KR20230154307A - 혈장 및 뇌척수액에서 신경필라멘트 경쇄를 검출하는 방법 - Google Patents

혈장 및 뇌척수액에서 신경필라멘트 경쇄를 검출하는 방법 Download PDF

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KR20230154307A
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랜들 베이트먼
멜리사 버들리어
데이비드 홀쯔먼
홍 지앙
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워싱턴 유니버시티
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Abstract

본 발명은 뇌 척수액 및 혈액에 존재하는 Nfl을 검출하고 선택적으로 정량화하는 방법, 및 신경 손상을 나타내는 Nfl 바이오마커의 수준을 검출하고 선택적으로 측정하는 방법의 용도를 제공한다. 또한 항-Nfl 항체들이 개시되어 있다.

Description

혈장 및 뇌척수액에서 신경섬유 경쇄를 검출하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 2월 10일에 출원된 미국 가출원 번호 63/147,833, 2021년 5월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 63/183,417, 및 2021년 6월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 63/197,826의 우선권을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
정부의 권리
본 발명은 국립보건원(National Institutes of Health)이 수여한 AG067559에 따라 정부 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정한 권리를 갖는다.
서열 목록의 참조
본 출원은 서열 목록을 포함하며, 이는 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 제출되었고 본 명세서에 전체가 참고로 포함된다. 2022년 1월 31일에 생성된 ASCII 사본의 파일명은 “716468_ST25.txt”이고 크기는 10,025바이트이다.
기술 분야
본 발명은 다양한 신경필라멘트 경쇄 종을 정량화하고 분석하는 방법 및 신경 손상을 측정하고, 신경퇴행성 질환의 진단을 알리고, 추가 진단 테스트를 위한 환자를 선택하고, 치료 결정을 안내하기 위한 이의 용도를 포함한다.
배경
신경필라멘트는 수초축삭의 신경 세포골격의 주요 구성요소이며 방사형 축삭 성장을 허용함으로써 신경 전도에 중요한 역할을 한다. 중추신경계에서 신경필라멘트는 다음 4가지 단백질로 구성된다: 신경필라멘트 중쇄(NfH), 신경필라멘트 중간 쇄(NfM), 신경필라멘트 경쇄(NfL) 및 알파-인터넥신. 이 4가지 단백질 중에서 NfL만이 신경 손상의 마커로 잘 확립되어 있다. 이는 알츠하이머병(AD), 전두측두엽 치매(FTD), 파킨슨병(PD), 진행성 핵상 마비(PSP), 외상성 뇌 손상(TBI), 다발성 경화증(MS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 및 기타 신경퇴행성 장애에서 상승된다. 이는 NfL에 대해 학습된 생물학 및 병태생리학이 다양한 신경퇴행성 질환에 유용하다는 것을 나타낸다.
현재, 상업적으로 이용가능한 한 쌍의 항-Nfl 항체만이 임상 코호트 및 시험들을 모니터링하는 데 활용된다(항-NF-L mAb 2:1 및 항-Nfl mAb 47:3, Umam). 상업적 분석법의 사용은 건강한 대조군과 신경퇴행성 질환을 구별하는 데 성공적이었지만, 바이오마커의 유용성은 현재 그 비특이적 특성으로 인해 제한된다. 여러 신경퇴행성 및 신경염증 과정에서 Nfl 상승으로 인한 “노이즈”는 Nfl을 질병 상태 및 치료 반응에 관한 신뢰성이 더 낮은 마커가 되게 하여, 치료 프로토콜에서 이의 임상적 유용성을 제한한다. Nfl은 다수의 번역 후 변형(PTM)을 거쳐 임의의 주어진 생물학적 샘플에서 다양한 Nfl 이소형이 발생할 가능성이 있지만, 상업적으로 이용 가능한 면역분석법은 이러한 PTM을 인식하지 못한다. 더욱이, 예를 들어 Nfl 종이 신경퇴행성 장애를 검출하고, 대상체의 단계를 결정하고/하거나 치료 결정을 안내하는 데 어느 정도까지 사용될 수 있는지와 같은, 우리의 이해에 중요한 간극이 남아 있다.
따라서, 뇌척수액 및 혈액에 존재하는 Nfl 이소형을 검출하고 정량화하는 개선된 방법이 당업계에 여전히 필요하다.
상세한 설명
본 발명의 다양한 양상들 중에는 뇌척수액 및 혈액에 존재하는 Nfl을 검출하고 선택적으로 정량화하는 방법의 제공, 및 신경 손상을 나타내는 Nfl 바이오마커의 수준을 검출하고 선택적으로 측정하는 방법의 사용이 있다. 본 명세서에 더 자세히 기술된 바와 같이, 특정 펩타이드 또는 Nfl의 일부가 다른 펩타이드 또는 Nfl의 일부보다 신경 손상의 더 나은 마커라는 것이 발견되었다. 또한, 다수의 항-Nfl 에피토프 결합제, 및 본 발명의 방법에서의 이들의 용도가 본 명세서에 개시된다.
I. 정의
본 명세서의 설명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어를 먼저 정의한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 실시형태들이 속하는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 변형되거나 균등한 많은 방법들 및 재료들은 본 발명의 실시형태들을 과도한 실험없이 실시함에 사용될 수 있으나, 본 명세서에는 바람직한 방법들 및 재료들이 기재되어 있다. 본 발명의 실시형태를 설명하고 청구함에 있어서, 다음의 용어는 아래에 설명된 정의에 따라 사용될 것이다.
농도, 양 및 기타 수치 데이터는 본 명세서에서 범위 형식으로 표현되거나 제시될 수 있다. 이러한 범위 형식은 단지 편의와 간결성을 위해 사용되며 범위의 한계로 명시적으로 언급된 수치 값뿐만 아니라 모든 개별 수치 값 또는 하위 값을 포함하도록 유연하게 해석되어야 한다는 점을 이해해야 한다. 각 수치 값과 하위 범위들은 이들이 명시적으로 언급된 것처럼 해당 범위 내에 포함된다. 예시로서, “약 2 내지 약 50”의 수치 범위는 2 내지 50의 명시적으로 인용된 값뿐만 아니라 표시된 범위 내의 모든 개별 값 및 하위 범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서 이 수치 범위에는 2, 2.4, 3, 3.7, 4, 5.5, 10, 10.1, 14, 15, 15.98, 20, 20.13, 23, 25.06, 30, 35.1, 38.0, 40, 44, 44.6, 45, 48 및 하위 범위, 예를 들어, 1-3, 2-4, 5-10, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-50, 2-10, 2-20, 2-30, 2-40, 2-50 등이 포함된다. 이와 동일한 원칙은 최소값 또는 최대값으로 하나의 수치 값만 언급하는 범위에도 적용된다. 또한 이러한 해석은 범위의 폭이나 설명되는 특성에 관계없이 적용되어야 한다.
본 명세서에 사용된 용어 “약”은 예를 들어 질량, 부피, 시간, 거리, 양 등을 비롯한(그러나 이에 제한되지 않음) 임의의 정량화 가능한 변수와 관련하여 일반적인 측정 기술 및 장비를 통해 발생할 수 있는 수치적 양의 변화를 의미한다. 또한, 실제 세계에서 사용되는 고체 및 액체 취급 절차를 고려할 때, 조성물을 제조하거나 방법 등을 수행하는 데 사용되는 성분의 제조, 공급원 또는 순도의 차이로 인해 발생할 수 있는 특정 부주의한 오류 및 변형이 있을 수 있다. “약”이라는 용어는 최대 ± 5%일 수 있지만 ± 4%, 3%, 2%, 1% 등일 수도 있는 이러한 변동도 포함한다. 용어 “약”에 의해 변형되든 아니든, 청구범위는 상기 양들에 대한 균등구성을 포함한다.
본 명세서에서, “포함하다”, “포함하는”, “함유하는” 및 “갖는” 등은 미국 특허법에서 그들에게 부여된 의미를 가질 수 있고 “포함한다”, “포함하는” 등을 의미할 수 있으며 일반적으로 개방형 용어로 해석된다. “구성된” 또는 “구성된”이라는 용어는 폐쇄형 용어이며, 해당 용어와 관련하여 구체적으로 나열된 구성요소, 구조, 단계 등뿐만 아니라 미국 특허법에 따른 것만을 포함한다. “본질적으로 구성되는” 또는 “본질적으로 구성된다”는 미국 특허법에 의해 일반적으로 부여되는 의미를 갖는다. 특히, 이러한 용어는 관련하여 사용되는 항목의 기본적이고 새로운 특성이나 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 항목, 재료, 구성 요소, 단계 또는 요소를 포함하는 것을 허용하는 것을 제외하고는 일반적으로 폐쇄적인 용어이다. 예를 들어, 조성물에 존재하지만 조성물의 성질이나 특성에 영향을 미치지 않는 미량 원소는 “본질적으로 구성되는”이라는 언어와 함께 기재되어 존재하는 경우, 해당 용어 이후에 언급되는 항목들의 목록에 명시적으로 언급되지 않더라도 허용될 것이다. 본 명세서에서 “포함하는” 또는 “비롯한”과 같은 개방형 용어를 사용하는 경우, “~로 본질적으로 구성되는” 이라는 표현, 뿐만 아니라 “~으로 구성되는”이라는 표현에도 마치 명시적으로 언급된 것처럼 직접적인 뒷받침이 제공될 수 있는 것으로 이해되며, 그 역도 그러하다.
“Aβ”라는 용어는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)이라고 불리는 더 큰 단백질의 카르복시 말단 영역에서 유래된 펩타이드를 의미한다. APP를 인코딩하는 유전자는 염색체 21번에 위치한다. 독성 효과를 가질 수 있는 다양한 형태의 Aβ가 있다. Aβ 펩타이드는 일반적으로 37-43개 아미노산 서열 길이이지만 전체 크기를 변경하는 절단 및 변형이 있을 수 있다. 이는 용해성 및 불용성 구획, 단량체, 올리고머 및 응집 형태, 세포내 또는 세포외에서 발견될 수 있으며 다른 단백질 또는 분자와 복합체를 형성할 수 있다. Aβ의 부작용 또는 독성 효과는 위에 언급된 형태 중 일부 또는 전부뿐만 아니라 구체적으로 설명되지 않은 다른 형태로 인해 발생할 수 있다. 예를 들어, 이러한 두 가지 Aβ 이소형에는 Aβ40 및 Aβ42가 포함되며; Aβ42 이소형은 특히 원섬유형성 또는 불용성이며 질병 상태와 연관되어 있다. “Aβ”라는 용어는 일반적으로 개별 Aβ 종들을 구별하지 않고 다수의 Aβ 종을 지칭한다. 특정 Aβ 종들은 펩타이드 크기별로, 예를 들어, Aβ42, Aβ40, Aβ38 등으로 식별된다.
본 명세서에 사용된 용어 “Aβ42/Aβ40 값”은 대상체로부터 얻은 샘플 내 Aβ42의 양을 동일한 샘플 내 Aβ40의 양과 비교한 비율을 의미한다.
“Aβ 아밀로이드증”은 뇌에서 임상적으로 비정상적인 Aβ 침착으로 정의된다. Aβ 아밀로이드증이 있는 것으로 결정된 대상체는 본 명세서에서 “아밀로이드 양성”으로 지칭되는 반면, Aβ 아밀로이드증이 없는 것으로 결정된 대상체는 본 명세서에서 “아밀로이드 음성”으로 지칭된다. 해당 분야에서 받아들여지는 Aβ 아밀로이드증의 마커가 있다. 본 발명 당시, Aβ 아밀로이드증은 아밀로이드 영상 검사(예를 들어, PiB PET, 플루오르베타피르, 또는 당업계에 공지된 다른 영상 검사 방법)에 의해 직접적으로 측정되거나 또는 감소된 뇌척수액(CSF) Aβ42 또는 감소된 CSF Aβ42/40 비율에 의해 간접적으로 측정된다. [11C] 평균 피질 결합 전위(MCBP) 점수 > 0.18인 PIB-PET 영상은 Aβ 아밀로이드증의 마커이며, 면역침전 및 질량 분석법(IP/ MS))으로 측정시 뇌척수액(CSF) Aβ42 농도는 1 ng/ml이다. 대안적으로, PIB-PET에 의해 결정된 아밀로이드 양성 예측의 정확도를 최대화하는 CSF Aβ42/40에 대한 컷오프 비율이 사용될 수 있다. 이들 값 또는 당업계에 공지되어 있고/거나 실시예에 사용된 다른 값들을 단독으로 또는 조합하여 사용하여 Aβ 아밀로이드증을 임상적으로 확인할 수 있다. 예를 들어, Klunk W E 외, Ann Neurol 55(3) 2004, Fagan A M 외, Ann Neurol, 2006, 59(3), Patterson et. al, Annals of Neurology, 2015, 78(3): 439-453, or Johnson 외, J. Nuc. Med., 2013, 54(7): 1011-1013을 참고하며, 각각은 그 전체가 참고로 본 문서에 포함된다. Aβ 아밀로이드증이 있는 대상체는 증상이 있을 수도 있고 없을 수도 있고, 증상이 있는 대상체는 Aβ 아밀로이드증과 관련된 질병에 대한 임상 기준을 충족할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. Aβ 아밀로이드증과 관련된 증상의 비제한적인 예로는 인지 기능 손상, 행동 변화, 비정상적인 언어 기능, 감정 조절 장애, 발작, 치매, 손상된 신경계 구조 또는 기능이 있다. Aβ 아밀로이드증과 관련된 질병에는 알츠하이머병(AD), 뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA), 루이소체 치매 및 봉입체 근염이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. Aβ 아밀로이드증이 있는 대상체는 Aβ 아밀로이드증과 관련된 질병이 발생할 위험이 증가한다.
“Aβ 아밀로이드증의 임상 징후”는 당업계에 공지된 Aβ 침착의 객관적 척도를 지칭한다. Aβ 아밀로이드증의 임상 징후에는 아밀로이드 영상 검사(예를 들어 PiB PET, 플루오르베타피르 또는 당업계에 공지된 다른 영상 검사 방법) 또는 감소된 뇌척수액(CSF) Aβ42 또는 Aβ42/40 비율에 의해 식별된 Aβ 침착이 포함될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, Klunk WE 외, Ann Neurol 55(3) 2004 및 Fagan AM 외, Ann Neurol 59(3) 2006을 참고하며, 각각은 전체 내용이 참조로 포함된다. Aβ 아밀로이드증의 임상 징후에는 Aβ 대사 측정, 특히, 단독으로 또는 다른 Aβ 변이체(예: Aβ37, Aβ38, Aβ39, Aβ40 및/또는 전체 Aβ)의 대사 측정과 비교한 Aβ42 대사 측정도 포함될 수 있으며, 이는 미국 특허출원 일련 번호 14/366,831, 14/523,148 및 14/747,453에 설명되어 있고, 이들 각각은 그 전체 내용이 참고로 본 명세서에 포함된다. 추가 방법은 Albert 외, Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 170-179; McKhann 외, Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 263-269; and Sperling 외, Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 280-292에 설명되어 있으며, 이들 문헌 각각은 그 전체가 참조로 포함된다. 중요하게도, Aβ 아밀로이드증의 임상 징후가 있는 대상체는 Aβ 침착과 관련된 증상이 있을 수도 있고 없을 수도 있다. 그러나 Aβ 아밀로이드증의 임상 징후가 있는 대상체는 Aβ 아밀로이드증과 관련된 질병이 발생할 위험이 증가한다. Aβ 아밀로이드증의 임상 징후는 또한 인산화된 타우 종(예를 들어, 잔기 T217 및/ro T181에서 인산화된 타우 종 등)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 CSF 또는 혈액 내 다른 가용성 단백질의 측정을 포함할 수 있습니다.
“아밀로이드 영상 검사 후보”는 임상의가 아밀로이드 영상 검사가 임상적으로 타당할 수 있는 개체로 식별한 대상체를 지칭한다. 비제한적인 예로서, 아밀로이드 영상 검사 후보자는 Aβ 아밀로이드증의 하나 이상의 임상 징후, 하나 이상의 Aβ 플라크 관련 증상, 하나 이상의 CAA 관련 증상 또는 이들의 조합을 갖는 대상체 일 수 있다. 임상의는 이러한 대상체의 임상 치료를 지시하기 위해 아밀로이드 영상 검사를 권장할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 아밀로이드 영상 검사 후보자는 Aβ 아밀로이드증과 관련된 질병에 대한 임상 시험의 잠재적 참가자일 수 있다(대조군 대상체 또는 테스트 대상체).
“Aβ 플라크 관련 증상” 또는 “CAA 관련 증상”은 각각 아밀로이드 원섬유라 불리는 규칙적으로 정렬된 원섬유 응집체로 구성되는 아밀로이드 플라크 또는 CAA의 형성에 의해 유발되거나 이와 관련된 모든 증상을 지칭한다. 예시적인 Aβ 플라크 관련 증상에는 신경 변성, 인지 기능 손상, 기억 손상, 행동 변화, 감정 조절 장애, 발작, 신경계 구조 또는 기능 손상, 알츠하이머병 또는 CAA 발병 위험 증가 또는 악화 증가가 포함될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 신경 변성은 신경 구조의 변화(독성 단백질의 세포내 축적, 단백질 응집체 등과 같은 분자 변화 및 축삭이나 수상돌기의 모양 또는 길이 변화, 미엘린 수초 구성의 변화, 미엘린 수초의 소실 등), 뉴런 기능의 변화, 뉴런의 기능 소실, 뉴런의 사멸, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 인지 기능 손상에는 기억력, 주의력, 집중력, 언어, 추상적 사고, 창의성, 실행 기능, 계획 및 조직의 어려움이 포함될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 행동 변화에는 신체적 또는 언어적 공격성, 충동성, 억제 감소, 무관심, 시작 감소, 성격 변화, 알코올, 담배 또는 약물 남용 및 기타 중독 관련 행동이 포함될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 감정 조절장애에는 우울증, 불안, 조증, 과민성 및 감정 실금이 포함될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 발작에는 전신 강직성 간대 발작, 복합 부분 발작, 비간질성 심인성 발작이 포함될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 신경계 구조 또는 기능 손상에는 수두증, 파킨슨증, 수면 장애, 정신병, 균형 및 조정 장애가 포함될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 여기에는 단일마비, 반신마비, 사지마비, 운동실조, Ballismus 및 떨림과 같은 운동 장애가 포함될 수 있다. 여기에는 후각, 촉각, 미각, 시각 및 청각 감각을 포함한 감각 상실 또는 기능 장애도 포함될 수 있다. 또한, 여기에는 장 및 방광 기능 장애, 성기능 장애, 혈압 및 체온 조절 장애와 같은 자율신경계 장애가 포함될 수 있다. 마지막으로, 여기에는 성장 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 황체형성 호르몬, 난포 자극 호르몬, 성선 자극 호르몬 방출 호르몬, 프로락틴, 및 기타 수많은 호르몬 및 조절제의 결핍 및 조절 장애와 같은 시상하부 및 뇌하수체 기능 장애로 인한 호르몬 장애가 포함될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 “혈액 샘플”은 혈액, 바람직하게는 말초(또는 순환) 혈액에서 유래된 생물학적 샘플을 지칭한다. 혈액 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청일 수 있지만 일반적으로 혈장이 선호된다.
본 명세서에 사용된 용어 “이소형”은 단백질을 인코딩하는 mRNA의 선택적 스플라이싱, 단백질의 번역 후 변형, 단백질의 단백질분해 가공, 유전적 변이 및 체세포 재조합으로 인해 발생하는 동일한 단백질 변이체의 여러 다른 형태 중 임의의 것을 지칭한다. 용어 “이소형”, “종” 및 “변이체”는 상호교환적으로 사용된다(예를 들어, 용어 “Nfl 이소형” 및 “Nfl 종”은 상호교환적으로 사용될 수 있음).
달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 용어 “신경필라멘트 경쇄”는 “인간 신경필라멘트 경쇄”를 의미하며 유전적으로 인코딩된 모든 이소형 또는 변이체뿐만 아니라 생체 내에서 C-말단이 절단된, 또는 생체 내에서 N-말단이 절단된, 또는 생체 내에서 N-말단이 절단되고 C-말단이 절단된, 또는 생체 내에서 번역 후 변형된, 또는 이들의 임의의 조합인 이들의 종을 포함한다. 용어 “신경필라멘트 경쇄”, “신경필라멘트 경쇄 폴리펩타이드” 및 “Nfl”은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 전장 Nfl은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는다.
용어 “재조합 Nfl”은 핵산의 발현 및 이의 단백질로의 번역을 지원하는 시스템(예: 원핵 세포, 진핵 세포 또는 무세포 발현 시스템)에 도입된 핵산에 의해 인코딩된 Nfl을 지칭한다. 재조합 단백질을 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에 개시된 재조합 Nfl의 생산은 특정 시스템에 제한되지 않는다.
“대상체”라는 용어는 인간, 또는 인간 Nfl을 발현하는 인간이 아닌 동물을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 “치료하다”, “치료하는” 또는 “치료”는 치료적 처치 및 예방적 또는 예방적 조치 둘 다를 의미하며, 여기서 목적은 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 질병/장애를 예방하거나 늦추는(완화) 것이다. 유익한 또는 원하는 임상적 결과들에는 증상들의 완화, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질병 진행의 지연 또는 저하, 질병 상태의 경감 또는 일시적 완화, 및 차도 (부분적이든 또는 전체적이든), 검출가능한지 또는 검출불가능한지 여부가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. “치료”는 또한 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 사람들은 이미 질병, 병태 또는 장애가 있는 사람들, 뿐만 아니라 질병, 병태 또는 장애에 걸리기 쉬운 사람들 또는 질병, 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 사람들을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 “항체”는 가장 넓은 의미로 사용되며, 전장 단클론, 다클론 및 다중특이성(예: 이중특이성, 삼중특이성 등) 항체뿐만 아니라 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 중쇄 항체 및 항체 단편을 포함하는(그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 항체 및 항체 유사 구조를 포함한다. 항원 결합에 관여하는 항체의 도메인(들)은 “가변 영역” 또는 “가변 도메인”으로 지칭되며, 아래에서 더 자세히 설명된다. 단일 가변 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 바람직하게는, 반드시 그런 것은 아니지만, 상기 발견에 유용한 항체들은 재조합적으로 생산된다. 항체는 당화될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있지만 당된 항체가 바람직할 수도 있다. “단리된” 항체는 자연 환경의 구성성분으로부터 분리된 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 해당 분야에 공지된 방법에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 순도를 초과하여 정제된다.
본 명세서에 기술된 항체에 더하여, 본 발명의 항체와 실질적으로 동일하게 기능하는 항체 모방체 또는 압타머를 당업계에 공지된 방법을 사용하여 설계하는 것이 가능할 수 있다. “항체 모방체”는 항원에 특이적으로 결합할 수 있지만 구조적으로 항체와 관련되지 않는 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 항체 모방체는 약 3kDa 내지 약 20kDa의 질량을 갖는다. 항체 모방체의 비제한적 예는 아피바디 분자, 아필린, 아피머, 알파바디, 안티칼린, 아비머, DARPin 및 모노바디이다. 압타머는 RNA 또는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드로 구성되고 표적에 대해 높은 특이성과 친화도를 갖는 작은 핵산 리간드의 한 종류이다. 압타머는 항원-항체 반응과 유사한 과정인 구조적 인식을 통해 표적과 상호작용하고 결합한다. 압타머는 항체보다 분자량이 낮으며 일반적으로 약 8-25kDa이다.
용어 “전장 항체” 및 “온전한 항체”는 본 명세서에서 호환적으로 사용되며 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본 명세서에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 천연 항체의 기본 구조 단위는 사량체로 구성된다. 각 사량체는 두 개의 동일한 폴리펩타이드 사슬 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 “경쇄”(약 25kDa)와 하나의 “중쇄”(약 50-70kDa)를 가진다. 경쇄는 감마, 뮤, 알파, 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되며 항체의 이소형은 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 정의된다. 각각의 경쇄 및 중쇄의 아미노 말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산 서열의 가변 영역(각각 VL 및 VH)을 포함한다. 각 사슬의 카르복시 말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산 서열의 “J” 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산 서열의 “D” 영역을 포함한다. 온전한 항체는 당업계에 공지된 바와 같이 이황화 결합을 통해 적절히 가교결합된다.
항체의 중쇄와 경쇄의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FRs)과 3개의 초가변 영역(HVR들)을 포함한다. (예컨대, Kindt 외. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91 페이지 (2007).참조) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱이, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위하여 항원에 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, Portolano 외, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 외, Nature 352:624-628 (1991) 참고한다.
“프레임워크 영역” 또는 “FR”은 초가변 영역 (HVR) 잔기들 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인들로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열들은 일반적으로에서 다음의 순서로 나타난다: FR1-HVR1-FR2-HVR2-FR3-HVR3-FR4. 중쇄와 경쇄의 FR 도메인은 당업계에 공지된 바와 같이 다를 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “초가변 영역” 또는 “HVR”은 서열에서 초가변인 (일반적으로 “상보성 결정 영역” 또는 “CDR”로도 지칭됨) 및/또는 구조적으로 정의된 루프 (“초가변 루프”)를 형성하고 및/또는 항원- 함유 잔기들 (“항원 접촉부”)을 함유하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체들은 6개의 HVR: VH에 3개(H1, H2, H3), 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 본 명세서에 사용된 “가변 영역으로부터 유래된 HVR”은 원래의 가변 영역으로부터의 상응하는 HVR과 비교하여 2개 이하의 아미노산 치환을 갖는 HVR을 지칭한다. 본원의 예시적인 HVR에는 본 발명의 다양한 항체들에 관해 이하에 정의된 바와 같이 포함된다: (a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)에서 나타나는 초가변 루프(Chothia and Lesk,　J. Mol. Biol.　196:901-917 (1987)); (b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)에서 나타나는 CDR(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,　5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); (c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)에서 나타나는 항원 접촉부(MacCallum et al.　J. Mol. Biol.　262: 732-745 (1996)); (d) CDR1-IMGT(위치 27-38), CDR2-IMGT(위치 56-65), 및 CDR3-IMGT 영역(위치 105-116 또는 105-117)(IMGT 고유 넘버링에 기반(Lefranc, “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains,” The Immunologist, 1999, 7: 132-136; Lefranc et al., Nucleic Acids Research, 2009, 37(Database issue): D1006-D1012; Ehrenmann et al., “Chapter 2: Standardized Sequence and Structure Analysis of Antibody Using IMGT,” in Antibody Engineering Volume 2, Eds. Roland E. Kontermann and Stefan Dubel, 2010, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, doi: 10.1007/978-3-642-01147-4; www.imgt.org/IMGTScientificChart/Nomenclature/IMGT-FRCDRdefinition.html)), 및 (e) (a), (b), (c), 및/또는 (d)의 조합. 달리 명시하지 않는 한, 서열 식별 번호가 할당된 가변 도메인(예: FR 잔기)의 HVR 잔기 및 기타 잔기는 상기 IMGT 고유 넘버링에 기반하여 번호가 지정된다.
본 명세서에서 용어 “Fc 영역”은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230에서 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 명시적으로 다른 언급이 없는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 EU 넘버링 체계, Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md, 1991에서 기재된 소위 EU 색인에 따른다.
