JP7402158B2 - 抗ｐｄ－ｌ１抗体及びｐｄ－ｌ１を検出するためにそれを使用する方法 - Google Patents

抗ｐｄ－ｌ１抗体及びｐｄ－ｌ１を検出するためにそれを使用する方法 Download PDF

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Description

関連出願
本出願は、２０１７年１１月３０日に出願された米国特許出願第６２／５９３，１２５号に対する優先権を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの次の提出物の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０４０１４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０１８年１１月９日、サイズ：２０ＫＢ）。
発明の分野
本発明は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びＰＤ－Ｌ１を検出するためにそれを使用する方法に関する。
Ｔ細胞機能障害またはアネルギーが、阻害性受容体であるプログラム死１ポリペプチド（ＰＤ－１）の発現の誘導及び持続と同時に生じることが発見された。結果として、ＰＤ－１、ならびにＰＤ－１との相互作用を介してシグナル伝達する他の分子、例えばプログラム死リガンド１（ＰＤーＬ１）及びプログラム死リガンド２（ＰＤーＬ２）を標的とする治療法は、極めて興味深い分野である。ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の阻害は、がんの治療のためにＴ細胞免疫を増強する手段として実証されている（例えば、腫瘍免疫）。抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を使用する療法が、様々なタイプのがんを治療するために開発され、使用されている。例えば、米国特許第８，２１７，１４９号を参照されたい。
当技術分野では、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体で治療された対象からの生体試料中のＰＤ－Ｌ１を検出することが必要とされている。本発明は、ＰＤ－Ｌ１への結合に関して治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体と競合することなく、特異的にＰＤ－Ｌ１を検出する抗ＰＤ－Ｌ１抗体を提供する。これらの抗体は、例えば、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体で治療された対象におけるがん治療の監視に有用である。
一態様では、本発明は、
（ａ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＴＳＷＭＮ（配列番号１）を含むＨＶＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＲＩＹＰＲＤＧＤＴＹＹＮＧＫＦＫＤ（配列番号２）を含むＨＶＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＮＰＧＧＹＹＦＤＹ（配列番号３）を含むＨＶＲ－Ｈ３；ならびに
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＩＨＴＹＬＮ（配列番号４）を含むＨＶＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号５）を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＶＳＳＬＰＰＷＴ（配列番号６）を含むＨＶＲ－Ｌ３
を含む単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体、またはその抗原結合断片を提供する。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
本明細書の実施形態のいずれかの一部では、抗体または抗原結合断片は、ヒトＰＤ－Ｌ１への結合に関して参照用抗体と競合せず、該参照用抗体は、
（ａ） 以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号１１）を含むＨＶＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）を含むＨＶＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号１３）を含むＨＶＲ－Ｈ３；ならびに
（ｂ） 以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１４）を含むＨＶＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号１５）を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号１６）を含むＨＶＲ－Ｌ３
を含む。
一部の実施形態では、参照用抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。一部の実施形態では、参照用抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
本明細書のいずれかの実施形態の一部では、抗体または抗原結合断片は、ある部分に連結される。一部の実施形態では、その部分は検出可能な部分である。一部の実施形態では、検出可能な部分は、ビオチン、ストレプトアビジン、発光剤、酵素、フルオロフォア、染料、放射性標識、発色団、金属イオン、金粒子、銀粒子、磁性粒子、ポリペプチド、またはオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、検出可能な部分はフルオロフォアである。一部の実施形態では、フルオロフォアは、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）、ＰＥ－Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）、ＢＶ４２１、ＢＶ５１０、ＡＰＣ－Ｈ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）である。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片をコードする単離された核酸を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される核酸を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される核酸を含む宿主細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、本明細書に記載の宿主細胞を抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片の産生に適した条件下で培養することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、宿主細胞によって産生された抗ＰＤ－Ｌ１抗体、またはその抗原結合断片を回収することをさらに含む。
別の態様では、本発明は、対象から得られた生体試料中のＰＤ－Ｌ１を検出するための方法であって、（ａ）生体試料を本明細書に記載の抗体または抗原結合断片に接触させること；及び（ｂ）生体試料中のＰＤ－Ｌ１への抗体または抗原結合断片の結合を検出し、それによって生体試料中のＰＤ－Ｌ１を検出することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、フローサイトメトリーを使用して検出される。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、生体試料は血液試料である。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、生体試料は骨髄試料である。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、生体試料は細胞または組織である。一部の実施形態では、細胞または組織は、がん細胞またはがん組織である。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、生体試料は生細胞を含む。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、対象はがんを有する。一部の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、及び急性骨髄性白血病からなる群から選択される。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、生体試料は、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片を投与された対象から得られ、該治療用抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ） 以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号１１）を含むＨＶＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）を含むＨＶＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号１３）を含むＨＶＲ－Ｈ３；ならびに
（ｂ） 以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１４）を含むＨＶＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号１５）を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号１６）を含むＨＶＲ－Ｌ３
を含む。
一部の実施形態では、治療用抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。一部の実施形態では、治療用抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、対象はヒトである。
別の態様では、本発明は、（ａ）第１の生体試料を、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片に接触させること；（ｂ）第１の生体試料中のＰＤ－Ｌ１への抗体または抗原結合断片の結合を検出すること；（ｃ）第１の生体試料中に存在するＰＤ－Ｌ１の量を決定すること；（ｄ）治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片での治療後に得られる第２の生体試料を、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片に接触させること；（ｅ）第２の生体試料中のＰＤ－Ｌ１への抗体または抗原結合断片の結合を検出すること；（ｆ）第２の生体試料中に存在するＰＤ－Ｌ１の量を決定すること；（ｇ）第１の生体試料中に存在するＰＤ－Ｌ１の量を第２の生体試料中に存在するＰＤ－Ｌ１の量と比較することを含む、対象におけるがん治療を監視する方法を提供する。一部の実施形態では、第２の生体試料中に存在するＰＤ－Ｌ１の量が、第１の生体試料と比較して増加していれば、患者が治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での治療に応答していないことが示される。一部の実施形態では、第２の生体試料中に存在するＰＤ－Ｌ１の量が、第１の生体試料と比較して減少していれば、患者が治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での治療に応答していることが示される。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、第１の生体試料は、対象から治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片での治療前に得られる。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、第１の生体試料は、対象から治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片での治療後に得られる。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、第１及び第２の生体試料は血液試料である。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、第１及び第２の生体試料は骨髄試料である。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、第１及び第２の生体試料は細胞または組織である。一部の実施形態では、細胞または組織は、がん細胞またはがん組織である。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、第１及び第２の生体試料は生細胞を含む。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、対象は、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、及び急性骨髄性白血病からなる群から選択されるがんを有する。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、治療用抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ） 以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号１１）を含むＨＶＲ－Ｈ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）を含むＨＶＲ－Ｈ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号１３）を含むＨＶＲ－Ｈ３；ならびに
（ｂ） 以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１４）を含むＨＶＲ－Ｌ１；
（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号１５）を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び
（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号１６）を含むＨＶＲ－Ｌ３
を含む。
一部の実施形態では、治療用抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。一部の実施形態では、治療用抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗原結合断片は、フローサイトメトリーを使用して検出される。本明細書の実施形態のいずれかの一部では、対象はヒトである。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片を含む組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体もしくは抗原結合断片または本明細書に記載の組成物を含む、生体試料中のＰＤ－Ｌ１を検出するためのキットを提供する。
最も近く一致するマウス生殖系列（配列番号２１）に対する１４Ｄ３抗ＰＤ－Ｌ１の重鎖可変領域（配列番号７）の配列アラインメントの図である。 最も近く一致するマウス生殖系列（配列番号２２）に対する１４Ｄ３抗ＰＤ－Ｌ１の軽鎖可変領域（配列番号８）の配列アラインメントの図である。 Ａ及びＢは、Ａ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ ２９Ｅ．２３で染色された；またはＢ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ １４．Ｄ３で染色された、健常なヒトドナーから得られた血液中のＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を示すグラフである。ＦＭＯは、蛍光染料を一種除いた（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｎｕｓ ｏｎｅ）ネガティブゲーティングコントロールを示す。 Ａ及びＢは、Ａ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ ２９Ｅ．２３で染色された；またはＢ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ １４．Ｄ３で染色された、健常なヒトドナーから得られた血液中のＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率（％）を示すグラフである。ＦＭＯは、蛍光染料を一種除いたネガティブゲーティングコントロールを示す。 Ａ及びＢは、Ａ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ ２９Ｅ．２３で染色された；またはＢ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ １４．Ｄ３で染色された、健常なヒトドナーから得られた血液中のＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を示すグラフである。ＦＭＯは、蛍光染料を一種除いたネガティブゲーティングコントロールを示す。 Ａ及びＢは、Ａ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ ２９Ｅ．２３で染色された；またはＢ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ １４．Ｄ３で染色された、健常なヒトドナーから得られた血液中のＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（％）を示すグラフである。ＦＭＯは、蛍光染料を一種除いたネガティブゲーティングコントロールを示す。 Ａ及びＢは、Ａ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ ２９Ｅ．２３で染色された；またはＢ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ １４．Ｄ３で染色された、健常なヒトドナーから得られた血液中のＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ１９Ｂ細胞の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を示すグラフである。ＦＭＯは、蛍光染料を一種除いたネガティブゲーティングコントロールを示す。 Ａ及びＢは、Ａ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ ２９Ｅ．２３で染色された；またはＢ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ １４．Ｄ３で染色された、健常なヒトドナーから得られた血液中のＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ１９Ｂ細胞の百分率（％）を示すグラフである。ＦＭＯは、蛍光染料を一種除いたネガティブゲーティングコントロールを示す。 Ａ及びＢは、Ａ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＰＣ ２９Ｅ．２３で染色された；またはＢ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦ６４７ １４．Ｄ３で染色された、健常なヒトドナーから得られた血液中のＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を示すグラフである。ＦＭＯは、蛍光染料を一種除いたネガティブゲーティングコントロールを示す。 Ａ及びＢは、Ａ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＰＣ ２９Ｅ．２３で染色された；またはＢ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦ６４７ １４．Ｄ３で染色された、健常なヒトドナーから得られた血液中のＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率（％）を示すグラフである。ＦＭＯは、蛍光染料を一種除いたネガティブゲーティングコントロールを示す。 Ａ及びＢは、Ａ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＰＣ ２９Ｅ．２３で染色された；またはＢ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦ６４７ １４．Ｄ３で染色された、健常なヒトドナーから得られた血液中のＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を示すグラフである。ＦＭＯは、蛍光染料を一種除いたネガティブゲーティングコントロールを示す。 Ａ及びＢは、Ａ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＰＣ ２９Ｅ．２３で染色された；またはＢ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦ６４７ １４．Ｄ３で染色された、健常なヒトドナーから得られた血液中のＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（％）を示すグラフである。ＦＭＯは、蛍光染料を一種除いたネガティブゲーティングコントロールを示す。 Ａ及びＢは、Ａ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＰＣ ２９Ｅ．２３で染色された；またはＢ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦ６４７ １４．Ｄ３で染色された、健常なヒトドナーから得られた血液中のＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ１９Ｂ細胞の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を示すグラフである。ＦＭＯは、蛍光染料を一種除いたネガティブゲーティングコントロールを示す。 Ａ及びＢは、Ａ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＰＣ ２９Ｅ．２３で染色された；またはＢ）ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での刺激後に、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）もしくはアテゾリズマブの存在下（＋薬物）で抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦ６４７ １４．Ｄ３で染色された、健常なヒトドナーから得られた血液中のＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ１９Ｂ細胞の百分率（％）を示すグラフである。ＦＭＯは、蛍光染料を一種除いたネガティブゲーティングコントロールを示す。 Ａ～Ｃは、健常なドナーから得られた、刺激されていない及び刺激された両血液中の、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）またはアテゾリズマブ（＋薬物）の存在下で抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ １４．