CN103097531B - 生物样本的预处理方法、rna的检测方法及预处理试剂盒 - Google Patents

生物样本的预处理方法、rna的检测方法及预处理试剂盒 Download PDF

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Abstract

提供能够迅速且简便地检测RNA的预处理方法。通过在包含人类鼻粘膜的生物样本中添加例如铁离子及碳酸根离子，来抑制存在于人类鼻粘膜的乳铁蛋白的RNA分解活性。如果使用经预处理的生物样本，则可以使用反转录酶扩增RNA病毒的基因。铁离子及碳酸根离子也可以抑制人类鼻粘膜中的溶菌酶C的反转录酶抑制。另外优选通过在包含人类鼻粘膜的生物样本中添加SDS，来除去RNA病毒的被膜。

Description

生物样本的预处理方法、RNA的检测方法及预处理试剂盒
技术领域
本发明涉及包含RNA的生物样本的预处理方法、RNA的检测方法及预处理试剂盒。
背景技术
作为检测血液等生物样本中的病毒的方法，有将病毒的基因进行扩增从而检测的方法。但是，生物样本中大多含有基因扩增的抑制物质，因此在基因扩增之前，实施对生物样本进行预处理而将抑制物质除去或钝化的操作。预处理方法例如有：通过表面活性剂、促溶剂、加热等对生物样本进行处理后，进一步通过固相载体或离子交换树脂进行纯化的方法(专利文献1～3)。然而，这些方法需要特殊的装置，并且需要多个操作步骤，因此繁杂。
特别是在以RNA为基因的病毒的检测中，为了通过反转录酶使RNA基因成为DNA后进行扩增操作，需要将RNA分解酶(RNase)及反转录酶钝化物质也除去或钝化，因此在现有的预处理方法中，进一步需要繁杂的操作。例如作为包含RNA病毒的生物样本的预处理方法，已知添加多胺或硫酸化多糖(专利文献4)。然而，添加多胺或硫酸化多糖会使预处理更加繁杂化，并且多胺及硫酸化多糖可能和RNA基因及通过反转录酶而生成的DNA结合，反而也可能抑制基因扩增。
另外，流感病毒为RNA病毒的一种，但是流感病毒是新型还是季节型的判断在临床上极为重要。另外，通常使用鼻粘膜作为用以检测流感病毒的生物样本。并且，流感病毒的检测需要在临床现场进行。因此，期望建立使用人类的鼻粘膜的流感病毒的迅速且简便的检测方法，这类需求并不限于流感病毒，也要求针对通常的RNA病毒的检测，而且不仅要求针对RNA病毒的检测，也要求针对基因以外的RNA本身的检测。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特开2009-247250号公报
专利文献2：国际公开WO2007/094506号公开文本
专利文献3：特开2006-87394号公报
专利文献4：特开2001-29078号公报
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是提供能够由包含RNA的生物样本迅速且简便地检测RNA的生物样本的预处理方法、使用该生物样本的预处理方法的RNA的检测方法、及所述生物样本的预处理方法中所用的预处理试剂盒。
解决问题的手段
本发明的预处理方法是包含RNA的生物样本的预处理方法，其特征在于：所述生物样本包含乳铁蛋白(Lactferrin)，并对所述生物样本实施乳铁蛋白的RNA分解活性抑制处理。
本发明的检测方法是生物样本中的RNA的检测方法，其特征在于所述生物样本包含乳铁蛋白(Lactferrin)，并且包括：对所述生物样本进行预处理的预处理步骤，及通过扩增而检测经所述预处理的生物样本中的所述RNA的RNA扩增检测步骤，所述预处理步骤通过所述本发明的生物样本的预处理方法而实施。
本发明的预处理试剂盒是包含RNA的生物样本的预处理试剂盒，其特征在于：所述生物样本包含乳铁蛋白(Lactferrin)，所述预处理试剂盒包含乳铁蛋白的RNA分解活性抑制剂。
发明效果
本发明者等人首先发现：抑制人类鼻粘膜样本中所含的以RNA为模板的反转录/DNA扩增反应的要素是乳铁蛋白的RNA分解活性。并且发现，通过仅对人类鼻粘膜样本实施乳铁蛋白的RNA分解活性抑制处理(例如乳铁蛋白的RNA分解活性抑制剂添加处理)，可以抑制RNA分解。进一步发现，作为人类鼻粘膜样本中所存在的其他反转录/DNA扩增反应抑制要素之一，溶菌酶C抑制通过反转录酶从RNA向DNA的反转录反应。并且发现，通过添加溶菌酶C的反转录酶抑制活性抑制剂，可以抑制反转录酶的抑制活性。并且通过这些反转录/DNA扩增反应抑制要素的抑制处理(添加包含抑制剂的试剂)而对人类鼻粘膜样本进行处理，其结果是，不经过特别的纯化步骤，便可以直接进行RNA基因的扩增，从而完成了本发明。根据本发明，可以迅速且简便地从包含RNA的生物样本检测RNA。
附图说明
图1是表示本发明的检测方法的一个实例的图。
图2是表示乳铁蛋白及溶菌酶C存在于人类鼻粘膜中的电泳照片。
图3是表示铁离子及碳酸根离子对乳铁蛋白的RNA分解活性的抑制效果的电泳照片。
图4是表示铁离子及碳酸根离子的热处理效果的一个实例的电泳照片。
图5是表示通过铁离子及碳酸根离子对溶菌酶C的反转录抑制活性进行抑制的一个实例的图。
图6是表示铁离子及碳酸根离子和SDS的协同效应的一个实例的电泳照片。
图7a是表示利用折回引物(turn-back primer)及折叠引物(foldingprimer)的核酸扩增反应的机理的一个实例的图。
图7b是表示利用折回引物及折叠引物的核酸扩增反应的机理的一个实例的图。
图8是表示因添加氧化铝而对SDS除去的影响的一个实例的图。
图9是表示因铁离子浓度的增加及超滤而对SDS除去的影响的一个实例的图。
图10是表示Triton X-100对核酸扩增反应中的SDS的核酸扩增抑制的缓和效果的一个实例的图。
图11是表示可以通过RT-SmartAmp法检测人类鼻粘膜所含的RNA病毒的图。
具体实施方式
本发明的预处理方法中，优选通过在所述生物样本中添加乳铁蛋白的RNA分解活性抑制剂，来对所述生物样本实施乳铁蛋白的RNA分解活性抑制处理。
本发明的预处理方法中，优选所述生物样本包括：动物的鼻粘膜、鼻窦粘膜、气管粘膜、唾液、来自口腔或咽喉的分泌液、泪、乳汁、胆汁、血液(白细胞)、子宫颈管的粘膜、内外生殖器的粘膜、羊水、或尿。
本发明的预处理方法中，优选所述动物为人类。
本发明的预处理方法中，优选所述生物样本包括人类鼻粘膜。
本发明的预处理方法中，优选对所述生物样本进一步实施溶菌酶C(Lysozyme C)的反转录抑制活性抑制处理。在这种情况下，优选通过在所述生物样本中添加溶菌酶C(Lysozyme C)的反转录抑制活性抑制剂，而对所述生物样本实施溶菌酶C(Lysozyme C)的反转录抑制活性抑制处理。
