TW201927820A - 抗ｐｄ-ｌ１抗體及使用其來偵測ｐｄ-ｌ１之方法 - Google Patents

Abstract

本申請案係關於抗PD-L1抗體及其在來自受檢者之樣品中偵測PD-L1之用途。在一些實施例中，已用治療性抗PD-L1抗體治療受檢者並且本文所述之抗PD-L1不與治療性抗PD-L1抗體競爭結合至PD-L1。在一些實施例中，該抗PD-L1抗體連接至可偵測之部分，諸如螢光團，並且將該抗PD-L1抗體用於在使用流動式細胞測量術時偵測受檢者中之PD-L1。

Description

抗PD-L1抗體及使用其來偵測PD-L1之方法

本發明係關於抗PD-L1抗體及使用其來偵測PD-L1之方法。

已發現T細胞功能障礙或無反應性與抑制性受體(亦即，程式化死亡1多肽(PD-1))之誘導及維持表現同時發生。因此，治療性靶向PD-1及經由與PD-1相互作用進行信號傳導之其他分子(諸如程式化死亡配位子1(PD-L1))係受強烈關注之領域。PD-L1信號傳導之抑制已經論證為增強T細胞免疫之手段以用於治療癌症(例如腫瘤免疫)。已經開發使用抗PD-1或抗PD-L1抗體之療法並用於治療不同類型之癌症。參見，例如美國專利第8,217,149號。

在此項技術中需要偵測來自已用治療性抗PD-L1抗體治療之受檢者之生物樣品中的PD-L1。本發明提供抗PD-L1抗體，其特異性地偵測PD-L1，而不會與治療性抗PD-L1抗體競爭結合至PD-L1。此等抗體適用於例如監測已用治療性抗PD-L1抗體治療之受檢者中的癌症治療。

在一態樣中，本發明提供一種經分離之抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含：
(a) 重鏈可變區，其包含：
(i) 包含胺基酸序列TSWMN (SEQ ID NO:1)之HVR-H1；
(ii) 包含胺基酸序列RIYPRDGDTYYNGKFKD (SEQ ID NO:2)之HVR-H2；及
(iii) 包含胺基酸序列NPGGYYFDY (SEQ ID NO:3)之HVR-H3；以及
(b) 輕鏈可變區，其包含：
(i) 包含胺基酸序列RASQDIHTYLN (SEQ ID NO:4)之HVR-L1；
(ii) 包含胺基酸序列YTSRLHS (SEQ ID NO:5)之HVR-L2；及
(iii) 包含胺基酸序列QQVSSLPPWT (SEQ ID NO:6)之HVR-L3。
在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO:7之胺基酸序列的重鏈可變區；及含有SEQ ID NO:8之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，該抗體包含：含有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的重鏈可變區；及含有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的輕鏈可變區。

在本文任何實施例之一些中，該抗體或抗原結合片段不與參考抗體競爭結合至人類PD-L1，其中該參考抗體包含：
(a) 重鏈可變區，其包含：
(i) 包含胺基酸序列GFTFSDSWIH (SEQ ID NO:11)之HVR-H1；
(ii) 包含胺基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:12)之HVR-H2；及
(iii) 包含胺基酸序列RHWPGGFDY (SEQ ID NO:13)之HVR-H3；以及
(b) 輕鏈可變區，其包含：
(i) 包含胺基酸序列RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:14)之HVR-L1；
(ii) 包含胺基酸序列SASFLYS (SEQ ID NO:15)之HVR-L2；及
(iii) 包含胺基酸序列QQYLYHPAT (SEQ ID NO:16)之HVR-L3。
在一些實施例中，參考抗體包含：含有SEQ ID NO:17之胺基酸序列的重鏈可變區；及含有SEQ ID NO:18之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，參考抗體包含：含有SEQ ID NO:19之胺基酸序列的重鏈；及含有SEQ ID NO:20之胺基酸序列的輕鏈。

在本文任何實施例之一些中，該抗體或抗原結合片段連接至部分。在一些實施例中，該部分為可偵測之部分。在一些實施例中，可偵測之部分為生物素、鏈黴抗生物素、發光試劑、酶、螢光團、染料、放射性標記、發色團、金屬離子、金顆粒、銀顆粒、磁粉、多肽或寡核苷酸。在一些實施例中，可偵測之部分為螢光團。在一些實施例中，螢光團為R-藻紅素(PE)、PE-Cy7、Alexa Fluor 488、螢光異硫氰酸鹽(FITC)、甲藻黃素葉綠素蛋白複合物(PerCP)、BV421、BV510、APC-H7、Alexa Fluor 647或別藻藍蛋白(APC)。

在另一態樣中，本發明提供一種經分離之核酸，其編碼本文所述之抗體或抗原結合片段。

在另一態樣中，本發明提供一種載體，其包含本文所述之核酸。在一些實施例中，該載體為表現載體。

在另一態樣中，本發明提供一種宿主細胞，其包含本文所述之核酸。

在另一態樣中，本發明提供一種產生本文所述之抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的方法，其包含在適於產生該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段之條件下培養本文所述之宿主細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含回收由該宿主細胞產生之抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。

在另一態樣中，本發明提供一種用於偵測由受檢者獲得之生物樣品中的PD-L1之方法，該方法包含：(a) 使該生物樣品與本文所述之抗體或抗原結合片段接觸；及(b) 偵測該抗體或抗原結合片段與該生物樣品中之PD-L1的結合，由此偵測該生物樣品中之PD-L1。在一些實施例中，使用流動式細胞測量術偵測該抗體或抗原結合片段。在本文任何實施例之一些中，該生物樣品為血液樣品。在本文任何實施例之一些中，該生物樣品為骨髓樣品。在本文任何實施例之一些中，該生物樣品為細胞或組織。在一些實施例中，該細胞或組織為癌細胞或癌組織。在本文任何實施例之一些中，該生物樣品包含活細胞。在本文任何實施例之一些中，該受檢者患有癌症。在一些實施例中，該癌症選自由下列各病組成之群：多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群及急性骨髓性白血病。在本文任何實施例之一些中，該生物樣品係由已投與治療性抗PD-L1抗體或其抗原結合片段之受檢者獲得，其中該治療性抗體或其抗原結合片段包含：
(a) 重鏈可變區，其包含：
(i) 包含胺基酸序列GFTFSDSWIH (SEQ ID NO:11)之HVR-H1；
(ii) 包含胺基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:12)之HVR-H2；及
(iii) 包含胺基酸序列RHWPGGFDY (SEQ ID NO:13)之HVR-H3；以及
(b) 輕鏈可變區，其包含：
(i) 包含胺基酸序列RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:14)之HVR-L1；
(ii) 包含胺基酸序列SASFLYS (SEQ ID NO:15)之HVR-L2；及
(iii) 包含胺基酸序列QQYLYHPAT (SEQ ID NO:16)之HVR-L3。
在一些實施例中，該治療性抗體或其抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO:17之胺基酸序列的重鏈可變區；及含有SEQ ID NO:18之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，該治療性抗體或其抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO:19之胺基酸序列的重鏈；及含有SEQ ID NO:20之胺基酸序列的輕鏈。在本文任何實施例之一些中，該受檢者為人類。

在另一態樣中，本發明提供一種監測受檢者中之癌症治療的方法，該方法包含：(a) 使第一生物樣品與本文所述之抗體或抗原結合片段接觸；(b) 偵測該抗體或抗原結合片段與該第一生物樣品中之PD-L1的結合；(c) 測定存在於該第一生物樣品中的PD-L1之量；(d) 使第二生物樣品與本文所述之抗體或抗原結合片段接觸，其中在用治療性抗PD-L1抗體或其抗原結合片段治療之後獲得該第二生物樣品；(e) 偵測該抗體或抗原結合片段與該第二生物樣品中之PD-L1的結合；(f) 測定存在於該第二生物樣品中的PD-L1之量；(g) 比較存在於該第一生物樣品中的PD-L1之量與存在於該第二生物樣品中的PD-L1之量。在一些實施例中，與第一生物樣品相比存在於第二生物樣品中的PD-L1之量的增加表明該患者對治療性抗PD-L1抗體之治療無反應。在一些實施例中，與第一生物樣品相比存在於第二生物樣品中的PD-L1之量的減少表明該患者對治療性抗PD-L1抗體之治療有反應。在本文任何實施例之一些中，在用治療性抗PD-L1抗體或其抗原結合片段治療之前由該受檢者獲得第一生物樣品。在本文任何實施例之一些中，在用治療性抗PD-L1抗體或其抗原結合片段治療之後由該受檢者獲得第一生物樣品。在本文任何實施例之一些中，該第一及第二生物樣品為血液樣品。在本文任何實施例之一些中，該第一及第二生物樣品為骨髓樣品。在本文任何實施例之一些中，該第一及第二生物樣品為細胞或組織。在一些實施例中，該細胞或組織為癌細胞或癌組織。在本文任何實施例之一些中，該第一及第二生物樣品包含活細胞。在本文任何實施例之一些中，該受檢者患有選自由下列各病組成之群的癌症：多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群及急性骨髓性白血病。在本文任何實施例之一些中，該治療性抗體或其抗原結合片段包含：
(a) 重鏈可變區，其包含：
(i) 包含胺基酸序列GFTFSDSWIH (SEQ ID NO:11)之HVR-H1；
(ii) 包含胺基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:12)之HVR-H2；及
(iii) 包含胺基酸序列RHWPGGFDY (SEQ ID NO:13)之HVR-H3；以及
(b) 輕鏈可變區，其包含：
(i) 包含胺基酸序列RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:14)之HVR-L1；
(ii) 包含胺基酸序列SASFLYS (SEQ ID NO:15)之HVR-L2；及
(iii) 包含胺基酸序列QQYLYHPAT (SEQ ID NO:16)之HVR-L3。
在一些實施例中，該治療性抗體或其抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO:17之胺基酸序列的重鏈可變區；及含有SEQ ID NO:18之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，該治療性抗體或其抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO:19之胺基酸序列的重鏈；及含有SEQ ID NO:20之胺基酸序列的輕鏈。在本文任何實施例之一些中，使用流動式細胞測量術偵測該抗PD-L1抗體或抗原結合片段。在本文任何實施例之一些中，該受檢者為人類。

在另一態樣中，本發明提供一種組合物，其包含本文所述之抗體或抗原結合片段。

在另一態樣中，本發明提供一種用於偵測生物樣品中之PD-L1的套組，其包含本文所述之抗體或抗原結合片段或本文所述之組合物。

相關申請案

此申請案主張2017年11月30日申請的美國專利申請第62/593,125號之優先權權益，其揭示內容以引用之方式全部併入本文中。
以ASCII文本文件形式之序列表的提交

ASCII文本文件形式之以下提交內容係以引用之方式全部併入本文中：序列表之計算機可讀形式(CRF)(文件名：146392040141SEQLIST.TXT；記錄日期：2018年11月9日；尺寸：20 KB)。
I. 定義

除非另外定義，否則本文所用之技術及科學術語皆具有本發明所屬之熟習此項技術者通常理解的相同含義。Singleton等人, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第2版, J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)及March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 第4版, John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)為熟習此項技術者提供關於本申請案中使用之許多術語的一般指南。本文引用之所有參考文獻(包括專利申請案及公佈)以引用之方式全部併入。

除非另外指出，否則本發明之實施將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術，其在熟習此項技術者之技能內。此類技術充分解釋於以下文獻中：諸如Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 第2版(Sambrook等人, 1989)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編, 1984)；Animal Cell Culture (R. I. Freshney編, 1987)；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel等人編 1987, 及定期更新)；PCR: The Polymerase Chain Reaction , (Mullis等人編, 1994)；A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988)；Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas等人, 2001)。

為了說明本說明書，將應用以下定義並且適當時，以單數形式使用之術語亦包括複數形式，反之亦然。應理解，本文所用之術語僅係用於描述具體實施例，而不旨在限制。一旦下文闡述之任何定義與以引用之方式併入本文中之任何文獻有衝突，將以下文闡述之定義為準。

「親和力」係指分子(例如抗體)之單個結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間的總非共價相互作用之強度。除非另外指出，否則如本文所用之「結合親和力」係指反映結合對之成員(例如，抗體與抗原)之間的1:1相互作用之內在結合親和力。分子X對其配偶體Y之親和力一般可由解離常數(K_D )表示。親和力可藉由此項技術中已知之常用方法量測，包括本文所述之彼等。用於量測結合親和力之具體的說明性及示範性實施例在本文中描述。

術語「抗體」在本文中以廣義使用並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)以及抗體片段，只要其表現出所需抗原結合活性。

「抗體片段」係指除完整抗體以外之分子，其包含結合完整抗體所結合至之抗原的完整抗體之一部分。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂ ；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；以及由抗體片段形成之多特異性抗體。抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個相同抗原結合片段，稱為「Fab」片段，各自具有單個抗原結合位點；及殘餘「Fc」片段，其名稱反映其容易結晶之能力。胃蛋白酶處理產生F(ab')₂ 片段，其具有兩個抗原結合位點並且仍能與抗原交聯。

如本文所用之術語「單株抗體」係指由實質上均質抗體群獲得之抗體，亦即構成該群之單個抗體為相同的及/或結合相同表位，除可能的變異抗體之外，例如，含有天然存在之突變或在產生單株抗體製劑期間出現，此類變異體一般以較小量存在。與通常包括針對不同決定子(表位)之不同抗體的多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」表示抗體如由實質上均質抗體群獲得之特性，並且不應視為需要藉由任何具體方法產生抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製備，包括但不限於融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體顯示方法、以及利用含有人免疫球蛋白基因座之全部或一部分的轉基因動物之方法，用於製造單株抗體之此類方法及其他示範性方法在本文中描述。

「裸抗體」係指不結合至異源部分(例如細胞毒性部分)或放射性標記之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。

「天然抗體」係指具有變化結構的天然存在之免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體為約150,000道爾頓之異四聚糖蛋白，其係由經二硫鍵結合之兩條相同輕鏈與兩條相同重鏈構成。自N-至C-末端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域，繼之以三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N-至C-末端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域，繼之以恆定輕鏈(CL)結構域。抗體之輕鏈基於其恆定結構域之胺基酸序列可分為兩種類型，稱為kappa(κ)與lambda(λ)。

抗體之「類別」係指由其重鏈所具有之恆定結構域或恆定區之類型。抗體存在五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干種可進一步分成亞類(同型)，例如IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 、IgG₄ 、IgA₁ 及IgA₂ 。對應於免疫球蛋白之不同類別的重鏈恆定結構域分別係稱作a、d、e、g及m。

術語「抗PD-L1抗體」、「抗PD-L1」、「PD-L1抗體」或「結合至PD-L1之抗體」係指能夠以足夠親和力結合PD-L1之抗體，由此該抗體適用作靶向PD-L1中之診斷劑及/或治療劑。在一實施例中，抗PD-L1抗體與不相關的非PD-L1蛋白結合之程度小於抗體與PD-L1結合之約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合至PD-L1之抗體具有以下解離常數(K_D )：≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如，10^-8 M或較小，例如10^-8 M至10^-13 M，例如10^-9 M至10^-13 M)。在某些實施例中，抗PD-L1抗體結合至PD-L1之表位，該表位在來自不同物種之PD-L1中係保守的。在某些實施例中，抗PD-L1抗體結合至人PD-L1。

