JP7128182B2 - 補体関連障害におけるC5b-9沈着に関するアッセイ - Google Patents
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Description
本出願は、2016年10月27日に出願された米国仮出願第62/413,614号の優先権を主張する。前述の出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
以前の研究では、C5b-9沈着を手動検出する試験について説明した(Noris et al.,Blood 2014;124:1715-26)。しかしながら、この試験は煩雑で時間がかかり、長い経験年数を持つ専門家の博士号の科学者または技術者によって、高度な試験研究環境でのみ実施できる。aHUSは慢性疾患であり、患者はエクリズマブおよび他の療法の有効性をモニタリングし、また患者の生涯にわたって内皮レベルで補体活性をモニタリングするのみならず、治療が間隔を置いているかまたは中断されるものであれば疾患の再発を予測するために反復検査がしばしば必要であるということを考慮すると、対費用効果が高く、再現性があり、効果的であり、精密であり、正確であり、また高度でない研究環境において容易に行うことができる(例えば、適切なトレーニングを受けた技術者によって)ような信頼できる検査が未だ要望されている。これにより、コストが著しく低減され、大掛かりな移動を必要とすることなく、患者がより迅速に結果を得ることができるようになるという重要な利点が提供される。このような検査はまた、外部委託を可能にし、分析時間を短縮し、それによって検査を診断に適切なものとし、治療のモニタリングおよび調整を行うことができる。本明細書に記載される方法は、未だ対処されていないこれらの要望に対処するものである。
(a)補体関連障害であるか、または、該障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、疾患関連細胞と生体外で接触させることと、
(b)該細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(c)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含む方法が、本明細書で提供される。
(a)患者から得られた生体試料を、C5の阻害剤がある状態および該阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(c)該細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(d)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含み、
阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではC5b-9沈着が少ないということが、患者が阻害剤での治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法が、本明細書で提供される。
(a)患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(b)該細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(c)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化すること、
(d)阻害剤で治療している患者からの生体試料でのC5b-9沈着が、コントロール試料でのC5b-9沈着と比較してより大きい場合、患者に投与する阻害剤の用量を増加させることとを含む方法が、本明細書で提供される。
特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも一つの図面を含む。カラー図面を伴う本特許または特許出願公開公報の写しは、請求および必要な料金の支払いにより米国特許庁によって提供されることとなる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
補体C5b-9沈着を測定する方法であって、
(a)補体関連障害であるか、または、前記障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、疾患関連細胞と生体外で接触させることと、
(b)前記細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(c)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含む、方法。
(項目2)
補体関連障害を有する患者がC5の阻害剤での治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、前記方法が、
(a)前記患者から得られた生体試料を、C5の阻害剤がある状態および前記阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの前記生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(c)前記細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(d)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含み、
前記阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、前記阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではC5b-9沈着がより少ないということが、前記患者が前記阻害剤での治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
(項目3)
補体関連障害を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、前記方法が、
(a)前記患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの前記生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(c)前記細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(d)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではC5b-9沈着がより少ないということが、前記患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
(項目4)
非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いかどうかを判断するための方法であって、前記方法が、
