MX2011001363A

MX2011001363A - Anticuerpos selectivos de anti-hepcidina-25 y usos de los mismos.

Info

Publication number: MX2011001363A
Application number: MX2011001363A
Authority: MX
Inventors: Ying Tang; Peng Luan; Donmienne Doen Mun Leung; Derrick Ryan Witcher; Pia Pauliina Yachi
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2008-08-06
Filing date: 2009-07-29
Publication date: 2011-04-26
Also published as: HK1156326A1; KR20110031963A; EA201170312A1; DK2328931T3; IL210643A; EP2328931B1; ES2432018T3; AU2009279865B2; AU2009279865A1; NZ590863A; ZA201100261B; WO2010017070A1; JP5730200B2; UA103032C2; PT2328931E; US20110189190A1; JP2011530514A; PL2328931T3; CN102112489A; EP2328931A1

Abstract

Se proporcionan anticuerpos monoclonales que se unen al término N de hepcidina-25 humana y se caracterizan por tener alta afinidad y selectividad para el polipéptido. Los anticuerpos de la invención son útiles para aumentar los niveles de hierro en el suero, cuentas de reticulocito, cuenta de glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocritos en un ser humano y para el tratamiento de varios trastornos, tales como anemia, en un ser humano. Los anticuerpos de la invención también son útiles como herramientas analíticas, tales como en ELISA de emparedado.

Description

ANTICU ERPOS SELECTIVOS ANTI-H EPCI DI NA-25 Y USOS DE LOS MISMOS La presente invención está- en el campo de medicina, particularmente en el campo de anticuerpos contra hepcidina-25 humana. Más específicamente, la presente invención se refiere al tratamiento de ciertas enfermedades, tales como anemia, administrando anticuerpos selectivos anti-hepcidina-25 a pacientes en necesidad del mismo. La presente invención además se refiere a métodos y kits para detectar hepcidina-25 y/o diagnosticar una condición de enfermedad caracterizada por niveles elevados de hepcidina-25.

La hepcidina humana, un polipéptido expresado predominantemente por hepatocitos, se cree es una proteína importante reguladora del hierro que negativamente regula la absorción intestinal del hierro, reciclando el hierro por macrófagos, y la inmovilización del hierro a partir de reservas hepáticas del hierro. La sobreproducción de hepcidina parece jugar un papel primario en la patofisiología de anemia y/o en anemia de enfermedad crónica.

Actualmente, terapias adecuadas y efectivas para anemia y/o para anemia de enfermedad crónica son limitadas. Específicamente, la administración de eritropoyetina es efectiva en solamente aproximadamente 50% de todos los pacientes y se asocia con efectos secundarios indeseables. Además, las transfusiones son indeseables debido a contaminación, infección y sobrecarga de hierro.

La hepcidina humana es codificada como un prepropéptido de 84 aminoácidos q ue contiene una secuencia señal de objetivo al retículo endoplásmico de 24 aminoácidos N-terminal típica, y una proregión de 35 aminoácidos con un sitio de desdoblamiento de furina consenso inmediatamente seguido por la hormona reguladora de hierro bioactiva de 25 aminoácidos C-terminales (hepcidina-25, SEC I D NO: 1 ) . Varias formas truncadas N-terminales de hepcidina, tales como hepcidina-20 (por ejemplo, para humanos, aminoácidos 6-25 de la SEC I D NO: 1 ) y hepcidina-22 (por ejemplo, para humanos, aminoácidos 4-25 de la SEC I D NO: 1 ) también se conocen por formarse in vivo. Si n embargo, la hepcidina-25 se piensa es la más, sino la ún icamente, forma fisiológicamente relevante de hepcidi na en h umanos. Las terapias que regulan selectivamente la concentración de hepcidina-25, contrario a las formas precu rsoras o truncadas, son particularmente deseables. En particular, anticuerpos que se enlazan selectivamente a hepcidina-25 contrario a las formas precursoras y tri ncadas pueden proporcionar numerosas ventajas en el tratamiento o diagnóstico de trastornos asociados con niveles elevados de hepcidina-25. Por ejemplo, comparados con anticuerpos selectivos sin hepcidina , anticuerpos ^ selectivos de hepcidi na-25 de alta afinidad pueden reduci r el riesgo de efectos secundarios y la dosis cl ínica requerida para tratamiento efectivo podría ser reducida debido a q ue los anticuerpos terapéuticos no pueden enlazarse a formas fisiológicamente irrelevantes de hepcidina. ,Mientras los anticuerpos monoclonales y policlonales no humanos a hepcidina han sido reportados previamente (véase, por ejemplo, Publ icaciones de Solicitudes de Patentes Estadounidenses 2006/001 9339 , 2007/02241 86, y 2008/0213277), permanece todavía en la técnica una mayor necesidad de anticuerpos monoclonales que se enlazan selectivamente a hepcidina-25. De este modo, un aspecto de la invención es la provisión de anticuerpos que se enlazan selectivamente a hepcidina-25 humana dentro de los aminoácidos 1 a 7, inclusivo, de hepcidina-25. Tales anticuerpos son útiles para incrementar los niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocrito en un humano para el tratamiento de una enfermedad, condición, o trastornos tales como anemia.

Adicionalmente, existen inmunoensayos para hepcidina que no diferencian la hepcidina-25 fisiológicamente relevante, activa, de las especies de hepcidina fisiológicamente no relevante, inactiva (véase, por ejemplo, Kemna, E.H., et al., Haematologica, 93(1):90-7 (2008); Roe M.A., et al., Br J Nutr., 97:544-9 (2007); y, Luukkonen S. and Punnonen K., Clin Chem Lab Med., 44:1361-2 (2006)). Actualmente, los únicos métodos actualmente disponibles para ensayar selectivamente la hepéidina-25 involucran LC/MS (cromatografía líquida/espectroscopia de masas) o métodos engorrosos los cuales requieren la separación de las varias formas de hepcidina (véase, por ejemplo, Gutiérrez, J.A., et al., BioTechniques, 38:S13-S17 (2005), Murphy, et al., Blood, 110;1048-54 (2007), y Kemna, E.H., et al., Clin. Chem., 53:620-8 (2007)). Mientras estos ensayos pueden ser exactos y precisos, su complejidad, costos y el alto nivel de competencia del operador requerida para inhibir su implementación de rutina. Por consiguiente, existe también una mayor necesidad de anticuerpos que se enlazan selectivamente con alta ; afinidad a hepcidina-25 humana para su aplicación en inmunoensayos para la detección o medición de hepcidina-25. De este modo, otro aspecto de la invención proporciona métodos para usar anticuerpos selectivos de hepcidina-25 en inmunoensayos relativamente simples aún altamente sensibles, robustos y selectivos para la detección y medición de hepcidina-25 en tejidos de mamíferos y fluidos biológicos.

La presente invención proporciona anticuerpos que se enlazan selectivamente a hepcidina-25 humana dentro de los aminoácidos 1 hasta 7, inclusive, de hepcidina-25. En una modalidad, un anticuerpo de la invención se enlaza selectivamente a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC I D NO: 1 ; opuesto a polipéptidos precursores y truncados relacionados, y comprende seis CDRs seleccionadas a partir del grupo que consiste de: (i) LCDR1 , LCDR2, LCDR3, HCDR1 , HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 9, 1 0, 1 1 , 32, 33 y 34, respectivamente; (ii) LCDR1 , LCDR2, LCDR3, HCDR1 , HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 12, 1 3, 14, 35, 36, y 37, respectivamente; (iii) LCDR1 , LCDR2, LCDR3, HCDR1 , HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC I D NOs: 45, 13, 14, 35, 36, y 37, respectivamente; (iv) LCDR1 , LCDR2, LCDR3, HCDR1 , HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 12, 1 3, 14, 38, 36 y 37, respectivamente; (v) LCDR1 , LCDR2, LCDR3, HCDR1 , HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC I D NOs: 15, 1 0, 16, 39, 40 y 41 , respectivamente; (vi) LCDR1 , LCDR2, LCDR3, HCDR1 , HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 20, 21 , 22, 42, 43, y 44, respectivamente; (vii) LCDR1 ,: LCDR2, LCDR3, HCDR1 , HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC I D NOs: 20, 21 , 23, 42, 43 y 44, respectivamente; (viii) LCDR1 , LCDR2, LCDR3, HCDR1 , HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 24, 25, 23, 42, 43 y 44, respectivamente; (ix) LCDR1 , LCDR2, LCDR3, HCDR1 , HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 26, 25, 27, 42, 43 y 44, respectivamente; y (x) LCDR1 , LCDR2, LCDR3, HCDR1 , HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 26, 25, 28, 42, 43 y 44, respectivamente.

En otra modalidad, un anticuerpo de la invención se enlaza a un epítope contenido dentro de los aminoácidos 1 hasta 7, inclusive, de hepcidina-25 humana, es decir, DTHFPIC de la SEC ID ?,?: 1 o DTNFPIC de hepcidina-25 de roedor (SEC ID NO: 2 o 3). Preferiblemente el anticuerpo de la invención comprende un polipéptido de región variable de cadena ligera ("LCVR") y un polipéptido de región variable de cadena pesada ("HCVR") en donde (i) los polipéptidos LCVR y HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC I D NOs: 48 y 49, respectivamente; (ii) los polipéptidos LCVR y HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC I D NOs: 50 y 51 , respectivamente; (iii) los polipéptidos LCVR y HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC I D NOs: 52 y 51 , respectivamente; (iv) la LCVR y la HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 53 y 54, respectivamente; (v) la LCVR y la HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 55 y 56, respectivamente; (vi) la LCVR y la HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC I D NOs: 59 y 58 respectivamente; (vii) la LCVR y la HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 60 y 58, respectivamente; (viii) la LCVR y la HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC I D NOs: 61 y 58, respectivamente; (ix) la LCVR y la HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 62 y 58, respectivamente; o (x) la LCVR y la HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 63 y 58, respectivamente.

En otra modalidad, la invención proporciona rrioléculas aisladas de ácido nucleico que codifican anticuerpos de la invención; vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos de la invención, opcionalmente, operablemente ligados a secuencias de control reconocidas por una célula hospedera transformada con el vector; células hospederas que comprenden vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos de la invención; un proceso para producir un anticuerpo de la invención que comprende cultivar células hospederas que comprenden vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos de la invención de manera que el ácido nucleico se expresa y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo a partir del medio de cultivo de célula hospedera.

En otra modalidad , la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención y u n portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende una población homogénea o sustancialmente homogénea de un anticuerpo monoclonal de la invención y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En otra modal idad , la invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano diseñado por i ngeniería que se enlaza selectivamente a hepcidina humana madura para uso en terapia.

En otra modalidad , la invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano d iseñado por ingeniería que se enlaza selectivamente a hepcidina humana madura para uso en el tratamiento o prevención de anemia en un sujeto humano.

La i nvención también incl uye el uso de un anticuerpo monoclonal h umano diseñado por ingeniería que se enlaza selectivamente a hepcidina humana madura para la preparación de un medicamento. La invención además incluye el uso de un anticuerpo monoclonal humano diseñado por ingeniería que se enlaza selectivamente a hepcidina humana madura en u n método para incrementar los niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de gl óbulos rojos, hemoglobina , y/o hematocrito en un animal , preferiblemente en especies de mam íferos, más preferiblemente un sujeto humano .

La invención además proporciona un método para incrementar los niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobi na, lo hematocrito que comprende administrar a un sujeto humano en necesidad del mismo, una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal humano diseñado por i ngeniería que se enlaza a hepcidina humana madura.

Otra modalidad de la i nvención proporciona un método para tratar una enfermedad, condición o trastorno, en un sujeto humano, el cual se beneficia de un incremento en los niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de gl óbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocrito , que incluye, pero no se limita a, anemia, por ejemplo, anemia que resulta de i nfección , inflamación , enfermedad crónica, y/o cáncer.

La invención también proporciona un método para medir la cantidad de hepcidina-25 en una muestra de tejido o fluido biológico obtenido de un ma mífero, el método comprende las eta pas de; (i) obtener una muestra de tejido o fluido biológico del mam ífero; (i¡) causar que la muestra se ponga en contacto con un anticuerpo selectivo a hepcidina-25 o fragmento del mismo; y (iii) detectar la cantidad de hepcidina-25 en la muestra di rectamente o indirectamente por medios cuantitativos, semi-cuantitativos o cualitativos.

En otra modal idad, los anticuerpos de la invención son útiles para cuantificar la cantidad de proteína de hepcidi na-25 en una muestra de tejido o fl uido biológico obtenido de un mam ífero que comprende; (i) revestir un soporte sólido con un pri mer anticuerpo que se enlaza a un epítope contenido dentro de los aminoácidos 5 a 25, inclusive, de la SEC ID NO: 1 , SEC ID NO:3 (5-25 de ratón), o SEC ID NO: 2 (5-25 de rata); (ii) obtener una muestra de prueba de tejido o fluido biológico del mamífero; (iii) aplicar la muestra de prueba al anticuerpo revestido del soporte sólido; (iii) permitir a cualquier hepcidina presente formar un primer complejo de anticuerpo-hepcidina bajo condiciones adecuadas para enlace del primer enlace de anticuerpo-hepcidina; (iv) remover la muestra no unida; (v) aplicar un segundo anticuerpo que se enlaza a un epítope contenido dentro de los aminoácidos 1 hasta 7, inclusive, de hepcidina-25 de roedor o humana, es decir, DTHFPIC o DTNFPIC respectivamente, al soporte sólido; (vi) permitir a cualquier hepcidina-25 presente formar un segundo anticuerpo-hepcidina-25-primer complejo de anticuerpo bajo condiciones adecuadas para el segundo anticuerpo para enlazar cualquier hepcidina-25-primer complejo de anticuerpo y; (v) remover el segundo anticuerpo no unido; (vi) y detectar la presencia o ausencia del segundo anticuerpo. La presencia o ausencia del segundo anticuerpo puede ser detectada ya sea directamente o indirectamente y se puede medir cuantitativamente, semi-cuantitativamente o cualitativamente.

Breve descripción de las figuras La Figura 1 representa un espectro de masas MALDI-TOF de las formas de hepcidina humana inmunoprecipitada a partir de suero humano con la anti-hepcidina-25 Mab 3.23 selectiva. La señal 1 tiene una masa la cual es consistente con la masa esperada de hepcidina-25 humana intacta (peso molecular aproximado (MW) de 2790 Daltons (Da)). La señal 2 tiene una masa la cual es consistente con la masa esperada de hepcidina-20 humana intacta (MW de 2192 Da). Como lo demuestra el cromatograma, el Mab 3.23 anti-hepcidina-25 une cantidades detectables de hepcidina-25, y cantidades muy reducidas de hepcidina-20! El Mab 3.23 no parece enlazar niveles detectables de hepcidina-22 (MW 2436 Da), hepcidina-24 (MW 2674 Da), o pro-hepcidina (MW 6929 Da). Se generó el espectro de masas en un espectrómetro de masas MALDI-TOF utilizando un método de modo lineal, de ión positivo con un ácido; a-ciano-4-hidroxicinámico (matriz peptídica) como muestra de, matriz esencialmente como se describe en el Ejemplo 6.

