CN117178189A

CN117178189A - 用于检测血浆和脑脊液中的神经丝轻链的方法

Info

Publication number: CN117178189A
Application number: CN202280027714.4A
Authority: CN
Inventors: R·贝特曼; M·布德利尔; D·霍尔兹曼; 姜宏
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 2021-02-10
Filing date: 2022-02-10
Publication date: 2023-12-05

Abstract

本公开内容提供了检测且任选地定量存在于脑脊液和血液中的Nfl的方法，以及该方法检测且任选地测量指示神经元损害的Nfl生物标记物的水平的用途。还公开了抗Nfl抗体。

Description

用于检测血浆和脑脊液中的神经丝轻链的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年2月10日提交的美国临时申请号63/147,833、于2021年5月3日提交的美国临时申请号63/183,417、以及于2021年6月7日提交的美国临时申请号63/197,826的优先权，所述美国临时申请各自在此通过引用以其整体并入。

政府权利

本发明在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的AG067559下由政府支持完成。政府在本发明中拥有一定的权利。

序列表的提及

本申请含有序列表，其已经由EFS-Web以ASCII格式提交，并且在此通过引用以其整体并入。ASCII副本于2022年1月31目创建，命名为“716468_ST25.txt”且大小为10,025字节。

技术领域

本公开内容涵盖了定量且分析各种神经丝轻链种类的方法，及其测量神经元损害、告知神经退行性疾病的诊断、选择患者用于进一步诊断测试、以及指导治疗决策的用途。

背景技术

神经丝是有髓鞘轴突的神经元细胞骨架的主要组分，并且通过允许径向轴突生长在神经传导中发挥重要作用。在中枢神经系统中，神经丝由四种蛋白质构成：神经丝重链(NfH)、神经丝中链(NfM)、神经丝轻链(NfL)和α-中连蛋白。在这四种蛋白质中，仅NfL被充分确立为神经元损害的标记物。它在阿尔茨海默氏病(AD)、额颞叶痴呆(FTD)、帕金森氏病(PD)、进行性核上性麻痹(PSP)、外伤性脑损伤(TBI)、多发性硬化(MS)、肌萎缩侧索硬化(ALS)和其它神经退行性病症中是升高的。这指示了解NfL的生物学和病理生理学对于各种神经退行性疾病是有用的。

目前，只有一对商购可得的抗Nfl抗体用于监测临床队列和试验(抗NF-L mAb 2：1和抗Nfl mAb 47：3，Umam)。虽然商业测定的使用已成功地区分神经退行性疾病与健康对照，但生物标记物的效用目前因其非特异性性质而受到限制。由于多重神经退行性过程和神经炎症过程中的Nfl升高的“噪音”使得Nfl成为疾病状态和治疗应答的较不可靠的标记物，限制了其在治疗方案中的临床效用。虽然Nfl经历多重翻译后修饰(PTM)，导致任何给定生物样品中的许多不同Nfl同种型的可能性，但商购可得的免疫测定对这些PTM视而不见。此外，我们的理解仍然存在重要差距，例如，Nfl种类在多大程度上(如果有的话)可以用于检测神经退行性病症、给受试者分期和/或指导治疗决策。

相应地，本领域仍然需要改进的方法来检测且定量存在于脑脊液和血液中的Nfl同种型。

附图说明

申请文件含有至少一张彩色照片。带有彩色照片的本专利申请公开的副本在请求和支付必要的费用后由专利局提供。

图1是显示了在用抗Nfl抗体的免疫沉淀和LC-MS分析后，重组全长Nfl(rec-Nfl)的量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。每条线都是不同的抗体(参见图内的图例)。关于各种抗体的数据呈现于图4-27中。

图2A是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体从脑裂解物中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。每条线都是不同的抗体(参见图内的图例)。关于各种抗体的数据呈现于图4-21中。

图2B是图2A中所示的曲线图的放大版本(注意两个图之间的y轴比例的差异)。

图3是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体从CSF中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。每条线都是不同的抗体(参见图内的图例)。关于各种抗体的数据呈现于图4-27中。

图4A和图4B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.1从脑裂解物(图4A)和CSF(图4B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图4C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.1免疫沉淀后的rec-Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图5A和图5B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.2从脑裂解物(图5A)和CSF(图5B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图5C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.2免疫沉淀后的rec-Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图6A和图6B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.3.1从脑裂解物(图6A)和CSF(图6B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图6C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.3.1免疫沉淀后的rec-Nfl的胰蛋白酶肽量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图7A和图7B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.4从脑裂解物(图7A)和CSF(图7B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图7C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.4免疫沉淀后的rec-Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图8A和图8B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.3.5从脑裂解物(图8A)和CSF(图8B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图8C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.5免疫沉淀后的rec-Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图9A和图9B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.6从脑裂解物(图9A)和CSF(图9B)中免疫沉淀的从脑裂解物免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图9C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.6免疫沉淀后的rec-Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图10A和图10B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.7从脑裂解物(图10A)和CSF(图10B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图10C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.7免疫沉淀后的rec-Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图11A和图11B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.8从脑裂解物(图11A)和CSF(图11B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图11C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.8免疫沉淀后的rec-Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图12A和图12B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.9从脑裂解物(图12A)和CSF(图12B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图12C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.9免疫沉淀后的rec-Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图13A和图13B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.11从脑裂解物(图13A)和CSF(图13B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图13C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.11免疫沉淀后的rec-Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图14A和图14B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.12从脑裂解物(图14A)和CSF(图14B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图14C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.12免疫沉淀后的rec-Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图15A和图15B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.13从脑裂解物(图15A)和CSF(图15B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图15C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.13免疫沉淀后的rec-Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图16A和图16B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.14从脑裂解物(图16A)和CSF(图16B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图16C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.14免疫沉淀后的rec-Nfi量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图17A和图17B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.15从脑裂解物(图17A)和CSF(图17B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图17C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.15免疫沉淀后的rec-Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图18A和图18B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.16.1从脑裂解物(图18A)和CSF(图18B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图18C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.16.1免疫沉淀后的rec-Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图19A和图19B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.16.2从脑裂解物(图19A)和CSF(图19B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图19C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.16.2免疫沉淀后的rec-Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图20A和图20B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.17从脑裂解物(图20A)和CSF(图20B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图20C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.17免疫沉淀后的rec-Nfi量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图21A和图21B是显示了如通过LC-MS测量的，用抗Nfl抗体HJ30.18从脑裂解物(图21A)和CSF(图21B)中免疫沉淀的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图21C是显示了如通过LC-MS测量的，在用抗Nfl抗体HJ30.18免疫沉淀后的rec-Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图22是概括来自抗Nfl抗体免疫沉淀实验和MS分析的数据的图示(图4-21中所示的各个数据)。上图示显示了从CSF中富集的大致Nfl同种型。下图示显示了从脑裂解物中富集的大致Nfl同种型。每个图示含有全长Nfl蛋白的示意图，其中氨基酸编号沿着底部指示。在CSF中，富集了多种Nfl同种型，包括具有N末端截短的同种型、具有C末端截短的同种型、以及具有N末端截短和C末端截短的同种型。同种型大小根据MS数据进行约计，但由于所使用方法的技术限制，在残基水平上并非特异性的。因此，每条线可以代表具有在任一末端处的长度差异的多种同种型。实线(深蓝色)指示较高水平的置信度-截短的同种型含有由实线约计的残基。虚线(浅蓝色)指示较低水平的置信度，代表可能的变动。例如，MS数据提示了多个N末端截短的同种型，其含有SEQ ID NO：1的氨基酸530至540(由CSF图示中的四条底线表示)。这些同种型中最小的约计为含有SEQ ID NO：1的氨基酸462至543。然而，这仅是近似值；使用当前方法无法确定确切的长度。因此还可能的是所表示的最小同种型是多种同种型。在脑裂解物中，富集了Nfl同种型的至少两个群体-大约全长的第一群体，以及至少包含SEQ ID NO：1的氨基酸530至540的N末端截短的同种型的第二群体。CSF图示还包括含有抗Nfl抗体与之结合的表位的各个区域的大致指示(如Nfl蛋白示意图上方所指示的)。例如，抗Nfl抗体HJ30.1、HJ30.2、HJ30.13和HJ30.15被描绘为与在包含全长Nfl的约氨基酸100至约225的区域内的表位结合，如根据MS数据确定的。注意：这种表示并非暗示这些抗体结合相同的表位。

图23描绘了两步富集过程的示意图(左侧)，以及显示在每个步骤中用HJ30.4免疫沉淀的胰蛋白酶肽[323，330]的量(y轴，峰面积)的图。红色条是14N[323，330]，并且蓝色条是15N[323，330]。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图24描绘了两步富集过程的示意图(左侧)，以及显示在每个步骤中用HJ30.11免疫沉淀的胰蛋白酶肽[529，539]的量(y轴，峰面积)的图。红色条是14N[529，539]，并且蓝色条是15N[529，539]。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图25描绘了两步富集过程的示意图(左侧)，以及显示在每个步骤中用HJ30.13免疫沉淀的胰蛋白酶肽[116，125]的量(y轴，峰面积)的图。红色条是14N[116，125]，并且蓝色条是15N[116，125]。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。

图26描绘了两种不同的三步富集过程。所鉴定的样品名称对应于图27-28的图例。

图27是显示了如通过LC-MS测量的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。每条彩色线都是不同的样品，如图例和图26中鉴定的。

图28是显示了如通过LC-MS测量的Nfl量的曲线图。y轴是关于沿着x轴的每种鉴定的胰蛋白酶肽的14N峰面积。关于胰蛋白酶肽命名法的描述，参见实施例2的第一段。每条彩色线都是不同的样品，如图例和图26中鉴定的。

图29描绘了三步富集过程。所鉴定的样品名称对应于图30-39和41。

图30是显示了从得自受试者的CSF中富集的Nfl量的曲线图，所述受试者呈淀粉样蛋白阳性，具有CDR＝0.5。y轴是关于沿着x轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。表A中提供了沿着x轴编号为1至24的胰蛋白酶肽的身份。蓝线是“30.13”样品，橙线是“post 30.13_30.4IP”样品；并且灰线是“post 30.13&4_30.11IP”样品。

表A

图31是显示了从得自受试者的CSF中富集的Nfl量的曲线图，所述受试者呈淀粉样蛋白阳性，具有CDR＝0.5。y轴是关于沿着x轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。表A中提供了沿着x轴编号为1至24的胰蛋白酶肽的身份。蓝线是“30.13”样品，橙线是“post 30.13_30.4IP”样品；并且灰线是“post 30.13&4_30.11IP”样品。

图32是显示了从得自受试者的CSF中富集的Nfl量的曲线图，所述受试者呈淀粉样蛋白阳性，具有CDR＝0.5。y轴是关于沿着x轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。表A中提供了沿着x轴编号为1至24的胰蛋白酶肽的身份。蓝线是“30.13”样品，橙线是“post 30.13_30.4IP”样品；并且灰线是“post 30.13&4_30.11IP”样品。

图33是显示了从得自受试者的CSF中富集的Nfl量的曲线图，所述受试者呈淀粉样蛋白阳性，具有CDR＝0.5。y轴是关于沿着x轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。表A中提供了沿着x轴编号为1至24的胰蛋白酶肽的身份。蓝线是“30.13”样品，橙线是“post 30.13_30.4IP”样品；并且灰线是“post 30.13&4_30.11IP”样品。

图34是显示了从得自受试者的CSF中富集的Nfl量的曲线图，所述受试者呈淀粉样蛋白阴性，具有CDR＝0。y轴是关于沿着x轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。表A中提供了沿着x轴编号为1至24的胰蛋白酶肽的身份。蓝线是“30.13”样品，橙线是“post 30.13_30.4IP”样品；并且灰线是“post 30.13&4_30.11IP”样品。

图35是显示了从得自受试者的CSF中富集的Nfl量的曲线图，所述受试者呈淀粉样蛋白阴性，具有CDR＝0。y轴是关于沿着x轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。表A中提供了沿着x轴编号为1至24的胰蛋白酶肽的身份。蓝线是“30.13”样品，橙线是“post 30.13_30.4IP”样品；并且灰线是“post 30.13&4_30.11IP”样品。

图36是显示了从得自受试者的CSF中富集的Nfl量的曲线图，所述受试者呈淀粉样蛋白阴性，具有CDR＝0。y轴是关于沿着x轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。表A中提供了沿着x轴编号为1至24的胰蛋白酶肽的身份。蓝线是“30.13”样品，橙线是“post 30.13_30.4IP”样品；并且灰线是“post 30.13&4_30.11IP”样品。

图37是显示了从得自受试者的CSF中富集的Nfl量的曲线图，所述受试者呈淀粉样蛋白阴性，具有CDR＝0。y轴是关于沿着x轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。表A中提供了沿着x轴编号为1至24的胰蛋白酶肽的身份。蓝线是“30.13”样品，橙线是“post 30.13_30.4IP”样品；并且灰线是“post 30.13&4_30.11IP”样品。

图38是显示了从得自受试者的CSF中富集的Nfl量的曲线图，所述受试者呈淀粉样蛋白阴性，具有CDR＝0。y轴是关于沿着x轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。表A中提供了沿着x轴编号为1至24的胰蛋白酶肽的身份。蓝线是“30.13”样品，橙线是“post 30.13_30.4IP”样品；并且灰线是“post 30.13&4_30.11IP”样品。

图39是显示了从得自受试者的CSF中富集的Nfl量的曲线图，所述受试者呈淀粉样蛋白阴性，具有CDR＝0。y轴是关于沿着x轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。表A中提供了沿着x轴编号为1至24的胰蛋白酶肽的身份。蓝线是“30.13”样品，橙线是“post 30.13_30.4IP”样品；并且灰线是“post 30.13&4_30.11IP”样品。

图40A、图40B和图40C是概括图31-40中的各个数据的曲线图。y轴是关于沿着x轴的鉴定的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。红线是淀粉样蛋白阳性受试者，并且黑线是淀粉样蛋白阴性受试者。

图40D是概括图31-40中的各个数据的图。x轴是关于沿着y轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。

图41A和图41B是显示了从得自以下受试者的CSF中富集的Nfl量的曲线图：所述受试者是淀粉样蛋白阳性(“AD”)和CDR 0、CDR 0.5、CDR 1或CDR 2，或者所述受试者是淀粉样蛋白阴性和CDR 0、CDR 0.5或CDR 1。其为淀粉样蛋白阴性的具有CDR≥0.5的受试者被视为“非AD”。图41A显示了“post30.13_30.4IP样品”，而图41B显示了“post30.13&4_30.11IP样品”。在每个曲线图中，y轴是关于沿着x轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。表B中提供了沿着x轴编号为1至24的胰蛋白酶肽的身份。

表B

图41C是概括图42B中的各个数据的图。y轴是关于[529，539]胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率。

图42A和图42B是显示了在“30.13样品”中，如通过LC-MS测量的，从血液中富集的Nfl量的曲线图。在每个曲线图中，y轴是关于沿着x轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率(图42A)或14N量(图42B)。当对于ISTD的给定胰蛋白酶肽并未检测到可靠的MS信号时，并不报告数据。每条线都是不同的血液样品。

图43A和图43B是显示了在“post30.13_30.4IP样品”中，如通过LC-MS测量的，从血液中富集的Nfl量的曲线图。在每个曲线图中，y轴是关于沿着x轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率(图43A)或14N量(图43B)。当对于ISTD的给定胰蛋白酶肽并未检测到可靠的MS信号时，并不报告数据。每条线都是不同的血液样品。

图44A和图44B是显示了在“post30.13&4_30.11IP样品”中，如通过LC-MS测量的，从血液中富集的Nfl量的曲线图。在每个曲线图中，y轴是关于沿着x轴的每种胰蛋白酶肽，所测量的峰面积的14N/15N比率(图44A)或14N量(图44B)。当对于ISTD的给定胰蛋白酶肽并未检测到可靠的MS信号时，并不报告数据。每条线都是不同的血液样品。

图45显示了重组NfL的免疫沉淀。23种NfL抗体中的每种(HJ.30.x)和针对β淀粉样蛋白的一种阴性对照抗体(HJ5.1)就其使全长重组NfL免疫沉淀的能力进行评价。显示了重组NfL回收的相对量(较高的N14/N15＝较高的N14回收。N15在IP后添加。

图46显示了来自合并CSF的天然NfL的免疫沉淀。23种内部NfL抗体中的每种(HJ.30.x)和针对β淀粉样蛋白的一种阴性对照抗体(HJ5.1)就其使来自CSF的NfL免疫沉淀的能力进行评价。线条颜色对应于各个抗体，并且在图例中注明。抗体似乎靶向NfL的3个不同区域。

图47显示了定量(6肽)MS方法的线性。所有6种肽的定量在测试的N14/N15范围内是线性的。

图48显示了神经丝轻种类的图，指示了CSF NfL作为多重片段种类存在。用于免疫沉淀的靶向NfL的各个结构域的抗体加上质谱分析，使得能够鉴定CSF中的多重NfL种类。浅色虚线代表NfL种类鉴定中的潜在片段，而深色实线代表鉴定的片段种类。使用23种不同的定制抗体来鉴定NfL种类，并且用于确定NfL种类的数据显示于图49A-49B中。

图49A、图49B和图49C显示了脑含有两种主要的NfL种类，而CSF具有至少3种主要的NfL种类。用于序贯IP-MS/MS测定的实验方法纯化且鉴定至少3种NfL片段种类图49A，来自合并CSF的序贯NfLIP指示3个主要NfL结构域；从NfL93到NfL224的中间结构域区域、从NfL324到NfL359的另一个区域、以及在NfL530处的c末端区域图49B，并且脑皮质裂解物显示了从NfL2到NfL540的全长NfL，其中c末端肽在NfL530处图49C。蓝线描绘了在用HJ30.13的第一次IP之后鉴定的肽，红线描绘了在用HJ30.4的第二次IP期间鉴定的肽，并且绿线代表了在用HJ30.11的第三次IP期间鉴定的肽。

图50显示了与健康对照相比，NfL种类在AD CSF中是增加的。三个主要CSF NfL种类的序贯IP/MS鉴定了，对于每个主要种类，与对照(n＝6)相比，在阿尔茨海默氏病痴呆(n＝4)中增加的NfL水平。红线代表了关于患有AD痴呆的个体的NfL种类的相对量，如通过经由PET的淀粉样蛋白斑块存在和非常轻度的痴呆(CDR＝0.5)确定的，并且黑线代表了健康年龄匹配的对照(CDR＝0)。

图51A、图51B、图51C、图51D、图51E、图51F和图51G显示了验证队列，其确认了与健康对照相比在AD中增加的NfL324和NfL530。示意图显示了定量IP-MS方法中的NfL图和肽的定位(图51A)。关于螺旋1A和1B区域NfL101(图51B)、NfL117(图51C)和NfL165(图51D)，在有症状的AD参与者(N＝30；淀粉样蛋白阳性，CDR＞0)和健康对照(N＝25；淀粉样蛋白阴性，CDR＝0)之间的NfL肽比较显示了在AD中不显著增加的趋势，在螺旋2B NfL283区域(图51E)中没有差异，以及在NfL323(图51F)和c末端区域NfL529(图51G)中高度显著的增加。**表示在p＜0.01下的静态显著性。

图52A、图52B、图52C、图52D、图52E和图52F显示了通过NfL种类，在IP-MS和ELISA之间的相关性。在IP-MS和黄金标准Uman Diagnostics ELISA结果之间的相关性因NfL种类而异：NfL101(图52A)、NfL117(图52B)、NfL165(图52C)、NfL284(图52D)、NfL324(图52E)、NfL530(图52F)。在ELISA和NfL324之间观察到最高相关性。

图53A、图53B、图53C、图53D、图53E和图53F显示了NfL种类与AD痴呆阶段(CDR总分(CDR sum of boxes))的相关性。NfL种类的量与痴呆严重程度的阶段最低限度地相关联。每个图的x轴表示临床痴呆量表的CDR总分，其中CDR-SB 0为正常，0.5至6为轻度痴呆，并且＞6为中等临床痴呆。NfL种类的相对量在y轴上显示为NfL区域的N14/N15比率。对于每组计算斯皮尔曼相关性和p值：NfL101：淀粉样蛋白+斯皮尔曼r＝0.29(ns，p＝0.05)，淀粉样蛋白-斯皮尔曼r＝0.18(ns，p＝0.30)(图53A)；NfL117：淀粉样蛋白+斯皮尔曼r＝0.30(p＝0.04)，淀粉样蛋白-斯皮尔曼r＝0.18(ns，p＝0.31)(图53B)；NfL165：淀粉样蛋白+斯皮尔曼r＝0.36(p＝0.01)，淀粉样蛋白-斯皮尔曼r＝0.19(ns，p＝0.28)(图53C)；NfL284：淀粉样蛋白+斯皮尔曼r＝0.24(ns，p＝0.10)，淀粉样蛋白-斯皮尔曼r＝0.31(ns，p＝0.07)(图53D)；NfL324：淀粉样蛋白+斯皮尔曼r＝0.30(p＝0.04)，淀粉样蛋白-斯皮尔曼r＝0.16(ns，p＝0.35)(图53E)；NfL530：淀粉样蛋白+斯皮尔曼r＝0.13(ns，p＝0.39)，淀粉样蛋白-斯皮尔曼r＝0.25(ns，p＝0.14)(图53F)。具有淀粉样蛋白斑块的参与者用红色圆圈显示，并且淀粉样蛋白阴性参与者用灰色方块显示。NfL101、NfL117、NfL165和NfL284各自具有n＝1个异常值，其并未在图上绘制，但包括在相关性的计算中。

图54A、图54B、图54C、图54D、图54E和图54F显示了通过淀粉样蛋白状态和CDR的对数转化的NfL浓度。淀粉样蛋白-CDR 0组用作参考组，并且其它三个组使用两样品t检验与参考组进行比较。P值使用Benjamini-Hochberg方法对于多重比较进行校正。对于NfL101(图54A)、NfL117(图54B)、NfL165(图54C)、NfL284(图54D)、NfL324(图54E)和NfL530(图54F)，比较了四个组(淀粉样蛋白阴性CDR＝0；淀粉样蛋白阳性CDR＝0，淀粉样蛋白阳性CDR＞0，淀粉样蛋白阴性CDR＞0)各自的NfL浓度。

