KR102421918B1

KR102421918B1 - 호산구 유래 신경독과 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102421918B1
Application number: KR1020190164407A
Authority: KR
Inventors: 김창근
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2022-07-18
Also published as: KR20210073785A

Abstract

본 발명은 호산구 유래 신경독(eosinophil-derived neurotoxin, EDN)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 관한 것으로서, 본 발명의 단일클론항체 “Anti-6C5” 또는 “Anti-14C10”는 EDN을 항원으로 인식하여 특이적으로 결합함을 확인하였는 바, EDN 유래의 천명 및 천식의 진단, 치료 및 정보제공방법에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

호산구 유래 신경독과 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도{Monoclonal antibodies that specifically bind to eosinophil-derived neurotoxins and uses thereof}

본 발명은, 호산구 유래 신경독(eosinophil-derived neurotoxin, EDN)과 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

천명(喘鳴)은 폐에서 발생하는 호흡 소리에 포함된 소리이다. 일반적인 영어 표현으로는 "Wheeze" 또는 "Wheezing sound"라고 한다. 호흡 소리에 천명이 포함되면 환자는 천식이 있다고 판단된다. 한편, 영유아기에서 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV) 감염 이후 재발성 천명 발생과 관련이 있다는 것은 여러 역학 연구에서 증명되었다. 알레르기 질환의 유전적 소인과 선천성 기관지 과민성이 모세기관지염 후의 천명과 천식 발생에 관여하는 것으로 알려져 있으며, RSV 감염 자체가 알레르기 염증 반응과 알레르겐 감작 빈도를 높여 천식을 일으킨다는 연구 결과도 있다. 특히 몇몇 연구에서는 첫 1년 이내에 중증의 RSV 모세기관지염을 앓는 소아에서 이후 재발성 천명 및 알레르겐 감작이 일어날 가능성이 높다고 하였다.

천식의 발생기전에는 여러 가지 혈구세포들이 관여하는 것으로 알려져 있으며, 특히 활성화된 호산구와 호중구가 천식환자의 기관지 점막, 기관폐포세척액, 객담, 그리고 혈액 등의 검체에서 그 수가 증가되어 있음이 이전의 여러 연구에서 보고된 바 있다. 호산구와 호중구는 세포 안 과립에 여러 화학매개물질을 함유하고 있는데, 이들 세포가 활성화되면 과립안의 화학매개물질들이 세포 밖으로 배출되면서 염증반응을 야기한다.

이 중 특히 호산구성 염증반응은 천식의 매우 중요한 특징 중 하나이며, 호산구는 천식의 발생기전에 관여하는 주요한 작동세포로 알려져 있다. 활성화된 호산구에 의한 기도 상피의 손상은 천식 발병에 있어 매우 중요한 기전이나, 호산구의 활성화를 반영하는 혈청 생물지표에 대해서는 연구가 많이 되어있지 않다. 호산구의 과립은 세포막에 붙어 있으며, 이 과립 안에 조직손상을 야기하는 강한 양전하의 단백물질들이 함유되어 있다. 과립의 중심에 MBP (major basic protein)이 있고, 과립의 기질에는 ECP (eosinophilic cationic protein), EPO (eosinophil peroxidase), EDN (eosinophil-derived neurotoxin) 등이 있다.

이들 과립단백물질 중 EDN은 천식의 진단 및 모니터링에 유용한 생물지표로써 많은 관심을 받고 있으며, 특히 소아에서 모세기관지염 이후의 반복적 천명, 소아천식, 알레르기비염, 만성기침 등과 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 이전에 혈중 호산구 수나 퍼센트 측정을 통해 호산구의 활성도를 측정하려는 연구들도 있었으나, 이는 실제 호산구의 활성도를 정확히 반영하지 못하였고, 호산구 과립 단백물질(EDN, ECP)의 측정이 실질적인 호산구성 염증반응 정도를 잘 반영하는 것으로 보고되고 있다.

