérica, composições terapêuticas compreendendo os anticorpos, e métodos de uso dos anticorpos para tratar as sinucleinopatias.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPOS PARA ALFA-SINUCLEÍNA E USOS DOS MESMOS. INFORMAÇÃO DE PEDIDO RELACIONADO [001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos N^Q 62/460.416, depositado em 17 de Fevereiro de 2017. O teor completo do pedido provisório anteriormente mencionado é incorporado aqui por referência.

ANTECEDENTES [002] A α-sinucleína (aSyn) é uma proteína de 140 aminoácidos, preferencialmente expressa em neurônios em terminais pré-sinápticos, onde se acredita que ela desempenhe um papel na regulação da transmissão sináptica (Bendor et al., Neuron 2013;79:1044-66). Foi proposto existir nativamente tanto como um monômero desdobrado (Fauvet et al., JBC 2012;287:15345-64) quanto um tetrâmero estável de α-hélices (Bartels et a!., Nature 2011;477:107-10; Wang et al., PNAS 2011;108:17797-802) e mostrou-se sofrer modificações póstranslacionais severas (Beyer and Ariza, Mol Neurobiol 2013;47:50924). Uma modificação que foi extensivamente estudada é a fosforilação de aSyn no resíduo de aminoácido, serina 129 (S129). Normalmente, apenas uma pequena porcentagem de aSyn é constitutivamente fosforilada em S129 (pS129), enquanto que a grande maioria de aSyn encontrada em inclusões intracelulares patológicas é aSyn pS129 (Oueslati, J Parkinsons Dis 2016;6:39-51). Estas inclusões patológicas consistem em acúmulos agregados, insolúveis de proteínas de aSyn desnaturadas e são um aspecto característico de um grupo de doenças neurodegenerativas coletivamente conhecidas como sinucleinopatias (Galvin et al., Arch Neurol 2001;58:186-90).

[003] Em sinucleinopatias, a aSyn pode formar agregados patológicos em neurônios conhecidos como corpos de Lewy, que são

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2/252 característicos tanto de Doença de Parkinson (DP) e demência com corpos de Lewy (DLB). Adicionalmente, lesões ricas em aSyn anormais chamadas inclusões citoplásmicas gliais (GCIs) são encontradas em oligodendrócitos, e representam a marca patológica de uma sinucleinopatia fatal, que progride rapidamente conhecida como atrofia de múltiplos sistemas (AMS). A evidência inicial para a propagação de aSyn patológica em todo o cérebro vem da progressão estereotípica de patologia cerebral descrita em DP (Braak et al., 2003) e de evidência de disseminação por hospedeiro-para-enxerto de agregados de aSyn em pacientes de DP (Kordower et al., 2008). Intrigantemente, relatos de níveis indetectáveis (Ozawa et al., Acta Neuropathologica 2001;102:188-190; Miller et al., J Neural Transm (Vienna) 2005;112:1613-24; Jin et al., Journal of Medical and Dental Sciences 2008;555:145-53) ou baixos (Asi etal., Glia 2014;62:964-70) de expressão de mRNA de aSyn em oligodendrócitos sugerem que alguma forma patológica de aSyn é propagada a partir de neurônios, onde ela é altamente expressa, aos oligodendrócitos. Trabalhos recentes suportam esta ideia de propagação de aSyn, demonstrando que aSyn é adotada por oligodendrócitos (Reyes et al., Glia 2014;62:387-98) e pelos neurônios (Volpicelli-Daley et al., Neuron 2011; 72:57-71; Luk et al., Science 2012; 338: 949-953). Além disso, a inoculação de homogeneizados de cérebro humano de pacientes de AMS em camundongos transgênicos de aSyn ou extratos de LB purificados de cérebros de DP em camundongos e primatas não humanos resulta em disfunção neurológica e extensivos depósitos neuronais de pS129 (Watts et al., PNAS 2013;110:19555-60; Prusiner et al., PNAS 2015;112:E5308-17; Recasens et al., Annals Neurology 2014;75:351-62).

[004] Atualmente, existe uma falta de terapêuticos que visam as sinucleinopatias a partir da perspectiva de propagação de aSyn.

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Consequentemente, agentes teparêuticos que preferencialmente alvejam a forma patológica de aSyn seriam desejáveis no tratamento de pacientes com sinucleinopatias tais como DP, DLB, e AMS.

SUMÁRIO [005] São fornecidos aqui anticorpos isolados, tais como anticorpos monoclonais, que especificamente se ligam à α-sinucleína e têm propriedades funcionais desejáveis. Estas propriedades incluem ligação, preferencialmente, à α-sinucleína oligomérica em comparação com α-sinucleína monomérica, e a capacidade de inibir a geração de agregados de α-sinucleína solúveis ou insolúveis (por exemplo, agregados de α-sinucleína fosforilados em serina-129) in vitro e in vivo. Os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui podem ser usados para tratar, diminuir a gravidade de, retardar a progressão de, reduzir o risco de desenvolvimento, retardar o início de, e diagnosticar sinucleinopatias, uma família de doenças caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro.

[006] Em um aspecto, são fornecidos aqui anticorpos ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam à α-sinucleína e exibem uma ou mais das seguintes propriedades:

[007] (a) ligam-se à α-sinucleína de camundongo e rato;

[008] (b) ligam-se à β-sinucleína humana e γ-sinucleína humana;

[009] (c) têm uma maior afinidade quanto aos oligômeros de asinucleína do que os monômeros de a-sinucleína;

[0010] (d) inibem a geração de agregados de a-sinucleína insolúveis induzidos por oligômero de α-sinucleína (por exemplo, agregados de α-sinucleína fosforilados em serina-129);

[0011] (e) esgotam a espécie molecular que produz agregados de α-sinucleína solúveis ou insolúveis (por exemplo, agregados de asinucleína fosforilados em serina-129) de PFF e/ou lisado cerebral

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4/252 preparado de pacientes com agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro;

[0012] (f) ligam-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 123-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1);

[0013] (g) ligam-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 125-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1);

[0014] (h) ligam-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 130-139 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1);

[0015] (i) ligam-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 119-126 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1); e [0016] (j) ligam-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 130-138 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1).

[0017] Em certas modalidades, o oligômero de α-sinucleína é PFF, por exemplo, preparada como descrito no Exemplo 3. Em algumas modalidades, os oligômeros de α-sinucleína são oligômeros de asinucleína solúveis. Em outras modalidades, os oligômeros de asinucleína são oligômeros de α-sinucleína insolúveis.

[0018] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos, têm uma maior afinidade para PFF, agregados solúveis (oligômeros) ou agregados insolúveis de α-sinucleína do que os monômeros de a-sinucleína, como avaliado por, por exemplo, um monômero de a-sinucleína/PFF de α-sinucleína, por exemplo, como descrito no Exemplo 3. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos, têm um monômero de asinucleína/PFF de α-sinucleína de 100 ou maior, por exemplo, 500 ou maior, 700 ou maior, 1500 ou maior 3000 ou maior, ou 5000 ou maior.

[0019] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos, ligam-se à asinucleína monomérica com um EC50 de 500 nM ou maior, e ligam-se

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5/252 à PFF com um EC50 de 0,5 nM ou menor. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, inibem a fosforilação de serina-129 de induzida por asinucleína com um IC50 de 0,1 nM ou menor, como avaliado, por exemplo, usando 0 ensaio descrito no Exemplo 10.

[0020] Em outro aspecto, são fornecidos aqui anticorpos monoclonais isolados, ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, que especificamente se ligam à α-sinucleína e compreendem as três CDRs de cadeia pesada variável e as três CDRs de cadeia leve variável que estão nos pares de cadeia pesada variável e cadeia leve variável selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8 e 9, 18 e 19, 28 e 29, 38 e 39, 48 e 49, 58 e 59, 68 e 69, 78 e 79, 94 e 95, 94 e 96, 94 e 97, e 106 e 107.

[0021] Em outro aspecto, são fornecidos aqui anticorpos monoclonais isolados, ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam à α-sinucleína, compreendendo:

[0022] (a) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NOs: 2-4, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 5-7, respectivamente;

[0023] (b) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 22-24, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 25-27, respectivamente;

[0024] (c) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 22-24, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 28-30, respectivamente;

[0025] (d) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 37-39, respectivamente, e

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CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 40-42, respectivamente;

[0026] (e) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 47-49, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 50-52, respectivamente;

[0027] (f) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 57-59, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 60-62, respectivamente;

[0028] (g) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 67-69, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 70-72, respectivamente;

[0029] (h) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 77-79, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 80-82, respectivamente;

[0030] (i) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 87-89, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 90-92, respectivamente;

[0031] (j) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 87-89, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 93-95, respectivamente;

[0032] (k) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 87-89, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 96-98, respectivamente; ou

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7/252 [0033] (I) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 107-109, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 110-112, respectivamente.

[0034] Em outro aspecto, são fornecidos aqui anticorpos monoclonais isolados, ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam à α-sinucleína e compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8, 18,31,43, 53, 63, 73, 83, 99, e 113.

[0035] Em outro aspecto, são fornecidos aqui anticorpos monoclonais isolados, ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam à α-sinucleína e compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 9, 19, 32, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 100, 101, 102, e 114.

[0036] Em outro aspecto, são fornecidos aqui anticorpos monoclonais isolados, ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam à α-sinucleína e compreendem sequências de região variável de cadeia pesada e leve pelo menos 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100% idênticas às sequências de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em:(a) SEQ ID NOs: 8 e 9, 18 e 19, 31 e 32, 31 e 33, 43 e 44, 53 e 54, 63 e 64, 73 e 74, 83 e 84, 99 e 100, 99 e 101,99 e 102; e SEQ ID NOs: 113 e 114.

[0037] Em outro aspecto, são fornecidos aqui anticorpos monoclonais isolados, ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam à α-sinucleína e compreendem sequências de cadeia

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8/252 pesada e cadeia leve pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, ou 100% idênticas às sequências de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 10 e 11,20 e 21, 34 e 35, 34 e 36, 45 e 46, 55 e 56, 65 e 66, 75 e 76, 85 e 86, 103 e 104, 103 e 105, 103 e 106, e 115 e 116. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos, ligam-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 123-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos, ligam-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 125-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1). Os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos, ligam-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 130-139 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1). Os anticorpos antia-sinucleína, ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos, ligam-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 119-126 de asinucleína humana (SEQ ID NO: 1). Os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos, ligam-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 130-138 de a-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1).

[0038] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos, ligam-se à asinucleína de rato e camundongo. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos, ligam-se à β-sinucleína humana e γ-sinucleína humana. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos, têm afinidade maior para PFF, agregados solúveis (oligômeros) ou agregados insolúveis de asinucleína do que os monômeros de α-sinucleína, como avaliado por um monômero de α-sinucleína/PFF de α-sinucleína (relação de ligação

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9/252 de monômero:PFF), como descrito, por exemplo, no Exemplo 3. Em algumas modalidades, a relação de ligação de monômero:PFF é 100 ou maior, 500 ou maior, 700 ou maior, 1500 ou maior, 3000 ou maior, ou 5000 ou maior.

[0039] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos, ligam-se ao mesmo epitopo como os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui (por exemplo, antibodies 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, e 1E8). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos, competem quanto à ligação à asinucleína humana com os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui (por exemplo, anticorpos 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11,2E2, 23H8-1,23H8-2, 23H8-3, e 1E8).

[0040] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos, são igG 1, lgG2, lgG3, ou lgG4 anticorpos, ou variantes dos mesmos. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína compreendem uma região Fc com função efetora reduzida ou nenhuma, por exemplo, um Fc de IgG 1 não efetora com as seguintes mutações: L234A, L235E, e G257A.

[0041] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos, são anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antigeno dos mesmos, são modificados para reduzir a imunogenicidade em humanos. Em uma modalidade, o anticorpo anti-a-sinucleína, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve mencionadas nas SEQ ID NOs: 18 e 19, respectivamente.

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10/252 [0042] Em outro aspecto, são fornecidas aqui moléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo anti-a-sinucleína ligado a uma molécula tendo uma segunda especificidade de ligação.

[0043] Em outro aspecto, são fornecidos aqui ácidos nucleicos codificando as CDRs, ou as regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve, ou as cadeias pesadas e/ou leves dos anticorpos anti-asinucleína, ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, descritos aqui, vetores de expressão compreendendo as moléculas de ácido nucleico, e células transformadas com os vetores de expressão.

[0044] Em outro aspecto, são fornecidos aqui imunoconjugados compreendendo anticorpos anti-a-sinucleína ligados a uma porção, tal como uma porção de ligação, uma porção de rotulagem, uma porção biologicamente ativa, ou um agente terapêutico.

[0045] Em outro aspecto, são fornecidas aqui composições compreendendo anticorpos anti-a-sinucleína ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, e um veículo. São também fornecidos aqui kits compreendendo os anticorpos anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, e instruções para uso.

[0046] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método de preparação de um anticorpo anti-a-sinucleína, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo expressão do anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em uma célula e isolamento do anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, da célula.

[0047] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método de detecção de α-sinucleína em uma amostra compreendendo o contato da amostra com um anticorpo anti-a-sinucleína, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, anticorpo biespecífico, ou imunoconjugado descrito aqui sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, e α-sinucleína, e detecção da formação do complexo.

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11/252 [0048] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método de inibição da geração de agregados de α-sinucleína insolúveis ou solúveis (por exemplo, agregados de α-sinucleína fosforilados em serina-129) em uma célula compreendendo contatar a célula com uma quantidade eficaz do anticorpo anti-a-sinucleína, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, anticorpo biespecífico, ou imunoconjugado descrito aqui. Em algumas modalidades, os anticorpos inibem a geração de agregados de α-sinucleína insolúveis ou solúveis que não contêm asinucleína fosforilada em serina 129. Em algumas modalidades, a fosforilação de serina-129 é induzida por oligômeros de a-sinucleína. Em algumas modalidades, os oligômeros de α-sinucleína são fibrilas de α-sinucleína pré-formadas. Em outras modalidades, os oligômeros de α-sinucleína são derivado de amostras cerebrais de pacientes com sinucleinopatias.

[0049] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método de tratamento, diminuição da gravidade de, retardo da progressão de, redução do risco de desenvolvimento, e/ou retardo do início de, uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro compreendendo a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo anti-a-sinucleína, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, anticorpo biespecífico, ou imunoconjugado descritos aqui.

[0050] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método de diagnóstico de uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína em um indivíduo compreendendo:

[0051] (a) contatar uma amostra do indivíduo com o anticorpo antia-sinucleína, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, anticorpo biespecífico, ou imunoconjugado descrito aqui de modo que um complexo de anticorpo-antígeno seja formado;

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12/252 [0052] (b) medir a quantidade do complexo formado; e [0053] (c) comparar a amostra do complexo na amostra com a quantidade em um controle, em que um nível elevado do complexo na amostra relativa ao controle indica que o indivíduo tem uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína. Em algumas modalidades, a amostra é fluido cerebrospinal, extrato de tecido cerebral, urina, ou sangue.

[0054] Em algumas modalidades, a doença nos métodos descritos acima é doença de Parkinson, demência de doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, doença de corpo de Lewy, atrofia de mútiplo sistema, ou insuficiência autômica pura. Em algumas modalidades, os métodos descritos acima também compreendem administrar um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0055] A Figura 1 é uma série de gráficos mostrando dados de ligação ao epitopo para 7A10, 21 A3, 15A5, 36A3, 11H11-1, 44B11, 1E8, 2E2, e 23H8 que foram incubados em placas revestidas com diferentes peptídeos de aSyn. Anticorpos ligados foram medidos por ELISA unidirecional. Os dados representam determinações simples.

[0056] A Figura 2 é uma série de gráficos da ligação de 7A10, 21 A3, 15A5, 36A3, 11H11-1, e 44B11 ao monômero de aSyn do tipo selvagem recombinante humano de tamanho natural, PFF de aSyn ou PFF de aSyn de A53T. Os anticorpos foram incubados em solução com concentrações crescentes de monômero de aSyn, PFF de aSyn ou PFF de aSyn de A53T. Anticorpos não ligados foram capturados em placas revestidas com PFF e medidos por ELISA unidirecional. Os dados representam a média±sd para determinações duplicadas.

[0057] A Figura 3 é um gráfico mostrando a ligação de Anticorpo 1 (um anticorpo conhecido ligar-se à aSyn) ao monômero de aSyn do tipo selvagem recombinante de tamanho natural, PFF de aSyn ou PFF

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13/252 de aSyn de A53T. O anticorpo não ligado foi capturado em placas revestidas com PFF e medido por ELISA unidirecional. Os dados representam a média±sd para determinações duplicadas.

[0058] A Figura 4 mostra a análise hotspot de imunogenicidade das cadeias pesada (VH) e leve (VK) de 7A10. A numeração dos aminoácidos segue a convenção de Kabat. As três regiões de CDR são indicadas pelas caixas retangulares para cada uma das duas cadeias, enquanto os resíduos estruturais são indicados por FW1, FW2 e FW3. O número abaixo de cada aminoácido significa a proporção de alelos que ligam um peptídeo de 15 mer centrado no aminoácido. Por exemplo, 5 a Y52 em 7A10_VH refere-se ao peptídeo de 15 mer centrado em Y52, isto é, LEWIGYIYYSGRTKY e significa que (i) este peptídeo não tem uma equiparação de linhagem germinativa humana (portanto, não auto), e (ii) entre 50 a 60% dos 27 alelos mostram alta afinidade de ligação a este peptídeo. Os números são atribuídos a uma cor em uma escala de cinza claro (menos provável de ser imunogênico) a escuro (mais provável de ser hotspot imunogênico) que variam os graus de cor como visto na figura. As 3 setas em negrito mostram as escolhas para as seleções de mutante: R56S, K58N, T93A.

[0059] As Figuras 5A e 5B são gráficos da porcentagem de doadores de PBMC humana de voluntário saudável com uma resposta de proliferação de CD4+ positiva após 7 dias de exposição para testar os anticorpos. Cada barra horizontal representa um doador positivo. 7A10 e 7A10 T93A foram testados em diferentes ciclos de ensaio. Avastina é um anticorpo monoclonal anti VEGF A e usada como um controle negativo. mAb de alL-21 R é um anticorpo monoclonal anti-IL21R totalmente humano e usado como um controle positivo.

[0060] As Figuras 6A e 6B são gráficos mostrando a ligação de 7A10 (Figura 6A) e 7A10-T93A (Figura 6B) para aumentar a

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14/252 concentração de peptídeos de aSyn de camundongo, rato e humana, e PFF de WT. O anticorpo não ligado foi capturado em placas revestidas com PFF e medido por ELISA unidirecional. Os dados representam a médiaisd para determinações duplicadas.

[0061] A Figura 7 é uma série de gráficos mostrando a ligação de 7A10, 21 A3, 15A5, 36A3, 11H11-1, e 44B11 aos monômeros de aSyn, pSyn, ySyn do tipo selvagem recombinante humana de tamanho natural; PFF de aSyn foi incluído como um controle positivo. O anticorpo não ligado foi capturado em placas revestidas com PFF e medido por ELISA unidirecional. Os dados representam a médiaisd para determinações duplicadas.

[0062] As Figuras 8A e 8B são gráficos mostrando a análise de ressonância plasmônica de superfície (SPR) da ligação de 7A10 e Anticorpo 1 para aSyn monomérica do tipo selvagem ou PFF. A Figura 8A mostra a ligação de aSyn wt monomérica ao 7A10 capturado na superfície como a curva inferior e ligação realçada de PFF multimérico (curva superior) ao 7A10. Em particular, a taxa de dissociação de aSyn do tipo selvagem é muito rápida, enquanto a dissociação de PFF é muito lento. A Figura 8B mostra o mesmo formato de dados para o Anticorpo 1 (a curva inferior corresponde ao PFF e a curva superior à aSyn do tipo selvagem). Ao contrário de 7A10, o anticorpo 1 não mostra nenhuma seletividade discernível na ligação da aSyn do tipo selvagem versus a forma PFF.

[0063] As Figuras 9A e 9B são gráficos mostrando os resultados de um ensaio de SPR refinado para estimar a avidez de 7A10 e 7A10T93A para PFF. A Figura 9A mostra cinéticas de ligação influenciadas pela avidez de várias concentrações (diluições de 3 vezes 100 nM a 0,4 nM) de 7A10-lgG1.3f ao PFF imobilizado na superfície (ka (1/Ms): 5,811E+7, kd (1/s): 0,009834, K_D: 1.692E-10 Μ). A Figura 9B mostra o mesmo format de dados para 7A10-T93A-lgG1.3f (ka (1/Ms):

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8,946E+7, kd (1/s): 0,03873, K_D: 4.329E-10 M).

[0064] A Figura 10A é um gráfico mostrando a indução de pS129 (normalizada a controle não tratado) após 11 dias de tratamento com PFF a 10 nM em neurônios hipocampais de rato transduzidos com MOI de AAV-hA53T-aSyn crescente. A Figura 10B é um gráfico mostrando curvas de resposta à concentração para a indução de pS129 (normalizada a controle não tratado) em neurônios hipocampais de rato transduzidos (3K MOI AAV-hA53T aSyn) tratados com hA53TPFF de aSyn (linha superior (ascendente)) ou monômero (linha inferior (plana)) durante 11 dias. A Figura 10C é um gráfico mostrando a indução de pS129 (normalizada a controle de PFF a 10 nM) após 11 dias de tratamento de neurônios hipocampais de rato transduzidos (3K MOI AAV-hA53T- aSyn) com lisados de 9 diferentes amostras de de érebro derivadas de paciente de AMS. As barras da esquerda para a direita correspondem ao PFF a 10 nM, MSA#1, MSA#2, MSA#3, MSA#4, MSA#5, MSA#6, MSA#7, MSA#8, e MSA#9. A Figura 10D mostra imagens imunofluorescentes de sinal de pS129 induzido em neurônios hipocampais de rato transduzidos (3K MOI AAV-hA53TaSyn) 11 dias após o tratamento com tampão, PFF a 10 nM, lisado de um cérebro de controle, ou lisado de um cérebro de AMS. Os lisados cerebrais foram aplicados em uma diluição de 1:300. A Figura 10E é um gráfico mostrando a correlação inversa entre a indução de aSyn pS129 (normalizada a controle não tratado; linha ascendente) e pontos de ramificação (normalizada a controle não tratado; linha descendente) em neurônios hipocampais de rato transduzidos (3K MOI AAV-hA53TaSyn) após 11 dias de tratamento com concentrações crescentes de PFF. A Figura 10F é um gráfico mostrando a indução de pS129 aSyn (normalizada a controle não tratado), em neurônios hipocampais de rato transduzidos (3K MOI AAV-hA53T- aSyn) após 11 dias de tratamento com PFF, MSA e lisados de cérebro de controle e as

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16/252 péletes de centrifugação de alta velocidade isoladas e sobrenadantes restantes de MSA e lisados de cérebro de controle. As barras da esquerda para direita correspondem ao controle, PFF a 1 nM, cérebro de AMS (lisado), AMS (Pélete), AMS (Sup), Controle (Lisado), Controle (Pélete), e Controle (Sup). A Figura 10G é um gráfico mostrando a indução dependente de tempo de aSyn pS129 (normalizada a um controle positivo de PFF a 10 nM) seguindo tratamento com pélete ressuspensa de um lisado tecidual de cérebro de AMS. As barras da esquerda para direita correspondem a 7 dias após a incubação, 14 dias após a incubação, e 18 dias após a incubação. A Figura 10H é um gráfico mostrando a indução de pS129 (normalizada a controle não tratado) e pontos de ramificação (normalizada a controle não tratado) 11d após tratamento tanto com PFF a 10 nM e lisados teciduais de cérebro de AMS. O par de barras apresentado para cada um de Controle (a barra de indução de pS129 é ausente, dada a ausência de indução), PFF, e AMS estão na ordem de indução de pS129 e pontos de ramificação.

[0065] A Figura 11 é uma série de gráficos mostrando curvas de resposta à concentração cumulativas para a imunodepleção de anticorpo 1 de PFF e lisados cerebrais de três diferentes pacientes de AMS (12-18, 01-03, 04-51). Amostras imunoesgotadas foram testadas quanto à indução de pS129 em neurônios hipocampais de rato transduzidos com 3K MOI hA53T aSyn AAV. Os valores de eixo Y representam a intensidade de pS129 normalizada a amostras não esgotadas. Os pontos de dados (média± 95% Cl) e curvas ajustadas gerados usando grupo de dados cumulativos. IC50S calculados para cada experimento e médiaisd mostrada.

[0066] A Figura 12 é uma série de gráficos mostrando curvas cumulativas de resposta à concentração para imunodepleção de 7A10 de PFF e lisados cerebrais gerados de três diferentes pacientes de

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AMS (12-18, 01-03, 04-51). Amostras imunoesgotadas foram testadas quanto à indução de pS129 em neurônios hipocampais de rato transduzidos com 3K MOI hA53T aSyn AAV. Os valores de eixo Y representam a intensidade de pS129 normalizada a amostras não esgotadas. Os pontos de dados (média± 95% Cl) e curvas ajustadas gerados usando grupo de dados cumulativos. IC50s calculados para cada experimento e média±sd mostrada.

[0067] A Figura 13 é uma série de gráficos mostrando curvas cumulativas de resposta à concentração para imunodepleção de 21 A3 de PFF e lisados cerebrais gerados de três diferentes pacientes de AMS (12-18, 01-03, 04-51). Amostras imunoesgotadas foram testadas quanto à indução de pS129 em neurônios hipocampais de rato transduzidos com 3K MOI hA53T aSyn AAV. Os valores de eixo Y representam a intensidade de pS129 normalizada a amostras não esgotadas. Os pontos de dados (média± 95% Cl) e curvas ajustadas gerados usando grupo de dados cumulativos. IC50s calculados para cada experimento e média±sd mostrada.

[0068] A Figura 14 é uma série de gráficos mostrando curvas cumulativas de resposta à concentração para 36A3 immunodepleção de PFF e lisados cerebrais gerados de três diferentes pacientes de AMS (12-18, 01-03, 04-51). Amostras imunoesgotadas foram testadas quanto à indução de pS129 em neurônios hipocampais de rato transduzidos com 3K MOI hA53T aSyn AAV. Os valores de eixo Y representam a intensidade de pS129 normalizada a amostras não esgotadas. Os pontos de dados (média± 95% Cl) e curvas ajustadas gerados usando grupo de dados cumulativos. IC50s calculados para cada experimento e média±sd mostrada.

[0069] A Figura 15 é uma série de gráficos mostrando curvas cumulativas de resposta à concentração para imunodepleção de 15A5 de PFF e lisados cerebrais gerados de três diferentes pacientes de

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AMS (12-18, 01-03, 04-51). A amostras imunoesgotadas foram testadas quanto à indução de pS129 em neurônios hipocampais de rato transduzidos com 3K MOI hA53T aSyn AAV. Os valores de eixo Y representam a intensidade de pS129 normalizada a amostras não esgotadas. Os pontos de dados (média± 95% Cl) e curvas ajustadas gerados usando grupo de dados cumulativos. IC50s calculados para cada experimento e médiaisd mostrada.

[0070] A Figura 16 é uma série de gráficos mostrando curvas cumulativas de resposta à concentração para imunodepleção de 11H11-1 de PFF e lisados cerebrais gerados de três diferentes pacientes de AMS (12-18, 01-03, 04-51). Amostras imunoesgotadas foram testadas quanto à indução de pS129 em neurônios hipocampais de rato transduzidos com 3K MOI hA53T aSyn AAV. Os valores de eixo Y representam a intensidade de pS129 normalizada a amostras não esgotadas. Os pontos de dados (média± 95% Cl) e curvas ajustadas gerados usando grupo de dados cumulativos. IC50s calculados para cada experimento e médiaisd mostrada.

[0071] A Figura 17 é uma série de gráficos mostrando curvas cumulativas de resposta à concentração para imunodepleção de 44B11 de PFF e lisados cerebrais gerados de três diferentes pacientes de AMS (12-18, 01-03, 04-51). Os valores de eixo Y representam a intensidade de pS129 normalizada a amostras não esgotadas. A amostras imunoesgotadas foram testadas quanto à indução de pS129 em neurônios hipocampais de rato transduzidos com 3K MOI hA53T aSyn AAV. Os pontos de dados (média± 95% Cl) e curvas ajustadas gerados usando grupo de dados cumulativos. IC50s calculados para cada experimento e médiaisd mostrada.

[0072] A Figura 18 é uma série de gráficos mostrando as concentrações plasmáticas de Anticorpo 3 (um anticorpo conhecido ligar-se à aSyn), Anticorpo 1, 7A10, 11H11-1, 15A5, 21 A3, 36A3, e

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44B11 em amostras plasmáticas tiradas em concentrações mínimas nas semanas 1-3 e coleta em 24 hr pós dose na semana 4. Esquerda superior (semana 1, concentração plasmática mínima), direita superior (semana 2, concentração plasmática mínima), esquerda inferior (semana 3, concentração plasmática mínima), e direita inferior (semana 4, plasma 24 horas pós dose).

[0073] A Figura 19 é um gráfico mostrando concentrações cerebrais de 7A10, 21 A3, 11H11-1, 15A5, 36A3, 44B11, e Anticorpo 1, ipsi-lateral e contra-lateral ao sítio de injeção de PFF.

[0074] A Figura 20 é um gráfico mostrando os níveis de plasma de Anticorpo 3, Anticorpo 1, 7A10, 21 A3, 15A5, e 44B11 na semana 4 para amostras sem atividade ADA (círculos) e com (triângulos).

[0075] A Figura 21 mostra imagens imuno-histoquímicas rpresentativas demonstrando a indução de patologia de aSyn pS129 em amígdala ipsilateral de camundongos. Os camundongos foram inoculados com PBS ou A53T-PFF e em seguida dosados semanalmente durante 4 semanas com PBS ou os seguintes anticorpos a 10 mg/kg: Anticorpo 1, 7A10, 21 A3, Anticorpo 3, 15A5, 36A3, 44B11 e 11H11-1. Seções cerebrais foram manchadas por aSyn pS129. As setas destacam os exemplos de agregados de aSyn pS129 detectados na seção de controle de A53T-PFF. As imagens foram adquiridas usando uma objetiva 10X.

[0076] As Figuras 22A-22D são gráficos mostrando o número de células positivas para manchamento por pS129 no córtex motor (Figuras 22A e 22B) e amígdala (Figuras 22C e 22D) ipsilateral ao sítio de injeção de A53T-PFF estriatal. Médias de grupo e significância estatística (Figuras 22A e 22C) e dados de animal individuais (Figuras 22B e 22D) são mostrados. A análise estatística om base em ANOVA unidirecional com pós-teste de Dunnett usando grupo PFF como controle (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

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20/252 [0077] As Figuras 23A-23D são gráficos mostrando níveis de oligômero de aSyn medidos em tecido cerebral usando dois ensaios ELISA independentes. Extratos solúveis de hemisférios cerebrais contralaterais e ipsilaterais ao sítio de injeção foram analisados. Médias de grupo e significância estatística (Figuras 23A e 23C) e dados de animal individuais (Figuras 23B e 23D) são mostrados. Análise estatística com base em ANOVA unidirecional com pós-teste de Dunnett usando grupo PFF como controle **p<0,01, ***p<0,001).

[0078] As Figuras 24A-24D é uma série de gráficos mostrando níveis de aSyn pS129 (Figuras 24A e 24B) e aSyn total (Figuras 24C e 24D) foram medidos em tecido cerebral usando ELISAs. Extratos solúveis de hemisférios cerebrais contralaterais e ipsilaterais ao sítio de injeção foram analisados. Médias de grupo (Figuras 24A e 24C) e dados de animal individuais (Figuras 24B e 24D) são mostrados. Não houve nenhuma diferença estatisticamente significante entre os grupos (análise estatística com base em ANOVA unidirecional com pós-teste de Dunnett usando grupo PFF como controle).

[0079] A Figura 25 é uma série de gráficos mostrando a ligação dos anticorpos indicados a uma a uma titulação de monômero de aSyn ou PFF de aSyn. Anticorpos não ligados foram capturados em placas revestidas com PFF e medidos por ELISA unidirecional. Os dados representam a médiaisd para determinações duplicadas.

[0080] A Figura 26 é uma série de gráficos mostrando a ligação dos anticorpos indicados a uma titulação de monômero de aSyn ou PFF de aSyn. Anticorpos não ligados foram capturados em placas revestidas com PFF e medidos por ELISA unidirecional. Os dados representam a médiaisd para determinações duplicadas.

[0081] A Figura 27 é uma série de gráficos mostrando a detecção de PFF e monômero de aSyn por ELISAs 1E8.10+2E2.2 (anticorpo de captura 1E8, anticorpo de detecção 2E2) e MJFR14642+23H8.G3

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21/252 (anticorpo de captura MJFR14642, anticorpo de detecção 23H8). Curvas de resposta à concentração exemplar mostradas. Amostras de PFF e monômero foram pré-tratadas com sonicação antes de ELISA. Os níveis de sinucleína de PFF e monômero são expressos como equivalente monomérico ng/ml. Os dados representam a média±sd de determinações triplicadas. CPS = contas por seg.

[0082] A Figura 28 é uma série de gráficos mostrando a detecção de monômero de aSyn e PFF por ELISA. Curvas de resposta à concentração exemplar mostradas. O anticorpo de captura é o primeiro anticorpo listado e o anticorpo de detecção é o segundo listado. Amostras de PFF e monômero foram pré-tratadas com sonicação antes de ELISA. Os níveis de sinucleína de PFF e monômero são expressos como equivalente monomérico ng/ml. Detecção de peptídeo de aSyn pS129 foi avaliada com ELISA de MJFR1+MJFR13. Os dados representam a média±sd de determinações triplicadas. CPS = contas por seg.

[0083] A Figura 29 é uma série de gráficos mostrando a detecção de aSyn e membros da família aSyn, β-sinucleína e γ-sinucleína por ELISA. O anticorpo de captura é o primeiro anticorpo listado e o anticorpo de detecção é o segundo listado. Curvas de resposta à concentração exemplar mostradas. Os dados representam a média±sd de determinações duplicadas. CPS = contas por seg.

[0084] A Figura 30 é uma série de gráficos mostrando níveis de aSyn medidos em controle, extratos de PD, AD e PSP usando ELISA de oligômero 1 E8.10+2E2.2, ELISA de oligômero MJFR14642+23H8.G3, ELISA total de MJFR1+4B12 e ELISA de MJFR1+MJFR13 (pS129). O anticorpo de captura é o primeiro anticorpo listado e o anticorpo de detecção é o segundo listado. Os níveis são expressos como equivalente de monômero de aSyn ou equivalente de peptídeo pS129 (MJFR1+MJFR13) normalizados para

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22/252 proteína total (pg/mg de proteína). Estatísticas com base em ANOVA unidirecional com múltiplas comparações de Dunnett com relação ao grupo de controle. Observa-se que as estatísticas não foram realizadas nos resultados de ensaio de oligômero, visto que a maioria das amostras de controle foi <LLQ. *p<0,05.

[0085] A Figura 31 é uma série de gráficos mostrando níveis de aSyn medidos em extratos de AMS, DLB e DP de controle usando ELISA de oligômero 1 E8.10+2E2.2, ELISA de oligômero MJFR14642+23H8.G3, ELISA total de MJFR1+4B12 e ELISA de MJFR1+MJFR13 (pS129). O anticorpo de captura é o primeiro anticorpo listado e o anticorpo de detecção é o segundo listado. Os níveis são expressos como equivalente de monômero de aSyn ou equivalente de peptídeo pS129 (MJFR1+MJFR13) normalizados para proteína total (pg/mg de proteína). Estatísticas com base em ANOVA unidirecional com múltiplas comparações de Dunnett com relação ao grupo de controle. Observa-se que as estatísticas não foram realizadas nos resultados de ensaio de oligômero, visto que a maioria das amostras de controle foi <LLQ. **p<0,01, ***p<0,001.

[0086] A Figura 32 é uma série de gráficos mostrando níveis de aSyn medidos em extratos de AMS, DLB e DP de controle usando ELISA de MJFR1+Syn303 N-terminal e ELISA de MJFR1+4D6 Cterminal. O anticorpo de captura é o primeiro anticorpo listado e o anticorpo de detecção é o segundo listado. Os níveis são expressos como equivalente de monômero de aSyn normalizados para proteína total (pg/mg de proteína). Nenhuma diferença significante foi observada (estatísticas com base em ANOVA unidirecional com múltiplas comparações de Dunnett com relação ao grupo de controle.). [0087] A Figura 33 é uma série de gráficos mostrando a correlação de níveis de aSyn medidos em extratos de AMS, DLB e DP usando ELISA de oligômero 1E8+2E2, ELISA de oligômero

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MJFR14642+23H8, ELISA de MJFR1+4B12 total e ELISAs de MJFR1+MJFR13 (pS129). O anticorpo de captura é o primeiro anticorpo listado e o anticorpo de detecção é o segundo listado. Os níveis são expressos como equivalente de monômero de aSyn ou equivalente de peptídeo pS129 (MJFR1+MJFR13). Observe que as unidades nos ensaios de 1E8+2E2, MJFR14642+23H8, MJFR1+4B12 são expressos como ng/ml. A linha pontilhada representa a correlação de 1:1.

[0088] A Figura 34 é uma série de gráficos mostrando a correlação de níveis de aSyn medidos em extratos de AMS, DLB e DP de controle usando ELISA de MJFR1+4B12 total, ELISA de MJFR1+Syn303 N-terminal, ELISA de MJFR1+4D6 C-terminal e ELISAs de MJFR1+MJFR13 (pS129). O anticorpo de captura é o primeiro anticorpo listado, o anticorpo de detecção é o segundo listado. Os níveis são expressos como equivalente de monômero de aSyn ou equivalente de peptídeo pS129 (MJFR1+MJFR13). Observe que as unidades nos ensaios de MJFR1+4B12, MJFR1+Syn303, MJFR1+4D6 são expressas como ng/ml. A linha pontilhada representa a correlação 1:1.

[0089] A Figura 35 é uma série de gráficos mostrando a detecção e recuperação de oligômeros em péletes de velocidade elevada isoladas de extratos de AMS, DLB e DP de controle. Os níveis são medidos usando ELISA de oligômero 1E8+2E2 e ELISA de oligômero MJFR14642+23H8, e são expressos como equivalente de monômero de aSyn. O anticorpo de captura é o primeiro anticorpo listado, o anticorpo de detecção é o segundo listado. A linha pontilhada representa a correlação 1:1. % de recuperação com base nos níveis de oligômero de partida e é mostrada para o ensaio de 1E8+2E2.

[0090] A Figura 36 mostra immunoblots de frações de pélete e e sobrenadante (sup) isoladas de extratos gerados a partir das amostras

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24/252 teciduais de cérebro de indivíduo de controle (11-46) e paciente de AMS (11-46). Os extratos cerebrais foram submetidos a SEC e em seguida as frações 5-14 analisadas por SDS-PAGE/immunoblot. O padrão de monômero de aSyn (Linha A) e padrões de peso molecular foram também incluídos em cada immunblot. A maioria de aSyn nas frações de sobrenadante eluídas na fração 10, correspondendo a um raio molecular de ~60 kDa, e resolvida a um monômero e fragmento de divagem por SDS-PAGE/immunoblot. Resultados similares foram observados tanto para as amostras de controle quanto AMS. A maioria da aSyn na pélete eluída no volume vazio (fração 6), correspondendo a um raio molecular de >670 kDa, resolvido em um monômero e fragmento de divagem por SDS-PAGE/immunoblot. O anticorpo 4B12 de aSyn foi usado para o immunoblot.

[0091] A Figura 37 mostra um immunoblot de péletes de extrato cerebral isoladas de amostras teciduais de cérebro de paciente de AMS, DLB e DP de controle. Os resultados para a região de peso molecular <20 kDa são mostrados. As amostras foram analisadas usando os anticorpos 4B12, 4D6, EP1536Y de aSyn e um controle de anticorpo anti-actina.

[0092] A Figura 38 mostra um immunoblot de péletes de extrato cerebral isoladas de amostras teciduais de cérebro de paciente de AMS, DLB e DP de controle. Os resultados para uma região de peso molecular 30-40 kDa são mostrados. As amostras foram analisadas usando os anticorpos Syn303, 4B12, LB509, 81 A, 4D6 de aSyn e um controle de anticorpo de IgG.

[0093] A Figura 39 mostra um immunoblot de péletes de extrato cerebral isoladas de amostras teciduais de cérebro de paciente de AMS, DLB e DP de controle. Os resultados para uma região de peso molecular 60-100 kDa são mostrados. As amostras foram analisadas usando os anticorpos Syn303, 4B12, LB509, 4D6 de aSyn e um

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25/252 controle de anticorpo de IgG.

[0094] A Figura 40 é uma série de gráficos mostrando a indução de aSyn de pS129 em neurônios hipocampais de rato primário transduzidos (AAV-hA53T-aSyn 3K MOI). Os neurônios foram tratados com péletes de extrato cerebral de extratos cerebrais de DP, DLB e AMS de controle durante 11 dias antes da extração e fixação. O sinal de pS129 insolúvel foi medido por análise de teor elevado (HC) anormalizado para controle de tratamento com PFF (10 nM). O sinal de HC detectado com péletes de extrato de controle foi similar ao sinal de base. O nível de sinal de HC para cada pélete foi correlacionada com o sinal de oligômero como medido usando ELISA de 1E8+2E2. Os níveis são expressos como equivalente de monômero de aSyn.

[0095] A Figura 41 é uma série de gráficos mostrando os níveis de oligômero de aSyn (1E8+2E2 e MJFR14642+23H8) e aSyn total (MJFR1+4B12) de amostras de CSF humana de controles de AMS, paralisia supranuclear progressiva (PSP) e saudáveis. O anticorpo de captura é o primeiro anticorpo listado, o anticorpo de detecção é o segundo listado. CSF foi diluída 4 vezes (1E8+2E2 e MJFR14642+23H8) e 20 vezes (MJFR1+4B12) antes da análise. Dados expressos como diluição corrigida e equivalente de monômero de aSyn (pg/ml). LLQ definido como base de ensaio de 2 x e LLQ corrigido por diluição indicado para cada ensaio. Média e SD para níveis de MJFR1+4B12 são mostrados na tabela.

[0096] A Figura 42 é uma série de gráficos mostrando níveis de oligômero de aSyn (1E8+2E2 e MJFR14642+23H8) e aSyn total (MJFR1+4B12) de amostras de CSF humano de controles de AMS e saudáveis. CSF foi diluído 4 vezes (1E8+2E2 e MJFR14642+23H8) e 20 vezes (MJFR1+4B12) antes da análise. Dados expressos como diluição corrigida e equivalente de monômero de aSyn (pg/ml). LLQ definido como base de ensaio de 2 x e LLQ corrigido por diluição

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26/252 indicado para cada ensaio. A média e SD para níveis de MJFR1+4B12 são mostrados na tabela.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0097] Descritos aqui são anticorpos isolados, particularmente anticorpos monoclonais, por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, que preferencialmente se ligam à α-sinucleína oligomérica mais do que α-sinucleína monomérica. Em certas modalidades, os anticorpos descritos aqui são derivados de sequências de linhagem germinativa de cadeia pesada e leve particular e/ou compreendem características estruturais particulares tais como regiões de CDR compreendendo as sequências de aminoácido particulares. São fornecidos aqui anticorpos isolados, métodos de preparação de tais anticorpos, imunoconjugados, e moléculas biespecíficas compreendendo tais anticorpos, e composições farmacêuticas formuladas para conter os anticorpos. São também fornecidos aqui métodos de uso dos anticorpos para inibir a geração de agregados insolúveis de α-sinucleína. Consequentemente, os anticorpos de asinucleína descritos aqui podem ser usados em um tratamento em uma ampla variedade de aplicações terapêuticas, incluindo, por exemplo, o tratamento de doenças de corpo de Lewy e sinucleínaopatias, e ensaios diagnósticos.

Definições [0098] A fim de que a presente descrição possa ser mais facilmente entendida, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são estabelecidas por toda a descrição detalhada.

[0099] Os termos α-sinucleína e aSyn são usados alternadamente aqui e referem-se a um polipeptídeo de 140 aminoácidos com a seguinte sequência de aminoácidos (a-sinucleína humana do tipo selvagem):

MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKE

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GVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAAT GFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYE PEA (SEQ ID NO: 1; GenBank Acesso N^Q P37840) [00100] A proteína tem três domínios reconhecidos, um domínio de repetição de KTKE abrangendo os aminoácidos 1 a 61, um dominio de NAG (componente não amiloide) abrangendo aproximadamente os aminoácidos 60 a 95, e um dominio acidico C-terminal abrangendo aproximadamente do aminoácido 98 a 140. A menos que especificado de outro modo, α-sinucleína ou seus fragementos inclui a sequência de aminoácido do tipo selvagem humano natural acima e variantes alélicas da mesma. Por exemplo, são também abrangidas variantes associadas com doença de corpo de Lewy (por exemplo, E46K, A30P e A53T). As mutações induzidas, E83Q, A90V, A76T, que realçam a agregação de α-sinucleína, podem também estar presentes individualmente ou em combinação entre si e/ou variantes alélicas humanas, E46K, A30P e A53T.

[00101] Como usado aqui, sinucleinopatia refere-se aos distúrbios neurodegenerativos caracterizados pela presença de acúmulo anormal de agregados de α-sinucleína em neurônios e glias e incluem, por exemplo, Doença de Parkinson (PD), DP com Demência (PDD), Demência com corpos de Lewy (DLB), Atrofia de mútiplo sistema (AMS), doença de Gaucher (DG), neurodegeneração com acúmulo de ferro cerebral (NBIA), doença de Alzheimer (AD), e distúrbios de armazenagem lisossomal (LSD) incluindo síndrome Sanfilippo, síndrome de Hunter, doença Tay-Sachs e Sandhoff e Niemann-Pick tipo C. Acúmulos de agregados de α-sinucleína encontrados nos corpos celulares ou neurites de neurônios são chamados corpos de Lewy e neurites de Lewy, respectivamente, e são as marcas patológicas de DP e DLB. A presença de inclusões citoplásmicas gliais de α-sinucleína (GCIs) encontradas em oligodendrócitos e a marca

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28/252 patológica de AMS.

[00102] Atrofia de mútiplo sistema ou AMS é uma doença neurodenegerativa marcada por uma combinação de sintomas; que afetam o movimento, pressão sanguínea e outras funções corporais. Os sintomas de AMS variam em distribuição de início e gravidade de pessoa para pessoa. Por causa disto, três diferentes doenças foram inicialmente descritas por realizar esta faixa de sintomas; síndrome Shy-Drager, degeneração estriatonigral (SD), e atrofia olivopontocerebelar (OPCA).