图55A、图55B、图55C、图55D、图55E和图55F显示了通过CDR总体状态的对数转化的NfL浓度。对于NfL101(图55A)、NfL117(图55B)、NfL165(图55C)、NfL284(图55D)、NfL324(图55E)和NfL530(图55F)，使用两样品t检验来比较CDR 0和CDR＞0组之间的差异。

图56显示了关于NfL种类与神经变性、AD和tau的临床生物标记物之间的相关性的热图。图代表斯皮尔曼的相关性，其中更深的蓝色表示较强的相关性，并且白色/浅蓝色表示弱相关性。CSF NfL区域彼此的相关性最强，其中c末端区域NfL324和NfL530与其它NfL区域的相关性最小。在NfL324或NfL530与CDR(一种临床痴呆评定量表)、年龄与p-tau和t-tau之间存在适度的相关性，而淀粉样蛋白PET和MMSE的测量具有低相关性。在NfL与tau或ptau之间的相关性对于NfL的c末端区域(NfL324、NfL530)高于其它肽。

图57描绘了富集过程(左侧)和样品类型(右侧)的示意图。

图58A、图58B、图58C、图58D、图58E和图58F显示的图显示了关于ALS、脊髓性肌萎缩(SMA)和对照的Nfl浓度差异。图58F显示了NfL101的浓度。图58E显示了NfL117的浓度。图58C显示了NfL165的浓度。图58D显示了NfL284的浓度。图58B显示了NfL324的浓度。图58A显示了NfL530的浓度。

图59A、图59B、图59C、图59D、图59E和图59F显示的图显示了ALS进展和Nfl浓度之间的相关性。图59F显示了NfL101的相关性。图59E显示了NfL117的相关性。图59C显示了NfL165的相关性。图59D显示了NfL284的相关性。图59B显示了NfL324的相关性。图59A显示了NfL530的相关性。

图60A、图60B、图60C、图60D、图60E和图60F显示的图显示了ALS进展和Nfl浓度之间的相关性。图60F显示了NfL101的相关性。图60E显示了NfL117的相关性。图60C显示了NfL165的相关性。图60D显示了NfL284的相关性。图60B显示了NfL324的相关性。图60A显示了NfL530的相关性。

图61显示了ALS中的CSF NfL种类的序贯IP/MS。

图62显示了对照中的CSF NfL种类的序贯IP/MS。

图63显示了SMA中的CSF NfL种类的序贯IP/MS。

具体实施方式

在本公开内容的各个方面中提供了检测且任选地定量存在于脑脊液和血液中的Nfl的方法，以及该方法检测且任选地测量指示神经元损害的Nfl生物标记物的水平的用途。如本文更详细地描述的，已发现了与Nfl的其它肽或部分相比，Nfl的某些肽或部分是神经元损害的更好的指示剂。本文还公开了多种抗Nfl表位结合剂，以及其在本公开内容的方法中的用途。

I.定义

为了使本发明可以更容易地理解，首先定义了某些术语。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。虽然在本文中描述了优选的材料和方法，但与本文描述的那些类似、修改或等价的许多方法和材料可以用于本发明的实施方案的实践中，而无需过度实验。在描述且请求保护本发明的实施方案时，下述术语将按照下文阐述的定义来使用。

浓度、量和其它数值数据可以在本文中以范围形式进行表达或呈现。应理解，此类范围形式仅仅为了方便和简洁而使用，并且应当被灵活地解释为不仅包括明确列举为范围界限的数值，而且还包括在该范围内涵盖的所有个别的数值或子范围，如同明确地叙述了每个数值和子范围一样。作为说明，“约2至约50”的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的2至50的值，而且还包括在所指示的范围内的所有各个值和子范围。因此，在该数值范围内包括的是各个值，例如2、2.4、3、3.7、4、5.5、10、10.1、14、15、15.98、20、20.13、23、25.06、30、35.1、38.0、40、44、44.6、45、48，以及子范围例如1-3、2-4、5-10、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-50、2-10、2-20、2-30、2-40、2-50等。相同的原则适用于仅叙述一个数值作为最小值或最大值的范围。此外，无论所描述的范围或特性的宽度如何，这种解释都应该适用。

如本文使用的，术语“约”指关于任何可定量的变量，包括但不限于质量、体积、时间、距离和量，例如通过典型的测量技术和设备可能发生的数值数量的变动。进一步地，考虑到现实世界中使用的固体和液体处理程序，存在某些无意的误差和变动，其很可能是通过用于制造组合物或执行方法等等的成分的制造、来源或纯度的差异。术语“约”也涵盖这些变动，其可以高达±5％，但也可以为±4％、3％、2％、1％等。无论是否被术语“约”修饰，权利要求包括数量的等价物。

在本公开内容中，“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有”和“具有”等等可以具有美国专利法中赋予其的含义，并且可以意指“包括(includes)”、“包括(including)”等等，并且一般被解释为开放式术语。术语“由......组成(consisting of)”或“由......组成(consists of)”是封闭术语，并且仅包括与此类术语结合具体列出的组分、结构、步骤等等，以及按照美国专利法的组分、结构、步骤等等。“基本上由......组成(Consisting essentially of)”或“基本上由......组成(consists essentially of)”具有通过美国专利法一般赋予其的含义。特别地，此类术语一般是封闭术语，除了允许包括实质上并不影响与之结合使用的项目的基本和新型特性或功能的另外的项目、材料、组分、步骤或元件之外。例如，如果在语言“基本上由......组成”下存在，则存在于组合物中，但不影响组合物的性质或特性的微量要素将是允许的，即使在此类术语之后的项目列表中没有明确叙述。在本说明书中，当使用开放式术语，如“包含”或“包括”时，应理解还应该向语言“基本上由......组成”以及语言“由......组成”提供直接支持，如同明确陈述一样，且反之亦然。

术语“Aβ”指衍生自称为淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的较大蛋白质的羧基末端中的区域的肽。编码APP的基因定位于21号染色体上。存在可能具有毒性效应的多种形式的Aβ：Aβ肽通常为37-43个氨基酸序列长，尽管它们可以具有改变其整体大小的截断和修饰。它们可以在可溶性区室和不溶性区室中，以单体、寡聚和聚集形式，细胞内或细胞外发现，并且可以与其它蛋白质或分子复合。Aβ的不利或毒性效应可以归于任何或所有上文指出的形式，以及并未具体描述的其它形式。例如，两个此类Aβ同种型包括Aβ40和Aβ42；其中Aβ42同种型是特别纤维原性的或不溶的，并且与疾病状态相关。术语“Aβ”通常指多个Aβ种类，而不区别各个Aβ种类。特定的Aβ种类通过肽的大小进行鉴定，例如Aβ42、Aβ40、Aβ38等。

如本文使用的，术语“Aβ42/Aβ40值”意指从受试者中获得的样品中的Aβ42量与同一样品中的Aβ40量相比的比率。

“Aβ淀粉样变性”定义为脑中的临床上异常的Aβ沉积。确定为具有Aβ淀粉样变性的受试者在本文中被称为“淀粉样蛋白阳性”，而确定为并不具有Aβ淀粉样变性的受试者在本文中被称为“淀粉样蛋白阴性”。本领域存在公认的Aβ淀粉样变性的指示剂。在本公开内容时，Aβ淀粉样变性通过淀粉样蛋白成像(例如，PiB PET、氟贝他吡(fluorbetapir)或本领域已知的其它成像方法)直接进行测量，或者通过降低的脑脊液(CSF)Aβ42或降低的CSF Aβ42/40比率间接进行测量。具有平均皮质结合电位(MCBP)评分＞0.18的[11C]PIB-PET成像是Aβ淀粉样变性的指示剂，如通过免疫沉淀和质谱法(IP/MS))测量的约1ng/ml的脑脊液(CSF)Aβ42浓度一样。可替代地，可以使用如通过PIB-PET确定的关于CSF Aβ42/40的截止比，其使预测淀粉样蛋白阳性的准确性达到最大。诸如这些的值或本领域已知的和/或实施例中使用的其它值可以单独或组合使用，以在临床上确认Aβ淀粉样变性。参见例如，各自在此通过引用以其整体并入的Klunk W E等人Ann Neurol 55(3)2004，Fagan A M等人AnnNeurol，2006，59(3)，Patterson等人，Annals of Neurology，2015，78(3)：439-453，或Johnson等人，J.Nuc.Med.，2013，54(7)：1011-1013。具有Aβ淀粉样变性的受试者可能是有症状的或可能并非有症状的，并且有症状的受试者可能满足或可能不满足与Aβ淀粉样变性相关的疾病的临床标准。与Aβ淀粉样变性相关的症状的非限制性实例可以包括认知功能受损、行为改变、语言功能异常、情绪失调、癫痫发作、痴呆和神经系统结构或功能受损。与Aβ淀粉样变性相关的疾病包括但不限于阿尔茨海默氏病(AD)、脑淀粉样蛋白血管病(CAA)、路易体痴呆和包涵体肌炎。具有Aβ淀粉样变性的受试者处于发展与Aβ淀粉样变性相关的疾病的增加风险中。

“Aβ淀粉样变性的临床体征”指本领域已知的Aβ沉积的客观量度。Aβ淀粉样变性的临床体征可以包括但不限于通过淀粉样蛋白成像(例如PiB PET、氟贝他吡或本领域已知的其它成像方法)，或者通过降低的脑脊液(CSF)Aβ42或Aβ42/40比率鉴定的Aβ沉积。参见例如，各自在此通过引用以其整体并入的Klunk WE等人Ann Neurol 55(3)2004，以及FaganAM等人Ann Neurol 59(3)2006。Aβ淀粉样变性的临床体征还可以包括Aβ代谢的测量，特别是单独的Aβ42代谢的测量或与其它Aβ变体(例如Aβ37、Aβ38、Aβ39、Aβ40和/或总Aβ)的代谢测量的比较，如各自在此通过引用以其整体并入的美国专利序列号14/366,831、14/523,148和14/747,453中所述的。另外的方法在以下中进行描述：各自在此通过引用以其整体并入的Albert等人Alzheimer’s&Dementia2007第7卷，第170-179页；McKhann等人，Alzheimer's&Dementia2007第7卷，第263-269页；以及Sperling等人Alzheimer’s&Dementia2007第7卷，第280-292页。重要的是，具有Aβ淀粉样变性的临床体征的受试者可能具有或可能不具有与Aβ沉积相关的症状。然而，具有Aβ淀粉样变性的临床体征的受试者处于发展与Aβ淀粉样变性相关的疾病的增加风险中。Aβ淀粉样变性的临床体征还可能包括测量CSF或血液中的其它可溶性蛋白质，包括但不包括限于磷酸化的tau种类(例如，在残基T217和/或T181处磷酸化的tau种类等等)。

“关于淀粉样蛋白成像的候选者”指已被临床医生鉴定为对于其淀粉样蛋白成像可能是临床上有必要的个体的受试者。作为非限制性实例，关于淀粉样蛋白成像的候选者可以为具有Aβ淀粉样变性的一种或多种临床体征、一种或多种Aβ斑块相关症状、一种或多种CAA相关症状或其组合的受试者。临床医生可能对于此类受试者推荐淀粉样蛋白成像，以指导他或她的临床护理。作为另一个非限制性实例，关于淀粉样蛋白成像的候选者可以为与Aβ淀粉样变性相关的疾病的临床试验的潜在参与者(对照受试者或测试受试者)。

“Aβ斑块相关症状”或“CAA相关症状”指分别由淀粉样蛋白斑块或CAA的形成引起或与其相关的任何症状，所述淀粉样蛋白斑块或CAA由称为淀粉样蛋白纤维的规则有序的纤维聚集体构成。示例性的Aβ斑块相关症状可能包括但不限于神经元变性、认知功能受损、记忆受损、行为改变、情绪失调、癫痫发作、神经系统结构或功能受损、以及阿尔茨海默氏病或CAA的发展或恶化的风险增加。神经元变性可能包括神经元结构的变化(包括分子变化，例如有毒蛋白质、蛋白质聚集体等的细胞内累积等，以及宏观水平的变化，例如轴突或树突的形状或长度的变化、髓鞘组成的变化、髓鞘的丧失等)、神经元功能的变化、神经元功能丧失、神经元死亡或其任何组合。认知功能受损可能包括但不限于关于记忆、注意力、集中力、语言、抽象思维、创造力、执行功能、计划和组织的困难。行为改变可能包括但不限于身体或言语攻击，冲动，抑制降低，冷漠，主动性降低(decreased initiation)，性格改变，酒精、烟草或药物滥用，以及其它成瘾相关行为。情绪失调可能包括但不限于抑郁、焦虑、躁狂、易怒和情绪失禁。癫痫发作可能包括但不限于全身性强直阵挛性癫痫发作、复杂部分性癫痫发作和非痫性心因性癫痫发作。神经系统结构或功能受损可能包括但不限于脑积水、帕金森综合征、睡眠障碍、精神病、平衡和协调损害。这可能包括运动损害，例如单肢轻瘫、轻偏瘫、四肢轻瘫、共济失调、颤搐和震颤。这还可能包括感觉丧失或功能障碍，包括嗅觉、触觉、味觉、视觉和听觉。此外，这可能包括自主神经系统损害，例如肠道和膀胱功能障碍、性功能障碍、血压和体温失调。最后，这可能包括可归于下丘脑和垂体功能障碍的激素损害，例如生长激素、促甲状腺激素、黄体生成素、促卵泡激素、促性腺激素释放激素、催乳素以及众多其它激素和调节剂的缺乏和失调。

如本文使用的，术语“血液样品”指衍生自血液，优选外周(或循环)血的生物样品。血液样品可以为全血、血浆或血清，尽管血浆通常是优选的。

如本文使用的，术语“同种型(isoform)”指同一蛋白质的几种不同形式中的任一种，其由于编码蛋白质的mRNA的可变剪接、蛋白质的翻译后修饰、在体内发生的蛋白质的蛋白酶解加工、遗传变异和体细胞重组而出现。术语“同种型”、“种类”和“变体”可互换使用(例如，术语“Nfl同种型”和“Nfl种类”可以是可互换使用的)。

除非另有明确说明，否则术语“神经丝轻链”指“人神经丝轻链”，并且涵盖所有遗传编码的同种型或变体，以及其在体内C末端截短的、在体内N末端截短的、在体内N末端截短和C末端截短的、在体内翻译后修饰的或其任何组合的种类。术语“神经丝轻链”、“神经丝轻多肽”和“Nfl”在本文中可互换使用。全长Nfl具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

术语“重组Nfl”指由已引入系统(例如，原核细胞、真核细胞或无细胞表达系统)内的核酸编码的Nfl，所述系统支持核酸的表达及其翻译成蛋白质。用于产生重组蛋白质的方法是本领域众所周知的，并且本文公开的重组Nfl的产生并不限于特定系统。

术语“受试者”指人或表达人Nfl的非人动物。

如本文使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指治疗性治疗和预防性或预防措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望有的生理变化或疾病/病症。有益的或期望的临床结果包括但不限于无论是可检测的还是不可检测的症状的减轻、疾病程度的缩小、疾病状态的稳定(即，不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解还是全部缓解)。“治疗”还可以意指与如果未接受治疗的预计存活相比的延长存活。需要治疗的那些人包括已经患有疾病、状况或病症的那些人，以及易于患有疾病、状况或病症的那些人，或者其中待预防疾病、状况或病症的那些人。

如本文使用的，术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体和抗体样结构，包括但不限于全长单克隆、多克隆和多特异性(例如，双特异性、三特异性等)抗体，以及重链抗体和抗体片段，条件是它们显示出所需的抗原结合活性。涉及结合抗原的抗体的结构域被称为“可变区”或“可变结构域”，并且在下文中进一步详细描述。单个可变结构域可能足以赋予抗原结合特异性。优选地，但不一定地，可用于开发的抗体是重组产生的。抗体可以是或可以不是糖基化的，尽管糖基化抗体可以是优选的。“分离的”抗体是已与其自然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过本领域已知的方法确定的。

除本文描述的抗体之外，使用本领域已知的方法设计与本发明的抗体基本上发挥相同功能的抗体模拟物或适体可以是可能的。“抗体模拟物”指可以特异性结合抗原，但在结构上与抗体无关的多肽或蛋白质。抗体模拟物具有约3kDa至约20kDa的质量。抗体模拟物的非限制性实例是亲和体分子、affilins、affimers、alphabodies、anticalins、高亲和性多聚体(avimers)、DARPins和单体(monobodies)。适体是一类小核酸配体，其由RNA或单链DNA寡核苷酸构成，并且对于其靶具有高特异性和亲和力。适体通过结构识别与其靶相互作用并结合，这一过程类似于抗原抗体反应的过程。适体具有比抗体低的分子量，通常为约8-25kDa。

术语“全长抗体”和“完整抗体”可以是可互换使用的，并且指具有与天然抗体结构基本上相似的结构或具有如本文定义的具有含有Fc区的重链的抗体。天然抗体的基本结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。轻链分类为γ、μ、α和λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每条轻链和重链的氨基末端部分包括约100至110个或更多个氨基酸的序列的可变区，其主要负责抗原识别(分别为VL和VH)。每条链的羧基端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。在轻链和重链内，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的序列的“J”区连接，其中重链还包括约10个或更多个氨基酸的序列的“D”区。完整的抗体经由二硫键适当地交联，如本领域已知的。

抗体的重链和轻链的可变结构域一般具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。)单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域来分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。

“构架区”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变结构域残基。可变结构域的FR一般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。相应地，HVR和FR序列一般按下述顺序出现：FR1-HVR1-FR2-HVR2-FR3-HVR3-FR4。如本领域已知的，重链和轻链的FR结构域可以不同。

如本文使用的，术语“高变区”或“HVR”指可变结构域的每个区域，其在序列中是高变的(通常也被称为“互补决定区”或“CDR”)，和/或形成结构上限定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)。一般地，抗体包含六个HVR：VH中的三个(H1、H2、H3)以及VL中的三个(L1、L2、L3)。如本文使用的，“衍生自可变区的HVR”指与来自原始可变区的相应HVR相比，具有不多于两个氨基酸取代的HVR。本文的示例性HVR包括：(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处出现的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处出现的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处出现的抗原接触(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；(d)CDR1-IMGT(位置27-38)、CDR2-IMGT(位置56-65)、以及CDR3-IMGT区域(位置105-116或105-117)，其基于IMGT唯一编号(Lefranc，“The IMGT unique numbering for Immunoglobulins，T cell receptors andIg-like domains，”The Immunologist，1999，7：132-136；Lefranc等人，Nucleic AcidsResearch，2009，37(Database issue)：D1006-D1012；Ehrenmann等人，“Chapter 2：Standardized Sequence and Structure Analysis of Antibody Using IMGT，”inAntibody Engineering Volume 2，编辑Roland E.Kontermann和Stefan Dubel，2010，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，doi：10.1007/978-3-642-01147-4；www.imgt.org/IMGTScientificChart/Nomenclature/IMGT-FRCDRdefinition.html)，以及(e)(a)、(b)、(c)和/或(d)的组合，如下文关于本公开内容的各种抗体定义的。除非另有说明，否则分配序列识别号的HVR残基和可变结构域中的其它残基((例如，FR残基)基于上文的IMGT唯一编号进行编号。

术语“Fc区”在本文中用于定义含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1991中所述的。

“变体Fc区”包含与天然Fc区或亲本多肽的Fc区相比，由于一个或多个氨基酸取代和/或修饰的糖基化模式，可以不同于天然Fc区的氨基酸序列。在一个实例中，变体Fc区可以具有在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中的约1至约10个氨基酸取代、或约1至约5个氨基酸取代。本文的变体Fc区可以与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性、至少约90％同源性或至少约95％同源性。

“抗体片段”指除完整抗体外的分子，其包含完整抗体的一部分，所述部分结合完整抗体与之结合的抗原。抗体片段的非限制性实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)₂；单链形式的抗体及其更高阶的变体；单结构域抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

抗体的单链形式及其更高阶的形式可以包括但不限于单结构域抗体、单链变体片段(scFv)、二价scFv(二-scFv)、三价scFv(三-scFv)、四价scFv(四-scFv)、双抗体、以及三抗体和四抗体。ScFv由通过接头连接的重链可变区和轻链可变区构成。在大多数情况下，但并非全部情况下，接头可以是肽。接头肽的长度优选为约5至30个氨基酸，或约10至25个氨基酸。通常，接头允许稳定可变结构域，而不干扰活性结合位点的适当折叠和产生。在优选的实施方案中，接头肽富含甘氨酸以及丝氨酸或苏氨酸。ScFv可以用于促进噬菌体展示，或者可以用于流式细胞术、免疫组织化学或用作靶向结构域。制备且使用scFv的方法是本领域已知的。ScFv还可以缀合至人恒定结构域(例如，重链恒定结构域衍生自IgG结构域，例如1gG1、IgG2、IgG3或IgG4，或者重链恒定结构域衍生自IgA、IgM或IgE)。双抗体、三抗体和四抗体以及更高阶的变体通常通过将接头肽的长度从零变为几个氨基酸而产生。可替代地，本领域还众所周知的是，可以使用连接至可变结构域的自组装单元来生成多价结合抗体变体。

“单结构域抗体”指由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。

多特异性抗体包括双特异性抗体，三特异性抗体，或者具有四种或更多种特异性的抗体。多特异性抗体可以通过将一种抗体的重链和轻链与一种或多种其它抗体的重链和轻链组合来产生。这些链可以是共价连接的。

“单克隆抗体”指衍生自单个拷贝或克隆的抗体，所述克隆包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆。“单克隆抗体”并不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可以使用本领域众所周知的杂交瘤技术，以及重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或此类技术和本领域容易已知的其它技术的组合来产生。此外，根据本领域已知的方法，单克隆抗体可以用可检测标记进行标记、固定在固相上和/或与异源化合物(例如酶或毒素)缀合。