(a)前記患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの前記生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(c)前記細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(d)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではC5b-9沈着がより少ないということが、前記患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
(項目5)
補体関連障害を有し、C5の阻害剤で治療されている患者をモニタリングする方法であって、前記方法が、
(a)前記患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(b)前記細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(c)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、
(d)前記阻害剤で治療されている前記患者からの前記生体試料でのC5b-9沈着が、前記コントロール試料でのC5b-9沈着と比較してより多い場合、前記患者に投与する前記阻害剤の用量を増加させることとを含む、方法。
(項目6)
増加させた用量の前記阻害剤を前記患者に投与する場合、工程(a)から(c)を繰り返して、前記増加させた用量が前記細胞におけるC5b-9沈着レベルを正規化するのに十分であるかどうかを判断する、項目5に記載の方法。
(項目7)
項目1から4のいずれか一項に記載の方法に従ってC5の阻害剤またはエクリズマブに対して応答性であると判断された患者において補体関連障害を治療する方法であって、前記方法は、治療有効量の前記阻害剤またはエクリズマブを前記患者に投与することを含む、方法。
(項目8)
前記C5の前記阻害剤は、エクリズマブなどの抗体である、項目2、5または6に記載の方法。
(項目9)
前記細胞が、マイクロプレートなどの固体プラットフォーム上で培養される、項目1から8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記固体プラットフォームが、96ウェルマイクロプレートである、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記疾患関連細胞は、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記疾患関連細胞は、皮膚起源由来のヒト微小血管内皮細胞、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、包皮の内皮細胞、および肝臓腺癌由来の内皮細胞からなる群から選択される内皮細胞である、項目11記載の方法。
(項目13)
前記細胞は、ウェル当たり約5,000~約6,000細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養される、項目1から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記細胞は、ウェル当たり約10,000~約12,500細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養される、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記細胞は、ウェル当たり約15,000細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養される、項目1から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
細胞は、前記生体試料と接触させられる前にコンフルエントである、項目1から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記生体試料が血清である、項目1から16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記血清は、aHUSの患者、寛解の患者またはエクリズマブ未感作患者由来のものである、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記細胞は、アデノシン5’-二リン酸、トロンビン、またはリポ多糖で活性化される、項目1から18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記細胞は、約1.5時間~約4時間、前記生体試料と接触させられる、項目1から19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記細胞は、前記接触させる工程の後であるが、前記評価する工程の前に、パラホルムアルデヒドなどの固定液と共にインキュベートされる、項目1から20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
C5b-9沈着のレベルは、抗C5b-9抗体を使用して評価される、項目1から21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記抗C5b-9抗体は、色素などの検出可能な標識を含む二次抗体で検出される、項目20記載の方法。
(項目24)
C5b-9沈着のレベルは、On-cell Westernアッセイを使用して評価される、項目1から23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記抗C5b-9抗体が二次抗体で検出された後で、前記細胞を透過処理する、項目23に記載の方法。
(項目26)
前記抗C5b-9抗体が二次抗体で検出される前に、前記細胞を透過処理する、項目23に記載の方法。
(項目27)
透過処理の後、DNAを染色する薬剤などである、核に蓄積する薬剤と共に前記細胞をインキュベートする、項目25または26に記載の方法。
(項目28)
前記薬剤が、CellTag 700 Stain、DAPI、アクリジンオレンジ、Hoechst 33342 Dye、Hoechst 33258、SYTOX Green nucleic acid stain、およびVybrant DyeCycle stainからなる群から選択される、項目27に記載の方法。
(項目29)
一つ以上の工程が自動化されている、項目1から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記患者は、非典型溶血性尿毒症症候群、STEC-HUS、糖尿病、ループス腎炎、血管炎、または慢性の同種移植片拒絶反応を有する、項目1から3、5から17、および、19から29のいずれか一項に記載の方法。
本明細書がより簡単に理解できるように、以下の定義が提供される。