本发明的预处理方法中，优选所述RNA分解活性抑制剂及所述反转录抑制活性抑制剂的至少一种包含铁离子剂及碳酸根离子剂。另外，本发明中，“铁离子剂”是指可以对所述生物样本供给铁离子的物质。同样，本发明中，“碳酸根离子剂”是指可以对所述生物样本供给碳酸根离子的物质。
本发明的预处理方法中，优选对添加了所述铁离子剂及所述碳酸根离子剂的所述生物样本进行加热处理。这是因为通过该加热处理，可以有效地抑制RNA分解活性及反转录抑制活性。
本发明的预处理方法中，可以在所述生物样本中进一步添加表面活性剂，例如优选添加极性表面活性剂。为了使基因从病毒粒子中露出，必须使用非离子性表面活性剂除去病毒的被膜，但非离子性表面活性剂有可能抑制本发明的所述铁离子剂及所述碳酸根离子剂的功能。但是如果是极性表面活性剂，则不会抑制本发明的所述铁离子剂及所述碳酸根离子剂的功能，而可以除去病毒的被膜。所述极性表面活性剂优选为SDS。另外，SDS可能会抑制基因扩增时的DNA聚合酶，因此优选在基因扩增之前，将钾盐或氧化铝添加至生物样本使SDS凝聚，并通过离心分离或过滤将SDS除去。
本发明的检测方法中，优选通过使用反转录酶的基因扩增方法来实施所述RNA的扩增。所述基因扩增方法优选为使用链置换DNA聚合酶的等温扩增方法。
本发明的检测方法中，使用表面活性剂从病毒粒子使RNA基因流出例如可以使用以下2个步骤中的任一个步骤。步骤B是在基因扩增步骤中添加非极性表面活性剂，通过非极性表面活性剂和基因扩增反应时的加热的效果，使RNA基因从病毒粒子中溶出的方法。
步骤A：通过表面活性剂破坏预处理过程中的样品中所含的病毒粒子，使RNA从病毒中溶出，同时通过抑制处理来抑制乳铁蛋白及溶菌酶C的RNA分解活性及所述反转录抑制活性，而将该预处理液供给至核酸扩增的步骤。
步骤B：不破坏样品中的病毒粒子(保持原样)，通过抑制处理来抑制乳铁蛋白及溶菌酶C的RNA分解活性及所述反转录抑制活性后，供给至包含非极性表面活性剂的核酸扩增反应，通过表面活性剂和热变性的效果，而使病毒粒子中的RNA基因组溶出，而实施来自病毒基因组的核酸扩增的步骤。
所述步骤A中，所述表面活性剂优选使用极性表面活性剂。所述极性表面活性剂优选为SDS。所述步骤B中，所述表面活性剂优选使用不会抑制核酸扩增反应的非极性表面活性剂。
本发明的预处理试剂盒优选进一步包含溶菌酶C(Lysozyme C)的反转录抑制活性抑制剂。
本发明的预处理试剂盒中，优选所述RNA分解活性抑制剂及所述反转录抑制活性抑制剂的至少一种包含铁离子剂及碳酸根离子剂。优选以相互不接触的状态包含所述铁离子剂及所述碳酸根离子剂。
接着，对本发明进行详细地说明。
本发明中，生物样本所含的RNA并无特别限制，包括从生物中取得的全部的RNA、宿主RNA、细菌或真菌的RNA。可以是基因RNA，也可以是基因以外的RNA。在基因RNA的情况下，生物样本所含的基因RNA优选为RNA病毒，特别优选流感病毒。
本发明中，所述生物样本是包含乳铁蛋白的样本。所述生物样本中，优选包含人类乳铁蛋白的样本。
已知乳铁蛋白包含在生物的几乎所有的外分泌液中。因此，所述生物样本例如可以列举：包括动物的来自鼻腔、鼻窦、喉头、气管、支气管、或肺等的上呼吸道粘膜的分泌液、来自口腔或咽喉的分泌液(例如唾液等)、来自消化道粘膜的分泌液、来自内生殖器、外生殖器(例如子宫颈管等)的粘膜的分泌液、来自肾尿路系统的粘膜的分泌液、来自腹腔内粘膜的分泌液、来自胸腔内粘膜的分泌液、来自心包内粘膜的分泌液、来自皮肤的分泌液、泪腺分泌液、乳汁、胆汁、血液(白细胞)、羊水、尿、粪便等的生物样本。这些中，例如优选来自鼻腔、鼻窦等的粘膜的分泌液、唾液、泪、乳汁、胆汁、血液(白细胞)、来自子宫颈管的分泌液、羊水、尿等样本，已知这些样本实际上包含乳铁蛋白。其中特别优选人类鼻粘膜。另外，所述动物优选人类，但也可以是人类以外的动物。人类以外的动物的实例可以列举：牛、猪、羊、马、骆驼、大鼠等。
乳铁蛋白不仅是在如上所述的鼻粘膜中，而且是在各种组织中发现、分泌的蛋白质。在人类的各种组织中，使用根据作为利用下一代序列发生器进行表达解析的方法之一的CAGE法(Kanamori-Katayama M,et al.Genome Res.(2011)5月19)得到的数据，来获得将编码乳铁蛋白的蛋白质的RNA表达量为何种程度进行解析、比较的数据，因此作为参考示于表1。其结果可知，乳铁蛋白的表达量高的组织有各种组织，暗示本发明的预处理方法的可应用性宽广。
(表1)
人类鼻粘膜例如可以从鼻腔洗液或擤鼻(捏鼻)而采集，更优选通过药签(swab)而采集。人类鼻粘膜可以直接作为生物样本，也可以分散或溶解在生理盐水或缓冲液等中而作为生物样本。为了防止碱化时的分解，作为缓冲液，可以使用在酸性至中性区域中对氢离子浓度具有缓冲作用的缓冲液。例如可以使用：乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、酒石酸缓冲液、硼酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、及各种古德(Good’s)缓冲液(MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS)。缓冲液的pH值例如为4.0～8.0，优选为5.0～7.0，更优选为5.5～6.0的范围，最优选使用MES(pKa＝6.15)。
抑制将生物样本中的RNA作为模板的反转录/DNA扩增反应的要素是乳铁蛋白的RNA分解活性，已发现如果抑制乳铁蛋白的RNA分解活性，则即便不进行特别的纯化处理，也可以进行RNA病毒的基因扩增，这是本发明的要点，如上所述。乳铁蛋白的RNA分解活性的抑制处理例如包括：在生物样本中添加乳铁蛋白的RNA分解活性抑制剂、以及生物样本的热处理。所述抑制处理例如可以通过添加RNA分解活性抑制剂及所述热处理二者来实施。所述热处理的温度例如为25℃～100℃的范围，优选为30℃～75℃的范围，更优选为37℃～65℃的范围。所述热处理的时间例如为1分钟～60分钟的范围，优选为2分钟～45分钟的范围，更优选5分钟～30分钟的范围。
所述乳铁蛋白的RNA分解活性也可以通过过量地添加作为靶的目标RNA以外的RNA(诱骗RNA)而降低。
