JP2024507755A - 血漿および脳脊髄液中のニューロフィラメント軽鎖を検出するための方法 - Google Patents
血漿および脳脊髄液中のニューロフィラメント軽鎖を検出するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
本開示は、脳脊髄液および血液中に存在するＮｆｌを検出し、適宜定量するための方法、ならびに神経損傷を示すＮｆｌバイオマーカーのレベルを検出し、適宜測定するための方法の使用を提供する。抗Ｎｆｌ抗体も開示される。
Description
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０２１年２月１０日に出願された米国仮出願第６３／１４７，８３３号、２０２１年５月３日に出願された米国仮出願第６３／１８３，４１７号、および２０２１年６月７日に出願された米国仮出願第６３／１９７，８２６号の優先権を主張し、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年２月１０日に出願された米国仮出願第６３／１４７，８３３号、２０２１年５月３日に出願された米国仮出願第６３／１８３，４１７号、および２０２１年６月７日に出願された米国仮出願第６３／１９７，８２６号の優先権を主張し、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＡＧ０６７５５９の政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＡＧ０６７５５９の政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
配列表に対する言及
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０２２年１月３１日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、「７１６４６８＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称であり、１０，０２５バイトのサイズである。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０２２年１月３１日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、「７１６４６８＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称であり、１０，０２５バイトのサイズである。
技術の分野
本開示は、さまざまなニューロフィラメント軽鎖種を定量および分析するための方法、ならびに神経損傷を測定する、神経変性疾患の診断の情報を与える、さらなる診断検査のために患者を選択する、および処置の決定をガイドするためのそれらの使用を包含する。
本開示は、さまざまなニューロフィラメント軽鎖種を定量および分析するための方法、ならびに神経損傷を測定する、神経変性疾患の診断の情報を与える、さらなる診断検査のために患者を選択する、および処置の決定をガイドするためのそれらの使用を包含する。
背景
ニューロフィラメントは、有髄軸索の神経細胞骨格の主要な構成要素であり、放射状の軸索成長を可能にすることによって、神経コンダクタンスにおいて重要な役割を果たす。中枢神経系において、ニューロフィラメントは、４つのタンパク質：ニューロフィラメント重鎖（ＮｆＨ）、ニューロフィラメント中鎖（ＮｆＭ）、ニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）およびアルファ－インターネキシンから構成される。これらの４つのタンパク質のうち、ＮｆＬのみが、神経損傷のマーカーとして十分に確立されている。これは、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および他の神経変性障害において上昇する。これは、ＮｆＬについて知られるようになった生物学および病態生理学が、各種の神経変性疾患のために有用であることを示す。
ニューロフィラメントは、有髄軸索の神経細胞骨格の主要な構成要素であり、放射状の軸索成長を可能にすることによって、神経コンダクタンスにおいて重要な役割を果たす。中枢神経系において、ニューロフィラメントは、４つのタンパク質：ニューロフィラメント重鎖（ＮｆＨ）、ニューロフィラメント中鎖（ＮｆＭ）、ニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）およびアルファ－インターネキシンから構成される。これらの４つのタンパク質のうち、ＮｆＬのみが、神経損傷のマーカーとして十分に確立されている。これは、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および他の神経変性障害において上昇する。これは、ＮｆＬについて知られるようになった生物学および病態生理学が、各種の神経変性疾患のために有用であることを示す。
現在、抗ＮｆＬ抗体の唯一の市販のペアが、臨床コホートおよび治験をモニタリングするために利用されている（抗ＮＦ－Ｌ ｍＡｂ ２：１および抗Ｎｆｌ ｍＡｂ ４７：３、Ｕｍａｍ）。市販アッセイの使用は、健康な対照から神経変性疾患を識別するのに成功しているが、バイオマーカーの有用性は、現在、その非特異的性質によって限定されている。複数の神経変性および神経炎症プロセスにおけるＮｆｌの上昇に起因する「ノイズ」は、Ｎｆｌを、疾患状態および処置応答のあまり信頼できないマーカーにし、処置プロトコールにおけるその臨床的有用性を制限する。Ｎｆｌは、複数の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を受けて、任意の所与の生体試料中で多くの異なるＮｆｌアイソフォームの可能性をもたらすが、市販のイムノアッセイは、これらのＰＴＭに結合する。また、例えば、もしあればＮｆｌ種が、どの程度まで神経変性障害の検出、対象のステージ分け、および／または処置決定のガイドに使用できるかの我々の理解には重大なギャップが残されている。
したがって、脳脊髄液および血液中に存在するＮｆｌアイソフォームを検出および定量するための改善された方法について、当技術分野における必要性が残されている。
本出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの写真を含む。カラー写真を伴う本出願公開の写しは、請求および必要な手数料の支払いにより庁によって提供される。
詳細な説明
本開示のさまざまな態様のうち、脳脊髄液および血液中に存在するＮｆｌを検出し、適宜定量するための方法、ならびに神経損傷を示すＮｆｌバイオマーカーのレベルを検出し、適宜測定するための方法の使用が提供される。本明細書においてより詳細に記載するように、Ｎｆｌのある特定のペプチドまたは部分が、Ｎｆｌの他のペプチドまたは部分よりも神経損傷の良好な指標であることを発見した。複数の抗Ｎｆｌエピトープ結合剤、および本開示の方法におけるそれらの使用も本明細書に開示される。
本開示のさまざまな態様のうち、脳脊髄液および血液中に存在するＮｆｌを検出し、適宜定量するための方法、ならびに神経損傷を示すＮｆｌバイオマーカーのレベルを検出し、適宜測定するための方法の使用が提供される。本明細書においてより詳細に記載するように、Ｎｆｌのある特定のペプチドまたは部分が、Ｎｆｌの他のペプチドまたは部分よりも神経損傷の良好な指標であることを発見した。複数の抗Ｎｆｌエピトープ結合剤、および本開示の方法におけるそれらの使用も本明細書に開示される。
Ｉ．定義
本発明をより容易に理解し得るように、ある特定の用語を最初に定義する。他に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の実施形態が関係する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似の、改変された、または等価な多くの方法および材料を、過度の実験なく、本発明の実施形態の実施において使用することができ、好ましい材料および方法を本明細書に記載する。本発明の実施形態を記載し、特許請求の範囲に記載する際に、以下の専門用語が、下記に示される定義に従って使用される。
本発明をより容易に理解し得るように、ある特定の用語を最初に定義する。他に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の実施形態が関係する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似の、改変された、または等価な多くの方法および材料を、過度の実験なく、本発明の実施形態の実施において使用することができ、好ましい材料および方法を本明細書に記載する。本発明の実施形態を記載し、特許請求の範囲に記載する際に、以下の専門用語が、下記に示される定義に従って使用される。
濃度、量および他の数値データは、範囲形式で本明細書に表されるか、または提示されることがある。そのような範囲形式は、便宜のためおよび簡潔さのために単に使用されることが理解されるべきであり、範囲の限界として明示的に列挙される数値を含めるだけでなく、それぞれの数値および下位範囲が明示的に列挙されているかのように、その範囲内に包含されるすべての個々の数値または下位範囲を含めるように柔軟に解釈されるべきである。実例として、「約２～約５０」の数値範囲は、２～５０の明示的に列挙される値を含むだけでなく、示された範囲内のすべての個々の値または下位範囲を含むように解釈されるべきである。そのため、この数値範囲には、２、２．４、３、３．７、４、５．５、１０、１０．１、１４、１５、１５．９８、２０、２０．１３、２３、２５．０６、３０、３５．１、３８．０、４０、４４、４４．６、４５、４８などの個々の値、および１～３、２～４、５～１０、５～２０、５～２５、５～３０、５～３５、５～４０、５～５０、２～１０、２～２０、２～３０、２～４０、２～５０などのような下位範囲が含まれる。この同じ原則は、最小または最大として１つの数値のみが列挙される範囲に適用される。さらにまた、そのような解釈は、記載されている範囲または特徴の幅にかかわらず適用されるものとする。
「約」という用語は、本明細書において使用される場合、限定されるものではないが、質量、容量、時間、距離および量を含む任意の定量可能な変数についての、例えば、典型的な測定技法および装置を通して生じ得る数量の変動を指す。さらに、現実世界において使用される固体および液体の取り扱い手順を考えれば、組成物を作製するかまたは方法を行うためなどに使用される成分の製造、供給源または純度における相違を通して可能性がある、ある特定の偶発性の誤差および変動が存在する。「約」という用語はまた、これらの変動を包含し、これは最大で±５％であり得るが、±４％、３％、２％、１％などでもあり得る。「約」という用語によって改変されるか否かどうかにかかわらず、特許請求の範囲は、量についての均等物を含む。
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに帰する意味を有することができ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができ、一般に、オープンエンドの用語と解釈される。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」という用語は、クローズドの用語であり、そのような用語と併せて具体的に列挙された構成要素、構造、工程などのみを含むだけでなく、これは、米国特許法に従う。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、米国特許法によってそれらに一般に帰する意味を有する。特に、そのような用語は、一般に、それらと関連して使用される項目の基本的および新規な特徴または機能に実質的な影響を及ぼさない、追加の項目、材料、構成要素、工程、または要素の包含を許容する場合を除き、クローズドの用語である。例えば、組成物の性質または特徴に影響を及ぼさないが、組成物中に存在する痕跡量の要素は、そのような専門用語に続く項目のリストに明示的に列挙されていなくても、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という語句の下で存在する場合に許容されるであろう。本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のようなオープンエンドの用語を使用する場合、明示的に述べられているかのような「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語句だけでなく、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語にも直接的な裏付けが提供されるべきであり、その逆も同様であることが理解される。
「Ａβ」という用語は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる大型タンパク質のカルボキシ末端における領域に由来するペプチドを指す。ＡＰＰをコードする遺伝子は、染色体２１に位置する。毒性効果を有し得る、多くのＡβの形態が存在する：Ａβペプチドは、一般に、３７～４３アミノ酸配列長であるが、それらは、それらの全体的サイズを変化させるトランケーションおよび改変を有し得る。それらは、細胞内または細胞外で、モノマー、オリゴマーおよび凝集形態で可溶性および不溶性区画において見出され得、他のタンパク質または分子と複合体化していてもよい。Ａβの有害または毒性効果は、上記に述べた形態のいずれかまたはすべて、ならびに特に記載されていない他のものに起因し得る。例えば、２つのそのようなＡβアイソフォームは、Ａβ４０およびＡβ４２を含み、Ａβ４２アイソフォームは、特に、線維素生成性または不溶性であり、疾患状態に関連する。「Ａβ」という用語は、典型的には、個々のＡβ種の中で区別することなく、複数のＡβ種を指す。特異的なＡβ種は、ペプチドのサイズ、例えば、Ａβ４２、Ａβ４０、Ａβ３８などによって特定される。
本明細書において使用される場合、「Ａβ４２／Ａβ４０値」という用語は、対象から得られた試料中のＡβ４２の量の同じ試料中のＡβ４０の量と比較した比を意味する。
「Ａβアミロイド症」は、脳における臨床的に異常なＡβ沈着として定義される。Ａβアミロイド症を有すると決定された対象は、本明細書において「アミロイド陽性」と称される一方、Ａβアミロイド症を有しないと決定された対象は、本明細書において「アミロイド陰性」と称される。当技術分野において許容されるＡβアミロイド症の指標が存在する。本開示の時点で、Ａβアミロイド症は、アミロイドイメージング（例えば、ＰｉＢ ＰＥＴ、フロルベタピル、または当技術分野において公知の他のイメージング方法）によって直接測定されるか、または減少した脳脊髄液（ＣＳＦ）Ａβ４２または減少したＣＳＦ Ａβ４２／４０比によって間接的に測定される。平均皮質結合能（ＭＣＢＰ）スコア＞０．１８の［１１Ｃ］ＰＩＢ－ＰＥＴイメージングは、Ａβアミロイド症の指標であり、免疫沈降および質量分析（ＩＰ／ＭＳ）によって測定された脳脊髄液（ＣＳＦ）Ａβ４２の約１ｎｇ／ｍｌの濃度である。代替的に、ＰＩＢ－ＰＥＴによって決定されたアミロイド陽性を予測する際に精度を最大化するＣＳＦ Ａβ４２／４０についてのカットオフ比を使用することができる。当技術分野において公知のこれらの値もしくは他の値、および／または実施例において使用される値などの値は、単独で、または組み合わせて使用して、Ａβアミロイド症を臨床的に確認することができる。例えば、その全体が参照により本明細書にそれぞれ組み込まれる、Klunk W E et al. Ann Neurol 55(3) 2004、Fagan A M et al. Ann Neurol, 2006, 59(3)、Patterson et. al, Annals of Neurology, 2015, 78(3): 439-453、またはJohnson et al., J. Nuc. Med., 2013, 54(7): 1011-1013を参照されたい。Ａβアミロイド症を有する対象は、症候性であってもよく、またはそうでなくてもよく、症候性対象は、Ａβアミロイド症に関連する疾患についての臨床的基準を満たしていてもよく、または満たしていなくてもよい。Ａβアミロイド症に関連する症状の非限定的な例としては、損なわれた認知機能、行動変化、異常な言語機能、感情調節不全、発作、認知症、および損なわれた神経系構造または機能が挙げられ得る。Ａβアミロイド症に関連する疾患としては、限定されるものではないが、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ）、レビー小体認知症、および封入体筋炎が挙げられる。Ａβアミロイド症を有する対象は、Ａβアミロイド症に関連する疾患を発生する増加したリスクがある。
「Ａβアミロイド症の臨床徴候」は、当技術分野において公知のＡβ沈着の客観的尺度を指す。Ａβアミロイド症の臨床徴候としては、限定されるものではないが、アミロイドイメージング（例えば、ＰｉＢ ＰＥＴ、フロルベタピル、または当技術分野において公知の他のイメージング方法）によって、または減少した脳脊髄液（ＣＳＦ）Ａβ４２またはＡβ４２／４０比によって特定されるＡβ沈着が挙げられ得る。例えば、その全体が参照により本明細書にそれぞれ組み込まれる、Klunk WE et al. Ann Neurol 55(3) 2004、およびFagan AM et al. Ann Neurol 59(3) 2006を参照されたい。Ａβアミロイド症の臨床徴候はまた、その全体が参照により本明細書にそれぞれ組み込まれる、米国特許出願１４／３６６，８３１号、同第１４／５２３，１４８号および同第１４／７４７，４５３号に記載されるように、Ａβの代謝の測定、特にＡβ４２代謝単独の測定、または他のＡβ変異体（例えば、Ａβ３７、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０、および／または総Ａβ）の代謝の測定との比較を含み得る。追加の方法は、その全体が参照により本明細書にそれぞれ組み込まれる、Albert et al. Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 170-179；McKhann et al., Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 263-269；およびSperling et al. Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 280-292に記載されている。重要なことには、Ａβアミロイド症の臨床徴候を有する対象は、Ａβ沈着に関連する症状を有していることも、または有していないこともある。それでも、Ａβアミロイド症の臨床徴候を有する対象は、Ａβアミロイド症に関連する疾患を発生する増加したリスクがある。Ａβアミロイド症の臨床徴候はまた、限定されるものではないが、リン酸化タウ種（例えば、残基Ｔ２１７および／またはＴ１８１でリン酸化されたタウ種など）を含む、ＣＳＦまたは血液中の他の可溶性タンパク質の測定を含んでいてもよい。
「アミロイドイメージングのための候補」は、アミロイドイメージングが臨床的に正当化され得る個体として臨床医によって特定されている対象を指す。非限定的な例として、アミロイドイメージングのための候補は、Ａβアミロイド症の１つもしくは複数の臨床徴候、１つもしくは複数のＡβプラーク関連症状、１つもしくは複数のＣＡＡ関連症状、またはそれらの組み合わせを有する対象であり得る。臨床医は、対象の臨床ケアを指示するために、そのような対象に対するアミロイドイメージングを推奨してもよい。別の非限定的な例として、アミロイドイメージングのための候補は、Ａβアミロイド症に関連する疾患についての臨床試験の潜在的な参加者（対照対象または試験対象のいずれか）であってもよい。
「Ａβプラーク関連症状」または「ＣＡＡ関連症状」は、アミロイド原線維と呼ばれる規則的に配列した原線維凝集体からなる、それぞれ、アミロイドプラークもしくはＣＡＡの形成によって引き起こされるかまたはそれに関連する任意の症状を指す。例示的なＡβプラーク関連症状としては、限定されるものではないが、ニューロン変性、損なわれた認知機能、損なわれた記憶、行動変化、感情調節不全、発作、損なわれた神経系構造または機能、およびアルツハイマー病またはＣＡＡを発生するかまたは悪化させる増加したリスクが挙げられ得る。ニューロン変性としては、ニューロンの構造変化（毒性タンパク質、タンパク質凝集体などの細胞内蓄積などの分子変化、および軸索または樹状突起の形状または長さの変化などのマクロレベル変化、髄鞘組成の変化、髄鞘喪失などを含む）、ニューロンの機能変化、ニューロンの機能喪失、ニューロンの死、またはそれら任意の組み合わせが挙げられ得る。損なわれた認知機能としては、限定されるものではないが、記憶、注意、集中、言語、抽象的思考、創造性、実行機能、計画、および組織化の困難が挙げられ得る。行動変化としては、限定されるものではないが、身体的または言葉による攻撃、衝動性、減少した阻害、無関心、減少したイニシエーション、人格変化、アルコール、タバコまたは薬物の乱用、および他の嗜癖関連行動が挙げられ得る。感情調節不全としては、限定されるものではないが、うつ病、不安、躁病、易刺激性、および感情失調が挙げられ得る。発作としては、限定されるものではないが、全身性強直性間代性発作、複雑部分発作、および非てんかん性の心因性発作が挙げられ得る。損なわれた神経系構造または機能としては、限定されるものではないが、水頭症、パーキンソン病、睡眠障害、精神病、平衡および協調の機能障害が挙げられる。これは、不全単麻痺、不全片麻痺、四肢不全麻痺、運動失調、バリズム、および振戦などの運動機能障害を含み得る。これはまた、嗅覚、触覚、味覚、視覚、および聴覚の感覚を含む、感覚喪失または機能不全を含み得る。さらにまた、これは、腸および膀胱機能不全、性機能障害、血圧および体温調節不全などの自律神経系機能障害を含み得る。最後に、これは、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、プロラクチン、ならびに多くの他のホルモンおよびモジュレーターの欠乏および調節不全などの視床下部および脳下垂体の機能不全に起因するホルモン機能障害を含み得る。
本明細書において使用される場合、「血液試料」という用語は、血液、好ましくは、末梢（または循環）血液に由来する生体試料を指す。血液試料は、全血、血漿または血清であり得るが、血漿が、典型的には、好ましい。
「アイソフォーム」という用語は、本明細書において使用される場合、タンパク質をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシング、タンパク質の翻訳後修飾、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で起こるタンパク質のタンパク分解プロセシング、遺伝的変異、および体細胞組換えに起因して生じる同じタンパク質のいくつかの異なる形態のいずれかを指す。「アイソフォーム」、「種」および「変異体」という用語は、互換的に使用される（例えば、「Ｎｆｌアイソフォーム」および「Ｎｆｌ種」という用語は互換的に使用され得る）。
他に明示的に述べられない限り、「ニューロフィラメント軽鎖」という用語は、「ヒトニューロフィラメント軽鎖」を指し、すべての遺伝的にコードされたアイソフォームまたは変異体だけでなく、インビボでＣ末端がトランケートされた、インビボでＮ末端がトランケートされた、インビボでＮ末端がトランケートおよびＣ末端がトランケートされた、インビボで翻訳後に改変されたその種、またはそれらの任意の組み合わせを包含する。「ニューロフィラメント軽鎖」、「ニューロフィラメント軽鎖ポリペプチド」および「Ｎｆｌ」という用語は、本明細書で互換的に使用される。全長Ｎｆｌは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
「組換えＮｆｌ」という用語は、核酸の発現およびタンパク質へのその翻訳をサポートする系（例えば、原核細胞、真核細胞、または無細胞発現系）に導入された核酸によってコードされるＮｆｌを指す。組換えタンパク質を産生するための方法は、当技術分野において周知であり、本明細書に開示される組換えＮｆｌの産生は、特定の系に限定されない。
「対象」という用語は、ヒト、またはヒトＮｆｌを発現する非ヒト動物を指す。
「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、本明細書において使用される場合、治療的処置および予防的または防止的方策の両方を指し、その目的は、望ましくない生理的変化または疾患／障害を防止するかまたは減速させる（低下させる）ことである。有益な臨床結果または所望される臨床結果としては、限定されるものではないが、検出可能または検出不能であるかに関わらず、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的または完全）が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けていない場合に予想される生存と比較して、生存を延長することを意味し得る。処置を必要とするものとしては、既に、疾患、状態もしくは障害を有するものだけでなく、疾患、状態もしくは障害を有する傾向があるもの、または疾患、状態もしくは障害が防止されるべきであるものが挙げられる。
「抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、最も広い意味で使用され、さまざまな抗体および抗体様構造を包含し、限定されるものではないが、全長のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体など）、ならびに所望の抗原結合活性を示すことを条件として重鎖抗体および抗体断片を含む。抗原の結合に関与する抗体のドメインは、「可変領域」または「可変ドメイン」と称され、下記でさらに詳細に記載する。単一可変ドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。必ずしもではないが、好ましくは、本発見において有用な抗体は、組換え的に産生される。抗体は、グリコシル化されていてもよく、またはされていなくてもよいが、グリコシル化された抗体が好ましくあり得る。「単離された」抗体は、その自然環境の構成要素から分離されている抗体である。一部の実施形態において、抗体は、当技術分野において公知の方法によって決定される、９５％または９９％よりも高い純度に精製される。
本明細書に記載される抗体に加えて、本発明の抗体と実質的に同じ機能を有する抗体ミメティックまたはアプタマーを、当技術分野において公知の方法を使用して設計することが可能であり得る。「抗体ミメティック」は、抗原に特異的に結合することができるが、抗体とは構造的に関連しない、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。抗体ミメティックは、約３ｋＤａ～約２０ｋＤａの質量を有する。抗体ミメティックの非限定的な例は、アフィボディ分子、アフィリン、アフィマー、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、およびモノボディである。アプタマーは、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドから構成され、それらの標的に対して高い特異性および親和性を有する、小核酸リガンドのクラスである。アプタマーは、抗原抗体反応に類似するプロセスである構造的認識によりそれらの標的と相互作用および結合する。アプタマーは、抗体よりも低い分子量、典型的には、約８～２５ｋＤａを有する。
「全長抗体」および「インタクト抗体」という用語は、互換的に使用され得、ネイティブ抗体構造に実質的に類似する構造を有するか、または本明細書において定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する、抗体を指す。ネイティブ抗体の基本構造単位は、四量体を含む。それぞれの四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖の対から構成され、それぞれの対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。軽鎖は、ガンマ、ミュー、アルファおよびラムダとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと定義する。それぞれの軽鎖および重鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識の原因となる約１００～１１０以上のアミノ酸配列の可変領域（それぞれ、ＶＬおよびＶＨ）を含む。それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能の原因となる定常領域を定義する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸配列の「Ｊ」領域によって接続されており、重鎖は、約１０より多くのアミノ酸配列の「Ｄ」領域も含む。インタクト抗体は、当技術分野において公知であるように、ジスルフィド結合を介して適切に架橋されている。
抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、一般に、類似する構造を有しており、それぞれのドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む （例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照されたい）。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。さらにまた、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体由来のＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離して、それぞれ、相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングしてもよい。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照されたい。