補体系は、体の他の免疫系と共に作用することで、細胞病原体およびウイルス病原体の侵入に対して防御する。少なくとも25個の補体タンパク質があり、これは血漿タンパク質および膜因子の複合集合(complex collection)として見出される。血漿タンパク質は、脊椎動物血清中のグロブリンの約10%を占める。補体成分は、複雑だが正確な一連の酵素的切断および膜結合イベントにおいて相互作用することにより、それらの免疫防御機能を達成する。その結果である補体カスケードが、オプソニン作用、免疫調節作用および溶解作用を有する産物の産生を導く。補体活性化に関連付けられた生物学的活性の簡潔な要約が、例えば、The Merck Manual,16th Editionで提供される。
本明細書において、細胞(例えば、内皮細胞)上のC5b-9の沈着を検出するための新しい生体外アッセイを提供する。こうしたアッセイは、抗C5抗体療法に反応するであろう、補体関連障害であるかまたは該障害であることが疑われる患者を特定するために特に有用である(例えば、このような患者からの生体試料について細胞におけるC5b-9沈着を促進する能力を試験することによって)。かかるアッセイはまた、例えばC5の候補阻害剤などの補体副経路の候補阻害剤をスクリーニングするためにも有用である。
(a)補体関連障害であるか、または、該障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、関心の特定の障害に関連する細胞型と生体外で接触させることと、
(b)細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(c)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含む。
本明細書においては、補体関連障害を有する患者がC5の阻害剤での治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、
(a)患者から得られた生体試料を、C5の阻害剤がある状態および阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(c)細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(d)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含み、
阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではC5b-9沈着が少ないということが、患者が阻害剤での治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法が、本明細書で提供される。
(a)患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(c)細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(d)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではC5b-9沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法が、本明細書で提供される。
(a)患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(c)細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(d)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではC5b-9沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法が、本明細書で提供される。
(a)患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(b)細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(c)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、
(d)阻害剤で治療している患者からの生体試料でのC5b-9沈着が、コントロール試料でのC5b-9沈着と比較してより大きい場合、患者に投与する阻害剤の用量を増加させることとを含む方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、工程(d)の結果に基づいて、増加した用量の阻害剤を患者に投与する場合、工程(a)から(c)を繰り返して、増加した用量が細胞におけるC5b-9沈着レベルを正規化するのに十分であるかどうかを判断する。これら工程は、C5b-9沈着のレベルを正規化するのに十分な投薬量が決定されるまで繰り返すことができる。正規化された、細胞におけるC5b-9沈着のレベルは、コントロール試料で観察されたC5b-9沈着に対して本質的に類似したC5b-9沈着のレベルに関する。一部の実施形態では、コントロール試料のレベルに相対的な正規化されたレベルが、コントロールのレベルよりも低いC5b-9のレベルを示しうるか、または、高い場合、コントロールのレベルよりも約1~20%高く、例えば約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、または約20%高いレベルを示しうる。
(a)補体関連障害を有することがわかっている患者からの生体試料を、候補阻害剤がある状態および候補阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(c)細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(d)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含み、
阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、候補阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではC5b-9沈着が少ないということが、候補阻害剤が抗C5活性を有するということを示唆する。こうした方法は、例えば既知の検証された阻害活性を有するC5の阻害剤である、陽性コントロールと並行して実施することができる。
本明細書に記載される方法で使用するためのヒト補体成分C5の適切な阻害剤(「C5の阻害剤」)には、任意の阻害剤がC5b-9の生成および/またはC5の活性に結合またはそうでなければ阻害する任意の分子である任意の阻害剤を含むことが可能である。例えば、「C5の阻害剤」は、以下を阻害する任意の薬剤とすることができる:(i)補体成分C5タンパク質の発現、もしくは、ある細胞によるタンパク質の適切な細胞内輸送もしくは分泌;(ii)C5切断断片C5aもしくはC5bの活性(例えば、C5aのその同族細胞受容体への結合、またはC5bのC6および/もしくは終末補体複合体のその他の成分への結合、上記参照);(iii)C5aおよびC5bを形成するヒトC5タンパク質の切断;(iv)ある細胞による、補体成分C5タンパク質の適切な細胞内輸送もしくは分泌;または(v)C5タンパク質もしくはC5タンパク質をコードするmRNAの安定性。補体成分C5タンパク質発現の阻害には、ヒトC5タンパク質をコードする遺伝子の転写の阻害;ヒトC5タンパク質をコードするmRNAの分解の増加;ヒトC5タンパク質をコードするmRNAの翻訳の阻害;ヒトC5タンパク質の分解の増加;プレプロヒトC5タンパク質の適切なプロセシングの阻害;またはヒトC5タンパク質の細胞による適切な輸送もしくは分泌の阻害が含まれる。候補薬剤がヒト補体成分C5の阻害剤であるかどうかを判断する方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。C3転換酵素および/もしくはC5転換酵素の減衰を形成または誘導を防止する任意の補体阻害剤を、本明細書に記載の方法を使用してスクリーニングすることができる。