为了进一步抑制乳铁蛋白的RNA分解活性，可以使用各种抑制剂。抑制剂可以使用分子生物学中通常所使用的来自牛胎盘的RNase抑制剂。另外，可以使用：与乳铁蛋白特异性结合、且可以抑制RNA分解活性的特异性IgG抗体或Affibody的蛋白质分子；或者能够以来自核酸的特异性结合分子的形式筛选的RNA/DNA适体。而且可以使用：通过对乳铁蛋白的硅中(in sillico)结合分子搜索而发现的硫酸盐、磺基硫酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、磺酰氯酸盐等低分子有机化合物。
乳铁蛋白的RNA分解活性抑制剂优选可以使用属于过渡金属及典型金属的金属离子。金属离子中，属于过渡金属的金属离子可以列举：铜(Cu2+、Cu3+)、镍(Ni2+)、铁(Fe2+、Fe3 +)、金(Au+、Au3+)、及过渡金属中分类为轻稀土的钪(Sc3+)、钇(Y3+)、钆(Gd3+)、铈(Ce3+)、钕(Nd3+)。属于典型金属的金属离子可以使用锌(Zn2+)。另外，这些金属可以单独使用或作为多种的混合试剂而使用。
乳铁蛋白的RNA分解活性抑制剂更优选同时使用铁离子剂及碳酸根离子剂。此种情况依据以下事实：乳铁蛋白在成为不含铁的Apo体(Apo乳铁蛋白)时，会引起高的RNA分解活性；以及在乳铁蛋白的结晶结构中采取在金属结合区包含铁离子与碳酸根离子的结构。认为通过对不含金属离子的Apo乳铁蛋白同时供给铁离子及碳酸根离子，可以有效地从Apo体转变成Holo体(Holo乳铁蛋白)，而可以抑制RNA分解活性。即便仅仅是铁离子剂也有乳铁蛋白的RNA分解活性抑制活性，但若仅有铁离子剂，则在提高铁离子剂的浓度的情况下，可能表达铁离子剂自身的RNA分解活性。碳酸根离子剂可以和剩余的铁离子剂反应而形成不溶性碳酸铁(Fe2(CO3)3)，因此具有作为抑制剩余的铁离子自身分解RNA的方法的效果。因此，如果与铁离子剂一起也添加碳酸根离子剂，则可以抑制乳铁蛋白的RNA分解活性，且抑制铁离子剂自身的RNA分解活性。
所述铁离子剂优选可以供给三价铁离子(Fe3+)的铁离子剂，例如优选氯化铁(FeCl3)、硝酸铁(Fe(NO3)3)及硫酸铁(Fe2(SO4)3)，更优选这些铁离子剂的水溶液。另外，从在水溶液中的稳定性的观点来看，优选使用硫酸铁。
所述碳酸根离子剂优选可以供给碳酸根离子(CO3 2-)的碳酸根离子剂，例如可以列举碳酸氢钠，优选碳酸氢钠的水溶液。
在同时存在Fe3+和CO3 2-的溶液中(生物样本中)，例如Fe3+的浓度为2mM～6mM的范围，且CO3 2-的浓度为5mM～20mM的范围。另外，铁离子剂及碳酸根离子剂的浓度例如为Fe2(SO4)3的浓度为1mM～3mM的范围，且NaHCO3的浓度为5mM～20mM的范围。更优选Fe2(SO4)3的浓度为2.5mM左右，且NaHCO3的浓度为10mM左右。
如上所述，在所述生物样本中添加作为所述极性表面活性剂的SDS的情况下，SDS可能会抑制基因扩增时的DNA聚合酶，因此如上所述，优选使用氧化铝等从所述生物样本中除去SDS。另外，在使用所述氧化铝的情况下，在所述氧化铝上，也可以出现SDS以外的极性分子的吸附，例如所述生物样本所含的RNA及DNA等也吸附在氧化铝上，因此从所述生物样本除去的情况。此处，SDS和铁离子通过相互作用而形成沉淀。也可以利用该沉淀形成能力，从所述生物样本上除去SDS。从此观点来看，优选将所述生物样本所含的铁离子的浓度设定为较高。所述铁离子(例如Fe3+)的浓度优选为1mM以上，更优选为2mM以上，进一步优选为2.5mM以上。所述铁离子的浓度的上限并无特别限制，例如为10mM以下或5mM以下。由SDS和铁离子形成的沉淀例如优选通过离心分离或过滤而从所述生物样本中除去。在通过所述过滤除去所述沉淀的情况下，所述过滤优选使用尺寸排除型过滤器(超滤过滤器)，例如所述超滤过滤器的孔径可以为0.1μm～0.45μm的范围，更优选为0.22μm。所述超滤过滤器例如可以使用Millipore公司制造的商品名“Millex HV”(膜孔径0.22μm)等。
在鼻粘膜样本中大量含有的溶菌酶C能抑制以RNA为模板合成DNA的反转录酶活性。如上所述，本发明中，优选对鼻粘膜样本等生物样本实施溶菌酶C(Lysozyme C)的反转录抑制活性的抑制处理。溶菌酶C的反转录抑制活性抑制处理例如包括：添加溶菌酶C的反转录抑制活性抑制剂、以及生物样本的热处理。所述抑制处理例如可以通过添加RNA分解活性抑制剂及所述热处理二者来实施。溶菌酶C的反转录抑制活性抑制剂例如可以使用：与溶菌酶C特异性结合、且可以抑制反转录抑制活性的特异性IgG抗体或Affibody的蛋白质分子；或者能够以来自核酸的特异性结合分子的形式筛选的RNA/DNA适体。更优选可以通过添加铁离子剂(例如可以供给三价铁离子的铁离子剂)及碳酸根离子剂来抑制。所述热处理的温度例如为25℃～100℃的范围，优选为30℃～75℃的范围，更优选为37℃～65℃的范围。所述热处理的时间例如为1分钟～60分钟的范围，优选为2分钟～45分钟的范围，更优选为5分钟～30分钟的范围。
添加了铁离子剂及碳酸根离子剂的生物样本优选进行加热处理。认为该加热处理具有使乳铁蛋白的结构产生波动的作用，结果可以提高铁离子剂及碳酸根离子剂对乳铁蛋白的作用，并且可以进一步抑制RNA分解活性。加热处理的条件例如温度为37℃～60℃的范围，时间为5分钟～30分钟的范围。例如在37℃时，进行30分钟的加热处理，在60℃时，进行5分钟的加热处理。
作为不含所述加热处理的步骤，可以使用微量的蛋白质变性剂。具体而言，有盐酸胍、硫氰酸胍、尿素(表面活性剂在以下示出)。
在添加了铁离子剂及碳酸根离子剂的生物样本中，为了除去病毒粒子的被膜，优选添加极性表面活性剂。极性表面活性剂优选使用阴离子类极性表面活性剂，具体而言，可以使用：皂甙、辛酸钠、癸酸钠、月桂酸钠、肉豆蔻酸钠、棕榈酸钠、硬脂酸钠、全氟辛酸(PFOA)、全氟壬酸、正月桂酰肌氨酸钠、椰油酰谷氨酸钠、α磺基脂肪酸甲酯盐、1-己磺酸钠、1-辛磺酸钠、1-癸磺酸钠、1-十二烷磺酸钠、全氟丁磺酸、直链烷基苯磺酸钠、萘磺酸钠、萘二磺酸二钠、萘三磺酸三钠、丁基萘磺酸钠、全氟辛磺酸(PFOS)、月桂基硫酸钠、肉豆蔻基硫酸钠、聚氧乙烯烷基苯酚磺酸钠、月桂基硫酸铵、月桂基磷酸、月桂基磷酸钠、月桂基磷酸钾、N-月桂酰肌氨酸钠、正十四烷基硫酸钠(STS)、正十二烷基磺酸钠、胆酸钠、甘氨胆酸钠、脱氧胆酸钠(DOC)、甘氨脱氧胆酸钠、鹅脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺鹅脱氧胆酸钠、牛磺脱氢胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、牛磺石胆酸钠、牛磺熊去氧胆酸钠。更优选添加正十二烷基硫酸钠(SDS)。添加浓度例如为SDS时为0.1w/v％以下。另外在添加SDS时，即便不进行所述加热处理，也可以通过铁离子剂及碳酸根离子剂迅速地抑制乳铁蛋白的RNA分解活性。另外，伴随极性表面活性剂的添加的人类鼻粘膜样本的预处理定义为依据以下步骤A的预处理方法。
