CN113820298B - 自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器及其制备方法与应用，自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器，包括：肽探针，为可被BACE‑1剪切的肽链，其上标记有荧光团；辅助DNA，其上标记有猝灭剂；以及，金纳米颗粒；其中，金纳米颗粒的表面组装至少一个肽探针和至少一个辅助DNA，辅助DNA与金纳米颗粒的连接端标记有荧光团，肽探针上的荧光团与辅助DNA上的淬灭剂相互接近。辅助DNA与金纳米颗粒的连接端标记有荧光团，使得AuNP表面局部高浓度的荧光团分子引起的内滤效应导致的荧光团自猝灭；荧光团与猝灭剂相互接近，诱导荧光猝灭；AuNP诱导Cy5和AuNP之间通过静态猝灭和FRET的荧光猝灭。以上三种猝灭机制可以保证萤光团完全猝灭，进而实现超猝灭。

Description

自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，属于用于活细胞中BACE-1成像的自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器，具体涉及一种自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器及其制备方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种严重的神经系统疾病，约占人类老年性痴呆的60-70％，其介导的进行性脑退化可导致一系列认知功能障碍，例如学习困难、记忆丧失、判断能力差和定向障碍等。β位淀粉样前体蛋白(APP)裂解酶1(BACE-1)与AD发病机制密切相关，它催化APP裂解生成淀粉样β蛋白(Aβ)，该蛋白具有神经毒性，可导致神经元细胞的死亡和AD的发病。AD患者大脑中的BACE-1水平明显升高，该酶可能是晚发AD的重要生物标志物。此外，抑制BACE-1活性可有效降低Aβs的沉积，甚至恢复认知能力，说明BACE-1可能是AD治疗的重要靶点。因此，开发高效检测BACE-1活性的方法对AD相关生物学研究、诊断和治疗具有重要价值。
传统的基于免疫印迹(WB)和酶联免疫吸附试验(ELISA)的检测方法已被广泛应用于BACE-1的检测，但这些方法只能检测蛋白水平而不能检测BACE-1活性，而且需要多种抗体(如：一抗、二抗)和繁琐的实验程序，不可避免地增加了检测成本和复杂性。另外，电化学方法和表面等离子体共振方法可以检测BACE-1的裂解活性，但它们仍然需要昂贵且不稳定的抗体来识别反应产物，以及结合抗体和在固体表面固定肽底物的复杂程序。荧光法是目前流行的检测BACE-1活性的方法，具有操作简单、灵敏度高、通量高等优点；但也存在有机标记探针溶解性差，以及由于复杂环境下探针不完全猝灭、稳定性差和在整体荧光测量中存在的内滤波效应导致的背景信号高，信噪比低等问题。
金纳米粒子(AuNPs)作为一种最受欢迎的纳米材料，已被广泛应用于基于比色法、电化学、荧光和表面增强拉曼散射检测等多种形式的生物传感领域。AuNP可以很容易地被核酸、多肽和抗体等各种传感探针修饰，而且它的大表面积允许在单个AuNP上装载多个探针，能显著放大目标信号。特别的是，AuNP能够通过静态猝灭和荧光共振能量转移(FRET)猝灭其表面的荧光基团，促进了以AuNP为基石的各种荧光猝灭纳米探针的发展。然而，发明人发现，荧光基团与AuNP表面之间的距离会明显影响荧光猝灭的效率，在某些情况下，AuNPs甚至可以通过金属增强荧光(MEF)增强相邻荧光团的荧光信号，这些因素往往会导致较高的背景信号，从而影响分析的准确性和灵敏度。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器及其制备方法与应用，该纳米传感器具有高选择性和灵敏度，可用于准确检测体外和活细胞中BACE-1活性，能够在体外和活细胞中近零背景检测BACE-1活性。
为解决以上技术问题，本发明的以下一个或多个实施例提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器，包括：
肽探针，为可被BACE-1剪切的肽链，其上标记有荧光团；
辅助DNA，其上标记有猝灭剂；
以及，金纳米颗粒；