[00103] Como usado aqui, o termo oligômero de a-sinucleína refere-se a um agregado de dois ou mais monômeros de a-sinucleína, e pode ter uma faixa de pesos moleculares. Em oligômeros gerais são entendidos ser uma espécie solúvel de agregados em comparação com fibrilas menos solúveis. Acredita-se que os oligômeros solúveis compreendam, em parte, a assim chamada espécie transmissível de α-sinucleína responsável pela propagação de célula-a-célula de patologia de α-sinucleína. A menos que especificado de outro modo, fibrilas pré-formadas ou PFF é uma espécie de oligômeros de asinucleína, por exemplo, oligômeros de α-sinucleína preparados como descrito no Exemplo 3. PFF são entendidas ser fabricadas de asinucleína monomérica humana recombinante sob condições que favorecem a agregação e fibrilização.

[00104] Como usado aqui, relação de ligação ao monômero/PFF refere-se à relação de afinidade de ligação de anticorpos anti-asinucleína para monômeros de α-sinucleína para a afinidade de ligação dos anticorpos à PFF. Relações maiores do que 1 indicam uma maior preferência quanto à ligação à PFF do que à a-sinucleína monomérica. Por exemplo, se um anticorpo ligar-se à a-sinucleína monomérica com um EC50 de 291 nM e PFF com um EC50 de 0,16 nM usando, por exemplo, a ELISA descrita no Exemplo 3, a ligação ao

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29/252 monômero/PFF daquele anticorpo será de 291/0,16 = 1819. Em algumas modalidades, ensaios diferentes de ELISA podem ser usados para gerar uma relação de ligação ao monômero/PFF. Em algumas modalidades, PFF é preparada usando o método descrito no Exemplo 3. Em algumas modalidades, oligômeros de α-sinucleína diferentes de PFF são usados para gerar uma relação de afinidade de ligação de monômero para oligômero.

[00105] O termo anticorpo como usado aqui inclui anticorpos inteiros e quaisquer fragmentos de ligação ao antígeno (isto é, porções de ligação ao antígeno) ou cadeias simples dos mesmos. Um anticorpo refere-se, em uma modalidade, a uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto, ou uma porção de ligação ao antígeno das mesmas. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como Vh) e uma região constante de cadeia pesada. Em certos anticorpos de ocorrência natural, a região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Em certos anticorpos de ocorrência natural, cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como Vl) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida de um domínio, CL. As regiões de Vh e Vl podem também ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões estruturais (FR). Cada Vh e Vl é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a

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30/252 ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do Sistema complemento clássico.

[00106] Os anticorpos tipicamente ligam-se especificamente aos seu antígeno cognate com afinidade elevada, refletida por uma constante de dissociação (Kd) de 10'⁵ a 10’¹¹ M ou menos. Qualquer Kd maior do que cerca de 10'⁴ M é geralmente considerado indicar ligação não específica. Como usado aqui, um anticorpo que especificamente se liga a um antígeno refere-se a um anticorpo que se liga ao antígeno e substancialmente antígenos idênticos com afinidade elevada, que significa tendo uma Kd de 10'⁷ M ou menos, preferivelmente 10’⁸ M ou menos, ainda mais preferivelmente 5 x 10’⁹M ou mais, e mais preferivelmente entre 10’⁸Me 10’¹⁰ M ou menos, porém não se liga com afinidade elevada aos antígenos não relacionados. Um antígeno será substancialmente idêntico a um determinado antígeno se ele exibir um grau elevado de identidade de sequência ao certo antígeno, por exemplo, se ele exibir pelo menos 80%, pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 97%, ou ainda mais preferivelmente pelo menos 99% de identidade de sequência do anígeno determinado.

[00107] Uma imunoglobulina pode ser de qualquer um dos isótipos comumente conhecidos incluindo, porém não limitada à IgA, IgA secretória, IgG e IgM. O istotipo IgG é dividido em subclasses em certas espécies: lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4 em humanos, e lgG1, lgG2a, lgG2b e lgG3 em camundongos. As imunoglobulinas, por exemplo, lgG1, existem em diversos alotipos, que diferem uns dos outros em no máximo alguns aminoácidos. Anticorpo inclui, por meio de exemplo, tanto anticorpos de ocorrência natural quanto de ocorrência não natural; anticorpos monoclonais e policlonais; anticorpos quiméricos e

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31/252 humanizados; anticorpos humanos e não humanos; anticorpos totalmente sintéticos; e anticorpos de cadeia simples.

[00108] O termo porção de ligação ao antigeno de um anticorpo, como usado aqui, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de especificamente ligar-se a um antigeno (por exemplo, α-sinucleína humana). Tais fragmentos são, por exemplo entre cerca de 8 e cerca de 1500 aminoácidos em comprimento, adequadamente entre cerca de 8 e cerca de 745 aminoácidos em comprimento, adequadamente cerca de 8 a cerca de 300, por exemplo cerca de 8 a cerca de 200 aminoácidos, ou cerca de 10 a cerca de 50 ou 100 aminoácidos em comprimento. Mostrou-se que a função de ligação ao antigeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de tamanho natural. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos no termo porção de ligação ao antigeno de um anticorpo incluem (i) um fragmento de Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios de Vl, Vh, CL e CH1; (ii) um fragmento de F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos de Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região dobradiça; (iii) um fragmento de Fd que consiste nos domínios de Vh e CH1; (iv) um fragmento de Fv que consiste nos domínios de Vl e Vh de uma ramificação simples de um anticorpo, (v) um fragmento de dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste em um domínio de Vh; e (vi) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR) ou (vii) uma combinação de duas ou mais CDRs isoladas que podem opcionalmente ser ligadas por um ligante sintético. Além disso, embora os dois domínios do fragmento de Fv, Vl e Vh, sejam codificados por genes separados, eles podem ser liados usando métodos recombinantes por um ligante sintético que permite que eles sejam feitos como uma cadeia de proteína simples, em que as regiões de Vl e Vh se unem para formar moléculas

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32/252 monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); see por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples são também destinados a ser abrangidos no termo porção de ligação ao antígeno de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica, e os fragmentos são analisados quanto à utilidade da mesma maneira que são os anticorpos intactos. As porções de ligação ao antígenos podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante, ou por divagem enzimática ou química de imunoglobulinas intactas.

[00109] Um anticorpo biespecífico ou bifuncional é um anticorpo híbrido artificial tendo dois diferentes pares de cadeia pesada/leve e dos diferentes sítios de ligação. Anticorpos biespecífico podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos de Fab'. Veja, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

[00110] O termo anticorpo monoclonal, como usado aqui, referese a um anticorpo que exibe uma única especificidade e afinidade de ligação para um epítopo particular ou uma composição de anticorpos, em que todos os anticorpos exibem uma única especificidade e afinidade de ligação para um epítopo particular. Consequentemente, o termo anticorpo monoclonal humano refere-se a um anticorpo ou composição de anticorpo que exibe(m) uma especificidade de ligação e que tem regiões constantes variáveis e opcionais derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em uma modalidade, anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B de um animal não humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um

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33/252 genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia fundidos a uma célula imortalizada.

[00111] O termo anticorpo recombinante humano, como usado aqui, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por métodos recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobulina humana ou um hibridona preparado a partir dos mesmos, (b) anticorpos isolados de ma célula hospedeira transformada para expresser o anticorpo, por exemplo, de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humano recombinante, combinatório e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro método que envolve a ligação de sequências de gene de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos recombinantes humanos compreendem regiões variáveis e constantes que utilizam sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana particulares são codificadas pelos genes de lihagem germinativa, porém incluem rearranjos e mutações subsequentes que ocorrem, por exemplo, durante a maturação de anticorpo. Como conhecido na técnica (veja, por exemplo, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125), a região variável contém o domínio de ligação ao antígeno, que é codificado por vários genes que se rearranjam para formar um anticorpo específico para um antígeno estranho. Além do rearranjo, a região variável pode ser também modificada por múltiplas mudanças de aminoácido simples (referidas como mutação somática ou hipermutação) para aumentar a afinidade do anticorpo ao antígeno estranho. A região constant mudará também em resposta a um antígeno (isto é, mudança de isótipo). Portanto, as moléculas de ácido nucleico rearranjadas e somaticamente mutadas que codificam os

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34/252 polipeptídeos de imunoglobulina de cadeia pesada e leve em resposta a um antígeno podem não ter identidade de sequência com as moléculas de ácido nucleico originais, porém ao invés disto serão substancialmente idênticas ou similares (isto é, têm pelo menos 80% de identidade).

[00112] Um anticorpo humano (HuMAb) refere-se a um anticorpo tendo regiões variáveis, em que tanto as regiões de CDR e estruturais são derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Além disso, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante também será derivada de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Os anticorpos descritos aqui podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese randômica ou específica de sítio in vitro ou por mutação somática in vivo). Entretanto, o termo anticorpo humano, como usado aqui, não se destina a incluir anticorpos em que as sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outra espécie mamífera, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências estruturais humanas. Os termos anticorpos humanos e anticorpos totalmente humanos e são usados sinonimamente.

[00113] Um anticorpo humanizado refere-se a um anticorpo, em que alguns, a maioria ou todos os aminoácidos fora dos domínios de CDR de um anticorpo não humano são substituídos com aminoácidos correspondentes derivados de imunoglobulinas humanas. Em uma modalidade de uma forma humanizada de um anticorpo, alguns, a maioria ou todos os aminoácidos fora os domínios de CDR foram substituídos com aminoácidos de imunoglobulinas humanas, enquanto alguns, a maioria ou todos os aminoácidos dentro de uma ou mais regiões de CDR são não mudados. Pequenas adições, deleções,

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35/252 inserções, substituições ou modificações são permissíveis, contanto que elas não anulem a capacidade do anticorpo de ligar-se a um antigeno particular. Um anticorpo humanizado retém uma especificidade antigênica similar àquela do anticorpo original.

[00114] Um anticorpo quimérico refere-se a um anticorpo, em que as regiões variáveis são derivada de uma espécie e a região constantes são derivadas de outra espécie, tal como um anticorpo em que as regiões variáveis são derivadas de um anticorpo de camundongo e a regiões constantes são derivadas de um anticorpo humano.

[00115] Como usado aqui, isótipo refere-se à classe de anticorpo (por exemplo, anticorpo de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1, lgA2, IgD, e IgE) que é codificada pelos genes de região constante de cadeia pesada.

[00116] Alotipo refere-se às variantes de ocorrência natural dentro de um grupo isótipo específico, cujas variantes diferem em alguns aminoácidos (veja, por exemplo, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1). Anticorpos descritos aqui podem ser de qualquer alotipo. Como usado aqui, anticorpos referidos como isótipo lgG1f ou lgG1.3f são anticorpos de lgG1 e lgG1.3 não efetores, respectivamente, do alotipo f, isto é, tendo L234A, L235E, e G237A de acordo com o índice EU como em Kabat, como mostrado, por exemplo, na SEQ ID NO: 119.

[00117] As frases um anticorpo que reconhece um antigeno e um anticorpo específico para um antigeno são usadas alternadamente aqui com o termo um anticorpo que especificamente se liga a um antigeno.

[00118] Um anticorpo isolado como usado aqui, destina-se a se referir a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que especificamente se liga à α-sinucleína é

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36/252 substancialmente livre de anticorpos que especificamente ligam antígenos diferentes de α-sinucleína). Um anticorpo isolado que especificamente se liga a um epitopo de α-sinucleína pode, entretanto, ter reatividade cruzada a outras proteínas de α-sinucleína de diferentes espécies (por exemplo, α-sinucleína de camundongo ou rato).

[00119] Uma função efetora refere-se à interação de uma região de anticorpos de Fc com um receptor ou ligante de Fc, ou um evento bioquímico que resulta a partir desta. Funções efetoras exemplares incluem ligação Clq, citotoxicidade dependente do complemento (CDC), ligação do receptor de Fc, funções efetoras mediadas por FcyR como ADCC e fagocitose mediada por célula dependente de anticorpos (ADCP), e sub-regulação de um receptor de superfície celular (por exemplo, o receptor de célula B; BCR). Tais funções efetoras geralmente requerem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpos).

[00120] Um receptor de Fc ou FcR é um receptor que se liga à região Fc de uma imunoglobulina. FcRs que se ligam a um anticorpo de IgG compreendem receptores da família FcyR, incluindo variantes alélicos e formas alternativamente ligadas destes receptores. A família FcyR consiste em três receptors de ativação (FcyRI, FcyRIII, e FcyRIV em camundongos; FcyRIA, FcyRIIA, e FcyRIIIA em humanos) e um inibitório (FcyRIIB). A maioria dos tipos de célula efetora inata coexpressa um ou mais FcyR de ativação e o FcyRIIB inibitório, enquanto as células exterminadoras naturais (NK) seletivamente expressam um receptor de Fc de ativação (FcyRIII em camundongos e FcyRIIIA em humanos), porém não o FcyRIIB inibitório em camundongos e humanos. IgGl humana liga-se à maioria dos receptores de Fc e é considerada equivalente à lgG2a de murino com

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37/252 respeito aos tipos de receptorss de Fc de ativação aos quais se ligam. [00121] Uma região Fc (região do fragmento cristalizável) ou domínio de Fc ou Fc refere-se à região C-terminal da cadeia pesada de um anticorpo que media a ligação da imunoglobulina aos fatores ou tecidos hospedeiros, incluindo ligação aos receptores de Fc localizada em várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) ou ao primeiro componente (C1q) do sistema complemento clássico. Desse modo, uma região Fc compreende a região constante de um anticorpo excluindo o primeiro domínio de imunoglobulina de região constante (por exemplo, CH1 ou CL). Em isótipos de anticorpo de IgG, IgA e IgD, a região Fc compreende dois fragmentos de proteína idênticos, derivados do segundo (Chz) e terceiro (Chs) domínios constantes das duas cadeias pesadas do anticorpo; regiões Fc de IgM e IgE compreendem três domínios constantes de cadeia pesada (domínios Ch 2-4) em cada cadeia de polipeptídeo. Para IgG, a região Fc compreende domínios de imunoglobulina Ογ2 e Cy3 e a dobradiça entre Cy1 e Ογ2. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida esticar-se de um resíduo de aminoácido na posição C226 ou P230 (ou aminoácido entre estes dois aminoácidos) ao terminal carbóxi da cadeia pesada, em que a numeração é de acordo com o índice EU como em Kabat. O domínio de Ch2 de uma região Fc de IgG humana se estende de cerca do aminoácido 231 a cerca do aminoácido 340, enquanto o domínio Ch3 é posicionado no lado do terminal C de um domínio Ch2 em uma região Fc, isto é, ele se estende de cerca de aminoácido 341 a cerca de aminoácido 447 de uma IgG. Como usado aqui, a região Fc pode ser um Fc de sequência nativa, incluindo qualquer variante alotípica, ou um Fc variante (por exemplo, um Fc de ocorrência não natural). Fc pode também referir-se à região em isolamento ou no contexto de um

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38/252 polipeptídeo proteico compreendendo de Fc tal como uma proteína de ligação compreendendo uma região Fc, também referida como uma proteína de fusão de Fc (por exemplo, um anticorpo ou imunoadesina).

[00122] O termo epitopo ou determinante antigênico refere-se a um sítio em um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo especificamente se liga. Epitopos podem ser formados tanto de aminoácidos contíguos (geralmente um epitopo linear) ou aminoácidos não contíguos juxtapostos por dobradura terciária de uma proteína (geralmente, um epitopo conformacional). Epitopos formados de aminoácidos contíguos são tipicamente, porém nem sempre, retidos na exposição a solventes de desnaturação, enquanto epitopos formados por dobradura terciária são tipicamente perdidos no tratamento com solventes de desnaturação. Um epitopo tipicamente inclui pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos em uma conformação espacial exclusiva. Métodos para determinação de quais epitopos são ligados por um determinado anticorpo (isto é, mapeamento de epitopo) são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ensaios de immunoblotting e imunoprecipitação, em que os peptídeos sobrepostos ou contíguos são testados quanto à reatividade com um determinado anticorpo. Métodos de determinação de conformação espacial de epitopos incluem técnicas na técnica e aqueles descritos aqui, por exemplo, cristalografia de raio x, ressonância magnética nuclear bidimensional e HDX-MS (veja, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).

[00123] O termo mapeamento de epitopo refere-se ao processo de identificação dos determinantes moleculares para reconhecimento de anticorpo-antigeno.

[00124] O termo ligam-se ao mesmo epitopo com referência a

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39/252 dois ou mais anticorpos significa que os anticorpos se ligam ao mesmo segmento de resíduos de aminoácido, como determinado por um determinado método. Técnicas para determinar se os anticorpos se ligam ao mesmo epítopo na α-sinucleína com os anticorpos descritos aqui incluem, por exemplo, métodos de mapeamento de epítopo, tais como, análises de raio x de cristais de complexos de antigeno: anticorpo que fornecem resolução atômica do epítopo e espectrometria de massa de permuta de deutério/hidrogênio (HDX-MS). Outros métodos monitoram a ligação do anticorpo aos fragmentos de antigeno ou variações mutadas do antigeno, onde a perda de ligação devido a uma modificação de um resíduo de aminoácido dentro da sequência de antigeno é frequentemente considerada uma indicação de um componente de epítopo. Além disso, métodos combinatoriais computacionais para mapeamento de epítopo podem também ser usados. Estes métodos dependem da capacidade do anticorpo de interesse para afinidade isolar os peptídeos curtos específicos de bibliotecas de peptídeo de exibição de fago combinatórias. Anticorpos tendo a mesma VH e VL ou as mesmas sequências de CDR1, 2 e 3 são esperados ligar-se ao mesmo epítopo.

[00125] Anticorpos que competem com outro anticorpo quanto à ligação a um alvo referem-se aos anticorpos que inibem (parcial ou completamente) a ligação do outro anticorpo ao alvo. Se dois anticorpos competem entre si quanto à ligação a um alvo, isto é, se e a que ponto um anticorpo inibe a ligação do outro anticorpo a um alvo, pode ser determinado usando experimentos de competição conhecidos. Em certas modalidades, um anticorpo compete com, e inibe a ligação de outro anticorpo a um alvo em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%. Ensaios de competição podem ser conduzidos como descrito, por exemplo, em Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006;

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40/252 doi:10.1101/pdb.prot4277 ou no Capítulo 11 de Using Antibodies por Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999. Anticorpos de competição ligam-se ao mesmo epítopo, um epítopo de sobreposição, ou a epitopos adjacentes (por exemplo, como evidenciado por impedimento estérico). [00126] Outros ensaios de ligação competitiva incluem: radioimunoensaio (RIA) direto ou indireto de fase sólida, imunoensaio enzimático (EIA) direto ou indireto de fase sólida, ensaio de competição em sanduíche (veja, Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (veja, Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); ensaio rotulado direto de fase sólida, ensaio sanduíche rotulado direto de fase sólida (veja, Harlow and Lane, Anticorpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de rótulo direto de fase sólida usando rótulo 1-125 (veja, Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); EIA de biotinaavidina direto de fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); e RIA rotulado direto. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)).

[00127] Como usado aqui, os termos ligação específica, ligação seletiva, liga-se seletivamente, e liga-se especificamente, referemse à ligação de anticorpo a um epítopo em um antígeno predeterminado. Tipicamente, o anticorpo (i) liga-se com uma constante de dissociação em equilíbrio (Kd) de aproximadamente menos do que 10'⁷ M, tal como aproximadamente menos do que 10 ⁸Μ, 10’⁹ M ou 10’¹⁰ M ou ainda menos quando determinada, por exemplo, por tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR) em um instrumento BIACORE 2000 usando o antígeno predeterminado como o analito e o anticorpo como o ligante, ou análise Scatchard de ligação do anticorpo às células positivas de antígeno, e (ii) liga-se ao antígeno predeterminado com uma afinidade

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41/252 que é pelo menos duas vezes maior do que sua afinidade para ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) diferente do antígeno predeterminado ou um antígeno intimamente relacionado. [00128] O termo k_assoc ou k_a, como usado aqui, destina-se a se referir à taxa de associação de uma interação particular de anticorpoantígeno, enquanto o termo kdis ou kd, como usado aqui, destina-se a se referir à taxa de dissociação de uma uma interação particular de anticorpo-antígeno. O termo Kd, como usado aqui, destina-se a se referir à constante de dissociação, que é obtida da relação de kd a k_a(isto é, kd/ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Os valores Kd para os anticorpos podem ser determinados usando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método preferido para a determinação da Kd de um anticorpo é o uso de ressonância plasmônica de superfície, preferivelmente usando um sistema de biossensor tal como um sistema Biacore® ou citometria de fluxo e análise Scatchard.

[00129] O termo EC50 no contexto de um ensaio in vitro ou in vivo usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, refere-se à concentração de um anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo que induz uma resposta que é 50% da resposta máxima, isto é, meio caminho entre a resposta máxima e a linha de base.

[00130] Um polipeptídeo refere-se a uma cadeia compreendendo pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivamente ligados, sem nenhum limite superior no comprimento da cadeia. Um ou mais resíduos de aminoácido na proteína podem conter uma modificação tal como, porém não limitada à, glicosilação, fosforilação ou formação de ligação de dissulfeto. Uma proteína pode compreender um ou mais polipeptídeos.

[00131] O termo molécula de ácido nucleico, como usado aqui,

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42/252 destina-se incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de fita única ou de fita dupla e pode ser cDNA.

[00132] São também fornecidas modificações de sequência conservativas das sequências mencionadas aqui, isto é, modificações de de sequência de nucleotídeo e aminoácido que não anulam a ligação do anticorpo codificado pela sequência de nucleotídeo ou contendo a sequência de aminoácido ao antígeno. Tais modificações conservadoras de sequência incluem substituições conservadoras de nucleotídeos e aminoácidos, bem como adições e deleções de nucleotídeos e aminoácidos. As substituições conservadoras de aminoácidos incluem aquelas em que o resíduo de aminoácidos é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Desse modo, um resíduo de aminoácido não essencial previsto em um anticorpo anti-a-sinucleína é preferivelmente substituído com outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Métodos de identificação de substituições de nucleotídeo e aminoácido que não eliminam a ligação ao antígeno são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng.

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12(10):879-884 (1999); e Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)).

[00133] Para ácidos nucleicos, o termo homologia substancial indica que dois ácidos nucleicos, ou sequências designadas dos mesmos, quando idealmente alinhados e comparados, são idênticos, com inserções ou deleções de nucleotídeos apropriados, em pelo menos cerca de 80% dos nucleotídeos, geralmente pelo menos cerca de 90% a 95%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% a 99,5% dos nucleotídeos. Alternativamente, a homologia substancial existe quando os segmentos se hibridizarão sob condições de hibridização seletiva, ao complemento da fita.

[00134] Para polipeptídeos, o termo homologia substancial indica que dois polipeptídeos, ou sequências designadas dos mesmos, quando idealmente alinhados e comparados, são idênticos, com inserções ou deleções de aminoácido apropriadas, em pelo menos cerca de 80% dos aminoácidos, geralmente pelo menos cerca de 90% a 95%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% a 99,5% dos aminoácidos.

[00135] A porcentagem de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % de homologia = # de posições idênticas/total # de posições x 100), levando em consideração o número de intervalos, e o comprimento de cada intervalo, que necessita ser introduzido para o alinhamento ideal de duas sequências. A comparação de sequências e determinação de porcentual de identidade entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático, como descrito nos exemplos não limitantes.

[00136] A porcentagem de identidade entre as duas sequências de nucleotídeo pode ser determinado usando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando uma

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44/252 matriz NWSgapdna.CMP e um peso de intervalo de 40, 50, 60, 70, ou 80 e um peso de comprimento de 1,2, 3, 4, 5, ou 6. A porcentagem de identidade entre duas sequências de nucleotídeo ou aminoácido pode também ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de 4. Além disso, a porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando o algoritmo Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1,2, 3, 4, 5, ou 6.

[00137] As sequências de ácido nucleico e proteína descritas aqui podem também ser usadas como uma sequência quer/ para realizar uma pesquisa em bases de dados públicas para, por exemplo, identicar as sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Pesquisas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, escore = 100, wordlength = 12 para obter as sequências de nucleotídeo homólogas às moléculas de ácido nucleico descritas aqui. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, escore = 50, wordlength = 3 para obter as sequências de aminoácido homólogas às moléculas de proteína descritas aqui. Para obter alinhamentos intervalados para os propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Fies. 25(17):33893402. Quando utilizando os programas BLAST e Gapped BLAST, os

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45/252 parâmetros básicos dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Veja, www.ncbi.nlm.nih.gov· [00138] Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisado celular, ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é isolado ou tornado substancialmente puro quando purificado longe de outros components celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares (por exemplo, as outras partes do cromossomo) ou proteínas, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandagem de CsCI, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de agarose e outras bem conhecidas na técnica. Veja, F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nova Iorque (1987).

[00139] Ácidos nucleicos, por exemplo, cDNA, podem ser mutados, de acordo com as técnicas padrão para fornecer sequências de gene. Para sequências de codificação, estas mutações podem afetar a sequência de aminoácido como desejado. Em particular, sequências de DNA substancialmente homólogas a ou derivadas de constante V, D, J, desvios e outras tais sequências descritas aqui são contempladas (onde derivada indica que uma sequência é idêntica ou modificada de outra sequência).

[00140] O termo vetor, como usado aqui, destina-se a se referir a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ela foi ligada. Um tipo de vetor é um plasmídeo, que se refere a uma alça circular de DNA de fita dupla na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual

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46/252 são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos e epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissômicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira na introdução na célula hospedeira, e sendo assim replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão dos genes aos quais estão operativamente ligados. Tais vetores são aqui referidos como vetores de expressão recombinante (ou simplesmente, vetores de expressão) Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. Na presente especificação, plasmídeo e vetor podem ser usados indistintamente, visto que o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. No entanto, também estão incluídas outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovirus defeituosos de replicação, adenovirus e vírus adeno-associados), que servem funções equivalentes.

[00141] O termo célula hospedeira recombinante (ou simplesmente célula hospedeira), como usado aqui, destina-se a se referir a uma célula que compreende um ácido nucleico que não está naturalmente presente na célula, e talvez uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve-se entender que tais termos são destinados a se referirem não apenas à célula objeto em particular, porém à progênie de tal célula. Porque certas modificações podem ocorrer em gerações sucessoras devido à mutação ou influências ambientais, tal progênie não pode, de fato, ser idêntica à célula mãe, mas ainda está incluída no escopo do termo célula hospedeira como usado aqui.

[00142] Como usado aqui, o termo antígeno refere-se a qualquer substância imunogênica natural ou sintética, tal como uma proteína,

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47/252 peptídeo, ou hapteno. Um antígeno pode ser α-sinucleína ou um fragmento da mesma.

[00143] Como usado aqui, o termo ligado refere-se à associação de duas ou mais moléculas. A ligação pode ser covalente ou não covalente. A ligação também pode ser genética (isto é, recombinantemente fundido). Tais ligações podem ser obtidos usando uma ampla variedade de técnicas reconhecidas na técnica, tais como conjugação química e produção de proteína recombinante.

[00144] Como usado aqui, administrando refere-se à introdução física de uma composição compreendendo um agente terapêutico a um indivíduo, usando qualquer um dos vários métodos e sistemas de liberação conhecidos por aqueles versados na técnica. Rotinas preferidas de administração para os anticorpos descritos aqui incluem intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, espinhal ou outras rotinas parenterais de administração, por exemplo, por injeção ou infusão. A frase administração parenteral como usado aqui significa os modos de administração diferentes de administração entérica e tópica, geralmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intraesternal, bem como eletroporação in vivo. Alternativamente, um anticorpo descrito aqui pode ser administrado por meio de uma rotina não parenteral, tal como uma rotina tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, retalmente, sublingualmente ou topicamente. A administração pode também ser realizada, por exemplo, uma vez, uma pluralidade de vezes, e/ou durante um ou mais períodos prolongados.

[00145] Os termos tratar, tratamentando, e tratamento, como

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48/252 usado aqui, refere-se a qualquer tipo de intervenção ou processo realizado em, ou a administração de um agente ativo, ao indivíduo com o objetivo de reverter, aliviar, melhorar, inibir ou diminuir ou impeder a progressão, desenvolvimento, gravidade ou recorrência de um sintoma, complicação, condição ou indícios bioquímicos associados com uma doença. O tratamento pode ser de um indivíduo tendo uma doença ou um indivíduo que não tem uma doença (por exemplo, para profilaxia).

[00146] O termo dose eficaz ou dosagem efiaz é definido como uma quantidade suficiente para obter ou pelo menos parcialmente obter um efeito desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz ou dosagem terapeuticamente eficaz de um fármaco ou agente terapêutico é qualquer quantidade do fármaco que, quando usado sozinho ou em combinação com outro agente terapêutico, promove a regressão de doença evidenciada por um decréscimo na gravidade dos sintomas da doença, um aumento na frequência e duração de períodos livres de sintoma de doença, ou uma prevenção de comprometimento ou incapacidade devido à aflição de doença. Uma dosagem ou quantidade terapeuticamente eficaz de um fármaco inclui uma quantidade profilaticamente eficaz ou uma dosagem profilaticamente eficaz, que é qualquer quantidade do fármaco que, quando administrado sozinho ou em combinação com outro agente terapêutico a um indivíduo em risco de desenvolver uma doença ou de sofrer uma recorrência de doença, inibe o desenvolvimento ou recorrência da doença. A capacidade de um agente terapêutico de promover a regressão de doença ou inibir o desenvolvimento ou recorrência da doença pode ser avaliada usando uma variedade de métodos conhecidos pelo técnico versado, tal como em indivíduos humanos durante testes clínicos, em sistemas de modelo de animal preditivos de eficácia em humanos, ou avaliando a atividade do agente

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49/252 em ensaios in vitro.

[00147] Como usado aqui, o termo indivíduo inclui qualquer animal humano ou não humano. Por exemplo, os métodos e composições descritos aqui podem ser usados para tratar um indivíduo tendo uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou α-sinucleína agregada no cérebro.

[00148] O termo paciente inclui indivíduos humanos e outros mamíferos que recebem tratamento profilático ou terapêutico.

[00149] Um indivíduo estará em risco de uma doença se o indivíduo tiver pelo menos um fator de risco conhecido (por exemplo, genético, bioquímico, histórico familiar, exposição situacional) colocando os indivíduos com tal fator de risco em um risco significante estatisticamente maior de desenvolvimento da doença do quo s indivíduos sem o fator de risco.

[00150] O termo sintoma refere-se a uma evidência subjetiva de uma doença, tal como marcha alterada, como percebida pelo paciente. Um sinal refere-se à evidência objetiva de uma doença, conforme observado por um médico.

[00151] Significância estatística significa p<0,05.

[00152] O termo amostra refere-se um tecido, fluido corporal, ou uma célula (ou uma fração de qualquer um dos anteriores) tirado de um paciente ou um indivíduo. Normalmente, o tecido ou célula será removido do paciente, porém diagnóstico in vivo é também contemplado.

[00153] Como usado aqui, o termo cerca de significa mais ou menos 10% de um valor especificado.

[00154] Como usado aqui, o termo e/ou inclui quaisquer e todas as cobinações de um ou mais dos itens associados listados.

[00155] Como usado na descrição da invenção e nas reivindicações anexas, as formas singulares um, uma (a), um, uma (an) e a, o

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50/252 destinam-se a incluir também as formas plurais, a menos que o contexto claramente indique de outro modo.

[00156] Vários aspectos da invenção são descritos em maiores detalhes nas seguintes subseções.

I. Anticorpos Anti-a-sinucleína (aSyn) [00157] São descritos aqui anticorpos, por exemplo, anticorpos isolados, por exemplo, anticorpos totalmente humanos isolados, que são caracterizados por características ou propriedades funcionais particulares. Por exemplo, os anticorpos especificamente se liga à asinucleína humana, isto é, tanto α-sinucleína monomérica humana quanto α-sinucleína oligomérico humano. Adicionalmente, anticorpos podem reagir cruzados com α-sinucleína de uma ou mais espécies não humanas, tais como α-sinucleína de camundongo ou rato, ou diferentes isoformas de sinucleína, tais como β-sinucleína e ysinucleína.

[00158] Consequentemente, os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui exibem uma ou mais das seguintes propriedades funcionais:

[00159] (a) ligam-se à α-sinucleína de camundongo e rato;

[00160] (b) ligam-se ao β-sinucleína e y-sinucleína;

[00161] (c) têm uma maior afinidade quanto aos oligômeros de asinucleína (por exemplo, PFF) do que os monômeros de a-sinucleína;

[00162] (d) inibem a geração de agregados de α-sinucleína solúveis ou insolúveis (por exemplo, agregados de α-sinucleína fosforilados em serina-129) induzidos por oligômero de α-sinucleína (por exemplo, PFF);

[00163] (e) esgotam a espécie molecular que produz agregados de α-sinucleína solúveis ou insolúveis (por exemplo, agregados de asinucleína fosforilados em serina-129) de PFF e/ou lisado cerebral preparado de pacientes com agregados patológicos de α-sinucleína no

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51/252 cérebro;

[00164] (f) ligam-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 123-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1);

[00165] (g) ligam-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 125-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1);

[00166] (h) ligam-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 130-139 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1);

[00167] (i) ligam-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 119-126 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1); e [00168] (j) ligam-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 130-138 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1).

[00169] Em algumas modalidades, o oligômero de α-sinucleína é PFF. Em algumas modalidades, PFF é preparada usando o método descrito no Exemplo 3. Em algumas modalidades, o oligômero de asinucleína é solúvel. Em outras modalidades, o oligômero de asinucleína é insolúvel. Em algumas modalidades, os anticorpos inibem a geração de agregados insolúveis ou solúveis de a-sinucleína fosforilados em serina-129. Em outras modalidades, os anticorpos inibem a geração de agregados de α-sinucleína insolúveis ou solúveis que não contêm α-sinucleína fosforilada em serina 129.

[00170] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui preferencialmente se ligam aos oligômeros de asinucleína (por exemplo, PFF) mais do que os monômeros de asinucleína, que podem ser apresentados como uma relação de afinidade de ligação para monômeros de α-sinucleína para a afinidade de ligação para oligômeros de α-sinucleína (por exemplo, PFF), também referida aqui como relação de ligação de monômero de asinucleína/oligômero de α-sinucleína. Quando PFF é a espécie de oligômero de α-sinucleína, a relação é referida como uma relação de ligação de monômero/PFF de α-sinucleína, ou relação M/P, e pode

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52/252 ser determinada como descrito no Exemplo 3.

[00171] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui têm uma relação M/P de 10 ou maior, 20 ou maior, 30 ou maior, 40 ou maior, 50 ou maior, 75 ou maior 100 ou maior, 150 ou maior 200 ou maior, 250 ou maior, 300 ou maior, 350 ou maior, 400 ou maior, 450 ou maior, 500 ou maior, 600 ou maior, 700 ou maior, 800 ou maior, 900 ou maior, 1000 ou maior, 1500 ou maior, 2000 ou maior, 2500 ou maior, 3000 ou maior, 3500 ou maior, 4000 ou maior, 5000 ou maior, 6000 ou maior, 7000 ou maior, 8000 ou maior, 9000 ou maior, 10000 ou maior, 10 a 10000, 50 a 10000, 100 a 10000, 500 a 10000, 700 a 10000, 1500 a 10000, 3000 a 10000, 5000 a 10000, 7000 a 10000, 100 a 7000, 500 a 7000, 700 a 7000, 1500 a 7000, 3000 a 7000, 5000 a 7000, 100 a 5000, 500 a 5000, 700 a 5000, 700 a 1500, 700 a 3000, 700 a 5000, 100 a 3000, 500 a 3000, 700 a 3000, 1500 a 3000, 100 a 1500, 500 a 1500, 700 a 1500, 100 a 700, 500 a 700, ou 100 a 500. Em algumas modalidades, as afinidades de ligação dos anticorpos para α-sinucleína oligomérica e monoméricas são determinadas usando ELISA, por exemplo, como descrito no Exemplo 3, para calcular a relação M/P.

[00172] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína ligam-se à α-sinucleína monomérica com um EC50 de 100 nM ou maior, e ligam-se à PFF com um EC50 de 2 nM ou menor. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína ligam-se à a-sinucleína monomérica com um EC50 de 500 nM ou maior, e ligam-se à PFF com um EC50 de 1 nM ou menor. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína ligam-se à α-sinucleína monomérica com um EC50 de 500 nM ou maior, e ligam-se à PFF com um EC50 de 0,5 nM ou menor. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína ligam-se à α-sinucleína monomérica com um EC50 de 500 nM ou maior, e ligamse à PFF com um EC50 de 0,3 nM ou menor. Em algumas modalidades,

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53/252 os anticorpos anti-a-sinucleína ligam-se à α-sinucleína monomérica com um EC50 de 500 nM ou maior, e ligam-se à PFF com um EC50 de 0,2 nM ou menor. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-asinucleína ligam-se à α-sinucleína monomérica com um EC50 de 700 nM ou maior, e ligam-se à PFF com um EC50 de 1 nM ou menor. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína ligam-se à asinucleína monomérica com um EC50 de 700 nM ou maior, e ligam-se à PFF com um EC50 de 0,5 nM ou menor. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína ligam-se à α-sinucleína monomérica com um EC50 de 700 nM ou maior, e ligam-se à PFF com um EC50 de 0,3 nM ou menor. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-asinucleína ligam-se à α-sinucleína monomérica com um EC50 de 700 nM ou maior, e ligam-se à PFF com um EC50 de 0.2 nM ou menor. Em algumas modalidades, os valores EC50 para α-sinucleína monomérica e oligomérica são determinados usando ELISA, por exemplo, como descrito no Exemplo 3.

[00173] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui se ligam à α-sinucleína oligomérica, por exemplo, PFF (por exemplo, PFF preparada como descrito no Exemplo 3), com um EC50 de 50 nM ou menor, 40 nM ou menor, 30 nM ou menor, 20 nM ou menor, 10 nM ou menor, 5 nM ou menor, 4 nM ou menor, 3 nM ou menor, 2 nM ou menor, 1 nM ou menor, 0,9 nM ou menor, 0,8 nM ou menor, 0,7 nM ou menor, 0,6 nM ou menor, 0,5 nM ou menor, 0,4 nM ou menor, 0,3 nM ou menor, 0,2 nM ou menor, 0,1 nM ou menor, 0,07 nM ou menor, 0,05 nM ou menor, 0,03 nM ou menor, ou 0,01 ou menor, como determinado por ELISA, por exemplo, como descrito no Exemplo 3.

[00174] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui podem inibir a geração de agregados insolúveis de asinucleína induzidos por PFF (por exemplo, agregados de a-sinucleína

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54/252 fosforilados em senna-129). Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos inibem a fosforilação de serina-129 de induzida por α-sinucleína com um IC50 de 0,2 nM ou menor, 0,15 nM ou menor, 0,1 nM ou menor, 0,09 nM ou menor, 0,08 nM ou menor, 0,07 nM ou menor, 0,06 nM ou menor, 0,05 nM ou menor, 0,04 nM ou menor, 0,03 nM ou menor, 0,02 nM ou menor, 0,01 nM ou menor, ou 0,005 nM ou menor, como avaliado usando, por exemplo, 0 ensaio de imunofluorescência de alto teor descrito no Exemplo 10.

[00175] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui podem depauperar a fosforilação de α-sinucleína em serina-129 induzindo a atividade de PFF e/ou lisado cerebral preparado de pacientes com corpos de Lewy ou agregação de asinucleína no cérebro.

[00176] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui podem ligar-se a um epítopo na região C-terminal de asinucleína. Por exemplo, os anticorpos anti-a-sinucleína podem ligarse a toda ou uma porção de aminoácidos 123-128 de a-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1), como determinado, por exemplo, por ligação dos anticorpos aos peptídeos sobrepostos de α-sinucleína humana (veja 0 Exemplo 2). Em outra modalidade, os anticorpos anti-asinucleína podem ligar-se a toda ou uma porção de aminoácidos 125128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1), como determinado, por exemplo, por ligação dos anticorpos aos peptídeos sobrepostos de asinucleína humana (veja 0 Exemplo 2). Em outra modalidade, os anticorpos anti-a-sinucleína podem ligar-se a toda ou uma porção de aminoácidos 130-139 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1), como determinado, por exemplo, por ligação dos anticorpos aos peptídeos sobrepostos de α-sinucleína humana (veja 0 Exemplo 2). Em outra modalidade, os anticorpos anti-a-sinucleína podem ligar-se a toda ou uma porção de aminoácidos 119-126 de α-sinucleína humana (SEQ ID

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NO: 1), como determinado, por exemplo, por ligação dos anticorpos aos peptídeos sobrepostos de α-sinucleína humana (veja o Exemplo 2). Em outra modalidade, os anticorpos anti-a-sinucleína podem ligar-se a toda ou uma porção de aminoácidos 130-138 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1), como determinado, por exemplo, por ligação dos anticorpos aos peptídeos sobrepostos de α-sinucleína humana (veja o Exemplo 2).

[00177] Um anticorpo que exibe uma ou mais das propriedades funcionais descritas acima (por exemplo, atividades bioquímicas, imunoquímicas, celulars, fisiológicas, biológicas ou outras, ou similares) como determinado de acordo com as metodologias conhecidas na técnica e descritas aqui, será entendido relacionar-se a uma diferença estatisticamente significante na atividade particular com relação àquela observada na ausência do anticorpo (por exemplo, ou quando um anticorpo de controle de especificidade irrelevante está presente). Preferivelmente, o aumento induzido pelo anticorpo anti-asinucleína em um parâmetro medido é um aumento de pelo menos 10%, mais preferivelmente de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 100% (isto é, 2 vezes), 3 vezes, 5 vezes ou 10 vezes. Contrariamente, o decréscimo induzido pelo anti-asinucleína anticorpo em um parâmetro medido é um decréscimo de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100%.

[00178] Os ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação dos anticorpos à α-sinucleína (por exemplo, α-sinucleína monomérica e α-sinucleína oligomérica) são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, ELISAs, Western blots, e RIAs. Ensaios adequados são descritos em detalhe nos Exemplos. As cinéticas de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) dos anticorpos também podem ser avaliadas por ensaios padrão conhecidos na técnica, tal como por

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56/252 análise Biacore. Ensaios para avaliar os efeitos dos anticorpos sobre as propriedades funcionais de α-sinucleína são descritos em maiores detalhes infra e nos Exemplos.

[00179] Em certas modalidades, os anticorpos de a-sinucleína descritos aqui não são anticorpos nativos ou não são anticorpos de ocorrência natural.

II. Anticorpos anti-a-sinucleína (aSyn) exemplares [00180] Os anticorpos particulares descritos aqui são anticorpos, por exemplo, anticorpos monoclonais, tendo as sequências de região variável e/ou CDR de anticorpos 7A10, 7A10-T93A, 11H11 (11H11-1 e 11H11-2), 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8 (23H8-1, 23H8-2, 23H8-3), e 1E8, isolados e estruturalmnte caracterizados como descrito no Exemplo 1, bem como anticorpos tendo pelo menos 80% de identidade (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade) à sua região variável ou sequência de CDR. As sequências de aminoácido de Vh de 7A10, 7A10-T93A, 11H11 (11H11-1 e 11H11-2), 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8, e 1E8 são mencionadas nas SEQ ID NOs: 8, 18, 31, 43, 53, 63, 73, 83, 99, e 113, respectivamente. As sequências de aminoácido de V_L de 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, e 1E8 são mencionadas nas SEQ ID NOs: 9, 19, 32, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 100, 101, 102, e 114, respectivamente.

[00181] Consequentemente, são fornecidos aqui anticorpos isolados, ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8, 18, 31,43, 53, 63, 73, 83, 99, e 113.

[00182] São fornecidos também anticorpos isolados, ou porções de

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57/252 ligação ao antigeno dos mesmos, compreendendo regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 9, 19, 32, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 100, 101, 102, e 114.

[00183] São também fornecidos aqui anticorpos isolados, ou porção de ligação ao antigeno dos mesmos, compreendendo:

[00184] (a) sequências de região variável de cadeia pesada e leve que compreendem as SEQ ID NOs: 8 e 9, respectivamente;

[00185] (b) sequências de região variável de cadeia pesada e leve que compreendem as SEQ ID NOs: 18 e 19, respectivamente;

[00186] (c) sequências de região variável de cadeia pesada e leve que compreendem as SEQ ID NOs: 31 e 32, respectivamente;

[00187] (d) sequências de região variável de cadeia pesada e leve que compreendem as SEQ ID NOs: 31 e 33, respectivamente;

[00188] (e) sequências de região variável de cadeia pesada e leve que compreendem as SEQ ID NOs: 43 e 44, respectivamente;

[00189] (f) sequências de região variável de cadeia pesada e leve que compreendem as SEQ ID NOs: 53 e 54, respectivamente;

[00190] (g) sequências de região variável de cadeia pesada e leve que compreendem as SEQ ID NOs: 63 e 64, respectivamente;

[00191] (h) sequências de região variável de cadeia pesada e leve que compreendem as SEQ ID NOs: 73 e 74, respectivamente;

[00192] (i) sequências de região variável de cadeia pesada e leve que compreendem as SEQ ID NOs: 83 e 84, respectivamente;

[00193] (j) sequências de região variável de cadeia pesada e leve que compreendem as SEQ ID NOs: 99 e 100, respectivamente;

[00194] (k) sequências de região variável de cadeia pesada e leve que compreendem as SEQ ID NOs: 99 e 101, respectivamente;

[00195] (I) sequências de região variável de cadeia pesada e leve

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58/252 que compreendem as SEQ ID NOs: 99 e 102, respectivamente; e [00196] (m) sequências de região variável de cadeia pesada e leve que compreendem as SEQ ID NOs: 113 e 114, respectivamente.

[00197] Anticorpos anti-a-sinucleína podem compreender as CDR1 s, CDR2s e CDR3s de cadeia pesada e leve de 7A10 (e 7A10-T93A, que compartilham as sequências VHCDR1-3 e VLCDR1-3 com 7A10), 11H11 (11H11-1 e 11H11-2 compartilham um VH comum, porém têm diferentes VLs), 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11,2E2, 23H8 (23H8-1,23H82, 23H8-3, que compartilham uma VH comum, porém têm diferentes VLs), e 1E8, ou combinações das mesmas. As sequências de aminoácidos das CDR1s Vh de 7A10 (e 7A10-T93A), 11H11, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8, e 1E8 são mencionadas nas SEQ ID NOs: 2, 22, 37, 47, 57, 67, 77, 87, e 107, respectivamente. As sequências de aminoácido das CDR2s Vh de 7A10 (e 7A10-T93A), 11H11, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8, e 1E8 são mencionadas nas SEQ ID NOs: 3, 23, 38, 48, 58, 68, 78, 88, e 108, respectivamente. As sequências de aminoácido das CDR3s Vh de 7A10 (e 7A10-T93A), 11H11, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11,2E2, 23H8, e 1E8 são mencionadas nas SEQ ID NOs: 4, 24, 39, 49, 59, 69, 79, 89, e 109. As sequências de aminoácido das CDR1s Vl de 7A10 (e 7A10T93A), 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, e 1E8 são mencionadas nas SEQ ID NOs: 5, 25, 28, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 93, 96, e 110, respectivamente. As sequências de aminoácido das CDR2s Vl de 7A10 (e 7A10-T93A), 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, e 1E8 são mencionadas nas SEQ ID NOs: 6, 26, 29, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 94, 97, e 111, respectivamente. As sequências de aminoácido das CDR3s V_L de 7A10 (ed 7A10-T93A), 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, e 1E8 são mencionadas nas SEQ ID NOs:7, 27, 30, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 95, 98, e 112,

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59/252 respectivamente. As regiões de CDR são delineadas usando o sistema Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH n^Q 91-3242).