“重链抗体”指由两条重链组成的抗体。重链抗体可以是来自骆驼、美洲驼、羊驼、鲨鱼等的IgG样抗体，或者来自软骨鱼的IgNAR。

“人源化抗体”指这样的非人抗体，其已进行修饰以减少非人抗体在施用之后在人中引发免疫应答的风险，但保留与起始非人抗体相似的结合特异性和亲和力。人源化抗体结合与非人抗体相同或相似的表位。术语“人源化抗体”包括通过改变具有非人高变区(“HVR”)的抗体的序列，部分或全部由衍生自人抗体种系的氨基酸序列构成的抗体。最简单的此类改变可以简单地由用人抗体的恒定区取代鼠恒定区组成，因此导致可能具有足够低的免疫原性以适合于药物用途的人/鼠嵌合体。优选地，抗体的可变区也通过本领域目前众所周知的技术进行人源化。例如，可变区的构架区可以被相应的人构架区取代，同时保留一个、几个或所有六个非人HVR。一些构架残基可以被来自非人VL结构域或VH结构域(例如，HVR残基衍生自其的非人抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善人源化抗体的特异性或亲和力。基本上人的构架区与已知的人构架序列具有至少约75％的同源性(即至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的序列同一性)。HVR也可以是随机突变的，使得对于抗原的结合活性和亲和力在全人种系构架区或基本上人的构架区的背景下得到维持或增强。如上文提到的，采用抗体片段对于该开发方法中的使用是足够的。进一步地，如本文使用的，术语“人源化抗体”指包含基本上人的构架区，来自非人抗体的至少一个HVR，并且其中存在的任何恒定区基本上是人的抗体。基本上人的恒定区与已知的人恒定序列具有至少约90％(即约90％、约95％或约99％的序列同一性)。因此，人源化抗体的所有部分(可能除了HVR之外)与相应的一对或多对种系人免疫球蛋白序列基本上等同。

需要时，人源化免疫球蛋白的设计可以如下进行，或者使用本领域技术人员熟悉的类似方法进行(例如，参见Almagro等人Front.Biosci.2008，13(5)：1619-33)。鼠抗体可变区与最相似的人种系序列进行比对(例如通过使用BLAST或类似算法)。将来自鼠抗体序列的CDR残基移植到类似的人“受体”种系内。随后，在CDR附近或在构架内的一个或多个位置(例如，Vernier位置)可以回复为原始鼠氨基酸，以便获得与原始鼠抗体具有相似结合亲和力的人源化抗体。通常，生成具有不同回复突变的几种形式的人源化抗体，并且凭经验测试活性。选择具有与亲本鼠抗体最相似的特性和最少鼠构架回复的人源化抗体变体作为最终的人源化抗体候选物。

术语“表位结合剂”指识别给定表位并能够与其特异性结合的抗体、适体、核酸、肽、蛋白质、脂质、代谢物、小分子或其片段。表位可能是线性表位或可能是构象表位。如本文使用的，术语“线性表位”指由氨基酸的线性(或连续)序列组成的表位。术语“构象表位”指由在蛋白质聚集体的表面上的不连续氨基酸组成的表位，所述氨基酸具有特定的三维形状。

如本文使用的，术语“适体”指多核苷酸，一般为RNA或DNA，其在生物化学活性、分子识别或结合属性方面具有有用的生物活性。通常，适体具有分子活性，例如与在特定表位(区域)处的靶分子结合。一般公认的是，在其与多肽结合方面特异性的适体可以通过体外进化方法进行合成和/或鉴定。用于制备且表征适体的手段，包括通过体外进化方法，是本领域众所周知的。参见例如，通过引用以其整体并入本文的US 7,939,313。

II.抗Nfl表位结合剂

如本文使用的，“抗Nfl表位结合剂”指与重组人神经丝轻多肽(Nfl)结合的分离的表位结合剂，其相互作用的亲和常数或亲和力(KD)为约0.1pM至约10μM，优选约0.1pM至约1μM，更优选约0.1pM至约100nM。用于确定表位结合剂对于抗原的亲和力的方法是本领域已知的，并且在实施例中进一步示出。在一些实施方案中，抗Nfl表位结合剂是核酸适体。在一些实施方案中，抗Nfl表位结合剂是抗体。

本文公开的抗Nfl表位结合剂可以依据它们识别或结合的表位进行描述或指定。与表位结合剂的抗原结合结构域特异性相互作用的靶多肽的一部分是“表位”。Nfl可以包含任何数目的表位，取决于蛋白质的来源(例如，重组体、人)、蛋白质的定位(例如，细胞内、细胞外、脑、CSF、血液等)、构象状态和同种型等。此外，应当注意，Nfl上的“表位”可以是线性表位或构象表位，并且在两种情况下均可以包括非多肽元件，例如表位可以包括碳水化合物侧链、脂质侧链、磷酸盐等。术语“亲和力”指各个表位与表位结合剂的抗原结合位点的结合强度的量度。

尽管本公开内容的抗Nfl表位结合剂可以通过使用重组全长Nfl作为抗原来生成，但可用于本公开内容的方法的抗Nfl表位结合剂特异性结合从血液或血浆中分离的Nfl上存在的表位。本公开内容的优选的抗Nfl表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸90至543内的表位。在各个实施方案中，本公开内容的抗Nfl表位结合剂特异性结合在SEQ IDNO.1的氨基酸90至300内、或在SEQ ID NO.1的氨基酸90至250内的表位。在其它实施方案中，本公开内容的抗Nfl表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO.1的氨基酸125至300内、在SEQID NO.1的氨基酸125至250内、或在SEQ ID NO.1的氨基酸125至200内的表位。在其它实施方案中，本公开内容的抗Nfl表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO.1的氨基酸251至400内、在SEQ ID NO.1的氨基酸251至355内、在SEQ ID NO.1的氨基酸272至355内、或在SEQ IDNO.1的氨基酸272至350内的表位。在其它实施方案中，本公开内容的抗Nfl表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO.1的氨基酸350至543内、在SEQ ID NO.1的氨基酸397至543内、在SEQID NO.1的氨基酸400至543内、在SEQ ID NO.1的氨基酸397至540内、或在SEQ ID NO.1的氨基酸400至540内的表位。用于表位作图的方法是本领域众所周知的。

在一个实施方案中，抗Nfl表位结合剂是HJ30.1、HJ30.1的抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.1与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。HJ30.1是通过保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)的杂交瘤克隆PTA-126966产生的单克隆抗体。

在一个实施方案中，抗Nfl表位结合剂是HJ30.2、HJ30.2的抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.2与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。HJ30.2是通过保藏于ATCC的杂交瘤克隆PTA-126967产生的单克隆抗体。

在一个实施方案中，抗Nfl表位结合剂是HJ30.4、HJ30.4的抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.4与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。HJ30.4是通过保藏于ATCC的杂交瘤克隆PTA-126968产生的单克隆抗体。

在一个实施方案中，抗Nfl表位结合剂是HJ30.7、HJ30.7的抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.7与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。HJ30.7是通过保藏于ATCC的杂交瘤克隆PTA-126969产生的单克隆抗体。

在一个实施方案中，抗Nfl表位结合剂是HJ30.11、HJ30.11的抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.11与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。HJ30.11是通过保藏于ATCC的杂交瘤克隆PTA-126970产生的单克隆抗体。

在一个实施方案中，抗Nfl表位结合剂是HJ30.13、HJ30.13的抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.13与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。HJ30.13是通过保藏于ATCC的杂交瘤克隆PTA-126971产生的单克隆抗体。

在其中表位结合剂是抗体的实施方案中，抗体可以具有或可以不具有变体Fc区。在一些实例中，Fc区可以进行修饰，以具有对于小胶质细胞上的Fc受体增加或降低的亲和力和/或改变的糖基化模式。在各个实施方案中，抗Nfl抗体可以是人源化抗体。例如，在一些实例中，本公开内容的抗Nfl抗体是衍生自HJ30.1、HJ30.2、HJ30.4、HJ30.7、HJ30.11或HJ30.13的人源化抗体。人源化的抗Nfl抗体可以包含基本上人(即，与已知的人构架序列至少90％、95％或99％的序列同一性)的一个或多个恒定区，或者恒定区的一部分。

如果测试表位结合剂优先结合表位达到它将参考表位结合剂与所述表位的结合阻断至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的程度，则称所述测试表位结合剂竞争性抑制参考表位结合剂(例如，HJ30.1、HJ30.2、HJ30.4、HJ30.7、HJ30.11、HJ30.13等)与给定表位的结合。竞争性抑制可以通过本领域已知的任何方法进行确定。在一个具体实例中，竞争性抑制通过包括以下步骤的竞争性抑制ELISA进行确定：用纯化的参考表位结合剂包被结合表面或支持物，以形成表位结合剂包被的表面；将预定量的纯化的、标记的抗原与含有测试表位结合剂的测试样品组合；将标记的抗原和测试表位结合剂的温育混合物加入所述包被表面中；使所述包被表面与抗原和测试表位结合剂的所述组合一起温育；并且测量与缺乏测试表位结合剂的条件相比的抗原结合抑制的量。

本文公开的抗Nfl表位结合剂也可以依据其序列进行描述或指定。

在一个实施方案中，抗Nfl抗体包含具有衍生自HJ30.1的一个或多个HVR的轻链可变区(VL)和/或具有衍生自HJ30.1的一个或多个HVR的重链可变区(VH)。衍生自HJ30.1的VL的HVR可以是L1、L2、L3或其任何组合。衍生自HJ30.1的VH的HVR可以是H1、H2、H3或其任何组合。包含衍生自HJ30.1的VH的一个或多个HVR的抗体可以进一步包括包含HJ30.1的VL的L1、L2、L3或其任何组合的VL。在上文的各个实施方案中，抗体可以是人源化抗体，或者抗体可以具有与HJ30.1的VL具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的VL，和/或与HJ30.1的VH具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的VH。在上文实施方案的各自中，抗Nfl抗体可以任选地包含基本上人(即，与已知的人构架序列至少90％、95％或99％的序列同一性)的一个或多个恒定区、或者恒定区的一部分。本公开内容还涵盖相应的核酸序列，其可以由本领域技术人员容易地确定，并且可以掺入载体或其它大DNA分子例如染色体内，以便表达本公开内容的抗体。

在一个实施方案中，抗Nfl抗体包含具有衍生自HJ30.2的一个或多个HVR的轻链可变区(VL)和/或具有衍生自HJ30.2的一个或多个HVR的重链可变区(VH)。衍生自HJ30.2的VL的HVR可以是L1、L2、L3或其任何组合。衍生自HJ30.2的VH的HVR可以是H1、H2、H3或其任何组合。包含衍生自HJ30.2的VH的一个或多个HVR的抗体可以进一步包括包含HJ30.2的VL的L1、L2、L3或其任何组合的VL。在上文的各个实施方案中，抗体可以是人源化抗体，或者抗体可以具有与HJ30.2的VL具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的VL，和/或与HJ30.2的VH具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的VH。在上文实施方案的各自中，抗Nfl抗体可以任选地包含基本上人(即，与已知的人构架序列至少90％、95％或99％的序列同一性)的一个或多个恒定区、或者恒定区的一部分。本公开内容还涵盖相应的核酸序列，其可以由本领域技术人员容易地确定，并且可以掺入载体或其它大DNA分子例如染色体内，以便表达本公开内容的抗体。

在一个实施方案中，抗Nfl抗体包含具有衍生自HJ30.4的一个或多个HVR的轻链可变区(VL)和/或具有衍生自HJ30.4的一个或多个HVR的重链可变区(VH)。衍生自HJ30.4的VL的HVR可以是L1、L2、L3或其任何组合。衍生自HJ30.4的VH的HVR可以是H1、H2、H3或其任何组合。包含衍生自HJ30.4的VH的一个或多个HVR的抗体可以进一步包括包含HJ30.4的VL的L1、L2、L3或其任何组合的VL。在上文的各个实施方案中，抗体可以是人源化抗体，或者抗体可以具有与HJ30.4的VL具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的VL，和/或与HJ30.4的VH具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的VH。在上文实施方案的各自中，抗Nfl抗体可以任选地包含基本上人(即，与已知的人构架序列至少90％、95％或99％的序列同一性)的一个或多个恒定区、或者恒定区的一部分。本公开内容还涵盖相应的核酸序列，其可以由本领域技术人员容易地确定，并且可以掺入载体或其它大DNA分子例如染色体内，以便表达本公开内容的抗体。

在一个实施方案中，抗Nfl抗体包含具有衍生自HJ30.7的一个或多个HVR的轻链可变区(VL)和/或具有衍生自HJ30.7的一个或多个HVR的重链可变区(VH)。衍生自HJ30.7的VL的HVR可以是L1、L2、L3或其任何组合。衍生自HJ30.7的VH的HVR可以是H1、H2、H3或其任何组合。包含衍生自HJ30.7的VH的一个或多个HVR的抗体可以进一步包括包含HJ30.7的VL的L1、L2、L3或其任何组合的VL。在上文的各个实施方案中，抗体可以是人源化抗体，或者抗体可以具有与HJ30.7的VL具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的VL，和/或与HJ30.7的VH具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的VH。在上文实施方案的各自中，抗Nfl抗体可以任选地包含基本上人(即，与已知的人构架序列至少90％、95％或99％的序列同一性)的一个或多个恒定区、或者恒定区的一部分。本公开内容还涵盖相应的核酸序列，其可以由本领域技术人员容易地确定，并且可以掺入载体或其它大DNA分子例如染色体内，以便表达本公开内容的抗体。

在一个实施方案中，抗Nfl抗体包含具有衍生自HJ30.11的一个或多个HVR的轻链可变区(VL)和/或具有衍生自HJ30.11的一个或多个HVR的重链可变区(VH)。衍生自HJ30.11的VL的HVR可以是L1、L2、L3或其任何组合。衍生自HJ30.11的VH的HVR可以是H1、H2、H3或其任何组合。包含衍生自HJ30.11的VH的一个或多个HVR的抗体可以进一步包括包含HJ30.11的VL的L1、L2、L3或其任何组合的VL。在上文的各个实施方案中，抗体可以是人源化抗体，或者抗体可以具有与HJ30.11的VL具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的VL，和/或与HJ30.11的VH具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的VH。在上文实施方案的各自中，抗Nfl抗体可以任选地包含基本上人(即，与已知的人构架序列至少90％、95％或99％的序列同一性)的一个或多个恒定区、或者恒定区的一部分。本公开内容还涵盖相应的核酸序列，其可以由本领域技术人员容易地确定，并且可以掺入载体或其它大DNA分子例如染色体内，以便表达本公开内容的抗体。

在一个实施方案中，抗Nfl抗体包含具有衍生自HJ30.17的一个或多个HVR的轻链可变区(VL)和/或具有衍生自HJ30.17的一个或多个HVR的重链可变区(VH)。衍生自HJ30.17的VL的HVR可以是L1、L2、L3或其任何组合。衍生自HJ30.17的VH的HVR可以是H1、H2、H3或其任何组合。包含衍生自HJ30.17的VH的一个或多个HVR的抗体可以进一步包括包含HJ30.17的VL的L1、L2、L3或其任何组合的VL。在上文的各个实施方案中，抗体可以是人源化抗体，或者抗体可以具有与HJ30.17的VL具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的VL，和/或与HJ30.17的VH具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的VH。在上文实施方案的各自中，抗Nfl抗体可以任选地包含基本上人(即，与已知的人构架序列至少90％、95％或99％的序列同一性)的一个或多个恒定区、或者恒定区的一部分。本公开内容还涵盖相应的核酸序列，其可以由本领域技术人员容易地确定，并且可以掺入载体或其它大DNA分子例如染色体内，以便表达本公开内容的抗体。

本文公开的抗Nfl表位结合剂也可以依据其交叉反应性进行描述或指定。术语“交叉反应性”指对于一种抗原特异性的表位结合剂与第二种抗原反应的能力；两种不同抗原物质之间的相关性的量度。因此，如果表位结合剂与除诱导其形成的表位外的表位结合，则它是交叉反应性的。交叉反应性表位一般含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下，实际上可以比原始表位更适合。例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，因为它们结合相关但不等同的表位，例如与参考表位具有至少约85％、至少约90％或至少约95％同一性的表位(如使用本领域已知的方法计算的)。如果抗体或其它表位结合剂并不结合与参考表位具有小于约95％、小于约90％或小于约85％同一性的表位，则它可以被说成具有很少的交叉反应性或无交叉反应性。如果抗体或其它表位结合剂并不结合某一表位的任何其它类似物、直向同源物或同源物，则它可以被视为对于该表位“高度特异性的”。

III.用于检测生物样品中的Nfl的方法

在另一个方面，本公开内容提供了用于检测生物样品中的Nfl的方法。该方法包括提供生物样品，富集生物样品中的一种至多种Nfl同种型，并且检测先前富集的一种至多种Nfl同种型。如本文使用的，术语“多种Nfl同种型”和“Nfl同种型群体”可以是可互换使用的。

(a)提供生物样品

合适的生物样品包括从受试者中获得的血液样品或脑脊液(CSF)样品。血液和CSF含有多种Nfl同种型，如实施例中详述的。

根据样品类型、样品由其获得的受试者的健康状况、以及除待分析的Nfl之外的分析物((例如，Aβ、tau、ApoE、α-突触核蛋白等)，所使用的生物样品的大小可以不同。CSF样品体积可以为约0.01mL至约5mL，或约0.05mL至约5mL。在一个具体实例中，样品的大小可以为约0.05mL至约1mL CSF。血浆样品体积可以为约0.01mL至约20mL，或约0.1mL至约20mL。在一个具体实例中，样品的大小可以为约1mL至约20mL血液。

在一些实施方案中，受试者是人。人受试者可以正在等待医疗护理或治疗，可以处于医疗护理或治疗下，或者可以已接受医疗护理或治疗。在各个实施方案中，人受试者可以是健康受试者、处于发展神经退行性疾病的风险中的受试者、具有神经元损害和/或神经退行性疾病的体征和/或症状的受试者、或者诊断有神经元损害和/或神经退行性疾病的受试者。神经退行性疾病可能是肌萎缩侧索硬化、Charcot-Marie-Tooth病、慢性创伤性脑病(CTE)、克雅二氏病、拳击员痴呆、唐氏综合征、Gerstmann--Scheinker病、亨廷顿氏病、包涵体肌炎、朊病毒蛋白脑淀粉样蛋白血管病、外伤性脑损伤(TBI)、关岛型肌萎缩侧索硬化/帕金森综合征-痴呆复合征、伴有神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、嗜银颗粒痴呆、皮质基底节变性、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化症、额颞叶痴呆、17号染色体连锁的额颞叶痴呆合并帕金森综合征、哈-斯二氏病(Hallevorden-Spatz disease)、路易体痴呆(LBD)、多发性硬化、多系统萎缩、强直性肌营养不良、尼曼-皮克二氏病C型、苍白球-脑桥-黑质变性、帕金森氏病、皮克氏病、进行性皮质下胶质增生、脑炎后帕金森综合征、PART(原发性年龄相关性Tau蛋白病)、进行性核上麻痹、亚急性硬化性全脑炎、亚急性硬化性全脑病(subacute sclerosis panencephalopathy)、仅缠结性痴呆(或缠结优势型痴呆)、缠结优势型痴呆、伴球状胶质细胞包涵体的白质tau蛋白病、轻度认知障碍(MCI)、青光眼、家族性英国型痴呆、家族性丹麦型痴呆、瓜德罗普岛帕金森综合征(GuadeloupeanParkinsonism)、神经退行性变伴脑铁沉积、SLC9A6相关智力低下、HIV相关痴呆、老年性心脏淀粉样变性。健康受试者，有时被称为“对照受试者”或“健康对照”，最低限度地没有认知障碍的临床体征或症状，并且还可能对于神经元损害、神经退行性疾病和/或外伤性脑损伤的其它临床体征或症状是“阴性的”。

在其它实施方案中，受试者是实验动物。在一个进一步的实施方案中，受试者是遗传改造为表达人Nfl的实验动物。

CSF可以通过伴随或不伴随留置CSF导管的腰椎穿刺获得。血液可以通过伴随或不伴随静脉内导管的静脉穿刺，或者通过手指针刺(或其等价方式)进行收集。可以将从受试者中同时收集的多份血液或CSF样品合并，以产生“样品”。一旦收集，血液或CSF样品就可以根据本领域已知的方法进行处理(例如，离心以去除全细胞和细胞碎片；使用设计为在分析测试之前稳定且保存样本的添加剂；等)。血液或CSF样品可以立即使用，或可以无限期地冷冻且贮存。

在用于本文公开的方法之前，必要或需要时，生物样品还可以进行修饰，以包括蛋白酶抑制剂、内部标准、去污剂和离液剂，以耗尽其它分析物(例如蛋白质、肽、代谢物等)或其任何组合。

术语“耗尽”意指数量或数目的减小。相应地，耗尽蛋白质的样品可以具有可测量地低于原始样品中的量的蛋白质的任何量，包括没有蛋白质的量。作为非限制性实例，可以通过超滤，或者用酸、有机溶剂或盐的蛋白质沉淀，从样品中耗尽蛋白质。一般来说，这些方法用于可靠地减少高丰度和高分子量蛋白质，其依次又富集低分子量和/或低丰度蛋白质和肽(例如tau、Aβ、Nfl等)。在一个具体实例中，可以通过沉淀从样品中耗尽蛋白质。简言之，沉淀包括将沉淀剂加入样品中并充分混合，使样品与沉淀剂一起温育，以使蛋白质沉淀，并通过离心或过滤分离沉淀的蛋白质。所得到的上清液随后可以用于下游应用中。所需试剂的量可以通过本领域已知的方法在实验上进行确定。合适的沉淀剂包括高氯酸、三氯乙酸、乙腈、甲醇等等。在一个示例性实施方案中，通过酸沉淀从样品中耗尽蛋白质。在一个进一步的实施方案中，通过使用高氯酸的酸沉淀从样品中耗尽蛋白质。