步骤A：通过极性表面活性剂破坏预处理过程中的样品中所含的病毒粒子，使RNA从病毒中溶出，同时通过抑制剂来抑制乳铁蛋白及溶菌酶C的RNA分解活性及所述反转录抑制活性，并将该预处理液供给至核酸扩增的步骤。
所述的极性表面活性剂的添加为任意的，即便不添加极性表面活性剂，也可以通过本发明的预处理，实现RNA病毒的RNA基因的扩增。此时，前提是在核酸扩增反应过程中引起来自病毒的RNA基因组的释放。在来自RNA的核酸扩增中，反转录反应例如在50℃～60℃下实施时，可以期待病毒被膜的热变性效果，并且可以实现来自RNA病毒的RNA基因组的释放。更优选可以在核酸扩增反应液中添加非离子性表面活性剂，该非离子性表面活性剂具有破坏病毒被膜的效果，且不会抑制核酸扩增反应。具体的非离子性表面活性剂可以使用：Tween(注册商标)类表面活性剂(Tween20、Tween40、Tween60、Tween80)、Brij(注册商标)类表面活性剂(Brij-76、Brij-96、Brij-56、Brij-58、Brij-35)、Span类表面活性剂(Span-20、Span-40、Span-60)、POE(9、10)壬基苯基醚(Triton(注册商标)N-101)、Triton(注册商标)X-100、Triton X-114、洋地黄皂甙、APO-10、APO-12、BIG CHAP、环己基-正乙基-β-D-麦芽糖苷、正癸酰基蔗糖、正十二碳酰基蔗糖、正癸基-β-D-吡喃麦芽糖苷(maltopyranoside)、正癸基-β-D-硫代麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷(glucopyranoside)、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、ELUGENT(注册商标)、GENAPOL(注册商标)C-100、GENAPOL X-80、GENAPOLX-100、HECAMEG、正庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、正己基-β-D-吡喃葡萄糖苷、MEGA-8、MEGA-9、MEGA-10、n-壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷、NP-40、正辛酰基-β-葡糖基胺(NOGA)、正辛酰基蔗糖、正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-β-D-吡喃麦芽糖苷、正辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、正十一烷基-β-D-麦芽糖苷、PLUPONIC(注册商标)F-127、壬苯聚醇、壬苯聚醇-9、月桂酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、脱水山梨醇脂肪酸酯、月桂酸二乙醇酰胺、油酸二乙醇酰胺、硬脂酸二乙醇酰胺、鲸蜡醇、硬脂醇、油醇。
如上所述，在所述生物样本中添加作为所述极性表面活性剂的SDS时，SDS可能会抑制基因扩增时的DNA聚合酶。因此，通过所述的使用氧化铝的方法、提高铁离子浓度而形成SDS和铁离子的沉淀的方法等，从所述生物样本中除去SDS。然而，存在所述生物样本中即便在SDS除去处理后也残存SDS的情况。本发明中，在将包含SDS的生物样本进行基因扩增时，优选添加所述不会抑制核酸扩增反应的非离子性表面活性剂。由此，所述生物样本中所含的SDS被引入所述非离子性表面活性剂的胶束中，抑制因SDS引起的基因扩增时的DNA聚合酶抑制。另外，所述机制为推测，本发明并不受该记载的任何限制。本发明中，为了所述目的，例如可以在所述的SDS除去处理后的生物样本中，在进行基因扩增时添加所述非离子性表面活性剂，也可以在未进行所述的SDS除去处理的生物样本中，在进行基因扩增时添加所述非离子性表面活性剂。另外，例如可以事先将非离子性表面活性剂添加于核酸扩增(基因扩增)的反应液中。所述非离子性表面活性剂优选Triton(注册商标)X-100，Triton(注册商标)X-100的添加量例如可以根据所述生物样本中的SDS的浓度进行适当设定，但在所述生物样本中包含0.1％的SDS时，更优选在所述生物样本中包含0.1％～1％的范围的Triton(注册商标)X-100，例如Triton(注册商标)X-100的浓度可以为0.5％。
如上所述，SDS可以通过添加中性的钾盐或氧化铝而除去。中性的钾盐可以使用乙酸钾、柠檬酸钾、盐酸钾、硫酸钾、硝酸钾。更优选为水溶性的中性的钾盐，更优选乙酸钾。氧化铝例如为氧化铝粒子(平均粒径1000nm以下的氧化铝粒子、优选平均粒径200nm以下的氧化铝粒子、更优选平均粒径20nm～100nm的氧化铝粒子)。或者也可以使用活性氧化铝(和光纯药公司制造、分子量101.96)等。
基因扩增法并无特别限制，例如有PCR法、使用链置换DNA聚合酶的等温扩增法，优选所述等温扩增法。所述等温扩增法例如可以列举：SDA法(特公平7-114718号公报)、使用下述折回引物(TP)的扩增方法，其中，优选使用TP的等温扩增法。
(折回引物)
所述折回引物是在3′末端部分包含在目标核酸序列的3′末端部分的序列(A)上进行杂交的序列(Ac′)而成，且所述目标核酸序列中在所述序列(Ac′)的5′侧包含在较所述序列(A)更偏向5′侧存在的序列(B)的互补序列(Bc)上进行杂交的序列(B′)而成。
在使用TP的等温扩增法中，可以是在正向引物及反向引物二者中使用TP的对称形态(TP-TP)，也可以是在正向引物及反向引物之一中使用TP，在另一方中使用其他引物(XP)的非对称形态(TP-XP)。
对称形态(TP-TP)的具体实例例如可以列举：LAMP法(国际公开WO2000/028082号公开文本)。LAMP法是除了一对TP(TP-TP)外，还使用一对外部引物(OP-OP)的方法。OP是在模板序列中在较TP更偏向5′侧处退火、并具有通过链置换反应而夺去TP伸长链的功能的引物。
非对称形态时的其他引物可以列举：PCR法所使用的通常的引物、下述折叠引物(FP)。非对称形态中，优选TP和FP的组合。TP和FP的组合的形态可以列举：SmartAmp法(注册商标)(国际公开WO2005/063977号公开文本)。将TP和FP的组合的一个实例示于图7a及图7b。除了TP和FP的组合外，还可以使用OP。OP的使用可以用于正向引物及反向引物中的至少一种引物。
