CN116297376B - 一种光电双模式生物探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种光电双模式生物探针及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种光电双模式生物探针，所述光电双模式生物探针为均相生物探针，包括生物识别元件、电化学标记物以及荧光标记物；所述电化学标记物和荧光标记物连接在生物识别元件上。所述光电双模式生物探针断裂前后，荧光信号和电信号均有着较大差异，因此，可以将所述光电双模式生物探针应用到生物医学检测领域，通过改变所述光电双模式生物探针的完整度，满足“一个体系，多种信号响应”这一需求，进而在依托“生物识别”开启“信号产出”的同时，通过电信号、光信号的双模式响应进一步提升检测中的灵敏度和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及一种光电双模式生物探针及其应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
生物检测监测是临床检验、食品安全、违禁筛查、生物安全等领域的重要技术支撑，其核心是依托生物检测监测技术明确密切关注的特定蛋白、核酸、细菌、细胞、化学分子是否存在及具体浓度。生物探针是生物检测监测技术的核心，其依托生物探针的“生物识别”对靶标进行特异性的甄别，依托生物探针的“信号产出”将靶标是否存在及相关浓度以可以量化测量的光电磁等信号予以直观展示。
现有生物探针就“信号产出”而言，通常为单一模式信号响应型，按信号响应方式可分为颜色探针、荧光信号探针、电信号探针、磁信号探针等。现有生物探针就“生物识别”而言，通常可分为抗体探针、核酸探针、分子探针等。现有生物探针就“生物识别”后的“信号产出”方式而言，通常可分为非均相型生物探针和均相型生物探针，其中，非均相型生物探针的“信号产出”与“生物识别”是否发生没有相关性，因而在检测过程中需要依托清洗，达到将“未发生生物识别，但有信号产出”游离生物探针进行分离的目的，而均相型生物探针的“信号产出”有赖于特定的“生物识别”发生，因而无需增加清洗与分离等操作步骤。
但是，均相生物探针在带来操作步骤简便快速的同时，存在检测中灵敏度低、特异性低和信噪比差的问题，限制了该技术的发展。因此，亟需找到一种灵敏度高、特异性强且信噪比好的均相生物探针以用于生物检测监测。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种光电双模式生物探针，所述光电双模式生物探针为均相生物探针，包括生物识别元件、电化学标记物以及荧光标记物；所述电化学标记物和荧光标记物连接在生物识别元件上。
在本发明的一种实施方式中，所述生物识别元件通过发生结构变化、长短变化或完整性变化，开启电化学标记物的电信号以及荧光标记物的光信号，并且，所述电化学标记物以及荧光标记物在生物识别元件未发生结构变化、长短变化或完整性变化时，互相拮抗或与生物识别元件拮抗，而无法产生可测量的信号。
在本发明的一种实施方式中，所述电化学标记物和荧光标记物的单位长度大于或等于生物识别元件的1个组成单位长度。
在本发明的一种实施方式中，所述生物识别元件包括分子链；所述分子链包括核酸链、蛋白质链或多肽链中的至少一种；所述核酸链包括DNA链、RNA链或DNA/RNA掺杂链中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述生物识别元件为核酸链；所述核酸链的长度为3~23bp。
在本发明的一种实施方式中，所述核酸链的长度为20bp。
在本发明的一种实施方式中，所述核酸链通过被RNA酶或Cas蛋白切割，发生结构变化、长短变化或完整性变化，进而开启电化学标记物的电信号以及荧光标记物的光信号。
在本发明的一种实施方式中，所述Cas蛋白包括Cas13a蛋白、Cas12a蛋白、Cas12b蛋白或Cas14蛋白中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述电化学标记物包括亚甲基蓝族类化合物、二茂铁族类化合物或道诺霉素族类化合物中的至少一种；所述亚甲基蓝族类化合物包括亚甲基蓝、亚甲基蓝衍生物或亚甲基蓝修饰物中的至少一种；所述二茂铁族类化合物包括二茂铁、二茂铁衍生物或二茂铁修饰物中的至少一种；所述道诺霉素族类化合物包括道诺霉素、道诺霉素衍生物或道诺霉素修饰物中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述电化学标记物连接在生物识别元件的末端或中间。
