JP2009514551A - 病原体の多重定量検出方法 - Google Patents

病原体の多重定量検出方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、単一試料中の複数の病原体の定量検出を可能にする。本方法は、病原体特異的プライマー対の各々から別個のサイズのアンプリコンを生成するための、複数の病原体特異的プライマー対を用いた試料の増幅を含む。さらに、本方法は、病原体特異的プライマー対の各々に対応する複数の競合ポリヌクレオチド標的の使用を含む。この競合ポリヌクレオチドは、公知濃度で反応混合物に添加され、試料中の病原体量の定量化を可能にする。この方法は、個体、好ましくは免疫無防備状態の個体における病原体感染をモニターするために用いることができる。

Description

発明の分野
本発明は、試料中の2種類以上のウイルス、細菌、または原生動物の病原体を同時に定量的に試験するための方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、病原体感染を定量的に検出および/またはモニターするための、個体由来の試料における定量的な試験のための方法および組成物に関する。
関連出願の参照
本出願は、2005年11月9日に出願された米国特許仮出願第60/735,085号の優先権および恩典を主張し、その全体の内容は参照により本明細書に組み入れられる。
発明の背景
免疫不全は、放射線、化学療法、重金属または殺虫剤に晒され；または、細菌、ウイルス（HIV）、寄生生物もしくは真菌感染の結果として獲得される遺伝性の遺伝的異常（例えば、チェディアック-東症候群、重症複合型免疫不全症、慢性肉芽腫症、ディジョージ症候群）を含む多くの異なった病因論に起因し得る。
臓器移植外科手術、特に、腎臓、肝臓、心臓、肺および骨髄の移植外科手術では、外科手術後の移植拒絶の可能性を最小限にするために移植受容者の免疫系を抑制することが必要である。様々な免疫抑制療法が用いられ、この目的のために提供されている。しかしながら、免疫抑制療法は、注意深くモニターすることが必要であり、それは、免疫抑制療法が、そうでなければ正常な免疫系によって制御される細菌およびウイルスによる感染に対して受容者が特に影響を受け易くさせ得るためである。臨床診療で首尾よく用いられている免疫抑制剤には、ステロイド、アザチオプリンおよびシクロスポリンAが含まれる。他の病原菌に対抗する受容者の一定量の免疫系の保持とともに移植拒絶エピソードを予防または治療するのに必要な免疫抑制の程度の均衡を保つように試みることは臨床診療において必要である。
発明の概要
疾患の出現および/または疾患の進行をモニターするために、無症候性患者、および対象となる病原性疾患に関して免疫系が損なわれ、無症候性である個体患者における2種類以上の病原体の量を同定および測定する方法が本明細書において開示される。
一局面では、本明細書において開示されている方法は、所与の生物試料中に存在しうる2種類以上の病原体、特にウイルス性、細菌性、および原生動物の病原体、並びに真菌性病原体に特異的であり、それらから調製または単離される2つ以上の標的ポリヌクレオチド、例えば、DNAまたはRNAの存在および/または量を同定することを可能にする。
この方法は、1回の反応において2つ以上の標的核酸に対するレベル（例えば、発現レベルまたはコピー数）の決定をさらに可能にすることができ、単独でおよび多重形式で、核酸試料中の病原体特異的標的な核酸、例えばDNAまたはRNAの検出および定量化を可能にする。臨床試料中の病原体特異的標的の同定および定量化は、免疫系が損なわれている患者を詳しくモニターすることを含む無数の臨床用途を有する。
一局面では、本明細書に記載される方法は、互いに、および標的核酸のサイズが異なる既知サイズの増幅産物を生じる外因的に添加された競合核酸の様々な既知濃度を用いて生じる内部標準を用いる。例えば、キャピラリー電気泳動によるサイズ分離は、例えば、蛍光検出による検出と結びつけて、競合核酸に対応する多量の増幅産物から標準曲線を作成する。標準曲線は、最初の試料中の標的核酸濃度の決定を可能にする。