Ｄ３抗体で染色された、Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣ）ＣＤ１９Ｂ細胞の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を示すグラフである。ＦＭＯは、蛍光染料を一種除いたネガティブゲーティングコントロールを示す。Ｃｙｔｏｓｔｉｍは、ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）刺激剤を示す。刺激なしＦＭＯ：抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ １４．Ｄ３抗体存在せず；刺激なし－薬物：抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ １４．Ｄ３抗体が存在した；刺激なし＋薬物：抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ １４．Ｄ３抗体及びアテゾリズマブが存在した；Ｃｙｔｏｓｔｉｍ ＦＭＯ：抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ １４．Ｄ３抗体存在せず；Ｃｙｔｏｓｔｉｍ－薬物：抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ １４．Ｄ３抗体が存在した；ならびにＣｙｔｏｓｔｉｍ＋薬物：抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ １４．Ｄ３抗体及びアテゾリズマブが存在した。 Ａ～Ｃは、健常なドナーから得られた、刺激されていない及び刺激された両血液中の、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）またはアテゾリズマブ（＋薬物）の存在下で抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦ６４７ １４．Ｄ３抗体で染色された、Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣ）ＣＤ１９Ｂ細胞の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を示すグラフである。ＦＭＯは、蛍光染料を一種除いたネガティブゲーティングコントロールを示す。Ｃｙｔｏｓｔｉｍは、ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）刺激剤を示す。刺激なしＦＭＯ：抗－ＰＤ－Ｌ１ ＡＦ６４７ １４．Ｄ３抗体存在せず；刺激なし－薬物：抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦ６４７ １４．Ｄ３抗体が存在した；刺激なし＋薬物：抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦ６４７ １４．Ｄ３抗体及びアテゾリズマブが存在した；Ｃｙｔｏｓｔｉｍ ＦＭＯ：抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦ６４７ １４．Ｄ３抗体存在せず；Ｃｙｔｏｓｔｉｍ－薬物：抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦ６４７ １４．Ｄ３抗体が存在した；ならびにＣｙｔｏｓｔｉｍ＋薬物：抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦ６４７ １４．Ｄ３抗体及びアテゾリズマブが存在した。 Ａ～Ｃは、健常なドナーから得られた、刺激されていない及び刺激された両血液中の、アテゾリズマブの非存在下（－薬物）またはアテゾリズマブ（＋薬物）の存在下で抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＰＣ ２９Ｅ．２３抗体で染色された、Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣ）ＣＤ１９Ｂ細胞の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を示すグラフである。アテゾリズマブの非存在下（－薬物）またはアテゾリズマブ（＋薬物）の存在下でのＤ３抗体。ＦＭＯは、蛍光染料を一種除いたネガティブゲーティングコントロールを示す。Ｃｙｔｏｓｔｉｍは、ＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）刺激剤を示す。刺激なしＦＭＯ：抗－ＰＤ－Ｌ１ ＡＰＣ ２９Ｅ．２３抗体存在せず；刺激なし－薬物：抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＰＣ ２９Ｅ．２３抗体が存在した；刺激なし＋薬物：抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＰＣ ２９Ｅ．２３抗体及びアテゾリズマブが存在した；Ｃｙｔｏｓｔｉｍ ＦＭＯ：抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＰＣ ２９Ｅ．２３抗体存在せず；Ｃｙｔｏｓｔｉｍ－薬物：抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＰＣ ２９Ｅ．２３抗体が存在した；ならびにＣｙｔｏｓｔｉｍ＋薬物：抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＰＣ ２９Ｅ．２３抗体及びアテゾリズマブが存在した。 フローサイトメトリーによって測定された、抗ＰＤＬ－１ １４Ｄ３抗体で染色されたヘパリン化された骨髄及び全血中の多発性骨髄腫（ＭＭ）におけるＰＤ－Ｌ１の発現を示すグラフである。ＰＣは、形質細胞を示す。ＢＭは、骨髄を示す。具体的な細胞集団は、括弧内に明記する。白抜き記号は、同じ患者を表す。
Ｉ．定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４）、及びＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）は、本出願に使用される多くの用語に対する一般的指針を当業者に提供する。特許出願及び刊行物を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体が参照により組み込まれている。
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当技術分野の範囲内である、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技法が用いられる。そのような技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ １９８７，ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１９９４）；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．，１９８８）；Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）などの文献に十分に説明されている。
本明細書を解釈する目的において、以下の定義が適用され、適正な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆も同様である。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定することを意図するものではないことを理解するべきである。以下に記載されるいずれかの定義が、参照により本明細書に組み込まれているいずれかの文献と矛盾する場合には、以下に記載される定義が優先するものとする。
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の、合計の非共有性相互作用の強度を指す。別途の指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原との）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための特定の例証的かつ例示的な実施形態が、本明細書に記載される。
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた（これらに限定されない）、様々な抗体構造を包含する。
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；二重特異性抗体；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体をパパイン消化すると、単一の抗原結合部位を各々有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一な抗原結合断片と、名称が容易に結晶化するその能力を反映する、残りの「Ｆｃ」断片とが生成される。ペプシンで処理すると、Ｆ（ａｂ’）２断片が得られ、これは、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋する能力を有する。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり及び／または同じエピトープに結合するが、存在し得る変異体抗体、例えば天然に存在する突然変異を含有するかまたはモノクローナル抗体調製物の生成の間に生じる、一般に少量存在する変異体は除外する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。よって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるものとしての抗体の特徴を示しており、何らかの特定の方法による抗体の生成を必要とするものとして解釈するべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含めた（これらに限定されない）多様な技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。
「裸の抗体」とは、異種部分（例えば、細胞毒性部分）または放射性標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。裸の抗体は、医薬製剤中に存在してもよい。
「天然抗体」とは、天然に存在する様々な構造を有する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて定常軽（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てることができる。
抗体の「クラス」とは、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分類することができる。免役グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、σ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」、「抗ＰＤ－Ｌ１」、「ＰＤ－Ｌ１抗体」、または「ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体」という用語は、抗体が、ＰＤ－Ｌ１を標的とする上で診断剤及び／または治療剤として有用になるように、十分な親和性でＰＤ－Ｌ１に結合することができる抗体を指す。一実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の、無関係の非ＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合の程度は、例えば放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）により測定されたときに、抗体のＰＤ－Ｌ１への結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、異なる種由来のＰＤ－Ｌ１の間で保存されているＰＤ－Ｌ１のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する。
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、詳細には非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部分が特定の源または種に由来する一方で、重鎖及び／または軽鎖の残りの部分が異なる源または種に由来する抗体を指す。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３にあるようなサブグループである。一実施形態では、ＶＬに関して、サブグループは、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌにあるようなサブグループカッパＩである。一実施形態では、ＶＨに関して、サブグループは、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌにあるようなサブグループカッパＩＩＩである。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、それにおいて、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに相当し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化型」とは、ヒト化を経た抗体を指す。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般に、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域 （ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む、類似の構造を有する。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい）。抗原結合特異性を与えるには、単一のＶＨまたはＶＬドメインで十分であり得る。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体からのＶＨまたはＶＬドメインを使用して相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリをそれぞれスクリーニングして、単離されてもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。
「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列が超可変であり、及び／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体の可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然４本鎖抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨにあり（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、３つがＶＬにある（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。ＨＶＲは一般に、超可変ループ及び／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性を有し、及び／または抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）に生じる。（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１の２４～３４、Ｌ２の５０～５６、Ｌ３の８９～９７、Ｈ１の３１～３５Ｂ、Ｈ２の５０～６５、及びＨ３の９５～１０２のアミノ酸残基に生じる。（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。ＶＨ内のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原に接触する残基である、「特異性決定残基」または「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮型ＣＤＲ、またはａ－ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含有される。例示的なａ－ＣＤＲ（ａ－ＣＤＲ－Ｌ１、ａ－ＣＤＲ－Ｌ２、ａ－ＣＤＲ－Ｌ３、ａ－ＣＤＲ－Ｈ１、ａ－ＣＤＲ－Ｈ２、及びａ－ＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１の３１～３４、Ｌ２の５０～５５、Ｌ３の８９～９６、Ｈ１の３１～３５Ｂ、Ｈ２の５０～５８、及びＨ３の９５～１０２のアミノ酸残基に生じる（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照されたい）。別段の指示がない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従って番号付けされる。
「Ｆａｂ」断片は、重鎖及び軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端への数個の残基の付加の分だけＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が、遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書での呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成されたものであった。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書では定常領域の少なくとも一部分を含有する免役グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端のリジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合もあれば、しない場合もある。本明細書で別段明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
「フレームワーク」または「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（またはＶＬ）に、ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４の順序で出現する。
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では相互に交換可能に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、相互に交換可能に使用され、外来核酸が導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び継代の数にかかわらずそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含量が細親胞と完全に同一ではない場合があるが、突然変異を含有することがある。元々の形質転換された細胞にあった、スクリーニングまたは選択された機能及び生物活性と同じものを有する突然変異体子孫は、本明細書に含まれる。ある特定の実施形態では、宿主細胞は「単離された」宿主細胞であり、「単離された」宿主細胞とは、その自然環境の構成成分から分離された宿主細胞を指す。
「単離された」抗体は、その自然環境の構成成分から分離された抗体である。一部の実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％超または９９％超の純度まで精製される。抗体の純度を評価するための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。
「単離された」核酸とは、その自然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、核酸分子を通常含有する細胞内に含有される核酸分子が含まれるが、その核酸分子は、染色体外に存在するか、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性の割合（％）」は、最大の配列同一性の割合（％）を達成するように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部としてみなさないときの、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性の割合（％）を決定するためのアラインメントは、当技術分野の範囲内の様々な方式で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたる最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるのに適正なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性（％）の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の著作であり、ソースコードは、ユーザ文書と共に米国著作権庁（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）に提出されて、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に利用可能であり、またはソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含めたＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用する場合はコンパイルするべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変動しない。
ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況下では、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれと対比した所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性（％）（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂ対する、それとの、またはそれと対比した、ある特定のアミノ酸配列同一性（％）を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することができる）は、以下のように算出される：
分率Ｘ／Ｙ×１００
式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢとのアラインメントにおいて完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性（％）は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性（％）と等しくはならないことが理解されるだろう。別段特に明示しない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性（％）の値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して得られる。
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、連結している別の核酸を増殖することができる核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。ある特定のベクターは、作動的に連結された核酸の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別段の指示がない限り、複数への言及を含む。