在本发明的一种实施方式中，所述电化学标记物通过碳链连接在生物识别元件的末端或中间。
在本发明的一种实施方式中，所述荧光标记物包括荧光素类荧光标记物、罗丹明类荧光标记物、菁染料类荧光标记物或香豆素类荧光标记物中的至少一种；所述荧光素类荧光标记物包括荧光素异硫氰酸、四氯荧光素或羟基荧光素中的至少一种；所述罗丹明类荧光标记物包括罗丹明B、罗丹明6G或罗丹明101中的至少一种；所述菁染料类荧光标记物包括Cy5、Cy7或Cy7.5中的至少一种；所述香豆素类荧光标记物包括AMCA、AFC或AMC中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述荧光标记物连接在生物识别元件的末端或中间。
在本发明的一种实施方式中，所述荧光标记物通过碳链连接在生物识别元件的末端或中间。
本发明还提供了一种靶标物检测试剂盒，所述靶标物检测试剂盒包括上述光电双模式生物探针以及切割组件；所述切割组件能够和靶标物特异性结合形成三元复合物；所述三元复合物能够使得生物识别元件发生结构变化、长短变化或完整性变化。
在本发明的一种实施方式中，所述靶标物为核酸、蛋白或多肽中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述靶标物为RNA；所述生物识别元件为RNA链；所述切割组件包括Cas13a蛋白以及crRNA；所述Cas13a蛋白和crRNA能够和靶标RNA特异性结合形成三元复合物，激活Cas13a蛋白的反式切割活性，进而使得RNA链能够在Cas13a蛋白的反式切割活性下发生裂解。
在本发明的一种实施方式中，所述靶标物检测试剂盒还包括含有金属阳离子的缓冲液；所述金属阳离子包括Mg2+、Na+或K+中的至少一种。
本发明还提供了一种靶标物检测方法，所述方法非疾病的诊断和治疗目的，所述方法为：使用上述靶标物检测试剂盒对待测样本进行检测。
在本发明的一种实施方式中，所述靶标物为核酸、蛋白或多肽中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述靶标物为RNA；所述生物识别元件为RNA链；所述方法为：先将上述光电双模式生物探针、Cas13a蛋白、crRNA和待测样本混合，得到反应体系，然后将反应体系进行孵育，得到孵育液，再检测孵育液电信号以及光信号，最后根据检测所得的电信号以及光信号，计算待测样本中靶标RNA的浓度。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为：先将上述光电双模式生物探针、Cas13a蛋白、crRNA、缓冲液和待测样本混合，得到反应体系，然后将反应体系进行孵育，得到孵育液，再检测孵育液电信号以及光信号，最后根据检测所得的电信号以及光信号，计算待测样本中靶标RNA的浓度。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，Cas13a和crRNA的摩尔浓度比为4:1~1:4。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，Cas13a和crRNA的摩尔浓度比为2:1。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，光电双模式生物探针的浓度为1~10μM。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，光电双模式生物探针的浓度为7μM。
在本发明的一种实施方式中，所述孵育的温度为15~45℃。
在本发明的一种实施方式中，所述孵育的温度为25~30℃。
本发明还提供了上述光电双模式生物探针或上述靶标物检测试剂盒或上述靶标物检测方法在靶标物检测中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。
在本发明的一种实施方式中，所述靶标物为核酸、蛋白或多肽中的至少一种。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种光电双模式生物探针，所述光电双模式生物探针为均相生物探针，包括生物识别元件、电化学标记物以及荧光标记物；所述电化学标记物和荧光标记物连接在生物识别元件上。所述光电双模式生物探针断裂前后，荧光信号和电信号均有着较大差异，因此，可以将所述光电双模式生物探针应用到生物医学检测领域，通过改变所述光电双模式生物探针的完整度，满足“一个体系，多种信号响应”这一需求，进而在依托“生物识别”开启“信号产出”的同时，通过电信号、光信号的双模式响应进一步提升检测中的灵敏度和特异性。与仅修饰电化学标记物或荧光标记物的生物探针相比，所述光电双模式生物探针具有更大的空间位阻和位阻效应以及更低的扩散速率，使得电化学标记物更难接触到电极表面，荧光标记物的光激发和发射受到影响，导致所述光电双模式生物探针具有更低的背景信号，更高的信噪比。
