CN109073661B

CN109073661B - 用于神经学疾病的诊断的测定法

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Publication number: CN109073661B
Application number: CN201780026668.5A
Authority: CN
Inventors: E·万莫彻伦; A·德沃斯; S·英吉尔博格斯; O·彼得斯; C·席普克
Original assignee: ADX Neurosciences NV; Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Current assignee: ADX Neurosciences NV; Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date: 2016-05-04
Filing date: 2017-05-03
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2037-05-03
Also published as: EP3452830B1; WO2017190834A8; CN109073661A; WO2017190834A1; EP3452830A1; EP3242134A1; US20190113527A1

Abstract

本发明涉及：在诊断上有用的载体，其包含用于捕获神经颗粒蛋白的工具，用于捕获BACE1的工具，和优选地，用于捕获一种或多种另外的生物标志物的工具；包含所述在诊断上有用的载体的试剂盒，其任选地进一步包含用于检测神经颗粒蛋白的工具，用于检测BACE1的工具，和优选地，用于检测所述一种或多种另外的生物标志物的工具；以及方法，其包括下列步骤：使来自受试者的样品与用于捕获神经颗粒蛋白的工具相接触，从所述样品中分离所述用于捕获神经颗粒蛋白的工具，并且使来自受试者的样品与用于捕获BACE1的工具相接触和从所述样品中分离所述用于捕获BACE1的工具。所述诊断旨在辨别神经变性疾病，优选地轻度阿尔茨海默病，和具有或不具有认知缺损的抑郁症。

Description

用于神经学疾病的诊断的测定法

本发明涉及：在诊断上有用的载体，其包含用于捕获神经颗粒蛋白的工具，用于捕获BACE1的工具，和优选地，用于捕获一种或多种另外的生物标志物的工具；包含所述在诊断上有用的载体的试剂盒，其任选地进一步包含用于检测神经颗粒蛋白的工具，用于检测BACE1 的工具，和优选地，用于检测所述一种或多种另外的生物标志物的工具；以及方法，其包括下列步骤：使来自受试者的样品与用于捕获神经颗粒蛋白的工具相接触，从所述样品中分离所述用于捕获神经颗粒蛋白的工具，并且使来自受试者的样品与用于捕获BACE1的工具相接触和从所述样品中分离所述用于捕获BACE1的工具。

开发用于神经学疾病的诊断系统是生物医学科学中的一项持续的挑战，这绝不是因为许多所遇到的神经学症状可以由极其多种多样的原因(包括遗传继承性疾病、药物滥用、营养不良、感染、损伤、精神病学疾患、免疫学缺陷和癌症)来解释。

由于神经学疾病很少与独特的临床症状样式相关联，因而常常难以基于对患者的观察和临床检查或者基于病史来提供可靠的诊断。

早期诊断的重要性怎么强调都不过分。许多神经学病症，最突出地神经变性疾病，例如阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)，目前还不能被治愈，但是可以用于减缓其进展的药物是可得的。诊断越早，利用可得药物谱以使患者充分受益的机会就越好。

另外，神经变性疾病在独个患者中以惊人地不同的速率进展。虽然在有些患者中症状在几个月内恶化，但其他患者可能继续携带轻微症状生活多年。

任何用于评估未来发展的选项都可以帮助患者、他们的医生、亲戚和照顾者相应地去调整治疗和患者的生活方式。这对于处于升高的发展出AD或PD或者精神病学状况例如抑郁症的风险中的患者来说也可以是有用的选项。

不幸的是，目前可得的诊断生物标志物不允许预测该疾病的未来进展。特别地，tau和A_β是关于未来认知衰退的具有有限诊断价值的状态标志物。缠结和斑块仅与认知缺损弱相关。

现有技术公开了一系列测定法。EP 1774023公开了基于在各种类型的样品中检测全长神经颗粒蛋白来诊断脑损伤出现的方法，但没有公开另外检测在脑脊液(CSF)中的BACE1的测定法。

Barao等人(2013)公开了用于检测BACE1(而不是神经颗粒蛋白)的夹心式ELISA。但是，BACE1被认为是“差的关于AD的诊断标志物”，其中在来自AD患者和对照组的样品之间具有“非常小的”差异。显然地，存在开发出可以用于预测此类疾病的发作或未来过程的诊断测定法的需要。

因此，作为本发明基础的问题是提供可以用于诊断神经变性疾病，更特别地AD的诊断测定法。

特别地，这样的测定法应当允许诊断具有可以与神经变性疾病和其他神经学疾病或者精神病学疾病例如抑郁症均相关联的特异和/或非特异的症状的患者。

作为本发明基础的另一个问题是提供允许预测神经变性疾病，更特别地AD的未来进展的诊断测定法。

作为本发明基础的另一个问题是提供可以用于诊断精神病学疾病，更特别地抑郁症的测定法。

通过所附的独立和从属权利要求的主题解决了作为本发明基础的问题。

在第一个方面，作为本发明基础的问题通过在诊断上有用的载体而得到解决，所述在诊断上有用的载体包含用于捕获神经颗粒蛋白的工具，用于捕获BACE1的工具，和优选地，用于捕获一种或多种另外的生物标志物的工具。

在第二个方面，作为本发明基础的问题通过包含根据本发明的在诊断上有用的载体的试剂盒而得到解决，所述试剂盒任选地进一步包含用于检测神经颗粒蛋白的工具，用于检测BACE1的工具，和优选地，用于检测所述一种或多种另外的生物标志物的工具。

在一个优选的实施方案中，所述用于特异性地捕获神经颗粒蛋白的工具和所述用于特异性地捕获BACE1的工具是在空间上分开的。

在另一个优选的实施方案中，所述在诊断上有用的载体选自包括珠粒、测试条、微量滴定板、印迹的组，优选地选自包括Western印迹、线印迹(line blot)和斑点印迹、玻璃表面、载玻片、生物芯片、膜、微阵列、电泳凝胶和亚微米大小的颗粒的组，

和更优选地，要么为微量滴定板，其具有包含所述用于特异性地捕获神经颗粒蛋白的工具的孔，具有包含所述用于特异性地捕获 BACE1的工具的孔，和任选地具有一个或多个另外的孔，每个另外的孔包含用于特异性地捕获所述一种或多种另外的生物标志物的工具，

要么为包含所述用于特异性地捕获神经颗粒蛋白的工具的珠粒，和包含所述用于特异性地捕获BACE1的工具的珠粒，和任选地一种或多种另外的珠粒，每种另外的珠粒包含用于特异性地捕获所述一种或多种另外的生物标志物的工具，

最优选地，为所述微量滴定板。

在第三个方面，作为本发明基础的问题通过一种方法而得到解决，所述方法包括下列步骤：

(a1)使来自受试者的样品与用于捕获神经颗粒蛋白的工具相接触，

(b1)从所述样品中分离所述用于捕获神经颗粒蛋白的工具，

并且

(a2)使来自受试者的样品与用于捕获BACE1的工具相接触，和 (b2)从所述样品中分离所述用于捕获BACE1的工具。

在另一个优选的实施方案中，所述方法进一步包括下列步骤：

(c1)使所述用于捕获神经颗粒蛋白的工具与可检测的结合神经颗粒蛋白的配体相接触，和

(c2)使所述用于捕获BACE1的工具与可检测的结合BACE1的配体相接触。

(d1)检测任何所捕获的神经颗粒蛋白，和

(d2)检测任何所捕获的BACE1。

(a3)使来自受试者的样品与用于捕获一种或多种另外的生物标志物的工具相接触，

(b3)从所述样品中分离所述用于捕获所述一种或多种另外的生物标志物的工具，和

任选地，

(c3)使所述用于捕获所述一种或多种另外的生物标志物的工具与可检测的结合所述一种或多种另外的生物标志物的配体相接触，和

任选地，

(d3)检测任何所捕获的所述一种或多种另外的生物标志物。

在第四个方面，作为本发明基础的问题通过经由根据本发明的方法可获得的在诊断上有用的载体而得到解决。

在另一个优选的实施方案中，所述一种或多种另外的生物标志物选自包括Abeta42和Abeta40、P-tau、T-tau和神经丝蛋白的组。

在另一个优选的实施方案中，所述载体、试剂盒或方法适合于通过使用从包括下列各项的组中选择的方法来检测神经颗粒蛋白、 BACE1和任选地一种或多种另外的生物标志物：免疫扩散技术；免疫电泳技术；光散射免疫测定法；凝集技术；标记免疫测定法，例如，从包括放射性标记免疫测定法、酶免疫测定法例如比色测定法、化学发光免疫测定法、荧光免疫测定法、纳米金标记的组中选择的那些；质谱法；和表面等离子体共振，优选地酶免疫测定法。

在另一个优选的实施方案中，所述载体、试剂盒或方法适合于基于夹心式ELISA来检测神经颗粒蛋白、BACE1和任选地一种或多种另外的生物标志物。

在第五个方面，作为本发明基础的问题通过根据本发明的在诊断上有用的载体或试剂盒用于诊断神经学疾病或神经变性疾病，优选地阿尔茨海默病(AD)的用途而得到解决。

在另一个优选的实施方案中，所述诊断旨在预测未来认知下降的速率。

在另一个优选的实施方案中，所述诊断旨在辨别神经变性疾病，优选地轻度AD，和具有或不具有认知缺损的抑郁症。

在第六个方面，作为本发明基础的问题通过用于诊断抑郁症(优选地在老年患者中)的根据本发明的在诊断上有用的载体或试剂盒而得到解决。

本发明涉及在诊断上有用的载体，其优选地为由人工材料例如玻璃或塑料制成的固体载体。该载体与用于特异性地捕获在来自受试者，优选地哺乳动物受试者，更优选地人受试者的体液样品中的抗体的工具相联合。在一个优选的实施方案中，所述固体载体为诊断装置，其更优选地选自包括珠粒、测试条、微量滴定板、印迹的组，优选地选自包括Western印迹、线印迹和斑点印迹、玻璃表面、载玻片、生物芯片、膜、微阵列、电泳凝胶和亚微米大小的颗粒的组，更优选地微量滴定板或珠粒，最优选地所述微量滴定板。所述诊断载体可以为一体式诊断载体，例如微量滴定板，其具有多于一个孔，例如一个孔包含用于捕获神经颗粒蛋白的工具而另一个孔包含用于捕获BACE1的孔，或者它可以包含两个或更多个部件，所述部件中的每一个可以用于分开的测定法。例如，所述诊断装置可以包括包含用于捕获神经颗粒蛋白的工具的第一种珠粒和包含用于捕获BACE1的工具的另一种珠粒。