KR

10-2007-0113330

A

따라서, 본 발명의 목적은, 호산구 유래 신경독(Eosinophil-derived neurotoxin, EDN)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기의 단일클론항체를 포함하는, 천명 및 천식의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기의 조성물을 포함하는 천명 및 천식 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, (a) 검체로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;

(b) 채취된 시료를 상기의 키트와 반응 시켜 항원-항체 복합체 형성을 유도하는 단계; 및

(c) 형성된 항원-항체 복합체형성을 확인하는 단계를 포함하는, 천명 및 천식의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기의 단일클론항체를 포함하는 천명 및 천식의 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기의 단일클론항체를 처리하는 단계를 포함하는 천명 및 천식의 치료 반응성을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기의 단일클론항체를 포함하는, EDN을 검출하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, (a) 검체로부터, 생물학적 시료를 채취하는 단계;

(c) 형성된 항원-항체 복합체형성을 확인하는 단계를 포함하는, EDN을 검출하는 정보제공 방법을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명은, 호산구 유래 신경독(Eosinophil-derived neurotoxin, EDN)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기의 단일클론항체를 포함하는, 천명 및 천식의 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은, 조성물을 포함하는 천명 및 천식 진단용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은, (a) 검체로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;

(c) 형성된 항원-항체 복합체형성을 확인하는 단계를 포함하는, 천명 및 천식의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

또한 본 발명은, 상기의 단일클론항체를 포함하는 천명 및 천식의 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은, 상기의 단일클론항체를 처리하는 단계를 포함하는, 천명 및 천식의 치료 반응성을 예측하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은, 상기의 단일클론항체를 포함하는, EDN을 검출하는 키트를 제공한다.

또한 본 발명은, (a) 검체로부터, 생물학적 시료를 채취하는 단계;

(b) 채취된 시료를 상기의 단일클론항체와 반응 시켜 항원-항체 복합체 형성을 유도하는 단계; 및

(c) 형성된 항원-항체 복합체형성을 확인하는 단계를 포함하는, EDN을 검출하는 정보제공 방법을 제공한다.

도 1은 단백질 농도를 측정하기 위하여, BSA 및 BGG를 표준물질로 bicinchoninic acid assay(BCA)의 표준곡선을 그린 도이다. A는 BSA를 표준 물질로 EDN의 농도를 측정한 것이며, B는 BGG를 표준물질로 본 발명의 항체 Anti-6C5(6C5)의 농도를 측정한 것이다.
도 2는 본 발명의 항원 EDN의 SDS-PAGE를 통한 크기를 확인한 도이다.
도 3는 본 발명의 항체 Anti-6C5(6C5) 및 Anti-14C10(14C10)의 SDS-PAGE를 통한 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 크기를 확인한 도이다.
도 4은 본 발명의 항체 Anti-6C5(6C5)의 항원 항체 친화도 분석과정을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 항체 Anti-6C5(6C5) 및 항원 EDN의 항원항체 결합 친화도를 나타낸 도이다.

본 발명은, 호산구 유래 신경독(Eosinophil-derived neurotoxin, EDN)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.

발명의 용어, "EDN(eosinophil-derived neurotoxin)"은 호산구 탈과립화의 산물로서 호산구에서 유래된 신경독을 의미한다. 효소 활성을 통해 ssRNA(single strand RNA) 바이러스의 활성을 줄일 수 있고, 면역세포를 끌어들이는 역할을 한다.

일반적으로 항체, 항체의 절편(단편, 일부분), 유사 기능물과 같은 물질들의 경우 면역진단기술에서 핵심적인 역할을 하는 물질(원료)이다. 면역진단기술의 경우, 외부 생명체(또는 물질)로부터 기인하거나 생체 내의 변이로 인해 생성된 항원(antigen)을 검출하거나, 상기 항원으로부터 생성된 항체(antibody) 검출을 통한 방법이 일반적이다. 특히, EDN 검출을 위한 면역진단기술의 경우 EDN으로부터 체내에 생성된 항체(이뮤노글로불린)의 일종인 IgA, IgM, IgG 중의 하나 혹은 그 이상, 또는 이들의 비율을 검출하는 것이 보편적으로 이용되고 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '항체'는 천연의 혹은 부분 또는 전부 합성된, 예컨대 재조합으로 제조된, 전장 면역글로불린의 특이성 결합력을 보유하는 면역글로불린 분자의 가변 영역의 일부 이상을 포함하는 임의의 단편을 포함하는, 면역글로불린 및 면역글로불린 단편을 나타낸다. 따라서 항체는 면역글로불린 항원-결합 도메인(항체 결합 부위)과 상동이거나, 실질적으로 상동인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 상기 항체는 합성 항체, 재조합적으로 제조된 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 사람 항체, 비-사람 항체, 사람화 항체, 키메라항체, 인트라바디 또는 항체 단편을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 항체는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 이황화-결합 Fv (dsFv), Fd 단편, Fd' 단편, 단일-사슬 Fv (scFv),단일-사슬 Fab (scFab), 디아바디 (diabody), 나노바디 (nanobody), 항-이디오타입 (항-Id)항체, 또는 상기 중 임의의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 '단일클론항체'란 당해 분야에 공지된 용어로 단일 항원선 부위(에피토프)에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해서 지시된다. 다클론항체는 일반적으로 교차반응이 있어 특이성이 낮고, 항혈청의 로트마다 항체가 및 특이성이 변동하는 결점이 있기 때문에, 다클론항체를 이용한 진단시약의 제조는 본질적으로 품질관리가 어렵다는 문제점이 있는 반면, 단일클론항체는 항원-항체결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마의 배양에 의해 생산되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.

