CN108020673A

CN108020673A - Aβ试剂盒、检测方法及应用

Info

Publication number: CN108020673A
Application number: CN201711132802.8A
Authority: CN
Inventors: 于顺; 杨巍巍; 李昕
Original assignee: Xuanwu Hospital
Current assignee: Xuanwu Hospital
Priority date: 2017-11-15
Filing date: 2017-11-15
Publication date: 2018-05-11
Also published as: WO2019095403A1

Abstract

本发明提供一种β‑淀粉样肽(Aβ)检测试剂盒，试剂盒包括抗血红蛋白(Hb)抗体和抗Aβ抗体，其以抗Hb抗体为捕获抗体，用于捕获Hb，以抗Aβ抗体为检测抗体，检测与Hb结合的Aβ含量。本发明至少具有以下优势之一：1)本发明提供的Aβ检测试剂盒适用于所有与Hb结合的Aβ含量的定量检测，包括与外周血红细胞中的与Hb结合的Aβ含量的定量检测；2)鉴于血液红细胞样本采集与保存便捷，该检测试剂盒适合大规模人群筛选；3)测试结果稳定；4)可反映机体组织尤其是神经组织中Aβ含量的变化；5)能够解决现有的从脑脊液、血浆和血清样本中检测Aβ的技术所存在的溶血对样本的污染问题。

Description

Aβ试剂盒、检测方法及应用

技术领域

本发明涉及免疫测定领域，具体涉及Aβ检测试剂盒、检测方法及其应用。

背景技术

β-淀粉样肽或蛋白(amyloidβ-peptide，又名amyloidβ-protein Aβ或Abeta)分子量约4kDa，由β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)水解而产生的含有39～43个氨基酸的多肽，其异常聚集体是构成AD病人脑中的主要病理结构——老年斑(senile plaque)的主要成分[1]。Aβ是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)在病理情况下的降解产物。在生理情况下， APP以分泌途径(或非淀粉样生成途径)降解。APP首先在α-分泌酶(α-secretase)的作用下降解为可溶性的N-末端片段(sAPPα) 和一个C-末端片段(C83)，后者被γ-分泌酶(γ-secretase)进一步分解为3kDa的较小的C-末端片段。在病理情况下，APP以淀粉样生成途径(amyloidogenic pathway)降解。APP首先被β-分泌酶 (β-secretase)降解，释放出较小的N-末端片段(sAPPα)和一个较长的含有Aβ全部氨基酸序列的C-末端片段(C99)，后者进一步在γ-分泌酶的作用下产生具有致病性的Aβ肽。不同分子大小的 Aβ在释放时以单体形式存在，逐渐聚集成寡聚体、原纤维和纤维，并沉积形成淀粉样斑块(或老年斑)。其中，Aβ42是最容易聚集且神经毒性作用最强的Aβ分子。Aβ寡聚体通过多种机制发挥神经毒性作用，包括激活炎症反应，引起线粒体功能异常，增强氧化应激，损害细胞内信号通路和突触可塑性，增加tau蛋白的磷酸化和GSK-3β活性，引起钙代谢失调和诱发细胞凋亡或死亡[2]。上述机制引起一个正反馈反应：Aβ肽的产生导致一系列对神经元有害的事件，后者反过来引起APP代谢的异常和更多的Aβ肽的释放。

鉴于Aβ在AD患者的大脑中积聚并且是AD发病机制的中心要素的事实，Aβ已经被认为是作为AD生物标志物的最合适候选物。目前，检测主要集中于脑脊液和血液中的Aβ。脑脊液中，AD 病人的Aβ42(或Aβ1-42)含量降低，t-tau和p-tau含量增高，Aβ42、 t-tau(总的tau)和p-tau(磷酸化tau)含量变化的检测结果一致。结合t-tau、p-tau，以及Aβ40(Aβ1-40)与Aβ42的比值，能有效地预测脑中Aβ的沉积。检测脑脊液中Aβ的变化可以将轻度认知功能障碍患者中呈现进行性认知功能下降或转为AD的与认知相对稳定的患者区分开来，且结果可靠。脑脊液Aβ作为AD诊断标志物的应用已经在大规模人群得到验证，并通过神经病理检测得到确认[3]。但是，检测脑脊液中的Aβ存在取样困难，采集过程复杂，损伤较大等问题，大多数患者不愿意接受，尤其是对于早期或可能患有AD的患者，从而延误治疗，错过AD治疗的最佳时期。

