KR20200090823A - 항-pd-l1 항체 및 pd-l1 탐지를 위하여 동일한 항체를 이용하는 방법 - Google Patents

항-pd-l1 항체 및 pd-l1 탐지를 위하여 동일한 항체를 이용하는 방법 Download PDF

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KR20200090823A
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seq
antigen
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도리스 김
테렌스 웡
아난 춘타라파이
세리 루이스 그린
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 출원은 항-PD-L1 항체 및 대상으로부터 획득된 샘플에서 PD-L1을 탐지하는데 이를 사용하는 용도에 관계한다. 일부 구체예들에서, 상기 대상은 치료요법적 항-PD-L1 항체으로 치료를 받았으며, 본원에서 기술된 항-PD-L1은 PD-L1로의 결합에 있어서 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체와 경쟁하지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 항체는 탐지가능한 모이어티, 이를 테면 형광단에 연계되며, 상기 항-PD-L1 항체는 유동 세포측정을 이용하여 대상에서 PD-L1을 탐지하는데 이용된다.

Description

항-PD-L1 항체 및 PD-L1 탐지를 위하여 동일한 항체를 이용하는 방법
관련된 출원
본 출원은 2017년 11월 30일자로 제출된 미국 가출원 번호 62/593,125를 우선권으로 주장하며, 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
ASCII 텍스트 화일로 서열 목록 제출
ASCII 텍스트 파일로 다음과 같이 제출된 내용은 전체 내용이 본원에 참조자료로 편입된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 형태 (CRF)(화일명: 146392040140SEQLIST.TXT, 기록일: 2018년 11월 9일, 크기: 20 KB).
발명의 분야
본 발명은 항-PD-L1 항체 및 PD-L1 탐지를 위하여 동일한 항체를 이용하는 방법에 관계한다.
발명의 배경
T 세포 기능장애 또는 무력증(anergy)은 억제성 수용체, 예정된 사멸 1 폴리펩티드 (PD-1)의 유도된 그리고 지속적인 발현과 동시에 발생되는 것으로 밝혀졌다. 그 결과, 치료요법적 PD-1 및 PD-1과의 상호작용을 통하여 신호를 발생시키는 다른 분자들을 표적화하는 것, 이를 테면, 예정된 사멸 리간드 1 (PD-L1)이 강력한 관심분야다. PD-L1 신호 전달의 억제는 암 (가령, 종양 면역)의 치료를 위한 T 세포 면역성을 향상시키는 수단으로서 입증되었다. 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체를 이용하는 요법이 개발되었고, 상이한 유형의 암을 치료하는데 이용되어 왔다. 예를 들면, U.S. 특허 제8,217,149호 참고.
치료요법적 항-PD-L1 항체로 치료를 받았던 대상의 생물학적 샘플에서 PD-L1을 검출하는 것이 당업계에 필요하다. 본 발명은 치료요법적 항-PD-L1 항체와 PD-L1에의 결합을 경쟁하지 않고, 특이적으로 PD-L1을 탐지하는 항-PD-L1 항체를 제공한다. 이들 항체는 예를 들면, 치료요법적 항-PD-L1 항체로 치료를 받았던 대상에서 암 치료를 모니터링하는데 유용하다.
본 발명의 요약
한 측면에서, 본 발명은 단리된 항-PD-L1 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 이때 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 TSWMN (서열 번호:1)을 포함하는 HVR-H1;
(ii) 아미노산 서열 RIYPRDGDTYYNGKFKD (서열 번호:2)을 포함하는 HVR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 NPGGYYFDY (서열 번호:3)을 포함하는 HVR-H3; 및
(b) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 RASQDIHTYLN (서열 번호:4)을 포함하는 HVR-L1;
(ii) 아미노산 서열 YTSRLHS (서열 번호:5)을 포함하는 HVR-L2; 및
(iii) 아미노산 서열 QQVSSLPPWT (서열 번호:6)을 포함하는 HVR-L3.
일부 구체예들에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항체는 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 PD-L1에로의 결합에 대하여 기준 항체와 경쟁하지 않으며, 이때 상기 기준 항체는 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 GFTFSDSWIH (서열 번호:11)을 포함하는 HVR-H1;
(ii) 아미노산 서열 AWISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:12)을 포함하는 HVR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 RHWPGGFDY (서열 번호:13)을 포함하는 HVR-H3; 및
(b) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 번호:14)을 포함하는 HVR-L1;
(ii) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 번호:15)을 포함하는 HVR-L2; 및
(iii) 아미노산 서열 QQYLYHPAT (서열 번호:16)을 포함하는 HVR-L3.
일부 구체예들에서, 상기 기준 항체는 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 기준 항체는 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 모이어티(moiety)에 연계된다. 일부 구체예들에서, 상기 모이어티는 탐지가능한 모이어티다. 일부 구체예들에서, 상기 탐지가능한 모이어티는 바이오틴, 스트렙타아비딘, 발광제, 효소, 형광단, 염료, 방사성 표지, 발색단, 금속 이온, 금 입자, 은 입자, 자성 입자, 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구체예들에서, 상기 탐지가능한 모이어티는 형광단이다. 일부 구체예들에서, 상기 형광단은 R-피코에리트린 (PE), PE-Cy7, Alexa Fluor 488, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 페리디닌 클로로필 단백질 복합체 (PerCP), BV421, BV510, APC-H7, Alexa Fluor 647 또는 알로피코시아닌 (APC)이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 벡터는 발현 벡터다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본원에 기재된 숙주 세포를 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 만드는데 적합한 조건하에서 배양하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 상기 숙주 세포에 의해 만들어진 항-PD-L1 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 것을 더 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상으로부터 수득한 생물학적 샘플 안에 PD-L1을 탐지하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 상기 생물학적 샘플에 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편을 접촉시키고; 및 (b) 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 상기 생물학적 샘플 안에 있는 PD-L1에 결합하는 지를 탐지하고, 이로써 상기 생물학적 샘플 안에 PD-L1을 탐지한다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 유동 세포측정(flow cytometry)을 이용하여 탐지된다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈액 샘플이다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 골수 샘플이다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 세포 또는 조직이다. 일부 구체예들에서, 상기 세포 또는 조직은 암 세포 또는 암 조직이다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 살아있는 세포를 포함한다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 대상은 암을 가지고 있다. 일부 구체예들에서, 상기 암은 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 및 급성 골수성 백혈병으로 구성된 군에서 선택된다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 치료요법적 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여받았던 대상으로부터 획득되며, 이때 상기 치료요법적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 GFTFSDSWIH (서열 번호:11)을 포함하는 HVR-H1;
(ii) 아미노산 서열 AWISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:12)을 포함하는 HVR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 RHWPGGFDY (서열 번호:13)을 포함하는 HVR-H3; 및
(b) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 번호:14)을 포함하는 HVR-L1;
(ii) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 번호:15)을 포함하는 HVR-L2; 및
(iii) 아미노산 서열 QQYLYHPAT (서열 번호:16)을 포함하는 HVR-L3.
일부 구체예들에서, 상기 치료요법적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 치료요법적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 대상은 인간이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상에게서 암 치료를 모니터링하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 제 1 생물학적 샘플에 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편을 접촉시키고; (b) 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 제 1 생물학적 샘플 안에 PD-L1에 결합을 탐지하고; (c) 상기 제 1 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양을 결정하고; (d) 제 2 생물학적 샘플에 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편을 접촉시키고, 이때 상기 제 2 생물학적 샘플은 치료요법적 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 처리한 후 획득되며; (e) 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 상기 제 2 생물학적 샘플 안의 PD-L1에 결합을 탐지하고; (f) 상기 제 2 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양을 결정하고; (g) 상기 제 1 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양과 상기 제 2 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양을 비교한다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 생물학적 샘플과 비교하였을 때, 상기 제 2 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양의 증가는 상기 환자가 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료에 반응하지 않음을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 생물학적 샘플과 비교하였을 때, 상기 제 2 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양의 감소는 상기 환자가 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료에 반응한다는 것을 나타낸다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 제 1 생물학적 샘플은 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 상기 대상을 치료하기 전에 획득된다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 제 1 생물학적 샘플은 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 상기 대상을 치료한 후 획득된다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 생물학적 샘플은 혈액 샘플이다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 생물학적 샘플은 골수 샘플이다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 생물학적 샘플은 세포 또는 조직이다. 일부 구체예들에서, 상기 세포 또는 조직은 암 세포 또는 암 조직이다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 생물학적 샘플은 살아있는 세포를 포함한다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 대상은 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 및 급성 골수성 백혈병으로 구성된 군에서 선택된 암을 가지고 있다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 치료요법적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 GFTFSDSWIH (서열 번호:11)을 포함하는 HVR-H1;
(ii) 아미노산 서열 AWISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:12)을 포함하는 HVR-H2; 및
(iii) 아미노산 서열 RHWPGGFDY (서열 번호:13)을 포함하는 HVR-H3; 및
(b) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(i) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 번호:14)을 포함하는 HVR-L1;
(ii) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 번호:15)을 포함하는 HVR-L2; 및
(iii) 아미노산 서열 QQYLYHPAT (서열 번호:16)을 포함하는 HVR-L3.
일부 구체예들에서, 상기 치료요법적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 치료요법적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 항-PD-L1 항체 또는 항원-결합 단편은 유동 세포측정을 이용하여 탐지된다. 본원의 임의의 구체예들중 일부에 있어서, 상기 대상은 인간이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 상기 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본원에 기재된 조성물을 포함하는 생물학적 샘플 안에서 PD-L1을 탐지하는 키트를 제공한다.
도 1a 및 1b는 가장 근접하게 매칭되는 마우스 생식선에 대하여 a) 14D3 항-PD-L1의 중쇄 가변 영역 (서열 번호:7), 및 b) 14D3 항-PD-L1 (서열 번호:8)의 경쇄 가변 영역 사이에 서열 정렬을 나타낸 도표다(도 1a에서 서열 번호:21 및 도 1b에서 서열 번호:22).
도 2a 및 2b는 건강한 인간 증여자로부터 획득한 혈액내 PD-L1+ CD4+ T 세포의 정중 형광 강도 (MFI)를 보여주는 그래프이며, a)는 CytoStim®(Miltenyi Biotec)로 자극한 후, 아테졸리주맙(Atezolizumab) 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 PE 29E.23으로 착색된 것이며; 또는 b)는 CytoStim®로 자극 한 후, 아테졸리주맙(Atezolizumab) 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 PE 14.D3으로 착색된 것이다. FMO는 형광에서 하나의 음성 게이팅 대조군을 뺀 것을 나타낸다.
도 3a 및 3b는 건강한 인간 증여자로부터 획득한 혈액내 PD-L1+ CD4+ T 세포의 백분율(%)을 보여주는 그래프이며, a)는 CytoStim®로 자극한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 PE 29E.23으로 착색된 것이며; 또는 b)는 CytoStim®로 자극 한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 PE 14.D3으로 착색된 것이다. FMO는 형광에서 하나의 음성 게이팅 대조군을 뺀 것을 나타낸다.
도 4a 및 4b는 건강한 인간 증여자로부터 획득한 혈액내 PD-L1+ CD8+ T 세포의 정중 형광 강도 (MFI)를 보여주는 그래프이며, a)는 CytoStim®로 자극한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 PE 29E.23으로 착색된 것이며; 또는 b)는 CytoStim®로 자극 한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 PE 14.D3으로 착색된 것이다. FMO는 형광에서 하나의 음성 게이팅 대조군을 뺀 것을 나타낸다.
도 5a 및 5b는 건강한 인간 증여자로부터 획득한 혈액내 PD-L1+ CD8+ T 세포의 백분율(%)을 보여주는 그래프이며, a)는 CytoStim®로 자극한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 PE 29E.23으로 착색된 것이며; 또는 b)는 CytoStim®로 자극 한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 PE 14.D3으로 착색된 것이다. FMO는 형광에서 하나의 음성 게이팅 대조군을 뺀 것을 나타낸다.
도 6a 및 6b는 건강한 인간 증여자로부터 획득한 혈액내 PD-L1+ CD19 B세포의 정중 형광 강도 (MFI)를 보여주는 그래프이며, a)는 CytoStim®로 자극한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 PE 29E.23으로 착색된 것이며; 또는 b)는 CytoStim®로 자극 한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 PE 14.D3으로 착색된 것이다. FMO는 형광에서 하나의 음성 게이팅 대조군을 뺀 것을 나타낸다.
도 7a 및 7b는 건강한 인간 증여자로부터 획득한 혈액내 PD-L1+ CD19 B 세포의 백분율(%)을 보여주는 그래프이며, a)는 CytoStim®로 자극한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 PE 29E.23으로 착색된 것이며; 또는 b)는 CytoStim®로 자극 한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 PE 14.D3으로 착색된 것이다. FMO는 형광에서 하나의 음성 게이팅 대조군을 뺀 것을 나타낸다.
도 8a 및 8b는 건강한 인간 증여자로부터 획득한 혈액내 PD-L1+ CD4+ T 세포의 정중 형광 강도 (MFI)를 보여주는 그래프이며, a)는 CytoStim®로 자극한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 APC 29E.23으로 착색된 것이며; 또는 b)는 CytoStim®로 자극 한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 AF647 14.D3으로 착색된 것이다. FMO는 형광에서 하나의 음성 게이팅 대조군을 뺀 것을 나타낸다.
도 9a 및 9b는 건강한 인간 증여자로부터 획득한 혈액내 PD-L1+ CD4+ T 세포의 백분율(%)을 보여주는 그래프이며, a)는 CytoStim®로 자극한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 APC 29E.23으로 착색된 것이며; 또는 b)는 CytoStim®로 자극 한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 AF647 14.D3으로 착색된 것이다. FMO는 형광에서 하나의 음성 게이팅 대조군을 뺀 것을 나타낸다.
도 10a 및 10b는 건강한 인간 증여자로부터 획득한 혈액내 PD-L1+ CD8+ T 세포의 정중 형광 강도 (MFI)를 보여주는 그래프이며, a)는 CytoStim®로 자극한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 APC 29E.23으로 착색된 것이며; 또는 b)는 CytoStim®로 자극 한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 AF647 14.D3으로 착색된 것이다. FMO는 형광에서 하나의 음성 게이팅 대조군을 뺀 것을 나타낸다.
도 11a 및 11b는 건강한 인간 증여자로부터 획득한 혈액내 PD-L1+ CD8+ T 세포의 백분율(%)을 보여주는 그래프이며, a)는 CytoStim®로 자극한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 APC 29E.23으로 착색된 것이며; 또는 b)는 CytoStim®로 자극 한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 AF647 14.D3으로 착색된 것이다. FMO는 형광에서 하나의 음성 게이팅 대조군을 뺀 것을 나타낸다.
도 12a 및 12b는 건강한 인간 증여자로부터 획득한 혈액내 PD-L1+ CD19 B 세포의 정중 형광 강도 (MFI)를 보여주는 그래프이며, a)는 CytoStim®로 자극한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 APC 29E.23으로 착색된 것이며; 또는 b)는 CytoStim®로 자극 한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 AF647 14.D3으로 착색된 것이다. FMO는 형광에서 하나의 음성 게이팅 대조군을 뺀 것을 나타낸다.
도 13a 및 13b는 건강한 인간 증여자로부터 획득한 혈액내 PD-L1+ CD19 B 세포의 백분율(%)을 보여주는 그래프이며, a)는 CytoStim®로 자극한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 APC 29E.23으로 착색된 것이며; 또는 b)는 CytoStim®로 자극 한 후, 아테졸리주맙 부재 하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에 (+약물) 항-PD-L1 AF647 14.D3으로 착색된 것이다. FMO는 형광에서 하나의 음성 게이팅 대조군을 뺀 것을 나타낸다.
도 14a-c는 건강한 증여자로부터 획득되고, 그리고 아테졸리주맙 부재하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재하에(+약물) 항-PD-L1 PE 14.D3 항체로 착색된 자극을 받지 않은 혈액과 자극을 받은 혈액 모두에서 a) CD4+ T 세포, b) CD8+ T 세포 및 c) CD19 B 세포의 정중 형광 강도 (MFI)를 보여주는 그래프다. FMO는 형광에서 하나의 음성 게이팅 대조군을 뺀 것을 나타낸다. Cytostim은 CytoStim®자극제를 나타낸다. 무(no)-Stim FMO: 항-PD-L1 PE 14.D3 항체는 존재하지 않음; 무-Stim-약물: 항-PD-L1 PE 14.D3 항체는 존재함; 무-Stim+약물: 항-PD-L1 PE 14.D3 항체 및 아테졸리주맙은 존재함; Cytostim FMO: 항-PD-L1 PE 14.D3 항체는 존재하지 않음; Cytostim-약물: 항-PD-L1 PE 14.D3 항체는 존재함; 그리고 Cytostim+약물: 항-PD-L1 PE 14.D3 항체 및 아테졸리주맙은 존재함.
도 15a-c는 건강한 증여자로부터 획득되고, 그리고 아테졸리주맙 부재하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재하에(+약물) 항-PD-L1 AF647 14.D3 항체로 착색된 자극을 받지 않은 혈액과 자극을 받은 혈액 모두에서 a) CD4+ T 세포, b) CD8+ T 세포 및 c) CD19 B 세포의 정중 형광 강도 (MFI)를 보여주는 그래프다. FMO는 형광에서 하나의 음성 게이팅 대조군을 뺀 것을 나타낸다. Cytostim은 CytoStim®자극제를 나타낸다. 무-Stim FMO: 항-PD-L1 AF647 14.D3 항체는 존재하지 않음; 무-Stim-약물: 항-PD-L1 AF647 14.D3 항체는 존재함; 무-Stim+약물: 항-PD-L1 AF647 14.D3 항체 및 아테졸리주맙은 존재함; Cytostim FMO: 항-PD-L1 AF647 14.D3 항체는 존재하지 않음; Cytostim-약물: 항-PD-L1 AF647 14.D3 항체는 존재함; 그리고 Cytostim+약물: 항-PD-L1 AF647 14.D3 항체 및 아테졸리주맙은 존재함.