[00198] Dado que cada um destes anticorpos liga-se à α-sinucleína e que especificidade de ligação ao antígeno é fornecida primeiramente pelas regiões de CDR1, 2 e 3, as sequências de CDR1, 2 e 3 de Vh e sequências de CDR1, 2 e 3 de Vl podem ser misturadas e combinadas (isto é, CDRs de diferentes anticorpos podem ser misturadas e combinadas, embora cada anticorpo deva conter uma CDR1,2 e 3 de Vh e uma CDR1,2 e 3 de Vl) para criar moléculas de ligação à anti-a-sinucleína descritas aqui. A ligação à α-sinucleína de tais anticorpos misturados e combinados pode ser testada usando os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (por exemplo, ELISAs). Preferivelmente, quando as sequências de CDR de Vh são misturadas e combinadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência de Vh em particular é substituída com uma sequência(s) de CDR estruturalmente similar(es). Igualmente, quando as sequências de CDR de Vl são misturadas e combinadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência de Vl em particular é preferivelmente substituída com uma sequência(s) de CDR estruturalmente similar(es). Será facilmente evidente para o técnico versado que novas sequências de Vh e Vl podem ser criadas por substituição de uma ou mais sequências de região de CDR de Vh e/ou Vl com sequências estruturalmente similares das sequências de CDR descritas aqui para anticorpos monoclonais 7A10 (e 7A10-T93A), 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, e 1E8.

[00199] Consequentemente, são fornecidos aqui anticorpos isolados, ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos

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60/252 compreendendo:

[00200] (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 22, 37, 47, 57, 67, 77, 87, e 107;

[00201] (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 23, 38, 48, 58, 68, 78, 88, e 108;

[00202] (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:4, 24, 39, 49, 59, 69, 79, 89, e 109;

[00203] (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:5, 25, 28, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 93, 96, e 110;

[00204] (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:6, 26, 29, 41,51,61,71,81,91,94, 97, e 111; e [00205] (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:7, 27, 30, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 95, 98, e 112;

[00206] em que o anticorpo liga-se especificamente à a-sinucleína humana.

[00207] Em uma modalidade, o anticorpo compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendem:

[00208] (a) SEQ ID NOs: 2-4;

[00209] (b) SEQ ID NOs: 22-24;

[00210] (c) SEQ ID NOs: 37-39;

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61/252 [00211 ] (d) SEQ ID NOs: 47-49;

[00212] (e) SEQ ID NOs: 57-59;

[00213] (f) SEQ ID NOs: 67-69;

[00214] (g) SEQ ID NOs: 77-79;

[00215] (h) SEQ ID NOs: 87-89; ou [00216] (i) SEQ ID NOs: 107-109, [00217] em que o anticorpo especificamente liga-se à a-sinucleína humana.

[00218] Em outra modalidade, o anticorpo compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que as regiões CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendem:

[00219] (a) SEQ ID NOs: 5-7;

[00220] (b) SEQ ID NOs: 25-27;

[00221 ] (c) SEQ ID NOs: 28-30;

[00222] (d) SEQ ID NOs: 40-42;

[00223] (e) SEQ ID NOs: 50-52;

[00224] (f) SEQ ID NOs: 60-62;

[00225] (g) SEQ ID NOs: 70-72;

[00226] (h) SEQ ID NOs: 80-82;

[00227] (i) SEQ ID NOs: 90-92;

[00228] (j) SEQ ID NOs: 93-92 [00229] (k) SEQ ID NOs: 96-98; ou [00230] (I) SEQ ID NOs: 110-112, [00231] em que o anticorpo especificamente liga-se à a-sinucleína humana.

[00232] Em uma modalidade particular, o anticorpo compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que:

[00233] (a) a CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreende as SEQ ID NOs: 2-4, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreende as SEQ

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ID NOs: 5-7, respectivamente;

[00234] (b) a CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendem as SEQ ID NOs: 22-24, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendem SEQ ID NOs: 25-27, respectivamente;

[00235] (c) a CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendem as SEQ ID NOs: 22-24, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendem a SEQ ID NOs: 28-30, respectivamente;

[00236] (d) a CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendem as SEQ ID NOs: 37-39, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendem as SEQ ID NOs: 40-42, respectivamente;

[00237] (e) a CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendem as SEQ ID NOs: 47-49, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendem as SEQ ID NOs: 50-52, respectivamente;

[00238] (f) a CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendem as SEQ ID NOs: 57-59, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendem as SEQ ID NOs: 60-62, respectivamente;

[00239] (g) a CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendem as SEQ ID NOs: 67-69, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendem as SEQ ID NOs: 70-72, respectivamente;

[00240] (h) a CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendem as SEQ ID NOs: 77-79, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendem as SEQ ID NOs: 80-82, respectivamente;

[00241] (i) a CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia

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63/252 pesada compreendem as SEQ ID NOs: 87-89, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendem as SEQ ID NOs: 90-92, respectivamente;

[00242] (j) a CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendem as SEQ ID NOs: 87-89, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendem as SEQ ID NOs: 93-95, respectivamente;

[00243] (k) a CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendem as SEQ ID NOs: 87-89, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendem as SEQ ID NOs: 96-98, respectivamente; ou [00244] (I) a CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendem as SEQ ID NOs: 107-109, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendem as SEQ ID NOs: 110-112, respectivamente, [00245] em que o anticorpo especificamente liga-se à a-sinucleína humana.

[00246] Um domínio de VH, ou uma ou mais CDRs do mesmo, descrito aqui pode ser ligado a um domínio constante para a formação de uma cadeia pesada, por exemplo, uma cadeia pesada de tamanho natural. Similarmente, um domínio de VL, ou uma ou mais CDRs do mesmo, descrito aqui pode ser pode ser ligado a um domínio constante para a formação de uma cadeia leve, por exemplo, uma cadeia leve de tamanho natural. Uma cadeia pesada de tamanho natural (com a exceção da lisina C-terminal (K) ou com a exceção da glicina e lisina C-terminal (GK), que podem estar ausentes) e cadeia leve de tamanho natural combinam-se para formar um anticorpo de tamanho natural.

[00247] Um domínio de VH descrito aqui pode ser fundido a um domínio constante de uma IgG humana, por exemplo, lgG1, lgG2,

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64/252 lgG3 ou lgG4, que são de ocorrência natural ou modificadas, por exemplo, como também descrito aqui. Por exemplo, um domínio de VH pode compreender a sequência de aminoácido de qualquer domínio de VH descrito aqui fundido à seguinte sequência de aminoácido de lgG1 humana:

ASTKGP SVFPLAPSSK

STSGGTAALG

CLVKDYFPEP

VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV

LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN

RVEPKSCDKT HTCPPCPAPE

LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV

HKPSNTKVDK

VDVSHEDPEV

KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE

EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE

KTISKAKGQP REPQVYTLPP

SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT

TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD

KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPG (SEQ ID NO: 117) [00248] O domínio constante de lgG1 humana pode também ser aquele de uma variante alotípica. Por exemplo, uma variante alotípica de lgG1 compreende um R107K, E189D e M191L (sublinhado acima). Dentro da região pesada de tamanho natural, estas substituições de aminoácido são numeradas R214K, E356D e M358L.

[00249] Um domínio de VL descrito aqui pode ser fundido ao domínio constante de uma cadeia leve Capa ou Lambda humana. Por exemplo, um domínio de VL pode compreender a sequência de aminoácido de qualquer domínio de VL descrito aqui fundido à seguinte sequência de aminoácido de cadeia leve de IgG 1 humana:

RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC (SEQ ID NO: 120)

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65/252 [00250] Em certas modalidades, a região constante de cadeia pesada compreende uma lisina ou outro aminoácido no terminal C. Em certas modalidades, a região constante de cadeia pesada não tem um ou mais aminoácidos no terminal C, e tem, por exemplo, a sequência C-terminal, LSPG (SEQ ID NO: 127) ou LSP.

[00251] As sequências de aminoácidos de cadeias pesadas e leves exemplares dos anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui são mencionadas na Tabela 22.

[00252] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-a-sinucleína compreende cadeias pesadas e leves, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido mencionada nas SEQ ID NOs: 10, 20, 34, 45, 55, 65, 75, 85, 103, e 115.

[00253] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-a-sinucleína compreende cadeias pesadas e leves, em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido mencionada nas SEQ ID NOs: 11,21,35, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 104, 105, 106, e 116.

[00254] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-a-sinucleína compreende cadeias pesadas e leves, em que as cadeias pesadas e leves compreendem sequências de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em:

[00255] (a) 10 e 11, [00256] (b) 20 e 21, [00257] (c) 34 e 35, [00258] (d) 34 e 36, [00259] (e) 45 e 46, [00260] (f) 55 e 56, [00261] (g) 65 e 66, [00262] (h) 75 e 76, [00263] (i) 85 e 86, [00264] (j) 103 e 104,

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66/252 [00265] (k) 103 e 105, [00266] (I) 103 e 106, e [00267] (m)115e116.

[00268] Cadeias pesadas e leves compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% ou 70% idêntica a qualquer uma das cadeias pesadas ou leves mencionadas na Tabela 22 (ou suas regiões variáveis), por exemplo, SEQ ID NOs: 10, 11, 20, 21, 34, 35, 36, 45, 46, 55, 56, 65, 66, 75, 76, 85, 86, 103, 104, 105, 106, 115, e 116 podem ser usadas para a formação de anticorpos anti-a-sinucleína humana tendo as características desejadas, por exemplo, aquelas descritas aqui. Variantes exemplares são aquelas compreendendo uma variação alotípica, por exemplo, no domínio constante, e/ou a mutação nas regiões variáveis ou constantes, tal como as mutações descritas aqui. Cadeias pesadas e leves compreendendo uma sequência de aminoácido que diferem em no máximo 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 15, 1-4, 1-3, 1-2 ou 1 aminoácido (por substituição, adição ou deleção) de qualquer uma das cadeias pesadas ou leves mencionadas na Tabela 22 (ou suas regiões variáveis) podem ser usadas para a formação de anticorpos anti-a-sinucleína tendo as características desejadas, por exemplo, aquelas também descritas aqui.

[00269] Em várias modalidades, os anticorpos descritos acima exibem uma ou mais das seguintes propriedades funcionais:

[00270] (a) ligam-se à α-sinucleína de camundongo e rato;

[00271] (b) ligam-se ao β-sinucleína e γ-sinucleína;

[00272] (c) têm uma maior afinidade quanto aos oligômeros de asinucleína (por exemplo, PFF) mais do que monômeros de asinucleína;

[00273] (d) inibem a geração de agregados insolúveis de asinucleína (por exemplo, agregados de α-sinucleína fosforilados em

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67/252 serina-129) induzidos por oligômero de α-sinucleína (por exemplo, PFF);

[00274] (e) esgotam a espécie molecular que produz agregados de α-sinucleína solúveis ou insolúveis (por exemplo, agregados de asinucleína fosforilados em serina-129) de PFF e/ou lisado cerebral preparado de pacientes com agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro;

[00275] (f) ligam-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 123-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1);

[00276] (g) ligam-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 125-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1);

[00277] (h) ligam-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 130-139 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1);

[00278] (i) ligam-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 119-126 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1); e [00279] (j) ligam-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 130-138 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1).

[00280] Em algumas modalidades, o oligômero de α-sinucleína é PFF. Em algumas modalidades, PFF é preparada usando o método descrito no Exemplo 3. Em algumas modalidades, o oligômero de asinucleína é solúvel. Em outras modalidades, o oligômero de asinucleína é insolúvel.

[00281] Tais anticorpos incluem, por exemplo, anticorpo humanos, anticorpos humanizados, ou anticorpos quiméricos.

[00282] Em uma modalidade, os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui se ligam a toda ou uma porção da seguinte sequência de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1):

[00283] EAYEMP (SEQ ID NO: 121), [00284] correspondendo aos resíduos de aminoácido 123-128 de asinucleína humana (SEQ ID NO: 1).

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68/252 [00285] Em outra modalidade, os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui se ligam a toda ou uma porção da seguinte sequência de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1):

[00286] YEMP (SEQ ID NO: 122), [00287] correspondendo aos resíduos de aminoácido 125-128 de asinucleína humana (SEQ ID NO: 1).

[00288] Em outra modalidade, os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui se ligam a toda ou uma porção da seguinte sequência de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1):

[00289] EEGYQDYEPE (SEQ ID NO: 124), [00290] correspondendo aos resíduos de aminoácido 130-139 de asinucleína humana (SEQ ID NO: 1).

[00291] Em outra modalidade, os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui se ligam a toda ou uma porção da seguinte sequência de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1):

[00292] DPDNEAYE (SEQ ID NO: 125), [00293] correspondendo aos resíduos de aminoácido 119-126 de asinucleína humana (SEQ ID NO: 1).

[00294] Em outra modalidade, os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui se ligam a toda ou uma porção da seguinte sequência de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1):

[00295] EEGYQDYEP (SEQ ID NO: 123), [00296] correspondendo aos resíduos de aminoácido 130-138 de asinucleína humana (SEQ ID NO: 1).

[00297] São também fornecidos aqui anticorpos anti-a-sinucleína que competem quanto à ligação à α-sinucleína com anticorpos anti-asinucleína compreendendo CDRs ou regiões variáveis descritos aqui, por exemplo, those of any of 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, e 1E8. Em algumas modalidades, anticorpos anti-a-sinucleína inibem a ligação de

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69/252 qualquer um de 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, e 1E8 à a-sinucleína humana (por exemplo, α-sinucleína monomérica ou a-sinucleína oligomérica) em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou em 100%. Os anticorpos de competição podem ser identificados com base em sua capacidade de inibir competitivamente a ligação à α-sinucleína usando ensaios de ligação padrão conhecidos na técnica (por exemplo, ensaio ELISA competitivo).

[00298] São também fornecidos aqui anticorpos anti-a-sinucleína que se ligam ao mesmo epítopo em α-sinucleína com anticorpos antia-sinucleína compreendendo CDRs ou regiões variáveis descritas aqui, por exemplo, aqueles de 7A10, 7A10-T93A, 11H11 -1, 11H11 -2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, e 1E8. Métodos para determiner se os anticorpos se ligam ao mesmo epítopo de asinucleína com os anticorpos descritos aqui include, por exemplo, métodos de mapeamento de epítopo, monitoramento da ligação do anticorpo aos fragmentos de antígeno ou variações mutadas do antígeno, onde a perda de ligação devido a uma modificação de um resíduo de aminoácido dentro da sequência de antígeno é considerada uma indicação de um componente de epítopo (por exemplo, escaneamento de alanina); pegada de proteína com base em MS, a avaliação da capacidade de um anticorpo de interesse de isolar por afinidade peptídeos curtos específicos (seja na forma tridimensional nativa ou na forma desnaturada) de bibliotecas combinatórias de peptídeos de exibição de fagos.

[00299] Os anticorpos descritos aqui incluem todas as formas de anticorpos e outras estruturas proteicas com propriedades semelhantes ao anticorpo. Por exemplo, o anticorpo pode ser um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo biespecífico, um imunoconjugado, um anticorpo quimérico, ou uma

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70/252 estrutura proteica com propriedades semelhantes ao anticorpo, tais como repetições de fibronectina ou ancirina. O anticorpo também pode ser um Fab, Fab’2, scFv, affibody®, avímero, nanocorpo, ou um anticorpo de domínio. O anticorpo também pode ter qualquer isótipo, incluindo qualquer um dos seguintes isótipos: anticorpos de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1, lgA2, IgAsec, IgD, e IgE. IgG são preferidos. Anticorpos de tamanho natural podem ser preparados a partir de sequências de Vh e Vl usando técnicas de DNA recombinante padrão e ácido nucleico codificando as sequências de região constante desejadas a serem operativamente ligadas às sequências de região variável.

III. Anticorpos Tendo Sequências de Linhagem Germinativa Particulares [00300] Em certas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui compreendem uma região variável de cadeia pesada de um gene de imunoglobulina de cadeia pesada de linhagem germinativa particular e/ou uma região variável de cadeia leve de gene de imunoglobulina de cadeia leve de linhagem germinativa particular.

[00301] Como usado aqui, um anticorpo humano compreende regiões variáveisde cadeia pesada ou leve que é o produto de ou derivado de uma sequência de linhagem germinativa particular se as regiões variáveis do anticorpo são obtidas de um sistema que usa os genes de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Tais sistemas incluem a imunização de um camundongo transgênico que transporta os genes de imunoglobulina humana com o antigeno de interesse ou análise de uma biblioteca de gene de imunoglobulina humana exibida no fago com o antigeno de interesse. Um anticorpo humano que é o produto de ou derivado de uma sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana pode ser identificado como tal comparando a sequência de aminoácido do anticorpo

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71/252 humano às sequências de aminoácidos de imunoglobulinas de linhagem germinativa humana e selecionando a sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana que é mais próxima em sequência (isto é, maior % de identidade) à sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é o produto de ou derivada de uma sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana particular pode conter diferenças de aminoácido como em comparação com a sequência de linhagem germinativa, devido à, por exemplo, mutações somáticas de ocorrência natural ou introdução intencional de mutação direcionada ao sítio. Entretanto, um anticorpo humano selecionado tipicamente é pelo menos 90% idêntico em sequência de aminoácidos a uma sequência de aminoácido codificada por um gene de imunoglobulina de linhagem germinativa humana e contém resíduos de aminoácido que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando em comparação com a sequências de aminoácido de imunoglobulina de linhagem germinativa de outras espécies (por exemplo, sequências de linhagem germinativa de murino). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 95%, ou ainda pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico em sequência de aminoácido à sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma sequência de linhagem germinativa humana particular não exibirá mais do que 10 diferenças de aminoácido da sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em certos casos, o anticorpo humano pode exibir não mais do que 5, ou até não mais do que 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácido da sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa.

IV. Anticorpos Homólogos [00302] São abrangidos aqui anticorpos anti-a-sinucleína tendo

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72/252 regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo as sequências de aminoácido que são homólogas às sequências de aminoácido dos anticorpos preferidos descritos aqui, e em que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui.

[00303] Por exemplo, um anticorpo de anti-a-sinucleína isolado, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, pode compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que:

[00304] (a) a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8, 18, 31,43, 53, 63, 73, 83, 99, e 113, ou compreende 1,2,3, 4, 5, 1 -2, 1 -3, 1 -4, 1-5, 1 10, 1-15, 1-20, 1-25, ou 1-50 mudanças de aminoácido (isto é, substituições, adições ou deleções de aminoácido) com relação a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8, 18, 31,43, 53, 63, 73, 83, 99, e 113;

[00305] (b) a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 9, 19, 32, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 100, 101, 102, e 114, ou compreende 1,2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, ou 1-50 mudanças de aminoácido (isto é, substituições, adições ou deleções de aminoácido) com relação a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 9, 19, 32, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 100, 101, 102, e 114;

[00306] (c) o anticorpo especificamente liga-se à α-sinucleína, e [00307] (d) o anticorpo exibe uma ou mais das seguintes

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73/252 propriedades funcionais:

[00308] (1) liga-se à α-sinucleína de camundongo e rato;

[00309] (2) liga-se ao β-sinucleína e γ-sinucleína;

[00310] (3) tem uma maior afinidade quanto aos oligômeros de asinucleína (por exemplo, PFF) do que os monômeros de a-sinucleína;

[00311] (4) inibe a geração de agregados insolúveis de a-sinucleína (por exemplo, agregados de α-sinucleína fosforilados em serina-129) induzidos por oligômero de α-sinucleína (por exemplo, PFF);

[00312] (5) esgota a espécie molecular que produz agregados insolúveis de α-sinucleína (por exemplo, agregados de a-sinucleína fosforilados em serina-129) de PFF e/ou lisado cerebral preparado de pacientes com agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro;

[00313] (6) liga-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 123-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 121);

[00314] (7) liga-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 125-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 122);

[00315] (8) liga-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 130-139 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 124);

[00316] (9) liga-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 119-126 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 125); e [00317] (10) liga-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 130-138 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 123).

[00318] Em algumas modalidades, o oligômero de α-sinucleína é PFF. Em algumas modalidades, PFF é preparada usando o método descrito no Exemplo 3. Em algumas modalidades, o oligômero de asinucleína é solúvel. Em outras modalidades, o oligômero de asinucleína é insolúvel.

[00319] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, compreendendo as sequências de região varivável de cadeia pesada e

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74/252 leve pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica às sequências de região variável de cadeia pesada e leve selecionadas do grupo que consiste em:

[00320] (a) SEQ ID NOs: 8 e 9;

[00321 ] (b) SEQ ID NOs: 18 e 19;

[00322] (c) SEQ ID NOs: 31 e 32;

[00323] (d) SEQ ID NOs: 31 e 33;

[00324] (e) SEQ ID NOs: 43 e 44;

[00325] (f) SEQ ID NOs: 53 e 54;

[00326] (g) SEQ ID NOs: 63 e 64;

[00327] (h) SEQ ID NOs: 73 e 74;

[00328] (i) SEQ ID NOs: 83 e 84;

[00329] (j) SEQ ID NOs: 99 e 100;

[00330] (k) SEQ ID NOs: 99 e 101;

[00331] (I) SEQ ID NOs: 99 e 102; e [00332] (m) SEQ ID NOs: 113 e 114, [00333] em que o anticorpo liga-se à a-sinucleína.

[00334] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo (por exemplo, anticorpo monoclonal isolado) compreendendo as sequências de região variável de cadeia pesada e leve que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências de aminoácidos mencionadas nas SEQ ID NOs: 8 e 9, respectivamente, em que:

[00335] a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00336] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2;

[00337] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3; e [00338] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:

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4; e [00339] a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00340] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5;

[00341] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6; e [00342] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7; e [00343] em que o anticorpo se liga à α-sinucleína humana (SEQ ID NO:1).

[00344] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo (por exemplo, anticorpo monoclonal isolado) compreendendo as sequências de região variável de cadeia pesada e leve que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências de aminoácidos mencionadas nas SEQ ID NOs: 18 e 19, respectivamente, em que:

[00345] a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00346] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12;

[00347] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13;e [00348] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14; e [00349] a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00350] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15;

[00351] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:

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16;e [00352] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17;e [00353] em que o anticorpo se liga à α-sinucleína humana (SEQ ID NO:1).

[00354] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo (por exemplo, anticorpo monoclonal isolado) compreendendo as sequências de região variável de cadeia pesada e leve que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências de aminoácidos mencionadas nas SEQ ID NOs: 31 e 32, respectivamente, em que:

[00355] a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00356] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22;

[00357] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23; e [00358] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 24; e [00359] a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00360] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25;

[00361] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26; e [00362] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 27; e [00363] em que o anticorpo se liga à α-sinucleína humana (SEQ ID NO:1).

[00364] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo (por

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77/252 exemplo, anticorpo monoclonal isolado) compreendendo as sequências de região variável de cadeia pesada e leve que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências de aminoácidos mencionadas nas SEQ ID NOs: 31 e 33, respectivamente, em que:

[00365] a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00366] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22;

[00367] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23; e [00368] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 24; e [00369] a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00370] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 28;

[00371] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 29; e [00372] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30; e [00373] em que o anticorpo se liga à α-sinucleína humana (SEQ ID NO:1).

[00374] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo (por exemplo, anticorpo monoclonal isolado) compreendendo as sequências de região variável de cadeia pesada e leve que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências de aminoácidos mencionadas nas SEQ ID NOs: 43 e 44, respectivamente, em que:

[00375] a região variável de cadeia pesada do anticorpo

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78/252 compreende as seguintes CDRs:

[00376] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37;

[00377] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 38; e [00378] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 39; e [00379] a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00380] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 40;

[00381] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 41; e [00382] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 42; e [00383] em que o anticorpo se liga à α-sinucleína humana (SEQ ID NO:1).

[00384] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo (por exemplo, anticorpo monoclonal isolado) compreendendo as sequências de região variável de cadeia pesada e leve que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências de aminoácidos mencionadas nas SEQ ID NOs: 53 e 54, respectivamente, em que:

[00385] a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00386] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 47;

[00387] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 48; e [00388] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:

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79/252

49; e [00389] a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00390] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50;

[00391] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 51; e [00392] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52; e [00393] em que o anticorpo se liga à α-sinucleína humana (SEQ ID NO:1).

[00394] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo (por exemplo, anticorpo monoclonal isolado) compreendendo as sequências de região variável de cadeia pesada e leve que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências de aminoácidos mencionadas nas SEQ ID NOs: 63 e 64, respectivamente, em que:

[00395] a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00396] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 57;

[00397] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 58; e [00398] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 59; e [00399] a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00400] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 60;

[00401] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:

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80/252 ;e [00402] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 62; e [00403] em que o anticorpo se liga à α-sinucleína humana (SEQ ID NO:1).

[00404] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo (por exemplo, anticorpo monoclonal isolado) compreendendo as sequências de região variável de cadeia pesada e leve que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências de aminoácidos mencionadas nas SEQ ID NOs: 73 e 74, respectivamente, em que:

[00405] a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00406] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 67;

[00407] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 68; e [00408] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69; e [00409] a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00410] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 70;

[00411] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 71 ;e [00412] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 72; e [00413] em que o anticorpo se liga à α-sinucleína humana (SEQ ID NO:1).

[00414] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo (por

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81/252 exemplo, anticorpo monoclonal isolado) compreendendo as sequências de região variável de cadeia pesada e leve que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências de aminoácidos mencionadas nas SEQ ID NOs: 83 e 84, respectivamente, em que:

[00415] a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00416] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 77;

[00417] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 78; e [00418] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 79; e [00419] a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00420] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 80;

[00421] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 81 ;e [00422] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 82; e [00423] em que o anticorpo se liga à α-sinucleína humana (SEQ ID NO:1).

[00424] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo (por exemplo, anticorpo monoclonal isolado) compreendendo as sequências de região variável de cadeia pesada e leve que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências de aminoácidos mencionadas nas SEQ ID NOs: 99 e 100, respectivamente, em que:

[00425] a região variável de cadeia pesada do anticorpo

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82/252 compreende as seguintes CDRs:

[00426] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 87;

[00427] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 88; e [00428] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 89; e [00429] a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00430] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 90;

[00431] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 91 ;e [00432] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 92; e [00433] em que o anticorpo se liga à α-sinucleína humana (SEQ ID NO:1).

[00434] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo (por exemplo, anticorpo monoclonal isolado) compreendendo as sequências de região variável de cadeia pesada e leve que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências de aminoácidos mencionadas nas SEQ ID NOs: 99 e 101, respectivamente, em que:

[00435] a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00436] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 87;

[00437] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 88; e [00438] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:

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83/252

89; e [00439] a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00440] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 93;

[00441] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 94; e [00442] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 95; e [00443] em que o anticorpo se liga à α-sinucleína humana (SEQ ID NO:1).

[00444] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo (por exemplo, anticorpo monoclonal isolado) compreendendo as sequências de região variável de cadeia pesada e leve que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências de aminoácidos mencionadas nas SEQ ID NOs: 99 e 102, respectivamente, em que:

[00445] a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00446] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 87;

[00447] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 88; e [00448] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 89; e [00449] a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00450] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 96;

[00451] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:

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84/252

97; e [00452] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 98; e [00453] em que o anticorpo se liga à α-sinucleína humana (SEQ ID NO:1).

[00454] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo (por exemplo, anticorpo monoclonal isolado) compreendendo as sequências de região variável de cadeia pesada e leve que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências de aminoácidos mencionadas nas SEQ ID NOs: 113 e 114, respectivamente, em que:

[00455] a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00456] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 107;

[00457] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 108; e [00458] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 109; e [00459] a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende as seguintes CDRs:

[00460] i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 110;

[00461] ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 111; e [00462] iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 112; e [00463] em que o anticorpo se liga à α-sinucleína humana (SEQ ID NO:1).

[00464] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo

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85/252 humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.

[00465] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-asinucleína isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, podem compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que: [00466] (a) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 10, 20, 34, 45, 55, 65, 75, 85,

103, e 115, ou compreende 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, ou 1-50 mudanças de aminoácido (isto é, substituições, adições ou deleções de aminoácido) com relação a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 10, 20, 34, 45, 55, 65, 75, 85, 103, e 115, com a condição de, em certas modalidades, se a sequência for aquela de cadeia pesada não efetora, as mutações que tornam a cadeia pesada não efetora não serão modificadas;

[00467] (b) a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 11,21,35, 36, 46, 56, 66, 76, 86,

104, 105, 106, e 116, ou compreende 1,2,3, 4, 5, 1 -2, 1 -3, 1 -4, 1-5, 1 10, 1-15, 1-20, 1-25, ou 1-50 mudanças de aminoácido (isto é, substituições, adições ou deleções de aminoácido) com relação a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 11,21,35, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 104, 105, 106, e 116;

[00468] (c) o anticorpo especificamente liga-se à α-sinucleína, e [00469] (d) o anticorpo exibe uma ou mais das seguintes propriedades funcionais:

[00470] (1) liga-se à α-sinucleína de camundongo e rato;

[00471] (2) liga-se ao β-sinucleína e γ-sinucleína;

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86/252 [00472] (3) tem uma maior afinidade quanto aos oligômeros de asinucleína (por exemplo, PFF) do que os monômeros de a-sinucleína;

[00473] (4) inibe a geração de agregados insolúveis de (por exemplo, agregados de α-sinucleína fosforilados em serina-129) induzidos por oligômero de α-sinucleína (por exemplo, PFF);

[00474] (5) esgota a espécie molecular que produz agregados insolúveis de α-sinucleína (por exemplo, agregados de a-sinucleína fosforilados em serina-129) de PFF e/ou lisado cerebral preparado de pacientes com agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro;

[00475] (6) liga-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 123-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 121);

[00476] (7) liga-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 125-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 122);

[00477] (8) liga-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 130-139 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 124);

[00478] (9) liga-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 119-126 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 125); e [00479] (10) liga-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 130-138 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 123).

[00480] Em algumas modalidades, o oligômero de α-sinucleína é PFF. Em algumas modalidades, PFF é preparada usando o método descrito no Exemplo 3. Em algumas modalidades, o oligômero de asinucleína é solúvel. Em outras modalidades, o oligômero de asinucleína é insolúvel.

[00481] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo sequências de cadeia pesada e cadeia leve pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticas às sequências de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em:

[00482] (a) SEQ ID NOs: 10 e 11,

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87/252 [00483] (b) SEQ ID NOs: 20 e 21, [00484] (c) SEQ ID NOs: 34 e 35, [00485] (d) SEQ ID NOs: 34 e 36, [00486] (e) SEQ ID NOs: 45 e 46, [00487] (f) SEQ ID NOs: 55 e 56, [00488] (g) SEQ ID NOs: 65 e 66, [00489] (h) SEQ ID NOs: 75 e 76, [00490] (i) SEQ ID NOs: 85 e 86, [00491 ] (j) SEQ ID NOs: 103 e 104, [00492] (k) SEQ ID NOs: 103 e 105, [00493] (I) SEQ ID NOs: 103 e 106, e [00494] (m) SEQ ID NOs: 115 e 116, [00495] em que o anticorpo se liga à a-sinucleína.

[00496] São fornecidos também anticorpos anti-a-sinucleína compreendendo a VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, e/ou VLCDR3 que diferem da CDR correspondente de 7A10, 7A10T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, e/ou 1E8, em 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, ou 1-5 mudanças de aminoácido (isto é, substituições, adições ou deleções de aminoácido). Em certas modalidades, um anticorpo anti-asinucleína compreende 1-5 mudanças de aminoácido em cada de 1,2, 3, 4, 5 ou 6 das CDRs com relação à sequência correspondente em 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11,2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, e/ou 1E8. Em certas modalidades, um anticorpo anti-a-sinucleína compreende um total de 1-5 mudanças de aminoácido através de todas as CDRs com relação às CDRs em 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11,2E2, 23H81, 23H8-2, 23H8-3, e/ou 1E8. Estes anticorpos alterados podem ser testados, usando os ensaios in vitro e in vivo descritos aqui e nos Exemplos, para determiner se eles mantêm uma ou mais propriedades

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88/252 funcionais listadas acima.

[00497] Anticorpos tendo sequências com homologia àquelas de 7A10, 11H11 (11H11-1 e 11H11-2), 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8 (23H8-1, 23H8-2, e 23H8-3), e/ou 1E8, por exemplo, as regiões V_H e Vl de SEQ ID NOs: 8, 18, 31, 43, 53, 63, 73, 83, 99, e 113, e SEQ ID NOs: 9, 19, 32, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 100, 101, 102, e 114, respectivamente, ou cadeias pesadas e leves de SEQ ID NOs: 10, 20, 34, 45, 55, 65, 75, 85, 103, e 115, e SEQ ID NOs: 11, 21, 35, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 104, 105, 106, e 116, respectivamente, ou as CDRs podem ser obtidas por mutagênese (por exemplo, mutagênese direcionada ao sítio ou mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico codificando as sequências de aminoácido, seguida pelo teste do anticorpo alterado codificado quanto à função mantida usando os ensaios funcionais descritos aqui.

V. Anticorpos com Modificações Conservativas [00498] Anticorpos anti-a-sinucleína podem compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, em que uma ou mais destas sequências de CDR compreendem sequências especificadas de aminoácido com base nos anticorpos preferidos descritos aqui, ou mutações conservativas dos mesmos, e em que os anticorpos mantêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui. Consequentemente, um anticorpo de anti-a-sinucleína isolado, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2, e CDR3, em que:

[00499] (a) a sequência de CDR3 de região variável de cadeia

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89/252 pesada compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 24, 39, 49, 59, 69, 79, 89, e 109, e mutações conservativas das mesmas, por exemplo, 1,2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 ou 1-5 substituições de aminoácido conservativas;

[00500] (b) a sequência de CDR3 de região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 7, 27, 30, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 95, 98, e 102, e mutações conservativas dos mesmos, por exemplo, 1,2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 ou 1-5 substituições de aminoácido conservativas;

[00501] (c) o anticorpo especificamente liga-se à α-sinucleína, and [00502] (d) o anticorpo exibe uma ou mais das seguintes propriedades funcionais:

[00503] (1) liga-se à α-sinucleína de camundongo e rato;

[00504] (2) liga-se ao β-sinucleína e γ-sinucleína;

[00505] (3) tem uma maior afinidade quanto aos oligômeros de asinucleína (por exemplo, PFF) mais do que monômeros de asinucleína;

[00506] (4) inibe a geração de agregados insolúveis de a-sinucleína de (por exemplo, agregados de α-sinucleína fosforilados em serina129) induzidos por oligômero de α-sinucleína (por exemplo, PFF);

[00507] (5) esgota a espécie molecular que produz agregados insolúveis de α-sinucleína (por exemplo, agregados de a-sinucleína fosforilados em serina-129) de PFF e/ou lisado cerebral preparado de pacientes com agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro;

[00508] (6) liga-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 123-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 121);

[00509] (7) liga-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 125-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 122);

[00510] (8) liga-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 130-139 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 124);

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90/252 [00511] (9) liga-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 119-126 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 125); e [00512] (10) liga-se a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 130-138 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 123).

[00513] Em algumas modalidades, o oligômero de α-sinucleína é PFF. Em algumas modalidades, PFF é preparada usando o método descrito no Exemplo 3. Em algumas modalidades, o oligômero de asinucleína é solúvel. Em outras modalidades, o oligômero de asinucleína é insolúvel.

[00514] Em uma modalidade preferida, a sequência CDR2 de região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 23, 38, 48, 58, 68, 78, 88, e 108, e mutações conservatives dos mesmos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 ou 1-5 substituições de aminoácido conservatives; e a sequência CDR2 de região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6, 26, 29, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 94, 97, e 111, e mutações conservatives dos mesmos, por exemplo, 1,2, 3, 4, 5, 1 -2, 1 -3, 1 -4 ou 1 -5 substituições de aminoácido conservatives. Em outra modalidade preferida, a sequência CRD1 de região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 22, 37, 47, 57, 67, 77, 87, e 107, e mutações conservatives dos mesmos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 ou 1-5 substituições de aminoácido conservatives; e a sequência CDR1 de região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 5, 25, 28, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 93, 96, e 110, e mutações conservatives dos mesmos, por exemplo, 1,2, 3, 4, 5, 1 -2, 1 -3, 1 -4 ou 1 -5 substituições de aminoácido conservatives.

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91/252 [00515] Em várias modalidades, o anticorpo pode exibir uma ou mais propriedades funcionais listadas acima. Tais anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos humanos, anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos.

[00516] Substituições de aminoácido conservatives podem também ser feitas em porções dos anticorpos diferentes de, ou além das CDRs. Por exemplo, modificações de aminoácido conservatives podem ser feitas em uma região estrutural ou em uma região Fc. Uma região variável ou uma cadeia leve ou pesada pode compreender 1,2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, ou 1-50 substituições de aminoácido conservatives com relação às sequências de anticorpo anti-a-sinucleína fornecidas aqui. Em certas modalidades, um anticorpo anti-a-sinucleína compreende uma combinação de modificação de aminoácido conservative e não conservative.

VI. Anticorpos Criados e Modificados

Regiões VHe VL [00517] São também fornecidos anticorpos criados e modificados que podem ser preparados usando um anticorpo tendo uma ou mais das sequências de Vh e/ou Vl descritas como material de partida para criar um anticorpo modificado, cujo anticorpo modificado pode ter propriedades alteradas dos anticorpos de partida. Um anticorpo pode ser criado modificando-se um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas regiões (isto é, Vh e/ou Vl), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de estrutura. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser criado modificando-se resíduos dentro da(s) região(ões) constante(s), por exemplo, para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo.

[00518] Um tipo de criação de região variável que pode ser realizado é enxerto de CDR. Os anticorpos interagem com antígenos alvo predominantemente por meio dos resíduos de aminoácido que

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92/252 são localizados nas seis regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve e pesada (CDRs). Por esta razão, as sequências de aminoácido dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que as sequências fora das CDRs. Porque as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que mimetizam as propriedades de anticorpos de ocorrência natural específicos construindo-se vetores de expressão que incluem sequências de CDR do anticorpo de ocorrência natural específico enxertado nas sequências estruturais de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (veja, por exemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. Estados Unidos da América, 86:10029-10033; Patente dos Estados Unidos n^Q 5.225.539 para Winter, e Patente dos Estados Unidos n^os 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et al.) [00519] Consequentemente, outra modalidade descrita aqui pertence a um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID n^os: 2, 22, 37, 47, 57, 67, 77, 87, e 107; SEQ ID n^os: 3, 23, 38, 48, 58, 68, 78, 88, e 108; e SEQ ID n^os: 4, 24, 39, 49, 59, 69, 79, 89, e 109, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve compreendendo as sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID n^os: 5, 25, 28, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 93, 96, e 110; SEQ ID n^os: 6, 26, 29, 41,51,61,71,81,91,94, 97, e 111; e SEQ ID n^os: 7, 27, 30, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 95, 98, e 102, respectivamente. Desse modo, tais anticorpos contêm as sequências de CDR de Vh e

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Vl de anticorpos monoclonais 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11,2E2, 23H8-1,23H8-2, 23H8-3, e 1E8, ainda podem conter as sequências estruturais diferentes destes anticorpos. [00520] Tais sequências estruturais podem ser obtidas de bases de dados de DNA públicas ou referências publicadas que incluem sequências de gene de anticorpo germinativas. Por exemplo, as sequências de DNA germinativas para genes de região variável de cadeia pesada e leve humanos podem ser encontradas na base de dados de sequência germinative humana VBase (disponível na Internet em www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH n^Q 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments com Different Hypervariable Loops J. Mol. Biol. 227:776-798; e Cox, J. P. L. et al. (1994) A Directory of Human Germ-line Vh Segments Reveals a Strong Bias in their Usage Eur. J. Immunol. 24:827-836; os conteúdos de cada dos quais são expressamente incorporados aqui por referência.

[00521] As sequências estruturais preferidas para uso nos anticorpos descritos aqui são aquelas que são estruturalmente similares às sequências estruturais usadas por anticorpos descritos aqui. A CDR1 de Vh, 2 e 3 sequências, e a CDR1 de Vl, 2 e 3 sequências, podem ser enxertadas nas regiões de estrutura que têm a sequência idêntica àquela encontrada no gene de imunoglobulina geminativo do qual o derivado de sequência de estrutura, ou as sequências de CDR podem ser enxertadas nas regiões de estrutura que contêm uma ou mais mutações como em comparação com as sequências germinativas. Por exemplo, descobriu-se que, em certos exemplos, é benéfico alterar os resíduos dentro das regiões de

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94/252 estrutura para manter ou realçar a capacidade de ligação de antigeno do anticorpo (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos nos 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen etal).

[00522] Os anticorpos criados descritos aqui incluem aqueles em que as modificações foram feitas nos resíduos da estrutura dentro das Vh e/ou Vl, por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente, tais modificações de estrutura são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, um método é mutar novamente um ou mais resíduos da estrutura para a sequência germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que foi submetido à mutação somática pode conter resíduos de estrutura que diferem da sequência germinativa da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados comparando-se as sequências estruturais de anticorpo com as sequências germinativas da qual o anticorpo é derivado. Para retornar as sequências de região de estrutura à sua configuração germinativa, as mutações somáticas podem ser mutadas novamente para a sequência germinativa por, por exemplo, mutagênese direcionada ao sítio ou mutagênise mediada por PCR. Tais anticorpos mutados novamente são também destinados a serem abrangidos.

[00523] Outro tipo de modificação de estrutura envolve mutação de um ou mais resíduos dentro da região de estrutura, ou ainda dentro de uma ou mais regiões de CDR, para remover epitopos de célula T para, desse modo, reduzir a imunogenicidade do anticorpo. Este método é também referido como desimunização e é descrito com mais detalhe na Puplicação de Patente dos Estados Unidos n^Q 20030153043 por Carr et al.

[00524] Outro tipo de modificação de região variável é a mutação dos resíduos de aminoácido dentro das regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 a Vh e/ou Vl para, desse modo, melhora uma ou mais

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95/252 propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse. A mutagênese direcionada ao sítio ou mutagênise mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito sobre a ligação de anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse pode ser avaliada em ensaios in vitro ou in vivo como descrita aqui e fornecida nos exemplos. As modificações preferivelmente conservadoras (como descritas acima) são introduzidas. As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoácido, porém são preferivelmente substituições. Além disso, tipicamente não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDR são alterados.

[00525] Consequentemente, são também fornecidos anticorpos anti-a-sinucleína monoclonais isolados, ou porções de ligação de antígeno dos mesmos, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo: (a) uma região CDR1 de Vh compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID n^os: 2, 22, 37, 47, 57, 67, 77, 87, e 107, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido como em comparação com SEQ ID n^os: 2, 22, 37, 47, 57, 67, 77, 87, e 107; (b) uma região CDR2 de V_Hcompreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID n^os: 3, 23, 38, 48, 58, 68, 78, 88, e 108, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido como em comparação com SEQ ID n^os: 3, 23, 38, 48, 58, 68, 78, 88, e 108; (c) uma região CDR3 de Vh compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID n^os: 4, 24, 39, 49, 59, 69, 79, 89, e 109, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido como em comparação com SEQ ID n^os: 4, 24, 39, 49, 59,

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69, 79, 89, e 109; (d) uma região CDR1 de Vl compreendendo uma sequência selecionada de aminoácido do grupo que consiste em SEQ ID n^os: 5, 25, 28, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 93, 96, e 110, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido como em comparação com SEQ ID n^os: 5, 25, 28, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 93, 96, e 110; (e) uma região CDR2 de Vl compreendendo uma sequência selecionada de aminoácido do grupo que consiste em SEQ ID n^os: 6, 26, 29, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 94, 97, e 111, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido como em comparação com SEQ ID n^os: 6, 26, 29, 41,51,61,71,81,91,94, 97, e 111; e (f) uma região CDR3 de Vl compreendendo uma sequência selecionada de aminoácido do grupo que consiste em SEQ ID n^os: 7, 27, 30, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 95, 98, e 102, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácido como em comparação com SEQ ID n^os: 7, 27, 30, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 95, 98, e 102.

[00526] Os resíduos de metionina nas CDRs de anticorpos podem ser oxidados, resultando em degradação química potencial e redução consequente em potência do anticorpo. Consequentemente, são também fornecidos anticorpos anti-a-sinucleína que têm um ou mais resíduos de metionina nas CDRs de cadeia pesada e/ou leve substituídas com resíduos de aminoácido que não sofre degradação oxidativa.

[00527] Similarmente, os sítios de desamidação podem ser removidos de anticorpos anti-a-sinucleína, particularmente nas CDRs. Fcs e Fcs modificada [00528] As regiões variáveis de anticorpo anti-a-sinucleína descritas aqui podem ser ligadas (por exemplo, covalentemente ou fundidas) a

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97/252 um Fc, por exemplo, um Fc de lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4, que pode ser de qualquer alotipo ou isoalotipo, por exemplo, para lgG1: G1m, G1m1(a), G1m2(x), G1m3(f), G1m17(z); for lgG2: G2m, G2m23(n); para lgG3: G3m, G3m21(g1), G3m28(g5), G3m11(b0), G3m5(b1), G3m13(b3), G3m14(b4), G3m10(b5), G3m15(s), G3m16(t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u), G3m27(v); e para K: Km, Km1, Km2, Km3 (see, por exemplo, Jefferies et al. (2009) mAbs 1:1).

[00529] Em certas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína têm um receptor de Fc sem, ou com reduzida, ligação de FcR, por exemplo, ligação reduzida a FcRs de ativação.

[00530] Em certas modalidades, as regiões variáveis de anticorpo anti-a-sinucleína descritas aqui são ligadas a Fc menos efetor ou, na maioria das vezes, menos efetor, por exemplo, lgG2 ou lgG4.

[00531] Geralemnte, as regiões variáveis descritas aqui podem ser ligadas a um Fc compreendendo uma ou mais modificação, tipicamente, para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticpro, tais como meia-vida sérica, fixação de compemento, ligação de receptor de Fc, e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno. Além disso, um anticrpo descrito aqui pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais propriedades químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar sua glicosilação, para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cadas destas modalidades é descrita com maior detalhe abaixo. A numeração de resíduos na região de Fc é aquela do índice EU de Kabat.

[00532] A região de Fc abrange domínios derivados da região constante de uma imunoglobulina, preferivelmente uma imunoglobulina humana, incluindo um fragmento, análogo, variante, mutante ou derivado da região constante. As imunoglobulinas incluem lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, e outras classes tais como IgA, IgD, IgE e

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IgM. A região constante de uma imunoglobulina é definida como um polipeptídeo de ocorrência natural ou sistematicamente produzido homólogo à região de terminal de C da imunoglobulina, e pode incluir um domínio de CH1, uma articulação, um domínio de CH2, um domínio de CH3, ou um domínio de CH4, separadamente ou em combinação.