血液样本采集操作容易、创伤小，容易被大多数患者所接受。目前针对血液中Aβ的检测主要是测试血浆或血清中的Aβ。然而，针对血浆或血清中Aβ42的检测则呈现出矛盾的结果。传统的 ELISA方法或Luminex检测法测试AD患者血浆的Aβ42含量的结果有的增高，有的降低，有的无变化。其主要原因之一被归结为血浆Aβ42含量较低，传统方法的检测敏感性不够[4-8]。然而，检测结果不一致的问题并没有因为增加检测敏感性得到解决。例如新近推出的超敏感的检测技术。一个技术是免疫磁珠还原法 (Immunomagnetic Reduction，IMR)，由MagQu Company,Ltd. 公司(台湾省新北市)开发。另一个技术是单分子阵列技术(Single molecular array，SIMOA)，由美国Quanterix公司(Lexington,MA) 开发。这两个技术都是基于特异性抗体与待检物质或蛋白标准品之间的免疫反应。IMR是通过超导量子干扰装置检测交流磁化率 (Magnetic susceptibility)。而SIMOA技术是通过与荧光底物(Resorufinβ-D-galactopyranoside)反应的单个酶标免疫复合物的荧光成像检测抗原分子的存在。然而，IMR检测出血浆中的Aβ的结果是：Aβ42水平增高，Aβ40水平降低或不变[4,9-12]；而SIMOA 技术检测出的血浆中Aβ的结果是：Aβ42和Aβ40水平降低[4,13]。

迄今为止，不管使用传统的ELISA技术还是更先进的IMR或 SIMOA技术，血液中Aβ的检测仍然没有一致性的结论。分析其原因，可能有以下几点：1.血液中的Aβ含量少，基本处于检测限以下，利用现有技术无法检测出Aβ，或检测结果不准确；2.利用现有技术检测血液中的Aβ时，无法避免溶血对其的影响。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种新的检测血液中Aβ的试剂盒。该试剂盒的检测能够避免溶血对样本的污染，使得结果更加准确，可靠。

一方面，本发明提供了一种检测待测样品中Aβ的试剂盒，其包括抗Hb抗体和抗Aβ抗体。在本发明的试剂盒中，抗Hb抗体可作为捕获抗体，用于捕获待检样品中的Hb；抗Aβ抗体可作为检测抗体，用于检测与Hb结合的Aβ。

优选地，本发明的检测待测样品中Aβ的试剂盒还任选地包括 Hb-Aβ复合体标准蛋白。该Hb-Aβ复合体标准蛋白可与抗Hb和Aβ抗体相结合，用于制作标准曲线。

示例性地，所述抗Hb抗体的浓度为0.5～4μg/mL，优选的为 1～2μg/mL，更优选的为2μg/mL。

示例性地，所述抗Aβ抗体的浓度为0.1～2μg/mL，优选的为 1μg/mL。

在本发明提供的一具体实施例中，所述抗Aβ抗体为酶标记的抗Aβ抗体。所述酶为辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase， HRP)、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)或葡萄糖氧化酶 (Glucose Oxidase，GO)。

在本发明提供的另一具体实施例中，所述抗Aβ抗体为荧光或化学发光材料或胶体金标记的抗Aβ抗体，例如FITC或绿色荧光蛋白等。

在本发明提供的另一具体实施例中，所述抗Aβ抗体为生物素化的抗Aβ抗体，以及，任选地，所述试剂盒还包括亲和素标记的酶，例如碱性磷酸酶。

在本发明提供的又一具体实施例中，所述抗Aβ抗体为未被酶标记的抗Aβ抗体，所述试剂盒还包括酶标记的二抗，或荧光素、化学发光材料、生物素、胶体金等其他物质标记的二抗，所述二抗可特异性的与抗Aβ抗体相结合。

示例性地，本发明中的待测样品是来源于人、动物和/或培养细胞。优选地，所述待测样品来源于人，更优选地，来源于阿尔茨海默(AD)患者或者具有患AD风险的人群。进一步优选地，所述样品是血液样品，或来自于血液的红细胞胞浆蛋白，或其它任何含有Hb的组织。