「人抗體」為具有對應於由人類或人類細胞產生或源自於利用人類抗體庫或其它人類抗體編碼序列之非人來源之抗體的胺基酸序列之抗體。人抗體之此定義明確地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。

術語「嵌合」抗體係指以下抗體：其中重鏈及/或輕鏈之一部分衍生自特定來源或物種，而其餘重鏈及/或輕鏈衍生自不同來源或物種。

「人共有架構」為表示在人免疫球蛋白VL或VH架構序列之選擇中最常出現之胺基酸殘基的架構。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列之選擇係來自於可變結構域序列之亞組。一般而言，序列之亞組為如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), 第1-3卷中所述之亞組。在一實施例中，對於VL，該亞組為如Kabat等人,上述中之亞組κ I。在一實施例中，對於VH，該亞組為如Kabat等人,上述中之亞組III。

「人源化」抗體係指包含來自非人HVR之胺基酸殘基及來自人FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人源化抗體將包含至少一個及通常兩個可變結構域之實質上全部，其中HVR(例如CDR)之全部或實質上全部對應於非人抗體之彼等，且FR之全部或實質上全部對應於人抗體之彼等。人源化抗體視情況可包含由人抗體衍生之抗體恆定區之至少一部分。「人源化形式」之抗體(例如，非人抗體)係指經歷人源化之抗體。

術語「可變區」或「可變結構域」係指參與抗體與抗原之結合的抗體重鏈或輕鏈之結構域。天然抗體之重鏈與輕鏈(分別為VH與VL)之可變結構域一般具有相似結構，其中各結構域包含四個保守架構區(FR)及三個高變區(HVR)。(參見，例如Kindt等人Kuby Immunology , 第6版, W.H. Freeman and Co., 第91頁 (2007))。單個VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可分別使用來自結合抗原之抗體的VH或VL結構域來分離以篩選互補VL或VH結構域之文庫。參見，例如Portolano等人,J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628 (1991)。

如本文所用之術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變結構域在序列上高變及/或形成結構上定義之環(「高變環」)的每個區。通常，天然四鏈抗體包含六個HVR；三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含來自高變環及/或來自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，後者具有最高序列可變性及/或參與抗原識別。示範性高變環出現在以下胺基酸殘基處：26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)。(Chothia與Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)。) 示範性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現在以下胺基酸殘基處：L1之24-34、L2之50-56、L3之89-97、H1之31-35B、H2之50-65、及H3之95-102。(Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。) 除VH中之CDR1之外，CDR通常包含形成高變環之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其為接觸抗原之殘基。SDR容納在CDR之區域內，稱為縮寫-CDR或a-CDR。示範性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現在以下胺基酸殘基處：L1之31-34、L2之50-55、L3之89-96、H1之31-35B、H2之50-58、及H3之95-102。(參見Almagro與Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)。) 除非另外指出，否則HVR殘基及在可變結構域中之其他殘基(例如FR殘基)在本文中根據Kabat等人,上述進行編號。

「Fab」片段含有重鏈與輕鏈可變結構域且亦含有輕鏈之恆定結構域與重鏈之第一恆定結構域(CH1)。Fab'片段因在包括一或多個來自抗體絞鏈區之半胱胺酸的重鏈CH1結構域之羧基末端處添加幾個殘基而不同於Fab片段。Fab'-SH係在本文中關於其中恆定結構域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基的Fab'之名稱。F(ab')₂ 抗體片段最初作為在其間具有鉸鏈半胱胺酸之成對Fab'片段而產生。亦已知抗體片段之其他化學偶合。

術語「Fc區」在本文中用於定義含有恆定區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈之C末端區域。該術語包括天然序列Fc區及變異Fc區。在某些實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或Pro230延伸至重鏈之羧基末端。然而，Fc區之C末端離胺酸(Lys447)可存在或不存在。除非在本文中另有規定，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之數目係根據EU編號系統，亦稱為EU指數，如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述。

「架構」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外的可變結構域殘基。可變結構域之FR一般係由四個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR與FR序列一般以如下序列出現於VH (或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換地用於指代具有實質上類似於天然抗體結構之結構或具有含有如本文所定義之Fc區的重鏈之抗體。

術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」與「宿主細胞培養物」可互換使用並且係指其中已引入外源性核酸之細胞，包括此類細胞之子代。宿主細胞包括「轉化體」及「轉化細胞」，其包括一次轉化細胞及由此衍生之子代，不考慮傳代之次數。子代在核酸含量上與親代細胞並非完全相同，而可含有突變。如在原始轉化細胞中經篩選或選擇而具有相同功能或生物活性之突變子代包括在本文中。在某些實施例中，宿主細胞為「經分離之」宿主細胞，其係指已自其自然環境之組分中分離的宿主細胞。

「經分離之」抗體為自其自然環境之組分中分離之抗體。在一些實施例中，將抗體純化至大於95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電點聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或逆相HPLC)所測定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見，例如Flatman等人,J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。

「經分離之」核酸係指已自其自然環境之組分中分離之核酸分子。經分離之核酸包括包含在通常含有核酸分子之細胞中的核酸分子，但核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置的染色體位置處。

相對於參考多肽序列之「胺基酸序列同一性百分比(%)」係定義為在比對序列與引入間隙(若需要)以獲得最大序列同一性百分比且不將任何保守取代視為序列同一性之部分後的候選序列之胺基酸殘基與參考多肽序列之胺基酸殘基相同的百分比。為測定胺基酸序列同一性百分比所進行之比對可用熟習此項技術者已知之各種方法完成，例如，使用公眾可獲得之計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較之序列全長上實現最大比對所需的任何算法。然而，為此目的，胺基酸序列同一性%值係使用序列比較計算機程式ALIGN-2產生。ALIGN-2序列比較計算機程序係由Genentech, Inc.設計，並且源代碼已與用戶文件一起提交至U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559，在此其係以美國版權登記第TXU510087號登記。ALIGN-2程式可公開獲自Genentech, Inc., South San Francisco, California，或可由源代碼編譯。ALIGN-2程式應在UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)上編譯以便使用。所有序列比較參數皆由ALIGN-2程式設定並且沒有變化。

在ALIGN-2用於胺基酸序列比較之情形下，給定胺基酸序列A同、與或針對給定胺基酸序列B之胺基酸序列同一性%(其可替代地解釋為同、與或針對給定胺基酸序列B具有或包含某一胺基酸序列同一性%之給定胺基酸序列A)係計算如下：
100乘分率X/Y
其中X為在比對A與B之程式中藉由序列比對程式ALIGN-2評為相同匹配之胺基酸殘基之數目，且其中Y為B中的胺基酸殘基之總數。應當理解，當胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A與B之胺基酸序列同一性%將不等於B與A之胺基酸序列同一性%。除非另外明確說明，否則本文中使用之所有胺基酸序列同一性%值係如前一段中所述使用ALIGN-2計算機程式獲得。

如本文所用之術語「載體」係指能夠載運另一與其相連之核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入宿主細胞(載體已引入其中)之基因組中的載體。某些載體能夠指導與其可操作連接之核酸的表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。

除非另外指出，否則如本文所用之單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個參考物。

如本文所用之術語「約」係指為此項技術中之熟練技術人員容易知曉的相應值之常見誤差範圍。在本文中提及「約」值或參數包括(且描述)涉及該值或參數本身之實施例。

應理解，本文所述之發明之態樣及實施例包括「包含」、「由以下組成」及「基本上由以下組成」：方面及實施例。
II. 用於偵測 PD-L1 之抗 PD-L1 抗體

在一態樣中，本發明提供抗PD-L1抗體，其適用於例如偵測及/或定量生物樣品中之細胞表面上的PD-L1蛋白。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為單株、嵌合或人源化的。在一些實施例中，抗PD-L1適用於偵測及/或定量生物樣品中之活細胞表面上的PD-L1蛋白。在一些實施例中，該生物樣品為末梢血液樣品或癌症樣品。在一些實施例中，該生物樣品為骨髓樣品。在一些實施例中，該生物樣品包含免疫細胞或腫瘤細胞。在一些實施例中，該樣品係來自於人受檢者。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係用於使用流動式細胞測量術偵測及/或定量PD-L1蛋白。在一些實施例中，抗PD-L1抗體不與抗PD-L1參考抗體交叉競爭結合至PD-L1。在一些實施例中，抗PD-L1參考抗體為阿特珠單抗。在一些實施例中，抗PD-L1抗體適用於偵測已接受阿特珠單抗治療之受試者中的PD-L1之存在。
A. 用於偵測 PD-L1 之示範性抗 PD-L1 抗體

一般而言，本揭示之抗體免疫特異性地結合PD-L1(例如，人PD-L1)。本揭示之抗體較佳為單株的，且可為多特異性、人、人源化、小鼠或嵌合單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段、由Fab表現文庫產生之片段、以及以上任一者之PD-L1結合片段。本揭示之免疫球蛋白分子可為免疫球蛋白分子之任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類。

在本揭示之某些實施例中，如本文所述之抗體或其抗原結合片段為抗原結合片段。在某些實施例中，抗原結合片段包括但不限於Fab、Fab'與F(ab')₂ 、Fd、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接之Fv (sdFv)以及包含V_L 或V_H 結構域之片段。包括單鏈抗體之抗原結合片段可包含單獨或以與以下之全部或一部分組合形式的可變區：絞鏈區、CH1、CH2、CH3及CL結構域。本揭示中亦包括包含一或多個可變區與絞鏈區、CH1、CH2、CH3及CL結構域之任何組合。較佳地，抗體或其抗原結合片段為人、鼠類(例如小鼠與大鼠)、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞。

可根據其所包含之特定HVR來描述或說明本揭示之抗體。

在某些實施例中，本發明提供抗PD-L1抗體，其包含：(a) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含含有胺基酸序列TSWMN (SEQ ID NO:1)之HVR-H1、含有胺基酸序列RIYPRDGDTYYNGKFKD (SEQ ID NO:2)之HVR-H2、及含有胺基酸序列NPGGYYFDY (SEQ ID NO:3)之HVR-H3；以及(b)輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含含有胺基酸序列RASQDIHTYLN (SEQ ID NO:4)之HVR-L1、含有胺基酸序列YTSRLHS (SEQ ID NO:5)之HVR-L2、及含有胺基酸序列QQVSSLPPWT (SEQ ID NO:6)之HVR-L3。

在一些實施例中，該抗PD-L1抗體包含抗體14D3之一、二、三、四、五或六個HVR(Kabat)，例如，如圖1A與圖1B中所示。在一些實施例中，該抗PD-L1抗體包含抗體14D3之VH及/或VL，例如，如圖1A與圖1B中所示。

在一些實施例中，提供抗PD-L1抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 7之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之重鏈可變結構域(VH)序列。在某些實施例中，與SEQ ID NO: 7之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼VH序列之抗PD-L1抗體保留結合至PD-L1之能力。在某些實施例中，總計1至10個胺基酸已在SEQ ID NO: 7中經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失出現在HVR之外的區域中(亦即，在FR中)。視情況，該抗PD-L1抗體包含SEQ ID NO: 7之VH序列，包括彼序列之翻譯後修飾。在一具體實施例中，VH包含一、二或三個選自以下之HVR：(a) 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的HVR-H1，(b) 包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的HVR-H2，以及(c) 包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的HVR-H3。

在一些實施例中，提供抗PD-L1抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之輕鏈可變結構域(VL)。在某些實施例中，與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含彼VL序列之抗PD-L1抗體保留結合至PD-L1抗體之能力。在某些實施例中，總計1至10個胺基酸已在SEQ ID NO: 8中經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失出現在HVR之外的區域中(亦即，在FR中)。視情況，該抗PD-L1抗體包含SEQ ID NO: 8之VL序列，包括彼序列之翻譯後修飾。在一具體實施例中，VL包含一、二或三個選自以下之HVR：(a) 包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的HVR-L1。(b) 包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的HVR-L2；以及(c) 包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HVR-L3。

在另一態樣中，提供一種抗PD-L1抗體，其中該抗體包含如在以上提供之任一實施例中之VH及如在以上提供之任一實施例中之VL。在一實施例中，該抗體包含SEQ ID NO: 7之VH序列及SEQ ID NO : 8之VL序列，包括彼等序列之翻譯後修飾。

在另一態樣中，提供一種抗PD-L1抗體，其中該抗體包含如在以上提供之任一實施例中之重鏈及如在以上提供之任一實施例中之輕鏈。在一實施例中，該抗體包含SEQ ID NO: 9之重鏈序列及SEQ ID NO : 10之輕鏈序列，包括彼等序列之翻譯後修飾。

亦可根據其與PD-L1(例如人PD-L1)之結合親和力來描述或說明本發明之抗體。較佳結合親和力包括具有小於以下之解離常數或Kd之彼等：5 x10^-2 M、10^-2 M、5x10^-3 M、10^-3 M、5x10^-4 M、10^-4 M、5x10^-5 M、10^-5 M、5x10^-6 M、10^-6 M、5x10^-7 M、10^-7 M、5x10^-8 M、10^-8 M、5x10^-9 M、10^-9 M、5x10^-10 M、10^-10 M、5x10^-11 M、10^-11 M、5x10^-12 M、10^-12 M、5x10^-13 M、10^-13 M、5x10^-14 M、10^-14 M、5x10^-15 M或10^-15 M。

在本發明之另一態樣中，根據以上實施例中任一個之抗PD-L1抗體為單株抗體，包括嵌合、人源化或小鼠抗體。在一實施例中，抗PD-L1抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙抗體或F(ab')₂ 片段。在另一實施例中，抗PD-L1抗體為全長抗體，例如，完整IgG1抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。

在本發明之另一態樣中，根據以上實施例中任一個或本文所述之抗PD-L1抗體連接或結合至異源部分或可偵測之部分。在一些實施例中，可偵測之部分為標記或生物素。在一些實施例中，可偵測之部分為標記。在一些實施例中，可偵測之部分為生物素。在一些實施例中，可偵測之部分為螢光團。在一些實施例中，螢光團為R-藻紅素(PE)、PE-Cy7、Alexa Fluor 488、螢光異硫氰酸鹽(FITC)、甲藻黃素葉綠素蛋白複合物(PerCP)、BV421、BV510、APC-H7、Alexa Fluor 647或別藻藍蛋白(APC)。在一些實施例中，螢光團為R-藻紅素(PE)。在一些實施例中，螢光團為別藻藍蛋白(APC)。在一些實施例中，螢光團為Alexa Fluor 647。
抗PD-L1抗體重鏈可變區胺基酸序列：

QVQLQQSGPELVNPGASVKISCKASGYAFSTSWMNWVKQRPGK GLEWIGRIYPRDGDTYYNGKFKDKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCTKNPGGYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 7)
抗PD-L1抗體輕鏈可變區胺基酸序列：