본 발명의 단일클론항체는 경쇄 가변부위 및 중쇄 가변부위를 모두 포함하는 단일클론항체일 수 있다. 본 발명의 항체 경쇄 및 중쇄의 가변 부위는, "상보성 결정 영역(complementarity-determining resion, CDR)"라고 알려진 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 "구조 영역(framework region, FR)"을 포함한다.

상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3으로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다. 한편, 본 발명의 단일클론항체는 상보성 결정 영역(CDR)에 공지의 치료용 항체의 구조 영역 (FR)을 접합시켜 제조할 수 있다. 본 발명에서는 상기 단일클론항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 부위에 대한 CDRs의 염기서열을 제공한다.

항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체를 형성하는 항체의 주요 부위인 중쇄와 경쇄의 가변 부위, 특히 CDR(complementarity determining region)이 복합체의 친화력을 결정하므로 기 단일클론항체 유전자를 클로닝하여 항체 중쇄와 경쇄의 가변부위에 대한 유전자 염기서열을 분석할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 단일클론항체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄가변영역; 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, 단일클론항체일 수 있다.

또한, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 것인, 단일클론항체일 수 있다.

또한, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 6의 염기서열로 코딩되는 것인, 단일클론항체일 수 있다.

또한, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 3의 CDR1 영역, 서열번호 4의 CDR2 영역 및 서열번호 5의 CDR3 영역으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산인 것인, 단일클론항체일 수 있다.

또한, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8의 CDR1 영역, 서열번호 9의 CDR2 영역 및 서열번호 10의 CDR3 영역으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산인 것인, 단일클론항체일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 단일클론항체는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 또는 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, 단일클론항체일 수 있다.

또한, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 11의 염기서열로 코딩되는 것인, 단일클론항체일 수 있다.

또한, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 16의 염기서열로 코딩되는 것인, 단일클론항체일 수 있다.

또한, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 13의 CDR1 영역, 서열번호 14의 CDR2 영역 및 서열번호 15의 CDR3 영역으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산인 것인, 단일클론항체일 수 있다.

또한, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 18의 CDR1 영역, 서열번호 19의 CDR2 영역 및 서열번호 20의 CDR3 영역으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산인 것인, 단일클론항체일 수 있다.

상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 염기서열은 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1, 서열번호 6, 서열번호 11 또는 서열번호 16의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다 이에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 염기 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 단일클론항체의 범위는 서열번호 2, 서열번호 7, 서열번호 12 또는 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2, 서열번호 7, 서열번호 12 또는 서열번호 17로 표시되는 염기서열의 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 단일클론항체는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

단일클론항체의 변이체란 이의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).

본 발명의 단일클론항체는, EDN을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.

상기 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

또한, 본 발명의 단일클론항체는 EDN에 특이적으로 결합하며, 그 친화도가 매우 높다. 본 발명의 일 실시예에서 측정된 EDN에 대한단일클론항체 6C5의 해리상수는 5.76E-11인 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는, 본원 발명의 단일클론항체가 EDN에 특이적인 결합을 형성하는 것을 보여주는 결과이다.