一局面では、本明細書に記載される方法は、核酸試料中の病原体特異的標的核酸、例えばDNAまたはRNAのレベルを推測するかまたは決定する方法に関し、該方法は、所与の病原体特異的標的核酸に対して、例えば、PCRまたはRT-PCRにより標的を増幅する際に既知の長さの標的アンプリコンを生じる増幅プライマー対を選択する工程を含む。少なくとも2つの競合核酸（例えば、DNAまたはRNA分子）のセットを作製し、そこでは、増幅プライマーの同じ対を用いて増幅される場合、競合物は標的核酸と比較して、異なった長さの生成物を生じるが、同じ増幅効率で生じる。増幅反応は、標的核酸レベルについて分析される試料が既知であり異なった濃度の少なくとも2つの競合核酸と混合される増幅反応が行われ、その後、増幅した生成物を分離および検出する。競合核酸のセットは、最初の試料中の標的核酸の量の決定のための内部参照を提供する。このアプローチは、1回の稼動において、1つの試料中の複数の病原体特異的標的核酸を測定するのに容易に適合し、所与の試料中の選択された病原体の標的遺伝子配列に対する増幅プロフィールを生じさせることができる。このプロフィールは、所与の試料中の病原体特異的核酸のレベルの正確な定量化を可能にする。
一局面では、本明細書に記載される方法は、症候前の免疫無防備状態の患者における選択された病原体の検出に関する。臨床症状の発症は、免疫無防備状態の患者、特に免疫抑制療法を受けている移植受容者では遅延するため、ウイルス性、細菌性および原生動物の病原体の定量検出は、治療が最も効果的となる可能性が高い免疫抑制療法剤（免疫抑制のために設計されたもの、および免疫抑制の副作用を有するもの）の投与、および抗病原体薬剤（例えば、抗ウイルス剤、抗生物質、抗真菌剤）の投与の調節によって、感染の初期段階での抗感染治療を導く1つの方法を提供する。
別の局面では、方法は、各病原体特異的標的由来のアンプリコンを生成するための核酸増幅反応において用いられるべき複数の病原体特異的標的に対して試料をスクリーニングすることによって、複数の所定の病原体のいずれかを含むことが疑われる試料を分析する方法である。この方法は、一連の病原体特異的プライマー対を選択する工程を含み、各プライマー対は、対応する病原体に特異的な核酸配列に対応し、それを標的とする。一連の病原体特異的プライマーを一緒に用いると、試料中の特定の病原体の存在とは別個のサイズのアンプリコンを生成する。アンプリコンが存在するかどうか、そうであれば、それらのサイズを決定するための増幅混合物の一部を解明することによって、アンプリコンが検出される。試料の一部は、増幅反応の全体で回収し、いつアンプリコンが最初に存在するのか、または増幅反応の終りに存在するのかを測定することができる。
更なる局面では、方法は、少なくとも1つの病原体を含むことが疑われる試料中の複数の所定の病原体を定量化する方法である。この方法には、所定の病原体の少なくとも1つを含むことが疑われる試料を得る工程が含まれる。試料は、環境（例えば、土壌、水、動物もしくはヒトの老廃物）から、または植物、動物、凍結組織バンク、もしくはヒトの供給源（例えば、病原体キャリヤーもしくは宿主）から得られる。核酸を試料から単離して、増殖反応における鋳型として用いる。病原体特異的プライマーは、試料中に存在することが疑われる複数の病原体のそれぞれに対応するように選択される。対照ポリヌクレオチド、好ましくは競合ポリヌクレオチドは、増幅反応にも含められる。この競合ポリヌクレオチドは、病原体特異的プライマーによる増幅のための鋳型であるが、試料または対照の鋳型とともに同じかまたはいずれかの他の病原体特異的プライマーを用いると、試料核酸から増幅された生成物とは別個のサイズのアンプリコンを生成する。競合ポリヌクレオチドは、特定の濃度（即ち、コピー数）で添加され、病原体特異的核酸の量（即ち、コピー数）の測定が可能となる。試料中の病原体の量は、本方法の検出限界を下回るか全くなくてもよい。
一局面では、この方法は、所定の複数の病原体のいずれかに対する同じ供給源由来の一連の試料をモニターする工程を含む。該方法は、規則的な間隔（例えば、週に約1回、月に約1回、年に約4回）で供給源から試料を得る工程、および競合ポリヌクレオチドとともに増幅方法を用いて試料中の複数の病原体の量を定量化する工程を含む。供給源は、感染にも関わらず、頻繁に無症候性となる免疫無防備状態の個体であり得る。規則的な間隔で複数の病原体の量を定量化することによって、病原体を無症候性の個体で検出することができ、例えば、個体の免疫抑制をもたらす組成物の投与、または病原体感染を改善および/または処置する治療薬の投与の修正など、適切な測定を行うことができる。
定義
本明細書において、「から調製されるかまたは単離される」という用語は、病原体「から調製されるかまたは単離される」核酸に関連して用いられる場合、ウイルスまたは他の病原体から単離した核酸、および例えば鋳型としてウイルス核酸を用いる逆転写またはDNA重合のプロセスによって、ウイルスからコピーされる核酸の両方を指す。病原体の核酸は、宿主の核酸と連結して試料から単離することができる。