도 16a-c는 건강한 증여자로부터 획득되고, 그리고 아테졸리주맙 부재하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재하에(+약물) 항-PD-L1 APC 29E.23 항체로 착색된 자극을 받지 않은 혈액과 자극을 받은 혈액 모두에서 a) CD4+ T 세포, b) CD8+ T 세포 및 c) CD19 B 세포의 정중 형광 강도 (MFI)를 보여주는 그래프다. 아테졸리주맙 부재하에 (-약물) 또는 아테졸리주맙 존재 하에(+약물) D3 항체. FMO는 형광에서 하나의 음성 게이팅 대조군을 뺀 것을 나타낸다. Cytostim은 CytoStim®자극제를 나타낸다. 무-Stim FMO: 항-PD-L1 APC 29E.23 항체는 존재하지 않음; 무-Stim-약물: 항-PD-L1 APC 29E.23 항체는 존재함; 무-Stim+약물: 항-PD-L1 APC 29E.23 항체 및 아테졸리주맙은 존재함; Cytostim FMO: 항-PD-L1 APC 29E.23 항체는 존재하지 않음; Cytostim-약물: 항-PD-L1 APC 29E.23 항체는 존재함; 그리고 Cytostim+약물: 항-PD-L1 APC 29E.23 항체 및 아테졸리주맙은 존재함.
도 17은 유동 세포측정에 의해 측정하였을 때, 항-PDL-1 14D3 항체로 착색된 헤파린처리된 골수 및 전혈(whole blood)에서 다발성 골수종(MM)에서 PD-L1의 발현을 보여주는 그래프다. PC는 형질 세포를 나타낸다. BM은 골수를 나타낸다. 특정 세포 집단은 괄호 안에 표시되어 있다. 개방(open) 기호는 동일한 환자를 나타낸다.
본 발명의 구체예들의 상세한 설명
I. 정의
명시적으로 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계 숙련자들에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. Singleton 외, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), 및 March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)는 본 출원에서 사용되는 많은 용어에 대한 일반적인 가이드를 당업자에게 제공한다. 특허 출원 및 공보를 비롯한, 본원에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업자에게 속하는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술들은 문헌에서 충분히 설명되는데, 이를 테면, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2 edition (Sambrook 외, 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel 외, eds 1987, 및 주기적 업데이트); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 외, ed., 1994); A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988); Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas 외, 2001).
이 명세서를 해석 할 목적으로, 다음의 정의들이 적용될 것이며, 적절한 경우 단수로 사용된 용어는 복수형을 포함하고 그 반대도 마찬가지이다. 본 명세서에서 이용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 목적이며, 제한하기 위한 의도는 없는 것으로 이해한다. 아래에 제시된 정의가 본 명세서에 참조로 포함 된 문서와 상충되는 경우, 아래에 정의된 정의가 우선한다.
"친화력(affinity)"이란 분자의 단일 결합 부위 (예컨데, 항체)와 이의 결합 짝 (예컨데, 항원) 사이에 비공유 상호작용의 총 강도를 말한다. 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 바와 같이, “결합 친화력”이란 결합 쌍의 구성요소들간 (예를 들면, 항체와 항원)에 1:1 상호작용을 반영한 고유한 결합 친화력을 지칭한다. 분자 X가 이의 짝 Y에 대한 친화력은 해리 상수 (KD)로 나타낼 수 있다. 친화력은 본 명세서에서 설명된 것이 포함된 당분야에 공지된 공통적 방법들에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특이적으로 설명되고, 예시적인 구체예를 본원에 기재한다.
용어 항체는 본 명세서에서 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체), 그리고 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나, 이에 국한되지 않은 다양한 항체 구조를 포괄하는 광범위한 의미로 이용된다.
항체 단편은 손상되지 않은(intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 손상되지 않은 항체의 부분을 포함하는 손상되지 않은 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편들의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디(diabodies); 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자들 (예로써 scFv); 그리고 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 항체의 파파인 절단으로 2개의 동일한 항원-결합 단편들, 소위 “Fab”단편들-각각은 단일 항원-결합 부위를 가짐-, 그리고 잔류 “Fc”단편들을 만드는데, 이의 이름은 쉽게 결정화하는 능력을 반영한다. 펩신 처리로 2 개의 항원-복합 부위를 갖고, 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
용어 “단일클론 항체(monoclonal antibody)”는 본 명세서에서 이용된 바와 같이 실질적으로 동질성 항체의 집단으로부터 수득한 항체, 가령, 이러한 집단을 포함하는 개별 항체는 동일하거나 및/또는 동일한 에피토프에 결합하지만, 예로써, 자연 발생적 돌연변이를 포함하는 또는 단일클론 항체 조제물 생산 동안 발생되는 가능한 변이체 항체의 경우는 제외되며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량 존재한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대항하는 상이한 항체를 일반적으로 함유하는 다중클론성 항체 조제물과 대조적으로, 단일클론 항체 조제물의 각 단일클론 항체는 항원에 있는 단일 결정인자를 지향한다. 따라서, 변경인자 “단일클론”은 상기 항체의 특징은 실질적으로 동질성 집단의 항체로부터 획득되나, 이 항체 생산에 임의의 특정 방법이 요구되지 않는 것으로 간주되는 것을 나타낸다. 　 예를 들면, 본 발명에 따라 이용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법들, 파아지-디스플레이 방법들, 그리고 상기 인간 면역글로블린 좌(loci)의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자삽입 동물을 이용하는 방법들을 포함하나, 이에 국한되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있으며, 단일클론 항체를 만드는 이러한 방법들과 다른 예시적인 방법들은 본 명세서에서 설명된다.
“네이키드(naked) 항체”는 이질성 모이어티 (예로써, 세포독성 모이어티) 또는 방사능라벨에 접합되지 않은 항체를 말한다. 상기 네이키드 항체는 약학 제형에 존재할 수 있다.
“고유 항체(Native antibodies)”는 다양한 구조를 가진 자연 발생적 면역글로블린 분자들을 지칭한다. 예를 들면, 고유한 IgG 항체는 이종사량체 당단백질로써, 약 150,000 달톤이며, 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄를 포함하며, 이들은 이황화 결합에 의해 연결되어 있다. N-말단에서 C-말단으로 방향으로, 각 중쇄는 가변적 영역 (VH), -이는 가변적 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변적 도메인으로 불리며-, 이어서 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)이 이어진다. 유사하게, N-말단에서 C-말단 방향으로, 각 경쇄는 가변적 영역 (VL)-가변적 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변적 도메인으로도 불림- 불변 경쇄 (CL) 도메인이 이어진다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여 2가지 유형의 소위, 카파 (κ) 및 람다 (λ)중 하나로 지정될 수 있다.
항체의 "클래스(class)"란 이의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체에는 5 가지 주요 클래스가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들중 몇 가지는 하위클래스(이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더 세분될 수 있다. 면역글로블린의 상이한 클래스에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 차례로 α,δ,ε,γ, 및μ로 불린다.
용어 “항-PD-L1 항체”, “항-PD-L1”“PD-L1 항체” 또는 “PD-L1 에 결합하는 항체”란 일반적으로 충분한 친화력으로 PD-L1에 결합하는 항체로써, 이 항체는 PD-L1을 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 한 구체예에서, 무관한, 비-PD-L1 단백질에 대한 항-PD-L1 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사선면역분석법 (RIA)에 의해 측정될 때, PD-L1에 대한 당해 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구체예들에서, PD-L1에 결합하는 항체는 ≤　1μM, ≤　100nM, ≤　10nM, ≤　1nM, ≤　0.1nM, ≤　0.01nM, 또는 ≤　0.001nM (가령, 10-8 M 또는 그 미만, 가령, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 특정 구체예들에 있어서, 항-PD-L1항체는 상이한 종의 PD-L1에서 보존된 PD-L1의 에피토프에 결합한다. 특정 구체예들에서, 항-PD-L1 항체는 인간 PD-L1에 결합한다.
“인간 항체(human antibody)”는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체에 대응하는 또는 인간 항체 레퍼토리를 이용하는 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 원천으로부터 유도된 항체에 대응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체다. 인간 항체의 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특이적으로 배제한다.
용어 “키메라(chimeric)”항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정 원천 또는 종들로부터 유도되지만, 한편 이 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분은 상이한 원천 또는 종들로부터 유도된 항체를 지칭한다.
“인간 콘센수스 틀구조(human consensus framework)”는 인간 면역글로블린 VL 또는 VH 틀구조 서열의 선별에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산 잔기를 제시하는 틀구조다. 일반적으로, 인간 면역글로블린 VL 또는 VH 서열의 선별은 가변적 도메인 서열들의 하위집단으로부터 한다. 일반적으로, 서열의 하위집단은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH 공개 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3와 같은 하위집단이다. 한 구체예에서, 상기 VL의 경우, 상기 하위집단은 Kabat 외, 상기와 같은 하위집단 카파 I이다. 한 구체예에서, 상기 VH의 경우, 상기 하위집단은 Kabat 외, 상기와 같은 하위집단 III 이다.
“인간화된(humanized)”항체는 비-인간 HVRs의 아미노산 잔기들과 인간 FRs의 아미노산 잔기들을 포함하는 키메라 항체를 말한다. 특정 구체예들에 있어서, 인간화된 항체는 실질적으로 최소한 하나의, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함하는데, 이때 HVRs (가령, CDRs)의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 비-인간 항체에 대응하며, FRs의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화된 항체는 임의선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 최소한 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "인간화된 형태(humanized form)", 가령, 비-인간 항체는 인간화를 겪은 항체를 말한다.
용어 “가변적 영역(variable region)”또는 “가변적 도메인(variable domain)”은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 말한다. 고유한 항체의 중쇄와 경쇄 (차례로 VH 및 VL)의 가변적 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 틀구조 영역 (FRs)과 3개의 초가변적 영역 (HVRs)을 포함한다. (예를 들면, Kindt 외 Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 참고). 단일 VH 또는 VL 도메인은 충분히 항원-결합 특이성을 부여할 수 있다. 더욱이, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크린하기 위하여 항원에 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 예를 들면, Portolano 외, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 외, Nature 352:624-628 (1991) 참고.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 “초가변 영역(hypervariable region)”또는 “HVR”은 서열에서 초가변적이고, 및/또는 구조적으로 특정된 루프(“초가변 루프(hypervariable loops)”)를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 고유한 4개-쇄로 된 항체는 6개의 HVRs; VH에 3개 (H1, H2, H3), 그리고 VL에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. HVRs는 일반적으로 초가변 루프 및/또는 "상보성 결정 영역들(complementarity determining regions)" (CDRs)의 아미노산 잔기를 포함하는데, 후자는 최대 서열 가변성이며 및/또는 항원 인지에 관련된다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에서 발생된다. (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) 예시적인 CDRs (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 그리고 H3의 95-102에서 발생된다. (Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) VH에서 CDR1을 제외하고, CDRs는 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 일반적으로 포함한다. CDRs는 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기(specificity determining residues)" 또는 "SDRs"도 포함한다. SDRs는 약식으로 나타낸 -CDRs 또는 a-CDRs라고 불리는 CDRs의 영역 내에 포함된다. 예시적인 a-CDRs (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)는 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 아미노산 잔기 50-55, L3의 아미노산 잔기 89-96, H1의 아미노산 잔기 31-35B, H2의 아미노산 잔기 50-58, 및 H3의 아미노산 잔기 95-102에서 발생된다. (Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 참고) 다른 언급이 없는 한, HVR 잔기와 가변적 도메인 (예로써, FR 잔기)에 있는 다른 잔기들은 Kabat 외., 상기에 따라 번호매김된다.
상기 “Fab”단편은 중쇄-가변 영역 및 경쇄-가변 영역을 내포하고, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH1) 또한 내포한다. Fab′단편들은 이 항체 힌지 영역의 하나 또는 그 이상의 시스테인을 함유하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 몇개의 잔기를 추가함으로써 Fab 단편들과는 상이하다. Fab′-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리(free) 티올기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편들은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 알려져 있다.
본 명세서에서 용어 "Fc 영역(region)"은 불변 영역의 최소한 일부분이 포함된 면역글로블린 중쇄의 C-말단 영역을 특정하는데 이용된다. 상기 용어는 고유한 서열 Fc 영역들 및 변이체 Fc 영역들을 포함한다.　 특정 구체예들에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226, 또는 Pro230으로부터 카르복실-말단까지 이어진다. 　그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수도 또는 존재하지 않을 수도 있다. 명시적으로 다른 언급이 없는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 번호매김은 EU 번호매김 체계, Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 소위 EU 색인에 따른다.
"틀구조(Framework)" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인들로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열들은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 다음의 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 “전장(full length) 항체", “무손상(intact) 항체", 및 “온전체(whole) 항체”는 본 명세서에서 호환 이용되는데, 고유한 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본 명세서에서 정의된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
용어 “숙주 세포", “숙주 세포 계통", 및 “숙주 세포 배양물”은 호환되며, 외인성 핵산이 도입된 세포 및, 이러한 세포의 후손을 포함하는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체(transformants)" 및 "형질전환된 세포"를 포함하고, 여기에는 원발성 형질변형된 세포 및 계대 횟수에 관계없이, 이로부터 유래된 자손이 포함된다. 자손은 핵산 함량에서 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있고, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 선별되거나 또는 선택되어, 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손도 본원에서는 포함된다. 특정 구체예들에서, 상기 숙주 세포는 “단리된” 숙주 세포이며, 이는 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 숙주 세포를 지칭한다.
“단리된(isolated)" 항체는 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 항체다. 일부 구체예들에 있어서, 항체는 예를 들면, 전기영동의 (예로써, SDS-PAGE, 등전초점조절 (IEF), 모세관전기이동) 또는 크로마토그래프 (예로써, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 순도이상으로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토는 예로써, Flatman 외, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)를 참고한다.
“단리된 핵산"은 항체는 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 보통 포함하는 세포 안에 있는 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체외부에 존재한다.
기준 폴리펩티드 서열에 대하여 “아미노산 서열 동일성 백분율(%)”은 참고 서열 및 후보 서열들을 배열하고, 필요에 따라 최대 백분율의 서열 동일성을 획득하기 위하여 갭을 도입한 후, 기준 폴리펩티드 서열에 있는 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에 있는 아미노산 잔기의 백분율로 정의되며, 임의의 보존 치환은 서열 동일성 부분으로 간주되지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로 성취될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 배열을 획득하기 위한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열 배열을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본 명세서의 목적을 위하여, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2을 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.의 것이며, 이의 원천 코드는 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559에 사용자 문서에 정리되어 있으며, 이것은 U.S. 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc., South San Francisco, California에서 공개적으로 이용가능하며, 또는 원천 코드로부터 만들 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여 UNIX 운영 체제에서 사용하도록 컴파일해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 가변적이지 않다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위하여 이용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 A과 주어진 아미노산 서열 B의 아미노산 서열 동일성 % (이는 주어진 아미노산 서열 B과 또는 이에 대항하여 아미노산 서열 동일성 특정 %를 가진 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 말을 바꿀 수 있다)는 다음과 같이 산출된다:
100 x 분획 X/Y
이때 X는 A와 B의 프로그램 배열에서 서열 배열 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 필적되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수를 말하며, Y는 B의 전체 아미노산 잔기 수가 된다. 아미노산 서열 A의 길이는 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 대등하지 않을 것으로 인지된다. 다른 특정 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 직전 단락에서 설명된 바와 같이 획득된다.
용어 “벡터"란 본원에서 사용된 바와 같이, 이에 연결된 또다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터, 및 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈에 포함된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 “발현 벡터”라고 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an") 및 관사("the")는 다르게 지시하지 않는 한, 복수 형태를 포함한다.
본원에 사용 된 용어 "약(about)"이란 이 기술 분야의 당업자에게 쉽게 알려진 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 지칭한다. 본 명세서에서 값 또는 파라미터의 "약(about)"에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 구체예들을 포함(및 설명)한다.
본 명세서에 기술된 본 발명의 구체예는 측면들 및 구체예들로 "~로 구성되는(consisting)" 및 "본질적으로 ~구성되는(consisting essentially of)"것을 포함하는 것으로 이해된다.
II. PD-L1 생산을 위한 항-PD-L1 항체
한 측면에서, 본 발명은 항-PD-L1 항체를 제공하는데, 이것은 생물학적 샘플 안에 세포 표면 상에 PD-L1 단백질의 탐지 및/또는 정량화에 유용하다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 항체는 단일클론, 키메라 또는 인간화된다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1은 생물학적 샘플 안에 세포 표면 상에 PD-L1 단백질의 탐지 및/또는 정량화에 유용하다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플 또는 암 샘플이다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 샘플은 골수 샘플이다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 샘플은 면역 세포 또는 종양 세포를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 샘플은 인간 대상으로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 항체는 유동 세포측정을 이용하여 PD-L1 단백질을 탐지 및/또는 정량화하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 항체는 PD-L1로의 결합에 있어서 항-PD-L1 기준 항체와 교차-경쟁하지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 기준 항체는 아테졸리주맙이다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙으로 치료를 받았던 대상에서 PD-L1의 존재를 탐지하는데 유용하다.
A. PD-L1 탐지를 위한 예시적인 항-PD-L1 항체
일반적으로, 본 명세서의 항체는 면역특이적으로 PD-L1 (예를 들면, 인간 PD-L1)에 결합한다. 본 명세서의 항체는 선호적으로는 단일클론이며, 그리고 다중특이적, 인간, 인간화된, 마우스 또는 키메라, 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 만들어진 단편, 및 그리고 전술한 것들중 임의의 PD-L1 결합 단편일 수 있다. 본 명세서의 면역글로블린 분자는 임의의 유형(가령, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(가령, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2) 또는 면역글로블린 분자의 임의의 아류일 수 있다.