进一步地，所述生物识别元件为核酸链；所述核酸链的长度为3~23bp。此长度下，所述光电双模式生物探针在断裂后可获得较优的电化学信号及P/N值。
进一步地，所述核酸链的长度为20bp。此长度下，所述光电双模式生物探针在断裂后可获得最优的电化学信号及P/N值。
进一步地，使用所述光电双模式生物探针进行检测时，控制反应体系中Cas13a蛋白与crRNA的摩尔浓度比为2:1。此比例下，所述光电双模式生物探针在断裂后可获得最优的电化学信号及P/N值。
进一步地，使用所述光电双模式生物探针进行检测时，控制反应体系中光电双模式生物探针的浓度为7μM。此浓度下，所述光电双模式生物探针在断裂后可获得最优的电化学信号及P/N值。
进一步地，使用所述光电双模式生物探针进行检测时，控制反应体系的孵育温度为25~30℃。此温度范围内，所述光电双模式生物探针在断裂后可获得最优的电化学信号值。
附图说明
图1：光电双模式生物探针的荧光信号图。
图2：光电双模式生物探针的电信号图。
图3：基于光电双模式生物探针的核酸检测方法的荧光信号图。
图4：基于光电双模式生物探针的核酸检测方法的电信号图。
图5：基于光电双模式生物探针的核酸检测方法的直接观察图。
图6：光电双模式生物探针RNA碱基个数对电信号的影响。
图7：Cas13a与crRNA之间的摩尔浓度比对电信号的影响。
图8：光电双模式生物探针浓度对电信号的影响。
图9：孵育温度对电信号的影响。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：一种光电双模式生物探针
本实施例提供了一种光电双模式生物探针FAM-RNA-MB，所述光电双模式生物探针FAM-RNA-MB为均相生物探针，包括通过碳链依次相连的FAM、RNA链以及亚甲基蓝（此光电双模式生物探针中RNA碱基个数为5bp）；
所述光电双模式生物探针FAM-RNA-MB的结构式如下：
。
实施例2：一种基于光电双模式生物探针的核酸检测试剂盒
本实施例提供了一种基于光电双模式生物探针的核酸检测试剂盒，所述核酸检测试剂盒由实施例1的光电双模式生物探针FAM-RNA-MB、Cas13a蛋白、crRNA、Tris-HCl、KCl以及MgCl2组成。
实施例3：一种基于光电双模式生物探针的核酸检测方法
本实施例提供了一种基于光电双模式生物探针的核酸检测方法，所述方法使用实施例2的基于光电双模式生物探针的核酸检测试剂盒，包括如下步骤：
将2.1μL实施例1的光电双模式生物探针FAM-RNA-MB（100μM）、0.6μL的Cas13a蛋白（2μM）、0.6μL的crRNA（1μM）、1.2μL的Tris-HCl（pH 8.0、500mM）、0.75μL的KCl（2M）、0.75μL的MgCl2（100mM）、18μL的超纯水和6μL的待测样本混合，得到反应体系；将反应体系在37℃下孵育25min，得到孵育液；通过丝网印刷电极（购自DropSens公司，型号为110）和电化学工作站（购自上海辰华仪器有限公司，型号为CHI760E）检测孵育液的电信号，并且，通过荧光分光光度计（购自日立高新技术公司，型号为F-7000）检测孵育液的光信号；根据检测所得的电信号以及光信号，计算待测样本中靶标核酸的浓度。
实验例1：光电双模式生物探针的性能验证
1、实验方法
1.1、信号响应验证
将实施例1的光电双模式生物探针FAM-RNA-MB、RNA酶（购自生工生物有限公司，型号为B001485-0100）和1×RNA酶缓冲液（购自生工生物有限公司，型号为B001485-0100）混合至FAM-RNA-MB的浓度为10μM、RNA酶的浓度为0.1mg/mL，得到反应体系；将反应体系在37℃下孵育40min，得到孵育液；通过丝网印刷电极和电化学工作站检测孵育液的电信号，并且，通过荧光分光光度计检测孵育液的光信号，检测所得荧光信号结果见图1，电信号结果见图2。
1.2、检测性能验证
