TW201310035A - 生物樣品之預處理方法、ｒｎａ之檢測方法及預處理套組 - Google Patents

生物樣品之預處理方法、ｒｎａ之檢測方法及預處理套組 Download PDF

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Saori GODA
Kazuhito Nomura
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Abstract

本發明提供一種可迅速且簡易地檢測RNA之預處理方法。即，於含有人類鼻腔黏膜之生物樣品中添加例如鐵離子及碳酸離子，藉此抑制存在於人類鼻腔黏膜之乳鐵蛋白的RNA分解活性。若使用經預處理之生物樣品，即可使用反轉錄酶來擴增RNA病毒之基因。鐵離子及碳酸離子亦可抑制人類鼻腔黏膜中的溶菌酶C之反轉錄酶抑制活性。又，宜於含有人類鼻腔黏膜之生物樣品中添加SDS，藉此除去RNA病毒之外膜。

Description

生物樣品之預處理方法、RNA之檢測方法及預處理套組 發明領域
本發明係有關於一種含RNA之生物樣品的預處理方法、RNA之檢測方法及預處理套組。
發明背景
作為檢測血液等生物樣品中的病毒之方法，有將病毒之基因擴增來檢測之方法。但，在生物樣品中，常含有基因擴增之抑制物質，在基因擴增之前，會先實施生物樣品進行預處理來除去或去活化抑制物質。作為預處理方法，例如可藉由界面活性劑、離液劑(chaotropic agent)、加熱等生物樣品之處理後，再藉由固相載體或離子交換樹脂來進行純化之方法(專利文獻1~3)。然而，該等方法需要特殊的裝置，且需要複數個操作步驟，係屬繁雜。
特別是以RNA為基因之病毒的檢測，因為會將RNA基因藉由反轉錄酶成為DNA再進行擴增之操作，故亦有必要除去或去活化RNA分解酵素(RNase)及反轉錄酶去活化物質，因此若是以往的預處理方法會需要更繁雜的操作。例如，作為含RNA病毒之生物樣品的預處理方法，已知有添加多胺或硫酸化多醣(專利文獻4)。然而，多胺或硫酸化多醣之添加會使預處理更加繁雜化，且多胺及硫酸化多醣有會與由RNA基因及反轉錄酶所生成之DNA結合之虞，反而有會抑制基因擴增之可能性。
另外，流行性感冒病毒為RNA病毒的一種，然而流行性感冒病毒為新型或季節型之判斷，在臨床上是非常重要的。此外，作為用來檢測流行性感冒病毒之生物樣品，一般是使用鼻腔黏膜。而且，流行性感冒病毒的檢測有必要在臨床現場來進行。因此，希望確立使用人類鼻腔黏膜之迅速且簡易的檢測方法，如此之需求並不限定流行性感冒病毒，而是對所有RNA病毒之檢測亦有需求，進一步地，不只是RNA病毒之檢測，基因以外之RNA本身的檢測亦有需求。
專利文獻
專利文獻1：日本專利特開第2009-247250號公報
專利文獻2：WO2007/094506號手冊
專利文獻3：日本專利特開第2006-87394號公報
專利文獻4：日本專利特開第2001-29078號公報
本發明之目的在於提供一種可迅速且簡易地檢測含有RNA之生物樣品的RNA之預處理方法、使用該方法之RNA的檢測方法以及用於前述生物樣品之預處理方法的預處理套組。
本發明之預處理方法係含有RNA之生物樣品的預處理方法，其特徵在於：前述生物樣品含有乳鐵蛋白 (Lactferrin)，且對前述生物樣品實施乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制處理。
本發明之檢測方法係生物樣品中之RNA的檢測方法，其特徵在於前述生物樣品係含有乳鐵蛋白(Lactferrin)，且該檢測方法包含：預處理步驟，其係將前述生物樣品進行預處理者；及，RNA擴增檢測步驟，其係藉由擴增經前述預處理之生物樣品中的前述RNA來進行檢測者；並且前述預處理步驟係藉由前述本發明之生物樣品之預處理方法來實施。
本發明之預處理套組係含RNA之生物樣品的預處理套組，其特徵在於：前述生物樣品含有乳鐵蛋白(Lactferrin)，且前述預處理套組含有乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制劑。
首先，本發明之發明者查明了抑制人類鼻腔黏膜樣品中所含之以RNA為模板的反轉錄/DNA擴增反應之要因係來自乳鐵蛋白之RNA分解活性。其次，查明了僅將乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制處理(例如，乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制處理)實施於人類鼻腔黏膜樣品，即可抑制RNA分解。進一步地，作為存在於人類鼻腔黏膜樣品之其他反轉錄/DNA擴增反應抑制要因之一，溶菌酶C會抑制藉由反轉錄酶之RNA至DNA之反轉路反應。又，發現了藉由添加溶菌酶C之反轉錄酶抑制活性抑制劑，可抑制反轉錄酶抑制活性。而且，藉由該等反轉錄/DNA擴增反應抑制要因之抑 制處理(添加含有抑制劑之試藥)來處理人類鼻腔黏膜樣品之結果，發現了沒有經過特別的純化步驟，而能直接進行RNA基因擴增，進而完成本發明。藉由本發明，可迅速且簡易地檢測含有RNA之生物樣品的RNA。
圖式簡單說明
第1圖係顯示本發明之檢測方法之一例的圖表。
第2圖係顯示人類鼻腔黏膜中存在有乳鐵蛋白及溶菌酶C之電泳照片。
第3圖係顯示鐵離子及碳酸離子的乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制效果的電泳照片。
第4圖係顯示鐵離子及碳酸離子的熱處理效果之一例的電泳照片。
第5圖係顯示鐵離子及碳酸離子所造成的溶菌酶C之反轉錄抑制活性之抑制之一例的圖表。
第6圖係顯示鐵離子及碳酸離子與SDS之協同效果之一例的電泳照片。
第7a圖係顯示轉回引子(turn-back primer)及折疊引子(folding primer)所造成的核酸擴增反應之機制之一例的圖。
第7b圖係顯示轉回引子(turn-back primer)及折疊引子(folding primer)所造成的核酸擴增反應之機制之一例的圖。
第8圖係顯示添加氧化鋁所造成的SDS除去的影響之一例的圖表。
第9圖係顯示鐵離子濃度之增加及超過濾濾器造成的SDS除去的影響之一例的圖表。
第10圖係顯示Triton X-100造成的核酸擴增反應中的SDS之核酸擴增抑制之緩和效果之一例的圖表。
第11圖係顯示藉由RT-SmartAmp法能檢測人類鼻腔黏膜所含之RNA病毒之圖表。
用以實施發明之形態
本發明之預處理方法中，較佳係藉由於前述生物樣品中添加乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制劑，來對前述生物樣品實施乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制處理。