본 명세서의 특정 구체예들에서, 본원에서 기술된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항원-결합 단편이다. 특정 구체예들에서, 항원-결합 단편에는 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일-쇄 Fvs (scFv), 단일-쇄 항체, 이황화결합-연계된 Fvs (sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편이 포함된다. 단일-쇄 항체를 포함한 항원-결합 단편은 오로지 가변 영역(들)만을 포함하거나, 또는 다음중 일부 또는 전체와 조합되어 포함될 수 있다: 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 및 CL 도메인. 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 및 CL 도메인의 임의의 조합을 포함하는 항원-결합 단편 또한 본 명세서에 포함된다. 선호적으로는, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간, 뮤린 (예를 들면, 마우스 및 렛), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭이다.
본 명세서의 항체는 이들이 포함하는 특정 HVRs의 관점에서 기술되거나 또는 특정될 수 있다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-PD-L1 항체를 제공한다: (a) 아미노산 서열 TSWMN (서열 번호:1)을 포함하는 HVR-H1, 아미노산 서열 RIYPRDGDTYYNGKFKD (서열 번호:2)을 포함하는 HVR-H2, 및 아미노산 서열 NPGGYYFDY (서열 번호:3)을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 아미노산 서열 RASQDIHTYLN (서열 번호:4)을 포함하는 HVR-L1, 아미노산 서열 YTSRLHS (서열 번호:5)을 포함하는 HVR-L2, 및 아미노산 서열 QQVSSLPPWT (서열 번호:6)을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 항체는 예를 들면, 도 1a 및 도 1b에 나타낸 것과 같이, 항체 14D3의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 HVRs (Kabat)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 항체는 예를 들면, 도 1a 및 도 1b에 나타낸 것과 같이, 항체 14D3의 VH 및/또는 VL를 포함한다.
일부 구체예들에서, 항-PD-L1 항체가 제공되는데, 이때 상기 항체는 서열 번호: 7의 아미노산 서열에 대하여 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 구체예들에서, 서열 번호:7의 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대하여 치환 (가령, 보존적 치환), 삽입, 또는 결손을 함유하지만, VH 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체는 PD-L1에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구체예들에서, 서열 번호: 7에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구체예들에서, 치환, 삽입, 또는 결손은 HVRs 밖의 영역 (즉, FRs에서)에서 발생한다. 임의선택적으로, 상기 항-PD-L1 항체는 서열 번호: 7의 전사-후 변형을 비롯하여 이 서열의 VH 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 VH는 (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 그리고 (c) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 HVRs를 포함한다.
일부 구체예들에서, 항-PD-L1 항체가 제공되는데, 이때 상기 항체는 서열 번호: 8의 아미노산 서열에 대하여 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 특정 구체예들에서, 서열 번호:8의 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대하여 치환 (가령, 보존적 치환), 삽입, 또는 결손을 함유하지만, VL 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체는 PD-L1 항체에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구체예들에서, 서열 번호: 8에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구체예들에서, 치환, 삽입, 또는 결손은 HVRs 밖의 영역 (즉, FRs에서)에서 발생한다. 임의선택적으로, 상기 항-PD-L1 항체는 서열 번호: 8,의 전사-후 변형을 비롯하여 이 서열의 VL 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 VL은 (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 그리고 (c) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 HVRs를 포함한다.
또다른 측면에서, 항-PD-L1 항체는 제공되는데, 이때 상기 항체는 상기에서 제공된 구체예들중 임의의 것과 같이, VH와 상기에서 제공된 구체예들중 임의의 것과 같이, VL을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 7의 VH 서열과 서열 번호: 8의 VL 서열, 그리고 이들 서열의 전사-후 변형을 포함한다.
또다른 측면에서, 항-PD-L1 항체가 제공되는데, 이때 상기 항체는 상기에서 제공된 구체예들중 임의의 것과 같은 중쇄와 상기에서 제공된 구체예들중 임의의 것과 같은 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 9의 중쇄 서열과 서열 번호: 10의 경쇄 서열, 그리고 이들 서열의 전사-후 변형을 포함한다.
본 발명의 항체는 PD-L1 (예를 들면 인간 PD-L1)에 대한 이들의 결합 친화력 관점에서 기술되거나 또는 특정될 수 있다. 바람직한 결합 친화력은 5 x10-2 M, 10-2 M, 5x10-3 M, 10-3 M, 5x10-4 M, 10-4 M, 5x10-5 M, 10-5 M, 5x10-6 M, 10-6 M, 5x10-7 M, 10-7 M, 5x10-8 M, 10-8M, 5x10-9 M, 10-9 M, 5x10-10 M, 10-10 M, 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M, 10-12 M, 5x10-13 M, 10-13 M, 5x10-14 M, 10-14 M, 5x10-15 M, 또는 10-15 M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 갖는 것들이 포함된다.
본 발명의 추가 측면에서, 상기 구체예들중 임의의 것에 따른 항-PD-L1 항체는 키메라, 인간화된 또는 마우스 항체를 포함한, 단일클론 항체다. 한 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 항체 단편, 예를 들면, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디(diabody), 또는 F(ab')2 단편이다. 또다른 구체예에서, 상기 항-PD-L1 항체는 전장 항체, 예를 들면, 무손상(intact) IgG1 항체 또는 본원에서 기술된 다른 항체 클래스 또는 이소타입이다.
본 발명의 추가 측면에서, 상기 구체예들중 임의의 것에 따른 또는 본원에 기술된 항-PD-L1 항체는 이질성(heterologous) 모이어티 또는 탐지가능한 모이어티에 연계되거나, 또는 접합된다. 일부 구체예들에서, 상기 탐지가능한 모이어티는 라벨 또는 바이오틴이다. 일부 구체예들에서, 상기 탐지가능한 모이어티는 라벨이다. 일부 구체예들에서, 상기 탐지가능한 모이어티는 바이오틴이다. 일부 구체예들에서, 상기 탐지가능한 모이어티는 형광단이다. 일부 구체예들에서, 상기 형광단은 R-피코에리트린 (PE), PE-Cy7, Alexa Fluor 488, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 페리디닌 클로로필 단백질 복합체 (PerCP), BV421, BV510, APC-H7, Alexa Fluor 647, 또는 알로피코시아닌 (APC)이다. 일부 구체예들에서, 상기 형광단은 R-피코에리트린 (PE)이다. 일부 구체예들에서, 상기 형광단은 알로피코시아닌 (APC)이다. 일부 구체예들에서, 상기 형광단은 Alexa Fluor 647이다.
항-PD-L1 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열:
QVQLQQSGPELVNPGASVKISCKASGYAFSTSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPRDGDTYYNGKFKDKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCTKNPGGYYFDYWGQGTTLTVSS (서열 번호: 7)
항-PD-L1 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTINCRASQDIHTYLNWYQQKPDGTVKLLIFYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQVSSLPPWTFGGGTKVEIK (서열 번호: 8)
항-PD-L1 항체 중쇄 아미노산 서열:
QVQLQQSGPELVNPGASVKISCKASGYAFSTSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPRDGDTYYNGKFKDKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCTKNPGGYYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG (서열 번호: 9)
항-PD-L1 항체 경쇄 아미노산 서열:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTINCRASQDIHTYLNWYQQKPDGTVKLLIFYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQVSSLPPWTFGGGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (서열 번호: 10)
B. 기준 또는 치료요법적 항-PD-L1 항체
또다른 측면에서, 본원에 기재된 항-PD-L1 항체는 PD-L1로의 결합에 있어서 기준 항-PD-L1 항체 또는 치료요법적 항-PD-L1 항체와 교차-경쟁하지 않는다. 본원에서 사용된 용어 “기준 항-PD-L1 항체” 및 “치료요법적 항-PD-L1 항체”는 본 명세서의 항-PD-L1 이외의 항-PD-L1 항체를 지칭한다. 용어 “기준 항-PD-L1 항체” 및 “치료요법적 항-PD-L1 항체”는 호환 사용될 수 있지만, 그러나 “치료요법적 항-PD-L1 항체”라는 용어는 당해 항체가 대상에게 투여될 때 일반적으로 사용된다.
특정 구체예들에서 상기 기준 또는 치료요법적 항-PD-L1 항체는 다음을 포함한다: (a) 아미노산 서열 GFTFSDSWIH (서열 번호:11)을 포함하는 HVR-H1, 아미노산 서열 AWISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:12)을 포함하는 HVR-H2 및 아미노산 서열 RHWPGGFDY (서열 번호:13)을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및(b) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 번호:14)을 포함하는 HVR-L1, 아미노산 서열 SASFLYS (서열 번호:15)을 포함하는 HVR-L2, 및 아미노산 서열 QQYLYHPAT (서열 번호:16)을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일부 구체예들에서, 상기 기준 또는 치료요법적 항-PD-L1 항체는 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 항체는 서열 번호:17의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역에 대하여 최소한 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역, 및/또는 서열 번호:18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역에 대하여 최소한 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 기준 또는 치료요법적 항-PD-L1 항체는 서열 번호:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 항체는일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 항체는 서열 번호:19의 아미노산 서열을 갖는 중쇄에 대하여 최소한 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄, 및/또는 서열 번호:20의 아미노산 서열을 갖는 경쇄에 대하여 최소한 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 기준 또는 치료요법적 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙 (TECENTRIQ®)이다.
일부 구체예들에서, 상기 기준 또는 치료요법적 항-PD-L1 항체는 단일클론, 키메라 또는 인간화된다.
예시적인 기준 또는 치료요법적 항-PD-L1 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:17)
예시적인 기준 또는 치료요법적 항-PD-L1 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK (서열 번호:18)
예시적인 기준 또는 치료요법적 항-PD-L1 항체 중쇄 아미노산 서열:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열 번호:19)
예시적인 기준 또는 치료요법적 항-PD-L1 항체 경쇄 아미노산 서열:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열 번호:20)
C. 생산 방법.
본 발명에 따라 사용된 항-항체의 생산을 위한 예시적인 기술에 대한 설명이 이어진다.
i. 다중클론 항체
상기 본 발명의 항체는 다중클론 항체를 포함할 수 있다. 다중클론 항체를 준비하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 다중클론 항체는 포유 동물에서, 예를 들어, 면역원 및 필요하다면 어쥬번트(adjuvant)와 함께, 1 회 또는 그 이상의 주사에 의해 발생될 수 있다. 전형적으로, 면역원 및/또는 어쥬번트는 포유 동물에게 피하 또는 복강내 다수의 주사에 의해 주입될 것이다. 면역원 물질은 항-PD-L1, 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화되는 포유 동물에서 면역원성이 있는 것으로 공지된 단백질에 면역화제를 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 이러한 면역 원성 단백질의 예로는 키홀 리펫(keyhole limpet) 헤모시아닌, 혈청 알부민, 티로글로불린 및 대두 트립신 저해제가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이용될 수 있는 어쥬번트의 예는 Freund's 컴플리트 어쥬번트, 및 MPL-TDM 어쥬번트 (모노포르포릴 리피드A, 합성 트레할로스 디코리노미코레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 과도한 실험없이, 당업자에 의해 선택될 수 있다. 그런 다음, 포유 동물로부터 출혈시키고, 혈청에서 항-PD-L1 항체 역가를 측정한다. 원한다면, 포유 동물은 항체 역가가 커지거나 정점에 이를 때까지 부스팅할 수 있다.
ii. 단일클론 항체
상기 본 발명의 항체는 대안으로 단일클론 항체일 수 있다. 단일클론 항체는 처음으로 Kohler 외, Nature 256:495 (1975)에서 기술된 하이브리도마 방법을 이용하여 만들거나, 또는 재조합 DNA 방법(가령, U.S. 특허 번호 제4,816,567호 참고)에 의해 만들어질 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물은 상기에서 기술된 바와 같이, 면역화제로 면역화되어, 면역접종에 이용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안으로, 림프구는 테스트 튜브내에서 면역화될 수 있다. 면역접종 후, 림프구는 단리되고, 적합한 융합 물질, 이를 테면, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포에 융합되어, 하이브리도마 세포를 만든다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
따라서 준비된 하이브리도마 세포는 융합안된, 부모계 골수종 세포 (융합 짝으로도 지칭된다)의 성장 또는 생장을 억제하는 하나 또는 그 이상의 물질을 포함하는 적합한 배양 배지에 접종되고, 성장된다. 예를 들면, 만일 부모 골수종 세포가 하이포산핀 구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT 또는 HPRT)가 부족한 경우, 하이브리도마의 선택적 배양 배지에는 전형적으로 HGPRT-결핍된 세포의 성장을 막는 물질인 하이포산핀, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")이 포함될 것이다.
융합 짝 골수종 세포는 효과적으로 융합되어, 선택된 항체-생산 세포에 의해 안정적이고 높은 수준의 생산을 지원하는 세포이며, 융합안된 부모 세포에 대항하여 선택된 선택적 배지에 민감하다. 골수종 세포주는 뮤린 골수종 계통, 이를 테면, Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA에서 이용가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것들, 그리고 예를 들면, American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA에서 이용가능한 X63-Ag8-653 세포와 같은 SP-2 및 유도물질이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종(heteromyeloma) 세포주는 또한 인간 단일클론 항체의 생산을 위해 기술되어 왔다 (Kozbor, J. Irnmunol., 133:3001 (1984); 및 Brodeur 외, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 상기 항원에 대항하여 단일클론 항체 생산에 대하여 분석된다. 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단일클론 항체의 결합 특이성은 테스트 튜브내 결합 분석, 예를 들면, 면역침강 법 또는 방사 면역 측정법 (RIA) 또는 효소-연계된 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 단일클론 항체의 결합 친화력은 예를 들면, Munson 외, Anal. Biochem., 107:220 (1980)에서 설명된 Scatchard 분석에 의해 결정될 수 있다.
원하는 특이성, 친화력, 및/또는 활성의 항체를 만드는 하이브리도마 세포가 일단 확인되면, , 클론을 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법으로 성장시킬 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). 이러한 목적을 위한 적절한 배양 배지는 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 예를 들면, 이 세포를 마우스에 i.p.주사함으로써, 동물의 생체내 복수(ascites) 종양으로 성장할 수 있다.
서브클론으로부터 분비되는 단일클론 항체는 배양 배지, 복수(ascites) 유체, 또는 혈청으로부터 통상적인 항체 정제 과정 이를 테면, 예를 들면, 친화력 크로마토그래피 (가령, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로즈를 이용) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 등에 의해 적절하게 분리된다.
단일클론 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차 (가령, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)를 이용하여 용이하게 단리되고, 그리고 서열화될 수 있다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로 작용한다. 일단 단리된 DNA를 발현 벡터에 넣은 다음, 항체 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예를 들면, 대장균 세포, 유인원(simian) COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질 감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체를 합성할 수 있다. 상기 항체를 인코드하는 DNA의 박테리아내 재조합 발현에 관한 검토 자료는 Skerra 외, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) 및 Pliickthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)을 포함한다.
추가 구체예에서, 단일클론 항체 또는 항체 단편은 McCafferty 외, Nature, 348:552-554 (1990). Clackson 외, Nature, 352:624-628 (1991)에서 기술된 기술을 이용하여 생성된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있고, 그리고 Marks 외, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)는 파아지 라이브러리를 이용하여 차례로 뮤린 및 인간 항체의 분리를 기술한다. 후속 공개는 쇄 셔플링 (Marks 외, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), 뿐만 아니라 복합 감염 및 매구 큰 파아지 라이브러리 구축을 위한 전략으로써 복합 감염 및 생체내 조합에 의한 고친화력(nM 범위) 인간 항체 생산을 기술한다 (Waterhouse 외, Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 ( 1993)). 따라서, 이들 기술은 단일클론 항체의 단리를 위한 전통적인 단일클론 항체 하이브리도마 기술에 대한 대안이다.
원칙적으로, 합성 항체 클론은 파아지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 나타내는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택된다. 이러한 파지 라이브러리는 원하는 항원에 대해 스크리닝된다. 원하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되고, 따라서 라이브러리 내의 비-결합 클론으로부터 분리된다. 이어서, 결합 클론은 항원으로부터 용출되고, 항원 흡착/용출의 추가적인 사이클에 의해 추가로 농축될 수 있다.
가변 도메인은 파지 상에 기능적으로 단일-쇄 Fv (scFv) 단편으로 디스플레이될 수 있는데, 이때 VH 및 VL은 짧은 가연성 펩티드를 통하여 공유적으로 연계되며, 또는 Fab 단편으로 디스트레이될 수 있는데, 이때 이들은 각각 불변 도메인과 융합되고, 예를 들면, Winter 외, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에서 기술된 바와 같이 비-공유적으로 상호작용한다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 쇄 반응(PCR)에 의해 별도 클로닝되고, 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 그 다음 Winter 외, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에서 기술된 바와 같이, 항원-결합 클론에 대해 조사될 수 있다. 면역화된 원천으로부터 라이브러리는 하이브리도마의 구축 요구없이 면역원에 대한 고-친화력 항체를 제공한다. 대안으로, 순수(naive) 레퍼토리가 클론되어 (가령, 인간으로부터) Griffiths 외, EMBO J, 12: 725-734 (1993)에서 설명된 바와 같이 임의의 면역화없이 광범위의 비-자가 및 자가 항원에 대한 인간 항체의 단일 원천을 제공할 수 있다. 끝으로, Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에서 기술된 바와 같이, 순수 라이브러리는 줄기 세포로부터 재배치되지 않은 V- 유전자 단편을 클로닝하고, 고도로 가변적인 CDR3 영역을 인코딩하고, 시험 관내에서 재배열을 수행하기 위하여 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여, 합성에 의해 만들어 질 수 있다.