本明細書においては、本明細書に記載する方法を実行するための構成要素および使用説明書を含むキットも提供される。したがって、一部の実施形態では、このキットは、関心の補体関連障害または補体関連疾患に関連する細胞と、抗C5b-9抗体と、検出可能部分を含む二次抗体などの抗C5b-9抗体を検出するための手段とを含む。こうしたキットは、緩衝液、安定剤、基質、免疫検出試薬(一次および二次抗体)、および/または方法を実施するために必要な補因子など、少なくとも一つの追加的試薬を含みうる。一部の実施形態では、キットは、患者から生体試料を収集するための手段を含む。こうした手段は、例えば、患者から流体または組織試料を得るために使用できる試薬または容器を含むことができる。キットはまた、例えば、市販の自動化されたプラットフォーム(例えば、LI-COR Odyssey CLXプラットフォーム)と併せてこの方法を使用する方法に関する指針を提供することによって、アッセイを自動化するための説明書を含みうる。
1.補体C5b-9沈着を測定する方法であって、
(a)補体関連障害であるか、または、該障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、疾患関連細胞と生体外で接触させることと、
(b)細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(c)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含む方法。
2.補体関連障害を有する患者がC5の阻害剤での治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、方法が、
(a)患者から得られた生体試料を、C5の阻害剤がある状態および阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(c)細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(d)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含み、
阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではC5b-9沈着が少ないということが、患者が阻害剤での治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
3.補体関連障害を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、方法が、
(a)患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(c)細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(d)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではC5b-9沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
4.非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いかどうかを判断するための方法であって、方法が、
(a)患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(c)細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(d)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではC5b-9沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
5.補体関連障害を有し、C5の阻害剤で治療している患者をモニタリングする方法であって、方法が、
(a)患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(b)細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(c)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、
(d)阻害剤で治療している患者からの生体試料でのC5b-9沈着が、コントロール試料でのC5b-9沈着と比較してより大きい場合、患者に投与する阻害剤の用量を増加させることとを含む方法。
6.増加した用量の阻害剤を患者に投与する場合、工程(a)から(c)を繰り返して、増加した用量が細胞におけるC5b-9沈着レベルを正規化するのに十分であるかどうかを判断する、実施形態5に記載の方法。
7.実施形態1から4のいずれか一つに記載の方法に従ってC5の阻害剤またはエクリズマブに反応すると判断された患者において補体関連障害を治療する方法であって、方法は、治療有効量の阻害剤またはエクリズマブを患者に投与することを含む方法。
8.C5の阻害剤は、エクリズマブなどの抗体である、実施形態2、5または6に記載の方法。
9.細胞がマイクロプレートなどの固体プラットフォーム上で培養される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
10.固体プラットフォームが96ウェルマイクロプレートである、実施形態9に記載の方法。
11.疾患関連細胞は、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
12.疾患関連細胞は、皮膚由来のヒト微小血管内皮細胞、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、包皮の内皮細胞、および肝臓腺癌由来の内皮細胞からなる群から選択される内皮細胞である、実施形態11に記載の方法。
13.細胞は、ウェル当たり約5,000~約6,000細胞の密度で蒔いて、コンフルエントまで培養される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
14.細胞は、ウェル当たり約10,000細胞~約12,500細胞の密度で蒔いて、コンフルエントまで培養される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