其中，金纳米颗粒的表面组装至少一个肽探针和至少一个辅助DNA，辅助DNA与金纳米颗粒的连接端标记有荧光团，肽探针上的荧光团与辅助DNA上的淬灭剂相互接近。
第二方面，本发明提供所述自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器在检测BACE-1活性中的应用，尤其在检测活细胞中BACE-1活性中的应用。
第三方面，本发明提供一种检测BACE-1活性的试剂盒，包括所述自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器。
第四方面，本发明提供采用所述自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器检测BACE-1的方法，包括如下步骤：
将含有BACE-1的待测样品加入至自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器检测体系中孵育反应设定时间；
然后，对Cy5的荧光信号进行检测，以定量检测待测样品中的BACE-1。
其中，采用全内角反射荧光技术(TIRF)的单分子成像系统对Cy5的荧光信号进行检测，以定量检测待测样品中的BACE-1。
第五方面，本发明提供所述自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器在检测BACE-1活性中的应用，尤其在检测活细胞中BACE-1活性中的应用。
采用所述自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器检测BACE-1活性的原理为：辅助DNA与金纳米颗粒的连接端标记有荧光团，使得AuNP表面局部高浓度的荧光团分子引起的内滤效应导致的荧光团自猝灭；荧光团与猝灭剂相互接近，诱导荧光猝灭；AuNP诱导Cy5和AuNP之间通过静态猝灭和FRET的荧光猝灭。以上三种猝灭机制可以保证萤光团完全猝灭，进而实现超猝灭，提高目标物质检测的准确性和灵敏度。
与现有技术相比，本发明的以上一个或多个技术方案取得了以下有益效果：
1.本发明制备得到的纳米传感器通过将多个探针组装到单个AuNP上，提高了探针密度和BACE-1解离效率，整个过程避免了复杂的检测设计和繁琐的信号放大步骤，同时利用单分子检测技术分析时间短，样品消耗少的优点，提高了检测的简便性；
2.本发明充分利用了单分子检测的高信噪比以及超猝灭纳米传感器的近零背景信号，实现对靶标的高灵敏度检测，检测限为2.648×10-13摩尔每升，与量子点荧光分析和肽核酸芯片分析相比，该纳米传感器的灵敏度提高了3个数量级，所提出金纳米颗粒纳米传感器实现高选择性以及高灵敏度检测BACE-1，即使在复杂样品中也能以极低的样品消耗和高信噪比实现单个目标分子的可视化和检测；
3.本发明还可以进一步应用于在活细胞中检测BACE-1，而且可用于抑制试验和动力学分析，并可轻易转移到活细胞中实时成像内源性BACE-1活性，在与BACE-1相关的生物医学研究和临床诊断中具有广阔前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例的用于活细胞中BACE-1成像的自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器示意图。
图2中，(A)为BACE-1催化肽底物裂解的PAGE分析图，肽底物的浓度为4微摩尔每升；
(B)为裸AuNPs的TEM分析图，比例尺为100纳米；
(C)为金纳米颗粒纳米探针的TEM分析图，比例尺为100纳米；
(D)为裸AuNP(黑色)和AuNP纳米探针(红色)的紫外-可见光谱图；
(E)为不同条件下的荧光光谱图，包括肽/DNA@AuNP+DTT(红线)、肽@AuNP+DTT(蓝线)、肽@AuNP(绿线)、肽/DNA@AuNP(黑线)，实验采用直径为20纳米的金纳米颗粒和100毫摩尔每升的DTT。
图3中，(A)为不存在和存在(对照)BACE-1的Cy5的单分子图像，比例尺为100纳米；
(B)为有和没有(对照)BACE-1时Cy5点数随反应时间的变化对比图；
(C)为肽@AuNP和肽/DNA@AuNP纳米探针加或不加(对照)BACE-1时的Cy5点数；
(D)有或没有(对照)BACE-1时Cy5点数随反应温度的变化，BACE-1的浓度为1微摩尔每升。