라이브러리의 스크리닝은 당분야에 공지된 다양한 기술에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들면, PD-L1은 흡착판의 웰을 피복하거나, 흡착판에 부착된 숙주 세포에서 발현되거나, 또는 세포 선별에 사용되거나, 또는 스트렙타비딘-코팅된 비드를 사용한 포획을 위한 바이오틴에 접합되거나, 또는 패닝 (panning) 디스플레이 라이브러리용 다른 방법에 사용될 수 있다.
느린 해리 역학 (및 우수한 결합 친화력)을 가진 항체의 선별은 Bass 외, Proteins, 8: 309-314 (1990) 및 WO 92/09690에서 기술된 바와 같이 장기 세척 및 단가(monovalent) 파지 디스플레이의 사용에 의해 촉진되고, 그리고 Marks 외, Biotechnol., 10: 779-783 (1992)에서 설명된 바와 같이 항원의 낮은 코팅 밀도를 이용하여 촉진될 수 있다.
본 발명의 상기 임의의 항-PD-L1 본 발명의 항체는 관심대상의 파아비 클론의 선별을 위한 적합한 항원 스크리닝 과정을 기획하고, 이어서 Kabat 외,Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에서 기술된 바와 같이 관심대상의 파아지 클론 및 적합한 불변 영역(Fc) 서열로부터 Fv 서열을 이용하여 전장 항-PD-L1 항체 클론을 구축함으로써, 획득될 수 있다.
iii. 항체 변이체
특정 구체예들에서, 본원에서 제공하는 항체의 아미노산 서열 변이체들도 고려된다. 예를 들면, 항체의 상기 결합 친화력 및/또는 다른 생물학적 성질들을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체들은 상기 항체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열 안으로 적절한 변형을 도입시킴으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다. 이러한 변형은 예를 들면, 이 항체의 아미노산 서열 안에 잔기의 결손 및/또는 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 만일 최종 구조체가 바람직한 특징, 가령, 항원-결합을 보유한다면, 최종 구조체에 결손, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 있을 수 있다.
1. 치환, 삽입, 및 결손 변이체
특정 구체예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들을 갖는 항체 변이체들이 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVRs 및 FRs를 포함한다. 보존적 치환은 표 1에서 “보존 치환”이란 칸 아래에 나타낸다. 더 많은 실질적인 변화는 표 1의 “예시적인 치환들"이라는 제목하에 제시되며, 이는 아미노산 측쇄 클래스를 참고하여 더 논의된다 아미노산 치환은 관심대상 항체 안으로 도입될 수 있고, 원하는 활성, 가령, 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대하여 산물을 스크리닝할 수 있다.
Figure pct00001
아미노산은 일반적인 측쇄-성질에 따라 그룹화될 수 있다:
-소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
-중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
-산성: Asp, Glu;
-염기성: His, Lys, Arg;
-쇄 방향성에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
-방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환들은 한 클래스의 멤버를 또다른 클래스로 교환을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 부모계 항체 (가령, 마우스, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 또는 그 이상의 초가변 영역 잔기의 치환이 관련된다. 일반적으로, 추가 연구를 위하여 선택된 생성 변이체(들)은 부모계 항체와 비교하여 특정 생물학적 성질 (가령, 증가된 친화력, 감소된 면역원성)의 변형을 가질 수 있거나 및/또는 부모계 항체의 특정 생물학적 성질이 실질적으로 유지될 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화력 발달된 항체이며, 이는 가령, 이를 테면, 본원에서 기술된 바와 같은 파아지 디스플레이-기반의 친화력 발달 기술에 의해 통상적으로 만들어질 수 있다. 간략하게 설명하자면, 하나 또는 그 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 상기 변이체 항체가 파아지 상에 디스플레이되고, 특정 생물학적 활성 (가령, 결합 친화력)에 대해 스크리닝된다.
예를 들면, 항체 친화력을 개선시키기 위하여 변경 (가령, 치환)은 HVRs에서 만들어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR에서 "핫스팟(hotspots)", 가령, 체세포 성숙 과정 동안 고빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코드되는 잔기에서 만들어질 수 있고(가령, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)), 및/또는 SDRs (a-CDRs), 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화력에 대하여 테스트된다. 제 2 라이브러리를 구축하고, 재선별함으로써 친화력 성숙은 예로써, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 외, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에서 설명되었다. 친화력 성숙의 일부 구체예들에 있어서, 다양성은 다양한 방법들 중 임의의 방법에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자들에 도입된다(가령, 오류-발생(error-prone) PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지향된 돌연변이생성). 그 다음 제 2 라이브러리가 만들어진다. 이어서, 이 라이브러리를 스크리닝하여, 원하는 친화력을 갖는 임의의 항체 변이체를 동정한다. 다양성을 도입하는 또다른 방법은 HVR-지향된 접근법을 포함하는데, 이때 몇 개의 HVR 잔기 (가령, 1회에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는 가령, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 동정될 수 있다. 특히, HVR-H3 및 HVR-L3이 대개 표적이 된다.
특정 구체예들에 있어서, 치환들, 삽입, 또는 결손은 이러한 변이로 인하여 상기 항체가 항원에 결합하는 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 또는 그 이상의 HVRs 안에서 발생될 수 있다. 예를 들면, 결합 친화력을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (가령, 본 명세서에서 제공된 보존적 치환)이 HVRs에 만들어 질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDRs 밖에 있을 수 있다. 상기에서 제시된 변이체 VH 및 VL의 특정 구체예들에 있어서, 각 HVR은변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이상의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발의 표적이 될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 동정하는데 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에서 설명된 바와 같이, "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 불린다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기 집단 (가령, 하전된 잔기, 이를 테면 Asp, Arg, His, Lys, 및 Glu)는 동정되고, 그리고 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지를 판단하기 위하여 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가령, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체된다. 추가 치환이 상기 아미노산 위치에 도입되어, 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증할 수 있다.
대안으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정(crystal) 구조는 항체와 항원 간의 접촉 접을 동정한다. 이러한 접촉 잔기와 이웃 잔기는 치환의 후보로 표적화되거나, 또는 제거될 수 있다. 변이체들이 원하는 성질을 보유하는지를 판단하기 위하여 이 변이체들이 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 한 개 잔기에서 수백 또는 그 이상의 잔기가 함유된 폴리펩티드 범위, 뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 포함된 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 상기 항체 분자의 다른 삽입 변이체들은 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (예로써 ADEPT의 경우) 또는 폴리펩티드에 당해 항체의 N- 또는 C-말단의 융합을 포함한다.
iv. 재조합 방법 및 조성물들
항체는 재조합 방법 및 조성물을 사용하여, 예를 들어 U.S. 특허 제 4,816,567 호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 항-PD-L1 항체가 인코딩된 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 상기 항체의 상기 VL이 포함된 아미노산 서열 및/또는 VH가 포함된 아미노산 서열(예로써, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 인코드할 수 있다. 추가 구체예에 있어서, 이러한 핵산이 포함된 하나 또는 그 이상의 벡터 (예로써, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 구체예에 있어서, 이러한 핵산이 포함된 숙주 세포가 제공된다. 이러한 하나의 구체예에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다 (가령, 다음에 의해 형질변환된다): (1) 상기 항체의 VL이 포함된 아미노산 서열과 상기 항체의 VH가 포함된 아미노산 서열을 인코드하는 핵산이 포함된 벡터, 또는 (2) 상기 항체의 VL이 포함된 아미노산 서열을 인코드하는 핵산이 포함된 제 1 벡터와 상기 항체의 VH가 포함된 아미노산 서열을 인코드하는 핵산이 포함된 제 2 벡터. 한 구체예에서, 상기 숙주 세포는 진핵, 예로써 중국 헴스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구 세포 (예로써, YO, NSO, Sp20 세포)다. 한 구체예에서, 항-PD-L1 항체를 만드는 방법이 제공되는데, 이때 상기 방법은 상기에서 제공된 바와 같이, 상기 항체를 인코드하는 핵산이 포함된 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고, 그리고 임의선택적으로 상기 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수하는 것을 포함한다.
항-PD-L1 항체의 재조합 생산을 위하여, 예로써 상기에서 기술된 바와 같이 항체를 인코드하는 핵산이 단리되고, 숙주 세포 안에서 추가 클로닝 및/또는 숙주 세포 안에서 발현을 위하여 하나 또는 그 이상의 벡터 안으로 삽입된다. 이러한 핵산은 통상적인 과정 (예로써, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코드하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여)을 이용하여 단리 및 서열화될 수 있다.
항체-인코딩된 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본 명세서에서 설명된 원핵 또는 진핵 세포들을 포함한다. 예를 들면, 특히 당화 및 Fe 작동체(effector) 기능이 필요하지 않을 때, 박테리아 안에서 항체가 만들어질 수 있다. 박테리아 안에서 항체 단편들 및 폴리펩티드의 발현과 관련하여 예로써, U.S. 특허번호 제5,648,237호, 제5,789,199호, 및 제5,840,523호 참고. (대장균(E. coli)에서 항체 단편들의 발현을 설명하는 Charlton, ,Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254 참고) 발현 후, 상기 항체는 박테리아 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리되며, 추가 정제될 수 있다.
원핵세포에 추가적으로, 진핵 미생물, 이를 테면 섬유성 곰팡이 또는 효모는 항체-인코딩된 벡터의 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 당화 경로가 “인간화되고", 결과적으로 부분적으로 또는 온전하게 인간 당화 패턴을 가진 항체가 생산되는 곰팡이 및 효모 균주가 포함된다. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li 외, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) 참고.
당화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포들은 다중세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 또한 유도된다. 무척추동물 세포들의 예로는 식물 및 곤충 세포들이 포함된다. 스포도프테라 푸르기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포들의 형질감염을 위하여 곤충 세포들과 병용될 수 있는 많은 베큘로바이러스 균주들이 확인되었다. 식물 세포 배양 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예로써, US 특허 번호 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호 참고 (유전자삽입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 을 설명).
척추동물 세포들 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유류 세포주들이 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예로는 SV40에 의해 형질변환된 원숭이 신장 CV 1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예로써, Graham et al., J. Gen Viral. 36:59 (1977)에서 설명된 293 또는 293 세포들); 아기 햄스터 신장 세포들 (BHK); 마우스 세르톨리 세포들 (예로써, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)에서 설명된 TM4 세포들); 원숭이 신장 세포들 (CV l); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포들 (VER0-76); 인간 경부 암종 세포들 (HELA); 갯과 신장 세포들 (MOCK; 버팔로 렛 간 세포들 (BRL 3A); 인간 폐 세포들 (W138); 인간 간 세포들 (Hep 02); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예로써, Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에서 설명된 TRI 세포들; MRC 5 세포들; 그리고 FS4 세포들이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포계통은 DHFK-CHO 세포 (Urlaub 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))을 포함하는 중국 헴스터 난소(CHO) 세포; 그리고 골수종 세포계통 이를 테면 YO, NSO 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 검토는 예로써, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)를 참고한다.
III. 검정법
본원에 제공된 항-PD-L1 항체는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 그들의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성을 확인, 스크리닝 또는 특성화될 수 있다.
A. 결합 검정법 및 기타 검정법
한 측면에서, 본 발명의 항체는 그의 항원 결합 활성, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블랏 등과 같은 공지된 방법에 의해 시험된다. 결합 친화력은 당분야에 공지된 공통적 방법들에 의해 측정될 수 있다. 한 구체예에서, 항체 KD는 다음 검정법에 의해 설명된 항체 및 항원 분자의 Fab 형태로 실행된 방사능라벨된 항원 결합 검정(RIA)에 의해 측정되며, 이때 상기 검정은 라벨안된 항원의 일련의 역가 존재 하에, 최소 농도의 (125I)-라벨된 항원으로 Fabs를 평형화시키고, 그 다음 항-Fab 항체-피복된 플레이트로 결합된 항원을 포집시킴으로써 측정된다 (Chen, 외, (1999) J. Mol. Biol 293:865-881). 검정한 조건을 확립하기 위하여, 미량적정 플레이트 (Dynex) 는 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 안에 5 ug/ml의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs)로 하룻밤 동안 피복되며, 그리고 후속적으로 2% (w/v) 소 혈청 알부민/PBS로 2-5 시간 동안 실온 (대략적으로 23℃)에서 차단된다. 비-흡착성 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100pM 또는 26pM [125I]-항원은 관심대상의 Fab의 일련의 희석물과 혼합된다 (예로써, 상기 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일관된다, Presta 외, (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). 관심대상의 Fab는 그 다음 하룻밤 동안 항온처리되고; 그러나, 평형에 확실하게 이를 수 있도록 더 오랜 기간(예로써, 65 시간) 동안 항온처리가 지속될 수 있다. 그 이후, 상기 혼합물은 실온에서 1 시간 동안 항온처리를 위하여 포획 플레이트로 이전된다. 상기 용액은 그 다음 제거되며, 상기 플레이트는 0.1% Tween-20/PBS에서 8회 세척되었다. 상기 플레이트를 건조할 때, 150 ul/웰의 섬광물질 (MICROSCINT-20; Packard)이 추가되며, 상기 플레이트는 10분 동안 Topcount 감마 카운터 (Packard)상에서 카운트된다. 경쟁적 결합 분석에 사용하기 위하여 최대 결합의 20% 미만 또는 이에 대등한 각 Fab 농도가 선택된다.
또다른 구체예에 따르면, KD는 25℃에서 ~10 반응 유닛 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩과 함께, BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 기구(BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)를 이용한 표면-플라스몬 공명 분석을 이용하여 측정된다. 간략하게 설명하자면, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)은 공급업자에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙시니미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원은 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.8을 이용하여 5μg/ml (0.2μM)으로 희석시킨 후, 5μL/분의 유속으로 주사하여 결합된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)를 얻는다. 항원 주입 후, 1M 에탄올아민을 주입하여 미-반응 그룹을 차단한다. 역동학 측정을 위하여, 0.05% TWEEN 20™ 계면활성제 (PBST)와 함께 Fab의 2-배 일련의 희석물 (0.78nM 에서 500nM)은 25℃에서 PBS에서 분당 대략 25μL의 유속으로 주사된다. 연합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 연합 및 해리 센소그램의 동시 피팅에 의해, 단순한 일대일(one-to-one) Langmuir 결합 모델 (BIAcore®Evaluation Software version 3.2)을 이용하여 산출된다. 평형 해리 상수 (KD)는 비율 kon/koff로 산출된다. 예를 들면, Chen 외, J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) 참고. 상기 표면-플스몬 공명 분석에 의해 연합 속도가 106M-1 s-1를 초과한다면, 분광계, 이를 테면 스탑-플로우(stop-flow) 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반 큐빗이 있는 8000-시리즈 SLM-AMINCOTM 분광광도계(ThermoSpectronic)에서 25 ℃에서 측정될 때, 항원의 농도를 증가시키면서 PBS, pH 7.2 안에 20nM 항-항원 항체의 형광-방출 강도(가령, 여기=295nM; 방출=340nM, 16nM 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 ??칭 기술에 의해 연합 속도(on-rate)는 측정될 수 있다.
또다른 측면에서, 경쟁 검정법은 본원에 기재된 항-PD-L1 항체가 PD-L1로의 결합에 있어서 본원에 기술된 바의 치료요법적 또는 기준 항체와 경쟁하는지를 결정하는데 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, 본원에 기재된 항-PD-L1 항체가 PD-L1로의 결합에 있어서 본원에 기술된 바의 치료요법적 또는 기준 항체와 경쟁하는 지를 결정하는데 이용되는 상기 경쟁 검정법은 유동 세포측정법이다. 특정 구체예들에서, 이러한 경쟁하는 항체는 PD-L1의 동일한 에피토프 (예를 들면, 선형 또는 형태학적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 멥핑하는 상세한 예시적인 방법들은 Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol Humana Press, Totowa, NJ)에서 제공된다. 일부 구체예들에서, 본원에 기재된 항-PD-L1 항체는 PD-L1로의 결합에 있어서 본원에 기술된 바의 치료요법적 또는 기준 항체와 경쟁하지 않는다. 일부 구체예들에서, 항-PD-L1 항체가 경쟁 검정법에서 PD-L1에 상기 치료요법적 또는 기준 항체의 결합을 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만으로 차단시킨다면, 상기 항체는 PD-L1로의 결합에 있어서 본원에 기술된 바의 치료요법적 또는 기준 항체와 경쟁하지 않는다. 일부 구체예들에서, 항-PD-L1 항체가 경쟁 검정법에서 PD-L1에 상기 치료요법적 또는 기준 항체의 결합을 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상으로 차단시킨다면, 당해 항체는 PD-L1로의 결합에 있어서 본원에 기술된 바의 치료요법적 또는 기준 항체와 경쟁한다. 일부 구체예들에서, 상기 PD-L1은 인간 PD-L1이다.
예시적인 경쟁 검정법에서, 고정된 PD-L1은 PD-L1 항체에 결합하는 제 1 라벨된 항체 (예를 들면, 제 1 라벨된 항-PD-L1 항체), 및 PD-L1로의 결합에 있어서 상기 제 1 항체와 경쟁하는 능력에 대하여 테스트된 제 2 라벨안된 항체 (예를 들면, 제 2 라벨안된 항-PD-L1 항체)를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 상기 제 2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로써, 고정된 PD-L1은 상기 제 1 라벨된 항체를 포함하지만, 상기 제 2 라벨안된 항체를 포함하지 않은 용액에서 항온처리된다. PD-L1에 대한 제 1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 항온처리한 후, 과량의 결합안된 항체를 제거하고, 고정된 PD-L1과 연합된 라벨의 양을 측정한다. 고정된 PD-L1과 연합된 라벨의 양이 대조군 샘플과 비교하여 테스트 샘플 안에 실질적으로 감소된다며, 이는 상기 제 2 항체는 PD-L1로의 결합에 있어서 상기 제 1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) 참고. PD-L1로 형질 감염되고, 세포 표면상에서 발현된 세포를 사용하여 FACS로 전술한 바와 같은 방식으로 경쟁 검정법을 수행할 수도 있다. 추가적으로, 경쟁 검정법에서 PD-L1과 함께 ELISA가 또한 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 경쟁 검정법은 유동 세포측정법이다.