15.細胞は、ウェル当たり約15,000細胞の密度で蒔いて、コンフルエントまで培養される、実施形態1から12のいずれか一つに記載の方法。
16.細胞は、生体試料と接触させる前にコンフルエントである、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
17.生体試料が血清である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
18.血清は、aHUSの患者、寛解の患者またはエクリズマブ未感作患者からのものである、実施形態17に記載の方法。
19.細胞は、アデノシン5’-二リン酸、トロンビン、またはリポ多糖で活性化される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
20.細胞は、約1.5時間~約4時間生体試料と接触させる、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
21.細胞は、接触させる工程の後であるが評価する工程の前に、パラホルムアルデヒドなどの固定液でインキュベートされる、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
22.C5b-9沈着のレベルは、抗C5b-9抗体を使用して評価される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
23.抗C5b-9抗体は、染料などの検出可能な標識を含む二次抗体で検出される、実施形態20に記載の方法。
24.C5b-9沈着のレベルは、On-cell Westernアッセイを使用して評価される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
25.抗C5b-9抗体が二次抗体で検出された後で、細胞を透過処理する、実施形態23に記載の方法。
26.抗C5b-9抗体が二次抗体で検出される前に、細胞を透過処理する、実施形態23に記載の方法。
27.透過処理の後、DNAを染色する薬剤などである、核に蓄積する薬剤と共に細胞をインキュベートする、実施形態25または26に記載の方法。
28.薬剤が、CellTag 700 Stain染色試薬、DAPI、アクリジンオレンジ、Hoechst 33342 Dye染料、Hoechst 33258、SYTOX緑色核酸染色試薬、およびVybrant DyeCycle染色試薬からなる群から選択される、実施形態27記載の方法。
29.一つ以上の工程が自動化されている、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
30.患者は非典型溶血性尿毒症症候群、STEC-HUS、糖尿病、ループス腎炎、血管炎、または慢性の同種移植片拒絶反応を有する、実施形態1から3、5から17、および、19から29のいずれか一つに記載の方法。
31.補体C5b-9沈着を測定する方法であって、
(a)補体関連障害であるか、または、該障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、疾患関連細胞と生体外で接触させることと、
(b)細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(c)細胞におけるC5b-9レベルの評価前または評価後に細胞を透過処理することと、
(c)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含む、方法。
32.補体関連障害を有する患者がC5の阻害剤での治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、方法が、
(a)患者から得られた生体試料を、C5の阻害剤がある状態および阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(c)細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(d)細胞におけるC5b-9レベルの評価前または評価後に細胞を透過処理することと、
(e)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含む方法であって、
阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではC5b-9沈着が少ないということが、患者が阻害剤での治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
33.補体関連障害を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、方法が、
(a)患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(c)細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(d)細胞におけるC5b-9レベルの評価前または評価後に細胞を透過処理することと、
(e)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含む方法であって、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではC5b-9沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
34.非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いかどうかを判断するための方法であって、方法が、
(a)患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(c)細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(d)細胞におけるC5b-9レベルの評価前または評価後に細胞を透過処理することと、
(e)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含む方法であって、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではC5b-9沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
35.補体関連障害を有し、C5の阻害剤で治療している患者をモニタリングする方法であって、方法が、
(a)患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
(b)細胞におけるC5b-9沈着レベルを評価することと、
(c)細胞におけるC5b-9レベルの評価前または評価後に細胞を透過処理することと、
(d)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含み、
(e)阻害剤で治療している患者からの生体試料でのC5b-9沈着が、コントロール試料でのC5b-9沈着と比較してより大きい場合、患者に投与する阻害剤の用量を増加させることとを含む方法。
