ES2693050T3 - Uso de hepcidina para preparar un medicamento para tratar trastornos de la homeostasis del hierro - Google Patents

Abstract

Polipéptido para su uso en un procedimiento de tratamiento para reducir la sobrecarga de hierro, en el que el polipéptido comprende una secuencia de 20 aminoácidos que tiene: - al menos 50% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1; - residuos de cisteína en las posiciones 2, 5, 6, 8, 9, 14, 17 y 18; y en donde el polipéptido es capaz de reducir la absorción de hierro.

Description

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DESCRIPCION

Uso de hepcidina para preparar un medicamento para tratar trastornos de la homeostasis del hierro

La invencion hace referencia al diagnostico y a la terapia de los trastornos de la homeostasis del hierro.

El hierro es un elemento esencial necesario para el crecimiento y la supervivencia de casi todos los organismos. En mairnferos, el equilibrio del hierro se regula principalmente a nivel de la absorcion duodenal del hierro alimenticio. Despues de la absorcion, el hierro ferrico se carga en la apo-transferrina en la circulacion y se transporta a los tejidos, incluyendo precursores eritroides, donde se capta por endocitosis mediada por el receptor de transferrina. Los macrofagos reticuloendoteliales desempenan un papel importante en el reciclaje de hierro de la degradacion de hemoglobina de eritrocitos senescentes, mientras que los hepatocitos contienen la mayor parte de las reservas de hierro del organismo en polfmeros de ferritina. Durante los ultimos cinco anos, ha surgido un importante conjunto de informacion con respecto a las protemas implicadas en la absorcion del hierro y en la regulacion de la homeostasis del hierro a partir del estudio de defectos hereditarios, tanto en seres humanos como en ratones, que conducen a distintos trastornos del hierro (para una revision vease ANDREWS, Nat. Rev. Genet., 1, 208-217, 2000). En el caso de deficiencia de hierro, las consecuencias fisiopatologicas de defectos genicos identificados se comprenden bien, ya que habitualmente dan como resultado la perdida de funcion de protemas directamente implicadas en la ruta de la absorcion del hierro. Las protemas incluyen los transportadores de hierro DMT1 (tambien denominados Nramp2 o DCT1) (FLEMING et al., Nat. Genet., 16, 383-386, 1997; GUNSHIN et al., Nature, 388, 482-488, 1997), ferroportina (tambien denominada IREG1 o MTP1) (DONOVAN et al., Nature, 403, 776-781, 2000) y oxidasas de cobre acopladas a ferroportina, concretamente ceruloplasmina (HARRIS, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 96, 10812-10817, 1999; YOsHiDA et al., Nat. Genet., 9, 267-272, 1995) y hefastina (VULPE et al., Nat. Genet., 21, 195-199, 1999).

Por el contrario, varias anomalfas asociadas con la sobrecarga de hierro genetica han identificado diversas protemas cuyo papel funcional en el control de la homeostasis del hierro continua sin comprenderse bien. En seres humanos, la hemocromatosis hereditaria (HH) es una enfermedad genetica autosomica recesiva comun causada por hiperabsorcion de hierro alimenticio, que conduce a una sobrecarga de hierro en el plasma y multiples organos, incluyendo en particular el pancreas, el hngado y la piel y dando como resultado lesiones en estos organos y tejidos debido a los depositos de hierro.

La hemocromatosis se debe habitualmente a una mutacion en el gen de la hemocromatosis (denominado HFE) asociado a HLA localizado en el cromosoma 6p y la mayona de los pacientes son homocigoticos para la mutacion C282Y en HFE (FEDER et al., Nat. Genet., 13, 399-408, 1996). Ademas, se han implicado otros loci en diferentes familias con HH: se ha descrito una mutacion sin sentido en el gen del receptor 2 de la transferrina (TRF2) en 7q en dos familias con HH no asociadas a HLA (CAMASCHELLA et al., Nat. Genet., 25, 14-15, 2000) y recientemente se ha mapeado un locus para hemocromatosis juvenil en el brazo cromosomico 1q (HFE2). Finalmente, aunque se conoce desde hace tiempo que la absorcion del hierro se regula en respuesta al nivel de las reservas de hierro del cuerpo y a la cantidad de hierro necesaria para la eritropoyesis (ROY et al., FEBS Lett., 484, 271-274, 2000), todavfa se tiene que identificar la naturaleza molecular de las senales que programan las celulas intestinales para regular la absorcion del hierro.

Recientemente se han descrito la alteracion del gen murino que codifica el factor de transcripcion USF2 y sus consecuencias en la regulacion genica dependiente de glucosa en el hngado (VALLET et al., J. Biol. Chem., 272, 21944-21949, 1997).

Los inventores han observado ahora que, sorprendentemente, los ratones Usf2 -/- desarrollan sobrecarga de hierro multivisceral que evita solamente el bazo cuyo contenido de hierro es extraordinariamente inferior en animales knock-out que en controles. Estos trastornos metabolicos del hierro se parecen a los observados en hemocromatosis hereditaria. Sin embargo, no se observo alteracion en genes identificados previamente por su implicacion en esta patologfa, por ejemplo, HFE o TFR2. Por tanto, los inventores buscaron nuevos genes candidatos que puedan explicar las anomalfas de la homeostasis del hierro en ratones Usf2 -/-mediante hibridacion sustractiva supresora entre hngados de ratones Usf2 -/- y ratones de tipo silvestre. Esto permitio aislar un ADNc que codifica el peptido hepcidina.

La hepcidina (tambien denominada LEAP-1, por peptido antimicrobiano expresado en hngado) se purifico recientemente de ultra filtrado de sangre humana y de orina y se observo que era un peptido unido por enlaces disulfuro que muestra actividad antimicrobiana (KRAUSE et al., FEBS Lett., 480, 147-150, 2000; PARK et al., J. Biol. Chem., 276, 7806-7810, 2001). La protema se sintetiza en el hngado en forma de un propeptido que contiene 83 aminoacidos y se convierte en peptidos maduros de 20, 22 o 25 aminoacidos (PARK et al., J. Biol. Chem., 276, 7806-7810, 2001; PIGEON et al., J. Biol. Chem., 276, 7811-7819, 2001). Tambien se describio recientemente que la hepcidina se sintetiza de manera elevada en hngados de ratones sobrecargados con hierro experimentalmente o espontaneamente (PIGEON et al., J. Biol. Chem., 276,

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7811-7819, 2001). Aunque se cuestiono la relacion de esta sobre-expresion con la sobrecarga de hierro, se indico que probablemente se produda como resultado de inflamacion relacionada con sobrecarga cronica de hierro.

Por el contrario, los Inventores han demostrado ahora que un defecto completo en la expresion de hepcidina conduce a sobrecarga progresiva de hierro en los tejidos en ratones Usf2-/-. Ademas, han obtenido ratones transgenicos que tienen un transgen que expresa hepcidina bajo el control de un promotor constitutivo espedfico del hngado y han observado que dichos ratones transgenicos estaban gravemente anemicos.