「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲの配列は、一般に、以下の配列で現れる：ＦＲ１－ＨＶＲ１－ＦＲ２－ＨＶＲ２－ＦＲ３－ＨＶＲ３－ＦＲ４。重鎖および軽鎖のＦＲドメインは、当技術分野において公知であるように、異なっていてもよい。
「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書において使用される場合、配列が超可変性であり（一般に「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも称される）、および／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含有する、可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲ：ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。本明細書において使用される場合、「可変領域に由来するＨＶＲ」は、元の可変領域由来の対応するＨＶＲと比較して、２つ以下のアミノ酸置換を有するＨＶＲを指す。本明細書における例示的なＨＶＲとしては、本開示の様々な抗体について下記に定義されるように、以下が挙げられる：（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）および９６～１０１（Ｈ３）において生じる超可変性ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９５～１０２（Ｈ３）において生じるＣＤＲ（Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）および９３～１０１（Ｈ３）において生じる抗原接触（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；（ｄ）ＣＤＲ１－ＩＭＧＴ（２７～３８位）、ＣＤＲ２－ＩＭＧＴ（５６～６５位）およびＣＤＲ３－ＩＭＧＴ領域（１０５～１１６位または１０５～１１７位）、これらはＩＭＧＴに固有の番号付けに基づく（Lefranc, "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains," The Immunologist, 1999, 7: 132-136；Lefranc et al., Nucleic Acids Research, 2009, 37(Database issue): D1006-D1012；Ehrenmann et al., "Chapter 2: Standardized Sequence and Structure Analysis of Antibody Using IMGT," in Antibody Engineering Volume 2, Eds. Roland E. Kontermann and Stefan Dubel, 2010, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, doi: 10.1007/978-3-642-01147-4; www.imgt.org/IMGTScientificChart/Nomenclature/IMGT-FRCDRdefinition.html）、ならびに（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）の組み合わせ。他に指示されない限り、配列識別番号が割り当てられている可変ドメインのＨＶＲ残基および他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上記のＩＭＧＴの固有の番号付けに基づいて、番号付けされる。
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、ネイティブ配列のＦｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシ末端まで伸びている。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、または存在していなくてもよい。本明細書において他に規定されない限り、Ｆｃ領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991に記載されているような、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
「変異体Ｆｃ領域」は、ネイティブＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、１つもしくは複数のアミノ酸置換および／または改変されたグリコシル化パターンによって、ネイティブＦｃ領域のものとは異なり得るアミノ酸配列を含む。ある例において、変異体Ｆｃ領域は、ネイティブ配列のＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域において約１～約１０のアミノ酸置換または約１～約５のアミノ酸置換を有し得る。本明細書における変異体Ｆｃ領域は、ネイティブ配列のＦｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、少なくとも約９０％の相同性、または少なくとも約９５％の相同性を有し得る。
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部分を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の非限定的な例としては、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；一本鎖形態の抗体およびその高次変異体；シングルドメイン抗体、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
一本鎖形態の抗体およびそれらの高次形態としては、限定されるものではないが、シングルドメイン抗体、一本鎖変異体断片（ｓｃＦｖ）、二価ｓｃＦｖ（ｄｉ－ｓｃＦｖ）、三価ｓｃＦｖ（ｔｒｉ－ｓｃＦｖ）、四価ｓｃＦｖ（ｔｅｔｒａ－ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、およびトリアボディ、およびテトラボディが挙げられ得る。ｓｃＦｖは、リンカーによって接続される重鎖および軽鎖可変領域から構成される。すべてではないが、ほとんどの場合において、リンカーは、ペプチドであり得る。リンカーペプチドは、好ましくは、約５～３０アミノ酸長、または約１０～２５アミノ酸長である。典型的には、リンカーは、適切なフォールディングおよび活性結合部位の作出を妨げることなく、可変ドメインの安定化を可能にする。好ましい実施形態において、リンカーペプチドは、グリシン、およびセリンまたはトレオニンに富んでいる。ｓｃＦｖは、ファージディスプレイを容易にするために使用することができ、またはフローサイトメトリー、免疫組織化学的検査のために、または標的化ドメインとして使用することができる。ｓｃＦｖを作製および使用する方法は、当技術分野において公知である。ｓｃＦｖはまた、ヒト定常ドメイン（例えば、重鎖定常ドメインは、ＩｇＧドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４に由来するか、または重鎖定常ドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＭ、もしくはＩｇＥに由来する）にコンジュゲートされていてもよい。ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、ならびにより高次の変異体は、典型的には、リンカーペプチドの長さを０～数個のアミノ酸変化させることによって作出される。代替的に、多価結合性抗体変異体が、可変ドメインに連結された自己アセンブリーユニットを使用して作製され得ることも当技術分野において周知である。
「シングルドメイン抗体」は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を指す。
多重特異性抗体としては、二重特異性抗体、三重特異性抗体、または４つ以上の特異性の抗体が挙げられる。多重特異性抗体は、１つの抗体の重鎖および軽鎖を１つまたは複数の他の抗体の重鎖および軽鎖と組み合わせることによって作出されてもよい。これらの鎖は、共有結合的に連結され得る。
「モノクローナル抗体」は、例えば、任意の真核生物、原核生物またはファージのクローンを含む、単一のコピーまたはクローンに由来する抗体を指す。「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術により産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野において周知のハイブリドーマ技法、ならびに組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、またはそのような技術の組み合わせ、および当技術分野において容易に公知の他の技術を使用して産生することができる。さらにまた、モノクローナル抗体は、当技術分野において公知の方法に従って、検出可能な標識で標識され得、固相に固定化され得、および／または異種化合物（例えば酵素または毒素）とコンジュゲートされ得る。
「重鎖抗体」は、２つの重鎖からなる抗体を指す。重鎖抗体は、ラクダ、ラマ、アルパカ、サメなど由来のＩｇＧ様抗体、または軟骨魚類由来のＩｇＮＡＲであってもよい。
「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体が投与後にヒトにおける免疫応答を誘発するリスクを低減するように改変されているが、出発非ヒト抗体に類似する結合特異性および親和性を保持している非ヒト抗体を指す。ヒト化抗体は、非ヒト抗体と同じまたは類似のエピトープに結合する。「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト超可変領域（「ＨＶＲ」）を有する抗体の配列を変化させることによって、ヒト抗体生殖細胞系列に由来するアミノ酸配列から部分的または完全に構成される抗体を含む。最も単純なそのような変化は、マウス定常領域をヒト抗体の定常領域に単に置換することからなっていてもよく、このようにして、これは医薬品の使用として許容され得るのに十分に低い免疫原性を有し得るヒト／マウスキメラをもたらす。好ましくは、抗体の可変領域はまた、現在当技術分野において周知の技法によってヒト化される。例えば、可変領域のフレームワーク領域は、対応するヒトフレームワーク領域によって置換され得るが、１つ、いくつかの、または６つすべての非ヒトＨＶＲを保持する。一部のフレームワーク残基を、非ヒトＶＬドメインまたはＶＨドメイン（例えば、ＨＶＲ残基が由来する非ヒト抗体）由来の対応する残基で置換して、例えば、ヒト化抗体の特異性または親和性を回復または改善し得る。実質的に、ヒトフレームワーク領域は、公知のヒトフレームワーク配列と少なくとも約７５％の相同性（すなわち、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性）を有する。ＨＶＲはまた、完全ヒト生殖細胞系列フレームワーク領域または実質的にヒトであるフレームワーク領域の文脈において、抗原に対する結合活性および親和性が維持または増強されるようにランダムに突然変異されてもよい。上記で述べたように、本発見の方法における使用のためには、抗体断片を用いることで十分である。さらに、本明細書において使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、実質的なヒトフレームワーク領域、非ヒト抗体由来の少なくとも１つのＨＶＲを含む抗体であって、ここで、存在する任意の定常領域が実質的にヒトであることを含む、抗体を指す。実質的にヒト定常領域は、公知のヒト定常配列と少なくとも約９０％（すなわち、約９０％、約９５％または約９９％の配列同一性）を有する。そのため、ヒト化抗体のすべての部分は、場合によりＨＶＲを除いて、１つまたは複数の生殖細胞系列ヒト免疫グロブリン配列の対応する対と実質的に同一である。
所望により、ヒト化免疫グロブリンの設計は、以下の通り、または当業者が精通している類似の方法を使用して行われてもよい（例えば、Almagro, et al. Front. Biosci. 2008, 13(5):1619-33を参照されたい）。マウス抗体の可変領域を、最も類似するヒト生殖細胞系列配列と（例えば、ＢＬＡＳＴまたは類似するアルゴリズムを使用することによって）整列させる。マウス抗体配列由来のＣＤＲ残基を、類似するヒト「アクセプター」生殖細胞系列にグラフトする。その後、元のマウス抗体と類似の結合親和性を有するヒト化抗体を達成するために、ＣＤＲ付近またはフレームワーク内の１つまたは複数の位置（例えば、Ｖｅｒｎｉｅｒ位置）を、元のマウスのアミノ酸に戻してもよい。典型的には、異なる復帰突然変異を有するいくつかのバージョンのヒト化抗体を作製し、活性について経験的に試験する。親のマウス抗体に最も類似する特性を有し、マウスフレームワークの復帰が最も少ないヒト化抗体変異体が、最終ヒト化抗体候補として選択される。
「エピトープ結合剤」という用語は、抗体、アプタマー、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、代謝産物、小分子、または所与のエピトープを認識し、それに特異的に結合することができるそれらの断片を指す。エピトープは、直線状エピトープであってもよく、または立体構造エピトープであってもよい。本明細書において使用される場合、「直線状エピトープ」という用語は、アミノ酸の直線状（または連続的な）配列からなるエピトープを指す。「立体構造エピトープ」という用語は、特異的な三次元形状を有するタンパク質凝集体の表面上の非連続的なアミノ酸からなるエピトープを指す。
本明細書において使用される場合、「アプタマー」という用語は、生化学的活性、分子認識または結合属性の観点で、有用な生物学的活性を有するポリヌクレオチド、一般にＲＮＡまたはＤＮＡを指す。通常、アプタマーは、特異的エピトープ（領域）で標的分子に結合するなどの分子活性を有する。ポリペプチドへの結合において特異的であるアプタマーを、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）進化方法によって合成および／または特定し得ることが一般に認められている。インビトロ進化方法によるものを含むアプタマーを調製および特徴付けるための手段は、当技術分野において周知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９３９，３１３号を参照されたい。
ＩＩ．抗Ｎｆｌエピトープ結合剤
「抗Ｎｆｌエピトープ結合剤」は、本明細書において使用される場合、約０．１ｐＭ～約１０μＭ、好ましくは、約０．１ｐＭ～約１μＭ、より好ましくは、約０．１ｐＭ～約１００ｎＭの親和性定数または相互作用の親和性（ＫＤ）で組換えヒトニューロフィラメント軽鎖ポリペプチド（Ｎｆｌ）に結合する単離されたエピトープ結合剤を指す。抗原に対するエピトープ結合剤の親和性を決定するための方法は当技術分野において公知であり、実施例においてさらに説明する。一部の実施形態において、抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、核酸アプタマーである。一部の実施形態において、抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、抗体である。
「抗Ｎｆｌエピトープ結合剤」は、本明細書において使用される場合、約０．１ｐＭ～約１０μＭ、好ましくは、約０．１ｐＭ～約１μＭ、より好ましくは、約０．１ｐＭ～約１００ｎＭの親和性定数または相互作用の親和性（ＫＤ）で組換えヒトニューロフィラメント軽鎖ポリペプチド（Ｎｆｌ）に結合する単離されたエピトープ結合剤を指す。抗原に対するエピトープ結合剤の親和性を決定するための方法は当技術分野において公知であり、実施例においてさらに説明する。一部の実施形態において、抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、核酸アプタマーである。一部の実施形態において、抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、抗体である。
本明細書に開示される抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、それらが認識または結合するエピトープの観点で記載または規定され得る。エピトープ結合剤の抗原結合性ドメインと特異的に相互作用する標的ポリペプチドの部分は、「エピトープ」である。Ｎｆｌは、タンパク質の供給源（例えば、組換え、ヒト）、タンパク質の場所（例えば、細胞内、細胞外、脳、ＣＳＦ、血液など）、コンフォメーション状態、およびアイソフォームなどに応じて、任意の数のエピトープを含み得る。さらにまた、Ｎｆｌ上の「エピトープ」が直線状エピトープまたは立体構造エピトープであり得ることに留意すべきであり、両方の場合において、非ポリペプチド要素を含み得る、例えば、エピトープは、炭水化物側鎖、脂質側鎖、ホスフェートなどを含み得る。「親和性」という用語は、個々のエピトープのエピトープ結合剤の抗原結合部位への結合の強さの尺度を指す。
本開示の抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、抗原として組換え全長Ｎｆｌを使用することによって、作製され得、本開示の方法のために有用な抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、血液または血漿から単離されたＮｆｌ上に存在するエピトープに特異的に結合する。本開示の好ましい抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸９０～５４３内のエピトープに特異的に結合する。さまざまな実施形態において、本開示の抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸９０～３００内、または配列番号１のアミノ酸９０～２５０内のエピトープに特異的に結合する。他の実施形態において、本開示の抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸１２５～３００内、配列番号１のアミノ酸１２５～２５０内、または配列番号１のアミノ酸１２５～２００内のエピトープに特異的に結合する。他の実施形態において、本開示の抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸２５１～４００内、配列番号１のアミノ酸２５１～３５５内、配列番号１のアミノ酸２７２～３５５内、または配列番号１のアミノ酸２７２～３５０内のエピトープに特異的に結合する。他の実施形態において、本開示の抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸３５０～５４３内、配列番号１のアミノ酸３９７～５４３内、配列番号１のアミノ酸４００～５４３、配列番号１のアミノ酸３９７～５４０内、または配列番号１のアミノ酸４００～５４０内のエピトープに特異的に結合する。エピトープマッピングのための方法は、当技術分野において周知である。
一実施形態において、抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．１、ＨＪ３０．１の抗原結合性断片、または全長組換えＮｌｆへのＨＪ３０．１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。ＨＪ３０．１は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマクローンＰＴＡ－１２６９６６によって産生されるモノクローナル抗体である。
一実施形態において、抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．２、ＨＪ３０．２の抗原結合性断片、または全長組換えＮｌｆへのＨＪ３０．２の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。ＨＪ３０．２は、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマクローンＰＴＡ－１２６９６７によって産生されるモノクローナル抗体である。
一実施形態において、抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．４、ＨＪ３０．４の抗原結合性断片、または全長組換えＮｌｆへのＨＪ３０．４の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。ＨＪ３０．４は、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマクローンＰＴＡ－１２６９６８によって産生されるモノクローナル抗体である。
一実施形態において、抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．７、ＨＪ３０．７の抗原結合性断片、または全長組換えＮｌｆへのＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。ＨＪ３０．７は、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマクローンＰＴＡ－１２６９６９によって産生されるモノクローナル抗体である。
一実施形態において、抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．１１、ＨＪ３０．１１の抗原結合性断片、または全長組換えＮｌｆへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。ＨＪ３０．１１は、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマクローンＰＴＡ－１２６９７０によって産生されるモノクローナル抗体である。
一実施形態において、抗Ｎｆｌエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．１３、ＨＪ３０．１３の抗原結合性断片、または全長組換えＮｌｆへのＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。ＨＪ３０．１３は、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマクローンＰＴＡ－１２６９７１によって産生されるモノクローナル抗体である。
エピトープ結合剤が抗体である実施形態において、抗体は、変異体Ｆｃ領域を有していてもよく、または有していなくてもよい。一部の例において、Ｆｃ領域は、ミクログリア細胞上のＦｃ受容体に対する親和性を増加または減少させるように、および／またはグリコシル化パターンを変化させるように、改変され得る。さまざまな実施形態において、抗Ｎｆｌ抗体は、ヒト化抗体であってもよい。例えば、一部の例において、本開示の抗Ｎｆｌ抗体は、ＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２、ＨＪ３０．４、ＨＪ３０．７、ＨＪ３０．１１、またはＨＪ３０．１３に由来するヒト化抗体である。ヒト化抗Ｎｆｌ抗体は、実質的にヒトである（すなわち、公知のヒトフレームワーク配列と少なくとも９０％、９５％、または９９％の配列同一性）１つまたは複数の定常領域または定常領域の一部分を含み得る。
試験エピトープ結合剤は、試験エピトープ結合剤が、参照エピトープ結合剤のエピトープへの結合を少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％遮断する程度まで、そのエピトープに優先的に結合する場合、所与のエピトープへの参照エピトープ結合剤（例えば、ＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２、ＨＪ３０．４、ＨＪ３０．７、ＨＪ３０．１１、ＨＪ３０．１３など）の結合を競合的に阻害すると言われる。競合的阻害は、当技術分野において公知の任意の方法によって決定することができる。具体例において、競合的阻害は、以下の工程を含む競合的阻害ＥＬＩＳＡによって決定される：結合表面または支持体を精製された参照エピトープ結合剤でコーティングして、エピトープ結合剤コーティング表面を形成する工程；所定量の精製された標識抗原および試験エピトープ結合剤を含有する試験試料を混ぜ合わせる工程；標識抗原および試験エピトープ結合剤のインキュベートされた混合物を前記コーティング表面に添加する工程；前記コーティング表面を抗原および試験エピトープ結合剤の前記組み合わせとともにインキュベートする工程；ならびに試験エピトープ結合剤が欠如する条件と比較して、抗原結合阻害の量を測定する工程。
本明細書に開示される抗Ｎｆｌエピトープ結合剤はまた、それらの配列の観点で記載または規定され得る。
一実施形態において、抗Ｎｆｌ抗体は、ＨＪ３０．１に由来する１つもしくは複数のＨＶＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、および／またはＨＪ３０．１に由来する１つもしくは複数のＨＶＲを有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。ＨＪ３０．１のＶＬに由来するＨＶＲは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。ＨＪ３０．１のＶＨに由来するＨＶＲは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。ＨＪ３０．１のＶＨに由来する１つまたは複数のＨＶＲを含む抗体は、ＨＪ３０．１のＶＬのＬ１、Ｌ２、Ｌ３、またはそれらの任意の組み合わせを含むＶＬをさらに含んでいてもよい。上記のさまざまな実施形態において、抗体は、ヒト化抗体であってもよく、または抗体は、ＨＪ３０．１のＶＬに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するＶＬ、および／またはＨＪ３０．１のＶＨに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するＶＨを有していてもよい。上記の実施形態のそれぞれにおいて、抗Ｎｆｌ抗体は、実質的にヒトである（すなわち、公知のヒトフレームワーク配列と少なくとも９０％、９５％、または９９％の配列同一性）１つまたは複数の定常領域または定常領域の一部分を適宜含んでいてもよい。本開示はまた、対応する核酸配列も包含し、これは、当業者によって容易に決定され得、本開示の抗体を発現させるために、ベクターまたは他の大きなＤＮＡ分子、例えば、染色体に組み込まれていてもよい。
一実施形態において、抗Ｎｆｌ抗体は、ＨＪ３０．２に由来する１つもしくは複数のＨＶＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、および／またはＨＪ３０．２に由来する１つもしくは複数のＨＶＲを有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。ＨＪ３０．２のＶＬに由来するＨＶＲは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。ＨＪ３０．２のＶＨに由来するＨＶＲは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。ＨＪ３０．２のＶＨに由来する１つまたは複数のＨＶＲを含む抗体は、ＨＪ３０．２のＶＬのＬ１、Ｌ２、Ｌ３、またはそれらの任意の組み合わせを含むＶＬをさらに含んでいてもよい。上記のさまざまな実施形態において、抗体は、ヒト化抗体であってもよく、または抗体は、ＨＪ３０．２のＶＬに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するＶＬ、および／またはＨＪ３０．２のＶＨに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するＶＨを有していてもよい。上記の実施形態のそれぞれにおいて、抗Ｎｆｌ抗体は、実質的にヒトである（すなわち、公知のヒトフレームワーク配列と少なくとも９０％、９５％、または９９％の配列同一性）１つまたは複数の定常領域または定常領域の一部分を適宜含んでいてもよい。本開示はまた、対応する核酸配列も包含し、これは、当業者によって容易に決定され得、本開示の抗体を発現させるために、ベクターまたは他の大きなＤＮＡ分子、例えば、染色体に組み込まれていてもよい。