进一步的，所述试剂盒还可以包括固相载体、缓冲液、封闭液等。其中，所述固相载体为酶标板、微孔板、试管或微孔滤膜，优选的，所述固相载体为酶标板；固相载体的材质例如可为聚苯乙烯、硝酸纤维素、尼龙等。

所述缓冲溶液选自Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、CBS缓冲液或缓冲生理盐水；

所述封闭液选自2％-8％的新生牛血清或含明胶的PBST。

另一方面，本发明还提供了抗Hb抗体在制备用于检测待测样本中Aβ含量的试剂盒或试剂中的用途。

在一具体的实施方式中，本发明提供了抗Hb抗体和抗Aβ抗体在制备用于检测待测样本中Aβ含量的试剂盒或试剂中的用途。

再一方面，本发明提供了抗Hb抗体在制备用于检测待测样品是否患有AD或患有AD风险的试剂盒或试剂中的用途。

在一具体的实施方式中，本发明提供了抗Hb抗体和抗Aβ抗体在制备用于检测待测样本是否患有AD或患有AD风险的试剂盒或试剂中的用途。

又一方面，本发明还提供了Aβ试剂盒的制备方法，其包括：

1)抗Hb抗体包被的固相载体的制备；和

2)抗Aβ抗体的配制；以及任选地，

3)Hb-Aβ复合物标准品的配制；

进一步的，上述步骤1)包括配制抗Hb抗体包被液、配制封闭液及包被酶标板。

在本发明的一个具体实施方式中：

配制抗Hb抗体包被液：采用缓冲溶液稀释抗Hb抗体；

配制封闭液：将2％-8％的新生牛血清加入缓冲溶液中，或将明胶溶于PBST中；以及，

包被酶标板：将配制的抗Hb抗体包被液加入酶标板孔中，孵育过夜，冲洗；将配制的封闭液加入酶标板孔中，恒温孵育2-4h，冲洗即得。

在本发明中，所述缓冲溶液优选自：Tris-HCl缓冲液，PBS 缓冲液，CBS缓冲液或缓冲生理盐水；

进一步的，在本发明的一个具体实施方式中，上述步骤3) 具体包括如下步骤：

A、用缓冲液分别溶解磷酸化Aβ和Hb后，将其混合，振荡孵育；

B、孵育样品离心取上清，层析柱凝胶过滤，分离Hb-Aβ复合体；

C、用质谱分析方法，确定Aβ占Hb-Aβ复合体的占比。

进一步的，在本发明的一个具体实施方式中，上述步骤2)是通过使用封闭液稀释抗Aβ抗体来进行的。

还一方面，本发明还提供了Aβ的检测方法，其包括以下步骤：

1)抗Hb抗体捕获Hb；和

2)抗Aβ抗体检测与Hb结合的Aβ。

进一步的，上述Aβ的检测方法，具体包括：

S1：准备待检样品；

S2：向固相载体中加入抗Hb抗体，孵育，冲洗；

S3：向固相载体中加入封闭液，孵育，冲洗；

S4：向固相载体中加入酶标记的抗Aβ抗体，孵育，冲洗；或

向固相载体中加入抗Aβ抗体，孵育，冲洗；加入酶标二抗，孵育，冲洗；加入OPD显色液显色；加入终止液终止显色；或，

向固相载体中加入生物素化的抗Aβ抗体，孵育，冲洗；加入亲和素标记的碱性磷酸酶，孵育，冲洗；加入对硝基苯磷酸显色液显色。

优选地，本发明中Aβ的检测包括对Aβ的定性和定量检测。

本发明还提供了Aβ试剂盒在检测Aβ中的应用。

优选地，在本发明所述的抗体为单克隆抗体，例如能够特异性结合Hb的抗体和能够特异性结合Aβ的抗体。示例性地，所述抗体可为完整抗体、双特异性抗体、抗体片段、基因工程抗体等，例如可以为(Fab’)₂、Fab’、Fab、scFv、diabody、minibody、鼠源抗体和人源化抗体等等。

优选地，在本发明中，与二抗相偶联的酶可选自辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP)、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)或葡萄糖氧化酶(GlucoseOxidase，GO)。