本發明之預處理方法中，前述生物樣品較佳係包含：動物之鼻腔黏膜、副鼻腔黏膜、氣管黏膜、唾液、源自口腔或咽頭之分泌液、淚液、乳汁、膽汁、血液(白血球)、子宮頸管之黏膜、內外性器之黏膜、羊水或尿液。
本發明之預處理方法中，前述動物較佳係人類。
本發明之預處理方法中，前述生物樣品較佳係含人類鼻腔黏膜。
本發明之預處理方法中，更進一步地，較佳係對前述生物樣品實施溶菌酶C(Lysozyme C)之反轉錄抑制活性的抑制處理。於此情況下，較佳係於前述生物樣品中添加溶菌酶C(Lysozyme C)之反轉錄抑制活性之抑制劑，以對前述生物樣品實施溶菌酶C(Lysozyme C)之反轉錄抑制活性的抑制處理。
本發明之預處理方法中，較佳係前述RNA分解活性抑制劑及前述反轉錄抑制活性之抑制劑中之至少一者含 有鐵離子劑及碳酸離子劑。又，本發明中，所謂「鐵離子劑」係指可供應鐵離子給前述生物樣品者。同樣地，本發明中，「碳酸離子劑」係指可供應碳酸離子給前述生物樣品者。
本發明之預處理方法中，較佳係對已添加前述鐵離子劑及碳酸離子劑之前述生物樣品施以加熱處理。藉由該加熱處理，可有效率地抑制RNA分解活性及反轉錄抑制活性。
本發明之預處理方法中，亦可進一步添加界面活性劑至前述生物樣品中，例如，以添加極性界面活性劑為佳。要使基因從病毒粒子露出，需要用非離子性界面活性劑來除去病毒之外膜，但非離子性界面活性劑可能會抑制本發明前述鐵離子劑及前述碳酸離子劑的機能。然而，若是極性界面活性劑，即可不抑制本發明前述鐵離子劑及前述碳酸離子劑的機能，而能除去病毒之外膜。前述極性界面活性劑係以SDS為佳。又，由於SDS在基因擴增之時會有抑制DNA聚合酶之虞，因此較佳係在基因擴增之前，添加鉀鹽或氧化鋁至生物樣品以凝集SDS，並將其離心分離或過濾來除去SDS。
本發明之檢測方法中，前述RNA之擴增係以使用了反轉錄酶的基因擴增方法來實施為佳。前述基因擴增方法係以使用了股置換DNA聚合酶之等溫擴增方法為佳。
本發明之檢測方法中，從已使用界面活性劑之病毒粒子之RNA基因流出，可舉例使用以下兩種步驟其中之 一者。步驟B係將非極性界面活性劑於基因擴增步驟中添加，藉由非極性界面活性劑、以及基因擴增反應之時的加熱之效果，使RNA基因從病毒粒子溶出的手法。
步驟A：在預處理過程中包含於檢體中的病毒粒子藉由界面活性劑來破壞，使RNA從病毒溶出的同時，將乳鐵蛋白及溶菌酶C之RNA分解活性及前述反轉錄抑制活性藉由抑制處理來抑制，將該預處理液供給至核酸擴增之步驟。
步驟B：不破壞檢體中之病毒粒子(維持包含著的狀態)，將乳鐵蛋白及溶菌酶C之RNA分解活性及前述反轉錄抑制活性藉由抑制處理來抑制後，供給至含非極性界面活性劑之核酸擴增反應，藉由界面活性劑及熱改質之效果來使病毒粒子中的RNA基因體(RNA genome)溶出，實施自病毒基因體之核酸擴增之步驟。
前述步驟A中，前述界面活性劑係以使用極性界面活性劑為佳。前述極性界面活性劑係以SDS為佳。前述步驟B中，前述界面活性劑係以使用不會抑制核酸擴增反應之非極性界面活性劑為佳。
本發明之預處理套組係以進一步地包含有溶菌酶C(Lysozyme C)之反轉錄抑制活性抑制劑為佳。
本發明之預處理套組中，較佳係前述RNA分解活性抑制劑及前述反轉錄抑制活性抑制劑之至少一者含有鐵離子劑及碳酸離子劑。前述鐵離子劑及前述碳酸離子劑係以互相不接觸的狀態被包含於其中為佳。
接著，詳細說明本發明。
本發明中，生物樣品所含的RNA沒有特別限制，包含所有可從生體取得的RNA、宿主RNA、細菌或真菌RNA。若為基因之RNA，包含在生物樣品中的係以RNA病毒，特別是以流行性感冒病毒為佳。
本發明中，前述生物樣品係含乳鐵蛋白之樣品。其中，前述生物樣品係以含人類乳鐵蛋白之樣品為佳。
乳鐵蛋白已知係包含於生體之幾乎所有的外分泌液中。因此，作為前述生物樣品，可舉例如，包含有下述物質之生物樣品：源自動物的鼻腔、副鼻腔、喉頭、氣管、支氣管、或是肺等的上呼吸道黏膜的分泌液；源自口腔或咽頭的分泌液(例如唾液等)；源自消化道黏膜之分泌液；源自內．外性器(例如子宮頸管等)黏膜的分泌液；源自腎尿道系統黏膜的分泌液；源自腹腔內黏膜的分泌液；源自胸腔內黏膜的分泌液；源自心包內黏膜的分泌液；源自皮膚的分泌液；淚腺分泌液；乳汁；膽汁；血液(白血球)；羊水；尿；糞便等。該等之中，較佳係例如源自鼻腔、副鼻腔等的黏膜的分泌液、唾液、淚、乳汁、膽汁、血液(白血球)、源自子宮頸管的分泌液、羊水、尿等樣品，已知該等係實際含有乳鐵蛋白。其中，特別係以人類鼻腔黏膜為佳。又，前述動物係以人類為佳，然而人類以外的動物亦可。作為人類以外的動物之例，可舉出牛、豬、羊、馬、駱駝、大鼠等。
乳鐵蛋白係不僅如前述之鼻腔黏膜，而是於各種組織中表現、被分泌出的蛋白質。於人類的各種組織中， 欲知乳鐵蛋白之蛋白質編碼的RNA表現量係何種程度，因使用了利用次世代定序器(sequencer)來進行表現解析的方法之一：CAGE法(Kanamori-Katayama M,et al.Genome Res.(2011)May 19)所得之資料來解析、比較後獲得之資料，表示於表1以供參考。由此結果明白作為乳鐵蛋白之表現量高的組織係有各式各樣的組織，並教示本發明之預處理方法之適用可能性的廣泛度。
人類鼻腔黏膜可藉由例如鼻腔洗淨液或擤鼻(擤鼻涕)來採取，較佳地，可用棉花棒來採取。人類鼻腔黏膜亦可依原樣直接當作生物樣品，亦可用生理食鹽水或緩衝液等使其分散或溶解來作為生物樣品。作為緩衝液，為了預防鹼化時之分解，可使用對於酸性至中性域之氫離子濃度具有緩衝作用者。例如，可使用醋酸緩衝液、磷酸緩衝液、酒石酸緩衝液、硼酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、參緩衝液(tris buffer)、磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)、以及各種Good緩衝液(MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS)。緩衝液的pH係在例如4.0~8.0，較佳係在5.0~7.0，更佳係在5.5~6.0之範圍，以使用MES(pKa=6.15)為最佳。
生物樣品中以RNA為模板的反轉錄/DNA擴增反應之要因係來自乳鐵蛋白之RNA分解活性，若抑制乳鐵蛋白之RNA分解活性，則不需特別之純化處理就可實行RNA病毒之基因擴增，此為本發明之重點所在，一如前述。乳鐵蛋白之RNA分解活性的抑制處理包含例如乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制劑添加至生物樣品、以及生物樣品之熱處理。前述抑制處理例如可藉由RNA分解活性抑制劑之添加及前述熱處理這兩者來實施。前述熱處理之溫度係例如在25~100℃之範圍，較佳係在30~75℃之範圍，更佳係在 37~65℃之範圍。前述熱處理之時間係例如在1~60分鐘之範圍，較佳係在2~45分鐘之範圍，更佳係在5~30分鐘之範圍。
