JP7173532B2 - α－シヌクレイノパチーの診断 - Google Patents

Description

本発明は、パーキンソン病等のα－シヌクレイノパチーの早期診断方法に関する。

パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、レビー小体型認知症は、進行性の難病であり、責任タンパク質であるα－シヌクレイン（ＡＳ）の凝集体沈着が共通病理として認識されている。これらの神経変性疾患は、α－シヌクレイノパチーと呼ばれている。これらの疾患は、いずれも根治療法は存在せず、対症療法が中心である。しかし、これらの疾患の診断及び治療開始の遅れは対症療法の効果を半減させ、寝たきりになるまでの期間を短くし、またＭＳＡの診断の遅れは病気の進行を予測することができないため、適切な処置が遅れ、突然死や重篤な肺炎などのリスクを上昇させる。

これらα－シヌクレイノパチーの早期診断手段としては、まず遺伝子検査が挙げられるが、例えばＰＤでは８０％程度の症例が遺伝的背景を持たない孤発性であるため有用ではない。また、心筋ＭＩＢＧシチグラフィー（ＰＤに生じる交換神経脱落をノルエピネフリン類似物質ＭＩＢＧの取り込み低下により評価）、ＤＡＴ（ドパミントランスポーター）スキャンなどの検査は一定の診断効率上昇の効果は認められるが、６万円以上の費用を要する。
また、髄液中の異常α－シヌクレイン濃度をＲＴ－ＱｕＩＣ（Real-time quaking-induced conversion）やＨＡＮＡＢＩ（Handai Amyloid Burst Inducer：交差型超音波発生装置とマイクロプレートリーダーを一体化した全自動蛋白質凝集検出装置）で測定する方法が報告されている（非特許文献１、２）。

Ann Clin Transl Neurol 2016; 3:812-818 J Biol Chem. 2014; 289:27290-27299.

しかし、髄液検査は、局所麻酔が必要であり、侵襲的な検査であるため患者への苦痛が伴うことから、全症例に行うことは困難である。
従って、本発明の課題は、患者に対する負担が少なく、かつ簡便かつ安価な、ＰＤに代表されるα－シヌクレイノパチーの早期診断方法を提供することにある。

そこで本発明者は、血液試料中の異常α－シヌクレインの測定を検討したが、そもそも血液中のα－シヌクレイン濃度は１ｐｇ／ｍＬ前後と非常に少なく検出に限界があった。さらに前述のように髄液に対して採用されていたＲＴ－ＱｕＩＣを検討したが、髄液中の異常α－シヌクレイン測定条件では正確な測定はできなかった。そこで、さらに検討した結果、まず血液試料に抗α－シヌクレイン抗体を反応させて免疫沈降を行い、沈降した試料に対して一定のｐＨ範囲でＲＴ－ＱｕＩＣを行えば、ＰＤ等のα－シヌクレイノパチーが正確かつ簡便に診断できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、次の〔１〕～〔３〕を提供するものである。

〔１〕α－シヌクレイノパチーを診断するために、被検血液試料に抗α－シヌクレイン抗体を反応させて免疫沈降した試料に対して、ｐＨ６～７．９の反応液条件でＲＴ－ＱｕＩＣを行うことを特徴とする被検血液中の異常α－シヌクレイン濃度の測定方法。
〔２〕α－シヌクレイノパチーが、パーキンソン病、多系統萎縮症及びレビー小体型認知症から選ばれる神経変性疾患である〔１〕記載の測定方法。
〔３〕被検血液試料が、ヒト血清である〔１〕又は〔２〕記載の測定方法。

本発明によれば、患者への負担が少なく、簡便かつ安価にＰＤに代表されるα－シヌクレイノパチーが早期診断できる。そのため、運動症状等が出現する前の早期から治療を開始することができる。

ｐＨ３．０～５．０で反応させた場合のＰＤと健常コントロールの凝集反応結果を示す図である。 ｐＨ８．０で反応させた場合のＰＤと健常コントロールの凝集反応結果を示す図である。 ｐＨ７．５で反応させた場合のＰＤと健常コントロールの凝集反応結果を示す図である。 本発明方法によるＰＤ、健常コントロール、ＭＳＡ及びＰＳＰの凝集反応結果を示す図である。 ＤＡＴスキャンで変化のないＲＢＤ患者の凝集反応結果を示す図である。 ヒト血清に直接ＱｕＩＣを施した場合のＰＤ及び健常コントロールの凝集反応結果を示す図である。

