JP2024028781A - アルツハイマー病の診断と予後判定におけるマーカーとしてのｐ５３ペプチド - Google Patents
アルツハイマー病の診断と予後判定におけるマーカーとしてのｐ５３ペプチド Download PDFInfo
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Abstract
【課題】ｐ５３ペプチドと、アルツハイマー病（ＡＤ）の診断及び／又は予後判定における生体試料中のバイオマーカーとしてのこれらの使用を提供する。【解決手段】以下の工程ａ）、ｂ）を含み：ａ）生体試料中の、ｐ５３ペプチドの存在を特定する工程、及び、ｂ）所定の対照と比較して前記ペプチドを定量する工程前記ｐ５３ペプチドは、配列式（ＩＩ）Ｐ２：ＴＥＥＥＮＬＲＫ［ＧＧ］Ｋ（式中、［ＧＧ］は、Ｐ２配列の１つ目のＫ（アミノ酸）を分岐する部位である）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．２）を有するｐ５３ペプチド；配列式（ＩＩＩ）Ｐ３：ＫＫＰＬＤＧＥＹＦＴＬＱＩＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．３）を有するｐ５３ペプチド；または配列式（Ｖ）Ｐ５：ＧＥＰＨＨＥＬＰＰＧＳＴＫＲＡＬＰＮＮＴＳＳＳＰＱＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．５）を有するｐ５３ペプチドのいずれかである、方法。【選択図】なし
Description
本発明は、ｐ５３ペプチドＰ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ５、並びに、アルツハイマー病（ＡＤ）の診断及び／又は予後判定における生体試料中のバイオマーカーとしてのこれらの使用に関する。また本発明は、特に患者のヒト血漿中の前記ｐ５３ペプチドのレベルを定量化することにより、アルツハイマー病の前臨床期及び前駆段階での診断、並びに被験者の認知機能低下の予後判定のための高精度質量分析に基づく診断方法を提供する。
アルツハイマー病（略して「ＡＤ」）の早期危険因子としての、多量の構造変化ｐ５３アイソフォームの存在の確認は、公表された様々な研究で立証されている［非特許文献１～３］。最初に、ＡＤ、軽度認知障害、パーキンソン病、その他の認知症、及び健常者のうち４００人超の被験者が様々な独立した研究に登録され、市販の構造特異的抗ｐ５３抗体を用いて様々な手法（免疫沈降実験、ＦＡＣＳ分析、ＥＬＩＳＡ）によって変性ｐ５３が検査された［非特許文献４～７］。
２００６年にＵｂｅｒｔｉら［非特許文献８］は、散発性アルツハイマー病（ＡＤ）患者の線維芽細胞が、ｐ５３の異常かつ検出可能な構造の状態（これは、これらの細胞を、年齢を適合させた非ＡＤ患者の線維芽細胞と区別する）を特異的に発現していることを初めて明らかにした。このように構造変化した状態では、ｐ５３は標的遺伝子を転写活性化する能力を失い、結果的にその生物学的機能を失う［非特許文献９～１０］。また、健康な非認知症の被験者、又は他の認知症及びＰＤ並びにＡＤに遷移したＭＣＩに罹患した患者と比較して、ＡＤの血液中には多量の変性ｐ５３が確認された。
これらのデータを総合すると、変性ｐ５３とＡＤの病態の直接的な関連が示唆された。
特許文献１では、２Ｄ３Ａ８と命名された新規の構造特異的抗Ｕｐ５３抗体の開発が報告されている。この抗体は、ｐ５３が野生型の構造を失って変性した表現型に向かう場合のみにアクセスできるエピトープ（ａａ２８２－２９７）に結合する。ＡＤにおける変性ｐ５３の発見当初に使用された市販の抗体（ＰＡｂ２４０、ａａ２１４－２１７）と比較して、２Ｄ３Ａ８抗体はオビエド群の健常な高齢者を対照としたＡＤ患者の識別において高い感度と特異性を示した。
特に、前記免疫診断法は、ＡＤの兆候である生体試料中の免疫複合体を特定し、軽度認知障害（ＭＣＩ）に罹患した被験者がＡＤを発症する素因を判定することができる。
現在、アルツハイマー病の診断及び／又は予後判定に使用できる新規の特異的な生物学的マーカーを特定し、ＡＤの特に前臨床期及び前駆段階における診断及び／又は予後判定、及びＡＤと他の形態の認知症との鑑別分析に使用できる正確で実用的な診断方法を開発する必要がある。
Ｓｔａｎｇａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐ５３ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉｓ ＨＩＰＫ２ ｔｈｅ ｌｉｎｋ？ Ａｇｉｎｇ，２（９），ｐｐ．５４５－５５４．
Ｌａｎｎｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００７．Ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐ５３：Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．ｐｐ．９３－９９．
Ｕｂｅｒｔｉ，Ｄ． ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｐ５３：ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏ－ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ，５（３－４），ｐｐ．２０９－１１．
Ｌａｎｎｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｐ５３：ａ ｎｏｖｅｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｍａｒｋｅｒ？ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１３（６），ｐｐ．６４１－７．
Ｌａｎｎｉ，Ｃ．，Ｒａｃｃｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐ５３ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｉｌｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｔｏ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＪＡＤ，２０（１），ｐｐ．９７－１０４．
Ｂｕｉｚｚａ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｌｔｅｒｅｄ ｐ５３ ａｓ ａｎ ｅａｒｌｙ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ，７（１），ｐ．ｅ２９７８９
Ａｒｃｅ－Ｖａｒａｓ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ ｒｅｄｏｘ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｎｄ Ｍｉｌｄ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１７；１４（１）：１１２－１２２．
Ｕｂｅｒｔｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ－ｌｉｋｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｓｐｏｒａｄｉｃ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ，２７（９），ｐｐ．１１９３－２０１．