前述乳鐵蛋白之RNA分解活性亦可藉由加入過量的作為目標之目的RNA以外的RNA(誘騙RNA)來使其降低。
欲進一步乳鐵蛋白之RNA分解活性，可使用各種抑制劑。作為抑制劑，可使用一般分子生物學上使用的源自牛胎盤之RNase抑制劑。又，可使用對乳鐵蛋白進行特異性結合而可抑制RNA分解活性之特異性IgG抗體或Affibody之蛋白質性分子，或是作為來自核酸之特異性結合分子且係可篩選之RNA/DNA核酸適體(aptamer)。進一步地，藉由對乳鐵蛋白之經電腦模擬(in sillico)結合分子搜尋所發現，可使用硫酸鹽、硫代磺酸鹽、磷酸鹽、胺基磺酸鹽、磺醯基氯等滴分子有機化合物。
作為乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制劑，較佳為使用屬於過渡金屬及主族金屬之金屬離子。作為金屬離子，可使用屬於過渡金屬者有銅(Cu2+、Cu3+)、鎳(Ni2+)、鐵(Fe2+、Fe3+)、金(Au+、Au3+)、及在過渡金屬中屬於輕稀土之鈧(Sc3+)、釔(Y3+)、釓(Gd3+)、鈰(Ce3+)、釹(Nd3+)。作為屬於主族金屬者，可使用鋅(Zn2+)。又，該等金屬可作為單獨或複數種的混合試藥來使用。
作為乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制劑，較佳為同時使用鐵離子劑及碳酸離子劑。此為乳鐵蛋白變成不含鐵之缺輔基體(缺輔基乳鐵蛋白)時，會引發高RNA分解活性之 事項，以及乳鐵蛋白之結晶構造中，金屬結合域係形成為包含鐵離子與碳酸離子之構造之事項為準。認為藉由對不含金屬離子之缺輔基乳鐵蛋白同時供給鐵離子與碳酸離子，可有效率地使缺輔基體成為完整體，可抑制RNA分解活性。光是鐵離子劑就具有乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制活性，然而單獨具有鐵離子劑，若是在已提高鐵離子劑之濃度的情況，會有鐵離子劑本身的RNA分解活性會表現之虞。碳酸離子會與剩餘的鐵離子劑反應而形成不溶性的碳酸鐵(Fe2(CO3)3)，故具有抑制剩餘的鐵離子本身去分解RNA之效果。因此，若與鐵離子劑一起添加碳酸離子劑，可抑制乳鐵蛋白之RNA分解活性，且可抑制鐵離子劑本身之RNA分解活性。
作為前述鐵離子劑，較佳係供給三價的鐵離子(Fe3+)，例如氯化鐵(FeCl3)、硝酸鐵(Fe(NO3)3)、及硫酸鐵(Fe2(SO4)3)，更佳為該等之水溶液。又，由水溶液下的安定性之觀點來看，較佳係使用硫酸鐵。
作為前述碳酸離子劑，較佳係供給碳酸離子(CO3 2-)，可舉例如碳酸氫鈉，較佳為碳酸氫鈉水溶液。
在Fe3+與CO3 2-同時存在之溶液中(生物樣品中)，例如，Fe3+的濃度為2~6mM之範圍，又，CO3 2-的濃度為5~20mM之範圍。又，鐵離子劑及碳酸離子劑之濃度係5~20mM之範圍。較佳係Fe2(SO4)3的濃度為1~3mM之範圍，而NaHCO3的濃度為5~20mM之範圍。更佳地，Fe2(SO4)3的濃度為2.5mM左右，而NaHCO3的濃度為10mM左右。
如前述，前述極性界面活性劑之SDS添加至前述生物樣品時，SDS會有抑制基因擴增時的DNA聚合酶之虞，如前述，以使用氧化鋁等來從生物樣品去除SDS為佳。又，使用前述氧化鋁時，前述氧化鋁亦會造成吸附SDS以外的極性分子，例如，前述生物樣品所含之RNA及DNA等亦被氧化鋁吸附而會有從前述生物樣品被去除之情況。在此，SDS與鐵離子會藉由相互作用而形成沈澱。利用這個沈澱形成能，亦可從前述生物樣品除去SDS。由此觀點來看，前述生物樣品所含得鐵離子之濃度係以設定成較高為佳。前述鐵離子(例如Fe3+)之濃度係以1mM以上為佳，以2mM以上較佳，以2.5mM以上更佳。前述鐵離子之濃度上限並無特別限制，例如藉由離心分離或過濾來從前述生物樣品去除為佳。藉由前述過濾來除去前述沈澱時，前述過濾係以使用斥濾型濾器(超過濾濾器)為佳，例如，前述超過濾濾器之孔徑亦可在0.1~0.45μm之範圍，較佳係0.22μm。前述超過濾濾器可使用例如Millipore社製之商品名「Millex-HV(膜孔徑0.22μm)等。
鼻腔黏膜樣品所含多量的溶菌酶C會抑制以RNA為模板來合成DNA之反轉錄酶活性。如前述，本發明係以對鼻腔黏膜樣品等生物樣品實施溶菌酶C(Lysozyme C)之反轉錄抑制活性抑制處理為佳。例如，包含添加溶菌酶C之反轉錄抑制活性抑制劑、以及生物樣品之熱處理。前述抑制處理可藉由RNA分解活性抑制劑之添加及前述熱處理這兩者來實施。作為溶菌酶C之反轉錄抑制活性抑制劑，可 使用例如對溶菌酶C特異性結合，抑制反轉錄抑制活性之特異性IgG抗體或Affibody之蛋白質性分子，或是作為來自核酸之特異性結合分子且係可篩選之RNA/DNA核酸適體。較佳地，可藉由鐵離子劑(例如，可供給三價鐵離子者)及碳酸離子劑之添加來抑制。前述熱處理之溫度係例如在25~100℃之範圍，較佳係在30~75℃之範圍，更佳係在37~65℃之範圍。前述熱處理之時間係例如在1~60分鐘之範圍，較佳係在2~45分鐘之範圍，更佳係在5~30分鐘之範圍。
添加有鐵離子劑及碳酸離子劑之生物樣品較佳係進行加熱處理。該加熱處理被認為係具有使乳鐵蛋白之結構波動發生的作用，以結果來說會使鐵離子劑及碳酸離子劑對乳鐵蛋白之作用提高，可進一步抑制RNA分解活性。加熱處理之條件係例如溫度在37~60℃之範圍，時間在5~30分鐘之範圍。例如，在37℃時，進行30分鐘的加熱處理；在60℃時，進行5分鐘的加熱處理。
作為伴隨前述之加熱處理的步驟，可使用微量的蛋白質改質劑。具體而言，有胍鹽酸鹽、胍硫氰酸鹽、尿素(界面活性劑表示於以下)。
針對添加了鐵離子劑及碳酸離子劑之生物樣品，為了除去病毒粒子之外膜，係以添加極性界面活性劑為佳。極性界面活性劑係以使用陰離子系者為佳，具體而言，可使用皂素、辛酸鈉、癸酸鈉、十二酸鈉、十四酸鈉、十六酸鈉、十八酸鈉、全氟辛酸(PFOA)、全氟壬酸、n-十二烷基肌胺酸鈉、椰油醯谷氨酸鈉、脂肪酸甲酯磺酸鈉、 1-己烷磺酸鈉、1-辛烷磺酸鈉、1-癸烷磺酸鈉、1-十二烷磺酸鈉、全氟丁烷磺酸鈉、直鏈烷基苯磺酸鈉、萘磺酸鈉、萘二磺酸二鈉、萘三磺酸三鈉、丁基萘磺酸鈉、全氟辛烷磺酸(PFOS)、十二烷硫酸鈉、十四烷硫酸鈉、聚氧乙烯烷基苯酚磺酸鈉、十二烷硫酸銨、十二烷磷酸、十二烷磷酸鈉、十二烷磷酸鉀、N-十二醯肌胺酸鈉、n-十四烷硫酸鈉(STS)、n-十二烷硫酸鈉、膽酸鈉、甘膽酸鈉、去氧膽酸鈉(DOC)、去氧甘膽酸鈉、鵝去氧膽酸鈉、牛膽酸鈉、牛磺鵝去氧膽酸鈉、牛去氫膽酸鈉、牛去氧膽酸鈉、牛石膽酸鈉、牛烏索去氧膽酸鈉。較佳者係添加n-十二烷硫酸鈉(SDS)。添加濃度例如SDS係0.1w/v%以下。又，添加了SDS時，不需進行前述加熱處理，即可迅速抑制鐵離子劑及碳酸離子劑造成之乳鐵蛋白之RNA分解活性。又，伴隨極性界面活性劑添加之人類鼻腔黏膜樣品之預處理，係定義為依據以下之步驟A為準的預處理方法。