以下に記述した実験を、内皮細胞におけるC5b-9沈着を検出するためのアッセイを自動化する目的で行った。
この実験では、細胞数および生存率におけるADPまたはトロンビンを用いたHMEC-1細胞の活性化の効果が評価された。5,000個のHMEC-1細胞を96ウェルマイクロプレート上に播種し、96時間培養した(増殖培地で72時間、および血清なしの培地で最後の24時間)。HMEC-1細胞単層を、試験培地(HBSS:137mmol/lのNaCl、5.4mmol/lのKCl、0.7mmol/lのNa2HPO4、0.73mmol/l KH2PO4、1.9mmol/lのCaCl2、0.8mmol/lのMgSO4、28mmol/lのトリス塩基(Trizma base)pH7.3、0.1%デキストロース;0.5%BSA添加)で三回洗浄し、その後10分間試験培地中で10μMのADP(シグマアルドリッチ社)を用いて活性化(ADP活性化細胞)、もしくはトロンビン(2U/ml、10分)を用いて活性化するか、 または試験培地単独でインキュベートした(細胞の静止)。ADPまたはトロンビンで予め活性化された休止細胞または細胞を、50%のコントロール血清(HBSS中、75μL最終量)で4時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、接着細胞数および生存率を、生/死細胞生存率アッセイを用いて評価した。
上記の実施例で決定された最適な培養条件を使用して、プラットフォームがHMEC-1細胞におけるC5b-9沈着の新しい自動化アッセイを開発するために使用できるか否かを評価する目的で、Odyssey CLXスキャナーを使用してパイロット試験を行った。
・ プレート1:休止セル;培地、コントロール血清、aHUS 1急性、aHUS 1急性+sCR1、aHUS 2急性、二次抗体1/600、左側:作製したブロッキング緩衝液、右側:市販のOdysseyブロッキング緩衝液(図5A)。
・ プレート2:ADP活性化細胞:培地、コントロール血清、aHUS 1急性、aHUS 1急性+sCR1、aHUS 2急性、二次抗体1/600、左側:作製したブロッキング緩衝液、右側:市販のOdysseyブロッキング緩衝液(図5B)。
・ プレート3:休止セル;培地、コントロール血清、aHUS 1急性、aHUS 1急性+sCR1、aHUS 2急性、二次抗体1/1200、左側:作製したブロッキング緩衝液、右側:市販のOdysseyブロッキング緩衝液(図5C)。
・ プレート4:ADP活性化細胞:培地、コントロール血清、aHUS 1急性、aHUS 1急性+sCR1、aHUS 2急性、二次抗体1/1200、左側:作製したブロッキング緩衝液、右側:市販のOdysseyブロッキング緩衝液(図5D)。
本実施例は、aHUS患者(#3:エクリズマブ治療中のaHUS患者、#4:寛解状態で治療されていないaHUS患者、#5:エクリズマブ治療中のaHUS患者)および健康なコントロール(健康な対象20人からプールした血清)からの血清試料での、自動化したC5b-9沈着アッセイの使用について説明する。
この実施例では、自動化されたC5b-9沈着アッセイは、三人の追加のaHUS患者からの血清試料を使用して検証された。
当業者は、本明細書に開示される特定の実施形態の多くの均等物を通常の実験以外に使用することを認識し、または確認することができる。こうした均等物は、以下の請求項に包含されることが意図されている。
Claims (28)
- 補体C5b-9沈着を測定する方法であって、
(a)補体関連障害であるか、または、前記障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される細胞と生体外で接触させることと、
(b)前記細胞におけるC5b-9沈着レベルを測定することと、
(c)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含み、
工程(b)と(c)が自動化されている、方法。 - C5b-9沈着レベルを、補体関連障害を有する患者がC5の阻害剤での治療から利益を得るかどうかの指標とする方法であって、前記方法が、
(a)前記患者から得られた生体試料をC5の阻害剤がある状態でインキュベートし、そして、前記患者から得られた生体試料をC5の阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの前記生体試料を、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される細胞と生体外で接触させることと、
(c)前記細胞におけるC5b-9沈着レベルを測定することと、
(d)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含み、
工程(c)と(d)が自動化されており、前記阻害剤がない状態でインキュベートした試料と比較した、前記阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料でのC5b-9沈着の減少が、前記患者が前記阻害剤での治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。 - C5b-9沈着レベルを、補体関連障害を有する患者がエクリズマブまたはALXN1210での治療から利益を得るかどうかの指標とする方法であって、前記方法が、
(a)前記患者から得られた生体試料をエクリズマブまたはALXN1210がある状態でインキュベートし、そして、前記患者から得られた生体試料をエクリズマブまたはALXN1210がない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの前記生体試料を、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される細胞と生体外で接触させることと、
(c)前記細胞におけるC5b-9沈着レベルを測定することと、
(d)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含み、
工程(c)と(d)が自動化されており、エクリズマブまたはALXN1210がない状態でインキュベートした試料と比較した、エクリズマブまたはALXN1210がある状態でインキュベートした生体試料でのC5b-9沈着の減少が、前記患者がエクリズマブまたはALXN1210での治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。 - C5b-9沈着レベルを、非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)を有する患者がエクリズマブまたはALXN1210での治療から利益を得る可能性が高いかどうかの指標とする方法であって、前記方法が、
(a)前記患者から得られた生体試料をエクリズマブまたはALXN1210がある状態でインキュベートし、そして、前記患者から得られた生体試料をエクリズマブまたはALXN1210がない状態でインキュベートすることと、