Ｌａｎｎｉ，Ｃ．，Ｎａｒｄｉｎｏｃｃｈｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ２：ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｂｅｔａ ａｍｙｌｏｉｄ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｐ５３ ａｎｄ ｉｎａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ，５（４），ｐ．ｅ１０１７１．
Ｌａｎｎｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｇｉｎｇ Ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｐ５３．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ，１４（２６），ｐｐ．２６６５－２６７１．
本発明の目的は、特許請求の範囲に記載された配列を有するＰ１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．１）、Ｐ２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．２）、Ｐ３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．３）及びＰ５（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．５）と呼ばれる４つのｐ５３ペプチドを生体試料中で特定することによって達成された。
本発明の別の側面は、アルツハイマー病の様々な段階の診断及び／又は予後判定に使用するための、前記ペプチドの特定及び定量化に基づく診断方法に関する。
本発明の特徴と利点は、以下の詳細な説明と、例示の目的で提供される実施例から明らかになるであろう。
［発明の詳細な説明］
したがって、本発明は、アルツハイマー病の前臨床期及び前駆段階における診断のための高精度な質量分析法に関する。前記方法は、アルツハイマー病に罹患した患者又はアルツハイマー病が発症しやすくなる症状を有する患者のヒト血漿中で質量分析法によって検出された特定のｐ５３ペプチド（「Ｐ１」、「Ｐ２」、「Ｐ３」及び「Ｐ５」又は「ｐ５３ペプチド」と略して呼ばれる）のレベルの特定及び定量化に基づく。
したがって、本発明は、アルツハイマー病の前臨床期及び前駆段階における診断のための高精度な質量分析法に関する。前記方法は、アルツハイマー病に罹患した患者又はアルツハイマー病が発症しやすくなる症状を有する患者のヒト血漿中で質量分析法によって検出された特定のｐ５３ペプチド（「Ｐ１」、「Ｐ２」、「Ｐ３」及び「Ｐ５」又は「ｐ５３ペプチド」と略して呼ばれる）のレベルの特定及び定量化に基づく。
特に質量分析法は、これらのｐ５３の特定の配列とＡＤとの正確な相関関係に関する情報が知られていないときに行われた定性及び定量的な方法である。
最初に、アルツハイマー病の前臨床期、前駆臨床期の患者、ＭＣＩ安定期の患者、及び認知機能が正常な被験者の血漿中で、ＡＤに罹患した患者の血漿中に存在するｐ５３ペプチドをディープシークエンスプロテイン法により特定した。次いで、血漿中のｐ５３ペプチドのレベルを、ＲＯＣ曲線の下面積（ＡＵＣ）（ＲＯＣ曲線とは「受信者動作特性曲線」を意味する）を実行する高感度選択反応モニタリング（ＳＲＭ）質量分析法を用いて定量した。
したがって、得られたデータは、ＡＤの診断及び／又は予後判定において、ｐ５３ペプチドをバイオマーカーと考えることができる強力な証拠を示す。
有利には、前記方法は、迅速であり、必要とする血漿サンプルが少量であり、分析された各サンプル中のｐ５３ペプチドの濃度を定量化する。
さらに、当該方法及び特定されたバイオマーカーは、無症状の人及びＭＣＩに罹患した人のアルツハイマー病の診断にも用いることができ、診断法市場への参入を可能とする。
また、前記バイオマーカーは無症状被験者及びＭＣＩ被験者のアルツハイマー型認知症に向かう認知機能低下の予後判定に用いることができるため、前記方法では、ｐ５３ペプチドの発現を用いて臨床試験の被験者を選択し、臨床試験の成功を可能にすること、及びＡＤに罹患した患者を他の形態の認知症と区別することが可能となる。
したがって、配列式（Ｉ）Ｐ１：ＴＥＥＥＮＬＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．１）から成るｐ５３ペプチドは、本発明の一実施形態である。あるいは、本発明のｐ５３ペプチドは、配列式（Ｉ）の配列と少なくとも８０～９０％の同一性、好ましくは配列式（Ｉ）の配列と少なくとも９０～９５％の同一性、より好ましくは配列式（Ｉ）の配列と少なくとも９６～９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
本発明のさらなる実施形態は、配列式（ＩＩ）Ｐ２：ＴＥＥＥＮＬＲＫ［ＧＧ］Ｋ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．２）を有するｐ５３ペプチドである。［ＧＧ］は、翻訳後修飾後のｐ５３タンパク質のＫ２９１でのユビキチン化に由来するユビキチンの残基テール部分である。この点について、本発明の目的のために、角括弧内の用語「［ＧＧ］」は、Ｐ２配列の一つ目のＫ（アミノ酸）が前記部分によって分岐していることを示す。
本発明のさらなる実施形態は、配列式（ＩＩ）Ｐ２：ＴＥＥＥＮＬＲＫ［ＧＧ］Ｋ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．２）から成るｐ５３ペプチドである。［ＧＧ］は上記で定義した通りである。あるいは、本発明のｐ５３ペプチドは、配列式（ＩＩ）の配列と少なくとも８０～９０％の同一性、好ましくは配列式（ＩＩ）の配列と少なくとも９０～９５％の同一性、より好ましくは配列式（ＩＩ）の配列と少なくとも９６～９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
さらなる実施形態は、アルツハイマー病の診断及び／又は予後判定のためのｉｎ ｖｉｔｒｏバイオマーカーとしての、本発明によるｐ５３ペプチドＰ１及び／又はＰ２の使用である。
本発明のさらなる実施形態は、配列式（ＩＩＩ）Ｐ３：ＫＫＰＬＤＧＥＹＦＴＬＱＩＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．３）を有するｐ５３ペプチドである。
本発明のさらなる実施形態は、配列式（ＩＩＩ）Ｐ３：ＫＫＰＬＤＧＥＹＦＴＬＱＩＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．３）から成るｐ５３ペプチドである。
本発明のさらなる実施形態は、配列式（Ｖ）Ｐ５：ＧＥＰＨＨＥＬＰＰＧＳＴＫＲＡＬＰＮＮＴＳＳＳＰＱＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．５）を有するｐ５３ペプチドである。
本発明のさらなる実施形態は、（Ｖ）Ｐ５：ＧＥＰＨＨＥＬＰＰＧＳＴＫＲＡＬＰＮＮＴＳＳＳＰＱＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．５）から成るｐ５３ペプチドである。
さらなる実施形態は、アルツハイマー病の診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏバイオマーカーとしての、本発明によるｐ５３ペプチドＰ３及び／又はＰ５の使用である。
本発明のさらなる実施形態は、アルツハイマー病の診断及び／又は予後判定のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの方法であって、当該方法は以下の工程を含む：
