JP5730200B2 - 抗ヘプシジン−25選択的抗体およびその使用 - Google Patents
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Description
a)以下を含む軽鎖可変領域;
i)配列番号6、9、12、45、15、17、20、24および26からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR1;
ii)配列番号7、10、13、18、21および25からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR2;および
iii)配列番号8、11、14、16、19、22、23、17および28からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR3;ならびに
b)以下を含む重鎖可変領域;
i)配列番号29、32、35、38、39および42からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR1;
ii)配列番号30、33、36、40および43からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR2;および
iii)配列番号31、24、27、41および44からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR3、
を含む抗体を含む。
a)以下を含むLCVR;
i)配列番号9、12、20および26からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR1;
ii)配列番号10、13、21および25からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR2;および
iii)配列番号11、14、23および27からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR3;ならびに
b)以下を含むHCVR;
i)配列番号32、35および42からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR1;
ii)配列番号33、36および43からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR2;および
iii)配列番号34、37および44に示すアミノ酸配列を有するHCDR3、
を含む。
標準的な分子生物学技術が、組み換え発現ベクターを調製するため、宿主細胞をトランスフェクトするため、形質転換体を選択するため、本発明の抗体を産生する宿主細胞株を単離するため、それらの宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収するために使用される。
好ましくは、治療目的のために使用される本発明の抗体は、抗体が免疫反応を引き起こす可能性を減少させるために、(抗体に存在する範囲で)ヒト由来のフレームワークおよび定常領域の配列を有する。ヒト遺伝子操作抗体は、それらが治療適用に有益であり、ヒト対象に投与される場合、マウス起源の抗体またはマウス起源の部分を含む抗体で頻繁に観察されるヒト抗マウス抗体反応の可能性を減少させるので、特に興味深い。好ましくは、注入されるヒト遺伝子操作抗体は、例えばマウス抗体より、むしろ天然のヒト抗体に近い半減期を有し得るので、より少ない用量かつ少ない頻度で対象に投与できる。
本発明の抗体は、ヘプシジン−25によって促進される疾患および状態に対する性質の評価、ならびにそれらを患っている患者におけるそのような疾患および状態の検出および診断のために、組織または生体液中のヘプシジン−25の量を正確に検出または測定するための手段を提供する。例えば、本発明のヘプシジン−25選択的抗体は、感受性が高く、信頼できる免疫学的検定(例えば、ELISA、RIA、免疫拡散法、またはSPRアッセイなどの免疫検出アッセイ)に導入され得る。同様に、本発明のヘプシジン−25選択的抗体はまた、組織または生体液サンプルの免疫組織化学的(IHC)および免疫蛍光(IF)アッセイに有用である。そのような分析は、ヘプシジン−25の異常レベルを検出し、それによって、ヘプシジン−25によって促進される疾患および状態を診断するために使用されてもよい。より具体的には、本発明は、患者由来の組織または生体液のサンプル中のヘプシジン−25のレベルを測定し、サンプル中のヘプシジン−25のレベルと、1つ以上のコントロール個体由来の対応するサンプル中のヘプシジン−25のレベルまたは基準物とを比較し、それによって、ヘプシジン−25の異常レベルに関連する疾患状態を検出することによって、患者におけるヘプシジン−25に関連する疾患または状態を診断する方法を提供する。疾患状態は、減少した血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および/またはヘマトクリットに関連する1つ以上の遺伝性疾患または非遺伝性疾患を含んでもよい。好ましくは、疾患状態は、貧血に関連する1つ以上の遺伝性疾患または非遺伝性疾患を含んでもよい。