「約」という用語は、本明細書で使用される場合、当業者であれば容易に理解するそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書での「約」の値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。
本明細書に記載の本発明の態様及び実施形態には、態様及び実施形態「を含むこと」、それら「からなること」、及びそれら「から本質的になること」が含まれることが理解される。
ＩＩ．ＰＤ－Ｌ１を検出するための抗ＰＤ－Ｌ１抗体
一態様では、本発明は、例えば、生体試料中の細胞の表面上のＰＤ－Ｌ１タンパク質の検出及び／または定量化に有用な、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を提供する。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、モノクローナル、キメラ、またはヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１は、生体試料中の生細胞の表面上のＰＤ－Ｌ１タンパク質の検出及び／または定量化に有用である。一部の実施形態では、生体試料は、末梢血試料またはがん試料である。一部の実施形態では、生体試料は骨髄試料である。一部の実施形態では、生体試料は、免疫細胞または腫瘍細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、ヒト対象からのものである。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、フローサイトメトリーを使用するＰＤ－Ｌ１タンパク質の検出及び／または定量化に使用される。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１の抗ＰＤ－Ｌ１参照用抗体との結合に関して交差競合しない。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１参照用抗体は、アテゾリズマブである。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブでの治療を受けた対象においてＰＤ－Ｌ１の存在を検出するのに有用である。
Ａ．ＰＤ－Ｌ１を検出するための例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体
一般に、本開示の抗体は、ＰＤ－Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１）に免疫特異的に結合する。本開示の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であり、多重特異性、ヒト、ヒト化、マウスまたはキメラ、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって生産された断片、及び上のいずれかのＰＤ－Ｌ１結合断片であってもよい。本開示の免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子であることができる。
本開示のある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、抗原結合断片である。ある特定の実施形態では、抗原結合断片として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ならびにＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合断片は（一本鎖抗体を含めて）、可変領域（複数可）を単独で含んでも、または、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＬドメインの全体または一部分を組み合わせて含んでもよい。同様に本開示に含まれるのは、可変領域（複数可）を、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＬドメインと任意に組み合わせて含む抗原結合断片である。好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト、ネズミ科（例えば、マウス及びラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ科、ウマ、またはニワトリのものである。
本開示の抗体は、それらが含む特定のＨＶＲの観点から説明または特定することができる。
ある特定の実施形態では、本発明は、（ａ）以下を含む重鎖可変領域：アミノ酸配列ＴＳＷＭＮ（配列番号１）を含むＨＶＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＲＩＹＰＲＤＧＤＴＹＹＮＧＫＦＫＤ（配列番号２）を含むＨＶＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＮＰＧＧＹＹＦＤＹ（配列番号３）を含むＨＶＲ－Ｈ３；ならびに（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＩＨＴＹＬＮ（配列番号４）を含むＨＶＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号５）を含むＨＶＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＱＱＶＳＳＬＰＰＷＴ（配列番号６）を含むＨＶＲ－Ｌ３、を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体を提供する。
一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、例えば図１Ａ及び図１Ｂに示されるように、抗体１４Ｄ３の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲ（Ｋａｂａｔ）を含む。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、例えば図１Ａ及び図１Ｂに示されるように、抗体１４Ｄ３のＶＨ及び／またはＶＬを含む。
一部の実施形態では、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が提供される。ある特定の実施形態では、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、そのＶＨ配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、合計１～１０個のアミノ酸が、配列番号７において置換、挿入及び／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲの中）で生じる。場合によって、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号７のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３から選択される、１つ、２つ、または３つのＨＶＲを含む。
一部の実施形態では、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が提供される。ある特定の実施形態では、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、そのＶＬ配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１抗体に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、合計１～１０個のアミノ酸が、配列番号８において置換、挿入及び／または欠失されている。ある特定の実施形態では、その置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲの中）で生じる。場合によって、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号８のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、１つ、２つ、または３つのＨＶＲを含む。
別の態様では、上に示した実施形態のいずれかにおけるＶＨと、上に示した実施形態のいずれかにおけるＶＬとを含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が提供される。一実施形態では、抗体は、配列番号７のＶＨ配列と配列番号８のＶＬ配列とを含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
別の態様では、上に示した実施形態のいずれかにおける重鎖と、上に示した実施形態のいずれかにおける軽鎖とを含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が提供される。一実施形態では、抗体は、配列番号９の重鎖配列と配列番号１０の軽鎖配列とを含み、それらは、これらの配列の翻訳後修飾を含む。
本開示の抗体はまた、それらのＰＤ－Ｌ１（例えばヒトＰＤ－Ｌ１）への結合親和性の観点から説明または特定することができる。好ましい結合親和性には、５×１０－２Ｍ、１０－２Ｍ、５×１０－３Ｍ、１０－３Ｍ、５×１０－４Ｍ、１０－４Ｍ、５×１０－５Ｍ、１０－５Ｍ、５×１０－６Ｍ、１０－６Ｍ、５×１０－７Ｍ、１０－７Ｍ、５×１０－８Ｍ、１０－８Ｍ、５×１０－９Ｍ、１０－９Ｍ、５×１０－１０Ｍ、１０－１０Ｍ、５×１０－１１Ｍ、１０－１１Ｍ、５×１０－１２Ｍ、１０－１２Ｍ、５×１０－１３Ｍ、１０－１３Ｍ、５×１０－１４Ｍ、１０－１４Ｍ、５×１０－１５Ｍ、または１０－１５Ｍ未満の解離定数もしくはＫｄを有するものが含まれる。
本発明のさらなる態様では、上の実施形態のいずれかによる抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、キメラ、ヒト化、またはマウス抗体を含めた、モノクローナル抗体である。一実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、またはＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体または本明細書において定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。
本発明のさらなる態様では、上の実施形態のいずれかによるまたは本明細書に記載される抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、異種部分または検出可能な部分に連結またはコンジュゲートされる。一部の実施形態では、検出可能な部分は、標識またはビオチンである。一部の実施形態では、検出可能な部分は、標識である。一部の実施形態では、検出可能な部分は、ビオチンである。一部の実施形態では、検出可能な部分は、フルオロフォアである。一部の実施形態では、フルオロフォアは、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）、ＰＥ－Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）、ＢＶ４２１、ＢＶ５１０、ＡＰＣ－Ｈ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）である。一部の実施形態では、フルオロフォアは、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）である。一部の実施形態では、フルオロフォアは、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）である。一部の実施形態では、フルオロフォアは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７である。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＮＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＴＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＫＧＬＥＷＩＧＲＩＹＰＲＤＧＤＴＹＹＮＧＫＦＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＴＫＮＰＧＧＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号７）
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＮＣＲＡＳＱＤＩＨＴＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＦＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＶＳＳＬＰＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号８）
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のアミノ酸配列：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＮＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＴＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＫＧＬＥＷＩＧＲＩＹＰＲＤＧＤＴＹＹＮＧＫＦＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＴＫＮＰＧＧＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＹＰＬＡＰＶＣＧＤＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＬＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＴＳＳＴＷＰＳＱＳＩＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＥＰＲＧＰＴＩＫＰＣＰＰＣＫＣＰＡＰＮＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＩＫＤＶＬＭＩＳＬＳＰＩＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＬＲＶＶＳＡＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＡＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＳＶＲＡＰＱＶＹＶＬＰＰＰＥＥＥＭＴＫＫＱＶＴＬＴＣＭＶＴＤＦＭＰＥＤＩＹＶＥＷＴＮＮＧＫＴＥＬＮＹＫＮＴＥＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＭＹＳＫＬＲＶＥＫＫＮＷＶＥＲＮＳＹＳＣＳＶＶＨＥＧＬＨＮＨＨＴＴＫＳＦＳＲＴＰＧ（配列番号９）
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖のアミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＮＣＲＡＳＱＤＩＨＴＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＦＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＶＳＳＬＰＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ（配列番号１０）
Ｂ．参照用または治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体
別の態様では、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１への結合に関して参照用抗ＰＤ－Ｌ１抗体または治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体と交差競合しない。「参照用抗ＰＤ－Ｌ１抗体」及び「治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１以外の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を指す。「参照用抗ＰＤ－Ｌ１抗体」及び「治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体」という用語は、相互に交換可能に使用することができるが、「治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体」という用語は一般に、該抗体が対象に投与されるときに使用される。
ある特定の実施形態では、参照用または治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、（ａ）以下を含む重鎖可変領域：アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号１１）を含むＨＶＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）を含むＨＶＲ－Ｈ２、及びアミノ酸配列ＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号１３）を含むＨＶＲ－Ｈ３；ならびに（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１４）を含むＨＶＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号１５）を含むＨＶＲ－Ｌ２、及びアミノ酸配列ＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号１６）を含むＨＶＲ－Ｌ３；を含む。
一部の実施形態では、参照用または治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び／または配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、参照用または治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する軽鎖とを含む。
一部の実施形態では、参照用または治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））である。
一部の実施形態では、参照用または治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、モノクローナル、キメラ、またはヒト化である。
例示的な参照用または治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１７）
例示的な参照用または治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１８）
例示的な参照用または治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖のアミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１９）
例示的な参照用または治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖のアミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２０）
Ｃ．生成方法
本発明によって使用される抗抗体を生成するための例示的な技法について以下に説明する。
ｉ．ポリクローナル抗体
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体を含んでもよい。ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に公知である。ポリクローナル抗体は、哺乳動物において、例えば、免疫剤及び所望であればアジュバントの１回または複数回の注射によって産生され得る。典型的には、免疫剤及び／またはアジュバントは、複数回の皮下または腹腔内注射によって哺乳動物に注射されるものである。免疫剤は、抗ＰＤ－Ｌ１、その抗原結合断片、またはその融合タンパク質を含んでもよい。免疫される哺乳動物において免疫原性であることが知られているタンパク質に免疫剤をコンジュゲートさせることが有用であり得る。そのような免疫原性タンパク質の例として、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、及びダイズトリプシン抑制因子が挙げられるが、これらに限定されない。用いることができるアジュバントの例として、フロイント完全アジュバント、及びＭＰＬ－ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。免疫プロトコルは、当業者であれば過度な実験を行うことなく選択することができる。哺乳動物は次いで採血され、その血清を抗ＰＤ－Ｌ１抗体価について評価することができる。所望であれば、哺乳動物は、抗体価が増加するかまたはプラトーに達するまで追加免疫することができる。
ｉｉ．モノクローナル抗体
本発明の抗体は、あるいはモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法により作製されてもよいし、または組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適正な宿主動物、例えばハムスターが、上記のように免疫されて、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生できるリンパ球が誘発される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫されてもよい。免疫された後、リンパ球は単離され、次いでポリエチレングリコールなどの適した融剤を使用して骨髄腫細胞株に融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
このように調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫細胞（融合パートナーとも称される）の増殖または生存を阻害する１種または複数の物質を含有する適切な培地に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用選択培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含むことになり（ＨＡＴ培地）、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