ａ）生体試料中のｐ５３ペプチドの存在を特定する工程、及び、
ｂ）所定の内部対照と比較して前記ペプチドを定量する工程。
ａ）生体試料中のｐ５３ペプチドの存在を特定する工程、及び、
ｂ）所定の内部対照と比較して前記ペプチドを定量する工程。
好ましい実施形態では、工程ａ）のｐ５３ペプチドは、ｐ５３ペプチドＰ１又はＰ２である。
好ましい実施形態では、本発明の方法は、ｐ５３ペプチドの量を、疾患の様々な段階にある患者のアルツハイマー病の診断と関連付ける工程ｃ）も含む。
好ましくは、前記生体試料は、血液、血漿、血清、唾液、尿、神経細胞、血球、又は他の種類の細胞である。
好ましい実施形態では、本発明による方法において、工程ａ）は、ｐ５３ペプチドに結合するモノクローナル抗体を用いてｐ５３ペプチドを免疫沈降することにより実施される。
好ましくは、前記モノクローナル抗体は、抗体２Ｄ３Ａ８である。
本発明による方法の好ましい実施形態では、工程ｂ）は、質量分析、好ましくはＨＰＬＣ－質量分析によって実施される。
さらに好ましい実施形態では、工程ｂ）において、標識されたペプチドが内部対照として使用される。
好ましい実施形態によれば、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの方法は、以下の工程を含む：
ａ）以下の手段によって、生体試料中のｐ５３ペプチドの存在を特定する工程：
（ｉ）生体試料を提供すること；
（ｉｉ）ｐ５３ペプチドに結合する抗体によるタンパク質の免疫沈降を行うこと；
（ｉｉｉ）トリプシンによるタンパク質の断片化を行うこと；
（ｉｖ）ペプチドの強陽イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；
及び、
ｂ）以下の手段によって、所定の内部対照と比較して前記ｐ５３ペプチドを定量する工程：
（ｖ）選択反応モニタリング分析を行い、所定の対照と比較してｐ５３ペプチドを特定及び定量すること。
ａ）以下の手段によって、生体試料中のｐ５３ペプチドの存在を特定する工程：
（ｉ）生体試料を提供すること；
（ｉｉ）ｐ５３ペプチドに結合する抗体によるタンパク質の免疫沈降を行うこと；
（ｉｉｉ）トリプシンによるタンパク質の断片化を行うこと；
（ｉｖ）ペプチドの強陽イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；
及び、
ｂ）以下の手段によって、所定の内部対照と比較して前記ｐ５３ペプチドを定量する工程：
（ｖ）選択反応モニタリング分析を行い、所定の対照と比較してｐ５３ペプチドを特定及び定量すること。
好ましくは、工程ａ）（ｉｉ）の抗体は２Ｄ３Ａ８である。
好ましくは、工程ａ）（ｉ）の生体試料は、工程ａ）（ｉｉ）を実行する前に、ＨＰＬＣ又はカラムクロマトグラフィーによる血漿タンパク質除去を受ける。
好ましい実施形態によれば、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ法は、無症状の人及びＭＣＩに罹患した人のアルツハイマー病の診断に使用される。
好ましくは、無症状の人及びＭＣＩに罹患した人では、ｐ５３ペプチドの量は０．０５ｆｍｏｌ／４０μｌ～６．７０ｆｍｏｌ／４０μｌである。
さらに好ましい実施形態によれば、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ法は、無症状の人及びＭＣＩに罹患した人のアルツハイマー病の認知機能低下の予後判定に用いられる。
好ましくは、アルツハイマー型認知症の認知機能低下の予兆がある無症状及び及びＭＣＩ被験者では、ｐ５３ペプチドの量は０．２０３ｆｍｏｌ／４０μｌ～６．７０ｆｍｏｌ／４０μｌである。
好ましくは、無症状の人では、ＡＵＣは少なくとも８０％である。
好ましくは、ＭＣＩに罹患した人では、ＡＵＣが少なくとも９０％である。
診断／予後判定方法の精度を示す尺度として、感度と特異性がある。感度とは、対象となる疾患を有する人の中で、検査結果が陽性となる確率であり、次の式で評価される：感度＝真の陽性／（真の陽性＋偽陰性）。特異性とは、対象となる疾患を有さない人の中で検査結果が陰性となる確率であり、次の式で評価される：特異性＝真の陰性／（真の陰性＋偽陽性）。
好ましくは、無症状の人では、ｐ５３ペプチドの感度は少なくとも７０％である。
好ましくは、ＭＣＩに罹患した人では、ｐ５３ペプチドの感度は少なくとも９０％である。
好ましくは、ＭＣＩに罹患した人では、ｐ５３ペプチドの感度は少なくとも９０％である。
好ましくは、無症状の人では、ｐ５３ペプチドの特異性は少なくとも９０％である。
好ましくは、ＭＣＩに罹患した人では、ｐ５３ペプチドの特異性は少なくとも９０％である。
好ましくは、ＭＣＩに罹患した人では、ｐ５３ペプチドの特異性は少なくとも９０％である。
さらに好ましい実施形態では、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ法は、アルツハイマー病と他の認知症との鑑別分析に使用される。前記他の認知症は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、レビー小体、パーキンソン病及び血管性認知症から選択される。
好ましくは、アルツハイマー病に罹患した患者では、前記ｐ５３ペプチドの量が２．２１ｆｍｏｌ／４０μｌ～６．５６ｆｍｏｌ／４０μｌであり、一方、他の形態の認知症に罹患した患者では、前記ｐ５３の量が３．８１ｆｍｏｌ／４０μｌよりも低い。
好ましくは、アルツハイマー病に罹患した患者では、ＡＵＣは少なくとも８５％である。
好ましくは、アルツハイマー病に罹患した患者では、ｐ５３ペプチドの感度は少なくとも７５％である。
好ましくは、アルツハイマー病に罹患した患者では、ｐ５３ペプチドの特異性は少なくとも８０％である。
好ましくは、アルツハイマー病に罹患した患者では、ｐ５３ペプチドの感度は少なくとも７５％である。
好ましくは、アルツハイマー病に罹患した患者では、ｐ５３ペプチドの特異性は少なくとも８０％である。
本発明のさらなる実施形態は、上記ｐ５３ペプチドを検出する方法であって、前記方法は以下の工程を含む：
ａ）生体試料中のｐ５３ペプチドの存在を特定する工程、及び、
ｂ）所定の対照と比較して前記ペプチドを定量する工程。
ａ）生体試料中のｐ５３ペプチドの存在を特定する工程、及び、
ｂ）所定の対照と比較して前記ペプチドを定量する工程。
さらなる好ましい実施形態では、本発明の方法は、ｐ５３ペプチドの量をアルツハイマー病の診断及び／又は予後判定と関連付ける工程ｃ）をさらに含む。
好ましい実施形態によれば、本発明の方法において、工程ｃ）は、無症状の人及びＭＣＩに罹患した人におけるアルツハイマー病の診断とｐ５３ペプチドの量を関連付ける。
好ましい実施形態では、工程ａ）のｐ５３ペプチドは、ｐ５３ペプチドＰ１又はＰ２である。
さらなる好ましい実施形態によれば、本発明の方法では、工程ｃ）において、ｐ５３ペプチドの量は、無症状の人及びＭＣＩに罹患した人におけるアルツハイマー病の認知機能低下の予後と関連付けられる。
より好ましくは、本発明の方法では工程ｃ）において、ｐ５３ペプチドの量が、アルツハイマー病と他の認知症との鑑別分析と関連付けられている。前記他の認知症は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、レビー小体、パーキンソン病及び血管性認知症から選択される。
また、本発明のペプチドの好ましい態様のすべての組み合わせ、並びに上記で報告されたそれらの調製プロセス及び使用方法が、ここに開示されているとみなされると理解されるべきである。
上記で開示された本発明のペプチド、調製プロセス、及び方法の好ましい態様のすべての組み合わせは、本明細書に記載されている通りに理解されるべきである。
以下に、例示の目的で提供される本発明の実施例を示す。
材料と方法
材料