本明細書において、「病原体」という用語は、微生物を含む生物を指し、それは、別の生物（例えば、動物および植物）において、他の生物を直接感染させることによって、または別の生物（例えば、病原性毒素などを産生する細菌など）に疾患を引き起こす作用物質を産生させることによって、疾患を引き起こす。本明細書において、病原体には、以下に限定されないが、細菌、原生動物、真菌、線虫、ウイロイドおよびウイルス、またはそれらのいずれかの組合せが含まれ、各病原体は、別の病原体と協力してまたは単独で、限定されないが哺乳動物を含み、限定されないがヒトを含む脊椎動物において、疾患を誘発することができる。本明細書において、「病原体」という用語は、免疫無防備状態ではない宿主において通常は病原性でなくてもよい微生物も包含する。ウイルス病原体の特定の非制限的な例には、HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、C型肝炎、B型肝炎、アデノウイルス、EEEV、WNE、JCV、およびBKVが含まれる。
本明細書において、「微生物」という用語には、古細菌（Archaea）、細菌（Bacteria）および真核生物（Eucarya）のドメイン由来の原核生物および真核生物の微生物種が含まれ、後者には、酵母および糸状菌、原生動物、藻類、またはより高等な原生生物が含まれる。用語「微生物細胞」および「微生物（microbe）」は、用語「微生物（microorganism）」と交互に用いられる。
「細菌」、または「真正細菌」とは、原核生物のドメインを指す。細菌には、下記の通り、少なくとも11個の別個の群が含まれる。（1）2つの主要な下位区分があるグラム陽性菌（グラム+）：（i）高G+C群（放線菌類（Actinomycetes）、マイコバクテリア（Mycobacteria）、ミクロコッカス（Micrococcus）、その他）（ii）低G+C群（バチルス（Bacillus）、クロストリジア（Clostridia）、乳酸菌（Lactobacillus）、ブドウ球菌（Staphylococci）、連鎖球菌（Steptococci）、マイコプラズマ（Mycoplasmas)；（2）プロテオバクテリア（Proteobacteria）、例えば、ムラサキ光合成＋非光合成グラム陰性菌（最も「一般的な」グラム陰性菌を含む)；（3）シアノバクテリア（Cyanobacteria）、例えば、酸素発生型光合成生物；（4）スピロヘータおよび関連した種；（5）プランクトミセス（Planctomyces)；（6）バクテロイデス（Bacteroides）、フラボバクテリア（Flavobacteria)；（7）クラミジア（Chlamydia)；（8）緑色硫黄細菌；（9）緑色非硫黄細菌（嫌気性光合成生物も)；（10）放射線耐性球菌および関連菌；（11）サーモトガ（Thermotoga）およびサーモシホ（Thermosipho）好熱菌（thermophiles）。
「グラム陰性菌」には、球菌（cocci）、非腸溶性ロッド（nonenteric rod）および腸溶性ロッド（enteric rod）を含む。グラム陰性菌の属には、例えば、ナイセリア（Neisseria）、螺旋菌（Spirillum）、パスツレラ（Pasteurella）、ブルセラ（Brucella）、エルシニア（Yersinia）、フランシセラ（Francisella）、ヘモフィルス（Haemophilus）、ボルデテラ（Bordetella）、大腸菌（Escherichia）、サルモネラ（Salmonella）、シゲラ（Shigella）、クレブシエラ（Klebsiella）、プロテウス（Proteus）、ビブリオ（Vibrio）、シュードモナス（Pseudomonas）、バクテロイデス（Bacteroides）、アセトバクター（Acetobacter）、アエロバクター（Aerobacter）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アゾトバクター（Azotobacter）、スピリラ（Spirilla）、セラチア（Serratia）、ビブリオ（Vibrio）、リゾビウム（Rhizobium）、クラミジア（Chlamydia）、リケッチア（Rickettsia）、トレポネーマ（Treponema）、およびフゾバクテリウム（Fusobacterium）が含まれる。
「グラム陽性菌」とは、球菌、胞子形成をしないロッドおよび胞子形成をするロッドが含まれる。グラム陽性細菌の属には、たとえば、放線菌（Actinomyces）、バチルス、クロストリジウム（Clostridium）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、エリジペロスリックス（Erysipelothrix）、乳酸菌（Lactobacillus）、リステリア（Listeria）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ミクソコッカス（Myxococcus）、ノカルディア（Nocardia）、ブドウ球菌（Staphylococcus）、連鎖球菌（Streptococcus）、およびストレプトマイセス（Streptomyces）が含まれる。