融合パートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの産生を支援し、融合していない親細胞に対して選択する選択培地に対して感受性を示すものである。骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ－２１及びＭＰＣ－１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡから入手可能なＳＰ－２及び誘導体、例えばＸ６３－Ａｇ８－６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｒｎｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；及びＢｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、抗原に対して指向されるモノクローナル抗体の産生に関してアッセイされる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定することができる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）に記載されるスキャチャード解析によって決定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定した後、クローンを限界希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的に適した培地として、例えば、Ｄ－ＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、例えば、この細胞をマウスに腹腔内注射することによって、動物内での腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、親和性クロマトグラフィ（例えば、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ－セファロースを使用するもの）またはイオン交換クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析などの従来の抗体精製手順によって、培地、腹水、または血清から適切に分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの供給源として機能する。単離した後、該ＤＮＡを発現ベクター内に入れ、次いでそれを、宿主細胞、例えば、元来抗体タンパク質を産生しない、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞中にトランスフェクトして、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成物を得てもよい。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する概説論文として、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６－２６２（１９９３）及びＰｌｉｉｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１－１８８（１９９２）が挙げられる。
さらなる実施形態では、モノクローナル抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）に記載される技法を使用して生成された抗体ファージライブラリから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離をそれぞれ記載している。その後の刊行物は、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９－７８３（１９９２））、ならびに極めて大きいファージライブラリを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換えを記載している（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５－２２６６（１９９３））。よって、これらの技法は、モノクローナル抗体を単離するための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法に代わる実行可能な別法である。
原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の様々な断片をディスプレイするファージを含有するファージライブラリをスクリーニングすることによって選択される。そのようなファージライブラリは、所望の抗原に対してスクリーニングされる。所望の抗原に結合することができるＦｖ断片を発現するクローンは、その抗原に吸着し、よってライブラリ内の結合していないクローンから分離される。次いで、結合クローンは、抗原から溶出され、追加の抗原吸着／溶出サイクルによってさらに富化することができる。
可変ドメインは、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３－４５５（１９９４）に記載されるように、短いフレキシブルペプチドを介してＶＨとＶＬとが共有結合した一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、またはそれらが各々定常ドメインに融合し、非共有結合的に相互作用するＦａｂ断片としてのいずれかで、ファージ上に機能的にディスプレイすることができる。
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３－４５５（１９９４）に記載されるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングし、ファージライブラリにおいてランダムに組換えることができ、次いでこれらを抗原結合クローンについて検索することができる。免疫された供給源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：７２５－７３４（１９９３）に記載されるように、ナイーブレパートリーをクローニングすれば、いかなる免疫化も行うことなく、広範囲の非自己抗原及びまた自己抗原に対する単一のヒト抗体供給源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１－３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再配列を遂行することによって、合成的に作製することができる。
ライブラリのスクリーニングは、当技術分野で公知の様々な技法によって遂行することができる。例えば、ＰＤ－Ｌ１を使用して、吸着プレートのウェルをコーティングすることができ、吸着プレートに付着された宿主細胞で発現されるか、または細胞選別に使用されるか、またはストレプトアビジンコーティングビーズで捕捉するためにビオチンにコンジュゲートされるか、またはファージディスプレイライブラリをパニングするための任意の他の方法に使用されてもよい。
遅い解離速度（及び良好な結合親和性）を有する抗体の選択は、Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９－３１４（１９９０）及びＷＯ９２／０９６９０に記載されるような長時間の洗浄及び一価ファージディスプレイの使用、ならびにＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９－７８３（１９９２）に記載されるような抗原の低コーティング密度の使用によって促進することができる。
本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれも、目的とするファージクローンを選択するのに適した抗原スクリーニング手順を設計し、続いて、目的とするファージクローンからのＦｖ配列と、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３に記載される適切な定常領域（Ｆｃ）配列とを使用して、全長の抗ＰＤ－Ｌ１抗体クローンを構築することによって得ることができる。
ｉｉｉ．抗体変異体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的性質を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適正な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製されてもよい。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列からの残基の欠失、及び／またはそこへ残基の挿入、及び／またはその内の残基の置換が含まれる。最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換を任意に組み合わせることができるが、但し、その最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を保有することを条件とする。
１．置換、挿入、及び欠失変異体
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換による変異誘発に関して目的とする部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換を表１に「保存的置換」という見出しの下に示す。より実質的な変化を表１に「例示的置換」の見出しの下に示し、またアミノ酸側鎖クラスに関して下にさらに記載する。目的とする抗体中にアミノ酸置換を導入し、その産物を、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングすることができる。
Figure 0007402158000001
アミノ酸は、一般的な側鎖の性質に従ってグループ化することができる：
－疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
－中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
－酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
－塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
－鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
－芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うことになる。
あるタイプの置換変異体は、親抗体（例えば、マウス、ヒト化、またはヒト抗体）の１つまたは複数の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる研究のために選択される、得られた変異体（複数可）は、親抗体と比較して、ある特定の生物学的性質における修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）を有し、及び／または実質的に保持された親抗体のある特定の生物学的性質を有することになる。例示的な置換変異体は、例えば、本明細書に記載されるものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して好都合に生成することができる、親和性成熟抗体である。簡潔には、１つまたは複数のＨＶＲ残基を変異させ、変異体抗体をファージ上にディスプレイし、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
改変（例えば、置換）は、ＨＶＲ中で、例えば、抗体親和性を改善するために行われてもよい。そのような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異が起こるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６ （２００８）を参照されたい）、及び／またはＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）において行われてもよく、得られた変異体ＶＨまたはＶＬが、結合親和性について試験される。二次ライブラリからの構築及び再選択による親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．によりＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟の一部の実施形態では、多様性が、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリが作製される。次いで、このライブラリは、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を特定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４～６個の残基）をランダム化する、ＨＶＲ指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、具体的に特定されてもよい。ＨＶＲ－Ｈ３及びＨＶＲ－Ｌ３が特に標的とされることが多い。
ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減させない限り、１つまたは複数のＨＶＲ中で生じてもよい。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的改変（例えば、本明細書に提供されるような保存的置換）が、ＨＶＲ中で行われてもよい。そのような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」またはＳＤＲの外側であってもよい。上に提供される変異体ＶＨ及びＶＬ配列のある特定の実施形態では、各ＨＶＲは、改変されていないか、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基または領域を特定するのに有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５によって記載されるような「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれるものである。この方法では、一残基または一群の標的残基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）が特定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられて、抗体の抗原との相互作用が影響を受けたかどうかが決定される。この最初の置換に対して機能的感受性を示したアミノ酸の場所に、さらなる置換が導入されてもよい。
あるいは、または加えて、抗体と抗原との間の接点を特定するための抗原－抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び近隣の残基は、置換候補として標的とされても、または置換候補から除外されてもよい。変異体をスクリーニングして、それらが所望の性質を含有するかどうかを決定してもよい。
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００残基以上を含有するポリペプチドの長さに及ぶアミノ末端及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列中への挿入が含まれる。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体には、Ｎ末端もしくはＣ末端に、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドを融合させたものが含まれる。
ｉｖ．組換え法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される組換え法及び組成物を使用して生産されてもよい。一実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／または重鎖）をコードすることができる。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む１つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態では、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、それらで形質転換されている）。一実施形態では、宿主細胞は、真核性であり、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ球様細胞（例えば、ＹＯ、ＮＳＯ、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、上に提供される、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養すること、及び場合によって抗体を宿主細胞（または宿主細胞培地）から回収することを含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を作製する方法が提供される。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の組換え産生のために、例えば上記のような、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／または発現のために１つまたは複数のベクターに挿入される。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離し、配列決定することができる。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合には、細菌で産生されてもよい。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。（また、Ｅ．ｃｏｌｉでの抗体断片の発現を記載している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照されたい）。発現後、抗体は、細菌細胞ペーストから可溶性画分中に単離されてもよく、さらに精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、抗体をコードするベクターに適したクローニングまたは発現宿主であり、そうしたものには真菌及び酵母株が含まれ、それらのグリコシル化経路が「ヒト化」されていることによって、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生がもたらされる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５（２００６）を参照されたい。
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例として、植物及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と併せて（特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションに）使用することができる、多数のバキュロウイルス株が特定されている。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。
脊椎動物細胞も、宿主として使用されてもよい。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ １株；ヒト胎児性腎株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒａｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３または２９３細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞；サル腎細胞（ＣＶ １）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲ０－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ ０２）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞、例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるもの；ＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株として、ＤＨＦＫ ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））を含めた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびに骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳＯ、及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に適したある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。
ＩＩＩ．アッセイ
本明細書に提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、当技術分野で公知の様々なアッセイによって、それらの物理的／化学的性質及び／または生物活性について特定する、スクリーニングする、または特徴付けることができる。
ａ．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、本発明の抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどの公知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。結合親和性は、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。一実施形態では、抗体のＫＤは、以下のアッセイに説明するように、Ｆａｂ型の抗体及び抗原分子を用いて行われる放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。すなわち、非標識抗原の滴定系列の存在下でＦａｂを最小限の濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡化し、次いで結合した抗原を抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートで捕捉することによって、抗原に対するＦａｂの溶液の結合親和性を測定する（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２９３：８６５－８８１）。このアッセイの条件を確立するために、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５ｕｇ／ｍｌの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで２～５時間室温（およそ２３℃）でブロッキングする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）において、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を、目的とするＦａｂの段階希釈物と混合する（Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３－４５９９における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ－１２の評価に準じる）。目的とするＦａｂを次いで一晩インキュベートするが、インキュベーションは、確実に平衡に達するように、より長い期間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を捕捉プレートに移して、室温で１時間インキュベートする。次いで溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０ｕｌ／ウェルのシンチラント（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ－２０、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）でプレートを１０分間計数する。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイに使用するために選択する。