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTINCRASQDIHTYLNWYQQKPDGTV KLLIFYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQVSSLPPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 8)
抗PD-L1抗體重鏈胺基酸序列：

QVQLQQSGPELVNPGASVKISCKASGYAFSTSWMNWVKQRPGK GLEWIGRIYPRDGDTYYNGKFKDKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCTKNPGGYYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG (SEQ ID NO: 9)
抗PD-L1抗體輕鏈胺基酸序列：

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTINCRASQDIHTYLNWYQQKPDGTV KLLIFYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQVSSLPPWTFGGGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 10)
B. 參考或治療性抗 PD-L1 抗體

在另一態樣中，本文所述之抗PD-L1抗體不與參考抗PD-L1抗體或治療性抗PD-L1抗體交叉競爭結合至PD-L1。如本文所用之術語「參考抗PD-L1抗體」及「治療性抗PD-L1抗體」係指除本揭示之抗PD-L1以外的抗PD-L1抗體。術語「參考抗PD-L1抗體」與「治療性抗PD-L1抗體」可互換使用，但當向受檢者施用該抗體時通常使用術語「治療性抗PD-L1抗體」。

在某些實施例中，參考或治療性抗PD-L1抗體包含：(a) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含含有胺基酸序列GFTFSDSWIH (SEQ ID NO:11)之HVR-H1、含有胺基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:12)之HVR-H2、及含有胺基酸序列RHWPGGFDY (SEQ ID NO:13)之HVR-H3；以及(b) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含含有胺基酸序列RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:14)之HVR-L1、含有胺基酸序列SASFLYS (SEQ ID NO:15)之HVR-L2、及包含胺基酸序列QQYLYHPAT (SEQ ID NO:16)之HVR-L3。

在一些實施例中，參考或治療性抗PD-L1抗體包含含有SEQ ID NO:17之胺基酸序列的重鏈可變區及含有SEQ ID NO:18之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包含：與具有SEQ ID NO:17之胺基酸序列的重鏈可變區具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之重鏈可變區；及/或與具有SEQ ID NO:18之胺基酸序列的輕鏈可變區具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之輕鏈可變區。

在一些實施例中，參考或治療性抗PD-L1抗體包含含有SEQ ID NO:19之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包含：與具有SEQ ID NO:19之胺基酸序列的重鏈具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性之重鏈；及與具有SEQ ID NO:20之胺基酸序列的輕鏈具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之輕鏈。

在一些實施例中，參考或治療性抗PD-L1抗體為阿特珠單抗(TECENTRIQ®)。

在一些實施例中，參考或治療性抗PD-L1抗體為單株、嵌合或人源化的。
示範性參考或治療性抗PD-L1抗體重鏈可變區胺基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGK GLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:17)
示範性參考或治療性抗PD-L1抗體輕鏈可變區胺基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAP KLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:18)
示範性參考或治療性抗PD-L1抗體重鏈胺基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKG LEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:19)
示範性參考或治療性抗PD-L1抗體輕鏈胺基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAP KLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:20)
C. 產生方法

說明書按照用於產生根據本發明使用之抗體之示範性技術。
i. 多株抗體

本發明之抗體可包含多株抗體。製備多株抗體之方法為熟練技術人員所知。可例如藉由免疫劑及(若需要)佐劑之一或多次注射在哺乳動物中產生多株抗體。通常，免疫劑及/或佐劑將藉由多次皮下或腹膜內注射在哺乳動物中注射。免疫劑可包括抗PD-L1、其抗原結合片段或其融合蛋白。免疫劑結合至已知在受免疫之哺乳動物中有免疫原性之蛋白質可為有用的。此類免疫原性蛋白質之實例包括但不限於匙孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白及大豆胰蛋白酶抑制劑。可採用之佐劑之實例包括弗氏完全佐劑及MPL-TDM佐劑(單磷醯基脂質A，合成的海藻糖二棒分枝桿菌酸酯)。免疫方案可由熟習此項技術者在無不當實驗下選擇。可接著對哺乳動物采血，並且分析血清中之抗PD-L1抗體滴度。若需要，則可對哺乳動物進行加強直至抗體滴度提高或穩定。
ii. 單株抗體

本發明之抗體可替代地為單株抗體。單株抗體可使用首先由Kohler等人, Nature, 256:495 (1975)描述之融合瘤方法製得，或可藉由重組DNA方法(參見，例如美國專利第4,816,567號)製得。

在融合瘤方法中，如上所述對小鼠或其他適當的宿主動物(諸如倉鼠)進行免疫以引發產生或能夠產生抗體之淋巴細胞，該等抗體將特異性地結合至蛋白質用於免疫。替代地，可在活體外免疫淋巴細胞。免疫之後，將淋巴細胞分離，接著使用合適的融合劑(諸如聚乙二醇)與骨髓瘤細胞株融合，以形成融合瘤細胞(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 第59-103頁 (Academic Press, 1986))。

將由此製備之融合瘤細胞接種並生長於合適的培養基中，該培養基含有一或多種抑制未融合之親代骨髓瘤細胞(亦稱為融合配偶體)之生長或存活的物質。例如，若親代骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶(HGPRT或HPRT)，則用於融合瘤之選擇性培養基通常將包括次黃嘌呤、胺蝶呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質阻止缺乏HGPRT之細胞的生長。

融合配偶體骨髓瘤細胞為以下彼等細胞：有效地融合、支持所選產抗體細胞穩定高水準地產生抗體、並且對針對未融合之親代細胞選出之選擇性培養基敏感。骨髓瘤細胞株為鼠類骨髓瘤株，諸如衍生自MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤之彼等(可獲自Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA)，以及SP-2及衍生物，例如可獲自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection), Manassas, Virginia, USA之X63-Ag8-653細胞。亦已關於人單株抗體之產生對人骨髓瘤及小鼠-人異骨髓瘤細胞株進行描述(Kozbor, J. Irnmunol., 133:3001 (1984)；及Brodeur等人, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 第51-63頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。

關於針對抗原之單株抗體之產生分析其中生長融合瘤細胞之培養基。由融合瘤細胞產生之單株抗體之結合特異性可藉由免疫沉澱或藉由活體外結合檢定，諸如放射免疫檢定(RIA)或酶聯免疫吸附檢定(ELISA)來測定。單株抗體之結合親和力可例如藉由Munson等人, Anal. Biochem., 107:220 (1980)中所述之Scatchard分析來測定。

一旦識別產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體的融合瘤細胞，便可藉由限制稀釋程序將純系次選殖並藉由標準方法使其生長(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,第59-103頁 (Academic Press, 1986))。出於此目的之合適培養基包括例如D­MEM或RPMI-1640培養基。另外，該融合瘤細胞可例如藉由將細胞i.p.注射至小鼠中而在活體內作為動物中之腹水腫瘤生長。

將由亞純系分泌之單株抗體藉由以下習知抗體純化程序適當地自培養基、腹水或血清中分離：諸如親和層析法(例如，使用蛋白A或蛋白G-瓊脂糖)或離子交換層析法、羥磷灰石層析法、凝膠電泳、透析等。

編碼單株抗體之DNA易於使用習知程序(例如，藉由使用能夠特異性地結合至編碼鼠類抗體之重鏈和輕鏈之基因的寡核苷酸探針)分離並定序。融合瘤細胞充當此類DNA之來源。一旦分離，DNA便可置於表現載體中，接著將其轉染至以下宿主細胞中以便在重組宿主細胞中合成單株抗體：諸如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不另外產生抗體蛋白質之骨髓瘤細胞。關於在編碼抗體之DNA的細菌中之重組表現的綜述論文包括Skerra等人, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)及Pliickthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)。

在又一實施例中，單株抗體或抗體片段可自使用McCafferty等人, Nature, 348:552-554 (1990)中所述之技術產生的抗體噬菌體文庫中分離。Clackson等人, Nature, 352:624-628 (1991)及Marks等人, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)描述使用噬菌體文庫分別分離鼠類及人抗體。隨後之出版物描述藉由鏈改組產生高親和力(nM範圍)人抗體(Marks等人, Bio/Technology, 10:779-783 (1992))以及組合感染及活體內重組作為用於構築極大噬菌體文庫之策略(Waterhouse等人, Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 ( 1993))。因此，此等技術為用於分離單株抗體之傳統單株抗體融合瘤技術的可行替代方案。

原則上，藉由篩選含有顯示融合至噬菌體外殼蛋白上的抗體可變區(Fv)之各種片段的噬菌體之噬菌體文庫選擇合成抗體純系。針對所需抗原篩選此類噬菌體文庫。表現能夠結合至所需抗原之Fv片段的純系係吸附至抗原且因此與文庫中之非結合純系分離。結合純系接著自抗原中溶離，並且可進一步藉由抗原吸附/溶離之另外的循環富集。

可變結構域可以如下形式在功能上呈現於噬菌體上：單鏈Fv(scFv)片段，其中VH與VL經由短的柔性肽共價連接；或Fab片段，其中該等片段各自融合至恆定結構域並且非共價地相互作用，如Winter等人, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)中所述。

VH與VL基因之庫可藉由聚合酶鏈反應(PCR)單獨選殖並且在噬菌體文庫中隨機重組，接著可如Winter等人, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)中所述針對抗原結合純系對其進行搜索。來自免疫來源之文庫提供針對免疫原之高親和力抗體，而不需要構築融合瘤。替代地，幼稚庫(naive repertoire)可經選殖以便如Griffiths等人, EMBO J, 12: 725-734 (1993)所述在無任何免疫作用下提供針對廣泛多種非自體以及自體抗原之人抗體的單一來源。最終，幼稚文庫亦可藉由自幹細胞選殖未經重排之V基因區段並且使用含有隨機序列之PCR引物以編碼高度可變之CDR3區域並完成活體外重排而以合成方式製得，如由Hoogenboom與Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)所述。

文庫之篩選可藉由此項技術中已知之各種技術完成。例如，PD-L1可用於包被吸附板之孔，在附著於吸附板之宿主細胞上表現，或在細胞分選中使用，或結合至生物素以用於經由鏈黴抗生物素包被之珠粒的捕獲，或在用於淘選顯示文庫之任何其他方法中使用。

具有慢解離動力學(及良好的結合親和力)之抗體之選擇可藉由使用如Bass等人, Proteins, 8: 309-314 (1990)及WO 92/09690中所述之長時間洗滌與單價噬菌體顯示以及如Marks等人, Biotechnol., 10: 779-783 (1992)中所述之低包被密度之抗原來促進。

本發明之抗PD-L1抗體中之任一者可藉由以下操作獲得：設計合適的抗原篩選程序以選擇感興趣之噬菌體純系，繼之如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), 第1-3卷中所述使用來自感興趣之噬菌體純系的Fv序列及合適的恆定區(Fc)序列構築全長抗PD-L1抗體純系。
iii. 抗體變異體

在某些實施例中，包括本文所提供之抗體之胺基酸序列變異體。例如，可能期望改良抗體之結合親和力及/或其他生物性質。抗體之胺基酸序列變異體可藉由引入適當的修飾至編碼抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如抗體之胺基酸序列內的殘基之缺失及/或插入及/或取代。可製造缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，前提條件為最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合。
1. 取代、插入及缺失變異體

在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。取代誘變之感興趣之位點包括HVR及FR。保守取代示於表1中之「保守取代」標題下。更實質性改變提供於表1中之「示範性取代」標題下，並且在下文中關於胺基酸側鏈類別進一步描述。胺基酸取代可引入至感興趣之抗體中並且針對以下所需活性對產物進行篩選：例如，經保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性、或經改良之ADCC或CDC。
表 1

可根據共同的側鏈性質對胺基酸分組：
- 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
- 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
- 酸性：Asp、Glu；
- 鹼性：His、Lys、Arg；
- 影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；
- 芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代將需要用另一類別更換此等類別中一者之成員。

一種類型之取代變異體涉及取代親代抗體(例如，小鼠、人源化或人抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，為進一步研究而選擇之所得變異體相對於親代抗體將在某些生物性質(例如，提高之親和力、降低之免疫原性)上具有修飾(例如改良)及/或將具有親代抗體之實質上保留之某些生物性質。示範性取代變異體為親和力成熟抗體，其適宜例如使用基於噬菌體顯示之親和力成熟技術(諸如本文所述之彼等)產生。簡言之，一或多個HVR殘基突變並且變異體抗體顯示在噬菌體上並針對特定的生物活性(例如結合親和力)進行篩選。

改變(例如取代)可在HVR中作出，以例如改良抗體親和力。此類改變可在HVR「熱點」中作出，亦即，由在體細胞成熟過程期間經歷高頻突變之密碼子編碼之殘基(參見，例如Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008))及/或SDR(a-CDR)，其中針對結合親和力測試所得變異VH或VL。藉由構築並自二級文庫進行選擇之親和力成熟描述於例如Hoogenboom等人 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等人編, Human Press, Totowa, NJ, (2001).)中。在親和力成熟之一些實施例中，將多樣性引入藉由多種方法(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變)中之任一者為成熟而挑選之可變基因中。接著創建二級文庫。隨後對該文庫進行篩選以識別具有所需親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一種方法涉及HVR定向方法，其中將若干HVR殘基(例如，每次4-6個殘基)隨機化。參與抗原結合之HVR殘基可例如使用丙胺酸掃描誘變或建模來特異性地識別。具體而言，常常靶向HVR-H3與HVR-L3。

在某些實施例中，取代、插入或缺失可出現在一或多個HVR內，只要此類變化沒有實質上削弱抗體結合抗原之能力。例如，沒有實質上降低結合親和力之保守變化(例如，如本文所提供之保守取代)可在HVR中作出。此類變化可在HVR「熱點」或SDR之外。在以上提供之變異VH及VL序列之某些實施例中，各HVR為不變的，或含有不超過一個、兩個或三個氨基酸取代。

用於識別可靶向誘變之抗體之殘基或區域的有用方法係稱作「丙胺酸掃描誘變」，如由Cunningham與Wells (1989) Science, 244:1081-1085所述。在此方法中，殘基或靶標殘基組(例如，帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)經識別並由中性或帶負電之胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)代替以便確定抗體與抗原之相互作用是否受影響。進一步之取代可在經論證對初始取代具有功能敏感性之胺基酸位置處引入。

或者或另外，抗原抗體複合物之晶體結構識別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及相鄰殘基可作為供取代用之候選物而被靶向或消除。可篩選變異體以確定其是否含有所需性質。

胺基酸序列插入物包括長度自一個殘基至含有一百或更多個殘基之多肽的胺基及/或羧基末端融合物以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入物。末端插入物之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N-或C-末端與增加抗體之血清半衰期的酶(例如對於ADEPT)或多肽之融合物。
iv. 重組方法及組合物