IV. 항-PD-L1 항체를 이용하는 방법
본 명세서의 특정 측면들은 치료요법적 항-PD-L1항체 치료에 대하여 암을 가진 대상의 반응성을 평가하기 위하여, 당해 대상의 생물학적 샘플 안에 인간 PD-L1의 발현을 탐지하거나, 또는 그 발현을 정량화시키는 방법에 관계한다. 본원에서 기술된 바와 같이, 그리고 이론에 결부되지 않고, PD-L1의 발현 수준, 예를 들면, 생물학적 샘플 안에서 세포 표면 상에 발현된 인간 PD-L1의 수준을 이용하여 암 (예를 들면, PD-L1-발현시키는 암)을 진단하고, 그리고 암 요법 (예를 들면, 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료)에 대한 반응을 평가하는데 이용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 명세서의 항-PD-L1 항체는 인간 PD-L1로의 결합에 있어서 치료요법적 항-PD-L1 항체 (예를 들면, 아테졸리주맙)와 경쟁하지 않는다(실시예 1 및 2 참고). 유리하게는, 본 명세서의 항-PD-L1 항체는 예를 들면, 유동 세포측정 검정법을 이용하여, 치료요법적 항-PD-L1 항체, 이를 테면 아테졸리주맙 존재 하에서 면역 세포 및 종양 세포로부터 PD-L1 발현을 정량화시키는데 이용될 수 있다. 이점은 다른 상업적으로 이용가능한 항-PD-L1 항체, 이를 테면, PD-L1 클론 29E.23과는 대조적인데, 이것은 인간 항-PD-L1로의 결합에 있어서 치료요법적 항-PD-L1 항체 (예를 들면, 아테졸리주맙)와 경쟁하고, 따라서 면역 세포와 종양 세포의 표면 상에 PD-L1 발현을 정량화시킴에 있어서 이의 사용이 저지된다.
본 명세서의 방법은 그중에서도, 치료요법적 항-PD-L1항체로 치료를 받았던/받게 될/받고 있는 암을 갖고 있는 대상의 투여를 조절/조정/결정/선택하기 위하여, 치료요법적 항-PD-L1항체로의 치료에 대하여 암이 있는 대상을 선별하기 위하여, 치료요법적 항-PD-L1항체에 대한 대상의 반응을 평가하기 위하여, 암을 가지고 있고, 치료요법적 항-PD-L1항체로 치료를 받았던 대상의 무-진행 생존을 평가하기 위하여, 암을 가지고 있고, 치료요법적 항-PD-L1항체로 치료를 받았던 대상에서 종양 부하(burden)를 평가하기 위하여, 암을 가지고 있고, 치료요법적 항-PD-L1항체로 치료를 받았던 대상에서 암 진행을 예측하기 위하여, PD-L1-발현시키는 암을 가진 대상을 진단하기 위하여, 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료에 반응성인 암을 가진 대상을 진단하기 위하여, 그리고 암을 가지고 있고, 치료요법적 항-PD-L1항체로 치료를 받았던 대상에서 암 진행을 진단하기 위하여 이용될 수 있다. 암의 예로는 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 및/또는 급성 골수성 백혈병을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 암은 PD-L1-발현시키는 암이다.
본원에서 제공된 바의 임의의 항-PD-L1 항체는 생물학적 샘플 안에 PD-L1의 존재를 탐지하는데 유용하다. 특정 구체예들에서, 본원에서 제공된 바의 임의의 항-PD-L1 항체는 생물학적 샘플 안에 PD-L1 수준을 정량화하는데 유용하다. 특정 구체예들에서, 본원에서 제공된 바의 임의의 항-PD-L1 항체는 면역 세포를 포함하는 생물학적 샘플 안에 PD-L1의 존재를 탐지하는데 유용하다. 특정 구체예들에서, 본원에서 제공된 바의 임의의 항-PD-L1 항체는 종양 세포를 포함하는 생물학적 샘플 안에 PD-L1의 존재를 탐지하는데 유용하다. 특정 구체예들에서, 본원에서 제공된 바의 임의의 항-PD-L1 항체는 살아있는 세포를 포함하는 생물학적 샘플 안에 PD-L1의 존재를 탐지하는데 유용하다. 특정 구체예들에서, 본원에서 제공된 바의 임의의 항-PD-L1 항체는 생물학적 샘플 안에 PD-L1의 존재를 탐지하는데 유용하며, 이때 상기 생물학적 샘플은 치료요법적 항-PD-L1 항체로 치료를 받았던 대상으로부터 유래된 샘플이다. 특정 구체예들에서, 본원에서 제공된 바의 임의의 항-PD-L1 항체는 예를 들면, 유동 세포측정, 면역검정법 (예를 들면 ELISA-기반의 검정법 및 근접 연장(proximity extension) 검정법), 웨스턴 블랏팅, 펩티드 마이크로어레이, 면역조직화학, 및/또는 질량 분석법을 이용하여 생물학적 샘플에서 PD-L1의 존재를 탐지하는데 유용하다. 특정 구체예들에서, 본원에서 제공된 바의 임의의 항-PD-L1 항체는 생물학적 샘플 안에 PD-L1의 존재를 탐지하는데 유용하며, 이때 상기 생물학적 샘플은 혈액 샘플이다. 특정 구체예들에서, 본원에서 제공된 바의 임의의 항-PD-L1 항체는 생물학적 샘플 안에 PD-L1의 존재를 탐지하는데 유용하며, 이때 상기 생물학적 샘플은 골수 샘플이다.
탐지 라벨
일부 구체예들에서, 상기 항-PD-L1 항체는 반응성 모이어티, 활성화된 모이어티, 또는 반응성 시스테인 티올기를 통하여 당해 항체에 공유적으로 결함할 수 있는 임의의 라벨 모이어티에 접합된다 (Singh 외 (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL). 상기 부착된 라벨은 다음의 기능을 할 수 있다: (i) 탐지가능한 신호를 제공하고; (ii) 제 2 라벨과 상호작용하여 상기 제 1 또는 제 2 라벨에 의해 제공되는 탐지가능한 신호를 변형시키고, 예를 들면, FRET (형광 공명 에너지 전달)을 제공하기 위하여; (iii) 항원 또는 리간드와의 상호작용을 안정화시키거나 또는 결합의 친화력을 증가시키고; (iv) 운동성, 가령, 전기영동 운동성, 또는 전하, 소수성, 모양 또는 다른 물리적 매개변수에 의한 세포-침투성에 영향을 주고, 또는 (v) 리간드 친화력, 항체/항원 결합, 또는 이온 복합체화를 조정하기 위하여 포획 모이어티를 제공한다.
가령, 희토류 킬레이트 (유로피움 킬레이트), FITC를 포함한 플루오레세인 유형, 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시 플루오레세인과 같은 형광 라벨; TAMRA를 포함한 로다민 유형; 단실; 리사민(Lissamine); 시아닌; 피코에리트린; 텍사스 레드(Texas Red); 및 이들의 유사체. 상기 형광 라벨은 예를 들어, 상기 Current Protocols in Immunology에 개시된 기술을 사용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광 염료 및 형광 라벨 시약은 Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) 및 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL)로부터 시판되는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 형광단은 R-피코에리트린 (PE), PE-Cy7, Alexa Fluor 488, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 페리디닌 클로로필 단백질 복합체 (PerCP), BV421, BV510, APC-H7, Alexa Fluor 647 또는 알로피코시아닌 (APC)이다. 일부 구체예들에서, 상기 형광단은 R-피코에리트린 (PE)이다. 일부 구체예들에서, 상기 형광단은 PE-Cy7이다. 일부 구체예들에서, 상기 형광단은 Alexa Fluor 488이다. 일부 구체예들에서, 상기 형광단은 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)이다. 일부 구체예들에서, 상기 형광단은 페리디닌 클로로필 단백질 복합체 (PerCP)이다. 일부 구체예들에서, 상기 형광단은 BV421이다. 일부 구체예들에서, 상기 형광단은 BV510이다. 일부 구체예들에서, 상기 형광단은 APC-H7이다. 일부 구체예들에서, 상기 형광단은 Alexa Fluor 647이다. 일부 구체예들에서, 상기 형광단은 알로피코시아닌 (APC)이다.
라벨된 시스테인 공작된 항체는 특정 세포, 조직, 또는 혈청에서 예를 들면, 관심 대상 항원 발현 탐지를 위하여 진단 검정법에 유용할 수 있다. 진단에 적용을 위하여, 상기 항체는 전형적으로 탐지가능한 모이어티로 라벨될 것이다. 일반적으로 다음 범주로 그룹화할 수 있는 수많은 라벨이 있다.
방사성동위원소 (방사성핵종), 이를 테면, 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, 또는 213Bi. 방사성동위원소 라벨된 항체는 수용체 표적화 이미징 실험에 유용하다. 상기 항체는 Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, New York, NY, Pubs. (1991)에 기술된 기술을 사용하여, 시약이 항체의 조작된 시스테인 티올과 반응성인 방사성 동위 원소 금속에 결합하거나, 킬레이트를 형성하거나, 또는 그렇지 않으면 복합체를 형성하는 리간드 시약으로 라벨될 수 있다. 금속 이온과 복합체를 형성할 수 있는 킬레이트 리간드에는 DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA 및 TETA (Macrocyclics, Dallas, TX)가 포함된다. 방사성핵종은 본 발명의 항체-약물 접합체와의 복합체화를 통하여 표적화될 수 있다 (Wu 외, (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146).
Axworthy 외, ((2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1802-1807)의 절차에 따라, 이를 테면, DOTA-말레이 미드 (4-말레이미도부틸아미도벤질-DOTA)와 같은 링커 시약은 이소프로필클로로포르메이트 (Aldrich)로 활성화된 4-말레이미도부티르산 (Fluka)과 아미노벤질-DOTA의 반응에 의해 제조될 수 있다. DOTA-말레이미드 시약은 시스테인 공작된 항체의 유리 시스테인 아미노산과 반응하여, 항체에 금속 착물(complexing) 리간드를 제공한다 (Lewis 외, (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86). DOTA-NHS (1,4,7,10-테트라아자사이클로도 데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 모노 (N-하이드록시숙시니미드 에스테르))와 같은 킬레이트 링커 라벨링 시약은 상업적으로 이용 가능하다(Macrocyclics, Dallas, TX). 방사성핵종 라벨된 항체를 사용한 수용체 표적 영상화는 종양 조직에서 항체의 점진적 축적의 탐지 및 정량화에 의해 경로 활성화의 마커를 제공할 수 있다(Albert 외 (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210). 접합된 방사성-금속은 리소좀 분해 후에 세포 내에 남아있을 수 있다.
영상화 실험을 위한 항체 라벨로서 적합한 금속-킬레이트 복합체들이 하기에 개시된다: US 5,342,606; US 5,428,155; US 5,316,757; US 5,480,990; US 5,462,725; US 5,428,139; US 5,385,893; US 5,739,294; US 5,750,660; US 5,834,456; Hnatowich 외 (1983) J. Immunol. Methods 65:147-157; Meares 외 (1984) Anal. Biochem. 142:68-78; Mirzadeh 외 (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65; Meares 외 (1990) J. Cancer1990, Suppl. 10:21-26; Izard 외 (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350; Nikula 외 (1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90; Camera 외 (1993) Nucl. Med. Biol. 20:955-62; Kukis 외 (1998) J. Nucl. Med. 39:2105-2110; Verel 외 (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Camera 외 (1994) J. Nucl. Med. 21:640-646; Ruegg 외 (1990) Cancer Res. 50:4221-4226; Verel 외 (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Lee 외 (2001) Cancer Res. 61:4474-4482; Mitchell, 외 (2003) J. Nucl. Med. 44:1105-1112; Kobayashi 외 (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111; Miederer 외 (2004) J. Nucl. Med. 45:129-137; DeNardo 외 (1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90; Blend 외 (2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363; Nikula 외 (1999) J. Nucl. Med. 40:166-76; Kobayashi 외 (1998) J. Nucl. Med. 39:829-36; Mardirossian 외 (1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74; Roselli 외 (1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20.
다양한 효소-기질 라벨이 이용 가능하거나 또는 개시되어 있다 (US 4275149). 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매한다. 예를 들면, 효소는 기질의 색상 변화를 촉매할 수 있으며, 이는 분광 광도계로 측정될 수 있다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학 발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량화하는 기술은 상기에 기술되어 있다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기된(excited) 후, (예를 들어 화학 발광계를 사용하여) 측정될 수 있거나 형광 수용체에 에너지를 제공할 수 있는 광을 방출할 수 있다. 효소 라벨의 예로는 루시퍼라제 (예를 들어, 반딧불이 루시퍼 라제 및 박테리아 루시페라제; US 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 탈수소효소, 우레아제, 과산화 효소, 예컨대 양고추냉이 과산화효소(HRP), 알칼리 포스파타제 (AP), β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당 산화효소 (예를 들어, 글루코스 산화효소, 갈락토스 산화효소 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소), 헤테로시 클릭 산화효소 (예컨데, 유리카제 및 크산틴 산화 효소와 같은), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 및 이와 유사한 것들이 포함된다. 효소를 항체에 접합시키는 기술이 O'Sullivan 외 (1981) “Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay”, in Methods in Enzym (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166에 설명되어 있다. 효소-기질 조합물의 예는 예를 들어, 다음을 포함한다: (i) 기질로서 과산화수소를 갖는 양고추냉이 과산화효소(HRP)를 포함하며, 여기서 수소 과산화 효소는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시키고); (ii) 발색 기질로서 파라-니트로 페닐 포스페이트를 갖는 알칼리 포스파타제 (AP); 및 (iii) 발색 기질을 갖는 β-D-갈락토시다제(β-D-Gal) (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 플루오로제닉 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제. 수많은 다른 효소-기질 조합물이 당업자에게 이용가능하다. 전반적인 검토를 위하여 US 4275149 및 US 4318980 참고.
라벨은 아미노산 측쇄, 활성화된 아미노산 측쇄, 시스테인 조작 된 항체 및 이와 유사한 것들과 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체는 바이오틴과 접합될 수 있고, 상기 언급 된 3 가지 광범위한 카테고리의 라벨 중 어느 하나는 아비딘 또는 스트렙타비딘과 접합될 수 있으며, 그 역도 마찬가지이다. 바이오틴은 스트렙타비딘에 선택적으로 결합하므로, 당해 라벨은 이러한 간접적인 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드 변이체와 라벨의 간접 접합을 달성하기 위해, 폴리펩티드 변이체는 작은 합텐 (예를 들어, 디곡신)과 접합되고, 상기 언급된 상이한 유형의 라벨중 하나는 항-합텐 폴리펩티드 변이체 (예를 들어, 항-디곡신 항체)에 접합된다. 따라서, 폴리펩티드 변이체와 표지의 간접 접합체가 획득될 수 있다 (Hermanson, G. (1996) in Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego).
탐지 라벨은 결합 또는 인지 사건(evnet)을 국소화, 시각화 및 정량화하는데 유용할 수 있다. 상기 라벨된 본 발명의 항체는 세포-표면 수용체를 탐지할 수 있다. 검출가능하게 라벨된 항체의 또다른 용도는 비드를 형광 라벨된 항체와 접합시키고, 리간드의 결합시 형광 신호를 검출하는 것을 포함하는 비드-기반 면역포획법이다. 유사한 결합 검출 방법론은 표면-플라즈몬 공명 (SPR) 효과를 이용하여, 항체-항원 상호 작용을 측정하고 검출하는 것이다.
탐지 라벨, 이를 테면 형광 염료 및 화학적발광 염료 (Briggs 외 (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1:1051-1058)는 탐지가능한 신호를 제공하며, 일반적으로 항체 라벨링에 적용할 수 있으며, 선호적으로는 다음의 성질을 갖는다: (i) 상기 라벨된 항체는 소량의 항체가 무-세포 및 세포-기반의 검정법에서 민감하게 탐지될 수 있도록 배경은 낮고, 매우 높은 신호를 생성해야 하고; 그리고 (ii) 상기 라벨된 항체는 형광 신호가 유의적인 광 표백(bleaching) 없이 관찰, 모니터, 및 기록될 수 있도록 광안정적이어야 한다. 라벨된 항체가 막 또는 세포 표면, 특히 살아있는 세포의 세포 표면 결합에 관련된 적용의 경우, 바람직하게는 상기 라벨은 (iii) 효과적인 접합체 농도 및 검출 감도를 달성하기 위해 우수한 수용성(water-solubility)을 가지며, 그리고 (iv) 살아있는 세포에 비-독성이어서, 세포의 정상적인 대사 과정을 방해하지 않거나 또는 조기 세포 사멸을 유발하지 않는다.
세포 형광 강도의 직접적인 정량 및 형광 라벨된 사례의 열거, 이를 테면, 펩티드-염료 접합체의 세포 표면 결합은 시스템(FMAT®8100 HTS System, Applied Biosystems, Foster City, Calif.)에서 수행될 수 있는데, 이 시스템은 살아있는 세포 또는 비드로 혼합-및-판독, 비-방사성 분석을 자동화한다(Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204). 라벨된 항체의 용도는 또한 세포 표면 수용체 결합 검정법, 면역포획 검정법, 형광 연계된 면역흡착 검정법 (FLISA), 카스파제-절단 (Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23; US 6,372,907), 아팝토시스 (Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol. Methods 184:39-51) 및 세포독성 검정법이 포함된다. 형광계측 마이크로볼륨(Fluorometric microvolume) 검정 기술을 사용하여, 세포 표면을 표적으로 하는 분자에 의한 상향 또는 하향 조절을 식별할 수 있다(Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271:143-51).