La Figura 2 representa una vista amplificada del espectro de masas mostrado en la Figura 1 en una región relevante (MW 2000-3000 Da). Como lo demuestra el cromatograma, el Mab 3.23 se une a hepcidina-25 (Señal 1), y en una extensión mucho menor a hepcidina-20 (Señal 2). El Mab 3.23 selectivo anti-hepcidina no parece enlazarse a niveles detectables de hepcidina-22 (MW 2436 Da) o hepcidina!-24 (MW 2674 Da). ! La Figura 3 representa un espectro de masas MALDl-TOF de las formas de hepcidina humana inmunoprecipitada a partir de suero humano con el Mab 5E8 selectivo anti-hepcidina-25. La señal 1 tiene una masa la cual es consistente con la masa esperada de hepcidina-25 humana intacta (2790 Da). Como lo demuestra el cromatograma, el Mab 5E8 anti-hepcidina-25 une cantidades detectables de hepcidina-25 solamente. Se generó el espectro de masas en un espectrómetro de masas MALDl-TOF utilizando un método de modo lineal, de ión positivo con un ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (matriz peptídica) como una matriz de muestra esencialmente como se describe en el Ejemplo 6 abajo.

La Figura 4 representa una vista amplificada del espectro de masas mostrado en la Figura 1 en una región relevante (MW 2000-3000 Da). Como lo demuestra el cromatograma, el Mab 5E8 une cantidades detectables de hepcidina-25 (Señal 1). El Mab 5E8 no se enlaza a niveles detectables de hepcidina-20 (MW de 2192 Da), hepcidina-22 (MW 2436 Da), hepcidina-24 (MW 2674 Da), o pro-hepcidina (MW 6929 Da).! La Figura 5 muestra una gráfica de una curva de calibración para hepcidina-25 generada diluyendo serialmente hepcidina-25 sintetizada (círculos sólidos) partiendo a una concentración de 10 g/L (10 ng/mL) y conduciendo el inmunoensayo MSD descrito en el Ejemplo 8. El inmunoensayo MSD fue específico para hepcidina-25 y no reconoce a hepcidina-20 (triángulos sólidos) o hepcidina-22 (círculos abiertos).

Las siguientes abreviaturas se usan en la presente: ACN: acetonitrilo, BSA: albúmina de suero bovino, DTT: ditiotreitol, EDTA: ácido etilendiamina tetraacético, ELISA: ensayo inmunosorbente ', ligado a la enzima, IMAC: cromatografía de afinidad de metal inmovilizado, IPTG: ß-D-l-tiogalactopiranósido de isopropilo, Mab: anticuerpo monoclonal, Mabs: anticuerpos monoclonales, MALDI-TOF: Ionización por Desorpción Láser Asociada a la Matriz en Tiempo de Vuelo, PBS: salina amortiguada de fosfato, SPR: resonancia de plasmón de superficie, TFA: ácido trifluoroacético. Todas las abreviaturas de aminoácidos usadas en esta descripción son aquellas aceptadas por la Oficina de Patentes y Marcas Estadounidense expuestas en 37 C.F.R. § 1.822 (B)(2).

La presente invención proporciona anticuerpos que se enlazan selectivamente a hepcidina-25 dirigiendo un epítope contenido dentro de los aminoácidos 1 hasta 7, i nclusive, de hepcidi na-25. Tales anticuerpos son útiles para i ncrementar los niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocrito en un humano para el tratamiento de una enfermedad , condición , o trastorno tal como anemia . Además, la presente i nvención proporciona métodos para usar tales anticuerpos en i nmunoensayos relativamente simples a ún altamente sensibles y selectivos ', para la detección y/o medición de hepcidina-25 en tejidos de mam íferos y fluidos biológicos.

Cuando se usa en la presente, el término "hepcidina" se refiere a cualquier forma de la proteína hepcidi na conocida por estar presente en mamíferos. Cuando se usa en la presente, el término "hepcidina madura" se refiere a cualquier forma bioactiva , madura de la proteína hepcidina expresada en mam íferos. Cuando se usa en la presente, la frase "hepcidina humana" se refiere a cualq uier forma de la proteína hepcid ina presente en humanos. Cuando se usa en la presente, la frase "hepcidina humana-25" se refiere a la forma madura de hepcidina humana que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC I D NO: 1 .

La estructura general de un anticuerpo es muy bien conocida en la técnica. Para un anticuerpo del tipo IgG , existen cuatro cadenas de aminoácido (dos cadenas " pesadas" y dos cadenas "ligeras") que son reticuladas vía enlaces disulfuro intra e inter-cadena . Cuando se expresan en ciertos sistemas biológicos, los anticuerpos que tienen secuencias Fe humanas no modificadas son glicosilados en la región Fe. Los anticuerpos pueden ser glicosilados en otras posiciones también. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de anticuerpos son bien conocidas en la técnica. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada N-terminal ("HCVR") y una región constante de cadena pesada ("HCCR"). La región constante de cadena pesada está comprendida de tres dominios (CH 1 , CH2, y CH3) para IgG, IgD, y IgA; y 4 dominios (CH1 , CH2, CH3, y CH4) para IgM e IgE. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (aquí "LCVR") y una región constante de cadena ligera ("LCCR") .

Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de enlace al anticuerpo. Las regiones HCVR y LCVR pueden ser además subdivididas en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones que determinan la complementariedad . (CDRs), intercaladas con regiones que son más conservadas, llamadas regiones de armazón (FR) . Cada HCVR y LCVR está compuesta de tres CDR y cuatro FR, ordenadas del término amino al término carboxi en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Aquí, las tres CDRs de la cadena pesada son referidas como "CDRH 1 , CDRH2, y CDRH3" y las tres CDRs de la cadena ligera son referidas como "CDRL1 , CDRL2 y CDRL3." Las CDRs contienen la mayoría de los residuos los cuales forman interacciones específicas con el antígeno. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de conformidad con convenciones bien conocidas (por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immuriological Interest, " National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1 991 )) .

Los anticuerpos de la presente invención pueden tener una región constante de cadena pesada seleccionada de cualquiera de las clases de inm unoglobulina (IgA, IgD , IgG , IgM, e Ig E) . Preferiblemente, los anticuerpos de la presente invención contienen una reg ión constante la cual se deriva de una región Fe de IgG de ratón o humana.

El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de una copia o clon único, que incl uye por ejemplo, cualquier eucariótico , procariótico o clon fago , y no el método por el cual se produce. Preferiblemente, un anticuerpo monoclonal de la invención existe en una población homogénea o sustancial mente homogénea.

Un anticuerpo de la presente invención puede ser intacto, es decir, comprende regiones constantes de long itud total o completa, que incluyen la región Fe, o una porción o fragmento de tal anticuerpo siempre que cualquier forma acortada comprenda la porción de enlace al antígeno y retenga la capacidad de enlace al antígeno. Tales formas acortadas incluyen , por ejemplo , un fragmento Fab, fragmento Fab' o fragmento F(ab')2 que incluye las CDRs o las regiones variables de los anticuerpos selectivos de hepcidina-25 descritos. Además, tales formas de anticuerpo acortado pueden ser un fragmento Fv de cadena ú nica que puede ser producido uniendo el DNA que codifica la LCVR y HCVR con una secuencia enlazadora. (Véase Pluckthun , The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol . 1 1 3, Rosenburg and Moore eds. , Springer-Verlag , New York, pp 269-31 5, 1 994) . Con respecto a si los fragmentos o porciones son especificados, el térm i no "anticuerpo" como es usado en la presente i ncluye tales fragmentos o porciones así como también formas de cadena única a menos que se indique de otro modo. En la medida en que la porción de proteína o fragmento de proteína retienen la capacidad para enlazarse selectivamente a hepcidina-25 y neutralizar una o más características de bioactividades de hepcidina-25 de mamífero in vivo o in vitro, se incluye dentro del término "anticuerpo".

Los anticuerpos de la invención se pueden producir usando técnicas bien conocidas en el arte, por ejemplo, metodologías recombinantes, tecnologías de exhibición de fago, tecnologías sintéticas o combinaciones de tales tecnologías u otras tecnologías fácilmente conocidas en el arte (véase, por ejemplo, Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45:1628-50 (1999) y Fellouse, F.A., et al., J. Mol. Biol., 373(4):924-40 (2007)).

Las Tablas 1 y 2 abajo representan CDRs preferidas para los anticuerpos de la presente invención.

Tabla 1 es V o A, X2 es Y o S; X3 es N o H, X4 es N, G o Y; X5 es S, R o P; X6 es S o P; X7 es V, H, I o F; X8 es T o V.

Tabla 2 X9 es F, Y o L; X10 es S o N, X„ es T o S; X12 es Y o P, X13 es I o F; X14 es V, o I; X15 es D o G; X16 es A o N; X17 es S o Y; X18 esA o T; X 19 es G o H; X20 es S o N; X2i es T o S; X22 es S, A o Y.

La presente invención incluye, pero no se limita a, un anticuerpo que comprende: a) una región variable de cadena ligera que comprende; i) una LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 6, 9, 12, 45, 1 5, 17, 20, 24 y 26; ii) una LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 7, 10, 13, 18, 21 y 25; y iii) una LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 8, 1 1 , 14, 16, 19, 22, 23, 17and 28; y b) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una HCDR 1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 29, 32, 35, 38, 39 y 42; ii) una HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 30, 33, 36, 40 y 43; y iii) una HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 31 , 24, 27, 41 y 44. ¦ Alternativamente, un anticuerpo preferido de la invención comprende: a) una LCVR que comprende: i) una LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 9, 12, 20 y 26; ii) una LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 10, 13, 21 y 25; y iii) una LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 11, 14, 23 y 27; y b) una HCVR que comprende: i) una HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 32, 35 y 42; ii) una HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 33, 36 y 43; y iii) una HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 34, 37 y 44.

Otro anticuerpo preferido de la invención comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 20, 21, 22, 42, 43 y 44, respectivamente.

Otro anticuerpo preferido de la invención comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 26, 25, 28, 42, 43 y 44, respectivamente.

Otro anticuerpo preferido de la invención comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 24, 25, 23, 42, 43 y 44, respectivamente.

Un anticuerpo más preferido de la invención comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que ¡tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs:: 26, 25, 27, 42, 43 y 44, respectivamente.

Un anticuerpo aún más preferido de la invención comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 9, 10, 11, 32, 33, y 34, respectivamente.

Un anticuerpo aún más preferido de la invención comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 12, 13, 14, 35, 36 y 37, respectivamente.

Un anticuerpo aún más preferido de la invención comprende una LCDR1 , LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 45, 13, 14, 35, 36 y 37, respectivamente.

Un anticuerpo mayormente preferido de la invención comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1 , HCDR2, y HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC:ID NOs: 20, 21, 23, 42, 43 y 44, respectivamente.

Un anticuerpo mayormente preferido de la invención comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 12, 13, 14, 38, 36 y 37, respectivamente.

Un anticuerpo mayormente preferido de la invención comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 15, 10, 16, 39, 40 y 41, respectivamente.

Un anticuerpo preferido de la invención comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 46, 48, 50, 52, 53, 55, 57, 59, 60, 61, 62, y 63. Otro anticuerpo preferido de la invención comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 47, 49, 51, 54, 56 y 58. Otro anticuerpo preferido de la invención comprende una LCVR de la SEC ID NO: 59 y una HCVR de la SEC ID NO: 58. Otro anticuerpo preferido de la invención comprende una LCVR de la SEC ID NO: 60 y una HCVR de la SEC ID NO: 58. Otro anticuerpo preferido de la invención comprende una LCVR de la SEC ID NO: 61 y una HCVR de la SEC ID NO: 58. Otro anticuerpo preferido de la invención comprende una LCVR de la SEC ID NO: 62 y una HCVR de la SEC ID NO: 58. Otro anticuerpo preferido de la invención comprende una LCVR de la SEC ID NO: 63 y una HCVR de la SEC ID NO: 58. Un anticuerpo mayormente preferido de la invención comprende una LCVR de la SEC ID NO: 48 y una HCVR de la SEC ID NO: 49. Otro anticuerpo más preferido de la invención comprende una LCVR de la SEC ID NO: 55 y una HCVR de la SEC ID NO: 56. Tales LCVRs están preferiblemente ligadas a una región constante de cadena pesada o cadena ligera.

Anticuerpos monoclonales preferidos de la invención son referidos aquí como 4C11, 1G8, 1B4, 1E3, 3A9, 2, 5E8, OB3, OB1, OH4 y OE1. Las SEC ID NOs de las secuencias de aminoácidos que codifican Mabs 4C11, 1G8, 1B4, 1E3, 3A9, 5E8, OB3, OB1, OH4, OE1, 3.12, 3.23 y/o varios fragmentos de los mismos, se proporcionan en la Tabla, 3 abajo.

Tabla 3 El término "epítope" se refiere a tal porción de una molécula capaz de ser reconocida por y unida mediante un anticuerpo en una o más de las regiones de enlace al antígeno del anticuerpo. Las determinantes epitópicas usualmente consisten de agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como también características de carga específica. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención se enlazan a un epítope en el N-término de hepcidina madura. Más preferiblemente, los anticuerpos de la invención se enlazan a un epítope contenido dentro de los aminoácidos 1 hasta 7, inclusive, de hepcidina-25. Más preferiblemente, los anticuerpos de la invención se enlazan al N-término de hepcidina-25 humana. Aún más preferiblemente, los anticuerpos de la invención se enlazan a un epítope contenido dentro de los aminoácidos 1 hasta 7, inclusive, de hepcidina-25 humana. Más preferiblemente, los anticuerpos de la invención se enlazan a un epítope contenido dentro de los aminoácidos DTHFPIC de la SEC ID NO: 1 .

El término "afinidad de enlace (KD)" como es usado en la presente, se pretende para referirse a la velocidad de disociación de una interacción de antígeno-anticuerpo particular. La KD es la relación de la velocidad de disociación, también llamada "constante de disociación ( kd¡soc) " , a la relación de velocidad de asociación , o "constante de asociación (kasoc)". De este modo, KD es igual a kd i S 0c/kaS0C y se ! expresa como una concentración molar (M). De ello se deduce que a más pequeño la KD, más fuerte la afinidad de enlace. Por lo tanto, una KD de 1 µ? indica débil afinidad de enlace comparado con una KD de 1 nM. Los valores KD se pueden obtener por métodos conocidos en el arte..