根据本发明，所述载体包含两种或更多种用于特异性地捕获多肽的工具，其中包括一种用于捕获神经颗粒蛋白的工具和一种用于捕获 BACE1的工具，任选地一种或多种用于捕获一种或多种另外的生物标志物的工具，例如一种、两种、三种、四种、五种、十种、五十种、一百种或一千种或更多种的工具，其中每一种用于捕获另外的生物标志物。

所述工具被固定在所述载体上，从而将所述工具恰当地进行放置以与待捕获的多肽例如神经颗粒蛋白、BACE1或任何另外的生物标志物相互作用和结合(当与包含所述待捕获的多肽的液体样品相接触时)，以便形成包含所述工具和待捕获的多肽的复合物。所述工具可以为任何特异性地结合神经颗粒蛋白、BACE1或任何另外的生物标志物的试剂，并且优选地选自包括下列各项的组：抗体，优选地单克隆或多克隆抗体，更优选地单克隆抗体；和适体，更优选地抗体。除了抗体或适体外，还可以使用钙调蛋白或其变体作为特异性地结合神经颗粒蛋白的工具。所述抗体优选地为分离的和/或重组的抗体。本领域技术人员熟悉可以用于产生这样的工具的方法。

优选地，所述用于捕获的工具具有这样的与待捕获的分子(优选地神经颗粒蛋白、BACE1或任何另外的生物标志物)的结合亲和力 K_D，其具有小于下列值的值(即指示更强的结合的值)：1mM，以优先级渐增的顺序，0.5mM、0.250mM、0.100mM、50μΜ、25μΜ、 10μΜ、5μΜ、1μΜ、0.5μΜ、0.25μΜ、0.1μM、50nΜ、25nΜ、 10nΜ、1nΜ、100pΜ、50pM、25pM、10pM、5pM、1pM、0.5 pM、0.25pM、0.1pM，这在25℃下在pH 7的PBS中通过使用表面等离子体共振来测量。

在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“神经颗粒蛋白”是指全长的哺乳动物(优选地人)神经颗粒蛋白(由数据库条目 Uniprot Q92686所表示的)或其片段，更优选地所述神经颗粒蛋白的在C-末端处经截短的片段，其包含至少SEQ ID NO 4，和任选地另外的N-末端氨基酸残基，但缺乏全长神经颗粒蛋白的三个C-末端残基，更特别地S76、G77和D78，该经截短的形式在整个该申请中也被称为“神经颗粒蛋白trunc p75”。所检测的神经颗粒蛋白或其片段可以携带一个或多个修饰，包括从由包括下列各项的组中选择的那些：N- 乙酰化，例如N-乙酰基-Met1；磷酸化，例如磷酸-Ser36；和瓜氨酸化，例如对于基于SEQ ID NO 1的编号的Arg68的。在整个该文档中所提及的任何数据库条目涉及在申请日之时在线的在那个数据库中的版本和序列。

在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“BACE1”是指全长的哺乳动物(优选地人)BACE1或其片段，优选地由SEQ ID NO 2所表示的片段。所检测的BACE1或其片段可以携带一个或多个修饰，包括从由包括下列各项的组中选择的那些：乙酰化，优选地从包括Lys105、Lys254、Lys258、Lys264、Lys278、Lys279和Lys286 的组中选择的赖氨酸侧链的乙酰化；糖基化，优选地从包括Asn132、 Asn151、Asn202和Asn333的组中选择的天冬酰胺侧链的糖基化；二硫键，优选地在从包括Cys195和Cys399、Cys257和Cys422以及 Cys309和Cys359的组中选择的半胱氨酸侧链对之间的二硫键。(所有上面的氨基酸编号均基于SEQID NO 2)。

在一个优选的实施方案中，所述一种或多种另外的生物标志物为这样的生物标志物，其可以用于诊断神经变性疾病，更优选地AD，更优选地选自精神病学状况(例如抑郁症)的AD症状。所述一种或多种另外的生物标志物优选地选自包括下列各项的组：Abeta42 (Αβ_1-42)，其优选地由SEQ ID NO 5所表示；Abeta40(Αβ_1-40)，其优选地由SEQ ID NO 6所表示；Tau，其优选地由SEQ ID NO 7所表示，要么总tau(也称为t-tau)，要么包含至少一个经磷酸化的序列基序的tau(也称为p-tau)；和神经丝蛋白，其优选地由SEQ ID NO 8所表示。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“t-tau”包括所有tau分子或其片段的全体。在另一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“p-tau”包括所有经磷酸化的tau分子或其片段的全体。

根据本发明，需要用于检测所捕获的多肽，例如神经颗粒蛋白、 BACE1或者所述一种或多种另外的生物标志物的工具。在一个优选的实施方案中，使用结合所捕获的多肽的第二抗体或适体，其与第一捕获抗体或适体不同或相同。所述第二抗体或适体可以与直接进行检测的标记物(例如荧光的、放射性的或具有酶促活性的标记物)相联合，其中后者可以催化化学发光反应，或者催化通过使用比色法或光谱学或另一种分析方法可检测的分子的产生。

所述用于检测的工具优选地如此地进行设计，从而它结合所捕获的多肽，并且后者可以在结合的同时被检测。例如，如果使用一抗来以夹心样方式捕获多肽，那么二抗结合在该多肽与一抗相结合的同时仍然可接近的另一个表位。

根据本发明，提供了第一反应混合物，其包含在诊断上有用的载体、样品和用于捕获神经颗粒蛋白的工具，所述工具任选地与神经颗粒蛋白相复合；和第二反应混合物，其与第一反应混合物相接触或在空间上分开，优选地在空间上分开，其包含在诊断上有用的载体、样品和用于捕获BACE1的工具，所述工具任选地与BACE1相复合。处于复合物中的神经颗粒蛋白可以与可检测的关于神经颗粒蛋白的配体相联合。处于复合物中的BACE1可以与可检测的关于BACE1的配体相联合。

本发明的教导提供了试剂盒，其优选地用于诊断神经变性疾病，更优选地用于诊断AD。此类试剂盒为这样的容器，其包含对于实施本发明的方法来说需要的特殊试剂，特别地根据本发明的在诊断上有用的载体，任选地另外还有一种或多种对于实施本发明的方法来说需要的溶液，其优选地选自包括下列各项的组：样品稀释缓冲液，洗涤缓冲液，和包含用于检测任何所捕获的多肽的工具(例如二抗)的缓冲液。进一步地，它可以包含使用说明书，其详细说明了如何使用该试剂盒和本发明的在诊断上有用的载体来使本发明的多肽与来自受试者(优选地人受试者)的体液样品相接触。进一步地，所述试剂盒可以包含阳性对照，例如重组神经颗粒蛋白和/或BACE1，其已知与用于捕获神经颗粒蛋白、BACE1和任选地一种或多种另外的生物标志物的工具相结合；和阴性对照。最后，此类试剂盒可以包含一种或多种用于制备校准曲线的标准溶液，例如包含以已知浓度的神经颗粒蛋白的标准溶液，包含以已知浓度的BACE1的标准溶液，和任选地一种或多种这样的标准溶液，每种标准溶液包含以已知浓度的另外的生物标志物。

在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“检测”意指，可以确定待检测的多肽(优选地，神经颗粒蛋白、BACE1或所述一种或多种另外的生物标志物)的存在或不存在。在一个更优选的实施方案中，所述术语是指至少半定量的测定，其允许浓度的粗略估计。在一个最优选的实施方案中，所述术语是指测定待检测的多肽的浓度(相对的或绝对的)，从而可以测定在样品中的神经颗粒蛋白与BACE1 的浓度比，和任选地神经颗粒蛋白或BACE1与一种或多种另外的生物标志物的比例。例如，在样品中的神经颗粒蛋白和BACE1两者的未知浓度可以通过下述方式来测定：在分开的反应中分别与已知量的神经颗粒蛋白和BACE1相平行地运行待检查的样品的ELISA，随后为基于已知量建立各自关于神经颗粒蛋白和BACE1的校准曲线，和测定在样品中的神经颗粒蛋白和BACE1的第一未知浓度。在一个优选的实施方案中，所述方法选自包括由下列各项组成的组：免疫扩散技术；免疫电泳技术；光散射免疫测定法；凝集技术；标记免疫测定法，例如，从包括放射性标记免疫测定法、酶免疫测定法例如比色测定法、化学发光免疫测定法、荧光免疫测定法、纳米金标记的组中选择的那些；质谱法；和表面等离子体共振，优选地酶免疫测定法。此类方法描述在现有技术中，例如在Fredolini等人(2016) Immunocapture strategies in translationalproteomics,Expt.Rev. Proteomics 13(1),83-98中。