图4中，(A)为Cy5点数随BACE-1浓度的变化图，该图显示了Cy5点数与BACE-1浓度从0.1到5×10-10摩尔每升的校准曲线；
(B)为该纳米传感器分别对0.1U/mL ALP、0.1U/mL ExoⅢ、0.1U/mL UDG、0.1U/mLM.SssI、0.1U/mL胰蛋白酶、1微摩尔每升BACE-1和不含任何酶的对照组响应的Cy5点数，误差棒代表三次实验的标准偏差。
图5中，(A)为BACE-1相对活性随BACE-1抑制剂IV浓度的变化图。(B)为初始速度随纳米探针浓度的变化趋势图。
图6中，(A)为该纳米传感器分别对不含细胞裂解液的对照组(左侧柱)、BACE-1过表达HEK293细胞裂解液+BACE-1抑制剂IV(中间柱)和BACE-1过表达HEK293细胞裂解液(右侧柱)响应的Cy5点数；实验使用0.2毫克每升细胞裂解液和4×10-7摩尔每升抑制剂，误差棒代表三次实验的标准偏差。
图7中，不同条件下的HeLa细胞中BACE-1活性成像，包括未转染-纳米探针(A)、未转染+纳米探针(B)、转染+纳米探针+抑制剂(C)和转染+纳米探针(D)，比例尺是5微米。(E)每个细胞对不同条件的荧光强度。第1组，未转染-纳米探针；第2组，未转染+纳米探针；第3组，转染+纳米探针+抑制剂；第4组，转染+纳米探针。(F)未转染、转染+抑制剂、转染等不同条件下的O.D.值变化情况。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中对检测BACE-1的方法普遍存在过程繁琐，需要昂贵且不稳定的酶催化信号放大、检测灵敏度低等缺点。
为解决以上问题，第一方面，本发明提供一种自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器，包括：
肽探针，为可被BACE-1剪切的肽链，其上标记有荧光团；
辅助DNA，其上标记有猝灭剂；
以及，金纳米颗粒；
其中，金纳米颗粒的表面组装至少一个肽探针和至少一个辅助DNA，辅助DNA与金纳米颗粒的连接端标记有荧光团，肽探针上的荧光团与辅助DNA上的淬灭剂相互接近。
辅助DNA与金纳米颗粒的连接端标记有荧光团，使得AuNP表面局部高浓度的荧光团分子引起的内滤效应导致的荧光团自猝灭；荧光团与猝灭剂相互接近，诱导荧光猝灭；AuNP诱导Cy5和AuNP之间通过静态猝灭和FRET的荧光猝灭。以上三种猝灭机制可以保证萤光团完全猝灭，进而实现超猝灭，提高目标物质检测的准确性和灵敏度。
在一些实施方式中，所述肽探针长度为9.96纳米，其序列为：CSEVNLDAEFRK。
优选的，所述肽探针的半胱氨酸残基C上含有巯基。
在该传感探针中，选用瑞典APP突变片段(SEVNLDAEFR)而不是野生型APP片段(SEVKMDAEFR)作为BACE-1底物，因为它可以被BACE-1剪切，而且剪切效率比野生型更高。此外，含有巯基(SH)的半胱氨酸残基(C)使肽探针通过Au-S键与AuNP表面结合，而含有氨基的赖氨酸(K)残基可以通过Cy5羧基与肽胺基的缩合反应促进Cy5基团的标记。为了避免不完全猝灭，在5'端引入了含有暗猝灭剂2(BHQ2)的辅助DNA。该纳米传感器的猝灭效率(QE)高达98.37％。
在一些实施方式中，所述辅助DNA的碱基序列为：5'-Cy5-SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-BHQ2-3'。
进一步的，所述猝灭剂为标记暗猝灭剂2(BHQ2)。
在一些实施方式中，所述金纳米颗粒的直径为15-25纳米，优选为20nm。此处的金纳米颗粒可以从Nanacs公司(美国纽约)购买。
在一些实施方式中，肽探针和辅助DNA通过Au-S键自组装在金纳米颗粒表面。
第二方面，本发明提供所述自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器在检测BACE-1活性中的应用，尤其在检测活细胞中BACE-1活性中的应用。
第三方面，本发明提供一种检测BACE-1活性的试剂盒，包括所述自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器。
在一些实施例中，所述试剂盒中还包括缓冲液，缓冲液为乙酸钠溶液，其浓度为0.05-0.2mol/L，尤其为0.1mol/L，其pH值为4。
第四方面，本发明提供采用所述自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器检测BACE-1的方法，包括如下步骤：