(折叠引物)
所述折叠引物是在3′末端部分包含在目标核酸序列的互补序列的3′末端部分的序列(C)上进行杂交的序列(Cc′)而成，且在所述序列(Cc′)的5′侧包含在同一链上含有相互杂交的2个核酸序列的折叠序列(D-Dc′)而成。
使用TP-FP的等温扩增的机理例如如以下所述。使用图7(图7a及图7b)来说明对于借助TP及FP的核酸扩增反应所认为的作用机理。另外，图7中，为了简化说明，使杂交的2个序列作为相互互补的序列，但本发明并不受此限定。首先，TP在目标核酸的有义链上杂交，引起该引物的伸长反应(图7(a))。接着，在伸长链(-)上形成茎-环结构，新的TP在由此成为单链的目标核酸有义链上的序列(A)上杂交(图7(b))，引起该引物的伸长反应，在先合成的伸长链(-)脱离。接着，FP在脱离的伸长链(-)上的序列(C)上杂交(图7(c))，引起该引物的伸长反应，合成伸长链(+)(图7(d))。在所生成的伸长链(+)的3′末端与伸长链(-)的5′末端，形成茎-环结构(图7(e))，从作为游离型的3′末端的伸长链(+)的环前端引起伸长反应，同时，所述伸长链(-)脱离(图7(f))。通过来自环前端的所述伸长反应，生成在伸长链(+)的3′侧经由序列(A)及序列(Bc)结合伸长链(-)的发夹型双链核酸，TP在该序列(A)及序列(Bc)上杂交(图7(g))，通过其伸长反应而生成伸长链(-)(图7(h)及图7(i))。另外，通过存在于所述发夹型双链核酸的3′末端的折叠序列来提供游离型的3′末端(图7(h))，通过由此发生的伸长反应(图7(i))，生成在两端具有折叠序列、经由来自TP及FP的序列而交替包含伸长链(+)和伸长链(-)的单链核酸(图7(j))。在该单链核酸中，通过存在于其3′末端的折叠序列来提供游离型的3′末端(互补链合成起点)(图7(k))，因此重复同样的伸长反应，而成为每1次伸长反应的2倍的链长(图7(l)及图7(m))。另外，图7(i)中来自脱离的TP的伸长链(-)中，通过存在于其3′末端的折叠序列来提供游离型的3′末端(互补链合成起点)(图7(n))，因此通过由此发生的伸长反应，在两端形成茎-环结构，生成经由来自引物的序列而交替包含伸长链(+)和伸长链(-)的单链核酸(图7(o))。在该单链核酸中，通过3′末端中的环形成，来依次提供互补链合成起点，因此依次引起由此发生的伸长反应。在如此自动延长的单链核酸中，来自TP及FP的序列包含在伸长链(+)和伸长链(-)之间，因此可以实现各引物杂交而引起伸长反应，由此明显扩增目标核酸的有义链及反义链。
在扩增RNA基因时，使用反转录酶生成cDNA，扩增该cDNA。如此将使用反转录酶扩增RNA的SmartAmp法称为RT-SmartAmp法。
本发明的预处理试剂盒的组成并无特别限制，例如可以列举：20mMMES缓冲液(pH值5.8)、2.5mM硫酸铁、20mM碳酸氢钠、0.1％SDS及20mg/ml氧化铝(Al2O3)的组成。
硫酸铁和碳酸氢钠以混合溶液的形式保存时，会迅速地形成沉淀。因此，在本发明的预处理试剂盒中，优选分成A液及B液2种溶液，分别提供硫酸铁和碳酸氢钠。此时，例如A液设为20mM MES缓冲液(pH值5.8)、40mM碳酸氢钠、0.2％SDS的组成。B液设为5mM硫酸铁、40mg/ml氧化铝的组成。此时，理想的是包含硫酸铁的B液进行遮光保存。A液及B液优选作为1：1的混合液在将人类鼻粘膜悬浮于缓冲液时而制备。
实施例
接着，对本发明的实施例进行说明。另外，本发明并不受实施例限制及限定。
实施例1
(人类鼻粘膜中所混合的模板RNA的核酸扩增)
本实施例中，示出了本发明的预处理试剂盒是否可以抑制来自人类鼻粘膜所具有的模板RNA的核酸扩增抑制活性。预处理试剂盒是制备以10mM MES缓冲液(pH值5.8)、2.5mM硫酸铁、20mM碳酸氢钠、0.1％SDS及20mg/ml活性氧化铝(和光纯药公司制造、分子量101.96)为组成的试剂盒(预处理试剂)。在该试剂盒中，悬浮健康人的人类鼻粘膜，接着，将下述中所制备的具有与病毒(流感A(H1N1))同样的部分序列的模板RNA进行107混合复制，来制成本实施例的样本。将该样本供于RT-SmartAmp法，检测RNA的存在。另外，比较例是在所述试剂盒中不添加硫酸铁及碳酸氢钠，除此以外，制备相同组成的试剂盒，进行同样的核酸扩增。将这些的结果示于图1。如该图所示，在使用本发明的试剂盒时，实现了以RNA为模板的核酸扩增。另一方面，比较例中，无法进行核酸扩增。另外，RT-SmartAmp按下述方式进行实施。
本实施例中的RT-SmartAmp法中，使用流感A(H1N1)的HA区域595-1048碱基为止的序列作为进行扩增的模板RNA。在制备模板RNA时，首先使用在HA区域具有互补性序列的cDNA、以下的引物1(序列编号1)及引物2(序列编号2)、以及SYBR Premix Ex Taq(TAKARABIO公司制造)实施PCR。
引物1(序列编号1)
5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCCATCTACTAGTGCTGACCA-3′
引物2(序列编号2)
5′-CCCTTCAATGAAACCGGCAA-3′
另外，所述PCR是使95℃30秒、60℃30秒、及72℃30秒这3种温度进行35个循环反应后，通过72℃3分钟的培养而实现。以通过该PCR而扩增的DNA片段为基础，使用CUGA7体外转录试剂盒(NIPPONGENE公司制造)，来合成模板RNA。
RT-SmartAmp法是将如下方式制成的溶液作为反应溶液：在体积25μL的液体中包含最终浓度为1.4mM dNTP、5％DMSO、20mMTris-HCl(pH值8.0)、30mM乙酸钾、10mM硫酸钠、8mM硫酸镁、0.1％Tween20、12单位Aac DNA聚合酶、及0.125单位AMV反转录酶的溶液中，添加以下所示的序列及浓度的引物(序列编号3～7、DNAFORM公司制造)及激子引物(序列编号8、DNAFORM公司制造、参照专利第4370385号公报)。
FP引物(序列编号3、最终浓度1.82μM)
5′-GCATTCGCGAAATGATAATACCAGATCC-3′
TP引物(序列编号4、最终浓度1.82μM)
5′-TTCCATTGCGAATGCACATTCGAAGCAAC-3′
OP引物1(序列编号5、最终浓度0.23μM)
5′-ACACTAGTAGAGCCGGGAGA-3′