在一个进一步的实例中，可以通过使用高氯酸的酸沉淀从样品中耗尽蛋白质。如本文使用的，“高氯酸”指70％的高氯酸，除非另有说明。在一些实施方案中，将高氯酸添加至约1％v/v至约15％v/v的最终浓度。在其它实施方案中，将高氯酸添加至约1％v/v至约10％v/v的最终浓度。在其它实施方案中，将高氯酸添加至约1％v/v至约5％v/v的最终浓度。在其它实施方案中，将高氯酸添加至约3％v/v至约15％v/v的最终浓度。在其它实施方案中，将高氯酸添加至约3％v/v至约10％v/v的最终浓度。在其它实施方案中，将高氯酸添加至约3％v/v至约5％v/v的最终浓度。在其它实施方案中，将高氯酸添加至3.5％v/v至约15％v/v、3.5％v/v至约10％v/v、或3.5％v/v至约5％v/v的最终浓度。在其它实施方案中，将高氯酸添加至约3.5％v/v的最终浓度。在高氯酸添加之后，将样品充分混合(例如，通过涡旋混合器)，并在低温下保持通常约10分钟或更长时间，以促进沉淀。例如，样品可以保持约10分钟至约60分钟、约20分钟至约60分钟、或约30分钟至约60分钟。在其它实例中，样品可以保持约15分钟至约45分钟、或约30分钟至约45分钟。在其它实例中，样品可以保持约15分钟至约30分钟、或约20分钟至约40分钟。在其它实例中，样品保持约30分钟。然后将样品在低温下离心，以使沉淀的蛋白质形成团块，并且将包含例如可溶性tau的上清液(即，酸溶性级分)转移到新鲜容器中。如在上文的背景下使用的，“低温”指10℃或更低的温度。例如，低温可以为约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃或约10℃。在一些实施方案中，较窄的温度范围可能是优选的，例如约3℃至约5℃、或甚至约4℃。在某些实施方案中，可以通过将样品置于冰上来实现低温。

可替代地或另外，可以通过特异性靶向目的生物分子的方法，例如通过亲和耗尽、固相提取、或本领域已知的其它方法，从样品中耗尽蛋白质、肽和/或代谢物。蛋白质/肽或多种蛋白质/肽的靶向耗尽可以用于其中需要该蛋白质/肽的下游分析(例如，鉴定、定量、翻译后修饰的分析等)的情形中。通常，原材料中至少50％(例如，50％、60％、70％、80％、90％或更多)的靶蛋白被耗尽。在一些实施方案中，原材料中约70％或更多、约80％或更多、或者约90％或更多的靶向蛋白质被耗尽。亲和耗尽指借助于其与分子的特异性结合特性，从样品中耗尽目的蛋白质的方法。通常，分子是附着至固体支持物例如珠、树脂、组织培养板等的配体(被称为固定化配体)。配体固定至固体支持物也可以在配体-蛋白质相互作用发生后发生。合适的配体包括抗体、适体和其它表位结合剂。例如，在用合适的表位结合剂亲和耗尽Aβ之后，可以通过本领域已知的方法来鉴定且定量Aβ肽。Tau也可以类似地进行鉴定且定量。分子还可以是选择性地吸收目的蛋白质的聚合物或其它材料。作为非限制性实例，被脂肪乙氧基化醇(fat oxethylized alcohol)(例如，PHM-L LIPOSORB，SigmaAldrich)取代的聚羟基亚甲基可以用于选择性地吸收来自血清的脂蛋白(包括ApoE)。ApoE同种型的鉴定(“ApoE状态”)和/或ApoE的定量然后可以通过本领域已知的方法发生。靶向耗尽也可以用于分离其它蛋白质用于后续分析，包括但不限于载脂蛋白J、突触核蛋白、可溶性淀粉样前体蛋白、α-2巨球蛋白、S100B、髓磷脂碱性蛋白、白细胞介素、TNF、TREM-2、TDP-43、YKL-40、VILIP-1、朊病毒蛋白、pNFH和DJ-1。

(b)富集生物样品中的一种至多种Nfl同种型

术语“富集”意指数量或数目的增加。血液和CSF含有多种Nfl同种型。相应地，“富集生物样品中的一种至多种Nfl同种型”意指与起始样品(即生物样品)相比，可测量地增加每体积样品中的Nfl同种型或多种Nfl同种型的量。在一些实例中，富集可以是至少约5倍。在一些实例中，富集可以是约5倍至约1000倍。例如，富集可以是至少约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约200倍、约300倍、约400倍、约500倍、约600倍、约700倍、约800倍、约900倍、约1000倍或更多倍。

在一些实施方案中，本公开内容的方法包括富集生物样品中的一种至多种Nfl同种型，其中所述Nfl同种型的长度为约350个氨基酸或更少。例如，Nfl同种型的长度可以为约300个氨基酸或更少、约250个氨基酸或更少、约200个氨基酸或更少、约150个氨基酸或更少、约100个氨基酸或更少、或者甚至约50个氨基酸或更少。长度约350个氨基酸或更少的Nfl同种型可以含有关于全长Nfl(其具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列)的N末端截短、C末端截短、或N末端截短和C末端截短。在进一步的实例中，本公开内容的方法可以包括富集一种至多种Nfl同种型，其具有包含SEQ ID NO：1的氨基酸92至100、氨基酸101至107、氨基酸108至116、氨基酸117至126、氨基酸137至144、氨基酸148至157、氨基酸158至164、氨基酸165至172、氨基酸178至185、氨基酸192至196、或氨基酸198至206或其任何组合的氨基酸序列。在其它实例中，本公开内容的方法可以包括富集一种至多种Nfl同种型，其具有包含SEQ IDNO：1的氨基酸282至292、氨基酸323至330、氨基酸331至338、或氨基酸339至353或其任何组合的氨基酸序列。在另外其它实例中，本公开内容的方法可以包括富集一种至多种Nfl同种型，其具有包含SEQ ID NO：1的氨基酸422至437、氨基酸438至462和/或氨基酸530至540的氨基酸序列。在另外其它实例中，本公开内容的方法可以包括富集Nfl同种型的第一群体，然后为随后富集Nfl同种型的第二群体、第三群体、第四群体或更多群体，在每种情况下使用先前耗尽的样品。在另外其它实例中，本公开内容的方法可以包括富集图22中描述的一种或多种同种型。

通过从生物样品中分离Nfl同种型(例如，亲和纯化、固相提取等)，并且/或通过从生物样品中去除其它Nfl同种型(例如，亲和耗尽、固相提取等)，本公开内容的方法可以富集截短的Nfl同种型或多个截短的Nfl同种型。上文描述了亲和耗尽。亲和纯化指借助于其与分子的特异性结合特性，来富集目的蛋白质的方法。通常，分子是附着至固体支持物例如珠、树脂、组织培养板等的配体(被称为固定化配体)。配体固定至固体支持物也可以在配体-蛋白质相互作用发生后发生。合适的配体包括抗体、适体和其它表位结合剂。通过亲和纯化来纯化Nfl包括使包含Nfl的样品与合适的固定化配体接触，一个或多个洗涤步骤，以及从固定化配体中洗脱Nfl。用于Nfl的亲和纯化和/或Nfl的亲和耗尽的试剂可以通过本领域已知的方法来生成(例如，使用全长重组Nfl来生成表位结合剂，然后选择结合给定表位的表位结合剂，使用重组Nfl肽生成针对Nfl的某些片段的表位结合剂等)。还可以使用商购可得的表位结合剂，例如ABIN6025698(Abbexa)、ABIN4339158(Novus Biologicals)、13-0400(Invitrogen Antibodies)、UD1或UD2(Uman Diagnostics)等)。合适的表位结合剂也在节段II中进行描述。

可替代地，可能并不直接发生Nfl同种型的富集，而是可能间接发生Nfl同种型或多种Nfl同种型的扩增检测。例如，邻近连接测定(例如，Duo-Link(Sigma Aldrich))可以用于用试剂检测Nfl同种型的N末端区域和C末端区域，当所述试剂分别与N末端区域和C末端区域结合时，试剂能够产生放大的信号。通常，试剂是表位结合剂。合适的表位结合剂可以包括节段II中描述的那些表位结合剂和/或商购可得的抗体。Nfl同种型或多种Nfl同种型通过邻近连接测定等等的扩增检测也可以在富集或耗尽步骤后((例如，在用富集包含SEQID NO：1的氨基酸530至540等的同种型的表位结合剂的单个富集步骤后)发生。

在上文的一个具体实施方案中，富集生物样品中的一种至多种Nfl同种型可以包括使生物样品与特异性结合Nfl同种型的第一群体的表位结合剂接触，并分离Nfl同种型的第一群体，其中所述表位结合剂选自以下：(i)与在SEQ ID NO：1的氨基酸90至250内的表位特异性结合的表位结合剂；(ii)与在SEQ ID NO：1的氨基酸116至184内的表位特异性结合的表位结合剂；(iii)与在SEQ ID NO：1的氨基酸250至400内的表位特异性结合的表位结合剂；(iv)与在SEQ ID NO：1的氨基酸283至338内的表位特异性结合的表位结合剂；(v)与在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内的表位特异性结合的表位结合剂；(vi)与在SEQ ID NO：1的氨基酸437至543内的表位特异性结合的表位结合剂；(vii)HJ30.1或其抗原结合片段，HJ30.2或其抗原结合片段，HJ30.13或其抗原结合片段，或者竞争性抑制HJ30.1、HJ30.2或HJ30.13与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；以及(vii)HJ30.4或其抗原结合片段、HJ30.7或其抗原结合片段、或者竞争性抑制HJ30.4或HJ30.7与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；以及(ix)HJ30.11、其抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.11与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。

在上文的另一个具体实施方案中，富集生物样品中的一种至多种Nfl同种型可以包括(a)使生物样品与特异性结合Nfl同种型的第一群体的第一表位结合剂接触，并分离Nfl同种型的第一群体；并且(b)使耗尽Nfl同种型的第一群体的样品与特异性结合Nfl同种型的第二群体的第二表位结合剂接触，并分离Nfl同种型的第二群体。可替代地，生物样品可以同时与第一表位结合剂和第二表位结合剂接触，并且可以序贯或同时分离Nfl同种型的第一群体和Nfl同种型的第二群体。在优选的实施方案中，第二表位结合剂结合第一表位结合剂的表位下游的表位。在一个实例中，第一表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸1至450内的第一表位；并且第二表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内的表位。在另一个实例中，第一表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸90至300内或在SEQ ID NO：1的氨基酸200至400内的第一表位；并且第二表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内的表位。在另一个实例中，第一表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸90至250内或在SEQ ID NO：1的氨基酸250至400内的第一表位；并且第二表位在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内或在SEQ ID NO：1的氨基酸430至540内。合适的表位结合剂包括节段II中描述的那些表位结合剂和/或商购可得的抗体。在一个具体实施方案中，第一表位结合剂可以为HJ30.1或其抗原结合片段，HJ30.2或其抗原结合片段，HJ30.13或其抗原结合片段，或者竞争性抑制HJ30.1、HJ30.2或HJ30.13与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。在另一个具体实施方案中，第一表位结合剂可以为HJ30.4或其抗原结合片段、HJ30.7或其抗原结合片段、或者竞争性抑制HJ30.4或HJ30.7与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。在另一个具体实施方案中，第二表位结合剂可以为HJ30.11、其抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.11与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。在另一个具体实施方案中，第二表位结合剂可以为HJ30.4或其抗原结合片段、HJ30.7或其抗原结合片段、或者竞争性抑制HJ30.4或HJ30.7与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。

在上文的另一个具体实施方案中，富集生物样品中的一种至多种Nfl同种型可以包括(a)使生物样品与特异性结合Nfl同种型的第一群体的第一表位结合剂接触，并分离Nfl同种型的第一群体；(b)使耗尽Nfl同种型的第一群体的样品与特异性结合Nfl同种型的第二群体的第二表位结合剂接触，并分离Nfl同种型的第二群体；并且(c)使耗尽Nfl同种型的第一群体和第二群体的样品与特异性结合Nfl同种型的第三群体的第三表位结合剂接触，并分离Nfl同种型的第三群体。可替代地，生物样品可以同时与第一表位结合剂、第二表位结合剂和第三表位结合剂接触，并且可以序贯地或以任何组合分离Nfl同种型的第一群体、Nfl同种型的第二群体和Nfl同种型的第三群体。在优选的实施方案中，第二表位结合剂可以结合第一表位结合剂的表位下游的表位，并且第三表位结合剂可以结合第二表位结合剂的表位下游的表位。可替代地，第二表位结合剂可以结合第一表位结合剂上游的表位。在一个实例中，第一表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸1至400内的第一表位；第二表位结合剂特异性结合在第一表位下游在SEQ ID NO：1的氨基酸90至450内的第二表位；并且第三表位结合剂特异性结合在第二表位下游在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内的第三表位。在另一个实例中，第一表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸90至300内的第一表位；第二表位结合剂特异性结合在第一表位下游在SEQ ID NO：1的氨基酸200至400内的第二表位；并且第三表位结合剂特异性结合在第二表位下游在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内的第三表位。在另一个实例中，第一表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸90至250内的第一表位；第二表位结合剂特异性结合在第一表位下游在SEQ ID NO：1的氨基酸250至400内的第二表位；并且第三表位结合剂特异性结合在第二表位下游在SEQID NO：1的氨基酸400至543内的第三表位。合适的表位结合剂包括节段II中描述的那些表位结合剂和/或商购可得的抗体。在一个具体实施方案中，(i)第一表位结合剂是HJ30.1或其抗原结合片段，HJ30.2或其抗原结合片段，HJ30.13或其抗原结合片段，或者竞争性抑制HJ30.1、HJ30.2或HJ30.13与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；(ii)第二表位结合剂是HJ30.4或其抗原结合片段、HJ30.7或其抗原结合片段、或者竞争性抑制HJ30.4或HJ30.7与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；(iii)第三表位结合剂是HJ30.11、其抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.11与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；(iv)或其任何组合。

在上文的另一个具体实施方案中，富集生物样品中的一种至多种Nfl同种型可以包括(a)使生物样品与两种或更多种表位结合剂同时(非序贯地)接触，其中每种表位结合剂特异性结合Nfl的不同表位；并且(b)检测且任选地定量步骤(a)中富集的一种至多种Nfl同种型。在一个实例中，第一表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸1至400内的第一表位；第二表位结合剂特异性结合在第一表位下游在SEQ ID NO：1的氨基酸90至450内的第二表位；并且第三表位结合剂特异性结合在第二表位下游在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内的第三表位。在另一个实例中，第一表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸90至300内的第一表位；第二表位结合剂特异性结合在第一表位下游在SEQ ID NO：1的氨基酸200至400内的第二表位；并且第三表位结合剂特异性结合在第二表位下游在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内的第三表位。在另一个实例中，第一表位结合剂特异性结合在SEQ IDNO：1的氨基酸90至250内的第一表位；第二表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸250至400内的第二表位；并且第三表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内的第三表位。合适的表位结合剂包括节段II中描述的那些表位结合剂和/或商购可得的抗体。在一个具体实施方案中，两种或更多种表位结合剂选自HJ30.1，HJ30.1的抗原结合片段，HJ30.2，HJ30.2的抗原结合片段，HJ30.13，HJ30.13的抗原结合片段，HJ30.4，HJ30.4的抗原结合片段，HJ30.7，HJ30.7的抗原结合片段，HJ30.11，HJ30.11的抗原结合片段，或者竞争性抑制HJ30.1、HJ30.2、HJ30.4、HJ30.7、HJ30.11和HJ30.13与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。在另一个具体实施方案中，一种表位结合剂选自组(i)、(ii)或(iii)，并且至少一种另外的表位结合剂选自组(i)、(ii)或(iii)中的不同者，其中组(i)、(ii)或(iii)是：(i)HJ30.1或其抗原结合片段，HJ30.2或其抗原结合片段，HJ30.13或其抗原结合片段，或者竞争性抑制HJ30.1、HJ30.2或HJ30.13与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；(ii)HJ30.4或其抗原结合片段、HJ30.7或其抗原结合片段、或者竞争性抑制HJ30.4或HJ30.7与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；(iii)HJ30.11、其抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.11与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。在另一个具体实施方案中，至少一种表位结合剂选自组(i)、(ii)和(iii)中的每一个，其中组(i)、(ii)或(iii)是：(i)HJ30.1或其抗原结合片段，HJ30.2或其抗原结合片段，HJ30.13或其抗原结合片段，或者竞争性抑制HJ30.1、HJ30.2或HJ30.13与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；(ii)HJ30.4或其抗原结合片段、HJ30.7或其抗原结合片段、或者竞争性抑制HJ30.4或HJ30.7与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；(iii)HJ30.11、其抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.11与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。

内部标准(本文缩写为“ISTD”)可以用于解释在富集自始至终的变异性并任选地计算绝对浓度。一般地，内部标准在重要的样品处理之前添加，并且需要时，它可以添加多于一次。可以使用一种或多种全长Nfl同种型。可替代地或另外，也可以使用具有翻译后修饰的Nfl同种型和/或Nfl的肽片段。例如，在具有多种同种型的序贯分离的实施方案中，使用等于分离步骤数目的内部标准数目可能是有利的，其中每个内部标准是Nfl的不同肽片段，使得每个分离步骤仅分离单个内部标准。在一些实施方案中，每个内部标准可以为不同的AQUA肽(即，对应于待通过MS检测的目的肽的稳定的同位素标记的肽)。可替代地，如果仅关注最终分离步骤的Nfl同种型，则可以使用单个内部标准，其中所述内部标准是直到最后步骤才被分离/富集的肽片段。在一些实施方案中，内部标准可以为AQUA肽。通常，内部标准是可检测地标记的，以便将Nfl标准与内源性Nfl分析物区分开，而不影响分离所依赖的化学特性。在一些实施方案中，内部标准是同位素标记的内部Nfl标准。合适的同位素标记的内部Nfl标准具有掺入至少一个氨基酸残基内的重同位素标记。一般来说，掺入的标记的氨基酸残基应该增加肽的质量而不影响其化学特性，并且起因于同位素标记的存在的质量偏移必须足以允许质谱方法区分内部标准(IS)与内源性Nfl分析物信号。如本文所示，合适的重同位素标记包括但不限于²H、¹³C和¹⁵N。在一个实例中，内部标准可以为Lys、Arg、¹³C和¹⁵N标记的重组、全长Nfl或Nfl的肽片段。通常，约0.1-10ng内部标准通常在适当的缓冲液(例如TBEAC、～0.01-2％白蛋白等)中充分稀释。在示例性实施方案中，约1ng至约2.5ng在约1％人血清白蛋白(HSA)中。

(c)检测先前富集的一种至多种Nfl同种型

Nfl同种型可以通过如下文或实施例中进一步详述的质谱法、或者通过本领域已知的其它方法在富集的样品中进行检测且任选地定量，所述其它方法包括但不限于免疫测定，多路复用测定(例如通过Luminex的xMAP技术)、单分子阵列测定(例如珠技术)、邻近连接测定(例如通过Sigma Aldrich的/>)等等。

在一些实施方案中，Nfl同种型通过质谱法在富集样品中进行检测且任选地定量。简言之，通过质谱法的检测包括用蛋白酶切割富集的Nfl同种型，并且任选地通过固相提取使所得的切割产物脱盐，以获得包含Nfl的蛋白酶解肽的样品；并且执行包含Nfl的蛋白酶解肽的样品的液相层析-质谱法(LC/MS)，以检测Nfl的至少一种蛋白酶解肽。在本文公开的任何方法中，还可以定量Nfl的任何蛋白酶解肽的量((例如，根据MS分析中对应于适当蛋白酶解肽的峰的高度或积分)。因此，在实践中，Nfl的一种或多种蛋白酶解肽用于检测且测量生物样品中存在的Nfl蛋白的量。因为血液和CSF含有多种Nfl同种型，并且多种同种型的子集共享序列相似性(参见图22)，所以Nfl的蛋白酶解肽的测量可以描述含有测量的蛋白酶解肽的生物样品中的多种Nfl同种型的水平，除非富集方法对于给定的同种型是特异性的。

在其中胰蛋白酶是蛋白酶的实施方案中，指示Nfl存在的合适的Nfl蛋白酶解肽可以如实施例中描述的。例如，胰蛋白酶肽[370，378]、[379，389]和[391，398]并非Nfl所独有的，并且因此当意图是定量生物样品中的Nfl时并非优选的。在一些实施方案中，指示Nfl存在的合适的Nfl蛋白酶解肽可以选自表C中列出的肽。示例性的胰蛋白酶肽包括具有SEQ IDNO：1的氨基酸108-116、SEQ ID NO：1的氨基酸117-126、SEQ ID NO：1的氨基酸165-172、SEQID NO：1的氨基酸198-206、SEQ ID NO：1的氨基酸324-331、SEQ ID NO：1的氨基酸400至421、SEQ ID NO：1的氨基酸422至437、SEQ ID NO：1的氨基酸438至462、以及SEQ ID NO：1的氨基酸530-540的胰蛋白酶肽。当使用替代酶用于消化时，所得到的蛋白酶解肽可能略微不同，但可以通过本领域普通技术人员容易地确定。不希望受理论束缚，认为相同类型的两个生物样品(例如两个血液样品)之间的胰蛋白酶肽的量的变动反映了构成这些生物样品的Nfl同种型的差异。如本文公开的，Nfl的某些蛋白酶解肽的量以及Nfl的某些蛋白酶解肽的比率可以提供临床上有意义的信息，以诊断神经元损害、告知神经退行性疾病的诊断、选择患者用于进一步诊断测试、指导治疗决策或其任何组合。因此，允许检测和定量Nfl的胰蛋白酶肽的方法具有在许多疾病的诊断、预后和治疗中的效用。

表C：Nfl的合适的胰蛋白酶肽

Nfl的蛋白酶解肽可以通过与高分辨率质谱仪接合的液相层析系统进行分离。合适的LC-MS系统可以包括<1.0mm ID柱，并且使用小于约100μl/分钟的流速。在优选的实施方案中，使用纳米流LC-MS系统(例如，约50-100μm ID柱和<1μL/分钟，优选约100-800nL/分钟，更优选约200-600nL/分钟的流速)。在一个示例性实施方案中，LC-MS系统可以包括0.05mM ID柱，并且使用约400nL/分钟的流速。