[00533] A região constante de uma imunoglobulina é responsável por muitas funções de anticorpo importantes, incluindo ligação de receptor de Fc (FcR) e fixação de complemento. Existem cinco classes principais de região constante de cadeia pesada, classificadas como IgA, IgG, IgD, IgE, IgM, cada com funções efetoras caractrísticas designadas por isotipo. Por exemplo, a IgG é separada em quatro subclasses conhecidas como lgG1, lgG2, lgG3, e lgG4.

[00534] As moléculas de Ig interagem com múltiplas classes de receptores celulares. Por exemplo, as moléculas de IgG interagem com três classes de receptor de Fey (FcyR) específicas para a classe de IgG de anticorpo, isto é, FcyRI, FcyRII, e FcyRIII. As sequências importantes para a ligação da IgG aos receptores de FcyR foram foram relatadas estarem localizadas nos domínios de CH2 e CH3. A meia-vida sérica de um anticorpo é influenciada pela capacidade de aqueles anticorpo ligar-se a um receptor de Fc (FcR).

[00535] Em certas modalidades, a região de Fc é uma região de Fc variante, por exemplo, uma sequência de Fc que foi modificada (por exemplo, por substituição, deleção e/ou inserção de aminoácido) em relação a uma sequência de Fc origem (por exemplo, um polipeptídeo de Fc não modificado que é subsequentemente modificado para gerar uma variante), para fornecer atividade biológica/aspectos estruturais desejados.

[00536] Por exemplo, alguém pode fazer modificações na região de Fc para gerar uma variante de Fc que (a) tem citotoxicidade mediada

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99/252 por célula dependente de anticorpo (ADCC), (b) tem citotoxicidade mediada por complemento (CDC), (c) tem afinidade diminuída com C1q e/ou (d) tem afinidade diminuída com um receptor de Fc em relação ao Fc origem. Tais variantes de região de Fc geralmente compreenderão pelo menos uma modificação de aminoácido na região de Fc. Acredita-se que a combinação de modificações de aminoácido seja particularmente desejável. Por exemplo, a região de Fc variante pode incluir dois, três, quatro, cinco, etc. substituições nesta, por exemplo, das posições específicas da região de Fc identificadas aqui. [00537] Uma região de Fc variante pode também compreender uma alteração de sequência em que os aminoácidos envolvidos na formação de ligação de dissulfeto são removidos ou substituídos com outros aminoácidos. Tal remoção pode evitar a reação com outras proteínas contendo cisteína presentes na célula hospedeira usada para produzir os anticorpos descritos aqui. Mesmo quando os resíduos de cisteína são removidos, os domínios de Fc de cadeia única podem ainda formar um domínio de Fc dimérico que é mantido junto não covalentemente. Em outras modalidades, a região de Fc pode ser modificada para que se a torne mais compatível com uma célula hospedeira selecionada. Por exemplo, alguém pode remover a sequência de PA próxima do terminal de N de uma região de Fc nativa típica, que pode ser reconhecida por uma enzima digestive em E. coli tal como prolina iminopeptidase. Em outras modalidades, um ou mais sítios de glicosilação dentro do domínio de Fc podem ser removidos. Os resíduos que são tipicamente glicosilados (por exemplo, asparagina) podem conferir resposta citolítica. Tais resíduos podem ser deletados ou substituídos com resíduos não glicosilados (por exemplo, alanina). Em outras modalidades, os sítios evolvidos na interação com complemento, tal como o sítio de ligação de C1q, podem ser removidos da região de Fc. Por exemplo, alguém pode

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100/252 deletar ou substituir a sequência EKK de lgG1 humana. Em certas modalidades, os sítios que afetam a ligação a receptores de Fc podem ser removidos, preferivelmente os sítios diferentes de sítios de ligação de receptor selvagem. Em outras modalidades, uma região de Fc pode ser modificada para remover um sítio de ADCC. Os sítios de ADCC são conhecidos na técnica; veja, por exemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) em relação aos sítios de ADCC em lgG1. Os exemplos específicos de domínios de Fc variantes são descritos, por exemplo, em WO 97/34631 e WO 96/32478.

[00538] Em uma modalidade, a região de articulação de Fc é modificada de tal forma que o número de resíduo de cisteína na região de aritulação seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Este método é descrito também na Patente dos Estados Unidos n^Q5.677.425 por Bodmer et al. O Número de resíduos de cisteína na região de articulação de Fc é alterado para, por exemplo, facilitar a montagem das cadeias leves e pesadas ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo. Em uma modalidade, a região de articulação de Fc de um anticorpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácido são introduzidas na região de interface de domínio de CH2-CH3 do fragmento de articulação de Fc, de tal forma que o anticorpo tenha ligação de proteína A de estafilococo (SpA) prejudicada em relação à ligação de SpA de domínio de articulação de Fc nativa. Este método é descrito com mais detalhes na Patente dos Estados Unidos n^Q 6.165.745 por Ward etal.

[00539] Em ainda outras modalidades, a região de Fc é alterada substituindo-se pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318,

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320 e 322 podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente de tal forma que o anticorpo tenha uma afinidade alterada com um ligante efetor, porém retenha a capacidade de ligação de antígeno do anticorpo origem. O ligante efetor ao qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor de Fc ou o componente de C1 do complemento. Este método é descrito com mais detalhe nas patentes dos Estados Unidos n^os 5.624.821 e 5.648.260, ambas por Winter et al.

[00540] Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácido 329, 331 e 322 podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente de tal forma que o anticorpo tenha ligação de C1q alterada e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) reduzida ou abolida. Este método é descrito com mais detalhe na Patente dos Estados Unidos rí 6.194.551 por Idusogie et al.

[00541] Em outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido dentro das posições de aminoácido 231 e 239 são alterados para, desse modo, alterar a capacidade do anticorpo fixar o complemento. Este método é descrito também na Publicação PCT WO 94/29351 por Bodmer et al.

[00542] Outras modificações de Fc que podem ser feitas nos Fcs são aquelas para redução ou ablação de ligação às proteínas de FcyR e/ou complemento, desse modo reduzindo ou ablando as funções efetoras mediadas por Fc tais como ADCC, ADCP, e CDC. As modificações exemplares incluem, porém não são limitadas a, substituições, inserções, e deleções nas posições 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325, e 328, em que a numeração é de acordo com o índice EU. As substituições exemplares incluem, porém não são limitadas a, 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325L, e 328R, em que a numeração é de acordo com o índice EU. Uma variante de Fc pode

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102/252 compreender 236R/328R. Outras modificações para redução de FcyR e interações de complemento incluem as substituições 297A, 234A, 235A, 237A, 318A, 228P, 236E, 268Q, 309L, 330S, 331 S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233P, e 234V, bem como remoção da glicosilação na posição 297 por meios mutacionais ou enzimáticos ou pela produção em organismos tais como bactérias que não glicosilam proteínas. Estas e outras modificações são revistas no Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691.

[00543] Opcionalmente, a região de Fc pode compreender um resíduo de aminoácido não de ocorrência natural em posições adicionais eqou alternativas conhecidas por alguém versado na técnica (veja, por exemplo, as patentes dos Estados Unidos n^os5.624.821; 6.277.375; 6.737.056; 6.194.551; 7.317.091; 8.101.720; publicações de Patente PCT WO 00/42072; WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 e WO 06/020114).

[00544] As afinidades e propriedades de ligação de uma região de Fc com seu ligante podem ser determinadas por vários métodos de ensaio in vitro (ensaios baseados bioquímicos ou imunológicos) conhecidos na técnica que inclui, porém não é limitada a, métodos de equilíbrio (por exemplo, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), ou radioimunoensaio (RIA)), ou cinética (por exemplo, análise de BIACORE), e outros métodos tais como ensaios de ligação indireta, ensaios de inibição competitivos, transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), eletroforese de gel e cromatografia (por exemplo, filtração em gel). Estes e outros métodos podem utilizar um rótulo em um ou mais dos componentes sendo examinados e/ou empregar vários métodos de detecção, incluindo, porém não limitados a, rótulos homogênicos, fluorescentes,

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103/252 luminescentes ou isotópicos. Uma descrição detalhada das afinidades e cinética de ligação pode ser encontrada em Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4- Edição, Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), que focaliza nas interações anticorpo-imunógeno.

[00545] Em certas modalidades, o anticorpo é modificado para criar sua meia-vida biológica. Vários métodos são possíveis. Por exemplo, este pode ser feito aumentando-se a afinidade de ligação da região de Fc com FcRn. Por exemplo, um ou mais dos seguintes resíduos podem ser mutados: 252, 254, 256, 433, 435, 436, como descrito na patente dos Estados n^Q 6.277.375. As substituições exemplares específicas incluem um ou mais das seguintes: T252L, T254S, e/ou T256F. Alternativamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região de CH1 ou CL para conter um epítopo de ligação de receptor selvagem tomado de duas alças de um domínio de CH2 de uma região de Fc de uma IgG, como descrito nas patentes dos Estados Unidos n^os 5.869.046 e 6.121.022 por Presta et al. Outras variantes exemplares que aumentam a ligação a FcRn e/ou melhora as propriedades farmacocinéticas incluem substituições nas posições 259, 308, 428, e 434, incluindo, por exemplo, 259I, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y, e 434M. Outras variantes que aumentam a ligação de Fc a FcRn incluem: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 307Q, 31 1 A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 31 1 S, 433R, 433S, 433I, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E,

433K/434F/436H, 308T/309P/311S (Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of

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Biological Chemistry 281:23514-23524). Outras modificações para modulação de ligação de FcRn são descritas em Yeung et al., 2010, J Immunol, 182:7663-7671. Em certas modalidades, isotipos de IgG híbridos com características biológicas particulares podem ser usados. Por exemplo, uma variante híbrida de lgG1/lgG3 pode ser contruída substituindo-se as posições de IgG 1 na região de CH2 e/ou CH3 pelos aminoácidos de lgG3 nas posições onde os dois isotipos diferenciamse. Desse modo, um anticorpo IgG variante híbrido pode ser contruído, o qual compreende uma ou mais substituições, por exemplo, 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 4221, 435R, e 436F. Em outras modalidades descritas aqui, uma variante híbrida de lgG1/lgG2 pode ser construída substituindo-se posições de lgG2 na região de CH2 e/ou CH3 com aminoácidos de IgG 1 nas posições onde os dois isotipos diferem-se. Desse modo, um anticorpo IgG variante híbrido pode ser construído, o qual compreende uma ou mais substituições, por exemplo, uma ou mais das seguintes substituições de aminoácido: 233E, 234L, 235L, -236G (que se referem a uma inserção de uma glicina na posição 236), e 327A.

[00546] Em certas modalidades, um Fc é escolhido, o qual tem ligação reduzida a FcyRs. Um Fc exemplar, por exemplo, Fc de lgG1, com ligação de FcyR reduzida compreende as seguintes três substituições de aminoácido: L234A, L235E e G237A. Este Fc de IgG 1 mutante é referido aqui como lgG1.3f.

[00547] Em certas modalidades, um Fc é escolhido, o qual tem fixação de complemento reduzida. Um fragmento exemplar, por exemplo, Fc de lgG1, com fixação de complemento reduzida, tem as seguintes duas substituições de aminoácido: A330S e P331S.

[00548] Em certas modalidades, um Fc é escolhido, o qual não tem essencialmente nenhuma função efetora, isto é, tem ligação reduzida a FcyRs e fixação de complemento reduzida. Um fragmento exemplar,

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105/252 por exemplo, Fc de lgG1, que é menos efetor, compreende as seguintes cinco mutações: L234A, L235E, G237A, A330S e P331S.

[00549] Quando usando um domínio constante de lgG4, é geralmente preferível incluir a substituição S228P, que mimetiza a sequência de articulação em lgG1 e, desse modo, estabiliza as moléculas de lgG4.

[00550] Em ainda outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser feito (isto é, o anticorpo sem glicosilação). A glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo para antígeno. Tais modificações de carboidrato podem ser acompanhadas por, por exemplo, alteração de um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência de anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácido podem ser feitas, as quais resultam na eliminação de um ou mais sítios de glicosilação de estrutura de região variável para, desse modo, eliminar a glicosilação naquele sítio. Tal glicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo com o antígeno. Tal método é descrito com mais detalhe na Patente dos Estados Unidos n^os5.714.350 e 6.350.861 por Co etal.

[00551] A glicosilação da região constante em N297 pode ser prevenida mutando-seo resíduo de N297 para outro resíduo, por exemplo, N297A, e/ou mutando-se um aminoácido adjacente, por exemplo, 298 para, desse modo, reduzir a glicosilação em N297.

[00552] Adicionalmente ou alternativamente, pode ser feito um anticorpo que tenha um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos de fucosila ou um anticorpo tendo estruturas de GlcNac bissecantes aumentadas. Tais padrões de glicosilação alterados foram demonstrados aumentar a capacidade de ADCC de anticorpos. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo,

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106/252 expressando-se o anticorpo em uma célula hospedeira com maquinaria de glicosilação alterada. As células com maquinaria de glicosilação alterada foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras para expressar anticorpos recombinantes descritos aqui para, desse modo, produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, EP 1.176.195 por Hanai et al. descreve uma linhagem de célula com um gene FUT8 funcionalmente interrompido, que codifica uma fucosil transferase, de tal forma que os anticorpos expressos em tal linhagem de célula exibam hipofucosilação. A Publicação PCT WO 03/035835 por Presta descreve uma linhagem de célula de CHO variante, células de Led3, com capacidade reduzida de ligar fucose a carboidratos ligados a Asn(297), também resultando em hipofucosilação de anticorpos expressos expressos naquela célula hospedeira (veja também Shields, R.L. etal. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740)· A Publicação PCT WO 99/54342 por Umana et al. descreve linhagens de célula criadas para expresser glicosil transferases de modificação de glicoproteína (por exemplo, beta(1,4)-N-acetilglicosaminiltransferase III (GnTIH)) de tal forma que os anticorpos expressos nas linhagens de célula criadas exibem estruturas de GlcNac bissecantes aumentadas que resultam em atividade de ADCC aumentada dos anticorpos (veja também Umana etal. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180).

[00553] Outra modificação dos anticorpos descritos aqui é pegilação. Um anticorpo pode ser pegilado para, por exemplo, aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para pegilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento do mesmo, tipicamente é reagido com polietileno glicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivado de aldeído de PEG, sob condições em que um ou mais grupos de PEG tornam-se ligados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. Preferivelmente, a pegilação é realizada por meio de uma

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107/252 reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Como usado aqui, o termo polietileno glicol é destinado a abranger qualquer das formas de PEG que foram usados para derivar outras proteínas, tal como mono (C1-C10) alcóxi- ou arilóxi-polietileno glicol ou polietileno glicol-maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser pegilado é um anticorpo aglicosilado. Os métodos para pegilação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos descritos aqui. Eja, por exemplo, EP 0 154 316 por Nishimura et al. e EP 0 401 384 por Ishikawa et al.

VII. Moléculas de Ácido Nucleico [00554] Outro aspecto descrito aqui pertence a moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui. Os ácidos nucleico podem ser presentes em células totais, em um lisado de célula, ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é isolado ou tornado substancialmente puro quando purificado longe de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares (por exemplo, outro DNA cromossômico, por exemplo, o DNA cromossômico que é ligado ao DNA isolado na natureza) ou proteínas, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandagem de CsCI, cromatografia de coluna, enzimas de restrição, eletroforese de gel de agarose e outros bem conhecidos na técnica. Veja, F. Ausubel, et al., edição. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nova Iorque. Um ácido nucleico descrito aqui pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou não conter sequências intrônicas. Em certas modalidades, o ácido nucleico é uma molécula de cDNA.

[00555] Os ácidos nucleicos descritos aqui podem ser obtidos usando técnicas de biologia molecular padrão. Para os anticorpos

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108/252 expressos por hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados de camundongos transgênicos que transportam genes de imunoglobulina humana como descrito também abaixo), os cDNAs que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo feito pelo hibridoma podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão ou técnicas de clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos de uma biblioteca de gene de imunoglobulina (por exemplo, usando técnicas de exibição de fago), ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser recuperado da biblioteca.

[00556] As moléculas de ácidos nucleicos preferidas descritas aqui são aquelas que codificam as sequências de VH e VL dos anticorpos monoclonais de 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11,2E2, 23H8-1,23H8-2, 23H8-3, e 1E8 (veja, por exemplo, a Tabela 22).

[00557] Um método para preparação de anticorpos anti-a-sinucleína pode compreender expressão da cadeia pesada e das cadeias leves em uma linhagem de célula compreendendo as sequências de nucleotídeo que codificam as cadeias pesadas e leves, respectivamente. As células hospedeiras compreendendo aquelas sequências de nucleotídeo (por exemplo, vetores compreendendo estas sequências de nucleotídeo) são abrangidas aqui.

[00558] Uma vez que os fragmentos de DNA que codificam os segmentos de VH e VL são obtidos, estes fragmentos de DNA podem ser também manipulados por técnicas de DNA recombinante padrão, por exemplo, para converter os genes de região variável em genes de cadeia de anticorpo de tamanho natural, em genes de fragmento de Fab ou em um gene de scFv. Nestas manipulações, um fragmento de DNA de codificação de VH ou VL é operativamente ligado a outro fragmento de DNA que codifica outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. O termo operativamente

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109/252 ligado, como usado neste contexto, é destinado a significar que os dois fragmentos de DNA são ligados de tal forma que as sequências de aminoácido codificadas pelos dois fragmentos de DNA permanecem na estrutura.

[00559] O DNA isolado que codifica a região de VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de tamanho natural operativamente ligando-se o DNA de codificação de VH a outra molécula de DNA que codifica as regiões constantes de cadeia pesada (articulação, CH1, CH2 e/ou CH3). As sequências de genes de região constante de cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH n^Q 91-3242) e fragmentos de DNA que abrangem estas regiões podem ser obtidas por amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, por exemplo, uma região de lgG1. Para um gene de cadeia pesada de fragmento de Fab, o DNA de codificação de VH pode ser operativamente ligado a outra molécula de DNA que codifica apenas a região de CH1 de cadeia pesada.

[00560] O DNA isolado que codifica a região de VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve de tamanho natural (bem como um gene de cadeia leve de Fab) operativamente ligando-se o DNA de codificação de VL a outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeia leve, CL. As sequências de genes de região constante de cadeia leve humanas são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health e Human Services, Publicação NIH n^Q 91-3242) e os fragmentos de DNA que abrangem estas regiões podem ser obtidos por amplificação de

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PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante capa ou lambda.

[00561] Para criar um gene de scFv, os fragmentos de DNA de codificação de VH e VL são operativamente ligados a outro fragment que codifica um ligante flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácido (Gly4 -Ser)3, de tal forma que as sequências de VH e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeia única contínua, com as regiões de VL e VH ligadas pelo ligante flexível (veja, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) A/afore 348:552-554).

[00562] São também fornecidas aqui moléculas de ácido nucleico que codificam as sequências de VH e VL que são homólogas àquelas dos anticorpos monoclonais 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, e 1E8 (por exemplo, aqueles mostrados na Tabela 22). As moléculas de ácido nucleico exemplares codificam sequências de VH e VL que são pelo menos 70% idênticas, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% idênticas, às moléculas de ácido nucleico que codificam as sequências de VH e VL dos anticorpos monoclonais de 7A10, 7A10T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, e 1E8 (por exemplo, aqueles mostrados na Tabela 22). São também fornecidos aqui vetores, por exemplo, vetores de expressão que codificam os ácidos nucleicos, bem como células hospedeiras que compreendem os vetores ou ácidos nucleicos descritos acima. São também fornecidos aqui moléculas de ácido nculeico com substituições silenciosas (isto é, substituições que não alteram a sequência de aminoácido resultante na translação da molécula de ácido nucleico), por exemplo, para otimização de códon.

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VIII. Produção de Anticorpo [00563] Os anticorpos monoclonais descritos aqui podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas, tal como a técnica de hibridização de célula somática padrão descrita por Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). Embora os procedimentos de hibridização de célula somática sejam preferidos, em princípio, outras técnicas para produção de anticorpos monoclonais também podem ser empregadas, por exemplo, transformação oncogênica ou viral de linfócitos B, técnica de exibição de fago usando bibliotecas de genes de anticorpo humano. [00564] O sistema animal preferido para preparação de hibridomas é o sistema de murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabilizado. Os protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murinas) e procedimentos de fusão são bem conhecidos.

[00565] Os anticorpos quiméricos ou humanizados descritos aqui podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal murino preparado como descrito acima. O DNA que codifica as imunoglobulinas de cadeia pesada e leve pode ser obtido do hibridoma de interesse e criado para conter sequências de imunoglobulina não murino (por exemplo, humanas) sequências de imunoglobulina usando técnicas de biologia molecular padrão. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis murinas podem ser ligadas às regiões constantes humanas usando métodos conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n^Q 4.816.567 para Cabilly et al.). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR murinas podem ser inseridas em uma estrutura humana usando métodos conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n^Q 5.225.539 para Winter, e Patente dos Estados Unidos n^os 5.530.101; 5.585.089;

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5.693.762 e 6.180.370 para Queen etal.).

[00566] Em uma modalidade, os anticorpos descritos aqui são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos direcionados contra α-sinucleína podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos que tranportam partes do sistema imune humano em vez de sistema de camundongo. Estes camundongos trangênicos e transcromossômicos incluem camundongos referidos aqui como camundongos de HuMAb e camundongos de KM, respectivamente, e são coletivamente referidos aqui como camundongos de Ig humanos.

[00567] O HuMAb mouse® (Medarex, Inc.) contém minlocais de gene de imunoglobulina humanos que codificam sequências de imunoglobulina de cadeia κ leve e cadeia pesada (μ e γ) humanas não redispostas, juntamente com mutações alvejadas que inativam os locais de cadeia μ e κ endógenos (veja, por exemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Consequentemente, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM ou κ de camundongo, e, em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humanos introduzidos sofrem mudança de classe e mutação somática para gerar IgGK monoclonal humana de alta afinidade (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisado em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 1.3: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546)· A preparação e uso de camundongos de HuMab, e as modificações genômicas realizadas por tais camundongos, são também descritos em Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295: Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830;

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Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920: Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; e Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, os conteúdos de todos os quais são, desse modo, especificamente incorporados por referência em sua totalidade. Veja também, patentes dos Estados Unidos n^os5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; todas para Lonberg e Kay; Patente dos Estados Unidos n^Q 5.545.807 para Surani et al.; publicações PCT n^os WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas para Lonberg e Kay; e Publicação PCT n^Q WO 01/14424 para Korman etal.

[00568] Em certas modalidades, os anticorpos descritos aqui são aumentados usando um camundongo que transporta sequências humanas de imunoglobulina em transgenes e transcromossomos, tal como um camundongo que transporta um transgene de cadeia pesada humano e um transcromossomo de cadeia leve humano. Tais camundongos, referidos aqui como camundongos de KM, são descritos em detalhe na Publicação PCT WO 02/43478 para Ishida et al.

[00569] Ainda além disso, os sistemas animais trangênicos alternativos que expressam genes de imunoglobulina são disponíveis na técnica e podem ser usados para aumentar os anticorpos anti-asinucleína descritos aqui. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo referido como o Xenomouse (Abgenix, Inc.) pode ser usado; tais camundongos são descritos na, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n^os 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6. 150.584 e 6.162.963 para Kucherlapati etal.

[00570] Além disso, os sistemas animais transcromossômicos alternativos que expressam genes de humnoglobulina humanos são disponíveis na técnica e podem ser usados para aumentar os

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114/252 anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui. Por exemplo, os camundongos que transportam que transportam tanto um transcromossomo de cadeia pesada humano quanto um transcromossomo de cadeia leve humano, referidos como camundongos de TC podem ser usados; tais camundongos são descritos no Tomizuka etal. (2000) Proc. Natl. A’cad. Sei. USA 97:722727. Além disso, vacas que transportam transcromossomos de cadeia pesada e leve humanos foram descritas na técnica (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) e podem ser usadas para aumentar os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui.

[00571] Os sistemas de camundongos adicionais descritos na técnica para aumnetar os anticorpos humanos incluem (i) o camundongo Veloclmmune® (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), em que as regiões variáveis de cadeia pesada e leve endógenas foram substituídas, por meio de recombinação homóloga, com regiões variáveis de cadeia pesada e leve humanas, operativamente ligadas às regiões constantes de camundongo endógenas, de tal forma que os anticorpos quiméricos (humano V/camundongo C) são aumentados nos camundongos, e em seguida, subsequentemente, convertidas em anticorpos totalmente humanos usando técnicas de DNA recombinante padrão; e (ii) o camundongo MeMo® (Merus Biopharmaceuticals, Inc.), em que o camundongo contém regiões variáveis de cadeia pesada humanas não redispostas, porém uma região variável de cadeia leve comum humana redisposta única. Tais camundongos, e o uso dos mesmos para aumentar os anticorpos, são descritos em, por exemplo, WO 2009/15777, US 2010/0069614, WO 2011/072204, WO 2011/097603, WO 2011/163311, WO 2011/163314, WO 2012/148873, US 2012/0070861 e US 2012/0073004.

[00572] Os anticorpos monoclonais humanos descritos aqui podem também ser preparados usando métodos de exibição de fago para

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115/252 análise de bibliotecas de genes de imunoglobulina humanos. Tais métodos de exibição de fago para isolamento de anticorpos humanos são estabelecidas na técnica. Veja, por exemplo: patentes dos Estados Unidos n^os 5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 para Ladner et al.; patentes dos Estados Unidos n^os 5.427.908 e 5.580.717 para Dower et al.; patentes dos Estados Unidos n^os 5.969.108 e 6.172.197 para McCafferty et al.; e Patente dos Estados Unidos n^os 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081 para Griffiths et al.

[00573] Os anticorpos monoclonais humanos descritos aqui podem também ser preparados usando camundongos SCID em que células imunes humanas foram reconstituídas de tal forma que uma resposta de anticorpo humano pode ser gerada na imunização. Tais camundongos são descritos nas, por exemplo, patentes dos Estados Unidos n^os 5.476.996 e 5.698.767 para Wilson etal.

Imunizações [00574] Para gerar anticorpos totalmente humanos para asinucleína, camundongos transgênicos ou transcromossômicos contendo genes de imunoglobulina humanos (por exemplo, camundongos HCo12, HCo7 ou KM) podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida do antígeno de α-sinucleína e/ou células que expressam α-sinucleína ou fragmento da mesma, como descrito para outros antígenos, por exemplo, por Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 e WO 98/24884. Por exemplo, em uma modalidade, os camundongos são imunizados com aSyn WT humana recombinante. Em outra modalidade, os camundongos são imunizados com proteína mutante aSyn A53T-PFF. Em outra modalidade, os camundongos são imunizados com aSyn WT-PFF. Em outra modalidade, os camundongos são imunizados com aSyn WT de

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116/252 ligação cruzada. Em outra modalidade, os camundongos são imunizados com A53T PFF de ligação cruzada. Em outra modalidade, os camundongos são imunizados com uma mistura de aSyn WT-PFF, aSyn A53T-PFF, aSyn WT-PFF de ligação cruzada, e aSyn A53T-PFF de ligação cruzada. Alternativamente, os camundogns podem ser imunizados com DNA que codifica a α-sinucleína humana ou fragmenta da mesma. Preferivelmente, os camundongos terão de 6 a 16 semanas de idade na primeira infusão. Por exemplo, uma preparação purificada ou enriquecida (5 a 50 pg) do antigeno de asinucleína recombinante pode ser usada para imunizar os camundongos HuMAb intraperitonealmente. No evento em que as imunizações usando uma preparação purificada ou enriquecida do antigeno de α-sinucleína não resultarem em anticorpos, os camundongos podem também ser imunizados com células que expressam α-sinucleína, por exemplo, uma linhagem de célula, para promover respostas imunes. As linhagens de célula exemplares incluem linhagens de célula de CHO e Raji estáveis de superexpressão de a-sinucleína.

[00575] A experiência cumulativa com vários antígenos mostraram que os camundongos transgênicos de HuMAb respondem melhor quando inicialmente intraperitonealmente (IP) ou subcutaneamente (SC) imunizados com antigeno em adjuvante de Ribi, seguido por imunizações IP/SC a cada duas semanas (até um total de 10) com antigeno em adjuvante de Ribi. A resposta imune pode ser monitorada durante o curso do protocol de imunização com as amostras de plasma sendo obtidas por sangramentos retroorbitais. O plasma pode ser analisado por ELISA e FACS (como descrito abaixo), e os camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina humana antia-sinucleína podem ser usados para infusões. Os camundongos podem ser reforçados intravenosamente com antigeno 3 dias antes do

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117/252 sacrifício e remoção dos baço e linfonodos. Espera-se que de 2 a 3 fusões para cada imunização precisem ser realizadas. Entre 6 e 24 camundongos são tipicamente imunizados para cada antigeno. Geralmente, as linhagens de HCo7, HCo12, e KM são usadas. Além disso, tanto HCo7 quanto HCo12 transgene podem ser criados juntos em um camundongo único tendo dois transgenes de cadeia pesada humanos diferentes (HCo7/HCo12).

Geração de Hibridomas que Produzem Anticorpos Monoclonais para a-sinucleína [00576] Para gerar hibridomas que produzem os anticorpos monoclonais humanos descritos aqui, esplenócitos e/ou células de linfonodo de camundongos imunizados podem ser isoladas e fundidas a uma linhagem de célula imortalizada apropriada, tal como uma linhagem celular de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem ser analisados para a produção de anticorpos específicos de antigeno. Por exemplo, suspensões de célula única de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados podem ser fundidas a células de mieloma de camundongo não secretoras Sp2/0 (ATCC, CRL 1581) com 50% de células de PEG. As células são banhadas em aproximadamente 2 x 10⁵ em placa de microtítulo de fundo plano, seguido de uma incubação de duas semanas em meio seletivo contendo 10% de Soro de Clone fetal, 18% de meio condicionado por 653, 5% de origem (IGEN), L-glutamina a 4 mM, piruvato de sódio a 1 mM, HEPES a 5 mM, 2-mercaptoetanol a 0,055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina e 1X HAT (Sigma). Após aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadas no meio em que HAT é substituído por HT. As células individuais podem em seguida ser analisadas por ELISA quanto aos anticorpos IgG e IgM monoclonais humanos. Uma vez que o crescimento de hibridoma extensivo ocorre, o meio pode ser

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118/252 observado geralmente após 10 a 14 dias. Os hibridomas secretores de anticorpo podem ser semeados, analisados novamente, e, se ainda positivos para IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes por diluição limitante. Os subclones estáveis podem em seguida ser cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo no meio de cultura do tecido para caracterização.

[00577] Para purificar os anticorpos monoclonais humanos, os hibridomas selecionados podem ser desenvolvidos em frasconetes giratórios de dois litros para purificação de anticorpo monoclonal. Os suplementos podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A sefarose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). A IgG eluída pode ser verificada por eletroforese de gel e cromatografia líquida de alto desempenho para assegurar a pureza. A solução de tampão pode ser permutada em PBS, e a concentração pode ser determinada por OD280 usando coeficiente de extinção 1.43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80° C.

Geração de Transfectomas que Produzem Anticorpos Monoclonais para a-sinucleína [00578] Os anticorpos podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinantes e métodos de transfecção de gene é bem conhecida na técnica (Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

[00579] Por exemplo, para expressar anticorpos, ou fragmento de anticorpos dos mesmos, os DNAs que codificam as cadeias pesadas e leves de tamanho natural ou parciais podem ser obtidos por técnicas de biologia molecular padrão (por exemplo, amplificação de PCR ou clonagem de cDNA usando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse) e os DNAs podem ser inseridos em vetores de expressão

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119/252 de tai forma que os genes sjam operativamente ligados às sequências de controle transcricionais e tranlacionais. Neste contexto, o termo operativamente ligado é destinado a significar que um gene de anticorpo é ligado em um vetor de tal forma que as sequências de controle transcricionais e translacionais dentro do vetor sirvam à sua função destinada de regulação da transcrição e translação do gene de anticorpo. O vetor de expressão e as sequências de controle de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos no vetor de forma separada ou ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de são inseridos no(s) vetor(es) de expressão por métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no vetor e fragmento de gene de anticorpo, ou ligação de exgtremidade cega se nenhum sítio de restrição estiver presente). As regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos descritos aqui podem ser usadas para criar genes de anticorpo de tamanho natural de qualquer isotipo de anticorpo inserindo-as em vetores de expressão já codificando as regiões constantes de cadeia pesada e constantes de cadeia leve do isotipo desejado de tal forma que o segmento de Vh seja operativamente ligado ao(s) segment(s) de Ch dentro do vetor do e do segmento de Vl seja operativamente ligado ao segmento de Cl dentro do vetor.

[00580] Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo de sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vector de tal forma que o peptídeo de sinal seja ligado, no quadro, ao término de amino do gene de cadeia de anticorpo. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterogêneo (isto é,

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120/252 um peptídeo de sinal de uma proteína não imunoglobulina).

[00581] Além do agente de cadeia de anticorpos, os vetores de expressão recombinantes pode transportar sequências reguladoras que controlam a expressão do gene de cadeia de anticorpos em uma célula hospedeira. O termo sequência regular é destinado a incluir promotores, realçadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou translação do gene de cadeia de anticorpos. Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, no Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Apreciar-se-á, por aqueles versados na técnica, que o planejamento do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências reguladoras, pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, etc. As sequências reguladoras preferidas para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteína em células de mamífero, tais como promotores e/ou realçadores derivados de citomegalovírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40), adenovirus, (por exemplo, o principal promotor tardio de adenovirus (AdMLP)) e polioma. Alternativamente, sequências reguladoras não virais podem ser usados, tal como o promotor de ubiquitina ou promotor de βglobina. Ainda além disso, os elementos reguladores compostos de sequências de diferentes fontes, tal como o sistema de promotor de SRa, que contém sequências iniciais do promotor de SV40 e da repetição terminal longa do vírus tipo 1 de leucemia de células T humanas (Takebe, Y. etal. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

[00582] Além do agente de cadeia de anticorpos e das sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes podem transportar sequências adicionais, tais como sequências que regulam

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121/252 a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras em que o vetor foi introduzido (veja, por exemplo, patentes dos Estados Unidos 4.399.216. 4.634.665 e 5.179.017, todas por Axel etal.). Por exemplo, tipicamente, o gene marcador selecionável confere resistência aos fármacos, tal como G418, higromicina ou metotrexato, emu ma célula hospedeira em que o vetor foi introduzido. Os genes marcadores selecionáveis preferíveis incluem o gene de diidrofalato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras de dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o neo gene (para seleção de G418).

[00583] Para expressão das cadeias leves e pesadas, o(s) vetor(es) de expressão que codifica(m) as cadeias pesadas e leves é(são) transfectado(s) em uma célula hospedeira por técnicas padrão. As várias formas do termo transfecção são destinadas a abranger uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroevaporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção por DEAE-dextrano e similares. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos descritos aqui em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas, e mais preferivelmente células hospedeiras de mamífero, é a mais preferida porque tais células eucarióticas, e em particular células de mamífero, são mais prováveis do que células procarióticas de montar e secretar um anticorpo devidamente duplicado e imunologicamente ativo. A expressão procariótica de genes de anticorpo foi reportada ser ineficaz para produção de altas produções de anticorpo ativo (Boss, M. A. e Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

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122/252 [00584] As células hospedeiras de mamífero preferidas para expressão dos anticorpos recombinantes descritos aqui incluem Ovário de Hamster Chinês (células de CHO) (incluindo células de CHO de dhfr, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220, usadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, como descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. /59:601-621), células do mieloma NSO, células COS e células SP2. Em particular, para uso com células do mieloma NSO, outro sistema de expressão preferido é o sistema de expressão de gene GS descrito em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338.841. quando vetores de expressão recombinantes que codificam os genes de anticorpo são introduzidos nas células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos cultivando-se as células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são desenvolvidas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos de purificação de proteína padrão.

IX. Ensaios [00585] Os anticorpos descritos aqui podem ser testados quanto à ligação à α-sinucleína por, por exemplo, ELISA padrão, usando técnicas padrão, tais como aquelas descritas nos exemplos.

[00586] Um ensaio ELISA como descrito acima pode ser usado para analisar anticorpos e, desse modo, hibridomas que produzem anticorpos que mostram atvividade positiva com o imunógeno de asinucleína imunógeno. Os hibridomas que produzem anticorpos que se ligam, preferivelmente com alta afinidade, à α-sinucleína podem em seguida ser subclonados e também caracterizados. Um clone de cada hibridoma, que retém a reatividade das células origem (por ELISA), pode em seguida ser escolhido para fazer um baco de células, e para

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123/252 purificação de anticorpo.

[00587] Para determinar se os anticorpos anti-a-sinucleína monoclonais selecionados ligam-se a epítopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado usando reagentes comercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, IL). A ligação de MAb biotinilado pode ser detectada com uma sonda rotulada de estreptavidina. Os estudos de competição usando anticorpos monoclonais não rotulados e anticorpos monoclonais biotinilados podem ser realizados usando placas de ELISA revestido de α-sinucleína como descrito acima.

[00588] As técnicas para avaliação da competição entre os anticorpos incluem, por exemplo, um imunoensaio, que mostra a capacidade de um anticorpo bloquear (ou não bloquear) a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo, isto é, um ensaio de ligação competitiva. A ligação competitiva é determinada em um ensaio em que a imunoglobulina sob teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum, tal como a-sinucleína. Vários tipos de ensaios de ligação competitivos são conhecidos, por exemplo: radioimunoensaio direto ou indireto de fase sólida (RIA), imunoensaio de enzima direto ou indireto de fase sólida (EIA), ensaio de competição sanduíche; EIA de biotina-avidina direto de fase sólida; ensaio rotulado direto de fase sólida, ensaio sanduíche rotulado direto de fase sólida; RIA rotulado ¹²⁵l direto de fase sólida; EIA de biotinaavidina direto de fase sólida; e RIA rotulado direto. A ressonância plasmônica de superfície pode também ser usada para este propósito. Tipicamente, tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células que transportam quaisquer destes, uma imunoglobulina de teste não rotulada, e uma imunoglobulina de referência rotulada. A inibição competitive é medida determinando-se a quantidade de rótulo ligada à superfície sólida ou células na presença da imunoglobulina de teste. A imunoglobulina de teste é tipicamente

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124/252 presente em excesso. Geralmente, quando um anticorpo de competição está presente em excesso, ele inibirá a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais.

[00589] Outras técnicas de análise para determinação do epítopo ligado pelo anticorpos descrito aqui incluem, por exemplo, análise de raio x de cristais de complexos antígeno:anticorpo, que fornecem resolução atômica do epítopo. Outros métodos monitoram a ligação do anticorpo aos fragmentos de antígeno ou variações mutadas do antígeno, em que a perda de ligação devido a uma modificação de um resíduo de aminoácido dentro da sequência de antígeno é frequentemente considerada uma indicação de um componente de epítopo. Além disso, os métodos combinatoriais computacionais para mapeamento de epítopo podem também ser usados. Estes métodos dependem da capacidade do anticorpo de interesse de isolar por afinidade peptídeos curtos específicos de bibliotecas de peptídeo de exibição de fago combinatório. Os peptídeos são em seguida registrados como condutores para a definição do epítopo que corresponde ao anticorpo usado para analisar a biblioteca de peptídeo. Para o mapeamento de epítopo, os algoritmos computacionais foram também desenvolvidos, os quais foram mostrados mapear os epitopos descontínuos confromacionais.

[00590] Para determinar o isótipo dos anticorpos purificados, os ELISAs de isótipo podem ser realizados usando reagentes específicos aos anticorpos de um isótipo particular.

[00591] Os anticorpos anti-a-sinucleína podem ser também testados para reatividade com o antígeno de α-sinucleína por manchamento do Oeste. Brevemente, os extratos celulares de células

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125/252 que expressam α-sinucleína podem ser preparadis e submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida de sulfato de dodecila de sódio. Após eletroforese, os antígenos separados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com 20% de soro de camundongo, e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testadas. A ligação de IgG pode ser detectada usando fosfatase alcalina anti-IgG e desenvolvida com comprimidos de substrato de BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).

[00592] Os métodos para análise de afinidade de ligação, reatividade cruzada, e cinética de ligação de vários anticorpos anti-asinucleína incluem ensaios padrão conhecidos na técnica, por exemplo, análise de ressonância de plasmônio de superfície da Biacore™ (SPR) usando um instrumento de SPR Biacore™ 2000 (Biacore AB, Uppsala, Sweden).

[00593] Os anticorpos anti-a-sinucleína podem também ser testados quanto à sua ligação preferencial a oligômeros de asinucleína do que aos monômeros de α-sinucleína. A relação de ligação monômero/PFF é usada aqui como um índice para descrever o comportamento de ligação de anticorpos anti-a-sinucleína ao PFF e monômeros de α-sinucleína. As porporções maiores do que 1 indicam uma maior preferência pela ligação ao PFF do que monômeros de asinucleína. Por exemplo, se um anticorpo ligar-se ao a-sinucleína monomérica com um EC50 de 291 nM e PFF com um EC50 de 0,16 nM por ELISA, por exemplo, como descrito no Exemplo 3, a relação de ligação monômero/PFF da qual o anticorpo seria 291/0,16 = 1819. Em algumas modalidades, PFF é preparado de acordo com o método descrito no Exemplo 3.

[00594] Os anticorpos anti-a-sinucleína podem ser testados quanto à sua capacidade de limpar os agregados de oligômeros de asinucleína no cérebro usando, por exemplo, os ensaios descritos no

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Exemplo 11, ou os ELISAs de oligômero descritos no Exemplo 12. Os anticorpos podem também ser testados quanto à sua capacidade de reduzir ou inibir o oligômero de α-sinucleína (PFF) de S129 de asinucleína usando, por exemplo, os métodos descritos nos exemplos 10 e 11, ou a capacidade de esgotar as espécies moleculares que produzem agregados de α-sinucleína insolúveis (por exemplo, agregados de α-sinucleína fosforilados em serina-129) de PFF e/ou lisado cerebral preparado de pacientes com agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro (por exemplo, lisados cerebrais preparados de pacientes patients com sinucleinopatias, por exemplo, MSA).

X. Imunoconjugados, Derivados de Anticorpo e Diagnósticos [00595] Os anticorpos descritos aqui podem ser usados para propósitos de diagnóstico, incluindo teste de amostra e imageamento in vivo, e para este propósito o anticorpo (ou fragmento de ligação do mesmo) pode ser conjugado a um agente detectável apropriado, para formar um imunoconjugado. Para propósitos diagnósticos, os agentes apropriados são rótulos detectáveis que incluem radioisótopos, para imageamento de corpo inteiro, e radioisótopos, enzimas, rótulos fluorescents e outras etiquetas de anticorpo adequadas para teste de amostra.

[00596] Os rótulos detectáveis podem ser qualquer dos vários tipos usados atualmente no campo de diagnóstico in vitro, incluindo rótulos de partículas incluindo sóis de metal tal como ouro colloidal, isótopos tal como I¹²⁵ ou Tc apresentados, por exemplo, com um agente quelante peptídico do tipo N2S2, N3S ou N4, cromóforos incluindo marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes, marcadores fosforescentes e similares, bem como rótulos de enzima que convertem um dado substrato em um marcador detectável, e etiquetas de polinucleotídeo que são revelados após amplificação tal como reação em cadeia de polimerase. Os rótulos de enzima adequados

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127/252 incluem rábano picante peroxidase, alcalino fosfatase e similares. Por exemplo, o rótulo pode ser a enzima fosfatase alcalina, detectada medindo-se a presença ou formação de quimioluminescência após conversão em substrates de 1,2 dioxetano tal como adamantil metóxi fosforilóxi fenil dioxetano (AMPPD), fosfato 3-(4-(metoxiespiro{1,2dioxetano-3,2'-(5'-chloro)triciclo{3.3.1.1 3,7}decan}-4-il) fenila dissódico (CSPD), bem como CDP e CDP-star® ou outros substrates luminescentes bem conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, os quelatos de lantanídeos adequados tal como Térbio(lll) e Európio(lll). Os meios de detecção são determinados pelo rótulo escolhido. A aparência do rótulo ou seus produtos de reação podem ser obtidos usando olho nu, no caso no qual o rótulo é particulado e se acumula em níveis apropiados, ou usando instrumentos tais como um espectrofotômetro, um luminômetro, um fluorímetro, e similares, todos de acordo com prática padrão.

[00597] Preferivelmente, os métodos de conjugação resultam em linhagens que são substancialmente (ou quase) não imunogênicos, por exemplo, linhagens de peptídeo (isto é, amida), sulfeto, (estricamente impedido), dissulfeto, hidrazona, e outras linhagens. Estas linhagens são quase não imunogênicas e mostram estabilidade rasoável dentro do soro (veja, por exemplo, Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244; WO 2009/059278; WO 95/17886).

[00598] Dependendo da natureza química da porção e do anticorpo, diferentes estratégias de conjugação podem ser empregadas. No caso da porção ser de ocorrência natural ou recombinante, dentre 50 e 500 aminoácidos, existem procedimentos padrão em livros que descrevem a química para síntese de conjugados de proteína, que podem ser facilmente seguidos pelo técnico versado (veja, por exemplo, Hackenberger, C. P. R., e Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074). Em uma modalidade, a reação de uma

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128/252 porção de maleinimida com um resíduo de cisteína dentro do anticorpo ou da porção é usada. Esta é uma química de acoplamento especialmente adequada no caso, por exemplo, de um fragmento Fab ou fragemento de Fab de um anticorpo ser usado. Alternativamente, em uma modalidade, o acoplamento à extremidade do terminal de C do anticorpo ou porção é realizado. A modificação do terminal de C de uma proteína, por exemplo, de um fragmento de Fab, pode, por exemplo, ser realizada como descrito (Sunbul, M. e Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371).

[00599] Em geral, a reação específica de sítio e acoplamento covalente são com base na transformação de um aminoácido natural em um aminoácido com uma reatividade que é orthogonal à reatividade dos outros grupos funcionais presentes. Por exemplo, uma cisteína específica dentro de um contexto de sequência raro pode ser enzimaticamente convertida em um aldeído (veja Frese, Μ. A., e Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427). É também possível obter uma modificação de aminoácido utilizando-se a reatividade enzimática específica de certas enzimas com um aminoácido natural em um contexto de sequência determinado (veja, por exemplo, Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sei. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136; e a formação catalisada por protease de ligações de C-N é usada por Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403).

[00600] A reação específica de sítio e acoplamento covalente pode também ser obtida pela reação seletiva de aminoácidos terminais com reagents de modificação apropriados.

[00601] A reatividade de uma cisteína de terminal de N com benzonitrilas (veja Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662) pode ser usada para obter um acoplamento covalente específico de sítio.

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129/252 [00602] A ligação química nativa pode também depender de resíduos de cisteína de terminal de C (Taylor, E. Vogel; Imperial!, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96).