“변이체 Fc 영역”은 천연 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환(들) 및/또는 변형된 당화 패턴으로 인해 천연 Fc 영역의 서열과 다를 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 한 예에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 또는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 본 명세서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 상동성, 적어도 약 90%의 상동성, 또는 적어도 약 95%의 상동성을 가질 수 있다.
항체 단편은 온전한(intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 비제한적인 예에는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab′)2; 단일 사슬 형태의 항체 및 이의 고차 변이체; 단일 도메인 항체 및 항체 단편들로 형성된 다중특이성 항체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
단일 사슬 형태의 항체 및 이들의 고차 형태에는 단일 도메인 항체, 단일 사슬 변이체 단편(scFvs), 2가 scFv(디-scFvs), 3가 scFv(트리-scFvs), 4가 scFv(테트라-scFv), 디아바디, 및 트리아바디 및 테트라바디가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. ScFv는 링커로 연결된 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 구성된다. 전부는 아니지만 대부분의 경우 링커는 펩타이드일 수 있다. 링커 펩타이드의 길이는 바람직하게는 약 5 내지 30개 아미노산 길이, 또는 약 10 내지 25개 아미노산 길이이다. 일반적으로 링커는 활성 결합 부위의 적절한 접힘 및 생성을 방해하지 않고 가변 도메인의 안정화를 가능하게 한다. 바람직한 실시형태에서, 링커 펩타이드는 글리신뿐만 아니라 세린 또는 트레오닌에도 풍부하다. ScFv는 파지 디스플레이를 촉진하는 데 사용될 수 있거나 유세포 분석, 면역조직화학 또는 표적화 도메인으로 사용될 수 있다. scFv를 만들고 사용하는 방법은 해당 분야에 알려져 있다. ScFv는 또한 인간 불변 도메인에 접합될 수 있다(예를 들어 중쇄 불변 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4와 같은 IgG 도메인으로부터 유래되거나 또는 중쇄 불변 도메인은 IgA, IgM 또는 IgE로부터 유래된다). 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 고차 변이체는 일반적으로 링커 펩타이드의 길이를 0에서부터 여러 아미노산까지 다양하게 변경하여 생성된다. 대안적으로, 가변 도메인에 연결된 자가 조립 단위를 사용하여 다가 결합 항체 변이체가 생성될 수 있다는 것도 당업계에 잘 알려져 있다.
“단일 도메인 항체”는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다.
다중특이성 항체에는 이중특이성 항체, 삼중특이적 항체 또는 4개 이상의 특이성을 갖는 항체가 포함된다. 다중특이성 항체는 하나의 항체의 중쇄 및 경쇄를 하나 이상의 다른 항체의 중쇄 및 경쇄와 결합하여 생성될 수 있다. 이들 사슬은 공유적으로 연결될 수 있다.
“단클론 항체”는, 예를 들어, 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론을 포함하는 단일 복사본 또는 클론으로부터 유래된 항체를 의미한다. “단클론 항체”는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에만 제한되는 것은 아니다. 단클론 항체는 당업계에 잘 알려진 하이브리도마 기술뿐만 아니라 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 이러한 기술과 당업계에 쉽게 알려진 다른 기술의 조합을 사용하여 생산될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 검출 가능한 표지로 표지될 수 있고, 고상에 고정되고/되거나 당업계에 공지된 방법에 따라 이종 화합물(예를 들어, 효소 또는 독소)과 접합될 수 있다.
“중쇄 항체”는 2개의 중쇄로 구성된 항체를 지칭한다. 중쇄 항체는 낙타, 라마, 알파카, 상어 등의 IgG 유사 항체이거나 연골 어류의 IgNAR일 수 있다.
“인간화 항체”는 투여 후 인간에서 면역 반응을 유도하는 비인간 항체의 위험을 감소시키도록 변형되었지만 출발 비인간 항체와 유사한 결합 특이성 및 친화도를 유지하도록 변형된 비인간 항체를 의미한다. 인간화 항체는 비인간 항체와 동일하거나 유사한 에피토프에 결합한다. “인간화 항체”라는 용어는 비인간 초가변 영역(“HVR”)을 갖는 항체의 서열을 변경함으로써 인간 항체 생식계열로부터 유래된 아미노산 서열로 부분적으로 또는 완전히 구성된 항체를 포함한다. 가장 단순한 이러한 변경은 단순히 뮤린 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환하여, 약학적 용도로 허용될 만큼 충분히 낮은 면역원성을 가질 수 있는 인간/뮤린 키메라를 생성하는 것으로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 항체의 가변 영역은 또한 현재까지 당업계에 널리 공지된 기술에 의해 인간화된다. 예를 들어, 가변 영역의 프레임워크 영역은 하나, 여러 개 또는 6개 모두의 비인간 HVR을 유지하면서 상응하는 인간 프레임워크 영역으로 치환될 수 있다. 일부 프레임워크 잔기는, 예를 들어, 인간화 항체의 특이성 또는 친화도를 복원하거나 개선하기 위해 비-인간 VL 도메인 또는 VH 도메인(예를 들어, HVR 잔기가 유래되는 비-인간 항체)으로부터의 상응하는 잔기로 치환될 수 있다. 실질적으로 인간 프레임워크 영역은 공지된 인간 프레임워크 서열과 약 75% 이상의 상동성(즉, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성)을 갖는다. HVR은 또한 항원에 대한 결합 활성 및 친화도가 완전한 인간 생식계열 프레임워크 영역 또는 실질적으로 인간인 프레임워크 영역의 맥락에서 유지되거나 향상되도록 무작위로 돌연변이될 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 항체 단편을 사용하는 것은 본 발명의 방법에 사용하기에 충분하다. 추가로, 본 명세서에 사용된 용어 “인간화 항체”는 실질적으로 인간 프레임워크 영역, 비인간 항체로부터의 적어도 하나의 HVR을 포함하고, 존재하는 임의의 불변 영역이 실질적으로 인간인 항체를 지칭한다. 실질적으로 인간 불변 영역은 공지된 인간 불변 서열과 적어도 약 90%(즉, 약 90%, 약 95% 또는 약 99%) 서열 동일성을 갖는다. 따라서, HVR을 제외한 인간화 항체의 모든 부분은 하나 이상의 생식계열 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 쌍들과 실질적으로 동일하다.
원하는 경우, 인간화 면역글로불린의 설계는 다음과 같이 수행되거나, 또는 당업자에게 친숙한 유사한 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, Almagro, et al. Front. Biosci. 2008, 13(5):1619-33 참조). 뮤린 항체 가변 영역은 가장 유사한 인간 생식계열 서열들에 대해 정렬된다(예: BLAST 또는 유사한 알고리즘을 사용). 뮤린 항체 서열의 CDR 잔기를 유사한 인간 “수용체” 생식계열에 이식한다. 후속적으로, CDR 근처 또는 프레임워크 내의 하나 이상의 위치(예를 들어, 버니어 위치)는 원래의 뮤린 항체와 유사한 결합 친화성을 갖는 인간화 항체를 달성하기 위해 원래의 뮤린 아미노산으로 복귀될 수 있다. 일반적으로, 다양한 복귀(reversion) 돌연변이를 갖는 여러 버전의 인간화 항체가 생성되고 활성에 대해 실증적으로 테스트된다. 모 뮤린 항체와 가장 유사한 특성을 갖고 뮤린 프레임워크 복귀가 가장 적은 인간화 항체 변이체가 최종 인간화 항체 후보로 선택된다.
“에피토프 결합제”라는 용어는 주어진 에피토프를 인식하고 이에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 압타머, 핵산, 펩타이드, 단백질, 지질, 대사산물, 소분자 또는 이들의 단편을 의미한다. 에피토프는 선형 에피토프일 수도 있고 구조적 에피토프일 수도 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “선형 에피토프”는 아미노산의 선형(또는 연속) 서열로 구성된 에피토프를 의미한다. “구조적 에피토프”란 특정 3차원 형태를 갖는 단백질 응집체 표면에 불연속적인 아미노산들로 구성된 에피토프를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 “압타머”는 폴리뉴클레오티드, 일반적으로 생화학적 활성, 분자 인식 또는 결합 속성 양상에서 유용한 생물학적 활성을 갖는 RNA 또는 DNA를 의미한다. 일반적으로 압타머는 특정 에피토프(영역)에서 표적 분자에 결합하는 등의 분자 활성을 가지고 있다. 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 압타머는 시험관내 진화 방법에 의해 합성 및/또는 식별될 수 있다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있다. 시험관 내 진화 방법을 포함하여 압타머를 제조하고 특성화하는 수단이 해당 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, US 7,939,313을 참고하며, 이 문헌은 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다.
II. 항-Nfl 에피토프 결합제
본 명세서에 사용된 “항-Nfl 에피토프 결합제”는 약 0.1 pM 내지 약 10μM, 바람직하게는 약 0.1pM 내지 약 1μM, 더 바람직하게는 약 0.1pM 내지 약 100nM 사이의 친화도 상수 또는 상호작용 친화도(KD)로 재조합 인간 신경필라멘트 경새 폴리펩타이드(Nfl)에 결합하는 단리된 에피토프 결합제를 의미한다. 항원에 대한 에피토프 결합제의 친화도를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 실시예에 추가로 설명되어 있다. 일부 실시형태에서, 항-Nfl 에피티오프 결합제는 핵산 압타머이다. 일부 실시형태에서, 항-Nfl 에피티오프 결합제는 항체이다.
본 명세서에 개시된 항-Nfl 에피토프 결합제는 이들이 인식하거나 결합하는 에피토프(들)의 관점에서 기재되거나 구체화될 수 있다. 에피토프 결합제의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 표적 폴리펩타이드 부분이 “에피토프”이다. Nfl은 단백질의 출처(예를 들어, 재조합, 인간), 단백질의 위치(예를 들어, 세포내, 세포외, 뇌, CSF, 혈액 등), 형태적 상태 및 이소형 등에 따라 임의의 수의 에피토프를 포함할 수 있다. 더욱이, Nfl 상의 “에피토프”는 선형 에피토프 또는 구조적 에피토프일 수 있고 두 경우 모두 비-폴리펩타이드 요소를 포함할 수 있다는 점에 유의해야 하는데, 예를 들어, 에피토프는 탄수화물 측쇄, 지질 측쇄, 인산염 등을 포함할 수 있다. “친화도”라는 용어는 개별 에피토프와 에피토프 결합제의 항원 결합 부위의 결합 강도를 측정한 것을 의미한다.
본 발명의 항-Nfl 에피토프 결합제는 항원으로서 재조합 전장 Nfl을 사용하여 생성될 수 있지만, 본 발명의 방법에 유용한 항-Nfl 에피토프 결합제는 혈액 또는 혈장으로부터 단리된 Nfl에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 바람직한 항-Nfl 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 543 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 항-Nfl 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 300 내부, 또는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 250 내부의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항-Nfl 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 125 내지 300 내부, 서열 번호 1의 아미노산 125 내지 250 내부, 또는 서열 번호 1의 아미노산 125 내지 200 내부의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항-Nfl 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 251 내지 400 내부 , 서열 번호 1의 아미노산 251 내지 355 내부, 서열 번호 1의 아미노산 272 내지 355 내부, 또는 서열 번호 1의 아미노산 272 내지 350 내부의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항-Nfl 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 350 내지 543 내부, 서열 번호 1의 아미노산 397 내지 543 내부, 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내부, 서열 번호 1의 아미노산 397 내지 540 내부, 또는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 540 내부의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 에피토프 매핑 방법은 해당 분야에 잘 알려져 있다.
한 실시형태에서, 항-Nfl 에피토프 결합제는 HJ30.1, HJ30.1의 항원 결합 단편, 또는 전장 재조합 Nfl에 결합하는 HJ30.1을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제이다. HJ30.1은 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁된 하이브리도마 클론 PTA-126966에 의해 생산된 단클론 항체이다.
한 실시형태에서, 항-Nfl 에피토프 결합제는 HJ30.2, HJ30.2의 항원 결합 단편, 또는 전장 재조합 Nfl에 결합하는 HJ30.2를 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제이다. HJ30.2는 ATCC에 기탁된 하이브리도마 클론 PTA-126967에 의해 생산된 단클론 항체이다.
한 실시형태에서, 항-Nfl 에피토프 결합제는 HJ30.4, HJ30.4의 항원 결합 단편, 또는 전장 재조합 Nfl에 결합하는 HJ30.4를 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제이다. HJ30.4는 ATCC에 기탁된 하이브리도마 클론 PTA-126968에 의해 생산된 단클론 항체이다.
한 실시형태에서, 항-Nfl 에피토프 결합제는 HJ30.7, HJ30.7의 항원 결합 단편, 또는 전장 재조합 Nfl에 결합하는 HJ30.7를 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제이다. HJ30.7은 ATCC에 기탁된 하이브리도마 클론 PTA-126969에 의해 생산된 단클론 항체이다.
한 실시형태에서, 항-Nfl 에피토프 결합제는 HJ30.11, HJ30.11의 항원 결합 단편, 또는 전장 재조합 Nfl에 결합하는 HJ30.11을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제이다. HJ30.11은 ATCC에 기탁된 하이브리도마 클론 PTA-126970에 의해 생산된 단클론 항체이다.
한 실시형태에서, 항-Nfl 에피토프 결합제는 HJ30.13, HJ30.13의 항원 결합 단편, 또는 전장 재조합 Nfl에 결합하는 HJ30.13을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제이다. HJ30.13은 ATCC에 기탁된 하이브리도마 클론 PTA-126971에 의해 생산된 단클론 항체이다.
에피토프 결합제가 항체인 실시형태에서, 항체는 변이체 Fc 영역을 가질 수도 있고 갖지 않을 수도 있다. 일부 예에서, Fc 영역은 미세아교세포 상의 Fc 수용체에 대한 증가 또는 감소된 친화도 및/또는 변경된 당화 패턴을 갖도록 변형될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 항-Nfl 항체는 인간화 항체일 수 있다. 예를 들어, 일부 예에서, 본 발명의 항-Nfl 항체는 HJ30.1, HJ30.2, HJ30.4, HJ30.7, HJ30.11 또는 HJ30.13으로부터 유래된 인간화 항체이다. 인간화 항-Nfl 항체는 실질적으로 인간인(즉, 공지된 인간 프레임워크 서열과 적어도 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성) 하나 이상의 불변 영역 또는 불변 영역의 일부를 포함할 수 있다.
테스트 에피토프 결합제가 주어진 에피토프에 대해 참조 에피토프 결합제(예: HJ30.1, HJ30.2, HJ30.4, HJ30.7, HJ30.11, HJ30.13 등)의 결합을 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%만큼 차단하는 정도까지 해당 에피토프에 우선적으로 결합하는 경우, 테스트 에피토프 결합제는 해당 에피토프에 대해 참조 에피토프 결합제의 결합을 경쟁적으로 억제한다고 한다. 경쟁적 억제는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 구체적인 예에서, 경쟁적 억제는 결합 표면 또는 지지체를 정제된 참조 에피토프 결합제로 코팅하여 에피토프 결합제 코팅된 표면을 형성하는 단계; 미리 결정된 양의 정제되고 표지된 항원과 테스트 에피토프 결합제를 함유하는 테스트 샘플을 조합하는 단계; 표지된 항원과 테스트 에피토프 결합제의 인큐베이션된 혼합물을 상기 코팅된 표면에 첨가하는 단계; 상기 코팅된 표면을 항원과 테스트 에피토프 결합제의 조합물과 함께 인큐베이션하는 단계; 및 테스트 에피토프 결합제가 없는 조건과 비교하여 항원 결합 억제의 양을 측정하는 단계를 포함하는 경쟁적 억제 ELISA에 의해 결정된다.
본 명세서에 개시된 항-Nfl 에피토프 결합제는 또한 그 서열의 측면에서 기재되거나 특정될 수 있다.
한 실시형태에서, 항-Nfl 항체는 HJ30.1로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 갖는 경쇄 가변 영역(VL) 및/또는 HJ30.1로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. HJ30.1의 VL로부터 유래된 HVR은 L1, L2, L3 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. HJ30.1의 VH로부터 유래된 HVR은 H1, H2, H3 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. HJ30.1의 VH로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 포함하는 항체는 HJ30.1의 VL의 L1, L2, L3 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 VL을 추가로 포함할 수 있다. 상기의 다양한 실시형태에서, 항체는 인간화 항체일 수 있거나, 항체는 HJ30.1의 VL에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 VL 및/또는 HJ30.1의 VH에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 VH를 가질 수 있다. 상기 실시형태들 각각에서, 항-Nfl 항체는 실질적으로 인간인(즉, 공지된 인간 프레임워크 서열에 적어도 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성) 하나 이상의 불변 영역 또는 불변 영역의 일부를 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고 벡터 또는 염색체와 같은 다른 대형 DNA 분자에 혼입되어 본 발명의 항체를 발현할 수 있는 상응하는 핵산 서열들을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-Nfl 항체는 HJ30.2로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 갖는 경쇄 가변 영역(VL) 및/또는 HJ30.2로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. HJ30.2의 VL로부터 유래된 HVR은 L1, L2, L3 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. HJ30.2의 VH로부터 유래된 HVR은 H1, H2, H3 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. HJ30.2의 VH로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 포함하는 항체는 HJ30.2의 VL의 L1, L2, L3 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 VL을 추가로 포함할 수 있다. 상기의 다양한 실시형태에서, 항체는 인간화 항체일 수 있거나, 항체는 HJ30.2의 VL에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 VL 및/또는 HJ30.2의 VH에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 VH를 가질 수 있다. 상기 실시형태들 각각에서, 항-Nfl 항체는 실질적으로 인간인(즉, 공지된 인간 프레임워크 서열에 적어도 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성) 하나 이상의 불변 영역 또는 불변 영역의 일부를 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고 벡터 또는 염색체와 같은 다른 대형 DNA 분자에 혼입되어 본 발명의 항체를 발현할 수 있는 상응하는 핵산 서열들을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-Nfl 항체는 HJ30.4로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 갖는 경쇄 가변 영역(VL) 및/또는 HJ30.4로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. HJ30.4의 VL로부터 유래된 HVR은 L1, L2, L3 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. HJ30.4의 VH로부터 유래된 HVR은 H1, H2, H3 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. HJ30.4의 VH로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 포함하는 항체는 HJ30.4의 VL의 L1, L2, L3 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 VL을 추가로 포함할 수 있다. 상기의 다양한 실시형태에서, 항체는 인간화 항체일 수 있거나, 항체는 HJ30.4의 VL에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 VL 및/또는 HJ30.4의 VH에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 VH를 가질 수 있다. 상기 실시형태들 각각에서, 항-Nfl 항체는 실질적으로 인간인(즉, 공지된 인간 프레임워크 서열에 적어도 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성) 하나 이상의 불변 영역 또는 불변 영역의 일부를 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고 벡터 또는 염색체와 같은 다른 대형 DNA 분자에 혼입되어 본 발명의 항체를 발현할 수 있는 상응하는 핵산 서열들을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-Nfl 항체는 HJ30.7로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 갖는 경쇄 가변 영역(VL) 및/또는 HJ30.7로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. HJ30.7의 VL로부터 유래된 HVR은 L1, L2, L3 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. HJ30.7의 VH로부터 유래된 HVR은 H1, H2, H3 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. HJ30.7의 VH로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 포함하는 항체는 HJ30.7의 VL의 L1, L2, L3 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 VL을 추가로 포함할 수 있다. 상기의 다양한 실시형태에서, 항체는 인간화 항체일 수 있거나, 항체는 HJ30.7의 VL에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 VL 및/또는 HJ30.7의 VH에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 VH를 가질 수 있다. 상기 실시형태들 각각에서, 항-Nfl 항체는 실질적으로 인간인(즉, 공지된 인간 프레임워크 서열에 적어도 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성) 하나 이상의 불변 영역 또는 불변 영역의 일부를 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고 벡터 또는 염색체와 같은 다른 대형 DNA 분자에 혼입되어 본 발명의 항체를 발현할 수 있는 상응하는 핵산 서열들을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-Nfl 항체는 HJ30.11로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 갖는 경쇄 가변 영역(VL) 및/또는 HJ30.11로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. HJ30.11의 VL로부터 유래된 HVR은 L1, L2, L3 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. HJ30.11의 VH로부터 유래된 HVR은 H1, H2, H3 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. HJ30.11의 VH로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 포함하는 항체는 HJ30.11의 VL의 L1, L2, L3 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 VL을 추가로 포함할 수 있다. 상기의 다양한 실시형태에서, 항체는 인간화 항체일 수 있거나, 항체는 HJ30.11의 VL에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 VL 및/또는 HJ30.11의 VH에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 VH를 가질 수 있다. 상기 실시형태들 각각에서, 항-Nfl 항체는 실질적으로 인간인(즉, 공지된 인간 프레임워크 서열에 적어도 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성) 하나 이상의 불변 영역 또는 불변 영역의 일부를 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고 벡터 또는 염색체와 같은 다른 대형 DNA 분자에 혼입되어 본 발명의 항체를 발현할 수 있는 상응하는 핵산 서열들을 포함한다.
한 실시형태에서, 항-Nfl 항체는 HJ30.17로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 갖는 경쇄 가변 영역(VL) 및/또는 HJ30.17로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. HJ30.17의 VL로부터 유래된 HVR은 L1, L2, L3 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. HJ30.17의 VH로부터 유래된 HVR은 H1, H2, H3 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. HJ30.17의 VH로부터 유래된 하나 이상의 HVR을 포함하는 항체는 HJ30.17의 VL의 L1, L2, L3 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 VL을 추가로 포함할 수 있다. 상기의 다양한 실시형태에서, 항체는 인간화 항체일 수 있거나, 항체는 HJ30.17의 VL에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 VL 및/또는 HJ30.17의 VH에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 VH를 가질 수 있다. 상기 실시형태들 각각에서, 항-Nfl 항체는 실질적으로 인간인(즉, 공지된 인간 프레임워크 서열에 적어도 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성) 하나 이상의 불변 영역 또는 불변 영역의 일부를 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고 벡터 또는 염색체와 같은 다른 대형 DNA 분자에 혼입되어 본 발명의 항체를 발현할 수 있는 상응하는 핵산 서열들을 포함한다.
본 명세서에 개시된 항-Nfl 에피토프 결합제는 또한 그 교차 반응성의 측면에서 기재되거나 특정될 수 있다.”교차 반응성”이라는 용어는 한 항원에 특이적인 에피토프 결합제가 두 번째 항원과 반응하는 능력을 의미하며; 두 가지 서로 다른 항원 물질들 사이의 관련성을 측정하는 것이다. 따라서, 에피토프 결합제는 자신의 형성을 유도한 에피토프가 아닌 다른 에피토프에 결합하는 경우 교차 반응성을 갖는다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로 유도 에피토프와 동일한 상보적인 구조적 특징을 많이 포함하며 어떤 경우에는 실제로 원본보다 더 잘 맞을 수도 있다. 예를 들어, 특정 항체들은, 관련이 있지만 동일하지 않은 에피토프, 예를 들어, 참조 에피토프에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 동일성(당업계에 공지된 방법을 사용하여 계산됨)을 갖는 에피토프에 결합한다는 점에서 어느 정도의 교차 반응성을 가진다. 항체 또는 다른 에피토프 결합제는 참조 에피토프에 대해 약 95% 미만, 약 90% 미만, 또는 약 85% 미만의 동일성으로 에피토프에 결합하지 않는 경우 교차 반응성이 거의 또는 전혀 없다고 말할 수 있다. 항체 또는 기타 에피토프 결합제는 해당 에피토프의 다른 유사체, 이종상동체 또는 상동체에 결합하지 않는 경우 특정 에피토프에 대해 “매우 특이적인” 것으로 간주될 수 있다.
III. 생물학적 샘플에서 Nfl을 검출하는 방법
다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 Nfl을 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 생물학적 샘플에서 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 농축시키는 단계, 및 이전에 농축된 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 검출하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 “다수의 Nfl 이소형” 및 “Nfl 이소형의 집단”은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
(a) 생물학적 샘플을 제공하는 단계
적합한 생물학적 샘플에는 대상체로부터 얻은 혈액 샘플 또는 뇌척수액(CSF) 샘플이 포함된다. 혈액 및 CSF는 실시예에 상세히 설명된 바와 같이 다수의 Nfl 이소형을 함유한다.
사용되는 생물학적 샘플의 크기는 샘플 유형, 샘플을 채취한 대상체의 건강 상태, Nfl 이외에 분석 대상 물질(예: Aβ, tau, ApoE, α-시누클레인 등)에 따라 달라질 수 있다. CSF 샘플 부피는 약 0.01mL 내지 약 5mL, 또는 약 0.05mL 내지 약 5mL 일 수 있다. 특정 예에서, 샘플의 크기는 약 0.05 mL 내지 약 1 mL CSF일 수 있다. 혈장 샘플 부피는 약 0.01mL 내지 약 20mL, 또는 약 0.1mL 내지 약 20mL 일 수 있다. 특정 예에서, 샘플의 크기는 약 1 mL 내지 약 20 mL 혈액일 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 인간 대상체는 의학적 캐어나 치료를 기다리고 있을 수도 있고, 의학적 캐어나 치료를 받고 있을 수도 있고, 의학적 캐어나 치료를 받았을 수도 있다. 다양한 실시형태에서, 인간 대상체는 건강한 대상체, 신경변성 질병이 발생할 위험이 있는 대상체, 신경 손상 및/또는 신경변성 질병의 징후 및/또는 증상이 있는 대상체, 또는 신경 손상 및/또는 신경변성 질병으로 진단된 대상체일 수 있다. 신경퇴행성 질환은 근위축성 측삭 경화증, 샤르코-마리-투스병, 만성 외상성 뇌병증(CTE), 크로이츠펠트-야콥병, 권투 선수 치매, 다운 증후군, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커병, 헌팅턴병, 봉입체 근염, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 외상성 뇌 손상(TBI), 괌의 근위축성 측삭 경화증/파킨슨증-치매 복합체, 신경원섬유 엉킴을 동반한 비-괌형(Non-Guamanian) 운동 신경 질환, 은친화 과립성 치매, 피질기저핵 변성, 석회화를 동반한 미만성 신경원섬유 엉킴, 전두측두엽 치매, 전두측두엽 17번 염색체와 연관된 파킨슨병을 동반한 치매, 할레보르덴-슈패츠병, 루이체 치매(LBD), 다발성 경화증, 다계통 위축, 근긴장성 이영양증, 니만-픽병 C형, 팔리도-폰토-흑질 변성, 파킨슨병, 픽병, 진행성 피질하 신경교증, 뇌염후 파킨슨증, PART(원발성 연령 관련 타우병증), 진행성 핵상 마비, 아급성 경화성 범뇌염, 아급성 경화증 범뇌병증, 엉킴만 있는 치매(또는 엉킴 우세 치매), 엉킴 우세 치매, 구형 신경교 내포물을 포함한 백질 타우병증, 경도 인지 장애(MCI), 녹내장, 가족형 영국 치매, 가족형 덴마크 치매, 과들루프 파킨슨증, 뇌 철분 축적을 동반한 신경변성, SLC9A6 관련 정신 지체, HIV 관련 치매, 노인성 심장 아밀로이드증일 수 있다. 때때로 “대조군” 또는 “건강한 대조군”이라고도 하는 건강한 대상체는 최소한 인지 장애의 임상 징후 또는 증상이 없으며 신경 손상, 신경퇴행성 질환, 신경 손상 및/또는 외상성 뇌 손상의 다른 임상 징후 또는 증상에 대해 “음성”일 수도 있다.