Estos hallazgos permiten proponer nuevos medios de regulacion de la homeostasis del hierro, en particular mediante la regulacion de la captura del hierro alimenticio por el intestino o del transporte del hierro materno-fetal a traves de la barrera placentaria y del reciclaje del hierro por macrofagos reticuloendoteliales.

Por consiguiente, la presente invencion la presente invencion se refiere a un polipeptido para su uso en un procedimiento de tratamiento para reducir la sobrecarga de hierro, en el que dicho polipeptido comprende una secuencia de 20 aminoacidos que tiene:

- al menos el 50% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1,

- restos de cistema en las posiciones 2, 5, 6, 8, 9, 14, 17 y 18, y

en donde el polipeptido es capaz de reducir la absorcion de hierro.

Tambien pueden usarse polipeptidos quimericos, que comprenden la secuencia de una forma madura de hepcidina, (y finalmente, toda de parte de la secuencia pro o prepro).

En una realizacion, el polipeptido es un homologo de vertebrado de una forma madura de hepcidina humana. En una realizacion, el homologo de vertebrado es un homologo de mairnfero.

En una realizacion, el polipeptido es un polipeptido de 25 aminoacidos que tiene la secuencia SEQ ID NO: 3. Los homologos de vertebrados conocidos de hepcidina humana incluyen, por ejemplo, hepcidina de rata, hepcidina de raton, hepcidina de trucha.

Tambien se pueden usar polipeptidos quimericos que comprenden la secuencia de una forma madura de hepcidina (y eventualmente, toda la parte de la pro o de la secuencia previa).

La invencion tambien abarca el uso de equivalentes funcionales de los polipeptidos definidos anteriormente. Los equivalentes funcionales se definen en el presente documento como variantes peptfdicas u otros compuestos que tienen la misma actividad funcional que las formas maduras de hepcidina. Los ejemplos de tales equivalentes funcionales incluyen compuestos qmmicos que se modelan para imitar la estructura tridimensional de cualquiera de los polipeptidos que tienen la secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3. De particular interes son los derivados de dichos polipeptidos que tienen una estabilidad y una semivida biologica mejorada. Ejemplos clasicos de tales derivados son, por ejemplo, peptidos "retro- inversos", en los que la secuencia de los aminoacidos se invierte, y los L-aminoacidos se reemplazan por D-aminoacidos.

Todos estos polipeptidos y acidos nucleicos pueden obtenerse por procedimientos clasicos conocidos por sf mismos. Por ejemplo, las formas de hepcidina de 20 aminoacidos y 25 aminoacidos pueden obtenerse de plasma o de orina, como se describe por KRAUSE et al. o PARK et al. Como alternativa, pueden obtenerse cultivando celulas que expresan hepcidina y recuperando dicho polipeptido del cultivo celular.

De acuerdo con una realizacion particular, dichas celulas son celulas hospedadoras transformadas por un acido nucleico que codifica uno de los polipeptidos definidos anteriormente.

Tambien puede usarse la smtesis qmmica, en particular en el caso de los derivados peptfdicos.

Puede obtenerse un acido nucleico que codifica hepcidina a partir de, por ejemplo, una genoteca genomica o de ADNc de un vertebrado, usando cebadores adecuados capaces de hibridarse lectivamente con dichos acidos nucleicos. Tambien se puede obtener mediante las tecnicas clasicas de smtesis de polinucleotidos.

La presente invencion tambien proporciona procedimientos para seleccionar equivalentes funcionales de hepcidina capaces de reducir la absorcion del hierro.

A modo de ejemplo, pueden seleccionarse facilmente equivalentes funcionales que tienen las propiedades biologicas de hepcidina en la regulacion de la homeostasis del hierro con animales, en especial con marnfferos no humanos que carecen de hepcidina.

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En particular, un procedimiento para seleccionar equivalentes funcionales de hepcidina capaces de reducir la absorcion del hierro comprende las siguientes etapas:

- administrar un compuesto a ensayar para su capacidad para reducir la absorcion de hierro a un animal knock-out deficiente en expresion de hepcidina.

- determinar el efecto de dicho compuesto en la sobrecarga de hierro en dicho animal.

Los medicamentos obtenidos de acuerdo con la invencion son utiles para prevenir y/o tratar:

- todas las formas de hemocromatosis;

- la sobrecarga secundaria de hierro, relacionada, por ejemplo, con anemias hereditarias y/o congenitas como la talasemia;

y enfermedades asociadas con las mismas. Estas ultimas enfermedades incluyen, por ejemplo, hepatocarcinoma, cardiomiopatfa o diabetes.

De acuerdo con otro aspecto, la invencion tambien propone el uso de un inhibidor de la expresion de hepcidina o tal y como se reivindica de la actividad de hepcidina tal y como se reivindica para preparar un medicamento util para aumentar la absorcion de hierro mediante el aumento de la captura de hierro alimenticio por el intestino y/o el aumento del reciclaje del hierro por los macrofagos. Dicho medicamento es util para tratar anemia o enfermedades relacionadas con anemia. Lo anterior incluye en particular anemia asociada con enfermedades agudas o cronicas que se produce en condiciones tales como infeccion o inflamacion, por ejemplo, enfermedades osteoarticulares tales como poliartritis reumatoide o tumores malignos, especialmente cuando estan asociadas con un smdrome inflamatorio.

Los inhibidores de la expresion de hepcidina incluyen por ejemplo, moleculas de ARN o ADN antisentido, o ribozimas.

Los inhibidores de la actividad de hepcidina incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-hepcidina, en particular anticuerpos dirigidos contra las formas maduras de hepcidina.

Los inhibidores de la actividad de hepcidina incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-hepcidina, en particular anticuerpos dirigidos contra las formas maduras de hepcidina.

La presente descripcion tambien proporciona procedimientos para seleccionar otros inhibidores de actividad de la hepcidina, por ejemplo, con animales transgenicos, en particular mamfferos transgenicos no humanos tales como ratones transgenicos que tienen un transgen que expresa hepcidina, induciendo dicha expresion anemia en el animal.

Por ejemplo, un procedimiento para seleccionar inhibidores de la actividad de hepcidina capaces de aumentar la absorcion de hierro comprende los siguientes pasos:

- administrar un compuesto a ensayar para su capacidad de aumentar la absorcion de hierro mediante la inhibicion de la actividad de hepcidina a un animal transgenico que tiene un transgen que expresa hepcidina.

- determinar el efecto de dicho compuesto sobre la anemia en dicho animal.

Los medicamentos obtenidos de acuerdo con la invencion pueden administrarse de diversas maneras, dependiendo de su naturaleza:

Por ejemplo, los polipeptidos de hepcidina segun la reivindicacion 1, asf como los inhibidores de hepcidina como se definen en la reivindicacion 6, tales como anticuerpos anti-hepcidina, pueden administrase por sf solos o mezclados con transportadores o excipiente o excipientes adecuados. Pueden usarse por via sistemica o por via local. Una via de administracion preferida es la via parenteral, que incluye, por ejemplo, inyecciones intramusculares, subcutaneas, intravenosas o intraperitoneales.