라벨된 본 명세서의 항-PD-L1 항체는 하기의 생의학 및 분자 영상화의 다양한 방법 및 기술에 의해 영상 바이오마커 및 프로브로 유용할 수 있다: (i) MRI (자기 공명 영상화); (ii) MicroCT (전산화 단층촬영); (iii) SPECT (단일 광자 방출 전산화 단층촬영); (iv) PET (양전자 방출 단층촬영) Chen 외 (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49; (v) 생체발광; (vi) 형광; 및 (vii) 초음파. 면역신티그래피(Immunoscintigraphy)는 방사성 물질로 라벨된 항체를 동물 또는 인간 환자에게 투여하고, 당해 항체가 국소화되는 신체 부위를 촬영하는 영상화 절차다(US 6528624). 영상화 바이오마커는 객관적으로 측정되고, 치료학적 개입에 대한 정상적인 생물학적 과정, 발병 과정 또는 약리학적 반응의 지표로서 평가될 수 있다. 바이오마커는 여러 유형이 될 수 있다: 타입 0은 질병의 자연력 마커이며, 알려진 임상 지표, 예를 들어 류마티스 관절염에서 활액 염증의 MRI 평가와 관련되며; 타입 I 마커는 작용-기전에 따라 중재 효과를 포착하지만, 당해 기전이 임상 결과와 무관할 수도 있고; 유형 II 마커는 변화가 있거나, 이 변화로부터 신호를 보내는 대리(surrogate) 종점으로 기능을 하며, 당해 바이오마커는 CT에 의한 류마티스 관절염에서 측정된, 골 침식과 같은 표적화된 반응을 "확인"하는 임상적 이점을 예측한다. 따라서, 영상화 바이오마커는 (i) 표적 단백질의 발현, (ii) 표적 단백질에 치료요법제의 결합, 즉 선택성, 그리고 (iii) 클리어런스 및 반감기-약동학 데이터에 관한 약력학(PD) 치료 정보를 제공할 수 있다. 실험실-기반 바이오마커와 비교하여, 생체 내 영상화 바이오마커의 장점은 다음을 포함한다: 비-침습적 치료, 정량화가능한 전신 평가, 반복적 투여 및 평가, 즉 여러 시점, 및 전임상 (작은 동물)에서 부터 임상 (인간) 결과까지의 잠재적으로 이전가능한 효과. 일부 응용의 경우, 바이오영상화는 전임상 연구에서 동물 실험을 대체하거나 최소화시킨다.
생물학적 샘플
특정 구체예들에서, 생물학적 샘플은 적혈구, 백혈구, 혈소판, 혈청 및 혈장이 포함된 전혈 또는 전혈 성분들, 복수, 유리 체액, 림프액, 활액, 여포 액, 정액, 양수, 젖, 타액, 가래, 눈물, 땀, 점액, 뇌척수액, 소변과 같은 과 같은 생물학적 유체 및 기타 신체 구성 성분이다. 특정 구체예들에서, 상기 생물학적 샘플은 말초 혈액 샘플이다. 특정 구체예들에서, 상기 생물학적 샘플은 골수 샘플이다. 특정 구체예들에서, 생물학적 샘플은 암 샘플이다. 특정 구체예들에서, 생물학적 샘플은 종양 생검이다. 다양한 구체예들에서, 상기 샘플은 임의 동물의 신체 샘플이다. 다양한 구체예들에서, 상기 샘플은 인간에서 얻은 샘플이다. 특정 구체예들에서, 상기 샘플은 살아있는 세포를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 샘플은 면역 세포를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 샘플은 종양 세포를 포함한다.
따라서, 본 명세서의 특정 측면은 대상으로부터 수득한 생물학적 샘플 안에 PD-L1을 탐지하는 방법에 관계하는데, 이 방법은 다음 단계들을 포함한다: 생물학적 샘플에 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편을 접촉시키는 단계와 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 상기 생물학적 샘플 안에 있는 PD-L1에 결합하는 지를 탐지하는 단계, 이로써 상기 생물학적 샘플 안에 PD-L1이 탐지된다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 유동 세포측정법, 면역검정법 (예를 들면 ELISA-기반의 검정법 및 근접 연장 검정법), 웨스턴 블랏팅, 펩티드 마이크로어레이, 면역조직화학, 및/또는 질량 분석법을 이용하여 탐지된다. 특정 구체예들에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 유동 세포측정을 이용하여 탐지된다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 샘플은 혈액 샘플이다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 샘플은 골수 샘플이다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 샘플은 세포 또는 조직이다. 일부 구체예들에서, 상기 세포 또는 조직은 암 세포 또는 암 조직이다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 샘플은 살아있는 세포를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 대상은 암을 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 암은 PD-L1-발현시키는 암이다. 일부 구체예들에서, 상기 암은 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 및/또는 급성 골수성 백혈병이다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 샘플은 본 명세서의 치료요법적 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 투여된 대상으로부터 획득된다. 일부 구체예들에서, 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙의 3개 HVR (HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 아테졸리주맙의 3개 HVR (HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열과 아테졸리주맙의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙의 중쇄 아미노산 서열과 아테졸리주맙의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙이다. 일부 구체예들에서, 상기 대상은 인간이다.
반응의 예상/모니터링/평가
특정 구체예들에서, 본 명세서의 방법은 대상에서 암 치료를 모니터링하는 방법에 관계하는데, 이 방법은 제 1 생물학적 샘플에 본 명세서의 항-PD-L1 항체 또는 항원-결합 단편을 접촉시키고; 상기 제 1 생물학적 샘플 안에서 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 PD-L1에로의 결합을 탐지하고; 상기 제 1 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양을 결정하고; 제 2 생물학적 샘플에 본 명세서의 항-PD-L1 항체 또는 항원-결합 단편을 접촉시키고, 이때 상기 제 2 생물학적 샘플은 치료요법적 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들면, 아테졸리주맙)으로 치료한 후 획득되며; 상기 제 2 생물학적 샘플 안의 PD-L1에 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 결합을 탐지하고; 상기 제 2 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양을 결정하고; 상기 제 2 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양을 결정하고; 그리고 상기 제 1 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양을 상기 제 2 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양에 비교한다.
일부 구체예들에서, 상기 제 1 생물학적 샘플과 비교하였을 때, 상기 제 2 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양의 증가는 당해 대상이 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료에 반응하지 않음을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 생물학적 샘플과 비교하였을 때, 상기 제 2 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양의 최소한 1%, 최소한 2%, 최소한 3%, 최소한 4%, 최소한 5%, 최소한 10%, 최소한 15%, 최소한 20%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 35%, 최소한 40%, 최소한 45%, 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 또는 최소한 100% 증가는 당해 대상이 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 (예를 들면, 아테졸리주맙)에 대하여 비-반응성임을 나타낸다.
일부 구체예들에서, 상기 제 1 생물학적 샘플과 비교하였을 때, 상기 제 2 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양의 감소는 당해 대상이 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료에 반응함을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 생물학적 샘플과 비교하였을 때, 상기 제 2 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양이 최소한 10%, 최소한 15%, 최소한 20%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 35%, 최소한 40%, 최소한 45%, 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 또는 최소한 95% 감소한다는 것은 당해 대상이 상 치료요법적 항-PD-L1 항체 (예를 들면, 아테졸리주맙)로의 치료에 반응함을 나타낸다.
일부 구체예들에서, 상기 제 1 생물학적 샘플은 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 상기 대상을 치료하기 전에 획득된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 생물학적 샘플은 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 상기 대상을 치료하기 후에 획득된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 및 제 2 생물학적 샘플은 혈액 샘플이다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 및 제 2 생물학적 샘플은 골수 샘플이다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 및 제 2 생물학적 샘플은 세포 또는 조직이다. 일부 구체예들에서, 상기 세포 또는 조직은 암 세포 또는 암 조직이다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 및 제 2 생물학적 샘플은 살아있는 세포를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 대상은 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 및/또는 급성 골수성 백혈병의 암을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 대상은 암을 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 암은 PD-L1-발현시키는 암이다. 일부 구체예들에서, 상기 암은 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 및/또는 급성 골수성 백혈병이다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적 샘플은 본 명세서의 치료요법적 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 투여된 대상으로부터 획득된다. 일부 구체예들에서, 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙의 3개 HVR (HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 아테졸리주맙의 3개 HVR (HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열과 아테졸리주맙의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙의 중쇄 아미노산 서열과 아테졸리주맙의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙이다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 유동 세포측정법, 면역검정법 (예를 들면 ELISA-기반의 검정법 및 근접 연장 검정법), 웨스턴 블랏팅, 펩티드 마이크로어레이, 면역조직화학, 및/또는 질량 분석법을 이용하여 탐지된다. 특정 구체예들에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 유동 세포측정을 이용하여 탐지된다. 일부 구체예들에서, 상기 대상은 인간이다.
특정 구체예들에서, 본 명세서의 방법은 암 (예를 들면, PD-L1-발현시키는 암)이 있는 대상이 치료요법적 항-PD-L1 항체 (예를 들면, 아테졸리주맙)을 이용한 치료에 대한 반응을 평가, 모니터링, 또는 예측하는 방법에 관계한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 제 1 시점에서 대상으로부터 획득한 샘플 안에 PD-L1 발현 수준을 측정 또는 탐지하고, 그리고 제 2 시점에서 대상으로부터 획득한 샘플 안에 PD-L1 발현 수준을 측정 또는 탐지하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체를 투여한 이후이다. 일부 구체예들에서, 상기 대상은 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체를 제공받지 않았다. 일부 구체예들에서, 상기 대상은 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료 중에 있다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 제 1 시점에서 대상으로부터 획득한 샘플 안에 PD-L1 발현 수준을 측정 또는 탐지하고, 당해 대상에게 치료요법적으로 효과량의 치료요법적 항-PD-L1 항체 (예를 들면, 아테졸리주맙)를 투여하고, 그리고 제 2 시점에서 대상으로부터 획득한 샘플 안에 PD-L1 발현 수준을 측정 또는 탐지하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 시점은 당해 대상에게 치료요법적 항-PD-L1 항체를 투여하기 전이다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체를 투여한 이후이다. 일부 구체예들에서, 상기 대상은 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체를 제공받지 않았다. 일부 구체예들에서, 상기 대상은 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료 중에 있다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 상기 제 1 시점과 비교하였을 때, 상기 제 2 시점에서 당해 대상으로부터 획득한 샘플 안에 PD-L1의 발현 수준에 근거하여 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료에 대하여 당해 대상이 반응성인지 또는 비-반응성인지를 분류하고, 이때 상기 제 2 시점에서 PD-L1 발현 수준의 감소는 상기 대상이 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 (예를 들면, 아테졸리주맙)를 이용한 치료에 반응성이거나, 또는 반응성일 수 있음을 나타낸다.
일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점의 PD-L1 발현 수준이 상기 제 1 시점보다 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만의 감소, 또는 감소가 없거나, 또는 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 5% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100% 이상의 증가는 당해 대상이 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 (예를 들면, 아테졸리주맙)에 대하여 비-반응성임을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 시점의 PD-L1 발현 수준이 상기 제 2 시점에서 감소가 되지 않았음은 당해 대상이 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체에 대하여 비-반응성임을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 시점의 PD-L1 발현 수준이 상기 제 2 시점에서 증가된다는 것은 당해 대상이 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체에 대하여 비-반응성임을 나타낸다.
일부 구체예들에서, 상기 제 1 시점에서 PD-L1 수준이 상기 제 2 시점에서 최소한 10%, 최소한 15%, 최소한 20%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 35%, 최소한 40%, 최소한 45%, 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 또는 최소한 95% 감소됨은 당해 대상이 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 (예를 들면, 아테졸리주맙)에 대하여 반응성임을 나타낸다.
일부 구체예들에서, 반응성은 치료 효과를 지칭할 수 있다. 당업자는 많은 치료 효능 측정치 및 이들의 조합이 유용할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구체예들에서, 치료 효능은 종양 반응 (예를 들어, 종양 크기, 성장 또는 조직 학적 단계의 안정화 또는 감소)을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 치료 효능은 생존 증가 (예를 들어, 1-년, 5-년, 무병 또는 전체), 삶의 질 증가, 진행까지의 시간 증가, 또는 이환율 감소를 포함할 수 있다. 이러한 요인은 로지스틱 회귀, Cox의 비례 위험 회귀 또는 Kaplan-Meier 추정과 같은 통계 도구를 사용하여 평가할 수 있다.
치료의 지속/중단/조정
본원에 기재된 바와 같이, 치료요법적 항-PD-L1 항체 (예를 들면, 아테졸리주맙)를 투여한 후, 대상의 샘플 안에 PD-L1 발현 수준을 측정하여 후속 치료를 유도할 수 있는데, 예를 들면, 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료의 지속, 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료의 중단, 또는 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료의 조정을 유도할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들에서, 본 명세서의 방법은 암(예를 들면, PD-L1-발현시키는 암)을 가진 대상에서 치료요법적 항-PD-L1 항체 (예를 들면, 아테졸리주맙)를 이용한 치료를 조정하는 방법에 관계한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 제 1 시점에서 대상으로부터 획득한 샘플 안에 PD-L1 발현 수준을 측정 또는 탐지하고, 당해 대상에게 치료요법적으로 효과량의 치료요법적 항-PD-L1 항체를 투여하고, 그리고 제 2 시점에서 대상으로부터 획득한 샘플 안에 PD-L1 발현 수준을 측정 또는 탐지하고, 그리고 상기 제 1 시점과 제 2 시점간에 PD-L1 발현 수준의 변화에 근거하여 당해 대상에게 투여되는 치료요법적 항-PD-L1 항체의 양을 조정하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 시점은 당해 대상에게 치료요법적 항-PD-L1 항체를 투여하기 전이다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체를 투여한 이후이다.
일부 구체예들에서, 상기 대상에게 투여되는 치료요법적 항-PD-L1 항체의 양의 조정은 상기 대상에게 투여되는 치료요법적 항-PD-L1 항체의 동일한 수준을 유지하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 대상에게 투여되는 치료요법적 항-PD-L1 항체의 양의 조정은 상기 대상에게 투여되는 치료요법적 항-PD-L1 항체의 수준을 증가시키는 것을 포함한다. 상기 대상에 투여된 치료요법적 항-PD-L1 항체 수준의 증가는 다음중 하나 또는 그 이상을 지칭하나, 이에 국한되지 않는다:당해 대상에게 투여되는 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체의 양, 투여, 횟수, 또는 투여 빈도 또는 농도의 증가.
일부 구체예들에서, 상기 대상에게 투여되는 치료요법적 항-PD-L1 항체의 양의 조정은 상기 대상에게 투여되는 치료요법적 항-PD-L1 항체의 수준을 감소시키는 것을 포함한다. 상기 대상에 투여된 치료요법적 항-PD-L1 항체 수준의 감소는 다음중 하나 또는 그 이상을 지칭하나, 이에 국한되지 않는다:당해 대상에게 투여되는 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체의 양, 투여, 횟수, 또는 투여 빈도 또는 농도의 감소.
암 진행의 예측
특정 구체예들에서, 본 명세서의 방법은 암 (예를 들면, PD-L1-발현시키는 암)을 갖는 대상의 무-진행 생존을 평가하는 방법에 관계한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 제 1 시점에서 대상으로부터 획득한 샘플 안에 PD-L1 발현 수준을 측정 또는 탐지하고, 당해 대상에게 치료요법적으로 효과량의 치료요법적 항-PD-L1 항체 (예를 들면, 아테졸리주맙)를 투여하고, 그리고 제 2 시점에서 대상으로부터 획득한 샘플 안에 PD-L1 발현 수준을 측정 또는 탐지하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 시점은 당해 대상에게 치료요법적 항-PD-L1 항체를 투여하기 전이다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체를 투여한 이후이다.
일부 구체예들에서, 상기 제 1 시점에서 PD-L1 수준이 상기 제 2 시점에서 최소한 10%, 최소한 15%, 최소한 20%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 35%, 최소한 40%, 최소한 45%, 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 또는 최소한 95% 감소됨은 당해 대상이 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 (예를 들면, 아테졸리주맙)는 무-진행 생존을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
PD-L1-발현시키는 암을 갖는 대상에서 암 진행을 예측하는 방법이 또한 본원에서 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 제 1 시점에서 대상으로부터 획득한 샘플 안에 PD-L1 발현 수준을 측정 또는 탐지하고, 당해 대상에게 치료요법적으로 효과량의 치료요법적 항-PD-L1 항체 (예를 들면, 아테졸리주맙)를 투여하고, 그리고 제 2 시점에서 대상으로부터 획득한 샘플 안에 PD-L1 발현 수준을 측정 또는 탐지하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 시점은 당해 대상에게 치료요법적 항-PD-L1 항체를 투여하기 전이다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체를 투여한 이후이다.
일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점의 PD-L1 발현 수준이 상기 제 1 시점보다 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만의 감소, 또는 감소가 없거나, 또는 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 5% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100% 이상의 증가는 당해 대상은 진행될 가능성이 있는 암을 갖고 있음을 나타낸다.
시점 측정
본 명세서의 방법, PD-L1의 발현 수준은 암 (예를 들면, PD-L1-발현시키는 암)을 갖는 대상에서 제 1 시점 (예를 들면, 기저수준)과 제 2 시점 간을 비교한다. 일부 구체예들에서, 상기 대상은 PD-L1-발현시키는 암을 갖는다.