[00603] A EP 1 074 563 descreve um método de conjugação que é com base na reação mais rápida de uma cisteína dentro de um estiramento de aminoácidos negativamente transportados com uma cisteína localizada em um estiramento de aminoácidos positivamente transportados.

[00604] A porção pode também ser um peptídeo sintético ou mímico de peptídeo. No caso de um polipeptídeo ser quimicamente sintetizado, os aminoácidos com reatividade química ortogonal podem ser incorporados durante tais síntese (veja, por exemplo, de Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295). Visto que uma grande variedade de grupos funcionais ortogonais está em jogo e pode ser introduzida em um peptídeo sintético, a conjugação de tal peptídeo a um ligante é química padrão.

[00605] Para obter um polipeptídeo monorrotulado, o conjugado com 1:1 de estereoquímica pode ser separado por cromatografia de outros subprodutos de conjugação. Este procedimento pode ser facilitado usando-se um membro do par de ligação rotulado por corante e um ligante transportado. Usando-se esta espécie de membro de par rotulado e altamente negativamente transportado, os polipeptídeos monoconjugados são facilmente separados de polipeptídeos não rotulados e polpeptídeos que transportam mais do que um ligante, visto que a diferença na carga e peso molecular pode ser usada para separação. O corante fluorescent epode ser útil para purificação do complexo de componentes não ligados, tipo um ligante monovalente rotulado.

[00606] Em uma modalidade, a porção ligada a um anticorpo anti-a

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130/252 sinucleína é selecionada do grupo que consiste em uma porção de ligação, uma porção de rotulagem, e uma porção biologicamente ativa. [00607] Os anticorpos descritos aqui podem também ser conjugadas a um agente terapêutico para formar um imunoconjugado tal como um conjugado um conjugado anticorpo-fármaco (ADC). Os agentes terapêuticos adequados incluem antimetabólitos, agentes de alquilação, ligantes de sulco menor do DNA, intercaladores de DNA, reticuladores de DNA, inibidores de histone desacetilase, inibidores de exportação nuclear, inibidores de proteassoma, inibidores de topoisomerase I ou II, inibidores de proteína de choque térmico, inibidores de tirosina cinase, antibióticos, e agentes antimitóticos. No ADC, o anticorpo e o agente terapêutico preferivelmente são conjugados por meio de um ligante clivável tal como um ligante de peptidila, dissulfeto, ou hidrazona. Mais preferivelmente, o ligante é um ligante de peptídeo tal como Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 128), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, AlaAla-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, ou Glu. Os ADCs podem ser preparados como descrito nas patentes dos Estados Unidos n^os7.087.600; 6.989.452; e 7.129.261; publicações PCT WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; e WO 08/103693; publicações de Patente dos Estados Unidos 20060024317; 20060004081; e 20060247295; as descrições das quais são incorporadas aqui por referência.

[00608] Os anticorpos anti-a-sinucleína, por exemplo, aqueles descritos aqui, podem também ser usados para detecção de asinucleína, tal como α-sinucleína humana, por exemplo, a-sinucleína humana em tecidos ou amostras de tecido. Os anticorpos podem ser usados, por exemplo, em um ensaio ELISA ou citometria de fluxo. Em certas modalidades, um anticorpo anti-a-sinucleína é conectado com células, por exemplo, células em um tecido, durante um tempo

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131/252 apropriado para a ligação específica ocorrer, e em seguida um reagente, por exemplo, um anticorpo que detecta o anticorpo anti-asinucleína, é adicionado. O anticorpo anti-a-sinucleína pode ser um anticorpo totalmente humano, ou pode ser um anticorpo quimérico, tal como um anticorpo tendo regiões variáveis humanas e regiões constantes murinas ou uma porção das mesmas. Os métodos exemplares para detecção de α-sinucleína, por exemplo, a-sinucleína humana, em uma amostra (amostra de célula ou tecido) compreendem (i) contatação de uma amostra com um anticorpo anti-a-sinucleína, durante um tempo suficiente para permitir a ligação específica do anticorpo anti-a-sinucleína à α-sinucleína na amostra, e (2) contatar a amostra com um reagente de detecção, por exemplo, um anticorpo, que especificamente liga-se ao anticorpo anti-a-sinucleína, tal como à região de Fc do anticorpo anti-a-sinucleína, para desse modo detectar α-sinucleína ligada pelo anticorpo anti-a-sinucleína. As etapas de lavagem podem ser incluídas após a incubação com o anticorpo e/ou reagente de detecção. Os anticorpos anti-a-sinucleína para uso nestes métodos não devem ser ligados a um rótulo ou agente de detecção, visto que um agente de detecção separado pode ser usado.

XI. Moléculas Biespecíficas [00609] Os anticorpos descritos aqui podem ser usados para formação de moléculas biespecíficas. Um anticorpo anti-a-sinucleína, ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, pode ser derivado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga ao pelo menos dois sítios de ligação ou moléculas alvo. Por exemplo, um anticorpo anti-asinucleína pode ser ligado a um anticorpo ou scFv que se liga especificamente a qualquer proteína que pode ser usada como alvos potenciais para tratamentos de combinação, tais como as proteínas

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132/252 descritas aqui. Os anticorpos descritos aqui podem, de fato, ser derivados ou ligados a mais do que uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecificas que se ligam a mais do que dois sítios de ligação diferentes e/ou moléculas alvos; tais moléculas multiespecificas são também destinadas a serem abrangidas pelo termo molécula biespecífica como usado aqui. Para criar uma molécula biespecífica descrita aqui, um anticorpo descrito aqui pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou outra forma) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tal como outro anticorpo, fragment de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação, de tal forma que uma molécula biespecífica resulte.

[00610] Consequentemente, são fornecidas aqui moléculas biespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para α-sinucleína e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epitopo alvo. Em uma modalidade descrita aqui, em que a molécula biespecífica é multiespecífica, a molécula pode também incluir uma terceira especificidade de ligação.

[00611] Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas descritas aqui compreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou um FV de cadeia única (scFv). O anticorpo pode também ser um dímero de cadeia leve ou cadeia pesada, ou qualquer fragmento animal do mesmo tal como um Fv ou uma contrução de cadeia única como descrito em Ladner et al. Patente dos Estados Unidos n^Q 4.946.778, o conteúdo da qual é expressamente incorporado por referência.

[00612] Ao mesmo tempo em que os anticorpos monoclonais humanos são preferidos, outros anticorpos que podem ser empregados nas moléculas biespecíficas descritos aqui são anticorpos

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133/252 monoclonais murinos, quiméricos e humanizados.

[00613] As moléculas biespecíficas descritas aqui podem ser preparadas conjugando-se as especificidades de ligação de constituintes usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e em seguida conjugadas umas às outras. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, vários agentes de acoplamento ou ligação cruzada podem ser usados para conjugação covalente. Os exemplos de agentes de ligação cruzada incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), ofenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e sulfossuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1carboxilato (sulfo-SMCC) (veja, por exemplo, Karpovsky etal. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83), e Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Os agentes de conjugados preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis por Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[00614] Em algumas modalidades, as moléculas biespecíficas descritas aqui têm uma segunda especificidade de ligação que aumenta o transporte da molécula no cérebro, por exemplo, através da barreira sangue-cérebro.

[00615] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, elas podem ser conjugadas por meio de ligação de fulfidrila das regiões de articulação do terminal de C das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particularmente preferida, a região de articulação é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidrila, preferivelmente um, antes da conjugação.

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134/252 [00616] Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil onde a molécula biespecífica é uma proteína de fusão de mAb x mAb, mAb x Fab, mAb x (scFv) 2, Fab x F(ab')2 ou ligante x Fab. Um anticorpo biespecífico pode compreender um anticorpo compreendendo um scFv no terminal de C de cada cadeia pesada. Uma molécula biespecífica descrita aqui pode ser uma molécula de cadeia única compreendendo um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única compreendendo dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Os métodos para preparação de moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos Número 5.260.203; Patente dos Estados Unidos Número 5.455.030; Patente dos Estados Unidos Número 4.881.175; Patente dos Estados Unidos Número 5.132.405; Patente dos Estados Unidos Número 5.091.513; Patente dos Estados Unidos Número 5.476.786; Patente dos Estados Unidos Número 5.013,653; Patente dos Estados Unidos Número 5.258.498; e Patente dos Estados Unidos Número 5.482.858.

[00617] A ligação das moléculas biespecíficas a seus ácidos específicos pode ser confirmada usando métodos reconhecidos na técnica, tais como ensaio de imunoabsorção enzimático (ELISA), radioimunoensaio (RIA), análise FACS, bioensaio (por exemplo, inibição de crescimento), ou ensaio Western Blot. Cada um destes ensaios geralmente detecta a presença de complexos de proteínaanticorpo de interesse particular empregando um reagente rotulado (por exemplo, um anticorpo) específico para 0 complexo de interesse.

XII. Composições [00618] São também fornecidas composições, por exemplo,

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135/252 composições farmacêuticas, contendo um ou uma combinação de anticorpos anti-a-sinucleína ou combinação com anticorpos para outros alvos, ou porção de ligação ao antígeno(s) dos mesmos, descritos aqui, formuladas juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos, ou imunoconjugados ou moléculas biespecíficas descritos aqui. Por exemplo, uma composição farmacêutica descrita aqui pode compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou bisepecíficos) que se ligam a diferentes epitopos no antigeno alvo ou que têm atividades complementares.

[00619] Em certas modalidades, uma composição compreende um anticorpo anti-a-sinucleína em uma concentração de pelo menos 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 1-300 mg/ml, ou 100-300 mg/ml.

[00620] Composições farmacêuticas descritas aqui também podem ser administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes (seja na mesma composição ou composições separadas). Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados em terapia de combinação incluem, por exemplo, levodopa, amantadina (Simetrel), anticolinérgicos (tri-hexifenidila, mesilato de benztropina, prociclidina, artano, cogentina), bromocriptidina (Parlodel), pergolida (Permax), ropinirol (Requip), pramipexol (Mirapex), inibidores de monoaminoxidase-B (MAO) tais como selegilina (Diprenil ou Eldepril), inibidores de catecol-O-metiltransferase (COMT) tais como entocapona, tasmar, ou tolcapona, inibidores de colinesterase, antagonistas de receptor D2, agonistas de DA, oligonucleotídeo sem sentido, (por exemplo, oligonucleotídeos antissentido direcionados contra α-sinucleína), inibidores de cinase e inibidores de cinase rica em repetição de leucina 2 (LRRK2). Agentes adicionais incluem, por

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136/252 exemplo, terapêuticos direcionados às moléculas conhecidos estar envolvidos na patologia de sinucleinopatias, tais como PINK, PARKIN, DJ1, glicocerebrosidase (GBA), e agentes que alvejam as espécies de oxigênio reativo.

[00621] Como usado aqui, veículo farmaceuticamente aceitável inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes retardantes de absorção e isotônico, e similares que são fisiologicamente compatíveis. Preferivelmente, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da rotina de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, imunoconjugado, ou molécula biespecífica, pode ser revestido em um material para proteger o compost da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

[00622] Os compostos farmacêuticos descritos aqui podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um sal farmaceuticamente aceitável refere-se a àquele que mantém a atividade biológica do composto origem e não produz quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (veja, por exemplo, Berge, S.M., etal. (1977) J. Pharm. Sei. 66:1-19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como hidroclórico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, hidrobrômico, hidroiodico, fósforo e similares, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos mono e dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos substituídos por fenila, ácidos hidróxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e similares. Sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalinoterrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e similares, bem como aminas

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137/252 orgânicas não tóxicas, tais como Ν,Ν'-dibenziletilenodiamina, Nmetilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e similares.

[00623] Uma composição farmacêutica descrita aqui pode também incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfeto de sódio, sulfeto de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propila, alfa-tocoferol, e similares; e (3) agentes quelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido tetra-acético de etilenodiamina (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e similares.

[00624] Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas descritas aqui incluem água, etanol, polióis (tal como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerida no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.

[00625] Estas composições podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção de presença de micro-organismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização, supra, quanto pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico, e similares. Pode ser também desejável incluir agentes isotônicos, tais como

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138/252 açúcares, cloreto de sódio, e similares nas composições. Além disso, absorção prologada da forma farmacêutica injetável pode ser realizada pela inclusão de agentes que retardam a absorção tais como monoestearato de alimínio e gelatina.

[00626] Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções e dispersão injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que quaisquer meios ou agente são incompatíveis com o composto ativo, o uso dos mesmos nas composições farmacêuticas descritas aqui é contemplado. Uma composição farmacêutica pode compreender um conservante ou pode ser desprovida de um conservante. Os compostos ativos suplementares podem ser incorporados nas composições.

[00627] As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenagem. A composição pode ser formuladas como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para concentração de fármaco elevada. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e similares), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode realizada pela inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

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139/252 [00628] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido pela microfiltragem de esterilização. Geralmente, dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básica e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados aqui. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de peparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução anteriormente filtrada estéril do mesmo.

[00629] A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material portador para produzir uma forma de dosagem simples variará dependendo do indivíduo sendo tratado, e o modo particular de administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material portador para produzir uma forma de dosagem simples geralmente será a quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, de cem por cento, esta quantidade variará de cerca de 0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento de ingrediente ativo, preferivelmente de cerca de 0,1 por cento a cerca de 70 por cento, mais preferivelmente de cerca de 1 por cento a cerca de 30 por cento de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00630] Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolus simples pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas

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140/252 exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenteral em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem como usado aqui refere-se às unidades fisicamente discretas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico. A especificação para as formas de unidade de dosagem descritas aqui são ditadas por e diretamente dependentes de (a) as características exclusivas do composto ativo e o efeito terapêutico particular a ser obtido, e (b) as limitações na técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

[00631] Para administração do anticorpo, as faixas de dosagem de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais geralmente 0,01 a 5 ou 10 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar implica a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada três a 6 meses. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-asinucleína pode ser administrado em uma dose fixa (regime de dose fixa).

[00632] Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, em cujo caso, a dosagem de cada anticorpo administrado se inclui nas faixas indicadas. O anticorpo é geralmente administrado em múltiplas ocasiões. Os intervalos as dosagens

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141/252 simples podem ser, por exemplo, semalmente, mesalmente e a cada três meses ou anualmente. Os intervalos podem também ser irregulares como indicado medindo-se os níveis sanguíneos de anticorpo ao antigeno alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para obter uma concentração de anticorpo plasmática de cerca de 1-1000 pg/ml e em alguns métodos, cerca de 25-300 pg/ml.

[00633] Um anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação prolongada, em cujo cado, administração menos frequente é requerida. A dosagem e frequência variam dependendo da meia vida do anticorpo no paciente. Em geral, os anticorpos humanos mostram meia vida mais longa, seguidos por anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e anticorpos não humanos. A dosagem e frequência de administração podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes durante um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento durante o resto das suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é às vezes necessária até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, e preferencialmente até que o paciente apresente melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. Depois disso, o paciente pode ser submetido a um regime profilático [00634] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas descritas aqui podem ser variados a fim de obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição, e modo de administração, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de

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142/252 fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições descritas aqui empregadas, ou o éster, sal ou amida das mesmas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto específico empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, estado geral de saúde e histórico médico do paciente sendo tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas [00635] Uma composição descrita aqui pode ser administrada por meio de uma ou mais vias de administração usando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será apreciado pelo técnico versado, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados. Vias preferidas de administração para os anticorpos descritos aqui incluem intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias parenterais de admnistração, por exemplo, por injeção ou infusão. A frase administração parenteral como usado aqui significa modos de adminisração diferentes da administração enteral e tópica, geralmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intraesternal.

[00636] Alternativamente, um anticorpo descrito aqui pode ser administrado por meio de uma via não parenteral, tal como uma via tópica, epidérmica ou mucosa de administração, por exemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, retalmente, sublingualmente ou topicamente.

[00637] Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra a rápida liberação, tal como uma

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143/252 formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de liberação microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Muitos método para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos por aqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978.

[00638] Composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade preferida, uma composição terapêutica descrita aqui pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos descritos nas Patentes dos Estados Unidos n^QS 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos para uso com anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui incluem: Patente dos Estados Unidos n^Q 4.487.603. que descreve uma bomba de microinfusão implantável para dispersão de medicamento em uma taxa controlada; Patente dos Estados Unidos n^Q 4.486.194, que descreve um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; Patente dos Estados Unidos n^Q 4.447.233, que descreve uma bomba de infusão de medicamente para liberação de medicamento em uma taxa de infusão precisa; Patente dos Estados Unidos n^Q 4.447.224, que descreve um aparato de infusão implantável de fluxo variável durante a liberação contígua de fármaco; Patente dos Estados Unidos n^Q 4.439.196, que descreve um sistema de liberação de fármaco osmótica tendo compartimentos de multicâmaras; e Patente dos Estados Unidos n^Q 4.475.196, que descreve um sistema de liberação de fármaco osmótica. Estas

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144/252 patentes são incorporadas aqui por referência. Muitos outros tais implantes, sistemas de de liberação e módulos são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00639] Em certas modalidades, os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui podem ser formulados para garantir distribuição in vivo apropriada. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para garantir que os compostos terapêuticos descritos aqui atravessem a BBB (se desejado, por exemplo, para cânceres cerebrais), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de fabricação de lipossomas, veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções que são seletivamente transportadas em células ou órgãos específicos, desse modo, realçam a liberação de fármaco alvejada (veja, por exemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). As porções de alvejamento exemplares incluem folato ou biotina (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos 5.416.016 por Low et al.); manosídeos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticorpos (P.G. Bloeman etal. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais etal. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína A tensoativo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); veja também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994,) Immunomethods 4:273.

XIII. Kits [00640] São fornecidos também kits compreendendo os anticorpos anti-a-sinucleína, anticorpos biespecíficos, ou imunoconjugados descritos aqui, opcionalmente contidos em um único frasconete ou recipiente, e incluem, por exemplo, instruções para uso no tratamento

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145/252 ou diagnóstico de uma doença associada com a presença de corpos de Lewy ou agregados de α-sinucleína no cérebro. Os kits podem incluir um rótulo indicando o uso pretendido dos teores do kit. O termo rótulo inclui qualquer material de escrita, marketing ou material gravado fornecido em ou com o kit, ou que de outro modo acompanha o kit. Tais kits podem compreender o anticorpo, anticorpos biespecíficos, ou imunoconjugado em forma de dosagem unitária, tal como em um único frasconete de dose ou uma seringa pré-carregada com dose única.

XIV. Usos e Métodos [00641] São fornecidos aqui métodos de tratamento de indivíduos (por exemplo, pacientes humanos) com doenças caracterizadas pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de a-sinucleína no cérebro, bem como métodos para profilaxia destas doenças.

[00642] Consequentemente, em um aspecto, são fornecidos aqui métodos de tratamento de uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro compreendendo administrar a um indivíduo com a doença uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-a-sinucleína, ou porção de ligação ao antígeno, descrito aqui.

[00643] Em outro aspecto, são fornecidos aqui métodos de diminuição da gravidade de uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro compreendendo administrar a um indivíduo com a doença uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-a-sinucleína, ou porção de ligação ao antígeno, descrito aqui.

[00644] Em outro aspecto, são fornecidos aqui métodos de retardo da progressão de uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro compreendendo administrar a um indivíduo com a doença uma

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146/252 quantidade eficaz de um anticorpo anti-a-sinucleína, ou porção de ligação ao antigeno, descrito aqui.

[00645] Em outro aspecto, são fornecidos aqui métodos de redução do risco de desenvolvimento de uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de a-sinucleína no cérebro compreendendo administrar a um indivíduo em risco de desenvolver a doença uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-asinucleína, ou porção de ligação ao antigeno, descrito aqui.

[00646] Em outro aspecto, são fornecidos aqui métodos de retardo de início de uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro compreendendo administrar a um indivíduo em risco de desenvolver a doença uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-a-sinucleína, ou porção de ligação ao antigeno, descrito aqui.

[00647] Em algumas modalidades, indivíduos a serem tratados exibem sintomas (sinais) de sinucleinopatias, tais como manifestações neuropsiquiátricas (depressão, demência, alucinações, ansiedade, apatia, anedonia), alterações autonômicas (hipotensão ortostática, distúrbios da bexiga, constipação, incontinência fecal, sialorreia, disfagia, disfunção sexual, alterações no fluxo sanguíneo cerebral), alterações sensoriais (olfativas, dor, sensações anormais de discriminação de cores), distúrbios do sono (distúrbio do comportamento do sono REM (RBD), síndrome das pernas inquietas/movimentos periódicos das extremidades, hipersônia, insônia), e outros sinais e sintomas (fadiga, diplopia, visão turva, seborreia, perda/ganho de peso) [00648] Em algumas modalidades, indivíduos a serem tratados não exibem sintomas da doença, porém são conhecidos ter um risco genético de desenvolver uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro.

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Por exemplo, tais indivíduos podem ter parentes com a doença, ou seu risco é determinado pela análise de marcadores genéticos ou bioquímicos. Por exemplo, mutações em SNCA (PARK1, codificando α-sinucleína), incluindo A30P, E46K, H50Q, G51D, e A53T, bem como duplicações e triplicações do gene SNCA inteiro causam formas dominantes autossômicas de PD. Mutações em LRRK2 (PARK8, cinase rica em repetição de leucina 2) e mutações em VPS35 (PARK17, classificação de proteína vacuolar 35) também causam formas dominantes autossômicas de DP (Hernandez et al., (2016) Genetics in Parkinson disease: Mendelial versus non-Medndelian inheritance. Journal of Neurochemistry 10.1111/jnc.13593). Mutações em PINK1 (PARK6, cinase 1 induzida por PTEN), DJ-1 (PARK7), Parkin (PARK2), ATP13A2 (PARK9, ATPase tipo 13A2), FBXO7 (PARK15, proteína F-box 7), e PLA2GB (PARK14, fosfolipase A2, grupo VI) mostraram causar DP/parkinonismo recessive autossômico. Além disso, 28 diferentes loci de risco genético associados com DP e sinucleinopatias relacionadas foram identificados incluindo SNCA, LRRK2, GBA/SYT11, MAPT, HLA-DRB5, GAK, GCH1, NUCKS1/RAB7L1, SLC41A1, BST1, SIPA1L2, ACMSD/TMEM163, STK39, MCCC1, TMEM175/GAK/DGKQ, FAM47E/SCARB2, GPNMB, FGF20, INPP5F, MIR4697, CCDC62, GCH1, VPS13C, BCKDK/STX1B, SREBF/RAI1, RIT2 e DDRGK1 (Nalls etal. (2014) A meta-análise em larga escala dos dados de associação em todo o genoma identifica seis novos loci de risco para Doença de Parkinson. Nature Genetics 46(9): 989-993). Consequentemente, em aplicações profiláticas, os anticorpos descritos aqui, ou composições farmacêuticas compreendendo os mesmos, são administrados a um paciente suscetível a, ou de outro modo em risco da doença em um regime (dose, frequência e via de administração) eficaz para reduzir o risco, diminuir a gravidade ou retardar o início de pelo menos um sinal ou

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148/252 sintoma da doença. Em algumas aplicações profiláticas, o regime é eficaz para inibir ou retardar o acúmulo de α-sinucleína no cérebro, e/ou inibir ou retardar seus efeitos tóxicos e/ou inibir ou retardar o desenvolvimento de déficits comportamentais no paciente.

[00649] Em algumas modalidades, os métodos descritos acima geram uma resposta terapêutica benéfica em um paciente (por exemplo, redução de agregados de α-sinucleína no cérebro, função cognitiva e/ou reversão melhorada, tratamento ou prevenção do declínio cognitivo) no indivíduo. Consequentemente, em algumas modalidades, os anticorpos descritos aqui são administrado a um paciente suspeito de, ou já sofrendo de uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de asinucleína no cérebro em um regime (dose, frequência e via de administração) eficaz para melhorar ou pelo menos inibir outra deterioração de pelo menos um sinal ou sintoma da doença. Em algumas aplicações terapêuticas, o regime é eficaz para reduzir ou pelo menos ininibir outro aumento de níveis de a-sinucleína, toxicidades associadas, e/ou déficits comportamentais. Em certas modalidades, os tratamentos podem resultar em, por exemplo, uma redução de agregados de α-sinucleína no cérebro em 10% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, ou 90% ou mais, com relação ao antes de iniciar o tratamento ou em comparação com uma população de pacientes de controle não tratados.

[00650] Em algumas modalidades, a doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de a-sinucleína no cérebro é doença de Parkinson (incluindo doença de Parkinson idiopática), DLB, DLBD, LBVAD, insuficiência autômica pura, disfagia de corpo de Lewy, LBD incidental, LBD hereditária (por exemplo, mutações de SNCA (PARK1), LRRK2 (PARK8), VPS35 (PARK17),

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PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), Parkin (PARK2), ATP13A2 (PARK9), FBXO7 (PARK15) e PLA2GB (PARK14)), ou atrofia de mútiplo sistema (AMS; por exemplo, atrofia olivopontocerebelar, degeneração estriatonigral e syndrome Shy-Drageri).

[00651] São fornecidos também métodos de inibição da geração de agregados insolúveis de α-sinucleína (por exemplo, agregados de asinucleína fosforilados em serina-129) em uma célula (in vitro ou in vivo) compreendendo contatar a célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-a-sinucleína, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, descrito aqui. Em algumas modalidades, a fosforilação de serina-129 é induzida por oligômeros de α-sinucleína (por exemplo, PFF).

[00652] São fornecidos também métodos para conservação ou aumento de densidade sináptica e/ou densidade dentrítica, como medido usando marcadores de formação de sinapse (sinaptofisina) e/ou dendritos (MAP2). Consequentemente, em algumas modalidades, indivíduos tratados com os anticorpos descritos aqui exibem um alevação de densidade sináptica ou dendrítica de 10% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, ou 50% ou mais, com relação a antes de iniciar o tratamento ou como em comparação com uma população de pacientes de controle não tratados.

[00653] Os anticorpos descritos aqui também podem ser usados para diagnosticar ou prognosticar doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro, por exemplo, contatando um anticorpo descrito aqui (por exemplo, ex vivo ou in vivo) com células do indivíduo, e medindo o nível de ligação à α-sinucleína nas células, em que os níveis de ligação anormalmente elevados à α-sinucleína indicam que o indivíduo tem uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro. Para os propósitos

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150/252 de diagnóstico ou prognóstico, os anticorpos descritos aqui podem ser administrados por injeção intravenosa no corpo do paciente, ou diretamente no cérebro por injeção intracraniana ou por perfuração de um buraco no crânio. A dosagem do reagente deve estar dentro das mesmas faixas como para os métodos de tratamento. Os rótulos adequados incluem, por exemplo, rótulos fluorescentes (por exemplo, para detecção ótica), rótulos paramagnéticos (por exemplo, para detecção tomográfica sem intervenção cirúrgica), e rótulos radioativos (por exemplo, para detecção usando PET ou SPECT). O diagnóstico é realizado pela comparação do número, tamanho e/ou intensidade dos loci marcados com os valores de linha de base correspondentes. Os valores de linha de base podem representar os níveis médios em uma população de indivíduos não adoecidos. Os valores de linha de base podem também representar níveis anteriores determinados no mesmo paciente. Por exemplo, os valores de linha de base podem ser determinados em um paciente antes de iniciar o tratamento, e os valores medidos depois disso comparados com os valores de linha de base. Uma diminuição nos valores com relação a uma linha de base sinaliza uma resposta positiva ao tratamento.

[00654] Em uma modalidade, fornecido aqui é um método para diagnosticar uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína em um indivíduo compreendendo:

[00655] (a) contatar uma amostra do indivíduo com um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, descrito aqui, de modo que um complexo de anticorpo-antígeno seja formado;

[00656] (b) medir a quantidade do complexo formado; e [00657] (c) comparar a amostra do complexo na amostra com a quantidade em um controle em que um nível elevado do complexo na amostra relativa ao controle indica que o indivíduo tem uma doença

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151/252 caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína. Em algumas modalidades, a amostra é fluido cerebrospinal, extrato de tecido cerebral, urina, ou sangue. Em algumas modalidades, o controle é uma população de indivíduos saudáveis que não exibem sintomas da doença e não são geneticamente predispostos à doença (por exemplo, sinucleinopatias). [00658] Em modalidades preferidas, um anticorpo anti-a-sinucleína descrito aqui não é significantemente tóxico. Por exemplo, um anticorpo anti-a-sinucleína não é significantemente tóxico a um órgão de um humano, por exemplo, um ou mais de fígado, rim, cérebro, pulmões e coração, como determinado, por exemplo, em testes clínicos. Em certas modalidades, um anticorpo anti-a-sinucleína não desencadeia significativamente uma resposta imune indesejável, por exemplo, autoimunidade ou inflamação.

[00659] O anticorpo pode ser administrado sozinho ou com outro agente terapêutico que age em conjunção com ou sinergicamente com o anticorpo para tartar a doença associada com corpos de Lewy ou agregados de α-sinucleína no cérebro (por exemplo, atrofia de mútiplo sistema).

[00660] Agentes terapêuticos exemplares adequados para uso em combinação com os anticorpos descritos aqui incluem, por exemplo, levodopa, amantadina (Simetrel), anticolinérgicos (tri-hexifenidila, mesilato de benztropina, prociclidina, artano, cogentina), bromocriptidina (Parlodel), pergolida (Permax), ropinirol (Requip), pramipexol (Mirapex), inibidores de monoaminoxidase-B (MAO) tal como selegilina (Diprenil ou Eldepril), inibidores de catecol-Ometiltransferase (COMT) tais como entocapona, tasmar, ou tolcapona, inibidores de colinesterase, antagonistas de receptor D2, agonistas de DA, oligonucleotídeos antissentido, (por exemplo, oligonucleotídeos antissentido direcionados contra α-sinucleína), inibidores de cinase, e

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152/252 inibidores de cinase rica em repetição de leucina 2 (LRRK2). Agentes adicionais incluem, por exemplo, moléculas de alvejamento terapêutico conhecidas estar envolvidas na patologia de sinucleinopatias, tal como PINK, PARKIN, DJ1, glicocerebrosidase (GBA), e agentes que alvejam as espécies de oxigênio alvo.

[00661] Agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados juntamente (por exemplo, concorrente ou sequencialmente) com os anticorpos descritos aqui, ou separadamente (por exemplo, horas ou dias à parte).

[00662] Também são abrangidos métodos para detecção da presença de antígeno de α-sinucleína humana em uma amostra, ou medição da quantidade de antígeno de α-sinucleína humana, compreendendo contatar a amostra, e uma amostra de controle, com um anticorpo monoclonal, por exemplo, um anticorpo monoclonal humano, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, que especificamente se liga à α-sinucleína humana, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção do mesmo e α-sinucleína humana. A formação de um complexo é em seguida detectada, em que uma diferente formação de complexo entre a amostra em comparação com a amostra de controle é indicativo da presença de antígeno de α-sinucleína humana na amostra. Em uma modalidade, os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui podem ser usados para purificar α-sinucleína humana por meio de purificação por imunoafinidade. Em outra modalidade, os anticorpos anti-a-sinucleína descritos aqui podem ser usados para detector a quantidade de proteínas de α-sinucleína em uma amostra biológica (por exemplo, uma biópsia). Ainda em outra modalidade, os anticorpos anti-asinucleína descritos aqui podem ser usados em ensaios in vitro (por exemplo, imunoensaios tais como Western blot, radioimunoensaios, ELISA) para detectar as proteínas de a-sinucleína.

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XV. Modalidades Exemplares [00663] 1. Um anticorpo isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga à α-sinucleína e exibe uma ou mais das seguintes propriedades:

[00664] (a) liga-se à α-sinucleína de camundongo e rato;

[00665] (b) liga-se à β-sinucleína humana e γ-sinucleína humana;

[00666] (c) tem uma maior afinidade quanto aos oligômeros de asinucleína do que os monômeros de a-sinucleína;

[00667] (d) inibe a geração de agregados insolúveis de a-sinucleína fosforilados em serina-129 induzidos por oligômero de a-sinucleína;

[00668] (e) esgota a espécie molecular que produz agregados insolúveis e solúveis de α-sinucleína caracterizada por fosforilação em serina-129 de PFF e/ou lisado cerebral preparado de pacientes com agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro;

[00669] (f) liga-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 123-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1);

[00670] (g) liga-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 125-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1);

[00671] (h) liga-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 130-139 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1);

[00672] (i) liga-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 119-126 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1); e [00673] (j) liga-se a toda ou uma parte das posiçõesde aminoácidos 130-138 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1).

[00674] 2. O anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de modalidade 1, em que o oligômero de α-sinucleína é PFF.

[00675] 3. O anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de modalidade 2, em que a PFF é preparada como descrito no Exemplo 3.

[00676] 4. O anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo,

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154/252 de qualquer uma das modalidades 1-3, em que os oligômeros de asinucleína são oligômeros solúveis de a-sinucleína.

[00677] 5. O anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades 1-3, em que os oligômeros de asinucleína são oligômeros de α-sinucleína insolúveis.

[00678] 6. O anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades 1-5, em que maior afinidade para PFF de α-sinucleína do que monômeros de α-sinucleína é medida usando um monômero de α-sinucleína/PFF de α-sinucleína, como determinado por um ensaio de ligação com base em luminescência (por exemplo, como descrito no Exemplo 3).

[00679] 7. O anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de modalidade 6, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, tem uma relação de monômero de asinucleína/PFF de α-sinucleína de 100 ou maior.

[00680] 8. O anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de modalidade 7, em que a relação de ligação de monômero/PFF é de 500 ou maior.

[00681] 9. O anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de modalidade 8, em que a relação de ligação de monômero/PFF é de 700 ou maior.

[00682]	10. O anticorpo, ou porção	de	ligação	ao	antígeno	do
mesmo,	de modalidade 9, em que	a	relação	de	ligação	de
monômero/PFF é de 1500 ou maior.
[00683]	11. O anticorpo, ou porção	de	ligação	ao	antígeno	do
mesmo,	de modalidade 10, em que	a	relação	de	ligação	de
monômero/PFF é de 3000 ou maior.
[00684]	12. O anticorpo, ou porção	de	ligação	ao	antígeno	do
mesmo,	de modalidade 11, em que	a	relação	de	ligação	de

monômero/PFF é de 5000 ou maior.

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155/252 [00685] 13. O anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, liga-se à asinucleína monomérica com um EC50 de 100 nM ou maior, e liga-se à PFF com um EC50 de 2 nM ou menor, como medido por ELISA.

[00686] 14. O anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, de modalidade 13, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, liga-se à α-sinucleína monomérica com um ECõo de 500 nM ou maior, e liga-se à PFF com um EC50 de 0,5 nM ou menor.

[00687] 15. O anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, inibe a fosforilação em serina-129 de α-sinucleína induzida por PFF com um IC50 de 0,1 nM ou menor, como avaliado usando o ensaio descrito no Exemplo 10.

[00688] 16. Um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, que especificamente se liga à α-sinucleína e compreende as três CDRs de cadeia pesada variável e as três CDRs de cadeia leve variável que estão no pares de cadeia pesada variável e cadeia leve variável selecionados do grupo que consiste em:

[00689] (a) SEQ ID NOs: 8 e 9;

[00690] (b) SEQ ID NOs: 18 e 19;

[00691 ] (c) SEQ ID NOs: 20 e 21;

[00692] (d) SEQ ID NOs: 31 e 32;

[00693] (e) SEQ ID NOs: 31 e 33;

[00694] (f) SEQ ID NOs: 43 e 44;

[00695] (g) SEQ ID NOs: 53 e 54;

[00696] (h) SEQ ID NOs: 63 e 64;

[00697] (i) SEQ ID NOs: 73 e 74;

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156/252 [00698] (j) SEQ ID NOs: 83 e 84;

[00699] (k) SEQ ID NOs: 99 e 100;

[00700] (I) SEQ ID NOs: 99 e 101;

[00701] (m) SEQ ID NOs: 99 e 102; e [00702] (n) SEQ ID NOs: 113 e 114.

[00703] 17. Um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, que se liga à α-sinucleína, compreendendo: [00704] (a) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 2-4, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 5-7, respectivamente;

[00705] (b) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 12-14, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 15-17, respectivamente;

[00706] (c) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 22-24, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 25-27, respectivamente;

[00707] (d) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 22-24, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 28-30, respectivamente;

[00708] (e) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 37-39, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 40-42, respectivamente;

[00709] (f) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 47-49, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve

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157/252 compreendendo as SEQ ID NOs: 50-52, respectivamente;

[00710] (g) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 57-59, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 60-62, respectivamente;

[00711] (h) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 67-69, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 70-72, respectivamente;

[00712] (i) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 77-79, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 80-82, respectivamente;

[00713] (j) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 87-89, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 90-92, respectivamente;

[00714] (k) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 87-89, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 93-95, respectivamente;

[00715] (I) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 87-89, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 96-98, respectivamente; ou [00716] (m) CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOs: 107-109, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOs: 110-112, respectivamente.

[00717] 18. Um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação

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158/252 ao antígeno do mesmo, que se liga à α-sinucleína e compreende as regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8, 18, 31,43, 53, 63, 73, 83, 99, e 113. [00718] 19. Um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga à α-sinucleína e compreende as regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 9, 19, 32, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 100, 101, 102, e 114.

[00719] 20. Um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga à α-sinucleína e compreende as sequências de região varivável de cadeia pesada e leve pelo menos 90% idênticas às sequências de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em:

[00720] (a) SEQ ID NOs: 8 e 9;

[00721 ] (b) SEQ ID NOs: 18 e 19;

[00722] (c) SEQ ID NOs: 31 e 32;

[00723] (d) SEQ ID NOs: 31 e 33;

[00724] (e) SEQ ID NOs: 43 e 44;

[00725] (f) SEQ ID NOs: 53 e 54;

[00726] (g) SEQ ID NOs: 63 e 64;

[00727] (h) SEQ ID NOs: 73 e 74;

[00728] (i) SEQ ID NOs: 83 e 84;

[00729] (j) SEQ ID NOs: 99 e 100;

[00730] (k) SEQ ID NOs: 99 e 101;

[00731] (I) SEQ ID NOs: 99 e 102; e [00732] (m) SEQ ID NOs: 113 e 114.

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159/252 [00733] 21. O anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, de modalidade 20, em que as regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendem uma sequência de aminoácido pelo menos 95%, 98%, 99%, ou 100% idêntica às regiões variáveis de cadeia pesada e leve selecionada do grupo que consiste em (a)-(m).

[00734] 22. Um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, que se liga à α-sinucleína e compreende as sequências de cadeia pesada e cadeia leve pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idênticas às sequências de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em:

[00735] (a) SEQ ID NOs: 10 e 11, [00736] (b) SEQ ID NOs: 20 e 21, [00737] (c) SEQ ID NOs: 34 e 35, [00738] (d) SEQ ID NOs: 34 e 36, [00739] (e) SEQ ID NOs: 45 e 46, [00740] (f) SEQ ID NOs: 55 e 56, [00741 ] (g) SEQ ID NOs: 65 e 66, [00742] (h) SEQ ID NOs: 75 e 76, [00743] (i) SEQ ID NOs: 85 e 86, [00744] (j) SEQ ID NOs: 103 e 104, [00745] (k) SEQ ID NOs: 103 e 105, [00746] (I) SEQ ID NOs: 103 e 106, e [00747] (m) SEQ ID NOs: 115 e 116.

[00748] 23. O anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo se liga a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 123-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1), como determinado por mapeamento de peptídeo (por exemplo, como descrito no Exemplo 1).

[00749] 24. O anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do

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160/252 mesmo, de modalidade 23, em que o anticorpo se liga a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 125-128 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1), como determinado por mapeamento de peptídeo (por exemplo, como descrito no Exemplo 1).

[00750] 25. O anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades 1-22, em que o anticorpo se liga a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 130-139 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1), como determinado por mapeamento de peptídeo (por exemplo, como descrito no Exemplo 1).

[00751] 26. O anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades 1-22, em que o anticorpo se liga a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 119-126 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1), como determinado por mapeamento de peptídeo (por exemplo, como descrito no Exemplo 1).

[00752] 27. O anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades 1-22, em que o anticorpo se liga a toda ou uma parte das posições de aminoácidos 130-138 de α-sinucleína humana (SEQ ID NO: 1), como determinado por mapeamento de peptídeo (por exemplo, como descrito no Exemplo 1).

[00753] 28. O anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo se liga à α-sinucleína de rato e camundongo.

[00754] 29. O anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo se liga à β-sinucleína humana e γ-sinucleína humana.

[00755] 30. O anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo tem maior afinidade para PFF de α-sinucleína do que os monômeros de α-sinucleína, como avaliado por um monômero de asinucleína/PFF de α-sinucleína (relação de ligação de monômero:PFF),

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161/252 como determinado para um ensaio de ligação com base em luminescência (por exemplo, como descrito no Exemplo 3).

[00756] 31. O anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, de modalidade 30, em que a relação de ligação de monômero:PFF é de 100 ou maior, 500 ou maior, 700 ou maior, 1500 ou maior, 3000 ou maior, ou 5000 ou maior.

[00757] 32. Um anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, que se liga o mesmo epitopo como o anticorpo de modalidade 21.

[00758] 33. Um anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, que compete quanto à ligação à α-sinucleína humana com o anticorpo de modalidade 21.

[00759] 34. O anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em uma lgG1, uma lgG2, uma lgG3, uma lgG4, ou uma variante da mesma.

[00760] 35. O anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, de modalidade 34, em que o anticorpo é um anticorpo de lgG1.

[00761] 36. O anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo compreende uma região Fc com função efetora reduzida ou nenhuma.

[00762] 37. O anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, de modalidade 36, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, compreende um Fc de lgG1 não efetora que compreende as seguintes mutações: L234A, L235E, e G257A.

[00763] 38. O anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, é um

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162/252 anticorpo quimérico, humanizado e humano.

[00764] 39. O anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo é modificado para reduzir a imunogenicidade em humanos.

[00765] 40. O anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, de modalidade 39, em que o anticorpo compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve mencionadas nas SEQ ID NOs: 18 e 19, respectivamente.

[00766] 41. O anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, de qualquer uma das modalidades anteriores, que é um anticorpo monoclonal.

[00767] 42. Uma molécula biespecífica compreendendo o anticorpo de qualquer uma das modalidades anteriores ligado a uma molécula tendo uma segunda especificidade de ligação.

[00768] 43. A molécula biespecífica de modalidade 42, em que a segunda especificidade de ligação aumenta o transporte da molécula no cérebro.

[00769] 44. Um ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada e/ou leve do anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno do mesmo, ou anticorpo biespecífico, de qualquer uma das modalidades 1-43.

[00770] 45. Um vetor de expressão compreendendo a molécula de ácido nucleico de modalidade 44.

[00771] 46. Uma célula transformada com um vetor de expressão de modalidade 45.

[00772] 47. U mimunoconjugado compreendendo o anticorpo ou anticorpo biespecífico de qualquer uma das modalidades 1-43, ligado a uma porção.

[00773] 48. O imunoconjugado de modalidade 47, em que a porção é uma porção de ligação, uma porção de rotulagem, uma porção

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163/252 biologicamente ativa, ou um agente terapêutico.

[00774] 49. Uma composição compreendendo o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, molécula biespecífica, ou imunoconjugado, de qualquer uma das modalidades 1-43, 47, e 48, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00775] 50. Um kit compreendendo o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, ou molécula biespecífica, ou imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1-43, 47, e 48, e instruções para uso.

[00776] 51. Um método de preparação de um anticorpo anti-asinucleína, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo expressão do anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, na célula de modalidade 46 e isolamento do anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, da célula.

[00777] 52. Um método de inibição da geração de agregados insolúveis de α-sinucleína fosforilados em serina-129 em uma célula compreendendo contatar a célula com uma quantidade eficaz do anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno, anticorpo biespecífico, ou imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1-43, 47, e 48.

[00778] 53. O método de modalidade 52, em que a fosforilação de serina-129 é induzida por oligômeros de a-sinucleína.

[00779] 54. O método de modalidade 53, em que os oligômeros de α-sinucleína são fibrilas de α-sinucleína pré-formadas.

[00780] 55. O método de modalidade 53, em que os oligômeros de α-sinucleína são derivados de amostras cerebrais de pacientes com sinucleinopatias.

[00781] 56. Um método de tratamento de uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro compreendendo administrar a um indivíduo com a doença uma quantidade eficaz do anticorpo, ou

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164/252 porção de ligação ao antigeno, anticorpo biespecífico, ou imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1-43, 47, e 48.

[00782] 57. Um método de diminuição da gravidade de uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro compreendendo administrar a um indivíduo com a doença uma quantidade eficaz do anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno, anticorpo biespecífico, ou imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1-43, 47, e 48.

[00783] 58. Um método de retardar a progressão de uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro compreendendo administrar a um indivíduo com a doença uma quantidade eficaz do anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno, anticorpo biespecífico, ou imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1-43, 47, e 48.

[00784] 59. Um método de redução do risco de desenvolvimento de uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro compreendendo administrar a um indivíduo em risco de desenvolver a doença uma quantidade eficaz do anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno, anticorpo biespecífico, ou imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1-43, 47, e 48.

[00785] 60. Um método de retardo de início de uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro compreendendo administrar a um indivíduo em risco de desenvolver a doença uma quantidade eficaz do anticorpo, ou porção de ligação ao antigeno, anticorpo biespecífico, ou imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1-43, 47, e 48.

[00786] 61. Um método de diagnosticar uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de asinucleína em um indivíduo compreendendo:

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165/252 [00787] (a) contatar uma amostra do indivíduo com o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, anticorpo biespecifico, ou imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1-43, 47, e 48 de modo que um complexo de anticorpo-antígeno seja formado;

[00788] (b) medir a quantidade do complexo formado; e [00789] (c) comparar a amostra do complexo na amostra com a quantidade em um controle em que um nível elevado do complexo na amostra relativa ao controle indica que o indivíduo tem uma doença caracterizada pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de a-sinucleína.

[00790] 62. O método de modalidade 61, em que a amostra é fluido cerebrospinal, extrato de tecido cerebral, urina, ou sangue.

[00791] 63. O método de qualquer uma das modalidade 56-62, em que a doença é Doença de Parkinson, demência de doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, doença de corpo de Lewy, atrofia de mútiplo sistema, ou insuficiência autômica pura.

[00792] 64. O método de qualquer uma das modalidade 56-63, compreendendo administrar um ou mais terapêuticos adicionais.

[00793] 65. Método para detecção de α-sinucleína em uma amostra compreendendo contatar a amostra com o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, anticorpo biespecifico, ou imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 1-43, 47, e 48 sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, e α-sinucleína, e detecção da formação do complexo.

ir ir ir ir ir ir ir ir [00794] A presente invenção é também ilustrada pelos seguintes exemplos, que não devem ser construídos como limitantes adicionais. Os teores de todas as Figuras e todas as referências, sequências Genbank, patentes e pedidos de patente publicados citados por todo

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166/252 este pedido são expressamente incorporados aqui por referência. Em particular, as descrições de publicações de PCT WO 09/045957, WO 09/073533, WO 09/073546, WO 09/054863 e PCT/US2013/072918, e Publicação de Patente dos Estados Unidos N^Q 2011/0150892 são expressamente incorporadas aqui por referência.