优选地，本发明的试剂盒还含有使用说明书。

本发明提供的Aβ试剂盒及其检测方法和相关的应用是以抗 Hb抗体为捕获抗体，用于捕获Hb，再以抗Aβ抗体为检测抗体，检测与捕获的Hb相结合的Aβ。示例性地，本发明至少具有以下优势之一：

1)本发明提供的Aβ检测试剂盒适用于所有与Hb结合的 Aβ含量的定量检测，包括与外周血红细胞中的与Hb结合的Aβ含量的定量检测；

2)血液红细胞样本采集与保存便捷，适合大规模人群筛选；

3)测试结果稳定；

4)可反映机体组织尤其是神经组织中Aβ含量的变化；

5)能够解决现有的从脑脊液、血浆和血清样本中检测Aβ的技术所存在的溶血对样本的污染问题。

附图说明

图1为本发明实施例中红细胞胞浆蛋白分离过程示意图；

图2为本发明实施例5中Aβ试剂盒检测结果；

图3为本发明实施例5中Aβ试剂盒检测结果的ROC曲线图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

需要说明的是，本发明中β-淀粉样肽或蛋白、amyloid、amyloid β-peptide、β-protein、Amyloid beta、Aβ以及Abeta等均为同一物质，且英文名称、简写等不区分大小写。

本发明中部分试剂的配制方法如下，其他试剂均为常规配制方法。

PBS的浓度为0.01mol/L，配制方法为：

NaHCO₃缓冲液的浓度为200mmol/L，pH 9.6，配制方法为：

NaHCO₃ 0.84g

20％叠氮钠(NaN₃) 50μl

DDW 50ml

封闭液的浓度为2.5％，配制方法为：

明胶 2.5g

PBST 100ml

PBST为含0.05％Tween-20的0.01mol/L PBS，配制方法为：

实施例1Aβ试剂盒的制备方法

1.配制抗Hb抗体包被液

采用缓冲溶液将抗Hb抗体稀释至0.2μg/mL-10μg/mL；所述缓冲溶液选自：Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、CBS缓冲液或缓冲生理盐水。本实施例采用NaHCO₃缓冲液。本实施例中对抗Hb 抗体不做限定，可为任意能够特异性识别血红蛋白的抗体。

2.配制封闭液

封闭液选自2％-8％的新生牛血清或明胶含量为2.5％的PBST 溶液(含0.05％Tween-20的0.01mol/L PBS)。本实施例采用明胶含量为2.5％的PBST溶液。

3.包被用固相载体

固相载体可为酶标板、微孔板、试管或微孔滤膜。本实施例中采用酶标板，且对酶标板进行修饰，其中所述的修饰通过如下进行：将酶标板置于装有紫外灯的医用净化操作台上，固定紫外灯与微孔板基底的垂直距离，对微孔板进行紫外处理。

4.配制标准品(定量标准曲线的建立)

1)用500μL的0.01mol/L PBS溶解人Aβ和Hb，使终浓度分别为2mol/L与1mol/L，混合于37℃、230rpm、振荡孵育24h；

2)孵育样品在10000×g离心5min，吸取上清，以PBS为流动相，HiPrep 26/60Sephacryl S-200High Resolution层析柱凝胶过滤，分离Hb-Aβ复合体；

3)用SWATH(Sequential Window Acquisition of all THeoretical MassSpectra)定量蛋白组方法，确定平均每个Hb结合的Aβ蛋白分子数，从而计算出Aβ占复合体的重量百分比或摩尔百分比。据此，配制不同浓度的Hb-Aβ蛋白复合体溶液，将其作为标准蛋白制作标准曲线。

5.配制抗Aβ抗体溶液

将抗Aβ抗体用酶偶联物稳定剂稀释而成。本实施例中对抗Aβ抗体不做限定，可为任意能够特异性识别Aβ的抗体。

酶偶联物稳定剂能够保持抗体与酶偶联物之间稳定性的试剂，能够保持抗体及酶的活性。优选的，其可为HRP酶偶联物稳定剂，本发明中酶偶联物稳定剂可为市售产品。

6.配制酶标二抗溶液

用封闭液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗Aβ抗体。

7.洗液

洗液为含Tween-20的PBS溶液(简称PBST溶液)，其中， PBST溶液中可包含生物液体防腐剂如ProClin300。

8.底物溶液

底物溶液可为OPD(邻苯二胺)、OT(邻联甲苯胺)、ABTS (2,2'-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))、p-NPP(对硝基苯磷酸酯)或四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine，TMB)。优选的为OPD。