串联质谱法可以用于改善分辨率，如本领域已知的，或者可以改善技术以实现具有单个质量分析器的串联质谱法的分辨率。合适类型的质谱仪是本领域已知的。这些包括但不限于四极杆、飞行时间、离子阱和Orbitrap，以及将不同类型的质量分析器组合到一种体系结构内的混合质谱仪(例如，各自来自ThermoFisher Scientific的Orbitrap Fusion^TMTribrid^TM Mass Spectrometer、Orbitrap Fusion^TM Lumos^TM Mass Spectrometer、Orbitrap Tribrid^TM Eclipse^TM Mass Spectrometer、Q Exactive Mass Spectrometer)。在一个示例性实施方案中，LC-MS系统可以包括选自Orbitrap Fusion^TM Tribrid^TM MassSpectrometer、Orbitrap Fusion^TM Lumos^TM Mass Spectrometer、Orbitrap Tribrid^TMEclipse^TM Mass Spectrometer的质谱仪，或者具有四极杆类似或改善的离子聚焦和离子透明度的质谱仪。可以通过优化在分析之前收集的离子数目(例如，(使用orbitrap的AGC设置)和/或注射时间来开发合适的质谱法方案。在一个示例性实施方案中，使用实施例中概述的质谱法方案。

通过MS分析的蛋白酶解肽可以通过本领域已知的方法进行定量。一般来说，将已知量的内部标准加入样品中。然后将样品消化并通过LC-MS进行分析。对于天然肽和内部标准生成所提取的离子层析图。使用峰比率(例如14N/15N)，计算天然肽的数量。

IV.用于检测生物标记物的方法及其用途

在另一个方面，本公开内容提供了用于检测且任选地定量从受试者中获得的样品中的蛋白质生物标记物的方法。该方法包括根据节段III的方法检测且任选地定量Nfl，其中所述生物样品是从具有神经元损害或处于具有神经元损害的风险中的受试者中获得的样品，并且其中所述生物标记物是富集的Nfl同种型、第一Nfl同种型与第二Nfl同种型的比率、Nfl同种型的富集群体、或富集的Nfl同种型的第一群体与富集的同种型的第二群体的比率。在一些实施方案中，神经元损害可以包括轴突损害。在一些实施方案中，神经元损害是轴突损害。神经元损害的类型不受限制，并且可能是由于急性或慢性损伤(例如，外伤性脑损伤等)、神经炎症和/或神经退行性疾病。神经退行性疾病的非限制性实例包括肌萎缩侧索硬化、Charcot-Marie-Tooth病、慢性创伤性脑病(CTE)、克雅二氏病、拳击员痴呆、唐氏综合征、Gerstmann--Scheinker病、亨廷顿氏病、包涵体肌炎、朊病毒蛋白脑淀粉样蛋白血管病、外伤性脑损伤、关岛型肌萎缩侧索硬化/帕金森综合征痴呆复合征、伴有神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、嗜银颗粒痴呆、皮质基底节变性、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化症、额颞叶痴呆、17号染色体连锁的额颞叶痴呆合并帕金森综合征、哈-斯二氏病、路易体痴呆(LBD)、多发性硬化、多系统萎缩、强直性肌营养不良、尼曼-皮克二氏病C型、苍白球黑质变性、帕金森氏病、皮克氏病、进行性皮质下胶质增生、脑炎后帕金森综合征、PART(原发性年龄相关性Tau蛋白病)、进行性核上麻痹、亚急性硬化性全脑炎、亚急性硬化性全脑病、仅缠结性痴呆(或缠结优势型痴呆)、缠结优势型痴呆、伴球状胶质细胞包涵体的白质tau蛋白病、轻度认知障碍(MCI)、青光眼、家族性英国型痴呆、家族性丹麦型痴呆、瓜德罗普岛帕金森综合征、神经退行性变伴脑铁沉积、SLC9A6相关智力低下、HIV相关痴呆、老年性心脏淀粉样变性。健康受试者，有时被称为“对照受试者”或“健康对照”，最低限度地没有认知障碍的临床体征或症状，并且还可能对于神经元损害、神经退行性疾病和/或外伤性脑损伤的其它临床体征或症状是“阴性的”。

在一些实施方案中，生物标记物可以是选自以下的Nfl同种型群体：具有基本上由Nfl的杆状结构域组成的氨基酸序列的同种型、具有基本上由Nfl的杆状结构域的一部分组成的氨基酸序列的同种型、具有由Nfl的杆状结构域的一部分组成的氨基酸序列且没有在该区域外的氨基酸的同种型、或其任何组合。杆状结构域通常被描述为包括SEQ ID NO：1的氨基酸90-396。例如，生物标记物可以包括包含SEQ ID NO：1的氨基酸90至396的一种或多种Nfl同种型，其具有至多约330个氨基酸的长度(例如，约330、约325、约320、约315、约310个氨基酸)。可替代地或另外，生物标记物可以包括一种或多种Nfl同种型，其为SEQ ID NO：1的氨基酸90至396的片段。例如，生物标记物可以包括一种或多种Nfl同种型，其长度小于310个氨基酸(约305、约300、约275、约250、约225、约200、约175、约150、约125、约100、约75、约50、约25等)，并且包含SEQ ID NO：1的氨基酸164至171、SEQ ID NO：1的氨基酸197至205、SEQ ID NO：1的氨基酸323至330或其任何组合。在一些实例中，生物标记物可以包括一种或多种Nfl同种型，其长度小于约200个氨基酸，并且包含SEQ ID NO：1的氨基酸165至172、SEQID NO：1的氨基酸198至206或其组合。可替代地或另外，生物标记物可以包括一种或多种Nfl同种型，其为SEQ ID NO：1的氨基酸125至396的片段。例如，生物标记物可以包括一种或多种Nfl同种型，其长度为约275个氨基酸或更少，并且包含SEQ ID NO：1的氨基酸165至172、SEQ ID NO：1的氨基酸198至206、SEQ ID NO：1的氨基酸324至331或其任何组合。

在一些实施方案中，生物标记物可以是选自以下的Nfl同种型群体：基本上由Nfl的尾区组成的同种型、具有由Nfl的尾区的一部分组成的氨基酸序列的同种型或其组合。尾区通常被描述为SEQ ID NO：1的氨基酸397至543。例如，生物标记物可以包括包含SEQ IDNO：1的氨基酸397至543的一种或多种Nfl同种型，其为长度147个氨基酸至长度约200个氨基酸。可替代地或另外，生物标记物可以包括一种或多种Nfl同种型，其为SEQ ID NO：1的氨基酸397至543的片段。例如，生物标记物可以包括一种或多种Nfl同种型，其长度小于147个氨基酸，并且包含SEQ ID NO：1的氨基酸422至437、SEQ ID NO：1的氨基酸438至462、SEQ IDNO：1的氨基酸530至540或其任何组合。在另一个实施方案中，生物标记物可以包括一种或多种Nfl同种型，其长度小于约100个氨基酸或更少，并且包含SEQ ID NO：1的氨基酸422至437、SEQ ID NO：1的氨基酸438至462、SEQ ID NO：1的氨基酸530至540或其任何组合。

在进一步的实施方案中，生物标记物可以是上述两种生物标记物的比率。作为非限制性实例，生物标记物可以是来自杆区的两种生物标记物的比率，或来自尾区的两种生物标记物的比率，或更优选地，来自杆区的一种生物标记物和来自尾区的一种生物标记物的比率。在再进一步的实施方案中，生物标记物可以是生物标记物与Nfl总量的比率。还考虑了其它数学运算以及多于两种生物标记物的使用。例如，当分析第一生物样品和第二生物样品时，其中第二样品在第一样品后的一段时间(例如，几天、几周、几个月、几年)获得，可以使用生物标记物的变化率。

在一些实施方案中，生物标记物可以是用表位结合剂亲和纯化的Nfl同种型群体，所述表位结合剂选自(i)HJ30.1或其抗原结合片段，HJ30.2或其抗原结合片段，HJ30.13或其抗原结合片段，或者竞争性抑制HJ30.1、HJ30.2或HJ30.13与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；(ii)HJ30.4或其抗原结合片段、HJ30.7或其抗原结合片段、或者竞争性抑制HJ30.4或HJ30.7与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；或(iii)HJ30.11、其抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.11与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。

在一些实施方案中，生物标记物可以是：

(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸165至172和/或SEQ ID NO：1的氨基酸198至206的Nfl同种型群体，其中所述Nfl同种型群体用选自以下的表位结合剂进行亲和纯化：(i)HJ30.1或其抗原结合片段，HJ30.2或其抗原结合片段，HJ30.13或其抗原结合片段，或者竞争性抑制HJ30.1、HJ30.2或HJ30.13与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；

(b)包含SEQ ID NO：1的氨基酸324至331的Nfl同种型群体，其中所述Nfl同种型群体用选自以下的表位结合剂进行亲和纯化：HJ30.4或其抗原结合片段、HJ30.7或其抗原结合片段、或者竞争性抑制HJ30.4或HJ30.7与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；

(c)包含SEQ ID NO：1的氨基酸530至540的Nfl同种型群体，其中所述Nfl同种型群体用选自以下的表位结合剂进行亲和纯化：HJ30.11、其抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.11与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；

(d)(a)与(b)的比率；

(e)(b)与(c)的比率；或

(f)(a)与(c)的比率。

在上文实施方案中，Nfl同种型的每个群体可以从生物样品中分离，或者可以从先前耗尽其它Nfl同种型的样品中分离。作为非限制性实例，(c)中的Nfl同种型群体可以从耗尽(a)、耗尽(b)、或耗尽(a)和(b)的样品中分离。

在一个实例中，该方法包括(a)提供从受试者中获得的生物样品，其中所述生物样品是血液样品或CSF样品，(b)富集生物样品中的一种至多种Nfl同种型，其中所述富集包括以下/由以下组成：(i)使生物样品与特异性结合Nfl同种型的第一群体的第一表位结合剂接触，并分离Nfl同种型的第一群体；(ii)使耗尽Nfl同种型的第一群体的样品与特异性结合Nfl同种型的第二群体的第二表位结合剂接触，并分离Nfl同种型的第二群体；并且(iii)使耗尽Nfl同种型的第一群体和第二群体的样品与特异性结合Nfl同种型的第三群体的第三表位结合剂接触，并分离Nfl同种型的第三群体；并且(c)检测且任选地定量第一群体、第二群体、第三群体或其任何组合中的一种至多种Nfl同种型，其中所述生物标记物是(c)中检测到的Nfl同种型或Nfl同种型群体、或者(c)中检测到的Nfl同种型或Nfl同种型群体之间的比率。在优选的实施方案中，第二表位结合剂可以结合第一表位结合剂的表位下游的表位，并且第三表位结合剂可以结合第二表位结合剂的表位下游的表位。可替代地，第二表位结合剂可以结合第一表位结合剂上游的表位。在一个实例中，第一表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸1至400内的第一表位；第二表位结合剂特异性结合在SEQ IDNO：1的氨基酸90至450内的第二表位；并且第三表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内的第三表位。在另一个实例中，第一表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸90至300内的第一表位；第二表位结合剂特异性结合在第一表位下游在SEQ IDNO：1的氨基酸200至400内的第二表位；并且第三表位结合剂特异性结合在第二表位下游在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内的第三表位。在另一个实例中，第一表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸90至250内的第一表位；第二表位结合剂特异性结合在SEQ IDNO：1的氨基酸250至400内的第二表位；并且第三表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内的第三表位。合适的表位结合剂包括节段II中描述的那些表位结合剂和/或商购可得的抗体。在一个具体实施方案中，(i)第一表位结合剂是HJ30.1或其抗原结合片段，HJ30.2或其抗原结合片段，HJ30.13或其抗原结合片段，或者竞争性抑制HJ30.1、HJ30.2或HJ30.13与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；(ii)第二表位结合剂是HJ30.4或其抗原结合片段、HJ30.7或其抗原结合片段、或者竞争性抑制HJ30.4或HJ30.7与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；(iii)第三表位结合剂是HJ30.11、其抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.11与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；(iv)或其任何组合。

在一些实施方案中，该方法包括(a)提供从受试者中获得的生物样品，其中所述生物样品是血液样品或CSF样品，(b)通过使生物样品与两种或更多种表位结合剂接触来富集多种Nfl同种型，其中每种表位结合剂特异性结合Nfl的不同表位；并且(c)检测且任选地定量步骤(b)中富集的一种至多种Nfl同种型，其中所述生物标记物是(c)中检测到的Nfl同种型或Nfl同种型群体、或者(c)中检测到的Nfl同种型或Nfl同种型群体之间的比率。在一个实例中，第一表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸1至400内的第一表位；第二表位结合剂特异性结合在第一表位下游在SEQ ID NO：1的氨基酸90至450内的第二表位；并且第三表位结合剂特异性结合在第二表位下游在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内的第三表位。在另一个实例中，第一表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸90至300内的第一表位；第二表位结合剂特异性结合在第一表位下游在SEQ ID NO：1的氨基酸200至400内的第二表位；并且第三表位结合剂特异性结合在第二表位下游在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内的第三表位。在另一个实例中，第一表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸90至250内的第一表位；第二表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸250至400内的第二表位；并且第三表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内的第三表位。合适的表位结合剂包括节段II中描述的那些表位结合剂和/或商购可得的抗体。在一个具体实施方案中，两种或更多种表位结合剂选自HJ30.1，HJ30.1的抗原结合片段，HJ30.2，HJ30.2的抗原结合片段，HJ30.13，HJ30.13的抗原结合片段，HJ30.4，HJ30.4的抗原结合片段，HJ30.7，HJ30.7的抗原结合片段，HJ30.11，HJ30.11的抗原结合片段，或者竞争性抑制HJ30.1、HJ30.2、HJ30.4、HJ30.7、HJ30.11和HJ30.13与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。在另一个具体实施方案中，一种表位结合剂选自组(i)、(ii)或(iii)，并且至少一种另外的表位结合剂选自组(i)、(ii)或(iii)中的不同者，其中组(i)、(ii)或(iii)是：(i)HJ30.1或其抗原结合片段，HJ30.2或其抗原结合片段，HJ30.13或其抗原结合片段，或者竞争性抑制HJ30.1、HJ30.2或HJ30.13与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；(ii)HJ30.4或其抗原结合片段、HJ30.7或其抗原结合片段、或者竞争性抑制HJ30.4或HJ30.7与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；(iii)HJ30.11、其抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.11与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。在另一个具体实施方案中，至少一种表位结合剂选自组(i)、(ii)和(iii)中的每一个，其中组(i)、(ii)或(iii)是：(i)HJ30.1或其抗原结合片段，HJ30.2或其抗原结合片段，HJ30.13或其抗原结合片段，或者竞争性抑制HJ30.1、HJ30.2或HJ30.13与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；(ii)HJ30.4或其抗原结合片段、HJ30.7或其抗原结合片段、或者竞争性抑制HJ30.4或HJ30.7与全长重组Nfl的结合的表位结合剂；(iii)HJ30.11、其抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.11与全长重组Nfl的结合的表位结合剂。

生物标记物的检测和定量可以用于多种目的。非限制性实例包括诊断神经元损害，诊断特征在于神经元损害的疾病或状况(例如，外伤性脑损伤、神经退行性疾病等)，监测/测量神经元损害和/或特征在于神经元损害的疾病状态的发展或进展，治疗具有神经元损害的受试者，确定/测量给定治疗的功效等等。

相应地，在另一个方面，该方法包括检测且定量生物标记物的水平，如上文任何实施方案所述，并且确定该水平与其在认知正常的对照受试者中的水平相比是否减少。在另一个方面，该方法包括检测且定量生物标记物的水平，如上文任何实施方案所述，并且确定该水平与其在认知正常且对于神经退行性疾病或外伤性脑损伤的一种或多种另外的临床体征或症状也是阴性的对照受试者中的水平相比是否减少。在另一个方面，该方法包括检测且定量生物标记物的水平，如上文任何实施方案所述，并且确定该水平与其在认知正常以及淀粉样蛋白阴性(Aβ-)的对照受试者中的水平相比是否减少。在另一个方面，该方法包括检测且定量生物标记物的水平，如上文任何实施方案所述，并且确定该水平与其在认知正常且对于脑中的tau沉积物的病理水平也是阴性的对照受试者中的水平相比是否减少。用于评估认知障碍包括痴呆的临床测试是本领域已知的。作为非限制性实例，可以使用临床痴呆评定(Clinical Dementia Rating)(CDR)测试。使用tau PET示踪剂或AβPET示踪剂来评价脑中的病理性蛋白质沉积也是本领域众所周知的。

在一些实施方案中，当生物标记物的水平显著偏离对照受试者的平均值时，受试者可以诊断为具有神经元损害。“显著偏离平均值”指高于或低于平均值至少1个标准差，优选至少1.3个标准差，更优选至少1.5个标准差，或甚至更优选至少2个标准差的值(例如，1σ、1.1σ、1.2σ、1.3σ、1.4σ、1.5σ等，其中σ是由在对照群体中测量的正态分布定义的标准差)。除使用阈值(例如，高于或低于平均值至少1个标准差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度也可以用于诊断受试者。

在另一个方面，该方法包括检测且定量从受试者中获得的第一生物样品和从受试者中获得的第二生物样品中的生物标记物的水平，如上文任何实施方案所述，其中第一生物样品和第二生物样品均为血液样品或均为CSF样品，并且其中第二生物样品在第一生物样品后获得。

在另一个方面，该方法包括检测且定量从受试者中获得的第一生物样品和从受试者中获得的第二生物样品中的生物标记物的水平，如上文任何实施方案所述，其中第一生物样品和第二生物样品均为血液样品或均为CSF样品，并且其中第二生物样品在第一生物样品后获得。与第一样品相比，第二样品中的生物标记物水平的增加指示神经元损害的增加。在一些实施方案中，第一样品和后续样品之间的生物标记物水平的变化率用于确定疾病的阶段和/或神经元损害的程度。相应地，此类方法可以用于监测具有神经元损害或处于具有神经元损害的风险中的受试者。

在一些实施方案中，上文方法中的一种或多种可以与本领域已知的一种或多种疾病生物标记物组合使用，以诊断、分期和/或治疗特异性神经退行性疾病。例如，数据显示了，AD进展中的病理生理事件级联始于改变的CSF和血浆Aβ42/Aβ40比率，随后为如通过淀粉样蛋白PET测量的淀粉样蛋白斑块增加，其与特定CSF tau种类(例如，p-tau217、p-tau231、p-tau181、p-tau153、p-tau111)的磷酸化增加相关，然后是p-tau205、NfL、总tau浓度的增加，代谢减退和萎缩。最后，MTBR-tau的一些种类(例如MTBR-tau299、MTBR-tau243、MTBR-tau354、MTBR-tau3R)在通过tau PET的tau聚集和临床症状出现之前或与之同时增加，并且与纵向tau聚集和临床进展相关联。这些发现指示了，与Aβ、p-tau、MTBR-tau测量中的一种或多种组合的CSF和血液Nfl测量是脑淀粉样变性、tau蛋白病和神经退行性变的高度精确的生物标记物，并且可以准确地鉴定临床前和临床AD的阶段并预测靶向某些疾病过程的治疗的有效性。还考虑了与其它疾病生物标记物的组合使用，用于除AD外的神经退行性疾病的诊断、分期和治疗。

在一些实施方案中，上文方法中的一种或多种可以加上更具侵入性的诊断方法例如PET或腰椎穿刺或作为其替代使用。因此，在任何上文方法中，在一些方面，受试者尚未接受先前的诊断测试，例如PET成像。

在一些实施方案中，上文方法中的一种或多种可以用于确定受试者是否应该接受另外的诊断测试，其可以例如是更具侵入性的诊断方法。例如，如果Nfl水平或与另一种临床体征组合的Nfl水平提示阿尔茨海默氏病，则可以选择受试者以接受基于淀粉样蛋白的PET或基于tau的PET。可替代地或另外，Nfl水平可以用于选择受试者以接受认知测试或进一步认知测试(如果已执行初始测试)，例如以进一步确认疾病的存在或特定的疾病阶段。可替代地或另外，Nfl水平可以用于选择受试者以接受另外的生物标记物测试，例如确定以下的总水平或特定同种型的水平的测试：载脂蛋白J、亨廷顿蛋白、突触核蛋白、可溶性淀粉样前体蛋白、α-2巨球蛋白、S100B、髓磷脂碱性蛋白、白细胞介素、超氧化物歧化酶、TNF、TREM-2、TDP-43、YKL-40、VILIP-1、朊病毒蛋白、pNFH、DJ-1等等。

在一些实施方案中，上文方法中的一种或多种也可以用于预测认知状态或认知下降。因此，在一些实施方案中，本公开内容涉及用于预测具有神经元损害(包括由神经退行性疾病、神经炎症或外伤性脑损伤引起的神经元损害)的人受试者中的认知状态或预测认知下降的上文方法。相应地，在进一步的实施方案中，本公开内容涉及用于预测神经退行性疾病进展的上文方法。

在另一个方面，该方法包括(a)在从受试者中获得的第一生物样品中，检测且定量生物标记物的水平，如上文任何实施方案中所述，生物标记物如上文所述；(b)向受试者施用治疗；并且(c)在治疗后从受试者中获得的第二生物样品中，检测且定量步骤(a)中定量的生物标记物；其中第一生物样品和第二生物样品均为血液样品或均为CSF样品。与第一样品相比，在第二样品中的生物标记物的水平没有变化、或生物标记物的水平降低指示了阳性治疗应答。另外，与第一样品相比，在第二样品中的生物标记物的水平增加也可能指示阳性治疗应答，当该增加小于在具有神经元损害但并未施用治疗的受试者的对照组中发生的增加时。优选地，对照受试者具有由于相同的疾病过程或损伤类型的神经元损害。相应地，此类方法可以用于测量具有神经元损害或处于具有神经元损害的风险中的受试者中的治疗应答。