本発明の被検血液中の異常α－シヌクレイン濃度の測定方法は、α－シヌクレイノパチーを診断するために、被検血液試料に抗α－シヌクレイン抗体を反応させて免疫沈降した試料に対して、ｐＨ６～７．９の反応液条件でＲＴ－ＱｕＩｃを行うことを特徴とする。

本発明に用いられる検体は、血液試料であり、好ましくはヒト血液であり、さらに、血清、特にヒト血清が好ましい。従来、異常α－シヌクレイン濃度測定に髄液は用いられていたが、血液は用いられていなかった。血液を検体として異常α－シヌクレインの検出が可能になれば、患者への負担が改善されることは明らかである。

まず、本発明方法では、被検血液試料に抗α－シヌクレイン抗体を反応させて免疫沈降を行う。
抗α－シヌクレイン抗体としては、α－シヌクレインに対する特異的でかつモノマー、オリゴマー、凝集体のすべての構造を認識する抗体であれば、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、既に市販されているものを使用することができる。免疫沈降は、通常の免疫沈降法を行えばよく、例えば、被検血液試料に抗α－シヌクレイン抗体を反応させ、ビーズ又は磁気ビーズを加えて免疫反応混合物とビーズ又は磁気ビーズと結合物を得、その後結合物から免疫反応混合物を回収する方法が挙げられる。

次に得られた免疫反応混合物に対して、ｐＨ６～７．９の反応液条件でＲＴ－ＱｕＩＣを行う。
ＲＴ－ＱｕＩＣは異常構造型のタンパク質を増幅反応の核（ｓｅｅｄ）として凝集反応を連続的に試験管内で行い、試料中の異常構造型タンパク質を増幅して検出する。またこの増幅過程をβシート構造のタンパク質に特異的に結合し蛍光を発するチオフラビンＴ（ＴｈＴ）の蛍光強度を測定することで異常構造型タンパク質の存在の有無をリアルタイムに測定するシステムである。
増幅反応は、（１）試料中の正常型α－シヌクレインと異常構造型α－シヌクレインを共凝集させる段階と、（２）共凝集を促進して正常型α－シヌクレインから異常構造型α－シヌクレインへの変換をもたらす段階を経てＴｈＴで検出する。異常構造型α－シヌクレインの共凝集を促進するため、正常型α－シヌクレインを反応液に添加するのが好ましい。この共凝集及び構造変換反応を、本発明ではｐＨ６～７．９の反応液条件で行う。
α－シヌクレインは酸性で凝集する傾向が強く、反応液がｐＨ６未満の強酸性の条件下では健常人にも内在性α－シヌクレインがあり、ＰＤ患者と同等に凝集反応を生じる。一方ｐＨ８．０のアルカリ性の条件下ではＰＤおよび健常人の試料において凝集反応が起こりにくい。反応液がｐＨ６～７．９であるとＰＤの試料は、蛍光強度が最大の２６万ＲＦＵまで上昇し、凝集反応を認めるが、健常人の試料においては凝集反応を認めず両者を区別することが可能である。好ましい反応ｐＨは６．５～７．９であり、より好ましくは６．５～７．８であり、さらに好ましくは７．５である。

以上のように、本発明方法によれば、患者に負担の少ない血液試料を用いて、簡便な操作により、異常α－シヌクレイン濃度が高い患者を健常人と区別して判定することができる。異常α－シヌクレイン濃度が高い患者としては、ＰＤに限定されず、ＭＳＡ、レビー小体型認知症が挙げられる。

次に実施例を挙げて、本発明を更に詳細な説明する。

実施例１
（１）ヒト血清に対して磁気ビーズを用いた免疫沈降を行った。
最初に磁気ビーズと抗α－シヌクレイン抗体をオーバーナイトで反応させ、その後被検血液試料を3時間反応させる。免疫反応混合物の溶出には、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５～３）を用いる。数秒反応させて溶出させたのち、速やかにｐＨ７．５に調整する。