別の実施形態によれば、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００機器（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を約１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップと共に２５℃で使用する、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の使用説明書に従って、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を用いて抗原を５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）に希釈した後、５μＬ／分の流量で注入して、およそ１０応答単位（ＲＵ）のカップリングしたタンパク質を得る。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応の基をブロックする。速度論的測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、０．０５％のＴＷＥＥＮ－２０（商標）界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に２５℃でおよそ２５μＬ／分の流量で注入する。単純な１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ第３．２版）を使用して、会合センサグラム及び解離センサグラムを同時にフィッティングすることによって、会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照されたい。オン速度が、上の表面プラズモン共鳴アッセイによって１０６Ｍ－１秒－１を超える場合、オン速度は、蛍光消光技法を使用することによって決定することができる。該技法は、漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）の増加または減少を測定するものであり、ストップフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計において測定される。
別の態様では、競合アッセイを使用して、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、ＰＤ－Ｌ１への結合に関して、本明細書に記載される治療用または参照用抗体と競合するかどうかを決定することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体がＰＤ－Ｌ１への結合に関して本明細書に記載される治療用または参照用抗体と競合するかどうかを決定するために使用される競合アッセイは、フローサイトメトリーである。ある特定の実施形態では、そのような競合抗体は、ＰＤ－Ｌ１の同じエピトープ（例えば、線状または立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に示されている。一部の実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１への結合に関して、本明細書に記載される治療用または参照用抗体と競合しない。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、競合アッセイにおいて、治療用または参照用抗体のＰＤ－Ｌ１への結合を２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満ブロックするならば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１への結合に関して、本明細書に記載される治療用または参照用抗体と競合しない。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、競合アッセイにおいて、治療用または参照用抗体のＰＤ－Ｌ１への結合を２０％より多く、２５％より多く、３０％より多く、３５％より多く、４０％より多く、４５％より多く、５０％より多く、５５％より多く、６０％より多く、６５％より多く、７０％より多く、７５％より多く、８０％より多く、８５％より多く、９０％より多く、９５％より多くブロックするならば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１への結合に関して、本明細書に記載される治療用または参照用抗体と競合する。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１は、ヒトＰＤ－Ｌ１である。
例示的な競合アッセイでは、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の標識抗体（例えば、第１の標識抗ＰＤ－Ｌ１抗体）及びＰＤ－Ｌ１への結合に関して第１の抗体と競合するその能力について試験されている第２の非標識抗体（例えば、第２の非標識抗ＰＤ－Ｌ１抗体）を含む溶液中で、固定化ＰＤ－Ｌ１をインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体を含まない溶液中で、固定化ＰＤ－Ｌ１をインキュベートする。ＰＤ－Ｌ１への第１の抗体の結合を許容する条件下でのインキュベーション後に、結合していない過剰な抗体を除去し、固定化ＰＤ－Ｌ１と会合した標識の量を測定する。固定化ＰＤ－Ｌ１と会合している試験試料中の標識の量が対照試料に対して実質的に低減していれば、それは、第２の抗体がＰＤ－Ｌ１への結合に関して第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。競合アッセイは、ＰＤ－Ｌ１をトランスフェクトし、表面上に発現させた細胞を使用するＦＡＣＳで、上記のように行うこともできる。加えて、ＰＤ－Ｌ１を用いるＥＬＩＳＡも、競合アッセイに使用することができる。一部の実施形態では、競合アッセイは、フローサイトメトリーである。
Ｉｖ．抗ＰＤ－Ｌ１抗体を使用する方法
本開示のある特定の態様は、例えば、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療に対する対象の応答性を評価するために、例えばがんを有する対象からの、生体試料中のヒトＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出または定量化する方法に関する。本明細書に開示されるように、理論に縛られることを望むものではないが、生体試料中のＰＤ－Ｌ１の発現レベル、例えば、細胞の表面上に発現するヒトＰＤ－Ｌ１のレベルは、がん（例えば、ＰＤ－Ｌ１を発現するがん）の診断に、またがん療法（例えば、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での治療）に対する応答性を評価するために使用することができる。本明細書に開示されるように、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１への結合に関して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）と競合しない（実施例１及び２を参照されたい）。有利なことに、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、例えばフローサイトメトリーアッセイを使用して、アテゾリズマブなどの治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の存在下で、免疫及び腫瘍細胞からのＰＤ－Ｌ１発現を定量化するために使用することができる。これは、ＰＤ－Ｌ１クローン２９Ｅ．２３などの他の市販される抗ＰＤ－Ｌ１抗体とは対照的である。これらは、ヒト抗ＰＤ－Ｌ１への結合に関して治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）と競合し、それによって免疫及び腫瘍細胞の表面上のＰＤ－Ｌ１発現を定量化する際にそれらを使用することができない。
本開示の方法は、とりわけ、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体で治療されることになる／治療された／治療されている、がんを有する対象の投薬を調節する／調整する／決定する／選択するために、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での治療のためにがんを有する対象を選択するために、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体に対する対象の応答性を評価するために、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体で治療された、がんを有する対象の無増悪生存期間を評価するために、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体で治療された、がんを有する対象における腫瘍量を評価するために、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体で治療された、がんを有する対象におけるがんの進行を予測するために、ＰＤ－Ｌ１を発現するがんを有する対象を診断するために、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での治療に応答するがんを有する対象を診断するために、及び治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体で治療された、がんを有する対象におけるがんの進行を診断するために、使用することができる。がんの例として、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、及び／または急性骨髄性白血病を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、がんは、ＰＤ－Ｌ１を発現するがんである。
本明細書に提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれかは、生体試料中のＰＤ－Ｌ１の存在を検出するのに有用である。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれかは、生体試料中のＰＤ－Ｌ１レベルを定量化するのに有用である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれかは、免疫細胞を含む生体試料中のＰＤ－Ｌ１の存在を検出するのに有用である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれかは、腫瘍細胞を含む生体試料中のＰＤ－Ｌ１の存在を検出するのに有用である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれかは、生細胞を含む生体試料中のＰＤ－Ｌ１の存在を検出するのに有用である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれかは、生体試料中のＰＤ－Ｌ１の存在を検出するのに有用であり、ここで、生体試料は、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体で治療された対象からのものである。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれかは、例えば、フローサイトメトリー、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ及び近接伸長アッセイ）、ウエスタンブロット法、ペプチドマイクロアレイ、免疫組織化学的検査、及び／または質量分析を使用する、生体試料中のＰＤ－Ｌ１の存在を検出するのに有用である。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれかは、生体試料中のＰＤ－Ｌ１の存在を検出するのに有用であり、ここで、生体試料は血液試料である。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれかは、生体試料中のＰＤ－Ｌ１の存在を検出するのに有用であり、ここで、生体試料は骨髄試料である。
検出標識
一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、反応性部分、活性化部分、または反応性システインチオール基を通して抗体に共有結合することができる任意の標識部分にコンジュゲートされる（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０４：１４７－１５；Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｌｕｎｄｂｌａｄ Ｒ．Ｌ．（１９９１）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２ｎｄ ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）。結合した標識は、以下のように機能することができる：（ｉ）検出可能なシグナルを提供する、（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第１または第２の標識によって提供される検出可能な信号を改変して、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を生じる、（ｉｉｉ）抗原もしくはリガンドとの相互作用を安定化する、またはそれらとの結合の親和性を増大させる、（ｉｖ）電荷、疎水性、形状、もしくは他の物理的パラメータによって、移動性、例えば電気泳動移動度もしくは細胞透過性に影響を与える、または（ｖ）捕捉部分を提供して、リガンド親和性、抗体／抗原結合、もしくはイオン性錯体形成を調節する。
蛍光標識、例えば、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、フルオレセイン型（ＦＩＴＣ、５－カルボキシフルオロセイン、６－カルボキシフルオロセインが含まれる）；ローダミン型（ＴＡＭＲＡが含まれる）；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリトリン；テキサスレッド；及びこれらの類似体。蛍光標識は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（上記）に開示される技法を用いて抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光染料及び蛍光標識試薬には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）及びＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から市販されるものが含まれる。一部の実施形態では、フルオロフォアは、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）、ＰＥ－Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）、ＢＶ４２１、ＢＶ５１０、ＡＰＣ－Ｈ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）である。一部の実施形態では、フルオロフォアは、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）である。一部の実施形態では、フルオロフォアは、ＰＥ－Ｃｙ７である。一部の実施形態では、フルオロフォアは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８である。一部の実施形態では、フルオロフォアは、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）である。一部の実施形態では、フルオロフォアは、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）である。一部の実施形態では、フルオロフォアは、ＢＶ４２１である。一部の実施形態では、フルオロフォアは、ＢＶ５１０である。一部の実施形態では、フルオロフォアは、ＡＰＣ－Ｈ７である。一部の実施形態では、フルオロフォアは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７である。一部の実施形態では、フルオロフォアは、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）である
標識されたシステイン操作抗体は、診断アッセイにおいて、例えば、目的とする抗原の発現を特定の細胞、組織、または血清中に検出するのに有用であり得る。診断用途では、抗体は、典型的には検出可能な部分で標識されるであろう。多数の標識が利用可能であり、これらは一般に、以下のカテゴリーにグループ化することができる：
放射性同位体（放射性核種）、例えば、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、または２１３Ｂｉ。放射性同位体標識抗体は、受容体を標的とするイメージング実験において有用である。抗体は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，Ｃｏｌｉｇｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｐｕｂｓ．（１９９１）に記載される技法を用いて、放射性同位体金属と結合、キレート化、または錯体形成するリガンド試薬（この試薬は抗体の操作システインチオールと反応する）で標識することができる。金属イオンと錯体形成することができるキレート化リガンドとして、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＴＰＡ、及びＴＥＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）が挙げられる。放射性核種は、本発明の抗体－薬物コンジュゲートとの錯体形成を介して標的とすることができる（Ｗｕ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（９）：１１３７－１１４６）。
ＤＯＴＡ－マレイミド（４－マレイミドブチルアミドベンジル－ＤＯＴＡ）などのリンカー試薬は、Ａｘｗｏｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ（（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７（４）：１８０２－１８０７）の手順に従って、アミノベンジル－ＤＯＴＡを、クロロギ酸イソプロピル（Ａｌｄｒｉｃｈ）で活性化された４－マレイミド酪酸（Ｆｌｕｋａ）と反応させることによって調製することができる。ＤＯＴＡ－マレイミド試薬は、システイン操作抗体の遊離システインアミノ酸と反応し、抗体上に金属錯体形成リガンドをもたらす（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ． ９：７２－８６）。キレート化リンカー標識試薬、例えばＤＯＴＡ－ＮＨＳ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸モノ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）は、市販されている（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）。放射性核種標識抗体を用いた受容体標的イメージングは、腫瘍組織での抗体の進行性蓄積を検出及び定量化することによって、経路活性化のマーカーを提供することができる（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８：１２０７－１２１０）。コンジュゲートされた放射性金属は、リソソームの分解後に細胞内に残存し得る。
イメージング実験の抗体標識として適した金属－キレート錯体は、以下に開示されている：ＵＳ５，３４２，６０６；ＵＳ５，４２８，１５５；ＵＳ５，３１６，７５７；ＵＳ５，４８０，９９０；ＵＳ５，４６２，７２５；ＵＳ５，４２８，１３９；ＵＳ５，３８５，８９３；ＵＳ５，７３９，２９４；ＵＳ５，７５０，６６０；ＵＳ５，８３４，４５６；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：１４７－１５７；Ｍｅａｒｅｓ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２：６８－７８；Ｍｉｒｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：５９－６５；Ｍｅａｒｅｓ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１９９０，Ｓｕｐｐｌ．１０：２１－２６；Ｉｚａｒｄ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：３４６－３５０；Ｎｉｋｕｌａ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２２：３８７－９０；Ｃａｍｅｒａ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０：９５５－６２；Ｋｕｋｉｓ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９：２１０５－２１１０；Ｖｅｒｅｌ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４：１６６３－１６７０；Ｃａｍｅｒａ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２１：６４０－６４６；Ｒｕｅｇｇ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：４２２１－４２２６；Ｖｅｒｅｌ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４：１６６３－１６７０；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ（２００１） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：４４７４－４４８２；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４：１１０５－１１１２；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：１０３－１１１；Ｍｉｅｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４５：１２９－１３７；ＤｅＮａｒｄｏ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４：２４８３－９０；Ｂｌｅｎｄ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ １８：３５５－３６３；Ｎｉｋｕｌａ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０：１６６－７６；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９：８２９－３６；Ｍａｒｄｉｒｏｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０：６５－７４；Ｒｏｓｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，１４：２０９－２０。