在另一个方面，本公开内容包括治疗诊断有神经元损害或处于具有神经元损害的风险中的受试者。该方法包括(a)在从受试者中获得的样品中定量如本文所述的生物标记物；并且(b)向受试者施用药物组合物，以降低或稳定步骤(a)中测量的生物标记物的量。

V.组合物

在另一个方面，本公开内容还提供了包含节段IV的生物标记物和内部标准的组合物。

在另一个方面，本公开内容提供了包含内部标准和多种Nfl同种型的组合物，所述Nfl同种型选自具有基本上由Nfl的杆状结构域(通常描述为SEQ ID NO：1的氨基酸90-396)组成的氨基酸序列的同种型、具有基本上由Nfl的杆状结构域的一部分组成的氨基酸序列的同种型、具有由Nfl的杆状结构域的一部分组成的氨基酸序列且没有在该区域外的氨基酸的同种型、或其任何组合。例如，组合物可以包括包含SEQ ID NO：1的氨基酸90至396的一种或多种Nfl同种型，其具有至多约330个氨基酸的长度。可替代地或另外，组合物可以包括一种或多种Nfl同种型，其为SEQ ID NO：1的氨基酸90至396的片段。例如，组合物可以包括一种或多种Nfl同种型，其长度小于310个氨基酸(约305、约300、约275、约250、约225、约200、约175、约150、约125、约100、约75、约50、约25等)，并且包含SEQ ID NO：1的氨基酸165至172、SEQ ID NO：1的氨基酸198至206、SEQ ID NO：1的氨基酸324至331或其任何组合。在一些实例中，组合物可以包括一种或多种Nfl同种型，其长度小于约200个氨基酸，并且包含SEQ ID NO：1的氨基酸165至172、SEQ ID NO：1的氨基酸198至206或其组合。可替代地或另外，组合物可以包括一种或多种Nfl同种型，其为SEQ ID NO：1的氨基酸125至396的片段。例如，组合物可以包括一种或多种Nfl同种型，其长度为约275个氨基酸或更少，并且包含SEQID NO：1的氨基酸165至172、SEQ ID NO：1的氨基酸198至206、SEQ ID NO：1的氨基酸324至331或其任何组合。

在另一个方面，本公开内容提供了包含内部标准和多种Nfl同种型的组合物，所述Nfl同种型选自基本上由Nfl的尾区组成的同种型、具有由Nfl的尾区的一部分组成的氨基酸序列的同种型或其组合。尾区通常被描述为SEQ ID NO：1的氨基酸397至543。例如，组合物可以包括包含SEQ ID NO：1的氨基酸397至543的一种或多种Nfl同种型，其为长度147个氨基酸至长度约200个氨基酸。可替代地或另外，组合物可以包括一种或多种Nfl同种型，其为SEQ ID NO：1的氨基酸397至543的片段。例如，组合物可以包括一种或多种Nfl同种型，其长度小于147个氨基酸，并且包含SEQ ID NO：1的氨基酸422至437、SEQ ID NO：1的氨基酸438至462、SEQ ID NO：1的氨基酸530至540或其任何组合。在另一个实施方案中，组合物可以包括一种或多种Nfl同种型，其长度小于约100个氨基酸或更少，并且包含SEQ ID NO：1的氨基酸422至437、SEQ ID NO：1的氨基酸438至462、SEQ ID NO：1的氨基酸530至540或其任何组合。

在另一个方面，本公开内容提供了包含内部标准和选自以下的肽的组合物：由SEQID NO：1的氨基酸165至172组成的肽、由SEQ ID NO：1的氨基酸198至206组成的肽、由SEQID NO：1的氨基酸324至331组成的肽、以及由SEQ ID NO：1的氨基酸530至540组成的肽。在另一个方面，本公开内容提供了包含内部标准以及由SEQ ID NO：1的氨基酸530至540组成的肽的组合物，其中所述组合物含有可忽略不计的量的由SEQ ID NO：1的氨基酸165至172组成的肽、由SEQ ID NO：1的氨基酸198至206组成的肽、以及由SEQ ID NO：1的氨基酸324至331组成的肽。

在上文组合物的一些实施方案中，内部标准是可检测地标记的重组Nfl或其片段。在一些实施方案中，内部标准用选自²H、¹³C和¹⁵N的重同位素标记进行可检测地标记。在一些实施方案中，内部标准是AQUA肽。在特定实施方案中，用重同位素标记可检测地标记的内部标准与生物标记物或多种Nfl同种型或肽可以为分别大于0.01/1和分别小于1/100的比率；或者可以为分别约0.1/1至分别约10/1的比率。

肽的量或生物标记物的量或多种Nfl同种型的量为至少0.1pg。在一些实施方案中，肽、生物标记物或多种Nfl同种型的量为约0.1pg至约10,000ng、或约0.1pg至约5,000ng、或约0.1pg至约1,000ng。在一些实施方案中，肽、生物标记物或多种Nfl同种型的量为约1pg至约10,000ng、或约1pg至约5,000ng、或约1pg至约1,000ng。在一些实施方案中，肽、生物标记物或多种Nfl同种型的量为约10pg至约10,000ng、或约10pg至约5,000ng、或约10pg至约1,000ng。在一些实施方案中，肽、生物标记物或多种Nfl同种型的量为约100pg至约10,000ng、或约100pg至约5,000ng、或约100pg至约1,000ng。在一些实施方案中，肽、生物标记物或多种Nfl同种型的量为约500pg至约10,000ng、或约500pg至约5,000ng、或约500pg至约1,000ng。在一些实施方案中，肽、生物标记物或多种Nfl同种型的量为约1,000pg至约10,000ng、或约1,000pg至约5,000ng、或约1,000pg至约1,000ng。在一些实施方案中，肽、生物标记物或多种Nfl同种型的量为约5ng至约10,000ng、或约5ng至约5,000ng、或约5ng至约1,000ng。在一些实施方案中，肽、生物标记物或多种Nfl同种型的量为约10ng至约10,000ng、或约10ng至约5,000ng、或约10ng至约1,000ng。

在上文实施方案各自中，组合物可以进一步包含如节段II中描述且通过引用并入本节段内的一种或多种抗Nfl表位结合剂。

实施例

包括下述实施例以证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当了解，在随后的实施例中公开的技术代表通过发明人发现的在本发明的实践中发挥良好功能的技术。然而，按照本公开内容，本领域技术人员应当了解，可以在所公开的具体实施方案进行许多改变，并且仍获得类似或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围，因此，在伴随实施例和附图中阐述或显示的所有内容应被解释为说明性的而非限制性的。

实施例1

该实施例描述了用于产生NfL单克隆抗体的免疫方案。

抗原：重组蛋白质(在大肠杆菌中产生并纯化的神经丝轻链-人)。产生并纯化NfL1-543aa。将100微克重组NfL蛋白腹膜内(IP)注射到B6/C3小鼠内。第一次IP注射剂由在200微升PBS+200微升完全弗氏佐剂中的100微克重组NfL1-543aa/小鼠组成。14天后的第二次IP注射剂由在200微升PBS加上200微升不完全弗氏佐剂中的100微克重组NfL1-543aa/小鼠组成。在21天后，从每只小鼠中取出30微升血液，并且通过直接ELISA针对重组NfL筛选血清。在28天后，小鼠接受在200μl PBS加上200微升不完全弗氏佐剂中的100微克重组NfL1-543aa的第三次IP注射剂。在35天后，从小鼠中取出30微升血液(第二次采血)，并且通过直接ELISA再次针对重组NfL评价血清。如果小鼠的滴度超过1∶10,000，则发生融合。然后在融合前3天，将PBS中的50微克重组NFL 1-543aa的最后一次加强IP注射给小鼠。

然后通过用重组NFL 1-543aa包被板来筛选由各个克隆产生的抗体。为此，将NfL1-543aa加入板，然后用1％乳封闭板。然后用PBS洗涤板，并且以在PBS缓冲液中的0.5％BSA加上抗小鼠IgG HRP中的1∶10稀释度添加来自各个克隆的细胞培养基。然后添加TMB，并且读取在650处的吸光度，并且将这与作为空白的单独的细胞培养基进行比较。

选择二十三种抗体用于进一步表征(参见实施例2)。抗体HJ30.1、HJ30.2、HJ30.4、HJ30.7、HJ30.11和HJ30.13保藏于ATCC。

表1

实施例2

在该实施例中，Nfl使用实施例1中描述的23种抗体之一进行免疫沉淀，蛋白酶解消化，然后通过质谱法(MS)检测且定量Nfl的蛋白酶解肽。在该实施例及其它实施例中描述的所有MS实验中，当对于ISTD的给定胰蛋白酶肽并未检测到可靠的MS信号时，并不报告关于ISTD(15N)或实验Nfl(14N)的数据-参见例如，图1中的胰蛋白酶肽[55，83]。说明书自始至终，包括在本文的实施例中，使用特定的简化符号-“[X，Y]”来标识胰蛋白酶肽-其中X是胰蛋白酶肽的第一个氨基酸，并且Y是胰蛋白酶肽的最后一个氨基酸，并且其中X+1或Y+1标识全长Nfl(SEQ ID NO：1)的氨基酸。例如，命名法“[55，83]”是由全长Nfl(SEQ ID NO：1)的氨基酸56至84组成的胰蛋白酶肽SYSSSSGSLMPSLENLDLSQVAAISNDLK(SEQ ID NO：5)的简化。

为了促进免疫沉淀的Nfl的回收，按照制造商说明书，使各个抗体以每mg珠25μg抗体的浓度与交联。HJ5.1，一种抗Aβ抗体，用作阴性对照。评估了从脑裂解物或CSF中分离的全长重组Nfl(rec-Nfl)和生物产生的Nfl。

对于全长重组Nfl分析(rec-Nfl)，将10uL 5ng/uL rec-Nfl的1％HSA溶液添加到40uL 100mM TEABC中。通过添加30uL 30％(即，3mg/mL)抗体缀合珠制剂的浆料，并且将样品在室温下旋转120分钟，使Nfl免疫沉淀。抗体缀合的珠进行磁分离，并且去除IP后的上清液。珠在1mL 25mM TEABC(每次洗涤)中洗涤3次。

NfL也从脑裂解物和CSF中进行亲和纯化。所使用的脑样品是先前裂解的样品，贮存于-80℃下用于测定开发。并未获得关于受试者的患者人口统计数据(例如，年龄、性别、神经元疾病的临床体征或症状)。将冷冻的裂解物解冻并且等分试样用1％HSA进行1：1000稀释。将450μl解冻的脑裂解物转移到1.6mL新管中。然后添加在50mM三乙基碳酸氢铵缓冲液(TEABC)中含有去污剂(1％NP-40)、离液剂(5mM胍)和蛋白酶抑制剂(Roche completeProtease Inhibitor Cocktail)、以及20uL 0.5ng/ml Nfl内部标准(ISTD)的25uL主混合物。Lys、Arg、¹³C和¹⁵N标记的重组全长Nfl用作ISTD。通过添加30uL 30％(即，3mg/mL)抗体缀合珠制剂的浆料，并且将样品在室温下旋转120分钟，使Nfl免疫沉淀。抗体缀合的珠进行磁分离，并且去除IP后的上清液。珠在1mL 25mM TEABC(每次洗涤)中洗涤3次。

所使用的CSF样品先前从用于测定开发的人受试者中获得并贮存于-80℃下。关于受试者的患者人口统计数据未知(例如，年龄、性别、神经元疾病的临床体征或症状)。将冷冻的CSF样品在室温下解冻，并且将500μl解冻的CSF转移到新管中。然后添加在50mM三乙基碳酸氢铵缓冲液(TEABC)中含有去污剂(1％NP-40)、离液剂(5mM胍)和蛋白酶抑制剂(Rochecomplete Protease Inhibitor Cocktail)、以及20uL 0.5ng/ml Nfl内部标准(ISTD)的25uL主混合物。Lys、Arg、¹³C和¹⁵N标记的重组全长Nfl用作ISTD。通过添加30uL 30％(即，3mg/mL)抗体缀合珠制剂的浆料，并且将样品在室温下旋转120分钟，使Nfl免疫沉淀。抗体缀合的珠进行磁分离，并且去除IP后的上清液。珠在1mL 25mM TEABC(每次洗涤)中洗涤3次。

不管样品如何，抗体结合的Nfl在37℃下用400ng MS级别胰蛋白酶或Lys-C的25mMTEABC溶液在珠上消化16小时。蛋白酶的浓度、温育时间和缓冲液可以根据本领域已知的方法进行调整。将消化物加载到按照制造商说明书进行调节的TopTip C18上，通过用0.1％甲酸(FA)洗涤两次进行脱盐，并且用60％乙腈(ACN)和0.1％FA进行洗脱。洗脱的肽通过真空离心进行干燥，并且贮存于-80℃下或立即重悬浮。

对于MS分析，洗脱的肽用25uL 0.1％FA/0％CAN进行重构。然后将每种消化物的4.5uL等分试样注射到nano-Acquity LC内用于MS分析。nano-Acquity LC(WatersCorporation，Milford，MA，USA)配备有HS ST375μm×100μm，1.8μm柱和0.5μL/分钟的流速。在从2％溶剂B到95％溶剂B的梯度上分离肽。溶液A由MS级别水中的0.1％甲酸构成，并且溶液B由乙腈中的0.1％甲酸构成。样品以正离子模式进行分析，使用2,200V的喷雾电压和275℃的离子传输管温度。对于内源性(N14)和同位素标记的(C₁₃N₁₅)肽，用平行反应监测(PRM)收集数据，靶向2+或3+电荷状态。HCD碰撞能量范围为18-27％，并且对于每种肽进行优化。最大注射时间范围为24至118ms，并且对于每种肽进行优化。标准化的AGC靶设定为400％。数据使用Skyline软件(McCoss laboratory)进行提取，并且在Skyline和Microsoft Excel中进行分析。

图1提供了关于rec-Nfl的Nfl回收/IP效率的概述。图2提供了来自脑裂解物的Nfl回收/IP效率的概述。图3提供了来自CSF的Nfl回收/IP效率的概述。图4-21显示了关于各个抗体的数据。对于每个图，y轴是14N/15N比率，并且x轴上的每个点都是Nfl的胰蛋白酶肽。

在图1中，14N/15N比率沿着序列是一致的，考虑到ISTD和实验Nfl(rec-Nfl)均为全长蛋白质，这是预计到的。值得注意的是，HJ13.3.2、HJ30.19、HJ30.19-40和HJ30-.19-77并未显示rec-Nfl回收。

在脑裂解物中，所检测到的Nfl也大部分是全长的(图2)。分析指示了N末端甲硫氨酸被切割，并且第二个氨基酸(丝氨酸)是乙酰化的(数据未显示)。对于胰蛋白酶肽[370，378]、[379，389]和[391，398]可见的高信号被确定为是由于污染物(数据未显示)。

在脑裂解物样品的分析中可见的污染在CSF样品的分析中也可见(图3-21)。由于胰蛋白酶肽[370，378]、[379，389]和[391，398]并非Nfl所独有的，因此它们不应该用于生物样品中的Nfl的检测和定量。[2，14]的乙酰化在CSF Nfl中也可见(图3-21)。与对于来自脑裂解物的rec-Nfl和Nfl可见的14N/15N比率不同，来自CSF的Nfl显示了沿着序列不一致的14N/15N比率，指示了CSF中的许多截短的Nfl种类(图3)。比较各个抗体的概况(图4-21)，显而易见的是某些抗体在使CSF Nfl免疫沉淀方面比其它抗体更有效，并且CSF Nfl含有各种长度的多种Nfl同种型，具有在N末端、C末端、或N末端和C末端处的切割。

在图22中示出了通过上述方法从脑裂解物和CSF中富集的一些潜在同种型的概述，伴随所提供的近似大小。

实施例3

在该实施例中，使用HJ30.4、HJ30.11或HJ30.13之一从CSF中免疫沉淀Nfl。所使用的CSF样品先前从用于测定开发的人受试者获得并贮存于-80℃下。关于受试者的患者人口统计数据未知(例如，年龄、性别、神经元疾病的临床体征或症状)。免疫沉淀和LC-MS分析一般如实施例2中所述的，除了在免疫沉淀后回收的上清液经受用相同的抗体的第二轮免疫沉淀之外。14N(红色条)和15N(蓝色条)数据分开显示(图23-25)。每个图中的前两个条对应于第一个富集步骤，并且后两个条对应于第二个富集步骤。

大部分内部标准(ISTD，蓝色条)通过第一个富集步骤从样品中进行回收。这提示了如果执行用相同或不同表位结合剂的连续几轮富集，则需要重新添加全长内部标准。类似地，HJ30.4和H30.13在单个步骤中有效地从CSF中富集Nfl同种型(图23-24)。相比之下，HJ30.11并未在单个步骤中免疫沉淀其特异性结合的所有Nfl同种型(图25)。

实施例4

还执行用多种抗体从CSF序贯免疫沉淀Nfl。所使用的CSF样品先前从用于测定开发的人受试者获得并贮存于-80℃下。关于受试者的患者人口统计数据未知(例如，年龄、性别、神经元疾病的临床体征或症状)。免疫沉淀和LC-MS分析一般如实施例2中所述的，除了在第一次免疫沉淀后回收的上清液经受用第二抗体的第二轮免疫沉淀，然后使第二次免疫沉淀后回收的上清液经受用第三抗体的第三轮免疫沉淀之外。在一个实验中，HJ30.2、HJ30.7、然后HJ30.11序贯地用于免疫沉淀。在第二个实验中，HJ30.11、HJ30.7和HJ30.2序贯地用于免疫沉淀。在这些实验中，仅将内部标准添加到初始CSF样品中。每个实验都一式两份执行。实验设计的示意图显示于图26中。图29中显示了其中内部标准也在下一轮富集之前添加到每种IP后的上清液中的替代方法。

来自两个实验的数据一起显示于图27-28中。在图27中，y轴是14N/15N比率，并且x轴上的每个点都是Nfl的胰蛋白酶肽。在图28中，y轴是14N信号，并且x轴上的每个点都是Nfl的胰蛋白酶肽。每条彩色线都是不同的样品，如图例和图26中鉴定的。当对于ISTD的给定胰蛋白酶肽并未检测到可靠的MS信号时，并不报告数据。与过程的开始相比，在过程结束时使用HJ30.11的序贯富集之后，包含C末端的Nfl同种型更丰富(将图28中的“30.11”或“30.11_duplicate”与“post30.2&7_30.11IP”或“post 30.2&7_30.11IP_duplicate”进行比较)。在分析的其它样品中，这些C末端同种型的检测是可忽略不计的。这些数据显示了，不同表位结合剂的序贯使用富集了Nfl同种型的不同群体。

实施例5

在该实施例中，将来自从具有神经元损害的人受试者中获得的CSF样品的Nfl同种型与来自从对照人受试者中获得的CSF样品的Nfl同种型进行比较。免疫沉淀和LC-MS分析一般如实施例2中所述的，除了在用HJ30.13的第一次免疫沉淀后回收的上清液经受用HJ30.4的第二轮免疫沉淀，然后使第二次免疫沉淀后回收的上清液经受用HJ30.11的第三轮免疫沉淀之外。在下一轮富集之前，还将内部标准添加到每种IP后的上清液中。实验设计的示意图显示于图29中。

图30-39中显示的数据来自使用以下的实验：从具有阿尔茨海默氏病(AD)的一种或多种生物标记物的人受试者中获得的CSF样品、或从对照人受试者中获得的CSF样品。更特别地，如通过PIB-PET成像或CSF Aβ42水平评估的，鉴定为患有AD的受试者是淀粉样蛋白阳性的(图30-33)。该队列中的所有AD受试者也具有≥0.5的临床痴呆评定(CDR)评分。对照受试者具有CDR评分零并且是淀粉样蛋白阴性的(图34-39)。每个图都是个别的受试者；在每个图中，蓝线是通过HJ30.13免疫沉淀的Nfl同种型，橙线是通过HJ30.4免疫沉淀的Nfl同种型，并且灰线是通过HJ30.11免疫沉淀的Nfl同种型，其中y轴是14N/15N比率，并且x轴上的每个点都是Nfl的胰蛋白酶肽。当对于ISTD的给定胰蛋白酶肽并未检测到可靠的MS信号时，并不报告数据。如图40中概括的，Nfl的一些部分似乎能够更好地区分AD受试者与对照受试者。

图41中显示的数据来自使用以下的实验：从按CDR评分(0、0.5、1或2)分组的具有一种或多种AD生物标记物(即，如通过PIB-PET成像或CSF Aβ42水平评估的至少淀粉样蛋白阳性)的人受试者中获得的另外CSF样品，来自对照人受试者(淀粉样蛋白阴性和CDR＝0)的另外样品，以及从其为淀粉样蛋白阴性、但患有非常轻度的痴呆(CDR 0.5)或轻度痴呆(CDR1)的人受试者中获得的样品。淀粉样蛋白阴性状态伴随非常轻度的痴呆至轻度痴呆可能指示其它神经系统疾病过程(即，除AD外的影响认知的神经系统疾病)。由于技术错误，无法获得来自第一个富集步骤的Nfl数据。然而，来自第二个和第三个富集步骤的数据看起来类似于AD相对于对照(淀粉样蛋白阴性，CDR 0)的初始分析。特别地，数据再次显示了包含SEQID NO：1的C末端氨基酸530至540的Nfl同种型区分AD受试者与对照受试者。另外，来自患有轻度痴呆(CDR 1)的淀粉样蛋白阴性受试者的数据提示了，所检测到的Nfl同种型可以用作由于其它原因的神经元损害的标记物。

实施例6

在该实施例中，分析了来自从人受试者中获得的血液样品中的Nfl同种型。使用了合并血液的两种不同样品，所述样品各自由先前从用于测定开发的多个人受试者中获得、合并且贮存于-80℃下的血液构成。免疫沉淀和LC-MS分析一般如实施例5中所述的，除了使用0.5mL血液而不是CSF之外。如图42-44中显示的，血液中的Nfl浓度低于CSF中的浓度，但可检测到。此外，类似于CSF，血液也由多种Nfl同种型构成。还类似于CSF，在血液中存在几种截短的Nfl同种型，其主要由C末端构成。