可使用重組方法及組合物產生抗體，例如，如美國專利第4,816,567號中所述。在一實施例中，提供編碼本文所述之抗PD-L1抗體的經分離之核酸。此類核酸可編碼包含抗體之VL的胺基酸序列及/或包含抗體之VH(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)的胺基酸序列。在又一實施例中，提供一或多種包含此類核酸之載體(例如表現載體)。在又一實施例中，提供包含此類核酸之宿主細胞。在一此類實施例中，宿主細胞包含(例如，已經以下各物轉化)：(1)包含核酸之載體，該核酸編碼包含抗體之VL的胺基酸序列及包含抗體之VH的胺基酸序列；或(2)包含編碼包含抗體之VL的胺基酸序列之核酸的第一載體及包含編碼包含抗體之VH的胺基酸序列之核酸的第二載體。在一實施例中，宿主細胞為真核的，例如，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如，YO、NSO、Sp20細胞)。在一實施例中，提供一種製備抗PD-L1抗體之方法，其中該方法包含在適於表現該抗體之條件下培養如上所提供之包含編碼該抗體之核酸的宿主細胞，及視情況由該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。

關於抗PD-L1抗體之重組產生，將編碼例如如上所述之抗體的核酸分離並插入一或多個載體中以便於在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此類核酸可易於使用習知程序(例如，藉由使用能夠特異性地結合至編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)分離並定序。

用於選殖或表現編碼抗體之載體的合適宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。例如，抗體可在細菌中產生，特別是當不需要糖基化及Fe效應功能時。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見，例如U.S.專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。(亦參見Charlton, ,Methods in Molecular Biology, 第248卷 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), 第245-254頁，其描述抗體片段在大腸桿菌中之表現。) 表現之後，可將抗體以可溶級分自細菌細胞漿中分離並可進一步純化。

除原核生物之外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母亦為適合於編碼抗體之載體的選殖或表現宿主，包括真菌及酵母菌株，其糖基化途徑已經「人源化」，造成具有部分或全人糖基化模式之抗體的產生。參見Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)及Li等人, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)。

適用於表現糖基化抗體之宿主細胞亦衍生自多細胞生物(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已識別許多桿狀病毒株，其可聯合昆蟲細胞使用，尤其係用於轉染草地夜蛾細胞。植物細胞培養物亦可用作宿主。參見，例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述用於在轉基因植物中產生抗體之PLANTIBODIES™技術)。

脊椎動物細胞亦可用作宿主。例如，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為有用的。有用的哺乳動物宿主細胞株之其他實例為由SV40轉化之猴腎CV 1株(COS-7)；人胚腎株(293或293細胞，如例如Graham等人, J Gen Viral. 36:59 (1977)中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠足細胞(TM4細胞，如例如Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)中所述)；猴腎細胞(CV l)；非洲綠猴腎細胞(VER0-76)；人宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MOCK；水牛(buffalo)大鼠肝細胞(BRL 3A)；人肺細胞(W138)；人肝細胞(Hep 02)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如例如Mather等人, Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)中所述；MRC 5細胞；以及FS4細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFK CHO細胞(Urlaub等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；以及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NSO及Sp2/0。關於適用於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述，參見，例如Yazaki與Wu, Methods in Molecular Biology, 第248卷 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ), 第255-268頁 (2003)。
III. 檢定

可藉由此項技術中已知之各種檢定，針對物理/化學性質及/或生物活性來識別、篩選或表徵本文所提供之抗PD-L1抗體。
A. 結合檢定及其他檢定

在一態樣中，例如藉由已知方法諸如ELISA、西方墨點等，將本發明之抗體關於其抗原結合活性進行測試。結合親和力可藉由此項技術中已知之常用方法量測。在一實施例中，藉由放射性標記之抗原結合檢定(RIA)量測抗體之K_D ，該RIA如由以下檢定所述用Fab形式之抗體及抗原分子進行，該檢定藉由下列操作來量測抗原對於Fab之溶液結合親和力：在一系列滴定之未標記抗原存在下使Fab與最小濃度之(¹²⁵ I)-標記抗原平衡，接著用抗Fab抗體包被之板捕獲結合抗原(Chen等人, (1999)J. Mol. Biol 293:865-881)。為了確定用於檢定之條件，在50 mM碳酸鈉(pH 9.6)中用5 ug/ml捕獲抗Fab抗體(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)隔夜，且隨後在室溫(大約23℃)下在PBS中用2% (w/v)牛血清白蛋白阻斷2至5小時。在非吸附板(Nunc #269620)中，將100 pM或26 pM [¹²⁵ I]-抗原與感興趣之Fab之連續稀釋液(遵循在Presta等人, (1997)Cancer Res. 57:4593-4599中抗VEGF抗體(Fab-12)之評估)混合。接著將感興趣之Fab培育隔夜；然而，培育可持續更長時間(例如65小時)以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕獲板以便在室溫下培育1小時。隨後移除溶液並且用在PBS中之0.1% Tween-20洗滌該板8次。當板已乾燥時，添加150 ul/孔之閃爍體(MicroScint-20；Packard)，並且在Topcount γ計數器(Packard)上計數板十分鐘。選擇給出小於或等於20%最大結合之各Fab之濃度以用於競爭性結合檢定中。

根據另一實施例，在25℃下，用經固定之抗原CM5晶片，在10個回應單位(RU)下，使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000儀器(BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)，藉由使用表面電漿子共振檢定量測K_D 。簡言之，根據供應商說明書，用N-乙基-N′-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)激活羧甲基化之葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIAcore Inc.)。將抗原用10 mM乙酸鈉pH 4.8稀釋至5 μg/ml (0.2 μM)，之後以5 μL/分鐘之流率進行注射以獲得大約10回應單位(RU)之偶合蛋白。注射抗原之後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。關於動力學量測，在25℃下，在大約25 μL/min之流率下，注射在含有0.05% TWEEN 20™界面活性劑(PBST)之PBS中的Fab之兩倍連續稀釋液(0.78 nM至500 nM)。使用簡單的一對一朗繆結合模型(BIAcore® Evaluation Software 3.2版)，藉由同時擬合結合與解離感測器圖來計算結合速率(k_結合 )與解離速率(k_解離 )。平衡解離常數(K_D )係計算為比率k_off /k_on 。參見，例如Chen等人,J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。若藉由上述表面電漿子共振檢定得出結合速率超過10⁶ M^{− 1} s^{− 1} ，則可藉由在25℃下在增加濃度之抗原存在下使用量測在PBS pH 7.2中的20 nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發= 295 nm；發射= 340 nm，16 nm帶通)之增加或減少的螢光淬滅技術測定結合速率，該抗原濃度如在分光計諸如配備止流裝置之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌槽之8000系列SLM-AMINCO™分光光度計中所量測。

在另一態樣中，競爭檢定可用於確定本文所述之抗PD-L1抗體是否與本文所述之治療性或參考抗體競爭結合至PD-L1。在某些實施例中，用於確定本文所述之抗PD-L1抗體是否與本文所述之治療性或參考抗體競爭結合至PD-L1之競爭檢定為流動式細胞測量術。在某些實施例中，這種競爭抗體結合至PD-L1之相同表位(例如，線性或構形表位)。關於繪製抗體所結合之表位的詳細示範性方法提供於Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols,"in Methods in Molecular Biology vol. Humana Press, Totowa, NJ)中。在一些實施例中，本文所述之抗PD-L1抗體不與本文所述之治療性或參考抗體競爭結合至PD-L1。在一些實施例中，若在競爭檢定中抗PD-L1抗體將治療性或參考抗體與PD-L1之結合阻斷了小於20%、小於15%、小於10%、小於9%、小於8%、小於7%、小於6%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%、小於1%，則該抗體不與本文所述之治療性或參考抗體競爭結合至PD-L1。在一些實施例中，若在競爭檢定中抗PD-L1抗體將治療性或參考抗體與PD-L1之結合阻斷了大於20%、大於25%、大於30%、大於35%、大於40%、大於45%、大於50%、大於55%、大於60%、大於65%、大於70%、大於75%、大於80%、大於85%、大於90%、大於95%，則該抗體與本文所述之治療性或參考抗體競爭結合至PD-L1。在一些實施例中，PD-L1為人PD-L1。

在示範性競爭檢定中，將經固定之PD-L1在包含以下之溶液中培育：結合至PD-L1抗體之第一標記之抗體(例如，第一標記之抗PD-L1抗體)及關於其與第一抗體競爭結合至PD-L1之能力進行測試之第二未標記之抗體(例如，第二未標記之抗PD-L1抗體)。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，將經固定之PD-L1在包含第一標記之抗體而非第二未標記之抗體中培育。在容許第一抗體結合至PD-L1之條件下培育之後，移除過量未結合之抗體，並且量測與經固定之PD-L1有關的標記之量。若與經固定之PD-L1有關的標記之量相對於對照樣品在測試樣品中實質上減少，則此表明第二抗體與第一抗體競爭結合至PD-L1。參見Harlow與Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual 第14章 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。競爭檢定亦可以如上所述之方式使用經PD-L1轉染之細胞用FACS進行並在細胞表面上表現。另外，採用PD-L1之ELISA亦可用於競爭檢定中。在一些實施例中，競爭檢定為流動式細胞測量術。
IV. 使用抗 PD-L1 抗體之方法

本揭示之某些態樣係關於偵測或定量例如來自患有癌症之受檢者之生物樣品中的人PD-L1之表現水準以評估例如受檢者對治療性抗PD-L1抗體治療之反應性的方法。如本文所揭示且不希望受理論約束，PD-L1之表現水準、例如在生物樣品中的細胞表面上表現之人PD-L1水準可用於診斷癌症(例如，表現PD-L1之癌症)並且評估對癌症療法(例如，治療性抗PD-L1抗體治療)之反應性。如本文所揭示，本揭示之抗PD-L1抗體不與治療性抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗)競爭結合至人PD-L1(參見實例1及2)。有利地，使用例如流動式細胞測量檢定，本揭示之抗PD-L1抗體可用於定量來自免疫及腫瘤細胞並且在治療性抗PD-L1抗體(諸如阿特珠單抗)存在下的PD-L1表現。此與其他市售之抗PD-L1抗體(諸如PD-L1純系29E.23)形成對比，該市售抗體與治療性抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗)競爭結合至人抗PD-L1，由此避免其用於定量免疫及腫瘤細胞表面上之PD-L1表現。

本揭示之方法可尤其用於調節/調整/確定/選擇患有癌症且將用/已用/正用治療性抗PD-L1抗體治療之受檢者的給藥；選擇患有癌症之受檢者來用治療性抗PD-L1抗體治療；評估受檢者對治療性抗PD-L1抗體之反應性；評估患有癌症且用治療性抗PD-L1抗體治療之受檢者的無進展存活；評估患有癌症且用治療性抗PD-L1抗體治療之受檢者中的腫瘤負荷；預測患有癌症且用治療性抗PD-L1抗體治療之受檢者中的癌症進展；診斷患有表現PD-L1之癌症的受檢者；診斷患有對用治療性抗PD-L1抗體之治療有反應之癌症的受檢者；以及診斷患有癌症且用治療性抗PD-L1抗體治療之受檢者中的癌症進展。癌症之實例可包括但不限於多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群及/或急性骨髓性白血病。在一些實施例中，癌症為表現PD-L1之癌症。

如本文所提供之任何抗PD-L1抗體適用於偵測生物樣品中之PD-L1之存在。在某些實施例中，如本文所提供之任何抗PD-L1抗體適用於定量生物樣品中之PD-L1水準。在某些實施例中，如本文所述之任何抗PD-L1抗體適用於偵測包含免疫細胞之生物樣品中的PD-L1之存在。在某些實施例中，如本文所述之任何抗PD-L1抗體適用於偵測包含腫瘤細胞之生物樣品中的PD-L1之存在。在某些實施例中，如本文所述之任何抗PD-L1抗體適用於偵測包含活細胞之生物樣品中的PD-L1之存在。在某些實施例中，如本文所述之任何抗PD-L1抗體適用於偵測生物樣品中的PD-L1之存在，其中該生物樣品來自於已用治療性抗PD-L1抗體治療之受檢者。在某些實施例中，如本文所提供之任何抗PD-L1抗體適用於使用例如流動式細胞測量術、免疫檢定(例如基於ELISA之檢定及親近延伸檢定)、西方墨點、肽微陣列、免疫組織化學及/或質譜法偵測生物樣品中的PD-L1之存在。在某些實施例中，如本文所提供之任何抗PD-L1抗體適用於偵測生物樣品中的PD-L1之存在，其中該生物樣品為血液樣品。在某些實施例中，如本文所提供之任何抗PD-L1抗體適用於偵測生物樣品中的PD-L1之存在，其中該生物樣品為骨髓樣品。
偵測標記

在一些實施例中，抗PD-L1抗體與任何標記部分結合，該標記部分可經由反應性部分、活化部分或反應性半胱胺酸硫醇基共價地連接於抗體(Singh等人 (2002) Anal. Biochem. 304:147-15；Harlow E.與Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 第2版 CRC Press, Boca Raton, FL)。附著標記可用於：(i)提供可偵測之信號；(ii)與第二標記相互作用以修改由第一或第二標記所提供之可偵測之信號，例如以便產生FRET (螢光共振能量轉移)；(iii)穩定化與抗原或配位子之相互作用或提高其結合親和力；(iv)藉由電荷、疏水性、形狀或其他物理參數實現移動性，例如，電泳移動性或細胞滲透性；或(v)提供捕獲部分，以調節配位子親和力、抗體/抗原結合、或離子錯合。

螢光標記諸如稀土螯合物(銪螯合物)；螢光素類型，包括FITC、5-羧基螢光素、6-羧基螢光素；玫瑰紅類型，包括TAMRA；丹磺醯；麗絲胺(Lissamine)；花青；藻紅素；德克薩斯(Texas)紅；及其類似物。可使用例如Current Protocols in Immunology,上述中所揭示之技術將螢光標記結合至抗體。螢光染料及螢光標記試劑包括由Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR)及Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL)市售之彼等。在一些實施例中，螢光團為R-藻紅素(PE)、PE-Cy7、Alexa Fluor 488、螢光異硫氰酸鹽(FITC)、甲藻黃素葉綠素蛋白複合物(PerCP)、BV421、BV510、APC-H7、Alexa Fluor 647或別藻藍蛋白(APC)。在一些實施例中，螢光團為R-藻紅素(PE)。在一些實施例中，螢光團為PE-Cy7。在一些實施例中，螢光團為Alexa Fluor 488。在一些實施例中，螢光團為螢光異硫氰酸鹽(FITC)。在一些實施例中，該螢光團為甲藻黃素葉綠素蛋白複合物(PerCP)。在一些實施例中，螢光團為BV421。在一些實施例中，螢光團為BV510。在一些實施例中，螢光團為APC-H7。在一些實施例中，螢光團為Alexa Fluor 647。在一些實施例中，螢光團為別藻藍蛋白(APC)。

經標記之半胱胺酸工程抗體可適用於診斷檢定中，例如用於偵測感興趣之抗原在特定的細胞、組織或血清中之表現。關於診斷應用，抗體通常將用可偵測之部分來標記。許多標記係可獲得的, 其通常劃分成以下類別：