(b)工程(a)からの前記生体試料を、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される細胞と生体外で接触させることと、
(c)前記細胞におけるC5b-9沈着レベルを測定することと、
(d)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと、を含み、
工程(c)と(d)が自動化されており、エクリズマブまたはALXN1210がない状態でインキュベートした試料と比較した、エクリズマブまたはALXN1210がある状態でインキュベートした生体試料でのC5b-9沈着の減少が、前記患者がエクリズマブまたはALXN1210での治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。 - C5b-9沈着レベルを、補体関連障害を有し、C5の阻害剤で治療されている患者をモニタリングするための指標とする方法であって、前記方法が、
(a)前記患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される細胞と生体外で接触させることと、
(b)前記細胞におけるC5b-9沈着レベルを測定することと、
(c)細胞数によってC5b-9沈着レベルを正規化することと
を含む方法であって、工程(b)と(c)が自動化されており、前記阻害剤で治療されている前記患者からの前記生体試料でのC5b-9沈着の、前記コントロール試料でのC5b-9沈着と比較した増加が、前記患者に投与する前記阻害剤の用量が増加させられ得ることを示す、方法。 - 増加させた用量の前記阻害剤を前記患者に投与する場合、工程(a)から(c)を繰り返して、前記増加させた用量が前記細胞におけるC5b-9沈着レベルを、前記コントロール試料のものと同レベルまたはそれより低くなるまで抑制するのに十分であるかどうかを判断する、請求項5に記載の方法。
- 前記C5の前記阻害剤は、エクリズマブまたはALXN1210などの抗体あるいはその抗原結合断片である、請求項2、5または6に記載の方法。
- 前記細胞が、固体プラットフォーム上で培養される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体プラットフォームが、96ウェルマイクロプレートである、請求項8に記載の方法。
- 前記細胞は、皮膚起源由来のヒト微小血管内皮細胞、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、包皮の内皮細胞、および肝臓腺癌由来の内皮細胞からなる群から選択される内皮細胞である、請求項1から9のいずれか一項記載の方法。
- 前記細胞は、ウェル当たり約5,000~約6,000細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養され、約には、指定された値から最大±10%の変化が包含される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、ウェル当たり約10,000~約12,500細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養され、約には、指定された値から最大±10%の変化が包含される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、ウェル当たり約15,000細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養され、約には、指定された値から最大±10%の変化が包含される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞は、前記生体試料と接触させられる前にコンフルエントである、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体試料が血清を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血清は、aHUSの患者、aHUSからの寛解の患者またはエクリズマブ未感作またはALXN1210未感作患者由来のものである、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞は、前記生体試料と接触させられる前に、アデノシン5’-二リン酸、トロンビン、またはリポ多糖で活性化される、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、約1.5時間~約4時間、前記生体試料と接触させられ、約には、指定された値から最大±10%の変化が包含される、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、前記接触させる工程の後であるが、前記測定する工程の前に、固定液と共にインキュベートされる、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
- C5b-9沈着のレベルは、抗C5b-9抗体を使用して測定される、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗C5b-9抗体は、検出可能な標識を含む二次抗体で検出される、請求項20に記載の方法。
- C5b-9沈着のレベルは、On-cell Westernアッセイを使用して測定される、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗C5b-9抗体が二次抗体で検出された後で、前記細胞を透過処理する、請求項21に記載の方法。
- 前記抗C5b-9抗体が二次抗体で検出される前に、前記細胞を透過処理する、請求項21に記載の方法。
- 透過処理の後、核に蓄積する薬剤と共に前記細胞をインキュベートする、請求項23または24に記載の方法。
- 前記薬剤が、CellTag 700 Stain、DAPI、アクリジンオレンジ、Hoechst 33342 Dye、Hoechst 33258、SYTOX Green nucleic acid stain、およびVybrant DyeCycle stainからなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
- 前記患者は、非典型溶血性尿毒症症候群、STEC-HUS、糖尿病、ループス腎炎、血管炎、または慢性の同種移植片拒絶反応を有する、請求項1から3、および、5から7のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項2から4のいずれか一項に記載の方法に従ってエクリズマブまたはALXN1210での治療から利益を得ると示唆された患者において補体関連障害を治療する方法において使用するための組成物であって、前記組成物は、エクリズマブもしくはALXN1210またはその抗原結合断片を含み、前記方法は、治療有効量のエクリズマブもしくはALXN1210またはその抗原結合断片を前記患者に投与することを含む、組成物。
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