实施例7

通过利用与NfL的各个区域结合的所开发的抗体，并且使用免疫沉淀质谱法(IP-MS)表征在脑组织和CSF中通过这些抗体回收的NfL结构域，该实施例进一步阐述了先前的实施例。本实施例显示了脑NfL大部分由全长蛋白质构成，而CSF NfL由不同蛋白质片段种类的混合物组成。然后测试了在对照和AD的开发队列中新近鉴定的NfL片段种类，并且在确认队列中进一步验证。

用于测定开发的合并的CSF样品先前从人受试者中获得并贮存于-80℃下。在初次收集时，CSF以1000x g离心10分钟，以去除细胞碎片，并且立即在-80℃下冷冻。脑样品包括先前贮存于-80℃下用于测定开发的裂解样品。所有AD和对照CSF样品在先前研究过程中进行收集，等分并贮存于-80℃下。验证队列包括来自以下的CSF样品：30个有症状的淀粉样蛋白阳性参与者、16个无症状的淀粉样蛋白阳性参与者、10个有症状的淀粉样蛋白阴性参与者和25个阴性对照。参与者的人口统计数据显示于表2中。

表2：验证队列的人口统计数据

通过添加30μL 30％(即，3mg/mL)抗体缀合珠制剂的浆料，并且将样品在室温下旋转120分钟，使重组和天然NfL免疫沉淀。抗体缀合的珠进行磁分离，并且去除IP后的上清液。珠在1mL 25mM TEABC(每次洗涤)中洗涤3次。结合的NfL在37℃下用400ng MS级别胰蛋白酶/Lys-C(Promega)在珠上消化16小时。将消化物加载到TopTip C18(Glygen，TT2C18.96)上，脱盐并洗脱。洗脱物在真空中无加热进行干燥，并且贮存于-80℃下，直至通过液相层析串联质谱法(LC-MS/MS)的分析(参见下文的LC-MS/MS方法)。16种抗体回收了全长重组蛋白质(图45)。基于来自从合并的CSF免疫沉淀的天然NfL的肽谱，抗体被确定为具有针对杆状结构域的氨基末端部分、杆状结构域的羧基末端部分、或NfL的羧基末端的表位(图46)。对于这些NfL结构域各自选择具有高回收和NfL特异性的抗体，并且用于定性和定量IP-MS测定中。定制抗体无一识别NfL的N末端。

三步序贯免疫沉淀用于表征脑裂解物和CSF中的NfL。使用靶向杆状结构域的螺旋1A/1B(HJ30.13)、杆状结构域的螺旋2B(HJ30.4)和尾区(HJ30.11)的抗体。将冷冻的脑裂解物解冻，并且解冻的脑裂解物的450μL等分试样用1％HSA进行1：1000稀释。将冷冻的CSF样品在室温下解冻，并且将450μL解冻的CSF转移到新的1.6mL新管中用于免疫沉淀。

使用30μL30％(即，3mg/mL)HJ30.13(螺旋1A/1B抗体)的抗体缀合珠制剂的浆料，如上文对于天然CSF所述，使脑和CSF样品两者免疫沉淀。将洗涤的珠贮存于冰上，直到所有样品准备用于珠上消化。在第二步中，添加20μL 0.5ng/ml NfL ISTD的50mM TEABC溶液，并且通过添加30μL 30％(即3，mg/mL)HJ30.4(螺旋2B抗体)的抗体缀合珠制剂的浆料，使NfL第二次免疫沉淀。剩余步骤与第一次免疫沉淀相同。在用HJ30.11(尾部抗体)执行的第三次序贯免疫沉淀之前，再次将10ng ISTD的50mM TEABC溶液添加到IP后的上清液中。结合的NfL在37℃下用400ng MS级别胰蛋白酶/Lys-C(Promega)在珠上消化16小时，并且如上所述提取样品。

为了消除关于ISTD的序贯添加的需要，将靶向杆状结构域的螺旋1A/1B(HJ30.13)、杆状结构域的螺旋2B(HJ30.4)和尾区(HJ30.11)的抗体1∶1∶1混合，以生成具有每种抗体10％(即，1mg/mL)的最终浓度的抗体浆料。将含有去污剂(1％NP-40)、离液剂(5mM胍)和蛋白酶抑制剂(Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail)的25μL主混合物添加到96孔板中。然后添加5μL ISTD(0.1ng/μL于1％HSA中；ISTD溶剂和量对于定量回收和测定的动态范围进行优化)，随后为450μL解冻的CSF和30μL抗体浆料。如上所述执行免疫沉淀和珠上消化。

筛选合并的CSF以鉴定具有低浓度和高浓度NfL的池。选择具有最低(NfL-L1)和最高(NfL-L2)NfL浓度的CSF池，并且用于确定测定的线性范围。NfL-L2 CSF用NfL-L1 CSF进行连续稀释，以生成具有以下的8点曲线：100％、50％、25％、12.5％、6.25％、3.13％和1.56％NfL-L2。如上所述，对NfL进行IP，一式三份，用于浓缩。在定量方法中对于6种肽各自确定N14/N15比率，并且重复的平均N14/N15比率针对％NfL-L2进行绘图，并且执行线性回归。所有6种肽都显示了跨越测试的NfL浓度的良好线性，具有R2≥0.988(图47)。关于每种肽跨越线性范围的平均％CV为8-12％(表3)。

表2：关于IP-MS方法跨越线性范围的小数％CV

％NfL-L2	NfL101	NfL117	NfL165	NfL284	NfL324	NfL530
							0	0.13	12.69	18.72	16.00	8.59	13.37
1.56	0.10	0.10	0.11	0.05	0.11	0.08
							3.125	0.21	0.15	0.22	0.15	O.05	0.07
6.25	0.11	0.10	0.08	0.02	0.10	0.18
							12.5	0.06	0.08	0.08	0.06	0.05	0.06
25	0.04	0.02	0.06	0.02	0.03	0.05
							50	0.11	0.05	0.13	0.07	0.08	0.01
100	0.16	0.15	0.06	0.12	0.16	0.21

提取的消化物用25μL 0.1％甲酸/0％ACN进行重构。然后将每种消化物的4.5μL等分试样注射到nano-Acquity LC内用于MS分析。nano-Acquity LC(Waters Corporation，Milford，MA，USA)配备有HSST375μm×100μm，1.8μm柱，并且溶液A和B梯度的0.5μL/分钟的流速用于分离肽。溶液A由MS级别水中的0.1％甲酸构成，并且溶液B由乙腈中的0.1％甲酸构成。样品以正离子模式进行分析，使用2,200V的喷雾电压和275℃的离子传输管温度。对于内源性(N14)和同位素标记的(Lys，Arg：13C 15N)肽，用平行反应监测(PRM)收集数据。经由Blast搜索鉴定对NfL特异性的胰蛋白酶肽，并且具有良好电离的那些肽包括在设计为优化序列覆盖率的定性PRM中。定量方法对于测定精度进行优化，并且多路复用减少为分析跨越各种NfL结构域的6种NfL肽及其相应的ISTD(表4)。

表3：定量MS肽列表

验证队列由81个CSF样品组成，所述样品先前从患有AD痴呆(淀粉样蛋白阳性，CDR0-2)、非AD痴呆(淀粉样蛋白阴性，CDR 0.5-1)的个体和健康对照(淀粉样蛋白阴性，CDR 0)中收集。淀粉样蛋白阳性先前通过Aβ42/Aβ40比率进行确定(Patterson等人，2015)。对于每个CSF样品，使用上述定量IP-MS方法，测量了对应于NfL的四个不同结构域(螺旋1A、螺旋1B、螺旋2B和尾部)的六种NfL肽。NfL还根据制造商的说明经由商业ELISA试剂盒(UMANDiagnostics)进行测量。简言之，对于ELISA测量，CSF样品在湿冰上进行解冻并涡旋。样品然后在96孔预板(pre-plate)中用所提供的样品稀释剂进行2x稀释，并且在转移到测定板之前进行混合。

为了确定可溶性NfL种类与AD临床、认知、成像和生物标记物量度的关系，在每个NfL区域(IP-MS)和先前获得的生物标记物数据之间执行相关性分析。评估了下述量度：年龄、CDR总体(CDR-global)和CDR总分(CDR-SB)、简易精神状态检查(Mini-Mental StateExam)(MMSE)、淀粉样蛋白斑块成像(PET PiB)、CSF Aβ42/Aβ40、CSF总tau(t-tau)、CSFptau 181和ptau181/tau181、CSF ptau205和ptau205/tau205、以及CSF ptau217和ptau217/tau217。

生成针对NfL的二十三种单克隆抗体，并且评估其免疫沉淀全长rec-NfL、来自脑裂解物的NfL和来自合并CSF的NfL的能力。抗体的特征在于它们靶向的NfL结构域、其IP效率及其特异性。选择用于每种NfL结构域的代表性抗体，并且用于进一步的测定开发。使用靶向各种NfL结构域的抗体，我们确定了多重NfL种类存在于CSF中(图48)。为了更好地阐明CSF中的NfL种类，从靶向螺旋1A/1B(大约aa93-252，HJ30.13)的抗体开始，随后为靶向螺旋2B(大约aa272-396，HJ30.4)的抗体，并且最后用靶向尾区的C末端的抗体(aa 520-550，HJ30.11)，对合并的CSF样品进行序贯免疫沉淀。基于这些蛋白质谱，在CSF中鉴定了最少三个主要的NfL片段种类，尽管很可能存在这些种类的多重变异。这些包括通过HJ30.13(aa92直到至少aa224，其中可能的变异延伸直到aa360)和HJ30.4(aa324直到aa360)富集、含有杆状结构域的两种不同的N末端和C末端截短，以及含有NfL的尾部的C末端片段(通过HJ30.11富集，含有aa530直到至少aa540)。并未回收到N末端片段，并且全长NfL并不以可定量的浓度存在于CSF中(图49A-49B)。

与CSF中的高度片段化的蛋白质形成对比，脑组织匀浆物主要含有全长NfL。为了确定脑中是否也存在任何截短的同种型，执行对人脑组织的相同的序贯免疫沉淀。虽然大多数脑NfL似乎是全长的，但也观察到含有至少氨基酸530-540的尾部亚结构域B的C末端片段(图49A、49C)，类似于CSF中鉴定的片段。含有aa165-224的片段似乎通过HJ30.13进行富集。在第二次IP(HJ30.4，杆状结构域的螺旋2B)期间，在脑中没有富集另外的NfL片段。

对来自阿尔茨海默氏病痴呆(AD，N＝4)和健康对照(N＝6)的开发队列的CSF样品，重复最初对实验性的合并CSF测试的序贯IP-MS方法。在两个临床组中观察到的肽类似于合并的CSF中观察到的那些肽，但与对照相比，存在AD中的三个主要NfL种类的量增加(图50)。另外，一些肽在区分AD与对照样品方面似乎优于其它肽。对于C末端尾部中的NfL530(胰蛋白酶肽VEGAGEEQAAK(SEQ ID NO：29)，aa530-540)以及在杆状结构域的螺旋1B内的胰蛋白酶肽GADEAALAR(SEQ ID NO：16)，观察到最显著的差异。

为了更好地比较AD、非AD痴呆和健康对照中的CSF NfL种类，我们开发了定量NfL测定，以可靠地测量跨越多重NfL种类的选择区域。为了改善精度，我们的定量方法中的多路复用减少为测量跨越各种NfL结构域的6种肽及其相应的内部标准。然后应用IP-MS定量方法，以测量81个AD和对照样品(，30个淀粉样蛋白阳性，CDR＞0；16个淀粉样蛋白阳性，CDR＝0；10个淀粉样蛋白阴性，CDR＝0；25个淀粉样蛋白阴性，CDR＝0。表2)的验证队列中的特定CSF NfL种类。CSF NfL浓度还使用黄金标准Uman NfL免疫测定进行定量用于比较。

与开发队列的序贯IP结果(图51)一致，与淀粉样蛋白阴性的健康对照(N＝25)相比，NfL浓度的增加在有症状的淀粉样蛋白阳性个体(N＝30)的确认队列中得到确认(图52)。有趣的是，组间的差异对于一些区域比其它区域更大，其中在杆状结构域的螺旋2B(NfL324；GMNEALEK(SEQ ID NO：20)，aa324-331)以及在尾部的C末端(NfL530；VEGAGEEQAAK(SEQ ID NO：29)，aa530-540)中观察到最大的差异。与对照相比，NfL324在AD中是1.5倍的增加(P＝0.008，图52F)，并且NfL530是1.7倍的增加(P＝0.002，图52G)。

与对照相比，NfL免疫测定在AD中是1.4倍的增加。它与NfL324肽浓度具有最强的相关性(R2＝0.84)，提示了Uman免疫测定靶向含有螺旋2B区域的CSF NfL片段。重要的是，在免疫测定与其它调查的肽之间的相关性对于NfL101、117、165和530更低(R2范围为0.34至0.49)，并未发现与NfL284的相关性(图52)。

由于NfL是一般的神经退行性变的标记物，并非对于AD特异性的，因此假设无论在患有临床痴呆和神经退行性变的那些人中是否存在淀粉样蛋白斑块，NfL都是增加的。对于淀粉样蛋白阳性和淀粉样蛋白阴性样品，评估在CDR-SB(痴呆严重程度的临床测量)和NfL种类之间的相关性(图53)。虽然相关性对于淀粉样蛋白阳性组中的一些NfL种类略高于淀粉样蛋白阴性组(NfL101、NfL117、NfL165和NfL324)，但相关性对于两组中的所有NfL种类是最低或低的。对于任一组，在NfL530和CDR-SB之间的相关性并非显著非零的。

还在6种定量的NfL肽各自与包括以下的另外先前测量的生物标记物和临床测量之间执行斯皮尔曼相关性分析：临床痴呆的一般标记物(CDR-SB、MMSE)、淀粉样蛋白斑块的生物标记物(PET PiB、CSF Aβ42/Aβ40)和tau生物标记物(CSF总tau，CSF磷酸-tau免疫测定，以及CSF ptau 181、205和217占有率的质谱法测量)；图54，表5。该分析的目标是形成与疾病特异性神经退行性变相比，关于不同NfL种类在一般神经退行性变中的生物学的假设。在杆状结构域的螺旋1A(NfL101和NfL117，r＝0.99)和螺旋1B(NfL101和NfL165，r＝0.98；NfL117和NfL165r＝0.98)内的肽之间观察到最强的相关性。杆状结构域的螺旋2B中的肽与螺旋1A肽具有相似但略微更低的相关性(NfL101和NfL284，r＝0.89；NfL101和NfL324，r＝0.87；NfL117和NfL284，r＝0.90；NfL117和NfL324，r＝0.88)。在C末端尾部肽和螺旋1A之间的相关性在所调查的NfL肽中是最低的(NfL101和NfL530，r＝0.75；NfL117和NfL530，r＝0.76)。有趣的是，测量的大多数c末端肽(NfL324和NfL530)具有在疾病生物标记物和NfL之间最高的相关性。在NfL324或NfL530与ptau 181、205或217之间的中等相关性范围为r＝0.45至0.49。在相同的NfL肽和tTau之间的相关性为r＝0.42至0.43。与CSF Aβ42/Aβ40和CSF NfL530的相关性低至-0.37。(图53，表4)。

表5：斯皮尔曼相关性表

/>

本实施例确定了在CSF中存在至少3种主要的NfL截短种类，并且这些在AD中不同程度地增加。进一步地，脑NfL是全长的，伴随新近鉴定的c末端片段。主要的CSF NfL种类具有与彼此及其它AD测量的不同关系。这指示了NfL截短的种类在NfL生物学和神经退行性变方面可以是差异性地分泌的，并且其中一些作为生物标记物可能比其它更相关。来自NfL螺旋1结构域的NfL肽水平彼此相关联，并且表现略为不同于由螺旋2和C-ter区域测量的肽。在有症状的AD CSF中发现了NfL肽324和530的显著增加，支持了这些结构域作为生物标记物可能是更相关的。在NfL324和NfL免疫测定之间观察到较高的相关性，与AD以及关于NfL325的对照(1.5x)和ELISA测定(1.4x)之间相似的倍数增加组合，提示了通过该Uman专有测定使用的抗体很可能被选择为靶向这些最佳表现的NfL同种型。与CDR、年龄、以及磷酸化和总tau存在适度的相关性，而淀粉样蛋白PET和MMSE的测量具有低相关性。

实施例8

在该实施例中，分析了来自从对照、ALS和SMA人受试者中获得的CSF样品的Nfl同种型。利用所述的相同方法，就NfL种类差异分析了来自偶发性肌萎缩侧索硬化(ALS，n＝12)、家族性ALS(n＝6)、脊髓性肌萎缩(SMA，n＝10)患者和正常神经对照的CSF样品。简言之，将0.5ng 15N13C内部标准NfL添加到0.5ml CSF中，然后为用抗体HJ30.13、HJ30.4和HJ30.11的1：1：1混合物的免疫沉淀。通过LC-MS/MS分析处理的样品，以定量在图57-63中所示的每个区域处的NfL种类的量。这些发现揭示了，偶发性和家族性ALS有症状病例中的增加多于无症状病例、SMA或对照。NfL种类的增加量与如通过ALS FRS量表(如按每月的下降测量的)测量的下降速率高度相关联。NfL种类的ALS谱显示了从氨基酸位置37直到352的量增加，然后为从437到539(c末端肽)的再次增加。然而，谱对于具有较不显著的c端肽量和其它区域的对照是不同的。最后，SMA谱显示了非常少的中结构域区域，而来自339-461的区域是相对增加的。这指示了对于每种疾病状态可能存在特异性的谱，其可以进行定量并用于差别诊断。

序列表

<110> Washington University

BATEMAN, Randall

HOLTZMAN, David

BUDELIER, Melissa

JIANG, Hong

<120> 用于检测血浆和脑脊液中的神经丝轻链的方法

<130> 047563-716468

<150> 63/197,826

<151> 2021-06-21

<150> 63/183,417

<151> 2021-05-03

<150> 63/147,833

<151> 2021-02-10

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 543

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Ser Ser Phe Ser Tyr Glu Pro Tyr Tyr Ser Thr Ser Tyr Lys Arg

1 5 10 15

Arg Tyr Val Glu Thr Pro Arg Val His Ile Ser Ser Val Arg Ser Gly

20 25 30

Tyr Ser Thr Ala Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Tyr Ser Ala Pro Val Ser

35 40 45

Ser Ser Leu Ser Val Arg Arg Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Gly Ser Leu

50 55 60

Met Pro Ser Leu Glu Asn Leu Asp Leu Ser Gln Val Ala Ala Ile Ser

65 70 75 80

Asn Asp Leu Lys Ser Ile Arg Thr Gln Glu Lys Ala Gln Leu Gln Asp

85 90 95

Leu Asn Asp Arg Phe Ala Ser Phe Ile Glu Arg Val His Glu Leu Glu

100 105 110

Gln Gln Asn Lys Val Leu Glu Ala Glu Leu Leu Val Leu Arg Gln Lys

115 120 125

His Ser Glu Pro Ser Arg Phe Arg Ala Leu Tyr Glu Gln Glu Ile Arg

130 135 140

Asp Leu Arg Leu Ala Ala Glu Asp Ala Thr Asn Glu Lys Gln Ala Leu

145 150 155 160

Gln Gly Glu Arg Glu Gly Leu Glu Glu Thr Leu Arg Asn Leu Gln Ala

165 170 175

Arg Tyr Glu Glu Glu Val Leu Ser Arg Glu Asp Ala Glu Gly Arg Leu

180 185 190

Met Glu Ala Arg Lys Gly Ala Asp Glu Ala Ala Leu Ala Arg Ala Glu

195 200 205

Leu Glu Lys Arg Ile Asp Ser Leu Met Asp Glu Ile Ser Phe Leu Lys

210 215 220

Lys Val His Glu Glu Glu Ile Ala Glu Leu Gln Ala Gln Ile Gln Tyr

225 230 235 240

Ala Gln Ile Ser Val Glu Met Asp Val Thr Lys Pro Asp Leu Ser Ala

245 250 255

Ala Leu Lys Asp Ile Arg Ala Gln Tyr Glu Lys Leu Ala Ala Lys Asn

260 265 270

Met Gln Asn Ala Glu Glu Trp Phe Lys Ser Arg Phe Thr Val Leu Thr

275 280 285

Glu Ser Ala Ala Lys Asn Thr Asp Ala Val Arg Ala Ala Lys Asp Glu

290 295 300

Val Ser Glu Ser Arg Arg Leu Leu Lys Ala Lys Thr Leu Glu Ile Glu

305 310 315 320

Ala Cys Arg Gly Met Asn Glu Ala Leu Glu Lys Gln Leu Gln Glu Leu

325 330 335

Glu Asp Lys Gln Asn Ala Asp Ile Ser Ala Met Gln Asp Thr Ile Asn

340 345 350

Lys Leu Glu Asn Glu Leu Arg Thr Thr Lys Ser Glu Met Ala Arg Tyr

355 360 365

Leu Lys Glu Tyr Gln Asp Leu Leu Asn Val Lys Met Ala Leu Asp Ile

370 375 380

Glu Ile Ala Ala Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Thr Arg Leu

385 390 395 400

Ser Phe Thr Ser Val Gly Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Ser Gln Ser Ser