일부 구체예들에서, 상기 제 1 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체 (예를 들면, 아테졸리주맙)로 치료 전, 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 탐지하는데 이용된다. 예를 들면, 대상에서 PD-L1의 발현 수준은 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 전에 측정될 수 있고, 그리고 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료 후 취해진 하나 또는 그 이상의 샘플을 이용하여 그중에서도, 치료 효과를 모니터하고, 당해 치료를 계속 또는 중단할 지 결정하고, 당해 치료에 대한 반응을 모니터링하고, 당해 치료를 조정하고, 당해 치료에 대한 반응을 모니터링하고, 유지 치료에 대한 반응을 예측하고, 암 진행을 예측하고, 그리고 기타 등등에 이용할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 제 1 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료 직전, 또는 약 10 초 전, 약 30 초 전, 약 1 분 전, 약 5 분 전, 약 10 분 전, 약 15 분 전, 약 30 분 전, 약 45 분 전, 약 1 시간 전, 약 1.5 시간 전, 약 2 시간 전, 약 2.5 시간 전, 약 3 시간 전, 약 3.5 시간 전, 약 4 시간 전, 약 4.5 시간 전, 약 5 시간 전, 약 5.5 시간 전, 약 6 시간 전, 약 7 시간 전, 약 8 시간 전, 약 9 시간 전, 약 10 시간 전, 약 11 시간 전, 약 12 시간 전, 약 18 시간 전, 약 1 일 전, 약 2 일 전, 약 3 일 전, 약 4 일 전, 약 5 일 전, 약 6 일 전, 약 1 주 전, 약 2 주 전, 약 3 주 전, 또는 약 4 주 전 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료의 약 1 시간 전, 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료의 약 4 시간 전, 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료의 약 1 일 전, 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료의 약 3 일 전, 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 특이적 구체예들에서, 상기 치료에 이용된 치료요법적 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙이다.
일부 구체예들에서, 상기 제 1 시점 은 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료 전, 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용되며, 제 2 시점에서 PD-L1의 발현 수준과 비교될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료 후, 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다 (예를 들면, 제 1 시점은 치료요법적으로 효과량의 치료요법적 항-PD-L1 항체의 최초 투여 전 취해질 수 있고, 이는 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체의 상기 제 1, 제 2, 제3, 제4, 또는 그 이후 투여 후 제2 시점에서 취해진 샘플과 비교될 수 있다). 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료 후 약 1 시간 이후, 약 2 시간 이후, 약 3 시간 이후, 약 4 시간 이후, 약 5 시간 이후, 약 6 시간 이후, 약 7 시간 이후, 약 8 시간 이후, 약 9 시간 이후, 약 10 시간 이후, 약 11 시간 이후, 약 12 시간 이후, 약 18 시간 이후, 약 1 일 이후, 약 1.5 일 이후, 약 2 일 이후, 약 2.5 일 이후, 약 3 일 이후, 약 3.5 일 이후, 약 4 일 이후, 약 4.5 일 이후, 약 5 일 이후, 약 5.5 일 이후, 약 6 일 이후, 약 6.5 일 이후, 약 1 주 이후, 약 1.5 주 이후, 약 2 주 이후, 약 2.5 주 이후, 약 3 주 이후, 약 3.5 주 이후, 약 4 주 이후, 약 1 개월 이후, 약 1.5 개월 이후, 약 2 개월 이후, 약 2.5 개월 이후, 약 3 개월 이후, 약 3.5 개월 이후, 약 4 개월 이후, 약 4.5 개월 이후, 약 5 개월 이후, 약 5.5 개월 이후, 약 6 개월 이후, 약 6.5 개월 이후, 약 7 개월 이후, 약 7.5 개월 이후, 약 8 개월 이후, 약 8.5 개월 이후, 약 9 개월 이후, 약 9.5 개월 이후, 약 10 개월 이후, 약 10.5 개월 이후, 약 11 개월 이후, 약 11.5 개월 이후, 또는 약 12 개월 이후, 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후 약 1 시간 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후 약 4 시간 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후 약 8 시간 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후 약 12 시간 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후 약 18 시간 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후 약 1 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후 약 1.5 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후 약 2 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후 약 2.5 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후 약 3 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후 약 3.5 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후 약 4 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후 약 4.5 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후 약 5 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 탐지하는데 이용된다. 특이적 구체예들에서, 상기 치료에 이용된 치료요법적 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙이다.
일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 임의의 후기 또는 차후 치료 후, 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다(예를 들면, 제 1 시점은 치료요법적 항-PD-L1 항체의 제1 투여 후 취해질 수 있고, 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체의 제 2 또는 제 3 투여 후 취해진 샘플과 비교될 수 있다). 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은임의의 후기 또는 후속적인 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후, 약 1 시간 이후, 약 2 시간 이후, 약 3 시간 이후, 약 4 시간 이후, 약 5 시간 이후, 약 6 시간 이후, 약 7 시간 이후, 약 8 시간 이후, 약 9 시간 이후, 약 10 시간 이후, 약 11 시간 이후, 약 12 시간 이후, 약 18 시간 이후, 약 1 일 이후, 약 1.5 일 이후, 약 2 일 이후, 약 2.5 일 이후, 약 3 일 이후, 약 3.5 일 이후, 약 4 일 이후, 약 4.5 일 이후, 약 5 일 이후, 약 5.5 일 이후, 약 6 일 이후, 약 6.5 일 이후, 약 1 주 이후, 약 1.5 주 이후, 약 2 주 이후, 약 2.5 주 이후, 약 3 주 이후, 약 3.5 주 이후, 약 4 주 이후, 약 1 개월 이후, 약 1.5 개월 이후, 약 2 개월 이후, 약 2.5 개월 이후, 약 3 개월 이후, 약 3.5 개월 이후, 약 4 개월 이후, 약 4.5 개월 이후, 약 5 개월 이후, 약 5.5 개월 이후, 약 6 개월 이후, 약 6.5 개월 이후, 약 7 개월 이후, 약 7.5 개월 이후, 약 8 개월 이후, 약 8.5 개월 이후, 약 9 개월 이후, 약 9.5 개월 이후, 약 10 개월 이후, 약 10.5 개월 이후, 약 11 개월 이후, 약 11.5 개월 이후, 또는 약 12 개월 이후, 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 임의의 후기 또는 후속적인 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후, 약 1 시간 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 임의의 후기 또는 후속적인 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후, 약 4 시간 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 임의의 후기 또는 후속적인 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후, 약 8 시간 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 임의의 후기 또는 후속적인 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후, 약 12 시간 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 임의의 후기 또는 후속적인 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후, 약 18 시간 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 임의의 후기 또는 후속적인 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후, 약 1 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 임의의 후기 또는 후속적인 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후, 약 1.5 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 임의의 후기 또는 후속적인 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후, 약 2 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 임의의 후기 또는 후속적인 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후, 약 2.5 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 임의의 후기 또는 후속적인 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후, 약 3 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 임의의 후기 또는 후속적인 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후, 약 3.5 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 임의의 후기 또는 후속적인 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후, 약 4 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 임의의 후기 또는 후속적인 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후, 약 4.5 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 제 2 시점은 임의의 후기 또는 후속적인 치료요법적 항-PD-L1 항체 치료 후, 약 5 일 이후 당해 대상에서 PD-L1의 발현 수준을 측정 또는 탐지하는데 이용된다. 특이적 구체예들에서, 상기 치료에 이용된 치료요법적 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙이다.
특정 구체예들에서, 상기 제 1 시점과 제 2 시점 간에 PD-L1의 발현 수준의 변화를 이용하여, 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 요법에 대한 반응에서 질병의 진행을 평가한다. 특정 구체예들에서, 상기 제 1 시점과 제 2 시점 간에 PD-L1의 발현 수준의 변화를 이용하여, 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 요법에 대한 반응에서 질환의 안정성을 평가한다. 특정 구체예들에서, 상기 제 1 시점과 제 2 시점 간에 PD-L1의 발현 수준의 변화를 이용하여, 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 요법의 연속된 투여를 결정한다. 특정 구체예들에서,상기 제 1 시점과 제 2 시점 간의 PD-L1의 발현 수준의 변화를 이용하여 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 요범의 과정을 결정한다 (예를 들면, 지속된 투여, 투여의 중단, 제 2 또는 제3 화학치료요법적제와의 병용, 투여 증가, 투여 감소, 투여 유지, 등등). 특이적 구체예들에서, 상기 치료에 이용된 치료요법적 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙이다.
기저수준의 추가 구체예는 다음과 같다: 특정 구체예들에서, 기저수준이란 치료요법적 항-PD-L1 항체 (예를 들면, 아테졸리주맙)를 이용한 치료 전 대상으로부터 취한 샘플을 지칭하고; 특이적 구체예들에서, 당해 치료에 이용된 치료요법적 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙이며; 특이적 구체예들에서, 상기 기저수준은 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 임의의 치료 전에 취한 샘플이며, 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료 후 취한 샘플과 비교에 이용된다 (예를 들면, 기저수준은 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체의 제1 투여 전에 취할 수 있으며, 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체의 제 1, 제 2, 제3, 제4, 또는 그 이후 투여 후 취해진 샘플과 비교됨); 및 특이적 구체예들에서, 상기 기저수준은 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 임의의 주어진 치료 전 취해진 샘플이며, 임의의 추후 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료 후 취한 샘플과 비교되며 (예를 들면, 기저수준은 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체의 제 1 투여 후 취해질 수 있고, 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체의 제 2 또는 제 3 투여 후 취해진 샘플과 비교됨).
V. 키트
본 발명의 검정법은 키트 형태로 제공될 수 있다. 한 구체예에서, 이러한 키트는 본원에서 기술된 항-PD-L1 항체 또는 항-PD-L1 항체를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구체예들에서, 이러한 키트는 항-PD-L1 항체 및 이러한 시약을 사용하여 분석법을 수행하는 방법에 대한 지침과 같은 의 기본 요소들을 포함하는 포장된 조합이다. 이들 기본 요소는 상기에서 정의된다.
상기 키트는 항-PD-L1 항체의 고형 지지대를 포함하며, 이는 별개의 요소로 제공되거나, 또는 상기 항-PD-L1 항체가 이미 이 지지대 상에 고정되어 있다.
상기 키트는 다른 부가제, 이를 테면 안정화제, 세척 및 배양 완충액 및 이와 유사한 것을 또한 포함할 수 있다.
상기 키트의 성분들은 예정된 비율로 제공될 것이며, 분석의 감도를 실질적으로 최대화시키기 위한 용액내 시약의 농도를 제공하기 위하여 적합하게 변화되는 다양한 시약의 상대적 양이 제공된다. 특히, 시약은 부형제를 비롯한, 일반적으로 동결 건조된 건조 분말로서 제공될 수 있으며, 이는 용해 시 테스트될 샘플과 조합하기에 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 것이다.
실시예
다음 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예 1: 항-PD-L1 항체 클론 14D3 특징의 평가
클론 14D3은 아테졸리주맙으로 공지된 단일클론 항-PD-L1 항체애 대한 특이적, 비-경쟁 클론이다. 14D3은 IgG1 이소타입 및 카파 경쇄를 갖는 마우스 항체다. 14D3을 생성하기 위한 면역원은 MOLM-1 거핵 세포 세포주였으며, 인간 PD-L1 및 시아노몰구스(Cynomolgus) PD-L1과 교차-반응성이다. 항체 14D3, 항-인간 PD-L1 항체의 경쟁 특징 및 비-경쟁 특징은 시판되는 이용가능한 항-인간 PD-L1 항체에 대하여 평가되었다.
방법
항체
2개의 시판되는 이용가능한 항-인간 PD-L1 항체의 PD-L1 결합 특징은 항-PDL-1 14D3 항체의 PD-L1 결합 특징과 비교되었다. 비교 연구에 14D3 항체의 2 가지 버젼이 이용되었는데, 한 가지 버변은 피코에리트린 (PE)으로 라벨된 것으로써, 본원에서는 항-PD-L1 PE 14D3으로 지칭되며, 다른 버젼은 Alexa Fluor 647®(AF647)로 라벨된 것으로써, 본원에서 항-PD-L1 AF647 14D3으로 지칭된다. 시판되는 항체는 PE (Biolegend)로 라벨된 항-PD-L1 항체 클론 29E.23으로써, 본원에서 항-PD-L1 PE 29E.23으로 지칭되며, 알로피코시아닌 (APC) (Biolegend)으로 라벨된 항-PD-L1 항체 클론 29E.23으로써, 본원에서 항-PD-L1 APC 29E.23으로 지칭된다.
혈액 자극
건강한 인간 대상으로부터 약 4mL 내지 5mL의 전혈을 수득하고, 항응고제로서 헤파린 나트륨을 갖는 진공관에 넣었다. 2 개의 15mL 원추형 튜브를 준비하고, 다음과 같이 라벨시켰다: 1) 자극 없는 혈액; 및 2) 자극을 받은 혈액. 각 튜브에 3 mL의 건강한 혈액을 채웠다. Miltenyi Biotec에 따르면, 전혈 1mL 당 20uL의 사용이 권장된다. 따라서, 60μl의 인산 완충 식염수 (PBS)를 비-자극 튜브인 튜브 1에 첨가하고, 60μl의 CytoStim®(Miltenyi Biotec)을 3 mL의 전혈을 포함하는 튜브 2에 첨가했다. 튜브의 캡은 느슨하게 고정되어, 산소와 CO2가 튜브 안으로 출입되도록 한다. 튜브를 37 ℃에서 24 시간 동안 CO2 인큐베이터에 두었다.
아테졸리주맙으로 차단
5 개의 5mL 밑-둥근 바닥 테스트 튜브 4 세트를 준비하고, 다음과 같이 분류했다: 1) 자극 및 무-약물; 2) 자극 +약물; 3) 무-자극 및 무-약물; 및 4) 무-자극 +약물. 혈액 샘플이 자극 단계 동안 24 시간 동안 항온처리되면, 자극된 혈액 100μL를 그룹 1과 그룹 2의 각 테스트 튜브에 추가하고, 한편 자극되지 않은 혈액 100μL를 그룹 3 및 그룹 4의 각 테스트 튜브에 첨가하였다.
아테졸리주맙은 당해 검정법의 차단 부분(blocking portion)을 위한 약물로 작용하였다. 약물 준비의 경우, 1:10 희석하기 위해 100μg/mL 농도에서 2μL의 아테졸리주맙을 PBS 18μL에 첨가하였다. "+약물"로 표시된 테스트 튜브(즉, 그룹 2 및 그룹 4)의 경우, 희석된 아테졸리주맙 1.6μl를 각 테스트 튜브에 첨가하였다. "무-약물"로 표시된 테스트 튜브(즉, 그룹 1 및 그룹 3)은 1.6μL의 PBS를 받았다. 테스트 튜브은 볼텍싱에 의해 잘 혼합시킨 다음, 어두운 곳에서 30 분 동안 실온에서 항온처리하였다.
표면 마커 착색
5 개의 표면 마커 칵테일을 준비했다 (표 2).
Figure pct00002
당해 약물 (가령, 아테졸리주맙) 또는 PBS와 항온처리 후, 표면 마커의 칵테일을 상기 항-PD-L1와 함께 또는 없는, 그리고 자극이 있는 또는 자극이 없는 혈액을 포함하는 각 테스트 튜브에 추가하였다 (표 2). 표시된 양의 칵테일을 첨가한 후, 표시된 양의 PBS를 첨가하여 총 칵테일 부피를 100μL로 만든다 (표 3). 이어서 테스트 튜브를 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 항온처리하였다.
Figure pct00003
살아있는 세포 또는 죽은 세포의 착색
Live Dead Kit(Invitrogen)를 실온으로 가져 두었다. 상기 키트는 근-적외선 형광 반응성 염료 및 DMSO를 포함하였다. 90mL 증류수에서 10mL의 10X Pharm Lyse (BD Biosciences)를 혼합하여 1X Pharm Lyse를 제조하였다. 테스트 튜브에서 세포를 표면 착색한 후, 당해 튜브를 볼텍싱하고, 3 mL의 1X Pharm Lyse를 각 테스트 튜브에 첨가하였다. Pharm Lyse의 존재 하에서 세포의 용해를 향상시키기 위해, 당해 테스트 튜브를 다시 볼텍싱하였다. 이어서 테스트 튜브를 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 테스트 튜브를 300 RCF/1500 내지 1600 RPM에서 5 분 동안 원심분리하였다. 원심 분리 후, 세포 펠렛을 흩트리지 않으면서, 상청액을 가능한 많이 흡인시켰다. 이어서, 각 테스트 튜브의 바닥을 가볍게 두드려, 세포를 3mL 인산 완충 식염수 (PBS)로 세척하기 전에 세포 펠렛을 부수었다. 당해 테스트 튜브는 300 RCF/1500 내지 1600 RPM에서 5 분 동안 한번 더 원심분리하였다. 이어서, 세포 펠렛을 흩트리지 않으면서, 상청액을 전과 같이 흡인하였다. 각 테스트 튜브의 바닥을 튕겨서, 세포 펠렛을 부수고 1 mL의 PBS를 각각의 테스트 튜브에 첨가하였다. BioRad TC20 세포 계수기를 사용하여 세포 카운트를 수행하기 위해 테스트 튜브를 선택하였다. 세포 카운트가 튜브 안에서 PBS mL 당 2 백만개 이상의 살아있는 세포인 경우, 농도를 mL 당 100 만개 살아있는 세포로 조정하고, 이에 따라 PBS를 사용하여 희석하였다. 키트로부터의 Live/Dead 염료는 50μL의 DMSO를 근적외선(Near-IR) 형광 반응성 염료 튜브에 첨가한 후, 혼합하여 제조 하였다. 1μL의 Live-Dead 염료를 각 테스트 튜브에 첨가하고, 잘 혼합 하였다. 테스트 튜브를 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 2 mL BD Pharmingen FBS에서 세척한 후, 300 RCF/1500 내지 1600 RPM에서 5 분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 흩트리지 않으면서, 상기 상청액을 가능한 많이 흡인시켰다. 45mL PBS에 16% 파라포름알데히드 3mL를 첨가하여, 1% 파라포름알데히드 용액을 제조하였다. 각 테스트 튜브의 바닥을 가볍게 두드려서, 세포 펠렛을 부수고 테스트 튜브를 와류시키기 전, 1% 파라포름알데히드 250μL의를 각각의 테스트 튜브에 첨가하였다. 마무리 준비 후 4 시간 이내에 BD FACSCantoTM II (BD Biosciences)상에서 테스트 튜브 샘플로부터 신호를 획득하였다.