在一个优选的实施方案中，所述用于捕获神经颗粒蛋白、BACE1 和任选地所述一种或多种另外的生物标志物的工具是在空间上分开的，即分开在不同的反应区室中，从而当测定浓度时没有试剂的转移。备选地，所述反应可以以“单罐”方式来进行，条件是存在这样的可能性：测定神经颗粒蛋白、BACE1和任选地所述一种或多种另外的生物标志物的比例，例如通过使用不互相干扰的不同的用于进行检测的工具。在另一个实施方案中，可以在捕获反应(其在相同的容器中进行)之后分开所述两种或更多种用于进行捕获的工具，以便分开地测定神经颗粒蛋白、BACE1和所述一种或多种另外的生物标志物的浓度。在另一个实施方案中，所述在诊断上有用的载体包含两种或更多种用于进行捕获的工具，但在捕获反应之后被拆分开并且在两个在空间上分开的反应中与两种或更多种不同的用于检测神经颗粒蛋白、 BACE1和任选地一种或多种另外的生物标志物的工具进行反应。在一个优选的实施方案中，使相同的样品顺次地或相伴地经历用于检测神经颗粒蛋白、BACE1和任选地一种或多种另外的生物标志物的反应。

在一个优选的实施方案中，所述在诊断上有用的载体为珠粒，其优选地为这样的颗粒，在其上可以附着用于捕获生物标志物的工具，从而所述珠粒连同此类工具一起可以基于其沉降特性而与液体溶液相分开，这比所述用于捕获生物标志物的工具靠自身，例如通过滗析、离心、过滤(优选地滗析)更为有效。典型地，这样的珠粒为由在水溶液中在化学上惰性的碳水化合物(例如琼脂糖或sepharose珠粒) 制成的珠粒。所述珠粒可以为磁珠，其可以包含以5至30％(重量/ 重量)的含量的铁。所述珠粒可以具有0.1至10μm，优选地0.5至5 μm的大小。所述在诊断上有用的载体可以包含包被有用于捕获神经颗粒蛋白的工具(优选地针对神经颗粒蛋白的抗体)的珠粒，和包被有用于捕获BACE1的工具(优选地针对BACE1的抗体)的珠粒，和任选地一种或多种这样的珠粒，其包被有用于捕获所述一种或多种另外的生物标志物的工具，优选地关于每种珠粒结合该另外的生物标志物的抗体，和任选地包被有用于捕获所述一种或多种另外的生物标志物的工具，优选地抗体或适体，优选地针对所述一种或多种另外的生物标志物的抗体。

在另一个优选的实施方案中，所述在诊断上有用的装置为微量滴定板，其包含包被有用于特异性地捕获神经颗粒蛋白的工具的孔，包被有用于特异性地捕获BACE1的工具的孔，和任选地一个或多个这样的孔，每个孔包含用于捕获另外的生物标志物的工具。

根据本发明进行测试的样品为血液样品、脑组织样品或CSF样品，优选地CSF样品，更优选地来自活的患者的CSF样品，所述患者优选地被怀疑罹患或显示出对于神经变性疾病来说特征性的症状，优选地神经变性疾病例如AD的初始症状。

本发明涉及包括在来自受试者的样品中检测神经颗粒蛋白、 BACE1和任选地一种或多种另外的生物标志物的步骤的方法。这样的方法可以包括下列步骤：提供来自受试者的样品，使所述样品与根据本发明的在诊断上有用的载体在与形成包含所述在诊断上有用的载体和待检测的多肽例如神经颗粒蛋白和BACE1的复合物相容的条件下相接触，例如通过简单地用所述样品或用经稀释的样品浸渍所述在诊断上有用的载体足够的时间段。另一个后续步骤可以涉及从样品的其余部分中分离出任何复合物，例如通过在形成复合物后从所述载体上轻轻地去除样品从而保留所述复合物，例如通过滗析。随后，可以再次在允许所形成的复合物的组分保持相联合的条件下洗涤所述在诊断上有用的载体。最后，可以检测所述复合物，通过直接检测完整的复合物，例如通过添加结合所述复合物而不结合所述用于进行捕获的工具自身的可检测的配体。备选地，所述复合物可以通过下述方式来进行检测：在去除样品后解离所述复合物，从所述用于进行捕获的工具上移除待检测的多肽，和检测任何解离出的多肽。所述方法优选地为体外方法。

在一个优选的实施方案中，使用可检测的配体来检测多肽例如神经颗粒蛋白、BACE1和任选地所述一种或多种另外的生物标志物。优选地，所述配体可以具有这样的与待检测的多肽的结合亲和力K_D，其具有小于下列值的值(即指示更强的结合的值)：1mM，以优先级渐增的顺序，0.5mM、0.250mM、0.100mM、50μΜ、25μΜ、10μΜ、 5μΜ、1μΜ、0.5μΜ、0.25μΜ、0.1μM、50nΜ、25nΜ、10nΜ、 1nΜ、100pΜ、50pM、25pM、10pM、5pM、1pM、0.5pM、0.25 pM或0.1pM，这在25℃下在pH 7的PBS中通过使用表面等离子体共振来测量。最优选地，所述配体具有1nM或更小的与待检测的多肽的结合亲和力K_D。在一个优选的实施方案中，所述可检测的配体优选地选自包括下列各项的组：抗体，优选地单克隆或多克隆抗体，更优选地单克隆抗体；或适体，更优选地抗体。所述抗体优选地为分离的和/或重组的抗体。所述可检测的配体可以与人工标记物(其优选地选自包括具有酶促活性的多肽、放射性核苷酸、自旋标记物、荧光标记物和生色团标记物的组)相联合。

在一个优选的实施方案中，使用夹心式ELISA来检测待检测的多肽，更特别地神经颗粒蛋白和BACE1和任选地一种或多种另外的生物标志物。简而言之，所述在诊断上有用的载体，优选地微量滴定板或珠粒，包含固定在所述载体上的第一抗体或适体，其充当用于捕获待检测的多肽的工具。包含第一抗体或适体和待检测的多肽的复合物通过添加第二抗体或适体(其携带标记物，并且结合与结合第一抗体的表位相同或不同的表位)来进行检测。各种用于检测神经颗粒蛋白和BACE1的免疫测定法描述在现有技术中，例如在De Vos等人,2015；Kvartsberg等人,2015；Thorsell等人,2010；WO2012/155134；和Barao等人,2013中。在一个优选的实施方案中，使用夹心式测定法来检测神经颗粒蛋白，通过使用第一单克隆抗体作为捕获抗体和第二单克隆抗体作为检测抗体。在一个更优选的实施方案中，所述检测抗体结合比所述捕获抗体所结合的表位更靠近C-末端的神经颗粒蛋白表位，优选地包含SEQ ID NO 3(AGGGP)的具有至少五个氨基酸，优选地至少10个氨基酸的表位。最优选地，这两种抗体均结合位于由SEQ ID NO 4所表示的神经颗粒蛋白的胶原样结构域中的神经颗粒蛋白表位。

在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“诊断”是指任何类型的旨在下列目的的程序：获得在评估患者是否在过去、在诊断之时或在未来罹患或可能罹患或比平均或比较受试者(其优选地具有相似的症状)更可能罹患某种疾病或状况之中有帮助的信息；发现疾病如何正在进展或在未来可能如何进展；或者评价患者对于某一治疗(例如，施用合适的减缓神经变性疾病的进展的药物)的应答性。换言之，术语“诊断”不仅包括诊断，而且还包括预测和/或监测疾病或病症的过程。在一个优选的实施方案中，所述疾病或病症为神经学疾病，更优选地神经变性疾病，更优选地AD，并且这可以通过使用本发明的教导而与具有或不具有认知缺损(优选地不具有认知缺损) 的抑郁症相区别。在年龄为至少40岁，更优选地50岁，更优选地60 岁，更优选地65岁，更优选地70岁，更优选地75岁，更优选地80岁的人中。

因此，术语“诊断”优选地并不暗示根据本发明的诊断方法或试剂将会是决定性的并且足以基于单个测试(更不用说参数)来完成诊断。相反，它可以是指对于所谓的“鉴别诊断”(即在某些诊断参数的基础上考虑一系列可能状况的可能性的系统性诊断程序)的贡献。这可以涉及通过排除另一个而间接地来诊断疾病或状况。术语“诊断”还可以是指用于为患者选择最具希望的治疗方案的方法或试剂。换言之，所述方法或试剂可以涉及为受试者选择治疗方案。

根据本发明，可以使用所述诊断载体或试剂盒或方法来在来自受试者的样品中检测神经颗粒蛋白和BACE1。在这样的受试者为罹患由于阿尔茨海默病而引起的轻度认知缺损(MCI)或者罹患由于阿尔茨海默病而引起的痴呆的患者，例如在本发明的实施例中所描述的患者的情况下，在那名受试者的CSF中的神经颗粒蛋白与BACE1的比例可以用于评估或监测那个个体的认知下降的进展速度，这借助于随时间的改变的简短精神状态检查(Mini-Mental State Examination， MMSE)值。30的MMSE值表明正常的、认知健康的状态。小于30，更优选地25或更小的MMSE值表明MCI或由于AD而引起的痴呆。在CSF中的神经颗粒蛋白与BACE1的比例可以用于评估或监测阿尔茨海默病的进展速度，其中高的比例表明比更低的比例更高的更快下降速度的可能性。可以通过使CSF样品经历本发明的方法来诊断MCI 或AD患者，其中在那个CSF样品中的低于0.105的神经颗粒蛋白与 BACE1的比例优选地可以表明在接下来的6年中小于0.42MMSE单位的MMSE降低。优选地，在0.105和0.144之间的神经颗粒蛋白与 BACE1的比例可以表明在接下来的6年中在1.64和1.84MMSE单位之间的MMSE降低。优选地，大于0.144的神经颗粒蛋白与BACE1 的比例将会表明在接下来的6年中大于2.68MMSE单位的MMSE降低。在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“神经颗粒蛋白与BACE1的比例”是指在目的样品中的以pg/mL表示的神经颗粒蛋白的浓度除以在相同样品中的以pg/mL表示的BACE1的浓度。