様々な酵素－基質標識が、入手可能であるか、または開示されている（ＵＳ４２７５１４９）。酵素は、一般に、様々な技法を使用して測定することができる発色基質の化学変性を触媒する。例えば、酵素は、分光光度法により測定することができる基質の色の変化を触媒してもよい。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を改変してもよい。蛍光の変化を定量化するための技法は、上に記載されている。化学発光基質は、化学反応により電子的に励起状態になり、次いで（例えば、化学発光計を用いて）測定することができる光を発するかまたは蛍光アクセプターにエネルギーを供与することができる。酵素標識の例として、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；ＵＳ４，７３７，４５６）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素を抗体にコンジュゲートするための技法は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ（１９８１）“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．（ｅｄ Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ＆Ｈ．Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，７３：１４７－１６６に記載されている。酵素－基質の組み合わせの例として、例えば：（ｉ）基質として水素ペルオキシダーゼを有する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ここで、水素ペルオキシダーゼは、染料前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；（ｉｉ）発色基質としてパラ－ニトロフェニルホスフェートを有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；及び（ｉｉｉ）発色基質（例えば、ｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトシダーゼ）または蛍光発生基質４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトシダーゼを有するβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ（β－Ｄ－Ｇａｌ）が挙げられる。多数の他の酵素－基質の組み合わせが当業者に利用可能である。一般的な概説については、ＵＳ４２７５１４９及びＵＳ４３１８９８０を参照されたい。
標識は、アミノ酸側鎖、活性化アミノ酸側鎖、システイン操作抗体などに間接的にコンジュゲートされてもよい。例えば、抗体をビオチンにコンジュゲートすることができ、上述の３つの広範なカテゴリーの標識のいずれかを、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートさせることができる。逆もまた同様である。ビオチンはストレプトアビジンに選択的に結合し、よって標識は、この間接的な様式で抗体にコンジュゲートすることができる。あるいは、標識とポリペプチド変異体との間接的なコンジュゲートを達成するために、ポリペプチド変異体を、低分子ハプテン（例えば、ジゴキシン）とコンジュゲートさせ、上述の様々なタイプの標識の１種を、抗ハプテンポリペプチド変異体（例えば、抗ジゴキシン抗体）にコンジュゲートさせる。このようにして、標識とポリペプチド変異体との間接的なコンジュゲーションを達成することができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．（１９９６）ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。
検出標識は、結合または認識事象を局所決定し、可視化し、及び定量化するのに有用であり得る。本発明の標識抗体は、細胞表面受容体を検出することができる。検出可能に標識した抗体の別の使用は、ビーズに基づく免疫捕捉法であり、この方法は、ビーズを蛍光標識抗体にコンジュゲートさせ、リガンドの結合時に蛍光シグナルを検出することを含む。同様の結合検出方法論は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）作用を利用して、抗体－抗原の相互作用を測定し、検出する。
蛍光染料及び化学発光染料などの検出標識（Ｂｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ（１９９７）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏ Ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，”Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ－Ｔｒａｎｓ．１：１０５１－１０５８）は、検出可能なシグナルを提供し、一般に抗体を標識するのに適用可能であり、好ましくは以下の性質を有する：（ｉ）少量の抗体を、無細胞アッセイと細胞に基づくアッセイのいずれにおいても高感度に検出することができるように、標識抗体は、低バックグラウンドを有する極めて高いシグナルを生じるべきである；ならびに（ｉｉ）相当な光退色を伴うことなく、蛍光シグナルを観察、監視、及び記録することができるように、標識抗体は光安定性であるべきである。標識抗体の、膜または細胞表面、特に生細胞への細胞表面結合を含む用途については、標識は、好ましくは（ｉｉｉ）良好な水溶性を有して、有効なコンジュゲート濃度及び検出感受性を達成する、ならびに（ｉｖ）細胞の正常な代謝プロセスを攪乱したり、未熟な細胞死を引き起こすことがないように、生細胞に対して非毒性である。
細胞の蛍光強度の直接定量及び蛍光標識事象（例えば、ペプチド－染料コンジュゲートの細胞表面結合）の計数は、生細胞またはビーズを用いたミックスアンドリード非放射性アッセイを自動化するシステム（ＦＭＡＴ（登録商標）８１００ ＨＴＳシステム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）上で行ってもよい（Ｍｉｒａｇｌｉａ，“Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｃｅｌｌ－ａｎｄ ｂｅａｄ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ ａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，（１９９９）Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ４：１９３－２０４）。標識抗体の使用として、細胞表面受容体結合アッセイ、免疫捕捉アッセイ、蛍光結合免疫吸着アッセイ（ＦＬＩＳＡ）、カスパーゼ切断（Ｚｈｅｎｇ，“Ｃａｓｐａｓｅ－３ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｂｏｔｈ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｖｅｎｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｆａｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ”，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６１８－２３；ＵＳ６，３７２，９０７）、アポトーシス（Ｖｅｒｍｅｓ，“Ａ ｎｏｖｅｌ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｅａｒｌｙ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｌａｂｅｌｌｅｄ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ”（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：３９－５１）及び細胞毒性アッセイも挙げられる。蛍光定量的マイクロボリュームアッセイ技術は、細胞表面を標的とする分子による上方または下方制御を特定するために使用することができる（Ｓｗａｒｔｚｍａｎ“Ａ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ ａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：１４３－５１）。
本開示の標識抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、（ｉ）ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）；（ｉｉ）ＭｉｃｒｏＣＴ（コンピュータ断層撮影法）；（ｉｉｉ）ＳＰＥＣＴ（単光子放出断層撮影法）；（ｉｖ）ＰＥＴ（陽電子放出断層撮影法）Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１５：４１－４９；（ｖ）生物発光；（ｖｉ）蛍光；及び（ｖｉｉ）超音波などの、生物医学及び分子イメージングの様々な方法及び技法によるイメージングバイオマーカー及びプローブとして有用であり得る。免疫シンチグラフィーは、放射性物質で標識した抗体を動物またはヒト患者に投与し、抗体が局在化する体内の部位の画像を撮影するイメージング手順である（ＵＳ６５２８６２４）。イメージングバイオマーカーは、客観的に測定することができ、正常な生物学的プロセス、病態プロセス、または治療的介入に対する薬理学的応答の指標として評価することができる。バイオマーカーは、いくつかのタイプのものであり得る：０型は、疾患の自然経過のマーカーであり、公知の臨床指標（例えば、リウマチ性関節炎における滑膜炎症のＭＲＩ評価）と長期にわたって相関性がある；Ｉ型マーカーは、作用機序に従って（その作用機序が臨床転帰と関連付けられない場合であっても）介入の作用を捕捉する；ＩＩ型マーカーは、標的とされる応答（ＣＴによって測定されるリウマチ性関節炎における骨びらんなど）を「検証する」ための代替エンドポイントとして機能し、代替エンドポイントでは、バイオマーカーの変化またはバイオマーカーからのシグナルが、臨床的な利益を予測する。よって、イメージングバイオマーカーは、（ｉ）標的タンパク質の発現、（ｉｉ）標的タンパク質への治療剤の結合、すなわち選択性、ならびに（ｉｉｉ）クリアランス及び半減期の薬物動態データに関する、薬力学的（ＰＤ）治療情報を提供することができる。研究室ベースのバイオマーカーに対するインビボでのイメージングバイオマーカーの利点として、非侵襲的治療、定量可能、全身評価、反復投薬及び評価（すなわち、複数時点）、ならびに前臨床結果（小動物）から臨床結果（ヒト）への潜在的に転換可能な効果が挙げられる。一部の用途では、生体イメージングにより、前臨床研究における動物実験が回避されるか、または動物実験の数が最小限に抑えられる。
生体試料
ある特定の実施形態では、生体試料は、体液、例えば、全血または全血構成成分（赤血球、白血球、血小板、血清、及び血漿が含まれる）、腹水、硝子体液、リンパ液、関節液、卵胞液、精液、羊水、乳、唾液、痰、涙、汗、粘液、脳脊髄液、尿、及び体の他の構成物質である。ある特定の実施形態では、生体試料は、末梢血試料である。ある特定の実施形態では、生体試料は、骨髄試料である。ある特定の実施形態では、生体試料は、がん試料である。ある特定の実施形態では、生体試料は、腫瘍生検である。様々な実施形態では、試料は、任意の動物からの身体試料である。様々な実施形態では、試料は、ヒトからの試料である。ある特定の実施形態では、試料は、生細胞を含む。ある特定の実施形態では、試料は、免疫細胞を含む。ある特定の実施形態では、試料は、腫瘍細胞を含む。
したがって、本開示のある特定の態様は、対象から得られた生体試料中のＰＤ－Ｌ１を検出するための方法であって、生体試料を本明細書に記載される抗体または抗原結合断片に接触させるステップ、及び生体試料中のＰＤ－Ｌ１への抗体または抗原結合断片の結合を検出し、それによって生体試料中のＰＤ－Ｌ１を検出するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、フローサイトメトリー、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ及び近接伸長アッセイ）、ウエスタンブロット法、ペプチドマイクロアレイ、免疫組織化学的検査、及び／または質量分析を使用して検出される。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、フローサイトメトリーを使用して検出される。一部の実施形態では、生体試料は、血液試料である。一部の実施形態では、生体試料は、骨髄試料である。一部の実施形態では、生体試料は、細胞または組織である。一部の実施形態では、細胞または組織は、がん細胞またはがん組織である。一部の実施形態では、生体試料は、生細胞を含む。一部の実施形態では、対象は、がんを有する。一部の実施形態では、がんは、ＰＤ－Ｌ１を発現するがんである。一部の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、及び／または急性骨髄性白血病である。一部の実施形態では、生体試料は、本開示の治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片を投与された対象から得られる。一部の実施形態では、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブの３つのＨＶＲ（ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２、及びＨＶＲ－Ｈ３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、アテゾリズマブの３つのＨＶＲ（ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２、及びＨＶＲ－Ｌ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。一部の実施形態では、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブの重鎖可変領域のアミノ酸配列と、アテゾリズマブの軽鎖可変領域のアミノ酸配列とを含む。一部の実施形態では、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブの重鎖のアミノ酸配列と、アテゾリズマブの軽鎖のアミノ酸配列とを含む。一部の実施形態では、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブである。一部の実施形態では、対象はヒトである。
応答性の予測／監視／評価
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、第１の生体試料を本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗原結合断片に接触させること；第１の生体試料中のＰＤ－Ｌ１への抗体または抗原結合断片の結合を検出すること；第１の生体試料中に存在するＰＤ－Ｌ１の量を決定すること；治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片（例えば、アテゾリズマブ）での治療後に得られる第２の生体試料を本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗原結合断片に接触させること；第２の生体試料中のＰＤ－Ｌ１への抗体または抗原結合断片の結合を検出すること；第２の生体試料中に存在するＰＤ－Ｌ１の量を決定すること；第２の生体試料中に存在するＰＤ－Ｌ１の量を決定すること；及び第１の生体試料中に存在するＰＤ－Ｌ１の量を第２の生体試料中に存在するＰＤ－Ｌ１の量と比較することによる、対象におけるがん治療を監視する方法に関する。
一部の実施形態では、第１の生体試料と比較して第２の生体試料中に存在するＰＤ－Ｌ１の量が増加していれば、対象が治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での治療に応答していないことが示される。一部の実施形態では、第１の生体試料と比較して、第２の生体試料中に存在するＰＤ－Ｌ１の量が、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加していれば、対象が治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）に非応答性であることが示される。
一部の実施形態では、第１の生体試料と比較して第２の生体試料中に存在するＰＤ－Ｌ１の量が減少していれば、患者が治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での治療に応答していることが示される。一部の実施形態では、第１の生体試料と比較して、第２の生体試料中に存在するＰＤ－Ｌ１の量が、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少していれば、対象が治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）での治療に応答していることが示される。
一部の実施形態では、第１の生体試料は、対象から治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片での治療前に得られる。一部の実施形態では、第１の生体試料は、対象から治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片での治療後に得られる。一部の実施形態では、第１及び第２の生体試料は、血液試料である。一部の実施形態では、第１及び第２の生体試料は、骨髄試料である。一部の実施形態では、第１及び第２の生体試料は、細胞または組織である。一部の実施形態では、細胞または組織は、がん細胞またはがん組織である。一部の実施形態では、第１及び第２の生体試料は、生細胞を含む。一部の実施形態では、対象は、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、及び／または急性骨髄性白血病であるがんを有する。一部の実施形態では、対象は、がんを有する。一部の実施形態では、がんは、ＰＤ－Ｌ１を発現するがんである。一部の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、及び／または急性骨髄性白血病である。一部の実施形態では、生体試料は、本開示の治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片を投与された対象から得られる。一部の実施形態では、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブの３つのＨＶＲ（ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２、及びＨＶＲ－Ｈ３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、アテゾリズマブの３つのＨＶＲ（ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２、及びＨＶＲ－Ｌ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。一部の実施形態では、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブの重鎖可変領域のアミノ酸配列と、アテゾリズマブの軽鎖可変領域のアミノ酸配列とを含む。一部の実施形態では、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブの重鎖のアミノ酸配列と、アテゾリズマブの軽鎖のアミノ酸配列とを含む。一部の実施形態では、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブである。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、フローサイトメトリー、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ及び近接伸長アッセイ）、ウエスタンブロット法、ペプチドマイクロアレイ、免疫組織化学的検査、及び／または質量分析を使用して検出される。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、フローサイトメトリーを使用して検出される。一部の実施形態では、対象はヒトである。
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、がん（例えば、ＰＤ－Ｌ１を発現するがん）を有する対象の、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）での治療に対する応答性を評価、監視、または予測するための方法に関する。一部の実施形態では、該方法は、第１の時点で対象から得られる試料中のＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出すること、及び第２の時点で対象から得られる試料中のＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出することを含む。一部の実施形態では、第２の時点は、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与後である。一部の実施形態では、対象は、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体を与えられたことがない。一部の実施形態では、対象は、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での治療を受けている最中である。
一部の実施形態では、該方法は、第１の時点で対象から得られる試料中のＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出すること、治療的有効量の治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）を対象に投与すること、及び第２の時点で対象から得られる試料中のＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出することを含む。一部の実施形態では、第１の時点は、対象に治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与する前である。一部の実施形態では、第２の時点は、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与後である。一部の実施形態では、対象は、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体を与えられたことがない。一部の実施形態では、対象は、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での治療を受けている最中である。
一部の実施形態では、該方法は、第１の時点との比較したときの、第２の時点で対象から得られた試料中のＰＤ－Ｌ１の発現のレベルに基づいて、対象を治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗での治療に対して応答性または非応答性に分類することを含み、この場合、第２の時点でのＰＤ－Ｌ１の発現のレベルが減少していれば、対象が治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）での治療に応答性であるかまたはその可能性があることが示される。
一部の実施形態では、第１の時点から第２の時点までにＰＤ－Ｌ１発現のレベルが、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満減少しているか、減少していないか、または１％超、２％超、３％超、４％超、５％超、１０％超、５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、もしくは１００％超増加していれば、対象が治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）に対して非応答性であることが示される。一部の実施形態では、第１の時点から第２の時点までにＰＤ－Ｌ１発現のレベルが減少していなければ、対象が治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体に対して非応答性であることが示される。一部の実施形態では、第１の時点から第２の時点までにＰＤ－Ｌ１発現のレベルが増加していれば、対象が治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体に対して非応答性であることが示される。