步驟A：在預處理過程中包含於檢體中的病毒粒子藉由極性界面活性劑來破壞，使RNA從病毒溶出的同時，將乳鐵蛋白及溶菌酶C之RNA分解活性及前述反轉錄抑制活性藉由抑制劑來抑制，將該預處理液供給至核酸擴增之步驟。
前述極性界面活性劑之添加係任選的，就算沒有添加極性界面活性劑，藉由本發明之預處理，仍可進行RNA病毒之RNA基因擴增。此時，作為前提，自病毒放出RNA基因體係於核酸擴增反應過程所發生。由RNA之核酸擴增中的反轉錄反應例如是在50~60℃實施時，可期待病毒外膜 之熱改質效果，自RNA病毒放出RNA基因體係可能的。較佳地，可添加具有使病毒外膜崩壞之效果且不會抑制核酸擴增反應的非離子性界面活性劑至核酸擴增反應液中。作為具體的非離子性界面活性劑，可使用Tween(註冊商標)系界面活性劑(Tween20、Tween40、Tween60、Tween80)、Brij(註冊商標)系界面活性劑(Brij-76、Brij-96、Brij-56、Brij-58、Brij-35)、Span(註冊商標)系界面活性劑(Span-20、Span-40、Span-60)、POE(9、10)壬基苯基醚(Triton(註冊商標)N-101)、Triton(註冊商標)X-100、Triton X-114、毛地黃皂苷、APO-10、APO-12、BIG CHAP、環己基-n-乙基-β-D-麥芽糖苷、n-癸醯蔗糖、n-十二醯蔗糖、n-癸基-β-D-吡喃麥芽糖苷、n-癸基-β-D-硫代麥芽糖苷、n-十二基-β-D-吡喃葡萄糖苷、n-十二基-β-D-麥芽糖苷、ELUGENT(註冊商標)、GENAPOL(註冊商標)C-100、GENAPOL X-80、GENAPOL X-100、HECAMEG、n-庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷、n-庚基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、n-己基-β-D-吡喃葡萄糖苷、MEGA-8、MEGA-9、MEGA-10、n-壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷、NP-40、n-辛醯基-β-醣苷胺(NOGA)、n-辛醯蔗糖、n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、n-辛基-β-D-吡喃麥芽糖苷、n-辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、n-十一基-β-D-麥芽糖苷、PLUPONIC(註冊商標)F-127、壬基酚聚醚、壬基酚聚醚-9、甘油月桂酸酯、甘油單硬脂酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、月桂酸二乙醇醯胺、油酸二乙醇醯胺、硬脂酸二乙醇醯胺、鯨蠟醇、硬脂醇、油醇。
如前述，前述極性界面活性劑之SDS添加至前述生物樣品時，SDS會有對基因擴增時之DNA聚合酶抑制之虞。因此，藉由使用前述氧化鋁之方法、將鐵離子濃度提高使SDS與鐵離子形成沈澱之方法等，來從前述生物樣品除去SDS。然而，會有在SDS除去處理後，前述生物樣品中仍然殘存之情況。本發明中，含SDS生物樣品進行基因擴增時，較佳係添加不會抑制前述之核酸擴增反應的非離子性界面活性劑。藉由如此進行，前述生物樣品所含的SDS會被前述非離子性界面活性劑的微胞包住，可抑制SDS造成的基因擴增時之DNA聚合酶抑制。又，前述之機制係屬推論，本發明不因該記載而受到任何限制。本發明中，為了前述目的，例如，亦可在基因擴增時添加前述非離子性界面活性劑至前述經SDS除去處理後的生物樣品中，亦可在基因擴增時添加前述非離子性界面活性劑至前述未經SDS除去處理的生物樣品中。又，例如，可事先添加非離子性界面活性劑至核酸擴增(基因擴增)之反應液中。前述非離子性界面活性劑係以Triton(註冊商標)X-100為佳，Triton(註冊商標)X-100之添加量可依據例如前述生物樣品中之SDS濃度來適宜設定，前述生物樣品含有SDS 0.1%時，Triton(註冊商標)X-100係以在0.1~1%之範圍內被包含於前述生物樣品為佳，例如，Triton(註冊商標)X-100之濃度亦可為0.5%。
SDS可藉由添加中性的鉀鹽或氧化鋁來除去，一如前述。中性的鉀鹽可使用醋酸鉀、檸檬酸鉀、鹽酸鉀、 硫酸鉀、硝酸鉀。較佳為水溶性者，更佳為醋酸鉀。作為氧化鋁，例如氧化鋁粒子(平均粒徑1000nm以下者，較佳為平均粒徑200nm以下者，更佳為平均粒徑20~100nm以下者)。或亦可使用活性氧化鋁(和光純藥社製，分子量101.96)等。
作為前述基因擴增法，並無特限制，例如有PCR法、使用了股置換DNA聚合酶之等溫擴增法，較佳係前述等溫擴增法。作為前述等溫擴增法，例如SDA法(日本專利特公平7-114718號公報)、使用下述轉回引子(TP，turn-back primer)之擴增方法，其中，以使用TP之等溫擴增法較佳。
(轉回引子)
前述轉回引子係於3'末端部份含有雜合於目標核酸序列3'末端部份之序列(A)的序列(Ac')，且前述轉回引子係於前述序列(Ac')之5'側含有一序列(B')，該序列(B')係雜合前述目標核酸序列中，存在於前述序列(A)之5'側之序列(B)的互補序列(Bc)者。
使用TP之等溫擴增法中，亦可順向引子及反向引子兩者皆使用TP之對稱型態(TP-TP)，亦可順向引子及反向引子之一者使用TP，另一者使用其他引子(XP)之非對稱型態(TP-XP)。
作為對稱型態(TP-TP)之具體例，可舉例如LAMP法(國際公開WO2000/028082號手冊)。LAMP法是使用一對TP(TP-TP)加上一對外引子(OP-OP)之方法。OP係具有於模板序列中，於TP之5'側黏合(annealing)，將TP延伸股藉由股 置換反應剝除之機能的引子。
作為非對稱型態時的其他引子，可舉出PCR法所使用的一般引子、下述折疊引子(folding primer，FP)。於非對稱型態下，係以TP與FP之組合為佳。作為TP與FP之組合的型態，可舉出SmartAmp法(註冊商標)(國際公開WO2005/063977號手冊)。TP與FP之組合的一例顯示於第7a圖及第7b圖。TP與FP之組合再加上使用OP亦可。OP之使用亦可使用於順向引子及反向引子之至少一者。
(折疊引子)