다른 실시형태에서, 대상체는 실험 동물이다. 추가 실시형태에서, 대상체는 인간 Nfl을 발현하도록 유전적으로 조작된 실험 동물이다.
CSF는 내재형 CSF 카테터 유무에 관계없이 요추 천자에 의해 얻을 수 있다. 혈액은 정맥 카테터를 사용하거나 사용하지 않고 정맥 천자하거나 천자침 (또는 이와 동등한 것)으로 채혈할 수 있다. 대상체로부터 동시에 수집된 여러 혈액 또는 CSF 샘플을 모아 “샘플”을 생성할 수 있다. 일단 수집되면, 혈액 또는 CSF 샘플은 당업계에 알려진 방법(예: 전체 세포 및 세포 파편을 제거하기 위한 원심분리, 분석 테스트 전에 표본을 안정화 및 보존하도록 고안된 첨가제 사용 등)에 따라 처리될 수 있다. 혈액 또는 CSF 샘플은 즉시 사용하거나 냉동 및 무기한 보관할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법에서 사용하기 전에, 생물학적 샘플은 필요하거나 원하는 경우 프로테아제 억제제, 내부 표준물질, 세제(들) 및 카오트로픽제(들)를 포함시키기 위해, 다른 분석물(예: 단백질 펩타이드, 대사산물)을 고갈시키기 위해, 또는 이의 조합을 위해 변형되어 있을 수도 있다.
용어 “고갈”은 양이나 수가 감소하는 것을 의미한다. 따라서, 단백질이 고갈된 샘플은 원래 샘플의 양보다 측정 가능하게 적은 임의의 양의 단백질을 가질 수 있으며, 단백질의 양이 없는 것을 포함한다. 비제한적인 예로서, 단백질(들)은 산, 유기 용매 또는 염을 이용한 한외여과 또는 단백질 침전에 의해 샘플에서 고갈될 수 있다. 일반적으로 말해서, 이러한 방법은 높은 존재비 및 고 분자량 단백질을 안정적으로 감소시키는 데 사용되며, 이는 차례로 저 분자량 및/또는 낮은 존재비 단백질 및 펩타이드(예: 타우, Aβ, Nfl 등)를 농축시킨다. 특정 예에서, 단백질은 침전에 의해 샘플로부터 고갈될 수 있다. 간단히 말해서, 침전은 침전제를 샘플에 추가하여 완전히 혼합하고, 샘플을 침전제와 함께 배양하여 단백질을 침전시키고, 침전된 단백질을 원심분리 또는 여과에 의해 분리하는 것을 포함한다. 생성된 상층액은 이후 하류 응용분야에서 사용될 수 있다. 필요한 시약의 양은 당업계에 공지된 방법에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 적합한 침전제는 과염소산, 트리클로로아세트산, 아세토니트릴, 메탄올 등을 포함한다. 한 예시적 실시형태에서, 단백질은 샘플로부터 산 침전에 의해 고갈된다. 추가 실시형태에서, 단백질은 과염소산을 사용한 산 침전에 의해 샘플로부터 고갈된다.
추가 예에서, 단백질은 과염소산을 사용한 산 침전에 의해 샘플로부터 고갈될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 “과염소산”은 달리 명시되지 않는 한 70% 과염소산을 의미한다. 일부 실시형태에서, 과염소산은 약 1% v/v 내지 약 15% v/v의 최종 농도로 추가된다. 다른 실시형태에서, 과염소산은 약 1% v/v 내지 약 10% v/v의 최종 농도로 추가된다. 다른 실시형태에서, 과염소산은 약 1% v/v 내지 약 5% v/v의 최종 농도로 추가된다. 다른 실시형태에서, 과염소산은 약 3% v/v 내지 약 15% v/v의 최종 농도로 추가된다. 다른 실시형태에서, 과염소산은 약 3% v/v 내지 약 10% v/v의 최종 농도로 추가된다. 다른 실시형태에서, 과염소산은 약 3% v/v 내지 약 5% v/v의 최종 농도로 추가된다. 다른 실시형태에서, 과염소산은 3.5% v/v 내지 약 15% v/v, 3.5% v/v 내지 약 10% v/v, 또는 3.5% v/v 내지 약 5% v/v의 최종 농도로 추가된다. 다른 실시형태에서, 과염소산은 약 3.5% v/v의 최종 농도로 추가된다. 과염소산을 추가한 후, 샘플을 잘 혼합하고(예: 와류 혼합기에 의해) 침전을 촉진하기 위해 일반적으로 약 10분 이상 동안 저온에서 홀드시킨다. 예를 들어, 샘플은 약 10분 내지 약 60분, 약 20분 내지 약 60분, 또는 약 30분 내지 약 60분 동안 홀드될 수 있다. 다른 예에서, 샘플은 약 15분 내지 약 45분, 또는 약 30분 내지 약 45분 동안 홀드될 수 있다. 다른 예에서, 샘플은 약 15분 내지 약 30분, 또는 약 20분 내지 약 40분 동안 홀드될 수 있다. 다른 예에서 샘플은 약 30분 동안 홀드된다. 그 다음, 샘플을 저온에서 원심분리하여 침전된 단백질을 펠릿화하고, 용해성 타우를 포함하는 상층액(즉, 산 용해성 분획)을, 예를 들어, 새로운 용기로 옮긴다. 상기 내용에서 사용되는 “저온”은 10℃ 이하의 온도를 지칭한다. 예를 들어, 저온은 약 1℃, 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃ 또는 약 10℃ 일 수 있다. 일부 구체예에서, 더 좁은 온도 범위, 예를 들어 약 3℃ 내지 약 5℃, 또는 심지어 약 4℃가 바람직할 수 있다. 특정 실시예에서, 샘플을 얼음 위에 올려놓음으로써 저온에 도달할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 단백질(들), 펩타이드(들) 및/또는 대사산물은 관심 있는 생체분자를 특이적으로 표적하는 방법, 예를 들어, 친화도 고갈, 고체상 추출 또는 기타 당업계에 알려진 방법을 통해 샘플에서 고갈될 수 있다. 단백질/펩타이드 또는 다중 단백질/펩타이드의 표적화된 고갈은 해당 단백질/펩타이드의 다운스트림 분석이 필요한 상황(예: 식별, 정량화, 번역 후 변형 분석 등)에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 출발 물질에서 표적된 단백질의 적어도 50%(예를 들어, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상)가 고갈된다. 일부 구체예에서, 출발 물질에서 표적된 단백질의 약 70% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상이 고갈된다. 친화도 고갈은 분자에 대한 특이적 결합 특성에 의해 샘플에서 관심 단백질을 고갈시키는 방법을 나타낸다. 일반적으로 분자는 비드, 수지, 조직 배양 플레이트 등과 같은 고체 지지체에 부착된 리간드(고정 리간드라 함)이다. 리간드-단백질 상호작용이 발생한 후에 고체 지지체에 리간드가 고정화될 수도 있다. 적합한 리간드에는 항체, 압타머 및 기타 에피토프 결합제가 포함된다. 예를 들어, Aβ 펩타이드는 Aβ의 친화도 고갈 후에 적합한 에피토프-결합제를 사용하여 당업계에 공지된 방법에 의해 식별 및 정량될 수 있다. 타우(Tau)도 유사하게 식별되고 정량화될 수 있다. 이러한 분자는 또한 관심 있는 단백질을 선택적으로 흡착하는 폴리머 또는 기타 물질일 수 있다. 비 제한적인 예로서, 지방 옥세틸화 알코올로 치환된 폴리하이드록시메틸렌 (예: PHM-L LIPOSORB, Sigma Aldrich)을 사용하여 혈청으로부터 지단백질(ApoE 포함)을 선택적으로 흡착할 수 있다. 이후 당업계에 공지된 방법에 의해 ApoE 이소형(“ApoE 상태”)을 식별하고/하거나 ApoE를 정량화 할 수 있다. 표적화 고갈은 또한 아포지단백질 J, 시누클레인, 용해성 아밀로이드 전구체 단백질, 알파-2 마크로글로불린, S100B, 미엘린 염기성 단백질, 인터루킨, TNF, TREM-2, TDP-43, YKL-40, VILIP-1, 프리온 단백질, pNFH 및 DJ-1을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 다른 단백질들을, 후속 분석을 위해 단리하기 위해 사용될 수도 있다.
(b) 생물학적 샘플에서 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 농축시키는 단계
용어 “농축시키다”는 양 또는 수를 증가시키는 것을 의미한다. 혈액 및 CSF는 다수의 Nfl 이소형을 함유한다. 따라서, “생물학적 샘플에서 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 농축시키는 단계”는 시작 샘플(즉, 생물학적 샘플)과 비교하여 샘플 부피당 Nfl 이소형 또는 다수의 Nfl 이소형의 양을 측정 가능하게 증가시키는 것을 의미한다. 일부 예에서, 농축은 적어도 약 5배일 수 있다. 일부 예에서 농축은 약 5배 내지 약 1000배 일 수 있다. 예를 들어, 농축은 적어도 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 200배, 약 300배, 약 400배, 약 500배일 수 있습니다. -배, 약 600배, 약 700배, 약 800배, 약 900배, 약 1000배, 또는 그 이상일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 생물학적 샘플에서 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 농축시키는 단계를 포함하며, 여기서 Nfl 이소형(들)은 길이가 약 350개 이하의 아미노산이다. 예를 들어, Nfl 이소형(들)은 약 300개 아미노산 이하의 길이, 약 250개 아미노산 이하의 길이, 약 200개 아미노산 이하의 길이, 약 150개 아미노산 이하의 길이, 약 100개 아미노산 이하의 길이, 또는 약 50개 아미노산 이하의 길이일 수 있다. 약 350개 아미노산 이하 길이인 Nfl 이소형은 전장 Nfl(서열 번호 1의 아미노산 서열을 가짐)에 대해 N-말단 절단, C-말단 절단, 또는 N-말단 절단 및 C-말단 절단을 함유할 수 있다.추가 예에서, 본 발명의 방법은 서열 번호 1의 아미노산 92 내지 100, 아미노산 101 내지 107, 아미노산 108 내지 116, 아미노산 117 내지 126, 아미노산 137 내지 144, 아미노산 148 내지 157, 아미노산 158 내지 164, 아미노산 165 내지 172, 아미노산 178 내지 185, 아미노산 192 내지 196, 또는 아미노산 198 내지 206을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 하나 내지 다수의 Nfl 이소형, 또는 이들의 임의의 조합을 농축시키는 단계를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 본 발명의 방법은 서열 번호 1의 아미노산 282 내지 292, 아미노산 323 내지 330, 아미노산 331 내지 338, 또는 아미노산 339 내지 353을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 하나 내지 다수의 Nfl 이소형 또는 이들의 임의의 조합을 농축시키는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 방법은 서열 번호 1의 아미노산 422 내지 437, 아미노산 438 내지 462 및/또는 아미노산 530 내지 540을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 농축시키는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 방법은 Nfl 이소형의 제1 집단을 농축한 다음, 각 경우에 이전에 고갈된 샘플을 사용하여 Nfl 이소형의 제2, 제3, 제4 또는 그 이상의 집단(들)을 농축시키는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 방법은 도 22에 기술된 하나 이상의 이소형을 농축시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 생물학적 샘플로부터 Nfl 이소형(들)을 단리함으로써(예를 들어, 친화도 정제, 고체상 추출 등) 및/또는 생물학적 샘플에서 다른 Nfl 이소형을 제거(예: 친화도 고갈, 고체상 추출 등)함으로써 절단된 Nfl 이소형 또는 다수의 절단된 Nfl 이소형을 농축할 수 있다. 친화도 고갈은 상기 설명되어 있다. 친화도 정제는 분자에 대한 특이적 결합 특성에 의해 관심 단백질을 농축시키는 방법을 지칭한다. 일반적으로 분자는 비드, 수지, 조직 배양 플레이트 등과 같은 고체 지지체에 부착된 리간드(고정 리간드라 함)이다. 리간드-단백질 상호작용이 발생한 후에 고체 지지체에 리간드가 고정화될 수도 있다. 적합한 리간드에는 항체, 압타머 및 기타 에피토프 결합제가 포함된다. 친화도 정제에 의한 Nfl의 정제는 Nfl을 포함하는 샘플을 적합한 고정화된 리간드와 접촉시키는 것, 하나 이상의 세척 단계, 및 고정화된 리간드로부터 Nfl을 용출시키는 것을 포함한다. Nfl의 친화도 정제 및/또는 Nfl의 친화도 고갈을 위한 시약들은 당업계에 공지된 방법(예를 들어, 전장 재조합 Nfl을 사용하여 에피토프 결합제를 생성한 후 주어진 에피토프(들)에 결합하는 에피토프 결합제를 선택하는, 재조합 Nfl 펩타이드를 사용하여 Nfl의 특정 단편에 대한 에피토프 결합제를 생성하는 등)에 의해 생성될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 에피토프 결합제, 예를 들어, ABIN6025698(Abbexa), ABIN4339158(Novus Biologicals), 13-0400(Invitrogen Antibodies), UD1 또는 UD2(Uman Diagnostics) 등)도 사용될 수 있다. 적합한 에피토프 결합제는 섹션 II에도 기재되어 있다.
대안적으로, Nfl 이소형(들)의 농축은 직접적으로 발생하기 보다는 오히려 Nfl 이소형 또는 다수의 Nfl 이소형의 증폭된 검출이 간접적으로 발생할 수 있다. 예를 들어, 근접 결찰 분석(예: Duo-Link(Sigma Aldrich))을 사용하여 Nfl 이소형의 N-말단 영역 및 C-말단 영역을 검출할 수 있으며, 이 때 시약들은 각각 N 말단 영역과 C 말단 영역에 각각 결합될 때 증폭된 신호를 생성할 수 있다. 일반적으로 시약은 에피토프 결합제이다. 적합한 에피토프 결합제는 섹션 II에 설명된 것들 및/또는 상업적으로 이용 가능한 항체를 포함할 수 있다. 근접 결찰 분석 등에 의한 Nfl 이소형 또는 다수의 Nfl 이소형의 증폭된 검출은 농축 또는 고갈 단계 후에(예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 530 내지 540 등을 포함하는 이소형들을 농축시키는 에피토프 결합제를 사용한 단일 농축 단계 후에) 발생할 수도 있다.
상기의 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플에서 하나 내지 다수의 Nfl 이소형들을 농축시키는 단계는 생물학적 샘플을 제1 Nfl 이소형 집단에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제와 접촉시키는 단계, 및 제1 Nfl 이소형 집단을 단리하는 단계를 포함할 수 있으며, 이 때 에피토프 결합제는 (i) 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 250 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제; (ii) 서열 번호 1의 아미노산 116 내지 184 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제; (iii) 서열 번호 1의 아미노산 250 내지 400 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제; (iv) 서열 번호 1의 아미노산 283 내지 338 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제; (v) 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제; (vi) 서열 번호 1의 아미노산 437 내지 543 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제; (vii) HJ30.1 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.2 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.13 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.1, HJ30.2 또는 HJ30.13의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제; 및 (viii) HJ30.4 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.7 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.4 또는 HJ30.7의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제; 및 (ix) HJ30.11, 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.11의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기의 또 다른 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플에서 하나 내지 다수의 Nfl 이소형들을 농축시키는 단계는 (a) 생물학적 샘플을 제1 Nfl 이소형 집단에 특이적으로 결합하는 제1 에피토프 결합제와 접촉시키고 제1 Nfl 이소형 집단을 단리하는 단계; 및 (b) 제1 Nfl 이소형 집단이 고갈된 샘플을 제2 Nfl 이소형 집단에 특이적으로 결합하는 제2 에피토프 결합제와 접촉시키고 Nfl 이소형의 제2 집단을 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 생물학적 샘플은 제1 에피토프 결합제 및 제2 에피토프 결합제와 동시에 접촉될 수 있으며, 제1 Nfl 이소형 집단과 제2 Nfl 이소형 집단은 순차적으로 또는 동시에 단리될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 제2 에피토프 결합제는 제1 에피토프 결합제의 에피토프의 하류 에피토프에 결합한다. 한 예에서, 제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 450 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제2 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 예에서, 제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 300 내 또는 서열 번호 1의 아미노산 200 내지 400 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제2 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 예에서, 제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 250 내 또는 서열 번호 1의 아미노산 250 내지 400 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제2 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내 또는 서열 번호 1의 아미노산 430 내지 540 내에 존재한다. 적합한 에피토프 결합제는 섹션 II에 설명된 것들 및/또는 상업적으로 이용 가능한 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 에피토프 결합제는 HJ30.1 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.2 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.13 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.1, HJ30.2 또는 HJ30.13의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프-결합제 일 수 있다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 제1 에피토프 결합제는 HJ30.4 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.7 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.4 또는 HJ30.7의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제일 수 있다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 제2 에피토프 결합제는 HJ30.11, 이의 항원 결합 단편, 또는 전장 재조합 Nfl에 대한 HJ30.11의 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제일 수 있다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 제2 에피토프 결합제는 HJ30.4 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.7 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.4 또는 HJ30.7의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제일 수 있다.
상기의 또 다른 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플에서 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 농축시키는 단계는 (a) 생물학적 샘플을 제1 Nfl 이소형 집단에 특이적으로 결합하는 제1 에피토프 결합제와 접촉시키고, 제1 Nfl 이소형 집단을 단리하는 단계; (b) 제1 Nfl 이소형 집단이 고갈된 샘플을 제2 Nfl 이소형 집단에 특이적으로 결합하는 제2 에피토프 결합제와 접촉시키고, 제2 Nfl 이소형 집단을 단리하는 단계; 및 (c) 제1 및 제2 Nfl 이소형 집단이 고갈된 샘플을 제3 Nfl 이소형 집단에 특이적으로 결합하는 제3 에피토프 결합제와 접촉시키고, 제3 Nfl 이소형 집단을 단리하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 생물학적 샘플은 제1 에피토프 결합제, 제2 에피토프 결합제, 및 제3 에피토프 결합제와 동시에 접촉될 수 있고, 제1 Nfl 이소형 집단, 제2 Nfl 이소형 집단 및 제3 Nfl 이소형 집단은 순차적으로 또는 임의의 조합으로 단리될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 제2 에피토프 결합제는 제1 에피토프 결합제의 에피토프의 하류 에피토프에 결합할 수 있고, 제3 에피토프 결합제는 제2 에피토프 결합제의 에피토프의 하류 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 제2 에피토프 결합제는 제1 에피토프 결합제의 상류 에피토프에 결합할 수 있다. 한 예에서, 제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 400 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제2 에피토프 결합제는 제1 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 450 내의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제3 에피토프 결합제는 제2 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내의 제3 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 예에서, 제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 300 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제2 에피토프 결합제는 제1 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 200 내지 400 내의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제3 에피토프 결합제는 제2 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내의 제3 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 예에서, 제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 250 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제2 에피토프 결합제는 제1 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 250 내지 400 내의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제3 에피토프 결합제는 제2 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내의 제3 에피토프에 특이적으로 결합한다. 적합한 에피토프 결합제는 섹션 II에 설명된 것들 및/또는 상업적으로 이용 가능한 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, (i) 제1 에피토프 결합제는 HJ30.1 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.2 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.13 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.1, HJ30.2 또는 HJ30.13의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프-결합제이거나; (ii) 제2 에피토프 결합제는 HJ30.4 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.7 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.4 또는 HJ30.7의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제이거나; (iii) 제3 에피토프 결합제는 HJ30.11, 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.11의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제이거나; (iv) 또는 이들의 조합이다.
상기의 또 다른 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플에서 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 농축시키는 단계는 (a) 생물학적 샘플을 2개 이상의 에피토프 결합제와 동시에(순차적이지 않음) 접촉시키는 단계(여기서 각각의 에피토프 결합제는 Nfl의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합함); 및 (b) 단계 (a)에서 농축된 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 검출하고 선택적으로 정량화하는 단계를 포함한다. 한 예에서, 제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 400 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제2 에피토프 결합제는 제1 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 450 내의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제3 에피토프 결합제는 제2 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내의 제3 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 예에서, 제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 300 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제2 에피토프 결합제는 제1 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 200 내지 400 내의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제3 에피토프 결합제는 제2 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내의 제3 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 예에서, 제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 250 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제2 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 250 내지 400 내의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제3 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내의 제3 에피토프에 특이적으로 결합한다. 적합한 에피토프 결합제는 섹션 II에 설명된 것들 및/또는 상업적으로 이용 가능한 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개 이상의 에피토프 결합제는 HJ30.1, HJ30.1의 항원 결합 단편, HJ30.2, HJ30.2의 항원 결합 단편, HJ30.13, HJ30.13의 항원 결합 단편, HJ30.4, HJ30.4의 항원 결합 단편, HJ30.7, HJ30.7의 항원 결합 단편, HJ30.11, HJ30.11의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.1, HJ30.2, HJ30.4, HJ30.7, HJ30.11 및 HJ30.13의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 하나의 에피토프 결합제는 (i), (ii) 또는 (iii)군에서 선택되고, 적어도 하나의 추가 에피토프 결합제는 (i), (ii) 또는 (iii)의 다른 군에서 선택되며, 여기서 (i), (ii) 또는 (iii)군은 다음과 같다: (i) HJ30.1 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.2 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.13 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.1, HJ30.2 또는 HJ30.13의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제; (ii) HJ30.4 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.7 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.4 또는 HJ30.7이 전장 재조합 Nfl에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제; (iii) HJ30.11, 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.11의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 적어도 하나의 추가 에피토프 결합제는 (i), (ii) 및 (iii)군 각각으로부터 선택되며, 여기서 (i), (ii) 또는 (iii)군은 다음과 같다: (i) HJ30.1 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.2 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.13 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.1, HJ30.2 또는 HJ30.13의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제; (ii) HJ30.4 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.7 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.4 또는 HJ30.7이 전장 재조합 Nfl에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제; (iii) HJ30.11, 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.11의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제.
내부 표준(본 명세서에서는 “ISTD”로 약칭)을 사용하여 농축 전반에 걸친 가변성을 설명하고 선택적으로 절대 농도를 계산할 수 있다. 일반적으로 내부 표준물질은 중요한 샘플 처리 전에 추가되며 필요한 경우 두 번 이상 추가할 수 있다. 하나 이상의 전장 Nfl 이소형이 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 번역 후 변형을 갖는 Nfl의 이소형 및/또는 Nfl의 펩타이드 단편이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 다수의 이소형을 순차적으로 단리하는 실시형태에서는 단리 단계들의 수와 동일한 수의 내부 표준을 사용하는 것이 유리할 수 있으며, 여기서 각 내부 표준은 Nfl의 서로 다른 펩타이드 단편이므로 각 단리 단계는 하나의 단일 내부 표준을 단리한다. 일부 실시형태에서 각각의 내부 표준은 서로 다른 AQUA 펩타이드(즉, MS에 의해 검출되는 관심 펩타이드에 상응하는 안정한 동위원소 표지 펩타이드)일 수 있다. 대안적으로, 최종 단리 단계의 Nfl 이소형이 오직 관심 대상인 경우, 단일 내부 표준이 사용될 수 있으며, 여기서 내부 표준은 최종 단계까지 단리/농축되지 않을 펩타이드 단편이다. 일부 실시형태에서 내부 표준은 AQUA 펩타이드일 수 있다. 일반적으로 내부 표준은 Nfl 표준을 내인성 Nfl 분석물과 구별하기 위해 그러나 단리에 필요한 화학적 특성에는 영향을 주지 않고 검출 가능하게 표지된다. 일부 실시형태에서, 내부 표준은 동위원소 표지된 내부 Nfl 표준이다. 적합한 동위원소 표지된 내부 Nfl 표준은 하나 이상의 아미노산 잔기에 혼입된 중동위원소 표지를 가진다. 일반적으로 말해서, 혼입되어 있는 이러한 표지된 아미노산 잔기는 화학적 특성에 영향을 미치지 않으면서 펩타이드의 질량을 증가시켜야 하며, 동위원소 표지의 존재로 인한 질량 이동은 질량 분석법이 내인성 Nfl 분석물 신호에서 내부 표준(IS)을 구별할 수 있도록 하기에 충분해야 한다. 본 명세서에서 보는 바와 같이, 적합한 무거운 동위원소 표지에는 2H,　13C, 및　15N이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 한 예에서, 내부 표준은 Lys, Arg, 13C 및 15N 표지된 재조합, 전장 Nfl 또는 Nfl의 펩타이드 단편일 수 있다. 일반적으로 내부 표준 약 0.1-10ng는 일반적으로 적절한 완충액(예: TBEAC, ~0.01-2% 알부민 등)에 충분히 희석된다. 예시적인 실시형태에서, 약 1% 인간 혈청 알부민(HSA) 중 약 1 ng 내지 약 2.5 ng이다.
(c) 이전에 농축된 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 검출하는 단계
Nfl 이소형(들)은 하기 또는 실시예에 더 상세히 설명된 바와 같이 농축된 샘플에서 질량 분석법에 의해, 또는 면역분석법, 다중 분석법(예: Luminex의 xMAP 기술), 단일 분자 배열 분석(예: Simoa®비드 기술), 근접 결찰 분석(예: Sigma Aldrich의 DuoLink®등을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 검출되고 선택적으로 정량화될 수 있다.
일부 실시형태에서, Nfl 이소형은 농축된 샘플에서 질량 분석법에 의해 검출되고 선택적으로 정량화된다. 간략하게, 질량 분석법에 의한 검출은 농축된 Nfl 이소형을 프로테아제로 절단하고 임의로 생성된 절단 생성물을 고상 추출에 의해 탈염시켜 Nfl의 단백질 분해 펩타이드를 포함하는 샘플을 얻는 단계; 및 Nfl의 단백질 분해 펩타이드를 포함하는 샘플의 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC/MS)을 수행하여 적어도 하나의 Nfl의 단백질 분해 펩타이드를 검출하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 개시된 임의의 방법에서, (예를 들어, 적절한 단백질 분해 펩타이드에 상응하는 MS 분석에서 피크의 높이 또는 적분으로부터) Nfl의 임의의 단백질 분해 펩타이드의 양도 정량화될 수 있다. 따라서 실제로, Nfl의 하나 이상의 단백질 분해 펩타이드를 사용하여 생물학적 샘플에 존재하는 Nfl 단백질의 양을 검출하고 측정한다. 혈액 및 CSF는 다수의 Nfl 이소형을 함유하고, 다수의 이소형의 하위집합은 서열 유사성을 공유하기 때문에(도 22 참조), Nfl의 단백질 분해 펩타이드의 측정치는 농축 방법이 주어진 이소형에 대해 특이적이지 않은 한, 측정된 단백질 분해 펩타이드를 포함하는 생물학적 샘플 내 다수의 Nfl 이소형의 수준을 나타낼수 있다.