OP引物2(序列编号6、最终浓度0.23μM)
5′-CTGGTGTTTATAGCACCCTT-3′
BP引物(序列编号7、最终浓度0.68μM)
5′-ACCACTAGATTTCCAG-3′
BP激子引物(序列编号8、最终浓度0.23μM)
5′-ACCACZAGATTTCCAG-3′(Z表示经激子标记的胸腺嘧啶残基)
接着添加将所述合成的模板RNA和人类鼻粘膜悬浮在预处理试剂盒中的样本，使反应体积为25μL后，使用实时PCR装置MX3000p(Agilent公司制造)，进行60℃、90分钟的恒温下的反应，通过FAM过滤器获得荧光扩增曲线，从而检测核酸扩增活性。其结果如图1所示，在本发明中的仅通过预处理试剂进行处理的样本中，由所添加的模板RNA实现了核酸扩增。
参考例1
(人类鼻粘膜中的乳铁蛋白及溶菌酶C的存在)
如图2的电泳照片所示，在人类鼻粘膜中确认了乳铁蛋白及溶菌酶C的存在。另外，人类鼻粘膜中的乳铁蛋白及溶菌酶C的存在按以下方式进行确认。
通过药签(MEN-TIP、日本棉棒公司制造)采集健康人的鼻粘膜样本(咽喉上部粘膜)，每1支药签悬浮于300μL的磷酸缓冲液(PBS)中。将所得的悬浮液供于凝胶过滤色谱仪(移动相磷酸缓冲液、柱HiLoad 16/60Superdex200pg、GE healthcare制造)，以4个级分(F1～F4)进行尺寸筛分。另外，将该悬浮液供于蛋白质G亲和离心柱(spincolumn)(同仁化学制造)，而获得柱结合级分。将所述凝胶过滤筛分制剂及亲和柱结合级分供于使用SuperSepAce10-20％线性梯度丙烯酰胺凝胶(和光纯药工业制造)的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，通过Silver MS Stain(和光纯药工业制造)进行银染色，从而检测蛋白质条带。对于图2中由方形包围的条带，使用Easy Separator(和光纯药工业制造)提取蛋白质，并供于液相色谱仪/串联质谱仪(SYNAPTLC/MS/MS、Waters公司制造)。使用根据所得的数据的MASCOT程序，检索根据通过质谱仪而得的肽片段的分子量而推测的蛋白质。其结果鉴定为：图2所示的约80kDa的条带为来自人类的乳铁蛋白，14kDa的条带为来自人类的溶菌酶C。
实施例2
(铁离子及碳酸根离子对人类乳铁蛋白的RNA分解活性抑制效果)
如图3所示，确认了铁离子及碳酸根离子对人类乳铁蛋白的RNA分解活性抑制效果。
本实施例中，使用与所述合成的模板RNA同样的RNA作为针对RNA分解活性(RNase活性)的基质。图3左图中，通过药签(MEN-TIP、日本棉棒制造)采集健康人的鼻粘膜样本(咽喉上部粘膜)，悬浮于250μL的40mM Tris-HCl(pH值7.5)中。接着，在悬浮液9μL中添加1.5mM的氯化铁，接着制备添加了5mM、10mM或15mM的NaHCO3的溶液，最后定容为18μL。然后，将悬浮液在37℃培育10分钟。对于其2.5μL的悬浮液，添加10μL的50ng/μL的RNA，在25℃培育10分钟。反应结束后，将反应液供于3.0％NuSieveGTG琼脂糖凝胶电泳(100V、30分钟)，通过溴化乙锭(EtBr)染色法检测RNA的条带。
图3右图中，将健康人的鼻粘膜样本悬浮于250μL的40mM MES(pH值5.8)中后，在该悬浮液9μL中添加1.5mM、2.0mM、2.5mM的Fe2(SO4)3、及10mM、15mM、20mM或25mM的NaHCO3，最后定容为18μL。之后进行与上述相同的操作，通过琼脂糖电泳检测RNA的条带。
实施例3
(铁离子及碳酸根离子对热处理的效果)
如图4所示，通过进行热处理，能够以短时间提高铁离子及碳酸根离子的RNA分解活性抑制作用。
本实施例中，将健康人的鼻粘膜样本悬浮于250μL的20mM MES(pH值5.8)、10％(w/v)Tween20中后，在该悬浮液10μL中添加1mM的Fe2(SO4)3、及6.7mM的NaHCO3，最后定容为18μL。然后，在37℃进行0分钟、1分钟或5分钟的培育。反应结束后，将反应液供于3.0％NuSieveGTG琼脂糖凝胶电泳(100V、30分钟)，通过溴化乙锭(EtBr)染色法检测RNA的条带，从而检测RNA分解活性。
实施例4
(因铁离子及碳酸根离子造成的对溶菌酶C的反转录抑制活性的抑制)
如图5所示，人类溶菌酶C的反转录抑制活性可以通过铁离子及碳酸根离子而抑制。
本实施例中，使用与上述相同的RT-SmartAmp法进行研究。在RT-SmartAmp法的反应溶液25μL中，以最终浓度为10ng/mL添加来自人类的纯化溶菌酶C(CALNIOCHEM制造)，通过荧光扩增曲线来比较向反应液中添加0mM或2.5mM的Fe2(SO4)3、及0mM、5mM、10mM或20mM的NaHCO3中任一种时的核酸扩增活性。
实施例5
(铁离子及碳酸根离子、与SDS的协同效应)
如图6所示，在铁离子及碳酸根离子的存在下，确认能够以低浓度提高RNA分解活性。
本实施例中，将健康人的鼻粘膜样本悬浮于250μL的40mM MES(pH值5.8)中后，在该悬浮液9μL中添加2.5mM的Fe2(SO4)3、及20mM的NaHCO3，接着添加作为极性表面活性剂的SDS(最终浓度0％、0.01％、0.02％、0.05％或0.1％)、或作为非离子性表面活性剂的Tween20(最终浓度0％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％或0.5％)，最后定容为18μL。然后，将悬浮液在37℃培育10分钟。相对于其2.5μL的悬浮液添加10μL的50ng/μL的RNA，在25℃培育10分钟。反应结束后，将反应液供于3.0％NuSieveGTG琼脂糖凝胶电泳(100V、30分钟)，通过溴化乙锭(EtBr)染色法检测RNA的条带。
参考例2
(通过添加氧化铝对从预处理试剂除去SDS的影响)
如图8所示，通过在预处理试剂中添加氧化铝，可以除去本发明中的预处理试剂中所含的SDS，其结果实现了模板RNA的核酸扩增。另外，本参考例中，为了仅判断SDS对核酸扩增抑制的活性，在不含人类鼻粘膜的条件下实施。
本参考例中的RT-SmartAmp法中，使用流感A(H3N2)的NA区域675-1075碱基为止的序列作为进行扩增的模板RNA。在制备模板RNA时，首先使用在NA区域具有互补性序列的cDNA、以下的引物3(序列编号9)及引物4(序列编号10)、以及作为PCR的酶的Prime STAR(TAKARA BIO公司制造)，来实施PCR。