前述折疊引子係於3'末端部份含有一序列(Cc')，該序列(Cc')雜合於目標核酸序列之互補序列的3'末端部份之序列(C)，且前述折疊引子係於前述序列(Cc')之5'側含有一轉回序列(D-Dc')，該序列(D-Dc')含有相互雜合之2個核酸序列於同一股上。
使用TP與FP之等溫擴增之機構例示如下所示。關於TP及FP之核酸擴增反應，將可能的作用機制用第7圖(第7a圖及第7b圖)來說明。又，於第7圖，為簡略化其說明，將雜合之2序列作為互相互補的序列，但本發明不因此受限制。首先，TP與目標核酸之有義股(sense strand)雜合，該引子之延伸反應啟動(第7圖(a))。接著，延伸股(-)上形成莖環構造，藉此使形成一股之目標核酸有義股上之序列(A)與新的TP雜合(第7圖(b))，該引子之延伸反應啟動，先前合成的延伸股(-)脫離。其次，已脫離的延長股(-)上的序列(C)與FP雜合(第7圖(c))，該引子之延伸反應啟動，合成延伸股 (+)(第7圖(d))。已生成之延伸股(+)的3'末端與延伸股(-)之5'末端形成莖環構造(第7圖(e))，從屬於游離型的3'末端之延伸股(+)之環先端啟動延伸反應之同時，前述延伸股(-)脫離(第7圖(f))。藉由從環先端之前述延伸反應，於延伸股(+)之3'側生成一隔著序列(A)及序列(Bc)結合了延伸股(-)之髮夾型的雙股核酸，該序列(A)及序列(Bc)與TP雜合(第7圖(g))，藉由該延伸反應生成延伸股(-)(第7圖(h)及(i))。又，藉由存在於前述髮夾型雙股核酸的3'末端之轉回序列，提供了游離型的3'末端(第7圖(h))，透過由該處之伸長反應(第7圖(i))，生成一隔著源自TP及FP之序列而交互含有延伸股(+)及延伸股(-)之單股核酸(第7圖(j))。該單股核酸藉由存在於其3'末端之轉回序列而提供游離型的3'末端(互補股合成起點)(第7圖(k))，故同樣的延伸反應會反覆進行，每一次的延伸反應會成為2倍之股長(第7圖(l)及(m))。又，第7圖(i)中已脫離之源自TP的延伸股(-)藉由存在於其3'末端之轉回序列而提供游離型的3'末端(互補股合成起點)(第7圖(n))，故藉由從該處之延伸反應，於兩端形成莖環構造，形成一隔著源自引子之序列而交互含有延伸股(+)與延伸股(-)之單股核酸(第7圖(o))。該單股核酸中亦是藉由其3'末端之環形成而依序提供互補股合成起點，由該處之延伸反應會相繼發生。如此自動地延伸之單股核酸因為源自TP及FP之序列係包含於延伸股(+)與延伸股(-)之間，故各引子可雜合並啟動延伸反應，藉此將目標核酸之有義股與反義股顯著地擴增。
RNA基因擴增時，使用反轉錄酶生成cDNA，擴增該cDNA。如此，使用反轉錄酶擴增RNA之SmartAmp法稱作RT-SmartAmp法。
本發明之預處理套組之組成並無特別限制，可舉例如20mM MES緩衝液(pH5.8)、2.5mM硫酸鐵、20mM碳酸氫鈉、0.1% SDS及20mg/ml氧化鋁(Al2O3)之組成。
硫酸鐵與碳酸氫鈉若是作為混合溶液來保存時，會迅速地形成沈澱。因此，本發明之預處理套組較佳係會分成A液及B液之2液，將硫酸鐵與碳酸氫鈉分別提供。此時，例如A液為20mM MES緩衝液(pH5.8)、40mM碳酸氫鈉、0.2% SDS之組成。B液為5mM硫酸鐵、40mg/ml氧化鋁之組成。此時，含有硫酸鐵之B液希望是遮光保存。A液及B液係以作為1：1之混合液將人類鼻腔黏膜於緩衝液在懸濁時調製為佳。
實施例
接著，將說明本發明之實施例。但本發明並不受實施例限定或限制。
[實施例1]
(混合於人類鼻腔黏膜中之模板RNA之核酸擴增)
本實施例中，顯示了來自人類鼻腔黏膜所具有的模板RNA之核酸擴增抑制活性是否能被本發明之預處理套組所抑制。作為預處理套組，調製如下組成之套組(預處理試藥)：10mM MES緩衝液(pH5.8)、2.5mM硫酸鐵、20mM碳酸氫鈉、0.1% SDS及20mg/ml活性氧化鋁(和光純藥社製， 分子量101.96)。將健康正常人的人類鼻腔黏膜懸濁於該套組，接著如下調製，將具有與病毒(流行性感冒病毒A(H1N1))相同的部份序列之模板RNA 107拷貝混合，以作為本實施例之樣品。將此樣品供給至RT-SmartAmp法，檢測RNA之存在。又，作為比較例，調製了於前述套組中除了不添加硫酸鐵及碳酸氫鈉以外皆為相同組成之物，並進行同樣的核酸擴增。該等之結果示於第1圖。如該圖所示，使用本發明之套組時，以RNA為模板之核酸擴增達成了。另一方面，在比較例中，無法核酸擴增。又，RT-SmartAmp法係如下所述來實施。
本實施例之RT-SmartAmp法係使用流行性感冒病毒A(H1N1)之HA領域595-1048鹼基為止的序列作為要擴增之模板RNA。模板RNA之調製時，首先使用於HA領域具有互補的序列之cDNA、以下之引子1(序列編號1)及引子2(序列編號2)、以及SYBR Premix Ex Taq(TAKARA BIO INC.製)實施PCR。
引子1(序列編號1)5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCCATCTACTAGTGCTGACCA-3'
引子2(序列編號2)5'-CCCTTCAATGAAACCGGCAA-3'
又，前述PCR係以95℃ 30秒、60℃ 30秒、及72℃ 30秒之3種溫度進行反應35循環後，經72℃ 3分鐘之培養而達成。以在此PCR被擴增之DNA斷片為基礎，使用CUGA7 in-vitro Transcription Kit(Nippon Gene Co.,Ltd.製)合成模板RNA。
RT-SmartAmp法係於容積25μL之液體中，於含有1.4mM dNTP、5% DMSO、20mM Tris-HCl(pH8.0)、30mM醋酸鉀、10mM硫酸鈉、8mM硫酸鎂、0.1% Tween20、12單位Aac DNA聚合酶、以及0.125單位AMV反轉錄酶作為最終濃度之溶液中，加入以下所示之序列及濃度之引子(序列編號3~7，DNAFORM社製)及激子引子(序列編號8，DNAFORM社製，參照日本專利特許第4370385號公報)以作為反應溶液。
FP引子(序列編號3，最終濃度1.82μM)5'-GCATTCGCGAAATGATAATACCAGATCC-3'
TP引子(序列編號4，最終濃度1.82μM)5'-TTCCATTGCGAATGCACATTCGAAGCAAC-3'
OP引子1(序列編號5，最終濃度0.23μM)5'-ACACTAGTAGAGCCGGGAG-3'
OP引子2(序列編號6，最終濃度0.23μM)5'-CTGGTGTTTATAGCACCCTT-3'
BP引子(序列編號7，最終濃度0.68μM)5'-ACCACTAGATTTCCAG-3'
BP激子引子(序列編號8，最終濃度0.23μM)5'-ACCACZAGATTTCCAG-3'(Z為被激子標記之胸腺嘧啶殘基)