本发明通过下面的非限制性实施例、序列和附图(从其中可以得到本发明的进一步的特征、实施方案、方面和优点)来进一步举例说明。

本申请中的序列包括：

SEQ ID NO 1：待检测的神经颗粒蛋白的最小序列

SEQ ID NO 2：待检测的没有跨膜结构域和胞质尾区的成熟 BACE1的序列(基于从位置22至460的uniprot序列P56817)

SEQ ID NO 3：C-末端神经颗粒蛋白表位(AGGGP)

SEQ ID NO 4：神经颗粒蛋白的胶原样结构域

SEQ ID NO 5：Abeta42

SEQ ID NO 6：Abeta40

SEQ ID NO 7：Tau

SEQ ID NO 8：神经丝蛋白

图1显示了：

(a)mAbs ADxNGCI2和ADxNGCT1两者的表位作图，其用从 R51至D78变动的重叠合成肽来进行。

(b)通过Western印迹分析来评价mAbs ADxNGCI2和 ADxNGCT1的特异性，合成的全长神经颗粒蛋白以及在P75处经截短的合成的神经颗粒蛋白肽两者均包括在凝胶电泳中，旁边为人I、III 和IV型胶原。ADxNGCI2阳性染色了所述两种合成肽，而ADxNGCT1 仅标记了经截短的形式。所述mAbs中没有一个检测出胶原蛋白质。

(c)数种在其C-末端不同的合成的神经颗粒蛋白肽(即完整的(具有完整C-末端的肽)，或者在P75处(肽trunc P75)或在S76处(肽 trunc S76)经截短的)的分析，以确证原型ELISA对于不同浓度的在P75处经截短的神经颗粒蛋白种类的特异性。

图2显示了针对年龄进行绘图的在20名认知健康的人(黑色方框) 和161份处于宽的年龄范围内的未经选择的CSF样品(空心圆)中的神经颗粒蛋白trunc P75(a)、BACE1(b)、总-tau(c)、Αβ_1-42 (d)、Αβ_1-40(e)和Αβ_1-38(f)的CSF水平。

图3显示了散点图，其显现了在下列不同诊断组中在CSF中的神经颗粒蛋白truncP75(a)或BACE1(b)的浓度：具有高的关于阿尔茨海默病的概率的轻度认知缺损(MCI)(n＝38)；由于阿尔茨海默病而引起的痴呆(AD)(n＝50)；和认知健康的参与者(CTRL) (n＝20)。在每个点图中以线来表示的是中值水平。棒条表示四分位数间距。组之间的统计学显著差异通过**＝P<0.01而呈现在所述图中。

图4显示了基线CSF神经颗粒蛋白trunc P75/BACE1水平对于随时间的MMSE演变的影响的图解说明。将样品按照该比例的CSF 水平分为三个组。所述图版显示了CSF神经颗粒蛋白P75/BACE1的水平的低的(上图版)、中间的(中图版)和高的(下图版)范围。对于MCI(a)和AD患者(b)两者制作分开的图版。对于MCI和 AD组两者，均关于每个范围将所观察到的MMSE对时间进行绘图。细线表示关于特定患者的所观察到的MMSE数据，粗线代表平均 MMSE对时间的线性回归线。

实施例

材料和方法

1.1研究群体

CSF样品通过在L3/L4或L4/L5间隙处的腰部穿刺(LP)来获得，收集在聚丙烯管中，立即在液氮中进行冷冻，并且储存于-80℃直至分析。在LP之前或之后3个月内，对于每名患者进行至少由简短精神状态检查(MMSE)得分组成的神经心理学检查。

包括了具有由于AD而引起的MCI的患者(以下称为‘MCI’) (n＝38)以及年龄匹配的具有由于AD而引起的痴呆的患者(‘AD’) (n＝50)，并且按照NIA-AA标准进行诊断(Albert等人(2011)The diagnosis of mild cognitive impairment due to Alzheimer's disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer'sAssociation workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer'sdisease.Alzheimers Dement 7(3),270-279；McKhann等人(2011)The diagnosis ofdementia due to Alzheimer's disease:recommendations from the NationalInstitute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnosticguidelines for Alzheimer's disease. Alzheimers Dement 7(3),263-269)。

为了区分AD与认知正常的人，在该研究之前已经在BIODEM实验室使用商业试剂盒(Innotestβ-AMYLOID(1-42)、Innotest hTAU-Ag 和Innotest PHOSPHO-TAU(181P)；Fujirebio Europe,Ghent, Belgium)分析了CSF生物标志物Αβ_1-42、T-tau和P-tau181P，其中应用了实验室的截止值[Van der Mussele等人(2014)Depression in Mild CognitiveImpairment is associated with Progression to Alzheimer's Disease:ALongitudinal Study.J Alzheimers Dis 42(4), 1239-1250]。所有MCI患者(其中包括2名具有致病的AD基因突变的患者)具有高的AD病因学概率，按照NIA-AA标准(还可参见补充表格1)。关于年龄匹配且性别匹配的认知健康的对照组('CTRL') (n＝20)的参与者，借助于神经心理学筛选来排除认知衰退。CTRL 受试者不具有神经学和精神病学前例、中枢神经系统病症或炎症综合征。

如果可得，在该研究中包括来自随访神经心理学检查(在LP(＝基线)之后至少一年)的MMSE总得分。这允许基于关于年龄和性别进行调整的线性混合模型来计算认知下降的速度。

1.2用于CSF的研究型神经颗粒蛋白ELISA

将96-孔微量滴定板用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的mAb ADxNGCI2在21℃下包被1小时。在用包含Tween-20的PBS(PBST) 洗涤孔后，将平板用封闭试剂在21℃下封闭2小时。在样品稀释剂 (SD)(具有封闭试剂和去污剂的基于PBS的缓冲液)中以900pg/mL 的初始浓度制备校准品，即包含在Pro75处经截短的神经颗粒蛋白的 C-末端的合成肽(由Proteogenix,France定制的)，并且进行随后的三倍稀释。将样品以及校准品稀释物同时地与在SD中的经生物素化的mAb ADxNGCT1一起在21℃下温育3小时。在用PBST洗涤平板后，添加缀合有辣根过氧化物酶的链霉抗生物素蛋白。在21℃下温育 30分钟后，洗涤平板并添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液以进行显色。在21℃下30分钟后，终止着色反应，并且在BioTek微量培养板阅读器中在450nm处对平板进行读取。基于校准曲线，通过内推法(5PL曲线拟合；log(X))来计算神经颗粒蛋白trunc P75的水平。

1.3用于CSF的BACE1ELISA

所使用的BACE1ELISA基于

等人((2013)BACE1levels correlate withphospho-tau levels in human cerebrospinal fluid.Curr Alzheimer Res 10(7),671-678)的ELISA方法。该ELISA通过实施允许15μL未稀释的CSF样品和检测抗体的同时温育(3小时)的改进而得到进一步发展。使用来自EUROIMMUN Medizinische LabordiagnostikaAG,Lübeck,Germany的试剂(BACE-1ELISA，产品编号EQ 6541-9601-L)。此外，发明人还进行了额外轮次的两种所牵涉的抗体之一的杂交瘤细胞系的亚克隆，以确保所述抗体的单克隆特征和产生。这导致mAb ADx402(克隆10B8F1)，其是在该ELISA 中的检测抗体，并且其被生物素化而不是如在先前形式中那样缀合有过氧化物酶(由

等人,2013所描述的)。捕获抗体mAb ADx401 (克隆5G7)的杂交瘤细胞系不经历额外轮次的亚克隆。发明人按照新的实验方案分析了BACE1水平，其中基于校准曲线通过内推法 (5PL曲线拟合；log(X))来计算浓度。

1.4关于CSF生物标志物总-tau、AB1-42、AB1-40和AB1-38的 ELISA

在该研究期间重新分析了总-tau、Aβ_1-42、Aβ_1-40的CSF水平，其中使用从EUROIMMUNMedizinische Labordiagnostika AG,Lübeck, Germany商购可得的总-tau ELISA、β-淀粉状蛋白(1-42)ELISA和β-淀粉状蛋白(1-40)ELISA试剂盒(β-淀粉状蛋白1-38，产品编号 EQ6501-9601(用于血浆)，EQ 6501-9601-L(用于CSF)；β-淀粉状蛋白1-40ELISA，EQ 6501-9601(用于血浆)，EQ 6501-9601-L(用于CSF)；β-淀粉状蛋白1-42ELISA，产品编号EQ 6501-9601(用于血浆)，EQ 6501-9601-L(用于CSF))。

此外，还使用由EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG,Lübeck,Germany提供的测定法来测量CSFΑβ_1-38。

1.4统计学分析

将GraphPad Prism 6.02和R版本3.1.2用于统计学分析和附图。分析物和/或参数之间的相关性强度用Spearman相关系数来表示。为了比较组之间的定量变量数据，应用Kruskal-Wallis检验。使用MMSE 作为因变量来对线性混合模型进行拟合，固定效应包括时间(连续变量)、CSF标志物值和其相互作用。随机效应包括关于个体的随机截距和关于时间的随机斜率。在CSF标志物值和时间之间的相互作用的显著性招致CSF标志物的水平对于随时间的MMSE改变是否具有显著影响。使用具有关于自由度数目的Kenward-Roger校正的F-检验来检验该项的显著性。对于P-值<0.05，结果被认为是显著的。