본 발명에서의 용어, "천명(wheezing)"은 RSV(respiratory syncytial virus) 감염에 의한 세기관지염 후 발생되는 재발성 천명(recurrent wheezing)을 말하며, 기도가 좁아져서 숨을 내쉴 때 쌕쌕거리거나 가랑가랑하는 호흡음이 나타나는 것으로서, 호흡 곤란을 일으키는 염증성 기도 폐쇄 질환인 천식에서도 흔히 나타나는바, 본 발명에서의 천명은 이러한 기침, 호흡곤란 등의 증상뿐만 아니라, 천식 등 의 질환을 포함하는 개념이라고 볼 수 있다.

또한 본 발명은, 상기의 조성물을 포함하는 천명 및 천식 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에서의 키트는 EDN 농도를 측정할 수 있도록 설계된다. 본 발명의 키트는 선택적으로, EDN 농도 분석에 필요한 시약, 인자, 조성물 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다. 바람직하게, 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. 일 구체예로서, 본 발명의 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, EDN 농도를 검출하는 수단이 함유된 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.

또한 본 발명은, (a) 검체로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계; (b) 채취된 시료를 상기의 키트와 반응 시켜 항원-항체 복합체 형성을 유도하는 단계; 및 (c) 형성된 항원-항체 복합체형성을 확인하는 단계를 포함하는, 천명 및 천식의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

또한, 상기 항원-항체 복합체 형성은 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법 (fluorometric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 흡광법(absorbance measurement), 분광법 (spectrometric method), 라만분광법(Raman spectroscopic method), 표면 플라즈몬공명법 (surface plasmon resonance method), 간섭계법 (interferometric method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 본 발명은, 상기의 단일클론항체를 포함하는 천명 및 천식의 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 용어 "치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. 치료는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "개선(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

본 발명의 약학 조성물에는 본 발명의 항체 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서,약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로 는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 항체의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 001 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 001 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.

또한 본 발명은, 상기의 단일클론항체를 포함하는 천명 및 천식의 치료 반응성을 예측하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기, 단일클론항체를 포함하는, EDN을 검출하는 키트를 제공한다.

본 발명에서의 용어 '검출'은 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용한다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소, 금속 나노입자, 란탄족(lanthanide) 원소, 라만 리포터(Raman reporter), 전기화학적 태그, 자성입자로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 그러나 반드시 이들로만 국한되지는 않는다. 바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 상기 단일클론항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.

실시예 1. EDN의 준비

인제대학교 상계백병원 천식알러지센터에서 사용한 프로토콜을 이용하여, 연구대상을 확대하고자 2016년 1월부터 2016년 12월까지, 중국산시성 시안 지아통대학교 산시성인민병원의 어린이병원 외래에 방문한 0-7세 천명 또는 천식 증상을 포함하는 호흡기 소아환자를 대상으로 하였다. 모든 조사과정은 산시성인민병원 임상연구심의위원회(International Review Board)의 승인(2016-001)하에 진행되었다. 환자들로 부터채혈을 시행 후 BD vacutainer (Becton, Dickinson and Company, FranklinLakes, NJ, USA) 혈청분리튜브에 검체를 수집하였다. 이를 25도에서 1시간 동안 응고시키고, 1350 g, 4℃에서 10분간 원심분리를 시행하였다. 각각의 혈청 샘플을 새로운 플라스틱 튜브에 담아 검사 전까지 -70℃에서 보관하였다.

실시예 2. 단일클론항체 생산

하이브리도마 세포주인 6C5 또는 14C10를 입수하여, 상기 하이브리도마 세포주 각각에서 EDN을 항원으로 인식하는 단일클론항체를 제조하였다.

구체적으로, 단일클론항체를 생산하기 위하여, 상기 입수된 하이브리도마 세포주 5 x 10⁶개의 6C5 또는 14C10 각각을 75cm²조직배양 플라스크에 DMEM(Gibco BRL, U.S.A.) 25ml에 37℃의 세포배양기에서 4~5일간 과다 증식시킨 다음, 세포배양액을 수거하였다. 수거된 세포 배양액은 1500rpm에서 15분간 원심분리를 실시하여 세포 성분을 제거하하고 세포상층액만을 회수함으로서 단일클론항체 생산을 완료하였다. 상기 생산된 단일클론항체는 시험에 사용할 때까지 4℃ 또는 -20℃에 보관하였다. 상기 하이브리도마 세포주인 6C5에서 생산된 단일클론항체는 “Anti-6C5”으로, 하이브리도마 세포주 14C10에서 생산된 단일클론항체는 “Anti-14C10”로 명명하였다.