一部の実施形態では、第１の時点から第２の時点までにＰＤ－Ｌ１発現のレベルが、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少していれば、対象が治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）に対して応答性であることが示される。
一部の実施形態では、応答性は、治療有効性を指すことができる。当業者であれば、治療有効性の多くの尺度、及びそれらの組み合わせが有用であり得ることを理解するであろう。一部の実施形態では、治療有効性には、腫瘍応答（例えば、腫瘍サイズ、増殖、または組織学的ステージの安定化または低減）が含まれてもよい。一部の実施形態では、治療有効性には、生存の延長（例えば、１年、５年、無再発生存、または全生存）、生活の質の向上、進行するまでの時間の延長、または病的状態の減少が含まれてもよい。そのような因子は、例えば、ロジスティック回帰分析、コックスの比例ハザード回帰、またはカプラン・マイヤー推定値などの統計手段を使用することによって評価されてもよい。
治療の継続／中断／調節
本明細書に開示されるように、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）の投与後の対象からの試料中のＰＤ－Ｌ１の発現のレベルの測定値を使用して、その後の治療、例えば、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療を継続するか、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療を中断するか、または治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療を調節するかを案内することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本開示の方法は、がん（例えば、ＰＤ－Ｌ１を発現するがん）を有する対象において治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）での治療を調節するための方法に関する。一部の実施形態では、該方法は、第１の時点で対象から得られた試料中のＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出すること、治療的有効量の治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体を対象に投与すること、第２の時点で対象から得られた試料中のＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出すること、及び第１の時点と第２の時点とのＰＤ－Ｌ１の発現のレベルの変化に基づいて、対象に投与される治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の量を調節することを含む。一部の実施形態では、第１の時点は、対象に治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与する前である。一部の実施形態では、第２の時点は、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与後である。
一部の実施形態では、対象に投与される治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の量を調節することは、対象に投与される治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体のレベルを同じに維持することを含む。
一部の実施形態では、対象に投与される治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の量を調節することは、対象に投与される治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体のレベルを増加させることを含む。対象に投与される治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体のレベルを増加させるとは、対象に投与される治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の量、投薬量、投薬回数もしくは投薬頻度、または濃度を増加させること（これらに限らない）のうちの１つまたは複数を指すことができる。
一部の実施形態では、対象に投与される治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の量を調節することは、対象に投与される治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体のレベルを減少させることを含む。対象に投与される治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体のレベルを減少させるとは、対象に投与される治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の量、投薬量、投薬回数もしくは投薬頻度、または濃度を減少させること（これらに限らない）のうちの１つまたは複数を指すことができる。
がんの進行の予測
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、がん（例えば、ＰＤ－Ｌ１を発現するがん）を有する対象において無増悪生存期間を評価するための方法に関する。一部の実施形態では、該方法は、第１の時点で対象から得られる試料中のＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出すること、治療的有効量の治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）を対象に投与すること、及び第２の時点で対象から得られる試料中のＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出することを含む。一部の実施形態では、第１の時点は、対象に治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与する前である。一部の実施形態では、第２の時点は、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与後である。
一部の実施形態では、第１の時点から第２の時点までにＰＤ－Ｌ１の発現のレベルが少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少していれば、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体が無増悪生存期間を増加させることが示される。
本明細書ではまた、ＰＤ－Ｌ１を発現するがんを有する対象においてがんの進行を予測するための方法が提供される。一部の実施形態では、該方法は、第１の時点で対象から得られる試料中のＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出すること、治療的有効量の治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）を対象に投与すること、及び第２の時点で対象から得られる試料中のＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出することを含む。一部の実施形態では、第１の時点は、対象に治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与する前である。一部の実施形態では、第２の時点は、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与後である。
一部の実施形態では、第１の時点から第２の時点までにＰＤ－Ｌ１の発現のレベルが、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満減少しているか、減少していないか、または１％超、２％超、３％超、４％超、５％超、１０％超、５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、もしくは１００％超増加していれば、対象が、進行する可能性が高いがんを有することが示される。
時点測定
本開示の方法では、がん（例えば、ＰＤ－Ｌ１を発現するがん）を有する対象において、ＰＤ－Ｌ１の発現レベルを第１の時点（例えば、ベースライン）と第２の時点との間で比較する。一部の実施形態では、対象は、ＰＤ－Ｌ１を発現するがんを有する。
一部の実施形態では、第１の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）治療前に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出する。例えば、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現レベルは、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療前に測定されてもよく、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での治療に続いて採取した１つまたは複数の試料を使用して、とりわけ、治療の有効性の監視、治療を継続するかまたは中断するかの決定、治療の調節、治療に対する応答性の監視、維持治療に対する応答性の予測、及びがん進行の予測などを行うことができる。
一部の実施形態では、第１の時点を使用して、抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の直前、またはその約１０秒前、約３０秒前、約１分前、約５分前、約１０分前、約１５分前、約３０分前、約４５分前、約１時間前、約１．５時間前、約２時間前、約２．５時間前、約３時間前、約３．５時間前、約４時間前、約４．５時間前、約５時間前、約５．５時間前、約６時間前、約７時間前、約８時間前、約９時間前、約１０時間前、約１１時間前、約１２時間前、約１８時間前、約１日前、約２日前、約３日前、約４日前、約５日前、約６日前、約１週間前、約２週間前、約３週間前、もしくは約４週間前に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第１の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約１時間前に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第１の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約４時間前に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第１の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約１日前に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第１の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約３日前に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。特定の実施形態では、治療に使用される治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブである。
一部の実施形態では、第１の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療前に対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出し、第２の時点でのＰＤ－Ｌ１の発現のレベルと比較することができる。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での治療後に対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する（例えば、第１の時点は、治療的有効量の治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の最初の投薬の前に採取して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の１回目、２回目、３回目、４回目、またはそれ以降の投薬後に、第２の時点で採取した試料と比較することができる）。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約５時間後、約６時間後、約７時間後、約８時間後、約９時間後、約１０時間後、約１１時間後、約１２時間後、約１８時間後、約１日後、約１．５日後、約２日後、約２．５日後、約３日後、約３．５日後、約４日後、約４．５日後、約５日後、約５．５日後、約６日後、約６．５日後、約１週間後、約１．５週間後、約２週間後、約２．５週間後、約３週間後、約３．５週間後、約４週間後、約１ヶ月後、約１．５ヶ月後、約２ヶ月後、約２．５ヶ月後、約３ヶ月後、約３．５ヶ月後、約４ヶ月後、約４．５ヶ月後、約５ヶ月後、約５．５ヶ月後、約６ヶ月後、約６．５ヶ月後、約７ヶ月後、約７．５ヶ月後、約８ヶ月後、約８．５ヶ月後、約９ヶ月後、約９．５ヶ月後、約１０ヶ月後、約１０．５ヶ月後、約１１ヶ月後、約１１．５ヶ月後、または約１２ヶ月後に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約１時間後に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約４時間後に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約８時間後に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約１２時間後に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約１８時間後に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約１日後に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約１．５日後に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約２日後に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約２．５日後に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約３日後に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約３．５日後に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約４日後に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約４．５日後に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約５日後に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを検出する。特定の実施形態では、治療に使用される治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブである。
一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での治療後またはそれ以降に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する（例えば、第１の時点は、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の１回目の投薬後に採取して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の２回目または３回目の投薬後に採取した試料と比較することができる）。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約５時間後、約６時間後、約７時間後、約８時間後、約９時間後、約１０時間後、約１１時間後、約１２時間後、約１８時間後、約１日後、約１．５日後、約２日後、約２．５日後、約３日後、約３．５日後、約４日後、約４．５日後、約５日後、約５．５日後、約６日後、約６．５日後、約１週間後、約１．５週間後、約２週間後、約２．５週間後、約３週間後、約３．５週間後、約４週間後、約１ヶ月後、約１．５ヶ月後、約２ヶ月後、約２．５ヶ月後、約３ヶ月後、約３．５ヶ月後、約４ヶ月後、約４．５ヶ月後、約５ヶ月後、約５．５ヶ月後、約６ヶ月後、約６．５ヶ月後、約７ヶ月後、約７．５ヶ月後、約８ヶ月後、約８．５ヶ月後、約９ヶ月後、約９．５ヶ月後、約１０ヶ月後、約１０．５ヶ月後、約１１ヶ月後、約１１．５ヶ月後、または約１２ヶ月後またはそれ以降に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約１時間後またはそれ以降に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約４時間後またはそれ以降に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約８時間後またはそれ以降に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約１２時間後またはそれ以降に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約１８時間後またはそれ以降に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約１日後またはそれ以降に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約１．５日後またはそれ以降に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約２日後またはそれ以降に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約２．５日後またはそれ以降に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約３日後またはそれ以降に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約３．５日後またはそれ以降に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約４日後またはそれ以降に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約４．５日後またはそれ以降に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。一部の実施形態では、第２の時点を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の約５日後またはそれ以降に、対象におけるＰＤ－Ｌ１の発現のレベルを測定または検出する。特定の実施形態では、治療に使用される治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブである。
ある特定の実施形態では、第１の時点と第２の時点との間のＰＤ－Ｌ１の発現のレベルの変化を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体療法に応答した疾患の進行を評価する。ある特定の実施形態では、第１の時点と第２の時点との間のＰＤ－Ｌ１の発現のレベルの変化を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体療法に応答した疾患の安定性を評価する。ある特定の実施形態では、第１の時点と第２の時点との間のＰＤ－Ｌ１の発現のレベルの変化を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体療法の投薬の継続を決定する。ある特定の実施形態では、第１の時点と第２の時点との間のＰＤ－Ｌ１の発現のレベルの変化を使用して、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での療法のコースを決定する（例えば、投薬の継続、投薬の中断、第２または第３の化学療法薬と併用した投薬、投薬の増加、投薬の減少、投薬の維持など）。特定の実施形態では、治療に使用される治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブである。
ベースラインの追加的な実施形態は、以下の通りである：ある特定の実施形態では、ベースラインとは、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）での治療前に対象から採取される試料を指す；特定の実施形態では、治療に使用される治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブである；特定の実施形態では、ベースラインは、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での任意の治療の前に採取された試料であり、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での治療後に採取された試料との比較に使用することができる（例えば、ベースラインは、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の１回目の投薬前に採取され、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の１回目、２回目、３回目、４回目、またはそれ以降の投薬後に採取された試料と比較することができる）；また特定の実施形態では、ベースラインは、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での任意の所与の治療前に採取された試料であり、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体での治療以降に採取された試料との比較に使用することができる（例えば、ベースラインは、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の１回目の投薬後に採取され、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体の２回目または３回目の投薬後に採取された試料と比較することができる）。
Ｖ．キット
本発明のアッセイ方法は、キットの形態で提供することができる。一実施形態では、そのようなキットは、本明細書に記載される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む組成物を含む。一部の実施形態では、そのようなキットは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びこれらの試薬を使用してアッセイを行う方法についての使用説明書からなる基本的な要素を含む組み合わせを包装したものである。これらの基本的な要素は、上文に定義されている。
キットは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体用の固体支持体をさらに含んでもよく、それは、別々の要素として提供されても、またはその上に抗ＰＤ－Ｌ１抗体が既に固定化されていてもよい。
キットは、他の添加剤、例えば、安定剤、洗浄及びインキュベーション緩衝液なども含有してもよい。
キットの構成成分は、様々な試薬の相対量を適切に変えて試薬の溶液中濃度がアッセイの感度を実質的に最大限にするようにした、所定の比率で提供されてもよい。特に、試薬は、賦形剤を含む乾燥粉末（通常、凍結乾燥されたもの）として提供されてもよく、それは、溶解時に、試験しようとする試料と合わせるのに適した濃度を有する試薬溶液をもたらす。