EXEMPLOS [00795] Reagentes comercialmente disponíveis referidos nos Exemplos abaixo foram usados de acordo com as instruções do fabricante, a menos que de outro modo indicado. A menos que de outro modo notado, a presente invenção usa procedimentos padrão de tecnologia de DNA recombinante, tais como aqueles descritos aqui acima e nos seguintes livros didáticos: Sambrook etal., supra; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.

Exemplo 1: Geração de anticorpos anti-alfa-sinucleína (anti-aSyn) [00796] Este Exemplo descreve a geração de anticorpos monoclonais (mAbs) anti-aSyn totalmente humanos que preferivelmente se ligam às fibrilas pré-formadas (PFF), compostas de aSyn do tipo selvagem recombinante humana, mais do que o monômero de aSyn.

[00797] Anticorpos monoclonais anti-aSyn humana foram gerados na cepa HCo42 de camundongos transgênico HuMAb® (HuMAb é uma Marca Comercial de Medarex, Inc., Princeton, Nova Jersey) e camundongos KM (a cepa KM Mouse® contém o transcromossoma SC20 como descrito na publicação de PCT WO 02/43478).

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167/252 [00798] Proteína mutante de A53T-PFF de aSyn ou tipo selvage de aSyn humana recombinante e aSyn tipo selvagem ou A53T PFF reticuladas foram usadas para imunizar os camundongos transgênicos humanos recombinantes. Os camundongos usados em Fusão 5448 foram imunizados por meio de injeções intraperitoneais (IP) e subcutâneas (SC) de 25 pg por camundongo de A53T-PFF de aSyn em adjuvante Ribi. Camundongos HCo42 usados na Fusão 5450 foram imunizados IP + Sc + Hock com 25 pg por camundongo de uma mistura (1:1:1:1) de Tipo Selvagem-PFF de aSyn, A53T-PFF de aSyn, Tipo Selvagem-PFF de aSyn reticulada, e A53T-PFF de aSyn reticulada. Uma mistura de antígeno de PFF de matéria prima foi feita misturando 200 pL de cada 1 mg/mL de PFF de matéria prima (WT, A53T, e WT reticulado e A53T). Os antígenos foram suspendos em adjuvante Ribi. Os camundongos selecionados para fusão e geração de hibridoma receberam reforço adicional intravenoso/intraperitoneal (IV/IP) de antígeno em salina tamponada por fosfato de Dulbecco (DPBS) 3 dias antes da fusão.

[00799] Após as fusões de espenócitos e linfonodos com células P3x63Ag8.653, as placas de fusão foram analisadas quanto aos anticorpos específicos de antígeno testando a presença de mAbs gama humanos/capa humanos. As células de placas de fusão foram testadas quanto à especificidade de ligação aos monômeros de aSyn nativos ou PFF de aSyn. Os hibridomas positivos de PFF de aSyn selecionados de análise funcional foram subclonados por subclonagem de célula simples para garantir a estabilidade da linhagem celular e monoclonalidade do hibridoma. Cada subclone foi testado novamente por ELISA quanto à ligação específica de antígeno (isto é, ligação de PFF de aSyn), produzindo os seguintes subclones: 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 7A10, 36A3, 44B11, e 21 A3. A análise de isótipo revelou todos os 6 anticorpos a serem IgG 1/capa humana por

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ELISA. As sequências de aminoácido e nucleotídeo das cadeias pesadas e leves, regiões variáveis de cadeia pesada e leve, e CDR1-3 de cadeia leve e pesada são fornecidas na Tabela 22.

[00800] As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de 7A10 consistem nas sequências de aminoácido 8 e 9, respectivamente. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de 11H11-1 consistem nas sequências de aminoácido 28 e 29, respectivamente. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de 11H11-2 consistem nas sequências de aminoácido 28 e 29, respectivamente. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve of 15A5 consistem nas sequências de aminoácido 38 e 39, respectivamente. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de 21 A3 consistem nas sequências de aminoácido 48 e 49, respectivamente. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de 36A3 consistem nas sequências de aminoácido 58 e 59, respectivamente. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de 44B11 consistem nas sequências de aminoácido 68 e 69, respectivamente. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de 2E2 consistem nas sequências de aminoácido 78 e 79, respectivamente. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de 23H8-1 consistem nas sequências de aminoácido 94 e 95, respectivamente. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de 23H8-2 consistem nas sequências de aminoácido 94 e 96, respectivamente. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de 23H8-3 consistem nas sequências de aminoácido 94 e 97, respectivamente. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de 1E8 consistem nas sequências de aminoácido 106 e 107, respectivamente.

[00801] Versões sem função efetora dos anticorpos anti-aSyn descritos acima foram também geradas. Como usado aqui, hlgGlf refere-se a um alotipo de lgG1 tendo a sequência de aminoácido mencionada na SEQ ID NO: 117, e hlgG1.3f refere-se a uma versão

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169/252 mutante tripla de hlgGlf (L234A, L235E, G237A) que não tem ligação de receptor de Fc gamma e função efetora. hlgG1.3f tem a sequência de aminoácido mencionada na SEQ ID NO: 119.

Exemplo 2: Mapeamento de epitopo de anticorpos anti-aSvn [00802] Sítios de ligação do epítopo dos anticorpos anti-aSyn anticorpos descritos no Exemplo 1 foram determinados usando uma série de peptídeos sobrepostos de aSyn.

[00803] Uma série de peptídeos sobrepostos com 10 a.a. de sequência de aSyn humana foi gerada com um grupo biotina Nterminal e um ligante de PEG4 e um CONH2 C-terminal (Tabela 1). Os peptídeos foram solubilizados em DPBS a 1 mg/ml. Para os estudos de mapeamento, 100 μΙ_ de 0,25 pg/ml de peptídeos de a-sinucleína em DPBS foram adicionados a uma placa de 96 cavidades de alta capacidade revestida com NeutrAvidina (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) e incubados em temperatura ambiente durante 2h (o durante a noite a 40). As placas foram lavadas 3 vezes com -300 μΙ_ de tampão de lavagem (0,05%Tween em DPBS). As placas foram em seguida bloqueadas com 150 μΙ de 3% de BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em DPBS em temperatura ambiente durante ~2h (ou durante a noite a 40). 100 μΙ de amostras testes diluídas em tampão de amostra (0,1% de BSA/0,05% de Tween/dPBS, 2 péletes de inibidor de protease (Roche completo, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em 50 ml de tampão foram incubadas nas placas em temperatura ambiente durante 2h. As placas foram lavadas 3 vezes. 100 μΙ de anticorpo secundário diluídos 1:1000 em PBSTB (1% de BSA/0,2% de Tween/DPBS) foram adicionados e incubados em temperatura ambiente durante 1hr. As placas foram lavadas 3 vezes durante 5-10 min cada lavagem. 100 μΙ de substrato de AP (Tropix GDP Star pronto para o uso com Sapphire II, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) foram adicionados e desenvolvidos em temperatura ambiente durante

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170/252 min. As contas de luminescência foram lidas com um Perkin Elmer EnVision (2102 Multilabel Reader, PerkinElmer, Waltham, MA). As placas foram mantidas sob agitação constante (Agitador de placa de titulação) durante o ensaio. Os anticorpos secundários usados incluíram IgG anti-humano de burro de fosfatase a\ca\\na-affinipure, (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), IgG anticoelho de burro de fosfatase a\ca\\na-affinipure, (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), IgG anticamundongo de burro de fosfatase alcalinaaffinipure, (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Todos os anticorpos secundários foram diluídos para 50% de concentração final de glicerol.

[00804] Um experimento inicial determinou que todos os anticorpos reconheceram os epitopos localizados dentro da região C-terminal de aSyn. Os peptídeos sobrepostos mostrados na Tabela 1 foram usados para também refinar os sítios de ligação de epítopo de cada anticorpo.

Tabela 1: Peptídeos de mapeamento de epítopo

Região^a de aSyn (a.a.)	Sequência (SEQ ID NO)
105-115	EGAPQEGILED (130)
106-116	GAPQEGILEDM (131)
107-117	APQEGILEDMP (132)
108-118	PQEGILEDMPV (133)
109-119	QEGILEDMPVD (134)
110-120	EGILEDMPVDP (135)
111-121	GILEDMPVDPD (136)
112-122	ILEDMPVDPDN (137)
113-123	LEDMPVDPDNE (138)
114-124	EDMPVDPDNEA (139)
115-125	DMPVDPDNEAY (140)
116-126	MPVDPDNEAYE (141)
117-127	PVDPDNEAYEM (142)

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Tabela 1: Peptídeos de mapeamento de epitopo

Região^a de aSyn (a.a.)	Sequência (SEQ ID NO)
118-128	VDPDNEAYEMP (143)
119-129	DPDNEAYEMPS (144)
120-130	PDNEAYEMPSE (145)
121 - 131	DNEAYEMPSEE (146)
122-132	NEAYEMPSEEG (147)
123-133	EAYEMPSEEGY (148)
124-134	AYEMPSEEGYQ (149)
125-135	YEMPSEEGYQD (150)
126-136	EMPSEEGYQDY (151)
127-137	MPSEEGYQDYE (152)
128-138	PSEEGYQDYEP (153)
129-139	SEEGYQDYEPE (154)
130-140	EEGYQDYEPEA (155)

^aPeptídeos sobrepostos com 10 a.a. de sequência de aSyn humana foram gerados com um grupo biotina N-terminal e um ligante de PEG4 e um CONH2 C-terminal.

[00805] Os resultados de mapeamento de epitopo são mostrados na Figura 1. Os dados mostram que 7A10, 21 A3, 15A5, 36A3, e 1E8 se ligam dentro dos aminoácidos 123-128 de aSyn, correspondendo à sequência de aminoácido EAYEMP (SEQ ID NO: 121); 11H11-1 ligase dentro dos aminoácidos 125-128 of aSyn, correspondendo à sequência de aminoácido YEMP (SEQ ID NO: 122); 44B11 liga-se dentro dos aminoácidos 130-139 de aSyn, correspondendo à sequência de aminoácido EEGYQDYEPE (SEQ ID NO: 124); 2E2 ligase dentro dos aminoácidos 119-126 de aSyn, correspondendo à sequência de aminoácido DPDNEAYE (SEQ ID NO: 125); e 23H8 ligase dentro dos aminoácidos 130-138 de aSyn, correspondendo à

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172/252 sequência de aminoácido EEGYQDYEP (SEQ ID NO: 123).

Exemplo 3: Seletividade de anticorpos anti-aSyn para aSyn-PFF mais do ciue monômeros de aSyn [00806] Este Exemplo demonstra que os anticorpos anti-aSyn preferencialmente se ligam à aSyn-PFF mais do que os monômeros de aSyn.

[00807] A aSyn humana do tipo selvagem recombinante (rPeptide, Bogart, GA) e aSyn humana contendo a mutação A53T (rPeptide, Bogart, GA) foram reconstituídas para 1 mg/ml em Tris/HCI a 20 mM, NaCI a 100 mM, PH7.4. PFF foi gerada usando um protocolo padrão (Luk et al., PNAS 2007;106:20051-6). Resumidamente, os monômeros foram incubados em tubos Eppendorf safe-lock de 2 ml (~1ml/frasconete) a 37Ό com agitação constante (Agitador de placa de titulação) durante 4 dias e em seguida centrifugados a 100.000g em temperatura ambiente durante 20 min. As péletes foram ressuspensas com PBS para uma concentração de PFF final de 1 mg/ml.

[00808] A fibrilização de aSyn foi monitorada por um ensaio de ligação de Tioflavina T, eletroforese em gel desnaturante (SDS-PAGE) e não desnaturante (nativo), e cromatografia por exclusão de tamanho (SEC-HPLC). Para ensaio de tioflavina-T, as amostras foram diluídas para 0,5 mg/ml em PBS e foram adicionadas a um volume igual de 25 μΜ de Tioflavina-T. As amostras foram em seguida medidas usando uma leitora de placa de multirrótulos Envision (PerkinElmer, Waltham, MA) com os comprimentos de onda de excitação e emissão estabelecidos a 485 e 535 nm, respectivamente. Os níveis de proteína totais foram avaliados tanto com um Kit de Ensaio de Proteína Micro BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) e ensaio de manchamento de proteina imperial (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

[00809] Para análise de SDS-PAGE, as amostras de PFF em

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173/252 agente redutor de amostra NuPAGE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) foram incubadas em bloco de aquecimento (70Ό) durante 10 min, separadas por SDS-PAGE (1 pg/1 ΟμΙ/linha) usando 412% de gel Bis-Tris (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) com tampão de execução MES SDS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) em voltagem constante a 200V, e em seguida transferidas para membrana de nitrocelulose (tamanho de poro de 0,45um, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) usando tampão de Tris/glicina (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) contendo metanol a 10% em voltagem constante 50V, 1,5h. Para Native-PAGE, amostras de PFF foram separadas por NativePAGE (1 pg/10 μΙ/linha) usando 3-12% de gel de proteina Bis-Tris (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) com tampão de execução NativePAGE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) em voltagem constante 150V e em seguida transferidas para membrana de PVDF (tamanho de poro de 0,45um, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) usando tampão de transferência NuPAGE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) em voltagem constante 50V, 1.5h. Membranas de PVDF foram pré-tratadas com metanol durante 30 seg, dH20 durante 2min e tampão de transferência durante 10 min. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em pó desnatado (Thermo Fisher Scientific, Waltham) em 0,1% de Tween/TBS em temperatura ambiente durante 2h, em seguida incubadas com o anticorpo primário 4B12 (BioLegend, San Diego, CA) 1:1000 diluídas em 1% de BSA/0,1% de Tween/TBS a 4Ό durante a noite. As membranas foram em seguida lavadas 3 vezes (5~10min cada lavagem) com 0,1% de Tween/TBS, e em seguida incubadas com IgG anticamundongo (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Fab2 purificado por afinidade conjugado com peroxidase) 1:10,000 diluídas em 1% de BSA/0,1% de Tween/TBS em temperatura ambiente durante 1 h. As membranas foram em seguida lavadas 3 vezes como

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174/252 acima e em seguida incubadas durante 5 min com SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). A detecção foi realizada usando o GE Amersham imager 600. MagicMark™ XP Western Protein Standard (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) e SeeBlue plus 2 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) foram usados para SDS-PAGE. NatTveMark Unstained Protein Standard (Invitrogen) foi usados para géis nativos. O tampão de lavagem (TBST) consistia em 0,1% de Tween-20 em salina tamponada por Tris.

[00810] Para o ensaio de ligação, placas de 96 cavidades (microplaca de ligação elevada) foram revestidas com 100 μΙ de 1 pg/ml de PFF de aSyn tipo selvagem em DPBS em temperatura ambiente durante 2h (ou durante a noite a 4Ό). As placas foram lavadas 3 vezes com -300 μΙ_ de tampão de lavagem (0,05% de Tween em DPBS). As placas foram bloqueadas com 150 μΙ de 3% de BSA/DPBS em temperatura ambiente durante 2h (ou durante a noite a 4Ό). Diluições seriais de 3 vezes de PFF (partindo de 2 pg/ml) e monômero de α-syn tipo selvagem (partindo de 20 pg/ml) foram preparadas em tampão de amostra (0,1% de BSA/0,05% de Tween/DPBS, 2 péletes de inibidor de protease (Roche completo, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em 50 ml de tampão). Para incubações de anticorpo, volumes iguais de concentração de ensaio de 2 vezes de PFF ou monômero de aSyn foram misturados com concentração de ensaio de 2 vezes de anticorpos em placas de baixa ligação BD Falcon e incubadas em temperatura ambiente durante ~2h. 100 μΙ de misturas de anticorpo e PFF ou monômero foram adicionados às placas revestidas com PFF e incubados em temperatura ambiente durante 10 min. As placas foram lavadas 3 vezes. 100 μΙ de IgG antihumano de burro (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, com 50% de glicerol) diluídos 1:1000 em PBSTB (1% de BSA/0.2% de

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Tween/dPBS) foram adicionados e as placas incubadas em temperatura ambiente durante 1 hr. As placas foram lavadas 3 vezes durante 5—10 min por lavagem. 100 μΙ de substrato de AP (Tropix CDP Star Ready-to-Use With Sapphire II, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) foram adicionados e desenvolvidos em temperatura ambiente durante 30 min. As contas de luminescência foram lidas com um Perkin Elmer EnVision (2102 Multilabel Reader, PerkinElmer, Waltham, MA). PFF foi sonicada com pulsos de 1 seg 15 vezes antes de revestir ou misturar com os anticorpos. As placas foram mantidas sob agitação constante (Agitador de placa de titulação) durante o ensaio.

[00811] Como mostrado na Figura 2, anticorpos anti-aSyn foram avaliados quanto à potência de ligação ao monômero de aSyn e às PFFs de aSyns tipo selvagem ou A53T. Os dados do anticorpo 1 de controle são também mostrados na Figura 3. A ligação similar à PFF do tipo selvagem e PFF A53T foi observada para todos os anticorpos testados, com a exceção de Anticorpo 1 e Anticorpo 2 de anticorpos de controle, todos os seis anticorpos anti-aSyn preferencialmente se ligam PFF de aSyns mais do que os monômeros de aSyn, com relações de M/P de pelo menos 500. Um sumário dos dados de ligação é mostrado na Tabela 2.

Tabela 2: Sumário dos resultados de ensaio de ligação

Anticorpo	Ligação ao Monômero (nM)	SD	Ligação à PFF (nM)	SD	Relação³de M/P	n
21A03	291	481	0,16	0,05	1819	4
7A10	779	694	0,15	0,03	5193	5
15A5	582	795	0,18	0,06	3233	5
36A3	350	224	0,49	0,11	714	6
11H11-1	>700		1,38	0,41	>500	5
44B11	>700		0,41	0,10	>1700	6
Anticorpo 1^b	0,86	0,11	0,077	0,009	11	19
Anticorpo 2^b	17	1,3	5,18	0,53	3	3

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176/252 ^a M/P = relação de ligação ao monômero/PFF o (relação menor significa preferência maior para PFF) ^b Anticorpo 1 e Anticorpo 2 são anticorpos de controle

Exemplo 4: Desimunizacão de anticorpos anti-aSyn [00812] Este Exemplo determinou o efeito que a desimunização de um subgrupo de anticorpos anti-aSyn tem sobre a ligação aos monômeros de aSyn e PFFs de aSyn.

[00813] A fim de remover os possíveis hotspots imunogênicos através da humanização, as sequências das cadeias pesadas e leves de 7A10 foram analisadas quanto à imunogenicidade. Uma análise de 7A10 quanto à ligação a 27 HLAs comumente encontradas nos alelos de população mundial e identificação de segmentos de linhagem não germinativa foram realizadas para determinar os possíveis hotspots imunogênicos.

[00814] A ligação aos alelos de MHC-II de um peptídeo cognato (formado como subproduto da endocitose e degradação do biológico por células dendríticas) seguida pela apresentação na superfície das células dendríticas é crítica para uma resposta imune adaptativa. Além da ligação aos alelos de MHC-II, entretanto, o peptídeo apresentado deve ser não indígena (não auto) para os receptores de células T CD4+ se para se ligarem a ele (reconhecimento de célula T), desse modo induzindo à ativação e proliferação de célula T. A fim de simular estes efeitos computacionalmente e modelar os efeitos de diversos doadores, o anticorpo é primeiro dividido em peptídeos de de 15 mer a partir do N-terminal e sistematicamente movendo-se para o C-terminal um aminoácido de cada vez. Cada um dos peptídeos de de 15 mer obtidos é avaliado para (i) ligação a cada um dos 27 HLAs comumente encontrados na população mundial, e (ii) sequência perfeita corresponde às sequências de linhagem germinativa da imunoglobulina humana. No caso de uma combinação perfeita da

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177/252 linhagem germinal, o peptídeo de de 15 mer é considerado auto e, portanto, não é considerado antigênico. Por outro lado, se determinado como não auto (ausência de correspondência de linhagem germinal perfeita), é considerado como potencialmente antigênico se ligar-se com afinidade suficiente a alguns dos 27 alelos.

[00815] As predições de afinidade da ligação de peptídeo/MHCII foram feitas usando a ferramenta de consenso de recursos de análise IEDB (Immune Epitope Database). As afinidades previstas foram reportadas como classificações de percentil com base no consenso de cinco diferentes métodos de predição de ligação de peptídeo MHC-II.

[00816] A análise de imunogenicidade das cadeias pesadas e leves de 7A10 é mostrada na Figura 4. Os resultados da análise mostram que a cadeia leve (VK) está prevista ser principalmente nãoimunogênica, com os únicos hotspots localizados em CDR3 que está tipicamente envolvida na ligação de epitopos. A cadeia pesada (VH) tem duas regiões mostrando os hotspots a serem espalhados por grandes regiões, ou seja, CDR2 (resíduos 49-65) e FW3-CDR3 (resíduos 90-98). Ignorando hotspots com menos de 8 trechos de comprimento, apenas duas regiões na cadeia VH (49-65, 90-98) foram consideradas para eliminação do risco por mutagênese.

[00817] O número abaixo de cada aminoácido na Figura 4 denota a proporção de alelos que ligam um peptídeo de de 15 mer centrado naquele aminoácido. Por exemplo, 5 em Y52 em 7A10_VH refere-se ao peptídeo de de 15 mer centrado em Y52, isto é, LEWIGYYYYSGRTKY e denota que (i) este peptídeo não tem uma correspondência de germinação humana (consequentemente não auto), e (ii) entre 50-60% dos 27 alelos mostram alta afinidade de ligação a este peptídeo. Os números são atribuídos uma cor em uma escala de cinza claro (menos provável de ser imunogênico) a cinza escuro (hotspot imunogênico mais provável). As 3 setas em negrito

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178/252 mostram as posições para as seleções mutantes: R56S, K58N e T93A. [00818] O risco de imunogenicidade humana foi avaliado quanto a 7A10 e 7A10-T93A desimunizado usando um ensaio de proliferação de PBMC humano in vitro. Avastina e alL-21R mAb foram usados como controles de ensaio negativo e positivo, visto que sua imunogenicidade clínica correlaciona-se positivamente com os resultados do ensaio de imunogenicidade in vitro. Os PBMC de voluntários saudáveis foram isolados por centrifugação gradiente Ficoll (GE Healthcare) e o antígeno leucocitário humano (HLA). A Classe II foi caracterizada utilizando amplificação da reação em cadeia da polimerase e hibridização com sondas oligonucleotídicas (Prolmmune). Para cada ensaio foi usado um painel de 40 doadores de PBMC compostos por tipos HLA de Classe II que se aproximam das frequências da população mundial. Os PBMC foram marcados com CFSE (succinimidil éster de carboxifluoresceína, Invitrogen) para monitorar a proliferação e semeados em placas de 96 cavidades em 6 réplicas a 200.000 células por cavidade em RPMI (Lonza) contendo 10% de soro AB humano (Bioreclamação), aminoácidos não essenciais (Gibco) e penicilina-estreptomicina (Gibco). Anticorpos de asinucleína e proteínas de controle foram cultivados com PBMC a 1 μΜ durante 7 dias, após os quais os meios foram lavados e as células foram marcadas com um CD4 mAb anti-humano conjugado com APC (Aloficocianina, BD Biosciences). Após a remoção do mAb anti-CD4 não ligado com uma etapa de lavagem, o restante das células foi fixado com formalina (Sigma) de 3,7% em PBS e analisado por citometria de fluxo para determinar a porcentagem de células CD4+ T proliferantes. Um doador é considerado positivo quando o percentual de células CD4+ T proliferantes para um anticorpo em particular é maior do que o percentual de células CD4+ T proliferantes com meios apenas mais dois desvios padrão. Os dados são apresentados como a

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179/252 porcentagem dos 40 doadores que apresentaram um sinal positivo de proliferação.

[00819] A porcentagem de doadores mostrando uma significante resposta à proliferação de célula T CD4+ após incubação com estes anticorpos é mostrada na Figura 5. 7A10 produziu uma resposta proliferative em 21 dos 40 (52,5%) dos doadores de PBMC, e 7A10T93A mostrou uma resposta proliferative em 5 dos 40 doadores (12,5%).

Exemplo 5: Ligação de anticorpos anti-aSyn desimunizados aos monômeros de aSyn e PFFs de aSyn [00820] Este exemplo avaliou a ligação da versão desimunizada de 7A10 descrita no Exemplo 4, bem como uma versão desimunizada de 21 A3, isto é, 21A3-V82L, aos monômeros de aSyn e PFFs de aSyn por ELISA, como descrito no Exemplo 3.

[00821] Como mostrado na Tabela 3, as reversões de 7A10-T93A e 21A3-V82L exibiram potências de ligação à PFF dentro de 2 vezes as potências medidas para os anticorpos origem; os valores de ligação ao monômero foram mais variáveis devido à dificuldade de gerar curvas de resposta à concentração para essas potências relativamente fracas. A reversão de K58Y-T93A foi >10X mais fraca para a ligação à PFF em comparação com 7A10 origem, enquanto as potências de ligação à PFF de R56S-T93A e R56S-K58N-T93A estavam em 2X de 7A10.

Tabela 3: Sumário de desimunizadas	Ligação	de	variantes de	aSyn
	Cone de ensaio (ng/ml)^b	Ligação ao		Ligação
Anticorpo³	monômero (nM)	SD	à PFF (nM)	SD	n
7A10-Vh-R56S-	30	23	15	0,290	0,099	3
T93A-hHC-lgG1,3f
7A10-Vh-K58Y-	10	43	22	2,595	0,285	3

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Tabela 3: Sumário de Ligação de variantes de aSyn desimunizadas

Cone	Ligação à PFF (nM)	SD	n
Anticorpo³	de ensaio (ng/ml)^b	Ligação ao monômero (nM)	SD
T93A-hHC-lgG1,3f 7A10-Vh-R56S-	100	1046	174	0,335	0,035	3
K58N-T93A-lgG1,3f 7A10-Vh-T93A-hHC-	1	3851	661	0,367	0,043	3
lgG1,3f 21 A3-Vh-V82L-hHC-	1	192	58	0,120	0,005	3
lgG1,3f 7A10-hlgG1,3f	1	764	163	0,171	0,009	3
21 A3-hlgG1,3f	1	700	0,0	0,073	0,013	3
	1	1,02	0,0	0,067	0,008	3
Anticorpo 1			7

^a Os dados mostrados é para a lgG1.3 dee isótipo humano inerte de Fc, como indicada ^b Concentração de anticorpo necessária para gerar sinal de controle aceitável

Exemplo 6: Reatividade interespécies de anticorpos anti-aSyn com aSyn de rato, camundongo ou humana [00822] A fim de avaliar a reatividade cruzada de espécies, anticorpos anti-aSyn foram testados quanto à ligação aos peptídeos representando a.a. 111-140 de aSyn de rato, camndongo ou humana (Tabela 4). As sequências de aSyn nas posições 121-122 diferem entre humano, rato e camundongo. O ensaio de ligação foi realizado como descrito no Exemplo 3.

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Tabela 4: Peptídeos 111-140 de aSyn humana, de rato e camundongo

Peptídeo Sequência

111-140 de

H-RRR GILEDMPVDP GSEAYEMPSE EGYQDYEPEA-NH2 Camundongo

111 -140 de Rato H-RRR GILEDMPVDP SSEAYEMPSE EGYQDYEPEA-NH2 111-140 de Ser

H-RRR GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA-NH2 Humano *111-140 de camundongo (SEQ ID NO: 156), 111-140 de rato (SEQ ID NO: 157), 111-140 de humano (SEQ ID NO: 158) [00823] Os anticorpos anti-aSyn exibiram ligação similar aos peptídeos 111-140 de aSyn de rato e camundongo como em comparação com o peptídeo humano correspondente (Figura 6). Um sumário de resultados de ligação de peptídeo é mostrado na Tabela 5. No geral, anticorpos anti-aSyn exibiram potência 2-3 vezes mais fraca para ligação ao peptídeo 111-140 de roedor em comparação com o peptídeo humano correspondente.

Tabela 5: Sumário de ligação aos peptídeos 111-140 de aSyn humana, de rato e camundongo

111-	111- 140
	Ligação àPFF (nM)	140 de	111- 140 de rato (nM)	SD
SD	camun dongo (nM)	SD	humanos (nM)	SD
36A3	0,416	0,062	8892	2888	8884	3591	3890	1207
15A5	0,144	0,012	9190	3505	8262	3195	3161	1658
44B11	0,389	0,038	93485	39183	78582	37897	75569	43663
11H11-1	2,675	1,196	5752	1708	5706	2338	3398	1149
7A10-Vh-
T93A-hHC-	0,423	0,024	8932	1350	9268	1492	4693	950
lgG1.3f
21A3-Vh-	0,086	0,007	6656	3133	6413	3057	3702	2951

V82L-hHCPetição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 196/443

182/252

	Ligação àPFF (nM)	111-	111- 140
140 de	111- 140 de rato (nM)
SD	camun dongo (nM)	SD
SD	huma- nos (nM)	SD
lgG1.3f 7A10- hlgG1.3f	0,135	0,020	11393	534	10964	809	4760	521
21A3- hlgG1.3f	0,095	0,016	13782	4139	12251	3248	6496	1939

Exemplo 7: Reatividade Cruzada de Anticorpos anti-aSyn com aSyn, 8Syn, e vSyn humana [00824] Neste Exemplo, anticorpos anti-aSyn foram testados quanto à ligação e reatividade cruzada à pSyn humana e ySyn humana por ELISA, como descrito no Exemplo 3.

[00825] Como mostrado na Figura 7, anticorpos não se distinguiram entre aSyn, pSyn, ou ySyn humana. A ligação à PFF foi incluída como um controle positivo.

Exemplo 8: Caracterização biofísica de anticorpos anti-aSyn [00826] Este exemplo descreve a caracterização de propriedades biofísicas de anticorpos anti-aSyn usando vários métodos. Os resultados de estabilidade térmica, peso molecular, pl, análises de hidrofobicidade são sumariados na Tabela 6.

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183/252

Tabela 6: Propriedades Biofísicas

Método	Resultado	7A10-lgG1f	7A10lgG1.3f	7A10- T93AlgG1.3f
Espec de Massa	Massa Intacta de LC	Confirma Identidade	Confirma Identidade	Confirma Identidade
Espec de Massa	Massa Intacta de HC	Confirma Identidade	Confirma Identidade	Confirma Identidade
Espec de Massa	Perfil de glicosilação	G0F 56% G1F39% G2F 5%	G0F 48% G1F46% G2F 6%	G0F 50% G1F45% G2F 5%
Estabilidade
térmica	Tm1	70,2	67,6	66,3
(DSC)	Tm2	83,3	83,3	83,2
	Tm3	86,6	86,6	87,1
SEC analítica	% de HMW	0	0	0
	% de LMW	1,4	0	0
iCIEF	pl (medido)	9,22	9,09	9,09
	% principal	84,9	87,2	84,4
	% acídica	10,7	10,9	12,5
	% básica	4,3	2,0	3,1
Hidrofobicid ade (HIC)	% principal	100	100	100

[00827] Para calorimetria de varredura diferencial (DSC), as amostras foram escaneadas em temperatura a GOO/hr em 1 mg/ml de anticorpo. Como mostrado na Tabela 6, todos os anticorpos 7A10

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184/252 mostraram estabilidade de dobramento favorável.

[00828] As identidades de todos os três anticorpos 7A10 mostrados na Tabela 6 foram avaliadas por análise de espectroscopia de massa (EM) intacta. As análises usaram um Espectrômetro de Massa ACQUITY UPLC/Waters Synapt G2. As amostras foram reduzidas por DTT (100 mM) em 1 mg/mL. Condições de UPLC/EM: 1 pg de injeção de amostra na coluna BEH C4 RP, 2,1 x 150 mm, 300 Á, partícula de

1.7 mm a 60°C, 20 min gradiente: 10% a 38% (Fase móvel B) em 10 min, taxa de fluxo de LC 200 pL/min, modo de íon de EM positivo. Este método foi usado também para análise de perfil de glicosilação.

[00829] As identidades de todos os três anticorpos 7A10 foram confirmadas por análise de espectroscopia de assa (EM) intacta com base na concordância de massas medidas e massas teoricamente medidas previstas de sequência de aminoácido. Adicionalmente, os perfis de glicosilação foram determinados e constatados ser típicos para mAbs glicosilados em N297.

[00830] Depois, as homogeneidades de carga foram medidas por iCIEF com as seguintes condições: instrumento ProteinSimple iCE3; pré-foco de 1 min 1500V, foco de 10 min 3000V, amostras relizadas em 0,2 mg/mL em 0,35% de Metil Celulose, Uréia a 2,0 M, 1% v/v Pharmalyte 5-8, e 3% em v/v de Pharmalyte 8-10.5. Marcadores de pl

5.8 e 10,10. A Tabela 6 mostra os valores pl medidos próximo a 9, e 84-87% como o pico principal, com 11-13% de variantes acídicas, e restante básico.

[00831] A homogeneidade dos anticorpos foi também sondada por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), usando as seguintes condições: Coluna Tosoh TSKgel Butyl NPR, Fase móvel A: fosfato de sódio a 0,1 M pH 7,0, sulfato de amônio a 2M, Fase móvel B: fosfato de sódio a 0,1 M pH 7,0, taxa de fluxo: 1,0 mL/min. Como mostrado na Tabela 6, todos os três anticorpos exibiram 100% como pico principal.

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185/252 [00832] A fim de avaliar se os anticorpos se agregam ou são truncados, SEC analítica foi conduzida com as seguintes condições: coluna Shodex K403-4F, tampão = fosfato de sódio a 100 mM, cloreto de sódio a 150 mM, pH7,3, taxa de fluxo = 0,3 mL/min. Como mostrado na Tabela 6, todas as versões de 7A10 não mostraram nenhuma espécie de HMW detectável.

[00833] A estabilidade de 7A10-lgG1f, 7A10-lgG1.3f, e 7A10-T93AlgG1.3f foi também testada sob condições de estabilidade forçada, incluindo concentração elevada e temperatura elevada. Os anticorpos foram concentrados para mais de 100 mg/ml em histina a 20 mM, sacarose a 250 mM, pH 6,0 e armazenados durante 4 semanas a 40. Os anticorpos foram em seguida analisados quanto aos aumentos em espécies de HMW ou LMW. Como mostrado na Tabela 7, houve pouco aumento em qualquer tipo de espécie, indicando que 7A10 tem comportamento de concentrabilidade muito favorável.

[00834] Os anticorpos foram também dialisados no mesmo tampão de histidine em uma concentração final de anticorpo de 10 mg/ml, e incubados a 40 ^QC durante 4 semanas para forçar qualquer degradação química ou física potencial. Como mostrado na Tabela 7, não houve aumento na espécie de HMW para qualquer um do três anticorpos 7A10 examinados. Houve um surgimento de uma pequena quantidade de espécie de LMW (2,5-5%).

[00835] O perfil de carga dos anticorpos foi também medido por CIEF.

[00836] Os anticorpos mostraram distribuições típicas principalmente do pico principal, com espécies acídicas como a maior população seguinte, e básica sendo a menor. As mudanças nas porporções destas espécies carregadas sob exposição a 40°C durante 4 semanas são também típicas para os anticorpos.

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186/252

Tabela 7: Estabilidade Forçada

Método	Resultado	7A10igGif	7A10lgG1.3f	7A10- T93AlgG1.3f	7A10- T93AigGif
Concentrabilidade	Concentração Testada	126 mg/ml	119 mg/ml	140 mg/ml	TBD
	% de HMW T=0	0	0,0	0,0	TBD
	% de HMW após 4 semanas 4°C	0	0,1	0,1	TBD
	% LMW T=0	0	0,0	0,0	TBD
	% LMW após 4 semanas 4°C	0	0,0	0,0	TBD
Temperatura
elevada	aSEC AHMW	0%	0%	0%	TBD
(40°C)	aSEC ALMW	5%	2,5%	2,5%	TBD
	CIEF T principal =0	ND	87,2	84,4	TBD
	CIEF principal 4 semanas a 40°C	ND	59,7	55,2	TBD
	CIEF acídico T=0	ND	10,9	12,5	TBD
	CIEF acídico 4 semanas a 40°C	ND	30,7	34,1	TBD
	CIEF básico T=0	ND	2,0	3,1	TBD
	CIEF básico 4	ND	9,6	10,7	TBD

semanas a 40°C

Exemplo 9: A avidez de ligação de anticorpos anti-aSyn às fibrilas de aSyn pré-formadas [00837] Este exemplo descreve o comportamento de ligação à aSyn de 7A10 usando ressonância plasmônica de superfície (SPR).

[00838] A Figura 8 mostra o comportamento de ligação com o anticorpo capturado na superfície e a aSyn monomérica do tipo selvagem em solução. Este formato permite que a afinidade

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187/252 monovalente seja medida. A aSyn do tipo selvagem mostrou ligação muito baixa e fraca. Ao contrário, quando PFF foi testada como o analito de solução, uma massa muito grande de aSyn foi observada ligar-se. Isto é consistente com um aumento na tensão devido à avidez bivalente da PFF multivalente. Um anticorpo anti-humano de aSyn de controle 1 foi também testado. Como mostrado na Figura 8, o Anticorpo 1 liga a aSyn monomérica e PFF com taxas de associação e dissociação similares, sugerindo que não há aumento de ligação detectável de bivalência/avidez com este anticorpo.

[00839] Em seguida, o formato de ensaio SPR foi otimizado para facilitar uma estimativa de avidez de ligação. Observe que PFF é multimérica e 7A10 é um anticorpo monoclonal normal bivalente. Desse modo, os dados de ligação refletem um realce na afinidade de ligação devido aos efeitos de avidez (veja a Figura 8).

[00840] Como mostrado na Figura 9, 7A10 e 7A10-T93A ligam-se com avidez similar à PFF imobilizada na superfície (7A10: ka (1/Ms): 5.811E+7, kd (1/s): 0,009834, K_D: 1,692E-10 Μ; 7A10-T93A: ka (1/Ms): 8,946E+7, kd (1/s): 0,03873, K_D: 4,329E-10 M). As cinéticas de associação para ambos foram constatadas ser muito rápidas. No entanto, os dois conjuntos de dados foram analisados tão precisamente quanto possível quanto a um modelo de ligação 1:1 para determinar se existe uma diferença discernível na avidez neste formato de ensaio. Com base no ajuste da curva, parece que os anticorpos se ligam com comorbidades que estão dentro de um fator de 4 vezes à PFF imobilizada a uma superfície.

Exemplo 10: Bloqueio da indução de aSyn agregada insolúvel por anticorpos anti-aSyn in vitro [00841] Este exemplo descreve a capacidade dos anticorpos antiaSyn de bloquearem a geração de intracelular, agregados de aSyn insolúveis em detergente, fosforilados (pS129) por PFF ou lisados

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188/252 cerebrais de AMS para induzir o in vitro.

[00842] Os agregados de aSyn intracelulares, insolúveis em detergente, fosforilados (pS129) podem ser induzidos em células cultivadas seguindo o tratamento com PFF ou lisados cerebrais de AMS (Prusiner et al., PNAS 2015:112:E5308-17; Luk et al., PNAS 2007;106:20051-6). Um Sistema similar foi desenvolvido usando neurônios hipocampais de rato superexpressando aSyn A53T humana e medindo a indução de aSyn pS129 insolúvel após exposição de células durante 11 dias com amostras de PFF ou lisado cerebral de AMS.

Métodos

a. Preparação de PFFs e análise da fibrilizacão

PFFs foram preparadas e analisadas usando o método descrito no Exemplo 3.

b. Preparação de human brain lysates [00843] As amostras cerebrais corticais foram obtidas de Banner Health Research Institute (Sun City, AZ). Tecidos cerebrais de AMS de pacientes 12-18, 01-03 e 04-51 foram usados para experimentos de imunodepleção. As amostras cerebrais foram sonicadas em PBS filtrado (1 ml de PBS/100 mg de peso úmido de tecido) com KONTES Micro Ultrasonic Cell Disrupter (saída 40, Sintonização 50) durante 2 x 10 seg. As amostras foram colocadas em tubos Eppendorf de 2 ml e os tubos foram mantidos em gelo úmido durante sonicação. Os lisados cerebrais foram centrifugados a 3.000 g, 4^QC durante 5 min. As alíquotas de sobrenadante foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C. Ensaios de QC incluindo ELISAs de aSyn (total & pS129) foram realizados. Para isolar péletes em centrifugação de alta velocidade, homogeneizados cerebrais anteriormente preparados a 100 mg/ml em PBS foram diluídos 3 vezes para 33,3 mg/ml em PBS gelada seguido por centrifugação a 100.000 x g durante 30 minutos a

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4Ό. Ο sobrenadante foi removido e descartado. A pé lete foi ressuspensa em PBS gelado no mesmo volume como a amostra de partida.

c. Isolamento de cultura cellular primária [00844] Culturas neuronais hipocampais de rato primárias foram preparadas semanalmente de ~7 litros no dia embionário 19 (E19) usando o Sistema de Dissociação de Papaína, de acordo com as instruções do fabricante (Worthington Biochemical). As células hipocampais de rato foram semeadas em placas de imageamento de BD de 96 cavidades revestidas com PDL (~16 placas por semana) em 30.000/cavidade em meio de cultura neuronal, contendo Meio Basal Neural (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) e GlutaMax a 0,5 mM (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), suplementado com 1X B-27 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA).

d. Imunoprecipitacão [00845] O homogeneizado cerebral anteriormente preparado (100 mg/ml) foi diluído 150 vezes em Meio Neurobasal completo (NBM) (meio neurobasal contendo pen/estrep, Glutamax, e suplemento B-27) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Uma função de resposta à concentração de anticorpos de sinucleína foi testada por adição de concentração teste de anticorpo a uma alíquota de homogeneizado cerebral diluído. A amostra foi incubada a 4Ό com incubação de ponta a ponta durante 2 horas seguida pela adição de suspensão de conta de agarose G/Proteína A lavada e bloqueada em diluição de 1:10 para a amostra seguida por incubação durante a noite a 4Ό com incubação de ponta a ponta. As contas de Proteína A/G agarose (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) foram lavadas uma vez com PBS + 0,05% de Tween 20, 3 vezes com PBS, em seguida bloqueadas em PBS + 1% de BSA durante 2 horas a 4Ό; 2 volumes de conta cada etapa; a suspensão de amostra de conta final foi de 1:1 com pélete de

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PBS:conta. Após incubação, as amostras foram centrifugadas a 1500g durante 2 minutos para peletizar as contas. O sobrenadante exaurido foi removido e usado para tratamento no ensaio de imunofluorescência.

e. Ensaio de imunofluorescência [00846] No dia 4 in vitro (DIV), os neurônios hipocampais foram transduzidos com um vetor viral adenoassociado, AAV1 contendo o cDNA para aSyn humana alojando a mutação A53T (GeneDetect, Bradenton, Flórida) em um MOI de 3,000. No DIV 7, as células foram tratadas com amostras teste (6 cavidades por tratamento). Todos os tratamentos foram feitos por meia permuta máxima. Cada placa continha um controle negativo (sem condição de tratamento), um controle positivo (PFF a 10 nM) e um controle indutor não esgotado. No DIV 18 (11 dias após tratamento), as células foram fixadas e manchadas por aSyn insolúvel. Para fixação, uma solução contendo paraformaldeído a 4% e sacarose a 4% e triton a 1% foi adicionada durante 15 min. após fixação, as células foram lavadas três vezes com tampão de lavagem contendo DPBS mais 0,05% de Tween. As células foram em seguida bloqueadas por 3% de BSA e triton a 0,3% em DPBS durante 1-2 horas para bloquear um sinal não específico. Após a etapa de bloqueio, as células foram tratadas com anticorpo primário durante a noite no tampão de bloqueio. Anticorpos primários usados onde anti-aSyn e beta Sinucleína (EP1646Y, Millipore/Abcam; Cambridge, Reino Unido; coelho monoclonal N-terminal, diluição 1:100), anti-aSyn, fosfo S129 (81 A, Covance/Biolegend, Bogart, GAcamundongo monoclonal, diluição 1:1000), e anti-MAP2 (ab5392, Abeam; Cambridge, Reino Unido; galinha policlonal, diluição 1:10.000). No dia seguinte, as placas foram lavadas 3 vezes com DPBS contendo 0,05% de Tween seguido por uma incubação de 1 hora com anticorpos secundários conjugados com fluorescente. Os anticorpos secundários usados foram IgG anticamundongo de cabra Alexa Fluor

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647, diluição 1:500; IgG anticoelho de cabra Alexa Fluor 488, diluição 1:500, IgG antigalinha de cabra Alexa Fluor 568, diluição 1:500 e Hoechst, diluição 1:800. Todos os anticorpos secundários foram obtidos de Invitrogen. As placas foram em seguida lavadas 3 vezes durante 15 minutos cada com DPBS mais 0,05% de Tween, com a lavagem final em DPBS sozinho.

f. Análise imunofluorescente de alto teor [00847] As imagens foram adquiridas em microscópio automatizado ArrayScan™ VTi e sistema de análise de imagem (Cellomics Inc., Pittsburgh, PA) com objetiva x10. As placas fotografadas foram analisadas com o pacote de software High Content Studio 3.0 (Cellomics, USA) usando a aplicação de perfil neuronal. As células foram identificadas com fluorescência Hoechst que define a área nuclear, e neuritos foram identificados por manchamento com MAP2. A soma celular foi identificada pela sobreposição de manchamento nuclear e MAP2. A Syn total insolúvel e a Syn total fosforilada em S129 (pS129) foram identificadas pelas intensidades de fluorescência em dois canais adicionais. A indução foi quantificada pela intensidade total da mancha de pS129 em neuritos. A indução da dobra foi determinada pela normalização para a média das cavidades de controle negativo. Um índice de toxicidade foi calculado multiplicandose a contagem de núcleos normalizados, contagem neuronal normalizada e comprimento de neurito normalizado, com cada cavidade normalizada a os respectivos valores médios das cavidades de controle negativo. As cavidades com escores de toxicidade inferiores a 0,6 foram excluídas da análise. Os valores de indução de dobra para cada concentração do teste de anticorpos foram normalizados para a média das cavidades tratadas com o indutor não depauperado. As curvas de resposta à concentração foram geradas por um ajuste de mínimos quadrados em Prism (GraphPad) usando a

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192/252 equação Y=Base + (Topo-Base)/(1 + 10^A((X-LoglC50))) e IC50s calculados para cada experimento.