El término "selectivo" usado en la presente con referencia a un anticuerpo anti-hepcidina-25 de la invención se refiere a un anticuerpo que se enlaza a hepcidina-25 con una KD de aproximadamente 1000-, 500-, 200-, 100-, 50-, 10-, o aproximadamente 5-veces inferior que el anticuerpo se enlaza con al menos una forma precursora de hepcidina-25 y/o al menos una forma N-terminalmente truncada de hepcidina-25 presente en las mismas especies de mamífero como se mide por SPR a 25°C. Adicionalmente, o alternativamente, un anticuerpo selectivo a hepcidina-25 de la invención se enlaza a hepcidina-25 pero no se enlaza a o solamente se enlaza mínimamente con al menos una forma precursora de hepcidina-25 y/o al menos una forma N-terminalmente truncada de hepcidina-25 presente en especies de mamíferos cuando se somete a ensayo por los métodos de espectrometría de masas MALDI-TOF y/o inmunoensayos descritos en el Ejemplo 4-8 aquí abajo. Preferiblemente, la forma precursora de hepcidina-25 es una pro-hepcidina humana, y más preferiblemente, pro-hepcidina humana que consiste de la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC I D NO:90. Preferiblemente, la forma N-terminalmente truncada de hepcidina-25 es hepcidi na humana-20 (es decir, 6-25 aminoácidos de la SEC ID NO: 1 ) o hepcidina humana-22 (4-25 aminoácidos de la SEC ID NO: 1 ).

El término "detecta" o "detectar" se usa en el sentido más amplio para incluir mediciones cuantitativas, semi-cuantitativas o cualitativas de una molécula objetivo. En un aspecto, los métodos descritos aquí pueden determinar solamente la presencia o ausencia de un polipéptido de hepcidina particular en una muestra biológica y, de este modo, que el polipéptido de hepcidina es detectable o, alternativamente, indetectable en la muestra cuando se somete a ensayo por el método.

El término "bioactividad," con referencia a un anticuerpo de la invención , incluye, pero no se limita a, afi nidad de enlace de antígeno o epítope, la estabilidad in vivo y/o in vitro del anticuerpo, las propiedades inmunogénicas del anticuerpo, por ejemplo, cuando se administra a un sujeto humano, y/o la capacidad para neutralizar o antagonizar una bioactividad de hepcidina-25, in vivo o in vitro, que incluye, pero no se limita a , inhibición de disregulación del n ivel de hierro en suero en un modelo animal de inflamación , por ejemplo, ensayo de estimulación de inflamación i nducido por I L-6. Las propiedades o características mencionadas anteriormente pueden ser observadas o medidas usando técnicas reconocidas en el arte que incl uyen, pero no se limitan a, ensayos de proximidad de escintilación , E LISA, ¡nmunoensayos ORIGEN (IGEN) , apagado por fluorescencia, E LISA por fl uorescencia , ELISA competitivo, anál isis SPR que incluye, pero no se li mita a, análisis de SPR usando un biosensor BIAcore, ensayos de neutralización in vitro e in vivo sin l ímite (véase, por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente Internacional PCT No. WO 2006/062685) .

El término "bioactividad" con referencia a hepcidina incl uye, pero no se li mita a, enlace específico de hepcidi na a otra proteína que incluye, pero no se limita a , su receptor ferroportina , una o más fgnciones de hepcidina mediadas por ferroportina, tales como internalización inducida por hepcidina y/o degradación de ferroportina (véase, por ejemplo , Nemeth, E., et al . , Hepcidin Regulates I ron Efflux by Binding to Ferroportin and I nducing Its I nternalization, Science 306, 2090-2093, (2004)), la regulación de hepcidina del eflujo de hierro mediado por ferroportina, induce en hepcidi na red ucción en los niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de g lóbulos rojos, hemog lobina, y/o hematocrito en un h umano, estabilidad de proteína, es decir, la hepcidina afecta los niveles o actividad de otra proteína in vivo o in vitro, y niveles de expresión de hepcidina y/o distribución de tejido.

El término "inhibe" o "neutraliza" como es usado en la presente con respecto a una bioactividad de un anticuerpo de la i nvención significa la capacidad del anticuerpo para sustancialmente antagonizar, prohibir, prevenir, restringir, alentar, interrumpir, eliminar, detener, reducir o invertir una bioactividad de hepcid ina, que incluye, pero no se limita a, una bioactividad de hepcidina-25 de humano, rata o ratón .

Los términos "sujeto" y "paciente," usados intercambiablemente en la presente, se refieren a un mamífero, preferiblemente, un humano. En ciertas modalidades, el paciente tiene una enfermedad, trastorno o condición que podría beneficiarse de un nivel reducido de hepcidina, una reducción en la bioactividad de hepcidina , y/o un incremento en el nivel de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocrito.

El término "enlaza específicamente" como es usado en la presente con referencia al enlace entre un anticuerpo y un pol ipéptido de hepcidi na significa que el anticuerpo se enlaza al polipéptido de hepcidina con una KD de menos de aproximadamente 500 nM como se determina por SPR a 25°C. ! En una modalidad , un anticuerpo de la invención tiene una KD para hepcidina humana-25 (S EC I D NO: 1 ) de menos de aproximadamente 100 nM, menos de aproximadamente 50 nM , menos de aproximadamente 25 nM, menos de aproximadamente 10 nM, menos de aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, o menos de aproximadamente 800 pM como se determina por SPR a 25°C. Preferiblemente, un anticuerpo de la invención también enlaza específicamente al menos un polipéptido de hepcidina madura de especies de mamíferos no humanos, como se determina por SPR a 25°C. Más preferiblemente, el anticuerpo: también enlaza específicamente al menos un polipéptido de hepcidina-25 seleccionado a partir del grupo que consiste de hepcidina-25 de ratón, rata y mono cinomólogo (SEC ID NOs: 3, 2, y 4, respectivamente), como se determina por SPR a 25°C. Aún más preferiblemente, el anticuerpo también enlaza específicamente una hepcidina-25 de mono cinomólogo (SEC ID NO: 4), como se determina por SPR a 25°C. Aún más preferiblemente, el anticuerpo también enlaza específicamente hepcidina-25 de rata y/o ratón (SEC ID NOs: 3 y 4, respectivamente), como se determina por SPR a 25°C.

En una modalidad, un anticuerpo de la invención tiene una D para hepcidina humana-25 (SEC ID NO: 1) de menos de aproximadamente 100 nM, menos de aproximadamente 50 nM, menos de aproximadamente 25 nM, menos de aproximadamente 10 nM, menos de aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, o menos de aproximadamente 800 pM como se determina por SPR a 25°C, y i) el anticuerpo tiene una KD para hepcidina-20 humana, pro-hepcidina humana (SEC ID NO:88) o hepcidina humana-22 (SEC ID NO:89) que es al menos de aproximadamente 200-, aproximadamente 100-, aproximadamente 50-, aproximadamente 10-, o aproximadamente 5-veces superior, como se determina por SPR a 25°C o ii) el enlace del anticuerpo a hepcidina-20 humana, pro-hepcidina humana (SEC ID NO:88) o hepcidina humana-22 (SEC ID NO:89) no es detectable o mínimamente detectable por los métodos de espectrometría de masas MALDI-TOF y/o inmunoensayos descritos en los Ejemplos 4-7. Preferiblemente, el anticuerpo también enlaza específicamente al menos un polipéptido de hepcidina madura de especies de mamíferos no humanos, como se determina por SPR a 25°C. Más preferiblemente, el anticuerpo también enlaza específicamente al menos un polipéptido de hepcidina-25 seleccionado a partir del grupo que consiste de hepqidina-25 de ratón, rata y mono cinomólogo (SEC ID NOs: 3, 2 y 4, respectivamente), como se determina por SPR a 25°C. Aún más preferiblemente, el anticuerpo también enlaza específicamente una hepcidina-25 de mono cinomólogo (SEC ID NO: 4), como se determina por SPR a 25°C. Aún más preferiblemente, el anticuerpo también enlaza específicamente hepcidina-25 de rata y/o ratón (SEC ID NOs: 2 y 3, respectivamente), como se determina por SPR a 25°C.

En otra modalidad, un anticuerpo de la invención tienje una KD para hepcidina humana-25 (SEC ID NO: 1) de entre aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, o entre aproximadamente 35 nM y 1 nM, como se determina por SPR a 25°C, y i) el anticuerpo tiene una KD para hepcidina-20 humana, pro-hepcidina humana (SEC ID NO:88) o hepcidina humana-22 (SEC ID NO:89) que es al menos de aproximadamente 200-, aproximadamente 100-, aproximadamente 50-, aproximadamente 10-, o aproximadamente 5-veces superior, como se determi na por SPR a 25°C o ii) el enlace del anticuerpo a hepcidina-20 humana , pro-hepcidina humana (SEC I D NO:88) o hepcidina humana-22 (SEC I D NO:89) no es detectable o mínimamente detectable por los métodos de espectrometría de masas MALDI-TOF y/o inmunoensayos descritos en los Ejemplos 4-7. Preferiblemente, el anticuerpo también enlaza específicamente al menos un polipéptido de hepcidina madura de especies de mamíferos no humanos, como se determina por SPR a 25°C . Más preferiblemente, el anticuerpo también enlaza específicamente al menos un polipéptido de hepcidina-25 seleccionado a partir del grupo que consiste de hepcidina-25 de ratón, rata y mono ci nomólogo (S EC I D NOs: 3, 2, y 4, respectivamente) , como se determina por S PR a 25°C . Aún más preferiblemente, el anticuerpo también enlaza específicamente una hepcidina-25 de mono cinomólogo (SEC I D NO : 4) , como se determina por SPR a 25°C . Aún más preferiblemente, el anticuerpo también enlaza específicamente hepcidina-25 de rata y/o ratón (SEC ID NOs: 3 y 2, respectivamente) , como se determina por SPR a 25°C .

En una modalidad , un anticuerpo de la invención tiene una KD para hepcidina humana-25 (S EC I D NO: 1 ) de menos de aproximadamente 100 nM, menos de aproximadamente 50 nM , menos de aproximadamente 25 nM , menos de aproximadamente 1 0 nM, menos de aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM , o menos de aproximadamente 800 pM como se determina por S PR a 25°C. Preferiblemente, un anticuerpo de la invención también tiene una KD entre aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 800 pM , entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, o entre aproximadamente 35 nM y 1 nM por al menos un polipéptido de hepcidina madura de especies de mamíferos no humanos, como se determina por SPR a 25°C. Más preferiblemente, el anticuerpo también tiene una KD entre aproximadamente 100 riM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, o entre aproximadamente 35 nM y 1 nM por al menos un polipéptido de hepcidina-25 seleccionado a partir del grupo que consiste de hepcidina-25 de ratón, rata y mono cinomólogo (SEC ID NOs: 3, 2, y 4, respectivamente), como se determina por SPR a 25°C. Aún más preferiblemente, el anticuerpo también tiene una KD entre aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, o entre aproximadamente 35 nM y 1 nM para una hepcidina-25 de mono cinomólogo (SEC ID NO: 4), como se determina por SPR a 25°C. Aún más preferiblemente, el anticuerpo también tiene una KD entre aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, ? entre aproximadamente 35 nM y 1 nM para hepcidina-25 de rata y/o ratón (SEC ID NOs: 3 y 2, respectivamente), como se determina por SPR a 25°C.

En otra modalidad, un anticuerpo de la invención tiene una KD para hepcidina humana-25 (SEC ID NO: 1) de entre aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproxi madamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM , entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, o entre aproxi madamente 35 nM y 1 nM, como se determina por SPR a 25°C. Preferiblemente, un anticuerpo de la i nvención también tiene una KD entre aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 800 pM , entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM , entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM , o entre aproximadamente 35 nM y 1 nM por al menos un polipéptido de hepcidina madura de especies de mamíferos no humanos, como se determ i na por SPR a 25°C . Más preferiblemente, el anticuerpo también tiene una KD entre aproximadamente 1 00 nM hasta aproximadamente 800 pM , entre aproximadamente 50 nli/l hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 , nM y aproximadamente 1 nM , o entre aproximadamente 35 nM y 1 nM por al menos un poli péptido de hepcidina-25 seleccionado a partir del grupo que consiste de hepcidi na-25 de ratón, rata y mono ci nomólogo (SEC ID NOs: 3, 2 y 4, respectivamente), como se determina por SPR a 25°C. Aún más preferiblemente, el anticuerpo también tiene una KD entre aproximadamente 1 00 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM y aproxi madamente 1 nM , ó entre aproximadamente 35 nM y 1 nM para una hepcidina-25 de mono cinomólogo (SEC I D NO: 4) , como se determ ina por SPR a 25°C . Aún más preferiblemente, el anticuerpo también tiene una KD entre aproximadamente 1 00 nM hasta aproximadamente 800 pM , entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, o entre aproximadamente 35 nM y 1 nM para hepcidina-25 de rata y/o ratón (SEC ID NOs: 3 y 2, respectivamente), como se determina por SPR a 25°C.

En una modalidad, un anticuerpo de la invención tiene una KD para hepcidina humana-25 (SEC ID NO: 1) de menos de aproximadamente 100 nM, menos de aproximadamente 50 nM, menos de aproximadamente 25 nM, menos de aproximadamente 10 nM, menos de aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, o menos de aproximadamente 800 pM como se determina por SPR a 25°C y i) el anticuerpo tiene una KD para hepcidina-20 humana, pro-hepcidina humana (SEC ID NO:88) o hepcidina humana-22 (SEC ID NO:89) que es al menos de aproximadamente 200-, aproximadamente 100-, aproximadamente 50-, aproximadamente 10-, o aproximadamente 5-veces superior, como se determina por SPR a 25°C o ii) el enlace del anticuerpo a hepcidina-20 humana, pro-hepcidina humana (SEC ID NO:88) o hepcidina humana-22 (SEC ID NO:89) no es detectable o mínimamente detectable por los métodos de espectrometría de masas MALDI-TOF y/o inmunoensayos descritos en los Ejemplos 4-7. Preferiblemente, el anticuerpo también tiene una KD entre aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, o entre aproximadamente 35 nM y 1 nM por al menos un polipéptido de hepcidina madura de especies de mamíferos no humanos, como se determina por SPR a 25°C. Más preferiblemente, el anticuerpo también tiene una KD entre aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, ó entre aproximadamente 35 nM y 1 nM por al menos un polipéptido de hepcidina-25 seleccionado a partir del grupo que consiste de hepcidina-25 de ratón, rata y mono cinomólogo (SEC ID NOs: 3, 2 y 4, respectivamente), como se determina por SPR a 25°C. Aún más preferiblemente, el anticuerpo también tiene una KD entre aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, o entre aproximadamente 35 nM y 1 nM para una hepcidina-25 de mono cinomólogo (SEC ID NO: 4), como se determina por SPR a 25°C. Aún más preferiblemente, el anticuerpo también tiene una KD entre aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, o entre aproximadamente 35 nM y 1 nM para hepcidina-25 de rata y/o ratón (SEC ID NOs: 3 y 2, respectivamente), como se determina por SPR a 25°C.