引物3(序列编号9)
5′-TAATACGACTCACTATAGGGCCAGGAGTCAGAATGCGTTT-3′
引物4(序列编号10)
5′-GCCTTTCACTCCATGACCAC-3′
另外，所述PCR是将98℃10秒、55℃5秒、及72℃30秒这3种温度进行30个循环反应后，通过72℃4分钟的培养而实现。以通过该PCR进行了扩增的DNA片段为基础，使用CUGA7体外转录试剂盒(NIPPONGENE制造)，来合成模板RNA。
RT-SmartAmp法是将如下方式制成的溶液作为反应溶液：在包含最终浓度为1.4mMdNTP、5％DMSO、20mM Tris-HCl(pH值8.0)、30mM乙酸钾、10mM硫酸钠、8mM硫酸镁、0.1％Tween20、12单位Aac DNA聚合酶、及0.125单位AMV反转录酶的溶液中，添加以下所示的序列及浓度的引物(序列编号11～15、DNAFORM公司制造)及激子引物(序列编号16、DNAFORM公司制造、参照专利第4370385号公报)及所述合成的模板RNA。
FP引物1(序列编号11、最终浓度1.82μM)
5′-TTTATATATATATAAACATGTCGAGGAGTG-3′
TP引物1(序列编号12、最终浓度1.82μM)
5′-CCTCGATATCCTGGTATGGGCCTATTGGA-3′
OP引物3(序列编号13、最终浓度0.23μM)
5′-GCACATTGTCAGGAAGTGC-3′
OP引物4(序列编号14、最终浓度0.23μM)
5′-TTTTTCTGGGTGTGTCTCC-3′
BP引物1(序列编号15、最终浓度0.68μM)
5′-TGTGTCTGCAGAG-3′
BP激子引物1(序列编号16、最终浓度0.23μM)
5′-TGTGZCTGCAGAG-3′(“Z”表示经激子标记的胸腺嘧啶残基)
制备在包含20mM MES缓冲液(pH值5.8)、2.5mM硫酸铁、20mM碳酸氢钠的溶液中添加0.1％SDS而成的溶液，作为预处理试剂。在该预处理试剂中，添加最终浓度1mg/ml的活性氧化铝(和光纯药公司制造、分子量101.96)，通过旋涡混合机进行搅拌而悬浮。在所述悬浮后，在具有玻璃烧结过滤器的空柱Micro Bio-Spin色谱柱(BIO-RAD公司制造)中，放置所述悬浮液，通过1200×g、1分钟的离心，获得将吸附了SDS的氧化铝除去的滤液。另外，比较对照是在不添加氧化铝的条件下进行与上述相同的处理而获得滤液。使用所述RT-SmartAmp法的反应溶液，对所得的滤液检测核酸扩增活性的有无，从而对SDS的残存活性(DNA聚合酶抑制活性)进行比较。
在所述RT-SmartAmp的反应溶液中，添加通过所述方法进行了处理的滤液5μL，以每1反应为25μL的溶液的方式进行制备，通过实时PCR装置MX3000p(Agilent公司制造)，进行60℃、90分钟的恒温下的反应，通过FAM过滤器获得荧光扩增曲线，从而检测核酸扩增活性。根据扩增曲线的上升的有无，评价产生核酸扩增的抑制的SDS的残存性，结果如图8所示，确认仅在添加氧化铝时实现明显的核酸扩增。因此判定，通过氧化铝添加处理，可以从本发明的预处理试剂中除去SDS。
参考例3
(通过超滤过滤器对从预处理试剂中除去SDS的影响)
如图9所示，通过使本发明的预处理试剂中所含的铁离子浓度增加，来促进SDS的沉淀形成，使该沉淀通过所述超滤过滤器(过滤)而实施处理，从而可以将预处理试剂中所含的SDS除去，并可以实现模板RNA的核酸扩增。另外，本参考例中，为了仅判断SDS对核酸扩增抑制的活性，在不含人类鼻粘膜的条件下实施。
制备在包含20mM MES缓冲液(pH值5.8)、5mM硫酸铁、20mM碳酸氢钠的溶液中添加0.1％SDS而成的溶液，作为预处理试剂。该预处理试剂中的铁离子浓度设定为高于所述实施例1的预处理试剂。使用注射器使该预处理试剂通过Millex HV(膜孔径0.22μm、Millipore公司制造)，而获得滤液。使用所述参考例2所示的RT-SmartAmp法的反应溶液，对所得的滤液检测核酸扩增活性的有无，从而将SDS的残存活性(DNA聚合酶抑制活性)与未将所述预处理试剂进行过滤器过滤而使用的情形进行比较。
在所述RT-SmartAmp反应溶液中，添加5μL的通过所述方法进行了处理的滤液，以每1反应为25μL的溶液的方式进行制备，通过实时PCR装置MX3000p(Agilent公司制造)，进行60℃、90分钟的恒温下的反应，通过FAM过滤器而获得荧光扩增曲线，从而检测核酸扩增活性。根据扩增曲线的上升的有无，来评价产生核酸扩增的抑制的SDS的残存性，结果如图9所示，在未进行过滤器过滤的情况下，未发现核酸扩增，但在通过具有0.22μm的膜孔径的超滤过滤器的情况下，发现实现明显的核酸扩增。因此判定，通过超滤过滤器处理，将伴随预处理试剂中的铁离子浓度的增加而产生的SDS的沉淀物除去，从而可以将SDS从本发明的预处理试剂中除去。
参考例4
(通过Triton X-100在核酸扩增反应中对于SDS的核酸扩增抑制的缓和效果)
如图10所示，将SDS直接添加于核酸扩增反应溶液中时，通过事先在核酸扩增反应溶液中添加作为非离子性表面活性剂的Triton(注册商标)X-100，可以缓和预处理试剂中所含的SDS的核酸扩增抑制。另外，本参考例中，为了仅判断SDS对核酸扩增抑制的活性，通过将SDS单独添加于RT-SmartAmp中进行实施。
在所述参考例2所示的RT-SmartAmp法的反应溶液中，以最终浓度为0％或0.5％的方式添加Triton X-100，接着，添加5μL的0.1％SDS溶液，以每1反应为25μL的反应溶液的方式进行制备。
对于该反应溶液，通过实时PCR装置MX3000p(Agilent公司制造)，进行60℃、90分钟的恒温下的反应，通过FAM过滤器获得荧光扩增曲线，从而检测核酸扩增活性。根据扩增曲线的上升的有无，评价核酸扩增因SDS引起的抑制效果，结果如图10所示，在将0.5％Triton X-100添加于所述反应溶液中的情况下，发现显著的核酸扩增。因此判定，即便SDS在核酸扩增反应液中共存的情况下，也可以通过Triton X-100来缓和SDS的核酸扩增抑制，从而可以实现来自模板RNA的核酸扩增。
实施例6
(人类鼻粘膜所含的RNA病毒的检测)
在本发明的包含铁离子及碳酸根离子的预处理试剂中添加SDS的条件下，实施所述参考例2～4所示的步骤，从而如图11所示，可以通过RT-SmartAmp法检测人类鼻粘膜中所含的RNA病毒。