结果

1.5神经颗粒蛋白单克隆抗体的产生

通过用包含神经颗粒蛋白的C-末端的合成肽对小鼠进行免疫接种来产生抗神经颗粒蛋白mAbs ADxNGCI2和ADxNGCT1。在用偶联有KLH的包含C-末端神经颗粒蛋白的内部序列(R51-D78)的肽进行注射和用全长合成神经颗粒蛋白进行额外加强后，在PharmAbs (KULeuven,Belgium)在Balb/c小鼠中产生了mAb ADxNGCI2(同种型IgG2a)。所述肽和全尺寸神经颗粒蛋白两者均在Proteogenix (France)合成。在用缀合有KLH的相应于在P75处经截短的C-末端(G60-P75)的肽(在BIOTEM合成)进行免疫接种后，从OF1 小鼠中分离出mAbADxNGCT1(同种型IgG1)(在BIOTEM, France)。这两种mAbs ADxNGCI2和ADxNGCT1各自识别在神经颗粒蛋白上的不同表位，如在图1a中所描绘的。采用链霉抗生物素蛋白包被和经生物素化的覆盖神经颗粒蛋白的C-末端的肽通过ELISA 进行的扫描揭示了，ADxNGCI2的表位位于序列R51-A66之内。mAb ADxNGCT1靶向从G62开始在P75结束的氨基酸范围。这两种mAbs的该特异性还通过对于合成神经颗粒蛋白(全尺寸的以及在P75处经截短的)的凝胶电泳而得到确证。还包括了三种丰富的人胶原类型，因为ADxNGCI2和ADxNGCT1靶向神经颗粒蛋白的胶原样结构域 (图1b)。

1.6靶向在P75处经截短的神经颗粒蛋白的ELISA的设计

为了测量神经颗粒蛋白，发明人将作为捕获抗体的ADxNGCI2 和作为经生物素化的检测抗体的ADxNGCT1组合入对于在P75处经截短的神经颗粒蛋白来说特异的研究型夹心式ELISA中(图1c)。神经颗粒蛋白的该形式在人CSF中比完整的C-末端更丰富 [Kvartsberg等人(2015)Cerebrospinal fluid levels of the synaptic protein neurogranincorrelates with cognitive decline in prodromal Alzheimer's disease.AlzheimersDement 11(10),1180-1190]。基于所述新mAbs的测定法的灵敏度用以4次重复进行运行的具有低内源性水平的神经颗粒蛋白trunc P75的三个CSF样品来进行评估，并且最低可定量浓度(具有20的变异系数(％CV))为26pg/mL(基于以二次重复的标准曲线)。使用包含在P75处结束的神经颗粒蛋白的C- 末端序列的合成肽的三倍系列稀释物来产生标准曲线，从900至4 pg/mL变动。

1.7CSF神经颗粒蛋白、CSF BACE1和经典的CSF AD生物标志物的年龄依赖性

在临床研究的准备中，发明人首先在一大组的CSF样品中作为“概念证明(proof-of-concept)”验证了神经颗粒蛋白trunc P75测定法。特别地，除了一群诊断不明确的CSF样品(n＝161)(Biomnis, France)外，发明人还分析了关于该临床研究的对照组(n＝20)。发明人选择了在宽的年龄范围内并具有相似的男性和女性受试者数目的前一个样品组。总共分析了181份样品(104名女性/77名男性受试者)，其中中值年龄为50.3(岁)(范围7.0-92.1)。除了神经颗粒蛋白trunc P75外，发明人还分析了BACE1、tau、Αβ_1-42、Αβ_1-40和Aβ_1-38的CSF 水平。表1汇总了所有分析物的浓度。如所描述的，仅在非常少数目的样品中不能测定神经颗粒蛋白trunc P75水平，即2.8％，这与其他五种分析物是高度相当的，即1.7％(对于总-tau、Αβ_1-42和Αβ_1-40)、 1.1％(对于Αβ_1-38)和0％(对于BACE1)。另外，所有CSF分析物均显示出与年龄的关联，虽然在Αβ_1-42的情况下非常弱：神经颗粒蛋白trunc P75(ρ＝0.253；P＝0.0007)、BACE1(ρ＝0.412；P<0.0001)、 tau(ρ＝0.366；P<0.0001)、Αβ_1-42(ρ＝0.147；P＝0.050)、Αβ_1-40 (ρ＝0.305；P<0.0001)和Αβ_1-38(ρ＝0.326；P<0.0001)。图2(其图解说明了数种CSF分析物与年龄之间的该关系)也确证了关于该临床研究的年龄匹配的对照组的这一准确选择。最后，一方面在神经颗粒蛋白trunc P75、BACE1和tau之间存在强的相关性，和另一方面在这三种Αβ-种类之间存在牢固的关系(表2)。

1.8在MCI和AD患者中神经颗粒蛋白trunc P75、BACE1和经典的CSF AD生物标志物的CSF水平。

在建立了关于神经颗粒蛋白的研究型测定法的“概念证明”后，发明人调查了相对于认知正常的参与者(CTRL)(n＝20)而言在MCI (n＝38)和AD(n＝50)患者的CSF中的神经颗粒蛋白trunc P75和 BACE1的水平。另外，在样品中对总-tau、Αβ_1-42、Αβ_1-40和Αβ_1-38进行了定量，所述样品是在对临床诊断不知情的情况下进行测试的。表3总结了每种分析物的水平，与该群体的人口统计学和临床数据相组合地。

相比于CTRL组而言，CSF神经颗粒蛋白trunc P75在MCI患者中显著地增加(P<0.01)，但在AD患者中没有显著地不同(表3，图3)。类似地，在MCI和AD组之间未注意到显著的差异。相反地， CSF BACE1水平在MCI组中相比于AD患者而言更高(P<0.01)，而在CTRL和MCI之间和在CTRL和AD之间未见显著的差异。对于这两种蛋白质，在从认知正常进展至MCI时均存在渐增的组水平这样的趋势，随后为降低，在向AD进展的情况下。这些发现通过接受者操作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)分析而得到反映，其中比较了CTRL组与这两个患者组(表4)。CSF神经颗粒蛋白trunc P75(作为单一分析物)在区分MCI与认知健康的人中运作良好，其中具有0.741的ROC曲线下面积(AUC)(P＝0.003)，但是不能区别AD与对照(AUC＝0.615，ns)。关于BACE1，对于作为单一分析物的CSF BACE1，对于MCI(AUC＝0.620，ns)和对于 AD(AUC＝0.554，ns)均未注意到显著的区分力。如所预期的，ROC 统计学证明了经典的CSF生物标志物总-tau和Αβ_1-42的强的诊断价值。关于CSF总-tau的AUC值在MCI的情况下为0.842(P<0.0001)，和对于AD为0.854(P<0.0001)，而关于CSFΑβ_1-42，AUC值在MCI 的情况下为0.765(P＝0.001)，和对于AD为0.849(P<0.0001)。将所述生物标志物组合成比例明显地导致更高的AUC值以及增加的统计学强度(表4)。关于CSF神经颗粒蛋trunc P75/Αβ_1-42的比例的 AUC值在用于区分MCI与CTRL时为0.874(P<0.0001)，和在AD对CTRL的情况下为0.903(P<0.0001)，相伴的是CSF Aβ_1-42/总-tau 这一比例的最大的区分性能(AUC(MCI)＝0.871，P<0.0001；AUC (AD)＝0.923，P<0.0001)。这两种突触蛋白质即神经颗粒蛋白trunc P75和BACE1的组合还导致高于作为单一参数的这两种分析物的值的AUC值。关于CSF神经颗粒蛋白trunc P75/BACE1的AUC值在关于MCI患者的情况下为0.715(P＝0.008)，和对于AD组为0.806 (P<0.0001)。

此外，发明人还调查了在临床组中所有CSF分析物之间的关系，并且与上面所描述的“概念证明”分析相似，在MCI(0.793，P<0.0001) 以及AD(0.711，P<0.0001)患者中，在神经颗粒蛋白trunc P75和 BACE1之间存在强的相关性(表5)。还观察到在这些突触分析物和总-tau之间的中等强的相关性，即神经颗粒蛋白trunc P75和tau在 MCI(0.635，P<0.0001)和AD(0.617，P<0.0001)中均相关，如BACE1 和tau在MCI(0.588，P<0.001)和AD(0.497，P<0.001)中那样。尽管神经颗粒蛋白trunc P75、BACE1和tau看起来紧密相关联，但当研究它们与Αβ-种类的各自关联时，细微的差异变得明显。神经颗粒蛋白trunc P75在MCI以及AD中与Aβ_1-40和Αβ_1-38两者均相关，但在这两种情况下均不与Αβ_1-42相关。另一方面，tau在MCI中显示出尽管弱但显著的与Αβ_1-42的相关性(0.383，P<0.05)，而BACE1 在AD中与Αβ_1-42相关(0.408，P<0.01)。当考虑CSFΑβ_1-42/Αβ_1-40和CSFΑβ_1-42/Αβ_1-38这些比例时，发现更多的差异(表6)。在MCI 群体中，神经颗粒蛋白trunc P75和BACE1两者与这两个比例均相关，而tau则不是。