Resultados [00848] Como mostrado na Figura 10A, a superexpressão de aSyn A53T usando AAV-hA53T-aSyn resultou em um aumento robusto no sinal de pS129 induzido por PFF como medido por análise de imunofluorescente de alto teor. O sinal de pS129 induzido por PFF foi dependente de dose, e não pôde ser eliciado com várias concentrações de monômero hA53T-aSyn até 300 nM (Figura 10B). Além disso, o tratamento com 9 amostras diferentes de lisado cerebral de AMS também induziu o sinal de pS129 (Figura 10C); no entanto, a indução não foi observada com lisados cerebrais de controle (Figura 10D). Aumentos dependentes de PFF no sinal de pS129 correlacionaram-se com a diminuição dos pontos de ramificação dos neurônios positivos para MAP2 (Figura 10E). A atividade indutora nos lisados de AMS pode ser isolada por centrifugação em alta velocidade (Figura 10F), sugerindo que o indutor nestas amostras é um agregado de peso molecular elevado. Além disso, um aumento dependente do tempo no sinal de pS129 foi visto após o tratamento com a pélete de AMS (7d de incubação: 0,22±0,06 de PFF a 10 nM, n=6; 14d de incubação: 0,32±0,05 de PFF a 10 nM , n=6; incubação 18d: 0,52±0,08 de PFF a 10 nM , n=6) (Figura 10G). Finalmente, similar à patologia induzida observada com PFF de hA53T-aSyn, uma redução nos pontos de ramificação também foi observada após tratamento com amostras de lisado cerebral de AMS (PFF a 10 nM: 0,50±0,16, n=4300; AMS: 0,58±0,17, n=1842; Figura 10H).

[00849] O ensaio de alto teor foi usado para avaliar a capacidade de diferentes anticorpos de Syn de imunoesgotar a atividade de indução (isto é, fosforilação induzida por PFF de S129) de amostras de lisado cerebral de PFF e AMS. Foram testados lisados feitos de 3

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193/252 diferentes pacientes de AMS, 12-18, 01-03, 04-51. Para imunodepleção, as amostras foram incubadas durante a noite com uma faixa de concentrações de anticorpos. Imunocomplexos foram então removidos e as amostras esgotadas foram incubadas com culturas neuronais durante 11d. A indução foi medida pela intensidade de de pS129 normalizada a a média das cavidades de controle não esgotadas. As curvas de resposta à concentração para imunodepleção com o Anticorpo 1 de anticorpo anti-Syn de referência são mostradas na Figura 11, e IC50s são sumariados nas Tabelas 8-11. O anticorpo 1 exibiu potente e completa depleção do indutor tanto de lisados cerebrais de PFF quanto AMS. Estes resultados confirmam que a atividade indutora no lisado de AMS é dependente de Syn. O anticorpo 1 foi mais potente para esgotar a atividade indutora da PFF (0,032 nM, Tabela 8) comparada com os lisados de AMS (5,47 nM, 2,48 nM e 0,43 nM, Tabelas 9-11) sugerindo que podem existir diferenças nos níveis ou conformação destas espécies indutoras.

[00850] Em seguida, anticorpos 7A10, 21 A3, 36A3, 15A5, 11H11-1, e 44B11 foram testados quanto à imunodepleção d atividade indutora de lisados cerebrais de PFF e AMS. Curvas de resposta à concentração exemplars para 7A10, 21 A3, 36A3, 15A5, 11H11-1, e 44B11 são mostradas nas Figuras 12-17, respectivamente. Um sumário dos valores IC50 médios para PFF, AMS 12-18, AMS 01-03, AMS 04-51 é sumariado nas Tabelas 8-11, respectivamente. Similar ao Anticorpo 1, todos os 6 anticorpos esgotaram a atividade indutora de PFF de uma maneira dependente de concentração (Figuras 12-17). Os IC50s médios variaram de 0,018 nM a 0,066 nM e não foram significantemente diferentes do IC50 para o Anticorpo 1 (Tabela 8). Todos os 6 anticorpos também completamente esgotaram os lisados de AMS de uma maneira dpendente de concentração; entretanto, ao contrário dos resultados com PFF, alguns dos anticorpos foram

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194/252 significantemente mais potentes do que o anticorpo 1 (Tabelas 9-11). Por exemplo, 7A10 foi significantemente mais potente do que o anticorpo 1 para depetação da atividade indutora de todos os 3 lisados de AMS: 7A10 foi 14 vezes mais potente do que o anticorpo 1 para depleção de AMS 12-18 (p < 0,001, Tabela 9), 9 vezes para AMS 0103 (p < 0,05, Tabela 10) e 12 vezes para AMS 04-51 (p < 0,01, Tabela 11). Similarmente, 21 A3 foi 34 vezes mais potente do que o anticorpo 1 para AMS 12-18 (p < 0,01, Tabela 9), 7 vezes para AMS 01-03 (não significante, Tabela 10), e 10 vezes para AMS 04-51 (p < 0.01). Os anticorpos 15A5 e 36A3 relacionados exibiram tendências similares (Tabelas 9-11). 11H11-1 exibiu diferenças menos robustas em potência em comparação com Anticorpo 1 (Tabelas 9-11). 44B11, que liga um epitopo distinto, foi 3 vezes mais potente do que 9E4 para imunodepleção de lisado de AMS 12-18 (p < 0,05, Tabela 9) e equipotente para o Anticorpo 1 para depleção de lisado de AMS 01-03 (Tabela 10) e lisado de AMS 04-51 (Tabela 11). As diferenças relativas na potência observadas podem ser ligadas às diferenças na conformação ou cepa indutora que impacta a exposição ou acessibilidade de epitopos de anticorpo.

Tabela 8: Sumários de dados de IC50 de PFF

Anticorpo	IC50 (nM)	Desvio a padrão	n	Anticorpo 1 dobrado
Anticorpo 1	0,032	0,049	10
7A10	0,018	0,003	3	1,8
44B11	0,028	0,011	3	1,1
15A5	0,042	0,010	3	0,8
36A3	0,057	0,018	5	0,6
21 A3	0,061	0,016	3	0,5
11H11-1	0,066	0,029	3	0,5
^a Estatísticas	com relação ao Anticorpo 1 e com	base em testes t

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195/252 pareados. ns: p>0,05; * p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. Os resultados de teste t são ns, a menos que indicado de outro modo

Tabela 9: Sumário de dados de IC50 para lisado de AMS 12-18

Anticorpo	IC50 (nM)^a	Desvio padrão	n	Anticorpo 1 dobrado
Anticorpo 1	5,47	6,76	25
21 A3	0,16**	0,11	10	34,1
7A10	0,39***	0,57	13	14,2
15A5	0,61*	0,44	10	8,9
36A3	0,63***	0,62	13	8,7
11H11-1	0,76*	0,67	6	7,2
44B11	2,21*	2,70	10	2,5
^a Estatísticas	; com relação	ao Anticorpo	1 e	com base em teste t
pareado. ns:	p>0,05; * p < 0	,05; **p < 0,01;		< 0,001. Os resultados

de teste t são ns, a menos que indicado de outro modo

Tabela 10: Sumário de dados de IC50 para lisado de AMS 01-03

Anticorpo	IC50 (nM)^a	Desvio padrão	n	Anticorpo 1 dobrado
Anticorpo 1	2,48	1,68	9
7A10	0,28*	0,27	6	8,8
21 A3	0,37	0,31	6	6,7
36A3	0,55	0,42	7	4,5
15A5	0,59*	0,60	6	4,2
11H1-1	2,60	2,07	6	1,0
44B11	2,70	2,06	6	0,9
^a Estatísticas	; com relação	ao Anticorpo	1 e	com base em teste t
pareado. ns:	p>0,05; * p < 0	,05; **p < 0,01;	★ ★★p	< 0,001. Os resultados

de teste t são ns, a menos que indicada de outro modo

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196/252

Tabela 11: Sumário de dados de IC50 para lisado de AMS 04-51

Anticorpo	IC50 (nM)^a	Desvio padrão	n	Anticorpo 1 dobrado
Anticorpo 1	0,43	0,24	8
7A10	0,04**	0,01	6	12,0
21 A3	0,05**	0,02	6	9,5
15A5	0,12**	0,11	6	3,6
11H11-1	0,15*	0,13	6	2,9
36A3	0,17*	0,08	6	2,5
44B11	0,41	0,10	6	1,1
^a Estatísticas com relação	ao Anticorpo	1 e	com base em teste t
pareado. ns:	p>0.05; * p < 0.05; **p < 0.01;		< 0.001. Os resultados

de teste t são ns, a menos que indicado de outro modo [00851 ] As variantes desimunizadas de 7A10 e 21 A3 também foram testadas para imunodepleção de extrato de AMS 12-18 para avaliar o impacto das modificações de aminoácidos sobre a atividade de anticorpos. Como mostrado na Tabela 12, 7A10-T93A exibiu potência similar para esgotar a atividade indutora da AMS 12-18 (0,66 nM) em comparação com o anticorpo 7A10 (0,52 nM); em contraste, outras variantes de 7A10 foram 10-100 vezes mais fracas que ο 7A10 origem. A variante V82L de 21 A3 exibiu potência semelhante à de 21 A3 origem (Tabela 12). Considerados juntos, estes resultados sugerem que as modificações em 7A10-T93A e 21A3-V82L não impactam a atividade global de anticorpos.

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Tabela 12: Sumário de dados de IC50 com lisado de AMS 12-18

Anticorpo	IC50 (nM)^a	Desvio padrão	n
7A10 hlgG1.3f (origem)	0,52	0,28	3
7A10-Vh-T93A-lgG1.3f	0,66	0,53	3
7A10 Vh-R56S-T93A-hlgG1.3f	9,00	3,15	3
7A10-Vh-K58Y-T93A-lgG1,3f	4,65	2,62	2
7A10-Vh-R56S-K58N-T93A-lgG1,3f	51,05	38,54	2
21 A3-hlgG1.3f (origem)	0,19	0,22	3
21A3-Vh-V82L-lgG1.3f	0,11	0,03	3

^a Estatísticas com relação ao 7A10 ou 21 A3 de origem e com base em teste t pareado. ns: p>0,05; * p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. Os resultados de teste t são ns, a menos que indicado de outro modo.

[00852] Em conclusão, 7A10, 21 A3, 36A3, 15A5, 11H11-1 e 44B11 apresentaram uma potente e completa depleção da atividade indutora de agregados dos PFF e de 3 diferentes lisados de AMS. Estes resultados, em conjunto com os resultados dos exemplos anteriores, sugerem que os anticorpos se ligam preferencialmente a uma forma de aSyn encontrada nestes extratos de cérebro da doença que pode ser responsável pela propagação da patologia e, desse modo podem ser eficazes no bloqueio da transmissão da patologia de aSyn in vivo.

Exemplo 11: Bloqueio de patologia de aSyn por anticorpos anti-aSyn in vivo [00853] Este exemplo descreve a capacidades dos anticorpos antiaSyn de inibirem a propagação e transmissão de patologia de aSyn em um modelo de camundongo.

Métodos

a. Camundongos [00854] Os camundongos usados nos estudos eram camundongos [PAC-Tg(SNCA^^3T)^+/+Snca~^A] (PAC-A53T) fêmeas e machos de 2 a 3

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198/252 meses de idade transportando a mutação A53T humana em uma base de nocaute de camundongo Snca (Kuo et al, Human Molecular Genetics 2010:19:1633-50) e foram usados para estudos de eficácia in vivo. Os camundongos foram alojados em grupos de quatro em salas com temperatura controlada com comida e água disponíveis ad libitum.

b. Tratamento com anticorpo e cirurgia estereotáxica [00855] Aproximadamente 40 μΙ de sangue foram coletados de um subgrupo de camundongos machos e fêmeas PAC-A53T por meio de sangramento retro-orbital para estabelecer a linha de base para os níveis de anticorpo e anti-fármaco-anticorpo (ADA). A coorte inteira de camundongos foi dividida em dois grupos: grupos de controle e tratamento. Os camundongos do grupo de controle receberam uma injeção intraperitoneal (i.p) de solução salina antes da injeção de PBS no estriato e 4 injeções semanais adicionais de solução salina até à conclusão do experimento (n=8). O segundo grupo de camundongos foi dividido em 9 grupos de subtratamento: salina (n=11), anticorpo 1 (n=12), 7A10 (n=12), 11AH11 (n=12), 15A5 (n=11), 21A3 (n=11), 36A3 (n=11), 44B11 (n=12), e anticorpo 3 (n=5). Todos os camundongos do segundo grupo foram inoculados com A53T-PFFs recombinantes após a primeira dose de soro fisiológico ou anticorpo selecionado. Semelhante ao grupo de controlo, os grupos de tratamento receberam 4 injeções semanais adicionais de soro fisiológico ou anticorpo selecionado. A dose de anticorpos em todos os grupos de tratamento foi de 10 mg/kg. A seleção da dose de anticorpos baseou-se no resultado do Estudo I, onde o anticorpo 3 reduziu eficazmente a patologia pSer129 em camundongos PAC-A53T. O tratamento semanal com anticorpos foi precedido por sangramento retro-orbital em um subconjunto de camundongos para avaliar a farmacocinética (PK) e possíveis níveis de ADA em todos os grupos de tratamento. Os camundongos foram sacrificados 30 dias após a inoculação de A53TPetição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 213/443

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PFF e 24 horas após o último tratamento com anticorpo.

[00856] Injeções etereotáxicas: Para injeções estriatais unilaterais, os camundongos foram anestesiados por meio de inalação de isoflurano (1-4%) e colocados em uma estrutura estereotáxica com um cone nasal acoplado para manter a anestesia induzida por isoflurano durante todo o procedimento. O sítio cirúrgico foi preparado com betadina seguida de álcool isopropílico a 70% e uma incisão cutânea de 1-2 cm foi feita para expor o crânio e os pontos de referência. Foram utilizados cotonetes de algodão estéreis para limpar suavemente o crânio. Uma broca de microbarra de carboneto estéril foi usada para perfurar um orifício a uma profundidade de 0,5-1 mm através da superfície do crânio. Os camundongos foram injetados unilateralmente com 10 ug de A53T-PFFs ou PBS (grupo controle) em um estriato lateral (AP 0,2, ML -2,0, DV-3,6). O material foi injetado através de uma seringa Hamilton em uma taxa de 0,25 μΙ por minuto (2,5 μΙ totais por camundongos) com a agulha no lugar durante >10 min no alvo. Os camundongos foram transferidos para seu alojamento uma vez que foram totalmente recuperados da cirurgia.

c. Imuno-histoguímica (IHC) [00857] Os camundongos foram sacrificados para avaliação da patologia 30 dias após as injeções de A53T-PFF. Para estudos histológicos, os cérebros foram fixados em 4% de Paraformaldeído (PFA) durante 48 horas seguidas por 24h em 15% de sacarose e em seguida durante 48h (ou até o uso) em solução de sacarose a 30%. Seções cerebrais seriais de 40 pm, coronais foram preparadas em um micrótomo deslizante (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) e colocadas em crioprotetor até a análise do IHC. O procedimento de IHC incluiu as seguintes etapas: as seções cerebrais foram transferidas para pratos de manchamento e enxaguadas em Salina Tamponada por Fosfato (PBS, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)

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200/252 vezes (5 min/enxágue). As seções em seguida foram pós-fixadas durante 10 minutos em formaldeído a 3,7% (em PBS). Em seguida, foram lavadas duas vezes em PBS (10min/lavagem). Em seguida, as seções foram incubadas em um H2O2 a 3% fresco, Metanol a 10% em PBS durante 30 min para se livrar da atividade de peroxidase endógena. As seções foram lavadas 3 vezes em PBS (10 min/lavagem) seguida por uma hora de bloqueio em soro normal a 10% (usando soro da espécie do anticorpo secundário) mais 0,3% Triton X-100 em PBS em temperatura ambiente. As fatias foram então lavadas 3 vezes em PBS (10 min/lavagem). As fatias cerebrais foram incubadas durante a noite em um anticorpo primário [Anti-alfa-syn pSer129 (Abeam, Cambridge, Reino Unido; ab51253) em diluição de 1:100.000] a 4 ^QC em um agitador de placa de microtitulação em uma velocidade para gentilmente, porém uniformemente agitar as seções. No segundo dia de IHC, as seções cerebrais foram lavadas x4 vezes em PBS (10 min/lavagem) e depois incubadas no 2- anticorpo biotinilado (1:500 anti-coelho de cabra em PBS, Vetor BA-1000) durante 60 min. As seções foram em seguida lavadas em PBS (4 vezes, 10 min/lavagem) e posteriormente incubadas no complexo ABC feito em PBS durante 60 min em temperatura ambiente (kit Elite ABC, Vector laboratories, Burlingame, CA). Após a lavagem em PBS (4 vezes, 10 min/lavagem), as seções foram incubadas durante 10 min em substrato de peroxidase (Vetor Cat. # SK-4100, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Por último, as seções cerebrais foram enxaguadas em PBS (4 vezes, 10 min/lavagem) e montadas em um Superfrost Plus Micro Slides (VWR, Randor, PA). As lâminas foram secadas ao ar e subsequentemente contramanchadas em soluções de Hemotoxylin e Scott's Blue seguido por séries de enxágue com etanol. As lâminas foram finalmente revestidas usando Permount e vidro de cobertura micro (VWR, Randor, PA) e deixadas secar para varredura e

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201/252 análise de quantificação IHC.

[00858] Quantificação de IHC: Seções cerebrais montadas em lâminas de vidro foram imageadas com o uso de scanners de slides Aperio AT2. Todas as lâminas de cada estudo foram imageadas usando a mesma potência de iluminação e exposição da câmera. Aproximadamente 2 lâminas de cada animal foram analisadas, cada uma com ~20 seções coronais cerebrais montadas. Após a aquisição da imagem, seções cerebrais contendo a região de interesse (ROI), a) Córtex primário junto com a região de Cingulado Giro (interaural 5,48 mm-2,96 mm, bregma 1,69 mm-0,83 mm, 6-10 seções) e b) Regiões de amígdala (interaural 2,72 mm-1,76 mm, bregma 1,07 mm-2,03 mm, 4-6 seções) foram identificados para cada animal usando o software de análise de imagem HALO. A ROI foi delineada para a área total ocupada pelo manchamento pS129 no lado ipsilateral (lado da injeção) e lado contralateral correspondente para ambas as regiões. O manchamento médio de todas as seções delineadas com ROI para cada animal foi em seguida quantificado usando Algoritmo (Indica Labs) - Quantificação de Área. Todas as imagens foram analisadas simultaneamente usando parâmetros limiares idênticos para identificar regiões positivamente manchadas. Área de tecido (pm²), área total de manchamento (pm²), área fraca e área forte de manchamento (pm²), % de tecido positivo de manchamento, % de manchamento fraco e % de tecido positivo de manchamento forte foram analisados. A ANOVA ONE Way seguida do pós-teste de Dunnett foi usada para determinar os efeitos do tratamento.

d. Medição dos níveis de anticorpos no plasma e no cérebro [00859] As placas ELISA (Gostar 3925) foram revestidas com 100 pl de 1 pg/ml de PFF (preparada a partir de α-sinucleína do tipo selvagem, PROTEOS) diluídos em PBS (GIBCO cat#14190) durante 2 horas em temperatura ambiente (RT). A PFF foi sonicada 15 segundos

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202/252 com uma pausa a cada segundo antes do revestimento. As placas foram lavadas quatro vezes com 0,05% de Tween em PBS de Dulbecco (Life Technologies, #1404040-117) e bloqueadas com 150 pl de BSA de 3% (albumina de soro bovino, livre de protease, Fração V, Roch Diagnostic #0311733332001) em DPBS durante 2~3h em RT ou durante a noite a 4Ό. Amostras de plasma e cérebro padrões foram diluídas em 1% de BSA/0,05% de Tween/DPBS contendo inibidor de protease Roche (Roche 11836145001, 1 pélete/25 ml). As amostras (diluições 3~4) 100 pL/cavidade foram carregados em duplicado e incubadas durante ~2 horas em temperatura ambiente. Após as placas terem sido lavadas quatro vezes com 0,05% Tween/DPBS, 100 pl de anticorpos secundários (IgG anti-humano de burro fosfatase alcalina afinipure, Jacksonlmmuno #709-055-149, com 50% de glicerol) 1:1000 diluídos em 1% de BSA/0,2% de Tween/DPBS foram adicionados e incubados durante 1 hora em temperatura ambiente. Após quatro lavagens, as placas foram desenvolvidas com 100 pL de substrato de fosfatase alcalina (Tropix GDP Star Ready-to-Use com Sapphire II, T2214, Life Technologies) durante 30 minutos. As contagens de luminescência foram medidas com Perkin Elmer EnVision (2102 Multilabel Reader). As placas foram mantidas em constante agitação (Agitador de placa de titulação, velocidade 3) durante o ensaio.

e. Medição de anticorpos antifármacos (ADAs) [00860] Um ensaio de imunogenicidade não quantitativo foi desenvolvido para detectar o possível desenvolvimento do anticorpo 1, anticorpo-7A10, anticorpo anti-11AH11, anticorpo anti-15A5, anticorpo21 A3, anticorpo anti-36A3, anticorpo anti-44B11 e anticorpo 3 em camundongos tratados com o anticorpo 1,7A10, 11AH11, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11 e anticorpo 3. Neste ensaio de imunoabsorção enzimática, o anticorpo 1, 7A10, 11AH11, 15A5, 21 A3, 36A3, 44B11 e o anticorpo 3 foram revestidos em uma placa de base plana de 96

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203/252 cavidades Maxisorp durante a noite a 4Ό. As amostras de soro diluídas em 1:100 foram incubadas durante a noite em temperatura ambiente para capturar potenciais anticorpos antifármacos (ADAs). Os anticorpos capturados foram detectados com um anticorpo conjugado com imunoglobulina G (IgG) anticamundongo de cabra e enzima rábano picante peroxidase (HRP) da imunoglobulina M (IgM) e da imunoglobulina M (IgM). Um anticorpo conjugado com enzima rábano picante peroxidase (HRP) da imunoglobulina G (IgG) e da imunoglobulina M (IgM) de cabra anti-humana foi usado como controle positivo. A tetrametilbenzidina (TMB) foi adicionada como substrato colorimétrico para PCR que produz densidade óptica (OD450) em proporção à quantidade de anticorpo 1, anticorpo anti-7A10, anticorpo anti-11AH11, anticorpo anti-15A5, anticorpo anti-21A 3, anticorpo anti36A3, anticorpo anti-44B11 e anticorpo 3 presentes nas amostras séricas.

f. Medição dos níveis de aSyn no tecido cerebral [00861] Resumidamente, as placas ELISA (Costar 3925) foram revestidas com 100 μΙ dos respectivos anticorpos de captura diluídos em tampão de carbonato-bicarbonato BupH, pH 9,4 (Thermo Fisher Scientific # 28382) durante a noite a 4Ό. Ο anticorpo de captura MJFR1 (Abeam ab138501) foi usado em uma concentração de 0,1 pg/ml (ensaio de α-sinucleína total) ou 0,35 pg/ml (ensaio pS129), MJFR14-6-4-2 (Abeam ab209538) a 0,1 pg/ml, e 1E8 (BMS 5446.1 E8.10) a 0,3 pg/ml. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS de Dulbecco (Thermo Fisher Scientific, #1404040-117) e bloqueadas com BSA 3% (albumina de soro bovino, livre de protease, Fração V, Thermo Fisher Scientific) em DPBS por 2~3h em temperatura ambiente (RT) ou durante a noite a 4Ό. Padrões, amostras de cérebro e amostras de QC foram diluídas com 1% de BSA/0,05% de Tween/DPBS contendo inibidor de protease Roche

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204/252 (Thermo Fisher Scientific, 1 pélete/25ml) e Inibidor de Fosfatase 2&3 (Sigma Aldrich, P5726 & P0044, 1:100). Os padrões são α-sinucleína do tipo selvagem (rPeptide S-1001), pS129 (aa89-140,

AATGFVKKKDKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDDNEAYEMP-pSEEGYQDYEPEAHHHHHH-CONH2; SEQ ID NO: 129) ou PFF (preparada de α-sinucleína tipo selvagem, PROTEOS). As amostras 50 pL/cavidade foram carregadas em duplicata e incubadas durante a noite a 40. Depois que as placas foram equilibradas para temperatura ambiente, 50 μΙ de anticorpos de detecção 1:4000 diluídos em 1% de BSA/0,1% de Tween/DPBS foram adicionados e coincubados com amostras em temperatura ambiente durante ~2 horas. Os anticorpos de detecção (4B12 de BioLegend SIG39730, MBJR13 de Abeam ab168381, 2E2, e 23H8) foram pré-conjugados com fosfatase alcalina (kit AP da Novus Biologicals #702-0010). As placas foram em seguida lavadas quatro vezes com 0,05% Tween/PBS e desenvolvidas com 100 μΙ_ de substrato de fosfatase alcalina (Tropix GDP Star Ready-toUse com Sapphire II, T-2214, Thermo Fisher Scientific) por 30 minutos. As contagens de luminescência foram medidas com Perkin Elmer EnVision (2102 Multilabel Reader). As placas foram mantidas em constante agitação (Agitador de placa de titulação, velocidade 3) durante o ensaio.

Resultados [00862] Os camundongos inoculados com PFF foram dosados semanalmente por injeção IP durante 4 semanas com PBS (n=11) ou Anticorpo 1 (n=12), 7A10 (n=12), 11AH11 (n=12), 15A5 (n=11), 21A3 (n=11), 36A3 (n=11), 44B11 (n=12) e Anticorpo 3(n=5). Os camundongos inoculados com PBS foram dosados por injeção IP com PBS (n=8) como controle negativo. Todos os anticorpos foram dosados a 10 mg/kg. O tratamento semanal de anticorpos foi precedido por sangramentos retro-orbitais em subgrupo de

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205/252 camundongos, a fim de avaliar a farmacocinética (PK) e possíveis niveis de ADA. Os camundongos foram colhidos 30 dias após a inoculação e 24 horas após o último tratamento com anticorpos. Os níveis de anticorpos foram medidos no tecido cerebral de um subconjunto de camundongos. A patologia de aSyn pS129foi medida em regiões cerebrais selecionadas por imuno-histoquímica.

[00863] As exposições de anticorpos plasmáticos são sumariadas na Figura 18. A exposição plasmática variou -100 vezes entre anticorpos e variou de 1 pg/ml a 100 pg/ml. A baixa exposição de alguns anticorpos (por exemplo, Anticorpo 1 e 21 A3) foi provavelmente devido aos ADAs. As concentrações plasmáticas do anticorpo de controle Anticorpo 3 foram similares aos níveis observados no primeiro estudo de tratamento. Os níveis de anticorpos nos extratos de tecido cerebral são mostrados na Figura 19. As exposições cerebrais variaram -10 vezes entre os anticorpos e variaram de -25 ng/ml a 250 ng/ml. Níveis similares de anticorpos foram observados nos hemisférios cerebrais ipsilaterais e contraislaterais ao local da injeção. ADAs foram medidos em amostras plasmáticas (Tabelas 13 e 14). Foram observados ADAs em alguns animais para o anticorpo 3 (n=3), Anticorpo 1 (n=6), 7A10 (n=1), 21 A3 (n=7), 15A5 (n=1), 36A3 (n=1) e 44B11 (n=1). ADAs não foram observados com o anticorpo 11H11-1. Níveis mais baixos de anticorpos plasmáticos foram associados com ADAs para tratados com o Anticorpo 1 e 21 A3 (Figura 20). Ao contrário, os níveis de anticorpos plasmáticos não foram adversamente afetados pela presença de ADAs para o Anticorpo 3, 7A10, 15A5e44B11.

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Tabela 13: Atividade de anticorpo antifármaco em amostras plasmáticas^a

7A10 ID#^b	OD^C	15A5 ID#	OD	21 A3 ID#	36A3	44B11
OD	ID#	OD	ID#	OD
Sem4- 44	0,230	Sem4- 57	0,497	Sem4- 71	0,663	Sem2- 88	0,429	Sem2- 102	0,487
				Sem4- 72	0,827			Sem3- 102	0,764
				Sem4- 73	4,000			Sem4- 102	1,410
				Sem4- 77	0,574
				Sem3- 78	0,743
				Sem4- 78	3,667
				Sem2- 79	0,207
				Sem3- 79	3,010
				Sem4- 79	4,000
				Sem3- 80	0,220
Corte^d	0,186		0,255		0,187		0,241		0,257

[00864] ^a Apenas amostras com atividade de ADA significante são mostradas. ADAs não foram observados para 11H11-1 [00865] ^b ID# indicaca a semana de coleta de amostra (Semi, Sem2, Sem3 ou Sem4) e animal ID# [00866] ^c Medida de densidade ótica de substrato colorométrico em 450 nm.

[00867] ^d Corte com base em 2X o OD médio das compostas de controle de veículo. Valores OD acima do limite de corte são considerados significantes. Cortes calculados para cada placa de ensaio são mostrados.

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Tabela 14: Atividade de anticorpo antifármaco para anticorpos de controle, Anticorpo 1 e Anticorpo 3^a

Anticorpo 3 ID#^b	OD^C	Anticorpo 1 ID#	OD
Sem1-105	2,099	Sem 1-22	0,234
Sem2-105	0,435	Sem4-22	0,522
Sem3-105	2,051	Sem 1-24	0,298
Sem4-105	2,854	Sem4-24	2,712
Sem4-106	0,524	Sem 1-25	0,382
Sem4-108	0,277	Sem4-25	3,658
		Sem4-26	3,410
		Sem2-31	0,371
		Sem3-31	2,715
		Sem4-31	3,553
		Sem3-32	0,372
		Sem4-32	2,298
Corte^d	0,196		0,216

[00868] ^aApenas amostras com atividade de ADA significante são mostradas.

[00869] ^b ID# indicia semana de coleta de amostra (Semi, Sem2, Sem3 ou Sem4) e animal ID# [00870] ^c Medição da densidade ótica de substrato colorimétrico em 450 nm.

[00871] ^d Corte com base em 2X do OD médio das amostras de controle de veículo. Os valores OD acima do limite de corte são considerados significantes. Cortes calculados para placa de ensaio são mostrados [00872] Para avaliar o efeito da imunização passiva na transmissão e disseminação da patologia, aSyn pS129 foi medida no córtex motor e amígdala por imuno-histoquímica. Imagens representativas são mostradas na Figura 21 e sumários gráficos na Figura 22.

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Camundongos com PAC injetados com A53T-PFFs exibiram um aumento significativo na patologia pS129 tanto no córtex motor (ANOVA unidirecional, p<0,05) quanto na amígdala (ANOVA unidirecional, p<0,001) em comparação aos controles de PBS (Figura 22). A imunização passiva com o anticorpo de controle de Anticorpo 3 resultou em uma redução significativa da patologia na amígdala ipsilateral (ANOVA unidirecional, p<0,001) e em uma tendência para a redução da patologia no córtex motor ipsilateral. Além do anticorpo 3, outros anticorpos com reduções significativas da patologia na amígdala foram 7A10 (p<0,01), 11H11-1 (p<0,001), 15A5 (p<0,01), 21 A3 (p<0,05), 36A3 (p<0,01) e 44B11 (p<0,05). Apenas o anticorpo 1 não apresentou uma redução significativa da patologia na amídala. No córtex motor, apenas 44B11 exibiu uma redução significativa na patologia (p<0,05) enquanto os outros anticorpos mostraram uma tendência de redução. A falta de efeitos significativos no córtex motor é provável devido à indução mediada por PFF variável observada. [00873] Em seguida, o efeito da imunização passiva sobre os níveis solúveis de aSyn em extratos de cérebro foi determinado. Extratos cerebrais foram avaliados quanto aos oligômeros de aSyn, aSyn pS129, e níveis totais de aSyn por ELISA e são mostrados nas Figuras 23 e 24. Aumentos significantes nos oligômeros de aSyn foram observados em animais inoculados com A53T-PFF comparados com os controles de PBS (Veí); resultados similares foram obtidos com dois ELISAs independentes de oligômeros de aSyn (1E8+2E2 e MJFR14642+23H8, ambos descritos no Exemplo 12) (Figura 23). Uma tendência de redução dos níveis de oligômeros em comparação com o grupo A53T-PFF foi observada para todos os animais tratados com os anticorpos. Ao contrário dos resultados dos oligômeros, os níveis de aSyn pS129 e aSyn total não foram afetados pela inoculação com A53T-PFF ou imunização passiva (Figura 24). As alterações no

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209/252 sinal de pS129 observadas pelo IHC não são prováveis de serem detectadas com o ELISA pS129 devido ao nível relativamente alto pS129 de base presente nos extratos.

[00874] Em um segundo estudo de 90 dias de duração usando os métodos descritos no Exemplo 11, 7A10-Vh-T93A-lgG1.3f foi administrado via injeção intraperitoneal em doses de 3, 10 e 30 mg/kg semanalmente. Para maior clareza, o anticorpo testado no Exemplo 11 foi 7A10 hlgG1.3f. No segundo estudo, usando 7A10-Vh-T93A-lgG1.3f, a presença de anticorpos antifármacos foi detectada em 44% dos animais tratados. Os resultados deste estudo foram altamente variáveis e não foi observado efeito significativo sobre a patologia.

[00875] Em suma, os anticorpos anti-aSyn 7A10, 11H11-1, 15A5, 21 A3, 36A3 e 44B11 são eficazes para bloquear a transmissão da patologia de aSyn in vivo.

Exemplo 12: Avaliação dos níveis de oligômeros de aSyn em extratos de cérebro e CSF usando ELISAs específicos de oligômeros [00876] O Exemplo descreve o desenvolvimento de ELISAs específicos de oligômeros para medir os níveis de oligômeros de aSyn em lisados cerebrais humanos e no CSF.

Métodos

a. Mapeamento de epítopos [00877] Peptídeos de aSyn para estudos de mapeamento de epitopo foram adquiridos do InnoPep (San Diego, CA). Dois conjuntos de peptídeos sobrepostos de sequência de aSyn humana foram gerados com um grupo de biotina N-terminal e um ligante PEG4 e um C-terminal. Peptídeos foram solubilizados em PBS a 1 mg/ml. Para estudos de mapeamento, 100 pL de 0,25 pg/ml de peptídeos de asinucleína em PBS foram adicionados a uma placa de 96 cavidades revestida com NeutrAvidin de alta capacidade (Thermo Fisher Scientific) e incubados em temperatura ambiente (RT) durante 2h (ou

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4Ό durante a noite (O/N)). As placas foram lavadas 3 vezes com -300 μΙ_ de tampão de lavagem (0,05% de Tween em PBS). As placas foram em seguida bloqueadas com 150 μΙ de 3% de BSA em PBS em temperatura ambiente durante ~2h (ou 40 durante O/N). 100 μΙ_ de amostras de teste diluídas em tampão de amostra (0,1% de BSA/0,05% de Tween/PBS, 2 péletes de inibidor de protease Roche em 50 ml de tampão) foram incubados nas placas em temperatura ambiente durante 2h. As placas foram em seguida lavadas 3 vezes. 100 μΙ_ de anticorpo secundário diluído 1:1000 em PBSTB (1% BSA/0,2% de Tween/PBS) foi adicionado e incubado em temperatura ambiente durante 1hr. As placas foram lavadas 3 vezes por 5-10 min por lavagem. 100 μΙ_ do substrato AP (Tropix CDP Star Ready-to-Use With Sapphire II, Applied Biosystems; Cat #T-2214) foram adicionados e desenvolvidos em temperatura ambiente durante 30 min. As contagens de luminescência foram lidas com uma Perkin Elmer EnVision (2102 Multilabel Reader). As placas foram mantidas sob constante agitação (Agitador de placa de titulação, velocidade 3) durante o ensaio. Os anticorpos secundários usados incluíram IgG anti-humana de burro fosfatase a\ca\\na-affinipure, (Jacksonlmmuno #709-055-149), IgG anticoelho de burro fosfatase a\ca\\na-affinipure, (Jacksonlmmuno #711-055-152), IgG anticamundongo de burro fosfatase a\ca\\na-affinipure, (Jacksonlmmuno #715-055-151). Todos os anticorpos secundários foram diluídos em 50% da concentração final de glicerol.

b. Preparação dos PFFs e análise da fibrilizacão [00878] As PFFs foram preparadas e analisadas pelo método descrito no Exemplo 3.

c. Ensaio de ligação de aSyn [00879] Os anticorpos foram testados quanto à ligação ao monômero de aSyn humana, monômero de aSyn humana, monômero

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211/252 de pSyn humana, monômero de ySyn humana, PFF gerada a partir de aSyn humana, PFF gerada a partir de peptídeos a.a. de aSyn A53T humana, e aSyn 111 a 140 contendo sequências humanas, de rato e camundongo. Peptídeos a.a. de aSyn 111 a 140 contendo sequências humanas, de rato e camundongo foram adquiridos de InnoPep (San Diego, CA). Monômero de aSyn humana, monômero de pSyn humana, e monômero de ySyn humana foram adquiridos de rPeptide (Bogart, GA).

[00880] Para o ensaio de ligação, placas de 96 cavidades (Costa #3925, microplaca de alta ligação) foram revestidas com 100 μΙ_ de 1pg/ml de PFF de aSyn WT em PBS em temperatura ambiente durante 2h (ou 4Ό durante O/N). As placas foram lavadas 3 vezes com -300 μΙ_ de tampão de lavagem (0,05%Tween em dPBS). As placas foram bloqueadas com 150 μΙ de 3% de BSA/PBS em temperatura ambiente durante 2h (ou 4Ό durante O/N). Diluições seriadas triplas de PFF (a partir de 2pg/ml) e do monômero de a-syn WT (a partir de 20 pg/ml) foram preparadas em tampão de amostra (0,1% de BSA/0,05% de Tween/PBS, 2 péletes de inibidor de protease completa Roche - em tampão de 50 ml). Para incubações de anticorpos, volumes iguais de concentração do ensaio de 2 vezes de PFF ou monômero de aSyn com concentração do ensaio de 2 vezes de anticorpos foram misturados em placas de baixa ligação Falcon BD e incubados em temperatura ambiente durante ~2h. 100 μΙ_ de misturas de anticorpos e PFF ou monômero foram adicionados às placas revestidas com PFF e incubados em temperatura ambiente durante 10 min. As placas foram lavadas 3 vezes. 100 μΙ_ de IgG antihumano de burro (Jacksolmmuno #709-055-149, com 50% de glicerol) diluídos 1:1000 em PBSTB (1% BSA/0.2% Tween/dPBS) foi adicionado e as placas incubadas em temperatura ambiente durante 1hr. As placas foram lavadas 3 vezes por 5-10min por lavagem.

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100μΙ_ do substrato AP (Tropix CDP Star Ready-to-Use With Sapphire II, Applied Biosystems) foram adicionados e as placas foram desenvolvidas em temperatura ambiente durante 30 min. As contagens de luminescência foram medidas usando um Perkin Elmer EnVision (2102 Multilabel Reader). A PFF foi sonicada com pulsos de 15 vezes 1 segundo antes de ser revestida ou misturada com os anticorpos. As placas foram mantidas sob constante agitação (agitador de placa de titulação, velocidade 3) durante o ensaio.

d. ELISA [00881] As placas ELISA (Gostar) foram revestidas com 100 μΙ dos respectivos anticorpos de captura diluídos em tampão de carbonatobicarbonato BupH, pH 9,4 (Thermo Fisher Scientific) durante a noite a 40. Ο anticorpo de captura MJFR1 (Abeam) foi usado em uma concentração de 0,1 pg/ml (ensaio de α-sinucleína total) ou 0,35pg/ml (ensaio de pS129), MJFR14642 (Abeam) a 0,1 pg/ml e 1E8 a 0,3pg/ml. As placas foram lavadas 4 vezes com PBS de Dulbecco (Thermo Fisher Scientific) e bloqueadas com 3% de BSA (albumina sérica bovina, livre de protease, Fração V,) em PBS durante 2~3h em temperatura ambiente ou durante a noite a 40. Amostras de cérebro e amostras de QC padrões foram diluídas com 1% de BSA/0,05% Tween/PBS contendo inibidor de protease completa Roche (1 pélete/25ml) e inibidor de Fosfatase 2&3 (Sigma Aldrich, 1:100). Os padrões são α-sinucleína WT (rPeptide), pS129 (aa89140,AATGFVKKKDKDQLGKNEEGNEEGAPQEGILEDMPVDPDDNEA YEMP-pS-EEGYQDYEPEAHHHHHH-CONH2; SEQ ID NO: 129) ou PFF. A sonicação da PFF e do monômero foi realizada por meio de um KONTES Micro Ultrasonic Cell Disrupter (saída 40, Sintonização 50). As amostras foram sonicadas 15 vezes, 1 segundo/pulso. As amostras 50pL/cavidade foram carregadas em duplicata e incubadas durante O/N a 40. Depois que as placas foram equil ibradas para

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213/252 temperatura ambiente, os anticorpos de detecção de 50 μΙ 1:4000 diluídos em 1% de BSA/0,1% de Tween/dPBS foram adicionados e coincubados com amostras em temperatura ambiente durante ~2 horas. Os anticorpos de detecção (4B12 da Covance, MBJR13 de Abeam, 2E2 e 23H8) foram pré-conjugados com fosfatase alcalina (kit AP de Novus Biologicals). As placas foram em seguida lavadas 4 vezes com 0,05% de Tween/PBS e desenvolvidas com 100 μΙ_ de substrato de fosfatase alcalina (Tropix CDP Star Ready-to-Use With Sapphire II, T-2214, Thermo Fisher Scientific) durante 30 minutos. As contagens de luminescência foram medidas com Perkin Elmer EnVision (2102 Multilabel Reader). As placas foram mantidas em constante agitação (Agitador de placa de titulação, velocidade 3) durante o ensaio. Os dados foram analisados usando o GraphPad Prism.

e. Preparação de lisados cerebrais humanos [00882] As amostras de cérebro foram sonicadas em PBS filtrada (Gibco, #70011, 1 ml PBS/100 mg peso úmido tecidual) com KONTES Micro Ultrasonic Cell Disrupter (saída 40, Sintonização 50) por 2 x 10 seg/pulse. As amostras foram colocadas em tubos Eppendorf de 2 ml e os tubos foram mantidos em gelo úmido durante a sonicação. Os lisados cerebrais foram girados a 3.000 g, 40 por 5 min. As alíquotas sobrenadantes foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80C. Foram realizados ensaios de QC incluindo ELISAs de aSyn (total e pS129) e BCA.

[00883] Para isolar péletes de centrifugação de alta velocidade, os homogeneizados cerebrais previamente preparados em 100mg/ml em 1XPBS foram diluídos 3 vezes a 33,3mg/ml em gelo frio 1X PBS seguido de centrifugação a 100,000Xg durante 30 minutos a 4Ό. O sobrenadante foi removido e descartado. O sedimento foi ressuspenso em gelo frio 1X PBS no mesmo volume da amostra inicial.

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f. Imunoprecipitação de extratos cerebrais [00884] Os extratos de cérebro humano agrupados foram preparados através da combinação das seguintes amostras em proporções iguais: DP (DP1, DP3 e DP5), AMS (12-18, 01-03 e 14-49) e DLB (13-37, 05-31 e 08-26). As amostras compostas foram diluídas 100 vezes com tampão PBSTB (1% de BSA + 0,05% de Tween + PBS). Para imunoprecipitação, os extratos cerebrais foram incubados com anticorpos a 40 durante 2 horas com rotação fi nal sobre a extremidade. As contas de proteína A/G agarose (Thermo Fisher Scientific) foram em seguida adicionadas e as amostras incubadas durante a noite a 40. Para preparar as contas de p roteína A/G, 1,2 ml de suspensão de contas foi centrifugada a 1000 x g durante 2 minutos a 40. O tampão de armazenagem foi removido e as co ntas lavadas 1 vez com 0,6 ml de PBS contendo 0,05% de tween-20, centrifugadas como acima e contas lavadas 3 vezes com 0,6 ml de PBS. Após a centrifugação final, as contas foram bloqueadas pela adição de 0,6 ml de BSA 1% em PBS e incubadas a 40 com incubação fi nal durante 2 horas. Após o bloqueio, as contas foram isoladas por centrifugação e ressuspensas em 0,6 ml de PBS para um volume final de 1,2 ml. A suspensão de contas foi adicionada a cada extrato cerebral em uma diluição de 1:10 (vokvol). Após a imunoprecipitação durante a noite, as amostras foram centrifugadas para remover as contas e as amostras de cérebro esgotadas isoladas e avaliadas por ELISA. Os seguintes anticorpos foram usados para a imunoprecipitação: 26D6 (anticorpo de controle de IgG de camundongo específico para Abeta humano (a.a. 112), MJFR-14642 (Abeam), LB509 (Covance), Clone 42 (BD), 7A10, e 1E8.

g. Isolamento de culturas celulares primárias [00885] Os neurônios primários do hipocampo de ratos foram preparados conforme descrito no Exemplo 10.

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h. Ensaio de imunofluorescência [00886] A imunofluorescência foi realizada como descrito no Exemplo 10.

i. Ensaio de imunofluorescência de alto teor [00887] O ensaio de imunofluorescência de alto teor foi realizado como descrito no Exemplo 10.

j. Análise SDS-P AGE/imunoblot [00888] Os homogeneizados cerebrais de AMS e tecido cerebral de DP foram gerados como descrito acima. 200 μΙ de cada homogeneizado cerebral foram conduzidos para um volume total de 400 μΙ por adição de PBS (Thermo Fisher Scientific). As amostras diluídas foram centrifugadas a 100.000 x g durante 30 minutos a4-C para isolar os agregados de alto peso molecular. As péletes foram ressuspensas em 200 μΙ de PBS. 50 μΙ de corante de carga 4X NuPAGE (Thermo Fisher Scientific) e 20 μΙ de agente redutor 10X NuPAGE (Thermo Fisher Scientific) foram adicionados a 130 μΙ de homogeneizado de péletes. As amostras foram desnaturadas por incubação a 95 ^QC durante 5 minutos e depois 10 μΙ de amostra fracionada em géis NuPAGE Bis-Tris a 4-12% com tampão de execução 1X MES (Thermo Fisher Scientific). Os géis foram executados a 200 V durante 50 minutos seguidos de transferência para 0,4 m de nitrocelulose (Thermo Fisher Scientific) a 30 V durante 1 hora. Blots foram então bloqueados em leite a 5% em TBST (TBS com 0,1% de Tween-20 (Promega)). Os blots foram em seguida testados durante a noite a 4 ^QC com agitação com os seguintes anticorpos diluídos 1:5000 em 1%de BSA (BioRad) em TBST: 4B12 (BioLegend), 4D6 (BioLegend), aSyn-303 (BioLegend), 81A (BioLegend), EP1536Y (Abeam), LB509 (BioLegend), IgG de camundongo (Thermo Fisher Scientific), antiactina (Sigma). Todos os anticorpos foram conjugados ao HRP usando o kit de conjugação BioRad EZ-link. Após a incubação

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216/252 noturna, os blots foram lavados com TBST. Os anticorpos marcados com HRP foram detectados usando o reagente de detecção Supersignal West Femto Maximum (Thermo Fisher Scientific) e imagens capturadas com a câmara CCD GE AI600.

k. Análise SEC-HPLC [00889] 100 μΙ de homogeneizado cerebral de AMS 11-46 e homogeneizado cerebral de controle 11-49, foram adicionados a 400 μΙ de PBS e amostras centrifugadas a 100.000 x g durante 30 minutos a 4 ^QC. Os sobrenadantes (sup) foram salvos e as péletes restantes ressuspensas em 120 μΙ de PBS. Para cromatografia por exclusão de tamanho, 100 μΙ de sup ou péletes foram injetadas em uma coluna BioSec-5 300Á SEC (7,8 mm diâmetro x 300 mm, Agilent) em uma HPLC 1100 Agilent. Frações de 1 ml foram coletadas durante o tempo de execução de 20 ml. A fase móvel usada foi PBS. A coluna foi executada a 1 ml/minuto e a temperatura da coluna de 37 ^QC. Para concentrar as frações da SEC, as amostras foram submetidas à extração em fase sólida (SPE) usando o cartucho Waters Oasis SPE HLB. 1 ml de cada fração SEC foi diluído com 1000 μΙ de ácido fosfórico a 4%. As colunas de SPE foram condicionadas com 1 ml de metanol e, em seguida, equilibradas com 1 ml de H2O. As amostras acidificadas foram em seguida adicionadas. As colunas carregadas foram lavadas com 1 ml de metanol a 5% e eluídas com 1 ml de metanol a 100%. Os eluatos foram secados durante a noite em um aspirador de velocidade. As frações de SEC-HPLC purificadas por SPE foram armazenadas a -20 ^QC secadas até a análise por SDSP AGE/imunoblot.