실시예 3. 단일클론항체의 서열분석

생산된 본 발명의 “Anti-6C5” 또는 “Anti-14C10” 항체를 앱클론(서울)에 제공하여, 상기 각 항체에 대한 가변부위의 중쇄(heavychain) 또는 경쇄(light chain)의 아미노산 서열 및 염기서열을 분석하였다. 또한, 각 중쇄 또는 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 확인하였다.

그 결과, 생산된 본 발명의 “Anti-6C5”항체의 가변영역 중 중쇄의 서열은 종래의 서열과 비교하여 91.8%의 상동성이 나타남을 확인하였다. 또한, 경쇄의 서열은 86.2%의 서열이 나타남을 확인하였다(표 1). 상기 “Anti-6C5”항체의 중쇄 가변역역은 서열번호 3의 CDR1 영역, 서열번호 4의 CDR2 영역 및 서열번호 5의 CDR3 영역을 포함하는 아미노산 서열로 이루어져 있다.

또한 상기 “Anti-6C5”항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 8의 CDR1 영역, 서열번호 9의 CDR2 영역 및 CDR3 서열번호 10의 영역을 포함하는 아미노산 서열로 이루어져 있다.

또한 상기 “Anti-6C5”항체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하고 있으며, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 1의 염기서열 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 6의 염기서열로 코딩되는 것을 확인 하였다.

또한, “Anti-14C10” 항체의 가변영역 중 중쇄의 서열은 종래의 서열과 비교하여 94.9%의 상동성이 나타남을 확인하였다. 또한, 경쇄의 서열은 85.8%의 서열이 나타남을 확인하였다(표 2).

상기 “Anti-14C10”항체의 중쇄 가변역역은 서열번호 13의 CDR1 영역, 서열번호 14의 CDR2 영역 및 서열번호 15의 CDR3 영역을 포함하는 아미노산 서열로 이루어져 있다.

또한 상기 “Anti-14C10”항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 18의 CDR1 영역, 서열번호 19의 CDR2 영역 및 서열번호 20의 CDR3 영역을 포함하는 아미노산 서열로 이루어져 있다.

또한 상기 “Anti-14C10”항체는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 또는 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하고 있으며, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 11의 염기서열 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 16의 염기서열로 코딩되는 것을 확인 하였다.

따라서, 본 발명의 단일클론항체는 종래 서열과 동일한 항체가 아닌, EDN을 항원으로 인식하는 신규한 항체임을 확인하였다.

실시예 4. 본 발명의 단일클론항체의 단백질 정량 분석

본 발명의 단일클론항체의 단백질 정량 분석을 위하여, BCA(Bicinchonic acid) 정량법을 수행하였다.

구체적으로, 단백질에 특이적으로 반응하는 BCA(Bicinchoninic acid)를 사용하여, 본 발명의 단일클론항체 “Anti-6C5” 및 항원 EDN에 대한 단백질 정량 분석을 수행하였다. 상기 BCA 정량법은 단백질의 펩티드결합의 성질을 이용하였다. 상기 펩티드결합은 2가 구리이온(Cu²⁺)을 1가 구리이온(Cu⁺)으로 환원시킬 수 있는 뷰렛반응을 일으킨다. 상기 반응으로 생성된 1가 구리이온 (Cu⁺)은 BCA 2분자와 배위 결합하여 보라색의 화합물을 형성하므로, 상기 화합물은 562nm에서 최대 흡광도를 가지며, 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. BCA 정량법의 측정은 standard assay를 이용하여 특정 범위에서 측정하였다. 항원 EDN에 대한 것은 BSA(bovine serum albumin)를 이용하여 스텐다드 커브를 작성하였고, 본 발명의 단일클론항체 “Anti-6C5”는 BGG(bovine gamma globulin)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 항원 EDN의 농도는 2.283의 값이 나타남을 확인하였으며(도 1A),또한, 단일클론항체 “Anti-6C5”의 농도는 1.380 평균값이 나타남을 확인하였다(도 1B).

실시예 5. 본 발명의 단일클론항체의 크기 및 순도 확인

본 발명의 단일클론항체의 크기 및 순도를 확인하기 위하여, SDS-PAGE를 수행하였다.