放射性同位素(放射性核素)，諸如³ H、¹¹ C、¹⁴ C、¹⁸ F、³² P、³⁵ S、⁶⁴ Cu、⁶⁸ Ga、⁸⁶ Y、⁹⁹ Tc、¹¹¹ In、¹²³ I、¹²⁴ I、¹²⁵ I、¹³¹ I、¹³³ Xe、¹⁷⁷ Lu、²¹¹ At或²¹³ Bi。放射性同位素標記之抗體適用於受體標靶成像實驗中。可使用Current Protocols in Immunology, 第1及2卷, Coligen等人編 Wiley-Interscience, New York, NY, Pubs. (1991)中所述之技術將抗體用配位子試劑標記，該配位子試劑結合、螯合或以其他方式錯合放射性同位素金屬，其中該試劑與抗體之工程半胱胺酸硫醇反應。可錯合金屬離子之螯合配位子包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA及TETA (Macrocyclics, Dallas, TX)。放射性核素可經由與本發明之抗體-藥物結合物之錯合而經靶向(Wu等人(2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146)。

連接試劑諸如DOTA-順丁烯二醯亞胺(4-順丁烯二醯亞胺基丁醯胺基苄基-DOTA)可藉由以下操作來製備：遵循Axworthy等人((2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1802-1807)之程序使胺苄基-DOTA與用氯甲酸異丙酯(Aldrich)活化之4-馬來醯亞胺基丁酸(Fluka)反應。DOTA-順丁烯二醯亞胺試劑與半胱胺酸工程抗體之游離半胱胺酸胺基酸反應並且提供在抗體上之金屬錯合配位子(Lewis等人 (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86)。螯合連接標記試劑諸如DOTA-NHS(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸單(N-羥基琥珀醯亞胺酯)係市售的(Macrocyclics, Dallas, TX).。用放射性核素標記抗體成像之受體標靶可藉由偵測並定量抗體在腫瘤組織中之漸進性積聚來提供途徑激活之標誌物(Albert等人 (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210)。結合之放射金屬可在溶酶體降解之後保留在胞內。

適用作成像實驗之抗體標記的金屬螯合錯合物揭示於：US 5,342,606；US 5,428,155；US 5,316,757；US 5,480,990；US 5,462,725；US 5,428,139；US 5,385,893；US 5,739,294；US 5,750,660；US 5,834,456；Hnatowich等人 (1983) J. Immunol. Methods 65:147-157；Meares等人 (1984) Anal. Biochem. 142:68-78；Mirzadeh等人 (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65；Meares等人 (1990) J. Cancer1990, 增刊10:21-26；Izard等人 (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350；Nikula等人 (1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90；Camera等人 (1993) Nucl. Med. Biol. 20:955-62；Kukis等人 (1998) J. Nucl. Med. 39:2105-2110；Verel等人 (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670；Camera等人 (1994) J. Nucl. Med. 21:640-646；Ruegg等人 (1990) Cancer Res. 50:4221-4226；Verel等人 (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670；Lee等人 (2001) Cancer Res. 61:4474-4482；Mitchell,等人 (2003) J. Nucl. Med. 44:1105-1112；Kobayashi等人 (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111；Miederer等人 (2004) J. Nucl. Med. 45:129-137；DeNardo等人 (1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90；Blend等人 (2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363；Nikula等人 (1999) J. Nucl. Med. 40:166-76；Kobayashi等人 (1998) J. Nucl. Med. 39:829-36；Mardirossian等人 (1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74；Roselli等人 (1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20。

各種酶-受質標記係可獲得或揭示的(US 4275149)。酶一般催化可使用各種技術量測之顯色受質之化學變化。例如，酶可催化受質中之顏色變化，此可經由分光光度法來量測。替代地，酶可改變受質之螢光或化學發光。用於定量螢光中之變化的技術如上所述。化學發光受質藉由化學反應變成電子激發態且接著可發射可經量測之光(使用例如化學發光計)或將能量提供給螢光受體。酶標記之實例包括螢光素酶(例如，螢光蟲螢光素酶及細菌螢光素酶；US 4,737,456)、螢光素、2,3-二氫呔口并二酮、蘋果酸脫氫酶、尿素酶、過氧化酶諸如山葵過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶)、乳過氧物酶、微過氧化酶及其類似物。用於將酶結合至抗體之技術描述於O'Sullivan等人 (1981) 「Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay」,Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis編), Academic Press, New York, 73:147-166中。酶-受質組合之實例包括例如：(i)山葵過氧化酶(HRP)與作為受質之過氧化氫酶，其中過氧化氫酶氧化染料前驅物(例如，鄰苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基聯苯胺鹽酸鹽(TMB))；(ii)鹼性磷酸酶(AP)與作為顯色受質之對硝基苯基磷酸鹽；以及(iii)b-D-半乳糖苷酶(b-D-Gal)與顯色受質(例如，對硝基苯基-b-D-半乳糖苷酶)或螢光受質4-甲基傘形酮-b-D-半乳糖苷酶。熟習此項技術者可利用許多其他酶-受質組合。關於一般綜述，參見US 4275149及US 4318980。

標記可與胺基酸側鏈、活化的胺基酸側鏈、半胱胺酸工程抗體及其類似物間接結合。例如，抗體可與生物素結合並且以上提及之三大類標記中之任一者可與抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素結合，或反之亦然。生物素選擇性地結合至鏈黴抗生物素且由此，標記可以此間接方式與抗體結合。替代地，為了達成標記與多肽變異體之間接結合，多肽變異體與小型半抗原(例如地高辛)結合並且以上提及之不同類型標記中之一者與抗半抗原多肽變異體(例如，抗地高辛抗體)結合。因此，可達成標記與多肽變異體之間接結合(Hermanson, G. (1996) in Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego)。

偵測標記可適用於定位、目測及定量結合或識別事件。本發明之經標記之抗體可偵測細胞-表面受體。可偵測標記之抗體的另一用途係基於珠粒之免疫捕獲方法，包含將珠粒與螢光標記抗體結合及在配位子結合之後偵測螢光信號。相似的結合偵測方法利用表面電漿子共振(SPR)作用來量測並偵測抗體-抗原相互作用。

偵測標記諸如螢光染料及化學發光染料(Briggs等人 (1997) 「Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids,」 J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1:1051-1058)提供可偵測之信號且通常適用於較佳具有下列性質之標記抗體：(i) 標記抗體將在低背景下產生極高信號以便可在無細胞及基於細胞之檢定中靈敏地偵測出少量抗體；及(ii) 標記抗體將為光安定的以便可在無顯著光致漂白下觀察、監測並記錄螢光信號。對於涉及標記抗體與膜或細胞表面(特別是活細胞)之細胞表面結合的應用，標記較佳(iii)具有良好的水溶性以實現有效結合物濃度及偵測靈敏度，以及(iv)對活細胞無毒，以便不破壞細胞之正常代謝過程或引起過早的細胞死亡。

細胞螢光強度之直接定量及螢光標記事件之列舉，例如肽-染料結合物之細胞表面結合，可在自動化mix-and-read、採用活細胞或珠粒之非放射性檢定(Miraglia, 「Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology」, (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204)的系統(FMAT® 8100 HTS System，Applied Biosystems, Foster City, Calif.)上進行。標記抗體之用途亦包括細胞表面受體結合檢定、免疫捕獲檢定、螢光連接之免疫吸附檢定(FLISA)、凋亡蛋白酶裂解(Zheng, 「Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo」, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23；US 6,372,907)、凋亡(Vermes, 「A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V」 (1995) J. Immunol. Methods 184:39-51)以及細胞毒性檢定。螢光微量檢定技術可用於識別藉由靶向細胞表面之分子的上調或下調(Swartzman, 「A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology」, (1999) Anal. Biochem. 271:143-51)。

本揭示之經標記之抗PD-L1抗體可適用作諸如以下各種生物及分子成像方法及技術的成像生物標誌物及探針：(i) MRI(磁共振成像)；(ii) MicroCT(電腦斷層掃描術)；(iii) SPECT(單光子發射電腦斷層掃描術)；(iv) PET(正電子發射斷層掃描術)Chen等人 (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49；(v)生物發光；(vi)螢光；以及(vii)超聲。免疫閃爍掃描為一種成像程序，其中向動物或人患者投與用放射性物質標記之抗體並且在抗體定位之體內的部位處拍攝照片(US 6528624)。可客觀地量測成像生物標誌物並且評價作為正常生物過程、病理過程或對治療干預之藥理學反應的指標。生物標誌物可具有若干類型：0型為疾病之自然病史標誌物並且縱向地與已知臨床指數相關，例如，在類風濕性關節炎中的滑液炎症之MRI評估；I型標誌物根據作用機制捕獲干預作用，儘管該機制可與臨床結果不相關；II型標誌物用作替代終點，其中生物標誌物之變化或來自生物標誌物之信號預測「驗證」標靶反應之臨床益處，諸如在類風濕性關節炎中藉由CT量測骨侵蝕。成像生物標誌物因此可提供關於以下之藥效學(PD)治療資訊：(i)標靶蛋白之表現；(ii)治療劑與標靶蛋白之結合，亦即選擇性；以及(iii)清除率及半衰期藥物動力學資料。活體內成像生物標誌物相對於基於實驗室之生物標誌物的優勢包括：非侵入式治療、可量化、全身評估、重複給藥及評估(亦即多個時點)、以及自臨床前(小動物)至臨床(人)結果之潛在可轉移作用。對於一些應用，生物成像代替或使臨床前研究中之動物實驗數量最小化。
生物樣品

在某些實施例中，生物樣品為生物流體，諸如全血或全血組分，包括紅血球、白血球、血小板、血清及血漿、腹水、玻璃狀液、淋巴液、滑液、卵泡液、精液、羊水、乳汁、唾液、痰液、淚、汗、黏液、腦脊液、尿及身體之其他成分。在某些實施例中，生物樣品為末梢血液樣品。在某些實施例中，生物樣品為骨髓樣品。在某些實施例中，生物樣品為癌症樣品。在某些實施例中，生物樣品為腫瘤生檢物。在各種實施例中，樣品為來自任何動物之身體樣品。在各種實施例中，樣品為來自人之樣品。在某些實施例中，樣品包含活細胞。在某些實施例中，樣品包含免疫細胞。在某些實施例中，樣品包含腫瘤細胞。

因此，本揭示之某些態樣係關於用於偵測由受檢者獲得之生物樣品中的PD-L1之方法，其包括以下步驟：使該生物樣品與如本文所述之抗體或抗原結合片段接觸及偵測該生物樣品中的抗體或抗原結合片段與PD-L1之結合，由此偵測生物樣品中之PD-L1。在一些實施例中，使用以下方法偵測抗體或抗原結合片段：流動式細胞測量術、免疫檢定(例如基於ELISA之檢定及親近延伸檢定)、西方墨點、肽微陣列、免疫組織化學及/或質譜法。在某些實施例中，使用流動式細胞測量術偵測抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，生物樣品為血液樣品。在一些實施例中，生物樣品為骨髓樣品。在一些實施例中，生物樣品為細胞或組織。在一些實施例中，細胞或組織為癌細胞或癌組織。在一些實施例中，生物樣品包含活細胞。在一些實施例中，受檢者患有癌症。在一些實施例中，癌症為表現PD-L1之癌症。在一些實施例中，癌症為多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群及/或急性骨髓性白血病。在一些實施例中，生物樣品係由已投與本揭示之治療性抗PD-L1抗體或其抗原結合片段之受檢者獲得。在一些實施例中，治療性抗PD-L1抗體包含：含有阿特珠單抗之三個HVR(HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3)胺基酸序列的重鏈可變區及含有阿特珠單抗之三個HVR(HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3)胺基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，治療性抗PD-L1抗體包含阿特珠單抗之重鏈可變區胺基酸序列及阿特珠單抗之輕鏈可變區胺基酸序列。在一些實施例中，治療性抗PD-L1抗體包含阿特珠單抗之重鏈胺基酸序列及阿特珠單抗之輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中，治療性抗PD-L1抗體為阿特珠單抗。在一些實施例中，受檢者為人類。
預測 / 監測 / 評估反應性

在某些實施例中，本揭示之方法係關於藉由以下步驟監測受檢者中之癌症治療的方法：使第一生物樣品與本揭示之抗PD-L1抗體或抗原結合片段接觸；偵測該抗體或抗原結合片段與該第一生物樣品中之PD-L1的結合；測定存在於該第一生物樣品中的PD-L1之量；使第二生物樣品與本揭示之抗PD-L1抗體或抗原結合片段接觸，其中在用治療性抗PD-L1抗體或其抗原結合片段(例如阿特珠單抗)治療之後獲得該第二生物樣品；偵測該抗體或抗原結合片段與該第二生物樣品中之PD-L1的結合；測定存在於該第二生物樣品中的PD-L1之量；測定存在於該第二生物樣品中的PD-L1之量；以及比較存在於該第一生物樣品中的PD-L1之量與存在於該第二生物樣品中的PD-L1之量。

在一些實施例中，與第一生物樣品相比存在於第二生物樣品中的PD-L1之量的增加表明受檢者對治療性抗PD-L1抗體之治療無反應。在一些實施例中，與第一生物樣品相比存在於第二生物樣品中的PD-L1之量的至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5% 、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%增加表明受檢者對治療性抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗)無反應。

在一些實施例中，與第一生物樣品相比存在於第二生物樣品中的PD-L1之量的減少表明受檢者對治療性抗PD-L1抗體之治療有反應。在一些實施例中，與第一生物樣品相比存在於第二生物樣品中的PD-L1之量的至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%減少表明受檢者對治療性抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗)之治療有反應。

在一些實施例中，在用治療性抗PD-L1抗體或其抗原結合片段治療之前由該受檢者獲得第一生物樣品。在一些實施例中，在用治療性抗PD-L1抗體或其抗原結合片段治療之後由該受檢者獲得第一生物樣品。在一些實施例中，第一及第二生物樣品為血液樣品。在一些實施例中，第一及第二生物樣品為骨髓樣品。在一些實施例中，第一及第二生物樣品為細胞或組織。在一些實施例中，細胞或組織為癌細胞或癌組織。在一些實施例中，第一及第二生物樣品包含活細胞。在一些實施例中，受檢者患有的癌症為多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群及/或急性骨髓性白血病。在一些實施例中，受檢者患有癌症。在一些實施例中，癌症為表現PD-L1之癌症。在一些實施例中，癌症為多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群及/或急性骨髓性白血病。在一些實施例中，生物樣品係由已投與本揭示之治療性抗PD-L1抗體或其抗原結合片段之受檢者獲得。在一些實施例中，治療性抗PD-L1抗體包含：含有阿特珠單抗之三個HVR(HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3)胺基酸序列的重鏈可變區及含有阿特珠單抗之三個HVR(HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3)胺基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，治療性抗PD-L1抗體包含阿特珠單抗之重鏈可變區胺基酸序列及阿特珠單抗之輕鏈可變區胺基酸序列。在一些實施例中，治療性抗PD-L1抗體包含阿特珠單抗之重鏈胺基酸序列及阿特珠單抗之輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中，治療性抗PD-L1抗體為阿特珠單抗。在一些實施例中，使用以下方法偵測抗體或抗原結合片段：流動式細胞測量術、免疫檢定(例如基於ELISA之檢定及親近延伸檢定)、西方墨點、肽微陣列、免疫組織化學及/或質譜法。在某些實施例中，使用流動式細胞測量術偵測該抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，受檢者為人類。