트립신이 프로테아제인 실시형태에서, Nfl의 존재를 나타내는 적합한 Nfl의 단백질 분해 펩타이드는 실시예에 기재된 바와 같을 수 있다. 예를 들어, 트립신 펩타이드 [370,378], [379,389] 및 [391,398]은 Nfl에 고유하지 않으므로, 생물학적 샘플에서 Nfl을 정량화하려는 경우에는 바람직하지 않다. 일부 실시형태에서, Nfl의 존재를 나타내는 적합한 Nfl의 단백질 분해 펩타이드는 표 C에 나열된 펩타이드로부터 선택될 수 있다. 예시적인 트립신 펩타이드에는 서열 번호 1의 아미노산 108 내지 116, 서열 번호 1의 아미노산 117 내지 126, 서열 번호 1의 아미노산 165 내지 172, 서열 번호 1의 아미노산 198 내지 206, 서열 번호 1의 아미노산 324 내지 331, 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 421, 서열 번호 1의 아미노산 422 내지 437, 서열 번호 1의 아미노산 438 내지 462, 및 서열 번호 1의 아미노산 530 내지 540을 갖는 트립신 펩타이드가 포함된다. 대체 분해 효소를 사용할 때, 생성된 단백질분해 펩타이드는 약간 다를 수 있지만 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 동일한 유형의 2개의 생물학적 샘플(예를 들어, 2개의 혈액 샘플) 사이의 트립신 펩타이드 양의 변화는 이러한 생물학적 샘플을 구성하는 Nfl 이소형의 차이를 반영하는 것으로 여겨진다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 특정 Nfl의 단백질 분해 펩타이드의 양뿐만 아니라 Nfl의 특정 단백질 분해 펩타이드의 비율은 신경 손상을 진단하거나, 신경퇴행성 질환의 진단을 알리거나, 추가 진단 테스트를 위한 환자를 선택하거나, 치료 결정을 안내하거나, 또는 이들의 조합을 위해 임상적으로 유의미한 정보를 제공할 수 있다. 따라서 Nfl의 트립신 펩타이드를 검출하고 정량화할 수 있는 방법은 많은 질병의 진단, 예후 및 치료에 유용하다.
표 C: 적합한 Nfl 트립신 펩타이드
Nfl의 단백질분해 펩타이드는 고해상도 질량 분석기와 연결된 액체 크로마토그래피 시스템에 의해 분리될 수 있다. 적합한 LC-MS 시스템은 <1.0mm ID 컬럼을 포함하고 약 100μl/분 미만의 유속을 사용할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 나노플로우 LC-MS 시스템이 사용된다(예를 들어, 약 50-100μm ID 컬럼 및 < 1μL/분, 바람직하게는 약 100-800nL/분, 보다 바람직하게는 약 200-600nL/분의 유속). 예시 실시형태에서, LC-MS 시스템은 0.05mM ID 컬럼을 포함할 수 있고 약 400nL/분의 유속을 사용할 수 있다.
탠덤 질량 분석법은 당업계에 알려진 바와 같이 분해능을 개선하기 위해 사용될 수 있고, 또는 이 기술은 단일 질량 분석기로 탠덤 질량 분석기의 분해능을 구현하기 위해 향상될 수 있다. 적합한 유형의 질량 분석기가 해당 분야에 알려져 있다. 여기에는 사중극자, 비행시간법(Time-of-Flight), 이온 트랩 및 Orbitrap뿐만 아니라 상이한 유형의 질량 분석기를 하나의 아키텍처로 결합하는 하이브리드 질량 분석기(예를 들어, Orbitrap Fusion™ Tribrid™ 질량 분석기, Orbitrap Fusion™ Lumos™ 질량 분석기, Orbitrap Tribrid™ Eclipse™ 질량 분석기, Q Exactive 질량 분석기, 각각 ThermoFisher Scientific사로부터 구입)가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시 실시형태에서, LC-MS 시스템은 Orbitrap Fusion™ Tribrid™ 질량 분석기, Orbitrap Fusion™ Lumos™ 질량 분석기, Orbitrap Tribrid™ Eclipse™ 질량 분석기, 또는 사중극자에서 유사한 또는 개선된 이온-포커싱 및 이온-투명도를 가지는 질량 분석기에서 선택된 질량 분석기를 포함할 수 있다. 적절한 질량 분석 프로토콜은 주입 시간 및/또는 분석 전에 수집된 이온 수 (예: 오비트랩을 사용한 AGC 설정)를 최적화하여 개발될 수 있다. 예시 실시형태에서, 실시예에 개략적으로 설명된 질량 분석법 프로토콜이 사용된다. 예시적인 실시형태에서, 실시예에 개략된 질량 분석 프로토콜이 사용된다.
MS에 의해 분석된 단백질 분해 펩타이드는 당업계에 공지된 방법에 의해 정량화될 수 있다. 일반적으로, 알려진 양의 내부 표준이 샘플에 추가된다. 그런 다음 샘플을 분해시키고 LC-MS로 분석한다. 추출된 이온 크로마토그램은 천연 펩타이드와 내부 표준에 대해 생성된다. 피크 비율(예: 14N/15N)을 사용하여 천연 펩타이드의 양이 계산된다.
IV. 바이오마커 검출 방법 및 이의 용도
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체로부터 얻은 샘플에서 단백질 바이오마커를 검출하고 임의로 정량화하는 방법을 제공한다. 이 방법은 섹션 III의 방법에 따라 Nfl을 검출하고 임의로 정량화하는 단계를 포함하며, 여기서 생물학적 샘플은 신경 손상을 갖거나 신경 손상 위험이 있는 대상체로부터 얻은 샘플이고, 여기서 바이오마커는 농축된 Nfl 이소형이며, 제1 Nfl 이소형 대 제2 Nfl 이소형의 비율, Nfl 이소형들의 농축된 집단, 또는 농축된 Nfl 이소형의 제1 집단과 농축된 이소형의 제2 집단의 비율이다. 일부 실시형태에서, 신경 손상은 축삭 손상을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 신경 손상은 축삭 손상이다. 신경 손상의 유형은 제한되지 않으며 급성 또는 만성 손상(예: 외상성 뇌 손상 등), 신경염증 및/또는 신경퇴행성 질환으로 인해 발생할 수 있다. 신경퇴행성 질환의 비제한적 예에는 근위축성 측삭 경화증, 샤르코-마리-투스병, 만성 외상성 뇌병증(CTE), 크로이츠펠트-야콥병, 권투 선수 치매, 다운 증후군, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커병, 헌팅턴병, 봉입체 근염, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 외상성 뇌 손상, 괌의 근위축성 측삭 경화증/파킨슨증-치매 복합체, 신경원섬유 엉킴을 동반한 비-괌형(Non-Guamanian) 운동 신경 질환, 은친화 과립성 치매, 피질기저핵 변성, 석회화를 동반한 미만성 신경원섬유 엉킴, 전두측두엽 치매, 전두측두엽 17번 염색체와 연관된 파킨슨병을 동반한 치매, 할레보르덴-슈패츠병, 루이체 치매(LBD), 다발성 경화증, 다계통 위축, 근긴장성 이영양증, 니만-픽병 C형, 팔리도-폰토-흑질 변성, 파킨슨병, 픽병, 진행성 피질하 신경교증, 뇌염후 파킨슨증, PART(원발성 연령 관련 타우병증), 진행성 핵상 마비, 아급성 경화성 범뇌염, 아급성 경화증 범뇌병증, 엉킴만 있는 치매(또는 엉킴 우세 치매), 엉킴 우세 치매, 구형 신경교 내포물을 포함한 백질 타우병증, 경도 인지 장애(MCI), 녹내장, 가족형 영국 치매, 가족형 덴마크 치매, 과들루프 파킨슨증, 뇌 철분 축적을 동반한 신경변성, SLC9A6 관련 정신 지체, HIV 관련 치매, 노인성 심장 아밀로이드증이 포함된다. 때때로 “대조군” 또는 “건강한 대조군”이라고도 하는 건강한 대상체는 최소한 인지 장애의 임상 징후 또는 증상이 없으며 신경 손상, 신경퇴행성 질환, 신경 손상 및/또는 외상성 뇌 손상의 다른 임상 징후 또는 증상에 대해 “음성”일 수도 있다.
일부 실시형태에서, 바이오마커는 Nfl의 막대 도메인으로 실질적으로 구성된 아미노산 서열을 갖는 이소형, Nfl의 막대 도메인의 일부로 실질적으로 구성된 아미노산 서열을 갖는 이소형, Nfl의 막대 도메인의 일부로 구성되고 이 영역 외부의 아미노산이 없는 이소형, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 Nfl 이소형의 집단일 수 있다. 막대 도메인은 전형적으로 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 396을 포함하는 것으로 설명된다. 예를 들어, 바이오마커는 길이가 약 330개 이하의 아미노산(예를 들어 약 330, 약 325, 약 320, 약 315, 약 310개 아미노산)인 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 396을 포함하는 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 바이오마커는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 396의 단편인 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이오마커는 310개 미만(약 305, 약 300, 약 275, 약 250, 약 225, 약 200, 약 175, 약 150, 약 125, 약 100, 약 75, 약 50, 약 25 등)의 아미노산 길이이고 서열 번호 1의 아미노산 164 내지 171, 서열 번호 1의 아미노산 197 내지 205, 서열 번호 1의 아미노산 323 내지 330, 또는 이들의 조합을 포함하는, 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 바이오마커는 약 200개 미만의 아미노산 길이이고 서열 번호 1의 아미노산 165 내지 172, 서열 번호 1의 아미노산 198 내지 206, 또는 이들의 조합을 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 바이오마커는 서열 번호 1의 아미노산 125 내지 396의 단편인 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이오마커는 약 275개 이하의 아미노산 길이이고 서열 번호 1의 아미노산 165 내지 172, 서열 번호 1의 아미노산 198 내지 206, 서열 번호 1의 아미노산 324 내지 331, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이오마커는 Nfl의 꼬리 영역으로 실질적으로 이루어진 이소형, Nfl의 꼬리 영역의 일부로 구성된 아미노산 서열을 갖는 이소형, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 Nfl 이소형의 집단일 수 있다. 꼬리 영역은 전형적으로 서열 번호 1의 아미노산 397 내지 543으로 기재된다. 예를 들어, 바이오마커는 147개 아미노산 길이 내지 약 200개 아미노산 길이인 서열 번호 1의 아미노산 397 내지 543을 포함하는 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 바이오마커는 서열 번호 1의 아미노산 397 내지 543의 단편인 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이오마커는 147개 미만의 아미노산 길이이고 서열 번호 1의 아미노산 422 내지 437, 서열 번호 1의 아미노산 438 내지 462, 서열 번호 1의 아미노산 530 내지 540, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 바이오마커는 약 100개 미만의 아미노산 길이이고 서열 번호 1의 아미노산 422 내지 437, 서열 번호 1의 아미노산 438 내지 462, 서열 번호 1의 아미노산 530 내지 540, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다.
추가 실시형태에서, 바이오마커는 상기 기재된 2개의 바이오마커의 비율일 수 있다. 비제한적인 예로서, 바이오마커는 막대 영역에서 유래한 2개의 바이오마커의 비율, 또는 꼬리 영역에서 유래한 2개의 바이오마커의 비율, 또는 보다 바람직하게는 막대 영역에서 유래한 하나의 바이오마커와 꼬리 영역에서 유래한 하나의 바이오마커의 비율일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 바이오마커는 Nfl의 총량에 대한 바이오마커의 비율일 수 있다. 다른 수학적 연산 및 2개 이상의 바이오마커의 사용도 고려된다. 예를 들어, 제1 및 제2 생물학적 샘플이 분석되고 제2 샘플은 제1 샘플 이후 일정 기간(예: 수 일, 수 주, 수 개월, 수 년) 후에 얻어지는 경우, 바이오마커의 변화율이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이오마커는 (i) HJ30.1 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.2 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.13 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.1, HJ30.2 또는 HJ30.13의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제; (ii) HJ30.4 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.7 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.4 또는 HJ30.7의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제; 또는 (iii) HJ30.11, 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.11의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제로부터 선택된 에피토프 결합제로 정제된 Nfl 이소형 친화도 집단일 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이오마커는 다음과 같을 수 있다:
(a) 서열 번호 1의 아미노산 165 내지 172 및/또는 서열 번호 1의 아미노산 198 내지 206을 포함하는 Nfl 이소형의 집단, 여기서 Nfl 이소형의 집단은 (i) HJ30.1 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.2 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.13 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.1, HJ30.2 또는 HJ30.13의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제로부터 선택된 에피토프 결합제로 친화도 정제되고;
(b) 서열 번호 1의 아미노산 324 내지 331을 포함하는 Nfl 이소형 집단, 여기서 Nfl 이소형 집단은 HJ30.4 또는 이의 항원 결합 단편인 HJ30.7 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.4 또는 HJ30.7의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제로부터 선택된 에피토프 결합제로 친화도 정제되고;
(c) 서열 번호 1의 아미노산 530 내지 540을 포함하는 Nfl 이소형 집단, 여기서 Nfl 이소형 집단은 HJ30.11, 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.11의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제로부터 선택된 에피토프 결합제로 친화도 정제되고;
(d) (a) 대 (b)의 비율;
(e) (b) 대 (c)의 비율; 또는
(f) (a) 대 (c)의 비율.
상기 실시형태에서, 각각의 Nfl 이소형 집단은 생물학적 샘플로부터 단리될 수 있거나, 이전에 다른 Nfl 이소형이 고갈된 샘플로부터 단리될 수 있다. 비제한적인 예로서, (c)의 Nfl 이소형 집단은 (a)가 고갈되거나, (b)가 고갈되거나, (a) 및 (b)가 고갈된 샘플로부터 단리될 수 있다.
한 예에서, 상기 방법은 (a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하는 단계(여기서 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 CSF 샘플임), (b) 생물학적 샘플에서 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 농축시키는 단계를 포함하고, 여기서 농축 단계는 (i) 생물학적 샘플을 제1 Nfl 이소형 집단에 특이적으로 결합하는 제1 에피토프 결합제와 접촉시키고, 제1 Nfl 이소형 집단을 단리하는 단계; (ii) 제1 Nfl 이소형 집단이 고갈된 샘플을 제2 Nfl 이소형 집단에 특이적으로 결합하는 제2 에피토프 결합제와 접촉시키고, 제2 Nfl 이소형 집단을 단리하는 단계; 및 (iii) 제1 및 제2 Nfl 이소형 집단이 고갈된 샘플을 제3 Nfl 이소형 집단에 특이적으로 결합하는 제3 에피토프 결합제와 접촉시키고, 제3 Nfl 이소형 집단을 단리하는 단계를 포함하고/단계로 구성되고; 및 (c) 제1 집단, 제2 집단, 제3 집단, 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 검출하고 선택적으로 정량화하는 단계(여기서, 바이오마커는 (c)에서 검출된 Nfl 이소형 또는 Nfl 이소형의 집단, 또는 (c)에서 검출된 Nfl 이소형 또는 Nfl 이소형 집단 사이의 비율임)를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 제2 에피토프 결합제는 제1 에피토프 결합제의 에피토프의 하류 에피토프에 결합할 수 있고, 제3 에피토프 결합제는 제2 에피토프 결합제의 에피토프의 하류 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 제2 에피토프 결합제는 제1 에피토프 결합제의 상류 에피토프에 결합할 수 있다. 한 예에서, 제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 400 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제2 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 450 내의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제3 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내의 제3 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 예에서, 제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 300 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제2 에피토프 결합제는 제1 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 200 내지 400 내의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제3 에피토프 결합제는 제2 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내의 제3 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 예에서, 제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 250 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제2 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 250 내지 400 내의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제3 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내의 제3 에피토프에 특이적으로 결합한다. 적합한 에피토프 결합제는 섹션 II에 설명된 것들 및/또는 상업적으로 이용 가능한 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, (i) 제1 에피토프 결합제는 HJ30.1 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.2 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.13 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.1, HJ30.2 또는 HJ30.13의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프-결합제이거나; (ii) 제2 에피토프 결합제는 HJ30.4 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.7 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.4 또는 HJ30.7의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제이거나; (iii) 제3 에피토프 결합제는 HJ30.11, 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.11의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제이거나; (iv) 또는 이들의 조합이다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 제공하는 단계(여기서 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 CSF 샘플임), (b) 생물학적 샘플을 2개 이상의 에피토프 결합제와 접촉시켜 다수의 Nfl 이소형들을 농축시키는 단계(여기서 각각의 에피토프 결합제는 Nfl의 다른 에피토프에 특이적으로 결합함); 및 (c) 단계 (b)에서 농축된 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 검출하고 임의로 정량화하는 단계(여기서, 바이오마커는 (c)에서 검출된 Nfl 이소형 또는 Nfl 이소형의 집단, 또는 (c)에서 검출된 Nfl 이소형 또는 Nfl의 집단 사이의 비율임)를 포함한다. 한 예에서, 제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 400 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제2 에피토프 결합제는 제1 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 450 내의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제3 에피토프 결합제는 제2 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내의 제3 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 예에서, 제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 300 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제2 에피토프 결합제는 제1 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 200 내지 400 내의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제3 에피토프 결합제는 제2 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내의 제3 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 예에서, 제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 250 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제2 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 250 내지 400 내의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하고; 제3 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내의 제3 에피토프에 특이적으로 결합한다. 적합한 에피토프 결합제는 섹션 II에 설명된 것들 및/또는 상업적으로 이용 가능한 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 2개 이상의 에피토프 결합제는 HJ30.1, HJ30.1의 항원 결합 단편, HJ30.2, HJ30.2의 항원 결합 단편, HJ30.13, HJ30.13의 항원 결합 단편, HJ30.4, HJ30.4의 항원 결합 단편, HJ30.7, HJ30.7의 항원 결합 단편, HJ30.11, HJ30.11의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.1, HJ30.2, HJ30.4, HJ30.7, HJ30.11 및 HJ30.13의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 하나의 에피토프 결합제는 (i), (ii) 또는 (iii)군에서 선택되고, 적어도 하나의 추가 에피토프 결합제는 (i), (ii) 또는 (iii)의 다른 군에서 선택되며, 여기서 (i), (ii) 또는 (iii)군은 다음과 같다: (i) HJ30.1 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.2 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.13 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.1, HJ30.2 또는 HJ30.13의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제; (ii) HJ30.4 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.7 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.4 또는 HJ30.7이 전장 재조합 Nfl에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제; (iii) HJ30.11, 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.11의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 적어도 하나의 추가 에피토프 결합제는 (i), (ii) 및 (iii)군 각각으로부터 선택되며, 여기서 (i), (ii) 또는 (iii)군은 다음과 같다: (i) HJ30.1 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.2 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.13 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.1, HJ30.2 또는 HJ30.13의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제; (ii) HJ30.4 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.7 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.4 또는 HJ30.7이 전장 재조합 Nfl에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제; (iii) HJ30.11, 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.11의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제.
바이오마커의 검출 및 정량화는 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 비제한적인 예에는 신경 손상 진단, 신경 손상을 특징으로 하는 질병 또는 상태(예: 외상성 뇌 손상, 신경퇴행성 질환 등) 진단, 신경 손상의 발달 또는 진행 및/또는 신경 손상으로 특성화된 질병 상태의 모니터링/측정, 신경 손상이 있는 대상체 치료, 주어진 치료의 효능 결정/측정 등이 포함된다.
따라서, 또 다른 측면에서, 상기 방법은 상기 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같이 바이오마커의 수준을 검출 및 정량화하는 단계, 및 이러한 수준이 인지적으로 정상인 대조군 대상체에서의 수준과 비교하여 감소되는지를 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 방법은 상기 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같이 바이오마커의 수준을 검출 및 정량화하는 단계, 및 이러한 수준이 인지적으로 정상이고 또한 신경퇴행성 질환 또는 외상성 뇌 손상의 하나 이상의 추가 임상 징후 또는 증상에 대해 음성인 대조군 대상체에서의 수준과 비교하여 감소되는지를 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 방법은 상기 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같이 바이오마커의 수준을 검출 및 정량화하는 단계, 및 이러한 수준이 인지적으로 정상이고 또한 아밀로이드 음성(Aβ-)인 대조군 대상체에서의 수준과 비교하여 감소되는지를 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 방법은 상기 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같이 바이오마커의 수준을 검출 및 정량화하는 단계, 및 이러한 수준이 인지적으로 정상이고 또한 뇌의 타우 침착물의 병리학적 수준에 대해 음성인 대조군 대상체에서의 수준과 비교하여 감소되는지를 결정하는 단계를 포함한다. 치매를 포함한 인지 장애를 평가하기 위한 임상 시험은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 비제한적인 예로서, 임상 치매 등급(CDR) 테스트가 사용될 수 있다. 뇌의 병리학적 단백질 침착을 평가하기 위해 타우 PET 추적자 또는 Aβ PET 추적자를 사용하는 것 또한 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 바이오마커의 수준이 대조군 대상체의 평균으로부터 유의하게 벗어난 경우 대상체가 신경 손상을 갖는 것으로 진단될 수 있다. “평균에서 유의하게 벗어난”은 평균보다 적어도 1 표준편차, 바람직하게는 적어도 1.3 표준편차, 더 바람직하게는 적어도 1.5 표준편차, 또는 훨씬 더 바람직하게는 적어도 2 표준편차 높거나 낮은 값(예를 들어, 1σ, 1.1σ, 1.2σ, 1.3σ, 1.4σ, 1.5σ 등을 지칭하며, 여기서 σ는 대조군 집단에서 측정된 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차이다). 임계값(예: 평균보다 적어도 1 표준 편차 높거나 낮음)을 사용하는 것 이외에도, 일부 실시형태에서는 평균보다 높거나 낮은 변화 정도를 대상체를 진단하기 위해 사용할 수 있다.　
또 다른 측면에서, 상기 방법은 상기 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같이 대상체로부터 획득한 제1 생물학적 샘플 및 대상체로부터 획득한 제2 생물학적 샘플에서 바이오마커의 수준을 검출하고 정량화하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 생물학적 샘플 및 제2 생물학적 샘플은 둘 다 혈액 샘플이거나 둘 다 CSF 샘플이고, 이 때 제2 생물학적 샘플은 제1 생물학적 샘플 이후에 획득되었다.
또 다른 측면에서, 상기 방법은 상기 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같이 대상체로부터 획득한 제1 생물학적 샘플 및 대상체로부터 획득한 제2 생물학적 샘플에서 바이오마커의 수준을 검출하고 정량화하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 생물학적 샘플 및 제2 생물학적 샘플은 둘 다 혈액 샘플이거나 둘 다 CSF 샘플이고, 이 때 제2 생물학적 샘플은 제1 생물학적 샘플 이후에 획득되었다. 제1 샘플과 비교하여 제2 샘플에서 바이오마커 수준의 증가는 신경 손상의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 제1 샘플과 후속 샘플 사이의 바이오마커 수준의 변화율을 사용하여 질병의 단계 및/또는 신경 손상 정도를 결정한다. 따라서, 이러한 방법은 신경 손상을 가지고 있거나 신경 손상을 가질 위험이 있는 대상체를 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 방법 중 하나 이상은 특정 신경퇴행성 질환을 진단, 단계 결정 및/또는 치료하기 위해 당업계에 공지된 하나 이상의 질병 바이오마커와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 데이터는 AD 진행에서 병리생리학적 일련의 사건이 CSF 및 혈장 Aβ42/Aβ40 비율의 변경과 함께 시작되고, 이어서 아밀로이드 PET로 측정된 아밀로이드 플라크의 증가가 수반됨을 보여주며, 이는 p-tau205, NfL, 총 타우 농도, 대사 저하 및 위축이 증가하기 전 특정 CSF 타우 종(예를 들어, p-tau217, p-tau231, p-tau181, p-tau153, p-tau111)의 인산화 증가와 관련된다. 마지막으로, 일부 종의 MTBR-tau(예: MTBR-tau299, MTBR-tau243, MTBR-tau354, MTBR-tau3R)는 타우 PET에 의한 타우 응집 및 임상 증상의 발병 전 또는 이와 함께 증가하고 종단적 타우 응집 및 임상 진행과 상관관계가 있다. 이러한 발견은 Aβ, p-tau, MBR-tau 측정치 중 하나 이상과 조합된, CSF 및 혈액 Nfl 측정치가 뇌 아밀로이드증, 타우병증 및 신경퇴행의 매우 정확한 바이오마커이며 전임상 및 임상 AD의 단계를 정확하게 식별할 수 있고 특정 질병 과정을 표적하는 치료의 효과를 예측할 수 있음을 나타낸다. AD 이외의 신경변성 질환의 진단, 단계 결정 및 치료를 위해 다른 질환 바이오마커와의 병용도 고려된다.
일부 실시형태에서, 상기 방법 중 하나 이상은 PET 또는 요추 천자와 같은 보다 침습적인 진단 방법에 추가하여 또는 이의 대안으로 사용될 수 있다. 따라서, 임의의 상기 방법에서, 대상체는 일부 측면에서 PET 영상 검사와 같은 선행 진단 테스트를 받지 않았다.