구체적으로, 항원 EDN, 본 발명의 단일클론항체인 “Anti-6C5” 또는 “Anti-14C10” 항체에 대하여, Coomassie Blue 염색한 후, 단백질 전기영동을 reducing condition으로 수행하였으며, SDS-PAGE 겔은 12%로 이용하였다.

그 결과, 항원 EDN에 대한 크기는 20 kDa임을 확인하였다(도 2). 또한, 본 발명의 단일클론항체인 “Anti-6C5” 또는 “Anti-14C10”는 도 3의 화살표에 나타낸 바와 같이 중쇄가 50 kDa 크기임을 확인하였고, 이에 본 발명의 단일클론항체는 고순도로 분리 및 정제가 우수하게 수행됨을 확인하였다(도 3).

실시예 6. 본 발명의 단일클론항체의 항원에 대한 친화도(KD, measured affinity) 측정

본 발명의 단일클론항체 “Anti-6C5”에 대하여 이의 항원인 EDN에 대한 친화도를 측정하였다.

구체적으로, 도 4에 나타낸 바와 같이, 단백질 분석 플랫폼인 octet 분석 시스템을 이용하였고, 칩은 AR2G(Amine Reactive Second-Generation) 바이오센서를 이용하였다. 버퍼는 1X 키네틱 버퍼(kinetic buffer)를 이용하였으며, 세척은 3차 증류수를 이용하였다. 본 발명의 항체 및 항원에 대한 친화도 값(KD값)을 구하기 위하여, analyte optimization 및 ligand optimization을 먼저 수행하였다. 분석을 위하여 분석 대상인 본 발명의 단일클론항체 “Anti-6C5”를 주입시간 10분, 안정화는 5분을 두었다. 이 후, 피분석 대상인 항원 EDN을 Association time으로 5분, Dissociation time으로 15분을 두었다. 상기 EDN은 12.5 nM, 6.25 nM, 3.13 nM, 1.56 nM, 0.78 nM, 의 총 5가지 서로 다른 농도로 주입하였다.

그 결과, 본 발명의 단일클론항체 “Anti-6C5”와 항원 EDN에 대한 친화도(KD) 값은 5.76E-11M 임을 확인하였는 바, 본 발명의 항체는 높은 친화도로 항원에 대한 결합력을 갖음을 확인하였다(도 5).

<110> inje university industry-academic cooperation foundation <120> Monoclonal antibodies that specifically bind to eosinophil-derived neurotoxins and uses thereof <130> PN1910-518 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 6C5 antibody VH DNASEQ <400> 1 gaggtccagc tgcagcagcc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctgctta ttcattcact gactacatca tgctctgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gcctagaatg gattggaaat attcatcctt actatggcag tagtagttac 180 aatctgaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcttccag tacagcctac 240 atgcagctca acagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagaagtg 300 ggctttggta agggggggtt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 360 360 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> 6C5 antibody VH AASEQ <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile Met Leu Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser 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gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacacta ccccgctcac tttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> 14C10 antibody VL AASEQ <400> 17 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> 14C10 antibody VL CDR1 AASEQ <400> 18 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 19 <211> 3 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> 14C10 antibody VL CDR2 AASEQ <400> 19 Ala Ala Ser 1 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> 14C10 antibody VL CDR3 AASEQ <400> 20 Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Leu Thr 1 5

Claims

호산구 유래 신경독(Eosinophil-derived neurotoxin, EDN)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하고,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
삭제
삭제
제 1항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 4항에 있어서,
상기 중쇄 가변영역은 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 4항에 있어서,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 6의 염기서열로 코딩되는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
호산구 유래 신경독(Eosinophil-derived neurotoxin, EDN)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하고,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
삭제
제7항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 또는 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 9항에 있어서,
상기 중쇄 가변영역은 서열번호 11의 염기서열로 코딩되는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 9항에 있어서,
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 16의 염기서열로 코딩되는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제 1항 또는 제7항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 천명 및 천식의 진단용 조성물.
제12항의 조성물을 포함하는 천명 및 천식 진단용 키트.
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제1항 또는 제7항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 천명 및 천식의 치료용 약학 조성물.
제1항 또는 제7항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계를 포함하는, 천명 및 천식의 치료 반응성을 예측하는 방법.
제 1항 또는 제7항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, EDN을 검출하는 키트.
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