在某些實施例中，本揭示之方法係關於用於評估、監測或預測患有癌症(例如，表現PD-L1之癌症)之受檢者對治療性抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗)治療之反應性的方法。在一些實施例中，該方法包含在第一時點量測或偵測由受檢者獲得之樣品中的PD-L1之表現水準及在第二時點量測或偵測由受檢者獲得之樣品中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係在投與治療性抗PD-L1抗體之後。在一些實施例中，受檢者未曾接受過治療性抗PD-L1抗體。在一些實施例中，受檢者正經歷治療性抗PD-L1抗體之治療。

在一些實施例中，該方法包含在第一時點量測或偵測由受檢者獲得之樣品中的PD-L1之表現水準；向受檢者投與治療有效量之治療性抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗)；以及在第二時點量測或偵測由受檢者獲得之樣品中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第一時點係在向受檢者投與治療性抗PD-L1抗體之前。在一些實施例中，第二時點係在投與治療性抗PD-L1抗體之後。在一些實施例中，受檢者未曾接受過治療性抗PD-L1抗體。在一些實施例中，受檢者正經歷治療性抗PD-L1抗體之治療。

在一些實施例中，該方法包含基於與第一時點相比在第二時點下由受檢者獲得之樣品中的PD-L1之表現水準將受檢者分為對治療性抗PD-L1抗體之治療有反應或無反應，其中在第二時點下PD-L1表現水準之減少表明受檢者對或可對治療性抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗)之治療有反應。

在一些實施例中，自第一時點至第二時點在PD-L1之表現水準上小於25%、小於20%、小於15%、小於10%、小於9%、小於8%、小於7%、小於6%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%、小於1%之下降、無下降，或大於1%、大於2%、大於3%、大於4%、大於5% 、大於10%、大於5%、大於20%、大於25%、大於30%、大於35%、大於40%、大於45%、大於50%、大於55%、大於60%、大於65%、大於70%、大於75%、大於80%、大於85%、大於90%、大於95%或大於100%之升高表明受檢者對治療性抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗)無反應。在一些實施例中，自第一時點至第二時點在PD-L1之表現水準上無下降表明受檢者對治療性抗PD-L1抗體無反應。在一些實施例中，自第一時點至第二時點在PD-L1之表現水準上的升高表明受檢者對治療性抗PD-L1抗體無反應。

在一些實施例中，自第一時點至第二時點在PD-L1之表現水準上至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之下降表明受檢者對治療性抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗)有反應。

在一些實施例中，反應性可指的是治療功效。熟習此項技術者應理解，治療功效之許多量度及其組合可為有用的。在一些實施例中，治療功效可包括腫瘤反應(例如，腫瘤尺寸、生長或組織學分期之穩定化或減小)。在一些實施例中，治療功效可包括延長之存活(例如，1年、5年、無病或總體)、提高的生活品質、增加的進展時間或降低的發病率。此類因素可例如藉由使用統計工具諸如邏輯式迴歸、Cox 比例風險迴歸或Kaplan-Meier 估計來評估。
繼續 / 中止 / 調整治療

如本文所揭示，在投與治療性抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗)之後來自受檢者之樣品中的PD-L1之表現水準的量測可用於指導後續治療，例如繼續治療性抗PD-L1抗體治療、中止治療性抗PD-L1抗體治療或調整治療性抗PD-L1抗體治療。因此，在某些實施例中，本揭示之方法係關於用於調整患有癌症(例如，表現PD-L1之癌症)之受檢者中的治療性抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗)之治療的方法。在一些實施例中，該方法包含在第一時點量測或偵測由受檢者獲得之樣品中的PD-L1之表現水準；向受檢者投與治療有效量之治療性抗PD-L1抗體；在第二時點量測或偵測由受檢者獲得之樣品中的PD-L1之表現水準；以及基於第一時點與第二時點之間的PD-L1表現水準之變化來調整向受檢者投與之治療性抗PD-L1抗體之量。在一些實施例中，第一時點係在向受檢者投與治療性抗PD-L1抗體之前。在一些實施例中，第二時點係在投與治療性抗PD-L1抗體之後。

在一些實施例中，調整向受檢者投與之治療性抗PD-L1抗體之量包含將向受檢者投與之治療性抗PD-L1抗體維持在相同水準。

在一些實施例中，調整向受檢者投與之治療性抗PD-L1抗體之量包含提高向受檢者投與之治療性抗PD-L1抗體之水準。提高向受檢者投與之治療性抗PD-L1抗體之水準可係指但不限於以下一或多者：提高向受檢者投與之治療性抗PD-L1抗體之量、劑量、劑量之數量或頻率、或濃度。

在一些實施例中，調整向受檢者投與之治療性抗PD-L1抗體之量包含降低向受檢者投與之治療性抗PD-L1抗體之水準。降低向受檢者投與之治療性抗PD-L1抗體之水準可係指但不限於以下一或多者：降低向受檢者投與之治療性抗PD-L1抗體之量、劑量、劑量之數量或頻率、或濃度。
預測癌症進展

在某些實施例中，本揭示之方法係關於用於評估患有癌症(例如，表現PD-L1之癌症)之受檢者中之無進展存活的方法。在一些實施例中，該方法包含在第一時點量測或偵測由受檢者獲得之樣品中的PD-L1之表現水準；向受檢者投與治療有效量之治療性抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗)；以及在第二時點量測或偵測由受檢者獲得之樣品中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第一時點係在向受檢者投與治療性抗PD-L1抗體之前。在一些實施例中，第二時點係在投與治療性抗PD-L1抗體之後。

在一些實施例中，自第一時點至第二時點在PD-L1表現水準上至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之下降表明治療性抗PD-L1抗體延長無進展存活。

本文亦提供用於預測患有表達PD-L1之癌症的受檢者中之癌症進展的方法。在一些實施例中，該方法包含在第一時點量測或偵測由受檢者獲得之樣品中的PD-L1之表現水準；向受檢者投與治療有效量之治療性抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗)；以及在第二時點量測或偵測由受檢者獲得之樣品中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第一時點係在向受檢者投與治療性抗PD-L1抗體之前。在一些實施例中，第二時點係在投與治療性抗PD-L1抗體之後。

在一些實施例中，自第一時點至第二時點在PD-L1表現水準上小於25%、小於20%、小於15%、小於10%、小於9%、小於8%、小於7%、小於6%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%、小於1%之降低、無降低，或大於1%、大於2%、大於3%、大於4%、大於5%、大於10%、大於5%、大於20%、大於25%、大於30%、大於35%、大於40%、大於45%、大於50%、大於55%、大於60%、大於65%、大於70%、大於75%、大於80%、大於85%、大於90%、大於95%或大於100%之提高表明受檢者患有可能進展之癌症。
時點量測

在本揭示之方法中，比較患有癌症(例如表現PD-L1之癌症)之受檢者中介於第一時點(例如基線)與第二時點之間的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，受檢者患有表現PD-L1之癌症。

在一些實施例中，第一時點係用於偵測在治療性抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗)治療之前受檢者中的PD-L1之表現水準。例如，可在治療性抗PD-L1抗體治療之前量測受檢者中的PD-L1之表現水準，並且在治療性抗PD-L1抗體治療之後採集的一或多個樣品可尤其用於監測治療功效、確定是否繼續或中止治療、調整治療、監測對治療之反應性、預測對維持治療之反應性、預測癌症進展，諸如此類。

在一些實施例中，第一時點係用於量測或偵測在以下時間下受檢者中的PD-L1之表現水準：在治療性抗PD-L1抗體治療之前緊接著、或之前約10秒前、之前約30秒、之前約1分鐘、之前約5分鐘、之前約10分鐘、之前約15分鐘、之前約30分鐘、之前約45分鐘、之前約1小時、之前約1.5小時、之前約2小時、之前約2.5小時、之前約3小時、之前約3.5小時、之前約4小時、之前約4.5小時、之前約5小時、之前約5.5小時、之前約6小時、之前約7小時、之前約8小時、之前約9小時、之前約10小時、之前約11小時、之前約12小時、之前約18小時、之前約1天、之前約2天、之前約3天、之前約4天、之前約5天、之前約6天、之前約1週、之前約2週、之前約3週或約4週。在一些實施例中，第一時點係用於量測或偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之前約1小時受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第一時點係用於量測或偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之前約4小時受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第一時點係用於量測或偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之前約1天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第一時點係用於量測或偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之前約3天受檢者中的PD-L1之表現水準。在特定實施例中，用於治療中之治療性抗PD-L1抗體為阿特珠單抗。

在一些實施例中，第一時點係用於量測或偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之前受檢者中的PD-L1之表現水準，並且可與在第二時點下的PD-L1之表現水準相比。在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之後受檢者中的PD-L1之表現水準(例如，第一時點可在治療有效量之治療性抗PD-L1抗體的初始劑量之前採集並且與在第二時點下、在治療性抗PD-L1抗體之第一、第二、第三、第四或稍後劑量之後採集的樣品相比)。在一些實施例中，第二時點係用於偵測在以下時間下受檢者中的PD-L1之表現水準：治療性抗PD-L1抗體治療之後約1小時、之後約2小時、之後約3小時、之後約4小時、之後約5小時、之後約6小時、之後約7小時、之後約8小時、之後約9小時、之後約10小時、之後約11小時、之後約12小時、之後約18小時、之後約1天、之後約1.5天、之後約2天、之後約2.5天、之後約3天、之後約3.5天、之後約4天、之後約4.5天、之後約5天、之後約5.5天、之後約6天、之後約6.5天、之後約1週、之後約1.5週、之後約2週、之後約2.5週、之後約3週、之後約3.5週、之後約4週、之後約1個月、之後約1.5個月、之後約2個月、之後約2.5個月、之後約3個月、之後約3.5個月、之後約4個月、之後約4.5個月、之後約5個月、之後約5.5個月、之後約6個月、之後約6.5個月、之後約7個月、之後約7.5個月、之後約8個月、之後約8.5個月、之後約9個月、之後約9.5個月、之後約10個月、之後約10.5個月、之後約11個月、之後約11.5個月或之後約12個月。在一些實施例中，第二時點係用於偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之後約1小時受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之後約4小時受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之後約8小時受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之後約12小時受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之後約18小時受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之後約1天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之後約1.5天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之後約2天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之後約2.5天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之後約3天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之後約3.5天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之後約4天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之後約4.5天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於偵測在治療性抗PD-L1抗體治療之後約5天受檢者中的PD-L1之表現水準。在特定實施例中，用於治療中之治療性抗PD-L1抗體為阿特珠單抗。

在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在治療性抗PD-L1抗體之任何稍後或後續治療之後受檢者中的PD-L1之表現水準(例如，第一時點可在治療性抗PD-L1抗體之第一劑量之後採集並且與在治療性抗PD-L1抗體之第二或第三劑量之後採集的樣品相比)。在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在以下時間下受檢者中的PD-L1之表現水準：在任何稍後或後續治療性抗PD-L1抗體治療之後約1小時、之後約2小時、之後約3小時、之後約4小時、之後約5小時、之後約6小時、之後約7小時、之後約8小時、之後約9小時、之後約10小時、之後約11小時、之後約12小時、之後約18小時、之後約1天、之後約1.5天、之後約2天、之後約2.5天、之後約3天、之後約3.5天、之後約4天、之後約4.5天、之後約5天、之後約5.5天、之後約6天、之後約6.5天、之後約1週、之後約1.5週、之後約2週、之後約2.5週、之後約3週、之後約3.5週、之後約4週、之後約1個月、之後約1.5個月、之後約2個月、之後約2.5個月、之後約3個月、之後約3.5個月、之後約4個月、之後約4.5個月、之後約5個月、之後約5.5個月、之後約6個月、之後約6.5個月、之後約7個月、之後約7.5個月、之後約8個月、之後約8.5個月、之後約9個月、之後約9.5個月、之後約10個月、之後約10.5個月、之後約11個月、之後約11.5個月或之後約12個月。在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在任何稍後或後續治療性抗PD-L1抗體治療之後約1小時受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在任何稍後或後續治療性抗PD-L1抗體治療之後約4小時受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在任何稍後或後續治療性抗PD-L1抗體治療之後約8小時受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在任何稍後或後續治療性抗PD-L1抗體治療之後約12小時受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在任何稍後或後續治療性抗PD-L1抗體治療之後約18小時受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在任何稍後或後續治療性抗PD-L1抗體治療之後約1天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在任何稍後或後續治療性抗PD-L1抗體治療之後約1.5天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在任何稍後或後續治療性抗PD-L1抗體治療之後約2天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在任何稍後或後續治療性抗PD-L1抗體治療之後約2.5天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在任何稍後或後續治療性抗PD-L1抗體治療之後約3天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在任何稍後或後續治療性抗PD-L1抗體治療之後約3.5天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在任何稍後或後續治療性抗PD-L1抗體治療之後約4天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在任何稍後或後續治療性抗PD-L1抗體治療之後約4.5天受檢者中的PD-L1之表現水準。在一些實施例中，第二時點係用於量測或偵測在任何稍後或後續治療性抗PD-L1抗體治療之後約5天受檢者中的PD-L1之表現水準。在特定實施例中，用於治療中之治療性抗PD-L1抗體為阿特珠單抗。

在某些實施例中，第一時點與第二時點之間的PD-L1表現水準之變化係用於評估響應於治療性抗PD-L1抗體療法之疾病之進展。在某些實施例中，第一時點與第二時點之間的PD-L1表現水準之變化係用於評估響應於治療性抗PD-L1抗體療法之疾病穩定性。在某些實施例中，第一時點與第二時點之間的PD-L1表現水準之變化係用於確定治療性抗PD-L1抗體療法之持續劑量。在某些實施例中，第一時點與第二時點之間的PD-L1表現水準之變化係用於確定治療性抗PD-L1抗體療法之過程(例如，繼續給藥、中止給藥、與第二或第三化療劑組合之給藥、增加給藥、減少給藥、維持給藥等)。在特定實施例中，用於治療中之治療性抗PD-L1抗體為阿特珠單抗。

基線之另外實施例如下：在某些實施例中，基線係指在用治療性抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗)治療之前取自受檢者之樣品；在特定實施例中，用於治療中之治療性抗PD-L1抗體為阿特珠單抗；在特定實施例中，基線為在用治療性抗PD-L1抗體之任何治療之前採集至樣品並且可用於與在用治療性抗PD-L1抗體治療之後採集之樣品比較(例如，基線可在治療性抗PD-L1抗體之第一劑量之前採集並且與治療性抗PD-L1抗體之第一、第二、第三、第四或稍後劑量之後採集的樣品相比)；並且在特定實施例中，基線為在用治療性抗PD-L1抗體之任何給定治療之前採集的樣品並且可用於與在用治療性抗PD-L1抗體之任何稍後治療之後採集的樣品比較(例如，基線可在治療性抗PD-L1抗體之第一劑量之後採集並且與治療性抗PD-L1抗體之第二或第三劑量之後採集的樣品相比)。
V. 套組