9.终止液

终止液可为10％(V/V)硫酸溶液。

10.样品稀释液

样品稀释液为PBS溶液。

本发明提供的试剂盒中，各种试剂分别包装，优选使用包装管，每个包装管装入试剂的量以够一个样本使用量为基本量，可以扩大到10个，100个，1000个样本的使用量。

实施例2Aβ试剂盒的检测方法(OPD法)

S1：如图1所示，取5-10ml抗凝血，混匀，贴壁加入至离心管中，记录全血的体积，按照一定的稀释比例加入PBS，充分混匀。

S2：将稀释后的全血缓慢加至淋巴细胞分离液上，离心，分离红细胞层。将红细胞转移到新的离心管中，加PBS，离心，-80℃保存。

S3：将冻存红细胞在室温融化后放入离心机，离心，上层即为红细胞胞浆蛋白。

S4：包被：用NaHCO₃缓冲液稀释抗Hb抗体至终浓度为 0.5-4μg/mL。向酶标板各孔加入该抗体稀释液，孵育过夜。冲洗。

S5：封闭：向酶标板各孔中加入封闭液，孵育2h。冲洗。

S6：反应1：向酶标板各孔中加入红细胞胞浆样品，或血红蛋白-Aβ复合物标准蛋白，孵育2h。冲洗。

S7：反应2：用封闭液稀释鼠抗Aβ抗体至终浓度为 0.1-2μg/mL。向酶标板的各孔加入该抗体稀释液，孵育2h。冲洗。

S8：用封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1:5000 稀释)，向酶标板的各孔加入该酶稀释液，每孔100μL。孵育0.5-2h。冲洗。

S9：显色：向酶标板的各孔加入OPD显色液，室温避光显色 15min。

S10：终止：用10％H₂SO₄终止显色。

S11：测定含量：在紫外分光光度计490nm处测定酶标板各孔的吸光度值。

S12：计算：根据体外制备的Hb-Aβ复合体标准品的浓度与 490nm处吸光值之间的关系曲线，计算样品中与血红蛋白结合的 Aβ复合体的含量。

本实施例试验了不同的抗Hb抗体浓度及样品浓度对试剂盒检测结果的影响。其中，包被抗体(抗Hb抗体)分别选择0.5μg/mL、 1μg/mL、2μg/mL和4μg/mL四个条件；样品采用PBS缓冲液稀释，样品浓度分别选择原样、1:1、1:2、1:4四个条件。其对试剂盒检测结果的影响如下表1。

表1不同的抗Hb抗体浓度及样品浓度对试剂盒的影响

从上述表1中可以看出，血液采用原样和稀释度为1:1比例的 OD值相差不大。考虑到成本问题，选择1:1比例稀释血液进行上样。包被抗体为1-2μg/mL时，测定的OD值在线性范围内，并且包被抗体达不到饱和状态，使得测量数值更加准确。综合考虑，上样样品浓度选择1:1的稀释比例，包被抗体选择2μg/mL。

本实施例还试验了不同的检测抗体(抗Aβ抗体)浓度对试剂盒检测结果的影响。其浓度选择及实验结果见下表2。

表2不同的捕获抗体浓度对试剂盒的影响

检测抗体(μg/ml)	0.5	1	2
				OD值	0.371	1.458	2.227

从上述表2中可以看出，检测抗体为0.5-2μg/mL时，测定的 OD值在线性范围内。综合考虑，检测抗体选择1μg/mL。

实施例3Aβ试剂盒的检测方法(生物素法)