抗体ベースの血漿／血清除去Ｓｅｐｐｒｏ（商標）ＩｇＹ１４ ＬＣ１０カラムは、シグマ－アルドリッチ社（メルク ＫＧａＡ，ダルムシュタット，ドイツ）から購入した。トリプシン（シーケンシンググレード，ブタ由来修飾トリプシン）は、プロメガ社から入手した。アセトニトリルはＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社から購入し、ギ酸はＥＭＤ ミリポア社（ビレリカ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した。サンプル調製用のＣ１８カートリッジ、並びに、ｂＲＰＬＣ及びトリプル四重極型質量分析計のオンラインＨＰＬＣ用のクロマトグラフィーカラムは、ウォーターズ（ミルフォード，マサチューセッツ州）から購入した。血漿希釈緩衝液、血漿洗浄緩衝液、及び血漿溶出緩衝液は、当該方法の標準的なプロトコルに従って調製した。その他のすべての試薬は，特に指示がない限りシグマ－アルドリッチ社（セントルイス，ミズーリ州）から購入した。
材料
抗体ベースの血漿／血清除去Ｓｅｐｐｒｏ（商標）ＩｇＹ１４ ＬＣ１０カラムは、シグマ－アルドリッチ社（メルク ＫＧａＡ，ダルムシュタット，ドイツ）から購入した。トリプシン（シーケンシンググレード，ブタ由来修飾トリプシン）は、プロメガ社から入手した。アセトニトリルはＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社から購入し、ギ酸はＥＭＤ ミリポア社（ビレリカ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した。サンプル調製用のＣ１８カートリッジ、並びに、ｂＲＰＬＣ及びトリプル四重極型質量分析計のオンラインＨＰＬＣ用のクロマトグラフィーカラムは、ウォーターズ（ミルフォード，マサチューセッツ州）から購入した。血漿希釈緩衝液、血漿洗浄緩衝液、及び血漿溶出緩衝液は、当該方法の標準的なプロトコルに従って調製した。その他のすべての試薬は，特に指示がない限りシグマ－アルドリッチ社（セントルイス，ミズーリ州）から購入した。
血漿サンプル除去
血漿中の最も豊富なタンパク質をＳｅｐｐｒｏ ＩｇＹ１４カラムを用いて除去した。血漿サンプルを血漿希釈緩衝液中で５倍に希釈し、濾過（０．２２μｍ）し、次にアジレント１２００ ＨＰＬＣシステムに取り付けられたＩｇＹ ＬＣ１０カラムに注入した。保持されていない画分を回収した。高度に豊富なタンパク質は血漿溶出緩衝液で溶出した。
血漿中の最も豊富なタンパク質をＳｅｐｐｒｏ ＩｇＹ１４カラムを用いて除去した。血漿サンプルを血漿希釈緩衝液中で５倍に希釈し、濾過（０．２２μｍ）し、次にアジレント１２００ ＨＰＬＣシステムに取り付けられたＩｇＹ ＬＣ１０カラムに注入した。保持されていない画分を回収した。高度に豊富なタンパク質は血漿溶出緩衝液で溶出した。
免疫沈降（ＩＰ）
ＩＰ反応には、抗体クローン２Ｄ３Ａ８を使用した。ビーズへの抗体の結合は、結合緩衝液を用いて最適化して行った。モノクローナル抗体をプロテイン Ｇ Ｄｙｎａｌ 磁性ビーズ（インビトロジェン社から入手）に直接加え、室温で２時間、回転台上で、緩衝液中で抗体をビーズに結合させた。次いで、抗体が結合したビーズを５０ｍＬの結合緩衝液Ａ中にインキュベートして洗浄し、磁石上に回収した。回転台上で５０ｍＬの緩衝液Ｂと共に室温で１時間インキュベートすることにより、抗体をビーズ上のプロテインＧに架橋した。
ＩＰ反応には、抗体クローン２Ｄ３Ａ８を使用した。ビーズへの抗体の結合は、結合緩衝液を用いて最適化して行った。モノクローナル抗体をプロテイン Ｇ Ｄｙｎａｌ 磁性ビーズ（インビトロジェン社から入手）に直接加え、室温で２時間、回転台上で、緩衝液中で抗体をビーズに結合させた。次いで、抗体が結合したビーズを５０ｍＬの結合緩衝液Ａ中にインキュベートして洗浄し、磁石上に回収した。回転台上で５０ｍＬの緩衝液Ｂと共に室温で１時間インキュベートすることにより、抗体をビーズ上のプロテインＧに架橋した。
次に、ビーズを５０ｍＬの緩衝液Ｃで２回洗浄し、５０ｍＬの緩衝液Ｃに再懸濁し、室温で１５分間回転させた。ビーズを緩衝液Ｃに再懸濁し、使用するまで－２０℃で保存した。２００μｌの除去された又は未除去の血漿サンプルをＩＰ反応に使用し、各サンプルを、ＩＰ緩衝液を用いて３ｍｌの系に再構成し、３ｍｌの抗体結合ビーズ（１：１の体積比）を系に加えた。このＩＰ系を毎分３２回転の速度の回転台上で、４℃で１８時間インキュベートした。ビーズを磁石上に集め、４℃で、ＩＰ洗浄緩衝液で３回洗浄し、続いてＩＰ溶出緩衝液を用いて抗原を溶出した。通過した画分を回収し、タンパク質サンプルを調製した。
タンパク質の調製
タンパク質サンプルは「フィルター補助サンプル調製」（ＦＡＳＰ）法（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９，６：３５９－３６２）に従って処理した。簡潔に説明すると、９Ｍ 尿素中のタンパク質サンプルを、５ｍＭ ＴＣＥＰを用いて３７℃で４５分間還元し、還元されたシステインを５０ｍＭ ヨードアセトアミドを用いて２５℃で１５分間ブロックした。次に、タンパク質サンプル（各１００μｇ）を、１０ｋＤａのアミコンフィルター（ＵＦＣ５０１０９６，ミリポア）を用いて、９Ｍ 尿素で３回、緩衝液１で２回洗浄した。次いで、トリプシン（Ｖ５１１１，プロメガ）を用いて、サンプルを３７℃で１２時間タンパク質分解した。その後、ペプチド溶液を、１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えて酸性化し、室温で１５分間インキュベートした。Ｓｅｐ－Ｐａｋ ライト Ｃ１８カートリッジ（ウォーターズ株式会社）に５ｍＬの１００％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）アセトニトリルを充填して活性化し、３．５ｍＬの０．１％ＴＦＡ溶液で２回洗浄した。
タンパク質サンプルは「フィルター補助サンプル調製」（ＦＡＳＰ）法（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９，６：３５９－３６２）に従って処理した。簡潔に説明すると、９Ｍ 尿素中のタンパク質サンプルを、５ｍＭ ＴＣＥＰを用いて３７℃で４５分間還元し、還元されたシステインを５０ｍＭ ヨードアセトアミドを用いて２５℃で１５分間ブロックした。次に、タンパク質サンプル（各１００μｇ）を、１０ｋＤａのアミコンフィルター（ＵＦＣ５０１０９６，ミリポア）を用いて、９Ｍ 尿素で３回、緩衝液１で２回洗浄した。次いで、トリプシン（Ｖ５１１１，プロメガ）を用いて、サンプルを３７℃で１２時間タンパク質分解した。その後、ペプチド溶液を、１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えて酸性化し、室温で１５分間インキュベートした。Ｓｅｐ－Ｐａｋ ライト Ｃ１８カートリッジ（ウォーターズ株式会社）に５ｍＬの１００％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）アセトニトリルを充填して活性化し、３．５ｍＬの０．１％ＴＦＡ溶液で２回洗浄した。
酸性化した消化ペプチド溶液を１，８００×ｇで５分間遠心分離し、上澄み液をカートリッジに充填した。カートリッジに結合したペプチドを脱塩するために、１ｍＬ、３ｍＬ、及び４ｍＬの０．１％ＴＦＡを連続して使用した。カートリッジからペプチドを溶出するために、０．１％ＴＦＡを含む４０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）アセトニトリル２ｍＬを使用し、この溶出をさらに２回繰り返した（合計６ｍＬの溶出液）。連続した各々の洗浄液と溶出液を使用する前に、カートリッジの滴下が止まっていることの確認が重要であった。溶出したペプチドをオーバーナイトで凍結乾燥し、１００μＬの緩衝液２で再構成した。