En otra modalidad, un anticuerpo de la invención tiene una KD para hepcidina humana-25 (SEC ID NO: 1) de entre aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, o entre aproximadamente 35 nM y 1 nM, como se determina por SPR a 25°C, y i) el anticuerpo tiene una KD para hepcidina-20 humana, pro-hepcidina humana (SEC ID NO:88) o hepcidina humana- 22 (S EC I D NO: 89) que es al menos de aproximadamente 200-, aproximadamente 100-, aproximadamente 50-, aproximadamente 1 0-, o aproximadamente 5-veces superior, como se determina por S PR a 25°C o ii) el enlace del anticuerpo a hepcidina-20 humana , pro-hepcidina humana (SEC I D NO: 88) o hepcidina humana-22 (SEC I D NO: 89) no es detectable o mínimamente detectable por los métodos de espectrometría de masas MALDI-TOF y/o inmunoensayos descritos en los Ejemplos 4-7. Preferiblemente, el anticuerpo también tiene una KD entre aproximadamente 1 00 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM , entre aproximadamente 50 nM y aproxi madamente 1 nM , o entre aproximadamente 35 nM y 1 nM por al menos u n polipéptido de hepcidina madura de especies de mamíferos no humanos, como se determina por SPR a 25°C. Más preferiblemente, el anticuerpo también tiene una KD entre aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 800 pM , entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM , entre aproximadamente 50 nM y aproxi madamente 1 nM , ó entre aproximadamente 35 nM y 1 nM por al menos un poli péptido de hepcidina-25 seleccionado a partir del grupo que consiste de hepcidina-25 de ratón , rata y mono ci nomólogo (SEC I D NOs: 3, 2 y 4, respectivamente) , como se determina por SPR a 25°C . Aún más preferiblemente, el anticuerpo también tiene una KD entre aproximadamente 1 00 nM hasta aproximadamente 800 pM , entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM , entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 1 nM, o entre a proximadamente 35 nM y 1 nM para una hepcidina-25 de mono cinomólogo (SEC ID NO: 4) , como se determina por SPR a 25°C . Aún más preferiblemente, el anticuerpo también tiene una KD entre aproximadamente 1 00 nM hasta aproximadamente 800 pM, entre aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 800 pM , entre aproximadamente 50 nM y aproxi madamente 1 nM , o entre aproximadamente 35 nM y 1 nM para hepcidina-25 de rata y/o ratón (SEC ID NOs: 3 y 2, respectivamente) , como se determina por SPR a 25°C .

Expresión de anticuerpo Se usan técnicas de biología molecular estándares para preparar el vector del vector de expresión recombi nante, transfectar las células hospederas, seleccionar transformantes, aislar l íneas de células hospederas que producen un anticuerpo de la i nvención , cultivar estas células hospederas y recuperar el anticuerpo a partir del medio de cultivo.

La presente invención también se di rige a células hospederas que expresan un anticuerpo anti-hepcidina de la invención . Una amplia variedad de sistemas de expresión hospederos conocidos en la técnica puede ser usada para expresar un anticuerpo de la presente invención que incluye sistemas procarióticos (bacterianos) y eucarióticús (tales como levadura, baculovirus, células vegetales, de mam ífero y otras de animales, animales transgénicos y cél ulas de hid ridoma) , así como también sistemas de expresión de despliegue de fago.

Un anticuerpo de la invención se puede preparar por expresión recombinante de genes de cadena pesada y ligera 1 en una célula hospedera. Para expresar un anticuerpo recombinantemente, una célula hospedera es transformada, transducida, infectada o similar con uno o más vectores de expresión recombinante que llevan fragmentos de DNA que codifican las cadenas ligera y/o pesada de inm unoglobulina del anticuerpo de manera tal que las cadenas ligera y/o pesada son expresadas en la célula hospedera. La cadena pesada y la cadena ligera pueden ser expresadas Independientemente de diferentes promotores a los cuales están operablemente ligadas en un vector o , alternativamente, la cadena pesada y la cadena ligera pueden ser expresadas independientemente de d iferentes promotores a los cuales están operablemente ligadas en dos vectores -uno q ue expresa la cadena pesada y uno que expresa la cadena ligera. Opcionalmente, la cadena pesada y cadena ligera pueden ser expresadas en diferentes células hospederas.

Las células hospederas también pueden ser usadas para producir porciones o fragmentos, de anticuerpos i ntactos, por ejemplo, fragmentos Fab o moléculas scFv, por técnicas que son convencionales. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula hospedera con DNA que codifica ya sea la cadena ligera o la cadena pesada de un anticuerpo de esta invención . La tecnolog ía de DNA recombinante también puede ser usada para remover algo o todo el DNA que codifica cualquiera o ambas de las cadenas ligera y pesada que no son necesarias para enlace a hepcidina humana-25. Las moléculas expresadas de tales moléculas de DNA truncado también están abarcadas por los anticuerpos de la invención.

La invención proporciona una célula hospedera que comprenden una molécula de ácido nucleico de la presente invención . Preferiblemente, una célula hospedera de la invención comprende uno o más vectores o constructos que comprenden una molécula de ácido nucleico de la presente invención . Por ejemplo , una célula hospedera de la invención es una célula en la cual u n vector de la invención se ha introducido, el vector comprende un poli nucleótido que codifica una LCVR de un anticuerpo de la invención y/o un polinucleótido q ue codifica una HCVR de la invención . La invención también proporciona una cél ula hospedera en la cual dos vectores de la invención se han i ntroducido; uno que comprende un polin ucleótido que codifica una LCVR de un anticuerpo de la invención y uno que comprende un polinucleótido que codifica una HCVR presente en un anticuerpo de la invención y cada uno operablemente ligado a elementos reguladores promotores/i ntensificadores (por ejemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares, tales como un elemento regulador del promotor AdMLP/intensificador de CMV o un elemento regulador del promotor AdMLP/intensificador de SV40) para i mpulsar altos niveles de transcripción de los genes.

Una vez expresados, los anticuerpos i ntactos, cadenas ligera y pesada individuales, u otras formas de i nmunoglobulina de la presente invención se pueden purificar de conformidad con procedimientos estándares del arte, que incluyen precipitación con sulfato de ; amonio, intercambio iónico, afinidad (por ejemplo, proteína A), fase inversa, cromatografía de columna de i nteracción hidrofóbica, cromatografía de hidroxilapatito , electroforesis en gel , y si milares. Las inmunoglobulinas sustancialmente puras de al menos aproximadamente 90%, aproximadamente 92%, aproximadamente 94% o aproximadamente 96% de homogeneidad son preferidas, y de aproximadamente 98 hasta aproximadamente 99% o más homogeneidad son más preferidas, para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o a homogeneidad como se deseen, los anticuerpos estériles pueden entonces ser usados terapéuticamente, como se dirige en la presente.

Anticuerpo Humano Diseñado por Ingeniería Preferiblemente, un anticuerpo de la invención a ser usado para propósitos terapéuticos, tiene la secuencia del armazón y la región constante (en la magnitud que existe en el anticuerpo) derivada de humano para así reducir la posibilidad de que el anticuerpo pueda activar una respuesta inmune. Anticuerpos humanos diseñados por ingeniería son de interés particular puesto que son valiosos para aplicación terapéutica y disminuyen la probabilidad de una respuesta de anticuerpo anti-ratón humano frecuentemente mente observada con anticuerpos de origen murino o anticuerpos que comprenden porciones las cuales son de origen murino cuando se administran a un sujeto humano. Preferiblemente, los anticuerpos humanos diseñados por ingeniería inyectados pueden tener una vida media más similar a aquella de anticuerpos humanos que se originan naturalmente que por ejemplo, a anticuerpos murinos, con ello permitiendo que dosis más pequeñas y menos frecuentes sean administradas al sujeto.

El término "anticuerpos humanos diseñados por ingeniería" como es usado en la presente se refiere a un anticuerpo en donde al menos una porción es de origen h umano. Por ejemplo, el anticuerpo humano diseñado por ingeniería puede comprender porciones derivadas de un anticuerpo de origen no humano, tal como un ratón , y porciones derivadas de un a nticuerpo de origen humano, unidos juntos, por ejemplo, qu ímicamente por técn icas convencionales (por ejemplo, sintéticas) o preparados como un polipéptido contig uo usa ndo técnicas de ingeniería genética. ! Preferiblemente, un "anticuerpo h umano diseñado por ingeniería" tiene CDRs q ue se origina de o se derivan a partir de un anticuerpo parental , es decir, u n anticuerpo no humano, preferiblemente un Mab de ratón o fragmento del mismo tal como el Fab 4C 1 1 de ratón , mientras el armazón y región constante, en la magnitud que estén presentes, (o una porción sustancial o significante del mismo, es decir, al menos aproximadamente 90%, 92%, 94% , 95% , 96% , 97% , 98% o 99%) son codificados por información de secuencia de ácido nucléico que ocurre en la región de inmunoglobulina de l ínea germinal humana (véase, por ejemplo, la I nternational I mMunoGeneTics Datábase) o en formas mutadas o recom bi nadas de los mismos o sin que los anticuerpos sean producidos en una célula humana. Preferiblemente, al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDRs de un anticuerpo humano diseñado por ingeniería son optimizadas a partir de las CDRs de un anticuerpo parental no humano a partir del cual se deriva el anticuerpo humano diseñado por ingeniería, para generar una propiedad deseada , por ejemplo, especificidad mejorada , afinidad o neutralización , los cuales puéden ser identificados por un ensayo de selección , por ejemplo, un ensayo ELISA. Preferiblemente, una CDR optimizada en un anticuerpo de la invención comprende al menos una sustitución de aminoácido cuando se compara con aquella presente en el Fab 4C 1 1 , 3A9, o 5E8 de ratón parental . Ciertas sustituciones de aminoácido en las CDRs de los anticuerpos humanos de la invención diseñados por ingeniería comparadas con aquellas del Fab 4C 1 1 , 3A9 o 5E8 de ratón parental , reducen la probabilidad de inestabilidad del anticuerpo (por ejem plo, remoción de uno o más residuos de Asn de la CDR) o reducen la probabilidad de inmunogenicidad del anticuerpo cuando se administran a un sujeto humano (por ejemplo, como se predice por I MMU NOF I LTE R™ Technology (Xencor, I nc. , Monrovia, CA) .

Anticuerpos hu manos diseñados por i ngeniería preferiblemente contienen una secuencia m ínima derivada de un anticuerpo no humano. Los anticuerpos humanos diseñados por ingeniería pueden comprender residuos los cuales no se encuentran ni en el recipiente de anticuerpo no en las CDR o secuencias de armazón importadas a partir del anticuerpo parental. Los anticuerpos humanos diseñados por ingeniería pueden ser sometidos a mutagénesis; in vitro usando métodos de rutina usados en la técnica y, de este modo, las secuencias de aminoácidos de la región de armazón de las regiones HCVR y LCVR de los anticuerpos humanos recombinantes diseñados por ingeniería son secuencias que, mientras se derivan de aquellas relacionadas con las secuencias HCVR y LCVR de l ínea germinal humana , no pueden existir naturalmente dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpo humano in vivo. Se contempla que tales secuencias de aminoácidos de las regiones de armazón HCVR y LCVR de los anticuerpos humanos recombinantes diseñados por ingeniería son al menos aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 92%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 98% o, más preferiblemente, al menos aproximadamente 99% o, mayormente preferiblemente, 100% idénticos a una secuencia de línea germinal humana. ! En modalidades preferidas, un anticuerpo humano de la presente invención diseñado por ingeniería comprende secuencias de armazón de cadena ligera de línea germinal humana y secuencias de armazón de cadena pesada de línea germinal humana (véase, por ejemplo, PCT WO 2005/005604).

Existen múltiples métodos disponibles en la técnica para generar anticuerpos humanos diseñados por ingeniería (véase, por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente Internacional PCT WO2006/06046935; Queen, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:2869 (1991); Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann, et al.,' Nature, 332:323-327 (1988); y Verhoeyen, et al., Science, 239:1534 (1988)). Por ejemplo, los anticuerpos humanos diseñados por ingeniería se pueden ser producir obteniendo secuencias de ácido nucleico que codifican la HCVR y LCVR de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo murino o anticuerpo elaborado por un hibridoma) el cual se enlaza selectivamente a hepcidina-25, identificando las CDRs en la HCVR y LCVR (no humana, e injertando tales secuencias de ácido nucleico que codifican las CDR sobre las secuencias de ácido nucleico que codifican el armazón humano seleccionado. Opcionalmente, una reg ión CDR puede ser optimizada mutagenizando aleatoriamente o en ubicaciones particulares para sustituir uno o más aminoácidos en la CDR con un aminoácido diferente previo a injertar la región CDR en la región de armazón . Alternativamente, una región de CDR puede ser opti mizada subsecuente a la inserción en la región de armazón humana usando métodos disponibles para un experto en la técnica.

Después que las secuencias que codifican a CDR son injertadas sobre las secuencias que codifican el armazón humano seleccionado, las secuencias de DNA resultantes que codifican las secuencias humanas ligera varia ble y pesada variable diseñadas por ingeniería son entonces expresadas para produci r un anticuerpo humano diseñado por ingeniería que se enlaza a hepcidi na-25. Las HCVR y LCVR humanas diseñadas por ingeniería pueden ser expresadas como parte de una molécula de anticuerpo anti-hepcidi na-25 completa , es decir, como una proteína de fusión con secuencias humanas de dom inio constante. Sin embargo, las secuencias HCVR y LCVR también pueden ser expresadas en la ausencia de secuencias consta ntes para producir Fv o Fab anti-hepcidi na-25 diseñados por ingeniería , por ejemplo (véase, por ejemplo, Watkins, J. , et al . , Anal . Biochem . 253: 37-45 (1 997) y Watkins, J. , et al. , Anal . Biochem . 256: 1 69-1 77, ( 1 998)) .

Usos de Diagnóstico Los anticuerpos de la presente i nvención proporcionan los medios para detectar o determinar exactamente las cantidades de hepcidina-25 en un tejido o fluido biológico para valoración de predisposiciones a enfermedades y condiciones promovidas por hepcidina-25, y para detección y diagnóstico de tales enfermedades y condiciones en pacientes que sufren de estas. Por ejemplo, los anticuerpos selectivos de hepcidina-25 de la invención pueden ser incorporados en inmunoensayos sensibles y confiables tales como ELISA, RIA, ensayos de inmunodifusión, o ensayos de inmunodetección, tales como ensayos SPR. De manera similar, los anticuerpos selectivos de hepcidina-25 de la presente invención son también útiles para los ensayos inmunohistoquímicos (IHC) y de inmunofluorescencia (I F) de muestras de tejido o fluido biológico. Tales análisis pueden ser usados para detectar niveles aberrantes de hepcidina-25 y por lo tanto diagnosticar enfermedades y condiciones promovidas por hepcidina-25. Más específicamente, la presente invención proporciona métodos para diagnosticar una enfermedad o condición asociada con hepcidina-25 en un paciente determinando el nivel de hepcidina-25 en una muestra de tejido o un fluido biológico del paciente y comparando el nivel de hepcidina-25 en la muestra con el nivel de hepcidina-25 en una muestra correspondiente a partir de uno o más individuos de control o con un estándar de referencia con ello detectando un estado de enfermedad asociado con el nivel anómalo de hepcidina-25. El estado de enfermedad puede comprender una o más de una enfermedad no genética o genética asociada con reducir los niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocrito.

Preferiblemente el estado de enfermedad puede comprender uno o más de una enfermedad genética o no genética asociada con anemia.