ヘプシジン−25により促進される疾患または状態は、それらを必要とする患者に、(1)ヒトヘプシジン−25、すなわちDTHFPIC(配列番号5)、および/または(2)マウスヘプシジン−25、すなわちDTNFPIC(配列番号86)を含むアミノ酸1〜7内に含まれるエピトープに結合するヘプシジン−25選択的抗体の二次抗体を含む医薬組成物を投与することによって予防または治療され得る。
a)治療の初期段階前または治療の初期段階中の患者から生体液の第1のサンプルを得る工程;
b)免疫学的検定法によって第1のサンプル中のヘプシジン−25のレベルを測定する工程;
c)治療が効果を有するうちの適切な時間の後に、患者から生体液の第2のサンプルを得る工程;
d)免疫学的検定法によって第2のサンプル中のヘプシジン−25の量を測定する工程;
e)ヘプシジン−25結合または遮断治療の効果を測定するために、第1のサンプル中のヘプシジン−25の測定された量と、第2のサンプル中のヘプシジン−25の量とを比較する工程、を含む。
本発明の抗体は、ヒト被検体への投与に適切な医薬組成物に組み込まれ得る。本発明の抗体は、ヒト被検体に単独あるいは単回または複数回投与量で薬理学的に許容可能な担体および/または希釈剤と併せて投与されてもよい。そのような医薬組成物は、選択される投与様式に適切であるように設計され、薬理学的に許容可能な希釈剤、担体、および/または賦形剤、例えば分散剤、バッファー、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などが必要に応じて使用される。前記組成物は、当該技術分野において公知の従来技術に従って設計されてもよい。
商業的供給源(例えば、Peptide International(Louisville,KY))から取得するかまたは当技術分野で公知の種々の合成または組み換え技術により、ヒトヘプシジン−25を生成することができる。例えば、ヘプシジン−25の25アミノ酸を含み、かつ、配列番号95に示すようなアミノ酸配列を有する融合タンパク質を、大腸菌で発現する。37℃にて1mMのIPTGを用いる誘導の3〜6時間後にヒトヘプシジン−25融合タンパク質を発現する3リットルの大腸菌から、封入体を単離する。封入体をバッファーA(50mMのTrisおよび8Mの尿素(pH8.0))に溶かす。上清を固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)カラム(20mL樹脂)に通す。カラムを吸光度が基準値に戻るまでバッファーAで洗浄し、結合したポリペプチドをバッファーA内の0.5Mのイミダゾールによりカラムから溶出されたバッチとする。ヒトヘプシジン−25融合タンパク質をプールし、50mMのDTTで還元する。その後、プールされた物質を、2Mの尿素、3mMのシステイン、50mMのTris(pH8.0)内で最終タンパク質濃度が50μg/mL未満になるように希釈することにより、この融合タンパク質をリフォールディングする。この物質を室温にて攪拌し、48時間空気中で酸化させる。酸化ポリペプチドを流速5mL/分にてIMACカラム(20mL)に通し、ヒトヘプシジン−25融合タンパク質をバッファーA内の0.5Mイミダゾールによりカラムから溶出されたバッチにする。ヒトヘプシジン−25融合タンパク質を含有するプールされた画分を濃縮し、50mMのTris、4Mの尿素、pH8.0で流速3mL/分にて平衡化されたサイジングカラム(例えば、SUPERDEX(登録商標)75、GE Healthcare、XK26/60)に通す。溶出された単量体融合タンパク質をプールし、次いで、50mMのTris、2Mの尿素、5mMのCaCl2、pH8.0に希釈し、その後、エンテロキナーゼで切断して、配列番号1のヒトヘプシジン−25を生成する。未切断のヒトヘプシジン−25融合タンパク質を、受動IMACクロマトグラフィー(上記の概略参照)により除去する。次いで、IMACカラムからの通過物(flow−through)をC−18逆相カラム上に流速4.0mL/分にて負荷する。カラムを吸光度が基準値に戻るまで0.1%のTFA入り水で洗浄し、結合したポリペプチドを、0.5%/分の速度で0.1%のTFAを含む20%〜40%のACNの線形勾配によりカラムから溶出する。ヒトヘプシジン−25ポリペプチドを含有する画分をプールし、N末端アミノ酸配列分析およびマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析(MALDI−MS)により分析する。
5個のアミノ酸ペプチドリンカー(すなわち、GPGPG)でOVAペプチド(アミノ酸323〜336)配列(すなわち、完全長免疫原DTHFPICGPGPGISQAVHAAHAEINE(配列番号87))に結合させたN末端ヘプシジンペプチド(配列番号1のアミノ酸1〜7)を用いてマウスに免疫性を与え、これらのマウスから脾臓を27日目に回収する。Ag+およびIgG+メモリーと胚中心細胞について1ウェルあたり1細胞においてB細胞をソートし、EL4B細胞と2週間共培養する。その後、得られたIgG含有上清を1.4倍に希釈し、以下の3つのELISAフォーマットに従ってスクリーニングする。(1)96ウェルプレートを、NEUTRAVIDIN(商標)結合タンパク質(すなわち、脱グリコシル化されかつ等電的中性型(isoelectrically neutral form)のアビジン(Pierce Biotechnology,Rockville,IL))を用いて、2μg/mLの炭酸バッファー中で一晩コーティングする。非特異的結合部位をカゼインで1時間ブロックする。