強陽イオン交換クロマトグラフィー
ペプチドは、強陽イオン交換（ＳＣＸ）クロマトグラフィーで分画した。簡潔に説明すると、凍結乾燥したペプチド混合物を１ｍｌのＳＣＸ溶媒Ａ（５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ｐＨ２．７，３０％ ＡＣＮ）に再懸濁し，ポリスルホエチルＡ（５μｍ，２００Å）カラム（２００×９．４ｍｍ；ポリエルシー社，コロンビア，ＭＤ）で、ＳＣＸ溶媒Ｂ（５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ｐＨ２．７，３０％ ＡＣＮ，３５０ｍＭ ＫＣｌ）の勾配を増加させながら、アジレント１２９０ インフィニティＩＩ ＬＣシステムで、ＳＣＸクロマトグラフィーにより分画した。各実験では、最初に合計９６フラクションを採取し、これを２４画分にプールし、ＳｐｅｅｄＶａｃ（エッペンドルフ）を用いて乾燥した。ｂＲＰＬＣとＳＣＸを並べて実行し、ＴＰ５３タンパク質の検出の適合性を比較した。この研究では、ＴＰ５３アイソフォームの相対的に強い収量が繰り返し観察されたため、ＳＣＸを選択した。
ペプチドは、強陽イオン交換（ＳＣＸ）クロマトグラフィーで分画した。簡潔に説明すると、凍結乾燥したペプチド混合物を１ｍｌのＳＣＸ溶媒Ａ（５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ｐＨ２．７，３０％ ＡＣＮ）に再懸濁し，ポリスルホエチルＡ（５μｍ，２００Å）カラム（２００×９．４ｍｍ；ポリエルシー社，コロンビア，ＭＤ）で、ＳＣＸ溶媒Ｂ（５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ ｐＨ２．７，３０％ ＡＣＮ，３５０ｍＭ ＫＣｌ）の勾配を増加させながら、アジレント１２９０ インフィニティＩＩ ＬＣシステムで、ＳＣＸクロマトグラフィーにより分画した。各実験では、最初に合計９６フラクションを採取し、これを２４画分にプールし、ＳｐｅｅｄＶａｃ（エッペンドルフ）を用いて乾燥した。ｂＲＰＬＣとＳＣＸを並べて実行し、ＴＰ５３タンパク質の検出の適合性を比較した。この研究では、ＴＰ５３アイソフォームの相対的に強い収量が繰り返し観察されたため、ＳＣＸを選択した。
ペプチドＳＲＭ遷移の最適化
ＴＰ５３タンパク質をターゲットにした４つのペプチドをＳＲＭの定量ターゲットとして選択し、アジレント６４９５ トリプル四重極型質量分析計を用いて、１＋、２＋、３＋及び４＋の荷電前駆イオンについて、４つのペプチドの１０９２セットの遷移パラメータと保持時間を個別に設定した。次いで、２つのペプチド（Ｐ１及びＰ２）が、ＡＤの病態に主に相関するものとして選択された。
ＴＰ５３タンパク質をターゲットにした４つのペプチドをＳＲＭの定量ターゲットとして選択し、アジレント６４９５ トリプル四重極型質量分析計を用いて、１＋、２＋、３＋及び４＋の荷電前駆イオンについて、４つのペプチドの１０９２セットの遷移パラメータと保持時間を個別に設定した。次いで、２つのペプチド（Ｐ１及びＰ２）が、ＡＤの病態に主に相関するものとして選択された。
選択反応モニタリング（ＳＲＭ）分析
３７μｌの緩衝液３で再構成したペプチドサンプルに、広い疎水性範囲と、広いＭ／ｚの範囲（Ｍ／ｚ ２００～１３００）をカバーする１フェムトモルの重同位体標識ペプチドのプールから成るＳＲＭ内部対照混合物を添加した。ペプチドサンプルは、オンラインのアジレント１２９０ ＨＰＬＣシステムを介して、アジレント６４９５ トリプル四重極型質量分析計のジェットストリームＥＳＩ源に溶出した。
３７μｌの緩衝液３で再構成したペプチドサンプルに、広い疎水性範囲と、広いＭ／ｚの範囲（Ｍ／ｚ ２００～１３００）をカバーする１フェムトモルの重同位体標識ペプチドのプールから成るＳＲＭ内部対照混合物を添加した。ペプチドサンプルは、オンラインのアジレント１２９０ ＨＰＬＣシステムを介して、アジレント６４９５ トリプル四重極型質量分析計のジェットストリームＥＳＩ源に溶出した。
結果
血漿中のｐ５３タンパク質について、過去の研究で累積的に５つのペプチドが検出された［Ｐ１：ＴＥＥＥＮＬＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．１）；Ｐ２：ＴＥＥＥＮＬＲＫ［ＧＧ］Ｋ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．２），Ｐ３：ＫＫＰＬＤＧＥＹＦＴＬＱＩＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．３），Ｐ４：ＥＰＧＧＳＲＡＨＳＳＨＬＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．４）；及びＰ５：ＧＥＰＨＨＥＬＰＰＧＳＴＫＲＡＬＰＮＮＴＳＳＳＰＱＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．５）］。４つのペプチドについて、ＳＲＭ検出法を確立した。ペプチドＧＥＰＨＨＥＬＰＰＧＳＴＫＲＡＬＰＮＮＴＳＳＳＰＱＰＫは、分子量が大きいため、ＳＲＭベースの検出には適していない。
血漿中のｐ５３タンパク質について、過去の研究で累積的に５つのペプチドが検出された［Ｐ１：ＴＥＥＥＮＬＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．１）；Ｐ２：ＴＥＥＥＮＬＲＫ［ＧＧ］Ｋ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．２），Ｐ３：ＫＫＰＬＤＧＥＹＦＴＬＱＩＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．３），Ｐ４：ＥＰＧＧＳＲＡＨＳＳＨＬＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．４）；及びＰ５：ＧＥＰＨＨＥＬＰＰＧＳＴＫＲＡＬＰＮＮＴＳＳＳＰＱＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．５）］。４つのペプチドについて、ＳＲＭ検出法を確立した。ペプチドＧＥＰＨＨＥＬＰＰＧＳＴＫＲＡＬＰＮＮＴＳＳＳＰＱＰＫは、分子量が大きいため、ＳＲＭベースの検出には適していない。
ｐ５３ペプチド配列とＡＤ診断の相関関係
実施例１．ディープシークエンスプロテイン法による無症状（正常な認知機能）段階及びＭＣＩ期におけるアルツハイマーのｐ５３ペプチドマーカーの検出
構造特異的Ａｂ ２Ｄ３Ａ８を用いて、免疫沈降したヒト血漿のディープシークエンス質量分析を実施した。上記の方法に従って、血漿サンプルから豊富なタンパク質を除去した。次いで、サンプルを２Ｄ３Ａ８で免疫沈降し、オービトラップ型（ディープシークエンス質量分析）を用いて分析した。得られたペプチドは、ＡＤ、ＭＣＩからＡＤ、及び無症状からＡＤに特異的に存在し、無症状及び安定したＭＣＩのサンプルには存在しないペプチドをマーカーとして選んだ。この方法によるペプチドの検出（存在／非存在）は、被験者の臨床診断と相関した。
実施例１．ディープシークエンスプロテイン法による無症状（正常な認知機能）段階及びＭＣＩ期におけるアルツハイマーのｐ５３ペプチドマーカーの検出
構造特異的Ａｂ ２Ｄ３Ａ８を用いて、免疫沈降したヒト血漿のディープシークエンス質量分析を実施した。上記の方法に従って、血漿サンプルから豊富なタンパク質を除去した。次いで、サンプルを２Ｄ３Ａ８で免疫沈降し、オービトラップ型（ディープシークエンス質量分析）を用いて分析した。得られたペプチドは、ＡＤ、ＭＣＩからＡＤ、及び無症状からＡＤに特異的に存在し、無症状及び安定したＭＣＩのサンプルには存在しないペプチドをマーカーとして選んだ。この方法によるペプチドの検出（存在／非存在）は、被験者の臨床診断と相関した。