更進一步地，加入將前述經合成之模板RNA與人 類鼻腔黏膜用預處理套組懸濁之樣品，將反應容積設為25μL後，於即時聚合酶連鎖反應(Real-time PCR)裝置MX3000p(Agilent社製)在60℃、90分鐘之一定溫度下進行反應，通過FAM濾器獲得螢光擴增曲線，藉此調查核酸擴增活性。其結果如第1圖所示，只有經本發明之預處理試藥處理後的樣品達成了已添加之模板RNA之核酸擴增。
[參考例1]
(人類鼻腔黏膜中乳鐵蛋白及溶菌酶C之存在)
如第2圖之電泳照片所示，人類鼻腔黏膜中已確認到乳鐵蛋白及溶菌酶C之存在。又，人類鼻腔黏膜中乳鐵蛋白及溶菌酶C之存在係如下確認。
用棉花棒(men-tip，日本棉棒社製)採取健康正常者的鼻腔黏膜樣品(咽頭上部黏膜)，每一根棉花棒用300μL之磷酸緩衝液(PBS)懸濁。獲得的懸濁液供給至凝膠過濾(移動相磷酸緩衝液，管柱HiLoad 16/60 Superdex200pg，GE Healthcare製)，大小區隔成四個斷片(F1~F4)。又，將同懸濁液供給至ProteinG親和性離心管柱(同仁化學製)，得到管柱結合區隔。將上述凝膠過濾區隔標本及親和性管柱結合區隔供給至使用了SuperSep Ace10-20%線性升梯式丙烯醯胺凝膠(和光純藥工業製)之SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，以silver MS stain(和光純藥工業製)進行銀染色來檢測蛋白質的條帶。關於第2圖用四方框起的條帶，使用Easy Separator(和光純藥工業製)抽出蛋白質，供給至液體層析儀/串聯質譜分析儀(SYNAPT LC/MS/MS，Waters社 製)。從所得的資料使用MASCOT程式，由質譜分析儀獲得的胜肽斷片之分子量來搜尋被推測之蛋白質。其結果，如第2圖所示鑑定出約80kDa的條帶係源自人類的乳鐵蛋白，14kDa的條帶係源自人類的溶菌酶C。
[實施例2]
(鐵離子及碳酸離子之人類乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制效果)
如第3圖所示，確認了鐵離子及碳酸離子之人類乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制效果。
本實施例中，將與前述經合成之模板RNA相同者使用作為對RNA分解活性(RNase活性)之基質。第3圖左圖係用棉花棒(men-tip，日本棉棒製)採取健康正常者的鼻腔黏膜樣品(咽頭上部黏膜)，懸濁於250μL之40mM Tris-HCl(pH7.5)。接著，於懸濁液9μL加入1.5mM氯化鐵，再加入5、10或15mM之NaHCO3調製，最終定容成為18μL。其後，將懸濁液於37℃下培養10分鐘。對於該2.5μL之懸濁液，加入10μL之50ng/μL的RNA，於25℃下培養10分鐘。反應終了後，將反應液供給至3.0% NuSieveGTG瓊脂凝膠電泳(100V，30分鐘)，以溴化乙菲錠(EtBr)染色法來檢測RNA之條帶。
第3圖右圖係將健康正常人的鼻腔黏膜樣品懸濁於250μL之40mM MES(pH7.5)後，於該懸濁液9μL加入1.5、2.0、2.5mM之Fe2(SO4)3、以及10、15、20或25mM之NaHCO3，定容成最終為18μL。此後進行與前述同樣之操 作，以瓊脂凝膠電泳檢測RNA之條帶。
[實施例3]
(鐵離子及碳酸離子之熱處理的效果)
如第4圖所示，藉由熱處理，可在短時間使鐵離子及碳酸離子之RNA分解活性抑制作用提昇。
本實施例中，將健康正常者的鼻腔黏膜樣品懸濁於250μL之20mM MES(pH5.8)、10%(w/v)Tween20，於該懸濁液10μL加入1mM之Fe2(SO4)3、以及6.7mM之NaHCO3，定容成最終為18μL。其後，於37℃下進行培養0.1或5分鐘。反應終了後，將反應液供給至3.0% NuSieveGTG瓊脂凝膠電泳(100V，30分鐘)，以溴化乙菲錠(EtBr)染色法來檢測RNA之條帶，藉此調查RNA分解活性。
[實施例4]
(鐵離子及碳酸離子造成的溶菌酶C之反轉錄抑制活性之抑制)
如第5圖所示，人類溶菌酶C之反轉錄抑制活性係可由鐵離子及碳酸離子來抑制。
本實施例中係使用與前述相同之RT-SmartAmp法來探討。RT-SmartAmp法之反應溶液25μL中加入源自人類的純化溶菌酶C(CALNIOCHEM製)使最終濃度成為10ng/ml，於反應液添加0或2.5mM之Fe2(SO4)3、以及0、5、10或20mM中任一者之NaHCO3時之核酸擴增活性係由螢光擴增曲線來比較之。
[實施例5]
(鐵離子及碳酸離子與SDS之協同效果)
如第6圖所示，於鐵離子及碳酸離子存在下，確認到在低濃度下RNA分解活性之提昇。
本實施例係將健康正常者的鼻腔黏膜樣品懸濁於250μL之40mM MES(pH5.8)後，於該懸濁液9μL加入2.5mM之Fe2(SO4)3、以及20mM之NaHCO3，進一步地添加SDS(最終濃度0、0.01、0.02、0.05或0.1%)作為極性界面活性劑或者Tween20(最終濃度0、0.01、0.02、0.05、0.1或0.5%)作為非離子性界面活性劑，定容成最終為18μL。其後，將懸濁液於37℃下培養10分鐘。對於該2.5μL之懸濁液，加入10μL之50ng/μL的RNA，於25℃下培養10分鐘。反應終了後，將反應液供給至3.0% NuSieveGTG瓊脂凝膠電泳(100V，30分鐘)，以溴化乙菲錠(EtBr)染色法來檢測RNA之條帶。
[參考例2]
(添加氧化鋁造成自預處理試藥除去SDS之影響)
如第8圖所示，藉由將氧化鋁添加至預處理試藥中，可除去本發明之預處理試藥中所含SDS，其結果，達成了模板RNA之核酸擴增。又，本參考例係僅為判斷對於SDS之核酸擴增抑制的活性，因此係於不含人類鼻腔黏膜之條件下實施。
本參考例之RT-SmartAmp法係使用流行性感冒病毒A(H3N2)之NA領域675-1075鹼基為止的序列作為要擴增之模板RNA。模板RNA之調製時，首先使用於HA領域具有互補的序列之cDNA、以下之引子3(序列編號9)及引子4 (序列編號10)、以及Prime STAR(TAKARA BIO INC.製)作為PCR之酵素來實施PCR。
引子3(序列編號9)5'-TAATACGACTCACTATAGGGCCAGGAGTCAGAATGCGTTT-3'
引子4(序列編號10)5'-GCCTTTCACTCCATGACCAC-3'
又，前述PCR係以98℃ 10秒、55℃ 5秒、及72℃ 30秒之3種溫度進行反應30循環後，經72℃ 4分鐘之培養而達成。以在此PCR被擴增之DNA斷片為基礎，使用CUGA7 in-vitro Transcription Kit(Nippon Gene Co.,Ltd.製)合成模板RNA。