一実施形態において、抗Ｎｆｌ抗体は、ＨＪ３０．４に由来する１つもしくは複数のＨＶＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、および／またはＨＪ３０．４に由来する１つもしくは複数のＨＶＲを有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。ＨＪ３０．４のＶＬに由来するＨＶＲは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。ＨＪ３０．４のＶＨに由来するＨＶＲは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。ＨＪ３０．４のＶＨに由来する１つまたは複数のＨＶＲを含む抗体は、ＨＪ３０．４のＶＬのＬ１、Ｌ２、Ｌ３、またはそれらの任意の組み合わせを含むＶＬをさらに含んでいてもよい。上記のさまざまな実施形態において、抗体は、ヒト化抗体であってもよく、または抗体は、ＨＪ３０．４のＶＬに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するＶＬ、および／またはＨＪ３０．４のＶＨに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するＶＨを有していてもよい。上記の実施形態のそれぞれにおいて、抗Ｎｆｌ抗体は、実質的にヒトである（すなわち、公知のヒトフレームワーク配列と少なくとも９０％、９５％、または９９％の配列同一性）１つまたは複数の定常領域または定常領域の一部分を適宜含んでいてもよい。本開示はまた、対応する核酸配列も包含し、これは、当業者によって容易に決定され得、本開示の抗体を発現させるために、ベクターまたは他の大きなＤＮＡ分子、例えば、染色体に組み込まれていてもよい。
一実施形態において、抗Ｎｆｌ抗体は、ＨＪ３０．７に由来する１つもしくは複数のＨＶＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、および／またはＨＪ３０．７に由来する１つもしくは複数のＨＶＲを有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。ＨＪ３０．７のＶＬに由来するＨＶＲは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。ＨＪ３０．７のＶＨに由来するＨＶＲは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。ＨＪ３０．７のＶＨに由来する１つまたは複数のＨＶＲを含む抗体は、ＨＪ３０．７のＶＬのＬ１、Ｌ２、Ｌ３、またはそれらの任意の組み合わせを含むＶＬをさらに含んでいてもよい。上記のさまざまな実施形態において、抗体は、ヒト化抗体であってもよく、または抗体は、ＨＪ３０．７のＶＬに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するＶＬ、および／またはＨＪ３０．７のＶＨに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するＶＨを有していてもよい。上記の実施形態のそれぞれにおいて、抗Ｎｆｌ抗体は、実質的にヒトである（すなわち、公知のヒトフレームワーク配列と少なくとも９０％、９５％、または９９％の配列同一性）１つまたは複数の定常領域または定常領域の一部分を適宜含んでいてもよい。本開示はまた、対応する核酸配列も包含し、これは、当業者によって容易に決定され得、本開示の抗体を発現させるために、ベクターまたは他の大きなＤＮＡ分子、例えば、染色体に組み込まれていてもよい。
一実施形態において、抗Ｎｆｌ抗体は、ＨＪ３０．１１に由来する１つもしくは複数のＨＶＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、および／またはＨＪ３０．１１に由来する１つもしくは複数のＨＶＲを有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。ＨＪ３０．１１のＶＬに由来するＨＶＲは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。ＨＪ３０．１１のＶＨに由来するＨＶＲは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。ＨＪ３０．１１のＶＨに由来する１つまたは複数のＨＶＲを含む抗体は、ＨＪ３０．１１のＶＬのＬ１、Ｌ２、Ｌ３、またはそれらの任意の組み合わせを含むＶＬをさらに含んでいてもよい。上記のさまざまな実施形態において、抗体は、ヒト化抗体であってもよく、または抗体は、ＨＪ３０．１１のＶＬに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するＶＬ、および／またはＨＪ３０．１１のＶＨに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するＶＨを有していてもよい。上記の実施形態のそれぞれにおいて、抗Ｎｆｌ抗体は、実質的にヒトである（すなわち、公知のヒトフレームワーク配列と少なくとも９０％、９５％、または９９％の配列同一性）１つまたは複数の定常領域または定常領域の一部分を適宜含んでいてもよい。本開示はまた、対応する核酸配列も包含し、これは、当業者によって容易に決定され得、本開示の抗体を発現させるために、ベクターまたは他の大きなＤＮＡ分子、例えば、染色体に組み込まれていてもよい。
一実施形態において、抗Ｎｆｌ抗体は、ＨＪ３０．１７に由来する１つもしくは複数のＨＶＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、および／またはＨＪ３０．１７に由来する１つもしくは複数のＨＶＲを有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。ＨＪ３０．１７のＶＬに由来するＨＶＲは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。ＨＪ３０．１７のＶＨに由来するＨＶＲは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。ＨＪ３０．１７のＶＨに由来する１つまたは複数のＨＶＲを含む抗体は、ＨＪ３０．１７のＶＬのＬ１、Ｌ２、Ｌ３、またはそれらの任意の組み合わせを含むＶＬをさらに含んでいてもよい。上記のさまざまな実施形態において、抗体は、ヒト化抗体であってもよく、または抗体は、ＨＪ３０．１７のＶＬに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するＶＬ、および／またはＨＪ３０．１７のＶＨに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するＶＨを有していてもよい。上記の実施形態のそれぞれにおいて、抗Ｎｆｌ抗体は、実質的にヒトである（すなわち、公知のヒトフレームワーク配列と少なくとも９０％、９５％、または９９％の配列同一性）１つまたは複数の定常領域または定常領域の一部分を適宜含んでいてもよい。本開示はまた、対応する核酸配列も包含し、これは、当業者によって容易に決定され得、本開示の抗体を発現させるために、ベクターまたは他の大きなＤＮＡ分子、例えば、染色体に組み込まれていてもよい。
本明細書に開示される抗Ｎｆｌエピトープ結合剤はまた、それらの交差反応性の観点で記載または規定され得る。「交差反応性」という用語は、１つの抗原に特異的なエピトープ結合剤が第２の抗原と反応する能力を指し、２つの異なる抗原性物質間の関連性の尺度を指す。したがって、エピトープ結合剤は、それがその形成を誘発するもの以外のエピトープに結合する場合、交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般に、誘導性エピトープと同じ相補的な構造的特色の多くを含み、一部の例において、実際に、元のものよりも良くフィットし得る。例えば、ある特定の抗体は、関連しているが同一ではないエピトープ、例えば、参照エピトープに対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の同一性（当技術分野において公知の方法を使用して算出される）を有するエピトープに結合するという点で、ある度合いの交差反応性を有する。抗体または他のエピトープ結合剤は、それが、参照エピトープに対して、約９５％未満、約９０％未満、または約８５％未満の同一性を有するエピトープに結合しない場合、交差反応性をほとんど有しないかまたは有しないと言うことができる。抗体または他のエピトープ結合剤は、ある特定のエピトープが、それが任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログに結合しない場合に、それに対して「高度に特異的」であると見なされ得る。
ＩＩＩ．生体試料中のＮｆｌを検出するための方法
別の態様において、本開示は、生体試料中のＮｆｌを検出するための方法を提供する。方法は、生体試料を準備する工程、生体試料中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮する工程、および以前に濃縮された１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを検出する工程を含む。本明細書において使用される場合、「複数のＮｆｌアイソフォーム」および「Ｎｆｌアイソフォームの集団」という用語は互換的に使用され得る。
別の態様において、本開示は、生体試料中のＮｆｌを検出するための方法を提供する。方法は、生体試料を準備する工程、生体試料中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮する工程、および以前に濃縮された１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを検出する工程を含む。本明細書において使用される場合、「複数のＮｆｌアイソフォーム」および「Ｎｆｌアイソフォームの集団」という用語は互換的に使用され得る。
（ａ）生体試料を準備する工程
好適な生体試料としては、対象から得られた血液試料または脳脊髄液（ＣＳＦ）試料が挙げられる。血液およびＣＳＦは、実施例に詳述されるように、複数のＮｆｌアイソフォームを含有する。
好適な生体試料としては、対象から得られた血液試料または脳脊髄液（ＣＳＦ）試料が挙げられる。血液およびＣＳＦは、実施例に詳述されるように、複数のＮｆｌアイソフォームを含有する。
使用される生体試料のサイズは、試料の種類、試料が得られた対象の健康状態、および分析されるＮｆｌに加えた分析物（例えば、Ａβ、タウ、ＡｐｏＥ、α－シヌクレインなど）に応じて変わり得る。ＣＳＦ試料の容量は、約０．０１ｍＬ～約５ｍＬ、または約０．０５ｍＬ～約５ｍＬであってもよい。具体例において、試料のサイズは、約０．０５ｍＬ～約１ｍＬのＣＳＦであってもよい。血漿試料の容量は、約０．０１ｍＬ～約２０ｍＬ、または約０．１ｍＬ～約２０ｍＬであってもよい。具体例において、試料のサイズは、約１ｍＬ～約２０ｍＬの血液であってもよい。
一部の実施形態において、対象はヒトである。ヒト対象は、医療もしくは処置を待っていてもよく、医療もしくは処置下にあってもよく、または医療もしくは処置を受けていてもよい。さまざまな実施形態において、ヒト対象は、健康な対象、神経変性疾患を発生するするリスクがある対象、神経損傷および／もしくは神経変性疾患の徴候および／もしくは症状を有する対象、または神経損傷および／もしくは神経変性疾患と診断された対象であってもよい。神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症、シャルコー－マリー－トゥース病、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、クロイツフェルト－ヤコブ病、拳闘家認知症、ダウン症、ゲルストマン－ストロイスラー－シャインカー病、ハンチントン病、封入体筋炎、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、グアム筋萎縮性側索硬化症／パーキンソニズム－認知症複合、神経原線維変化を伴う非グアム島運動神経疾患、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ）、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、ハラーホルデン－スパッツ病、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、多発性硬化症、多系統萎縮症、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン－ピック病Ｃ型、パリド－ポント－黒質変性症、パーキンソン病、ピック病、進行性皮質下グリオーシス、脳炎後パーキンソニズム、ＰＡＲＴ（原発性加齢関連タウオパチー）、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、亜急性硬化性全脳症、濃縮体のみの認知症（または濃縮体優位型認知症）、濃縮体優位型認知症、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、緑内障、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、グアドループ島パーキンソニズム、脳鉄蓄積を伴う神経変性、ＳＬＣ９Ａ６関連精神遅滞、ＨＩＶ関連認知症、老人性心アミロイドーシスであってもよい。「対照対象」または「健康な対照」と称される場合がある健康な対象は、最小限に、認知機能障害の臨床徴候または症状を有さず、神経損傷、神経変性疾患、および／または外傷性脳損傷の他の臨床徴候または症状に対して「陰性」であることもある。
他の実施形態において、対象は実験動物である。さらなる実施形態において、対象はヒトＮｆｌを発現するよう遺伝子操作された実験動物である。
ＣＳＦは、留置ＣＳＦカテーテルを用いるかまたは用いない腰部穿刺によって得てもよい。血液は、静脈カテーテルを用いるもしくは用いない静脈穿刺、または指穿刺（またはその同等のもの）で収集されてもよい。対象から同時期に収集された複数の血液またはＣＳＦ試料をプールして、「試料」を作出してもよい。収集されたら、血液またはＣＳＦ試料を、当技術分野において公知の方法に従って処理してもよい（例えば、全細胞および細胞残屑を除去するための遠心分離；分析試験前に検体を安定化および保存するために設計された添加剤の使用など）。血液またはＣＳＦ試料は、すぐに使用されもよく、または凍結し、無期限に保存されてもよい。
本明細書において開示される方法における使用の前に、生体試料はまた、必要によりまたは所望により、プロテアーゼ阻害剤、内部標準、界面活性剤、およびカオトロピック剤を含めるように、他の分析物（例えば、タンパク質、ペプチド、代謝産物など）を枯渇させるように、またはその任意の組み合わせで改変されていてもよい。
「枯渇する」という用語は、量または数を減少させることを意味する。したがって、タンパク質が枯渇した試料は、元の試料における量より測定可能に少ない任意の量のタンパク質を有していてもよく、タンパク質の量を含まなくてもよい。非限定的な例として、タンパク質は、限外濾過、または酸、有機溶媒もしくは塩を用いるタンパク質沈殿によって、試料から枯渇されてもよい。一般的に言えば、これらの方法を使用して、高存在量および高分子量のタンパク質を確実に低減させ、次に、これが、低分子量および／または低存在量のタンパク質およびペプチド（例えば、タウ、Ａβ、Ｎｆｌなど）を濃縮する。具体例において、タンパク質は、沈殿によって試料から枯渇されてもよい。簡潔には、沈殿は、沈殿剤を試料に添加することおよび徹底的に混合すること、試料を沈殿剤とともにインキュベートして、タンパク質を沈殿させること、ならびに遠心分離または濾過によって沈殿したタンパク質を分離することを含む。次いで、得られた上清を、下流の適用において使用してもよい。必要な試薬の量は、当技術分野において公知の方法によって実験的に決定されてもよい。好適な沈殿剤としては、過塩素酸、トリクロロ酢酸、アセトニトリル、メタノールなどが挙げられる。例示的な実施形態において、タンパク質は、酸沈殿によって試料から枯渇される。さらなる実施形態において、タンパク質は、過塩素酸を使用する酸沈殿によって試料から枯渇される。
さらなる例において、タンパク質は、過塩素酸を使用する酸沈殿によって試料から枯渇されてもよい。本明細書において使用される場合、「過塩素酸」は、他に指示されない限り、７０％の過塩素酸を指す。一部の実施形態において、過塩素酸は、約１％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖの最終濃度まで添加される。他の実施形態において、過塩素酸は、約１％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの最終濃度まで添加される。他の実施形態において、過塩素酸は、約１％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖの最終濃度まで添加される。他の実施形態において、過塩素酸は、約３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖの最終濃度まで添加される。他の実施形態において、過塩素酸は、約３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの最終濃度まで添加される。他の実施形態において、過塩素酸は、約３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖの最終濃度まで添加される。他の実施形態において、過塩素酸は、３．５％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、３．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、または３．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖの最終濃度まで添加される。他の実施形態において、過塩素酸は、約３．５％ｖ／ｖの最終濃度まで添加される。過塩素酸の添加後、試料を、十分に混合し（例えば、ボルテックスミキサーによって）、典型的には、約１０分間以上、低温で維持して、沈殿を促進する。例えば、試料は、約１０分間～約６０分間、約２０分間～約６０分間、または約３０分間～約６０分間維持されてもよい。他の例において、試料は、約１５分間～約４５分間、または約３０分間～約４５分間維持されてもよい。他の例において、試料は、約１５分間～約３０分間、または約２０分間～約４０分間維持されてもよい。他の例において、試料は、約３０分間維持される。次いで、試料を、低温で遠心分離して、沈殿したタンパク質をペレット化し、例えば、可溶性タウを含む上清（すなわち、酸可溶性画分）を新しい容器に移す。上記の文脈において使用される場合、「低温」は、１０℃以下の温度を指す。例えば、低温は、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、または約１０℃であってもよい。一部の実施形態において、より狭い温度範囲、例えば、約３℃～約５℃、またはさらに約４℃が好ましくあり得る。ある特定の実施形態において、低温は、試料を氷上に置くことによって達成されてもよい。
代替的にまたはそれに加えて、タンパク質、ペプチド、および／または代謝産物は、目的の生体分子を特異的に標的にする方法によって、例えば、親和性枯渇、固相抽出、または当技術分野において公知の他の方法によって、試料から枯渇されてもよい。タンパク質／ペプチドまたは複数のタンパク質／ペプチドの標的化枯渇は、タンパク質／ペプチドの下流の分析が所望される状況（例えば、翻訳後修飾の特定、定量、分析など）において使用されてもよい。典型的には、出発物質における標的化タンパク質の少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上）が枯渇される。一部の実施形態において、出発物質における標的化タンパク質の約７０％以上、約８０％以上、または約９０％以上が枯渇される。親和性枯渇は、分子へのその特異的結合性によって、試料から目的のタンパク質を枯渇させる方法を指す。典型的には、分子は、固体支持体、例えば、ビーズ、樹脂、組織培養プレートなどに付着したリガンド（固定化リガンドと称される）である。リガンドの固体支持体への固定化はまた、リガンド－タンパク質相互作用が起こった後に起こり得る。好適なリガンドとしては、抗体、アプタマー、および他のエピトープ結合剤が挙げられる。例えば、Ａβペプチドは、好適なエピトープ結合剤を用いるＡβの親和性枯渇後に、当技術分野において公知の方法によって特定および定量されてもよい。タウも、同様に特定および定量されてもよい。分子はまた、目的のタンパク質を選択的に吸収するポリマーまたは他の材料であってもよい。非限定的な例として、脂肪オキセチル化（ｏｘｅｔｈｙｌｉｚｅｄ）アルコールによって置換されたポリヒドロキシメチレン（例えば、ＰＨＭ－Ｌ ＬＩＰＯＳＯＲＢ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、血清からリポタンパク質（ＡｐｏＥを含む）を選択的に吸収してもよい。次いで、ＡｐｏＥアイソフォーム（「ＡｐｏＥ状態」）の特定および／またはＡｐｏＥの定量は、当技術分野において公知の方法によって行われてもよい。標的化枯渇はまた、その後の分析のために、限定されるものではないが、アポリポタンパク質Ｊ、シヌクレイン、可溶性アミロイド前駆体タンパク質、アルファ－２マクログロブリン、Ｓ１００Ｂ、ミエリン塩基性タンパク質、インターロイキン、ＴＮＦ、ＴＲＥＭ－２、ＴＤＰ－４３、ＹＫＬ－４０、ＶＩＬＩＰ－１、プリオンタンパク質、ｐＮＦＨ、およびＤＪ－１を含む他のタンパク質を単離するために使用されてもよい。
（ｂ）生体試料中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮する工程
「濃縮する」という用語は、量または数の増加を意味する。血液およびＣＳＦは、複数のＮｆｌアイソフォームを含有する。したがって、「生体試料中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮する工程」は、出発試料（すなわち、生体試料）と比較して、試料の容量あたりのＮｆｌアイソフォームまたは複数のＮｆｌアイソフォームの量を測定可能に増加させることを意味する。一部の例において、濃縮は、少なくとも約５倍であってもよい。一部の例において、濃縮は、約５倍～約１０００倍であってもよい。例えば、濃縮は、少なくとも約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約２００倍、約３００倍、約４００倍、約５００倍、約６００倍、約７００倍、約８００倍、約９００倍、約１０００倍、またはそれ以上であってもよい。
「濃縮する」という用語は、量または数の増加を意味する。血液およびＣＳＦは、複数のＮｆｌアイソフォームを含有する。したがって、「生体試料中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮する工程」は、出発試料（すなわち、生体試料）と比較して、試料の容量あたりのＮｆｌアイソフォームまたは複数のＮｆｌアイソフォームの量を測定可能に増加させることを意味する。一部の例において、濃縮は、少なくとも約５倍であってもよい。一部の例において、濃縮は、約５倍～約１０００倍であってもよい。例えば、濃縮は、少なくとも約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約２００倍、約３００倍、約４００倍、約５００倍、約６００倍、約７００倍、約８００倍、約９００倍、約１０００倍、またはそれ以上であってもよい。
一部の実施形態において、本開示の方法は、生体試料中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮する工程であって、Ｎｆｌアイソフォームが、約３５０アミノ酸長以下である、工程を含む。例えば、Ｎｆｌアイソフォームは、約３００アミノ酸長以下、約２５０アミノ酸長以下、約２００アミノ酸長以下、約１５０アミノ酸長以下、約１００アミノ酸長以下、またはさらに約５０アミノ酸長以下であってもよい。約３５０アミノ酸長以下のＮｆｌアイソフォームは、全長Ｎｆｌ（配列番号１のアミノ酸配列を有する）について、Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーション、またはＮ末端トランケーションおよびＣ末端トランケーションを含有していてもよい。さらなる例において、本開示の方法は、配列番号１のアミノ酸９２～１００、アミノ酸１０１～１０７、アミノ酸１０８～１１６、アミノ酸１１７～１２６、アミノ酸１３７～１４４、アミノ酸１４８～１５７、アミノ酸１５８～１６４、アミノ酸１６５～１７２、アミノ酸１７８～１８５、アミノ酸１９２～１９６、もしくはアミノ酸１９８～２０６、またはそれらの任意の組み合わせを含むアミノ酸配列を有する１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮する工程を含んでいてもよい。他の例において、本開示の方法は、配列番号１のアミノ酸２８２～２９２、アミノ酸３２３～３３０、アミノ酸３３１～３３８、もしくはアミノ酸３３９～３５３、またはそれらの任意の組み合わせを含むアミノ酸配列を有する１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮する工程を含んでいてもよい。さらに他の例において、本開示の方法は、配列番号１のアミノ酸４２２～４３７、アミノ酸４３８～４６２、および／またはアミノ酸５３０～５４０を含むアミノ酸配列を有する１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮する工程を含んでいてもよい。さらに他の例において、本開示の方法は、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団を濃縮する工程、および次いで、以前に枯渇された試料を使用するそれぞれの場合において、Ｎｆｌアイソフォームの第２、第３、第４、またはそれ以上の集団を続いて濃縮する工程を含んでいてもよい。さらに他の例において、本開示の方法は、図２２に記載される１つまたは複数のアイソフォームを濃縮する工程を含んでいてもよい。
本開示の方法は、Ｎｆｌアイソフォームを生体試料から単離することによって（例えば、親和性精製、固相抽出など）および／または他のＮｆｌアイソフォームを生体試料から除去することによって（例えば、親和性枯渇、固相抽出など）によって、トランケートされたＮｆｌアイソフォームまたは複数のトランケートされたＮｆｌアイソフォームを濃縮してもよい。親和性枯渇は、上記に記載されている。親和性精製は、分子へのその特異的結合性によって、目的のタンパク質を濃縮する方法を指す。典型的には、分子は、固体支持体、例えば、ビーズ、樹脂、組織培養プレートなどに付着したリガンド（固定化リガンドと称される）である。リガンドの固体支持体への固定化はまた、リガンド－タンパク質相互作用が起こった後に起こり得る。好適なリガンドとしては、抗体、アプタマー、および他のエピトープ結合剤が挙げられる。親和性精製によってＮｆｌを精製することには、Ｎｆｌを含む試料を好適な固定化リガンドと接触させること、１回または複数回の洗浄工程、およびＮｆｌの固定化リガンドからの溶出を含む。Ｎｆｌの親和性精製および／またはＮｆｌの親和性枯渇のための試薬は、当技術分野において公知の方法（例えば、全長組換えＮｆｌを使用して、エピトープ結合剤を作製すること、および次いで、所与のエピトープに結合するエピトープ結合剤を選択すること、組換えＮｆｌペプチドを使用して、Ｎｆｌのある特定の断片に対するエピトープ結合剤を作製することなど）によって作製されてもよい。市販のエピトープ結合剤、例えば、ＡＢＩＮ６０２５６９８（Ａｂｂｅｘａ）、ＡＢＩＮ４３３９１５８（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、１３－０４００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ＵＤ１またはＵＤ２（Ｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）なども使用されてもよい。好適なエピトープ結合剤は、セクションＩＩにも記載されている。
代替的に、Ｎｆｌアイソフォームの濃縮は、直接行われなくてもよいが、むしろＮｆｌアイソフォームまたは複数のＮｆｌアイソフォームの増幅された検出は、間接的に行われてもよい。例えば、近接ライゲーションアッセイ［例えば、Ｄｕｏ－Ｌｉｎｋ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）］を使用して、試薬がそれぞれＮ末端領域およびＣ末端領域に結合するときに増幅されたシグナルを生成することができる試薬を用いて、ＮｆｌアイソフォームのＮ末端領域およびＣ末端領域を検出してもよい。典型的には、試薬は、エピトープ結合剤である。好適なエピトープ結合剤としては、セクションＩＩに記載されているものおよび／または市販抗体が挙げられ得る。近接ライゲーションアッセイなどによるＮｆｌアイソフォームまたは複数のＮｆｌアイソフォームの増幅された検出はまた、濃縮または枯渇工程後に行われてもよい（例えば、配列番号１のアミノ酸５３０～５４０を含むアイソフォームを濃縮するエピトープ結合剤を用いる単一の濃縮工程後など）。