S5：封闭：向酶标板各孔中加入封闭液，孵育2h。冲洗。

S6：反应1：向酶标板各孔中加入红细胞胞浆样品，或Hb-Aβ复合物标准蛋白，孵育2h。冲洗。

S7：反应2：用封闭液稀释生物素化鼠抗Aβ抗体至终浓度为 0.5-4μg/mL。向酶标板的各孔加入该抗体稀释液，孵育2h。冲洗。

S8：用封闭液稀释亲和素标记的碱性磷酸酶(1:5000稀释)，向酶标板的各孔加入该酶稀释液，每孔100μL。孵育0.5-2h。冲洗。

S9：显色：向酶标板的各孔加入对硝基苯磷酸显色液，37℃水浴避光显色30min。

S10：终止：用10％H₂SO₄终止显色。

S11：测定含量：在紫外分光光度计405nm处测定酶标板各孔的吸光度值。

S12：计算：根据体外制备的Hb-Aβ复合体标准品的浓度与 405nm处吸光值之间的关系曲线，计算样品中与Hb结合的Aβ含量。

同样，本实施例试验了不同的包被抗体(抗Hb抗体)浓度、样品浓度及检测抗体(抗Aβ抗体)浓度对试剂盒检测结果的影响。其中，包被抗体(抗Hb抗体)分别选择0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL 和4μg/mL四个条件；样品采用PBS缓冲液稀释，样品浓度分别选择原样、1:1、1:2、1:4四个条件；检测抗体(抗Aβ抗体)浓度选择0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL三个条件。

通过实验，最终选择包被抗体的浓度为2μg/mL；样品浓度为 1:1的稀释比例；检测抗体浓度为1μg/mL。

实施例4Aβ试剂盒重复性、精密度试验

以实施例2中选出的最佳条件制备Aβ试剂盒，分别取三批，每批中随机抽取20个试剂盒进行如下试验。

精密度试验：采用上述抽取出的试剂盒分别测定三份Aβ蛋白值分别为0.5mmol/L(高)、0.125mmol/L(中)和0.03125mmol/L (低)的样本，各8次。计算测定浓度的变异系数。

实验结果表明，上述三批试剂盒的检测结果的变异系数小于 8.0％。重复性试验：采用上述抽取出的试剂盒分别对相同样本重复试验3次，其结果显示相对标准差RSD为0.60％，

以上实验结果表明各试剂盒对样品的检测结果的离散程度较小，重复性较好，均可用于Aβ的检测。

实施例5Aβ试剂盒的应用

利用本发明实施例2选出的最佳条件制备Aβ试剂盒，检测 50例正常人群，50例AD病人血液红细胞中与Hb结合的Aβ的 OD值，然后绘制成散点图，如图2所示。

图2中实心圆圈代表每个正常的人Hb-Aβ的OD值。空心圆圈代表每个AD病人Hb-Aβ的OD值。图中的横线代表正常人与 AD的均值水平。

从图2中可知，AD病人血液红细胞中Hb-Aβ的量较正常人群增高显著。

图3为根据试剂盒检测的OD值绘制的ROC曲线，初步检测了Aβ试剂盒的敏感性为87.5％；特异性为81.25％；95％可信区间为0.7615-0.9612。

据此可知，本发明实施例提供的Aβ试剂盒敏感性、特异性均较高，能够适用于血液红细胞中Hb-Aβ的检测。且利用本发明提供的Aβ试剂盒，能够避免溶血对样本的污染，使得检测结果更加准确可靠，依据Aβ蛋白循环于血液、脑脊液和脑间质液的特征，可间接判定Aβ蛋白在其他部位的含量。

再者，含有血红蛋白的样本易于采集，容易被患者所接受，使得本发明提供的Aβ试剂盒能够适用于大规模的筛查，以便尽早的检测出或确定是否为AD病人，也便于对神经保护药物疗效的评估，其应用价值非常广泛。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

参考文献

1.Hamley IW.The amyloid beta peptide:a chemist's perspective. Role inAlzheimer's and fibrillization.Chem Rev.2012； 112(10):5147-5192.

2.Penke B,Bogár F,L.β-Amyloid and the Pathomechanisms ofAlzheimer's Disease:A Comprehensive View.Molecules.2017；22(10).pii:E1692.

3.Blennow K.A Review of Fluid Biomarkers for Alzheimer's Disease:Moving from CSF to Blood.Neurol Ther.2017；6

(Suppl 1):15-24.

4.Lue LF,Guerra A,Walker DG.Amyloid Beta and Tau as Alzheimer'sDisease Blood Biomarkers:Promise From New Technologies.Neurol Ther.2017；6(Suppl 1):25-36.

5.Rani P,Krishnan S,Rani Cathrine C.Study on Analysis of PeripheralBiomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis. Front Neurol.2017；8:328.