일부 실시형태에서, 상기 방법 중 하나 이상은 대상체가 추가 진단 테스트를 받아야 하는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어 보다 침습적인 진단 방법일 수 있다. 예를 들어, Nfl 수준 또는 다른 임상 징후와 조합된 Nfl 수준이 알츠하이머병을 시사하는 경우, 대상체는 아밀로이드 기반 PET 또는 타우 기반 PET를 받도록 선택될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 초기 테스트가, 예를 들어 질병의 존재 또는 특정 질병 단계를 추가로 확인하기 위해 수행된 경우, Nfl 수준은 인지 테스트 또는 추가 인지 테스트를 받을 대상체를 선택하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, Nfl 수준은 추가적인 바이오마커 테스트, 예를 들어, 아포지단백질 J, 헌팅틴 단백질, 시누클레인, 가용성 아밀로이드 전구체 단백질, 알파-2 마크로글로불린, S100B, 미엘린 염기성 단백질, 인터루킨, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, TNF, TREM-2, TDP-43, YKL-40, VILIP-1, 프리온 단백질, pNFH, DJ-1 등의 총 수준 또는 특정 이소형의 수준을 결정하기 위한 테스트를 받을 대상체를 선택하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 방법 중 하나 이상은 인지 상태 또는 인지 저하를 예측하는 데에도 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 신경퇴행성 질환, 신경염증 또는 외상성 뇌 손상으로 인한 신경 손상을 비롯한 신경 손상이 있는 인간 대상체에서 인지 상태를 예측하거나 인지 저하를 예측하는데 사용하기 위한 상기 방법에 관한 것이다. 따라서, 추가 실시형태에서, 본 발명은 신경변성 질환 진행을 예측하는데 사용하기 위한 상기 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 상기 방법은 (a) 대상체로부터 얻은 제1 생물학적 샘플에서 본 명세서에 기재된 바이오마커인 상기 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 바이오마커의 수준을 검출하고 정량화하는 단계; (b) 대상체에게 치료제를 투여하는 단계; 및 (c) 치료 후 대상체로부터 얻은 제2 생물학적 샘플에서 단계 (a)에서 정량된 바이오마커를 검출하고 정량화하는 단계를 포함하고; 여기서 제1 생물학적 샘플과 제2 생물학적 샘플은 둘 다 혈액 샘플이거나 둘 다 CSF 샘플이다. 제1 샘플과 비교하여 제2 샘플에서 바이오마커 수준의 변화 없음 또는 바이오마커 수준의 감소는 긍정적인 치료 반응을 나타낸다. 또한, 제1 샘플과 비교하여 제2 샘플에서 바이오마커 수준의 증가는 또한 이러한 증가가 신경 손상을 가지지만 치료를 투여방지 않았던 대상체들의 대조군에서 발생한 증가 보다 작은 경우 긍정적인 치료 반응을 나타낼 수도 있다. 바람직하게는 대조군 대상체는 동일한 질병 진행 또는 손상 유형으로 인한 신경 손상을 가진다. 따라서, 이러한 방법은 신경 손상을 가지거나 가질 위험이 있는 대상체의 치료 반응을 측정하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 신경 손상을 가지거나 신경 손상을 가질 위험이 있는 것으로 진단된 대상체를 치료하는 것을 포함한다. 이 방법은 (a) 대상체로부터 얻은 샘플에서 본 명세서에 기술된 바이오마커를 정량화하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 측정된 바이오마커의 양을 감소시키거나 안정화시키기 위해 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
V. 조성물
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 섹션 IV의 바이오마커 및 내부 표준을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 Nfl의 막대 도메인으로 실질적으로 구성된 아미노산 서열(일반적으로 서열 번호 1의 아미노산 90-396으로 기재됨)을 가지는 이소형, Nfl의 막대 도메인의 일부로 실질적으로 구성된 아미노산 서열을 가지는 이소형, Nfl의 막대 도메인의 일부로 구성된 아미노산 서열을 가지며 이 영역 외부에는 아미노산이 없는 이소형, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 다수의 Nfl 이소형 및 내부 표준을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 조성물은 길이가 약 330개 이하의 아미노산인 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 396을 포함하는 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 조성물은 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 396의 단편인 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 310개 미만(약 305, 약 300, 약 275, 약 250, 약 225, 약 200, 약 175, 약 150, 약 125, 약 100, 약 75, 약 50, 약 25 등)의 아미노산 길이이고 서열 번호 1의 아미노산 165 내지 172, 서열 번호 1의 아미노산 198 내지 206, 서열 번호 1의 아미노산 324 내지 331, 또는 이들의 조합을 포함하는, 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 조성물은 약 200개 미만의 아미노산 길이이고 서열 번호 1의 아미노산 165 내지 172, 서열 번호 1의 아미노산 198 내지 206, 또는 이들의 조합을 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 조성물은 서열 번호 1의 아미노산 125 내지 396의 단편인 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 약 275개 이하의 아미노산 길이이고 서열 번호 1의 아미노산 165 내지 172, 서열 번호 1의 아미노산 198 내지 206, 서열 번호 1의 아미노산 324 내지 331, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Nfl의 꼬리 영역으로 실질적으로 구성된 이소형, Nfl의 꼬리 영역의 일부로 구성된 아미노산 서열을 가지는 이소형, 또는 이의 조합으로부터 선택된 다수의 Nfl 이소형 및 내부 표준을 포함하는 조성물을 제공한다. 꼬리 영역은 전형적으로 서열 번호 1의 아미노산 397 내지 543으로 기재된다. 예를 들어, 조성물은 147개 아미노산 길이 내지 약 200개 아미노산 길이인 서열 번호 1의 아미노산 397 내지 543을 포함하는 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 조성물은 서열 번호 1의 아미노산 397 내지 543의 단편인 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 147개 미만의 아미노산 길이이고 서열 번호 1의 아미노산 422 내지 437, 서열 번호 1의 아미노산 438 내지 462, 서열 번호 1의 아미노산 530 내지 540, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 약 100개 미만의 아미노산 길이이고 서열 번호 1의 아미노산 422 내지 437, 서열 번호 1의 아미노산 438 내지 462, 서열 번호 1의 아미노산 530 내지 540, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 하나 이상의 Nfl 이소형을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1의 아미노산 165 내지 172로 구성된 펩타이드, 서열 번호 1의 아미노산 198 내지 206으로 구성된 펩타이드, 서열 번호 1의 아미노산 324 내지 331로 구성된 펩타이드, 및 서열 번호 1의 아미노산 530 내지 540으로 구성된 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 펩타이드와 내부표준물질을 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 내부 표준 및 서열 번호 1의 아미노산 530 내지 540으로 구성된 펩타이드를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 서열 번호 1의 아미노산 165 내지 172로 이루어진 펩타이드, 서열 번호 1의 아미노산 198 내지 206으로 구성된 펩타이드, 및 서열 번호 1의 아미노산 324 내지 331로 구성된 펩타이드를 무시할 수 있는 양으로 함유한다.
상기 조성물의 일부 실시형태에서, 내부 표준은 검출 가능하게 표지된 재조합 Nfl 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 내부 표준은 2H,　13C, 및 15N으로부터 선택된 중동위원소 표지로 검출 가능하게 표지된다. 일부 실시형태에서, 내부 표준은 AQUA 펩타이드이다. 특정 실시형태에서, 중동위원소 표지로 검출가능하게 표지된 상기 내부 표준 및 상기 바이오마커 또는 다수의 Nfl 이소형 또는 펩타이드는 각각 0.01 대 1 초과 및 1 대 100 미만의 비율일 수 있고; 또는 각각 약 0.1 대 1 내지 각각 약 10 대 1의 비율일 수 있다.
펩타이드의 양 또는 바이오마커의 양 또는 다수의 Nfl 이소형의 양은 적어도 0.1 pg 이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드, 바이오마커 또는 다수의 Nfl 이소형의 양은 약 0.1pg 내지 약 10,000ng, 또는 약 0.1pg 내지 약 5,000ng, 또는 약 0.1pg 내지 약 1,000ng이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드, 바이오마커 또는 다수의 Nfl 이소형의 양은 약 1pg 내지 약 10,000ng, 또는 약 1pg 내지 약 5,000ng, 또는 약 1pg 내지 약 1,000ng이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드, 바이오마커 또는 다수의 Nfl 이소형의 양은 약 10pg 내지 약 10,000ng, 또는 약 10pg 내지 약 5,000ng, 또는 약 10pg 내지 약 1,000ng이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드, 바이오마커 또는 다수의 Nfl 이소형의 양은 약 100pg 내지 약 10,000ng, 또는 약 100pg 내지 약 5,000ng, 또는 약 100pg 내지 약 1,000ng이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드, 바이오마커 또는 다수의 Nfl 이소형의 양은 약 500pg 내지 약 10,000ng, 또는 약 500pg 내지 약 5,000ng, 또는 약 500pg 내지 약 1,000ng이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드, 바이오마커 또는 다수의 Nfl 이소형의 양은 약 1,000pg 내지 약 10,000ng, 또는 약 1,000pg 내지 약 5,000ng, 또는 약 1,000pg 내지 약 1,000ng이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드, 바이오마커 또는 다수의 Nfl 이소형의 양은 약 5ng 내지 약 10,000ng, 또는 약 5ng 내지 약 5,000ng, 또는 약 5ng 내지 약 1,000ng이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드, 바이오마커 또는 다수의 Nfl 이소형의 양은 약 10ng 내지 약 10,000ng, 또는 약 10ng 내지 약 5,000ng, 또는 약 10ng 내지 약 1,000ng이다.
각각의 상기 실시형태에서, 조성물은 섹션 II에 기재된 그리고 이 섹션에 참고로 포함된 바와 같은 하나 이상의 항-Nfl 에피토프 결합제를 추가로 포함할 수 있다.
도면의 간단한 설명
출원 파일에는 컬러로 완성된 하나 이상의 사진이 포함되어 있다. 컬러 사진들이 있는 본 특허 출원 공개공보 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불 시 특허청에서 제공할 것이다.
도 1은 항-Nfl 항체를 이용한 면역침전 및 LC-MS 분석 후 재조합 전장 Nfl(rec-Nfl)의 양을 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다. 각 라인은 서로 다른 항체이다(도면 내의 키 참고). 개별 항체에 대한 데이터를 도 4-27에 제시한다.
도 2A는 항-Nfl 항체로 뇌 용해물로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다. 각 라인은 서로 다른 항체이다(도면 내의 키 참고). 개별 항체에 대한 데이터를 도 4-21에 제시한다.
도 2B는 도 2A에 도시된 그래프의 확대 버전이다(두 도면 사이의 y축 스케일의 차이에 주목).
도 3은 항-Nfl 항체로 CSF로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다. 각 라인은 서로 다른 항체이다(도면 내의 키 참고). 개별 항체에 대한 데이터를 도 4-27에 제시한다.
도 4A 및 도 4B는 항-Nfl 항체 HJ30.1로 뇌 용해물(도 4A) 및 CSF(도 4B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 4C는 항-Nfl 항체 HJ30.1로 면역침전시킨 후 LC-MS로 측정한 rec-Nfl 양을 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 5A 및 도 5B는 항-Nfl 항체 HJ30.2로 뇌 용해물(도 5A) 및 CSF(도 5B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 5C는 항-Nfl 항체 HJ30.2로 면역침전시킨 후 LC-MS로 측정한 rec-Nfl 양을 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 6A 및 도 6B는 LC-MS에 의해 측정된, 항-Nfl 항체 HJ30.3.1을 사용하여 뇌 용해물(도 6A) 및 CSF(도 6B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 6C는 항-Nfl 항체 HJ30.3.1로 면역침전시킨 후 LC-MS로 측정한 rec-Nfl의 트립신 펩타이드의 양을 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 7A 및 도 7B는 항-Nfl 항체 HJ30.4로 뇌 용해물(도 7A) 및 CSF(도 7B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 7C는 항-Nfl 항체 HJ30.4로 면역침전시킨 후 LC-MS로 측정한 rec-Nfl 양을 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 8A 및 도 8B는 항-Nfl 항체 HJ30.3.5로 뇌 용해물(도 8A) 및 CSF(도 8B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 8C는 항-Nfl 항체 HJ30.5로 면역침전시킨 후 LC-MS로 측정한 rec-Nfl 양을 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 9A 및 도 9B는 항-Nfl 항체 HJ30.6으로 뇌 용해물(도 9A) 및 CSF(도 9B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 9C는 항-Nfl 항체 HJ30.6으로 면역침전시킨 후 rec-Nfl 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 10A 및 도 10B는 항-Nfl 항체 HJ30.7로 뇌 용해물(도 10A) 및 CSF(도 10B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 10C는 항-Nfl 항체 HJ30.7로 면역침전시킨 후 rec-Nfl 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 11A 및 도 11B는 항-Nfl 항체 HJ30.8로 뇌 용해물(도 11A) 및 CSF(도 11B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 11C는 항-Nfl 항체 HJ30.8로 면역침전시킨 후 rec-Nfl 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 12A 및 도 12B는 항-Nfl 항체 HJ30.9로 뇌 용해물(도 12A) 및 CSF(도 12B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 12C는 항-Nfl 항체 HJ30.9로 면역침전시킨 후 rec-Nfl 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 13A 및 도 13B는 항-Nfl 항체 HJ30.11로 뇌 용해물(도 13A) 및 CSF(도 13B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 13C는 항-Nfl 항체 HJ30.11로 면역침전시킨 후 rec-Nfl 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 14A 및 도 14B는 항-Nfl 항체 HJ30.12로 뇌 용해물(도 14A) 및 CSF(도 14B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 14C는 항-Nfl 항체 HJ30.12로 면역침전시킨 후 rec-Nfl 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 15A 및 도 15B는 항-Nfl 항체 HJ30.13으로 뇌 용해물(도 15A) 및 CSF(도 15B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 15C는 항-Nfl 항체 HJ30.13으로 면역침전시킨 후 rec-Nfl 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 16A 및 도 16B는 항-Nfl 항체 HJ30.14로 뇌 용해물(도 16A) 및 CSF(도 16B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 16C는 항-Nfl 항체 HJ30.14로 면역침전시킨 후 rec-Nfl 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 17A 및 도 17B는 항-Nfl 항체 HJ30.15로 뇌 용해물(도 17A) 및 CSF(도 17B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 17C는 항-Nfl 항체 HJ30.15로 면역침전시킨 후 LC-MS로 측정한 rec-Nfl 양을 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 18A 및 도 18B는 항-Nfl 항체 HJ30.16.1로 뇌 용해물(도 18A) 및 CSF(도 18B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 18C는 항-Nfl 항체 HJ30.16.1로 면역침전시킨 후 rec-Nfl 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 19A 및 도 19B는 항-Nfl 항체 HJ30.16.2로 뇌 용해물(도 19A) 및 CSF(도 19B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 19C는 항-Nfl 항체 HJ30.16.2로 면역침전시킨 후 rec-Nfl 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 20A 및 도 20B는 항-Nfl 항체 HJ30.17로 뇌 용해물(도 20A) 및 CSF(도 20B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 20C는 항-Nfl 항체 HJ30.17로 면역침전시킨 후 rec-Nfl 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 21A 및 도 21B는 항-Nfl 항체 HJ30.18로 뇌 용해물(도 21A) 및 CSF(도 21B)로부터 면역침전된 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 21C는 항-Nfl 항체 HJ30.18로 면역침전시킨 후 rec-Nfl 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 22는 항-Nfl 항체 면역침전 실험 및 MS 분석으로부터 얻은 데이터(개별 데이터는 도 4-21에 도시)를 요약한 예시이다. 상단 도면은 CSF로부터 농축된 대략적인 Nfl 이소형을 보여준다. 하단 도면은 뇌 용해물로부터 농축된 대략적인 Nfl 이소형을 보여준다. 각 도면에는 전장 Nfl 단백질의 개략도가 포함되어 있으며 하단에 아미노산 번호를 표시한다. CSF에서, N-말단이 절단된 이소형, C-말단이 절단된 이소형, 및 N-말단 및 C-말단이 절단된 이소형을 포함하여 다수의 Nfl 이소형이 농축되었다. 이소형 크기는 MS 데이터로부터 대략적으로 계산되지만, 사용된 접근 방식의 기술적 한계로 인해 잔류물 수준에서는 구체적이지 않다. 따라서, 각 선은 다수의 이소형을 나타낼 수 있으며 이들은 한 쪽 말단에서 길이가 다르다. 실선(짙은 파란색)은 더 높은 수준의 신뢰도를 나타내며-절단된 이소형은 실선에 의해 추정되는 잔류물을 포함한다. 점선(밝은 파란색)은 낮은 수준의 신뢰도를 나타내며, 변동이 가능함을 나타낸다. 예를 들어, MS 데이터는 서열 번호 1의 아미노산 530 내지 540을 포함하는 다수의 N-말단 절단된 이소형을 제안한다(CSF 예시에서 4개의 하단 선들로 나타냄). 이들 이소형 중 가장 작은 것은 서열 번호 1의 아미노산 462 내지 543을 함유하는 것으로 추정된다. 그러나 이것은 단지 근사치일 뿐이며, 현재 접근 방식으로는 정확한 길이를 결정할 수 없다. 따라서 제시된 가장 작은 이소형이 다수의 이소형인 것도 가능하다. 뇌 용해물에서는 적어도 2개의 Nfl 이소형 집단이 농축되었다- 첫 번째 집단은 대략 전장의 서열 번호 1이고, 두 번째 집단은 서열 번호 1의 적어도 아미노산 530 내지 540을 포함하는 N-말단 절단된 이소형이다. CSF 예시는 또한 항-Nfl 항체가 결합하는 에피토프를 함유하는 다양한 영역들의 대략적인 표시를 포함한다(Nfl 단백질 도식 위에 표시됨). 예를 들어, 항-Nfl 항체 HJ30.1, HJ30.2, HJ30.13 및 HJ30.15는 MS 데이터로부터 결정된 바와 같이 전장 Nfl의 아미노산 약 100 내지 약 225를 포함하는 영역 내의 에피토프에 결합하는 것으로 도시된다. 참고: 이러한 표현은 이들 항체가 동일한 에피토프에 결합한다는 것을 시사하지 않는다.
도 23은 2단계 농축 과정의 도식(왼쪽)과 각 단계에서 HJ30.4로 면역침전된 트립신 펩타이드[323,330]의 양(y축, 피크 면적)을 보여주는 그래프를 도시한다. 빨간색 막대는 14N[323,330]이고 파란색 막대는 15N[323,330]이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 24는 2단계 농축 과정의 도식(왼쪽)과 각 단계에서 HJ30.11로 면역침전된 트립신 펩타이드[529,539]의 양(y축, 피크 면적)을 보여주는 그래프를 도시한다. 빨간색 막대는 14N[529,539]이고 파란색 막대는 15N[529,539]이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 25는 2단계 농축 과정의 도식(왼쪽)과 각 단계에서 HJ30.13으로 면역침전된 트립신 펩타이드[116,125]의 양(y축, 피크 면적)을 보여주는 그래프를 도시한다. 빨간색 막대는 14N[116,125]이고 파란색 막대는 15N[116,125]이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다.
도 26은 두 가지 서로 다른 3단계 농축 과정을 보여준다. 표시된 샘플명은 도 27-28의 키에 해당한다.
도 27은 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다. 각각의 색상 선은 키에 그리고 도 26에 표시된 바와 같이 서로 다른 샘플이다.
도 28은 Nfl의 양을 LC-MS로 측정하여 보여주는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대한 14N 피크 면적이다. 트립신 펩타이드 명명법에 대한 설명은 실시예 2의 첫 번째 단락을 참고한다. 각각의 색상 선은 키에 그리고 도 26에 표시된 바와 같이 서로 다른 샘플이다.
도 29는 3단계 농축 과정을 도시한다. 표시된 샘플명은 도 30-39 및 41에 상응한다.
도 30은 CDR=0.5로 아밀로이드 양성인 대상체로부터 얻은 CSF로부터 농축된 Nfl의 양을 나타내는 그래프이다. y축은 x축을 따라 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. x축을 따라 1부터 24까지 넘버링된 트립신 펩타이드가 무엇인지는 표 A에 제공되어 있다. 파란색 선은 “30.13” 샘플이고 주황색 선은 “post 30.13_30.4IP” 샘플이다. 회색 선은 “post 30.13&4_30.11IP” 샘플이다.
표 A

도 31은 CDR=0.5로 아밀로이드 양성인 대상체로부터 얻은 CSF로부터 농축된 Nfl의 양을 나타내는 그래프이다. y축은 x축을 따라 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. x축을 따라 1부터 24까지 넘버링된 트립신 펩타이드가 무엇인지는 표 A에 제공되어 있다. 파란색 선은 “30.13” 샘플이고 주황색 선은 “post 30.13_30.4IP” 샘플이다. 회색 선은 “post 30.13&4_30.11IP” 샘플이다.
도 32는 CDR=0.5로 아밀로이드 양성인 대상체로부터 얻은 CSF로부터 농축된 Nfl의 양을 나타내는 그래프이다. y축은 x축을 따라 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. x축을 따라 1부터 24까지 넘버링된 트립신 펩타이드가 무엇인지는 표 A에 제공되어 있다. 파란색 선은 “30.13” 샘플이고 주황색 선은 “post 30.13_30.4IP” 샘플이다. 회색 선은 “post 30.13&4_30.11IP” 샘플이다.
도 33은 CDR=0.5로 아밀로이드 양성인 대상체로부터 얻은 CSF로부터 농축된 Nfl의 양을 나타내는 그래프이다. y축은 x축을 따라 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. x축을 따라 1부터 24까지 넘버링된 트립신 펩타이드가 무엇인지는 표 A에 제공되어 있다. 파란색 선은 “30.13” 샘플이고 주황색 선은 “post 30.13_30.4IP” 샘플이다. 회색 선은 “post 30.13&4_30.11IP” 샘플이다.
도 34는 CDR=0으로 아밀로이드 음성인 대상체로부터 얻은 CSF로부터 농축된 Nfl의 양을 나타내는 그래프이다. y축은 x축을 따라 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. x축을 따라 1부터 24까지 넘버링된 트립신 펩타이드가 무엇인지는 표 A에 제공되어 있다. 파란색 선은 “30.13” 샘플이고 주황색 선은 “post 30.13_30.4IP” 샘플이다. 회색 선은 “post 30.13&4_30.11IP” 샘플이다.
도 35는 CDR=0으로 아밀로이드 음성인 대상체로부터 얻은 CSF로부터 농축된 Nfl의 양을 나타내는 그래프이다. y축은 x축을 따라 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. x축을 따라 1부터 24까지 넘버링된 트립신 펩타이드가 무엇인지는 표 A에 제공되어 있다. 파란색 선은 “30.13” 샘플이고 주황색 선은 “post 30.13_30.4IP” 샘플이다. 회색 선은 “post 30.13&4_30.11IP” 샘플이다.
도 36은 CDR=0으로 아밀로이드 음성인 대상체로부터 얻은 CSF로부터 농축된 Nfl의 양을 나타내는 그래프이다. y축은 x축을 따라 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. x축을 따라 1부터 24까지 넘버링된 트립신 펩타이드가 무엇인지는 표 A에 제공되어 있다. 파란색 선은 “30.13” 샘플이고 주황색 선은 “post 30.13_30.4IP” 샘플이다. 회색 선은 “post 30.13&4_30.11IP” 샘플이다.
도 37은 CDR=0으로 아밀로이드 음성인 대상체로부터 얻은 CSF로부터 농축된 Nfl의 양을 나타내는 그래프이다. y축은 x축을 따라 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. x축을 따라 1부터 24까지 넘버링된 트립신 펩타이드가 무엇인지는 표 A에 제공되어 있다. 파란색 선은 “30.13” 샘플이고 주황색 선은 “post 30.13_30.4IP” 샘플이다. 회색 선은 “post 30.13&4_30.11IP” 샘플이다.
도 38은 CDR=0으로 아밀로이드 음성인 대상체로부터 얻은 CSF로부터 농축된 Nfl의 양을 나타내는 그래프이다. y축은 x축을 따라 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. x축을 따라 1부터 24까지 넘버링된 트립신 펩타이드가 무엇인지는 표 A에 제공되어 있다. 파란색 선은 “30.13” 샘플이고 주황색 선은 “post 30.13_30.4IP” 샘플이다. 회색 선은 “post 30.13&4_30.11IP” 샘플이다.
도 39는 CDR=0으로 아밀로이드 음성인 대상체로부터 얻은 CSF로부터 농축된 Nfl의 양을 나타내는 그래프이다. y축은 x축을 따라 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. x축을 따라 1부터 24까지 넘버링된 트립신 펩타이드가 무엇인지는 표 A에 제공되어 있다. 파란색 선은 “30.13” 샘플이고 주황색 선은 “post 30.13_30.4IP” 샘플이다. 회색 선은 “post 30.13&4_30.11IP” 샘플이다.
도 40A, 도 40B 및 도 40C는 도 31-40의 개별 데이터를 요약하는 그래프이다. y축은 x축을 따라 표시된 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. 빨간색 선은 아밀로이드 양성 대상체이고 검은색 선은 아밀로이드 음성 대상체이다.
도 40D는 도 31-40의 개별 데이터를 요약한 그래프이다. x축은 y축에 따른 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다.
도 41A 및 도 41B는 아밀로이드 양성(“AD”)이고 CDR 0, CDR 0.5, CDR 1 또는 CDR 2인 대상체, 또는 아밀로이드 음성이고 CDR 0, CDR 0.5 또는 CDR 1인 대상체로부터 얻은 CSF로부터 농축된 Nfl의 양을 보여주는 그래프이다. 아밀로이드 음성인 CDR ≥ 0.5인 대상체는 “비-AD”로 간주된다. 도 41A는 “post30.13_30.4IP 샘플”을 보여주고, 도 41B는 “post 30.13&4_30.11IP 샘플”을 보여준다. 각 그래프에서, y축은 x축을 따라 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다. x축을 따라 1부터 24까지 넘버링된 트립신 펩타이드가 무엇인지는 표 B에 제공되어 있다.
표 B

도 41C는 도 42B의 개별 데이터를 요약한 그래프이다. y축은 [529,539] 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율이다.
도 42A 및 도 42B는 “30.13 샘플”에서 LC-MS에 의해 측정된 혈액으로부터 농축된 Nfl의 양을 보여주는 그래프이다. 각 그래프에서, y축은 x축에 따른 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율(도 42A) 또는 14N 양(도 42B)이다. 주어진 ISTD의 트립신 펩타이드에 대해 신뢰할 수 있는 MS 신호가 검출되지 않은 경우 데이터가 보고되지 않았다. 각각의 선은 다른 혈액 샘플이다.
도 43A 및 도 43B는 “post30.13_30.4IP 샘플”에서 LC-MS에 의해 측정된 혈액으로부터 농축된 Nfl의 양을 보여주는 그래프이다. 각 그래프에서, y축은 x축에 따른 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율(도 43A) 또는 14N 양(도 43B)이다. 주어진 ISTD의 트립신 펩타이드에 대해 신뢰할 수 있는 MS 신호가 검출되지 않은 경우 데이터가 보고되지 않았다. 각각의 선은 다른 혈액 샘플이다.
도 44A 및 도 44B는 “post30.13&4_30.11IP 샘플”에서 LC-MS에 의해 측정된 혈액으로부터 농축된 Nfl의 양을 보여주는 그래프이다. 각 그래프에서, y축은 x축에 따른 각 트립신 펩타이드에 대해 측정된 피크 면적의 14N/15N 비율(도 44A) 또는 14N 양(도 44B)이다. 주어진 ISTD의 트립신 펩타이드에 대해 신뢰할 수 있는 MS 신호가 검출되지 않은 경우 데이터가 보고되지 않았다. 각각의 선은 다른 혈액 샘플이다.
도 45는 재조합 NfL의 면역침전을 보여준다. 23개의 NfL 항체(HJ.30.x) 각각과 아밀로이드 베타(HJ5.1)에 대한 하나의 음성 대조 항체를 전장 재조합 NfL을 면역침전시키는 능력에 대해 평가했다. 재조합 NfL 회수율의 상대 양이 표시된다(더 높은 N14/N15 = 더 높은 N14의 회수율). IP 이후 N15가 추가되었다.
도 46은 풀링된 CSF로부터의 천연 NfL의 면역침전을 보여준다. 23개 각각의 사내 NfL 항체(HJ.30.x)와 아밀로이드 베타에 대한 1개의 음성 대조군 항체(HJ5.1)를 CSF로부터 NfL을 면역침전시키는 능력에 대해 평가하였다. 선의 색상은 개별 항체에 해당하며 도면 범례에 표시되어 있다. 항체는 NfL의 3가지 다른 영역을 표적하는 것으로 나타났다.
도 47은 정량적(6개 펩타이드) MS 방법의 선형성을 보여준다. 6개 펩타이드 모두의 정량은 테스트된 N14/N15 범위 내에서 선형이다.