上記の具体的な実施形態において、生体試料中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮する工程は、生体試料を、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団に特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させ、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団を単離することを含み、ここで、エピトープ結合剤は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸９０～２５０内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１１６～１８４内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸２５０～４００内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸２８３～３３８内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；（ｖ）配列番号１のアミノ酸４００～５４３内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；（ｖｉ）配列番号１のアミノ酸４３７～５４３内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；（ｖｉｉ）ＨＪ３０．１もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．２もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．１３もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２もしくはＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤；（ｖｉｉｉ）ＨＪ３０．４もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．７もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．４もしくはＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤；および（ｉｘ）ＨＪ３０．１１、その抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤からなる群から選択される。
上記の別の具体的な実施形態において、生体試料中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮する工程は、（ａ）生体試料を、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団に特異的に結合する第１のエピトープ結合剤と接触させ、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団を単離すること；および（ｂ）Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団が枯渇した試料を、Ｎｆｌアイソフォームの第２の集団に特異的に結合する第２のエピトープ結合剤と接触させ、Ｎｆｌアイソフォームの第２の集団を単離することを含んでいてもよい。代替的には、生体試料は、第１のエピトープ結合剤および第２のエピトープ結合剤と同時に接触させてもよく、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団およびＮｆｌアイソフォームの第２の集団は、順次的または同時に単離されてもよい。好ましい実施形態において、第２のエピトープ結合剤は、第１のエピトープ結合剤のエピトープの下流のエピトープに結合する。一例において、第１のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸１～４５０内の第１のエピトープに特異的に結合し；第２のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸４００～５４３内のエピトープに特異的に結合する。別の例において、第１のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸９０～３００内または配列番号１のアミノ酸２００～４００内の第１のエピトープに特異的に結合し；第２のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸４００～５４３内のエピトープに特異的に結合する。別の例において、第１のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸９０～２５０内または配列番号１のアミノ酸２５０～４００内の第１のエピトープに特異的に結合し；第２のエピトープは、配列番号１のアミノ酸４００～５４３内または配列番号１のアミノ酸４３０～５４０内である。好適なエピトープ結合剤としては、セクションＩＩに記載されているものおよび／または市販抗体が挙げられる。具体的な実施形態において、第１のエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．１もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．２もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．１３もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２もしくはＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤であってもよい。別の具体的な実施形態において、第１のエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．４もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．７もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．４もしくはＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤であってもよい。別の具体的な実施形態において、第２のエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．１１、その抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤であってもよい。別の具体的な実施形態において、第２のエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．４もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．７もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．４もしくはＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤であってもよい。
上記の別の具体的な実施形態において、生体試料中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮する工程は、（ａ）生体試料を、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団に特異的に結合する第１のエピトープ結合剤と接触させ、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団を単離すること；（ｂ）Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団が枯渇した試料を、Ｎｆｌアイソフォームの第２の集団に特異的に結合する第２のエピトープ結合剤と接触させ、Ｎｆｌアイソフォームの第２の集団を単離すること；および（ｃ）Ｎｆｌアイソフォームの第１および第２の集団が枯渇した試料を、Ｎｆｌアイソフォームの第３の集団に特異的に結合する第３のエピトープ結合剤と接触させ、Ｎｆｌアイソフォームの第３の集団を単離することを含んでいてもよい。代替的に、生体試料は、第１のエピトープ結合剤、第２のエピトープ結合剤、および第３のエピトープ結合剤と同時に接触させてもよく、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団、Ｎｆｌアイソフォームの第２の集団、およびＮｆｌアイソフォームの第３の集団は、順次的または任意の組み合わせで単離されてもよい。好ましい実施形態において、第２のエピトープ結合剤は、第１のエピトープ結合剤のエピトープの下流のエピトープに結合してもよく、第３のエピトープ結合剤は、第２のエピトープ結合剤のエピトープの下流のエピトープに結合してもよい。代替的に、第２のエピトープ結合剤は、第１のエピトープ結合剤の上流のエピトープに結合してもよい。一例において、第１のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸１～４００内の第１のエピトープに特異的に結合し；第２のエピトープ結合剤は、第１のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸９０～４５０内の第２のエピトープに特異的に結合し；第３のエピトープ結合剤は、第２のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸４００～５４３内の第３のエピトープに特異的に結合する。別の例において、第１のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸９０～３００内の第１のエピトープに特異的に結合し；第２のエピトープ結合剤は、第１のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸２００～４００内の第２のエピトープに特異的に結合し；第３のエピトープ結合剤は、第２のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸４００～５４３内の第３のエピトープに特異的に結合する。別の例において、第１のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸９０～２５０内の第１のエピトープに特異的に結合し；第２のエピトープ結合剤は、第１のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸２５０～４００内の第２のエピトープに特異的に結合し；第３のエピトープ結合剤は、第２のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸４００～５４３内の第３のエピトープに特異的に結合する。好適なエピトープ結合剤としては、セクションＩＩに記載されているものおよび／または市販抗体が挙げられる。具体的な実施形態において、（ｉ）第１のエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．１もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．２もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．１３もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２もしくはＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤であるか；（ｉｉ）第２のエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．４もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．７もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．４もしくはＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤であるか；（ｉｉｉ）第３のエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．１１、その抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤であるか；あるいは（ｉｖ）それらの任意の組み合わせである。
上記の別の具体的な実施形態において、生体試料中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮する工程は、（ａ）生体試料を、２つ以上のエピトープ結合剤と同時に接触させること（順次的ではない）、ここで、それぞれのエピトープ結合剤が、Ｎｆｌの異なるエピトープに特異的に結合する；ならびに（ｂ）工程（ａ）において濃縮された１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを検出し、適宜定量することを含んでいてもよい。一例において、第１のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸１～４００内の第１のエピトープに特異的に結合し；第２のエピトープ結合剤は、第１のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸９０～４５０内の第２のエピトープに特異的に結合し；第３のエピトープ結合剤は、第２のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸４００～５４３内の第３のエピトープに特異的に結合する。別の例において、第１のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸９０～３００内の第１のエピトープに特異的に結合し；第２のエピトープ結合剤は、第１のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸２００～４００内の第２のエピトープに特異的に結合し；第３のエピトープ結合剤は、第２のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸４００～５４３内の第３のエピトープに特異的に結合する。別の例において、第１のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸９０～２５０内の第１のエピトープに特異的に結合し；第２のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸２５０～４００内の第２のエピトープに特異的に結合し；第３のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸４００～５４３内の第３のエピトープに特異的に結合する。好適なエピトープ結合剤としては、セクションＩＩに記載されているものおよび／または市販抗体が挙げられる。具体的な実施形態において、２つ以上のエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．１、ＨＪ３０．１の抗原結合性断片、ＨＪ３０．２、ＨＪ３０．２の抗原結合性断片、ＨＪ３０．１３、ＨＪ３０．１３の抗原結合性断片、ＨＪ３０．４、ＨＪ３０．４の抗原結合性断片、ＨＪ３０．７、ＨＪ３０．７の抗原結合性断片、ＨＪ３０．１１、ＨＪ３０．１１の抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２、ＨＪ３０．４、ＨＪ３０．７、ＨＪ３０．１１、およびＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤からなる群から選択される。別の具体的な実施形態において、１つのエピトープ結合剤は、群（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）から選択され、少なくとも１つの追加のエピトープ結合剤は、異なる群（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）から選択され、ここで、群（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）は、（ｉ）ＨＪ３０．１もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．２もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．１３もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２もしくはＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤；（ｉｉ）ＨＪ３０．４もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．７もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．４もしくはＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤；（ｉｉｉ）ＨＪ３０．１１、その抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。別の具体的な実施形態において、少なくとも１つのエピトープ結合剤は、群（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のそれぞれから選択され、ここで、群（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）は、（ｉ）ＨＪ３０．１もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．２もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．１３もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２もしくはＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤；（ｉｉ）ＨＪ３０．４もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．７もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．４もしくはＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤；（ｉｉｉ）ＨＪ３０．１１、その抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。
内部標準（本明細書において「ＩＳＴＤ」と略される）を使用して、濃縮の間にわたる変動を説明し、適宜、絶対濃度を算出してもよい。一般に、内部標準は、重要な試料の処理の前に添加され、これは、必要により１回よりも多く添加され得る。１つまたは複数の全長Ｎｆｌアイソフォームが使用されてもよい。代替的にまたはそれに加えて、翻訳後修飾を有するＮｆｌおよび／またはＮｆｌのペプチド断片のアイソフォームも使用されてもよい。例えば、複数のアイソフォームの順次的単離を用いる実施形態において、単離工程の数に等しい内部標準の数を使用することが有利であり得、ここで、それぞれの内部標準は、それぞれの単離工程が、単一の内部標準だけを単離するように、Ｎｆｌの異なるペプチド断片である。一部の実施形態において、それぞれの内部標準は、異なるＡＱＵＡペプチド（すなわち、ＭＳによって検出される目的のペプチドに対応する安定な同位体標識ペプチド）であってもよい。代替的に、最終単離工程のＮｆｌアイソフォームが目的のものみである場合、単一の内部標準が使用されてもよく、ここで、内部標準は、最終工程まで単離／濃縮されないペプチド断片である。一部の実施形態において、内部標準は、ＡＱＵＡペプチドであってもよい。典型的には、内部標準は、分離のために依拠する化学的特性に影響を及ぼすことはないが、内因性Ｎｆｌ分析物からＮｆｌ標準を識別するために、検出可能に標識される。一部の実施形態において、内部標準は、同位体標識内部Ｎｆｌ標準である。好適な同位体標識内部Ｎｆｌ標準は、少なくとも１つのアミノ酸残基に組み込まれた重同位体標識を有する。一般的に言えば、組み込まれる標識アミノ酸残基は、その化学的特性に影響を及ぼすことなく、ペプチドの質量を増加させるはずであり、同位体標識の存在から生じる質量シフトは、質量分析方法が、内因性Ｎｆｌ分析物のシグナルから内部標準（ＩＳ）を識別することを可能にするのに十分でなければならない。本明細書に示されるように、好適な重同位体標識としては、限定されるものではないが、２Ｈ、１３Ｃおよび１５Ｎが挙げられる。一例において、内部標準は、Ｌｙｓ、Ａｒｇの１３Ｃおよび１５Ｎ標識組換え全長ＮｆｌまたはＮｆｌのペプチド断片であってもよい。典型的には、約０．１～１０ｎｇの内部標準が、通常、適切な緩衝液（例えば、ＴＢＥＡＣ、約０．０１～２％のアルブミンなど）に十分に希釈される。例示的な実施形態において、約１％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）中に約１ｎｇ～約２．５ｎｇである。
（ｃ）以前に濃縮された１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを検出する工程
Ｎｆｌアイソフォームは、限定されるものではないが、イムノアッセイ、マルチプレックスアッセイ（ＬｕｍｉｎｅｘによるｘＭＡＰ技術など）、単一分子アレイアッセイ［Ｓｉｍｏａ（登録商標）ビーズ技術など］、近接ライゲーションアッセイ［Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈによるＤｕｏＬｉｎｋ（登録商標）など］などを含む、下記にまたは実施例においてさらに詳述されるように質量分析によって、または当技術分野において公知の他の方法によって、濃縮された試料中で検出され、適宜定量され得る。
Ｎｆｌアイソフォームは、限定されるものではないが、イムノアッセイ、マルチプレックスアッセイ（ＬｕｍｉｎｅｘによるｘＭＡＰ技術など）、単一分子アレイアッセイ［Ｓｉｍｏａ（登録商標）ビーズ技術など］、近接ライゲーションアッセイ［Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈによるＤｕｏＬｉｎｋ（登録商標）など］などを含む、下記にまたは実施例においてさらに詳述されるように質量分析によって、または当技術分野において公知の他の方法によって、濃縮された試料中で検出され、適宜定量され得る。
一部の実施形態において、Ｎｆｌアイソフォームは、質量分析によって濃縮された試料中で検出され、適宜定量される。簡潔には、質量分析による検出は、濃縮されたＮｆｌアイソフォームをプロテアーゼにより切断すること、および固相抽出によって、得られた切断生成物を適宜脱塩して、Ｎｆｌのタンパク質分解ペプチドを含む試料を得ること；ならびにＮｆｌのタンパク質分解ペプチドを含む試料の液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を行って、Ｎｆｌの少なくとも１つのタンパク質分解ペプチドを検出することを含む。本明細書において開示される方法のいずれかにおいて、Ｎｆｌの任意のタンパク質分解ペプチドの量も定量されてもよい（例えば、適切なタンパク質分解ペプチドに対応するＭＳ分析のピークの高さまたは積分から）。したがって、実際には、Ｎｆｌの１つまたは複数のタンパク質分解ペプチドを使用して、生体試料中に存在するＮｆｌタンパク質の量が検出および測定される。血液およびＣＳＦが、複数のＮｆｌアイソフォームを含有し、複数のアイソフォームのサブセットが、配列類似性を共有するので（図２２を参照されたい）、Ｎｆｌのタンパク質分解ペプチドの測定は、濃縮方法が所与のアイソフォームに特異的である限り、測定されるタンパク質分解ペプチドを含有する生体試料中の複数のＮｆｌアイソフォームのレベルを記載し得る。
トリプシンがプロテアーゼである実施形態において、Ｎｆｌの存在を示す好適なＮｆｌのタンパク質分解ペプチドは、実施例に記載され得る通りである。例えば、トリプシンペプチド［３７０，３７８］、［３７９，３８９］、および［３９１，３９８］は、Ｎｆｌに固有ではなく、従って、目的が生体試料中のＮｆｌを定量することである場合に好ましくない。一部の実施形態において、Ｎｆｌの存在を示す好適なＮｆｌのタンパク質分解ペプチドは、表Ｃにリストされたペプチドから選択され得る。例示的なトリプシンペプチドとしては、配列番号１のアミノ酸１０８～１１６、配列番号１のアミノ酸１１７～１２６、配列番号１のアミノ酸１６５～１７２、配列番号１のアミノ酸１９８～２０６、配列番号１のアミノ酸３２４～３３１、配列番号１のアミノ酸４００～４２１、配列番号１のアミノ酸４２２～４３７、配列番号１のアミノ酸４３８～４６２、および配列番号１のアミノ酸５３０～５４０を有するトリプシンペプチドが挙げられる。消化のために代替の酵素を使用する場合、得られるタンパク質分解ペプチドは、わずかに異なり得るが、当業者によって容易に決定することができる。理論に縛られることを望まないが、同じ種類の２つの生体試料（例えば、２つの血液試料）間のトリプシンペプチドの量の変動は、これらの生体試料を構成するＮｆｌアイソフォームにおける相違を反映すると考えられる。本明細書において開示されるように、ある特定のＮｆｌのタンパク質分解ペプチドの量、およびある特定のＮｆｌのタンパク質分解ペプチドの比は、神経損傷を診断する、神経変性疾患の診断の情報を与える、さらなる診断検査のために患者を選択する、処置の決定をガイドする、またはそれらの任意の組み合わせのために臨床的に重要な意味を持つ情報を提供し得る。したがって、Ｎｆｌのトリプシンペプチドの検出および定量を可能にする方法は、多くの疾患の診断、予後診断、および処置における有用性を有する。
Ｎｆｌのタンパク質分解ペプチドは、高分解能質量分析計と接続された液体クロマトグラフィーシステムによって分離されてもよい。好適なＬＣ－ＭＳシステムは、＜１．０ｍｍのＩＤのカラムを含み、約１００μｌ／分未満の流速を使用してもよい。好ましい実施形態において、ナノフローＬＣ－ＭＳシステムが使用される（例えば、約５０～１００μｍのＩＤのカラムおよび＜１μＬ／分、好ましくは、約１００～８００ｎＬ／分、より好ましくは、約２００～６００ｎＬ／分の流速）。例示的な実施形態において、ＬＣ－ＭＳシステムは、０．０５ｍＭのＩＤのカラムを含み、約４００ｎＬ／分の流速を使用してもよい。
当技術分野において公知であるように、タンデム質量分析を使用して、分解能を改善してもよく、または技術を、単一の質量分析器を用いてタンデム質量分析法の分解能を達成するように改善してもよい。好適な質量分析器の種類は、当技術分野において公知である。これらとしては、限定されるものではないが、四重極、飛行時間型、イオントラップおよびＯｒｂｉｔｒａｐ、ならびに異なる種類の質量分析器を１つの構成に組み合わせたハイブリッド質量分析器［例えば、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）質量分析器、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）質量分析器、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）質量分析器、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ 質量分析器、それぞれＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］が挙げられる。例示的な実施形態において、ＬＣ－ＭＳシステムは、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）質量分析器、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）質量分析器、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）質量分析器、または四重極で類似のまたは改善されたイオン集束およびイオン透過性を有する質量分析器から選択される質量分析器を含んでいてもよい。好適な質量分析プロトコールは、分析の前に収集されたイオンの数（例えば、Ｏｒｂｉｔｒａｐ を使用するＡＧＣ設定）および／または注入時間を最適化することによって発展し得る。例示的な実施形態において、実施例において概説される質量分析プロトコールが使用される。
ＭＳによって分析されるタンパク質分解ペプチドは、当技術分野において公知の方法によって定量されてもよい。一般的に言えば、既知量の内部標準が試料に添加される。次いで、試料は、消化され、ＬＣ－ＭＳによって分析される。抽出されたイオンクロマトグラムを、ネイティブペプチドおよび内部標準について作成する。ピーク比（例えば、１４Ｎ／１５Ｎ）を使用して、ネイティブペプチドの量が算出される。
ＩＶ．バイオマーカーを検出するための方法およびその使用
別の態様において、本開示は、対象から得られた試料中のタンパク質バイオマーカーを検出し、適宜定量するための方法を提供する。方法は、セクションＩＩＩの方法に従ってＮｆｌを検出し、適宜定量する工程を含み、ここで、生体試料は、神経損傷を有するかまたはそれを有するリスクがある対象から得られた試料であり、バイオマーカーは、濃縮されたＮｆｌアイソフォーム、第１のＮｆｌアイソフォームの第２のＮｆｌアイソフォームに対する比、Ｎｆｌアイソフォームの濃縮された集団、または濃縮されたＮｆｌアイソフォームの第１の集団および濃縮されたアイソフォームの第２の集団の比である。一部の実施形態において、神経損傷は、軸索損傷を含み得る。一部の実施形態において、神経損傷は、軸索損傷である。神経損傷の種類は、限定されず、急性もしくは慢性傷害（例えば、外傷性脳損傷など）、神経炎症、および／または神経変性疾患に起因していてもよい。神経変性疾患の非限定的な例としては、筋萎縮性側索硬化症、シャルコー－マリー－トゥース病、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、クロイツフェルト－ヤコブ病、拳闘家認知症、ダウン症、ゲルストマン－ストロイスラー－シャインカー病、ハンチントン病、封入体筋炎、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、外傷性脳損傷、グアム筋萎縮性側索硬化症／パーキンソニズム－認知症複合、神経原線維変化を伴う非グアム島運動神経疾患、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、前頭側頭型認知症、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、ハラーホルデン－スパッツ病、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、多発性硬化症、多系統萎縮症、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン－ピック病Ｃ型、パリド－ポント－黒質変性症、パーキンソン病、ピック病、進行性皮質下グリオーシス、脳炎後パーキンソニズム、ＰＡＲＴ（原発性加齢関連タウオパチー）、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、亜急性硬化性全脳症、濃縮体のみの認知症（または濃縮体優位型認知症）、濃縮体優位型認知症、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、緑内障、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、グアドループ島パーキンソニズム、脳鉄蓄積を伴う神経変性、ＳＬＣ９Ａ６関連精神遅滞、ＨＩＶ関連認知症、老人性心アミロイドーシスが挙げられる。「対照対象」または「健康な対照」と称される場合がある健康な対象は、最小限に、認知機能障害の臨床徴候または症状を有さず、神経損傷、神経変性疾患、および／または外傷性脳損傷の他の臨床徴候または症状に対して「陰性」であることもある。