本明細書において、「検出」という用語は、試料中の微生物の存在または非存在の定量的な測定を指す。「検出」という用語には、微生物の「同定」、即ち、当技術分野において承認された分類学に従って、および本明細書において記載されるように、微生物の属、種、または菌株を決定することも含まれる。さらに、「検出」という用語は、試料中の微生物の定量化、例えば、試料のマイクロリットル（またはミリリットルもしくはリットル）または（マイクログラム（またはミリグラムもしくはグラムもしくはキログラム）中の微生物のコピー数を含む。
本明細書において、「免疫無防備状態の患者または個体」という用語は、その個体の免疫系が最適処理能力で作用していないため、感染症を発症する危険にある個体を指す。一局面では、個体は、例えば、炎症を妨げるかまたは移植の拒絶を妨げるために、設計された治療計画により免疫無防備状態となる。
本明細書において、「試料」という用語は、その自然環境から単離され、ポリヌクレオチドを含む生物学的材料を指す。本明細書に記載される方法に係る試料は、精製または単離されたポリヌクレオチドからなっていてもよく、あるいは、組織試料、体液試料、またはポリヌクレオチドを含む細胞試料などの生物試料を含んでもよい。体液には、以下に限定されないが、例えば血液、血漿、唾液、尿、脳脊髄液、洗浄液、および白血球分析法試料が含まれる。試料は、特定の病原体に関連した疾患の発生が起こった場所の病原体の存在を検出するための土壌、水、または動物もしくはヒトの老廃物などの環境試料であってもよい。試料は、組織バンクもしくは保存試料の分析用の他の供給源から得られてもよく、または移植前の組織を試験するために得られてもよい。本明細書に記載される方法に有用な試料は、任意の植物、動物、ポリヌクレオチドを含む細菌もしくはウイルス材料、またはそれらから由来する任意の材料であり得る。
試料は、数多くの理由のいずれかで、「複数の所定の病原体の少なくとも1つを含むことが疑われる」。例えば、土壌試料は、土壌試料が回収された場所の近くで生存しているヒトまたは動物が土壌病原体と関連した状態または疾患の症状を示すとすれば、病原体を含むことが疑われうる。あるいは、免疫抑制された個体または他には感染に感受性である個体は、感染の明確な徴候を示すことなく、病原体の宿主または担体であることが疑われる場合がある。このような個体から採取した試料は、感染でなくても、複数の病原体の少なくとも1つを含むことが疑われることもある。
本明細書において、「アンプリコン」という用語は、核酸の増幅反応由来の増幅産物を指す。この用語は、一般的には、所与の増幅プライマーのセットを用いて生じる、予測された既知サイズの特定の増幅産物を指す。
本明細書において、「逆転写」という用語は、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性によって生じるRNA鎖のDNA相補体を指す。
本明細書において、「競合ポリヌクレオチド」または「核酸競合物」という用語は、標的核酸の増幅のために選択される一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる既知の長さおよび組成である核酸鋳型を指す。ある種の態様では、競合核酸は、RNA分子であってもよく、その場合において、「競合RNA」または「RNA競合物」と呼ばれ得る。他の態様では、競合核酸は、DNA分子であってもよく、その場合において、「競合DNA」または「DNA競合物」と呼ばれ得る。「競合核酸」（DNAまたはRNA）は、例えば、既知であり、区別可能な長さ、例えば標的核酸における内部挿入または欠失の長さによって、それぞれ、標的核酸から生成されるアンプリコンよりも長いかまたは短いアンプリコンを生成する。内部挿入または欠失は、1〜20個のヌクレオチドまたは塩基、好ましくは5〜20個のヌクレオチドまたは塩基、あるいは5〜10個のヌクレオチドまたは塩基とすべきである。標的アンプリコンと競合アンプリコンの長さの相違は、長さにして1〜20個のヌクレオチド、好ましくは長さにして5〜20または5〜10個のヌクレオチドである。挿入される配列は、好ましくは、標的配列には存在しない安定な二次構造のための能力を導入しない。核酸の二次構造を予測するためのソフトウェアは、当技術分野において周知である。「競合ポリヌクレオチド」は、増幅プライマーの選択された対を用いる場合、標的核酸と同じ増幅効率を有する。