La via oral tambien puede usarse, a condicion de que el medicamento este en una forma adecuada para administracion oral, capaz de proteger el principio activo de las enzimas gastricas e intestinales.

Como se ha indicado anteriormente, tambien puede usarse una molecula de acido nucleico, por ejemplo, un acido nucleico que codifica cualquiera de los polipeptidos de hepcidina que se han mencionado anteriormente, para permitir la expresion de dicho polipeptido en las celulas o de un acido nucleico transcrito en un ARN antisentido, para suprimir la expresion de hepcidina en las celulas de un sujeto a tratar.

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En este caso, dicha molecula de acido nucleico se introduce en las celulas diana mediante las tecnicas clasicas de transferencia de genes.

Habitualmente, la molecula de acido nucleico se pone bajo control transcripcional de un promotor apropiado. La eleccion del promotor depende del uso deseado del medicamento y/o del organo o tejido diana. Por tanto, puede elegirse un promotor constitutivo o inducible y/o ubicuo o espedfico de tejido.

El casete de expresion obtenido de esta manera puede transferirse directamente a las celulas como ADN desnudo, o ponerse en un vector apropiado, tal como un vector viral, por ejemplo, un vector obtenido de adenovirus.

La eleccion del procedimiento de transferencia y/o del vector depende del organo o tejido diana y/o de si se desea una expresion a corto plazo (expresion transitoria) o una expresion estable.

La transferencia de genes puede realizarse ex vivo en celulas extrafdas del sujeto a tratar y reimplantadas posteriormente en dicho sujeto, o puede realizarse por administracion directa del acido nucleico a dicho sujeto.

La invencion tambien describe animales no humanos modificados geneticamente, en los que la modificacion genetica da como resultado una anomalfa en la expresion de hepcidina. La invencion tambien incluye material biologico, tal como celulas, tejidos y organos obtenidos de dichos animales modificados geneticamente.

Esto comprende en particular animales knock-out, preferiblemente marnfferos knock-out y en particular ratones knock-out que no expresan hepcidina funcional. Esta falta de expresion de hepcidina induce una sobrecarga de hierro en dichos animales. Los ratones knock-out conocidos, descritos por VALLETet al. (J. Biol. Chem., 272, 21944-21949, 1997), en los que el gen que codifica el factor de transcripcion USF2 esta inactivado, estan excluidos.

Los animales knock-out de la invencion pueden obtenerse por inactivacion total o parcial del geno los genes de la hepcidina, dando como resultado dicha inactivacion la ausencia de produccion de hepcidina o una perdida de funcionalidad de la misma.

La inactivacion del gen de hepcidina puede tener como objetivo:

- la secuencia que codifica hepcidina, que da como resultado la ausencia de produccion de dicha protema, o una perdida de funcionalidad de la misma, y / o

- al menos una de las secuencias reguladoras que controlan la expresion de hepcidina, que da como resultado una falta de produccion de hepcidina, o una disminucion drastica de la cantidad de hepcidina producida.

Otros animales modificados geneticamente de la invencion que tienen una anomalfa en la expresion de hepcidina son animales transgenicos, preferiblemente mairnferos transgenicos y en particular ratones transgenicos, que tienen un transgen que expresa hepcidina, produciendo dicha expresion anemia en dichos animales.

Se conocen bien en la tecnica los procedimientos adecuados para la preparacion de animales transgenicos o knock-out, descritos, por ejemplo, en: Manipulating the Mouse Embryo, 2a Ed., de HOGAN et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994; Transgenic Animal Technology, editado por C. PINKERT, Academic Press Inc., 1994; Gene Targeting: A Practical Approach, editado por A.L. JOYNER, Oxford University Press, 1995; Strategies in Transgenic Animal Science, editado por G.M. MONASTERSKY y J. M. ROBL, ASM Press, 1995; Mouse Genetics: Concepts and Applications, de Lee M. SILVER, Oxford University Press, 1995.

Los animales knock-out que expresan hepcidina no funcional, asf como los animales transgenicos que tienen un transgen que expresa hepcidina, pueden usarse como modelos para estudiar los mecanismos de la homeostasis del hierro. Tambien pueden usarse, como se ha descrito anteriormente, para explorar compuestos que tienen el mismo efecto que la hepcidina sobre la absorcion del hierro, o para explorar compuestos capaces de inhibir el efecto de la hepcidina sobre la absorcion del hierro.

La invencion tambien proporciona procedimientos de diagnostico para determinar si una anomalfa de la absorcion del hierro esta asociada con una mutacion en hepcidina o con una produccion anormal de hepcidina.

Por ejemplo, la invencion divulga:

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- un procedimiento para detectar si una anomaKa de absorcion de hierro resulta de una produccion anormal de hepcidina, donde dicho procedimiento comprende determinar la cantidad de hepcidina en una muestra biologica de un sujeto que padece dicha anomalfa;

- un procedimiento para detectar si una anomalfa de absorcion de hierro esta asociada con una mutacion que perjudica la produccion de hepcidina funcional, donde dicho procedimiento comprende detectar una mutacion en el gen de hepcidina en una muestra de acido nucleico obtenida de un sujeto que padece dicha anomalfa.

Las muestras biologicas adecuadas para determinar la cantidad de hepcidina incluyen, por ejemplo, muestras de sangre, orina o lfquido amniotico o biopsias de organos, en particular biopsias de tngado o biopsias de placenta.

Las muestras de acido nucleico adecuadas para detectar una mutacion que altera la produccion de hepcidina funcional incluyen ARN, ADNc o ADN genomico.

La cantidad de hepcidina en una muestra biologica puede determinarse facilmente mediante procedimientos bien conocidos, tales como, a modo de ejemplo, cromatograffa HPLC, espectroscopfa de masas o mediante inmunoensayo usando anticuerpos anti-hepcidina.

Las mutaciones en el gen de hepcidina pueden detectarse facilmente secuenciando dicho gen o una parte del mismo, previamente aislado de la muestra de ADN a analizar, y comparando la secuencia con la secuencia o las secuencias de tipo silvestre correspondientes, que pueden obtenerse de uno o varios sujetos que no tienen anomalfas de la homeostasis del hierro.

La presente invencion se ilustrara adicionalmente mediante la siguiente descripcion adicional, que se refiere a ejemplos que ilustran los efectos de la falta de produccion de hepcidina en animales knock-out o de la sobreproduccion de hepcidina en animales transgenicos. Debe entenderse, sin embargo, que estos ejemplos se proporcionan solamente a modo de ilustracion de la invencion y no constituyen de ningun modo una limitacion de la misma.