別の態様において、本開示は、対象から得られた試料中のタンパク質バイオマーカーを検出し、適宜定量するための方法を提供する。方法は、セクションＩＩＩの方法に従ってＮｆｌを検出し、適宜定量する工程を含み、ここで、生体試料は、神経損傷を有するかまたはそれを有するリスクがある対象から得られた試料であり、バイオマーカーは、濃縮されたＮｆｌアイソフォーム、第１のＮｆｌアイソフォームの第２のＮｆｌアイソフォームに対する比、Ｎｆｌアイソフォームの濃縮された集団、または濃縮されたＮｆｌアイソフォームの第１の集団および濃縮されたアイソフォームの第２の集団の比である。一部の実施形態において、神経損傷は、軸索損傷を含み得る。一部の実施形態において、神経損傷は、軸索損傷である。神経損傷の種類は、限定されず、急性もしくは慢性傷害（例えば、外傷性脳損傷など）、神経炎症、および／または神経変性疾患に起因していてもよい。神経変性疾患の非限定的な例としては、筋萎縮性側索硬化症、シャルコー－マリー－トゥース病、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、クロイツフェルト－ヤコブ病、拳闘家認知症、ダウン症、ゲルストマン－ストロイスラー－シャインカー病、ハンチントン病、封入体筋炎、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、外傷性脳損傷、グアム筋萎縮性側索硬化症／パーキンソニズム－認知症複合、神経原線維変化を伴う非グアム島運動神経疾患、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、前頭側頭型認知症、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、ハラーホルデン－スパッツ病、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、多発性硬化症、多系統萎縮症、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン－ピック病Ｃ型、パリド－ポント－黒質変性症、パーキンソン病、ピック病、進行性皮質下グリオーシス、脳炎後パーキンソニズム、ＰＡＲＴ（原発性加齢関連タウオパチー）、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、亜急性硬化性全脳症、濃縮体のみの認知症（または濃縮体優位型認知症）、濃縮体優位型認知症、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、緑内障、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、グアドループ島パーキンソニズム、脳鉄蓄積を伴う神経変性、ＳＬＣ９Ａ６関連精神遅滞、ＨＩＶ関連認知症、老人性心アミロイドーシスが挙げられる。「対照対象」または「健康な対照」と称される場合がある健康な対象は、最小限に、認知機能障害の臨床徴候または症状を有さず、神経損傷、神経変性疾患、および／または外傷性脳損傷の他の臨床徴候または症状に対して「陰性」であることもある。
一部の実施形態において、バイオマーカーは、Ｎｆｌの桿状ドメインから実質的になるアミノ酸配列を有するアイソフォーム、Ｎｆｌの桿状ドメインの一部分から実質的になるアミノ酸配列を有するアイソフォーム、Ｎｆｌの桿状ドメインの一部分からなり、この領域外のアミノ酸なしのアミノ酸配列を有するアイソフォーム、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＮｆｌアイソフォームの集団であってもよい。桿状ドメインは、典型的には、配列番号１のアミノ酸９０～３９６を含むとして記載される。例えば、バイオマーカーは、最大で約３３０アミノ酸長（例えば、約３３０、約３２５、約３２０、約３１５、約３１０アミノ酸）を有する配列番号１のアミノ酸９０～３９６を含む１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。代替的にまたはそれに加えて、バイオマーカーは、配列番号１のアミノ酸９０～３９６の断片である１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。例えば、バイオマーカーは、３１０アミノ酸長未満（約３０５、約３００、約２７５、約２５０、約２２５、約２００、約１７５、約１５０、約１２５、約１００、約７５、約５０、約２５など）であり、配列番号１のアミノ酸１６４～１７１、配列番号１のアミノ酸１９７～２０５、配列番号１のアミノ酸３２３～３３０、またはそれらの任意の組み合わせを含む、１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。一部の例において、バイオマーカーは、約２００アミノ酸長未満であり、配列番号１のアミノ酸１６５～１７２、配列番号１のアミノ酸１９８～２０６、またはそれらの任意の組み合わせを含む、１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。代替的にまたはそれに加えて、バイオマーカーは、配列番号１のアミノ酸１２５～３９６の断片である１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。例えば、バイオマーカーは、約２７５アミノ酸長以下であり、配列番号１のアミノ酸１６５～１７２、配列番号１のアミノ酸１９８～２０６、配列番号１のアミノ酸３２４～３３１、またはそれらの任意の組み合わせを含む、１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。
一部の実施形態において、バイオマーカーは、Ｎｆｌのテール領域から実質的になるアイソフォーム、Ｎｆｌのテール領域の一部分からなるアミノ酸配列を有するアイソフォーム、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるＮｆｌアイソフォームの集団であってもよい。テール領域は、典型的には、配列番号１のアミノ酸３９７～５４３として記載される。例えば、バイオマーカーは、１４７アミノ酸長～約２００アミノ酸長である配列番号１のアミノ酸３９７～５４３を含む１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。代替的にまたはそれに加えて、バイオマーカーは、配列番号１のアミノ酸３９７～５４３の断片である１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。例えば、バイオマーカーは、１４７アミノ酸長未満であり、配列番号１のアミノ酸４２２～４３７、配列番号１のアミノ酸４３８～４６２、配列番号１のアミノ酸５３０～５４０、またはそれらの任意の組み合わせを含む、１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。別の実施形態において、バイオマーカーは、約１００アミノ酸長以下より少なく、配列番号１のアミノ酸４２２～４３７、配列番号１のアミノ酸４３８～４６２、配列番号１のアミノ酸５３０～５４０、またはそれらの任意の組み合わせを含む、１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。
さらなる実施形態において、バイオマーカーは、上記に記載される２つのバイオマーカーの比であってもよい。非限定的な例として、バイオマーカーは、桿状領域由来の２つのバイオマーカーの比、またはテール領域由来の２つのバイオマーカーの比、またはより好ましくは、桿状領域由来の１つのバイオマーカーおよびテール領域由来の１つのバイオマーカーの比であってもよい。またさらなる実施形態において、バイオマーカーは、バイオマーカーのＮｆｌの総量に対する比であってもよい。他の数学的演算、および２つよりも多くのバイオマーカーの使用も企図される。例えば、第１および第２の生体試料が分析され、ここで、第２の試料が、第１の（例えば、日、週、月、年）後の期間に得られる場合、バイオマーカーの変化の速度が使用されてもよい。
一部の実施形態において、バイオマーカーは、（ｉ）ＨＪ３０．１もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．２もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．１３もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２もしくはＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤；（ｉｉ）ＨＪ３０．４もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．７もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．４もしくはＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤；あるいは（ｉｉｉ）ＨＪ３０．１１、その抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤から選択されるエピトープ結合剤を用いて親和性精製されたＮｆｌアイソフォームの集団であってもよい。
一部の実施形態において、バイオマーカーは以下であってもよい。
（ａ）配列番号１のアミノ酸１６５～１７２および／または配列番号１のアミノ酸１９８～２０６を含むＮｆｌアイソフォームの集団であって、Ｎｆｌアイソフォームの集団が、（ｉ）ＨＪ３０．１もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．２もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．１３もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２もしくはＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤から選択されるエピトープ結合剤を用いて親和性精製されている、Ｎｆｌアイソフォームの集団；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸３２４～３３１を含むＮｆｌアイソフォームの集団であって、Ｎｆｌアイソフォームの集団が、ＨＪ３０．４もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．７もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．４もしくはＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤から選択されるエピトープ結合剤を用いて親和性精製されている、Ｎｆｌアイソフォームの集団；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸５３０～５４０を含むＮｆｌアイソフォームの集団であって、Ｎｆｌアイソフォームの集団が、ＨＪ３０．１１、その抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤から選択されるエピトープ結合剤を用いて親和性精製されている、Ｎｆｌアイソフォームの集団；
（ｄ）（ａ）の（ｂ）に対する比；
（ｅ）（ｂ）の（ｃ）に対する比；あるいは
（ｆ）（ａ）の（ｃ）に対する比。
（ａ）配列番号１のアミノ酸１６５～１７２および／または配列番号１のアミノ酸１９８～２０６を含むＮｆｌアイソフォームの集団であって、Ｎｆｌアイソフォームの集団が、（ｉ）ＨＪ３０．１もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．２もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．１３もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２もしくはＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤から選択されるエピトープ結合剤を用いて親和性精製されている、Ｎｆｌアイソフォームの集団；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸３２４～３３１を含むＮｆｌアイソフォームの集団であって、Ｎｆｌアイソフォームの集団が、ＨＪ３０．４もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．７もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．４もしくはＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤から選択されるエピトープ結合剤を用いて親和性精製されている、Ｎｆｌアイソフォームの集団；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸５３０～５４０を含むＮｆｌアイソフォームの集団であって、Ｎｆｌアイソフォームの集団が、ＨＪ３０．１１、その抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤から選択されるエピトープ結合剤を用いて親和性精製されている、Ｎｆｌアイソフォームの集団；
（ｄ）（ａ）の（ｂ）に対する比；
（ｅ）（ｂ）の（ｃ）に対する比；あるいは
（ｆ）（ａ）の（ｃ）に対する比。
上記の実施形態において、Ｎｆｌアイソフォームのそれぞれの集団は、生体試料から単離されてもよく、または他のＮｆｌアイソフォームが以前に枯渇された試料から単離されてもよい。非限定的な例として、（ｃ）におけるＮｆｌアイソフォームの集団は、（ａ）が枯渇したか、（ｂ）が枯渇したか、または（ａ）および（ｂ）が枯渇した試料から単離されてもよい。
一例において、方法は、（ａ）対象から得られた生体試料を準備する工程であって、生体試料が、血液試料またはＣＳＦ試料である、工程、（ｂ）生体試料中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮する工程であって、濃縮する工程が、（ｉ）生体試料を、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団に特異的に結合する第１のエピトープ結合剤と接触させ、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団を単離すること；（ｉｉ）Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団が枯渇した試料を、Ｎｆｌアイソフォームの第２の集団に特異的に結合する第２のエピトープ結合剤と接触させ、Ｎｆｌアイソフォームの第２の集団を単離すること；および（ｉｉｉ）Ｎｆｌアイソフォームの第１および第２の集団が枯渇した試料を、Ｎｆｌアイソフォームの第３の集団に特異的に結合する第３のエピトープ結合剤と接触させ、Ｎｆｌアイソフォームの第３の集団を単離することを含むかまたはそれからなる、工程、ならびに（ｃ）第１の集団、第２の集団、第３の集団、またはそれらの任意の組み合わせ中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを検出し、適宜定量する工程を含み、ここで、バイオマーカーは、（ｃ）において検出されたＮｆｌアイソフォームもしくはＮｆｌアイソフォームの集団、または（ｃ）において検出されたＮｆｌアイソフォームもしくはＮｆｌアイソフォームの集団間の比である。好ましい実施形態において、第２のエピトープ結合剤は、第１のエピトープ結合剤のエピトープの下流のエピトープに結合してもよく、第３のエピトープ結合剤は、第２のエピトープ結合剤のエピトープの下流のエピトープに結合してもよい。代替的に、第２のエピトープ結合剤は、第１のエピトープ結合剤の上流のエピトープに結合してもよい。一例において、第１のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸１～４００内の第１のエピトープに特異的に結合し；第２のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸９０～４５０内の第２のエピトープに特異的に結合し；第３のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸４００～５４３内の第３のエピトープに特異的に結合する。別の例において、第１のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸９０～３００内の第１のエピトープに特異的に結合し；第２のエピトープ結合剤は、第１のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸２００～４００内の第２のエピトープに特異的に結合し；第３のエピトープ結合剤は、第２のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸４００～５４３内の第３のエピトープに特異的に結合する。別の例において、第１のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸９０～２５０内の第１のエピトープに特異的に結合し；第２のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸２５０～４００内の第２のエピトープに特異的に結合し；第３のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸４００～５４３内の第３のエピトープに特異的に結合する。好適なエピトープ結合剤としては、セクションＩＩに記載されているものおよび／または市販抗体が挙げられる。具体的な実施形態において、（ｉ）第１のエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．１もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．２もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．１３もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２もしくはＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤であるか；（ｉｉ）第２のエピトープ結合剤が、ＨＪ３０．４もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．７もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．４もしくはＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤であるか；（ｉｉｉ）第３のエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．１１、その抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤であるか；あるいは（ｉｖ）それらの任意の組み合わせである。
一部の実施形態において、方法は、（ａ）対象から得られた生体試料を準備する工程であって、生体試料が、血液試料またはＣＳＦ試料である、工程、（ｂ）生体試料を、２つ以上のエピトープ結合剤と接触させることによって、複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮する工程であって、それぞれのエピトープ結合剤が、Ｎｆｌの異なるエピトープに特異的に結合する、工程、および（ｃ）工程（ｂ）において濃縮された１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを検出し、適宜定量する工程を含み、ここで、バイオマーカーは、（ｃ）において検出されたＮｆｌアイソフォームもしくはＮｆｌアイソフォームの集団、または（ｃ）において検出されたＮｆｌアイソフォームもしくはＮｆｌアイソフォームの集団間の比である。一例において、第１のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸１～４００内の第１のエピトープに特異的に結合し；第２のエピトープ結合剤は、第１のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸９０～４５０内の第２のエピトープに特異的に結合し；第３のエピトープ結合剤は、第２のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸４００～５４３内の第３のエピトープに特異的に結合する。別の例において、第１のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸９０～３００内の第１のエピトープに特異的に結合し；第２のエピトープ結合剤は、第１のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸２００～４００内の第２のエピトープに特異的に結合し；第３のエピトープ結合剤は、第２のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸４００～５４３内の第３のエピトープに特異的に結合する。別の例において、第１のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸９０～２５０内の第１のエピトープに特異的に結合し；第２のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸２５０～４００内の第２のエピトープに特異的に結合し；第３のエピトープ結合剤は、配列番号１のアミノ酸４００～５４３内の第３のエピトープに特異的に結合する。好適なエピトープ結合剤としては、セクションＩＩに記載されているものおよび／または市販抗体が挙げられる。具体的な実施形態において、２つ以上のエピトープ結合剤は、ＨＪ３０．１、ＨＪ３０．１の抗原結合性断片、ＨＪ３０．２、ＨＪ３０．２の抗原結合性断片、ＨＪ３０．１３、ＨＪ３０．１３の抗原結合性断片、ＨＪ３０．４、ＨＪ３０．４の抗原結合性断片、ＨＪ３０．７、ＨＪ３０．７の抗原結合性断片、ＨＪ３０．１１、ＨＪ３０．１１の抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２、ＨＪ３０．４、ＨＪ３０．７、ＨＪ３０．１１、およびＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤からなる群から選択される。別の具体的な実施形態において、１つのエピトープ結合剤は、群（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）から選択され、少なくとも１つの追加のエピトープ結合剤は、異なる群（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）から選択され、ここで、群（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）は、（ｉ）ＨＪ３０．１もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．２もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．１３もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２もしくはＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤；（ｉｉ）ＨＪ３０．４もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．７もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．４もしくはＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤；（ｉｉｉ）ＨＪ３０．１１、その抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。別の具体的な実施形態において、少なくとも１つのエピトープ結合剤は、群（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のそれぞれから選択され、ここで、群（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）は、（ｉ）ＨＪ３０．１もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．２もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．１３もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２もしくはＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤；（ｉｉ）ＨＪ３０．４もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．７もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．４もしくはＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤；（ｉｉｉ）ＨＪ３０．１１、その抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。
バイオマーカーの検出および定量は、いくつかの目的のために使用され得る。非限定的な例としては、神経損傷を診断すること、神経損傷によって特徴付けられる疾患または状態（例えば、外傷性脳損傷、神経変性疾患など）を診断すること、神経損傷および／または神経損傷によって特徴付けられる疾患状態の発生または進行をモニタリング／測定すること、神経損傷を有する対象を処置すること、所与の処置の有効性を決定／測定することなどが挙げられる。
したがって、別の態様において、方法は、上記の実施形態のいずれかに記載されるようにして、バイオマーカーのレベルを検出および定量する工程、ならびにレベルが、認知機能が正常である対照対象におけるそのレベルと比較して低減されているかを決定する工程を含む。別の態様において、方法は、上記の実施形態のいずれかに記載されるようにして、バイオマーカーのレベルを検出および定量する工程、ならびにレベルが、認知機能が正常であり、神経変性疾患または外傷性脳損傷の１つまたは複数の追加の臨床徴候または症状について陰性でもある対照対象におけるそのレベルと比較して低減されているかを決定する工程を含む。別の態様において、方法は、上記の実施形態のいずれかに記載されるようにして、バイオマーカーのレベルを検出および定量する工程、ならびにレベルが、認知機能が正常であり、アミロイド陰性（Ａβ－）でもある対照対象におけるそのレベルと比較して低減されているかを決定する工程を含む。別の態様において、方法は、上記の実施形態のいずれかに記載されるようにして、バイオマーカーのレベルを検出および定量する工程、ならびにレベルが、認知機能が正常であり、脳におけるタウ沈着の病理学的レベルについて陰性でもある対照対象におけるそのレベルと比較して低減されているかを決定する工程を含む。認知症を含む認知機能障害を評価するための臨床検査は、当技術分野において公知である。非限定的な例として、臨床的認知症尺度（ＣＤＲ）検査が使用されてもよい。脳における病原性タンパク質沈着を評価するためのタウＰＥＴトレーサーまたはＡβ ＰＥＴトレーサーの使用も当技術分野において周知である。
一部の実施形態において、対象は、バイオマーカーのレベルが、対照対象における平均から有意に逸脱する場合に、神経損傷を有すると診断されてもよい。「平均から有意に逸脱する」は、平均の、少なくとも１標準偏差、好ましくは、少なくとも１．３標準偏差、より好ましくは、少なくとも１．５標準偏差、またはさらにより好ましくは、少なくとも２標準偏差上または下である（例えば、１σ、１．１σ、１．２σ、１．３σ、１．４σ、１．５σなど、ここで、σは、対照集団において測定された正規分布によって定義される標準偏差である）値を指す。閾値（例えば、平均の少なくとも１標準偏差上または下）を使用することに加えて、一部の実施形態において、平均の上または下の変化の程度を、対象を診断するために使用してもよい。