以下の実施例は、例証のみを目的として含まれており、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１：抗ＰＤ－Ｌ１抗体クローン１４Ｄ３の特性の評価
クローン１４Ｄ３は、アテゾリズマブとして公知のモノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体に非競合的な、特異的なクローンである。１４Ｄ３は、ＩｇＧ１アイソタイプ及びカッパ軽鎖を有するマウス抗体である。１４Ｄ３を生成する免疫源はＭＯＬＭ－１巨核球細胞株であり、ヒトＰＤ－Ｌ１だけでなくカニクイザルＰＤ－Ｌ１とも交差反応性である。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体である抗体１４Ｄ３の競合及び非競合特性を、市販される抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体に対して評価した。
方法
抗体
２つの市販される抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体のＰＤ－Ｌ１結合特性を、抗ＰＤ－Ｌ１ １４Ｄ３抗体のＰＤ－Ｌ１結合特性と比較した。２つのバージョンの１４Ｄ３抗体を比較研究で使用した。一方のバージョンは、本明細書では抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ １４Ｄ３と呼ぶ、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識されたものであり、他方のバージョンは、本明細書では抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦ６４７ １４Ｄ３と呼ぶ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（登録商標）（ＡＦ６４７）で標識されたものであった。市販の抗体は、本明細書では抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ ２９Ｅ．２３と呼ぶ、ＰＥで標識された抗ＰＤ－Ｌ１抗体クローン２９Ｅ．２３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及び本明細書では抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＰＣ ２９Ｅ．２３と呼ぶ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識された抗ＰＤ－Ｌ１抗体クローン２９Ｅ．２３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）であった。
血液刺激
約４ｍＬ～５ｍＬの全血を健常なヒト対象から得て、抗凝固薬としてヘパリンナトリウムを有するバキュテナーチューブに入れた。２本の１５ｍＬのコニカルチューブを用意し、次のようにラベルを付けた：１）刺激していない血液；及び２）刺激した血液。各チューブに３ｍＬの健常な血液を充填した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃによれば、全血１ｍＬ当たり２０ｕＬを使用することが推奨されている。したがって、３ｍＬの全血を含有するチューブに、６０μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）をチューブ１（本発明者らの非刺激チューブ）に添加し、６０μｌのＣｙｔｏＳｔｉｍ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）をチューブ２に添加した。チューブ上のキャップを緩く締めて、酸素及びＣＯ２がチューブへ流入及び流出できるようにした。チューブを３７℃のＣＯ２インキュベーターに２４時間入れた。
アテゾリズマブでのブロッキング
５ｍＬの丸底試験管を４組用意し、以下のようにグループ化した：１）刺激及び薬物なし；２）刺激＋薬物；３）非刺激及び薬物なし；ならびに４）非刺激＋薬物。刺激ステップ中で血液試料を２４時間インキュベートした後、刺激した血液１００μＬをグループ１及びグループ２の各試験管に添加し、一方、刺激していない血液１００μＬをグループ３及びグループ４の各試験管に添加した。
アテゾリズマブは、アッセイのブロッキング部分のための薬物として機能する。この薬物を調製するために、１００μｇ／ｍＬの濃度のアテゾリズマブ２μＬを１８μＬのＰＢＳに添加して１：１０に希釈した。「＋薬物」（すなわち、グループ２及びグループ４）とラベルを付けた試験管については、希釈したアテゾリズマブ１．６μｌを各試験管に添加した。「薬物なし」（すなわち、グループ１及びグループ３）とラベルを付けた試験管には、１．６μＬのＰＢＳを与えた。試験管をボルテックスによってよく混合し、次いで暗所中室温で３０分間インキュベートした。
表面マーカー染色
５種の表面マーカーのカクテルを調製した（表２）。
Figure 0007402158000002
薬物（すなわち、アテゾリズマブ）またはＰＢＳとのインキュベーション後に、表面マーカーのカクテルを、抗ＰＤ－Ｌ１を含むまたは含まない、刺激したまたは刺激していない血液を含有する各試験管に添加した（表２）。指示量のカクテルを添加した後、指示量のＰＢＳを添加して、カクテルの総量を１００μＬにした（表３）。次いで試験管を暗所中室温で３０分間インキュベートした。
Figure 0007402158000003
生細胞または死細胞の染色
Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温にした。このキットは、近赤外線蛍光反応染料及びＤＭＳＯを含んでいた。１×のＰｈａｒｍ Ｌｙｓｅは、１０ｍＬの１０× Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を９０ｍＬの蒸留水中に混合することによって作製した。細胞を試験管中で表面染色した後、試験管をボルテックスし、３ｍＬの１× Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅを各試験管に添加した。試験管を再びボルテックスして、Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅの存在下での細胞の溶解を強化した。次いで試験管を暗所中室温で１５分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、試験管を３００ＲＣＦ／１５００～１６００ＲＰＭで５分間遠心分離した。遠心分離後、細胞ペレットを乱さずに上清をできる限り吸引した。次いで各試験管の底を軽くたたいて細胞ペレットを壊し、その後細胞を３ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。試験管を３００ＲＣＦ／１５００～１６００ＲＰＭで５分間、もう一回遠心分離した。次いで上清を前回と同じように細胞ペレットを乱さずに吸引した。各試験管の底を軽くたたいて細胞ペレットを壊し、１ｍＬのＰＢＳを各試験管に添加した。試験管を選択して、ＢｉｏＲａｄ ＴＣ２０セルカウンターを使用して細胞計数を行った。細胞計数が試験管中でＰＢＳ１ｍＬ当たり生細胞２００万個を上回った場合、濃度を１ｍＬ当たり生細胞１００万個に調整し、ＰＢＳを使用して適宜希釈した。キットからのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染料は、５０μＬのＤＭＳＯを近赤外線蛍光反応染料チューブに添加し、続いて混合することによって調製した。１μＬの量のＬｉｖｅ－Ｄｅａｄ染料を各試験管に添加し、よく混合した。試験管を暗所中室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞を２ｍＬのＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ ＦＢＳ中で洗浄し、続いて３００ＲＣＦ／１５００～１６００ＲＰＭで５分間遠心分離した。細胞ペレットを乱さずに上清をできる限り吸引した。１％パラホルムアルデヒドの溶液は、３ｍＬの１６％パラホルムアルデヒドを４５ｍＬのＰＢＳに添加することによって調製した。各試験管の底を軽くたたいて細胞ペレットを壊し、２５０μＬの１％パラホルムアルデヒドを各試験管に添加した後、試験管をボルテックスした。調製を終了してから４時間以内に試験管試料からＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でシグナルを取得した。
コンペンセーションコントロールを作製した（表４）。コンペンセーションコントロールを作製するために、以下を含有するように９本の５ｍＬ丸底チューブを作製した：１）対照チューブ－染色なし；２）ＡＦ４８８／ＦＩＴＣ；３）ＰＥ；４）ＰｅｒＣＰ；５）ＰＥ－Ｃｙ７；６）ＡＦ６４７／ＡＰＣ；７）ＢＶ４２１；８）ＢＶ５１０；及び９）ＡＰＣ－Ｈ７。一滴のＵｌｔｒａＣｏｍｐ ｅＢｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各チューブに添加した。示した抗体を示した容量で添加した（表３）。コンペンセーションコントロールを暗所中室温で１５～２０分間インキュベートした。次いでチューブを３ｍＬのＢＤ ＦＢＳで洗浄した後、３００ＲＣＦ／１５００～１６００ＲＰＭで５分間遠心分離した。ビーズペレットを乱さずに上清をできる限り吸引した。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩで取得するための準備として、１００μＬの量のＢＤ ＦＢＳを各コンペンセーションコントロールチューブに添加した。
Figure 0007402158000004
結果
アテゾリズマブが存在したとき、市販の抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ ２９Ｅ．２３抗体で染色された細胞ではＰＤ－Ｌ１の表面発現検出のレベルが減少したことが観察された。具体的には、フローサイトメトリーによる結合分析から、健常なドナーからの刺激された血液中のＣＤ４＋Ｔ細胞（図２Ａ及び図３Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図４Ａ及び図５Ａ）、及びＣＤ１９Ｂ細胞（図６Ａ及び図７Ａ）によって発現されるＰＤ－Ｌ１への結合に関して、市販の抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ ２９Ｅ．２３抗体が、アテゾリズマブと競合することが判明した。同様の結合結果が、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図８Ａ及び図９Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１０Ａ及び図１１Ａ）、及びＣＤ１９Ｂ細胞（図１２Ａ及び図１３Ａ）において市販の抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＰＣ ２９Ｅ．２３抗体を利用するアッセイで観察された。
対照的に、抗ＰＤ－Ｌ１ ＰＥ １４Ｄ３抗体は、健常なドナーからの刺激された血液中のＣＤ４＋Ｔ細胞（図２Ｂ及び図３Ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図４Ｂ及び図５Ｂ）、及びＣＤ１９Ｂ細胞（図６Ｂ及び図７Ｂ）によって発現されるＰＤ－Ｌ１への結合に関して、アテゾリズマブと競合しなかった。これらの結果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図８Ｂ及び図９Ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１０Ｂ及び図１１Ｂ）、及びＣＤ１９Ｂ細胞（図１２Ｂ及び図１３Ｂ）におけるＡＦ６４７標識抗ＰＤ－Ｌ１ １４Ｄ３抗体（すなわち、抗ＰＤ－Ｌ１ ＡＦ６４７ １４Ｄ３抗体）にも及んだ。
ＰＥ（図１４）またはＡＦ６４７（図１５）で標識された抗ＰＤ－Ｌ１ １４Ｄ３抗体が、アテゾリズマブの存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ１９Ｂ細胞上のＰＤ－Ｌ１に結合する能力が、刺激されていない健常な血液での結合と比較して、刺激された健常な血液で観察される。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ１９Ｂ細胞上のＰＤ－Ｌ１への結合に関する、ＡＰＣで標識された抗ＰＤ－Ｌ１ ２９Ｅ．２３抗体（図１６）とアテゾリズマブとの競合が、刺激されていない健常な血液での結合と比較して、刺激された健常な血液で見ることができる。
結論
これらの結果から、１４Ｄ３抗体は、アテゾリズマブの飽和濃度であると予想されるレベルであっても、アテゾリズマブと競合しないことが示される。標識された１４Ｄ３抗体を使用すれば、アテゾリズマブが存在していても、免疫及び腫瘍細胞（例えば、生きている免疫及び腫瘍細胞）の表面上のＰＤ－Ｌ１発現を定量化できることが、フローサイトメトリーアッセイなどの検出アッセイにおいて判明した。しかしながら、ＰＤ－Ｌ１クローン２９Ｅ．２３などの他の市販される抗体は、アテゾリズマブと競合し、それによって免疫及び腫瘍細胞におけるＰＤ－Ｌ１の定量化に最適な試薬としてのそれらの使用が妨げられる。
実施例２：抗ＰＤ－Ｌ１ １４Ｄ３抗体を使用する、多発性骨髄腫におけるＰＤ－Ｌ１発現の評価
１４Ｄ３を、血液悪性腫瘍、特に、多発性骨髄腫を有する患者におけるＰＤ－Ｌ１の発現を検出するその能力について評価した。
方法
多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する患者から新鮮な骨髄及び新鮮な全血を収集した。試料は、健常な対象からも収集した。実施例１に記載されるように、骨髄及び全血をヘパリン化し、抗ＰＤ－Ｌ１ １４Ｄ３抗体を含めて表面マーカーを染色した。
結果
抗ＰＤ－Ｌ１ １４Ｄ３抗体は、ＰＤ－１チェックポイント阻害剤で治療されていない多発性骨髄腫を有する患者から収集された骨髄及び全血中のＰＤ－Ｌ１の存在を検出することができた（図１７）。
結論
１４Ｄ３抗体は、多発性骨髄腫などの血液悪性腫瘍と診断された患者の末梢血を循環する免疫細胞ならびに血液及び骨髄からの悪性細胞によって発現されるＰＤ－Ｌ１のベースライン検出に使用することができる。
実施例３：抗ＰＤ－Ｌ１ １４Ｄ３抗体を使用する、急性骨髄性白血病及び骨髄異形成症候群におけるＰＤ－Ｌ１発現の評価
１４Ｄ３を、血液悪性腫瘍、特に、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を有する患者におけるＰＤ－Ｌ１の発現を検出するその能力について評価した。
方法
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を有する患者から新鮮な骨髄及び新鮮な全血を収集する。試料は、健常な対象からも収集する。実施例１に記載されるように、骨髄及び全血をヘパリン化し、抗ＰＤ－Ｌ１ １４Ｄ３抗体を含めて表面マーカーを染色する。
実施例４：血液悪性腫瘍を有し、アテゾリズマブで治療された対象におけるＰＤ－Ｌ１発現の評価
１４Ｄ３抗体はアテゾリズマブのエピトープと競合しないので、１４Ｄ３抗体は、治療的処置の有効性を監視するために、アテゾリズマブを投薬された患者においてＰＤ－Ｌ１発現を検出するその能力について評価される。
方法
多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または骨髄異形成症候群（ＭＳＤ）を含めた血液悪性腫瘍を有する患者を、骨髄及び血液試料中のＰＤ－Ｌ１のベースライン発現について評価する。実施例２に記載されるように、試料を収集し、処理する。ＰＤ－Ｌ１発現は、ＰＥなどの検出可能な標識に連結された抗ＰＤ－Ｌ１ １４Ｄ３抗体での染色によって決定される。試料をフローサイトメトリーに供して、患者におけるＰＤ－Ｌ１のベースライン発現を決定する。患者は、血液悪性腫瘍の治療に適した投与計画でアテゾリズマブを用いて治療される。血液及び骨髄試料は、アテゾリズマブでの治療後の一時点または様々な時点で収集される。試料は上記のように処理され、検出可能な標識（例えば、ＰＥ）に連結された抗ＰＤ－Ｌ１ １４Ｄ３抗体で染色される。生きている免疫細胞及び／または腫瘍細胞などの細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現は、フローサイトメトリーによって標識された抗ＰＤ－Ｌ１ １４Ｄ３抗体を検出することによって決定されたときに、治療された患者から決定される。

Claims (30)

  1. 配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と
    を含む、単離された抗ＰＤ－Ｌ１抗体、またはその抗原結合断片。
  2. 前記抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
  3. ヒトＰＤ－Ｌ１への結合に関して参照用抗体と競合せず、前記参照用抗体が、
    （ａ） 以下を含む重鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号１１）を含むＨＶＲ－Ｈ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）を含むＨＶＲ－Ｈ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号１３）を含むＨＶＲ－Ｈ３；ならびに
    （ｂ） 以下を含む軽鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１４）を含むＨＶＲ－Ｌ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号１５）を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号１６）を含むＨＶＲ－Ｌ３
    を含む、請求項１または２に記載の抗体または抗原結合断片。
  4. 前記参照用抗体が、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項３に記載の抗体または抗原結合断片。
  5. 前記参照用抗体が、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項４に記載の抗体または抗原結合断片。
  6. ある部分に連結された、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
  7. 前記部分が検出可能な部分である、請求項６に記載の抗体または抗原結合断片。
  8. 前記検出可能な部分が、ビオチン、ストレプトアビジン、発光剤、酵素、フルオロフォア、染料、放射性標識、発色団、金属イオン、金粒子、銀粒子、磁性粒子、ポリペプチド、またはオリゴヌクレオチドである、請求項７に記載の抗体または抗原結合断片。
  9. 前記検出可能な部分がフルオロフォアである、請求項７に記載の抗体または抗原結合断片。
  10. 前記フルオロフォアが、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）、ＰＥ－Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）、ＢＶ４２１、ＢＶ５１０、ＡＰＣ－Ｈ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）である、請求項９に記載の抗体または抗原結合断片。
  11. 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片をコードする、単離された核酸。
  12. 請求項１１に記載の核酸を含む、ベクター。
  13. 発現ベクターである、請求項１２に記載のベクター。
  14. 請求項１３に記載の核酸を含む、宿主細胞。
  15. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、請求項１４に記載の宿主細胞を、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片の産生に適した条件下で培養することを含む、前記方法。
  16. 前記宿主細胞によって産生された抗ＰＤ－Ｌ１抗体、またはその抗原結合断片を回収することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 対象から得られた生体試料中のＰＤ－Ｌ１を検出するための方法であって、
    （ａ）前記生体試料を、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片に接触させること；及び
    （ｂ）前記生体試料中のＰＤ－Ｌ１への前記抗体または抗原結合断片の結合を検出し、それによって前記生体試料中のＰＤ－Ｌ１を検出すること
    を含む、前記方法。
  18. 前記抗体または抗原結合断片が、フローサイトメトリーを使用して検出される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記生体試料が、血液試料である、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. 前記生体試料が、骨髄試料である、請求項１７または１８に記載の方法。
  21. 前記生体試料が、細胞または組織である、請求項１７または１８に記載の方法。
  22. 前記細胞または組織が、がん細胞またはがん組織である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記生体試料が、生細胞を含む、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記対象が、がんを有する、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記がんが、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、及び急性骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記生体試料が、治療用抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片を投与された対象から得られ、前記治療用抗体またはその抗原結合断片が、
    （ａ） 以下を含む重鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨ（配列番号１１）を含むＨＶＲ－Ｈ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）を含むＨＶＲ－Ｈ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＲＨＷＰＧＧＦＤＹ（配列番号１３）を含むＨＶＲ－Ｈ３；ならびに
    （ｂ） 以下を含む軽鎖可変領域：
    （ｉ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１４）を含むＨＶＲ－Ｌ１；
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号１５）を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び
    （ｉｉｉ）アミノ酸配列ＱＱＹＬＹＨＰＡＴ（配列番号１６）を含むＨＶＲ－Ｌ３
    を含む、請求項１７～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記治療用抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記治療用抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を含む組成物。
  30. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体または請求項２９に記載の組成物を含む、生体試料中のＰＤ－Ｌ１を検出するためのキット。
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