EJEMPLO 1: CARACTERISTICAS DE RATONES KNOCK-OUT DEFICIENTES EN EXPRESION DE HEPCIDINA

Materiales y Procedimientos

Generacion y genotipificacion de ratones Usf2 -/-

La alteracion del gen Usf2 se ha descrito anteriormente (VALLET et al., J. Biol. Chem., 272, 21944-21949, 1997). El alelo mutado contiene el casete IRESpgeo sin promotor en el exon 7 del gen USF2 murino. Todos los ratones estudiados tienen un fondo genetico mixto que inclrna contribuciones de las cepas C57BL/6 y 129/Sv. Los ratones se alimentaron con pienso para raton de laboratorio convencional (AO3, UAR, Francia) que contema 280 mg de carbonato ferrico por kg. Se sacrificaron ratones de 2, 5 meses hasta 19 meses de edad. Se realizo el genotipado del ADN de cola de raton usando una unica reaccion de PCR para identificar los alelos de tipo silvestre (TS) y knock-out para USF2. Se uso ADN genomico (0, 5-1 |jg) en una reaccion de 50jl que inclrna 3 cebadores: el alelo de USF2 de tipo silvestre se amplifico usando los siguientes cebadores:

- directa (recocido en Intron 6):

GCGAAGCCCTGGGTTCAATC (SEQ ID NO: 4) e

- inversa (recocido en Intron 7):

GGGGTCCACCACTTCAAGAGG (SEQ ID NO: 5).

El alelo knock-out para USF2 se amplifico usando los siguientes cebadores:

- directa:

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inversa (recocido en el marcador de seleccion Neo de la construccion de direccionamiento): GAATTCTCTAGAGCGGCCGGAC (SEQ ID NO: 7).

La PCR se realizo del siguiente modo: 37 ciclos (consistiendo cada ciclo en 30 s a 94°C, 30 s a 56°C y 40 s a 72°C) con un paso de desnaturalizacion inicial a 94°C durante 4 min y un paso de elongacion final a 72°C durante 5 min en Tris-HCl 20 mM (pH 8, 4), KCl 50 mM, W-I al 0, 05%, MgCh 2 mM, glicerol al 5%, azul de bromofenol al 0, 04%, cada dNTP 0, 2 mM, cada cebador 0, 2 jM, 2 unidades de Taq polimerasa (Gibco). La reaccion se analizo en gel de agarosa al 1, 5-2% que contema bromuro de etidio. Se observo que este procedimiento de PCR para genotipado de raton proporciona los mismos resultados que el procedimiento de transferencia de Southern que se ha descrito anteriormente (VALLET et al., J. Biol. Chem., 272, 2194421949, 1997).

Generacion de una genoteca sustraida mediante Hibridacion Sustractiva Supresora (SSH)

Se preparo ARN total como se ha descrito anteriormente (CHOMCZYNSKI y SACCHI, Anal. Biochem., 162, 156-159, 1987). Se aislo ARN poliadenilado usando oligo (dT) celulosa (Boehringer Mannheim Biochemica). La SSH se realizo entre 3 ARN de hngado combinados de ratones deficientes en USF2 homocigoticos de 5 meses de edad ('de control') y ARN de hngado de un raton de tipo silvestre de 5 meses de edad ('de ensayo') usando el kit de sustraccion de ADNc PCR-selectTM (Clontech) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para todos los pasos. En resumen, se mezclaron 14 ng de ADNc de ensayo ligado y 420 ng de control no ligado, se desnaturalizaron y se dejaron re-hibridar. Despues de la hibridacion sustractiva, se amplifico 1 jl de ADNc mediante dos rondas de PCR. La genoteca de ADNc sustrafda se clono en el vector pT-Adv usando el kit de clonacion de PCR AdvanTAge™ (Clontech). Despues de la PCR secundaria (15 ciclos) con la mezcla de ADNc polimerasa Advantage (Clontech), la mezcla de ADNc sustrafdo para PCR se incubo durante 10 min adicionales a 72°C con 1 unidad de ADN polimerasa de Taq (Gibco BRL) para maximizar la eficacia de clonacion y se purifico con el kit de purificacion de PCR QIAquick (Quiagen). La mezcla de ligacion se introdujo en la cepa bacteriana Electromax DH10B (Gibco BRL) por electroporacion (1, 8 kV) usando un Cell-Porator® (Gibco BRL). La genoteca se sembro en placas de agar de 22 x 22 cm que conteman ampicilina (100 jg/ml) y se propago con 40 jl de X-gal (40 mg/ml) y 40 jl de IPTG (0,1 M). Las bacterias se cultivaron a 37°C hasta que las colonias fueron visibles y se mantuvieron a 4°C hasta que la tincion azul/blanco pudiera distinguirse claramente.

Transferencias de Northern Inversa de elevada densidad y seleccion

Se recogio un total de 400 clones individuales, se resuspendieron en 30 jl de agua, se calentaron a 100°C durante 10 min, despues se pusieron en hielo durante 5 min y se centrifugaron durante 5 min. Se realizo PCR usando 3 jl de sobrenadante limpio con los siguientes cebadores:

- directa:

5'-CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3' (SEQ ID NO: 8), e

inversa:

5'-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3' (SEQ ID NO: 9).

Los productos de PCR se transfirieron a filtros Hybond-N+ (Amersham Pharmacia). Las transferencias se hibridaron durante una noche a 72°C con ADNc bicatenario marcado con 32P-dCTP (RTS RadPrime DNA Labeling System, Gibco) sintetizado con 2 jg de ARN poliadenilado de ligado de raton de tipo silvestre o Usf2 -/, tal y como se describe a continuacion. Las transferencias se lavaron cuatro veces en SSC 2X/SDS al 0,1% a 68°C durante 20 min y dos veces en SSC 0, 2X/SDS al 0,1% a 68°C durante 20 min.

Transcripcion inversa y RT-PCR

Se sintetizo ADNc bicatenario en 20 jl, con 2 jg de ARN total (o ARN poliA para la genoteca sustrafda), en presencia de 0, 25 mM de cada dNTP, 200 ng de cebadores hexanucieotfdicos aleatorios, 20 unidades de RNA sin (Promega), DTT10 mM y 200 unidades de transcriptasa inversa M-MLV (Gibco). Despues de la desnaturalizacion del ARN a 70°C durante 10 min en un termociclador (Perkin Elmer Cetus), se realizo la

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reaccion durante 1 hora a 42°C antes de que se inactivara la transcriptasa inversa durante 6 min a 96°C. Al final de la reaccion se anadieron 80 |jl de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y EDTA 0,1 mM (pH 8, 0). La amplificacion por PCR se realizo con 5 jl de mezcla de reaccion de transcriptasa inversa en 50 jl de Tris- HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, MgCh 2mM, W-1 al 0,05% (v/v), 0, 2 mM de cada dNTP, 1 pmol de cebadores espedficos directos e inversos (enumerados mas adelante), 1 pmol de cebadores de p-actina de control directos e inversos y 2 unidades de Taq polimerasa (Gibco). Las condiciones de PCR eran 25 ciclos de desnaturalizacion a 94°C durante 20 s, hibridacion a 50°C durante 20 s y extension con cebador a 72°C durante 20 s. Despues de la PCR, se separaron los productos amplificados (171 pb para HEPC1 o HEPC2 y 250 pb para p-actina) mediante electroforesis en gel de agarosa al 1, 5%.

Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes:

* HEPC1:

- directa:

5'-CCTATCTCCATCAACAGATG-3' (SEQ ID NO: 10) e

- inversa

5'-AACAGATACCACACTGGGAA-3' (SEQ ID NO: 11);

* HEPC2.

- directa:

5'-CCTATCTCCAGCAACAGATG-3' (SEQ ID NO: 12) e

- inversa:

5'-AACAGATACCACAGGAGGGT-3' (SEQ ID NO: 13);

* p-actin:

- directa:

5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3' (SEQ ID NO: 14) e

- inversa:

5'-TTTGATGTCACGCACGATTT-3' (SEQ ID NO: 15).

Los cebadores usados para la amplificacion de DMT1 fueron los siguientes:

* isoforma de DMT1 sin IRE:

- directa:

5'-TCCTGGACTGTGGACGCT-3' (SEQ ID NO: 16) e

- inversa:

5'-GGTGTTCAGAAGATAGAGTTCAGG-3' (SEQ ID NO: 17);

* DMT1 con IRE:

- directa:

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inversa:

5'-CGCTCAGCAGGACTTTCGAG-3' (SEQ ID NO: 19);

* Normalizacion con 14S:

- directa:

5'-CAGGACCAAGACCCCTGGA-3' (SEQ ID NO: 20) e

- inversa:

5'-ATCTTCATCCCAGAGCGA-3' (SEQ ID NO: 21) Transferencia de Northern

Los cebadores usados para la amplificacion de las sondas usadas para detectar los ARNm espedficos fueron:

* para amplificacion de ADNc (1080 pb) de hemocromatosis (HFE) de raton:

- directa:

5'- ATGAGCCTATCAGCTGGGCT -3' (SEQ ID NO: 22) e

- inversa:

5'-TCACTCACAGTCTGTTAAGA-3' (SEQ ID NO: 23);

* para amplificacion de ADNc (285 pb) del receptor de transferrina (TfR) de raton:

- directa:

5'-GAAATCCCTGTCTGTTATAC-3' (SEQ ID NO: 24) and

- inversa:

5'-GGCAAAGCTGAAAGCATTTC-3' (SEQ ID NO: 25);

* para amplificacion de ADNc (333 pb) del receptor 2 de transferrina (TFR2) de raton:

- directa:

5'-TACAGCTCGGAGCGGAACG-3' (SEQ ID NO: 26) e

- inversa:

5'-TTACAATCTCAGGCACCTCC-3' (SEQ ID NO: 27);

* para amplificacion de ADNc (350 pb) de ceruloplasmina de raton:

- directa

5'-ACTTATTTCAGTTGACACGG-3' (SEQ ID NO: 28) e

- inversa

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* para amplificacion de ADNc (258 pb) de hemo oxigenasa 1 (HmoxI) de raton: - directa:

5'-ATGGAGCGTCCACAGCCCG-3' (SEQ ID NO: 30), e

inversa:

5'-CCTTCGGTGCAGCTCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 31).

Cada fragmento se amplifico usando Taq polimerasa y ADNc total hepatico, se purifico de gel de agarosa (kit de purificacion de PCR QIAquick, Qiagen) y se subclono en el vector TA (kit de clonacion AdvanTAge, Clontech). El plasmido recombinante se selecciono de acuerdo con el protocolo y se amplifico en medio LB que contema 100 pg/ml de ampicilina y se purifico (QIAprep Spin Miniprep, Qiagen). Cada ADNc se purifico del vector despues de la digestion con EcoRI y migracion en gel de agarosa. La sonda usada para detectar ARNm de HEPC1 se preparo a partir de la digestion con EcoRI del pT-Adv/HEPC1 aislado mediante hibridacion sustractiva supresora. Se desnaturalizaron veinte microgramos de ARN de cada fuente en tampon que contema formaldetndo y se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1%, formaldetndo 2,2 M. La transferencia de Northern se realizo como se ha descrito anteriormente (VALLET et al., J. Biol. Chem., 272, 21944-21949, 1997). Se separo cada transferencia y se resondo con ADNc 18 S ribosomico, para comprobar la integridad y la cantidad de los ARN cargados.

Transferencia de Southern

Las transferencias de Southern se realizaron tal y como se describio anteriormente (VALLET et al., J. Biol. Chem., 272, 21944-21949, 1997). La sonda de HEPC1 se preparo a partir de un fragmento de ADN genomico de raton de 1437 pb amplificado con los siguientes cebadores:

- directa:

5'-GAGCAGCACCACCTATCTCCA-3' (SEQ ID NO: 32) and

inversa:

5-AACAGATACCACAGGAGGGT-3' (SEQ ID NO: 33).

Despues de la digestion con PvuII, se purifico un fragmento de 545 pb del gel de agarosa y se uso como sonda para la transferencia de Southern. Esta sonda de HEPC1 mostro una identidad del 95% con la region de HEpC2 homologa.

Analisis hematologico de ratones

Se obtuvo sangre por flebotoirna retroorbital antes de la eutanasia de los ratones y se recogio en tubos heparinizados (capiject™ T-MLH, Terumo® medical corporation). Los hemogramas y parametros de los eritrocitos se determinaron usando un analizador automatico MaxM coulter.

Mediciones de hierro e histologia

La cuantificacion del nivel de hierro se realizo tal como lo ha sido descrito anteriormente por Torrance y Bothwell (1968) en fragmentos u organos enteros usando IL test™ (Instrumentation Laboratory). Para la histologfa, se fijaron los tejidos en formaldetndo al 4%, se incluyeron en parafina, se montaron sobre portaobjetos y se tineron con azul de Prusia y tincion de contraste con rojo nuclear usando procedimientos convencionales.

Resultados

Sobrecarga masiva de hierro en hgado y pancreas de ratones Usf2 -/-

Todos los ratones USF2 -/- presentan despues del tercer mes de vida una densa pigmentacion marron del tngado y una pigmentacion bronce mas o menos pronunciada del pancreas. Dado que este rasgo fenotfpico

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es caractenstico de la hemocromatosis, el trastorno hereditario de la absorcion del hierro, se decidio analizar el estado del hierro de los ratones Usf2-/-. En primer lugar, para evaluar el nivel de acumulacion de hierro, se realizo tincion con azul de Prusia de Perls en hngado y pancreas de ratones de tipo silvestre y Usf2 -/- alimentados con una dieta convencional.