También se proporciona un método para monitorear una enfermedad o condición asociada con hepcidi na-25 en un paciente. El método incluye determinar el nivel de hepcidina-25 en una muestra de un tej ido o fluido biológico a partir de un paciente q ue sufre de o en riesgo de una enfermedad o condición asociada con hepcidi na-25 en un primer punto de tiempo; determinar el nivel de hepcidina-25 en una o más muestras de tejido o fluido biológico del paciente en uno o más diferentes puntos de tiempo; comparar los niveles de hepcidina-25 determinados en diferentes puntos de tiem po y con ello monitorear la enfermedad o condición promovida por hepcidina-25.

Los anticuerpos selectivos de hepcidina-25 de la presente invención son particularmente útiles cuando se aplican a métodos de alto rendimiento. Tales métodos incluyen métodos de micro-chip y micro-arreglo, de manera que muchas muestras pueden ser probadas en una microplaca o laminilla u otro sustrato de ensayo conocido en la técnica .

La presencia de hepcidina-25 o niveles de la misma en una muestra biológica pueden ser establecidos com bi nando la muestra biológica con , por ejemplo, un anticuerpo de la invención bajo condiciones adecuadas para formar un complejo antígeno-anticuerpo. El anticuerpo es directamente o, más preferiblemente, indirectamente etiquetado con una porción detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. U na amplia variedad de métodos de detección de formación de inmunocomplejo son bien conocidas en la técnica , por ejemplo, ELISA, RIA, inmunomanchado (por ejemplo, manchado de punto, manchado de ranura , manchado wester, etc. ) , técnicas de inmunofluorescencia indirecta y métodos que dependen de la detección de cambios en parámetros físicos, tales como por ejemplo, SPR y similares. Tales aplicaciones incluyen métodos que utilizan un anticuerpo selectivo a hepcidi na-25 de la invención conjugado con una porción detectable para detectar hepcidina en una muestra biológica , por ejemplo, en un fluido biológico humano o en una célula o extracto de tej ido. Los anticuerpos de la invención pueden ser usados en tales ensayos con o sin modificación con una; porción detectable. Si se modifican con una porción detectable, los anticuerpos de la invención pueden ser modificados por unión covalente o no covalente de la porción detectable. Como se usa en la presente, el término "detectable" describe una característica de una sustancia (un conjugado, compuesto o porción) que permite identificar o rastrear la sustancia por un detector, usando técnicas anal íticas conocidas. Los ejemplos representativos de porciones detectables incl uyen , sin limitación, cromóforos, porciones fluorescentes, porciones fosforescentes, porciones luminiscentes, porciones radioactivas, varias enzimas (tales como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante) , porciones magnéticas (por ejemplo, materiales diamagnéticos, paramagnéticos y ferromagnéticos), y agrupamientos de metales pesados, así como también cualquiera de otras porciones detectables conocidas. La cantidad de un complejo estándar de anticuerpo-antígeno formado puede ser cuantificada por varios métodos conocidos en el arte, tales como, por ejemplo, medios fotométricos o colorimétricos. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención son usados sin modificación, es decir, directamente etiquetados, de conformidad con los métodos bien conocidos en el arte.

La invención incluye un método para detectar la proteína de hepcidina-25 en una muestra biológica, que comprende incubar un anticuerpo de la invención con una muestra biológica bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir al anticuerpo enlazarse a la proteína de hepcidina-25, y detectar el enlace. Preferiblemente, el anticuerpo es 5E8, OH4 y/o OB3. Un método preferido para detectar la proteína de hepcidina-25 en una muestra biológica es un ELISA intercalado, que comprenden incubar un primer anticuerpo de la invención con la muestra biológica bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir al anticuerpo enlazarse a la proteína de hepcidina-25, remover la muestra no unida, aplicar un segundo anticuerpo que se enlaza selectivamente a un epítope contenido dentro de los aminoácidos 1 hasta 7 de la SEC I D NO: 1 , remover el segundo anticuerpo no unido, y detectar el enlace del segundo anticuerpo. Preferiblemente, el primer anticuerpo es 3.23 o 3.12 y el segundo anticuerpo es OH4 u OB3. Mab 3,23 anti-hepcidina comprende dos polipéptidos de cadena ligera y dos polipéptidos de cadena pesada en donde cada uno de los polipéptidos de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 82 y cada uno de los polipéptidos de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 83 y se enlaza a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC I D NO: 1 . Mab 3.12 anti-hepcidina comprende dos polipéptidos de cadena ligera y dos polipéptidos de cadena pesada en donde cada uno de los polipéptidos de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC I D NO: 84 y cada uno de los polipéptidos de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 85 y se enlaza a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 1 . Un método más preferido para detectar la proteína de hepcidina-25 en una muestra biológica es un ELISA intercalado, que comprende incubar un primer anticuerpo que específicamente se enlaza a un epítope contenido dentro de los aminoácidos 5-25 de hepcidina con la muestra biológica bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir al anticuerpo enlazarse a la(s) proteína(s) de hepcidina, remover la muestra no unida, aplicar un segundo anticuerpo que se enlaza a un epítope contenido dentro de los aminoácidos 1 hasta 7 de hepcidina-25, remover el segundo anticuerpo no unido, y detectar la presencia o ausencia del enlace del segundo anticuerpo. Preferiblemente, el primer anticuerpo es 3.23 o 3.12 y el segundo anticuerpo es OH4 u OB3. Más preferiblemente, el segundo anticuerpo no es etiquetado y el enlace se detecta indirectamente de conformidad con métodos conocidos en la técnica.

La presente invención también proporciona composiciones, métodos y kits para seleccionar muestras sospechosas de contener hepcidina-25. Tal selección se puede realizar en muestras de pacientes, o muestras de laboratorio sospechosas de contener o producir tal polipéptido. Un kit puede contener un anticuerpo selectivo a hepcidina-25 de la presente invención. El kit puede contener un amortiguador adecuado y reactivos para detectar una interacción entre una muestra y un anticuerpo selectivo a hepcidina-25 de la presente invención. El reactivo proporcionado puede ser un agente radioetiquetado, etiquetado fluorescentemente o etiquetado enzimáticamente capaz de enlazarse o interactuar con un anticuerpo de la presente invención tal como un anticuerpo IgG anti-ratón.

El reactivo del kit puede ser proporcionado como una solución líquida, unido a un soporte sólido o como un polvo seco. Cuando el reactivo se proporciona en una solución líquida, preferiblemente, la solución líquida es una solución acuosa. Preferiblemente, cuando el reactivo proporcionado está unido a un soporte sólido, el soporte sólido puede ser un medio cromatográfico, una placa de prueba que tiene una pluralidad de cavidades, o una laminilla de microscopio. Cuando el reactivo proporcionado es un polvo seco, el polvo puede ser reconstituido por la adición de un solvente adecuado, el cual puede ser proporcionado también en el kit.

El kit de la invención se proporciona en un contenedor que en general incluye un vial en el cual el anticuerpo, antígeno o reactivo de detección puede ser colocado, y preferiblemente adecuadamente sometido a alícuotas. Los kits de la presente invención también incluirán típicamente un medio para contener los recipientes del anticuerpo, antígeno, y reactivo para escala comercial. Tales contenedores pueden incluir recipientes de plástico en los cuales los viales deseados están retenidos y uno o más químicos necesarios, tales como material de cromatografía, solventes y eluyentes, tubos de ensayo, detergentes, anticuerpos y químicos para la reacción de detección.

Usos Terapéuticos Las enfermedades o condiciones promovidas por hepcidina-25 se pueden prevenir o tratar administrando a un paciente en necesidad del mismo una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo selectivo a hepcidina-25 un segundo anticuerpo que se enlaza a un epítope contenido dentro de los aminoácidos 1 hasta 7, inclusivo, de (1 ) hepcidina humana-25, es decir, DTHFPIC (SEC ID NO: 5), y/o (2) hepcidiha-25 de ratón, es decir, DTNFPIC (SEC ID NO: 86).

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención puede ser usada para incrementar los niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocrito en un humano cuando una cantidad efectiva se administra a un sujeto humano en necesidad del mismo. Además, un anticuerpo de la invención puede ser útil para el tratamiento de condiciones, enfermedades o trastornos en donde la presencia de hepcidina-25 causa o contribuye a efectos patológicos indeseables o a una reducción de niveles de hepcidina-25 o bioactividad de hepcidina que tiene un beneficio terapéutico en sujetos humanos. Tales condiciones, enfermedades o trastornos incluyen anemia que incluye, pero no se limita a, anemia que resulta de infección, inflamación, enfermedad crónica, y cáncer. Los sujetos pueden ser masculinos o femeninos. Preferiblemente, un sujeto humano tiene o están en riesgo de tener nivel de hierro e|n suero indeseablemente bajo, conteo de reticulocitos bajo, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocrito. Más preferiblemente, un sujeto humano están en riesgo de, o que sufre de, anemia que incluye, pero no se limita a, anemia que resulta de infección, inflamación, enfermedad crónica, y/o cáncer.

Adicionalmente, el uso de un anticuerpo de la invención para uso en la manufactura de un medicamento para el tratamiento o prevención de anemia que incluye, pero no se limita a , anemia que resulta de infección, inflamación, enfermedad crónica y cáncer.

Los anticuerpos selectivos hepcidina-25 de la presente invención también son útiles para la prevención y terapia de enfermedades y condiciones promovidas por hepcidina-2. Los Mab selectivos de anti-hepcidina-25 de la invención se puede formular en composiciones farmacéuticas para inmunización pasiva contra hepcidina-25. Los fragmentos funcionales del Mabs de la presente invención, tal como, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 y cualquiera de los fragmentos que retienen la capacidad para selectivamente enlazar hepcidina-25 pueden también ser incorporados en las composiciones farmacéuticas y aplicados en terapia.

Además, el Mabs selectivo de hepcidina-25 de la presente invención puede ser aplicado en inmunoensayos para monitorear el progreso de las enfermedades o condiciones promovidas por hepcidina-25, en donde el nivel o cantidad de hepcidina-25 proporciona una indicación de los sucesos de tratamiento o terapia, o del progreso de la enfermedad o condición. , Más aún, los Mabs de la presente invención son útiles en métodos para evaluar un tratamiento que bloqueo hepcidina-25 de un paciente que sufre de una enfermedad o condición promovida por hepcidina-25. El método incluye las etapas de: a) Obtener una primera muestra biológica de fluido biológico del paciente antes a o en las etapas tempranas de un tratamiento; b) determinar el nivel de hepcidina-25 en la primera muestra por un método de inmunoensayo; c) obtener una segunda muestra de fluido biológico del paciente después de un tiempo adecuado dentro del cual el tratamiento puede tener un efecto; d) determinar la cantidad de hepcidina-25 en la segunda muestra por el método de inmunoensayo, e) comparar las cantidades determinadas de hepcidina-25 en la primera muestra con la cantidad de hepcidina-25 en la segunda muestra con el fin de determinar la eficacia del tratamiento que enlaza o bloquea hepcidina-25.

El método descrito anteriormente aplica para evaluar un tratamiento que enlaza o tratamiento que bloqueo hepcidina-25 en un paciente, es particularmente valioso en práctica cl ínica, en donde en momento de iniciar con un régimen terapéutico u otro puede ser crítico al resultado para el paciente. El método de la presente invención proporciona información en la base de estas decisiones críticas. El método proporciona una medición de la cantidad de hepcidina-25 antes a o en las etapas tempranas de tratamiento y proporciona una o más mediciones de hepcidina-25 en uno o más periodos después del inicio de tratamiento, particularmente cuando el tratamiento se espera ha comenzado a ser efectivo.

El tratamiento que bloquea hepcidina-25 puede ser administración pasiva de anticuerpo selectivo de anti-hepacidina-25 a un paciente. El anticuerpo selectivo anti-hepcidina-25 puede ser un anticuerpo humano/no humano quimérico, un anticuerpo selectivo anti-hepcidina-25 monoclonal humanizado o uno completamente humano, o cualquier fragmento de anticuerpo selectivo de hepcidina-25 que es funcional en hepcidina-25 enlazada.

Son bien conocidos en la técnica una amplia variedad de métodos de detección de formación de inmunocomplejo, por ejemplo, ELISA, RIA, inmunomanchado (por ejemplo, manchado de punto, manchado de ranura, manchado western , etc.), técnicas de inmunofluorescencia indirecta y métodos que confían en la detección de cambios en parámetros físicos, tal como SPR. En un método ampliamente usado, se detecta la formación de inmunocomplejo a través del uso de una etiqueta, tal como un radioetiquetado o una mancha de enzima (tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante). Ventajas adicionales pueden aumentar a través del uso de un ligando de enlace secundario tal como un segundo anticuerpo o una molécula acoplada a avidina para enlazar un ligando biotinilado, de conformidad con los métodos bien conocidos en la técnica.

Los términos "tratamiento" y "tratar" como se usan en la presente, se refieren a administrar una sustancia a un paciente; el cual tiene una enfermedad, condición o trastorno descrito en la presente, un síntoma de una enfermedad, condición o trastorno o una predisposición hacia una enfermedad, condición o trastorno, con el propósito de conferir un efecto terapéutico, por ejemplo, para curar, aliviar, alterar, afectar, controlar, detener, mejorar o prevenir la enfermedad, condición o trastorno, un síntoma de la misma, o una predisposición hacia esta. Preferiblemente, el paciente tratado es un mamífero, y, más preferiblemente, un humano. Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, un bolo único puede ser administrado, varias dosis divididas se puede administrar durante un tiempo o la dosis puede ser proporcionalmente reducida o incrementada como se indique por las exigencias de la situación terapéutica.

Composición Farmacéutica Un anticuerpo de la invención se puede incorporar en una composición farmacéutica adecuada para administración a un sujeto humano. Un anticuerpo de la invención se puede administrar a un sujeto humano solo o en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable y/o diluyente en una dosis única o múltiple. Tales composiciones farmacéuticas se diseñan para ser apropiadas para la forma seleccionada de administración, y diluyentes, portador y/o excipientes farmacéuticamente aceptables tal como agentes dispersantes, aglutinantes, surfactantes, conservadores, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidad, agentes estabilizantes y similares, se usan como apropiado. Las composiciones se pueden diseñar de conformidad con las técnicas convencionales conocidas en la técnica.

Portadores adecuados para composiciones farmacéuticas incluyen cualquier materia el cual, cuando se combina con un Mab de la invención, retiene la actividad de la molécula y no es reactivo con el sistema inmune del sujeto.

Una composición farmacéutica que comprende un Mab anti-hepcidina-25 de la presente se puede administrar a un sujeto en riesgo para o que exhibe patologías como se describe en la presente, por ejemplo, trastornos de anemia, usando técnicas de administración estándar.

La frase "cantidad efectiva" como se usa en la presente se refiere a una cantidad necesaria (en dosificaciones y por periodos de tiempo y para los medios de administración) para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad efectiva del anticuerpo puede variar de conformidad con los factores tal como la etapa de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción del anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad efectiva es también una en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo, se ven compensados por los efectos benéficos terapéuticos.