本明細書において、核酸増幅に適用される場合の「類似の効率」なる用語は、同じセットのプライマーおよび等量の標的および競合鋳型を用いて生じる標的および競合の核酸増幅産物を検出するための閾値サイクル（Ct）が同じであることを意味する。サイクルの一部に対するCtを算出することは可能である。しかしながら、1つのアンプリコンに対するCtは、全サイクル数が同じである場合、別のアンプリコンに対するCtと「同じ」であり、即ち、2.0、2.3および2.6のCtは、この用語が本明細書において使用されるのと「同じ」である。本明細書において、「Ct」は、PCR産物のシグナル強度が増幅産物に対するシグナル強度のバックグラウンド値の10の標準偏差の閾値に達するPCRサイクルである。この状況でのシグナル強度は、（標識したプライマーまたは標識したヌクレオチドのいずれかの取り込みによって）蛍光標識を取り込んでいる増幅産物由来の蛍光シグナルを指し、複数のサイクルポイントでのサイクリング反応から回収した試料中に存在する増幅産物のキャピラリー電気泳動の後に測定される。増幅効率の別の測定は、連続サイクルでの増幅産物の量を（例えば、蛍光強度または標識の取り込みによって）測定することであり、効率は、式E = (Pn+1-Pn)/(Pn-Pn-1)を用いて計算され、式中、Pは、サイクルnでの増幅産物の量である。増幅効率は、標的と競合核酸との間での効率における相違が絶対値で0.2未満であれば「類似」である。
本明細書に記載される方法では、標的および競合核酸の増幅の効率がこれらの基準のいずれか、好ましくはその両方によって「類似」であれば、効率は「類似」である。
「増幅を仲介することができる」プライマー対は、標的に特異的であるプライマー対として理解され、適切な融解温度を有し、過度の二次構造を含まない。増幅を媒介することができるプライマー対を設計するためのガイドラインは、本明細書において提供されている。
「増幅を促進する条件」は、本明細書において、増幅に用いられる酵素に関する製造業者によって提供される増幅するための条件である。酵素は、様々な条件（例えば、イオン濃度、温度、酵素濃度）で作用しうることが理解される。複数の温度が増幅に（例えば、PCRにおいて）要求されてもよいことも理解される。増幅を促進する条件は、反応中の全てのプライマーおよび標的に対して同一である必要はなく、反応は、増幅がまだ可能である場合の準最適条件下で行われてもよい。
本明細書において、「アリコート」という用語は、増幅反応混合物から採取した試料容量を指す。アリコートの容量は変化し得るが、一般的には、所与の実験進行内で一定である。アリコートは、全反応混合物の容量未満である。増幅計画中に回収されるべきX個のアリコートが存在する場合、アリコートの容量は、1/X倍の反応容量以下である。
本明細書において、「分注する」という用語は、分注、転移、回収、押出しまたは移動を意味する。
本明細書において、「複数の段階での反応混合物からアリコートを分注する」という句は、増幅反応中に少なくとも2回、好ましくは少なくとも3回、4回、5回、10回、15回、20回、30回またはそれ以上、アリコートを回収することを指す。「段階」とは、所与のサイクル数での時点またはその後の時点を指すか、あるいは増幅計画がサイクルでない場合には、反応の開始時または開始後の選択された時間を指す。
本明細書において、試料中の核酸「を分離すること」または「の分離」は、核酸断片がサイズによって分離されるプロセスを指す。分離する方法は、10個以下のヌクレオチド（または、選択的に、10以下の塩基対、例えば、非変性条件が採用される場合）によってサイズが異なる核酸断片を分離すること（resolving）ができる。本明細書に記載される方法において採用される分離技術の分離のための好ましい分離度（resolution）には、5個のヌクレオチド以下（あるいは、5以下の塩基対）の異なる核酸の分離度が含まれ、最高では、たった1つのヌクレオチド（または1塩基対）の異なる核酸の分離度が含まれる。
本明細書において、「キャピラリー電気泳動によって区別され得るサイズ」とは、少なくとも1個のヌクレオチド（または塩基対）の相違を意味するが、好ましくは少なくとも5個以上のヌクレオチド（または塩基対）、10個のヌクレオチド（または塩基対）以上である。本明細書で使用するとき、ポリヌクレオチドの長さに関して用いる場合の「とは区別される」なる用語は、キャピラリー電気泳動によって、ポリヌクレオチドの長さが別のポリヌクレオチドの長さとは区別され得ることを意味する。
本明細書において、「増幅された生成物」という用語は、増幅反応中に生成された特定のポリヌクレオチドのコピーであるポリヌクレオチドを指す。本発明に従って、「増幅された生成物」は、DNAまたはRNAであってもよく、二本鎖または一本鎖であってもよい。増幅された産物は、本明細書において「アンプリコン」も指す。