Los resultados se muestran en la figura 1 (de A a D):

Resena: seccion de hngado de (A) ratones de tipo silvestre de 8 meses de edad (x 50), (B) miembro de la misma camada Usf2 -/- de 8 meses de edad y (C) raton Usf2-/- de 19 meses de edad (x 10). La seccion del pancreas en (D) es de un raton Usf2 -/- de 8 meses de edad (x 12,5). Las puntas de flecha en C indican hierro en el nucleo del hepatocito. Las puntas de flecha en D senalan los islotes de Langerhans dispersos por todo el tejido exocrino.

Mientras que los ratones de control mostraron muy poca o ninguna tincion de hierro positiva en el hngado (figura 1A), los ratones Usf2 -/- presentaron acumulacion de hierro en los hepatocitos (figura 1B-C). Este deposito de hierro se limito principalmente a los hepatocitos periportales y despues, con la edad, el numero de hepatocitos tenidos aumento. A los 19 meses de edad, como se muestra en la figura 1C, la acumulacion de hierro era considerable y la tincion era homogenea por todo el parenquima hepatico. Ademas, en algunos hepatocitos se detecto una intensa acumulacion de hierro nuclear (figura 1B). Para el pancreas, se obtuvieron resultados similares, es decir, ninguna tincion en el tejido de control y una intensa acumulacion de hierro en el pancreas exocrino de ratones Usf2 -/- (figura 1D).

Para cuantificar mas exactamente la sobrecarga de hierro durante la vida de los animales, se midieron los niveles de hierro en hngado y pancreas de ratones de 2, 5 a 19 meses de edad.

Los resultados se muestran en la figura 1 (E y F):

Resena: Concentracion de hierro no hemo (microgramos de hierro por gramo de tejido seco) hepatica (E) y pancreatica (F) dependiente de la edad cuando se mide en ratones de control (ratones de tipo silvestre y heterocigoticos, ▲) y ratones Usf2 -/- (□).

Como se muestra en la figura 1E, el hierro se acumula en el hngado de ratones entre 60 y 100 dfas despues del nacimiento y alcanzo un nivel correspondiente aproximadamente a un contenido de hierro 10 veces mayor que en ratones de tipo silvestre. En el pancreas (figura 1F), la acumulacion de hierro fue mas progresiva, con niveles en ratones Usf2 -/- un maximo de 20 veces superior que en ratones de tipo silvestre. La acumulacion de hierro tambien se midio en rinon y corazon mostrando una acumulacion de 2 y 4 veces, respectivamente. Finalmente, se observo un nivel de hierro 1,7 veces superior en el suero de ratones Usf2- /- en comparacion con ratones de control (3,550 ± 259 |jg de hierro/l en controles [n=15] frente a 6,274 ± 514 jg de hierro/l en ratones Usf2 -/- [n=13] P<(0,0001), pero este aumento no parecio ser dependiente de la edad. Este aumento del nivel de hierro en suero en ratones Usf2 -/- se correlaciono con un aumento de 1,6 veces de la saturacion de transferrina (61 ± 9% de saturacion en controles [n=6] frente al 95 ± 9% de saturacion en ratones Usf2 -/- [=6] P<0, 0004). Finalmente, en la hembra de mas edad analizada hasta ahora (19 meses), la sobrecarga de hierro se extendio con un nivel de hierro aumentado en todos los tejidos ensayados incluyendo musculo, utero, pulmon e hipofisis (no se muestra).

El bazo de ratones Usf2 -/- es resistente al deposito natural de hierro

Los resultados se muestran en la figura 2:

Resena de la figura 2:

(A) Concentracion de hierro no hemo esplenico dependiente de la edad (microgramos de hierro por gramo de tejido seco) cuando se mide en ratones de control (ratones de tipo silvestre y heterocigoticos, ▲) y ratones Usf2-/- (□). Seccion de bazo de un raton representativo (B) de tipo silvestre de 8 meses (x 20) y (C) un companero de la misma camada Usf2 - / - de 8 meses (x 20) tenido con la tincion de Perls para hierro. RP, pulpa roja; WP pulpa blanca.

A diferencia de todos los demas tejidos ensayados, se observo una acumulacion de hierro dependiente de la edad en el bazo de ratones de tipo silvestre, como se muestra (figura 2A).

Se observaron granulos que dieron una reaccion positiva con tincion con azul de Prusia de Perls, principalmente dispersos entre celulas de la pulpa roja (figura 2B). Se observo que esta acumulacion fluctuaba enormemente entre ratones, sugiriendo que puede depender del fondo de cepa hforida (129/Sv x C57BL/6) de cada animal. Este almacenamiento de hierro natural se ha comunicado anteriormente en

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ratones C57BL/6 y se describio que se producia principalmente en macrofagos esplenicos (VENINGA et al., Lab, Anim,, 23, 16-20, 1989). De manera sorprendente, en el bazo de ratones Usf2 -/-, los niveles de hierro permanecieron muy bajos (figura 2A), con una ausencia completa de tincion con azul de Prusia de Perls (figura 2C).

Los parametros eritroides no se ven afectados en ratones Usf2-/-

Para descartar la posibilidad de que la acumulacion de hierro aumentada en ratones Usf2 -/- pudiera ser el resultado de anemia diseritropoyetica, se midieron los parametros eritroides en ratones de control y Usf2 -/a diferentes edades. Los valores del recuento de globulos rojos (RCB, 106/ml), concentracion de hemoglobina (Hb, g/dl) y volumen corpuscular medio (MCB, fl) eran normales: RBC, Hb y MCB de 10,3± 0,3, 16,73 ± 0,49 y 48,27 ± 0,67 para ratones de tipo silvestre (n=3); 10,0 ± 0,3, 15,67 ± 0,06 y 48,63 ± 1,63 para ratones Usf2 -/- (n=3), respectivamente.

Por tanto, de manera interesante, las anomalias del hierro observadas en ratones Usf2 -/-, incluyendo la resistencia del bazo a la acumulacion de hierro y los parametros hematologicos normales, se parecen notablemente al fenotipo de ratones HFE -/ (LEVY et al,, Blood, 94, 9-11, 1999; ZHOU et al., Proo. Natl, Acad. Soi. USA, 95, 2492-2497, 1998), el modelo murino de hemocromatosis hereditaria.

La expresion de genes HFE y TFR2 no esta modificada en el higado de ratones Usf2 -/-

Puesto que USF2 es un factor de transcripcion, se determino si USF2 podria estar implicado en la regulacion de genes que codifican proteinas relacionadas con el metabolismo del hierro. Debido a la similitud entre ratones HFE -/- y el modelo Usf2 -/-, se comprobo en primer lugar la expresion del gen HFE. Tambien se examino el gen que codifica el receptor 2 de la transferrina, del cual se ha descrito recientemente una mutacion en Hh (CAMASCHELLA et al,, Nat, Genet,, 25, 14-1, 2000).