将含有BACE-1的待测样品加入至自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器检测体系中孵育反应设定时间；
然后，对Cy5的荧光信号进行检测，以定量检测待测样品中的BACE-1。
其中，采用全内角反射荧光技术(TIRF)的单分子成像系统对Cy5的荧光信号进行检测，以定量检测待测样品中的BACE-1。
在一些实施例中，孵育反应的温度为40-45℃，时间为2-4小时。
第五方面，本发明提供所述自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器在检测BACE-1活性中的应用，尤其在检测活细胞中BACE-1活性中的应用。
所述纳米传感器检测BACE-1活性的原理为：C端以Cy5标记的肽段CSEVNLDAEFRK设计为传感探针，在该传感探针中，选用瑞典APP突变片段(SEVNLDAEFR)而不是野生型APP片段(SEVKMDAEFR)作为BACE-1底物，因为它可以被BACE-1剪切，而且剪切效率比野生型更高。此外，含有巯基(SH)的半胱氨酸残基(C)使肽探针通过Au-S键与AuNP表面结合，而含有氨基的赖氨酸(K)残基可以通过Cy5羧基与肽胺基的缩合反应促进Cy5基团的标记。根据相邻的氨基酸之间的距离为0.83纳米，确定多肽探针的长度为9.96纳米，因此由于AuNP和Cy5的空间分离将会导致Cy5的不完全猝灭。为了避免不完全猝灭，在5'端引入了标记暗猝灭剂2(BHQ2)的辅助DNA。辅助DNA由30个胸腺嘧啶碱基(T30)组成，根据相邻DNA碱基之间的距离为0.34纳米，其长度为10.2纳米。肽探针和辅助DNA通过稳定的Au-S键自组装在AuNP表面，获得金纳米颗粒纳米探针，每个AuNP上装载的肽探针和辅助DNA数量分别为85和40。在这个纳米探针中，因为肽探针(9.96纳米)和辅助DNA(10.2纳米)的长度相同，所以Cy5和BHQ2相互接近。金纳米颗粒纳米探针的荧光猝灭有以下三种机制：(1)由于AuNP表面局部高浓度的Cy5分子引起的内滤效应导致的Cy5自猝灭；(2)BHQ2通过Cy5和BHQ2之间的FRET诱导荧光猝灭；(3)AuNP诱导Cy5和AuNP之间通过静态猝灭和FRET的荧光猝灭。经过BACE-1处理后，肽探针被切割成两部分(CSEVNL和DAEFRK-Cy5)，Cy5分子与BHQ2和AuNP分离，Cy5荧光信号恢复，易于单分子计数检测。与需要多抗体的传统免疫检测方法相比，该方法只需要一个纳米探针，一步反应，不需要任何抗体和洗涤步骤。此外，纳米探针可以很容易地转移到活细胞中，实时成像内源性BACE-1活性。
下面结合实施例作进一步具体说明。
实施例1
金纳米颗粒纳米探针的制备：采用典型的盐老化法制备AuNP纳米探针，将肽探针(CSEVNLDAEFRK，氨基酸序列详见SEQ ID NO.1)和辅助DNA(Cy5-SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-BHQ2，核苷酸序列详见SEQ ID NO.2)加入1毫升的AuNP溶液(7.0×1011颗粒每毫升)中，置于含0.1％Tween 20的PBS缓冲液(10毫摩尔每升磷酸盐溶液(NaH2PO4/Na2HPO4)，pH 7.4)中孵育。室温孵育20分钟后，24小时内逐步提高NaCl浓度至0.3摩尔每升，再在4℃孵育24小时，完成功能化反应。将该溶液在12000g转速下离心3次，每次15分钟，去除未结合的肽探针和辅助DNA，再重悬于60微升PBS缓冲液(10毫摩尔每升磷酸盐溶液，0.3摩尔每升NaCl,pH 7.4)中，4℃保存。
金纳米颗粒纳米传感器检测BACE-1：将5微升金纳米颗粒纳米探针和1微升指定浓度的BACE-1混合在10微升反应缓冲液(0.1摩尔每升乙酸钠，pH4)中，42℃孵育3小时以完成裂解反应。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：探针自组装产物用12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，电泳缓冲液为1×TBE缓冲液(9毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 7.9，9毫摩尔每升的硼酸，0.2毫摩尔每升的乙二胺四乙酸)。上样后在110伏特恒定电压下电泳60分钟。最后通过ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)进行凝胶成像分析。