別の態様において、方法は、上記の実施形態のいずれかに記載されるようにして、対象から得られた第１の生体試料および対象から得られた第２の生体試料中のバイオマーカーのレベルを検出および定量する工程であって、第１の生体試料および第２の生体試料が、両方とも血液試料または両方ともＣＳＦ試料であり、第２の生体試料が、第１の生体試料後に得られた、工程を含む。
別の態様において、方法は、上記の実施形態のいずれかに記載されるようにして、対象から得られた第１の生体試料および対象から得られた第２の生体試料中のバイオマーカーのレベルを検出および定量する工程であって、第１の生体試料および第２の生体試料が、両方とも血液試料または両方ともＣＳＦ試料であり、第２の生体試料が、第１の生体試料後に得られた、工程を含む。第１の試料と比較した第２の試料中のバイオマーカーレベルの増加は、神経損傷の増加を示す。一部の実施形態において、第１およびその後の試料間のバイオマーカーのレベルの変化の速度を使用して、疾患のステージおよび／または神経損傷の程度が決定される。したがって、そのような方法を使用して、神経損傷を有するか、または神経損傷を有するリスクがある対象をモニタリングしてもよい。
一部の実施形態において、上記の方法の１つまたは複数は、特異的な神経変性疾患を診断、ステージ分け、および／または処置することが当技術分野において公知の１つまたは複数の疾患バイオマーカーと組み合わせて使用されてもよい。例えば、データは、ＡＤ進行における事象の病態生理学的カスケードが、ＣＳＦおよび血液の血漿Ａβ４２／Ａβ４０比の変化で開始し、それに続いてｐ－タウ２０５、ＮｆＬ、総タウ濃度、代謝低下、および萎縮の増加の前に、特異的なＣＳＦのタウ種（例えば、ｐ－タウ２１７、ｐ－タウ２３１、ｐ－タウ１８１、ｐ－タウ１５３、ｐ－タウ１１１）のリン酸化の増加に関連する、アミロイドＰＥＴによって測定されるアミロイドプラークが増加することを示す。最後に、ＭＴＢＲ－タウ（例えば、ＭＴＢＲ－タウ２９９、ＭＴＢＲ－タウ２４３、ＭＴＢＲ－タウ３５４、ＭＴＢＲ－タウ３Ｒ）の一部の種は、タウＰＥＴによるタウ凝集および臨床症状の開始の前にまたはそれとともに増加し、長期的なタウ凝集および臨床的進行と相関する。これらの知見は、Ａβ、ｐ－タウ、ＭＴＢＲ－タウの尺度の１つまたは複数と組み合わせた、ＣＳＦおよび血液のＮｆｌの尺度が、脳のアミロイド症、タウオパチー、および神経変性の非常に正確なバイオマーカーであり、前臨床および臨床ＡＤのステージを正確に特定し、ある特定の疾患プロセスを標的にする処置の有効性を予測することができる。ＡＤ以外の神経変性疾患の診断、ステージ分け、および処置のための他の疾患バイオマーカーとの併用も企図される。
一部の実施形態において、上記の方法の１つまたは複数は、ＰＥＴまたは腰椎穿刺などのより侵襲的な診断方法に加えてまたはその代替として使用されてもよい。したがって、上記の方法のいずれかにおいて、一部の態様における対象は、ＰＥＴイメージングなどの診断検査を以前に受けていない。
一部の実施形態において、上記の方法の１つまたは複数を使用して、対象が、例えば、より侵襲的な診断方法であり得る追加の診断検査を受けるべきかどうかを決定してもよい。例えば、Ｎｆｌレベルまたは別の臨床徴候と組み合わせたＮｆｌレベルが、アルツハイマー病を示唆する場合、対象は、アミロイドに基づくＰＥＴまたはタウに基づくＰＥＴを受けるように選択されてもよい。代替的にまたはそれに加えて、Ｎｆｌレベルを使用して、認知検査、または最初の検査が、例えば、疾患の存在または特定の疾患ステージをさらに確認するために行われた場合に、さらなる認知検査を受けるための対象を選択してもよい。代替的にまたはそれに加えて、Ｎｆｌレベルを使用して、追加のバイオマーカー検査、例えば、アポリポタンパク質Ｊ、ハンチンチンタンパク質、シヌクレイン、可溶性アミロイド前駆体タンパク質、α－２マクログロブリン、Ｓ１００Ｂ、ミエリン塩基性タンパク質、インターロイキン、スーパーオキシドジスムターゼ、ＴＮＦ、ＴＲＥＭ－２、ＴＤＰ－４３、ＹＫＬ－４０、ＶＩＬＩＰ－１、プリオンタンパク質、ｐＮＦＨ、ＤＪ－１などの特定のアイソフォームの総レベルまたはそのレベルを決定するための検査を受けるための患者を選択してもよい。
一部の実施形態において、上記の方法の１つまたは複数を使用して、認知状態または認知機能低下の予後診断も行ってもよい。したがって、一部の実施形態において、本開示は、神経変性疾患、神経炎症、または外傷性脳損傷によって引き起こされる神経損傷を含む、神経損傷を有するヒト対象において認知状態を予測するかまたは認知機能低下を予測する使用のための上記の方法に関する。したがって、さらなる実施形態において、本開示は、神経変性疾患の進行を予測する使用のための上記の方法に関する。
別の態様において、方法は、（ａ）上記の実施形態のいずれかに記載されるようにして、本明細書に記載されるバイオマーカーである、対象から得られた第１の生体試料中のバイオマーカーのレベルを検出および定量する工程；（ｂ）処置を対象に投与する工程；ならびに（ｃ）処置後に対象から得られた第２の生体試料において、工程（ａ）において定量されたバイオマーカーを検出および定量する工程を含み、ここで、第１の生体試料および第２の生体試料は、両方とも血液試料または両方ともＣＳＦ試料である。第１の試料と比較した、第２の試料における、バイオマーカーのレベルの変化の不在、またはバイオマーカーのレベルの減少のいずれかは、ポジティブな処置応答を示す。加えて、第１の試料と比較した第２の試料中のバイオマーカーのレベルの増加も、増加が、神経損傷を有するが、処置を受けていなかった対象の対照群において生じる増加未満である場合に、ポジティブな処置応答を示し得る。好ましくは、対照対象は、同じ疾患プロセスまたは傷害の種類に起因する神経損傷を有する。したがって、そのような方法を使用して、神経損傷を有するかまたはそれを有するリスクがある対象における処置応答が測定される。
別の態様において、本開示は、神経損傷と診断されたか、または神経損傷を有するリスクがある対象を処置することを含む。方法は、（ａ）対象から得られた試料において、本明細書に記載されるバイオマーカーを定量する工程；および（ｂ）工程（ａ）において測定されたバイオマーカーの量を減少または安定化する医薬組成物を対象に投与する工程を含む。
Ｖ．組成物
別の態様において、本開示は、セクションＩＶのバイオマーカーおよび内部標準を含む組成物も提供する。
別の態様において、本開示は、セクションＩＶのバイオマーカーおよび内部標準を含む組成物も提供する。
別の態様において、本開示は、内部標準、ならびにＮｆｌの桿状ドメインから実質的になるアミノ酸配列を有するアイソフォーム（典型的には、配列番号１のアミノ酸９０～３９６と記載される）、Ｎｆｌの桿状ドメインの一部分から実質的になるアミノ酸配列を有するアイソフォーム、Ｎｆｌの桿状ドメインの一部分からなり、この領域外のアミノ酸なしのアミノ酸配列を有するアイソフォーム、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される複数のＮｆｌアイソフォームを含む組成物を提供する。例えば、組成物は、最大で約３３０アミノ酸長を有する配列番号１のアミノ酸９０～３９６を含む１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。代替的にまたはそれに加えて、組成物は、配列番号１のアミノ酸９０～３９６の断片である１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。例えば、組成物は、３１０アミノ酸長未満（約３０５、約３００、約２７５、約２５０、約２２５、約２００、約１７５、約１５０、約１２５、約１００、約７５、約５０、約２５など）であり、配列番号１のアミノ酸１６５～１７２、配列番号１のアミノ酸１９８～２０６、配列番号１のアミノ酸３２４～３３１、またはそれらの任意の組み合わせを含む、１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。一部の例において、組成物は、約２００アミノ酸長未満であり、配列番号１のアミノ酸１６５～１７２、配列番号１のアミノ酸１９８～２０６、またはそれらの任意の組み合わせを含む、１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。代替的にまたはそれに加えて、組成物は、配列番号１のアミノ酸１２５～３９６の断片である１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。例えば、組成物は、約２７５アミノ酸長以下であり、配列番号１のアミノ酸１６５～１７２、配列番号１のアミノ酸１９８～２０６、配列番号１のアミノ酸３２４～３３１、またはそれらの任意の組み合わせを含む、１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。
別の態様において、本開示は、内部標準、およびＮｆｌのテール領域から実質的になるアイソフォーム、Ｎｆｌのテール領域の一部分からなるアミノ酸配列を有するアイソフォーム、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される複数のＮｆｌアイソフォームを含む組成物を提供する。テール領域は、典型的には、配列番号１のアミノ酸３９７～５４３として記載される。例えば、組成物は、１４７アミノ酸長～約２００アミノ酸長である配列番号１のアミノ酸３９７～５４３を含む１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。代替的にまたはそれに加えて、組成物は、配列番号１のアミノ酸３９７～５４３の断片である１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。例えば、組成物は、１４７アミノ酸長未満であり、配列番号１のアミノ酸４２２～４３７、配列番号１のアミノ酸４３８～４６２、配列番号１のアミノ酸５３０～５４０、またはそれらの任意の組み合わせを含む、１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。別の実施形態において、組成物は、約１００アミノ酸長以下より少なく、配列番号１のアミノ酸４２２～４３７、配列番号１のアミノ酸４３８～４６２、配列番号１のアミノ酸５３０～５４０、またはそれらの任意の組み合わせを含む、１つまたは複数のＮｆｌアイソフォームを含んでいてもよい。
別の態様において、本開示は、内部標準、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５～１７２からなるペプチド、配列番号１のアミノ酸１９８～２０６からなるペプチド、配列番号１のアミノ酸３２４～３３１からなるペプチド、および配列番号１のアミノ酸５３０～５４０からなるペプチドからなる群から選択されるペプチドを含む組成物を提供する。別の態様において、本開示は、内部標準、および配列番号１のアミノ酸５３０～５４０からなるペプチドを含む組成物であって、組成物が、無視できる量の配列番号１のアミノ酸１６５～１７２からなるペプチド、配列番号１のアミノ酸１９８～２０６からなるペプチド、および配列番号１のアミノ酸３２４～３３１からなるペプチドを含有する、組成物を提供する。
上記の組成物の一部の実施形態において、内部標準は、組換えＮｆｌ、またはその断片であり、これは検出可能に標識されている。一部の実施形態において、内部標準は、２Ｈ、１３Ｃおよび１５Ｎから選択される重同位体標識で検出可能に標識されている。一部の実施形態において、内部標準は、ＡＱＵＡペプチドである。特定の実施形態において、重同位体標識で検出可能に標識された内部標準、およびバイオマーカーまたは複数のＮｆｌアイソフォームもしくはペプチドは、それぞれ０．０１対１超、およびそれぞれ１対１００未満の比であってもよく、またはそれぞれ約０．１対１～それぞれ約１０対１である比であってもよい。
ペプチドの量、またはバイオマーカーの量、またはアイソフォームである複数のＮｆｌの量は、少なくとも０．１ｐｇである。一部の実施形態において、ペプチド、バイオマーカー、または複数のＮｆｌアイソフォームの量は、約０．１ｐｇ～約１０，０００ｎｇ、または約０．１ｐｇ～約５，０００ｎｇ、または約０．１ｐｇ～約１，０００ｎｇである。一部の実施形態において、ペプチド、バイオマーカー、または複数のＮｆｌアイソフォームの量は、約１ｐｇ～約１０，０００ｎｇ、または約１ｐｇ～約５，０００ｎｇ、または約１ｐｇ～約１，０００ｎｇである。一部の実施形態において、ペプチド、バイオマーカー、または複数のＮｆｌアイソフォームの量は、約１０ｐｇ～約１０，０００ｎｇ、または約１０ｐｇ～約５，０００ｎｇ、または約１０ｐｇ～約１，０００ｎｇである。一部の実施形態において、ペプチド、バイオマーカー、または複数のＮｆｌアイソフォームの量は、約１００ｐｇ～約１０，０００ｎｇ、または約１００ｐｇ～約５，０００ｎｇ、または約１００ｐｇ～約１，０００ｎｇである。一部の実施形態において、ペプチド、バイオマーカー、または複数のＮｆｌアイソフォームの量は、約５００ｐｇ～約１０，０００ｎｇ、または約５００ｐｇ～約５，０００ｎｇ、または約５００ｐｇ～約１，０００ｎｇである。一部の実施形態において、ペプチド、バイオマーカー、または複数のＮｆｌアイソフォームの量は、約１，０００ｐｇ～約１０，０００ｎｇ、または約１，０００ｐｇ～約５，０００ｎｇ、または約１，０００ｐｇ～約１，０００ｎｇである。一部の実施形態において、ペプチド、バイオマーカー、または複数のＮｆｌアイソフォームの量は、約５ｎｇ～約１０，０００ｎｇ、または約５ｎｇ～約５，０００ｎｇ、または約５ｎｇ～約１，０００ｎｇである。一部の実施形態において、ペプチド、バイオマーカー、または複数のＮｆｌアイソフォームの量は、約１０ｎｇ～約１０，０００ｎｇ、または約１０ｎｇ～約５，０００ｎｇ、または約１０ｎｇ～約１，０００ｎｇである。
上記の実施形態のそれぞれにおいて、組成物は、セクションＩＩに記載され、参照により本セクションに組み込まれる、１つまたは複数の抗Ｎｆｌエピトープ結合剤をさらに含んでいてもよい。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。後の実施例において開示される技法が、本発明の実施において十分に機能するように本発明者らによって発見された技法を表すことが、当業者に認識されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示の観点から、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、依然として同様のまたは類似の結果を得ることができることを認識すべきであり、したがって、添付の実施例および図面に記載または示されているすべての事項が、限定的な意味ではなく、例示として解釈されるべきである。
［実施例１］
［実施例１］
本実施例は、ＮｆＬモノクローナル抗体の産生のための免疫化プロトコールを記載する。
抗原：組換えタンパク質［大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）において産生され、精製されたニューロフィラメント軽鎖－ヒト］。ＮｆＬ １－５４３ａａを産生し、精製した。１００マイクログラムの組換えＮｆＬタンパク質を、Ｂ６／Ｃ３マウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。初回注射は、２００マイクロリットルのＰＢＳ＋２００マイクロリットルのフロイント完全アジュバント中、マウス１頭あたり１００マイクログラムの組換えＮｆＬ １－５４３ａａ、ＩＰから構成された。１４日後の２回目の注射は、マウス１頭あたり２００マイクロリットルのＰＢＳと２００マイクロリットルのフロイント不完全アジュバント中の１００マイクログラムの組換えＮｆＬ １－５４３ａａ、ＩＰから構成された。２１日後、３０マイクロリットルの血液を、それぞれのマウスから取り、血清を、組換えＮｆＬに対する直接ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。マウスは、２００μｌのＰＢＳと２００マイクロリットルのフロイント不完全アジュバント中の１００マイクログラムの組換えＮｆＬ １－５４３ａａ、ＩＰの２８日後の３回目の注射を受けた。３０マイクロリットルの血液を、３５日後にマウスから取り（２回目の採血）、血清を、組換えＮｆＬに対する直接ＥＬＩＳＡによって再び評価した。マウスの力価が１：１０，０００を上回ったら、次いで、融合を行った。次いで、ＰＢＳ中の５０マイクログラムの組換えＮｆＬ １－５４３ａａの最後のブーストを、融合の３日前に、マウスにＩＰ注射した。
次いで、個々のクローンから産生した抗体を、組換えＮｆＬ １－５４３ａａによってプレートをコーティングすることによってスクリーニングした。これを行うために、ＮｆＬ １－５４３ａａを蒔き、次いで、プレートを、１％のミルクでプレートをブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳで洗浄し、細胞培養培地を、ＰＢＳ緩衝液中０．５％のＢＳＡとマウス抗ＩｇＧ ＨＲＰ中１：１０の希釈で、個々のクローンから添加した。次いで、ＴＭＢを、添加し、６５０での吸光度によって読み取り、これを、ブランクとしての細胞培養培地単独と比較した。
２３の抗体を、さらなる特徴付けのために選択した（実施例２を参照されたい）。抗体ＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２、ＨＪ３０．４、ＨＪ３０．７、ＨＪ３０．１１、およびＨＪ３０．１３を、ＡＴＣＣに寄託した。
この実施例において、Ｎｆｌを、実施例１に記載される２３の抗体の１つを使用して免疫沈降し、タンパク質分解的に消化し、次いで、Ｎｆｌのタンパク質分解ペプチドを、質量分析（ＭＳ）によって検出および定量した。このおよび他の実施例において記載されるすべてのＭＳ実験において、確実なＭＳシグナルが、所与のＩＳＴＤのトリプシンペプチドについて検出されなかった場合、データは、ＩＳＴＤ（１５Ｎ）または実験Ｎｆｌ（１４Ｎ）のいずれかについて報告しなかった。例えば、図１におけるトリプシンペプチド［５５，８３］を参照されたい。トリプシンペプチドを、本明細書における実施例を含む明細書全体にわたって、特定の短縮表記法－「［Ｘ，Ｙ］」を使用して特定し、ここで、Ｘは、トリプシンペプチドの第１のアミノ酸であり、Ｙは、トリプシンペプチドの最後のアミノ酸であり、Ｘ＋１またはＹ＋１は、全長Ｎｆｌのアミノ酸（配列番号１）を特定する。例えば、命名法「［５５，８３］」は、トリプシンペプチドＳＹＳＳＳＳＧＳＬＭＰＳＬＥＮＬＤＬＳＱＶＡＡＩＳＮＤＬＫ（配列番号５）についての省略表現であり、これは、全長Ｎｆｌ（配列番号１）のアミノ酸５６～８４からなる。
免疫沈降されたＮｆｌの回収を容易にするために、個々の抗体を、製造業者の指示に従って、ビーズ１ｍｇあたり２５μｇの抗体の濃度で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）に架橋した。抗Ａβ抗体であるＨＪ５．１を陰性対照として使用した。全長組換えＮｆｌ（ｒｅｃ－Ｎｆｌ）および脳溶解物またはＣＳＦから単離された生物学的に産生されたＮｆｌを評価した。
全長組換えＮｆｌ分析（ｒｅｃ－Ｎｆｌ）のために、１０ｕＬの１％のＨＳＡ中の５ｎｇ／ｕＬのｒｅｃ－Ｎｆｌを、４０ｕＬの１００ｍＭのＴＥＡＢＣに添加した。Ｎｆｌを、３０ｕＬの３０％（すなわち、３ｍｇ／ｍＬ）の抗体コンジュゲートビーズ調製物のスラリーを添加し、試料を、室温で１２０分間回転させることによって、免疫沈降させた。抗体コンジュゲートビーズを、磁気分離し、ＩＰ後上清を除去した。ビーズを、１ｍＬの２５ｍＭのＴＥＡＢＣ（洗浄あたり）で３回洗浄した。
ＮｆＬはまた、脳溶解物およびＣＳＦから親和性精製した。使用された脳試料は、以前に溶解された試料であり、アッセイ開発の間－８０℃で保管された。対象についての患者の人口統計は入手しなかった（例えば、年齢、性別、神経疾患の臨床徴候または症状）。凍結された溶解物を解凍し、アリコートを、１％のＨＳＡで１：１０００希釈した。４５０μｌの解凍された脳溶解物を、１．６ｍＬの新しいチューブに移した。次いで、界面活性剤（１％のＮＰ－４０）、カオトロピック試薬（５ｍＭのグアニジン）、およびプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）を含有する２５ｕＬのマスターミックス、ならびに５０ｍＭの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＢＣ）中の２０ｕＬの０．５ｎｇ／ｍｌのＮｆｌ内部標準（ＩＳＴＤ）を添加した。Ｌｙｓ、Ａｒｇの１３Ｃおよび１５Ｎ標識組換え全長Ｎｆｌを、ＩＳＴＤとして使用した。Ｎｆｌを、３０ｕＬの３０％（すなわち、３ｍｇ／ｍＬ）の抗体コンジュゲートビーズ調製物のスラリーを添加し、試料を、室温で１２０分間回転させることによって、免疫沈降させた。抗体コンジュゲートビーズを、磁気分離し、ＩＰ後上清を除去した。ビーズを、１ｍＬの２５ｍＭのＴＥＡＢＣ（洗浄あたり）で３回洗浄した。
使用されたＣＳＦ試料は、アッセイ開発のためにヒト対象から以前に得られ、－８０℃で保管された。対象についての患者の人口統計は公知ではない（例えば、年齢、性別、神経疾患の臨床徴候または症状）。凍結されたＣＳＦ試料を室温で解凍し、５００μｌの解凍されたＣＳＦを、新しいチューブに移した。次いで、界面活性剤（１％のＮＰ－４０）、カオトロピック試薬（５ｍＭのグアニジン）、およびプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）を含有する２５ｕＬのマスターミックス、ならびに５０ｍＭの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＢＣ）中の２０ｕＬの０．５ｎｇ／ｍｌのＮｆｌ内部標準（ＩＳＴＤ）を添加した。Ｌｙｓ、Ａｒｇの１３Ｃおよび１５Ｎ標識組換え全長Ｎｆｌを、ＩＳＴＤとして使用した。Ｎｆｌを、３０ｕＬの３０％（すなわち、３ｍｇ／ｍＬ）の抗体コンジュゲートビーズ調製物のスラリーを添加し、試料を、室温で１２０分間回転させることによって、免疫沈降させた。抗体コンジュゲートビーズを、磁気分離し、ＩＰ後上清を除去した。ビーズを、１ｍＬの２５ｍＭのＴＥＡＢＣ（洗浄あたり）で３回洗浄した。
試料に関わらず、抗体が結合したＮｆｌを、２５ｍＭのＴＥＡＢＣ中の４００ｎｇのＭＳグレードのトリプシンまたはＬｙｓ－Ｃを用いて、３７℃で１６時間、ビーズ上で消化した。プロテアーゼの濃度、インキュベーション時間、および緩衝液は、当技術分野において公知の方法に従って調整することができる。消化物を、製造業者の指示に従って条件付けされたＴｏｐＴｉｐ Ｃ１８上にロードし、０．１％のギ酸（ＦＡ）で２回洗浄することによって脱塩し、６０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）および０．１％のＦＡにより溶出させた。溶出したペプチドを、真空遠心分離によって乾燥させ、－８０℃で保管またはすぐに再懸濁のいずれかを行った。
ＭＳ分析のために、溶出したペプチドを、２５ｕＬの０．１％のＦＡ／０％のＣＡＮを用いて復元した。次いで、それぞれの消化物の４．５ｕＬのアリコートを、ＭＳ分析のために、ｎａｎｏ－Ａｃｑｕｉｔｙ ＬＣに注入した。ｎａｎｏ－Ａｃｑｕｉｔｙ ＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を、ＨＳＳ Ｔ３ ７５μｍ×１００μｍ、１．８μｍのカラム、および０．５μＬ／分の流速に適合させた。ペプチドを、２％の溶媒Ｂから９５％の溶媒Ｂのグラジエントで分離した。溶液Ａは、ＭＳグレードの水中０．１％のギ酸で構成され、溶液Ｂは、アセトニトリル中０．１％のギ酸で構成された。試料を、陽イオンモードにおいて、２，２００Ｖのスプレー電圧および２７５℃のイオン移動チューブ温度で分析した。データを、２＋または３＋の電荷状態を標的にする、内因性（Ｎ１４）および同位体標識（Ｃ１３Ｎ１５）ペプチドについて並行反応モニタリング（ＰＲＭ）により収集した。ＨＣＤ衝突エネルギーは、１８～２７％の範囲であり、それぞれのペプチドについて最適化した。最大注入時間は、２４～１１８ｍｓの範囲であり、それぞれのペプチドについて最適化した。正規化されたＡＧＣ標的を、４００％に設定した。データを、Ｓｋｙｌｉｎｅソフトウェア（ＭｃＣｏｓｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用して抽出し、ＳｋｙｌｉｎｅおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌにおいて分析した。
図１は、ｒｅｃ－ＮｆｌについてのＮｆｌ回収／ＩＰ効率の概要を提供する。図２は、脳溶解物からのＮｆｌ回収／ＩＰ効率の概要を提供する。図３は、ＣＳＦからのＮｆｌ回収／ＩＰ効率の概要を提供する。図４～２１は、個々の抗体についてのデータを示す。それぞれのグラフにおいて、ｙ軸は、１４Ｎ／１５Ｎ比であり、ｘ軸におけるそれぞれのポイントは、Ｎｆｌのトリプシンペプチドである。
図１において、１４Ｎ／１５Ｎ比は、配列に沿って一致し、これは、ＩＳＴＤおよび実験Ｎｆｌ（ｒｅｃ－Ｎｆｌ）の両方が全長タンパク質であったことを考えれば、予想された。特に、ＨＪ１３．３．２、ＨＪ３０．１９、ＨＪ３０．１９－４０、およびＨＪ３０－．１９－７７は、ｒｅｃ－Ｎｆｌ回収を示さなかった。
脳溶解物において、検出されたＮｆｌもほぼ全長であった（図２）。分析は、Ｎ末端メチオニンが切断され、２番目のアミノ酸（セリン）がアセチル化されたことを示した（データは示さない）。トリプシンペプチド［３７０，３７８］、［３７９，３８９］、および［３９１，３９８］により見られた高いシグナルは、汚染に起因すると決定した（データは示さない）。
脳溶解物試料の分析において見られた汚染は、ＣＳＦ試料の分析においても見られた（図３～２１）。トリプシンペプチド［３７０，３７８］、［３７９，３８９］、および［３９１，３９８］は、Ｎｆｌに固有ではないので、それらは、生体試料中のＮｆｌの検出および定量のために使用すべきではない。［２，１４］のアセチル化も、ＣＳＦ Ｎｆｌにおいて見られた（図３～２１）。ｒｅｃ－Ｎｆｌおよび脳溶解物由来のＮｆｌで見られた１４Ｎ／１５Ｎ比とは異なって、ＣＳＦ由来のＮｆｌは、配列に沿って一貫性のない１４Ｎ／１５Ｎ比を示し、ＣＳＦ中のトランケートされたＮｆｌ種の数を示した（図３）。個々の抗体のプロファイルを比較して（図４～２１）、ある特定の抗体が、他のものよりもＣＳＦ Ｎｆｌを免疫沈降するのにより有効であること、およびＣＳＦ Ｎｆｌが、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端での切断を伴う可変の長さの複数のＮｆｌアイソフォームを含有することが明らかであった。
本明細書に記載される方法によって脳溶解物およびＣＳＦから濃縮された可能性のあるアイソフォームの一部の要約を、提供されたおよそのサイズとともに図２２に図示する。
［実施例３］
［実施例３］
この実施例において、Ｎｆｌを、ＨＪ３０．４、ＨＪ３０．１１、またはＨＪ３０．１３の１つを使用して、ＣＳＦから免疫沈降させた。使用されたＣＳＦ試料は、アッセイ開発のためにヒト対象から以前に得られ、－８０℃で保管された。対象についての患者の人口統計は公知ではない（例えば、年齢、性別、神経疾患の臨床徴候または症状）。免疫沈降およびＬＣ－ＭＳ分析は、免疫沈降後に回収された上清が、同じ抗体による免疫沈降の２回目のラウンドに供された以外は、一般に実施例２に記載された通りであった。１４Ｎ（赤色のバー）および１５Ｎ（青色のバー）のデータを別々に示す（図２３～２５）。それぞれの図における最初の２つのバーは、第１の濃縮工程に対応し、２番目の２つのバーは、第２の濃縮工程に対応する。
内部標準（ＩＳＴＤ、青色のバー）のほとんどは、第１の濃縮工程によって試料から回収される。これは、同じまたは異なるエピトープ結合剤による濃縮のその後のラウンドが行われる場合に、全長内部標準を再添加することが必要であることを示唆する。同様に、ＨＪ３０．４およびＨ３０．１３は、単一工程において、ＣＳＦからＮｆｌアイソフォームを効率的に濃縮した（図２３～２４）。対照的に、ＨＪ３０．１１は、単一工程において、それが特異的に結合するすべてのＮｆｌアイソフォームを免疫沈降させなかった（図２５）。
［実施例４］
［実施例４］
複数の抗体によるＣＳＦ由来のＮｆｌの順次的免疫沈降も行った。使用されたＣＳＦ試料は、アッセイ開発のためにヒト対象から以前に得られ、－８０℃で保管された。対象についての患者の人口統計は公知ではない（例えば、年齢、性別、神経疾患の臨床徴候または症状）。免疫沈降およびＬＣ－ＭＳ分析は、第１の免疫沈降後に回収された上清が、第２の抗体による免疫沈降の２回目のラウンドに供され、次いで、第２の免疫沈降後に回収された上清が、第３の抗体による免疫沈降の３回目のラウンドに供された以外は、一般に実施例２に記載された通りであった。１つの実験において、ＨＪ３０．２、ＨＪ３０．７、および次いでＨＪ３０．１１を、免疫沈降のために順次的に使用した。第２の実験において、ＨＪ３０．１１、ＨＪ３０．７、およびＨＪ３０．２を、免疫沈降のために順次的に使用した。これらの実験において、内部標準は、最初のＣＳＦ試料に添加したのみであった。それぞれの実験を、二反復で行った。実験設計の概略図を、図２６に示す。内部標準を用いる代替手法も、図２９に示される濃縮のその後のラウンドの前に、それぞれのＩＰ後上清に添加した。
両方の実験からのデータを、図２７～２８に一緒に示す。図２７において、ｙ軸は、１４Ｎ／１５Ｎ比であり、ｘ軸におけるそれぞれのポイントは、Ｎｆｌのトリプシンペプチドである。図２８において、ｙ軸は、１４Ｎシグナルであり、ｘ軸におけるそれぞれのポイントは、Ｎｆｌのトリプシンペプチドである。それぞれの色の線は、凡例および図２６において特定されるように、異なる試料である。確実なＭＳシグナルがＩＳＴＤの所与のトリプシンペプチドについて検出されなかった場合、データは報告しなかった。Ｃ末端を含むＮｆｌアイソフォームは、プロセスの開始と比較して、プロセスの最後に、ＨＪ３０．１１を使用する順次的な濃縮後に、より存在量が多かった（図２８における「３０．１１」または「３０．１１＿二反復」と「ｐｏｓｔ ３０．２＆７＿３０．１１ＩＰ」または「ｐｏｓｔ ３０．２＆７＿３０．１１ＩＰ＿二反復」を比較する）。これらのＣ末端アイソフォームの検出は、分析された他の試料において無視できた。これらのデータは、異なるエピトープ結合剤の順次的な使用が、異なるＮｆｌアイソフォームの集団を濃縮することを示す。