도 48은 CSF NfL이 다중 단편 종으로 존재함을 나타내는 신경필라멘트 경쇄 종들의 맵을 보여준다. 면역침전에 사용되는 NfL의 다양한 도메인을 표적으로 하는 항체는 질량 분석 분석과 결합되어 CSF에서 여러 NfL 종을 식별할 수 있게 하였다. 옅은색 점선은 NfL 종 식별에서 잠재적인 단편들을 나타내고, 진한 실선은 식별된 단편 종을 나타낸다. NfL 종은 23개의 서로 다른 맞춤형 항체를 사용하여 식별되었으며 NfL 종을 결정하는 데 사용된 데이터를 도 49A-49B에 나타낸다.
도 49A, 도 49B 및 도 49C는 뇌에 2개의 주요 NfL 종이 포함되어 있는 반면, CSF에는 적어도 3개의 주요 NfL 종이 포함되어 있음을 보여준다. 적어도 3개의 NfL 단편 종을 정제하고 식별하는 순차적 IP-MS/MS 분석을 위한 실험 방법 도 49A 풀링된 CSF로부터의 순차적 NfL IP는 3개의 주요 NfL 도메인; NfL93에서 NfL224까지의 중간 도메인 영역, NfL324에서 NfL359까지의 또 다른 영역, NfL530의 c-말단 영역을 나타내는 도 49B 그리고 NfL2에서 NfL540까지의 전장 NfL을 보여주는 뇌 피질 용해물(NfL 530에 c-말단 펩타이드 포함) 도 49C. 파란색 선은 HJ30.13을 사용한 1차 IP 후 식별된 펩타이드를 나타내고, 빨간색 선은 HJ30.4를 사용한 2차 IP 동안 식별된 펩타이드를 나타내며, 녹색 선은 HJ30.11을 사용한 3차 IP 동안 식별된 펩타이드를 나타낸다.
도 50은 NfL 종이 건강한 대조군과 비교하여 AD CSF에서 증가함을 보여준다. 세 가지 주요 CSF NfL 종의 순차적 IP/MS는 각 주요 종에 대한 대조군(n=6)과 비교하여 알츠하이머병 치매(n=4)에서 NfL 수준이 증가됨을 확인시켜준다. 빨간색 선은 PET 및 매우 경증인 치매(CDR=0.5)에 의한 아밀로이드 플라크의 존재에 의해 결정된 AD 치매 개체들에서 NfL 종의 상대적인 양을 나타내고 검은색 선은 연령이 동일한 건강한 대조군(CDR=0)을 나타낸다.
도 51A, 도 51B, 도 51C, 도 51D, 도 51E, 도 51F 및 도 51G는 검증 코호트가 건강한 대조군과 비교하여 AD에서 NfL324 및 NfL530을 증가시킴을 확인시켜줌을 보여준다. 정량적 IP-MS 방법에서 NfL 맵 및 펩타이드 위치를 보여주는 개략도(도 51A). Coil 1A 및 1B 영역 NfL101(도 51B), NfL117(도 51C) 및 NfL165(도 51D)에 대한 증상이 있는 AD 참가자(N=30; 아밀로이드 양성, CDR>0)와 건강한 대조군(N=25; 아밀로이드 음성, CDR=0) 간의 NfL 펩타이드 비교는 AD에서 유의미하지 않은 증가 경향을 나타내고, Coil 2B NfL283 영역(도 51E)에서는 차이가 없으며, NfL323(도 51F) 및 c-말단 영역 NfL529(도 51G)에서는 매우 유의미한 증가를 나타낸다. ** p<0.01에서 통계적 유의성을 나타낸다.
도 52A, 도 52B, 도 52C, 도 52D, 도 52E 및 도 52F는 NfL 종별 IP-MS와 ELISA 간의 상관관계를 보여준다. IP-MS와 표준 Uman Diagnostics ELISA 결과 사이의 상관관계는 NfL 종에 따라 다르다: NfL101(도 52A), NfL 117(도 52B), NfL 165(도 52C), NfL284(도 52D), NfL 324(도 52E), NfL530(도 52F). ELISA와 NfL324 사이에 가장 높은 상관관계가 관찰된다.
도 53A, 도 53B, 도 53C, 도 53D, 도 53E 및 도 53F는 NfL 종과 AD 치매 단계의 상관 관계를 보여준다(상자들의 CDR 합계). NfL 종의 양은 치매 중증도 단계와 최소한의 상관관계가 있다. 각 그래프의 x축은 CDR 상자 합계를 나타내며, 치매의 임상 척도는 CDR-SB 0은 정상, 0.5 내지 6은 경도 치매, >6은 중등도의 임상 치매를 나타낸다. NfL 종의 상대량은 NfL 영역의 N14/N15 비율로 y축에 표시된다. 각 그룹에 대해 계산된 스피어만의 상관관계 및 p-값: NfL101: 아밀로이드+ 스피어만 r = 0.29 (ns, p=0.05), 아밀로이드- 스피어만 r = 0.18 (ns, p=0.30)(도 53A); NfL117: 아밀로이드+ 스피어만 r = 0.30 (p=0.04), 아밀로이드- 스피어만 r = 0.18 (ns, p=0.31)(도 53B); NfL165: 아밀로이드+ 스피어만 r = 0.36 (p=0.01), 아밀로이드- 스피어만 r = 0.19 (ns, p=0.28)(도 53C); NfL284: 아밀로이드+ 스피어만 r = 0.24 (ns, p=0.10), 아밀로이드- 스피어만 r = 0.31 (ns, p=0.07)(도 53D); NfL324: 아밀로이드+ 스피어만 r = 0.30 (p=0.04), 아밀로이드- 스피어만 r = 0.16 (ns, p=0.35)(도 53E); NfL530: 아밀로이드+ 스피어만 r = 0.13 (ns, p=0.39), 아밀로이드- 스피어만 r = 0.25 (ns, p=0.14)(도 53F). 아밀로이드 플라크가 있는 참가자는 빨간색 원으로 표시되고, 아밀로이드 음성 참가자는 회색 사각형으로 표시된다. NfL101, NfL117, NfL165 및 NfL284에는 각각 그래프에 표시되지 않은 n=1의 이상치가 있지만 이는 상관 관계 계산에는 포함된다.
도 54A, 도 54B, 도 54C, 도 54D, 도 54E, 및 도 54F는 아밀로이드 상태 및 CDR에 의해 로그 변환된 NfL 농도를 보여준다. 아밀로이드-CDR 0 그룹을 참조 그룹으로 사용하고 나머지 3개 그룹은 두 개의 샘플 t 테스트를 사용하여 참조 그룹과 비교했다. 벤자민-호치버그 방법을 사용하여 다중 비교를 위한 P 값을 수정했다. 4개의 그룹 각각에 대한 NfL 농도(아밀로이드 음성 CDR = 0; 아밀로이드 양성 CDR = 0, 아밀로이드 양성 CDR > 0, 아밀로이드 음성 CDR > 0)를 NfL 101 (도 54A), NfL 117 (도 54B), NfL 165 (도 54C), NfL 284 (도 54D), NfL 324 (도 54E) 및 NfL 530 (도 54F)에 대해 비교했다.
도 55A, 도 55B, 도 55C, 도 55D, 도 55E, 및 도 55F는 로그 변환된 NfL 농도를 CDR 전반적 상태 별로 보여준다. NfL 101 (도 55A), NfL 117 (도 55B), NfL 165 (도 55C), NfL 284 (도 55D), NfL 324 (도 55E) 및 NfL 530 (도 55F)에 대해 두 개의 샘플 t 테스트를 사용하여 CDR 0과 CDR > 0 그룹 사이의 차이를 비교하였다.
도 56은 NfL 종과 신경변성, AD 및 타우의 임상 바이오마커 사이의 상관관계에 대한 히트맵을 보여준다. 맵은 스피어만의 상관관계를 나타내며 진한 파란색은 강한 상관관계를 나타내고 흰색/옅은 파란색은 약한 상관관계를 나타낸다. CSF NfL 영역의 가장 강한 상관관계는 서로간에 존재하였으며, c-말단 영역인 NfL324와 NfL530은 다른 NfL 영역과 가장 적은 상관관계를 보였다. NfL324 또는 NfL530과 CDR(임상 치매 등급 척도), 연령, p-tau와 t-tau 사이에는 적당한 상관관계가 있었던 반면, 아밀로이드 PET와 MMSE의 측정치는 상관관계가 낮았다. NfL과 tau 또는 ptau 사이의 상관관계는 다른 펩타이드보다 NfL의 c-말단 영역(NfL324, NfL530)에서 더 높았다.
도 57은 농축 과정(왼쪽)과 샘플 유형(오른쪽)의 도식을 보여준다.
도 58A, 도 58B, 도 58C, 도 58D, 도 58E 및 도 58F는 ALS, 척수성 근위축증(SMA) 및 대조군에 대한 Nfl 농도의 차이를 보여주는 그래프를 보여준다. 도 58F는 NfL 101의 농도를 보여준다. 도 58E는 NfL 117의 농도를 보여준다. 도 58C는 NfL165의 농도를 보여준다. 도 58D는 NfL 284의 농도를 보여준다. 도 58B는 NfL 324의 농도를 보여준다. 도 58A는 NfL 530의 농도를 보여준다.
도 59A, 도 59B, 도 59C, 도 59D, 도 59E 및 도 59F는 ALS 진행과 Nfl 농도 사이의 상관관계를 보여주는 그래프를 보여준다. 도 59F는 NfL 101의 상관관계를 보여준다. 도 59E는 NfL 117의 상관관계를 보여준다. 도 59C는 NfL165의 상관관계를 보여준다. 도 59D는 NfL 284의 상관관계를 보여준다. 도 59B는 NfL 324의 상관관계를 보여준다. 도 59A는 NfL 530의 상관관계를 보여준다.
도 60A, 도 60B, 도 60C, 도 60D, 도 60E, 및 도 60F는 ALS 진행과 Nfl 농도 사이의 상관관계를 보여주는 그래프를 보여준다. 도 60F는 NfL 101의 상관관계를 보여준다. 도 60E는 NfL 117의 상관관계를 보여준다. 도 60C는 NfL165의 상관관계를 보여준다. 도 60D는 NfL 284의 상관관계를 보여준다. 도 60B는 NfL 324의 상관관계를 보여준다. 도 60A는 NfL 530의 상관관계를 보여준다.
도 61은 ALS에서 CSF NfL 종의 순차적 IP/MS를 보여준다.
도 62는 대조군에서 CSF NfL 종의 순차적 IP/MS를 보여준다.
도 63은 SMA에서 CSF NfL 종의 순차적 IP/MS를 보여준다.
실시예
하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 구체예들을 증명하기 위하여 포함된다. 당업자는 다음 실시예에 개시된 기술이 본 발명의 실시에서 잘 기능하도록 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타낸다는 것을 이해해야 한다. 그러나 당업자는 본 개시 내용에 비추어 개시된 특정 실시예에서 많은 변경이 이루어질 수 있고 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 여전히 유사하거나 유사한 결과를 얻을 수 있으므로, 첨부된 실시예 및 도면에 제시되거나 도시된 모든 사항은 제한적인 의미가 아니라 예시적인 것으로 해석되어야 함을 이해하여야 한다.
실시예 1
이 실시예에서는 NfL 단클론 항체 생산을 위한 면역화 프로토콜을 설명한다.
항원: 재조합 단백질(신경필라멘트 경쇄-인간, 대장균에서 생산되고 정제됨). NfL 1-543aa를 생산하고 정제했다. 100 마이크로그램의 재조합 NfL 단백질을 B6/C3 마우스에 복강내(IP) 주사했다. 1차 주사는 200μl의 PBS + 200μl의 완전 프로인트 보조제 IP에 포함된 마우스당 100 마이크로그램의 재조합 NfL 1-543aa로 구성되었다. 14일 후 2차 주사는 마우스당 200마이크로리터의 PBS와 200마이크로리터의 불완전 프로인트 보조제 IP에 포함된 100 마이크로그램의 재조합 NfL 1-543aa로 구성되었다. 21일 후, 각 마우스로부터 30 마이크로리터의 혈액을 제거하고 재조합 NfL에 대해 직접 ELISA로 혈청을 스크리닝했다. 마우스는 200μl PBS와 200마이크로리터의 불완전 프로인트 보조제 IP에 포함된 100 마이크로그램의 재조합 NfL1-543aa를 28일 동안 주입받은 후 3차 주사를 받았다. 35일(2차 채혈) 후 30 마이크로리터의 혈액을 마우스로부터 제거하고 혈청을 재조합 NfL에 대해 직접 ELISA로 다시 평가했다. 마우스의 역가가 1:10,000 이상이었던 경우, 융합이 일어났다. 그런 다음 PBS에 용해된 재조합 NFL1-543aa 50 마이크로그램의 최종 부스트를 융합 3일 전에 마우스에 IP 주사했다.
이어서, 개별 클론들로부터 생산되는 항체를 재조합 NFL 1-543aa로 플레이트를 코팅하여 스크리닝하였다. 이를 위해, NfL 1-543aa를 플레이트에 둔 다음, 플레이트를 1% 우유로 차단시켰다. 그런 다음 플레이트를 PBS로 세척하고 PBS 완충액과 항-마우스 IgG HRP 중에서의 0.5% BSA에서 1:10으로 희석하여 개별 클론들의 세포 배양 배지를 첨가했다. 그런 다음 TMB를 첨가하고 650의 흡광도로 판독하고 이를 블랭크로서 세포 배양 배지 단독과 비교했다.
추가 특성화를 위해 23개의 항체를 선택했다(실시예 2 참조). 항체 HJ30.1, HJ30.2, HJ30.4, HJ30.7, HJ30.11 및 HJ30.13은 ATCC에 기탁되었다.
표 1
실시예 2
본 실시예에서는, 실시예 1에 기술된 23개의 항체 중 하나를 사용하여 Nfl을 면역침전시키고, 단백질 분해에 의해 분해한 다음, Nfl의 단백질 분해 펩타이드를 검출하고 질량 분석법(MS)으로 정량화했다. 이 실시예와 다른 실시예에 설명된 모든 MS 실험에서 ISTD의 주어진 트립신 펩타이드에 대해 신뢰할 수 있는 MS 신호가 검출되지 않은 경우, ISTD(15N) 또는 실험적 Nfl(14N)에 대해 데이터가 보고되지 않았다-예를 들어, 도 1의 트립신 펩타이드[55,83]을 참고한다. 트립신 펩타이드는 본 명세서의 실시예를 비롯한 명세서 전반에 걸쳐 특정 약어 표기법(“[X,Y]”)을 사용하여 식별되는데, 여기서 X는 트립신 펩타이드의 첫 번째 아미노산이고 Y는 트립신 펩타이드의 마지막 아미노산이며, X+1 또는 Y+1은 전장 Nfl(서열 번호 1)의 아미노산을 식별한다. 예를 들어, 명명법 “[55,83]”은 트립신 펩타이드 SYSSSSGSLMPSLENLDLSQVAAISNDLK(서열 번호 5)에 대한 약어로서, 이는 전장 Nfl(서열 번호 1)의 아미노산 56 내지 84로 구성된다.
면역침전된 Nfl의 회수를 촉진하기 위해 제조업체 지침에 따라 개별 항체를 비드 mg당 항체 25μg의 농도로 Dynabeads®에 가교시켰다. 항-Aβ 항체인 HJ5.1을 음성 대조군으로 사용하였다. 전장, 재조합 Nfl(rec-Nfl) 및 뇌 용해물 또는 CSF로부터 단리된 생물학적으로 생산된 Nfl을 평가했다.
전장 재조합 Nfl(rec-Nfl) 분석을 위해 1% HSA 중 5ng/uL rec-Nfl 10uL를 100mM TEABC 40uL에 첨가했다. 항체-접합된 비드 제제의 30%(즉, 3 mg/mL) 슬러리 30 uL를 첨가하고, 샘플을 실온에서 120분 동안 원심분리시켜 Nfl을 면역침전시켰다. 항체-접합된 비드를 자기적으로 분리하고 IP 후 상층액을 제거했다. 비드를 1mL의 25mM TEABC(세척 1회 당)에서 3회 세척했다.
NfL은 또한 뇌 용해물과 CSF로부터 친화도 정제되었다. 사용된 뇌 샘플은 이전에 용해된 샘플이었고 분석 개발을 위해 -80°C에서 보관되었다. 대상체에 대한 환자 인구통계(예: 연령, 성별, 신경 질환의 임상 징후 또는 증상)는 확보되지 않았다. 냉동된 용해물을 해동하고 분취량을 1% HSA로 1:1000으로 희석했다. 해동된 뇌 용해물 450μl를 1.6mL의 새 튜브로 옮겼다. 이후 세제(1% NP-40), 카오트로픽 시약(5mM 구아니딘) 및 프로테아제 억제제(Roche 완전 프로테아제 억제제 칵테일)를 포함하는 마스터 믹스 25uL 및 50mM 트리에틸 암모늄 중탄산염 완충액(TEABC) 중의 0.5ng/ml Nfl 내부 표준(ISTD) 20uL를 첨가했다. Lys, Arg, 13C 및 15N 표지된 재조합 전장 Nfl이 ISTD로 사용되었다. 항체-접합된 비드 제제의 30%(즉, 3 mg/mL) 슬러리 30 uL를 첨가하고, 샘플을 실온에서 120분 동안 원심분리시켜 Nfl을 면역침전시켰다. 항체-접합된 비드를 자기적으로 분리하고 IP 후 상층액을 제거했다. 비드를 1mL의 25mM TEABC(세척 1회 당)에서 3회 세척했다.
사용된 CSF 샘플은 이전에 분석 개발을 위해 인간 대상체로부터 얻은 것이며 -80°C에서 보관되었다. 대상체의 환자 인구통계(예를 들어, 연령, 성별, 신경 질환의 임상 징후 또는 증상)는 알려져 있지 않다. 냉동된 CSF 샘플을 실온에서 해동하고, 해동된 CSF 500μl를 새 튜브로 옮겼다. 이후 세제(1% NP-40), 카오트로픽 시약(5mM 구아니딘) 및 프로테아제 억제제(Roche 완전 프로테아제 억제제 칵테일)를 포함하는 마스터 믹스 25uL 및 50mM 트리에틸 암모늄 중탄산염 완충액(TEABC) 중의 0.5ng/ml Nfl 내부 표준(ISTD) 20uL를 첨가했다. Lys, Arg, 13C 및 15N 표지된 재조합 전장 Nfl이 ISTD로 사용되었다. 항체-접합된 비드 제제의 30%(즉, 3 mg/mL) 슬러리 30 uL를 첨가하고, 샘플을 실온에서 120분 동안 원심분리시켜 Nfl을 면역침전시켰다. 항체-접합된 비드를 자기적으로 분리하고 IP 후 상층액을 제거했다. 비드를 1mL의 25mM TEABC(세척 1회 당)에서 3회 세척했다.
샘플에 관계없이, 항체-결합된 Nfl을 25mM TEABC 중 400ng MS 등급 트립신 또는 Lys-C를 사용하여 37°C에서 16시간 동안 비드 상에서 분해시켰다. 프로테아제의 농도, 인큐베이션 시간 및 완충액은 당업계에 공지된 방법에 따라 조정될 수 있다. 분해물을 제조업체 지침에 따라 전처리된 TopTip C18에 로딩하고, 0.1% 포름산(FA)으로 2회 세척하여 탈염하고, 60% 아세토니트릴(ACN) 및 0.1% FA로 용출했다. 용출된 펩타이드를 진공 원심분리로 건조시키고 -80°C에 보관하거나 즉시 재현탁시켰다.
MS 분석을 위해, 용출된 펩타이드를 25uL의 0.1% FA/0% CAN으로 재구성했다. 그런 다음 각 분해물의 4.5uL 분취량을 MS 분석을 위해 나노-Acquity LC에 주입했다. 나노-Acquity LC(Waters Corporation, Milford, MA, USA)에는 HSS T3 75 μm x 100 μm, 1.8 μm 컬럼 및 유속 0.5 μL/분이 장착되었다. 펩타이드는 2% 용매 B에서 95% 용매 B까지의 기울기에 따라 분리되었다. 용액 A는 MS 등급 물에 포함된 0.1% 포름산으로 구성되었으며, 용액 B는 아세토니트릴에 포함된 0.1% 포름산으로 구성되었다. 샘플은 2,200V의 스프레이 전압과 275°C의 이온 전달 튜브 온도로 양이온 모드에서 분석되었다. 데이터는 2+ 또는 3+ 전하 상태를 표적하는 내인성(N14) 및 동위원소 표지된(C13N15) 펩타이드에 대한 병렬 반응 모니터링(PRM)을 통해 수집되었다. HCD 충돌 에너지는 18-27% 범위였으며 각 펩타이드에 대해 최적화되었다. 최대 주입 시간은 24 내지 118ms 범위였으며 각 펩타이드에 최적화되었다. 정규화된 AGC 목표는 400%로 설정되었다. Skyline 소프트웨어(McCoss 연구소)를 사용하여 데이터를 추출하고 Skyline 및 Microsoft Excel에서 분석했다.
도 1은 rec-Nfl에 대한 Nfl 복구/IP 효율성의 개요를 제공한다. 도 2는 뇌 용해물로부터의 Nfl 복구/IP 효율성의 개요를 제공한다. 도 3은 CSF로부터의 Nfl 복구/IP 효율성의 개요를 제공한다. 도 4-21은 개별 항체에 대한 데이터를 보여준다. 각 그래프의 경우 y축은 14N/15N 비율이고 x축의 각 점은 Nfl의 트립신 펩타이드이다.
도 1에서, 14N/15N 비율은 서열을 따라 일관되며, 이는 ISTD와 실험적 Nfl(rec-Nfl)이 모두 전장 단백질이었다는 점을 고려하면 예상된 것이다. 특히, HJ13.3.2, HJ30.19, HJ30.19-40, HJ30.19-77에서는 rec-Nfl 복구가 나타나지 않았다.
뇌 용해물에서 검출된 Nfl도 대부분 전장이었다(도 2). 분석 결과 N-말단 메티오닌이 절단되었고 아미노산(세린)이 아세틸화되었음을 나타냈다(데이터는 표시되지 않음). 트립신 펩타이드 [370,378], [379,389] 및 [391,398]에서 나타나는 높은 신호는 오염 물질로 인한 것으로 결정되었다(데이터는 표시되지 않음).
뇌 용해물 샘플 분석에서 나타난 오염은 CSF 샘플 분석에서도 나타났다(도 3-21). 트립신 펩타이드 [370,378], [379,389] 및 [391,398]은 Nfl에 고유한 것이 아니므로 생물학적 샘플에서 Nfl의 검출 및 정량화에 사용해서는 안 된다. [2,14]의 아세틸화는 CSF Nfl에서도 나타났다(도 3-21). 뇌 용해물에서 나온 rec-Nfl 및 Nfl에서 볼 수 있는 14N/15N 비율과 달리, CSF에서 나온 Nfl은 서열을 따라 일관되지 않은 14N/15N 비율을 나타냈는데, 이는 CSF에서 절단된 여러 Nfl 종을 나타낸다(도 3). 개별 항체들의 프로파일을 비교하면(도 4-21), 특정 항체가 다른 항체보다 CSF Nfl을 면역침전시키는 데 더 효과적이며 CSF Nfl이 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단에서 절단되는 다양한 길이의 다수의 Nfl 이소형을 포함한다는 것이 분명했다.
위에서 설명한 방법에 의해 뇌 용해물과 CSF로부터 농축된 일부 가능한 이소형들의 요약은 대략적인 크기와 함께 도 22에 설명되어 있다.
실시예 3
이 실시예에서 Nfl은 HJ30.4, HJ30.11 또는 HJ30.13 중 하나를 사용하여 CSF로부터 면역침전되었다. 사용된 CSF 샘플은 이전에 분석 개발을 위해 인간 대상체로부터 얻은 것이며 -80°C에서 보관되었다. 대상체의 환자 인구통계(예를 들어, 연령, 성별, 신경 질환의 임상 징후 또는 증상)는 알려져 있지 않다. 면역침전 및 LC-MS 분석은 실시예 2에 일반적으로 기술된 바와 같으나, 면역침전 후 회수된 상층액에 동일한 항체를 사용하여 2차 면역침전을 실시하였다. 14N(빨간색 막대) 및 15N(파란색 막대) 데이터가 별도로 표시된다(도 23-25). 각 도면의 처음 두 개의 막대는 1차 농축 단계에 해당하고 두 번째 두 개의 막대는 2차 농축 단계에 해당한다.
내부 표준(ISTD, 파란색 막대)의 대부분은 1차 농축 단계에서 샘플로부터 회수된다. 이는 동일하거나 다른 에피토프 결합제를 사용하여 순차적 농축 라운드를 수행하는 경우 전장의 내부 표준을 다시 추가해야 함을 의미한다. 유사하게, HJ30.4 및 H30.13은 단일 단계로 CSF로부터 Nfl 이소형을 효율적으로 농축시켰다(도 23-24). 대조적으로, HJ30.11은 특이적으로 결합하는 모든 Nfl 이소형을 단일 단계로 면역침전시키지 않았다(도 25).
실시예 4
다수의 항체를 사용하여 CSF로부터 Nfl의 순차적 면역침전도 수행되었다. 사용된 CSF 샘플은 이전에 분석 개발을 위해 인간 대상체로부터 얻은 것이며 -80℃에서 보관되었다. 대상체의 환자 인구통계(예를 들어, 연령, 성별, 신경 질환의 임상 징후 또는 증상)는 알려져 있지 않다. 면역침전 및 LC-MS 분석은 일반적으로 실시예 2에 기재된 바와 같았으나, 1차 면역침전 후 회수된 상층액을 2차 항체로 2차 면역침전시킨 다음, 2차 면역침전 후 회수한 상층액을 제3 항체로 3차 면역침전시켰다. 한 실험에서는 HJ30.2, HJ30.7, HJ30.11을 순차적으로 면역침전에 사용했다. 두 번째 실험에서는 HJ30.11, HJ30.7, HJ30.2를 순차적으로 면역침전에 사용하였다. 이 실험에서는 초기 CSF 샘플에만 내부 표준이 추가되었다. 각 실험은 이중으로 수행되었다. 실험 설계의 개략도를 도 26에 나타내었다. 후속 농축 라운드 전에 각 IP 후 상층액에 내부 표준을 추가하는 대체 접근법을 도 29에 나타낸다.
두 실험의 데이터는 도 27-28에 함께 표시된다. 도 27에서, y축은 14N/15N 비율이고 x축의 각 점은 Nfl의 트립신 펩타이드이다. 도 28에서, y축은 14N 신호이고 x축의 각 점은 Nfl의 트립신 펩타이드이다. 각각의 색상 선은 키에 그리고 도 26에 표시된 바와 같이 서로 다른 샘플이다. 주어진 ISTD의 트립신 펩타이드에 대해 신뢰할 수 있는 MS 신호가 검출되지 않은 경우 데이터가 보고되지 않았다. C-말단을 포함하는 Nfl 이소형은 공정 시작과 비교하여 공정 종료 시 HJ30.11을 사용한 순차적 농축 이후 더 풍부했다(“30.11” 또는 “30.11_duplicate”를 도 28의 “post 30.2&7_30.11IP” 또는 “post 30.2&7_30.11IP_duplicate”와 비교). 분석된 다른 샘플에서는 이러한 C-말단 이소형의 검출이 무시할 정도였다. 이들 데이터는 상이한 에피토프 결합제의 순차적 사용이 Nfl 이소형의 상이한 집단을 농축시킨다는 것을 보여준다.