ＰｉＢ（ピッツバーグ化合物Ｂ）＋ｖｅのＡＤ患者（ＰｉＢ＋ｖｅ）由来の１０サンプルのプール（ＡＤ）；ベースライン後少なくとも１０８カ月間、無症状及びＰｉＢ－ｖｅの両方を維持した無症状のＰｉＢ陰性者由来のベースライン血漿サンプル１０サンプルのプール（正常）；ＡＤ症状に転換する１８か月前のＰｉＢ＋ｖｅのＭＣＩ患者由来のベースライン血漿サンプル１０サンプルのプール（前駆期、ＡＤによるＭＣＩ）；ＡＤ症状に至るさらなる認知機能低下を経験しなかったＰｉＢ－ｖｅのＭＣＩ患者由来のベースライン血漿サンプル１０サンプルのプール（ベースライン後１８～７２ヶ月の継続調査）（安定したＭＣＩ）；及び、ＡＤ症状に転換する１８か月前のＰｉＢ＋ｖｅのＭＣＩ患者由来のベースライン血漿サンプル３サンプル（前臨床期、正常からＡＤへの転換）を分析した。
表１：ベースライン特性の包含基準
結果
表２：無症状及びＭＣＩ期のＡＤ診断におけるｐ５３マーカーの性能の検証：ディープシークエンス質量分析法による結果
遷移Ｎが１は「陰性の可能性」と判断することができる。遷移Ｎ＝２は「可能性あり」、遷移Ｎ＝０は「陰性」、及び、遷移Ｎ＝３は「陽性」である。
表２：無症状及びＭＣＩ期のＡＤ診断におけるｐ５３マーカーの性能の検証：ディープシークエンス質量分析法による結果
遷移Ｎが１は「陰性の可能性」と判断することができる。遷移Ｎ＝２は「可能性あり」、遷移Ｎ＝０は「陰性」、及び、遷移Ｎ＝３は「陽性」である。
実施例２．アルツハイマー病の前臨床期及び前駆段階における、アルツハイマー病に構造特異的なｐ５３ヒト血漿バイオマーカーの検証
認知機能が正常な被験者とＡＤへの可能性が高い軽度認知障害のある人の臨床的進行について、直接ＥＬＩＳＡで測定したＵ－ｐ５３シグナルを測定する４年間の縦断研究の初期の結果は、進行に対する非常に高い予測値を示した。この知見に基づき、前臨床期及び前駆段階におけるアルツハイマー病の診断、並びに認知機能低下の予後判定のために、ｐ５３ペプチドＰ１及び／又はＰ２の特定に基づく高精度の質量分析法が開発された。認知機能低下からアルツハイマー型認知症への予後判定のＰＰＶは、ＭＣＩの被験者と無症状の被験者の両方で最大となった。Ｐ５３ペプチド（Ｐ１及び／又はＰ２）の診断性能と予後判定性能の両方は、これまでに報告された中で最も高いと考えられる。
認知機能が正常な被験者とＡＤへの可能性が高い軽度認知障害のある人の臨床的進行について、直接ＥＬＩＳＡで測定したＵ－ｐ５３シグナルを測定する４年間の縦断研究の初期の結果は、進行に対する非常に高い予測値を示した。この知見に基づき、前臨床期及び前駆段階におけるアルツハイマー病の診断、並びに認知機能低下の予後判定のために、ｐ５３ペプチドＰ１及び／又はＰ２の特定に基づく高精度の質量分析法が開発された。認知機能低下からアルツハイマー型認知症への予後判定のＰＰＶは、ＭＣＩの被験者と無症状の被験者の両方で最大となった。Ｐ５３ペプチド（Ｐ１及び／又はＰ２）の診断性能と予後判定性能の両方は、これまでに報告された中で最も高いと考えられる。
（トリプル四重極型質量分析計を用いた）ＳＲＭ（選択反応モニタリング）法である特定の質量分析法を使用して、ＡＤ、無症状、ＭＣＩ被験者由来の血漿サンプル中のＰ１及び／又はＰ２の両方を定量した。本質的に質量フィルターとして機能するトリプル四重極型質量分析計により、様々な遷移ピークを見ることでペプチドの配列を決定することができる。次いで、ペプチド１及び２の重標識内部対照を使用して、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）法により、これらのペプチドを最高の精度で定量することができる。
予後判定性能
ＰｉＢ＋であるがＭＣＩから１８か月後に認知機能低下を示す被験者、及び、診察時に無症状であり１８～７２ヵ月後に認知機能低下を示す被験者である患者について抽出するバイオマーカーの予後判定力を評価した。これは、無症状及びＭＣＩ患者における疾患修飾試験の終点として、認知機能低下を有意に抽出するバイオマーカーの価値を評価するために行われた。Ｐ１とＰ２の予後判定力を、臨床症状の将来の転換を用いて検討した。Ｐ１とＰ２の予後判定力を説明できる統計的パラメータは以下の通りである。
ＰｉＢ＋であるがＭＣＩから１８か月後に認知機能低下を示す被験者、及び、診察時に無症状であり１８～７２ヵ月後に認知機能低下を示す被験者である患者について抽出するバイオマーカーの予後判定力を評価した。これは、無症状及びＭＣＩ患者における疾患修飾試験の終点として、認知機能低下を有意に抽出するバイオマーカーの価値を評価するために行われた。Ｐ１とＰ２の予後判定力を、臨床症状の将来の転換を用いて検討した。Ｐ１とＰ２の予後判定力を説明できる統計的パラメータは以下の通りである。
表３：ＡＤに向かう無症状被験者診断の予後判定力
表４：ＡＤに向かうＭＣＩ被験者診断の予後判定力
結論
Ｐ１及びＰ２は、非常に高い特異性と感度で、無症状又はＭＣＩのいずれかの臨床症状から認知機能低下を示す患者を正確に抽出できるため、疾患の非常に初期の段階を対象とした疾患修飾薬のための患者の募集を成功させることができる。
Ｐ１及びＰ２は、非常に高い特異性と感度で、無症状又はＭＣＩのいずれかの臨床症状から認知機能低下を示す患者を正確に抽出できるため、疾患の非常に初期の段階を対象とした疾患修飾薬のための患者の募集を成功させることができる。
実施例３．アルツハイマー病と他の認知症の鑑別診断
また、アルツハイマー型認知症におけるＵ－Ｐ５３バイオマーカーの特異性における過去のデータを検証するための分析も行った。アミロイド陽性でアルツハイマー型認知症であるよく特徴付けられたアルツハイマー病の患者を、ＦＴＤ（前頭側頭型認知症）、パーキンソン病、レビー小体、血管性認知症等の他の認知症の臨床症状のある患者と比較した。
また、アルツハイマー型認知症におけるＵ－Ｐ５３バイオマーカーの特異性における過去のデータを検証するための分析も行った。アミロイド陽性でアルツハイマー型認知症であるよく特徴付けられたアルツハイマー病の患者を、ＦＴＤ（前頭側頭型認知症）、パーキンソン病、レビー小体、血管性認知症等の他の認知症の臨床症状のある患者と比較した。
ＯＤ（ＦＴＤ、血管性、パーキンソン病、レビー小体）の血漿サンプルは、病期に採取されたものであり、いずれにせよ鑑別診断においては、特定のカットオフ値を超えると、両ペプチド配列はＯＤに比べてＡＤに対して高い特異性と感度を示すことが確認できる。
さらに、両ペプチドのＡＵＣは９０％超であり、バイオマーカー濃度とＡＤ診断の間に高い相関関係を示すことが確認された。
文献において、アルツハイマー型認知症の鑑別診断については、これらは臨床症状が類似している場合があるので、ａ）進行性ＦＴＤと進行性ＡＤ；ｂ）進行性ＬＢＤとＡＤの間に満たされていないニーズがある。ＡＤ又は他の認知症のいずれかを除外できるものであれば、臨床的価値がある。したがって、いずれかの認知症の感度が高ければ十分価値がある。
表５：認知症の被験者におけるアルツハイマー病の病態と他の認知症を区別するｐ５３ペプチドＰ１及びＰ２の性能測定
参考文献
１．Ｓｔａｎｇａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐ５３ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉｓ ＨＩＰＫ２ ｔｈｅ ｌｉｎｋ？ Ａｇｉｎｇ，２（９），ｐｐ．５４５－５５４．
２．Ｌａｎｎｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００７．Ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐ５３：Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．ｐｐ．９３－９９．