［実施例５］
［実施例５］
この実施例において、神経損傷を有するヒト対象から得られたＣＳＦ試料由来のＮｆｌアイソフォームを、対照ヒト対象から得られたＣＳＦ試料由来のＮｆｌアイソフォームと比較した。免疫沈降およびＬＣ－ＭＳ分析は、ＨＪ３０．１３による第１の免疫沈降後に回収された上清が、ＨＪ３０．４による免疫沈降の２回目のラウンドに供され、次いで、第２の免疫沈降後に回収された上清が、ＨＪ３０．１１による免疫沈降の３回目のラウンドに供された以外は、一般に実施例２に記載された通りであった。内部標準も、濃縮のその後のラウンドの前に、それぞれのＩＰ後上清に添加した。実験設計の概略図を、図２９に示す。
図３０～３９に示されたデータは、アルツハイマー病（ＡＤ）についての１つもしくは複数のバイオマーカーを用いてヒト対象から得られたＣＳＦ試料、または対照ヒト対象から得られたＣＳＦ試料を使用する実験からである。より具体的には、ＡＤを有すると特定された対象は、ＰＩＢ－ＰＥＴイメージングまたはＣＳＦ Ａβ４２レベルによって評価されるように、アミロイド陽性であった（図３０～３３）。このコホートにおけるすべてのＡＤ対象は、≧０．５の臨床的認知症尺度（ＣＤＲ）スコアも有していた。対照対象は、ゼロのＣＤＲスコアを有し、アミロイド陰性であった（図３４～３９）。それぞれの図は、個々の対象であり、それぞれの図において、青色の線は、ＨＪ３０．１３によって免疫沈降されたＮｆｌアイソフォームであり、オレンジ色の線は、ＨＪ３０．４によって免疫沈降されたＮｆｌアイソフォームであり、灰色の線は、ＨＪ３０．１１によって免疫沈降されたＮｆｌアイソフォームであり、ここで、ｙ軸は、１４Ｎ／１５Ｎ比であり、ｘ軸におけるそれぞれのポイントは、Ｎｆｌのトリプシンペプチドである。確実なＭＳシグナルがＩＳＴＤの所与のトリプシンペプチドについて検出されなかった場合、データは報告しなかった。図４０に要約されるように、Ｎｆｌの一部の部分は、対照対象に対して、ＡＤ対象をより良好に識別することが可能であると思われる。
図４１に示されるデータは、ＣＤＲスコア（０、０．５、１、または２）によってグループ分けされたＡＤについての１つまたは複数のバイオマーカーを有するヒト対象から得られた追加のＣＳＦ試料（すなわち、ＰＩＢ－ＰＥＴイメージングまたはＣＳＦ Ａβ４２レベルによって評価されるように、少なくともアミロイド陽性）、対照ヒト対象由来の追加試料（アミロイド陰性およびＣＤＲ＝０）、および非常に軽度の認知症（ＣＤＲ ０．５）または軽度の認知症（ＣＤＲ １）を有するがアミロイド陰性であったヒト対象から得られた試料を使用する実験からである。非常に軽度から軽度の認知症を伴うアミロイド陰性状態は、他の神経疾患（すなわち、ＡＤ以外の認知に影響を及ぼす神経疾患）のプロセスを示し得る。技術的エラーに起因して、第１の濃縮工程からのＮｆｌデータは得られなかった。しかしながら、第２および第３の濃縮工程からのデータは、ＡＤ対対照（アミロイド陰性、ＣＤＲ ０）の最初の分析と同様に見えた。特に、データは、再び、配列番号１のＣ末端アミノ酸５３０～５４０を含むＮｆｌアイソフォームが、ＡＤ対象を対照対象から識別することを示す。加えて、軽度の認知症（ＣＤＲ １）を有するアミロイド陰性の対照からのデータは、検出されたＮｆｌアイソフォームが、他の原因に起因する神経損傷のマーカーとして有用であることを示唆する。
［実施例６］
［実施例６］
この実施例において、ヒト対象から得られた血液試料由来のＮｆｌアイソフォームを分析した。プールされた血液の２つの異なる試料を使用し、そのそれぞれは、アッセイ開発のために複数のヒト対象から以前に得た血液から構成され、プールされ、－８０℃で保管された。免疫沈降およびＬＣ－ＭＳ分析は、ＣＳＦではなく０．５ｍＬの血液が使用された以外は、一般に実施例５に記載された通りであった。図４２～４４に示されるように、血液中のＮｆｌ濃度は、ＣＳＦ中よりも低いが、検出可能である。さらにまた、血液はまた、ＣＳＦと類似して、複数のＮｆｌアイソフォームから構成されている。また、ＣＳＦと類似して、Ｃ末端から主に構成される血液中のいくつかのトランケートされたＮｆｌアイソフォームが存在する。
［実施例７］
［実施例７］
この実施例は、ＮｆＬのさまざまな領域に結合する開発された抗体を利用すること、および脳組織およびＣＳＦにおいて免疫沈降質量分析（ＩＰ－ＭＳ）を使用してこれらの抗体によって回収されたＮｆＬドメインを特徴付けることによって、以前の実施例から発展させる。本実施例は、脳ＮｆＬが、全長タンパク質を主に構成するが、ＣＳＦ ＮｆＬが、異なるタンパク質断片種の混合物からなることを示す。次いで、対照およびＡＤの発見コホートにおける新たに特定されたＮｆＬ断片種を試験し、確認コホートにおいてさらに検証した。
アッセイ開発のために使用されたプールされたＣＳＦ試料は、ヒト対象から以前に得られ、－８０℃で保管された。最初の収集の時に、ＣＳＦを、１０００×ｇで１０分間遠心分離して、細胞残屑を除去し、－８０℃で直ぐに凍結した。脳試料は、アッセイ開発の間－８０℃で保管された、以前に溶解された試料を含んでいた。すべてのＡＤおよび対照ＣＳＦ試料を、以前の研究の間に収集し、アリコートし、－８０℃で保管した。検証コホートは、３０人の症候性のアミロイド陽性の参加者、１６人の無症候性のアミロイド陽性の参加者、１０人の症候性のアミロイド陰性の参加者、および２５人の陰性対照由来のＣＳＦ試料を含んでいた。参加者の人口統計を、表２に示す。
組換えおよびネイティブＮｆＬの両方を、３０ｕＬの３０％（すなわち、３ｍｇ／ｍＬ）の抗体コンジュゲートビーズ調製物のスラリーを添加し、試料を、室温で１２０分間回転させることによって、免疫沈降させた。抗体コンジュゲートビーズを、磁気分離し、ＩＰ後上清を除去した。ビーズを、１ｍＬの２５ｍＭのＴＥＡＢＣ（洗浄あたり）で３回洗浄した。結合したＮｆＬを、４００ｎｇのＭＳグレードのトリプシン／Ｌｙｓ－Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、３７℃で１６時間、ビーズ上で消化した。消化物を、ＴｏｐＴｉｐ Ｃ１８（Ｇｌｙｇｅｎ、ＴＴ２Ｃ１８．９６）上にロードし、脱塩し、溶出させた。溶出液を、加熱することなく、真空中で乾燥させ、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）による分析（下記のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法を参照されたい）まで、－８０℃で保管した。１６の抗体が、全長組換えタンパク質を回収した（図４５）。プールされたＣＳＦから免疫沈降されたネイティブＮｆＬからのペプチドプロファイルに基づいて、抗体が、桿状ドメインのアミノ末端部分、桿状ドメインのカルボキシ末端部分、またはＮｆＬのカルボキシ末端に対するエピトープを有することを決定した（図４６）。高い回収およびＮｆＬ特異性を有する抗体を、これらのＮｆＬドメインのそれぞれについて選択し、定性的および定量的ＩＰ－ＭＳアッセイにおいて使用した。カスタム抗体は、ＮｆＬのＮ末端を認識しなかった。
３工程の順次的免疫沈降を使用して、脳溶解物およびＣＳＦ中のＮｆＬを特徴付けた。桿状ドメインのコイル１Ａ／１Ｂ（ＨＪ３０．１３）、桿状ドメインのコイル２Ｂ（ＨＪ３０．４）、およびテール領域（ＨＪ３０．１１）を標的にする抗体を使用した。凍結された脳溶解物を解凍し、凍結された脳溶解物の４５０μＬのアリコートを、１％のＨＳＡで１：１０００希釈した。凍結されたＣＳＦ試料を室温で解凍し、４５０μＬの解凍されたＣＳＦを、免疫沈降のために、１．６ｍＬの新しいチューブに移した。
脳およびＣＳＦ試料の両方を、３０μＬの３０％（すなわち、３ｍｇ／ｍＬ）のＨＪ３０．１３（コイル１Ａ／１Ｂ抗体）の抗体コンジュゲートビーズ調製物のスラリーを使用して、ネイティブＣＳＦについて上記に記載されたようにして、免疫沈降させた。すべての試料がビーズ上での消化の準備ができるまで、洗浄されたビーズを氷上で保管した。第２工程において、５０ｍＭのＴＥＡＢＣ中の２０μＬの０．５ｎｇ／ｍｌのＮｆＬ ＩＳＴＤを添加し、ＮｆＬを、３０μＬの３０％（すなわち、３ｍｇ／ｍＬ）のＨＪ３０．４（コイル２Ｂ抗体）の抗体コンジュゲートビーズ調製物のスラリーを添加することによって、２回目の免疫沈降を行った。残りの工程は、第１の免疫沈降と同一であった。５０ｍＭのＴＥＡＢＣ中の１０ｎｇのＩＳＴＤを、ＨＪ３０．１１（テール抗体）を用いて行われる３回目の順次的免疫沈降の前に、ＩＰ後上清に再び添加した。結合したＮｆＬを、４００ｎｇのＭＳグレードのトリプシン／Ｌｙｓ－Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、３７℃で１６時間、ビーズ上で消化し、試料を、上記に記載されたようにして、抽出した。
ＩＳＴＤの順次的な添加についての必要性を排除するために、桿状ドメインのコイル１Ａ／１Ｂ（ＨＪ３０．１３）、桿状ドメインのコイル２Ｂ（ＨＪ３０．４）、およびテール領域（ＨＪ３０．１１）を標的にする抗体を、１：１：１で混合して、１０％（すなわち、１ｍｇ／ｍＬ）の最終濃度のそれぞれの抗体を有する抗体スラリーを作製した。界面活性剤（１％のＮＰ－４０）、カオトロピック試薬（５ｍＭのグアニジン）、およびプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）を含有する２５μＬのマスターミックスを、９６ウェルプレートに添加した。次いで、５μＬのＩＳＴＤ（１％のＨＳＡ中０．１ｎｇ／μＬ；定量的回収およびアッセイのダイナミックレンジについて最適化されたＩＳＴＤ溶媒および量）、それに続いて、４５０μＬの解凍されたＣＳＦおよび３０μＬの抗体スラリーを添加した。免疫沈降およびビーズ上消化を、上記に記載されたようにして、行った。
プールされたＣＳＦを、スクリーニングして、低濃度および高濃度のＮｆＬを有するプールを特定した。最低（ＮｆＬ－Ｌ１）および最高（ＮｆＬ－Ｌ２）のＮＦＬ濃度を有するＣＳＦプールを選択し、アッセイの線形範囲を決定するために使用した。ＮｆＬ－Ｌ２ ＣＳＦを、ＮｆＬ－Ｌ１ ＣＳＦで連続希釈して、１００％、５０％、２５％、１２．５％、６．２５％、３．１３％、および１．５６％のＮｆＬ－Ｌ２で、８点の曲線を作成した。ＮｆＬを、濃度について、三反復で、上記に記載されたようにして、ＩＰを行った。Ｎ１４／Ｎ１５比を、定量的方法において、６つのペプチドのそれぞれについて決定し、反復の平均Ｎ１４／Ｎ１５比を、ＮｆＬ－Ｌ２％に対してプロットし、線形回帰を行った。６つのペプチドすべてが、Ｒ２≧０．９８８で、試験されたＮｆＬ濃度にわたって良好な線形性を示した（図４７）。線形範囲にわたるそれぞれのペプチドについての平均ＣＶ％は、８～１２％であった（表３）。
抽出された消化物を、２５μＬの０．１％のギ酸／０％のＡＣＮを用いて復元した。次いで、それぞれの消化物の４．５ｕＬのアリコートを、ＭＳ分析のために、ｎａｎｏ－Ａｃｑｕｉｔｙ ＬＣに注入した。ｎａｎｏ－Ａｃｑｕｉｔｙ ＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を、ＨＳＳ Ｔ３ ７５μｍ×１００μｍ、１．８μｍのカラムに適合させ、溶液ＡおよびＢのグラジエントの０．５μＬ／分の流速を使用して、ペプチドを分離した。溶液Ａは、ＭＳグレードの水中０．１％のギ酸で構成され、溶液Ｂは、アセトニトリル中０．１％のギ酸で構成された。試料を、陽イオンモードにおいて、２，２００Ｖのスプレー電圧および２７５℃のイオン移動チューブ温度で分析した。データを、内因性（Ｎ１４）および同位体標識（Ｌｙｓ、Ａｒｇ：１３Ｃ１５Ｎ）ペプチドについて並行反応モニタリング（ＰＲＭ）により収集した。ＮｆＬに特異的なトリプシンペプチドを、Ｂｌａｓｔサーチを介して特定し、良好なイオン化を有するものを、配列カバレッジを最適化するように設計された定性的ＰＲＭに含めた。定量方法を、アッセイ精度について最適化し、マルチプレックス化を、さまざまなＮｆＬドメインおよびそれらの対応するＩＳＴＤにわたって６つのＮｆＬペプチドの分析に低減した（表４）。
検証コホートは、ＡＤ型認知症（アミロイド陽性、ＣＤＲ ０～２）、非ＡＤ型認知症（アミロイド陰性、ＣＤＲ ０．５～１）、および健康な対照（アミロイド陰性、ＣＤＲ ０）を有する個体から以前に収集された８１のＣＳＦ試料からなった。アミロイド陽性は、Ａβ４２／Ａβ４０比によって以前に決定した（Patterson et al., 2015）。それぞれのＣＳＦ試料について、ＮｆＬの４つの異なるドメイン（コイル１Ａ、コイル１Ｂ、コイル２Ｂ、およびテール）に対応する６つのＮｆＬペプチドを、上記に記載された定量的ＩＰ－ＭＳ方法を使用して測定した。ＮｆＬも、市販のＥＬＩＳＡキット（ＵＭＡＮ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を介して、製造業者の説明に従って測定した。簡潔には、ＥＬＩＳＡ測定のために、ＣＳＦ試料を、湿氷上で解凍し、ボルテックスした。次いで、試料を、９６ウェルプレプレート中、提供された試料希釈液で２倍希釈し、混合した後、アッセイプレートに移した。
ＡＤ臨床、認知、イメージングおよびバイオマーカー尺度に対する可溶性ＮｆＬ種の関係を決定するために、相関分析を、それぞれのＮｆＬ領域（ＩＰ－ＭＳ）と以前に得られたバイオマーカーデータとの間で行った。以下の尺度を評価した：年齢、ＣＤＲグローバルおよびＣＤＲボックス合計（ＣＤＲ－ＳＢ）、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）、アミロイドプラークイメージング（ＰＥＴ ＰｉＢ）、ＣＳＦのＡβ４２／Ａβ４０、ＣＳＦ 総タウ（ｔ－ｔａｕ）、ＣＳＦのｐｔａｕ １８１およびｐｔａｕ１８１／ｔａｕ１８１、ＣＳＦのｐｔａｕ２０５およびｐｔａｕ２０５／ｔａｕ２０５、ＣＳＦのｐｔａｕ２１７およびｐｔａｕ２１７／ｔａｕ２１７。
２３のモノクローナル抗体を、ＮｆＬに対して作製し、全長ｒｅｆ－ＮｆＬ、脳溶解物由来のＮｆＬ、およびプールされたＣＳＦ由来のＮｆＬを免疫沈降するそれらの能力について評価した。抗体を、それらが標的にするＮｆＬドメイン、それらのＩＰ効率、およびそれらの特異性によって特徴付けた。それぞれのＮｆＬドメインについての代表的な抗体を選択し、さらなるアッセイ開発のために使用した。さまざまなＮｆＬドメインを標的にする抗体を使用して、我々は、複数のＮｆＬ種がＣＳＦ中に存在すると決定した（図４８）。ＣＳＦ中のＮｆＬ種をより良く解明するために、プールされたＣＳＦ試料を、コイル１Ａ／１Ｂを標的にする抗体（およそａａ９３～２５２、ＨＪ３０．１３）から出発し、それに続いてコイル２Ｂを標的にする抗体（およそａａ２７２～３９６、ＨＪ３０．４）、および最後にテール領域のＣ末端を標的にする抗体（ａａ５２０～５５０、ＨＪ３０．１１）へと順次的に免疫沈降させた。これらのタンパク質プロファイルに基づいて、ＣＳＦ中の最低限の３つの主要なＮｆＬ断片種を特定したが、これらの種の複数のバージョンが存在する可能性がある。これらとしては、ＨＪ３０．１３（ａａ９２から少なくともａａ２２４、ａａ３６０まで伸びる可能性があるバージョン）およびＨＪ３０．４（ａａ３２４からａａ３６０）によって濃縮された桿状ドメインを含有する２つの異なるＮ末端およびＣ末端トランケーション、ならびにＮｆＬのテールを含有するＣ末端断片（ＨＪ３０．１１によって濃縮、ａａ５３０から少なくともａａ５４０を含有）が挙げられる。Ｎ末端断片は回収されず、全長ＮｆＬは、ＣＳＦ中に定量可能な濃度で存在しなかった（図４９Ａ～４９Ｂ）。
ＣＳＦ中の高度に断片化されたタンパク質とは対照的に、脳組織ホモジネートは、ほぼ全長のＮｆＬを含有した。任意のトランケートされたアイソフォームも脳中に存在するかを決定するために、ヒト脳組織に対する同じ順次的免疫沈降を行った。ほとんどの脳ＮｆＬは全長であるように思われたが、ＣＳＦにおいて特定された断片と同様に、少なくともアミノ酸５３０～５４０を含有するテールサブドメインＢのＣ末端断片も観察された（図４９Ａ、４９Ｃ）。ａａ１６５～２２４を含有する断片は、ＨＪ３０．１３によって濃縮されると思われる。追加のＮｆＬ断片は、２回目のＩＰ（ＨＪ３０．４、桿状ドメインのコイル２Ｂ）の間に、脳において濃縮されなかった。
順次的ＩＰ－ＭＳ方法を、実験において最初に試験し、プールされたＣＳＦにおいてされた、アルツハイマー病型認知症（ＡＤ、Ｎ＝４）および健康な対照（Ｎ＝６）の発見コホートからのＣＳＦ試料において繰り返した。両方の臨床群において観察されたペプチドは、プールされたＣＳＦにおいて観察されたものと類似していたが、対照と比較して、ＡＤにおける３つの主要なＮｆＬ種の量が増加していた（図５０）。加えて、一部のペプチドは、ＡＤおよび対照試料を識別するのに他のものよりも良好であると思われた。最も顕著な相違は、Ｃ末端テールにおけるＮｆＬ５３０（トリプシンペプチドＶＥＧＡＧＥＥＱＡＡＫ（配列番号２９）、ａａ５３０－５４０）および桿状ドメインのコイル１Ｂ内のトリプシンペプチドＧＡＤＥＡＡＬＡＲ（配列番号１６）について観察された。
ＡＤ、非ＡＤ型認知症、および健康な対照においてＣＳＦ ＮｆＬ種をより良好に比較するために、我々は、複数のＮｆＬ種にわたって選択領域を確実に測定するための定量的ＮｆＬアッセイを開発した。精度を改善するために、我々の定量的方法のマルチプレックス化を低減して、さまざまなＮｆＬドメインにわたる６つのペプチドおよびそれらの対応する内部標準を測定した。次いで、ＩＰ－ＭＳ定量的方法を適用して、８１のＡＤおよび対照試料（３０のアミロイド陽性、ＣＤＲ＞０；１６のアミロイド陽性、ＣＤＲ＝０；１０のアミロイド陰性、ＣＤＲ＝０；２５のアミロイド陰性、ＣＤＲ＝０、表２）の検証コホートにおいて特異的ＣＳＦ ＮｆＬ種を測定した。ＣＳＦ ＮｆＬ濃度も、比較のために、ゴールドスタンダードＵｍａｎ ＮｆＬイムノアッセイを使用して定量した。
発見コホートの順次的ＩＰの結果と一致して（図５１）、ＮｆＬ濃度の増加が、アミロイド陰性の健康な対照（Ｎ＝２５）と比較して、症候性のアミロイド陽性個体（Ｎ＝３０）の確認コホートにおいて観察された（図５２）。興味深いことに、群間の相違は、他のものよりも一部の領域について大きく、最大の相違は、桿状ドメインのコイル２Ｂ［ＮｆＬ３２４；ＧＭＮＥＡＬＥＫ（配列番号２０）、ａａ３２４～３３１］およびテールのＣ末端［ＮｆＬ５３０；ＶＥＧＡＧＥＥＱＡＡＫ（配列番号２９）、ａａ５３０～５４０］において観察された。ＮｆＬ３２４は、対照と比較して、ＡＤにおいて１．５倍増加し（Ｐ＝０．００８、図５２Ｆ）、ＮｆＬ５３０は、１．７倍増加した（Ｐ＝０．００２、図５２Ｇ）。
ＮｆＬイムノアッセイは、対照と比較して、ＡＤにおいて１．４倍増加した。これは、ＮｆＬ３２４ペプチド濃度と最も強い相関を有し（Ｒ２＝０．８４）、Ｕｍａｎイムノアッセイがコイル２Ｂ領域を含有するＣＳＦ ＮｆＬ断片を標的にすることを示唆する。重要なことに、イムノアッセイと他の調査されたペプチドとの間の相関は、ＮｆＬ１０１、１１７、１６５および５３０についてより低く（０．３４～０．４９の範囲のＲ２）、相関は、ＮｆＬ２８４で見出されなかった（図５２）。
ＮｆＬは、一般的な神経変性のマーカーであり、ＡＤに特異的ではないので、ＮｆＬが、臨床認知症および神経変性を有するものにおけるアミロイドプラークの存在にかかわらず増加したと仮説を立てた。ＣＤＲ－ＳＢ（認知症の重症度の臨床尺度）とＮｆＬ種との間の相関を、アミロイド陽性およびアミロイド陰性試料について評価した（図５３）。相関は、アミロイド陰性群におけるよりもアミロイド陽性群における一部のＮｆＬ種についてわずかに高かったが（ＮｆＬ１０１、ＮｆＬ１１７、ＮｆＬ１６５およびＮｆＬ３２４）、相関は、両方の群におけるＮｆＬ種のすべてについて、最低限または低かった。ＮｆＬ５０とＣＤＲ－ＳＢとの間の相関は、いずれかの群について、有意に、非ゼロではなかった。
スピアマン相関分析も、６つの定量されたＮｆＬペプチド、および追加の以前に測定されたバイオマーカー、および臨床認知症の一般マーカー（ＣＤＲ－ＳＢ、ＭＭＳＥ）、アミロイドプラークのバイオマーカー（ＰＥＴ ＰｉＢ、ＣＳＦ Ａβ４２／Ａβ４０）およびタウバイオマーカー（ＣＳＦ総タウ、ＣＳＦホスホ－タウイムノアッセイ、ならびにＣＳＦ ｐｔａｕ １８１、２０５および２１７の占有の質量分析測定）；図５４、表５を含む臨床尺度のそれぞれの間で行った。この分析の目標は、疾患特異的神経変性と比較して、一般的な神経変性における異なるＮｆＬ種の生物学についての仮定を形成することであった。最も強い相関が、桿状ドメインのコイル１Ａ（ＮｆＬ１０１およびＮｆＬ１１７、ｒ＝０．９９）およびコイル１Ｂ（ＮｆＬ１０１およびＮｆＬ１６５、ｒ＝０．９８；ＮｆＬ１１７およびＮｆＬ１６５ ｒ＝０．９８）内のペプチド間で観察された。桿状ドメインのコイル２Ｂにおけるペプチドは、コイル１Ａペプチドと類似であるがわずかに低い相関を有する（ＮｆＬ１０１およびＮｆＬ２８４、ｒ＝０．８９；ＮｆＬ１０１およびＮｆＬ３２４、ｒ＝０．８７；ＮｆＬ１１７およびＮｆＬ２８４、ｒ＝０．９０；ＮｆＬ１１７およびＮｆＬ３２４、ｒ＝０．８８）。Ｃ末端テールペプチドとコイル１Ａとの間の相関は、調査されたＮｆＬペプチドの中で最も低い（ＮｆＬ１０１およびＮｆＬ５３０、ｒ＝０．７５；ＮｆＬ１１７およびＮｆＬ５３０、ｒ＝０．７６）。興味深いことに、測定されたほとんどのｃ末端ペプチド（ＮｆＬ３２４およびＮｆＬ５３０）は、疾患バイオマーカーとＮｆＬとの間で最も高い相関を有する。ＮｆＬ３２４またはＮｆＬ５３０とｐｔａｕ１８１、２０５または２１７との間の中程度の相関は、ｒ＝０．４５～０．４９の範囲である。同じＮｆＬペプチドとｔＴａｕとの間の相関は、ｒ＝０．４２～０．４３である。ＣＳＦ Ａβ４２／Ａβ４０およびＣＳＦ ＮｆＬ５３０による相関は、－０．３７で、より低かった（図５３、表４）。
本実施例は、ＣＳＦ中に少なくとも３つの主要なＮｆＬのトランケートされた種が存在すること、およびＡＤにおいて可変の度合いで増加が存在することを確立する。さらに、脳ＮｆＬは、新たに特定されたｃ末端断片を有する全長である。主要なＣＳＦ ＮｆＬ種は、互いとおよび他のＡＤ尺度と異なる関係を有する。これは、ＮｆＬのトランケートされた種が、ＮｆＬ生物学および神経変性について異なって分泌され、それらの一部が、他のものよりもバイオマーカーとしてより関連する可能性があることを示すであろう。ＮｆＬのコイル１ドメインからのＮｆＬペプチドレベルは、互いと相関し、コイル２およびＣ末端領域から測定されたペプチドとわずかに異なって挙動した。ＮｆＬペプチド３２４および５３０の有意な増加が、症候性ＡＤ ＣＳＦにおいて見出され、これらのドメインが、バイオマーカーとしてより関連する可能性があることを裏付けた。ＮｆＬ３２４とＮｆＬイムノアッセイとの間で観察されたより高い相関は、ＡＤとＮｆＬ３２５についての対照（１．５倍）およびＥＬＩＳＡアッセイ（１．４倍）との間の類似の倍数増加と組み合わせて、このＵｍａｎ所有のアッセイによって使用された抗体が、これらの最も良好な性能のＮｆＬアイソフォームを標的とするために選択される可能性があることを示唆するであろう。ＣＤＲ、年齢、ならびにリン酸化および総タウとの中程度の相関が存在したが、アミロイドＰＥＴおよびＭＭＳＥの尺度は、低い相関を有していた。
［実施例８］
［実施例８］
この実施例において、対照、ＡＬＳおよびＳＭＡヒト対象から得られたＣＳＦ試料由来のＮｆｌアイソフォームを分析した。孤発性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ｎ＝１２）、家族性ＡＬＳ（ｎ＝６）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ、ｎ＝１０）を有する患者由来のＣＳＦ試料、および正常な神経の対照を、記載された同じ方法を利用して、ＮｆＬ種の相違について分析した。簡潔には、０．５ｎｇの１５Ｎ１３Ｃ内部標準ＮｆＬを、０．５ｍｌのＣＳＦに添加した後、抗体ＨＪ３０．１３、ＨＪ３０．４およびＨＪ３０．１１の１：１：１混合物を用いて免疫沈降した。処理された試料を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析して、図５７～６３に示されるそれぞれの領域で、ＮｆＬ種の量を定量した。これらの知見は、無症候性の場合、ＳＭＡ、または対照よりも孤発性および家族性ＡＬＳの症候性の場合における増加を明らかにした。ＮｆＬ種の増加の量は、月ごとの減少で測定されるＡＬＳ ＦＲＳスケールによって測定される減少率と非常に相関した。ＮｆＬ種のＡＬＳプロファイルは、アミノ酸位置３７から３５２の増加した量、次いで、および４３７～５３９（ｃ末端ペプチド）の別の増加を示した。しかしながら、プロファイルは対照では異なり、ｃ末端ペプチドの量および他の領域があまり顕著ではなかった。最後に、ＳＭＡプロファイルは、非常に少ない中央ドメイン領域を示したが、３３９～４６１からの領域は、相対的に増加した。これは、異なる診断のために定量および使用され得るそれぞれの疾患状態について特異的なプロファイルが存在し得ることを示す。
Claims (68)
- 生体試料中のニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）を検出するための方法であって、
（ａ）血液試料またはＣＳＦ試料から選択される生体試料を準備する工程；
（ｂ）生体試料中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において濃縮された１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを検出する工程
を含む方法。 - 工程（ｂ）が、
（ｉ）生体試料を、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団に特異的に結合する第１のエピトープ結合剤と接触させ、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団を単離し、それによってＮｆｌアイソフォームの第１の集団が枯渇した試料を生成すること；
（ｉｉ）Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団が枯渇した試料を、Ｎｆｌアイソフォームの第２の集団に特異的に結合する第２のエピトープ結合剤と接触させ、Ｎｆｌアイソフォームの第２の集団を単離し、それによってＮｆｌアイソフォームの第１および第２の集団が枯渇した試料を生成すること；ならびに
（ｉｉｉ）Ｎｆｌアイソフォームの第１および第２の集団が枯渇した試料を、Ｎｆｌアイソフォームの第３の集団に特異的に結合する第３のエピトープ結合剤と接触させ、Ｎｆｌアイソフォームの第３の集団を単離すること
を含み、
工程（ｃ）が、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォーム、Ｎｆｌアイソフォームの第２の集団中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォーム、Ｎｆｌアイソフォームの第３の集団中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォーム、またはそれらの任意の組み合わせを検出することを含む、
請求項１に記載の方法。 - 第１のエピトープ結合剤が、配列番号１のアミノ酸９０～３００内の第１のエピトープに特異的に結合し；
第２のエピトープ結合剤が、第１のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸２００～４５０内の第２のエピトープに特異的に結合し；および
第３のエピトープ結合剤が、第２のエピトープの下流にある配列番号１のアミノ酸３９７～５４３内の第３のエピトープに特異的に結合する、
請求項２に記載の方法。 - 第１のエピトープが、配列番号１のアミノ酸９０～２５０内にあるか；
第２のエピトープが、配列番号１のアミノ酸２５０～４００内にあるか；
第３のエピトープが、配列番号１のアミノ酸３９７～５４３内にあるか；
またはそれらの任意の組み合わせである、請求項３に記載の方法。 - 第１のエピトープ結合剤が、ＨＪ３０．１もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．２もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．１３もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２もしくはＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤であるか；
第２のエピトープ結合剤が、ＨＪ３０．４もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．７もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．４もしくはＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤であるか；
第３のエピトープ結合剤が、ＨＪ３０．１１、その抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤であるか；
あるいはそれらの任意の組み合わせである、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。 - 工程（ｂ）が、
（ｉ）生体試料を、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団に特異的に結合する第１のエピトープ結合剤と接触させ、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団を単離し、それによってＮｆｌアイソフォームの第１の集団が枯渇した試料を生成すること；