Los resultados se muestran en la figura 3:

Resena de la figura 3:

Veinte microgramos de ARN total de higado de ratones de tipo silvestre y ratones Usf2 -/- (de 3 a 11 meses de edad) se sometieron a electroforesis y transferencia. Las transferencias se hibridaron con una sonda marcada con 32P (generada por PCR, como se describe en Materiales y Procedimientos) para HFE (A) y RTf2 (B).

Como se muestra en la transferencia de Northern de la figura 3A, la abundancia de ARNm de HFE en el higado de ratones Usf2 -/- es comparable a la de ratones de tipo silvestre. El analisis de transferencia de Northern tambien demostro que la expresion hepatica del gen RTf2 no se modifico en ratones Usf2 -/- en comparacion con ratones de tipo silvestre (figura 3B).

Tambien se controlo el nivel de ARNm de ceruloplasmina, hemo oxigenasa 1 y receptor de transferrina en ratones Usf2 -/-, ya que se habia descrito que la abundancia de estos ARNm se modificaba en trastornos que alteran el equilibrio del hierro (para una revision vease ANDREWS et al,, Nutr, Rev,, 57, 114-123, 1999). Se observo de nuevo que el nivel de estos ARNm era comparable en ratones Usf2 -/- y de control.

Finalmente, se analizo la expresion del gen DMT1 (denominado tambien Nramp2), la principal proteina transmembrana de captacion de hierro que transporta activamente el hierro alimenticio reducido al interior de eritrocitos intestinales. Se analizo la expresion duodenal de DMT1 por cuantificacion relativa usando RT- PCR (7 ratones Usf2 -/- frente a 6 de control). No se observaron diferencias estadisticamente significativas entre los dos grupos de ratones (no se muestran).

Analisis de genotecas de ADNc de sustraccion: identificacion de hepcidina como un supuesto candidato para hemocromatosis

Para identificar genes cuyo nivel de expresion esta modificado en ratones Usf2 -/-, se realizo una genoteca de ADNc sustraida entre higado de ratones Usf2 -/- (de control) y de tipo silvestre (de ensayo) (DIATCHENKO, Proc, Natl, Sci, USA, 93, 6025-6030, 1996). Entre los 400 clones analizados, varios clones estaban regulados negativamente en el higado de ratones Usf2 -/- como se analiza por transferencia de Northern inversa (no se muestra). Uno de estos clones contenia un ADNc de longitud completa que codifica el peptido hepcidina caracterizado recientemente (KRAUSE et al,, FEBS Lett,, 480, 147-150, 2000; PARK et al,, J, Biol. Chem,, 276, 7806-7810, 2001; PIGEON et al., J, Biol, Chem,, 276, 7811-7819, 2001).

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Organizacion murina de genes Usf2 y de hepcidina en el cromosoma 7

El genoma murino contiene dos genes de hepcidina estrechamente relacionados que se colocalizan en el mismo clon genomico de raton (clon de Genbank, numero de acceso AC020841). Estos genes HEPC1 y HEPC2 fueron mencionados por PIGEON et al. (J. Biol. Chem., 276, 7811-7819, 2001). De manera interesante, el clon genomico CT7-8N15 tambien mostro que HEPC1 se situa en estrecha proximidad del gen Usf2 en el cromosoma 7 murino. PIGEON et al., describieron que HEPC1 se localizaba directamente cadena abajo del gen Usf2 (PIGEON et al. J. Biol. Chem., 276, 7811-7819, 2001). Analizando otro clon genomico, RP23-22G9 (Genbank, numero de acceso AC87143), se observo que parte del gen Usf2 (incluyendo los exones 8, 9 y 10) tambien estaba duplicado y que, de hecho, HEPC1 se situa cadena abajo del gen Usf2 truncado.

La organizacion genomica de los genes Usf2 y de hepcidina se muestra en la figura 4.

Resena de la figura 4:

Representacion esquematica (no a escala) de la region del locus que incluye los genes Usf2 y hepcidina. El alelo dirigido se representa con la insercion del casete betageo en el exon 7 (VALLET et al. J. Biol. Chem., 272, 21944-21949, 1997). Los datos se obtienen del clon genomico RP23-22G9 (Genbank). Hasta ahora, no se dispoma de datos con respecto a la orientacion y la distancia entre los dos genes de hepcidina. La transferencia de Southern a la derecha de la figura es de ADN de cola de ratones heterocigotos y homocigotos, de tipo silvestre, digerido con BglII e hibridado con la sonda de HEPC1. Se detectaron dos bandas del tamano esperado, 12, 4 kpb y 5, 1 kpb, cualquiera que fuese el genotipo. Usando la sonda de USF2 se mostraron las mismas bandas.

El gen HEPC2 se localiza cadena abajo del gen Usf2 funcional completo y el gen HEPC1 se localiza cadena abajo del gen Usf2 parcial. En la actualidad, no existe informacion disponible con respecto a la orientacion relativa 5'-3' de los genes HEPC1 y HEPC2 ni la distancia entre los mismos.

Debido a la proximidad del gen Usf2 y del locus de hepcidina, se determino si el acontecimiento de recombinacion en el intron 7 del alelo de Usf2 dirigido podna haber eliminado o truncado los genes HEPC1 y HEPC2. Para comprobar esta hipotesis, se realizo transferencia de Southern en ADN de cola genomico de ratones Usf2 +/- o Usf2-/-, de tipo silvestre, con una sonda de HEPC1 (figura 4). El ADN genomico se digirio con BglII. Basandose en el analisis del locus AC087143, se predijo que esta digestion genera dos fragmentos de 5,1 y 12,4 kpb, que contienen los genes HEPC1 y HEPC2, respectivamente. Debido a la estrecha similitud (mas del 95%) entre la region de hibridacion de HEPC1 y HEPC2, se esperaba que ambas bandas se mostrasen mediante la sonda de HEPC1. Esto es lo que se observo, como se muestra en la transferencia de Southern en la figura 4. Se observo el mismo patron con ADN de ratones Usf2 -/- indicando que los genes de hepcidina estan presentes en ratones Usf2-/ y que no han experimentado una redisposicion importante. Finalmente, las dos bandas tambien hibridaron con una sonda de USF2 que se extiende desde el exon 8 al exon 10, demostrando que los exones 8 a 10 de USF2 estan efectivamente duplicados.

Los genes de hepcidina son totalmente silenciosos en el hgado de ratones Usf2 -/-

Se midio el nivel de expresion de los genes de hepcidina mediante analisis de transferencia de Northern. De hecho, el ARNm de hepcidina era totalmente indetectable en el hngado de ratones Usf2-/- (figura 5). Vale la pena senalar que el hngado de ratones Usf2 +/ contema una cantidad reducida de ARNm de hepcidina en comparacion con la de ratones de tipo silvestre. Para evaluar adicionalmente el nivel espedfico de mensajeros de HEPC1 y HEPC2, se disenaron cebadores espedficos para los transcritos de HEPC1 y HEPC2. Mediante RT-PCR se demostro que ambos genes se transcribfan activamente en el hngado de ratones de tipo silvestre (figura 5B-C) mientras que los transcritos tanto de HEPC1 como de HEPC2 estaban totalmente ausentes en el hngado de ratones Usf2 -/- (figura 5B-C) .