실시예 5
본 실시예에서, 신경 손상이 있는 인간 대상체로부터 얻은 CSF 샘플로부터의 Nfl 이소형을 대조군 인간 대상체로부터 얻은 CSF 샘플로부터의 Nfl 이소형과 비교하였다. 면역침전 및 LC-MS 분석은 일반적으로 실시예 2에 기재된 바와 같았으나, HJ30.13으로 1차 면역침전 후 회수된 상층액을 HJ30.4로 2차 면역침전시킨 다음, 2차 면역침전 후 회수한 상층액을 HJ30.11로 3차 면역침전시켰다. 후속 농축 라운드 전에 각 IP 후 상층액에 내부 표준도 추가되었다. 실험 설계의 개략도를 도 29에 나타내었다.
도 30-39에 표시된 데이터는 알츠하이머병(AD)에 대한 하나 이상의 바이오마커를 가진 인간 대상체에서 얻은 CSF 샘플, 또는 대조군 인간 대상체에서 얻은 CSF 샘플을 사용한 실험에서 얻은 것이다. 보다 구체적으로, AD를 갖는 것으로 식별된 대상체는 PIB-PET 영상 검사 또는 CSF Aβ42 수준에 의해 평가된 바와 같이 아밀로이드 양성이었다(도 30-33). 이 코호트의 모든 AD 대상체는 또한 임상 치매 등급(CDR) 점수가 ≥ 0.5였다. 대조군 대상체는 CDR 점수가 0이었고 아밀로이드 음성이었다(도 34-39). 각 도면은 개개의 대상체이며; 각 도면에서 파란색 선은 HJ30.13에 의해 면역침전된 Nfl 이소형이고, 주황색 선은 HJ30.4에 의해 면역침전된 Nfl 이소형이고, 회색 선은 HJ30.11에 의해 면역침전된 Nfl 이소형이며, 여기서 y축은 14N/15N 비율이고 x축의 각 점은 Nfl의 트립신 펩타이드이다. 주어진 ISTD의 트립신 펩타이드에 대해 신뢰할 수 있는 MS 신호가 검출되지 않은 경우 데이터가 보고되지 않았다. 도 40에 요약된 바와 같이, Nfl의 일부 부분은 AD 대상체와 대조군 대상체를 더 잘 구별할 수 있는 것으로 보인다.
도 41에 제시된 데이터는 CDR 점수(0, 0.5, 1 또는 2) 별로 그룹화된 AD에 대한 하나 이상의 바이오마커(즉, PIB-PET 영상 검사 또는 CSF Aβ42 수준에 의해 평가된 적어도 아밀로이드 양성)를 갖는 인간 대상체로부터 얻은 추가 CSF 샘플, 대조군 인간 대상체(아밀로이드 음성 및 CDR=0)의 추가 샘플, 아밀로이드 음성이지만 매우 경도 치매(CDR 0.5) 또는 경도 치매(CDR 1)가 있는 인간 대상체로부터 얻은 샘플을 사용한 실험에서 얻은 것이다. 매우 경도 내지 경도 치매의 아밀로이드 음성 상태는 다른 신경 질환 과정(즉, AD 이외에, 인지에 영향을 미치는 신경 질환)을 나타낼 수 있다. 기술적 오류로 인해 1차 농축 단계의 Nfl 데이터를 얻을 수 없었다. 그러나 2차 및 3차 농축 단계의 데이터는 AD 대 대조군(아밀로이드 음성, CDR 0)의 초기 분석과 유사해 보였다. 특히, 데이터는 서열 번호 1의 C-말단 아미노산 530 내지 540을 포함하는 Nfl 이소형이 AD 대상체를 대조군 대상체와 구별한다는 것을 다시 보여준다. 또한, 경도 치매(CDR 1)가 있는 아밀로이드 음성 대상체의 데이터는 검출된 Nfl 이소형이 다른 원인으로 인한 신경 손상의 마커로서 유용할 수 있음을 시사한다.
실시예 6
이 실시예에서는 인간 대상체로부터 얻은 혈액 샘플의 Nfl 이소형을 분석했다. 두 가지 서로 다른 혼합 혈액 샘플이 사용되었는데, 각 샘플은 이전에 분석법 개발을 위해 여러 인간 대상체로부터 얻은 혈액으로 구성되고, 풀링되어, -80℃에서 보관되었다. 면역침전 및 LC-MS 분석은 일반적으로 CSF 대신 혈액 0.5mL를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5에 기재된 것과 동일했다. 도 42-44에 표시된 바와 같이, 혈액 내 Nfl 농도는 CSF보다 낮지만 검출 가능하다. 더욱이, 혈액도 CSF와 유사하게 다수의 Nfl 이소형으로 구성된다. 또한 CSF와 유사하게 혈액에는 주로 C-말단으로 구성된 여러 개의 절단된 Nfl 이소형이 있다.
실시예 7
이 실시예는 NfL의 다양한 영역에 결합하는 개발된 항체를 활용하고 뇌 조직 및 CSF에서 면역침전 질량 분석법(IP-MS)을 사용하여 이러한 항체들에 의해 회수된 NfL 도메인을 특성화함으로써 이전 실시예들을 확장시킨다. 본 실시예는 뇌 NfL이 주로 전장 단백질로 구성되어 있는 반면 CSF NfL은 다양한 단백질 단편 종들의 혼합물로 구성되어 있음을 보여준다. 그런 다음 대조군과 AD의 발견 코호트에서 새로 식별된 NfL 단편 종들을 테스트하고 확인 코호트에서 추가로 검증했다.
분석 개발에 사용된 풀링된 CSF 샘플은 이전에 인간 대상체로부터 획득하여 -80°C에서 보관했다. 초기 수집 시 CSF를 1000 xg에서 10분간 원심분리하여 세포 잔해를 제거하고 즉시 -80℃에서 동결시켰다. 뇌 샘플에는 분석 개발을 위해 -80°C에 보관된 이전에 용해된 샘플이 포함되었다. 이전 연구에서 모든 AD 및 대조군 CSF 샘플을 수집하고 분취하여 -80℃에 보관했다. 검증 코호트에는 유증상 아밀로이드 양성 참가자 30명, 무증상 아밀로이드 양성 참가자 16명, 유증상 아밀로이드 음성 참가자 10명, 음성 대조군 25명의 CSF 샘플이 포함되었다. 참가자 인구통계를 표 2에 나타낸다.
표 2: 검증 코호트의 인구통계
항체-접합된 비드 제제의 30%(즉, 3 mg/mL) 슬러리 30 μL를 첨가하고, 샘플을 실온에서 120분 동안 원심분리시켜 재조합 및 천연 NfL 모두를 면역침전시켰다. 항체-접합된 비드를 자기적으로 분리하고 IP 후 상층액을 제거했다. 비드를 1mL의 25mM TEABC(세척 1회 당)에서 3회 세척했다. 결합된 NfL을 400ng MS 등급 트립신/Lys-C(Promega)를 사용하여 37℃에서 16시간 동안 비드 상에서 분해했다. 분해물을 TopTip C18(Glygen, TT2C18.96)에 부하하고 탈염시키고 용출시켰다. 용출액을 열 없이 진공에서 건조시키고 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)으로 분석할 때까지 -80℃에서 보관했다(아래 LC-MS/MS 방법 참조). 16개의 항체가 전장 재조합 단백질을 회수했다(도 45). 풀링된 CSF로부터 면역침전된 천연 NfL의 펩타이드 프로파일에 기초하여, 항체는 막대 도메인의 아미노 말단 부분, 막대 도메인의 카르복시 말단 부분, 또는 NfL의 카르복시 말단 부분에 대한 에피토프를 갖는 것으로 결정되었다(도 46). 높은 회수율과 NfL 특이성을 지닌 항체를 이들 NfL 도메인 각각에 대해 선택하여 정성적 및 정량적 IP-MS 분석에 사용했다. 맞춤형 항체 중 어느 것도 NfL의 N-말단을 인식하지 못했다.
뇌 용해물과 CSF에서 NfL을 특성화하기 위해 3단계 순차적 면역침전이 사용되었다. 막대 도메인의 Coil 1A/1B(HJ30.13), 막대 도메인의 Coil 2B(HJ30.4) 및 꼬리 영역(HJ30.11)을 표적으로 하는 항체를 사용했다. 냉동 뇌 용해물을 해동시키고, 해동된 뇌 용해물 450μL 분취량을 1% HSA로 1:1000으로 희석했다. 냉동 CSF 샘플을 실온에서 해동시키고, 해동된 CSF 450μL를 면역침전을 위해 새로운 1.6mL 튜브로 옮겼다.
뇌와 CSF 샘플 모두 HJ30.13(Coil 1A/1B 항체)의 항체-접합 비드 제제의 30%(즉, 3 mg/mL) 슬러리 30 μL를 사용하여 천연 CSF에 대해 위에서 설명한 바와 같이 면역침전되었다. 세척된 비드는 모든 샘플이 비드 상에서의 분해에 대해 준비가 될 때까지 얼음에서 보관되었다. 두 번째 단계에서는 50mM TEABC 중의 0.5ng/ml NfL ISTD 20μL를 첨가하고, HJ30.4(Coil 2B 항체)의 항체-접합 비드 제제의 30%(즉, 3mg/mL) 슬러리 30μL를 첨가하여 NfL을 두 번째로 면역침전시켰다. 나머지 단계는 첫 번째 면역침전과 동일했다. 50mM TEABC 중의 ISTD 10ng을 다시 IP 후 상층액에 첨가한 다음 HJ30.11(꼬리 항체)을 사용하여 세 번째 순차적 면역침전을 수행하였다. 결합된 NfL을 400ng MS 등급 트립신/Lys-C(Promega)를 사용하여 37℃에서 16시간 동안 비드에서 분해하고 샘플들을 위에서 설명한 대로 추출했다.
ISTD를 순차적으로 추가할 필요가 없도록 하기 위해 막대 도메인의 Coil 1A/1B(HJ30.13), 막대 도메인의 Coil 2B(HJ30.4) 및 꼬리 영역(HJ30.11)을 표적으로 하는 항체를 1:1:1로 혼합했하여, 각 항체의 최종 농도가 10%(즉, 1mg/mL)인 항체 슬러리를 생성하였다. 세제(1% NP-40), 카오트로픽 시약(5mM 구아니딘) 및 프로테아제 억제제(Roche 완전 프로테아제 억제제 칵테일)를 함유한 마스터 믹스 25μL를 96웰 플레이트에 첨가했다. 그런 다음 5μL의 ISTD(1% HSA 중 0.1ng/μL; 정량적 회수 및 분석의 동적 범위에 최적화된 양 및 ISTD 용매)를 첨가한 다음, 해동된 CSF 450μL 및 항체 슬러리 30μL를 첨가했다. 위에서 설명한 대로 면역침전 및 비드 상의 분해를 수행했다.
풀링된 CSF를 스크리닝하여 NfL 농도가 낮거나 높은 풀을 식별했다. NfL 농도가 가장 낮고(NfL-L1) 가장 높은(NfL-L2) CSF 풀을 선택하여 분석의 선형 범위를 결정하는 데 사용했다. NfL-L2 CSF를 NfL-L1 CSF로 연속 희석하여 100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.13% 및 1.56%의 NfL-L2를 포함하는 8점 곡선을 생성했다. NfL은 농축을 위해 위에서 설명한 대로 3회 IP 처리되었다. 정량적 방법으로 6개의 펩타이드 각각에 대해 N14/N15 비율을 결정하고, 반복실험의 평균 N14/N15 비율을 NfL-L2%에 대해 플롯팅하고 선형 회귀를 수행했다. 6개 펩타이드 모두 테스트된 NfL 농도 전반에 걸쳐 우수한 선형성을 나타냈으며 R2 ≥ 0.988이었다(도 47). 선형 범위 전반에 걸쳐 각 펩타이드의 평균 CV%는 8-12%였다(표 3).
표 2: IP-MS 방법에서 선형 범위 전반에 걸친 십진수 CV%
추출된 분해물은 25μL의 0.1% 포름산/0% ACN으로 재구성되었다. 그런 다음 각 분해물의 4.5 μL 분취량을 MS 분석을 위해 나노-Acquity LC에 주입했다. nano-Acquity LC(Waters Corporation, Milford, MA, USA)에 HSS T3 75 μm x 100 μm, 1.8 μm 컬럼을 장착하고 유속 0.5 μL/분의 용액 A와 B 기울기를 사용하여 펩타이드를 분리했다. 용액 A는 MS용 물에 용해된 0.1% 포름산으로 구성되었으며, 용액 B는 아세토니트릴에 용해된 0.1% 포름산으로 구성되었다. 샘플은 2,200V의 스프레이 전압과 275℃의 이온 전달 튜브 온도로 양이온 모드에서 분석되었다. 데이터는 내인성(N14) 및 동위원소 표지된(Lys, Arg: 13C 15N) 펩타이드에 대한 병렬 반응 모니터링(PRM)을 통해 수집되었다. NfL에 특이적인 트립신 펩타이드는 Blast 검색을 통해 식별되었으며, 이온화가 잘 된 것들은 서열 적용 범위를 최적화하도록 설계된 정성적 PRM에 포함되었다. 정량적 방법은 분석 정밀도를 위해 최적화되었으며 다중화는 다양한 NfL 도메인 및 이들의 상응하는 ISTD 전반에 걸쳐 6개의 NfL 펩타이드 분석으로 축소되었다(표 4).
표 3: 정량적 MS 펩타이드 목록
검증 코호트는 이전에 AD 치매(아밀로이드 양성, CDR 0-2), 비-AD 치매(아밀로이드 음성, CDR 0.5-1) 및 건강한 대조군(아밀로이드 음성, CDR 0) 개체들로부터 수집된 81개의 CSF 샘플로 구성되었다. 아밀로이드 양성은 이전에 Aβ42/Aβ40 비율에 의해 결정되었다(Patterson et al., 2015). 각 CSF 샘플에 대해 위에서 설명한 정량적 IP-MS 방법을 사용하여 NfL의 4가지 서로 다른 도메인(Coil 1A, Coil 1B, Coil 2B 및 테일)에 해당하는 6개의 NfL 펩타이드를 측정했다. NfL은 또한 제조업체의 사양에 따라 시판 ELISA 키트(UMAN Diagnostics)를 통해 측정되었다. 간단히 말하면, ELISA 측정을 위해 CSF 샘플을 젖은 얼음에서 해동시키고 와류시켰다. 그런 다음 샘플을 96 웰 사전 플레이트에서 제공된 샘플 희석제로 2x 희석하고 혼합하여 분석 플레이트로 옮겼다.
가용성 NfL 종과 AD 임상, 인지, 영상 검사 및 바이오마커 측정값의 관계를 확인하기 위해, 각 NfL 영역(IP-MS)과 이전에 얻은 바이오마커 데이터 간에 상관 분석을 수행했다. 다음 측정값을 평가했다: 연령, CDR-전체 및 CDR 상자 합계(CDR-SB), 간이 정신 상태 검사(MMSE), 아밀로이드 플라크 영상 검사(PET PiB), CSF A42/ A40, CSF 총 타우(t-tau), CSF ptau 181 및 ptau181/tau181, CSF ptau205 및 ptau205/tau205, CSF ptau217 및 ptau217/tau217.
NfL에 대해 23개의 단클론 항체를 생성하고 전장 Rec-NfL, 뇌 용해물로부터의 NfL 및 풀링된 CSF로부터의 NfL을 면역침전시키는 능력에 대해 평가했다. 항체는 표적화한 NfL 도메인, IP 효율성 및 특이성을 특징으로 한다. 각 NfL 도메인에 대한 대표 항체를 선택하여 추가 분석 개발에 사용했다. 다양한 NfL 도메인을 표적하는 항체를 사용하여 우리는 CSF에 여러 NfL 종이 존재한다는 것을 확인했다(도 48). CSF에서 NfL 종을 더 잘 규명하기 위해, 풀링된 CSF 샘플을 Coil 1A/1B를 표적으로 하는 항체(약 aa93-252, HJ30.13)로 시작하고, 다음으로 Coil 2B를 표적으로 하는 항체(약 aa272-396, HJ30.4), 마지막으로 꼬리 부위의 C 말단을 표적으로 하는 항체(aa 520-550, HJ30.11)를 사용하여 순차적으로 면역침전시켰다. 이러한 단백질 프로파일을 기반으로 CSF에서 최소 3개의 주요 NfL 단편 종을 식별했지만, 이들 종의 다양한 변이가 존재할 가능성이 높다. 여기에는 HJ30.13(aa92부터 적어도 aa224까지, 가능한 변이는 aa360을 통해 확장) 및 HJ30.4(aa324부터 aa360까지)에 의해 농축된 막대 도메인을 포함하는 두 개의 서로 다른 N-말단 및 C-말단 절단뿐만 아니라 NfL의 꼬리(HJ30.11에 의해 농축, aa530부터 적어도 aa540까지 포함)를 포함하는 C-말단 단편도 포함된다. N-말단 단편은 회수되지 않았으며 전장 NfL은 CSF에 정량 가능한 농도로 존재하지 않았다(도 49A-49B).
CSF의 고도로 단편화된 단백질과 대조적으로, 뇌 조직 균질액은 대부분 전장 NfL을 함유했다. 절단된 이소형이 뇌에도 존재하는지 확인하기 위해 인간 뇌 조직에 대해 동일한 순차적 면역침전을 수행했다. 대부분의 뇌 NfL은 전장인 것으로 보였지만, 적어도 아미노산 530-540을 함유하는 꼬리 하위 도메인 B의 C-말단 단편도 관찰되었는데(도 49A, 49C), 이는 CSF에서 확인된 단편과 유사하다. aa165-224를 포함하는 단편은 HJ30.13에 의해 농축된 것으로 보인다. 2차 IP 동안 뇌에 어떠한 추가 NfL 단편도 농축되지 않았다(HJ30.4, 막대 도메인의 Coil 2B).
풀링된 실험 CSF에 대해 초기에 테스트된 순차 IP-MS 방법을 알츠하이머병 치매(AD, N=4) 및 건강한 대조군(N=6)의 발견 코호트에서 얻은 CSF 샘플에서 반복하였다. 두 임상 그룹 모두에서 관찰된 펩타이드는 풀링된 CSF에서 관찰된 것과 유사했지만, 대조군과 비교하여 AD에서 3가지 주요 NfL 종의 양이 증가했다(도 50). 또한 일부 펩타이드는 AD와 대조군 샘플을 구별하는 데 있어 다른 펩타이드보다 더 나은 것으로 나타났다. 가장 두드러진 차이는 C-말단 꼬리의 NfL530(트립신 펩타이드 VEGAGEEQAAK(서열 번호 29), aa530-540)과 막대 도메인의 Coil 1B 내 트립신 펩타이드 GADEAALAR(서열 번호 16)에서 관찰되었다.
AD, 비-AD 치매 및 건강한 대조군에서 CSF NfL 종을 더 잘 비교하기 위해 우리는 여러 NfL 종에 걸쳐 선택 영역들을 안정적으로 측정하는 정량적 NfL 분석법을 개발했다. 정밀도를 향상시키기 위해 정량적 방법의 다중화를 줄여, 다양한 NfL 도메인과 해당 내부 표준들 전반에 걸쳐 6개의 펩타이드를 측정했다. 그런 다음 IP-MS 정량적 방법을 적용하여 AD 81개 및 대조군 샘플의 검증 코호트에서 특정 CSF NfL 종들을 측정했다(아밀로이드 양성 30개, CDR>0; 아밀로이드 양성 16개, CDR=0; 아밀로이드 음성 10개, CDR=0; 아밀로이드 음성 25개, CDR=0, 표 2). 비교를 위해 금 표준 Uman NfL 면역분석법을 사용하여 CSF NfL 농도를 정량화했다.
발견 코호트의 순차적 IP 결과(도 51)와 일관되게, 아밀로이드 음성 건강한 대조군(N=25)과 비교하여 유증상 아밀로이드 양성 개체들의 확인 코호트(N=30)에서 NfL 농도의 증가가 확인되었다(도 52). 흥미롭게도 그룹들 간의 차이는 일부 영역에서 다른 영역들보다 더 컸으며 막대 도메인의 Coil 2B(NfL324; GMNEALEK(서열 번호 20), aa324-331)와 꼬리의 C-말단(NfL530; VEGAGEEQAAK(서열 번호 29), aa530-540.)에서 가장 큰 차이가 관찰되었다. NfL324는 대조군과 비교하여 AD에서 1.5배 증가하였고(P = 0.008, 도 52F), NfL530은 1.7배 증가하였다(P = 0.002, 도 52G).
NfL 면역분석법은 대조군에 비해 AD에서 1.4배 증가했다. 이는 NfL324 펩타이드 농도(R2 = 0.84)와 가장 강한 상관관계를 가졌는데, 이는 Uman 면역분석법이 Coil 2B 영역을 포함하는 CSF NfL 단편을 표적한다는 것을 시사하는 것이다. 중요하게도, 면역분석법과 다른 조사 펩타이드 사이의 상관관계는 NfL101, 117, 165 및 530(R2 범위 0.34 내지 0.49)에 대해 더 낮았으며 NfL284에서는 상관관계가 발견되지 않았다(도 52).
NfL은 일반적인 신경퇴행의 마커이고 AD에 특이적이지 않기 때문에 임상적 치매와 신경퇴행이 있는 환자에서는 아밀로이드 플라크의 존재와 관계없이 NfL이 증가할 것이라는 가설이 세워졌다. CDR-SB(치매 중증도의 임상 척도)와 NfL 종들 사이의 상관관계를 아밀로이드 양성 샘플과 아밀로이드 음성 샘플에 대해 평가했다(도 53). 아밀로이드 음성 그룹(NfL101, NfL117, NfL165 및 NfL324)보다 아밀로이드 양성 그룹의 일부 NfL 종에 대한 상관관계가 약간 더 높았지만 두 그룹의 모든 NfL 종에 대한 상관관계는 최소이거나 낮았다. NfL530과 CDR-SB 사이의 상관관계는 두 그룹 모두에서 유의미하게 0이 아니었다.
스피어만 상관 분석은 또한 6개의 정량화된 NfL 펩타이드 각각과 이전에 측정된 추가 바이오마커 및 임상적 치매의 일반 마커(CDR-SB, MMSE), 아밀로이드 플라크의 바이오마커(PET PiB, CSF Aβ42/Aβ40) 및 타우 바이오마커(CSF 총-타우, CSF 포스포-타우 면역분석법 및 CSF ptau 181, 205 및 217 점유의 질량 분석 측정)를 포함하는 임상적 측정치 사이에서 수행되었다; 도 54, 표 5. 이 분석의 목표는 질병 특이적 신경퇴행과 비교하여 일반적인 신경퇴행에서 다양한 NfL 종들의 생물학에 대한 가설을 형성하는 것이었다. Coil1A(NfL101 및 NfL117, r = 0.99) 내의 펩타이드와 막대 도메인의 Coil 1B(NfL101 및 NfL165, r = 0.98, NfL 117 및 NfL 165 r = 0.98) 사이에 가장 강한 상관관계가 관찰되었다. 막대 도메인의 Coil 2B에 있는 펩타이드는 Coil 1A 펩타이드와 유사하지만 약간 낮은 상관 관계를 갖는다(NfL101 및 NfL284, r = 0.89, NfL 101 및 NfL324, r = 0.87, NfL117 및 NfL284, r = 0.90, NfL117 및 NfL324, r = 0.88). C-말단 꼬리 펩타이드와 Coil 1A 사이의 상관관계는 조사된 NfL 펩타이드 중에서 가장 낮다(NfL101 및 NfL530, r = 0.75; NfL117 및 NfL530, r = 0.76). 흥미롭게도, 측정된 대부분의 c-말단 펩타이드(NfL324 및 NfL530)는 질병 바이오마커와 NfL 사이에 가장 높은 상관관계를 가지고 있다. NfL324 또는 NfL530과 ptau 181, 205 또는 217 사이의 중간 상관관계는 r= 0.45 내지 0.49 범위이다. 동일한 NfL 펩타이드와 tTau 사이의 상관관계는 r = 0.42 내지 0.43이다. CSF Aβ42/Aβ40 및 CSF NfL530과의 상관관계는 -0.37로 더 낮았다. (도 53, 표 4).
표 5: 스피어만 상관관계 표
본 실시예는 CSF에 적어도 3개의 주요 NfL 절단 종들이 존재하며, 이들은 AD에서 서로 다른 정도로 증가한다는 것을 입증한다. 또한, 뇌 NfL은 새로 확인된 c-말단 단편을 포함하는 전장이다. 주요 CSF NfL 종은 서로 및 다른 AD 측정치와 서로 다른 관계를 가지고 있다. 이는 NfL 절단 종들이 NfL 생물학 및 신경변성과 관련하여 차등적으로 분비될 수 있으며 이들 중 일부는 다른 것들보다 바이오마커로서 더 관련성이 있을 수 있음을 나타낸다. NfL Coil 1 도메인의 NfL 펩타이드 수준은 서로 상관 관계가 있었고 Coil 2 및 C-ter 영역에서 측정된 펩타이드와 약간 다르게 거동하였다. NfL 펩타이드 324 및 530의 유의한 증가는 유증상 AD CSF에서 발견되었으며 이는 이들 도메인이 바이오마커로서 더 관련성이 있을 수 있음을 뒷받침하는 것이다. NfL324와 NfL 면역분석 사이에 관찰된 더 높은 상관관계는 NfL325(1.5x) 및 ELISA 분석(1.4x)에서 AD와 대조군 간의 유사한 배수 증가와 함께, 이러한 Uman 전용 분석에 의해 사용된 항체가 이러한 최고 성능 NfL 이소형을 표적하기 위해 선택되었을 가능성이 있음을 시사한다. CDR, 연령, 인산화된 타우 및 총 타우와는 약간의 상관관계가 있었던 반면, 아밀로이드 PET와 MMSE의 측정치는 상관관계가 낮았다.