1.9CSF生物标志物与MMSE下降的关系

除了其诊断性能外，发明人还通过评估它们与认知下降的关系而评价了作为可能的进展生物标志物的分析物。因此，发明人在其中监测MMSE的MCI(n＝36)和AD(n＝45)患者的亚组中，考虑了所有分析物的CSF水平(作为单一参数以及比例)。在关于年龄和性别进行调整后，以纵向MMSE测量值作为结果的线性混合模型分析证明，处于基线的单一分析物(即神经颗粒蛋白trunc P75、BACE1和经典的CSF AD生物标志物)中没有一个与认知下降的速度相关联(表 7)。大多数的生物标志物比例也不相关，虽然存在有CSF生物标志物的一个特殊比例，其在MCI和AD患者两者中均显示出对于MMSE 的纵向下降的始终如一地显著的影响，即CSF神经颗粒蛋白trunc P75/BACE1(β＝-0.018；P<0.05，对于MCI；β＝-0.051；P<0.01，对于AD)。倘若将两个可能的混杂因素(tau和Αβ_1-42的CSF水平)作为固定效应添加至该模型，统计学显著性仍然不变。为了阐明神经颗粒蛋白trunc P75/BACE1比例与认知衰退之间的这一相关性，将具有在LP时和在LP后随访的MMSE的患者亚组按照比例水平分为三个三分位组(图4 )。在MCI和AD组中，具有最高比例水平的个体(每个由细线表示)，即在最高的三分位组中的个体，均具有最陡的斜率或MMSE的最大改变。该效应在AD患者中更加明显。存在一个另外的也与认知下降显著相关的比例，虽然仅在AD患者中：CSF神经颗粒蛋白truncΡ75/Αβ_1-42(β＝-3.589；P<0.05)。

2结果

2.1神经颗粒蛋白单克隆抗体的产生

将作为捕获抗体的ADxNGCI2和作为经生物素化的检测抗体的 ADxNGCT1相组合导致对于在P75处经截短的神经颗粒蛋白来说特异的研究型夹心式ELISA(图1c)。

2.2CSF神经颗粒蛋白、CSF BACE1和经典的CSF AD生物标志物的年龄依赖性

在临床研究的准备中，发明人首先在一大组的CSF样品中作为“概念证明(proof-of-concept)”验证了神经颗粒蛋白trunc P75测定法。特别地，除了一群诊断不明确的CSF样品(n＝161)(Biomnis, France)外，还分析了关于该临床研究的对照组(n＝20)。选择了在宽的年龄范围内并具有相似的男性和女性受试者数目的前一个样品组。总共分析了181份样品(104名女性/77名男性受试者)，其中中值年龄为50.3(岁)(范围7.0-92.1)。除了神经颗粒蛋白trunc P75 外，我们还分析了BACE1、tau、Αβ_1-42、Αβ_1-40和Aβ_1-38的CSF水平。表1汇总了所有分析物的浓度。如所描述的，仅在非常少数目的样品中不能测定神经颗粒蛋白trunc P75水平，即2.8％，这与其他五种分析物是高度相当的，即1.7％(对于总-tau、Αβ_1-42和Αβ_1-40)、1.1％ (对于Αβ_1-38)和0％(对于BACE1)。另外，所有CSF分析物均显示出与年龄的关联，虽然在Αβ_1-42的情况下非常弱：神经颗粒蛋白 trunc P75(ρ＝0.253；P＝0.0007)、BACE1(ρ＝0.412；P<0.0001)、 tau(ρ＝0.366；P<0.0001)、Αβ_1-42(ρ＝0.147；P＝0.050)、Αβ_1-40 (ρ＝0.305；P<0.0001)和Αβ_1-38(ρ＝0.326；P<0.0001)。图3(其图解说明了数种CSF分析物与年龄之间的该关系)也确证了关于该临床研究的年龄匹配的对照组的这一准确选择。最后，一方面在神经颗粒蛋白trunc P75、BACE1和tau之间存在强的相关性，和另一方面在这三种Αβ-种类之间存在牢固的关系(表2)。

2.3在MCI和AD患者中神经颗粒蛋白trunc 75、BACE1和经典的AD标志物的CSF水平

发明人调查了相对于认知正常的参与者(CTRL)(n＝20)而言在MCI(n＝38)和AD(n＝50)患者的CSF中的神经颗粒蛋白trunc P75和BACE1的水平。另外，在样品中对总-tau、Αβ_1-42、Αβ_1-40和Αβ_1-38进行了定量，所述样品是在对临床诊断不知情的情况下进行测试的。表3总结了每种分析物的水平，与该群体的人口统计学和临床数据相组合地。

相比于CTRL组而言，CSF神经颗粒蛋白trunc P75在MCI患者中显著地增加(P<0.01)，但在AD患者中没有显著地不同(表3，图4)。类似地，在MCI和AD组之间未注意到显著的差异。相反地， CSF BACE1水平在MCI组中相比于AD患者而言更高(P<0.01)，而在CTRL和MCI之间和在CTRL和AD之间未见显著的差异。对于这两种蛋白质，在从认知正常进展至MCI时均存在渐增的组水平这样的趋势，随后为降低，在向AD进展的情况下。这些发现通过接受者操作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)分析而得到反映，其中比较了CTRL组与这两个患者组(表4)。CSF神经颗粒蛋白trunc P75(作为单一分析物)在区分MCI与认知健康的人中运作良好，其中具有0.741的ROC曲线下面积(AUC)(P＝0.003)，但是不能区别AD与对照(AUC＝0.615，ns)。关于BACE1，对于作为单一分析物的CSF BACE1，对于MCI(AUC＝0.620，ns)和对于 AD(AUC＝0.554，ns)均未注意到显著的区分力。如所预期的，ROC 统计学证明了经典的CSF生物标志物总-tau和Αβ_1-42的强的诊断价值。关于CSF总-tau的AUC值在MCI的情况下为0.842(P<0.0001)，和对于AD为0.854(P<0.0001)，而关于CSFΑβ_1-42，AUC值在MCI 的情况下为0.765(P＝0.001)，和对于AD为0.849(P<0.0001)。将所述生物标志物组合成比例明显地导致更高的AUC值以及增加的统计学强度(表4)。关于CSF神经颗粒蛋trunc P75/Αβ_1-42的比例的 AUC值在用于区分MCI与CTRL时为0.874(P<0.0001)，和在AD对CTRL的情况下为0.903(P<0.0001)，相伴的是CSF Aβ_1-42/总-tau 这一比例的最大的区分性能(AUC(MCI)＝0.871，P<0.0001；AUC (AD)＝0.923，P<0.0001)。这两种突触蛋白质即神经颗粒蛋白trunc P75和BACE1的组合还导致高于作为单一参数的这两种分析物的值的AUC值。关于CSF神经颗粒蛋白trunc P75/BACE1的AUC值在关于MCI患者的情况下为0.715(P＝0.008)，和对于AD组为0.806 (P<0.0001)。

2.4CSF生物标志物与MMSE下降的关系

发明人在其中在LP后纵向地监测MMSE至少一年的MCI (n＝36)和AD(n＝41)患者的亚组中，考虑了所有分析物的CSF水平(作为单一参数以及比例)。在关于年龄和性别进行调整后，以纵向MMSE测量值作为结果的线性混合模型分析证明，处于基线的单一分析物(即神经颗粒蛋白trunc P75、BACE1和经典的CSF AD生物标志物)中没有一个与认知下降的速度相关联。但是，存在有CSF 生物标志物的一个特殊比例，其横跨MCI和AD组两者均显示出对于 MMSE的纵向下降的始终如一地显著的影响，即CSF神经颗粒蛋白 trunc P75/BACE1(β＝-0.018；P<0.05，对于MCI；β＝-0.051；P<0.01，对于AD)(图4 )。倘若将两个可能的混杂因素(tau和Αβ_1-42的CSF 水平)作为固定效应添加至该模型，统计学显著性仍然不变。存在一个另外的也与认知下降显著相关的比例，虽然仅在AD患者中：CSF 神经颗粒蛋白truncΡ75/Αβ_1-42(β＝-3.589；P<0.05)。

总结

在本研究的样品组中，发明人已显示，CSF神经颗粒蛋白trunc P75/BACE1的比例在由于AD而引起的MCI以及由于AD而引起的痴呆中与正在经历的和未来的认知下降相关，这与作为单一参数的神经颗粒蛋白trunc P75和BACE1形成对比，或者与目前的AD CSF生物标志物总-tau、Αβ₄₂或Αβ₄₀形成对比。

表1

在未经选择的CSF样品的群组和关于该临床研究的年龄匹配的对照组中，所有经定量的分析物以及其与年龄的相关性的概览。

％N＝不可定量的样品的百分比(181个之中)

表2

在来自该临床研究的年龄匹配的对照和在诊断上未经选择的样品的群组中，关于CSF生物标志物的Spearman相关性分析。在该表中由 Spearmanρ-值所表示的每个所研究的在分析物之间的关系是在统计学上显著的(P<0.0001)。

表3

临床组的人口统计学、临床和生物标志物数据的汇总，其中关于分析物的数据被汇总为中值，其具有25th和75th四分位数。在年龄匹配的对照组(CTRL)与MCI和AD组之间的中值差异使用 Kruskal-Wallis检验来进行检验。

AD＝阿尔茨海默病；CTRL＝认知健康的；F＝女性；LP＝腰部穿刺；M ＝男性；MCI＝具有高的关于AD的概率的轻度认知缺损；MMSE＝简短精神状态检查；N＝样品数目；yr＝岁

统计学显著性(相对于CTRL)由*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；**** P<0.0001来表示。

表4

关于CSF生物标志物的ROC-统计学(作为单一分析物或作为比例)，其中将CTRL组的那套数据与MCI或AD组进行比对。<0.05的P- 值以粗体字进行强调。

AD＝阿尔茨海默病；AUC＝ROC下面积；CTRL＝认知健康的；F＝女性； M＝男性；MCI＝具有高的关于AD的概率的轻度认知缺损；MMSE＝简短精神状态检查；N＝样品数目；ROC＝接受者操作曲线；yr＝岁