RT-SmartAmp法係於含有1.4mM dNTP、5% DMSO、20mM Tris-HCl(pH8.0)、30mM醋酸鉀、10mM硫酸鈉、8mM硫酸鎂、0.1% Tween20、12單位Aac DNA聚合酶、以及0.125單位AMV反轉錄酶作為最終濃度之溶液中，加入以下所示之序列及濃度之引子(序列編號11~15，DNAFORM社製)及激子引子(序列編號16，DNAFORM社製，參照日本專利特許第4370385號公報)及前述經合成之模板RNA以作為反應溶液。
FP引子1(序列編號11，最終濃度1.82μM)5'-TTTATATATATATAAACATGTCGAGGAGTG-3'
TP引子1(序列編號12，最終濃度1.82μM)5'-CCTCGATATCCTGGTATGGGCCTATTGGA-3'
OP引子3(序列編號13，最終濃度0.23μM)5'-GCACATTGTCAGGAAGTGC-3'
OP引子4(序列編號14，最終濃度0.23μM)5'-TTTTTCTGGGTGTGTCTCC-3'
BP引子1(序列編號15，最終濃度0.68μM)5'-TGTGTCTGCAGAG-3'
BP激子引子1(序列編號16，最終濃度0.23μM)5'-TGTGZCTGCAGAG-3'(Z為被激子標記之胸腺嘧啶殘基)
作為預處理試藥，調製了於含有20mM MES緩衝液(pH5.8)、2.5mM硫酸鐵、20mM碳酸氫鈉之溶液中添加有0.1% SDS之溶液。於該預處理試藥中，添加最終濃度為1mg/ml之活性氧化鋁(和光純藥社製，分子量101.96)，以試管振盪器(Vortex Mixer)攪拌並懸濁。前述懸濁後，於具有玻璃燒結濾器之空管柱Micro Bio-spin Chromatography Column(BIO-RAD社製)裝入前述懸濁液，以1200×g、1分鐘之離心，獲得除去了吸附有SDS之氧化鋁的濾液。又，作為比較對照，於不添加氧化鋁之條件下進行與前述同樣之處理，獲得濾液。所獲得的濾液使用前述RT-SmartAmp法之反應溶液，調查核酸擴增活性之有無，藉此比較SDS之殘存活性(DNA聚合酶抑制活性)。
於前述RT-SmartAmp之反應溶液加入以前述方法進行處理之濾液5μL，調製成每一反應為25μL之溶液，於即時PCR裝置MX3000p(Agilent社製)在60℃、90分鐘之一定溫度下進行反應，通過FAM濾器獲得螢光擴增曲線， 藉此調查核酸擴增活性。藉由擴增曲線之直立的有無來評價產生核酸擴增之抑制的SDS之殘存性，結果如第8圖所示，只有添加氧化鋁之情況才能確認到達成了顯著的核酸擴增。因此，判斷出藉由氧化鋁之添加處理，可自本發明之預處理試藥中除去SDS。
[參考例3]
(超過濾濾器造成自預處理試藥除去SDS之影響)
如第9圖所示，藉由令本發明之預處理試藥中所含的鐵離子增加，促進SDS之沈澱形成，藉由施行使該沈澱通過(過濾)前述超過濾濾器之處理，可除去預處理試藥中所含之SDS，可達成模板RNA之核酸擴增。又，本參考例係僅為判斷對於SDS之核酸擴增抑制的活性，因此係於不含人類鼻腔黏膜之條件下實施。
作為預處理試藥，調製了於含有20mM MES緩衝液(pH5.8)、5mM硫酸鐵、20mM碳酸氫鈉之溶液中添加有0.1% SDS之溶液。於該預處理試藥中，鐵離子濃度係設定成相較於前述實施例1為高。將該預處理試藥以注射器使其通過MillexHV(Φ13mm、膜孔徑0.22μm、Millipore社製)，獲得濾液。將所得之濾液使用前述參考例2所示之RT-SmartAmp之反應溶液，藉由調查核酸擴增活性之有無，將SDS殘存活性(DNA聚合酶抑制活性)與前述預處理試藥不經濾器過濾而使用之情況作比較。
於前述RT-SmartAmp之反應溶液加入以前述方法進行處理之濾液5μL，調製成每一反應為25μL之溶液， 於即時PCR裝置MX3000p(Agilent社製)在60℃、90分鐘之一定溫度下進行反應，通過FAM濾器獲得螢光擴增曲線，藉此調查核酸擴增活性。藉由擴增曲線之直立的有無來評價產生核酸擴增之抑制的SDS之殘存性，結果如第9圖所示，未進行過濾之情況無法確認到核酸擴增，而通過具有0.22μm膜孔徑之超過濾濾器之情況可以確認到核酸擴增顯著地達成。因此，伴隨預處理試藥中的鐵離子濃度之增加所產生的SDS沈澱物由超過濾濾器處理來除去，藉此判斷可由本發明之預處理試藥中除去SDS。
[參考例4]
(Triton X-100造成於核酸擴增反應中之SDS的核酸擴增抑制之緩和效果)
如第10圖所示，將SDS直接添加至核酸擴增反應溶液時，會因核酸擴增反應溶液添加了非離子性界面活性劑之Triton X-100，可緩和預處理試藥中所含SDS之核酸擴增抑制。又，本參考例係僅為判斷對於SDS之核酸擴增抑制的活性，因此係將SDS單獨加入RT-SmartAmp來實施。
於前述參考例2所示RT-SmartAmp法之反應溶液添加Triton X-100使最終濃度成為0%或0.5%，接著，添加0.1% SDS之溶液5μL，調製成每一反應為25μL之反應溶液。
將該反應溶液於即時PCR裝置MX3000p(Agilent社製)在60℃、90分鐘之一定溫度下進行反應，通過FAM濾器獲得螢光擴增曲線，藉此調查核酸擴增活性。藉由擴增曲線之直立的有無來評價核酸擴增之SDS造成的抑 制效果，結果如第10圖所示，0.5% Triton X-100添加至前述反應溶液中時，確認到顯著的核酸擴增。因此，判斷核酸擴增反應液中共存有SDS時，亦可藉由Triton X-100來緩和SDS之核酸擴增抑制，模板RNA之核酸擴增可達成。
[實施例6]
(人類鼻腔黏膜所含RNA病毒之檢測)
本發明之含有鐵離子及碳酸離子的預處理試藥在加入SDS之條件下，藉由實施前述參考例2~4之步驟，如第11圖所示，人類鼻腔黏膜中所含RNA病毒可由RT-SmartAmp法來檢測。
作為預處理試藥，調製了於含有20mM MES緩衝液(pH5.8)、5mM硫酸鐵、20mM碳酸氫鈉之溶液中添加有0.1% SDS之溶液。將人類鼻腔黏膜及相當於104pfu/ml之流行性感冒病毒(H3N2)懸濁於該預處理試藥500μL。前述懸濁後，於該懸濁液進一步添加用以破壞病毒外膜之0.1% SDS後，以注射器使其通過MillexHV(Φ13mm、膜孔徑0.22μm、Millipore社製)，獲得濾液作為預處理完成樣品。又，作為比較對照，不添加破壞病毒外膜用的0.1% SDS，調製將預處理得試藥經濾器過濾之樣品。