荧光测量：50微升反应产物在FLS-1000荧光光谱仪(英国利文斯顿爱丁堡仪器有限公司)上使用痕量石英比色皿测量。激发波长为640纳米，测量650纳米至750纳米范围内的发射光谱，激发和发射的狭缝宽度分别为9纳米和7纳米。
单分子检测及数据分析：在单分子检测之前，首先将反应产物用1×成像缓冲溶液(10毫摩尔每升Tris-盐酸，pH 8.0，50毫摩尔每升氯化钾，1毫摩尔每升水溶性维生素E，5毫摩尔每升氯化镁)稀释150倍。然后直接将10微升样品滴到盖玻片上进行全内反射荧光单分子成像。使用红色640纳米激光源(50毫瓦,Coherent,USA)激发Cy5，通过100×物镜(Olympus，Japan)收集Cy5产生的光子，最后用AndorIxon DU897EMCCD相机以500毫秒的曝光时间成像。使用image J软件选择500×500像素大小的图像区域进行Cy5荧光团的单分子计数。
活细胞成像：转染前，将人宫颈癌细胞系(HeLa)细胞置于20毫米玻璃底细胞培养皿中，并在含10％胎牛血清(FBS)的1％双抗的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)培养基中培养过夜。贴壁细胞用1×PBS清洗一次。根据制造商的说明，使用LipofectamineTM3000试剂进行转染检测。简单地说，7.5微升LipofectamineTM3000稀释到250微升Opti-MEM中；2微升质粒(0.1克每升)和10微升P3000TM稀释到250微升的Opti-MEM中。将上述两种溶液混合，室温孵育15分钟，制备Opti-MEM转染混合物。细胞与Opti-MEM转染混合物在37℃含5％CO2的培养箱中培养5小时，然后在含10％胎牛血清的DMEM培养基中孵育过夜。转染后用1×PBS洗涤3次。抑制实验:将转染后的细胞置于含有35微摩尔每升BACE-1抑制剂IV的Opti-MEM培养基中培养30分钟。为了将金纳米颗粒纳米探针转移到活细胞中，将细胞在含有10微升纳米探针(0.2纳摩尔每升)的500微升Opti-MEM的培养基中培养2小时。细胞成像前，用1×PBS冲洗细胞5次。细胞荧光图像在倒置的Olympus IX71显微镜(Olympus,Japan)上10×物镜下获得。
酶联免疫吸附测定：使用动物细胞活性蛋白提取试剂盒HeLa细胞中提取含BACE-1的总蛋白。使用人β-位点APP裂解酶1(BACE-1)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒对获得的上清液进行分析。采用Rayto RT-6100酶标仪(深圳，中国)在450纳米波长下测定光密度(O.D.值)。
实施例2
原理的实验验证
本发明技术方案原理：C端以Cy5标记的肽段(CSEVNLDAEFRK)设计为传感探针，在该传感探针中，选用瑞典APP突变片段(SEVNLDAEFR)而不是野生型APP片段(SEVKMDAEFR)作为BACE-1底物，因为它可以被BACE-1剪切，而且剪切效率比野生型更高。此外，含有巯基(SH)的半胱氨酸残基(C)使肽探针通过Au-S键与AuNP表面结合，而含有氨基的赖氨酸(K)残基可以通过Cy5羧基与肽胺基的缩合反应促进Cy5基团的标记。根据相邻的氨基酸之间的距离为0.83纳米，确定多肽探针的长度为9.96纳米，因此由于AuNP和Cy5的空间分离将会导致Cy5的不完全猝灭。为了避免不完全猝灭，在5'端引入了标记暗猝灭剂2(BHQ2)的辅助DNA。辅助DNA由30个胸腺嘧啶碱基(T30)组成，根据相邻DNA碱基之间的距离为0.34纳米，其长度为10.2纳米。肽探针和辅助DNA通过稳定的Au-S键自组装在AuNP表面，获得AuNP纳米探针，每个AuNP上装载的肽探针和辅助DNA数量分别为85和40。在这个纳米探针中，因为肽探针(9.96纳米)和辅助DNA(10.2纳米)的长度相同，所以Cy5和BHQ2相互接近。金纳米颗粒纳米探针的荧光猝灭有以下三种机制：(1)由于AuNP表面局部高浓度的Cy5分子引起的内滤效应导致的Cy5自猝灭；(2)BHQ2通过Cy5和BHQ2之间的FRET诱导荧光猝灭；(3)AuNP诱导Cy5和AuNP之间通过静态猝灭和FRET的荧光猝灭。经过BACE-1处理后，肽探针被切割成两部分(CSEVNL和DAEFRK-Cy5)，Cy5分子与BHQ2和AuNP分离，Cy5荧光信号恢复，易于单分子计数检测。与需要多抗体的传统免疫检测方法相比，该方法只需要一个纳米探针，一步反应，不需要任何抗体和洗涤步骤。此外，纳米探针可以很容易地转移到活细胞中，实时成像内源性BACE-1活性。