（２）ＲＴ－ＱｕＩＣ
増幅反応は（ｉ）反応液とＩＰ－血清をインキュベートして反応混合物中に存在する正常型α－シヌクレインと構造異常型α－シヌクレインの共凝集を可能にする段階（ii）共凝集を促進して正常型α－シヌクレインから構造異常型への変換をもたらす段階を経てＴｈＴで検出する。共凝集の促進、構造変換においては２００ｒｐｍ，１ｍｉｎ ｓｈａｋｅ，１４ｍｉｎ ｒｅｓｔの振盪を１２０時間連続して行い、マルチプレートリーダー（ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ－Ｆｘ１Ｐ ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）を用いてリアルタイムに蛍光強度を測定した。反応液の組成は１００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５），１０μｍｏｌ／Ｌ ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ Ｔを用いた。基質α－シヌクレインは１０μｇ使用している。ＳｅｅｄはＩＰ－血清を使用している。ＢＣＡ ａｓｓａｙを行い、タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍＬに合わせた血清１００μＬをＩＰし、ｓｅｅｄとして５μＬ使用している。
α－シヌクレインは酸性で凝集する傾向が強い。ＭＥＳ溶液とＮａＯＨ溶液で調整したＭＥＳ溶液を用いた反応液で、ｐＨ３．０～５．０の強酸性の条件下では健常人にも内在性α－シヌクレインがあり、ＰＤ患者と同等に凝集反応を認めた（図１）。一方りん酸二水素ナトリウムとりん酸水素二ナトリウムで調整したｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒを用いた反応液でｐＨ８．０のアルカリ性の条件下ではＰＤおよび健常人のＩＰ－血清において凝集反応が起こりにくかった（図２）。反応液がｐＨ７．５であるとＰＤのＩＰ－血清は、蛍光強度が最大の２６万ＲＦＵまで上昇し、凝集反応を認めるが、健常人のＩＰ－血清においては凝集反応を認めず両者を区別することが可能であった（図３）。

上記の方法を利用して患者群の血清（対照群をｃｏｎｔｒｏｌ、レム睡眠行動異常症のみを認める群ＲＢＤ、多系統萎縮症をＭＳＡ、進行性核上性麻痺をＰＳＰと表記する）を用いてアッセイを行った。特にＲＢＤはＰＤ／ＭＳＡの運動症状発症前の前駆症状として知られており、ＲＢＤ患者のうち、５年間で１８～３５％、１０年間で４１～７６％がＰＤ／ＭＳＡに移行する。血液採取にあたり、特に絶食などの制限は行っていない。血液採取・血清抽出を行い、－８０℃に保存した。ＰＤ患者２００名、ｃｏｎｔｒｏｌ１００名、ＲＢＤ７名、ＭＳＡ患者１５名、ＰＳＰ患者４名、ＡＤ群２３名でアッセイを行った。
ＰＤおよびＭＳＡにおいては約８０時間前後で凝集反応を認めた（図４）。一方でｃｏｎｔｒｏｌおよびＰＳＰでは凝集反応を認めなかった（図４）。ＤＡＴスキャンで変化のないＲＢＤ患者では凝集反応を認めなかった（図５）。

（３）ヒト血清を直接ＲＴ－ＱｕＩＣに付した（免疫沈降は行なっていない。反応液の組成は１００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５），１０μｍｏｌ／Ｌ ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ Ｔである。基質α－シヌクレインは１０μｇ使用している。タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍＬに合わせた血清５μＬを使用）。その結果、異常構造型α－シヌクレインは検出できなかった（図６）。

Claims (3)

1. α－シヌクレイノパチーを診断するために、被検ヒト血液試料に抗α－シヌクレイン抗体を反応させて免疫沈降した試料に対して、ｐＨ６．５～７．８の反応液条件でＲＴ－ＱｕＩｃを行うことを特徴とする被検ヒト血液中の異常α－シヌクレイン濃度の測定方法。
2. α－シヌクレイノパチーが、パーキンソン病、多系統萎縮症及びレビー小体型認知症から選ばれる神経変性疾患である請求項１記載の測定方法。
3. 被検ヒト血液試料が、ヒト血清である請求項１又は２記載の測定方法。

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