本明細書において、「増幅」または「増幅反応」という用語は、特定のポリヌクレオチド配列のコピーを生成させるか、または特定のポリヌクレオチド配列のコピー数もしくは量を増加させるための反応を指す。例えば、ポリヌクレオチド増幅は、初期に存在していたものより多い量で、任意の特定のポリヌクレオチド配列、即ち、標的ポリヌクレオチド配列の全部または一部分を生成するためのポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドプライマー対を用いるプロセスであり得る。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のインビトロ法によって達成することができる。概して、それぞれが参照により全体として組み入れられる、PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification（H.A. Erlich, Ed.）Freeman Press, NY, NY（1992)；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Eds.) Academic Press, San Diego, CA（1990)；Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19：4967（1991)；Eckert et al., PCR Methods and Applications 1：17（1991)；PCR（McPherson et al. Ed.), IRL Press, Oxford；並びに米国特許第4,683,202号および同第4,683,195号を参照されたい。他の増幅方法には、以下に限定されないが、（a）リガーゼ連鎖反応（LCR）（Wu and Wallace, Genomics 4：560（1989）およびLandegren et al., Science 241：1077（1988）を参照されたい)；（b）転写増幅（Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：1173（1989))；（c）自立配列複製（Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87：1874（1990))；および（d）核酸を基礎とした配列増幅（NABSA）（Sooknanan, R.およびMalek, L., Bio Technology 13：563-65（1995）を参照されたい）が含まれ、それぞれが参照により全体として組み入れられる。
本明細書において、「標的ポリヌクレオチド」（例えば、標的RNAまたは標的DNAを含む）は、分析されるべきポリヌクレオチドである。標的ポリヌクレオチドは、本発明の方法を用いて分析される前に単離されるかまたは増幅されてもよい。例えば、標的ポリヌクレオチドは、増幅するために用いられる一対のオリゴヌクレオチドプライマーの2つメンバーのハイブリダイゼーション領域間にある配列であり得る。標的ポリヌクレオチドは、RNAまたはDNA（例えば、cDNAを含む）であり得る。標的ポリヌクレオチド配列は、一般的に、より大きな「鋳型」配列の一部として存在する；しかしながら、ある場合には、標的配列および鋳型は同じである。
本明細書において、「病原体特異的標的ポリヌクレオチド」は、上記で定義される標的ポリヌクレオチドであり、標的ポリヌクレオチドは、関心対象の病原体から調製または単離されるものであり、分析される異なる病原体の群のたった1つのメンバーに存在するものである。
本明細書において、「オリゴヌクレオチドプライマー」とは、ポリヌクレオチド鋳型にアニーリングすることができ、ポリヌクレオチド鋳型に相補的である伸長生成物を生成するための3'末端を提供することができるポリヌクレオチド分子（即ち、DNAまたはRNA）を指す。開始および伸長の条件は、通常、適切なバッファー（「バッファー」には、共同因子であるか、またはpH、イオン強度などに影響を及ぼす置換体を含む）中で、適切な温度で、4つの異なったデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dNTP）およびDNAポリメラーゼまたは逆転写酵素活性などの重合誘導剤の存在を含む。本明細書において記載されるプライマーは、一本鎖または二本鎖であってもよい。プライマーは、好ましくは、増幅の最大効率のためには一本鎖である。本明細書に記載される方法に有用な「プライマー」は、長さにして100ヌクレオチド以下、例えば、90以下、または80以下、または70以下、または60以下、または50以下、または40以下、または30以下、または20以下、または15以下であるが、好ましくは10ヌクレオチドを超える長さである。