Una cantidad efectiva es al menos una cantidad mínima, pero menos que una cantidad tóxica, de un agente activo el cual es necesario para impartir un beneficio terapéutico a un sujeto. Dicho de otra manera, una cantidad efectiva o cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención es una cantidad la cual en mamíferos, preferiblemente, humanos, (I) incrementa niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina y/o hematocrito, o (¡i¡) tratar una condición, trastorno o enfermedad en donde la presencia de hepcidina-25 causa o contribuye a un efecto patológico no deseable, o (iii) una disminución en niveles de hepcidina-25 o bioactividad de hepcidina resulta en un efecto terapéutico benéfico en un mamífero, preferiblemente, un humano, que incluye, pero no se limita a, anemia que incluye, pero no se limita a, anemia de enfermedad crónica, que incluye pero no se limita a, anemia que resulta de infección , inflamación, enfermedad crónica y/o cáncer. Una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención se puede administrar en una dosis única o en dosis múltiples. Además, una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención se puede administrar en dosis múltiples de cantidades que pueden ser menos que una cantidad efectiva si no se administra más de una vez.

Como es bien conocido en las técnicas médicas, dosificaciones para cualquier sujeto depende de muchos factores, que incluyen, frecuencia y ruta de administración, salud general y otros fármacos a ser administrados concurrentemente. Las dosis pueden además variar dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente .1 hasta aproximadamente 100 mg; preferiblemente, aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1 00 mg; más preferiblemente, aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50 mg; sin embargo, dosis por debajo o por encima de este intervalo ejemplar son previstas, especialmente considerando los factores antes mencionados. Un régimen de dosificación parenteral diario puede ser aproximadamente 10 pk/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal total, preferiblemente de aproximadamente 100 pg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg, más preferiblemente de aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 1 0 mg/kg. El progreso puede ser monitoreado por mediciones periódjcas, y la dosis por lo tanto ajustada.

Estas cantidades sugeridas de anticuerpo se someten a un mayor detalle de discreción terapéutica. El factor clave para seleccionar una dosis apropiada y programación es el resultado obtenido. Factores para consideración en este contexto incluyen el trastorno particular a ser tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del anticuerpo, el tipo particular de anticuerpo, el método de administración, el esquema y frecuencia de administración, y otros factores conocidos por practicantes en medicina.

La ruta de administración de un anticuerpo de la presente invención puede ser oral, parenteral, por inhalación o tópica. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención pueden ser incorporados en una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. El término parenteral como se usa en la presente incluye administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal , vaginal o intraperitoneal. Se prefiere suministro parenteral por inyección intravenosa o intraperitoneal o subcutánea. La inyección subcutánea es más preferida. Vehículos adecuados para las inyecciones son bien conocidos en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas típicamente pueden ser estériles y estables bajo las condiciones de manufactura y almacenaje en el contenedor proporcionado, que incluye, por ejemplo un vial sellado, jeringa u otro dispositivo de sumi nistro, por ejemplo, una pluma. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas pueden ser estériles filtradas después de elaborar la formulación , o de otra forma hechas microbiológicamente aceptables.

Se ofrecen los siguientes ejemplos para propósitos ilustrativos únicamente, y no se pretende limitar el alcance de la presente invención .

Ejemplos Ejemplo 1 : Producción de Hepcidina-25 Humana Se puede obtener hepcidina-25 humana de fuentes comerciales (por ejemplo, Peptide I nternational (Lousvi lle, KY)) o producida por una variedad de técnicas si ntéticas o recombinantes conocidas en la técnica. Por ejemplo, una proteína de fusión que comprende veintici nco ami noácidos de hepcidi na-25 y que itiene la secuencia de aminoácidos como se m uestra en la SEC I D NO: 95 es expresada en E. coli. Los anticuerpos de inclusión se aislan de 3 litros de E. coli que expresa la proteína de fusión hepcidina-25 humana después de una inducción de 3-6 horas con 1 mM de I PTG a 37°C. Los anticuerpos de inclusión se solubilizan en amortiguador A (50 mM de Tris y urea 8 M (pH 8.0)) . Lo sobrenadante se pasa sobre una columna Cromatografía de Afinidad Metal-Hierro I nmovilizada (I MAC) (20 m i de resina) . La columna se lava con amortiguador A hasta que la absorbancia regresó a la l ínea base y los polipéptidos enlazados son elu ídos en lotes a partir de la columna por imidazol 0.5 M en amortiguador A. La proteína de fusión hepcidina-25 humana se combi na y se reduce con 50 mM de DTT. Esta proteína de fusión es después doblada nuevamente diluyendo el material combinado en urea 2M, 3 mM de cisteína, 50 mM de Tris (pH 8.0) a una concentración de proteína final menor que 50 pg/ml . Este materia se agita a temperatura ambiente y se oxida con aire por 48 horas. Los polipéptidos oxidados se pasan sobre una columna I MAC (20 mi) a una velocidad de flujo de 5 ml/min , y la proteína de fusión hepcidina-25 hu mana se eluye por lotes de la columna por imidazol 0.5 M en amortiguado A. Las fracciones combi nadas que contienen la proteína de fusión hepcidina-25 humana se concentran y se pasan a través de una columna de clasificación por tamaño (por ejemplo, SUPERDEX® 75, GE Healthcare, XK26/60) equilibrada con 50 mM de Tris, urea 4M , pH 8.0, a una velocidad de flujo de 3 ml/min . La proteína de fusión monomérica eluída se combina y después se diluye a 50 mM de Tris, urea 2M , 5 mM de CaCI2, pH 8.0 y después se desdobla con enterocinasa para ! producir hepcidina-25 humana de la SEC I D NO: 1 . La proteína de fusión hepcidina-25 humana no desdoblada se remueve por cromatografía I MAC pasiva (como se resumen anteriormente) . El flujo a través de la columna I MAC después se carga en una columna de Fase I nversa C-1 8 a una velocidad de fl ujo de 4.0 ml/min . La colum na se lava con TFA al 0.1 % en agua hasta que la absorbancia regresa a la l ínea base y el polipéptido de enlace se eluye de la columna con un grad iente li neal de ACN de 20% hasta 40% con TFA al 0. 1 % a u na velocidad de 0.5%/min . Las fracciones las cuales contienen el polipéptido hepcidina-25 humano se combi nan y analizan por secuenciamiento de aminoácido N-terminal y matriz asistida por desorpción láser/espectrometría de masa de ionización (MALDI-MS).

Los polipéptidos que codifican hepcidina-25 de rata, ratón y mono cinomólogo y varias formas N-terminalmente truncadas de hepcidina-25 humana forman una hepcidina-25 humana, que incluye hepcidina-22 y hepcidina-20 también se elaboran esencialmente como se describe para hepcidina-25 humana.

Ejemplo 2: Producción Anticuerpos Hepcidina-25 N-terminal Se inmunizan ratones con un péptido hepcidina N-terminal (aminoácidos 1 -7 de SEC ID NO: 1 ) conjugada con un enlazador peptídico de cinco aminoácidos (es decir, GPGPG) a una secuencia de péptido OVA (aminoácidos 323-336), es decir, inmunógeno de longitud completa DTHFPICGPGPGISQAVHAAHAEINE (SEC I D NO: 87) y los bazos de estos ratones se recolecta en el Día 27. Las células B se ordenan a 1 célula por cavidad para memoria Ag+ e lgG+ y células centrales germinales !y se co-cultivan con células EL4B por 2 semanas. Los sobrenadantes que contienen IgG resultantes después se diluyen 1 .4 veces y se seleccionan en los siguientes tres formatos ELISA: 1 ) placas de 96 cavidades revestidas con NEUTRAVIDIN™ enlazado a la proteína, una forma desglicosilada e isoeléctricamente neutral de avidina (Pierce Biotechnology, Rocville, IL) a 2 ug/ml en amortiguador de carbonato durante la noche. Sitios de enlace no específico se bloquean con, caseína por 1 hora. La placa después se lava 3 veces con PBS Tween-20 al 0.05% y 1 00 nM de hepcidina biotinilada se incuba en la placa por 1 hora. La placa se lava nuevamente como se describe. Los sobrenadantes IgG del cultivo después se incuban por 1 hora y la placa se lava. Se detecta enlace específico del anticuerpo hepcidi na-25 por 0.5 g/ml de fosfatasa alcalina Fcy IgG antiratón de cabra. La actividad de fosfatasa alcalina se mide agregando una cantidad apropiada de sustrato PM P/AM P (6 mg/ml de fenolftaleína monofosfato (PM P) en Tris 0.5M , pH 1 0.2 , 2% de 2-amino-2-metil- 1 -propanol (AM P) , 0.1 % de NaN3) y se mide la cantidad de absorbancia a 560 nm; 2) placas de 96 cavidades se revisten ! con IgG anti-ratón de cabra a 2 g/ml en amortiguador de carbonato durante la noche. Los sitios de en lace no específicos son después bloqueados con caseína por 1 hora. La placa se lava 3 veces con PBS con Tween-20 0.05% y se incuban los sobrenadantes IgG del medio de cultivo por 1 hora. Después se incuba hepcidi na-25 biotinilada ( 100 n M) en la placa por 1 hora y la placa se lava como previamente se describe. Después se detectan enlaces específicos de hepcidina-25 para anticuerpo capturado agregando 1 Mg/m l de N EUTRAVIDI N-AP™, un conjugado N E UTRAVI DI N™-fosfatasa alcalina (Pierce Biotechnology, Rockford, I L) y detectar la actividad de fosfatasa alcalina agregando sustrato PMP/AMP y midiendo la absorbancia a 560 nm ; y 3) placas de 96 cavidades se revisten con 1 00 nM de hepcidi na-25 en agua durante la noche: a 37°C. Después se bloquean sitios de enlace no específicos con caseína por 1 hora y la placa se lava 3 veces con PBS con Tween-20 al 0.0,5% . Los sobrenadantes IgG del medio de cultivo después se incuban por 1 hora y la placa nuevamente se lava como se describe. Se detecta el enlace específico del anticuerpo hepcidina-25 N-terminal por 0.5 pg/ml de fosfatase alcalina Fcy IgG anti-ratón de cabra. Se mide la actividad de fosfatasa alcalina con sustrato PMP/AMP y se mide la cantidad de absorbancia a 560 nm.

Anticuerpos de ratón que expresan células B específicos para el N-término de hepcidina-25 tal como 3A9, 4C 1 1 y 5E8 después se usan para aislar RNA y las regiones variables se amplifican por RT-PCR y subsecuentemente se clonan en vectores lgG1 de ratón comercialmente disponibles o cadena pesada o ligera respectivamente. Se confirman los anticuerpos de ratón expresados temporalmente como anticuerpos específicos hepcidina-25 N-terminal usando SPR.

Ejemplo 3: Mediciones de Enlace de Afinidad de Fabs y Mabs anti-Hepcidina usando SPR.

Se puede usar un biosensor SPR tal como el BIAcore® T100 para medir cinéticas de enlace y afinidad de anticuerpos tales como los anticuerpos descritos en la presente. El sistema BIAcore® utiliza las propiedades ópticas de SPR para detectar la alteración en concentración de proteína de moléculas que interactúan dentro de una matriz del biosensor de dextrano. Excepto como se notó, todos los reactivos y materiales se adquieren de BIAcore® AB (Upsala, Suecia). Todas las mediciones se rea l iza n a 25°C. Las muestras se disuelven en amortiguador HBS-EP (1 50 mM de cloruro de sodio, 3 mM de EDTA, 0.05% (p/v) tensoactivo P-20 y 10 mM de HEPES, pH 7.4). Para Icapturar Fabs con kappa humana, se inmoviliza kappa a nti-humano de cabra en células de flujo 1 hasta 4 de un chip sensor CM5 a un nivel de 5000- 10000 de unidades de respuesta (Rus) usando un kit de acoplamiento de amina. Para capturar Mabs con lgG1 de ratón, se inmoviliza gama Fe antiratón de cabra en células de flujo 1 hasta 4 de un chip sensor CM5 a un nivel de 5000-10000 Rus usando un kit de acoplamiento de amina. Para capturar anticuerpos con lgG4 humano, la proteína A se inmoviliza de células de flujo 1 hasta 4 de un chip sensor CM4 a un nivel de 400-700 Rus usando un kit de acoplamiento de amina. Se evalúan Fabs preparados de periplasma de E. coli y Mabs preparados de cultivo celular de mamífero usando ciclos analíticos múltiples. Cada ciclo consiste de las siguientes etapas: 0.3-2 minutos de inyección de un Fab o un Mab a ~ 10 µ?/??????? apuntando a una captura de 200-10000 Rus, 2 minutos de inyección a 50 pL/minuto de varias concentraciones de hepcidina-25 humana (de 600 nM hasta 0.1 nM) obtenidas como se describe en el Ejemplo 1 anterior seguido por 2-10 minutos de disociación, y regeneración usando 30 µ?_ de 10 mM de clorhidrato de glicina, pH 1.5. Las mediciones se obtienen a 25°C y las proporciones de asociación y disociación para cada ciclo se evalúan usando "1:1 con modelo dé enlace de transferencia" en el software BIAevaluation.

Los anticuerpos monoclonales de ratón 3A9, 4C11, 5E8, OB3, OH4, OB1 y OE1 exhiben enlace a hepcidina-25 humana con una;afinidad (KD) de aproximadamente 36 nM hasta aproximadamente 1 nM. Anticuerpo monoclonal de ratón OH4 enlazado a hepcidina-25 humana con un KD de aproximadamente 1.2 nM pero no detectablemente enlaza a hepcidina-20 humana o hepcidina-22 humana. El anticuerpo monoclonal de ratón 5E8 enlaza hepcidina-25 humana pero no detectablemente enlaza a hepcidina- 25 de ratón o rata. Anticuerpo monoclonal de ratón 4C11 enlaza hepcidina-25 humana, ratón y rata, a un grado mucho menor, hépcidina-22 humana (aproximadamente 209 nM) pero no hepcidina-22 humana.

Ejemplo 4: Identificación de un Par de Mabs que enlazan Hepcidina-25 Humana Simultáneamente Anticuerpos monoclonales elevan nuevamente aminoácidos 1-7, inclusivos, de hepcidina-25 humana la cual demuestra anta afinidad enlazada a hepcidina-25 humana por análisis SPR se probaron por su capacidad para simultáneamente enlazar a hepcidina-25 humana con Mab 3.23.

Brevemente, en un Biacore® T100, se inmoviliza anticuerpo policlonal Fe lgG1 anti-ratón de cabra en célula de flujo 1 hasta 4 de chip CM5 a 5000-15000 unidades de respuesta (Ru). Se captura 5E8 Mab en célula de flujo 2, se captura 4C11 Mab en célula de flujo 3, y se captura 3A9 Mab en célula de flujo 4. La célula de flujo 1 se usa como una célula de flujo de referencia. Todas las células de flujo después se inyectan con hepcidina-25 humana. Las células de flujo con 5E8, 4C11 3A9 Mabs inmovilizadas por consiguiente, todas muestran un incremento en Rus, indicando enlace de los Mabs a hepcidina-25 humana. Después, todas las células de flujo se inyectan con Mab 3.23. Únicamente las células de flujo 2, con 5E8 Mab inmovilizadas por consiguiente, muestran enlace simultáneo de hepcidina-25 humano por 5E8 y 3.23 Mabs.