本發明之檢定方法可以套組形式提供。在一實施例中，此類套組包含抗PD-L1抗體或含有如本文所述之抗PD-L1抗體之組合物。在一些實施例中，此類套組為包括以下基本要素之套裝組合：抗PD-L1抗體及關於如何使用此等試劑實施鑒定方法之說明書。此等基本要素在上文中定義。

該套組可進一步包含用於抗PD-L1抗體之固相支撐體，其可作為單獨要素提供或者抗PD-L1抗體已固定於其上。

該套組亦可含有其他添加劑，諸如穩定劑、洗滌與培育緩衝劑及其類似物。

套組之組分可以預定比率提供，其中各種試劑之相對量適當地變化以提供試劑在溶液中之濃度，該等濃度實質上使檢定之靈敏度最大化。具體而言，試劑可以乾燥粉末形式提供，通常為凍乾的，包括賦形劑，其一旦溶解便將提供具有適當濃度之試劑溶液以便與有待測試之樣品組合。
實例

以下實例僅用於說明性目的並且不旨在限制本發明之範疇。
實例 1 ：評估抗 PD-L1 抗體純系 14D3 之特徵

純系14D3為單株抗PD-L1抗體之特異性非競爭純系，稱為阿特珠單抗。14D3為具有IgG1同型及κ輕鏈之小鼠抗體。用於生成14D3之免疫原為MOLM-1巨核細胞細胞株並且與人類PD-L1以及獼猴PD-L1有交叉反應性。針對市售之抗人類PD-L1抗體評估抗體14D3(亦即抗人類PD-L1抗體)之競爭與非競爭特徵。
方法
抗體

將兩種市售抗人PD-L1抗體之PD-L1結合特徵與抗PDL-1 14D3抗體之PD-L1結合特徵相比。將兩種形式之14D3抗體用於比較研究中，一種形式用藻紅素(PE)標記，在本文中稱為抗PD-L1 PE 14D3，且另一種形式用Alexa Fluor 647® (AF647)標記，在本文中稱為抗PD-L1 AF647 14D3。商用抗體為用PE(Biolegend)標記之抗PD-L1抗體純系29E.23，在本文中稱為抗PD-L1 PE 29E.23；及用別藻藍蛋白(APC)(Biolegend)標記之抗PD-L1抗體純系29E.23，在本文中稱為抗PD-L1 APC 29E.23。
血液刺激

約4 mL至5 mL之全血係由健康人受檢者獲得並且置於含有肝素鈉作為抗凝劑之真空采血管中。準備兩個15 mL錐形管並且標記如下：1)無刺激之血液；及2)有刺激之血液。用3 mL健康血液填充各管。根據Miltenyi Biotec，推薦每mL全血使用20 uL。因此，將60 µl磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)添加至管1(亦即非刺激管)中，並且將60 µl CytoStim® (Miltenyi Biotec)添加至含有3 mL全血之管2中。將管上之帽鬆弛地固定以便容許氧氣與CO₂ 流入並流出該等管。將該等管置於37℃下之CO₂ 培養箱中24小時。
用阿特珠單抗阻斷

準備5個5 mL圓底試管之四個組並且分組如下：1)刺激且無藥物；2)刺激+藥物；3)無刺激且無藥物；及4)無刺激+藥物。在刺激步驟期間培育血液樣品24小時後，將100 µL經刺激之血液添加至組1與組2之各試管中，而將100 µL未經刺激之血液添加至組3與組4之各試管中。

阿特珠單抗充當用於檢定之阻斷部分的藥物。關於藥物之製備，將2 µL阿特珠單抗以100 µg/mL之濃度添加至18 µL PBS中以用於1:10稀釋。對於標記為「+藥物」(亦即組2與組4)之試管，將1.6 µl經稀釋之阿特珠單抗添加至各試管中。標記為「無藥物」(亦即組1與組3)之試管接受1.6 µL PBS。將試管藉由渦旋充分混合，且隨後在室溫下，在黑暗中培育30分鐘。
表面標誌物染色

製備五種表面標誌物雞尾酒(表2)。
表2. 表面標誌物雞尾酒

在與藥物(亦即阿特珠單抗)或PBS一起培育之後，將表面標誌物之雞尾酒添加至含有血液之各試管中，有或無抗PD-L1且有或無刺激(表2)。在添加所示量之雞尾酒之後，添加所示量之PBS以使總雞尾酒體積達到100 µL(表3)。隨後在黑暗中，在室溫下將試管培育30分鐘。
表 3. 四個測試組之表面染色
用於活細胞或死細胞之染色

使Live Dead Kit(Invitrogen)達到室溫。該套組包括近IR螢光反應性染料及DMSO。藉由在90 mL蒸餾水中混合10 mL 10X Pharm Lyse (BD Biosciences)來製備1X Pharm Lyse。在試管中表面染色細胞之後，將該等管渦旋並且將3 mL 1X Pharm Lyse添加至各試管中。將試管再次渦旋以增強在Pharm Lyse存在下細胞之裂解。隨後在黑暗中，在室溫下將試管培育15分鐘。培育之後，將試管在300 RCF / 1500至1600 RPM下離心5分鐘。離心之後，在不妨礙細胞沉澱之情況下盡可能地抽吸上清液。隨後輕彈各試管之底部以分散細胞沉澱，之後將細胞在3 mL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中洗滌。將試管再次在300 RCF / 1500至1600 RPM下離心5分鐘。接著，如前所述在不妨礙細胞沉澱之情況下抽吸上清液。輕彈各試管之底部以分散細胞沉澱並且將1 mL PBS添加至各試管中。選擇試管以使用BioRad TC20細胞計數器進行細胞計數。若該管中之細胞計數每mL PBS超過2百萬活細胞，則將濃度調節至每mL 1百萬活細胞且相應地使用PBS稀釋。藉由將50 µL DMSO添加至近IR螢光反應性染料管中繼之混合來製備來自套組之Live/Dead染料。將1 µL之量的Live-Dead染料添加至各試管中並充分混合。在黑暗中，在室溫下將試管培育30分鐘。培育之後，將細胞在2mL BD Pharmigen FBS中洗滌，繼之在300 RCF / 1500至1600 RPM下離心5分鐘。在不妨礙細胞沉澱之情況下盡可能地抽吸上清液。藉由將3 mL之16%聚甲醛添加至45 mL PBS中來製備1%聚甲醛溶液。輕彈各試管之底部以分散細胞沉澱並且將250 µL 1%聚甲醛添加至各試管中，之後渦旋該等試管。在完成製備4小時內在BD FACSCanto^TM II (BD Biosciences)上由試管樣品獲取信號。

創建補償對照(表4)。為了創建補償對照，生成含有以下各物之9個5 mL圓底管：1) 對照管-無染色；2) AF488/FITC；3) PE；4) PerCP；5) PE-Cy7；6) AF647/APC；7) BV421；8) BV510；以及9) APC-H7。將一滴UltraComp eBeads (Invitrogen)添加至各管中。以所示體積添加所示抗體(表3)。在黑暗中，在室溫下將補償對照培育15-20分鐘。隨後將該等管在3 mL BD FBS中洗滌，繼之在300 RCF/ 1500至1600 RPM下離心5分鐘。在不妨礙珠粒沉澱之情況下盡可能地抽吸上清液。將100 µL之量的BD FBS添加至各補償對照管中以準備在BD FACSCanto^TM II上獲取。
表 4. 用於各表面標誌物雞尾酒之補償對照
結果

觀察到，當存在阿特珠單抗時，PD-L1表面表達偵測水準在用商用抗PD-L1 PE 29E.23抗體染色之細胞中有所降低。特定而言，藉由流動式細胞測量術之結合分析確定商用抗PD-L1 PE 29E.23抗體與阿特珠單抗競爭結合至在來自健康予體之經刺激之血液中由CD4+ T細胞(圖2A與圖3A)、CD8+ T細胞(圖4A與圖5A)及CD19 B細胞(圖6A與圖7A)表現之PD-L1。在CD4+ T細胞(圖8A與圖9A)、CD8+ T細胞(圖10A與圖11A)及CD19 B細胞(圖12A與圖13A)中利用商用抗PD-L1 APC 29E.23抗體之檢定中觀察到相似的結合結果。

相反，抗PD-L1 PE 14D3抗體不與阿特珠單抗競爭結合至在來自健康予體之經刺激之血液中由CD4+ T細胞(圖2B與圖3B)、CD8+ T細胞(圖4B與圖5B)及CD19 B細胞(圖6B與圖7B)表現之PD-L1。此等結果亦擴展至在CD4+ T細胞(圖8B與圖9B)、CD8+ T細胞(圖10B與圖11B)及CD19 B細胞(圖12B與圖13B)中用AF647標記之抗PD-L1 14D3抗體(亦即，抗PD-L1 AF647 14D3抗體)。

當與未經刺激之健康血液中之結合相比時，在經刺激之健康血液中觀察到在阿特珠單抗存在下用PE(圖14)或AF647(圖15)標記之抗PD-L1 14D3抗體結合CD4+ T細胞、CD8+ T細胞及CD19 B細胞上之PD-L1的能力。當與未經刺激之健康血液中之結合相比時，在經刺激之健康血液中可見用APC(圖16)標記之抗PD-L1 29E.23抗體與阿特珠單抗競爭結合至CD4+ T細胞、CD8+ T細胞及CD19 B細胞上之PD-L1。
結論

此等結果顯示14D3抗體不與阿特珠單抗競爭，甚至在預期為阿特珠單抗之飽和濃度的水準下亦如此。已確定，可在偵測檢定中使用經標記之14D3抗體，諸如藉由流動式細胞測量檢定，甚至在阿特珠單抗存在下定量免疫及腫瘤細胞(例如，活免疫及腫瘤細胞)表面上之PD-L1表現。然而，其他市售抗體(諸如PD-L1純系29E.23)與阿特珠單抗競爭，由此防止其用作定量PD-L1在免疫及腫瘤細胞中之表現的最佳試劑。
實例 2 ：使用抗 PD-L1 14D3 抗體評估在多發性骨髓瘤中之 PD-L1 表現

關於14D3偵測患有血液學惡性腫瘤(特別是多發性骨髓瘤)之患者中的PD-L1表現之能力對其進行評估。
方法

新鮮骨髓及新鮮全血係由患有多發性骨髓瘤(MM)之患者處收集。樣品係由健康受檢者處收集。將骨髓及全血肝素化並且如實例1中所述關於包括抗PD-L1 14D3抗體之表面標誌物進行染色。
結果

抗PD-L1 14D3抗體能夠偵測由患有多發性骨髓瘤且未用PD-1檢查點抑制劑治療之患者處收集的骨髓及全血中的PD-L1之存在(圖17)。
結論

14D3抗體可用於PD-L1之基線偵測中，該PD-L1係由來自循環末梢血液之免疫細胞以及由來自診斷患有血液學惡性腫瘤(諸如多發性骨髓瘤)之患者之血液及骨髓的惡性細胞表現。
實例 3 ：使用抗 PD-L1 14D3 抗體評估在急性骨髓性白血病及骨髓發育不良症候群中之 PD-L1 表現

評估14D3在偵測患有血液學惡性腫瘤(特別是急性骨髓性白血病(AML)或骨髓發育不良症候群(MDS))之患者中的PD-L1表現方面之能力。
方法

新鮮骨髓及新鮮全血係由患有急性骨髓性白血病(AML)或骨髓發育不良症候群(MDS)之患者處收集。樣品亦係由健康受檢者處收集。將骨髓及全血肝素化並且如實例1中所述關於包括抗PD-L1 14D3抗體之表面標誌物進行染色。
實例 4 ：評估患有血液學惡性腫瘤並用阿特珠單抗治療之受檢者中的 PD-L1 表現

由於14D3抗體與阿特珠單抗之表位係非競爭的，所以評估14D3抗體關於其偵測在給予阿特珠單抗之患者中的PD-L1表現之能力以便監測治療性治療之有效性。
方法

關於骨髓與血液樣品中的PD-L1之基線表現來評估患有包括以下之血液學惡性腫瘤之患者：多發性骨髓瘤(MM)、急性骨髓性白血病(AML)或骨髓發育不良症候群(MSD)。如實例2中所述收集並處理樣品。藉由用連接至可偵測之標記諸如PE上之抗PD-L1 14D3抗體染色來測定PD-L1表現。使樣品經受流動式細胞測量術以測定PD-L1在患者中之基線表現。將患者以適於治療血液學惡性腫瘤之給藥方案用阿特珠單抗治療。在用阿特珠單抗治療之後一或多個時點下收集血液及骨髓樣品。將樣品如上所述處理並用連接至可偵測之標記(例如PE)上的抗PD-L1 14D3抗體染色。由經治療之患者測定PD-L1在細胞(諸如活的免疫細胞及/或腫瘤細胞)中之表現，如藉由經由流動式細胞測量術偵測經標記之抗PD-L1 14D3抗體所測定。

圖 1A 及 1B 為針對最接近匹配之小鼠生殖系(圖1A中之SEQ ID NO:21及圖1B中之SEQ ID NO:22)的A) 14D3抗PD-L1 (SEQ ID NO:7)之重鏈可變區與B) 14D3抗PD-L1 (SEQ ID NO:8)之輕鏈可變區之間的序列比對之圖。

圖 2A 及 2B 為顯示在由健康人類予體獲得並在以下條件下染色之血液中的PD-L1+ CD4+ T細胞之中值螢光強度(MFI)的圖：A) 在用CytoStim® (Miltenyi Biotec)刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 PE 29E.23染色；或B) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 PE 14.D3染色。FMO表示螢光減去一陰性門控對照。

圖 3A 及 3B 為顯示在由健康人類予體獲得並在以下條件下染色之血液中的PD-L1+ CD4+ T細胞之百分比(%)的圖：A) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 PE 29E.23染色；或B) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 PE 14.D3染色。FMO表示螢光減去一陰性門控對照。

圖 4A 及 4B 為顯示在由健康人類予體獲得並在以下條件下染色之血液中的PD-L1+ CD8+ T細胞之中值螢光強度(MFI)的圖：A) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 PE 29E.23染色；或B) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 PE 14.D3染色。FMO表示螢光減去一陰性門控對照。

圖 5A 及 5B 為顯示在由健康人類予體獲得並在以下條件下染色之血液中的PD-L1+ CD8+ T細胞之百分比(%)的圖：A) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 PE 29E.23染色；或B) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 PE 14.D3染色。FMO表示螢光減去一陰性門控對照。