表5

在MCI(对角线之上)和AD(对角线之下)患者中，关于CSF生物标志物的Spearman相关性分析。

AD＝阿尔茨海默病；MCI＝具有高的关于AD的概率的轻度认知缺损。统计学显著性由*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001来表示。

表6

在CTRL以及MCI和AD中，以CSF Aβ_1-42/Aβ_1-40和CSFΑβ_1-42/Αβ_1-38这些比例关于CSF神经颗粒蛋白trunc P75、BACE1和总-tau的 Spearman相关性分析

AD＝阿尔茨海默病；CTRL＝认知健康的；MCI＝具有高的关于AD的概率的轻度认知缺损。

相应的统计学显著性由**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001来表示。

表7

在认知下降与单一分析物和比例之间的关联性的统计学显著性，其基于关于年龄和性别进行调整的线性混合模型分析(MCI n＝36；AD n＝45)。<0.05的P-值加有下划线和以粗体字进行强调。

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序列表

<110> ADx and EUROIMMUN

<120> 用于神经学疾病的诊断的测定法

<130> 15PP074WO

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 78

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

Met Asp Cys Cys Thr Glu Asn Ala Cys Ser Lys Pro Asp Asp Asp Ile

1 5 10 15

Leu Asp Ile Pro Leu Asp Asp Pro Gly Ala Asn Ala Ala Ala Ala Lys

20 25 30

Ile Gln Ala Ser Phe Arg Gly His Met Ala Arg Lys Lys Ile Lys Ser

35 40 45

Gly Glu Arg Gly Arg Lys Gly Pro Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly Ala

50 55 60

Gly Val Ala Arg Gly Gly Ala Gly Gly Gly Pro Ser Gly Asp

65 70 75

<210> 2

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser Gly Leu Gly Gly Ala

1 5 10 15

Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp Glu Glu Pro Glu Glu

20 25 30

Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val Asp Asn Leu Arg Gly

35 40 45

Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr Val Gly Ser Pro Pro

50 55 60

Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser Ser Asn Phe Ala Val

65 70 75 80

Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr Tyr Gln Arg Gln Leu

85 90 95

Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val Tyr Val Pro Tyr Thr

100 105 110

Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp Leu Val Ser Ile Pro

115 120 125

His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile Ala Ala Ile Thr Glu

130 135 140

Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp Glu Gly Ile Leu Gly

145 150 155 160

Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp Ser Leu Glu Pro Phe

165 170 175

Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His Val Pro Asn Leu Phe Ser Leu

180 185 190

Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln Ser Glu Val Leu Ala

195 200 205

Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile Asp His Ser Leu Tyr

210 215 220

Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg Glu Trp Tyr Tyr Glu

225 230 235 240

Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln Asp Leu Lys Met Asp

245 250 255

Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val Asp Ser Gly Thr Thr

260 265 270

Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala Ala Val Lys Ser Ile

275 280 285

Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp Gly Phe Trp Leu Gly

290 295 300

Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr Pro Trp Asn Ile Phe

305 310 315 320

Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val Thr Asn Gln Ser Phe

325 330 335

Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg Pro Val Glu Asp Val

340 345 350

Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala Ile Ser Gln Ser Ser

355 360 365

Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu Gly Phe Tyr Val Val

370 375 380

Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala Val Ser Ala Cys His

385 390 395 400

Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu Gly Pro Phe Val Thr

405 410 415

Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro Gln Thr Asp Glu Ser

420 425 430

Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr

435

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

Ala Gly Gly Gly Pro

1 5

<210> 4

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

Ser Gly Glu Arg Gly Arg Lys Gly Pro Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ala Gly Val Ala Arg Gly Gly Ala Gly Gly Gly Pro Ser Gly Asp

20 25 30

<210> 5

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

35 40

<210> 6

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly

20 25

<210> 7

<211> 441

<212> PRT

<213> 人

<400> 7

Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly

1 5 10 15

Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His

20 25 30

Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu

35 40 45

Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser

50 55 60

Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val

65 70 75 80

Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu

85 90 95

Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro

100 105 110

Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val

115 120 125

Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro

145 150 155 160

Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro

165 170 175

Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly

180 185 190

Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser

195 200 205

Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys

210 215 220

Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys

225 230 235 240

Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val

245 250 255

Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly

260 265 270

Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln

275 280 285

Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser

305 310 315 320

Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln

325 330 335

Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser

340 345 350

Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn

355 360 365

Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala

370 375 380

Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser

385 390 395 400

Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser

405 410 415

Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val

420 425 430

Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu

435 440

<210> 8

<211> 1026

<212> PRT

<213> 人

<400> 8

Met Met Ser Phe Gly Gly Ala Asp Ala Leu Leu Gly Ala Pro Phe Ala

1 5 10 15

Pro Leu His Gly Gly Gly Ser Leu His Tyr Ala Leu Ala Arg Lys Gly

20 25 30

Gly Ala Gly Gly Thr Arg Ser Ala Ala Gly Ser Ser Ser Gly Phe His

35 40 45

Ser Trp Thr Arg Thr Ser Val Ser Ser Val Ser Ala Ser Pro Ser Arg

50 55 60

Phe Arg Gly Ala Gly Ala Ala Ser Ser Thr Asp Ser Leu Asp Thr Leu

65 70 75 80

Ser Asn Gly Pro Glu Gly Cys Met Val Ala Val Ala Thr Ser Arg Ser

85 90 95

Glu Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Asn Asp Arg Phe Ala Gly Tyr Ile

100 105 110

Asp Lys Val Arg Gln Leu Glu Ala His Asn Arg Ser Leu Glu Gly Glu

115 120 125

Ala Ala Ala Leu Arg Gln Gln Gln Ala Gly Arg Ser Ala Met Gly Glu

130 135 140

Leu Tyr Glu Arg Glu Val Arg Glu Met Arg Gly Ala Val Leu Arg Leu

145 150 155 160

Gly Ala Ala Arg Gly Gln Leu Arg Leu Glu Gln Glu His Leu Leu Glu

165 170 175

Asp Ile Ala His Val Arg Gln Arg Leu Asp Asp Glu Ala Arg Gln Arg

180 185 190

Glu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala Leu Ala Arg Phe Ala Gln Glu

195 200 205

Ala Glu Ala Ala Arg Val Asp Leu Gln Lys Lys Ala Gln Ala Leu Gln

210 215 220

Glu Glu Cys Gly Tyr Leu Arg Arg His His Gln Glu Glu Val Gly Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gln Ile Gln Gly Ser Gly Ala Ala Gln Ala Gln Met Gln

245 250 255

Ala Glu Thr Arg Asp Ala Leu Lys Cys Asp Val Thr Ser Ala Leu Arg

260 265 270

Glu Ile Arg Ala Gln Leu Glu Gly His Ala Val Gln Ser Thr Leu Gln

275 280 285

Ser Glu Glu Trp Phe Arg Val Arg Leu Asp Arg Leu Ser Glu Ala Ala

290 295 300

Lys Val Asn Thr Asp Ala Met Arg Ser Ala Gln Glu Glu Ile Thr Glu

305 310 315 320

Tyr Arg Arg Gln Leu Gln Ala Arg Thr Thr Glu Leu Glu Ala Leu Lys

325 330 335

Ser Thr Lys Asp Ser Leu Glu Arg Gln Arg Ser Glu Leu Glu Asp Arg

340 345 350

His Gln Ala Asp Ile Ala Ser Tyr Gln Glu Ala Ile Gln Gln Leu Asp

355 360 365

Ala Glu Leu Arg Asn Thr Lys Trp Glu Met Ala Ala Gln Leu Arg Glu

370 375 380

Tyr Gln Asp Leu Leu Asn Val Lys Met Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala

385 390 395 400

Ala Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Cys Arg Ile Gly Phe Gly

405 410 415

Pro Ile Pro Phe Ser Leu Pro Glu Gly Leu Pro Lys Ile Pro Ser Val

420 425 430

Ser Thr His Ile Lys Val Lys Ser Glu Glu Lys Ile Lys Val Val Glu

435 440 445

Lys Ser Glu Lys Glu Thr Val Ile Val Glu Glu Gln Thr Glu Glu Thr

450 455 460

Gln Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Glu Glu Glu Lys Glu Ala Lys Glu

465 470 475 480

Glu Glu Gly Lys Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Ala Glu Gly

485 490 495

Gly Glu Glu Glu Thr Lys Ser Pro Pro Ala Glu Glu Ala Ala Ser Pro

500 505 510

Glu Lys Glu Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Ala

515 520 525

Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Ala Glu Val

530 535 540

Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Ala Lys Glu Glu Ala Lys Ser

545 550 555 560

Pro Pro Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Ala

565 570 575

Glu Val Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Ala Lys Glu Glu Ala

580 585 590

Lys Ser Pro Ala Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Val

595 600 605

Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Ala Glu Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu

610 615 620

Glu Ala Lys Ser Pro Ala Glu Val Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser

625 630 635 640

Pro Thr Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Glu

645 650 655

Lys Ala Lys Ser Pro Glu Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala

660 665 670

Lys Ser Pro Val Lys Ala Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser

675 680 685

Pro Val Lys Ala Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Val

690 695 700

Lys Glu Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu

705 710 715 720

Glu Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu Glu Ala

725 730 735

Lys Thr Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu Glu Ala Lys Ser

740 745 750

Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Glu Lys Ala Lys Thr Leu Asp Val Lys

755 760 765

Ser Pro Glu Ala Lys Thr Pro Ala Lys Glu Glu Ala Arg Ser Pro Ala

770 775 780

Asp Lys Phe Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Val Lys Glu Glu Val Lys