本发明选择BACE-1作为模型靶标以验证所提出的金纳米颗粒纳米传感器的可行性。首先利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)研究了该方法的可行性。BACE-1在阿尔茨海默病发病机制中发挥着关键作用，被认为是阿尔茨海默病诊断和治疗的有价值的生物标志物。肽探针与靶标BACE-1孵育后，对反应产物进行凝胶电泳，然后直接通过激发Cy5荧光成像。如图2A所示，在没有BACE-1(对照)的情况下，存在一个清晰完整的肽探针带。经过BACE-1处理后，肽探针带强度减弱，同时出现迁移速度变慢的剪切探针新带。由于完整肽探针的等电点(pH 4.68)低于裂解产物(pH 6.07)，因此完整肽探针在电泳缓冲液(TAE，pH 8.0)中的电泳迁移率高于裂解产物。这些结果很好地证明了肽探针在BACE-1检测中的适用性。透射电子显微镜(TEM)实验显示，裸AuNP(图2B)和AuNP纳米探针(图2C)的直径都在20纳米左右。与裸AuNPs相比(图2D，下方线)，AuNP纳米探针表现出红移的紫外-可见吸收带，这是由于探针连接引起的粒径分布、粒子聚集状态和局部介质环境的变化引起的(图2D，上方线)，在260纳米处观察到DNA的特征吸收峰，在280纳米处观察到肽的特征吸收峰，表明AuNP与肽探针和辅助DNA成功功能化。荧光测量表明，所提出的纳米探针具有可忽略的背景荧光(图2E，最下方黑线)，随着二硫苏糖醇(DTT)的加入，可以通过配体交换过程从AuNP表面释放硫代探针(即肽探针)，在670纳米处产生了一个强的Cy5荧光发射特征波长峰。根据式1估算猝灭效率(QE)为98.37％。
其中Fd和F分别表示有无DTT时的荧光强度。通过将荧光团标记的肽探针和猝灭剂标记的辅助DNA组装在AuNP表面(肽/DNA@AuNP)，制备出超猝灭金纳米颗粒纳米探针。传统的金纳米颗粒探针是只在AuNP表面组装荧光团标记的传感探针，制备不加辅助DNA的传统肽@AuNP纳米探针，虽然肽@AuNP的荧光恢复信号(图2E，荧光强度(FL)＝10732)和肽/DNA@AuNP(图1E、红线、FL＝11113)相似，但是肽@AuNP的背景信号(图2E，FL＝1823)远高于肽/DNA@AuNP(图2E，FL＝181)，表明肽@AuNP猝灭效率较低，猝灭效率为83.01％。结果证明了超猝灭金纳米颗粒纳米探针的成功制备。
单分子荧光检测方法优于传统的整体平均荧光检测方法，可以消除内滤波效应，即使在复杂样品中也能以极低的样品消耗和高信噪比实现单个目标分子的可视化和检测。因此采用单分子检测来测量BACE-1衍生的Cy5信号。如图3A所示，在640纳米激发下，1微摩尔每升BACE-1处理后产生明显的Cy5信号，而没有BACE-1的对照组则没有Cy5信号。时间过程实验显示，Cy5点数随反应时间从0到180分钟增加，然后趋于平稳，而对照组的信号保持不变(图3B)，值得注意的是，近零的背景信号使得高信噪比(S/N)为107.4(图3C)。相反，肽@AuNP组背景信号明显升高，信噪比为5.77。结果表明，所提出的超猝灭纳米传感器能够对BACE-1进行高信噪比的灵敏检测。此外，还研究了反应温度对测定性能的影响，Cy5信号随着反应温度的升高而增强，在42℃时达到最大值，超过42℃后减弱，而对照组信号保持不变，表明该纳米传感器在不同温度下表现出良好的检测性能；在47℃时，对照组信号增加，因为高温可能会抑制酶的活性，通过破坏Au-S键，诱导探针与AuNP表面分离，导致反应效率降低，背景信号增加。结果表明，该纳米传感器可用于单分子水平的BACE-1检测。
灵敏度分析