보상(Compensation) 대조군도 만들었다 (표 4). 보상 대조군을 만들기 위해, 다음을 함유하도록 9 개의 5mL 밑-둥근 튜브를 준비하였다: 1) 대조군 튜브-착색 없음; 2) AF488/FITC; 3) PE; 4) PerCP; 5) PE-Cy7; 6) AF647/APC; 7) BV421; 8) BV510; 및 9) APC-H7. UltraComp eBeads (Invitrogen) 한 방울을 각 튜브에 추가했다. 표시된 항체를 지시된 부피로 첨가하였다 (표 3). 보정 대조군을 암실에서 15-20 분 동안 실온에서 항온처리였다. 이어서, 튜브를 3 mL BD FBS에서 세척한 후, 300 RCF/1500 내지 1600 RPM에서 5 분 동안 원심분리하였다. 비드 펠렛을 흩트리지 않으면서, 상기 상청액을 가능한 많이 흡인시켰다. BD FACSCantoTM II에서 획득하기 위해 각 보상 대조군 튜브에 100μL의 BD FBS를 첨가했다.
Figure pct00004
결과
아테졸리주맙이 존재하는 경우, 시판되는 항-PD-L1 PE 29E.23 항체로 착색된 세포에서 PD-L1 표면 발현 검출 수준이 감소한 것으로 관찰되었다. 구체적으로, 유동 세포측정에 의한 결합 분석에서 시판되는 항-PD-L1 PE 29E.23 항체는 건강한 증여자의 자극된 혈액 내 CD4+ T 세포 (도 2a 및 도 3a), CD8+ T 세포 (도 4a 및 도 5a) 및 CD19 B 세포 (도 6a 및 도 7a)에서 발현되는 PD-L1로의 결합에 있어서 아테졸리주맙과 경쟁한 것으로 결정되었다. CD4+ T 세포 (도 8a 및 도 9a), CD8+ T 세포 (도 10a 및 도 11a) 및 CD19 B 세포 (도 12a 및 도 13a)에서 시판되는 항-PD-L1 APC 29E.23 항체를 이용한 검정법에서 유사한 결합 결과가 관찰되었다.
대조적으로, 상기 항-PD-L1 PE 14D3 항체는 건강한 증여자의 자극된 혈액 내 CD4+ T 세포 (도 2b 및 도 3b), CD8+ T 세포 (도 4b 및 도 5b) 및 CD19 B 세포 (도 6b 및 도 7b) 에서 발현되는 PD-L1로의 결합에 있어서 아테졸리주맙과 경쟁하지 않았다. 이들 결과는 CD4+ T 세포 (도 8b 및 도 9b), CD8+ T 세포 (도 10b 및 도 11b) 및 CD19 B 세포 (도 12b 및 도 13b)에서 AF647로 라벨된 항-PD-L1 14D3 항체 (가령, 항-PD-L1 AF647 14D3 항체)까지 또한 확장되었다.
자극되지 않은 건강한 혈액에서의 결합과 비교하였을 때, 자극된 건강한 혈액에서 아테졸리주맙 존재 하에 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 CD19 B 세포 상의 PD-L1에 결합하는 PE (도14) 또는 AF647 (도15)로 라벨된 항-PD-L1 14D3 항체의 능력이 관찰된다. CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 CD19 B 세포 상에서 PD-L1로의 결합에 있어서 APC로 라벨된 항-PD-L1 29E.23 항체(도 16)와 아테졸리주맙 간의 경쟁은 자극되지 않은 건강한 혈액에서의 결합과 비교하였을 때, 자극된 건강한 혈액에서 볼 수 있을 것이다.
결론
이러한 결과에서 14D3 항체는 아테졸리주맙에 대한 포화 농도 일 것으로 예상되는 수준에서도 아테졸리주맙과 경쟁하지 않음을 보여준다. 면역 세포 및 종양 세포 (예를 들어, 살아있는 면역 세포 및 종양 세포) 표면에서의 PD-L1 발현은 검출 분석법, 예를 들어 유동 세포측정 검정법을 이용하여, 심지어 아테졸리주맙의 존재 하에서도 라벨된 14D3 항체를 사용하여 정량화될 수 있는 것으로 결정되었다. 그러나, PD-L1 클론 29E.23과 같은 다른 시판되는 항체는 면역 세포 및 종양 세포에서 PD-L1 발현의 정량화를 위한 최적의 시약으로서의 사용을 방해하는 아테졸리주맙과 경쟁하였다.
실시예 2: 항-PD-L1 14D3 항체를 이용한 다발성 골수종에서 PD-L1 발현 평가
혈액 악성 종양, 특히 다발성 골수종 환자에서 PD-L1 발현을 검출하는 능력에 대해 14D3를 평가하였다.
방법
다발성 골수종 (MM) 환자로부터 신선한 골수 및 신선한 전혈을 수집하였다. 건강한 대상들로부터 샘플이 또한 수집되었다. 골수 및 전혈을 실시예 1에 기재된 항-PD-L1 14D3 항체를 포함하는 표면 마커에 대해 헤파린처리하고, 염색하였다.
결과
항-PD-L1 14D3 항체는 골수 및 PD-1 체크-포인트 억제제로 치료되지 않았던 다발성 골수종 환자로부터 수집된 전혈에서 PD-L1의 존재를 검출할 수 있었다 (도 17).
결론
상기 14D3 항체는 말초 혈액을 순환시키는 면역 세포 뿐만 아니라 다발성 골수종과 같은 혈액 악성 종양으로 진단된 환자의 혈액 및 골수로부터의 악성 세포에 의해 발현된 PD-L1의 기준선 검출에 사용될 수 있다.
실시예 3: 항-PD-L1 14D3 항체를 이용하여 급성 골수성 백혈병 및 골수이형성 증후군에서 PD-L1 발현 평가
혈액 악성 종양, 특히 급성 골수성 백혈병 (AML) 또는 골수이형성 증후군 (MDS) 환자에서 PD-L1 발현을 검출하는 능력에 대해 14D3을 평가하였다.
방법
신선한 골수 및 신선한 전혈은 급성 골수성 백혈병 (AML) 또는 골수이형성 증후군 (MDS) 환자에서 수집되었다. 건강한 대상들로부터 샘플이 또한 수집된다. 골수 및 전혈을 실시예 1에 기재된 항-PD-L1 14D3 항체를 포함하는 표면 마커에 대해 헤파린처리하고, 염색한다.
실시예 4: 혈액 악성종양을 가진 대상에서 아테졸리주맙으로 치료한 경우 PD-L1 발현 평가
14D3 항체는 아테졸리주맙의 에피토프에 대해 경쟁적이지 않기 때문에, 치료요법적 치료의 효과를 모니터링하기 위해 아테졸리주맙을 투여받은 환자에서 PD-L1 발현을 검출하는 능력에 대해 상기 14D3 항체가 평가된다.
방법
다발성 골수종 (MM), 급성 골수성 백혈병 (AML), 또는 골수이형성 증후군 (MSD)을 포함하는 혈액 악성종양을 가진 환자들은 골수 및 혈액 샘플 안에 PD-L1의 기저 발현에 대해 평가되었다. 샘플은 실시예 2에서 기술된 바와 같이 수집되고, 처리된다. 탐지가능한 라벨, 이를 테면, PE에 연계된 항-PD-L1 14D3 항체로 착색함으로써, PD-L1 발현이 결정된다. 상기 샘플은 당해 환자들에서 PD-L1의 기저수준 발현을 결정하기 위하여 유동 세포측정을 거친다. 환자는 혈액 악성 종양의 치료에 적합한 투여 요법으로 아테졸리주맙으로 치료받는다. 혈액 및 골수 샘플은 아테졸리주맙으로 처리한 후 한 번의 시점 또는 다양한 시점에서 수집된다. 상기 샘플은 상기와 같이 처리되고, 탐지가능한 라벨 (예를 들면, PE)에 연계된 항-PD-L1 14D3 항체로 착색된다. 세포, 이를 테면, 살아있는 면역 세포 및/또는 종양 세포에서 PD-L1의 발현은 치료를 받은 환자로부터 유동 세포측정을 통하여 라벨된 항-PD-L1 14D3 항체를 탐지하여 결정된다.
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Claims (47)

  1. 단리된 항-PD-L1 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 이때 상기 항체는 다음을 포함한다:
    (a) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
    (i) 아미노산 서열 TSWMN (서열 번호:1)을 포함하는 HVR-H1;
    (ii) 아미노산 서열 RIYPRDGDTYYNGKFKD (서열 번호:2)을 포함하는 HVR-H2; 및
    (iii) 아미노산 서열 NPGGYYFDY (서열 번호:3)을 포함하는 HVR-H3; 및
    (b) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
    (i) 아미노산 서열 RASQDIHTYLN (서열 번호:4)을 포함하는 HVR-L1;
    (ii) 아미노산 서열 YTSRLHS (서열 번호:5)을 포함하는 HVR-L2; 및
    (iii) 아미노산 서열 QQVSSLPPWT (서열 번호:6)을 포함하는 HVR-L3.
  2. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 항체는 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 항체는 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 청구항 1-3중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 PD-L1에로의 결합에 대하여 기준 항체와 경쟁하지 않으며, 이때 상기 기준 항체는 다음을 포함한하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
    (i) 아미노산 서열 GFTFSDSWIH (서열 번호:11)을 포함하는 HVR-H1;
    (ii) 아미노산 서열 AWISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:12)을 포함하는 HVR-H2; 및
    (iii) 아미노산 서열 RHWPGGFDY (서열 번호:13)을 포함하는 HVR-H3; 및
    (b) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
    (i) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 번호:14)을 포함하는 HVR-L1;
    (ii) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 번호:15)을 포함하는 HVR-L2; 및
    (iii) 아미노산 서열 QQYLYHPAT (서열 번호:16)을 포함하는 HVR-L3.
  5. 청구항 4에 있어서, 이때 상기 기준 항체는 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 청구항 5에 있어서, 이때 상기 기준 항체는 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 청구항 1-6중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 모이어티에 연계된, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 청구항 7에 있어서, 이때 상기 모이어티는 탐지가능한 모이어티인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 청구항 8에 있어서, 이때 상기 탐지가능한 모이어티는 바이오틴, 스트렙타아비딘, 발광제, 효소, 형광단, 염료, 방사성 표지, 발색단, 금속 이온, 금 입자, 은 입자, 자성 입자, 폴리펩티드인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 청구항 8에 있어서, 이때 상기 탐지가능한 모이어티는 형광단인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 청구항 10에 있어서, 이때 상기 형광단은 R-피코에리트린 (PE), PE-Cy7, Alexa Fluor 488, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 페리디닌 클로로필 단백질 복합체 (PerCP), BV421, BV510, APC-H7, Alexa Fluor 647 또는 알로피코시아닌 (APC)인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 청구항 1-9중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산.
  13. 청구항 12의 핵산을 포함하는 벡터.
  14. 청구항 13에 있어서, 이때 상기 벡터는 발현 벡터인, 벡터.
  15. 청구항 14의 핵산을 포함하는 벡터.
  16. 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법에 있어서, 청구항 15에 따른 숙주 세포를 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 만드는데 적합한 조건하에서 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 숙주 세포에 의해 만들어진 항-PD-L1 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  18. 대상으로부터 획득한 생물학적 샘플 안에 PD-L1을 탐지하는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
    (a) 상기 생물학적 샘플에 청구항 1-11중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 접촉시키고; 그리고
    (b) 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 상기 생물학적 샘플 안 PD-L1에로의 결합을 탐지하고, 이로써 상기 생물학적 샘플 안에 PD-L1이 탐지된다.
  19. 청구항 18에 있어서, 이때 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 유동 세포측정을 이용하여 탐지되는, 방법.
  20. 청구항 18-19중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 생물학적 샘플은 혈액 샘플인, 방법.
  21. 청구항 18-19중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 생물학적 샘플은 골수 샘플인, 방법.
  22. 청구항 18-19중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 생물학적 샘플은 세포 또는 조직인, 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 이때 상기 세포 또는 조직은 암 세포 또는 암 조직인, 방법.
  24. 청구항 18-23중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 생물학적 샘플은 살아있는 세포를 포함하는, 방법.
  25. 청구항 18-24중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 대상은 암을 갖고 있는, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 이때 상기 암은 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 및 급성 골수성 백혈병으로 구성된 군에서 선택된, 방법.
  27. 청구항 18-26중 임의의 한 항에 있어서 이때 상기 생물학적 샘플은 치료요법적 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여받았던 대상으로부터 획득되며, 이때 상기 치료요법적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 방법:
    (a) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
    (i) 아미노산 서열 GFTFSDSWIH (서열 번호:11)을 포함하는 HVR-H1;
    (ii) 아미노산 서열 AWISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:12)을 포함하는 HVR-H2; 및
    (iii) 아미노산 서열 RHWPGGFDY (서열 번호:13)을 포함하는 HVR-H3; 및
    (b) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
    (i) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 번호:14)을 포함하는 HVR-L1;
    (ii) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 번호:15)을 포함하는 HVR-L2; 및
    (iii) 아미노산 서열 QQYLYHPAT (서열 번호:16)을 포함하는 HVR-L3.
  28. 청구항 27에 있어서, 이때 상기 치료요법적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 이때 상기 치료요법적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 방법.
  30. 대상에게서 암 치료를 모니터링하는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
    (a) 제 1 생물학적 샘플에 청구항 1-11중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 접촉시키고;
    (b) 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 상기 제 1 생물학적 샘플 안에 PD-L1에로의 결합을 탐지하고;
    (c) 상기 제 1 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양을 결정하고;
    (d) 제 2 생물학적 샘플에 청구항 1-11중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 접촉시키고, 이때 상기 제 2 생물학적 샘플은 치료요법적 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 치료 후 획득되고;
    (e) 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 상기 제 2 생물학적 샘플 안에 PD-L1에로의 결합을 탐지하고;
    (f) 상기 제 2 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양을 결정하고;
    (g) 상기 제 1 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양을 상기 제 2 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양과 비교한다.
  31. 청구항 30에 있어서, 이때 상기 제 1 생물학적 샘플과 비교하였을 때, 상기 제 2 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양의 증가는 상기 환자가 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료에 반응하지 않음을 나타내는, 방법.
  32. 청구항 30에 있어서, 이때 상기 제 1 생물학적 샘플과 비교하였을 때, 상기 제 2 생물학적 샘플 안에 존재하는 PD-L1의 양의 감소는 상기 환자가 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체를 이용한 치료에 반응한다는 것을 나타내는, 방법.
  33. 청구항 30-32중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 제 1 생물학적 샘플은 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 상기 대상을 치료하기 전에 획득되는, 방법.
  34. 청구항 30-32중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 제 1 생물학적 샘플은 상기 치료요법적 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 상기 대상을 치료한 후 획득되는, 방법.
  35. 청구항 30-34중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 제 1 및 제 2 생물학적 샘플은 혈액 샘플인, 방법.
  36. 청구항 30-34중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 제 1 및 제 2 생물학적 샘플은 골수 샘플인, 방법.
  37. 청구항 30-34중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 제 1 및 제 2 생물학적 샘플은 세포 또는 조직인, 방법.
  38. 청구항 37에 있어서, 이때 상기 세포 또는 조직은 암 세포 또는 암 조직인, 방법.
  39. 청구항 30-38중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 제 1 및 제 2 생물학적 샘플 살아있는 세포를 포함하는, 방법.
  40. 청구항 30-39중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 대상은 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 및 급성 골수성 백혈병으로 구성된 군에서 선택된 암을 가지고 있는, 방법.
  41. 청구항 30-40중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 치료요법적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 방법:
    (a) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
    (i) 아미노산 서열 GFTFSDSWIH (서열 번호:11)을 포함하는 HVR-H1;
    (ii) 아미노산 서열 AWISPYGGSTYYADSVKG (서열 번호:12)을 포함하는 HVR-H2; 및
    (iii) 아미노산 서열 RHWPGGFDY (서열 번호:13)을 포함하는 HVR-H3; 및
    (b) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
    (i) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA (서열 번호:14)을 포함하는 HVR-L1;
    (ii) 아미노산 서열 SASFLYS (서열 번호:15)을 포함하는 HVR-L2; 및
    (iii) 아미노산 서열 QQYLYHPAT (서열 번호:16)을 포함하는 HVR-L3.
  42. 청구항 41에 있어서, 이때 상기 치료요법적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.
  43. 청구항 42에 있어서, 이때 상기 치료요법적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 방법.
  44. 청구항 30-43중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-PD-L1 항체 또는 항원-결합 단편은 유동 세포측정을 이용하여 탐지되는, 방법.
  45. 청구항 18-44중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 대상은 인간인, 방법.
  46. 청구항 1-11중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물.
  47. 생물학적 샘플 안에 PD-L1을 탐지하기 위한, 청구항 1-11중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 청구항 46의 조성물을 포함하는 키트.
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