785 790 795 800

Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ser Pro Leu Lys Glu Asp Ala Lys Ala Pro

805 810 815

Glu Lys Glu Ile Pro Lys Lys Glu Glu Val Lys Ser Pro Val Lys Glu

820 825 830

Glu Glu Lys Pro Gln Glu Val Lys Val Lys Glu Pro Pro Lys Lys Ala

835 840 845

Glu Glu Glu Lys Ala Pro Ala Thr Pro Lys Thr Glu Glu Lys Lys Asp

850 855 860

Ser Lys Lys Glu Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ala Pro Lys Pro Lys Val

865 870 875 880

Glu Glu Lys Lys Glu Pro Ala Val Glu Lys Pro Lys Glu Ser Lys Val

885 890 895

Glu Ala Lys Lys Glu Glu Ala Glu Asp Lys Lys Lys Val Pro Thr Pro

900 905 910

Glu Lys Glu Ala Pro Ala Lys Val Glu Val Lys Glu Asp Ala Lys Pro

915 920 925

Lys Glu Lys Thr Glu Val Ala Lys Lys Glu Pro Asp Asp Ala Lys Ala

930 935 940

Lys Glu Pro Ser Lys Pro Ala Glu Lys Lys Glu Ala Ala Pro Glu Lys

945 950 955 960

Lys Asp Thr Lys Glu Glu Lys Ala Lys Lys Pro Glu Glu Lys Pro Lys

965 970 975

Thr Glu Ala Lys Ala Lys Glu Asp Asp Lys Thr Leu Ser Lys Glu Pro

980 985 990

Ser Lys Pro Lys Ala Glu Lys Ala Glu Lys Ser Ser Ser Thr Asp Gln

995 1000 1005

Lys Asp Ser Lys Pro Pro Glu Lys Ala Thr Glu Asp Lys Ala Ala

1010 1015 1020

Lys Gly Lys

1025

Claims

1.在诊断上有用的载体，其包含用于捕获神经颗粒蛋白的片段的工具，用于捕获BACE1的工具，和任选地，用于捕获一种或多种另外的生物标志物的工具，其中所述用于捕获BACE1的工具为抗体或适体，并且所述用于捕获神经颗粒蛋白的片段的工具为特异性地结合神经颗粒蛋白的在C-末端处经截短的片段的抗体或适体，所述神经颗粒蛋白的在C-末端处经截短的片段包含至少SEQ ID NO:4，但缺乏全长神经颗粒蛋白的三个C-末端残基，即S76、G77和D78，其中所述抗体或适体不结合全长神经颗粒蛋白。

2.包含根据权利要求1的载体的试剂盒。

3.根据权利要求2的试剂盒，其进一步包含用于检测神经颗粒蛋白的工具，用于检测BACE1的工具，和任选地，用于检测所述一种或多种另外的生物标志物的工具。

4.根据权利要求1的载体或根据权利要求2至3中任一项的试剂盒，其中所述用于捕获神经颗粒蛋白的片段的工具和所述用于捕获BACE1的工具是在空间上分开的。

5.根据权利要求4的载体或试剂盒，其中所述在诊断上有用的载体选自包括下列各项的组：珠粒、测试条、微量滴定板、玻璃表面、生物芯片、膜、微阵列和电泳凝胶。

6.根据权利要求5的载体或试剂盒，其中所述在诊断上有用的载体为微量滴定板，其具有包含所述用于捕获神经颗粒蛋白的片段的工具的孔，具有包含所述用于捕获BACE1的工具的孔，和任选地具有一个或多个另外的孔，所述一个或多个另外的孔包含用于捕获所述一种或多种另外的生物标志物的工具，

或者为包含所述用于捕获神经颗粒蛋白的片段的工具的珠粒，和包含所述用于捕获BACE1的工具的珠粒，和任选地一种或多种另外的珠粒，所述一种或多种另外的珠粒包含用于捕获所述一种或多种另外的生物标志物的工具。

7.根据权利要求4的载体或试剂盒，其中所述在诊断上有用的载体为载玻片或亚微米大小的颗粒。

8.一种方法，其包括下列步骤：

(a1)使来自受试者的样品与用于捕获神经颗粒蛋白的片段的工具相接触，

(b1)从所述样品中分离所述用于捕获神经颗粒蛋白的片段的工具，

并且

(a2)使来自受试者的样品与用于捕获BACE1的工具相接触，和

(b2)从所述样品中分离所述用于捕获BACE1的工具，

其中所述用于捕获BACE1的工具为抗体或适体，并且所述用于捕获神经颗粒蛋白的片段的工具为特异性地结合神经颗粒蛋白的在C-末端处经截短的片段的抗体或适体，所述神经颗粒蛋白的在C-末端处经截短的片段包含至少SEQ ID NO:4，但缺乏全长神经颗粒蛋白的三个C-末端残基，即S76、G77和D78，其中所述抗体或适体不结合全长神经颗粒蛋白。

9.根据权利要求8的方法，其进一步包括下列步骤：

(c1)使所述用于捕获神经颗粒蛋白的片段的工具与可检测的结合神经颗粒蛋白的配体相接触，和

10.根据权利要求8至9中任一项的方法，其进一步包括下列步骤：

(d1)检测任何所捕获的神经颗粒蛋白，和

(d2)检测任何所捕获的BACE1。

11.根据权利要求8至9中任一项的方法，其进一步包括下列步骤：

任选地，

(d3)检测任何所捕获的所述一种或多种另外的生物标志物。

12.根据权利要求10的方法，其进一步包括下列步骤：

任选地，

(d3)检测任何所捕获的所述一种或多种另外的生物标志物。

13.根据权利要求1和5至7中任一项的载体、根据权利要求2至3和5至7中任一项的试剂盒或根据权利要求8至9和12中任一项的方法，其中所述一种或多种另外的生物标志物选自包括Abeta42和Abeta40、p-tau、t-tau和神经丝蛋白的组。

14.根据权利要求4的载体或试剂盒，其中所述一种或多种另外的生物标志物选自包括Abeta42和Abeta40、p-tau、t-tau和神经丝蛋白的组。

15.根据权利要求10的方法，其中所述一种或多种另外的生物标志物选自包括Abeta42和Abeta40、p-tau、t-tau和神经丝蛋白的组。

16.根据权利要求11的方法，其中所述一种或多种另外的生物标志物选自包括Abeta42和Abeta40、p-tau、t-tau和神经丝蛋白的组。

17.根据权利要求1、5至7和14中任一项的载体、根据权利要求2至3、5至7和14中任一项的试剂盒或根据权利要求8至9、12和15至16中任一项的方法，其中所述载体、试剂盒或方法适合于通过使用从包括下列各项的组中选择的方法来检测神经颗粒蛋白、BACE1和任选地一种或多种另外的生物标志物：免疫扩散技术；免疫电泳技术；光散射免疫测定法；凝集技术；标记免疫测定法；质谱法；和表面等离子体共振。

18.根据权利要求4的载体或试剂盒，其中所述载体或试剂盒适合于通过使用从包括下列各项的组中选择的方法来检测神经颗粒蛋白、BACE1和任选地一种或多种另外的生物标志物：免疫扩散技术；免疫电泳技术；光散射免疫测定法；凝集技术；标记免疫测定法；质谱法；和表面等离子体共振。

19.根据权利要求13的载体、试剂盒或方法，其中所述载体、试剂盒或方法适合于通过使用从包括下列各项的组中选择的方法来检测神经颗粒蛋白、BACE1和任选地一种或多种另外的生物标志物：免疫扩散技术；免疫电泳技术；光散射免疫测定法；凝集技术；标记免疫测定法；质谱法；和表面等离子体共振。

20.根据权利要求10的方法，其中所述方法适合于通过使用从包括下列各项的组中选择的方法来检测神经颗粒蛋白、BACE1和任选地一种或多种另外的生物标志物：免疫扩散技术；免疫电泳技术；光散射免疫测定法；凝集技术；标记免疫测定法；质谱法；和表面等离子体共振。

21.根据权利要求11的方法，其中所述方法适合于通过使用从包括下列各项的组中选择的方法来检测神经颗粒蛋白、BACE1和任选地一种或多种另外的生物标志物：免疫扩散技术；免疫电泳技术；光散射免疫测定法；凝集技术；标记免疫测定法；质谱法；和表面等离子体共振。

22.根据权利要求17的载体、试剂盒或方法，其中所述标记免疫测定法选自包括下列各项的组：放射性标记免疫测定法、酶免疫测定法、化学发光免疫测定法、荧光免疫测定法和纳米金标记。

23.根据权利要求22的载体、试剂盒或方法，其中所述酶免疫测定法为比色测定法。

24.根据权利要求17的载体、试剂盒或方法，其中所述载体、试剂盒或方法适合于基于夹心式ELISA来检测神经颗粒蛋白、BACE1和任选地一种或多种另外的生物标志物。

25.根据权利要求18至19和22至23中任一项的载体、根据权利要求18至19和22至23中任一项的试剂盒或根据权利要求19至23中任一项的方法，其中所述载体、试剂盒或方法适合于基于夹心式ELISA来检测神经颗粒蛋白、BACE1和任选地一种或多种另外的生物标志物。

26.根据权利要求1和4至5中任一项的载体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断阿尔茨海默病。

27.根据权利要求26的用途，其中所述诊断旨在预测未来认知下降的速率。

28.根据权利要求26至27中任一项的用途，其中所述试剂盒进一步包含用于检测神经颗粒蛋白的工具，用于检测BACE1的工具，和任选地，用于检测所述一种或多种另外的生物标志物的工具。