参照实施例2的方法，将2.1μL实施例1的光电双模式生物探针FAM-RNA-MB（100μM）、0.6μL的Cas13a蛋白（2μM）、0.6μL的crRNA（1μM）、1.2μL的Tris-HCl（pH 8.0、500mM）、0.75μL的KCl（2M）、0.75μL的MgCl2（100mM）、18μL的超纯水和6μL的靶标核酸（靶标核酸分别为5pM、50pM、500pM、5nM、50nM的ssRNA1）混合，得到反应体系（ssRNA1、Cas13a蛋白和crRNA参见文献“Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, Essletzbichler P, Dy AJ, JoungJ, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-42.”）；将反应体系在37℃下孵育25min，得到孵育液；通过丝网印刷电极和电化学工作站检测孵育液的电信号，并且，通过荧光分光光度计检测孵育液的光信号，检测所得荧光信号结果见图3，电信号结果见图4，直接观察结果见图5。
1.3、RNA碱基个数对信号响应的影响实验
在1.2的基础上，将实施例1的光电双模式生物探针FAM-RNA-MB的RNA碱基个数分别替换为3、6、12、18、20、23，检测所得电信号结果见图6。
1.4、Cas13a蛋白与crRNA的浓度比例对信号响应的影响实验
在1.2的基础上，将反应体系中Cas13a蛋白与crRNA的摩尔浓度比分别替换为4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4（即将crRNA的用量分别替换为0.3、0.4、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8μL），检测所得电信号结果见图7。
1.5、光电双模式生物探针的浓度对信号响应的影响实验
在1.2的基础上，将反应体系中实施例1的光电双模式生物探针FAM-RNA-MB的浓度分别替换为1、3、5、7、10μM（即将FAM-RNA-MB的用量分别替换为0.3、0.9、1.5、2.1、3μL），检测所得电信号结果见图8。
1.6、孵育温度对信号响应的影响实验
在1.2的基础上，将反应体系的孵育温度分别替换为15、20、25、30、35、40、45℃，检测所得电信号结果见图9。
2、实验结果
2.1、信号响应验证
由图1可知，FAM-RNA-MB的结构中，因FAM和RNA链自身较大的空间位阻、较小的扩散速率及其对亚甲基蓝的静电吸附作用，导致FAM-RNA-MB与电极表面之间的电子转移难度较大，电化学信号较弱，而在含有RNA酶的体系中，FAM-RNA-MB结构能够被RNA酶水解，空间位阻和静电吸附作用的减小以及扩散速率的增大使得亚甲基蓝的电化学信号升高，且电化学信号强度与RNA酶浓度呈正比。
由图2可知，通过共价连接电子给体FAM和电子受体亚甲基蓝而得到的FAM-RNA-MB具有较低的HOMO-LUMO能隙，以及明显的分子内电荷转移现象，正是这一现象使得FAM-RNA-MB在发生水解前后，不仅具有明显的电化学信号变化，还具有明显的荧光信号变化，分子内电荷转移现象的存在使得FAM的荧光强度较弱，在FAM-RNA-MB被RNA酶水解后，分子内电荷转移现象的消失以及位阻效应的减弱使得FAM的荧光信号增强。
2.2、检测性能验证
由图3~4可知，待测样本中的靶标核酸能够和Cas13a蛋白以及crRNA形成三元复合物，激活Cas13a蛋白的反式切割活性，使其无差别的剪切反应体系中任意的RNA链，包括FAM-RNA-MB中的RNA链，进而释放被修饰在RNA链中的亚甲基蓝，随着FAM-RNA-MB的断裂，亚甲基蓝的荧光信号和电信号增强，且两种信号的增强幅度相近
由图5可知，由于CRISPR/Cas13a反应体系内存在大量Mg2+等金属阳离子，它们可以和FAM-RNA-MB中的磷酸基团和尿嘧啶配位结合，致使FAM-RNA-MB的结构发生分子内甚至是分子间团聚，增大FAM基团的位阻效应，进一步减弱FAM基团的荧光强度，正是FAM基团的荧光强度的进一步减弱，使其与正常荧光强度有着巨大差别，导致FAM-RNA-MB断裂前后的荧光强度的变化可通过肉眼直接观察。
综合图3~5的结果可知，在CRISPR/Cas13a反应体系这一含有大量Mg2+等金属阳离子的体系内，以DNA链、RNA链或DNA/RNA掺杂链作为长链的光电双模式生物探针FAM-RNA-MB可同时实现三种信号响应。
2.3、RNA碱基个数对信号响应的影响实验
由图6可知，在FAM-RNA-MB的结构中，RNA的长度影响着FAM-RNA-MB的空间位阻和Cas13a蛋白的剪切效率，不同长度的FAM-RNA-MB（RNA碱基个数为3~23）具有不同强度的背景信号、阳性信号和P/N值，当RNA碱基个数为20时，可获得最优的阳性信号及P/N值。
2.4、Cas13a蛋白与crRNA的浓度比例对信号响应的影响实验