405 410 415

Gln Val Phe Gly Arg Ser Ala Tyr Gly Gly Leu Gln Thr Ser Ser Tyr

420 425 430

Leu Met Ser Thr Arg Ser Phe Pro Ser Tyr Tyr Thr Ser His Val Gln

435 440 445

Glu Glu Gln Ile Glu Val Glu Glu Thr Ile Glu Ala Ala Lys Ala Glu

450 455 460

Glu Ala Lys Asp Glu Pro Pro Ser Glu Gly Glu Ala Glu Glu Glu Glu

465 470 475 480

Lys Asp Lys Glu Glu Ala Glu Glu Glu Glu Ala Ala Glu Glu Glu Glu

485 490 495

Ala Ala Lys Glu Glu Ser Glu Glu Ala Lys Glu Glu Glu Glu Gly Gly

500 505 510

Glu Gly Glu Glu Gly Glu Glu Thr Lys Glu Ala Glu Glu Glu Glu Lys

515 520 525

Lys Val Glu Gly Ala Gly Glu Glu Gln Ala Ala Lys Lys Lys Asp

530 535 540

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

Tyr Val Glu Thr Pro Arg

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

Val His Ile Ser Ser Val Arg

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 4

Ser Ala Tyr Ser Ser Tyr Ser Ala Pro Val Ser Ser Ser Leu Ser Val

1 5 10 15

Arg

<210> 5

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Gly Ser Leu Met Pro Ser Leu Glu Asn Leu

1 5 10 15

Asp Leu Ser Gln Val Ala Ala Ile Ser Asn Asp Leu Lys

20 25

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 6

Ala Gln Leu Gln Asp Leu Asn Asp Arg

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

Phe Ala Ser Phe Ile Glu Arg

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

Val His Glu Leu Glu Gln Gln Asn Lys

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 9

Val Leu Glu Ala Glu Leu Leu Val Leu Arg

1 5 10

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 10

Ala Leu Tyr Glu Gln Glu Ile Arg

1 5

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 11

Leu Ala Ala Glu Asp Ala Thr Asn Glu Lys

1 5 10

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

Gln Ala Leu Gln Gly Glu Arg

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

Glu Gly Leu Glu Glu Thr Leu Arg

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 14

Tyr Glu Glu Glu Val Leu Ser Arg

1 5

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 15

Leu Met Glu Ala Arg

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 16

Gly Ala Asp Glu Ala Ala Leu Ala Arg

1 5

<210> 17

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 17

Ile Asp Ser Leu Met Asp Glu Ile Ser Phe Leu Lys

1 5 10

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 18

Phe Thr Val Leu Thr Glu Ser Ala Ala Lys

1 5 10

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 19

Gly Met Asn Glu Ala Leu Glu Lys

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 20

Gln Leu Gln Glu Leu Glu Asp Lys

1 5

<210> 21

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 21

Leu Glu Asn Glu Leu Arg

1 5

<210> 22

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 22

Leu Ser Phe Thr Ser Val Gly Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Ser Gln Ser

1 5 10 15

Ser Gln Val Phe Gly Arg

20

<210> 23

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 23

Ser Ala Tyr Gly Gly Leu Gln Thr Ser Ser Tyr Leu Met Ser Thr Arg

1 5 10 15

<210> 24

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 24

Ser Phe Pro Ser Tyr Tyr Thr Ser His Val Gln Glu Glu Gln Ile Glu

1 5 10 15

Val Glu Glu Thr Ile Glu Ala Ala Lys

20 25

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 25

Val Glu Gly Ala Gly Glu Glu Gln Ala Ala Lys

1 5 10

Claims

1.一种用于检测生物样品中的神经丝轻链(Nf1)的方法，所述方法包括

(a)提供选自血液样品或CSF样品的生物样品；

(b)富集所述生物样品中的一种至多种Nf1同种型；和

(c)检测步骤(b)中富集的一种至多种Nf1同种型。

2.权利要求1的方法，

其中步骤(b)包括

(i)使生物样品与特异性结合Nf1同种型的第一群体的第一表位结合剂接触，并分离Nf1同种型的第一群体，从而产生耗尽Nf1同种型的第一群体的样品；

(ii)使耗尽Nf1同种型的第一群体的样品与特异性结合Nf1同种型的第二群体的第二表位结合剂接触，并分离Nf1同种型的第二群体，从而产生耗尽Nf1同种型的第一群体和第二群体的样品；和

(iii)使耗尽Nf1同种型的第一群体和第二群体的样品与特异性结合Nf1同种型的第三群体的第三表位结合剂接触，并分离Nf1同种型的第三群体；

其中步骤(c)包括检测所述Nf1同种型的第一群体中的一种至多种Nf1同种型、所述Nf1同种型的第二群体中的一种至多种Nf1同种型、所述Nf1同种型的第三群体中的一种至多种Nf1同种型、或其任何组合。

3.权利要求2的方法，其中

所述第一表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸90至300内的第一表位；

所述第二表位结合剂特异性结合在第一表位下游在SEQ ID NO：1的氨基酸200至450内的第二表位；和

所述第三表位结合剂特异性结合在第二表位下游在SEQ ID NO：1的氨基酸397至543内的第三表位。

4.权利要求3的方法，其中

所述第一表位在SEQ ID NO：1的氨基酸90至250内，

所述第二表位在SEQ ID NO：1的氨基酸250至400内；

所述第三表位在SEQ ID NO：1的氨基酸397至543内；

或其任何组合。

5.权利要求2至4中任一项的方法，其中

所述第一表位结合剂是HJ30.1或其抗原结合片段，HJ30.2或其抗原结合片段，HJ30.13或其抗原结合片段，或者竞争性抑制HJ30.1、HJ30.2或HJ30.13与全长重组Nf1的结合的表位结合剂；

所述第二表位结合剂是HJ30.4或其抗原结合片段、HJ30.7或其抗原结合片段、或者竞争性抑制HJ30.4或HJ30.7与全长重组Nf1的结合的表位结合剂；

所述第三表位结合剂是HJ30.11、其抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.11与全长重组Nf1的结合的表位结合剂；

或其任何组合。

6.权利要求1的方法，

其中步骤(b)包括

(ii)使耗尽Nf1同种型的第一群体的样品与特异性结合Nf1同种型的第二群体的第二表位结合剂接触，并分离Nf1同种型的第二群体；

其中步骤(c)包括检测所述Nf1同种型的第一群体中的一种至多种Nf1同种型、所述Nf1同种型的第二群体中的一种至多种Nf1同种型、或其任何组合。

7.权利要求6的方法，其中

所述第一表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸90至450内的第一表位；

所述第二表位结合剂特异性结合在SEQ ID NO：1的氨基酸396至543内的表位。

8.权利要求7的方法，其中

所述第一表位在SEQ ID NO：1的氨基酸90至250内；和

且所述第二表位在SEQ ID NO：1的氨基酸396至543内。

9.权利要求8的方法，其中

所述第一表位结合剂是HJ30.1或其抗原结合片段，HJ30.2或其抗原结合片段，HJ30.13或其抗原结合片段，或者竞争性抑制HJ30.1、HJ30.2或HJ30.13与全长重组Nf1的结合的表位结合剂；和/或

所述第二表位结合剂是HJ30.11、其抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.11与全长重组Nf1的结合的表位结合剂。

10.权利要求7的方法，其中

所述第一表位在SEQ ID NO：1的氨基酸250至400内；和

所述第二表位在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内。

11.权利要求10的方法，其中

所述第一表位结合剂是HJ30.4或其抗原结合片段、HJ30.7或其抗原结合片段、或者竞争性抑制HJ30.4或HJ30.7与全长重组Nf1的结合的表位结合剂；和/或

12.权利要求1的方法，

其中步骤(b)包括使所述生物样品与特异性结合Nf1同种型的第一群体的表位结合剂接触，并分离Nf1同种型的第一群体；其中所述表位结合剂选自以下：

(i)与在SEQ ID NO：1的氨基酸90至250内、或在SEQ ID NO：1的氨基酸125至250内的表位特异性结合的表位结合剂；

(ii)与在SEQ ID NO：1的氨基酸116至184内的表位特异性结合的表位结合剂；

(iii)与在SEQ ID NO：1的氨基酸250至400内的表位特异性结合的表位结合剂；

(iv)与在SEQ ID NO：1的氨基酸283至338内的表位特异性结合的表位结合剂；

(v)与在SEQ ID NO：1的氨基酸400至543内的表位特异性结合的表位结合剂；

(vi)与在SEQ ID NO：1的氨基酸437至543内的表位特异性结合的表位结合剂；

(vii)HJ30.1或其抗原结合片段，HJ30.2或其抗原结合片段，HJ30.13或其抗原结合片段，或者竞争性抑制HJ30.1、HJ30.2或HJ30.13与全长重组Nf1的结合的表位结合剂；

(viii)HJ30.4或其抗原结合片段、HJ30.7或其抗原结合片段、或者竞争性抑制HJ30.4或HJ30.7与全长重组Nf1的结合的表位结合剂；和

(ix)HJ30.11、其抗原结合片段、或竞争性抑制HJ30.11与全长重组Nf1的结合的表位结合剂。

13.权利要求1的方法，其中步骤(b)包括富集长度为约350个氨基酸或更少、长度为约300个氨基酸或更少、长度为约250个氨基酸或更少、长度为约200个氨基酸或更少、长度为约150个氨基酸或更少、或者长度为约100个氨基酸或更少的Nf1同种型。

14.权利要求13的方法，其中步骤(b)包括富集长度为约100个氨基酸至约250个氨基酸的Nf1同种型

15.权利要求14的方法，其中步骤(b)包括富集长度为约106个氨基酸或更少的Nf1同种型。

16.权利要求1、13、14或1 5中任一项的方法，其中步骤(b)包括富集一种至多种Nf1同种型，所述Nf1同种型具有包含SEQ ID NO：1的氨基酸92至100、SEQ ID NO：1的氨基酸101至107、SEQ ID NO：1的氨基酸108至116、SEQ ID NO：1的氨基酸117至126、SEQ ID NO：1的氨基酸137至144、SEQ ID NO：1的氨基酸148至157、SEQ ID NO：1的氨基酸158至164、SEQ ID NO：1的氨基酸165至172、SEQ ID NO：1的氨基酸178至185、SEQ ID NO：1的氨基酸192至196、或SEQ ID NO：1的氨基酸198至206的氨基酸序列。

17.权利要求16的方法，其中步骤(b)包括富集一种至多种Nf1同种型，所述Nf1同种型具有包含SEQ ID NO：1的氨基酸165至172的氨基酸序列。

18.权利要求1、13、14或15中任一项的方法，其中步骤(b)包括富集一种至多种Nf1同种型，所述Nf1同种型具有包含SEQ ID NO：1的氨基酸283至293、SEQ ID NO：1的氨基酸324至331、SEQ ID NO：1的氨基酸332至339、或SEQ ID NO：1的氨基酸340至354的氨基酸序列。

19.权利要求1、13、14或15中任一项的方法，其中步骤(b)包括富集一种至多种Nf1同种型，所述Nf1同种型具有包含SEQ ID NO：1的氨基酸438至462或SEQ ID NO：1的氨基酸530至540的氨基酸序列。

20.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(b)富集包含N末端截短的Nf1同种型，其中关于每个Nf1同种型的N末端截短包含独立地选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：1的氨基酸1至90；

(b)SEQ ID NO：1的氨基酸1至92；

(c)SEQ ID NO：1的氨基酸1至124；

(d)SEQ ID NO：1的氨基酸1至135；

(e)SEQ ID NO：1的氨基酸1至137；

(f)SEQ ID NO：1的氨基酸1至146；

(g)SEQ ID NO：1的氨基酸1至162；

(h)SEQ ID NO：1的氨基酸1至222；

(i)SEQ ID NO：1的氨基酸1至223；

(j)SEQ ID NO：1的氨基酸1至234；

(k)SEQ ID NO：1的氨基酸1至252；

(l)SEQ ID NO：1的氨基酸1至271；

(m)SEQ ID NO：1的氨基酸1至281；

(n)SEQ ID NO：1的氨基酸1至323；

(o)SEQ ID NO：1的氨基酸1至339；

(p)SEQ ID NO：1的氨基酸1至359；

(q)SEQ ID NO：1的氨基酸1至396；

(r)SEQ ID NO：1的氨基酸1至399；

(s)SEQ ID NO：1的氨基酸1至420；

(t)SEQ ID NO：1的氨基酸1至436；或

(t)SEQ ID NO：1的氨基酸1至528。

21.权利要求20的方法，其中关于每个Nf1同种型的N末端截短包含SEQ ID NO：1的氨基酸1至396或SEQ ID NO：1的氨基酸1至437。

22.权利要求20或权利要求21的方法，其中步骤(b)富集单一同种型。

23.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(c)中的检测通过质谱法发生。

24.权利要求23的方法，其中所述方法在步骤(c)中进一步包括：

用蛋白酶切割富集的Nf1同种型，且然后任选地通过固相提取使所得的切割产物脱盐，以获得包含Nf1的蛋白酶解肽的样品；和

执行包含Nf1的蛋白酶解肽的样品的液相层析-质谱法(LC/MS)，以检测且任选地定量Nf1的至少一种蛋白酶解肽的量。

25.权利要求24的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。

26.权利要求25的方法，其中检测且任选地定量的Nf1的至少一种蛋白酶解肽包括具有选自以下的氨基酸序列的肽：(i)SEQ ID NO：1的氨基酸165至172，(ii)SEQ ID NO：1的氨基酸198至206，(iii)SEQ ID NO：1的氨基酸324至331，(iv)SEQ ID NO：1的氨基酸438至462，或(v)SEQ ID NO：1的氨基酸530至540。

27.权利要求25的方法，其中检测且任选地定量的Nf1的至少一种蛋白酶解肽包括具有选自以下的氨基酸序列的两种或更多种肽：(i)SEQ ID NO：1的氨基酸165至172，(ii)SEQID NO：1的氨基酸198至206，(iii)SEQ ID NO：1的氨基酸324至331，(iv)SEQ ID NO：1的氨基酸438至462，或(v)SEQ ID NO：1的氨基酸530至540。

28.权利要求25的方法，其中检测且任选地定量的Nf1的至少一种蛋白酶解肽包括具有选自以下的氨基酸序列的三种或更多种肽：(i)SEQ ID NO：1的氨基酸165至172，(ii)SEQID NO：1的氨基酸198至206，(iii)SEQ ID NO：1的氨基酸324至331，(iv)SEQ ID NO：1的氨基酸438至462，或(v)SEQ ID NO：1的氨基酸530至540。

29.权利要求1至22中任一项的方法，其中步骤(c)中的检测通过免疫测定或单分子阵列测试发生。

30.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括定量步骤(c)中检测到的一种至多种Nf1同种型。

31.一种检测从受试者中获得的样品中的生物标记物的方法，所述方法包括根据权利要求1至29中任一项的方法检测神经丝轻链，其中所述生物样品是从具有神经元损害或处于具有神经元损害的风险中的受试者中获得的样品，并且所述生物标记物是步骤(c)中检测的一种至多种Nf1同种型。

32.权利要求31的方法，其进一步包括定量所述一种至多种Nf1同种型。

33.权利要求30或32的方法，其中所述方法包括定量Nf1同种型的第一群体和第二群体，并且任选地其中所述生物标记物是所述两个群体的比率。

34.权利要求33的方法，其中

所述Nf1同种型的第一群体是权利要求2(i)中分离的Nf1同种型群体，并且所述Nf1同种型的第二群体是权利要求2(ii)中分离的Nf1同种型群体，任选地其中所述权利要求2(i)和权利要求2(ii)的同种型群体根据权利要求3、4、5或23-29产生；或

所述Nf1同种型的第一群体是权利要求2(i)中分离的Nf1同种型群体，并且所述Nf1同种型的第二群体是权利要求2(iii)中分离的Nf1同种型群体，任选地其中所述权利要求2(i)和权利要求2(iii)的同种型群体根据权利要求3、4、5或23-29产生；或

所述Nf1同种型的第一群体是权利要求2(ii)中分离的Nf1同种型群体，并且所述Nf1同种型的第二群体是权利要求2(iii)中分离的Nf1同种型群体，任选地其中所述权利要求2(ii)和权利要求2(iii)的同种型群体根据权利要求3、4、5或23-29产生。

35.权利要求30至32中任一项的方法，其进一步包括确定所述定量的生物标记物的量与其在以下中的水平相比是否减少：认知正常的对照受试者、认知正常且淀粉样蛋白阴性的对照受试者、或认知正常且如通过PET评估的对于脑中的tau沉积物的病理水平阴性的对照受试者。

36.权利要求35的方法，其中当所述定量的生物标记物的量显著偏离对照受试者中的平均值时，所述受试者被诊断为患有神经退行性疾病或外伤性脑损伤。

37.权利要求31至34中任一项的方法，所述方法进一步包括治疗所述受试者。

38.一种测量具有神经元损害或处于具有神经元损害的风险中的受试者中的治疗应答的方法，所述方法包括

(a)根据权利要求31至36中任一项，在从所述受试者中获得的第一生物样品中定量生物标记物；

(b)向所述受试者施用治疗；和

(c)在治疗后从所述受试者中获得的第二生物样品中，定量步骤(a)中定量的生物标记物；

其中所述第一生物样品和第二生物样品均为血液样品或均为CSF样品；和

其中与所述第一样品相比，在所述第二样品中的生物标记物的量没有变化或降低指示了阳性治疗应答，或者其中与所述第一样品相比，生物标记物的量在所述第二样品中增加，但变化小于在具有神经元损伤但并未施用治疗的受试者的对照组中发生的变化。

39.一种监测具有神经元损害或处于具有神经元损害的风险中的受试者的方法，所述方法包括根据权利要求31至35中任一项，定量从所述受试者中获得的第一生物样品和从所述受试者中获得的第二生物样品中的生物标记物，其中所述第一生物样品和第二生物样品均为血液样品或均为CSF样品，并且其中所述第二生物样品在所述第一生物样品后获得；

其中与所述第一样品相比，在所述第二样品中的生物标记物的量的增加指示了神经元损害的增加。

40.权利要求31至39中任一项的方法，其中所述受试者患有神经退行性疾病或处于患有神经退行性疾病的风险中。

41.权利要求31至39中任一项的方法，其中所述受试者患有外伤性脑损伤或处于患有外伤性脑损伤的风险中。

42.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)表位结合剂，其选自HJ30.1、HJ30.1的人源化形式、或竞争性抑制HJ30.1与全长重组Nf1的结合的表位结合剂。

43.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)表位结合剂，其选自HJ30.2、HJ30.2的人源化形式、或竞争性抑制HJ30.2与全长重组Nf1的结合的表位结合剂。

44.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)表位结合剂，其选自HJ30.4、HJ30.4的人源化形式、或竞争性抑制HJ30.7与全长重组Nf1的结合的表位结合剂。

45.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)表位结合剂，其选自HJ30.7、HJ30.7的人源化形式、或竞争性抑制HJ30.7与全长重组Nf1的结合的表位结合剂。

46.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)表位结合剂，其选自HJ30.11、HJ30.11的人源化形式、或竞争性抑制HJ30.11与全长重组Nf1的结合的表位结合剂。

47.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)表位结合剂，其选自HJ30.13、HJ30.13的人源化形式、或竞争性抑制HJ30.13与全长重组Nf1的结合的表位结合剂。

48.一种分离的抗体，其通过保藏于美国典型培养物保藏中心具有ATCC名称PTA-126966的杂交瘤产生。

49.一种分离的抗体，其通过保藏于美国典型培养物保藏中心具有ATCC名称PTA-126967的杂交瘤产生。

50.一种分离的抗体，其通过保藏于美国典型培养物保藏中心具有ATCC名称PTA-126968的杂交瘤产生。

51.一种分离的抗体，其通过保藏于美国典型培养物保藏中心具有ATCC名称PTA-126969的杂交瘤产生。

52.一种分离的抗体，其通过保藏于美国典型培养物保藏中心具有ATCC名称PTA-126970的杂交瘤产生。

53.一种分离的抗体，其通过保藏于美国典型培养物保藏中心具有ATCC名称PTA-126971的杂交瘤产生。

54.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)，其包含(a)HJ30.1(ATCC#PTA-126966)的轻链可变区、和/或(b)HJ30.1(ATCC#PTA-126966)的重链可变区。

55.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)，其包含(a)HJ30.2(ATCC#PTA-126967)的轻链可变区、和/或(b)HJ30.2(ATCC#PTA-126967)的重链可变区。

56.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)，其包含(a)HJ30.4(ATCC#PTA-126968)的轻链可变区、和/或(b)HJ30.4(ATCC#PTA-126968)的重链可变区。

57.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)，其包含(a)HJ30.7(ATCC#PTA-126969)的轻链可变区、和/或(b)HJ30.7(ATCC#PTA-126969)的重链可变区。

58.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)，其包含(a)HJ30.11(ATCC#PTA-126970)的轻链可变区、和/或(b)HJ30.11(ATCC#PTA-126970)的重链可变区。

59.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)，其包含(a)HJ30.13(ATCC#PTA-126971)的轻链可变区、和/或(b)HJ30.13(ATCC#PTA-126971)的重链可变区。

60.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)，其包含(a)与HJ30.1(ATCC#PTA-126966)的VL具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的轻链可变区，和/或(b)与HJ30.1(ATCC#PTA-126966)的VH具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的重链可变区。

61.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)，其包含(a)与HJ30.2(ATCC#PTA-126967)的VL具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的轻链可变区，和/或(b)与HJ30.2(ATCC#PTA-126967)的VH具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的重链可变区。

62.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)，其包含(a)与HJ30.4(ATCC#PTA-126968)的VL具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的轻链可变区，和/或(b)与HJ30.4(ATCC#PTA-126968)的VH具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的重链可变区。

63.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)，其包含(a)与HJ30.7(ATCC#PTA-126969)的VL具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的轻链可变区，和/或(b)与HJ30.7(ATCC#PTA-126969)的VH具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的重链可变区。

64.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)，其包含(a)与HJ30.11(ATCC#PTA-126970)的VL具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的轻链可变区，和/或(b)与HJ30.11(ATCC#PTA-126970)的VH具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的重链可变区。

65.一种分离的抗神经丝轻链(Nf1)，其包含(a)与HJ30.13(ATCC#PTA-126971)的VL具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的轻链可变区，和/或(b)与HJ30.13(ATCC#PTA-126971)的VH具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的重链可变区。

66.权利要求42至65中任一项的表位结合剂检测和/或定量生物样品中的Nf1的用途。

67.根据权利要求66的表位结合剂的用途，其中所述生物样品是血液样品或脑脊液样品。

68.根据权利要求42或65的表位结合剂的用途，其中所述表位结合剂附接可检测标记。