在优化的实验条件下，进一步通过测量不同BACE-1浓度下的Cy5点数来测试纳米传感器的灵敏度。随着BACE-1浓度从0增加到1微摩尔每升,Cy5点数不断增加(图4A)。得到了在0.1～50纳摩尔每升范围内Cy5点数与BACE-1浓度之间的校准曲线(图4A的插图)，回归方程为N＝23.75+21.09log10C(R2＝0.9988)，其中N为Cy5点数，C为BACE-1的浓度(纳摩尔每升)。通过对空白信号的平均值加上3倍标准差计算出检测限为26.48皮摩尔每升。与量子点荧光分析(0.15微摩尔每升)和肽核酸芯片分析(0.1微摩尔每升)相比，该纳米传感器的灵敏度提高了3个数量级。其优异的灵敏度可归因于：(1)超猝灭纳米探针的近零背景；(2)通过将多个探针组装到单个AuNP上，提高了探针密度和BACE-1解离效率；(3)单分子检测固有的灵敏度。值得注意的是，与传统的免疫检测方法相比，这种纳米传感器只涉及通过简单的自组装和简单的一步反应获得的单个纳米探针，不需要任何抗体和分离步骤。综上说明该技术方案的灵敏度足够高。
特异性分析
还使用碱性磷酸酶(ALP)、外切酶Ⅲ(ExoⅢ)、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和CpG甲基转移酶(M.SssI)等干扰酶作为阴性对照，评估纳米传感器的特异性。碱性磷酸酶是从含磷酸酯的磷酸化底物中去除磷酸基。ExoⅢ是从dsDNA的3'羟基端切割单核苷酸。UDG是从含尿嘧啶的dsDNA和ssDNA中释放游离尿嘧啶。M.SssI是在dsDNA中甲基化胞嘧啶碱基，识别序列为5'…CG…3'。理论上，这些酶都不能通过切割肽探针和DNA来恢复纳米探针的荧光信号。如图4B所示，靶蛋白BACE-1存在时，Cy5信号高；而ALP、ExoⅢ、UDG、M.SssI反应时，Cy5信号底，与不含任何酶的对照组相同。由此表明，本技术方案所提出的生物传感器具有高特异性。
抑制剂分析
使用BACE-1抑制剂IV来研究纳米传感器对BACE-1抑制剂检测的适用性。BACE-1抑制剂IV含有一个羟乙胺基序，可以结合BACE-1活性位点阻断其蛋白水解活性。随着BACE-1抑制剂IV浓度从2纳摩尔每升增加到500纳摩尔每升，BACE-1的相对活性呈剂量依赖性降低。IC50值为26.03纳摩尔每升，与基于喷墨打印的荧光分析得到的IC50值(18.0纳摩尔每升)相似。IC50值表示能够降低50％BACE-1活性的抑制剂浓度。这些结果表明本技术方案所提出的生物传感器可以用于BACE-1抑制剂的筛选，在抗阿尔茨海默病药物的开发中具有很大的潜力。
动力学分析
进一步将纳米传感器应用于BACE-1动力学分析(图5B)。测量了不同浓度纳米探针的初始速度(V)，并符合Michaelis-Menten方程2。
其中Vmax为最大初速度，[S]为纳米探针浓度，Km为Michaelis–Menten常数。在0～12纳摩尔每升范围内，随着肽底物浓度的增加，初始速度增强。Vmax为38.71min-1,Km为12.47纳摩尔每升。这些结果表明本技术方案所提出的生物传感器可以用于动力学分析。
实际样品分析
进一步测量了BACE-1在细胞裂解液中的活性(图6A)。与不含任何细胞裂解液的对照组的近零背景信号(图6A，左侧柱)相比，BACE-1过表达的HEK293细胞裂解液产生了明显的Cy5信号(图6A，右侧柱)，而BACE-1抑制剂IV的加入进一步降低了Cy5信号(图6A，中间柱)。此外，Cy5信号随着细胞裂解液浓度从0到0.6纳克每微升的增加而增强，Cy5点数与BACE-1过表达的HEK293细胞裂解液浓度在0.0001到0.03纳克每微升范围内呈线性相关(图6B)。相应的线性方程为N＝99.64+20.897log10C(R2＝0.9958)，其中N为Cy5点数，C为细胞裂解液浓度，计算出检出限为22.76飞克每微升。这些结果清楚地表明，所提出的金纳米颗粒纳米传感器可以准确地检测真实生物样品中的内源性BACE-1活性。
对HeLa细胞内源性BACE-1活性成像分析
进一步利用所提出的纳米传感器对HeLa细胞内源性BACE-1活性进行成像。在未转染HeLa细胞的对照组中，当AuNP纳米探针缺失时，没有产生荧光信号(图7A)，而金纳米颗粒纳米探针转染HeLa细胞时，产生微弱的荧光信号(图7B)，说明HeLa细胞中BACE-1水平极低。相反，当用BACE-1质粒转染HeLa细胞时，Cy5信号显著增强(图7D)。值得注意的是，转染了BACE-1抑制剂IV后，Cy5信号下降了78.74％(图7C，7E)，表明抑制剂IV有效地抑制了细胞内BACE-1活性。ELISA检测相应细胞裂解液中BACE-1的活性进一步证实了这些结果(图7F)。与未转染细胞的低光密度(O.D.)