由图7可知，Cas13a和crRNA的摩尔浓度比影响着三元复合物的生成效率，进而影响着Cas13a的剪切效率，不同摩尔浓度比下（4:1~1:4）具有不同强度的电化学信号和P/N值，当Cas13a和crRNA的摩尔浓度比为2:1时，可获得最优的电化学信号及P/N值。
2.5、光电双模式生物探针的浓度对信号响应的影响实验
由图8可知，FAM-RNA-MB浓度影响着背景信号强度和Cas13a蛋白的剪切效率，不同浓度的FAM-RNA-MB（1~10μM）具有不同强度的背景信号、阳性信号和P/N值，当FAM-RNA-MB的浓度为7μM时，可获得最优的阳性信号及P/N值。
2.6、孵育温度对信号响应的影响实验
由图9可知，孵育温度影响着三元复合物的生成效率和Cas13a蛋白的剪切效率，不同反应温度（15~45℃）具有不同强度的背景信号和阳性信号，当反应温度为25~30℃时，可获得较优的背景信号和阳性信号。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种光电双模式生物探针，其特征在于，所述光电双模式生物探针包括生物识别元件、电化学标记物以及荧光标记物；所述电化学标记物和荧光标记物连接在生物识别元件上；所述生物识别元件为核酸链；所述核酸链的长度为6~23bp；所述核酸链通过被RNA酶或Cas蛋白切割，发生结构变化、长短变化或完整性变化，进而开启电化学标记物的电信号以及荧光标记物的光信号。
2.如权利要求1所述的光电双模式生物探针，其特征在于，所述Cas蛋白包括Cas13a蛋白、Cas12a蛋白、Cas12b蛋白或Cas14蛋白中的至少一种。
3.如权利要求1所述的光电双模式生物探针，其特征在于，所述电化学标记物包括亚甲基蓝族类化合物、二茂铁族类化合物或道诺霉素族类化合物中的至少一种；所述亚甲基蓝族类化合物包括亚甲基蓝、亚甲基蓝衍生物或亚甲基蓝修饰物中的至少一种；所述二茂铁族类化合物包括二茂铁、二茂铁衍生物或二茂铁修饰物中的至少一种；所述道诺霉素族类化合物包括道诺霉素、道诺霉素衍生物或道诺霉素修饰物中的至少一种。
4.如权利要求1所述的光电双模式生物探针，其特征在于，所述荧光标记物包括荧光素类荧光标记物、罗丹明类荧光标记物、菁染料类荧光标记物或香豆素类荧光标记物中的至少一种；所述荧光素类荧光标记物包括荧光素异硫氰酸、四氯荧光素或羟基荧光素中的至少一种；所述罗丹明类荧光标记物包括罗丹明B、罗丹明6G或罗丹明101中的至少一种；所述菁染料类荧光标记物包括Cy5、Cy7或Cy7.5中的至少一种；所述香豆素类荧光标记物包括AMCA、AFC或AMC中的至少一种。
5.如权利要求1~4任一项所述的光电双模式生物探针，其特征在于，所述电化学标记物连接在生物识别元件的末端或中间；所述荧光标记物连接在生物识别元件的末端或中间。
6.如权利要求5所述的光电双模式生物探针，其特征在于，所述电化学标记物通过碳链连接在生物识别元件的末端或中间；所述荧光标记物通过碳链连接在生物识别元件的末端或中间。
7.一种靶标物检测试剂盒，其特征在于，所述靶标物检测试剂盒包括权利要求1~6任一项所述的光电双模式生物探针以及切割组件；所述靶标物为RNA；所述生物识别元件为RNA链；所述切割组件包括Cas13a蛋白以及crRNA；所述Cas13a蛋白和crRNA能够和靶标RNA特异性结合形成三元复合物，激活Cas13a蛋白的反式切割活性，进而使得RNA链能够在Cas13a蛋白的反式切割活性下发生裂解。
8.如权利要求7所述的靶标物检测试剂盒，其特征在于，所述靶标物检测试剂盒还包括含有金属阳离子的缓冲液；所述金属阳离子包括Mg2+、Na+或K+中的至少一种。
9.一种靶标物检测方法，所述方法非疾病的诊断和治疗目的，其特征在于，所述方法为：使用权利要求7或8所述的靶标物检测试剂盒对待测样本进行检测；所述靶标物为RNA；所述生物识别元件为RNA链；所述方法为：先将权利要求1~6任一项所述的光电双模式生物探针、Cas13a蛋白、crRNA和待测样本混合，得到反应体系，然后将反应体系进行孵育，得到孵育液，再检测孵育液电信号以及光信号，最后根据检测所得的电信号以及光信号，计算待测样本中靶标RNA的浓度；
所述反应体系中，Cas13a和crRNA的摩尔浓度比为4:1~1:2；
所述反应体系中，光电双模式生物探针的浓度为3~10μM；
所述孵育的温度为20~40℃。
10.权利要求1~6任一项所述的光电双模式生物探针或权利要求7或8所述的靶标物检测试剂盒或权利要求9所述的靶标物检测方法在靶标物检测中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。
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