本明細書において、「標識」または「検出可能な標識」とは、検出可能な（好ましくは定量可能な）シグナルを提供するために用いることができる任意の部分または分子を指す。「標識したヌクレオチド」（例えば、dNTP）、または「標識したポリヌクレオチド」は、検出可能な標識に連結したものである。「連結した」という用語には、例えば、水素結合、イオン結合、またはファン・デル・ワールス結合による共有結合および非共有結合が包含される。このような結合は、少なくとも2つの同一であるかまたは異なった原子またはイオン間に形成され、それは、それらの原子またはイオンの電子密度が再分布した結果である。標識は、蛍光、放射線、比色分析、重量測定、X線回折または吸収、磁性、酵素活性、質量分析、結合親和性、ハイブリダイゼーション 高周波、ナノ結晶などによって検出可能なシグナルを提供することができる。本明細書に記載される方法に有用なヌクレオチドは、増幅産物が標識したヌクレオチドを取り込むことができかつ検出可能になり得るように、標識することができる。蛍光色素は、本発明に従った好ましい標識である。適した蛍光染料には、蛍光色素、例えばCy5、Cy3、ローダミンおよび誘導体（例えばテキサスレッド）、フルオレセインおよび誘導体（例えば5-ブロモメチルフルオレセイン）、ルシファー・イエロー、IAEDANS、7-Me2N-クマリン-4-アセテート、7-OH-4-CH3-クマリン-3-アセテート、7-NH2-4-CH3-クマリン-3-アセテート（AMCA）、モノブロモビマン、ピレントリスルホネート、例えばカスケード・ブルー、およびモノブロモリメチル-アンモニオビマン（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、DeLuca, Immunofluorescence Analysis, in Antibody As a Tool, Marchalonis, et al., eds., John Wiley & Sons, Ltd.,（1982）を参照されたい）が含まれる。
「標識したヌクレオチド」という用語には、本明細書において、例えば、それぞれが、全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,268,132号および同第5,763,167号、Hawkins et al.,（1995, Nucleic Acids Research, 23：2872-2880）、Seela et al.,（2000, Helvetica Chimica Acta, 83：910-927）、（Wierzchowski et al.,（1996, Biochimica et Biophysica Acta, 1290：9-17）、Virta et al.,（2003, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 22：85-98）に記載される固有の蛍光の合成または生化学的に誘導したヌクレオチドアナログが包含される。「固有の蛍光」とは、ヌクレオチドアナログが、スペクトル的に独特であり、物理学的な条件下で選択的な励起および発光に対してそれらの能力において、通常存在している従来のヌクレオシドとは区別されることを意味する。固有の蛍光ヌクレオチドに関して、蛍光は、典型的には、可視波長を通して紫外近傍での波長で発生する。好ましくは、蛍光は、250nm〜700nmの間の波長で発生し、最も好ましくは250nm〜500nmの間の可視波長で発生する。
「検出可能な標識」または「標識」という用語は、それ自体によるかまたは別の標識との相互作用を通じて、検出可能なシグナルを生じることができる分子または部分を含む。「標識」は、シグナル生成システムのメンバーであってもよく、したがって、シグナル生成システムの他のメンバー、例えば、ビオチン-アビジンシグナル生成システム、または蛍光共鳴エネルギー伝達（FRET）に関するドナー-アクセプター対（Stryer et al., 1978, Ann. Rev. Biochem., 47：819；Selvin, 1995, Methods Enzymol., 246：300）、または核酸（DNAもしくはRNA分子）への結合に応じて検出可能なシグナルを生成する核酸結合色素との関連で、検出可能なシグナルを生成することができる。
「ヌクレオチド」または「核酸」という用語は、本明細書において、ヌクレオシドのリン酸エステル、例えば、モノ、ジ、トリ、およびテトラリン酸エステルを指し、エステル化の最も共通した部位は、ペントースのC-5位（またはペントースでない「糖部分」の同等な位置）に結合したヒドロキシル基である。「ヌクレオチド」という用語には、従来のヌクレオチドと従来でないヌクレオチドの両方が含まれ、以下に限定されないが、ホスホロチオエート、亜リン酸塩、環原子修飾誘導体など、例えば、固有の蛍光ヌクレオチドが含まれる。