Adicionalmente, Hu22, 3.23, 3.12 Mabs, y un anticuerpo lgG4 humano de control negativo se inmovilizaron en células de flujo separadas de un Chip Sensor_Chip CM4 (Biacore) a 1000-4000 Rus. Las células de flujo después se inyectan con hepcidina-25 humana. Después, las células de flujo se inyectan con 5E8 Mab. Las células de flujo que tienen Hu22, 3.23 y 3.1 2 Mabs inmovilizadas por consiguiente mostró enlace de hepcidina-25 humana y después enlace simultánea de 5E8 Mab. La célula de flujo que tiene un lgG4 humano de control negativo inmovilizado por consiguiente no muestra enlace a ya sea hepcidina-25 humana o 5E8 Mab. Además, 5E8 Mab no enlazahepcidina-25 humana simultáneamente con ya sea antisuero policlonal de conejo elevado a péptidos conjugados KLH que consiste de aminoácidos 1 -7 de hepcidina-25 humana y ratón (Alpha Diagnostic International, San Antonio TX; cat #Hepc 13-S) o una preparación purificada IgG del mismo (Alpha Diagnostic International; cat #Hepc13-A)).

Ejemplo 5: Ensayo de Elisa Intercalado para Medir Hepcidina-25 Humana Las cavidades de una placa de cavidades múltiples se revisten por 1 hora a temperatura ambiente con 3.23 Mab a una concentración de 2 mg/l en amortiguador que contiene carbonato-bicarbonato, pH 9.40 (Pierce Biotechnology, Rockville, IL). Después, las células se aspiran y se lavan 3 veces con TBST (salina amortiguada TRIS que contiene 10 mmol/l de Tris pH 7.4, 1 50 mmol/l de NaCI con 1 mi de Tween-20/?). Las cavidades después se bloquean por 1 hora con amortiguador de bloqueo TBS-caseína (150 mM NaCI, 25 mM de Tris, 1 % de caseína, pH 7.4 con antimicrobiano Kathon (Pierce Biotechnology; cat #37532). Después, 100 µ? de un estándar de hepcidina-25 (que varía de concentraciones de hepcidina-25 humana sintetizada en amortiguador de ensayo que consiste de 50 mmol/l HEPES, pH 7.40, 150 mmol/l NaCI, 10 ml/l Tritón® X-100 tensoactivo no iónico (Union CArbide Corp., Oanbury, CT), 5 mmol/l EDTA y 5 mmol/l ácido etilenglicoltetraacético (EGTA) se agrega a una serie de cavidades para generar una curva de calibración. Posteriormente, las muestras de suero se diluyen 1:20 en amortiguador de ensayo y se agrega a sus cavidades respectivas, y la placa ELISA se deja incubar por 1 hora a temperatura ambiente. Después de la aspiración, las cavidades se lavan 3 veces con TBST, y se agrega 100 µ? de una solución 1:1000 de 5E8 Mab anti-hepcidina-25 biotilinada a 1 mg/ml a las cavidades por 1 hora de incubación a temperatura ambiente. Después de la aspiración, las cavidades se lavan 3 veces con TBST, y se agrega 100 µ? de una solución poli-estreptavidina-HRP (Pierce Biotechnology, Rockville, IL) a las cavidades para una incubación por 30 minutos a temperatura ambiente. Las cavidades después se lavan 3 veces con TBST. Después de la última aspiración de TBST, se agrega 100 µ? del sustrato desarrollado con 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Pierce Biotechnology, Rockville, IL) a las cavidades y se dejan incubar por 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detiene con un volumen igual de ácido fosfórico 2N, y las placas se leen a 450 nm.

Las concentraciones de suero de hepcidina-25 a partir de 40 pacientes normales y con cáncer medidas por el ELISA de intercalación descrito anteriormente varía de 5 hasta 656 pg/l y directamente correlacionado con concentraciones de suero de hepcidina-25 medida usando un ensayo LC/MS estándar (r = 0.98, p < 0.0001)(véase, Murphy, et al, (2007)). También, 100 muestras de suero humano de donadores saludables (50 hombres y 50 mujeres; edad que varía entre 18 hasta 66 años, media 37 años) obtenidos de Bioreclamation, Inc. (East Meadow, NJ)) se determinan por tener concentraciones de hepcidina-25 que varía de < 1 -79 g/ml . Adicionalmente, el ELISA de intercalación detecta el péptido de control hepcidina-25 humana en una manera dependiente de la dosis hasta al menos 1 ng/ml. Por otra parte, ni el péptido de control hepcidina-25 humana (hasta 2 ng/ml) ni hepcidina-25 endógena en un control positivo de muestra de suero humano, es decir, previamente determinado por ensayo LC/MS por contener hepcidina-25, es detectable en el mismo ensayo cuando 5E8 Mab se sustituye con i) antisuero policlonal de conejo elevado a péptidos conjugados KLH que consiste de aminoácidos 1 -7 de hepcidina-25 humana y ratón (Alpha Diagnostic International , San Antonio TX; cat #Hepc 1 3-S) o ii) una preparación del mismo purificada de IgG (Alpha Diagnostic International; cat #Hepc13-A)). Además, ni el estándar hepcidina-25 ni el control positivo de muestra de suero humano son detectables cuando el anti-suero HEPC-1 3-S o la preparación del mismo purificada de IgG sin i) revestidas en cavidades separadas de la placa de ensayo, es decir, como los anticuerpos capturados, ii) se agrega al ensayo como anticuerpos de detección conjugados con biotina, o iii) se agrega al ensayo como anticuerpos de detección no conjugados, es decir, con su enlace subsecuentemente sometido a ensayo para uso de un anticuerpo secundario IgG antiVconejo.

El péptido de control hepcidina-25 humana y hepcidina-25 endógeno en la muestra de control positivo de suero humano no se detecta cuando se conduce el ELISA de intercalación usando 5E8 Mab como el anticuerpo capturado y apareado con un IgG policlonal de conejo comercialmente disponible elevado contra un conjugado KLH, péptido C-terminal de hepcidina humana madura de 1 3 aminoácidos (Alpha Diagnostic International, San Antonio, TX; cat #HEPC1 2-A).

Ejemplo 6: Determinación de Selectividad de Anticuerpos anti-Hepcidina usando MALDI-TOF El diagnóstico de rutina clínico de biomarcadores es principalmente basado en técnicas cuantitativas inmunológicas, por ejemplo, ELISA. Estos métodos son a menudo no aplicables para antígenos pequeños o para isoformas de antígeno (Sparbier, K. , International Meeting of the Association of Biomolecular Resource Facilities, Salt Lake City, UT, Poster V28-S, (2008) ; y Gutiérrez, J.A. , et al. , (2005)). Mabs y Fabs se evalúan por su capacidad para selectivamente inmunoprecipitar hepcidina-25 endógena, en lugar de precursores o formas truncadas del mismo, a partir de suero humano vía espectrometría de masa MALDI-TOF en polipéptidos de hepcidina enlazados al anticuerpo realizado después de la reducción de la muestra.

Se revisten Mabs o Fabs de hepcidina anti-humano en cavidades separadas de una placa ELISA estándar de 96 cavidades en amortiguador carbonato-bicarbonato (pH 9.4) por 1 hora a temperatura ambiente a una concentración de 2 mg/l. Las cavidades después se aspiran y se lavan 3 veces con TBST. Las muestras de suero humano que contiene una cantidad conocida de hepcidina-25 (diluida en amortiguador de ensayo) se agrega a 1 00 µ?/cavidad por una hora a temperatura ambiente. Las cavidades se aspira n y se lavan 3 veces con TBST. Se eluyen los polipéptidos de hepcidina capturados agregando 40 µ?/cavidad de ácido fórm ico al 0.1 % por 5 minutos a temperatura ambiente. Las muestras eluidas se recolectan y se concentran con un C4 ZipTip™ (Millipore, Billerica, MA) , una pipeta de punta de 1 0 µ? con un lecho de medio de cromatografía para purificar y concentrar femtomoles a picomoles de proteína o péptidos, ideal mente que varía de 25, 000 MW a 1 00,000 MW. Una mitad de un microtitulador de muestra se visualiza en un objetivo MALD I y un volumen igual de solución de matriz (50% de acetonitrilo, 0. 1 % de TFA saturado con ácido alfa-cian-4-hidroxicinámico) se agrega a la muestra. La muestra se seca y analiza con u n Espectrómetro de Masa 4700 TOF-TOF (Applied Biosystems) operado en una forma lineal .

Se realizan experimentos usando espectrometría MALDI-TOF esencialmente como se descri be inmediatamente antes, muestra que hepcidina-25 unida a 3.23 Mab y, a una magnitud mucho menor, hepcidina-20 (Figuras 1 y 2) . El 3.23 Mab no parece enlazar niveles detectables de hepcidina-22 (MW 2436 Da) , hepcidina-24 (MW 2674 Da) , o pro-hepcidina (MW 6929) , asumiendo, por supuesto, que las muestras de suero probadas también contienen las cantidades esperadas de estas formas de hepcidina humana .

Se realizan experimentos similares usando espectrometría MALDI-TOF para determinar las especies de hepcidina en suero! humano enlazadas por 5E8 Mab. Estos experimentos determi nan que 5E8 Mab enlaza únicamente hepcidina-25 en suero humano (Figuras 3 y 4). De forma importante, no se enlazan hepcidina-20, hepcidina-22, pro-hepcidina u otras especies de hepcidina a 5E8 Mab, nuevamente, asumiendo que estas especies de hepcidina humana están presentes en las muestras de suero como se espera.

De esta forma, los inmunoensayos usando el 5E8 Mab, o anticuerpos derivados del mismo o relacionados a este, que incluyen, pero no se limitan a OH4 Mab, son muy específicos y selectivos para hepcidina-25 humana, la forma fisiológicamente relevante, activa de hepcidina en suero humano. Es de esperarse mejoramientos adicionales en especificidad y/o selectividad en inmunoensayo para hepcidina-25 humana que combina el uso de 5E8 Mab, o anticuerpos derivados del mismo o relacionados a este, que incluye, pero no se limita a OH4 Mab y 3.23 Mab, 3.12 Mab o anticuerpos derivados del mismo o relacionados a este.

Ejemplo 7: Ensayo ELISA de intercalación para Medir Hepcidina-25 Humana (sin etiquetado directo de anticuerpos) Se realiza un ELISA de intercalación como en el Ejemplo 5, excepto que i) el anticuerpo conjugado etiquetado se sustituye con OH4 no etiquetado y ii) en enlace del OH4 se detecta directamente por el uso de un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante.

Usando 3.23 Mab y OH4 Mab no etiquetado en un ELISA de intercalación como se describe anteriormente, la hepcidina-25 humana es selectivamente detectada en suero humano con una sensibilidad de aproximadamente 0.2 ng/ml.

Ejemplo 8: Inmunoensayo de Intercalación de Descubrimiento a Meso Escala para Medir Hepcidina-25 Humana Se construye un inmunoensayo de Descubrimiento a Meso Escala de hepcidina-25 humana (MSD)(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) usando los reactivos descritos anteriormente. Brevemente, 1 mg de OH4 Mab se biotiniló usando un kit comercialmente disponible (Pierce Biotechnology, Rockville, IL) diluido en 50% de glicerol y almacenando a -20°C hasta que se necesita. Las cavidades bloqueadas y revestidas con estreptavidina de una placa ELISA se incuban por 1 hora con OH4 Mab biotinilado a una concentración de 2 mg/l. Más tarde, las cavidades se aspiran y se lavan tres veces con TBST (salina amortiguada Tris que contiene 1 0 mmol/l de Tris pH 7.40, 1 50 mmol/l de NaCI con 1 mi de Tween 20/I). Después, se agregan 1 00 µ? de estándares de hepcidina (concentraciones variadas de proteína hepcidina-25 sintetizada en amortiguador de ensayo que consiste de 50 mmol/l HEPES, pH 7.40, 1 50 mmol/l NaCI, 10 ml/l de Tritón X-1 00, 5 mmol/l EDTA y 5 mmol/l EGTA) a las cavidades para generar una curva de calibración. Al mismo tiempo, se diluyen muestras de suero 1 :20 en amortiguador de ensayo y se agregan a sus respectivas cavidades, y la placa ELISA se deja incubar por 1 hora a temperatura ambiente. Después de la aspiración, las cavidades se lavan tres veces con TBST, y se agregan 100 µ? de una dilución 1 : 1 000 de 3.23 Mab etiquetado con rutenio a 1 mg/ml a las cavidades durante 1 hora de incubación a temperatura ambiente. Después de la aspiración, las cavidades se lavan tres veces con TBST, y la placa ELISA se desarrolla usando un lector MSD, la cual pasa un voltaje a través de las cavidades y electroquimioluminiscencia de rutenio registrado para cada cavidad. Se usan el software MSD y SigmaPlot versión 8.0 para probar las curvas de calibración para el ELISA.

El apareamiento óptimo de anticuerpos en el inmunoensayo de intercalación MSD se determina para ser OH4 Mab apareado como el anticuerpo de captura y 3.23 Mab como el anticuerpo conjugado. La proteína hepcidina-25 sintetizada se prepara a una concentración de 1 0 g/l y se diluye serialmente para crear una curva estándar. Como la figura 5 indica, el ELISA se encuentra por tener un intervalo dinámico, antecedente y sensibilidad aceptable. En base a una de las tres evaluaciones de desviación estándar del calibrador cero, la sensibilidad del inmunoensayo se determina por ser mejor que 0.01 g/l, indicando que el inmunoensayo debe tener más de la sensibilidad adecuada para medir niveles de hepcidina-25 de suero humano, en base a estimados previos de niveles de hepcidina-25 de suero humano como se mide por ensayos tipo LC/MS (Murphy, et al. , (2007)). Los datos graficados en la Figura 2 también indican que el inmunoensayo de intercalación MSD es selectivo para hepcidina-25 ya que no se detecta hepcidina-20 o hepcidina-22. Además, las curvas de dilución de inmunoensayo para las muestras de suero humano actual y estándar recombinante se determinan por estar en paralelo, y el inmunoensayo demuestra excelente linealidad dilucional para muestras de suero humano (datos no mostrados) .

La selectividad y sensibilidad del método de inmunoensayo de intercalación MSD se compara al ensayo LC/MS estándar de oro previamente descrito (Murphy, et al. , (2007)) . Más específicamente, cincuenta y dos (52) muestras de suero humano de una mezcla de sujetos normales y pacientes con cáncer se analizan usando tanto el inmunoensayo de intercalación MS D, así como también el ensayo LC/MS previamente descrito por ser específico para hepcidina-25 (Murphy, et al . , (2007)). Los resultados de esta comparación m uestran que los valores de hepcidina-25 determinados usando el inmunoensayo MS D están muy altamente correlacionados con valores de ensayo LC/MS de hepcidina-25 (r = 0.98, p < 0.00001 ) , confirmando que el inm unoensayo de intercalación MSD específicamente y selectivamente m ide hepcidina-25 en muestras de suero humano (datos no mostrados).