３．Ｕｂｅｒｔｉ，Ｄ． ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｐ５３：ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏ－ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ，５（３－４），ｐｐ．２０９－１１．
４．Ｌａｎｎｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｐ５３：ａ ｎｏｖｅｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｍａｒｋｅｒ？ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１３（６），ｐｐ．６４１－７．
５．Ｌａｎｎｉ，Ｃ．，Ｒａｃｃｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐ５３ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｉｌｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｔｏ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＪＡＤ，２０（１），ｐｐ．９７－１０４．
６．Ｂｕｉｚｚａ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｌｔｅｒｅｄ ｐ５３ ａｓ ａｎ ｅａｒｌｙ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ，７（１），ｐ．ｅ２９７８９
７．Ａｒｃｅ－Ｖａｒａｓ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ ｒｅｄｏｘ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｎｄ Ｍｉｌｄ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ
ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１７；１４（１）：１１２－１２２．
８．Ｕｂｅｒｔｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ－ｌｉｋｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｓｐｏｒａｄｉｃ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ，２７（９），ｐｐ．１１９３－２０１．
９．Ｌａｎｎｉ，Ｃ．，Ｎａｒｄｉｎｏｃｃｈｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ２：ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｂｅｔａ ａｍｙｌｏｉｄ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｐ５３ ａｎｄ ｉｎａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ
ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ，５（４），ｐ．ｅ１０１７１．
１０．Ｌａｎｎｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ
ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｇｉｎｇ Ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｐ５３．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ，１４（２６），ｐｐ．２６６５－２６７１．
１．Ｓｔａｎｇａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐ５３ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉｓ ＨＩＰＫ２ ｔｈｅ ｌｉｎｋ？ Ａｇｉｎｇ，２（９），ｐｐ．５４５－５５４．
２．Ｌａｎｎｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００７．Ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐ５３：Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．ｐｐ．９３－９９．
３．Ｕｂｅｒｔｉ，Ｄ． ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｐ５３：ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏ－ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ，５（３－４），ｐｐ．２０９－１１．
４．Ｌａｎｎｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｐ５３：ａ ｎｏｖｅｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｍａｒｋｅｒ？ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１３（６），ｐｐ．６４１－７．
５．Ｌａｎｎｉ，Ｃ．，Ｒａｃｃｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐ５３ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｉｌｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｔｏ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＪＡＤ，２０（１），ｐｐ．９７－１０４．
６．Ｂｕｉｚｚａ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｌｔｅｒｅｄ ｐ５３ ａｓ ａｎ ｅａｒｌｙ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ，７（１），ｐ．ｅ２９７８９
７．Ａｒｃｅ－Ｖａｒａｓ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ ｒｅｄｏｘ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｎｄ Ｍｉｌｄ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ
ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１７；１４（１）：１１２－１２２．
８．Ｕｂｅｒｔｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ－ｌｉｋｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｓｐｏｒａｄｉｃ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ，２７（９），ｐｐ．１１９３－２０１．