6.J,Giedraitis V,Irizarry MC,J,Ingelsson E,E,J,Gunnarsson MD,Hyman BT,Basun H,Ingelsson M,Lannfelt L,Kilander L.Plasma beta amyloid and the risk of Alzheimer disease and dementiain elderly men: a prospective,population-based cohort study.Arch Neurol.2008；65(2):256-263.

7.Donohue MC,Moghadam SH,Roe AD,Sun CK,Edland SD, Thomas RG,PetersenRC,Sano M,Galasko D,Aisen PS, Rissman RA.Longitudinal plasma amyloid beta inAlzheimer's disease clinical trials.Alzheimers Dement.2015；11(9): 1069-1079.

8.Ritchie C,Smailagic N,Noel-Storr AH,Takwoingi Y,Flicker L,Mason SE,McShane R.Plasma and cerebrospinal fluid amyloid beta for the diagnosis ofAlzheimer's disease dementia and other dementias in people with mildcognitive impairment (MCI).Cochrane Database Syst Rev.2014；(6):CD008782.

9.Lue LF,Sabbagh MN,Chiu MJ,Jing N,Snyder NL,Schmitz C, Guerra A,Belden CM,Chen TF,Yang CC,Yang SY,Walker DG,Chen K,Reiman EM.Plasma Levels ofAβ42 and Tau Identified Probable Alzheimer's Dementia:Findings in TwoCohorts.Front Aging Neurosci.2017；9:226.

10.Chiu MJ,Yang SY,Chen TF,Chieh JJ,Huang TZ,Yip PK, Yang HC,ChengTW,Chen YF,Hua MS,Horng HE.New assay for old markers-plasma beta amyloid ofmild cognitive impairment and Alzheimer’s disease.Curr Alzheimer Res. 2012；9:1142-1148.

11.Chiu MJ,Chen YF,Chen TF,Yang SY,Yang FP,Tseng TW, Chieh JJ,ChenJC,Tzen KY,Hua MS,Horng HE.Plasma tau as a window to the brain-negativeassociations with brain volume and memory function in mild cognitiveimpairment and early Alzheimer’s disease.Hum Brain Mapp.2014；35: 3132-3142.

12.Tzen KY,Yang SY,Chen TF,Cheng TW,Horng HE,Wen HP, Huang YY,ShiueCY,Chiu MJ.Plasma Abeta but not tau is related to brain PiB retention inearly Alzheimer’s disease. ACS Chem Neurosci.2014；5:830-836.

13.Janelidze S,Stomrud E,Palmqvist S,Zetterberg H,van Westen D,Jeromin A,Song L,Hanlon D,Tan Hehir CA, Baker D,Blennow K,Hansson O.Plasmabeta-amyloid in Alzheimer’s disease and vascular disease.Sci Rep.2016；6:26801.

Claims

1.试剂盒，包括抗血红蛋白(Hb)抗体和抗Aβ抗体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，还包括Hb-Aβ复合体标准蛋白。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，所述抗Aβ抗体可为酶标记的抗Aβ抗体，或荧光或化学发光材料或胶体金标记的抗Aβ抗体，或生物素化的抗Aβ抗体。

4.如权利要求1或2所述的试剂盒，所述抗Aβ抗体为未标记的抗Aβ抗体，所述试剂盒还包括酶，或荧光素，或化学发光材料，或胶体金标记的二抗，或生物素化的二抗，所述二抗可特异性地与抗Aβ抗体相结合。

5.抗Hb抗体在制备用于检测待测样品中Aβ含量的试剂盒或试剂中的用途。

6.抗Hb抗体和抗Aβ抗体在制备用于检测待测样品中Aβ含量的试剂盒或试剂中的用途。

7.抗Hb抗体在制备用于检测待测样品是否患有阿尔茨海默(AD)或患有AD风险的试剂盒或试剂中的用途。

8.如权利要求5-7中任一项所述的用途，所述待测样品来源于人、动物和/或培养细胞，优选来源于AD患者或者具有患AD风险的人群。

9.如权利要求5-7中任一项所述的用途，所述待测样品为血液样品，或来自于血液的红细胞胞浆蛋白，或其它任何含有血红蛋白的组织。

10.检测Aβ的方法，其包括在检测过程中使用抗Hb抗体和抗Aβ抗体。