Varios parámetros del insmunoensayo de intercalación MSD se evalúa usando m uestras de suero humano. Más específicamente, se evalúa la estabilidad congelamiento-descongelamiento probando cuatro diferentes muestras. Estos resultados muestran que la estabilidad congelamiento-descongelamiento posee inmunoensayo de intercalación MSD con recuperación de hepcidina-25 de 80- 120% consistente aún después de 5 ciclos de congelamiento-descongelamiento. Resultados individuales para los ciclos de congelamiento-descongelamiento son como sigue: muestra A - 0.1 6, 0.16, 0.1 7, 0. 1 7 y 0.1 7 g l respectivamente; muestra B - 4.5, 4.4, 4.6, 4.6, 4.6 y 4.4 pg/l respectivamente; m uestra C -8.9, 9.6, 9.7, 9.7, 9.9 y 9.6 , respectivamente; y muestra D - 1 5.1 , 15.1 , 15.4, 1 5.7, 1 5.4 y 1 5.4 pg/l respectivamente. La precisión del inmunoensayo de intercalación MSD se valora usando muestras de suero humano que contiene 0.16, 4.5 y 1 5.1 pg/l de hepcidina-25 endógena. Los resultados de precisión de intra-ensayo (n = 20)(CVs) son 3.4%, 4.5% y 3.5% respectivamente en los niveles anteriores, indicando precisión aceptable en todas las concentraciones de hepcidina-25 probadas.

Para probar la recuperación de proteína hepcidina-25 sintetizada agregada en suero humano, se agrega proteína hepcidina-25 sintetizada a tres diferentes muestras de suero humano (cada una que contiene muy bajas concentraciones de hepcidina-25 endógena), a concentraciones de 250, 25, 2.5 y 0.25 pg/l respectivamente. Estas muestras se analizan usando el inmunoensayo de intercalación MSD. Los resultados promedio (SD) son 287 (6) pg/l, 24.2 (0.2) pg/l, 2.0 (0.1 ) pg/l y 0.23 (0.01 ) pg/l, respectivamente, indicando 80-120% de recuperación a todos los niveles de hepcidina-25 probada.

El intervalo normal del inmunoensayo de intercalación MSD se estabiliza corriendo 100 muestras de suero a partir de voluntarios saludables normales (50 hombres y 50 mujeres). Los valores de hepcidina-25 en estas muestras varía de <0.02 pg/l hasta 25 pg/l, con un valor medio de 3.0 ± 0.5 pg/l, que consiste con los niveles de hepcidina-25 previamente reportada en humanos normales usando ensayos LC/MS (véase, Murphy, et al. , Blood, 1 10: 1048-54 (2007)).

De forma interesante, los niveles de hepcidina-25 en sujetos humanos normales se encuentran ser significantemente (p < 0.01 ) menor en mujeres (1 .8 ± 0.4 pg/l) comparado a hombres (4.2 ± 0.8 pg/l). Los niveles de hepcidina-25 en estos sujetos normales son también comparados a concentraciones de ferritina en suero y se encuentran estar di rectamente correlacionados con niveles de ferritina en suero (r = 0.71 , p < 0.001 )(datos no mostrados).

Finalmente, los niveles de hepcidina-25 en el suero de pacientes con cáncer (n = 34) se comparan a niveles de hepcidina-25 en el suero de voluntarios saludables normales (n = 1 00) , cada uno determinado por el i nmunoensayo de intercalación MSD. Los resultados de esta comparación demuestran que los niveles de hepcidiná-25 son significativamente (p < 0.001 ) elevado en pacientes con cáncer (70.9 ± 1 0.4 pg/l) comparado a controles normales (3.0 ± 0.5 g/l)(datos no mostrados) . De forma interesante, cohortes de paciente con malignidades tanto hematológicas (83.3 ± 1 1 .9 pg/l)como no-hematológicas (58.4 ± 1 7 pg/l) cada una significantemente demuestra niveles de hepcidina-25 incrementados comparados a controles normales (p < 0.001 para ambos) , lo que sugiere que los n iveles de hepcidina-25 elevados pueden jugar un papel importante en anemia asociada al cáncer (datos no mostrados) .

Comparado a métodos E LI SA existentes, los cuales no son específicos para hepcidina-25 y pueden reaccionar en forma cruzada con pro-hepcidina y otras especies de hepcidina no relevantes, el inmunoensayo de intercalación MSD descrito en la presente, específicamente y selectivamente mide niveles de hepcidina-25 en suero humano y se correlaciona bien con un ensayo LC/MS de método está ndar oro previamente descrito para hepcidina-25. U na ventaja del inmunoensayo de i ntercalación MSD sobre un método tipo LC/MS para medir niveles de hepcidi na de suero hu mano es que el inmunoensayo de intercalación MSD se puede implementar en la mayoría de los laboratorios clínicos, lo cual usualmente ni tienen el equipamiento complejo no el operador altamente especializado experto requerido para realizar rutinariamente los ensayos de tipo LC/MS. Además, el ¡nmunoehsayo de intercalación MSD puede tener el potencial para un rendimiento mucho más alto que un ensayo LC/MS. Por lo tanto, el inmunoensayo de intercalación MSD proporciona un método que puede ser rutinariamente utilizado clínicamente para selectivamente medir niveles de hepcidina-25 en sujetos humanos.

Claims

REIVI NDICACIONES

1 . Un anticuerpo monoclonal que se enlaza selectivamente a hepcidina humana-25 caracterizado porque consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 1 con una KD entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 800 pM como se determina por SPR a 25°C .

2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a pro-hepcidina y hepcidina humana-20 con una KD que es al menos aproximadamente 1 0-veces superior que el anticuerpo que se enlaza a la hepcidina humana-25 como se determina por SPR a 25°C.

3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a pro-hepcidina y hepcidina humana-20 con una KD que es al menos 50-veces superior que el anticuerpo que se enlaza a la hepcidina humana-25 como se determina por SPR a 25°C.

4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a pro-hepcidina y hepcidina humana-20 con una KD que es al menos 100-veces superior que el anticuerpo que se enlaza a la hepcidina humana-25 como se determina por SPR a 25°C.

5. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 -4, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a hepcidina humana-22 con una KD mayor de aproximadamente 200 nM como se determina por SPR a 25°C.

6. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 -5, caracterizado por además se enlaza a hepcidina-25 de rata y/o ratón (SEC ID NOs: 3 y 4, respectivamente) con una KD menos de aproximadamente 500 nM como se determina por SPR a 25°C.

7. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende seis CDRs seleccionadas a partir del grupo que consiste de: (i) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 9, 10, 11, 32, 33 y 34, respectivamente; (ii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1 , HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 12, 13, 14, 35, 36, y 37, respectivamente; (iii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 45, 13, 14, 35, 36, y 37, respectivamente; (iv) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 12, 13, 14, 38, 36 y 37, respectivamente; (v) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 15, 10, 16, 39, 40 y 41, respectivamente; (vi) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 20, 21, 22, 42, 43, y 44, respectivamente; (vii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 20, 21, 23, 42, 43 y 44, respectivamente; (viii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID i NOs: 24, 25, 23, 42, 43 y 44, respectivamente; ¡ (ix) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 26, 25, 27, 42, 43 y 44, respectivamente; y (x) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1 , HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 26, 25, 28, 42, 43 y 44, respectivamente.

8. Un anticuerpo monoclonal caracterizado porque se] enlaza selectivamente hepcidina-25 y comprende seis CDRs seleccionadas a partir del grupo que consiste de: (i) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 9, 10, 11, 32, 33 y 34, respectivamente; ; (ii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y¡ HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 12, 13, 14, 35, 36, y 37, respectivamente; (iii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 45, 13, 14, 35, 36, y 37, respectivamente; (iv) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en lasi SEC ID NOs: 12, 13, 14, 38, 36 y 37, respectivamente; LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 15, 10, 16, 39, 40 y 41, respectivamente; (vi) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, yj HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID I NOs: 20, 21, 22, 42, 43, y 44, respectivamente; (vii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1 , HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 20, 21, 23, 42, 43 y 44, respectivamente; (viii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 24, 25, 23, 42, 43 y 44, respectivamente; (ix) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 26, 25, 27, 42, 43 y 44, respectivamente; y (x) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 26, 25, 28, 42, 43 y 44, respectivamente.

9. El anticuerpo de conformidad con cualquiera jde las Reivindicaciones 1-8, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal humano diseñado por ingeniería.

10. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es un fragmento.

11. Un anticuerpo monoclonal caracterizado porque comprende un polipéptido de región variable de cadena ligera (LCVR) y un polipéptido de región variable de cadena pesada (HCVR) en donde: (i) los polipéptidos LCVR y HCVR tienen las secu†ncias de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 48 y 49, respectivamente; ! (ii) los polipéptidos LCVR y HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 50 y 51 respectivamente; (iii) los polipéptidos LCVR y HCVR tienen las secu†ncias de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 52 y 51 , respectivamente; (iv) los polipéptidos LCVR y HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 53 y 54, respectivamente; (v) los polipéptidos LCVR y HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 55 y 56, respectivamente; (vi) los polipéptidos LCVR y HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC I D NOs: 59 y 58 respectivamente; (vii) los polipéptidos LCVR y HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 60 y 58, respectivamente; (viii) los polipéptidos LCVR y HCVR tienen las secuéncias de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 61 y 58, respectivamente; (ix) los polipéptidos LCVR y HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 62 y 58, i respectivamente; o (x) la LCVR y la HCVR tienen las secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEC I D NOs: 63 y 58, respectivamente.

12. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 -1 1 , en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

13. El uso de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 -1 1 , para uso en terapia.

14. El uso de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 -1 1 , para la manufactura de un medicamento para el tratamiento of anemia.

15. El anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 -1 1 , para uso en un método para incrementar los niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocrito en un sujeto humano.

16. El uso de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 -1 1 , para la manufactura de un medicamento para incrementar los niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo i de glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocrito en un sujeto humano. 17. anticuerpo de conformidad con cualquiera de las

Reivindicaciones 1 -1 1 , para uso en un método para incrementar los niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de ; glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocrito en un sujeto humano.

18. Un método para incrementar los niveles de hierro en suero, conteo de reticulocitos, conteo de glóbulos rojos, hemoglobina, y/o hematocrito caracterizado porque comprende administrar a un sujeto humano una cantidad efectiva del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 -1 1 .

19. Un método para tratar anemia en un sujeto humano en n'ecesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto; humano una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 -1 1 .

20. Un método para medir la cantidad de hepcidina-25 en una muestra de tejido o fluido biológico, caracterizado porque el método comprende las etapas de: (i) obtener la muestra de tejido o fluido biológico; (ii) provocar que la muestra ponga en contacto un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlaza a un epítope contenido dentro de los aminoácidos 1 hasta 7, inclusive, de la SEC ID NO: 1 con una KD entre aproximadamente 50 nM y aproximadamente 800 p IM y pro-hepcidina y hepcidina humana-20 con una KD que es al menos aproximadamente 10-veces superior como se determina por SPR a 25°C; y (iii) detectar la cantidad de hepcidina-25 unida al anticuerpo o fragmento en la muestra cuantitativamente semi- cuantitativamente o cualitativamente.

21 . El método de conformidad con la Reivindicación 20, porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo además hepcidina humana-22 con una KD mayor de aproximadamente: 200 n como se determina por SPR a 25°C.

22. Un método para cuantificar la cantidad de proteína de hepcidina-25 en una muestra de tejido o fluido biológico caracterizado porque comprende: (i) revestir un soporte sólido con un primer anticuerpo que se enlaza a (a) un epítope contenido dentro de los aminoácidos 1 hasta 7, inclusive, de la SEC I D NO: 1 , o (b) un epítope contenido dentro de los aminoácidos 5 a 25, inclusive, de la SEC ID NO: 1 ; (ii) aplicar la muestra al soporte sólido revestido de anticuerpo; (iii) remover la muestra no unida; (iv) si el primer anticuerpo se enlaza al epítope (a) , aplicar un segundo anticuerpo que se enlaza al epítope (b) al soporte sólido, o, si el i primer anticuerpo se enlaza al epítope (b), aplicar un segundo anticuerpo que se enlaza al epítope (a) al soporte sólido; (v) remover el segundo anticuerpo no unido; y (vi) detectar la cantidad de hepcidina-25 unida al segundo anticuerpo en la muestra cuantitativamente, semi-cuantitativamente o cualitativamente.

23. El método de conformidad con la Reivindicación 22, caracterizado porque el anticuerpo que se enlaza a un epítope (a) además comprende seis CDRs seleccionadas a partir del grupo que consiste de: (i) LCDR1 , LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 20, 21, 22, 42, 43, y 44, respectivamente; (Ü) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 20, 21, 23, 42, 43 y 44, respectivamente; (iii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 24, 25, 23, 42, 43 y 44, respectivamente; i (iv) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID ! NOs: 26, 25, 27, 42, 43 y 44, respectivamente; y (v) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 26, 25, 28, 42, 43 y 44, respectivamente.

24. El método de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 22-23, caracterizado porque el anticuerpo que se enlaza al epítope (a) comprende una LCVR y una HCVR seleccionada a partir del grupo que consiste de: (i) la LCVR y la HCVR que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 59 y 58, respectivamente; (ii) la LCVR y la HCVR que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 60 y 58, respectivamente; (iii) la LCVR y la HCVR que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC I D NOs: 61 y 58, respectivamente; (iv) la LCVR y la HCVR que tienen la secuencia de aminoácidos como se muestra en las S EC I D NOs: 62 y 58, respectivamente; y (v) la LCVR y la HCVR que tienen la secu†ncia de aminoácidos como se muestra en las SEC I D NOs: 63 y 58, respectivamente. :

25. El método de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 22-24, caracterizado porque el anticuerpo que se enlaza al epítome (a) se selecciona a partir del grupo que consiste de Mab 5E8, Mab 0,B 1 , Mab OB3, Mab OH4 y Mab OE 1 .

26. El método de conformidad con cualquiera de las Reivindijcaciones 22-25, caracterizado porque el anticuerpo que se enlaza al epítope (b) comprende una LCVR y una HCVR que tienen la secuejncia de aminoácidos como se muestra en las SEC I D NOs: 82 y 83.

27. El método de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 22-25, caracterizado porque el anticuerpo que se enlaza a epítope (b) comprende una LCVR y una HCVR que tienen la secuencia de aminoácidos como se m uestra en las SEC I D NOs: 84 y 85.

28. El método de conformidad con cualq uiera de las Reivindicaciones 22-27, caracterizado porque solamente el primero o segundo anticuerpo es etiquetado con una porción detectable .

29. El método de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 20-28, caracterizado porque la detección es indirecta.

30. El método de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 20-29, caracterizado porque la muestra es sangre, plasma, suero, orina, fluido cerebro-espinal (CSF), fluido amniótico, saliva, sudor, fluido de ascitis, linfáticos, fluido de quiste, leche materna, fluido de heridas o derivados a partir de estos, y en donde la muestra contacta el anticuerpo o fragmento del mismo en un inmunoensayo de enzima (EIA), ELISA, un ensayo de ELISA intercalado, radioinmunoensayo, una reacción de precipitación o un inmunoensayo fluorescente.

31. Un kit para detectar o cuantificar hepcidina-25, caracterizado porque comprende el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-11.