９．Ｌａｎｎｉ，Ｃ．，Ｎａｒｄｉｎｏｃｃｈｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ２：ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｂｅｔａ ａｍｙｌｏｉｄ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｐ５３ ａｎｄ ｉｎａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ
ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ，５（４），ｐ．ｅ１０１７１．
１０．Ｌａｎｎｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ
ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｇｉｎｇ Ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｐ５３．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ，１４（２６），ｐｐ．２６６５－２６７１．
Claims (19)
- アルツハイマー病の診断及び／又は認知機能低下の予後判定のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの方法であって、以下の工程ａ）、ｂ）を含み：
ａ）生体試料中の、ｐ５３ペプチドの存在を特定する工程、及び、
ｂ）所定の対照と比較して前記ペプチドを定量する工程
前記ｐ５３ペプチドは、
配列式（ＩＩ）Ｐ２：ＴＥＥＥＮＬＲＫ［ＧＧ］Ｋ（式中、［ＧＧ］は、Ｐ２配列の１つ目のＫ（アミノ酸）を分岐する部位である）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．２）を有するｐ５３ペプチド；
配列式（ＩＩＩ）Ｐ３：ＫＫＰＬＤＧＥＹＦＴＬＱＩＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．３）を有するｐ５３ペプチド；または
配列式（Ｖ）Ｐ５：ＧＥＰＨＨＥＬＰＰＧＳＴＫＲＡＬＰＮＮＴＳＳＳＰＱＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．５）を有するｐ５３ペプチド
のいずれかである、方法。 - 前記生体試料が、血液、血漿、血清、唾液、尿、神経細胞、血球、又は他の種類の細胞である、請求項１に記載の方法。
- 工程ａ）が、ｐ５３ペプチドに結合するモノクローナル抗体を用いてｐ５３ペプチドを免疫沈降することにより実施される、請求項１または２に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体が、ヒトｐ５３タンパク質のアミノ酸２８２－２９７からなるエピトープに結合する抗ヒトｐ５３抗体である、請求項３に記載の方法。
- 工程ｂ）が、質量分析によって実施される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
- 工程ｂ）が、ＨＰＬＣ－質量分析によって実施される、請求項５に記載の方法。
- 工程ｂ）が、内部対照として標識されたペプチドを使用して行われる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
- 以下の工程を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法：
ａ）以下の手段によって、生体試料中のｐ５３ペプチドの存在を特定する工程：
（ｉ）生体試料を提供すること；
（ｉｉ）ｐ５３ペプチドに結合する抗体によるタンパク質の免疫沈降を行うこと；
（ｉｉｉ）トリプシンによるタンパク質の断片化を行うこと；
（ｉｖ）ペプチドの強陽イオン交換クロマトグラフィーを行うこと；
及び、
ｂ）以下の手段によって、所定の内部対照と比較して前記ｐ５３ペプチドを定量する工程：
（ｖ）選択反応モニタリング分析を行い、所定の対照と比較してｐ５３ペプチドを特定及び定量すること。 - 工程ａ）（ｉ）の生体試料が、血液または血漿であり、工程ａ）（ｉｉ）を実行する前に、ＨＰＬＣ又はカラムクロマトグラフィーによる血漿タンパク質除去を受ける、請求項８に記載の方法。
- 無症状の人及びＭＣＩに罹患した人のアルツハイマー病の診断のための、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
- 無症状の人及びＭＣＩに罹患した人のアルツハイマー病の認知機能低下の予後判定のための、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
- アルツハイマー病と他の認知症の鑑別分析のための方法であって、前記他の認知症が、前頭側頭型認知症、パーキンソン病及び血管性認知症から選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
- 工程ａ）のｐ５３ペプチドが、配列式（ＩＩ）Ｐ２：ＴＥＥＥＮＬＲＫ［ＧＧ］Ｋ（式中、［ＧＧ］は、Ｐ２配列の一つ目のＫ（アミノ酸）を分岐する部位である）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．２）を有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- アルツハイマー病の診断及び／又は認知機能低下の予後判定のためのｉｎ ｖｉｔｒｏバイオマーカーとしての、ｐ５３ペプチドの使用であって、
前記ｐ５３ペプチドは、配列式（ＩＩ）Ｐ２：ＴＥＥＥＮＬＲＫ［ＧＧ］Ｋ（式中、［ＧＧ］は、Ｐ２配列の一つ目のＫ（アミノ酸）を分岐する部位である）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．２）を有する、使用。 - アルツハイマー病の診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏバイオマーカーとしての、ｐ５３ペプチドの使用であって、
前記ｐ５３ペプチドは、配列式（ＩＩＩ）Ｐ３：ＫＫＰＬＤＧＥＹＦＴＬＱＩＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．３）を有する、使用。 - アルツハイマー病の診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏバイオマーカーとしての、ｐ５３ペプチドの使用であって、
前記ｐ５３ペプチドは、配列式（Ｖ）Ｐ５：ＧＥＰＨＨＥＬＰＰＧＳＴＫＲＡＬＰＮＮＴＳＳＳＰＱＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．５）を有する、使用。 - 配列式（ＩＩ）Ｐ２：ＴＥＥＥＮＬＲＫ［ＧＧ］Ｋ（式中、［ＧＧ］は、Ｐ２配列の１つ目のＫ（アミノ酸）を分岐する部位である）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．２）を有するｐ５３ペプチド。
- 配列式（ＩＩＩ）Ｐ３：ＫＫＰＬＤＧＥＹＦＴＬＱＩＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．３）を有するｐ５３ペプチド。
- 配列式（Ｖ）Ｐ５：ＧＥＰＨＨＥＬＰＰＧＳＴＫＲＡＬＰＮＮＴＳＳＳＰＱＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ．５）を有するｐ５３ペプチド。
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