（ｉｉ）Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団が枯渇した試料を、Ｎｆｌアイソフォームの第２の集団に特異的に結合する第２のエピトープ結合剤と接触させ、Ｎｆｌアイソフォームの第２の集団を単離すること；
を含み、
工程（ｃ）が、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォーム、Ｎｆｌアイソフォームの第２の集団中の１つ～複数のＮｆｌアイソフォーム、またはそれらの任意の組み合わせを検出することを含む、
請求項１に記載の方法。 - 第１のエピトープ結合剤が、配列番号１のアミノ酸９０～４５０内の第１のエピトープに特異的に結合し；
第２のエピトープ結合剤が、配列番号１のアミノ酸３９６～５４３内のエピトープに特異的に結合する、
請求項６に記載の方法。 - 第１のエピトープが、配列番号１のアミノ酸９０～２５０内にあり；および
第２のエピトープが、配列番号１のアミノ酸３９６～５４３内にある、
請求項７に記載の方法。 - 第１のエピトープ結合剤が、ＨＪ３０．１もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．２もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．１３もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２もしくはＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤であり；および／あるいは
第２のエピトープ結合剤が、ＨＪ３０．１１、その抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤である、
請求項８に記載の方法。 - 第１のエピトープが、配列番号１のアミノ酸２５０～４００内にあり；および
第２のエピトープが、配列番号１のアミノ酸４００～５４３内にある、
請求項７に記載の方法。 - 第１のエピトープ結合剤が、ＨＪ３０．４もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．７もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．４もしくはＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤であり；および／あるいは
第２のエピトープ結合剤が、ＨＪ３０．１１、その抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤である、
請求項１０に記載の方法。 - 工程（ｂ）が、生体試料を、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団に特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させ、Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団を単離することを含み、エピトープ結合剤が、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸９０～２５０または配列番号１のアミノ酸１２５～２５０内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１１６～１８４内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸２５０～４００内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸２８３～３３８内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；
（ｖ）配列番号１のアミノ酸４００～５４３内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；
（ｖｉ）配列番号１のアミノ酸４３７～５４３内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；
（ｖｉｉ）ＨＪ３０．１もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．２もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．１３もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１、ＨＪ３０．２もしくはＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤；
（ｖｉｉｉ）ＨＪ３０．４もしくはその抗原結合性断片、ＨＪ３０．７もしくはその抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．４もしくはＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤；および
（ｉｘ）ＨＪ３０．１１、その抗原結合性断片、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤
からなる群から選択される、
請求項１に記載の方法。 - 工程（ｂ）が、約３５０アミノ酸長以下、約３００アミノ酸長以下、約２５０アミノ酸長以下、約２００アミノ酸長以下、約１５０アミノ酸長以下、または約１００アミノ酸長以下であるＮｆｌアイソフォームを濃縮することを含む、請求項１に記載の方法。
- 工程（ｂ）が、約１００アミノ酸長～約２５０アミノ酸長であるＮｆｌアイソフォームを濃縮することを含む、請求項１３に記載の方法。
- 工程（ｂ）が、約１０６アミノ酸長以下であるＮｆｌアイソフォームを濃縮することを含む、請求項１４に記載の方法。
- 工程（ｂ）が、配列番号１のアミノ酸９２～１００、配列番号１のアミノ酸１０１～１０７、配列番号１のアミノ酸１０８～１１６、配列番号１のアミノ酸１１７～１２６、配列番号１のアミノ酸１３７～１４４、配列番号１のアミノ酸１４８～１５７、配列番号１のアミノ酸１５８～１６４、配列番号１のアミノ酸１６５～１７２、配列番号１のアミノ酸１７８～１８５、配列番号１のアミノ酸１９２～１９６、または配列番号１のアミノ酸１９８～２０６を含むアミノ酸配列を有する１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮することを含む、請求項１、１３、１４または１５のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ｂ）が、配列番号１のアミノ酸１６５～１７２を含むアミノ酸配列を有する１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮することを含む、請求項１６に記載の方法。
- 工程（ｂ）が、配列番号１のアミノ酸２８３～２９３、配列番号１のアミノ酸３２４～３３１、配列番号１のアミノ酸３３２～３３９、または配列番号１のアミノ酸３４０～３５４を含むアミノ酸配列を有する１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮することを含む、請求項１、１３、１４または１５のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ｂ）が、配列番号１のアミノ酸４３８～４６２または配列番号１のアミノ酸５３０～５４０を含むアミノ酸配列を有する１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを濃縮することを含む、請求項１、１３、１４または１５のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ｂ）が、Ｎ末端トランケーションを含むＮｆｌアイソフォームを濃縮し、それぞれのＮｆｌアイソフォームについてのＮ末端トランケーションが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸１～９０；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１～９２；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１～１２４；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸１～１３５；
（ｅ）配列番号１のアミノ酸１～１３７；
（ｆ）配列番号１のアミノ酸１～１４６；
（ｇ）配列番号１のアミノ酸１～１６２；
（ｈ）配列番号１のアミノ酸１～２２２；
（ｉ）配列番号１のアミノ酸１～２２３；
（ｊ）配列番号１のアミノ酸１～２３４；
（ｋ）配列番号１のアミノ酸１～２５２；
（ｌ）配列番号１のアミノ酸１～２７１；
（ｍ）配列番号１のアミノ酸１～２８１；
（ｎ）配列番号１のアミノ酸１～３２３；
（ｏ）配列番号１のアミノ酸１～３３９；
（ｐ）配列番号１のアミノ酸１～３５９；
（ｑ）配列番号１のアミノ酸１～３９６；
（ｒ）配列番号１のアミノ酸１～３９９；
（ｓ）配列番号１のアミノ酸１～４２０；
（ｔ）配列番号１のアミノ酸１～４３６；または
（ｕ）配列番号１のアミノ酸１～５２８
からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。 - それぞれのＮｆｌアイソフォームについてのＮ末端トランケーションが、配列番号１のアミノ酸１～３９６または配列番号１のアミノ酸１～４３７を含む、請求項２０に記載の方法。
- 工程（ｂ）が、単一のアイソフォームを濃縮する、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
- 工程（ｃ）における検出が、質量分析によって行われる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ｃ）において、
濃縮されたＮｆｌアイソフォームをプロテアーゼにより切断し、次いで、固相抽出によって、得られた切断生成物を適宜脱塩して、Ｎｆｌのタンパク質分解ペプチドを含む試料を得ること；および
Ｎｆｌのタンパク質分解ペプチドを含む試料の液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を行って、Ｎｆｌの少なくとも１つのタンパク質分解ペプチドの量を検出し、適宜定量すること
をさらに含む、請求項２３に記載の方法。 - プロテアーゼが、トリプシンである、請求項２４に記載の方法。
- 検出および適宜定量されたＮｆｌの少なくとも１つのタンパク質分解ペプチドが、（ｉ）配列番号１のアミノ酸１６５～１７２、（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１９８～２０６、（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸３２４～３３１、（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸４３８～４６２、または（ｖ）配列番号１のアミノ酸５３０～５４０から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項２５に記載の方法。
- 検出および適宜定量されたＮｆｌの少なくとも１つのタンパク質分解ペプチドが、（ｉ）配列番号１のアミノ酸１６５～１７２、（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１９８～２０６、（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸３２４～３３１、（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸４３８～４６２、または（ｖ）配列番号１のアミノ酸５３０～５４０から選択されるアミノ酸配列を有する２つ以上のペプチドを含む、請求項２５に記載の方法。
- 検出および適宜定量されたＮｆｌの少なくとも１つのタンパク質分解ペプチドが、（ｉ）配列番号１のアミノ酸１６５～１７２、（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸１９８～２０６、（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸３２４～３３１、（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸４３８～４６２、または（ｖ）配列番号１のアミノ酸５３０～５４０から選択されるアミノ酸配列を有する３つ以上のペプチドを含む、請求項２５に記載の方法。
- 工程（ｃ）における検出が、イムノアッセイまたは単一分子アレイ試験によって行われる、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
- 工程（ｃ）において検出された１つ～複数のＮｆｌアイソフォームを定量することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 対象から得られた試料中のバイオマーカーを検出する方法であって、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法に従ってニューロフィラメント軽鎖を検出することを含み、生体試料が、神経損傷を有するかまたはそれを有するリスクがある対象から得られた試料であり、バイオマーカーが、工程（ｃ）において検出された１つ～複数のＮｆｌアイソフォームである、方法。
- １つ～複数のＮｆｌアイソフォームを定量することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
- Ｎｆｌアイソフォームの第１および第２の集団を定量することを含み、適宜、バイオマーカーが、２つの集団の比である、請求項３０または３２に記載の方法。
- Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団が、請求項２（ｉ）において単離されたＮｆｌアイソフォームの集団であり、Ｎｆｌアイソフォームの第２の集団が、請求項２（ｉｉ）において単離されたＮｆｌアイソフォームの集団であり、適宜、請求項２（ｉ）および請求項２（ｉｉ）のアイソフォームの集団が、請求項３、４、５または２３～２９に従って生成されるか；あるいは
Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団が、請求項２（ｉ）において単離されたＮｆｌアイソフォームの集団であり、Ｎｆｌアイソフォームの第２の集団が、請求項２（ｉｉｉ）において単離されたＮｆｌアイソフォームの集団であり、適宜、請求項２（ｉ）および請求項２（ｉｉｉ）のアイソフォームの集団が、請求項３、４、５または２３～２９に従って生成されるか；あるいは
Ｎｆｌアイソフォームの第１の集団が、請求項２（ｉｉ）において単離されたＮｆｌアイソフォームの集団であり、Ｎｆｌアイソフォームの第２の集団が、請求項２（ｉｉｉ）において単離されたＮｆｌアイソフォームの集団であり、適宜、請求項２（ｉｉ）および請求項２（ｉｉｉ）のアイソフォームの集団が、請求項３、４、５または２３～２９に従って生成される、
請求項３３に記載の方法。 - 定量されたバイオマーカーの量が、認知機能が正常である対照対象、認知機能が正常であり、アミロイド陰性である対照対象、または認知機能が正常であり、ＰＥＴによって評価される脳におけるタウ沈着の病理学的レベルについて陰性である対照対象におけるそのレベルと比較して低減されているかを決定することをさらに含む、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が、定量されたバイオマーカーの量が、対照対象における平均から有意に逸脱する場合に、神経変性疾患または外傷性脳損傷を有すると診断される、請求項３５に記載の方法。
- 対象を処置することをさらに含む、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。
- 神経損傷を有するかまたはそれを有するリスクがある対象における処置応答を測定する方法であって、
（ａ）対象から得られた第１の生体試料において、請求項３１～３６のいずれか一項に従ってバイオマーカーを定量する工程；
（ｂ）処置を対象に投与する工程；および
（ｃ）処置後の対象から得られた第２の生体試料において、工程（ａ）において定量されたバイオマーカーを定量する工程
を含み、
第１の生体試料および第２の生体試料が、両方とも血液試料または両方ともＣＳＦ試料であり、
第１の試料と比較した、第２の試料中のバイオマーカーの量の変化の不在または減少が、ポジティブな処置応答を示すか、またはバイオマーカーの量が、第１の試料と比較して第２の試料中で増加するが、変化が、神経傷害を有するが処置を投与されなかった対象の対照群において起こる変化よりも少ない、
方法。 - 神経損傷を有するかまたはそれを有するリスクがある対象をモニタリングする方法であって、対象から得られた第１の生体試料および対象から得られた第２の生体試料において、請求項３１～３５のいずれか一項に従ってバイオマーカーを定量することであって、第１の生体試料および第２の生体試料が、両方とも血液試料または両方ともＣＳＦ試料であり、第２の生体試料が、第１の生体試料後に得られることを含み；
第１の試料と比較した第２の試料中のバイオマーカーの量の増加が、神経損傷の増加を示す、
方法。 - 対象が、神経変性疾患を有するかまたはそれを有するリスクがある、請求項３１～３９のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が、外傷性脳損傷を有するかまたはそれを有するリスクがある、請求項３１～３９のいずれか一項に記載の方法。
- ＨＪ３０．１、ＨＪ３０．１のヒト化バージョン、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤からなる群から選択される単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）エピトープ結合剤。
- ＨＪ３０．２、ＨＪ３０．２のヒト化バージョン、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．２の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤からなる群から選択される単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）エピトープ結合剤。
- ＨＪ３０．４、ＨＪ３０．４のヒト化バージョン、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤からなる群から選択される単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）エピトープ結合剤。
- ＨＪ３０．７、ＨＪ３０．７のヒト化バージョン、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．７の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤からなる群から選択される単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）エピトープ結合剤。
- ＨＪ３０．１１、ＨＪ３０．１１のヒト化バージョン、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１１の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤からなる群から選択される単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）エピトープ結合剤。
- ＨＪ３０．１３、ＨＪ３０．１３のヒト化バージョン、または全長組換えＮｆｌへのＨＪ３０．１３の結合を競合的に阻害するエピトープ結合剤からなる群から選択される単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）エピトープ結合剤。
- ＡＴＣＣ命名ＰＴＡ－１２６９６６を有するアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託されたハイブリドーマによって産生される単離された抗体。
- ＡＴＣＣ命名ＰＴＡ－１２６９６７を有するアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託されたハイブリドーマによって産生される単離された抗体。
- ＡＴＣＣ命名ＰＴＡ－１２６９６８を有するアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託されたハイブリドーマによって産生される単離された抗体。
- ＡＴＣＣ命名ＰＴＡ－１２６９６９を有するアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託されたハイブリドーマによって産生される単離された抗体。
- ＡＴＣＣ命名ＰＴＡ－１２６９７０を有するアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託されたハイブリドーマによって産生される単離された抗体。
- ＡＴＣＣ命名ＰＴＡ－１２６９７１を有するアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託されたハイブリドーマによって産生される単離された抗体。
- （ａ）ＨＪ３０．１（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９６６）の軽鎖可変領域、および／または（ｂ）ＨＪ３０．１（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９６６）の重鎖可変領域を含む、単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）。
- （ａ）ＨＪ３０．２（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９６７）の軽鎖可変領域、および／または（ｂ）ＨＪ３０．２（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９６７）の重鎖可変領域を含む、単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）。
- （ａ）ＨＪ３０．４（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９６８）の軽鎖可変領域、および／または（ｂ）ＨＪ３０．４（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９６８）の重鎖可変領域を含む、単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）。
- （ａ）ＨＪ３０．７（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９６９）の軽鎖可変領域、および／または（ｂ）ＨＪ３０．７（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９６９）の重鎖可変領域を含む、単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）。
- （ａ）ＨＪ３０．１１（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９７０）の軽鎖可変領域、および／または（ｂ）ＨＪ３０．１１（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９７０）の重鎖可変領域を含む、単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）。
- （ａ）ＨＪ３０．１３（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９７１）の軽鎖可変領域、および／または（ｂ）ＨＪ３０．１３（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９７１）の重鎖可変領域を含む、単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）。
- （ａ）ＨＪ３０．１（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９６６）のＶＬに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有する軽鎖可変領域、および／または（ｂ）ＨＪ３０．１（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９６６）のＶＨに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有する重鎖可変領域を含む、単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）。
- （ａ）ＨＪ３０．２（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９６７）のＶＬに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有する軽鎖可変領域、および／または（ｂ）ＨＪ３０．２（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９６７）のＶＨに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有する重鎖可変領域を含む、単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）。
- （ａ）ＨＪ３０．４（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９６８）のＶＬに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有する軽鎖可変領域、および／または（ｂ）ＨＪ３０．４（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９６８）のＶＨに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有する重鎖可変領域を含む、単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）。
- （ａ）ＨＪ３０．７（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９６９）のＶＬに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有する軽鎖可変領域、および／または（ｂ）ＨＪ３０．７（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９６９）のＶＨに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有する重鎖可変領域を含む、単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）。
- （ａ）ＨＪ３０．１１（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９７０）のＶＬに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有する軽鎖可変領域、および／または（ｂ）ＨＪ３０．１１（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９７０）のＶＨに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有する重鎖可変領域を含む、単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）。
- （ａ）ＨＪ３０．１３（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９７１）のＶＬに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有する軽鎖可変領域、および／または（ｂ）ＨＪ３０．１３（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６９７１）のＶＨに対して、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有する重鎖可変領域を含む、単離された抗ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）。
- 生体試料中のＮｆｌを検出および／または定量するための、請求項４２～６５のいずれか一項に記載のエピトープ結合剤の使用。
- 生体試料が、血液試料または脳脊髄液試料である、請求項６６に記載のエピトープ結合剤の使用。
- エピトープ結合剤が、検出可能標識に付着している、請求項４２または６５に記載のエピトープ結合剤の使用。
Applications Claiming Priority (7)
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| US202163147833P | 2021-02-10 | 2021-02-10 | |
| US63/147,833 | 2021-02-10 | ||
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