その後、プレートを0.05%のTween−20を含むPBSで3回洗浄し、100nMのビオチン化ヘプシジンを1時間プレート上でインキュベートする。プレートを再度上述のように洗浄する。その後、培養物からのIgG上清を1時間インキュベートし、プレートを洗浄する。ヘプシジン−25抗体の特異的結合を0.5μg/mLのヤギ抗マウスIgGのFcγアルカリホスファターゼにより検出する。アルカリホスファターゼ活性を、適当量のPMP/AMP基質(6mg/mlのフェノールフタレイン一リン酸(PMP)入り0.5MのTris、pH10.2、2%の2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール(AMP)、0.1%のNaN3)を加えることにより測定し、560nmにおける吸光度の量を測定する。(2)96ウェルプレートを、ヤギ抗マウスカッパIgGを用いて、2μg/mlにて炭酸バッファー中で一晩コーティングする。その後、非特異的結合部位をカゼインで1時間ブロックする。プレートを0.05%のTween−20を含むPBSで3回洗浄し、培養物からのIgG上清を1時間インキュベートする。その後、ビオチン化ヘプシジン−25(100nM)を1時間プレート上でインキュベートし、プレートを再度上述のように洗浄する。その後、捕捉した抗体に対するヘプシジン−25の特異的結合を、1μg/mlのNEUTRAVIDIN−AP(商標)、NEUTRAVIDIN(商標)−アルカリホスファターゼ結合体(Pierce Biotechnology,Rockford,IL)を加えることにより検出し、アルカリホスファターゼ活性をPMP/AMP基質を加えることにより検出し、560nmにおける吸光度を測定する。(3)96ウェルプレートを100nMのヘプシジン−25入り水を用いて一晩37℃にてコーティングする。その後、非特異的結合部位をカゼインで1時間ブロックし、プレートを0.05%のTween−20を含むPBSで3回洗浄する。その後、培養物からのIgG上清を1時間インキュベートし、プレートを再度上述のように洗浄する。N末端ヘプシジン−25抗体の特異的結合を0.5μg/mLのヤギ抗マウスIgGのFcγアルカリホスファターゼにより検出する。アルカリホスファターゼ活性をPMP/AMP基質で測定し、560nmにおける吸光度の量を測定する。
SPRバイオセンサー(例えば、BIAcore(登録商標)T100)を、抗体(例えば、本明細書に開示された抗体)の結合反応速度および親和性を測定するために用いることができる。BIAcore(登録商標)システムは、SPRの光学的性質を利用して、デキストランバイオセンサーマトリクス内の相互作用分子のタンパク質濃度における変化を検出する。特に指定のない限り、全ての試薬および物質をBIAcore(登録商標)AB(Upsala,Sweden)から購入する。全ての測定を25℃にて行う。サンプルをHBS−EPバッファー(150mMの塩化ナトリウム、3mMのEDTA、0.05%(w/v)界面活性剤P−20および10mMのHEPES、pH7.4)に溶解する。ヒトカッパでFabsを捕捉するために、ヤギ抗ヒトカッパを、アミン結合キットを用いて、5000〜10000反応単位(Rus)のレベルにてCM5センサーチップの1〜4のフローセル上に固定する。マウスIgG1でMabsを捕捉するために、ヤギ抗マウスFcガンマを、アミン結合キットを用いて、5000〜10000RusのレベルにてCM5センサーチップの1〜4のフローセル上に固定する。ヒトIgG4で抗体を捕捉するために、タンパク質Aを、アミン結合キットを用いて、400〜700RusのレベルにてCM4センサーチップの1〜4のフローセル上に固定する。大腸菌のペリプラズマから調製されたFabsおよび哺乳動物細胞培養物から調製されたMabsを、複数の分析サイクルを用いて評価する。各サイクルは、以下のステップからなる。200〜1000Rusの捕捉を目指してFabまたはMabを約10μL/分にて0.3〜2分間注入し、実施例1において上述したように取得された種々の濃度のヒトヘプシジン−25(600nM〜0.1nM)を50μL/分にて2分間注入し、次いで、2〜10分間解離し、そして、30μLの10mMの塩酸グリシン、pH1.5を用いて再生する。測定は25℃にて取得され、各サイクルにおける会合速度および解離速度を、BIA評価ソフトウェア内の「1:1の物質移動を伴う」結合モデルを用いて評価する。
SPR分析によりヒトヘプシジン−25に対する高親和性結合を示したヒトヘプシジン−25を含むアミノ酸1〜7に対して産生されたモノクローナル抗体を、Mab3.23とともにヒトヘプシジン−25に同時結合する能力について試験した。