실시예 8
본 실시예에서는 대조군, ALS 및 SMA 인간 대상체로부터 얻은 CSF 샘플의 Nfl 이소형을 분석했다. 산발성 근위축성 측삭 경화증(ALS, n=12), 가족성 ALS(n=6), 척수성 근위축증(SMA, n =10) 및 정상 신경학적 대조군 환자의 CSF 샘플들을 동일한 방법을 사용하여 NfL 종 차이에 대해 분석했다. 간략하게, 0.5ng의 15N13C 내부 표준 NfL을 0.5ml CSF에 첨가한 후 항체 HJ30.13, HJ30.4 및 HJ30.11의 1:1:1 혼합물을 사용한 면역침전을 수행했다. 처리된 샘플을 LC-MS/MS로 분석하여 도 57-63에 도시된 각 영역에서 NfL 종의 양을 정량화했다. 이러한 연구 결과는 산발적이고 가족성인 ALS 증상 사례가 무증상 사례, SMA 또는 대조군보다 더 많이 증가하는 것으로 나타났다. NfL 종의 증가량은 매월 감소로 측정된 ALS FRS 척도로 측정한 감소율과 높은 상관관계가 있었다. NfL 종의 ALS 프로파일은 아미노산 위치 37에서 352까지의 양의 증가 그리고 이후 437에서 539(c-말단 펩타이드)까지의 또 다른 증가를 보여주었다. 그러나 c-말단 펩타이드 양이 덜 두드러졌던 대조군 및 기타 영역들의 경우 프로파일이 달랐다. 마지막으로 SMA 프로파일에서는 중간 도메인 영역이 거의 나타나지 않은 반면 339-461 영역은 상대적으로 증가했다. 이는 각 질병 상태에 대해, 정량화되고 구별 진단에 사용될 수 있는 특이적인 프로파일이 존재할 수 있음을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Washington University BATEMAN, Randall HOLTZMAN, David BUDELIER, Melissa JIANG, Hong <120> METHODS FOR DETECTING NEUROFILAMENT LIGHT CHAIN IN PLASMA AND CEREBROSPINAL FLUID <130> 047563-716468 <150> 63/197,826 <151> 2021-06-21 <150> 63/183,417 <151> 2021-05-03 <150> 63/147,833 <151> 2021-02-10 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 543 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Ser Phe Ser Tyr Glu Pro Tyr Tyr Ser Thr Ser Tyr Lys Arg 1 5 10 15 Arg Tyr Val Glu Thr Pro Arg Val His Ile Ser Ser Val Arg Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Thr Ala Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Tyr Ser Ala Pro Val Ser 35 40 45 Ser Ser Leu Ser Val Arg Arg Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Gly Ser Leu 50 55 60 Met Pro Ser Leu Glu Asn Leu Asp Leu Ser Gln Val Ala Ala Ile Ser 65 70 75 80 Asn Asp Leu Lys Ser Ile Arg Thr Gln Glu Lys Ala Gln Leu Gln Asp 85 90 95 Leu Asn Asp Arg Phe Ala Ser Phe Ile Glu Arg Val His Glu Leu Glu 100 105 110 Gln Gln Asn Lys Val Leu Glu Ala Glu Leu Leu Val Leu Arg Gln Lys 115 120 125 His Ser Glu Pro Ser Arg Phe Arg Ala Leu Tyr Glu Gln Glu Ile Arg 130 135 140 Asp Leu Arg Leu Ala Ala Glu Asp Ala Thr Asn Glu Lys Gln Ala Leu 145 150 155 160 Gln Gly Glu Arg Glu Gly Leu Glu Glu Thr Leu Arg Asn Leu Gln Ala 165 170 175 Arg Tyr Glu Glu Glu Val Leu Ser Arg Glu Asp Ala Glu Gly Arg Leu 180 185 190 Met Glu Ala Arg Lys Gly Ala Asp Glu Ala Ala Leu Ala Arg Ala Glu 195 200 205 Leu Glu Lys Arg Ile Asp Ser Leu Met Asp Glu Ile Ser Phe Leu Lys 210 215 220 Lys Val His Glu Glu Glu Ile Ala Glu Leu Gln Ala Gln Ile Gln Tyr 225 230 235 240 Ala Gln Ile Ser Val Glu Met Asp Val Thr Lys Pro Asp Leu Ser Ala 245 250 255 Ala Leu Lys Asp Ile Arg Ala Gln Tyr Glu Lys Leu Ala Ala Lys Asn 260 265 270 Met Gln Asn Ala Glu Glu Trp Phe Lys Ser Arg Phe Thr Val Leu Thr 275 280 285 Glu Ser Ala Ala Lys Asn Thr Asp Ala Val Arg Ala Ala Lys Asp Glu 290 295 300 Val Ser Glu Ser Arg Arg Leu Leu Lys Ala Lys Thr Leu Glu Ile Glu 305 310 315 320 Ala Cys Arg Gly Met Asn Glu Ala Leu Glu Lys Gln Leu Gln Glu Leu 325 330 335 Glu Asp Lys Gln Asn Ala Asp Ile Ser Ala Met Gln Asp Thr Ile Asn 340 345 350 Lys Leu Glu Asn Glu Leu Arg Thr Thr Lys Ser Glu Met Ala Arg Tyr 355 360 365 Leu Lys Glu Tyr Gln Asp Leu Leu Asn Val Lys Met Ala Leu Asp Ile 370 375 380 Glu Ile Ala Ala Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu Thr Arg Leu 385 390 395 400 Ser Phe Thr Ser Val Gly Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Ser Gln Ser Ser 405 410 415 Gln Val Phe Gly Arg Ser Ala Tyr Gly Gly Leu Gln Thr Ser Ser Tyr 420 425 430 Leu Met Ser Thr Arg Ser Phe Pro Ser Tyr Tyr Thr Ser His Val Gln 435 440 445 Glu Glu Gln Ile Glu Val Glu Glu Thr Ile Glu Ala Ala Lys Ala Glu 450 455 460 Glu Ala Lys Asp Glu Pro Pro Ser Glu Gly Glu Ala Glu Glu Glu Glu 465 470 475 480 Lys Asp Lys Glu Glu Ala Glu Glu Glu Glu Ala Ala Glu Glu Glu Glu 485 490 495 Ala Ala Lys Glu Glu Ser Glu Glu Ala Lys Glu Glu Glu Glu Gly Gly 500 505 510 Glu Gly Glu Glu Gly Glu Glu Thr Lys Glu Ala Glu Glu Glu Glu Lys 515 520 525 Lys Val Glu Gly Ala Gly Glu Glu Gln Ala Ala Lys Lys Lys Asp 530 535 540 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 2 Tyr Val Glu Thr Pro Arg 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 3 Val His Ile Ser Ser Val Arg 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 4 Ser Ala Tyr Ser Ser Tyr Ser Ala Pro Val Ser Ser Ser Leu Ser Val 1 5 10 15 Arg <210> 5 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 5 Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Gly Ser Leu Met Pro Ser Leu Glu Asn Leu 1 5 10 15 Asp Leu Ser Gln Val Ala Ala Ile Ser Asn Asp Leu Lys 20 25 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 6 Ala Gln Leu Gln Asp Leu Asn Asp Arg 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 7 Phe Ala Ser Phe Ile Glu Arg 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 8 Val His Glu Leu Glu Gln Gln Asn Lys 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 9 Val Leu Glu Ala Glu Leu Leu Val Leu Arg 1 5 10 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 10 Ala Leu Tyr Glu Gln Glu Ile Arg 1 5 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 11 Leu Ala Ala Glu Asp Ala Thr Asn Glu Lys 1 5 10 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 12 Gln Ala Leu Gln Gly Glu Arg 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 13 Glu Gly Leu Glu Glu Thr Leu Arg 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 14 Tyr Glu Glu Glu Val Leu Ser Arg 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 15 Leu Met Glu Ala Arg 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 16 Gly Ala Asp Glu Ala Ala Leu Ala Arg 1 5 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 17 Ile Asp Ser Leu Met Asp Glu Ile Ser Phe Leu Lys 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 18 Phe Thr Val Leu Thr Glu Ser Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 19 Gly Met Asn Glu Ala Leu Glu Lys 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 20 Gln Leu Gln Glu Leu Glu Asp Lys 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 21 Leu Glu Asn Glu Leu Arg 1 5 <210> 22 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 22 Leu Ser Phe Thr Ser Val Gly Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Ser Gln Ser 1 5 10 15 Ser Gln Val Phe Gly Arg 20 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 23 Ser Ala Tyr Gly Gly Leu Gln Thr Ser Ser Tyr Leu Met Ser Thr Arg 1 5 10 15 <210> 24 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 24 Ser Phe Pro Ser Tyr Tyr Thr Ser His Val Gln Glu Glu Gln Ile Glu 1 5 10 15 Val Glu Glu Thr Ile Glu Ala Ala Lys 20 25 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 25 Val Glu Gly Ala Gly Glu Glu Gln Ala Ala Lys 1 5 10

Claims (68)

  1. 생물학적 샘플에서 신경필라멘트 경쇄(Nfl)를 검출하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
    (a) 혈액 샘플 또는 CSF 샘플 중에서 선택된 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 생물학적 샘플에서 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 농축시키는 단계; 및
    (c) 단계 (b)에서 농축된 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 검출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    단계 (b)는 다음 단계를 포함하고:
    (i) 생물학적 샘플을 제1 Nfl 이소형 집단에 특이적으로 결합하는 제1 에피토프 결합제와 접촉시키고 제1 Nfl 이소형 집단을 단리하는 단계;
    (ii) 제1 Nfl 이소형 집단이 고갈된 샘플을 제2 Nfl 이소형 집단에 특이적으로 결합하는 제2 에피토프 결합제와 접촉시키고, 제2 Nfl 이소형 집단을 단리함으로써, 제1 및 제2 Nfl 이소형 집단이 고갈된 샘플을 생산하는 단계; 및
    (iii) 제1 및 제2 Nfl 이소형 집단이 고갈된 샘플을 제3 Nfl 이소형 집단에 특이적으로 결합하는 제3 에피토프 결합제와 접촉시키고, 제3 Nfl 이소형 집단을 단리하는 단계;
    여기서 단계 (c)는 제1 Nfl 이소형 집단에서 하나 내지 다수의 Nfl 이소형, 제2 Nfl 이소형 집단에서 하나 내지 다수의 Nfl 이소형, 제3 Nfl 집단에서 하나 내지 다수의 Nfl 이소형, 또는 이들의 임의의 조합을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 300 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고;
    제2 에피토프 결합제는 제1 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 200 내지 450 내의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하고; 그리고
    제3 에피토프 결합제는 제2 에피토프의 하류에 있는 서열 번호 1의 아미노산 397 내지 543 내의 제3 에피토프에 특이적으로 결합하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    제1 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 250 내에 존재하거나;
    제2 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 250 내지 400 내에 존재하거나;
    제3 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 397 내지 543 내에 존재하거나;
    또는 이의 임의의 조합인, 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 에피토프 결합제는 HJ30.1 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.2 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.13 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.1, HJ30.2 또는 HJ30.13의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프-결합제이거나;
    제2 에피토프 결합제는 HJ30.4 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.7 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.4 또는 HJ30.7의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제이거나;
    제3 에피토프 결합제는 HJ30.11, 이의 항원 결합 단편, 또는 전장 재조합 Nfl에 대한 HJ30.11의 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제이거나;
    또는 이의 임의의 조합인, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    단계 (b)는 다음 단계를 포함하고:
    (i) 생물학적 샘플을 제1 Nfl 이소형 집단에 특이적으로 결합하는 제1 에피토프 결합제와 접촉시키고 제1 Nfl 이소형 집단을 단리하는 단계;
    (ii) 제1 Nfl 이소형 집단이 고갈된 샘플을 제2 Nfl 이소형 집단에 특이적으로 결합하는 제2 에피토프 결합제와 접촉시키고, 제2 Nfl 이소형 집단을 단리하는 단계;
    여기서 단계 (c)는 제1 Nfl 이소형 집단에서 하나 내지 다수의 Nfl 이소형, 제2 Nfl 이소형 집단에서 하나 내지 다수의 Nfl 이소형, 또는 이들의 임의의 조합을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    제1 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 450 내의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고;
    제2 에피토프 결합제는 서열 번호 1의 아미노산 396 내지 543 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    제1 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 250 내에 존재하고; 그리고
    제2 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 396 내지 543 내에 존재하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    제1 에피토프 결합제는 HJ30.1 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.2 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.13 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.1, HJ30.2 또는 HJ30.13의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프-결합제이고/이거나;
    제2 에피토프 결합제는 HJ30.11, 이의 항원 결합 단편, 또는 전장 재조합 Nfl에 대한 HJ30.11의 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제인, 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    제1 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 250 내지 400 내에 존재하고; 그리고
    제2 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내에 존재하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    제1 에피토프 결합제는 HJ30.4 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.7 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.4 또는 HJ30.7의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제이고/이거나;
    제2 에피토프 결합제는 HJ30.11, 이의 항원 결합 단편, 또는 전장 재조합 Nfl에 대한 HJ30.11의 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제인, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    단계 (b)는 생물학적 샘플을 제1 Nfl 이소형 집단에 특이적으로 결합하는 제1 에피토프 결합제와 접촉시키고 제1 Nfl 이소형 집단을 단리하는 단계를 포함하고; 여기서 에피토프 결합제는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법:
    (i) 서열 번호 1의 아미노산 90 내지 250 또는 서열 번호 1의 아미노산 125 내지 250 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제;
    (ii) 서열 번호 1의 아미노산 116 내지 184 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제;
    (iii) 서열 번호 1의 아미노산 250 내지 400 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제;
    (iv) 서열 번호 1의 아미노산 283 내지 338 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제;
    (v) 서열 번호 1의 아미노산 400 내지 543 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제;
    (vi) 서열 번호 1의 아미노산 437 내지 543 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제;
    (vii) HJ30.1 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.2 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.13 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.1, HJ30.2 또는 HJ30.13의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프-결합제;
    (viii) HJ30.4 또는 이의 항원 결합 단편, HJ30.7 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 HJ30.4 또는 HJ30.7의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제; 및
    (ix) HJ30.11, 이의 항원 결합 단편, 또는 전장 재조합 Nfl에 대한 HJ30.11의 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제.
  13. 제1항에 있어서, 단계 (b)는 약 350개 이하의 아미노산 길이, 약 300개 이하의 아미노산 길이, 약 250개 이하의 아미노산 길이, 약 200개 이하의 아미노산 길이, 약 150개 이하의 아미노산 길이, 또는 약 100개 이하의 아미노산 길이의 Nfl 이소형(들)을 농축시키는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 단계 (b)는 약 100개 아미노산 내지 약 250개 아미노산 길이의 Nfl 이소형(들)을 농축시키는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 단계 (b)는 약 106개 이하의 아미노산 길이인 Nfl 이소형(들)을 농축시키는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제1항, 제13항, 제14항, 또는 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 서열 번호 1의 아미노산 92 내지 100, 서열 번호 1의 아미노산 101 내지 107, 서열 번호 1의 아미노산 108 내지 116, 서열 번호 1의 아미노산 117 내지 126, 서열 번호 1의 아미노산 137 내지 144, 서열 번호 1의 아미노산 148 내지 157, 서열 번호 1의 아미노산 158 내지 164, 서열 번호 1의 아미노산 165 내지 172, 서열 번호 1의 아미노산 178 내지 185, 서열 번호 1의 아미노산 192 내지 196, 또는 서열 번호 1의 아미노산 198 내지 206을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 하나 내지 다수의 Nfl 이소형, 또는 이들의 임의의 조합을 농축시키는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 단계 (b)는 서열 번호 1의 아미노산 165 내지 172를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 농축시키는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제1항, 제13항, 제14항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 서열 번호 1의 아미노산 283 내지 293, 서열 번호 1의 아미노산 324 내지 331, 서열 번호 1의 아미노산 332 내지 339, 또는 서열 번호 1의 아미노산 340 내지 354를 포함하는 아미노산 서열을 가지는 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 농축시키는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제1항, 제13항, 제14항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 서열 번호 1의 아미노산 438 내지 462 또는 서열 번호 1의 아미노산 530 내지 540을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 농축시키는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 N-말단 절단을 포함하는 Nfl 이소형을 농축시키는 단계, 여기서 각각의 Nfl 이소형에 대한 N-말단 절단은 다음으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방법:
    (a) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 90;
    (b) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 92;
    (c) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 124;
    (d) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 135;
    (e) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 137;
    (f) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 146;
    (g) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 162;
    (h) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 222;
    (i) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 223;
    (j) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 234;
    (k) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 252;
    (l) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 271;
    (m) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 281;
    (n) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 323;
    (o) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 339;
    (p) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 359;
    (q) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 396;
    (r) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 399;
    (s) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 420;
    (t) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 436; 또는
    (u) 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 528.
  21. 제20항에 있어서, 각각의 Nfl 이소형에 대한 N-말단 절단은 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 396 또는 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 437을 포함하는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 단계 (b)는 단일 이소형을 농축시키는, 방법.
  23. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서의 검출은 질량 분석법에 의해 발생하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c)에서 다음 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    농축된 Nfl 이소형을 프로테아제로 절단한 다음, 생성된 절단 생성물을 고체상 추출에 의해 선택적으로 탈염시켜 Nfl의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플을 얻는 단계; 및
    Nfl의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플의 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC/MS)을 수행하여 Nfl의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 양을 검출하고 선택적으로 이를 측정하는 단계.
  25. 청구항 24에 있어서, 프로테아제는 트립신인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 검출되고 선택적으로 정량화된 Nfl의 적어도 하나의 단백질 분해 펩타이드는 (i) 서열 번호 1의 아미노산 165 내지 172, (ii) 서열 번호 1의 아미노산 198 내지 206, (iii) 서열 번호 1의 아미노산 324 내지 331, (iv) 서열 번호 1의 아미노산 438 내지 462, 또는 (v) 서열 번호 1의 아미노산 530 내지 540으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 1개의 펩타이드를 포함하는, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 검출되고 선택적으로 정량화된 Nfl의 적어도 하나의 단백질 분해 펩타이드는 (i) 서열 번호 1의 아미노산 165 내지 172, (ii) 서열 번호 1의 아미노산 198 내지 206, (iii) 서열 번호 1의 아미노산 324 내지 331, (iv) 서열 번호 1의 아미노산 438 내지 462, 또는 (v) 서열 번호 1의 아미노산 530 내지 540으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 2개 이상의 펩타이드를 포함하는, 방법.
  28. 제25항에 있어서, 검출되고 선택적으로 정량화된 Nfl의 적어도 하나의 단백질 분해 펩타이드는 (i) 서열 번호 1의 아미노산 165 내지 172, (ii) 서열 번호 1의 아미노산 198 내지 206, (iii) 서열 번호 1의 아미노산 324 내지 331, (iv) 서열 번호 1의 아미노산 438 내지 462, 또는 (v) 서열 번호 1의 아미노산 530 내지 540으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 3개 이상의 펩타이드를 포함하는, 방법.
  29. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서의 검출은 면역분석법 또는 단일 분자 배열 테스팅에 의해 일어나는, 방법.
  30. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 검출된 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 정량화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  31. 대상체로부터 얻은 샘플에서 바이오마커를 검출하는 방법으로서, 이 방법은 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 따라 신경필라멘트 경쇄를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 생물학적 샘플은 신경 손상을 가지거나 신경 손상 위험을 가지는 대상체로부터 얻은 샘플이고 상기 바이오마커는 단계 (c)에서 검출된 하나 내지 다수의 Nfl 이소형인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 하나 내지 다수의 Nfl 이소형을 정량화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  33. 제30항 또는 제32항에 있어서, 상기 방법은 제1 및 제2 Nfl 이소형 집단을 정량화하는 단계를 포함하고, 그리고 선택적으로 바이오마커는 이들 두 집단의 비율인, 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    제1 Nfl 이소형 집단은 제2항의 (i)에서 단리된 Nfl 이소형 집단이고, 제2 Nfl 이소형 집단은 제2항의 (ii)에서 단리된 Nfl 이소형 집단이고, 선택적으로, 제2항의 (i) 및 제2항의 (ii)의 이소형 집단은 제3항, 제4항, 제5항 또는 제23항 내지 제29항에 따라 생산되거나; 또는
    제1 Nfl 이소형 집단은 제2항의 (i)에서 단리된 Nfl 이소형 집단이고, 제2 Nfl 이소형 집단은 제2항의 (iii)에서 단리된 Nfl 이소형 집단이고, 선택적으로, 제2항의 (i) 및 제2항의 (iii)의 이소형 집단은 제3항, 제4항, 제5항 또는 제23항 내지 제29항에 따라 생산되거나; 또는
    제1 Nfl 이소형 집단은 제2항의 (ii)에서 단리된 Nfl 이소형 집단이고, 제2 Nfl 이소형 집단은 제2항의 (iii)에서 단리된 Nfl 이소형 집단이고, 선택적으로, 제2항의 (ii) 및 제2항의 (iii)의 이소형 집단은 제3항, 제4항, 제5항 또는 제23항 내지 제29항에 따라 생산되는, 방법.
  35. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 정량화된 바이오마커의 양은 인지적으로 정상인 대조군 대상체, 인지적으로 정상이고 아밀로이드 음성인 대조군 대상체, 또는 인지적으로 정상이고 뇌의 타우 침착물의 병리학적 수준이 음성인 대조군 대상체에서의 수준과 비교하여 감소되는지를 PET로 평가하여 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 정량화된 바이오마커의 양이 대조군 대상체의 평균을 유의하게 벗어나는 경우 대상체가 신경퇴행성 질환 또는 외상성 뇌 손상을 가진 것으로 진단되는, 방법.
  37. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  38. 신경 손상을 가지거나 가질 위험이 있는 대상체에서 치료 반응을 측정하는 방법으로서, 이 방법은 다음 단계를 포함하고:
    (a) 대상체로부터 얻은 제1 생물학적 샘플에서 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 바이오마커를 정량화하는 단계;
    (b) 대상체에게 치료제를 투여하는 단계; 및
    (c) 치료 후 대상체로부터 얻은 제2 생물학적 샘플에서 단계 (a)에서 정량화된 바이오마커를 정량화하는 단계;
    여기서 제1 생물학적 샘플과 제2 생물학적 샘플은 둘 다 혈액 샘플이거나 둘 다 CSF 샘플이고; 그리고
    여기서 제1 샘플과 비교하여 제2 샘플 내 바이오마커의 양에 변화가 없거나 감소하는 것 또는 상기 바이오마커의 양이 제1 샘플과 비교하여 제2 샘플에서 증가하지만 그 변화가 신경 손상을 가지지만 치료를 받지 않았던 대조군 대상체에서 발생한 변화보다 적은 것은 양성 치료 반응을 나타내는, 방법.
  39. 신경 손상을 가지거나 가질 위험이 있는 대상체를 모니터링하는 방법으로서, 이 방법은 대상체로부터 얻은 제1 생물학적 샘플 및 대상체로부터 얻은 제2 생물학적 샘플에서 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 바이오마커를 정량화하는 단계를 포함하고, 제1 생물학적 샘플과 제2 생물학적 샘플은 둘 다 혈액 샘플이거나 둘 다 CSF 샘플이고, 제2 생물학적 샘플은 제1 생물학적 샘플 이후에 얻은 것이며;
    제1 샘플과 비교하여 제2 샘플에서 바이오마커 양의 증가는 신경 손상의 증가를 나타내는, 방법.
  40. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 신경퇴행성 질환을 가지거나 가질 위험이 있는, 방법.
  41. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 외상성 뇌 손상을 가지거나 가질 위험이 있는, 방법.
  42. HJ30.1, HJ30.1의 인간화 버전, 또는 HJ30.1의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제로 구성된 군으로부터 선택된 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl) 에피토프 결합제.
  43. HJ30.2, HJ30.2의 인간화 버전, 또는 HJ30.2의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제로 구성된 군으로부터 선택된 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl) 에피토프 결합제.
  44. HJ30.4, HJ30.4의 인간화 버전, 또는 HJ30.4의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제로 구성된 군으로부터 선택된 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl) 에피토프 결합제.
  45. HJ30.7, HJ30.7의 인간화 버전, 또는 HJ30.7의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제로 구성된 군으로부터 선택된 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl) 에피토프 결합제.
  46. HJ30.11, HJ30.11의 인간화 버전, 또는 HJ30.11의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제로 구성된 군으로부터 선택된 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl) 에피토프 결합제.
  47. HJ30.13, HJ30.13의 인간화 버전, 또는 HJ30.13의 전장 재조합 Nfl에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 에피토프 결합제로 구성된 군으로부터 선택된 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl) 에피토프 결합제.
  48. 미국 표준 균주 은행(American Type Culture Collection)에 기탁된 ATCC 등록번호 PTA-126966의 하이브리도마에 의해 생산된 단리된 항체.
  49. 미국 표준 균주 은행(American Type Culture Collection)에 기탁된 ATCC 등록번호 PTA-126967의 하이브리도마에 의해 생산된 단리된 항체.
  50. 미국 표준 균주 은행(American Type Culture Collection)에 기탁된 ATCC 등록번호 PTA-126968의 하이브리도마에 의해 생산된 단리된 항체.
  51. 미국 표준 균주 은행(American Type Culture Collection)에 기탁된 ATCC 등록번호 PTA-126969의 하이브리도마에 의해 생산된 단리된 항체.
  52. 미국 표준 균주 은행(American Type Culture Collection)에 기탁된 ATCC 등록번호 PTA-126970의 하이브리도마에 의해 생산된 단리된 항체.
  53. 미국 표준 균주 은행(American Type Culture Collection)에 기탁된 ATCC 등록번호 PTA-126971의 하이브리도마에 의해 생산된 단리된 항체.
  54. (a) HJ30.1(ATCC # PTA-126966)의 경쇄 가변 영역 및/또는 (b) HJ30.1(ATCC #PTA-126966)의 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl).
  55. (a) HJ30.2(ATCC # PTA-126967)의 경쇄 가변 영역 및/또는 (b) HJ30.2(ATCC #PTA-126967)의 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl).
  56. (a) HJ30.4(ATCC # PTA-126968)의 경쇄 가변 영역 및/또는 (b) HJ30.4(ATCC #PTA-126968)의 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl).
  57. (a) HJ30.7(ATCC # PTA-126969)의 경쇄 가변 영역 및/또는 (b) HJ30.7(ATCC #PTA-126969)의 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl).
  58. (a) HJ30.11(ATCC # PTA-126970)의 경쇄 가변 영역 및/또는 (b) HJ30.11(ATCC #PTA-126970)의 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl).
  59. (a) HJ30.13(ATCC # PTA-126971)의 경쇄 가변 영역 및/또는 (b) HJ30.13(ATCC #PTA-126971)의 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl).
  60. (a) HJ30.1(ATCC # PTA-126966)의 VL에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역, 및/또는 (b) HJ30.1(ATCC # PTA-126966)의 VH에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl).
  61. (a) HJ30.2(ATCC # PTA-126967)의 VL에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역, 및/또는 (b) HJ30.2(ATCC # PTA-126967)의 VH에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl).
  62. (a) HJ30.4(ATCC # PTA-126968)의 VL에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역, 및/또는 (b) HJ30.4(ATCC # PTA-126968)의 VH에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl).
  63. (a) HJ30.7(ATCC # PTA-126969)의 VL에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역, 및/또는 (b) HJ30.7(ATCC # PTA-126969)의 VH에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl).
  64. (a) HJ30.11(ATCC # PTA-126970)의 VL에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역, 및/또는 (b) HJ30.11(ATCC # PTA-126970)의 VH에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl).
  65. (a) HJ30.13(ATCC # PTA-126971)의 VL에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역, 및/또는 (b) HJ30.13(ATCC # PTA-126971)의 VH에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-신경필라멘트 경쇄(Nfl).
  66. 생물학적 샘플에서 Nfl을 검출 및/또는 정량화하기 위한, 제42항 내지 제65항 중 어느 한 항의 에피토프 결합제의 용도.
  67. 제66항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 뇌 척수액 샘플인, 용도.
  68. 에피토프 결합제는 검출가능한 표지에 부착되는, 제42항 또는 제65항에 따른 에피토프 결합제의 용도.
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