圖 6A 及 6B 為顯示在由健康人類予體獲得並在以下條件下染色之血液中的PD-L1+ CD19 B細胞之中值螢光強度(MFI)的圖：A) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 PE 29E.23染色；或B) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 PE 14.D3染色。FMO表示螢光減去一陰性門控對照。

圖 7A 及 7B 為顯示在由健康人類予體獲得並在以下條件下染色之血液中的PD-L1+ CD19 B細胞之百分比(%)的圖：A) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 PE 29E.23染色；或B) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 PE 14.D3染色。FMO表示螢光減去一陰性門控對照。

圖 8A 及 8B 為顯示在由人類健康予體獲得並在以下條件下染色之血液中的PD-L1+ CD4+ T細胞之中值螢光強度(MFI)的圖：A) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 APC 29E.23染色；或B) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 AF647 14.D3染色。FMO表示螢光減去一陰性門控對照。

圖 9A 及 9B 為顯示在由人類健康予體獲得並在以下條件下染色之血液中的PD-L1+ CD4+ T細胞之百分比(%)的圖：A) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 APC 29E.23染色；或B) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 AF647 14.D3染色。FMO表示螢光減去一陰性門控對照。

圖 10A 及 10B 為顯示在由人類健康予體獲得並在以下條件下染色之血液中的PD-L1+ CD8+ T細胞之中值螢光強度(MFI)的圖：A) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 APC 29E.23染色；或B) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 AF647 14.D3染色。FMO表示螢光減去一陰性門控對照。

圖 11A 及 11B 為顯示在由人類健康予體獲得並在以下條件下染色之血液中的PD-L1+ CD8+ T細胞之百分比(%)的圖：A) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 APC 29E.23染色；或B) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 AF647 14.D3染色。FMO表示螢光減去一陰性門控對照。

圖 12A 及 12B 為顯示在由人類健康予體獲得並在以下條件下染色之血液中的PD-L1+ CD19 B細胞之中值螢光強度(MFI)的圖：A) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 APC 29E.23染色；或B) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 AF647 14.D3染色。FMO表示螢光減去一陰性門控對照。

圖 13A 及 13B 為顯示在由人類健康予體獲得並在以下條件下染色之血液中的PD-L1+ CD19 B細胞之百分比(%)的圖：A) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 APC 29E.23染色；或B) 在用CytoStim®刺激之後，在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 AF647 14.D3染色。FMO表示螢光減去一陰性門控對照。

圖 14A-C 為顯示在由健康予體獲得並在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 PE 14.D3抗體染色之未經刺激及經刺激之血液中的A) CD4+ T細胞、B) CD8+ T細胞及C) CD19 B細胞之中值螢光強度(MFI)的圖。FMO表示螢光減去一陰性門控對照。Cytostim表示CytoStim®刺激劑。無Stim FMO：不存在抗PD-L1 PE 14.D3抗體；無Stim-藥物：存在抗PD-L1 PE 14.D3抗體；無Stim+藥物：存在抗PD-L1 PE 14.D3抗體及阿特珠單抗；Cytostim FMO：不存在抗PD-L1 PE 14.D3抗體；Cytostim-藥物：存在抗PD-L1 PE 14.D3抗體；以及Cytostim+藥物：存在抗PD-L1 PE 14.D3抗體及阿特珠單抗。

圖 15A-C 為顯示在由健康予體獲得並在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 AF647 14.D3抗體染色之未經刺激及經刺激之血液中的A) CD4+ T細胞、B) CD8+ T細胞及C) CD19 B細胞之中值螢光強度(MFI)的圖。FMO表示螢光減去一陰性門控對照。Cytostim表示CytoStim®刺激劑。無Stim FMO：不存在抗PD-L1 AF647 14.D3抗體；無Stim-藥物：存在抗PD-L1 AF647 14.D3抗體；無Stim+藥物：存在抗PD-L1 AF647 14.D3抗體及阿特珠單抗；Cytostim FMO：不存在抗PD-L1 AF647 14.D3抗體；Cytostim-藥物：存在抗PD-L1 AF647 14.D3抗體；以及Cytostim+藥物：存在抗PD-L1 AF647 14.D3抗體及阿特珠單抗。

圖 16A-C 為顯示在由健康予體獲得並在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)用抗PD-L1 APC 29E.23抗體染色之未經刺激及經刺激之健康血液中的A) CD4+ T細胞、B) CD8+ T細胞及C) CD19 B細胞之中值螢光強度(MFI)的圖。在阿特珠單抗不存在下(-藥物)或在阿特珠單抗存在下(+藥物)之D3抗體。FMO表示螢光減去一陰性門控對照。Cytostim表示CytoStim®刺激劑。無Stim FMO：不存在抗PD-L1 APC 29E.23抗體；無Stim-藥物：存在抗PD-L1 APC 29E.23抗體；無Stim+藥物：存在抗PD-L1 APC 29E.23抗體及阿特珠單抗；Cytostim FMO：不存在抗PD-L1 APC 29E.23抗體；Cytostim-藥物：存在抗PD-L1 APC 29E.23抗體；以及Cytostim+藥物：存在抗PD-L1 APC 29E.23抗體及阿特珠單抗。

圖 17 為顯示在用抗PDL-1 14D3抗體染色之肝素化骨髓及全血中的多發性骨髓瘤(MM)中如藉由流動式細胞測量術所量測之PD-L1之表現的圖。PC表示漿細胞。BM表示骨髓。特定的細胞群在括號中識別。空心符號表示同一患者。

Claims (47)

1. 一種經分離之抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含： (a) 重鏈可變區，其包含： (i) 包含胺基酸序列TSWMN (SEQ ID NO:1)之HVR-H1； (ii) 包含胺基酸序列RIYPRDGDTYYNGKFKD (SEQ ID NO:2)之HVR-H2；及 (iii) 包含胺基酸序列NPGGYYFDY (SEQ ID NO:3)之HVR-H3；以及 (b) 輕鏈可變區，其包含： (i) 包含胺基酸序列RASQDIHTYLN (SEQ ID NO:4)之HVR-L1； (ii) 包含胺基酸序列YTSRLHS (SEQ ID NO:5)之HVR-L2；及 (iii) 包含胺基酸序列QQVSSLPPWT (SEQ ID NO:6)之HVR-L3。
2. 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含：含有SEQ ID NO:7之胺基酸序列的重鏈可變區；及含有SEQ ID NO:8之胺基酸序列的輕鏈可變區。
3. 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含：含有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的重鏈；及含有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的輕鏈。
4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段不與參考抗體競爭結合至人PD-L1，其中該參考抗體包含： (a) 重鏈可變區，其包含： (i) 包含胺基酸序列GFTFSDSWIH (SEQ ID NO:11)之HVR-H1； (ii) 包含胺基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:12)之HVR-H2；及 (iii) 包含胺基酸序列RHWPGGFDY (SEQ ID NO:13)之HVR-H3；以及 (b) 輕鏈可變區，其包含： (i) 包含胺基酸序列RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:14)之HVR-L1； (ii) 包含胺基酸序列SASFLYS (SEQ ID NO:15)之HVR-L2；及 (iii) 包含胺基酸序列QQYLYHPAT (SEQ ID NO:16)之HVR-L3。
5. 如申請專利範圍第4項之抗體或抗原結合片段，其中該參考抗體包含：含有SEQ ID NO:17之胺基酸序列的重鏈可變區；及含有SEQ ID NO:18之胺基酸序列的輕鏈可變區。
6. 如申請專利範圍第5項之抗體或抗原結合片段，其中該參考抗體包含：含有SEQ ID NO:19之胺基酸序列的重鏈；及含有SEQ ID NO:20之胺基酸序列的輕鏈。
7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段連接至部分。
8. 如申請專利範圍第7項之抗體或抗原結合片段，其中該部分為可偵測之部分。
9. 如申請專利範圍第8項之抗體或抗原結合片段，其中該可偵測之部分為生物素、鏈黴抗生物素、發光試劑、酶、螢光團、染料、放射性標記、發色團、金屬離子、金顆粒、銀顆粒、磁粉、多肽或寡核苷酸。
10. 如申請專利範圍第8項之抗體或抗原結合片段，其中該可偵測之部分為螢光團。
11. 如申請專利範圍第10項之抗體或抗原結合片段，其中該螢光團為R-藻紅素(PE)、PE-Cy7、Alexa Fluor 488、螢光異硫氰酸鹽(FITC)、甲藻黃素葉綠素蛋白複合物(PerCP)、BV421、BV510、APC-H7、Alexa Fluor 647或別藻藍蛋白(APC)。
12. 一種經分離之核酸，其編碼如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之抗體或抗原結合片段。
13. 一種載體，其包含如申請專利範圍第12項之核酸。
14. 如申請專利範圍第13項之載體，其中該載體為表現載體。
15. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第14項之核酸。
16. 一種產生抗PD-L1抗體或其抗原結合片段之方法，其包含在適於產生該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段之條件下培養如申請專利範圍第15項之宿主細胞。
17. 如申請專利範圍第16項之方法，其進一步包含回收由該宿主細胞產生之抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。
18. 一種用於偵測由受檢者獲得之生物樣品中的PD-L1之方法，該方法包含： (a) 使該生物樣品與如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之抗體或抗原結合片段接觸；及 (b) 偵測該抗體或抗原結合片段與該生物樣品中之PD-L1的結合，由此偵測該生物樣品中之PD-L1。
19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中使用流動式細胞測量術偵測該抗體或抗原結合片段。
20. 如申請專利範圍第18項至第19項中任一項之方法，其中該生物樣品為血液樣品。
21. 如申請專利範圍第18項至第19項中任一項之方法，其中該生物樣品為骨髓樣品。
22. 如申請專利範圍第18項至第19項中任一項之方法，其中該生物樣品為細胞或組織。
23. 如申請專利範圍第22項之方法，其中該細胞或組織為癌細胞或癌組織。
24. 如申請專利範圍第18項至第23項中任一項之方法，其中該生物樣品包含活細胞。
25. 如申請專利範圍第18項至第24項中任一項之方法，其中該受檢者患有癌症。
26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該癌症選自由下列各病組成之群：多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群及急性骨髓性白血病。
27. 如申請專利範圍第18項至第26項中任一項之方法，其中該生物樣品係由已投與治療性抗PD-L1抗體或其抗原結合片段之受檢者獲得，其中該治療性抗體或其抗原結合片段包含： (a) 重鏈可變區，其包含： (i) 包含胺基酸序列GFTFSDSWIH (SEQ ID NO:11)之HVR-H1； (ii) 包含胺基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:12)之HVR-H2；及 (iii) 包含胺基酸序列RHWPGGFDY (SEQ ID NO:13)之HVR-H3；以及 (b) 輕鏈可變區，其包含： (i) 包含胺基酸序列RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:14)之HVR-L1； (ii) 包含胺基酸序列SASFLYS (SEQ ID NO:15)之HVR-L2；及 (iii) 包含胺基酸序列QQYLYHPAT (SEQ ID NO:16)之HVR-L3。
28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該治療性抗體或其抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO:17之胺基酸序列的重鏈可變區；及含有SEQ ID NO:18之胺基酸序列的輕鏈可變區。
29. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該治療性抗體或其抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO:19之胺基酸序列的重鏈；及含有SEQ ID NO:20之胺基酸序列的輕鏈。
30. 一種監測受檢者中之癌症治療的方法，該方法包含： (a) 使第一生物樣品與如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之抗體或抗原結合片段接觸； (b) 偵測該抗體或抗原結合片段與該第一生物樣品中之PD-L1的結合； (c) 測定存在於該第一生物樣品中的PD-L1之量； (d) 使第二生物樣品與如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之抗體或抗原結合片段接觸，其中在用治療性抗PD-L1抗體或其抗原結合片段治療之後獲得該第二生物樣品； (e) 偵測該抗體或抗原結合片段與該第二生物樣品中之PD-L1的結合； (f) 測定存在於該第二生物樣品中的PD-L1之量； (g) 比較存在於該第一生物樣品中的PD-L1之量與存在於該第二生物樣品中的PD-L1之量。
31. 如申請專利範圍第30項之方法，其中與該第一生物樣品相比存在於該第二生物樣品中的PD-L1之量的增加表明該患者對該治療性抗PD-L1抗體之治療無反應。
32. 如申請專利範圍第30項之方法，其中與第一生物樣品相比存在於該第二生物樣品中的PD-L1之量的減少表明該患者對該治療性抗PD-L1抗體之治療有反應。
33. 如申請專利範圍第30項至第32項中任一項之方法，其中在用該治療性抗PD-L1抗體或其抗原結合片段治療之前由該受檢者獲得該第一生物樣品。
34. 如申請專利範圍第30項至第32項中任一項之方法，其中在用該治療性抗PD-L1抗體或其抗原結合片段治療之後由該受檢者獲得該第一生物樣品。
35. 如申請專利範圍第30項至第34項中任一項之方法，其中該第一及第二生物樣品為血液樣品。
36. 如申請專利範圍第30項至第34項中任一項之方法，其中該第一及第二生物樣品為骨髓樣品。
37. 如申請專利範圍第30項至第34項中任一項之方法，其中該第一及第二生物樣品為細胞或組織。
38. 如申請專利範圍第37項之方法，其中該細胞或組織為癌細胞或癌組織。
39. 如申請專利範圍第30項至第38項中任一項之方法，其中該第一及第二生物樣品包含活細胞。
40. 如申請專利範圍第30項至第39項中任一項之方法，其中該受檢者患有選自由下列各病組成之群的癌症：多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群及急性骨髓性白血病。
41. 如申請專利範圍第30項至第40項中任一項之方法，其中該治療性抗體或其抗原結合片段包含： (a) 重鏈可變區，其包含： (i) 包含胺基酸序列GFTFSDSWIH (SEQ ID NO:11)之HVR-H1； (ii) 包含胺基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:12)之HVR-H2；及 (iii) 包含胺基酸序列RHWPGGFDY (SEQ ID NO:13)之HVR-H3；以及 (b) 輕鏈可變區，其包含： (i) 包含胺基酸序列RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:14)之HVR-L1； (ii) 包含胺基酸序列SASFLYS (SEQ ID NO:15)之HVR-L2；及 (iii) 包含胺基酸序列QQYLYHPAT (SEQ ID NO:16)之HVR-L3。
42. 如申請專利範圍第41項之方法，其中該治療性抗體或其抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO:17之胺基酸序列的重鏈可變區；及含有SEQ ID NO:18之胺基酸序列的輕鏈可變區。
43. 如申請專利範圍第42項之方法，其中該治療性抗體或其抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO:19之胺基酸序列的重鏈；及含有SEQ ID NO:20之胺基酸序列的輕鏈。
44. 如申請專利範圍第30項至第43項中任一項之方法，其中使用流動式細胞測量術偵測該抗PD-L1抗體或抗原結合片段。
45. 如申請專利範圍第18項至第44項中任一項之方法，其中該受檢者為人類。
46. 一種組合物，其包含如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之抗體或抗原結合片段。
47. 一種套組，其係用於偵測包含如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之抗體或如申請專利範圍第46項之組合物的生物樣品中之PD-L1。