制备在包含20mM MES缓冲液(pH值5.8)、5mM硫酸铁、20mM碳酸氢钠的溶液中添加了0.1％SDS而成的溶液，作为预处理试剂。在该预处理试剂500μL中，悬浮人类鼻粘膜、及相当于104pfu/mL的流感A(H3N2)。在所述悬浮后，为了使病毒外膜破坏，在该悬浮液中进一步添加0.1％SDS，然后，使用注射器使其通过Millex HV(膜孔径0.22μm、Millipore公司制造)，将所得的滤液作为经预处理的样本。另外，比较对照是制备不添加病毒外膜破坏用的0.1％SDS，而将经预处理试剂进行过滤器过滤而得的样本。
RT-SmartAmp法是将如下方式制成的溶液作为反应溶液：在包含最终浓度为1.4mMdNTP、5％DMSO、20mM Tris-HCl(pH值8.0)、30mM乙酸钾、10mM硫酸钠、8mM硫酸镁、0.1％Tween20、12单位Aac DNA聚合酶、及0.125单位AMV反转录酶的溶液中，以成为0.5％的方式添加Triton X-100，接着添加所述参考例2所示的序列及浓度的引物(序列编号11～15、DNAFORM公司制造)及激子引物(序列编号16、DNAFORM公司制造、参照专利第4370385号公报)。
在该反应溶液中，添加所述经预处理的样本5μL，以每1反应为25μL的溶液的方式进行制备，通过实时PCR装置MX3000p(Agilent公司制造)，进行60℃、90分钟的恒温下的反应，通过FAM过滤器获得荧光扩增曲线，从而检测核酸扩增活性。其结果如图11所示，为了使病毒外膜破坏，在预处理试剂中进一步添加0.1％SDS，仅通过该所得的经预处理的试剂实现核酸扩增，可以检测来自RNA病毒的核酸扩增。

Claims (28)

1.生物样本的预处理方法，其是包含RNA的生物样本的预处理方法，其特征在于：
所述生物样本包含乳铁蛋白(Lactferrin)，
通过在所述生物样本中添加乳铁蛋白的RNA分解活性抑制剂，对所述生物样本实施乳铁蛋白的RNA分解活性抑制处理，
所述乳铁蛋白的RNA分解活性抑制剂是为至少一种选自以下的金属的离子：铜、镍、铁、金、钪、钇、钆、铈、钕和锌。
2.权利要求1的生物样本的预处理方法，其中所述铜的离子为Cu2+或Cu3+、镍的离子为Ni2+、铁的离子为Fe2+或Fe3+、金的离子为Au+或Au3+、钪的离子为Sc3+、钇的离子为Y3+、钆的离子为Gd3+、铈的离子为Ce3+、钕的离子为Nd3+和锌的离子为Zn2+。
3.权利要求1的生物样本的预处理方法，其特征在于：所述生物样本包括：动物的鼻粘膜、鼻窦黏膜、气管粘膜、唾液、来自口腔或咽喉的分泌液、泪、乳汁、胆汁、血液(白细胞)、子宫颈管的粘膜、内外生殖器的粘膜、羊水、或尿。
4.权利要求3的生物样本的预处理方法，其特征在于：所述动物为人类。
5.权利要求1的生物样本的预处理方法，其特征在于：所述生物样本包括人类鼻粘膜。
6.权利要求2的生物样本的预处理方法，其特征在于：所述生物样本包括人类鼻粘膜。
7.权利要求3的生物样本的预处理方法，其特征在于：所述生物样本包括人类鼻粘膜。
8.权利要求4的生物样本的预处理方法，其特征在于：所述生物样本包括人类鼻粘膜。
9.权利要求1至8中任一项的生物样本的预处理方法，其特征在于：进一步对所述生物样本实施溶菌酶C(Lysozyme C)的反转录抑制活性抑制处理。
10.权利要求9的生物样本的预处理方法，其特征在于：通过在所述生物样本中添加溶菌酶C(Lysozyme C)的反转录抑制活性抑制剂，来对所述生物样本实施溶菌酶C(LysozymeC)的反转录抑制活性抑制处理。
11.权利要求10的生物样本的预处理方法，其特征在于：所述RNA分解活性抑制剂及所述反转录抑制活性抑制剂中的至少一种包括铁离子剂及碳酸根离子剂。
12.权利要求11的生物样本的预处理方法，其特征在于：对添加了所述铁离子剂及碳酸根离子剂的所述生物样本进行加热处理。
13.权利要求1至8和10至12中任一项的生物样本的预处理方法，其特征在于：进一步在所述生物样本中添加离子性表面活性剂。
14.权利要求9的生物样本的预处理方法，其特征在于：进一步在所述生物样本中添加离子性表面活性剂。
15.权利要求13的生物样本的预处理方法，其特征在于：所述离子性表面活性剂为SDS。
16.检测方法，其是生物样本中的RNA的检测方法，其特征在于：
所述生物样本包含乳铁蛋白(Lactferrin)，
并且包括：对所述生物样本进行预处理的预处理步骤，及
通过对经所述预处理的生物样本中的所述RNA进行扩增而进行检测的RNA扩增检测步骤，
所述预处理步骤通过权利要求1至15中任一项的生物样本的预处理方法实施。
17.权利要求16的检测方法，其特征在于：所述预处理步骤通过权利要求1至12中任一项的生物样本的预处理方法实施，
在所述RNA扩增检测步骤中，在经所述预处理的生物样本中进一步添加表面活性剂。
18.权利要求17的检测方法，其特征在于：所述表面活性剂为非离子性表面活性剂。
19.权利要求16至18中任一项的检测方法，其特征在于：所述RNA的扩增通过使用反转录酶的基因扩增方法而实施。
20.权利要求19的检测方法，其特征在于：所述基因扩增方法是使用链置换DNA聚合酶的等温扩增方法。
21.预处理试剂盒，其是包含RNA的生物样本的预处理试剂盒，其特征在于：
所述生物样本包含乳铁蛋白(Lactferrin)，
并且所述预处理试剂盒包含乳铁蛋白的RNA分解活性抑制剂，
所述乳铁蛋白的RNA分解活性抑制剂是至少一种选自以下的离子：铜、镍、铁、金、钪、钇、钆、铈、钕和锌。
22.权利要求21的预处理试剂盒，其中所述铜的离子为Cu2+或Cu3+、镍的离子为Ni2+、铁的离子为Fe2+或Fe3+、金的离子为Au+或Au3+、钪的离子为Sc3+、钇的离子为Y3+、钆的离子为Gd3 +、铈的离子为Ce3+、钕的离子为Nd3+和锌的离子为Zn2+。
23.权利要求21的预处理试剂盒，其特征在于：进一步包含溶菌酶C(Lysozyme C)的反转录抑制活性抑制剂。
24.权利要求23的预处理试剂盒，其特征在于：所述RNA分解活性抑制剂及所述反转录抑制活性抑制剂中的至少一种包含铁离子剂及碳酸根离子剂。
25.权利要求24的预处理试剂盒，其特征在于：以相互不接触的状态包含所述铁离子剂及所述碳酸根离子剂。
26.权利要求21至25中任一项的预处理试剂盒，其特征在于：进一步包含离子性表面活性剂。
27.权利要求26的预处理试剂盒，其特征在于：所述离子性表面活性剂为SDS。
28.权利要求21至25中任一项的预处理试剂盒，其特征在于：进一步包含非离子性表面活性剂。
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