Resultados

a. Caracterização de anticorpos [00890] Um sumário dos anticorpos usados neste estudo é apresentado na Tabela 15.

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Tabela 15: Sumário de Anticorpo

Anticorpo	Isótipo	Fonte	Imunógeno	Epitopo (aa)
1E8	lgG1 humana		PFF	123-128^a
2E2	lgG1 humana		PFF	119-126^a
23H8	lgG1 humana		PFF	130-138^a
MJFR14642	IgG de coelho	abeam	filamento	130-140^a
MJFR1	IgG de coelho	abeam	peptídeo de tamanho natural	118-123^b
4D6	lgG1 de camundongo	Biolegend	peptídeo de tamanho natural	124-128^a
4B12	lgG1 de camundongo	Biolegend	peptídeo de tamanho natural	103-108^b
Syn303	lgG1 de camundongo	Biolegend	Tamanho natural oxidado	1-5^C
LB509	lgG1 de camundongo	Biolegend	Corpos de Lewy	115-121^d
MJFR13	IgG de coelho	abeam	peptídeo de pS129	pS129^b
EP1536Y	IgG de coelho	abeam	peptídeo de pS129	pS129^b
81A	lgG2a de camundongo	Biolegend	peptídeo de pS129	pS129^e

^aEpitopo mapeado de uma maneira similar como descrito no Exemplo 2; veja a Figura 1.

^bEpitopo fornecido pelo vendedor ^CJ Duda, et al., Ann Neurol 2002; H Tran, et al., Cell Reports, 2014 ^dM Baba, et al., Am J Path 1998; R Jakes, etal., Neurosci Letts 1999 ^e Waxman e B Giasson, J Neuropath Exp Neurol 2008 [00891] Os anticorpos descritos acima foram avaliados quanto à potência de ligação aos monômeros de aSyn e PFF de aSyn. Os anticorpos foram incubados em solução com concentrações crescentes de monômeros ou PFF de aSyn. O anticorpo não ligado foi

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218/252 capturado em placas revestidas com PFF e os níveis de anticorpos medidos por ELISA unidirecional. Como mostrado na Figura 25, os anticorpos 1E8, 2E2, 23H8 e MJFR14642 mostraram uma ligação mais potente à TFP em comparação com o monômero, com relações de potência de ligação ao monômero-PFF de 902, 236, 3258 e 7234, respectivamente (Tabela 16). Ao contrário, os anticorpos MJFR1, 4B12 e aSyn303 foram mais potentes para ligação ao monômero comparado à PFF (Figura 26), com potências de ligação monômeroPFF de 0,27, 0,24 e 0,47, respectivamente (Tabela 16). Os anticorpos 4D6 e LB509 foram modestamente seletivos com relação de potência de ligação ao monômero-PFF de 26 e 34, respectivamente. Considerados juntos, estes resultados indicam que os anticorpos 1E8, 2E2, 23H8 e MJFR14642 são altamente seletivos para PFF/oligômero.

Tabela 16: Sumário de ligação de anticorpo

	monômero		PFF		Relação de
Anticorpo	SD	n	SD	n
(ng/ml)		(ng/ml)		Mono/PFF

1E8	6464	872	4	7,2	2,0	4	903
2E2	6226	6690	4	26,4	6,5	4	236
23H8	5808	10834	4	1,8	0,3	4	3258
MJFR 14642	3658	1981	5	0,51	0,10	5	7234
MJFR1	8,0	1,28	2	29,2	7,0	2	0,27
4D6	54,2	17,6	2	2,1	0,2	2	26
4B12	5,6	1,15	2	23,3	3,2	2	0,24
Syn303	51,2	9,1	2	109,3	6,6	2	0,47
LB509	62	24	2	1,6	0,1	2	38

b. Desenvolvimento de ELISAs específicos do oligômero [00892] Com base nos dados de ligação do monômero e do PFF acima descritos, foram desenvolvidas e avaliadas várias combinações de pares de anticorpos em ELISA em sanduíche para detecção de monômeros aSyn e PFF/oligômeros aSyn; um resumo dos pares ELISA óptimos identificados e as especificidades desses ensaios são apresentados na Tabela 17.

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Tabela 17: Sumário de ELISA

Anticorpo de captura	Epitopo (aa)	Anticorpo de detecção³	Epitopo (aa)	Monômero LLQ (pg/ml)^b	PFF LLQ (pg/ml)^b
1E8.10	123-128	2E2.2	119-126	>10.000	33
MJFR1464 2	130-140	23H8.G3	130-138	>10.000	34
MJFR1	118-123	Syn303	1-5	23	45
MJFR1	118-123	4B12	103-108	8	23
MJFR1	118-123	4D6	124-128	27	19
MJFR1	118-123	MJFR13	pS129	>3.000	>3.000

[00893] ^a Os anticorpos de detecção foram conjugados com fosfatase alcalina (AP) [00894] ^bLLQ (menor nível de quantificação) é definido por 2 vezes a base do ensaio. LLQ de monômero com base nos resultados para o monômero sonicado; resultados similares foram observados com monômero não sonicado. LLQ de PFF com base nos resultados para PFF sonicada. LLQ para ELISA de pS129 (MJFR1+MJFR13) é de 2 pg/ml (peptídeo de pS129).

[00895] Os pares ELISA 1E8.10+2E2.2 e MJFR14642+23H8.G3 exibiram detecção sensível e específica de PFF/oligômeros, porém não de monômeros de aSyn (Tabela 17; Figura 27). A sonicação de PFF realçou o sinal geral em ambos os ensaios, sugerindo que os ensaios são sensíveis ao tamanho do agregado e que a sonicação pode expor sítios adicionais de ligação de anticorpos. Ao contrário, a sonicação não teve qualquer impacto sobre a capacidade dos anticorpos de detectar os monômeros. Ambos os ensaios exibiram sensibilidade similar de aproximadamente 30 pg/ml (equivalente ao monômero) para detecção de PFF sonicada. Apenas o sinal de base foi observado com concentrações de monômero de até 10 ng/ml, a concentração mais elevada testada. Considerados juntos, estes resultados estabelecem que os ELISAs que empregam 1E8+2E2 e

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MJFR14642+23H8 são específicos de PFF/oligômero.

[00896] Foram também desenvolvidas combinações adicionais de pares de ELISA, incorporando o mesmo anticorpo de captura (MJFR1) associado a diferentes anticorpos de detecção, incluindo um anticorpo específico para o domínio N-terminal (Syn303), o domínio médio (4B12), o domínio C-terminal (4D6) e pS129 (MJFR13) de aSyn. Pares de ELISA, MJFR1+Syn303, MJFR1+4B12 e MJFR1+4D6 exibiram detecção sensível tanto de monômero de aSyn quanto PFF de aSyn (Tabela 17; Figura 28). Todos os três ensaios detectaram PFF sonicada com sensibilidades similares aos ELISA do oligômero (Tabela 17). Ao contrário dos ensaios com oligômeros, a detecção de PFF por MJFR1+Syn303 e MJFR1+4B12 não foi afetada pela sonicação, sugerindo que a exposição destes epítopos é menos sensível ao tamanho do agregado. Curiosamente, a sonicação realçou a detecção de PFF por MJFR1+4D6, potencialmente relacionada ao fato de que 4D6 se liga a um epítopo C-terminal, semelhante aos anticorpos seletivos de oligômeros. Ao contrário dos ensaios específicos de oligômero, MJFR1+Syn303, MJFR1+4B12 e MJFR1+4D6 exibiram detecção sensível do monômero de aSyn com LLQs de 23, 8 e 27 pg/ml, respectivamente. A detecção de monômero não foi afetada pela sonicação. O ELISA de MJFR1+MJFR13 demonstrou detecção sensível e específica do peptídeo de aSyn pS129 confirmando sua especificidade à pS129.

[00897] Para também avaliar a especificidade, MJFR1+Syn303, MJFR1+4B12 e MJFR1+4D6 também foram testados quanto à detecção dos membros da família aSyn, β-sinucleína e y-sinucleína. Como mostrado na Figura 29, todos os três ensaios exibiram pouca reatividade cruzada com β-sinucleína ou γ-sinucleína, confirmando sua especificidade à aSyn. Considerados juntos, estes resultados indicam que MJFR1+Syn303, MJFR1+4B12 e MJFR1+4D6 são específicos

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221/252 para aSyn e podem detectar tanto o monômero quanto oligômero suportando sua utilidade como ensaios de aSyn total.

c. Medição dos níveis de aSyn em extratos cerebrais [00898] ELISAs foram usados para medir os níveis de oligômeros, pS129 e aSyn total em extratos cerebrais gerados a partir de tecido de controle e doença (AD, PSP, MSA, DP, DLB). A especificidade do sinal de ELISA do extrato cerebral foi confirmada por estudos de linearidade de diluição e imunodepleção. Como mostrado na Figura 30, níveis robustos de oligômero de aSyn (1E8+2E2 e MJFR14642+23H8) foram detectados em extratos cerebrais de DP comparados com extratos de outras doenças neurodegenerativas (AD, PSP) e controles. Os níveis médios de oligômeros em extratos de DP foram de 36 ng/mg de proteína total no ELISA 1E8+2E2 e 40 ng/mg de proteína total no ELISA MJFR14642+23H8.G2 (Tabela 18). Os níveis de oligômeros foram <LLLQ para a maioria dos extratos de AD, PSP e controle. Ao contrário dos resultados dos oligômeros, níveis similares aos de aSyn total foram observados em todos os extratos como medidos usando o ensaio MJFR1+4B12 (Figura 30; Tabela 18). A aSyn pS129 foi detectada em todos os extratos, porém os níveis foram elevados na DP e significativamente mais elevados em comparação com os controles (Figura 30; Tabela 18).

Tabela 18: Sumário de níveis de aSyn em extratos cerebrais de PD, AD e PSP de controle

Ensaio^a	Controle AVE	Contro	PD SD	AD	PSP SD
le SD	PD AVE
AD AVE	SD	PSP AVE
1E8+2E2 Oligômero	NA		35.990	69.69 6	NA		NA
MJFR14642+ 23H8 oligômero	NA		39.890	67.15 8	NA		NA
MJFR1+	1.026.7	377.8	1.070.4	265.6	741.7	263.1	993.6	483.8

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222/252

Contro	AD	PSP SD
Ensaio^a	Controle AVE	le SD	PD
PD	AD AVE	SD	PSP AVE
AVE	SD
4B12	76	89	30	30	02	91	85	47
total
MJFR1+
MJFR13	184	56	1.143	1.554	316	387	221	73
pS129 Proteína Total (mg/ml)	3,3	0,3	3,3	0,5	3,0	0,5	3,3	0,9

[00899] ^a Dados normalizados para proteína total e expressos como equivalente monomérico (pg/mg de proteína total) ou equivalente de peptídeo pS129 (pg/mg de proteína total). Os níveis de proteína totais expressos como mg/ml [00900] Para determinar se os oligômeros de aSyn também estão presentes no tecido cerebral de outros doentes com sinucleinopatia, foram também gerados extratos de AMS e DLB e analisados usando o oligômero ELISAs. Como mostrado na Figura 31, níveis semelhantes e robustos de oligômeros foram detectados em todos os três extratos cerebrais de sinucleinopatia (AMS, DLB e DP) enquanto os níveis em extratos de controle foram LLQ; resultados semelhantes foram observados em ambos os ensaios de oligômeros. Ao contrário, os níveis de aSyn total medidos usando MJFR1+4B12 foram similares em todos os extratos, incluindo os controles (Figura 31). O níveis de pS129 também foram elevados em uma extensão similar nos extratos de sinucleinopatia, e foram significativamente maiores (AMS, DLB) ou tendência maior (DP) em comparação aos controles (Figura 31). Os níveis de aSyn total também foram medidos usando os ELISAs sensíveis à região N-terminal (MJFR1+Syn303) e região C-terminal (MJFR1+4D6). Como mostrado na Figura 32, não foram observadas

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223/252 diferenças nos níveis totais de aSyn. Os resultados do ELISA são sumariados na Tabela 19.

Tabela 19: Sumário de níveis de aSyn em extratos de controle, AMS, DLB, e DP

Ensaio^a	Contro le AVE	Contro le SD	AMS	DLB SD	PD AVE	PD SD
AMS	DLB AVE
AVE	SD
1E8+2E2 oligômero MJFR14642+2	NA		19.491	1.442	36.937	10.465	14.278	6.880
3H8	NA		31.237	16.953	57.456	13.458	18.501	13.487
oligômero MJFR1+ 4B12 total MJFR1+	642.88 1	108.67 0	814.33 5	172.62 8	546.14 5	98.753	745.52 1	251.29 3
MJFR13	322	63	1.335	393	1.713	31	801	246
pS129 MJFR1+ Syn303 N-term	456.57 2	81.475	371.49 8	232.72 0	314.51 8	104.70 5	530.48 1	121.37 1
MJFR1+ 4D6 C-term	772.98 5	97.069	907.13 2	148.46 2	622.22 3	79.754	929.48 8	242.20 6
Proteína total (mg/ml)	4,4	1,1	3,7	0,6	4,0	0,8	3,5	0,3

[00901] ^a Dados normalizados para proteína total e expressos como equivalente monomérico (pg/mg de proteína total) ou equivalente de peptídeo pS129 (pg/mg de proteína total). Os níveis de proteína totais expressos como mg/ml.

[00902] Os níveis de oligômeros medidos nos ELISA 1E8+2E2 e MJFR14642+23H8 foram altamente correlacionados entre os diferentes extratos cerebrais de sinucleinopatia (AMS, DLB, DP) (Figura 33, Tabela 20). Níveis absolutos de oligômeros foram comparáveis nos dois ensaios de oligômeros. Os níveis de pS129

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224/252 (MJFR1+MJFR13) também foram altamente correlacionados com os níveis de oligômeros. Ao contrário, os níveis totais de aSyn medidos no ensaio MJFR1+4B12 não foram significativamente correlacionados com os níveis de oligômeros ou níveis de pS129 (Figura 33, Tabela 20). No entanto, os níveis totais de aSyn no ensaio MJFR1+4B12 foram significativamente correlacionados com os níveis no ensaio MJFR1+4D6 e mostraram uma tendência para correlação com os níveis medidos no ensaio MJFR1+Syn303 (Figura 34, Tabela 21). Esses resultados fornecem confirmação adicional da especificidade do sinal nos diferentes ensaios. A correlação entre os ELISAs específicos de oligômero e o ELISA de pS129 sugere que as espécies oligoméricas provavelmente serão fosforiladas.

Tabela 20: Correlação de níveis de oligômero ^a

	MJFR14642+23H8	MJFR1+MJFR13	MJFR1+4B12
1E8+2E2	0,95	0,92	NS
MJFR14642+23H8		0,96	NS
MJFR1+MJFR13			NS

[00903] ^a Dados de análise de extratos cerebrais de AMS, DLB e DP. Valores Pearson r para correlações significantes (p<0,001) mostradas. NS representa p>0,05

Tabela 21: Correlação de níveis totais de aSyn^a

	MJFR1+MJFR13	MJFR1+Syn303	MFJR1+4D6
MJFR1+4B12	NS	NS	0,97
MJFR1+MJFR13		NS	NS
MJFR1+Syn303			NS

[00904] ^a Dados de análise de extratos cerebrais de controle, AMS, DLB e DP. Valores Pearson r para correlações significantes (p<0.001) mostradas. NS representas p>0,05

d. Caracterização bioquímica de oligômeros em extratos cerebrais [00905] A centrifugação de alta velocidade pode ser usada para purificar a PFF de aSyn e foi usada para isolar os agregados de alto

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225/252 peso molecular da proteína tau de extratos cerebrais. Uma estratégia similar foi empregada para ajudar a isolar e caracterizar os agregados de aSyn presentes nos extratos cerebrais de sinucleinopatia. Os extratos cerebrais de controle, AMS, DLB e DP foram submetidos à centrifugação de alta velocidade e o material solúvel (supe) e insolúvel (pélete) isolado e analisado pelo oligômero ELISA. Como mostrado na Figura 35, o oligômero foi detectado em péletes de extrato cerebral, incluindo extratos gerados a partir de tecidos cerebrais de controle. A especificidade desses sinais de ELISA foi confirmada pela linearidade da diluição. Resultados similares foram observados com ambos os oligômeros de ELISA. A recuperação global do oligômero nas péletes em relação aos níveis no extrato inicial variou entre 20 a 80% (Figura 35). Ao contrário, o oligômero não foi detectado nos sobrenadantes de nenhum dos extratos cerebrais. Estes resultados sugerem que os oligômeros estão presentes como agregados de alto peso molecular e também indicam que os oligômeros estão presentes nos extratos cerebrais de controle, porém em níveis mais baixos em comparação com os extratos de doenças.

[00906] Para também caracterizar os agregados moleculares elevados em extratos cerebrais, péletes e frações sobrenadantes isoladas de um extrato cerebral de controle e AMS foram submetidas à cromatografia por exclusão de tamanho e frações analisadas por SDSPAGE/imunblot. Como mostrado na Figura 36, a maioria da aSyn nas frações de SEC sobrenadantes, tanto dos extratos de controle quanto de AMS, eluídas na fração 10, correspondendo a um raio molecular de ~60 kDa e sugerindo que esta espécie é um tetrâmero. Este tetrâmero resolvido em um fragmento de divagem de monômero e menor peso molecular quando analisado por SDS-PAGE/imunoblot. Em contraste, a maioria da aSyn isolada nas frações de péletes eluídas no volume vazio por SEC (fração 6), correspondendo a um raio molecular de

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226/252 >670 kDa. Resultados similares foram observados para as amostras de controle e AMS confirmando a presença de agregados nos extratos de controle: Esses agregados de alto peso molecular também foram resolvidos em fragmentos de monômero e divagem por SDSPAGE/imunoblot. Além disso, aSyn do isolado de péletes também foi detectada na fração 6, sugerindo que o agregado de alto peso molecular está em rápido equilíbrio com as espécies de tetrâmero. Considerados juntos, estes resultados confirmam a presença de agregados de elevado peso molecular tanto nos extratos de AMS quanto de controle, indicam que o tamanho dos agregados é >670 kDa e que os agregados são perturbados em condições de desnaturação (SDS com ebulição).

[00907] Para investigar melhor a diferença potencial nos agregados de alto peso molecular, péletes de extrato isolados de controle, AMS, DLB e DP foram analisados por SDS-PAGE/imunoblot usando diferentes anticorpos de aSyn. Os resultados são mostrados para intervalos de peso molecular de <20 kDA (Figura 37), 30 a 40 kDa (Figura 38) e 60 a 100 kDa (Figura 39). A especificidade do sinal de aSyn foi confirmada usando um controle de anticorpos de IgG. Como mostrado na Figura 37, níveis comparáveis de aSyn migrando como um monômero (-14 kDa) foram detectados em todas as péletes de extrato cerebral (4B12, 4D6). No entanto, o nível e a extensão dos produtos de divagem pareciam ser mais elevados nas péletes de AMS e DLB em comparação com a DP e o controle (4B12). Os resultados com o anticorpo 4D6, que reconhece o domínio C-terminal da aSyn, indicam que os fragmentos de divagem não têm esta região Cterminal. O sinal de pS129 (EP1536Y) foi mais elevado em DLB >AMS>DP»controle. A actina estava presente nos isolados de péletes e os níveis eram comparáveis entre as amostras. Não foi observada reatividade inespecífica com o anticorpo de controle de IgG,

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227/252 confirmando a especificidade de aSyn nessa região de peso molecular. [00908] Uma espécie proeminente de 30 a 40 kDa foi detectada em níveis comparáveis em todas as péletes de extrato e provavelmente corresponde a um dímero de aSyn (Figura 38). Os resultados com anticorpos aSyn 303 e 4D6 indicam que esta espécie contém domínios N- e C-terminais intactos, respectivamente. Interessantemente, o dímero proeminente não foi prontamente detectado usando o anticorpo 4B12, embora um baixo nível de reatividade estivesse presente nas péletes de DLB. Estes resultados indicam que o epítopo 4B12 está mascarado na espécie de dímero e sugerem que a reatividade do 4B12 pode ser um indicador sensível da conformação do dímero. Resultados com anticorpo 81A indicam que a espécie de dímero é fosforilada na S129 e que os níveis mais altos são observados nas péletes de DLB.

[00909] Múltiplas espécies foram detectadas na faixa de peso molecular 60-100 kDa (Figura 39). Potenciais agregados de aSyn de -60 kDa (Syn303, 4B12, 4D6) e -80-100 kDa (4B12, LB509, 4D6) foram detectados. Em geral, o padrão de imunorreatividade observado com os diferentes anticorpos de aSyn foi similar em todas as péletes de extrato cerebral.

e. Indução de agregados insolúveis de aSyn pS129 em células [00910] PFF de aSyn e extratos isolados de tecido cerebral de paciente de sinucleinopatia induziram à formação de agregados insolúveis de aSyn, altamente fosforilados quando adicionados aos neurônios primários em cultura. Além disso, a indução foi dependente de espécies de aSyn de alto peso molecular presentes nos extratos cerebrais. Estas descobertas sustentam a ideia de que a patologia aSyn pode ser transmitida de forma similar ao príon e sugerem que as espécies transmissíveis são um agregado de aSyn. Agregados de alto peso molecular isolados na fração de péletes de extratos de controle,

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228/252

AMS, DLB e DP foram avaliados quanto à indução de insolúveis, aSyn pS1290 em neurônios primários superexpressando aSyn A53T humana. A indução robusta da pS129 insolúvel foi observada após tratamento com péletes de extrato cerebral de AMS durante 11 dias; ao contrário, níveis 10 vezes mais baixos de indução foram observados com péletes de extrato DP e DLB e apenas o sinal de fundo foi observado com os péletes de extrato de controle (Figura 40). A indução não esteve relacionada aos níveis de oligômeros presentes nos isolados de péletes. Estes resultados sugerem que a indução robusta observada com as péletes de extrato de AMS pode estar relacionada às diferenças na conformação e/ou modificações das espécies de alto peso molecular de AMS em comparação com DP, DLB e controle e que essas diferenças provavelmente afetam a absorção e/ou a capacidade de iniciar agregação modelada dentro da célula receptora.

f. Medição dos níveis de aSyn no CSF humano [00911] Os ELISAS de oligômero de aSyn 1E8+2E2 e MJFR14642+23H8 foram usados para avaliar o CSF de pacientes com sinucleinopatia AMS e controles; O ELISA de aSyn total MJFR1+4B12 também foi incluído para comparação. A análise da linearidade da diluição e da recuperação do pico foi usada para validar os ensaios quanto ao CSF humano e para identificar a diluição ideal. Como mostrado na Figura 41, os níveis de oligômeros foram <LLQ para todas as amostras de CSF na coorte 1, incluindo AMS, paralisia supranuclear progressiva (PSP) e controles. Resultados similares foram observados tanto nos ELISAs 1E8+2E2 quanto MJFR14642+23H8. Ao contrário, níveis totais de aSyn -1000 pg/ml foram observados no ensaio MJFR1+4B12 e os níveis foram similares entre AMS, PSP e controles. Uma segunda coorte de amostras de CSF de controle e AMS foi analisada (Figura 42). Como observado

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229/252 para a coorte 1, os níveis de oligômeros na maioria das amostras foram <LLLQ; no entanto, níveis de oligômeros quantificáveis foram detectados para 7 amostras de CSF (6 AMS e 1 controle) no ELISA 1E8+2E2. Os níveis totais de aSyn, medidos com MJFR1+4B12, foram similares entre as amostras de CSF de controle e AMS e foram -1000 pg/ml, consistentes com os resultados da coorte 1.

Tabela 22. Sumário de Sequências

SEQ ID	Descrição	Sequência
1	a-sinucleína humana	MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTK EGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGG AVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKN EEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYE PEA
2	7A10 VH CDR1	SGRYYWS
3	7A10 VH CDR2	YIYYSGRTKYNPSLKS
4	7A10 VH CDR3	ERGYLDY
5	7A10 VL CDR1	RASQSVSSSYLA
6	7A10 VL CDR2	GASSRAT
7	7A10 VL CDR3	QQYGSSPLT
8	7A10 VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGRY YWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGRTKYNPSLKSR VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRERGY LDYWGQGTLVTVSS
9	7A10 VL	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTK VEIK
10	7A10 HC	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGRY YWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGRTKYNPSLKSR VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRERGY LDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSV

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230/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
		FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
11	7A10 LC	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC
12	7A10-T93A VH CDR1	SGRYYWS
13	7A10-T93A VH CDR2	YIYYSGRTKYNPSLKS
14	7A10-T93A VH CDR3	ERGYLDY
15	7A10-T93A VL CDR1	RASQSVSSSYLA
16	7A10-T93A VL CDR2	GASSRAT
17	7A10-T93A VL CDR3	QQYGSSPLT
18	7A10-T93A VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGRY YWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGRTKYNPSLKSR VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARERGY LDYWGQGTLVTVSS
19	7A10-T93A VL	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTK VEIK

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231/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
20	7A10-T93A HC	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGRY YWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGRTKYNPSLKSR VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARERGY LDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
21	7A10-T93A LC	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC
22	11H11 VH CDR1	SYAMH
23	11H11 VH CDR2	AIGTGGGTYYADSVKG
24	11H11 VH CDR3	GNWEFDY
25	11H11 VL1 CDR1	RASQSVSSSYLA
26	11H11 VL1CDR2	GASSRAT
27	11H11 VL1 CDR3	QQYGSSPFT
28	11H11 VL2 CDR1	RASQGISSALA

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232/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
29	11H11 VL2 CDR2	DASSLES
30	11H11 VL2 CDR3	QQFNSYP
31	11H11 VH	EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSSYAM HWVRQAPGKGLEWVSAIGTGGGTYYADSVKGRF TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCARGNWE FDYWGQGTLVTVSS
32	11H11 VL1	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWY QQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFT LTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPFTFGPGTKVDIK
33	11H11 VL2	AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWY QQKPGKAPKVPIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDLATYYCQQFNSYPFGGGTKVEIK
34	11H11 HC	EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCAGSGFTFSSYAM HWVRQAPGKGLEWVSAIGTGGGTYYADSVKGRF TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCARGNWE FDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
35	11H11 LC1 (SEQ ID NO: 33+34=11H11- 1)	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPFTFGPGTK VDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC

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233/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
36	11H11 LC2 (SEQ ID NO: 33+35=11H11- 2)	AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWY QQKPGKAPKVPIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDLATYYCQQFNSYPFGGGTKVEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC
37	15A5 VH CDR1	SGSYYWC
38	15A5 VH CDR2	YIYYSGRTKYNPSLKS
39	15A5 VH CDR3	ERGRFDY
40	15A5 VLCDR1	RASQSVSSSYLA
41	15A5 VLCDR2	GASSRAT
42	15A5 VLCDR3	QQYGSSPLT
43	15A5 VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSY YWCWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGRTKYNPSLKSR VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARERGR FDYWGQGTLVTVSS
44	15A5 VL	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTK VEIK
45	15A5 HC	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSY YWCWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGRTKYNPSLKSR VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARERGR FDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 248/443

234/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
46	15A5 LC	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC
47	21A3 VH CDR1	NRNYYWS
48	21 A3 VH CDR2	YIYYSGRTKYNPSLKS
49	21 A3 VH CDR3	ERGRFDY
50	21 A3 VL CDR1	RASQSVSSSYLA
51	21 A3 VL CDR2	GASSRAT
52	21 A3 VL CDR3	QQYGSSPLT
53	21 A3 VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSNRNY YWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGRTKYNPSLKSR VTISVDTSKNQFSLKVSSVTAADTAVYYCARERGR FDYWGQGTLVTVSS
54	21 A3 VL	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTK VEIK
55	21 A3 HC	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSNRNY YWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGRTKYNPSLKSR VTISVDTSKNQFSLKVSSVTAADTAVYYCARERGR FDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 249/443

235/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
56	21 A3 LC	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC
57	36A3 VH CDR1	SGSYYWS
58	36A3 VH CDR2	YIYYSGRTKYNPSLKS
59	36A3 VH CDR3	ERGWLDP
60	36A3 VL CDR1	RASQSVSSSYLA
61	36A3 VL CDR2	GASSRAT
62	36A3 VL CDR3	QQYGSSPLT
63	36A3 VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSY YWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGRTKYNPSLKSR VTISVDTSRNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARERGW LDPWGQGTLVTVSS
64	36A3 VL	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTR LEIK
65	36A3 HC	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSY YWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGRTKYNPSLKSR VTISVDTSRNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARERGW LDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 250/443

236/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
66	36A3 LC	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTR LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC
67	44B11 VH CDR1	SKYMS
68	44B11 VH CDR2	VMYSGGRRYYADSVKG
69	44B11 VH CDR3	GDRGDY
70	44B11 VL CDR1	RASQSVSSYLA
71	44B11 VL CDR2	DASNRAT
72	44B11 VL CDR3	QQRSNWPIT
73	44B11 VH	EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSSKYM SWVRQAPGKGLEWVSVMYSGGRRYYADSVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDR GDYWGQGTLVTVSS
74	44B11 VL	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAW YQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEI K
75	44B11 HC	EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSSKYM SWVRQAPGKGLEWVSVMYSGGRRYYADSVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDR GDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSV

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 251/443

237/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
		FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
76	44B11 LC	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAW YQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC
77	2E2 VH CDR1	SYAMH
78	2E2 VH CDR2	VISYDGSNKYYADSVKG
79	2E2 VH CDR3	RGSGSYYNFDY
80	2E2 VL CDR1	RASQSVSSSYLA
81	2E2 VL CDR2	GASSRAT
82	2E2 VL CDR3	QQYGSSPT
83	2E2 VH	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAM HWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSG SYYNFDYWGQGTLVTVSS
84	2E2 VL	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPTFGQGTRL EIK
85	2E2 HC	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAM HWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSG SYYNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEG

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 252/443

238/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
		APSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG
86	2E2 LC	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPTFGQGTRL EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC
87	23H8 VH CDR1	SYGMN
88	23H8 VH CDR2	YISSSSSTIYYADSVKG
89	23H8 VH CDR3	WGSY
90	23H8 VL1 CDR1	RASQSVSRSYLA
91	23H8 VL1 CDR2	GASSRAT
92	23H8 VL1 CDR3	QQYGSSPLT
93	23H8 VL2 CDR1	RASQGVSSYLA
94	23H8 VL2 CDR2	DASNRAT
95	23H8 VL2 CDR3	QQRSNWHT
96	23H8 VL3 CDR1	RASQSVSSSYLA
97	23H8 VL3 CDR2	GASSRAT

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 253/443

239/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
98	23H8 VL3 CDR3	QQYGSSPT
99	23H8 VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGM NWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRF TISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCANWGSY WGQGTLVTVSS
100	23H8 VL1	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLA WYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTK VEIK
101	23H8 VL2	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQGVSSYLAW YQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGPGTD FTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWHTFGGGTKVEI K
102	23H8 VL3	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPTFGGGTKV EIK
103	23H8 HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGM NWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRF TISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCANWGSY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
104	23H8 LC1 (SEQ ID NO: 102+103=23H8-	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLA WYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTK

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 254/443

240/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
	1)	VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC
105	23H8 LC2 (SEQ ID NO: 102+104=23H8- 2)	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQGVSSYLAW YQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGPGTD FTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWHTFGGGTKVEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC
106	23H8 LC3 (SEQ ID NO: 102+105=23H8- 3)	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPTFGGGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC
107	1E8 VH CDR1	SGSYYWS
108	1E8VH CDR2	YIYYSGRTKYNPSLKS
109	1E8VH CDR3	ERGWFDP
110	1E8VLCDR1	RASQSVSSSYLA
111	1E8VLCDR2	GASSRAT
112	1E8VLCDR3	QQYGSSPLT
113	1E8VH	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSY YWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGRTKYNPSLKSR VTISVDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCVRERGW FDPWGQGTLVTVSS
114	1E8VL	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTK VEIK
115	1E8HC	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSY YWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGRTKYNPSLKSR

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 255/443

241/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
		VTISVDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCVRERGW FDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
116	1E8LC	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSG TDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC
117	Domínio constante de lgG1f humana	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG
118	IgGIza humana (variante alotípica)	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 256/443

242/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
		KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPG
119	lgG1.3f humana	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
120	Região constante de cadeia leve lgG1 capa humana	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC
121	Epítopo de aSyn (123-128)	EAYEMP
122	Epítopo de aSyn (125-128)	YEMP
123	Epítopo aSyn (130-138)	EEGYQDYEP
124	Epítopo aSyn (130-139)	EEGYQDYEPE
125	Epítopo aSyn (119-126)	DPDNEAYE
126	Epítopo aSyn (130-138)	EEGYQDYEP
127	Sequência Cterminal	LSPG

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 257/443

243/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
128	Ligante de peptídeo	PVGVV
129	Peptídeo pS219	AATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNE AYEMP-pS-EEGYQDYEPEAHHHHHH
130	aSyn 105-115	EGAPQEGILED
131	aSyn 106-116	GAPQEGILEDM
132	aSyn 107-117	APQEGILEDMP
133	aSyn 108-118	PQEGILEDMPV
134	aSyn 109-119	QEGILEDMPVD
135	aSyn 110-120	EGILEDMPVDP
136	aSyn 111-121	GILEDMPVDPD
137	aSyn 112-122	ILEDMPVDPDN
138	aSyn 113-123	LEDMPVDPDNE
139	aSyn 114-124	EDMPVDPDNEA
140	aSyn 115-125	DMPVDPDNEAY
141	aSyn 116-126	MPVDPDNEAYE
142	aSyn 117-127	PVDPDNEAYEM
143	aSyn 118-128	VDPDNEAYEMP
144	aSyn 119-129	DPDNEAYEMPS
145	aSyn 120-130	PDNEAYEMPSE
146	aSyn 121-131	DNEAYEMPSEE
147	aSyn 122-132	NEAYEMPSEEG
148	aSyn 123-133	EAYEMPSEEGY
149	aSyn 124-134	AYEMPSEEGYQ
150	aSyn 125-135	YEMPSEEGYQD
151	aSyn 126-136	EMPSEEGYQDY
152	aSyn 127-137	MPSEEGYQDYE
153	aSyn 128-138	PSEEGYQDYEP
154	aSyn 129-139	SEEGYQDYEPE
155	aSyn 130-140	EEGYQDYEPEA
156	peptídeo 111- 140 de aSyn de camundongo na tabela 4	RRRGILEDMPVDPGSEAYEMPSEEGYQDYEPEA

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 258/443

244/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
157	peptídeo 111- 140 de aSyn de rato na tabela 4	RRRGILEDMPVDPSSEAYEMPSEEGYQDYEPEA
158	peptídeo 111140 de aSyn humana na tabela 4	RRRGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA
159	7A10-T93AlgG1.3 HC DNA	ATGAGGGCTTGGATCTTCTTTCTGCTCTGCCTGG CCGGGAGAGCGCTCGCACAGGTGCAGCTGCAG GAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGA GACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGG CTCCGTCAGCAGTGGTCGTTACTACTGGAGCTG GATTCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGT GGATTGGGTATATCTATTACAGTGGGAGAACCA AGTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCA TATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCT GAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGG CCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGAGGGGGTACC TTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCG TCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCT TCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTG GGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG GACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTA CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG CAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGT GAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAA GAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCA CACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGA AGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAA ACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCC TGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAA

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 259/443

245/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
		AGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGA GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGG GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACC TGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATC GCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGA GAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTC ACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAA CGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT GCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCCCCGGGTTGA
160	DNA 7A10-LC (tanto para 7A10 quanto 7A10-T93A); mesma sequência de LC compartilhada com 21 A3 e 15A5	ATGAGGGCTTGGATCTTCTTTCTGCTCTGCCTGG CCGGGCGCGCCTTGGCCGAAATTGTGTTGACGC AGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGG AAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGA GTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGC AGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCT ATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAG ACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACT TCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAG AI I I I GCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAG CTCACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGT GGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGT CTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAA TCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGA AGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCC AGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGAC AGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTC

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 260/443

246/252

SEQ ID	Descrição	Sequência
		GCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG TTAG
161	7A10 VH DNA	CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACT GGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTG CACTGTCTCTGGTGGCTCCGTCAGCAGTGGTCG TTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGG GAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTA CAGTGGGAGAACCAAGTACAACCCCTCCCTCAA GAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAA GAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGAC CGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTACGAG AGAGAGGGGGTACCTTGACTACTGGGGCCAGG GAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
162	DNA de VL 7A10 (tanto para 7A10 quanto 7A10T93A); mesma sequência VL compartilhada com 21 A3 e 15A5	GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTG TCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCC TGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTAC TTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCT CCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGG GCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGC AGACTGGAGCCTGAAGAI I I IGCAGTGTATTACT GTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCG GCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
163	DNA de VH 7A10-T93A	CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACT GGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTG CACTGTCTCTGGTGGCTCCGTCAGCAGTGGTCG TTACTACTGGAGCTGGATTCGGCAGCCCCCAGG GAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTA CAGTGGGAGAACCAAGTACAACCCCTCCCTCAA GAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAA GAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGAC CGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAG AGAGAGGGGGTACCTTGACTACTGGGGCCAGG GAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 261/443

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SEQ ID	Descrição	Sequência
164	DNA de VH 21 A3	CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACT GGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTG CACTGTCTCTGGTGGCTCCGTCAGCAATCGTAA TTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGG GAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTA CAGTGGGAGGACCAAGTACAACCCCTCCCTCAA GAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAA GAACCAGTTCTCCCTGAAGGTGAGCTCTGTGAC CGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAG AGAGAGGGGGCGGTTTGACTACTGGGGCCAGG GAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
165	DNA de VL 21 A3	GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTG TCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCC TGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTAC TTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCT CCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGG GCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGC AGACTGGAGCCTGAAGAI I I IGCAGTGTATTACT GTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCG GCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
165	DNA de VH 1E8	CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACT GGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTG CACTGTCTCTGGTGGCTCCGTCAGCAGTGGTAG TTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGG GAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTA CAGTGGGAGAACCAAGTACAACCCCTCCCTCAA GAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAA GAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGGTCTGTGAC CGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGTGAG AGAGAGGGGCTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGG GAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
166	DNA de VL 1E8	GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTG TCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCC

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 262/443

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SEQ ID	Descrição	Sequência
		TGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTAC TTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCT CCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGG GCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGC AGACTGGAGCCTGAAGAI I I IGCAGTGTATTACT GTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTCTCACTTTCG GCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
167	2E2 VH DNA	CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGT GGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTG TGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCT ATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGG GCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGG AAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGG CCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAC ACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCT GAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAAGG GGTTCGGGGAGTTATTATAACTTTGACTACTGGG GCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
168	DNA de VL 2E2	GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTG TCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCC TGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTAC TTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCT CCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGG GCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGC AGACTGGAGCCTGAAGA I I I I GCAGTGTATTACT GTCAGCAGTATGGTAGCTCACCCACCTTCGGCC AAGGGACACGACTGGAGATTAAA
169	DNA de VH 23H8	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTT GGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTG TGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGG CATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTA

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 263/443

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SEQ ID	Descrição	Sequência
		GTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGG GCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGA ACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAG ACGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCTAACT GGGGATCCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTC ACCGTCTCCTCA
170	DNA de VL1 23H8	GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTG TCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCC TGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGAAGCTAC TTAGCCTGGTACCAGCAGAAACTTGGCCAGGCT CCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGG GCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGC AGACTGGAGCCTGAAGAI I I IGCAGTGTATTACT GTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTCTCACTTTCG GCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
171	DNA de VL2 23H8	GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGT CTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCT GCAGGGCCAGTCAGGGTGTTAGCAGCTACTTAG CCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA GGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCA CTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGG CCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGC CTAGAGCCTGAAGAI I I IGCAGTTTATTACTGTC AGCAGCGTAGCAACTGGCATACTTTCGGCGGAG GGACCAAGGTGGAGATCAAA
172	DNA de VL3 23H8	GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTG TCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCC TGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTAC TTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCT CCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGG GCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGC AGACTGGAGCCTGAAGA I I I I GCAGTGTATTACT

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 264/443

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SEQ ID	Descrição	Sequência
		GTCAGCAGTATGGTAGCTCACCCACTTTCGGCG GAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
173	DNA de 11H11VH	GAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTT GGTACATCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTG TGCAGGCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCT ATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGAAAAGGT CTGGAGTGGGTATCAGCTATTGGTACTGGTGGT GGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGA TTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCCT TGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGG ACATGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGAACT GGGAATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTG GTCACCGTCTCCTCA
174	DNA de 11H11VL1	GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTG TCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCC TGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTAC TTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCT CCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGG GCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGC AGACTGGAGCCTGAAGAI I I IGCAGTGTATTACT GTCAGCAGTATGGTAGCTCACCATTCACTTTCGG CCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
175	DNA de 11H11VL2	GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTG TCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTT GCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAG CCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTA AGGTCCCGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAA GTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGAT CTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCC TGCAGCCTGAAGATCTTGCAACTTATTACTGTCA ACAGTTTAATAGTTACCCTTTCGGCGGAGGGAC CAAGGTGGAGATCAAA
176	DNA de	CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACT

Petição 870190076189, de 07/08/2019, pág. 265/443

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SEQ ID	Descrição	Sequência
	15A5VH	GGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTG CACTGTCTCTGGTGGCTCCGTCAGCAGTGGTAG TTACTACTGGTGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGG GAAGGGACTGGAGTGGATCGGGTATATCTATTA CAGTGGGCGCACCAAGTACAACCCCTCCCTCAA GAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAA GAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGAC CGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAG AGAGAGGGGGCGGTTTGACTACTGGGGCCAGG GAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
177	DNA de 15A5VL	GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTG TCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCC TGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTAC TTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCT CCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGG GCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGC AGACTGGAGCCTGAAGAI I I IGCAGTGTATTACT GTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCG GCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
178	DNA de 36A3VH	CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACT GGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTG CACTGTCTCTGGTGGCTCCGTCAGCAGTGGTAG TTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGG GAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTA CAGTGGGAGAACCAAGTACAACCCCTCCCTCAA GAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAG GAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGAC CGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAG AGAGAGGGGCTGGCTCGACCCCTGGGGCCAGG GAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
179	DNA de 36A3VL	GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGT CTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCT GCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAG

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SEQ ID	Descrição	Sequência
		CCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA GGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCA CTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGT CTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCC TAGAGCCTGAAGAI I I IGCAGTTTATTACTGTCA GCAGCGTAGCAACTGGTCACCTTCGGCCAAGG GACACGACTGGAGATTAAA
180	DNA de 44B11VH	GAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTT GATCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTG TGCAGCCTCTGGGTTCACCGTCAGTAGCAAATA CATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGG GGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATGTATAGCGGTG GTAGAAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCC GATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACAC GCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGA GGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGG ATCGGGGTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTG GTCACCGTCTCCTCA
181	DNA de 44B11VL	GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGT CTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCT GCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAG CCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA GGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCA CTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGT CTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCC TAGAGCCTGAAGA I I I I GCAGTTTATTACTGTCA GCAGCGTAGCAACTGGCCGATCACCTTCGGCCA AGGGACACGACTGGAGATTAAA

Equivalentes:

[00912] Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determiner, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas descritas aqui. Tais equivalentes destinam-se a ser abrangidos pelas seguintes reivindicações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo as seguintes CDRs:

i. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:12;

ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:13;e iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:14; e uma região variável de cadeia leve compreendendo as seguintes CDRs:

1. CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:15;

ii. CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:16; e iii. CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:17;

em que o anticorpo se liga à α-sinucleína humana (SEQ ID NO:1).
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se a pelo menos um ou mais resíduos de aminoácido 123-128 de SEQ ID NO: 1.
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem maior afinidade para PFF de α-sinucleína do que os monômeros de α-sinucleína, como avaliado por um monômero de α-sinucleína/PFF de a-sinucleína (relação de ligação de monômero:PFF) como descrito no Exemplo 3.
4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo

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2/4 compreende sequências de região variável de cadeia pesada e leve que são pelo menos 95% idênticas às sequências de aminoácidos mencionadas nas SEQ ID NOs: 18 e 19, respectivamente.
5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em uma lgG1, uma lgG2, uma lgG3, uma lgG4, ou uma variante da mesma.
6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio de Fc compreendendo a sequência de aminoácido mencionada na SEQ ID NO: 119.
7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende sequências de cadeia pesada e leve que são pelo menos 95% idênticas às sequências de aminoácidos mencionadas nas SEQ ID NOs: 20 e 21, respectivamente.
8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.
9. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo biespecífico.
10. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica a região variável de cadeia pesada e/ou leve do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.
11. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 10.
12. Célula transformada, caracterizada pelo fato de é transformada com um vetor de expressão como definido na

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3/4 reivindicação 11.
13. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo como definido como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ligado a uma porção.
14. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo ou imunoconjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e 13, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. Método para preparação de um anticorpo anti-asinucleína, caracterizado pelo fato de que compreende:

cultivar uma célula hospedeira compreendendo o vetor de expressão como definido na reivindicação 11, em que o anticorpo é expresso e isolar o anticorpo da célula.
16. Método para inibição da geração de agregados de asinucleína insolúveis fosforilados em serina-129 em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da célula com uma quantidade eficaz do anticorpo, imunoconjugado, ou composição como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, 13 e 14.
17. Método de tratamento de uma doença ou diminuição da gravidade de uma doença distinguida pela presença de corpos de Lewy ou agregados patológicos de α-sinucleína no cérebro, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo com a doença de uma quantidade eficaz do anticorpo, imunoconjugado, ou composição como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, 13 e 14.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a doença é doença de Parkinson, demência de doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, doença de corpo de Lewy, atrofia do múltiplo sistema, ou insuficiência autonômica pura.

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4/4
19. Método, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
20. Método para detecção de α-sinucleína em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da amostra com o anticorpo ou imunoconjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e 13, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou imunoconjugado e α-sinucleína, e detecção da formação do complexo.