RT-SmartAmp法係於含有1.4mM dNTP、5% DMSO、20mM Tris-HCl(pH8.0)、30mM醋酸鉀、10mM硫酸鈉、8mM硫酸鎂、0.1% Tween20、12單位Aac DNA聚合酶、以及0.125單位AMV反轉錄酶作為最終濃度之溶液中，加入Triton X-100成為0.5%，再加入前述參考例2所示之序 列及濃度之引子(序列編號11~15，DNAFORM社製)及激子引子(序列編號16，DNAFORM社製，參照日本專利特許第4370385號公報)以作為反應溶液。
於該反應溶液中添加前述之預處理完成樣品5μL，調製成每一反應為25μL之溶液，於即時PCR裝置MX3000p(Agilent社製)在60℃、90分鐘之一定溫度下進行反應，通過FAM濾器獲得螢光擴增曲線，藉此調查核酸擴增活性。結果如第11圖所示，只有預處理試藥再添加用以破壞病毒外膜之0.1% SDS之預處理完成試藥達成核酸擴增，RNA病毒之核酸擴增檢測係屬可能。
第1圖係顯示本發明之檢測方法之一例的圖表。
第2圖係顯示人類鼻腔黏膜中存在有乳鐵蛋白及溶菌酶C之電泳照片。
第3圖係顯示鐵離子及碳酸離子的乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制效果的電泳照片。
第4圖係顯示鐵離子及碳酸離子的熱處理效果之一例的電泳照片。
第5圖係顯示鐵離子及碳酸離子所造成的溶菌酶C之反轉錄抑制活性之抑制之一例的圖表。
第6圖係顯示鐵離子及碳酸離子與SDS之協同效果之一例的電泳照片。
第7a圖係顯示轉回引子(turn-back primer)及折疊引子(folding primer)所造成的核酸擴增反應之機制之一例的圖。
第7b圖係顯示轉回引子(turn-back primer)及折疊引子(folding primer)所造成的核酸擴增反應之機制之一例的圖。
第8圖係顯示添加氧化鋁所造成的SDS除去的影響之一例的圖表。
第9圖係顯示鐵離子濃度之增加及超過濾濾器造成的SDS除去的影響之一例的圖表。
第10圖係顯示Triton X-100造成的核酸擴增反應中的SDS之核酸擴增抑制之緩和效果之一例的圖表。
第11圖係顯示藉由RT-SmartAmp法能檢測人類鼻腔黏膜所含之RNA病毒之圖表。
<110> DNAFORM株式會社理研(Riken)
<120> 生物樣品之預處理方法、RNA之檢測方法及預處理套組
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Claims (23)

  1. 一種生物樣品之預處理方法，該生物樣品含有RNA，其特徵在於：前述生物樣品含有乳鐵蛋白(Lactferrin)，且對前述生物樣品實施乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制處理。
  2. 如申請專利範圍第1項之生物樣品之預處理方法，其係藉由於前述生物樣品中添加乳鐵蛋白之RNA分解活性阻害劑來對前述生物樣品實施乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制處理。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之生物樣品之預處理方法，其中前述生物樣品包含：動物之鼻腔黏膜、副鼻腔黏膜、氣管黏膜、唾液、源自口腔或咽頭之分泌液、淚液、乳汁、膽汁、血液(白血球)、子宮頸管之黏膜、內外性器之黏膜、羊水或尿液。
  4. 如申請專利範圍第3項之生物樣品之預處理方法，其中前述動物為人類。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之生物樣品之預處理方法，其中前述生物樣品含有人類鼻腔黏膜。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之生物樣品之預處理方法，其更對前述生物樣品實施溶菌酶C(Lysozyme C)之反轉錄抑制活性之抑制處理。
  7. 如申請專利範圍第6項之生物樣品之預處理方法，其係於前述生物樣品中添加溶菌酶C(Lysozyme C)之反轉錄抑制活性之抑制劑，以對前述生物樣品實施溶菌酶 C(Lysozyme C)之反轉錄抑制活性之抑制處理。
  8. 如申請專利範圍第7項之生物樣品之預處理方法，其中前述RNA分解活性抑制劑及前述反轉錄抑制活性之抑制劑中之至少一者含有鐵離子劑及碳酸離子劑。
  9. 如申請專利範圍第8項之生物樣品之預處理方法，其係對已添加前述鐵離子劑及碳酸離子劑之前述生物樣品施行加熱處理。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之生物樣品之預處理方法，其更添加極性界面活性劑至前述生物樣品中。
  11. 如申請專利範圍第10項之生物樣品之預處理方法，其中極性界面活性劑係SDS。
  12. 一種檢測方法，係生物樣品中之RNA之檢測方法，其特徵在於前述生物樣品含有乳鐵蛋白(Lactferrin)，且該檢測方法包含：預處理步驟，其係將前述生物樣品施行預處理者；及RNA擴增檢測步驟，其係藉由擴增經前述預處理之生物樣品中的前述RNA來進行檢測；並且，前述預處理步驟係藉由如申請專利範圍第1至11項中任一項之生物樣品之預處理方法來實施。
  13. 如申請專利範圍第12項之檢測方法，其中前述預處理步驟係藉由如申請專利範圍第1至9項中任一項之生物樣品之預處理方法來實施，且於前述RNA擴增檢測步驟中，更對前述經預處理之生物樣品添加界面活性劑。
  14. 如申請專利範圍第13項之檢測方法，其中前述界面活性劑係非極性界面活性劑。
  15. 如申請專利範圍第12至14項中任一項之檢測方法，其中前述RNA之擴增係以使用反轉錄酶的基因擴增方法來實施。
  16. 如申請專利範圍第15項之檢測方法，其中前述基因擴增方法係使用股置換DNA聚合酶之等溫擴增方法。
  17. 一種預處理套組，係含有RNA之生物樣品的預處理套組，其特徵在於：前述生物樣品含有乳鐵蛋白(Lactferrin)，且前述預處理套組包含乳鐵蛋白之RNA分解活性抑制劑。
  18. 如申請專利範圍第17項之預處理套組，其更包含有溶菌酶C(Lysozyme C)之反轉錄抑制活性之抑制劑。
  19. 如申請專利範圍第18項之預處理套組，其中前述RNA分解活性抑制劑及前述反轉錄抑制活性之抑制劑中之至少一者含有鐵離子劑及碳酸離子劑。
  20. 如申請專利範圍第19項之預處理套組，其中前述鐵離子劑及前述碳酸離子劑係在互不接觸的狀態下包含於該預處理套組中。
  21. 如申請專利範圍第17至20項中任一項之預處理套組，其更包含有極性界面活性劑。
  22. 如申請專利範圍第21項之預處理套組，其中前述極性界面活性劑係SDS。
  23. 如申請專利範圍第17至20項中任一項之預處理套組，其 更包含有非極性界面活性劑。
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