マルチウェルプレートのウェルを、炭酸−重炭酸コーティングバッファー、pH9.40(Pierce Biotechnology,Rockville,IL)中で2mg/Lの濃度にてMab 3.23を用い、室温にて1時間コーティングする。次に、ウェルを吸引し、TBST(10mmol/LのTris、pH7.4、1mLのTween−20/Lを含む150mmol/LのNaClを含有するTRIS緩衝化生理食塩水)で3回洗浄する。次いで、ウェルをTBS−カゼインブロッキングバッファー(カトン(Kathon)抗菌剤を含む150mMのNaCl、25mMのTris、1%のカゼイン、pH7.4(Pierce Biotechnology;cat.#37532)で1時間ブロックする。次に、100μLのヘプシジン−25標準(50mmol/LのHEPES、pH7.40、150mmol/LのNaCl、10mL/LのTriton(登録商標)X−100非イオン界面活性剤(Union Carbide Corp.,Danbury,CT)、5mmol/LのEDTA、および、5mmol/Lのエチレングリコ−四酢酸(EGTA)からなる、アッセイバッファー中の種々の濃度における合成されたヒトヘプシジン−25)をウェルのセットに加えて、較正曲線を生成する。その後、血清サンプルをアッセイバッファー中で1:20に希釈し、その個々のウェルに加え、ELISAプレートを室温にて1時間インキュベートする。吸引後、ウェルをTBSTで3回洗浄し、100μLの1:1000希釈ビオンチン化抗ヘプシジン−25Mab 5E8を1mg/mlにてウェルに加え、室温にて1時間インキュベートする。吸引後、ウェルをTBSTで3回洗浄し、100μLのポリ−ストレプトアビジン−HRP溶液(Pierce Biotechnology,Rockville,IL)をウェルに加え、室温にて30分間インキュベートする。その後、ウェルをTBSTで3回洗浄する。最後のTBSTの吸引後、100μLの3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン発色基質(development substrate)(Pierce Biotechnology,Rockville,IL)をウェルに加え、室温にて30分間インキュベートする。反応を等量の2Nリン酸で停止し、プレートを450nmにて読み取る。
バイオマーカーの臨床の慣例の診断は、主に免疫学的定量的技術(例えば、ELISA)に基づく。これらの方法は、小さい抗原または抗原アイソフォームに適用できないことが多い(Sparbier,K.,International Meeting of the Association of Biomolecular Resource Facilities,Salt Lake City,UT,Poster V28−S,(2008);およびGutierrez,J.A.ら(2005))。MabsまたはFabsは、サンプル減少後に実行された、抗体結合ヘプシジンポリペプチドで、MALDI−TOF質量分析によって、ヒト血清から、前駆体またはそれらの切断型よりも内因性ヘプシジン−25を選択的に免疫沈降させるそれらの能力について評価され得る。
サンドイッチELISAを、(i)標識した結合抗体を非標識のOH4と置換すること、および(ii)OH4の結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体を用いて間接的に検出することを除いて、実施例5のように行う。
Claims (5)
- 配列番号1に示すアミノ酸配列からなるヒトヘプシジン−25に選択的に結合する、軽鎖可変領域(LCVR)ポリペプチドおよび重鎖可変領域(HCVR)ポリペプチドを含むモノクローナル抗体であって、
(i)前記LCVRおよび前記HCVRポリペプチドが、それぞれ配列番号59および58に示すアミノ酸配列を有するか;または
(ii)前記LCVRおよび前記HCVRポリペプチドが、それぞれ配列番号62および58に示すアミノ酸配列を有する、抗体。 - (i)配列番号76および77にそれぞれ示すアミノ酸配列;または(ii)配列番号76および80にそれぞれ示すアミノ酸配列、を有する重鎖および軽鎖を含む、請求項1に記載の抗体。
- 組織または生体液のサンプル中のヘプシジン−25タンパク質の量を定量化するための方法であって、
(i)固体支持体を、(a)請求項1または2に記載の一次抗体、または(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列のアミノ酸5〜25(5および25を含む)内に含まれるエピトープに結合する一次抗体でコーティングする工程と、
(ii)前記サンプルを、前記抗体でコーティングされた固体支持体に付与する工程と、
(iii)未結合のサンプルを除去する工程と、
(iv)工程(i)における前記一次抗体が(a)である場合、配列番号1で示されるアミノ酸配列のアミノ酸5〜25内に含まれるエピトープに結合する二次抗体を前記固体支持体に付与する工程、または工程(i)における前記一次抗体が(b)である場合、請求項1または2に記載の二次抗体を前記固体支持体に付与する工程と、
(v)未結合の二次抗体を除去する工程と、
(vi)定量的に、前記サンプル中の前記二次抗体に結合されたヘプシジン−25の量を検出する工程と、
を含み、前記一次抗体または前記二次抗体が、配列番号82および83に示すアミノ酸配列を有する軽鎖および重鎖を含む、方法。 - 前記サンプルが、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液(CSF)、羊水、唾液、汗、腹水、リンパ液、嚢胞液、母乳、創傷液、またはそれらに由来し、前記サンプルは、酵素免疫測定法(EIA)、ELISA、サンドイッチELISAアッセイ、ラジオイムノアッセイ、沈澱反応または蛍光免疫測定法において、前記抗体と接触する、請求項3に記載の方法。
- 請求項1または2に記載の抗体を含む、ヘプシジン−25を検出または定量化するためのキット。
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