值相比，转染了BACE-1质粒的细胞产生了较高的O.D.值，但转染了BACE-1抑制剂IV的细胞孵育后O.D.值降低。结果表明，金纳米颗粒纳米传感器可用于活细胞中BACE-1活性的实时成像。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器及其制备方法与应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Cys Ser Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Arg Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tttttttttt tttttttttt tttttttttt 30

Claims (13)

1.一种自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器，其特征在于：包括：
肽探针，为可被BACE-1剪切的肽链，其上标记有荧光团；
辅助DNA，其上标记有猝灭剂；
以及，金纳米颗粒；
其中，金纳米颗粒的表面组装至少一个肽探针和至少一个辅助DNA，辅助DNA与金纳米颗粒的连接端标记有荧光团，肽探针上的荧光团与辅助DNA上的淬灭剂相互接近；
所述肽探针的氨基酸序列为：CSEVNLDAEFRK；
所述辅助DNA的碱基序列为：5'-Cy5-SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-BHQ2-3'。
2.根据权利要求1所述的自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器，其特征在于：所述肽探针的半胱氨酸残基C上含有巯基。
3.根据权利要求1所述的自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器，其特征在于：所述猝灭剂为标记暗猝灭剂2。
4.根据权利要求1所述的自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器，其特征在于：所述金纳米颗粒的直径为15-25纳米。
5.根据权利要求4所述的自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器，其特征在于：所述金纳米颗粒的直径为20nm。
6.根据权利要求1所述的自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器，其特征在于：肽探针和辅助DNA通过Au-S键自组装在金纳米颗粒表面。
7.一种检测BACE-1活性的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-6任一所述自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：其中还包括缓冲液，缓冲液为乙酸钠溶液，其浓度为0.05-0.2mol/L。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述浓度为0.1mol/L。
10.采用权利要求1-6任一所述自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器检测BACE-1的方法，其特征在于：包括如下步骤：
将含有BACE-1的待测样品加入至自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器检测体系中孵育反应设定时间；
然后，对Cy5的荧光信号进行检测，以定量检测待测样品中的BACE-1。
11.根据权利要求10所述的检测BACE-1的方法，其特征在于：孵育反应的温度为40-45℃，时间为2-4小时。
12.权利要求1-6任一所述自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器在检测BACE-1活性中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述应用为在检测活细胞中BACE-1活性中的应用。
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