Resena de la figura 5:

(A) Veinte microgramos de ARN total de hngado de animales de tipo silvestre, Usf2 +/- y Usf2 -/- (entre 3 y 11 meses de edad) se sometieron a electroforesis y transferencia. La transferencia se hibrido con una sonda de HEPC marcada con 32P (preparada como describe en "Materiales y Metodos") que mas probablemente reconoda los transcritos tanto de HEPC1 como de HEPC2. (B) Se midieron los niveles espedficos de HEPC1 y HEPC2 mediante RT-PCR como se describe en

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Materiales y Metodos. Despues de la PCR, los productos amplificados (171 pb para HEPC1 o HEPC2 y 250 pb para p-actina) se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Ninguno de los cebadores espedficos de HEPC1 ni de HEPC2 fueron capaces de reamplificar los productos PCR de HEPC2 y HEPC1, respectivamente, demostrando la elevada especificidad de cada par de cebadores (no mostrado).

La similitud de las alteraciones en el metabolismo del hierro entre ratones knock-out para HFE y los ratones Usf2-/ deficientes en hepcidina sugiere que la hepcidina puede funcionar en la misma ruta reguladora que HFE. Se ha demostrado que HFE interacciona ffsicamente con el receptor de transferrina en celulas cnpticas de la mucosa duodenal (WAHEED et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1579-1584, 1999). Sin quedar ligado a la teona, puede postularse que esta interaccion modula el estado del hierro de estas celulas que, a su vez, controlan la expresion de los transportadores apicales y basolaterales en celulas maduras en las puntas de las vellosidades. La hepcidina puede ser necesaria para la actividad de HFE quizas mediante la interaccion directa con el complejo HFE/beta2 microglobulina / receptor de transferrina. De manera similar, la hepcidina puede ser necesaria para la regulacion del deposito de hierro en macrofagos. La presencia de una protema de HFE mutada o un defecto completo en la expresion de hepcidina puede ser responsable de absorcion de hierro intestinal aumentada y de reservas de hierro reducidas en macrofagos, de acuerdo con el modelo mostrado en la figura 6.

En este modelo, la hepcidina evita la sobrecarga de hierro reduciendo el transporte de hierro al enterocito y programando los macrofagos para retener el hierro. En ratones Usf2 -/-, la deficiencia de hepcidina sena responsable del transporte de hierro intestinal aumentado y de reservas de hierro reducidas en macrofagos.

En ambas condiciones, el hierro plasmatico supera la capacidad de union de transferrina y el hierro no unido a transferrina se acumula en diversos tejidos incluyendo corazon y pancreas.

De acuerdo con la funcion propuesta de la hepcidina en la homeostasis del hierro, la produccion de hepcidina puede depender de la captacion de hierro unido a transferrina mediada por TFR2 en hepatocitos. Esto podna explicar por que el defecto de TFR2 es responsable de una forma de hematocromatosis genetica humana si este defecto conduce a una disminucion en la secrecion de hepcidina que, a su vez, da como resultado una absorcion de hierro aumentada. Esta hipotesis se podra ensayar midiendo la hepcidina en plasma en pacientes con deficiencia de TFR2 o en ratones knock-out para TFR2.

EJEMPLO 2: CARACTERISTICAS DE RATONES TRANSGENICOS QUE SOBRE-EXPRESAN HEPCIDINA

Procedimientos

Generacion de ratones transgenicos

Se amplifico ADNc de longitud completa de ADNc de hepcl murino usando los cebadores

5'-GGGGGATATCAGGCCTCTGCACAGCAGAACAGAAGG-3' (SEQ ID NO: 34) y 5'-GGGGGATATCAGGCCTCTATGTTTTGCAACAGATACC-3' (SEQ ID NO: 35).

Ambos cebadores contienen un sitio Stul (subrayado).

El fragmento de PCR de hepcl se introdujo entre el promotor de transtiretina (TTR) de raton (que consiste en el primer exon, primer intron y la mayor parte del segundo exon) y el casete de senal poli (A) T pequeno de SV40. La construccion lleva 3 kb de secuencias de ADN de tTr de raton 5' al sitio cap (YAN etal., EMBO J., 9, 869-879, 1990). El transgen de TTR-hepc1 de 4, 7 kpb se separo de la secuencia plasirndica mediante digestion con HindIII y se uso para microinyeccion pronuclear.

Genotipado mediante PCR y transferencia de Southern

Se realizo transferencia de Southern de acuerdo con metodos convencionales (SAMBROOK et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989). Se preparo ADN genomico a partir de cola como se indica a continuacion: se corto un trozo de 5 mm de cola de cada raton y se puso en 500 pl de mezcla de digestion (Tris 50 mM, pH 8/EDTA 100 mM /NaCl 100 mM/SDS al 1%). Se anadio proteinasa K (200 pg) y se realizo la digestion a 55°C durante una noche. Las muestras se

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   REIVINDICACIONES

   1. Polipeptido para su uso en un procedimiento de tratamiento para reducir la sobrecarga de hierro, en el que el polipeptido comprende una secuencia de 20 aminoacidos que tiene:

   - al menos 50% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1;

   - residuos de cistema en las posiciones 2, 5, 6, 8, 9, 14, 17 y 18; y en donde el polipeptido es capaz de reducir la absorcion de hierro.
2. 2. Polipeptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el polipeptido comprende una secuencia de 20 aminoacidos que tiene al menos un 60% de identidad con la secuencia SEC ID N°:1.
3. 3. Polipeptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el polipeptido es un homologo de vertebrado de una forma madura de hepcidina humana.
4. 4. Polipeptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que el homologo de vertebrado es un homologo de mairnfero.
5. 5. Polipeptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el polipeptido es un polipeptido de 25 aminoacidos que tiene la secuencia SEQ ID NO: 3.
6. 6. Polipeptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para prevenir y/o tratar la hemocromatosis o una enfermedad resultante de la misma.
7. 7. Polipeptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que la enfermedad producida por la hemocromatosis es hepatocarcinoma, cardiomiopatfa o diabetes.
8. 6. Inhibidor de la expresion de hepcidina para su uso en un procedimiento de tratamiento para aumentar la absorcion de hierro en el que el inhibidor es una molecula de ADN o ARN antisentido, o una ribozima
9. 9. Inhibidor de la capacidad de la hepcidina para reducir la absorcion de hierro para su uso en un procedimiento de tratamiento para aumentar la absorcion de hierro, en el que el inhibidor es un anticuerpo anti-hepcidina.
10. 10. Inhibidor para el uso de la reivindicacion 9, en el que el anticuerpo anti-hepcidina se dirige contra una forma madura de hepcidina.
11. 11. Inhibidor para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para tratar la anemia o una enfermedad resultante de la misma.