本明細書において、「従来のヌクレオチド」という用語は、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP、およびdITPを含む「天然の」デオキシヌクレオチド（dNTP）の1つを指す。
本明細書において、「従来にないヌクレオチド」という用語は、非天然のヌクレオチドであるヌクレオチドを指す。「天然の」という用語は、ヒトの介入がなく自然に存在するヌクレオチドを指す。対照的に、「従来にないヌクレオチド」という用語は、ヒトの介入によってのみ存在するヌクレオチドを指す。「従来にないヌクレオチド」には、ペントース糖および/または一つまたは複数のリン酸エステルがそれぞれのアナログと置換されるヌクレオチドが含まれてもよい。例示的なペントース糖アナログは、ヌクレオシドアナログと併せて前述したものである。例示的なリン酸エステルアナログには、以下に限定されないが、アルキルホスホネート、メチルホスホネート 、ホスホルアミデート、ホスホロトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニーロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェートなどが含まれ、存在するならば、任意の関連する対イオンが含まれる。従来にないヌクレオチドは、従来のヌクレオチドに対して、別の人工的なヌクレオチドとの優先的な塩基対を示し得る（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ohtsuki et al. 2001, Proc. Ntal. Acad. Sci., 98：4922-4925に記載される）。塩基対の能力は、Ohtsukiら（前記）において記載されるように、T7転写アッセイによって測定することができる。「人工ヌクレオチド」の他の非制限的な例は、全てが参照により本明細書に組み入れられる、Lutz et al.（1998）Bioorg. Med. Chem. Lett., 8：1149-1152；Voegel and Benner（1996）Helv. Chim. Acta 76, 1863-1880；Horlacher et al.（1995）Proc. Natl. Acad. Sci., 92：6329-6333；Switzer et al.（1993), Biochemistry 32：10489-10496；Tor and Dervan（1993）J. Am. Chem. Soc. 115：4461-4467；Piccirilli et al.（1991）Biochemistry 30：10350-10356；Switzer et al.（1989）J. Am. Chem. Soc. 111：8322-8323に見出すことができる。「従来にないヌクレオチド」は、変性したヌクレオチドまたは固有の蛍光性ヌクレオチドであってもよい。
本明細書において、「変性したヌクレオチド」という用語は、dA、dG、dC、およびdTのいずれかであってよく；または、dA、dG、dC、およびdTの少なくとも2つの塩基と塩基対をなすことができうるヌクレオチドを示す。dA、dG、dC、およびdTの少なくとも2つの塩基と塩基対をなす変性したヌクレオチドの非制限的な例には、イノシン、5-ニトロピロール（nitropyrole）、5-ニトロインドール、ヒポキサンチン、6H,8H,4-ジヒドロピリミド[4,5c][1,2]オキサシン-7-オン（P）、2-アミノ-6-メトキシアミノプリン、dPTPおよび8-オキソ-dGTPが含まれる。
本明細書において、「逆配向」という用語は、プライマーに言及する場合、1つのプライマーが標的ポリヌクレオチド鋳型のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含み、別のプライマーが同じ標的ポリヌクレオチド鋳型のアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むことを意味する。逆配向のプライマーは、それらが相補的となる適合したポリヌクレオチド鋳型からPCR増幅産物を生じさせることができる。逆配向の2つのプライマーは、リバースプライマーおよびフォワードプライマーと呼ばれることがある。
本明細書において、「同配向」という用語は、プライマーが標的ポリヌクレオチド鋳型の同じ鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むことを意味する。同配向のプライマーは、それらが相補的となる適合したポリヌクレオチド鋳型からPCR増幅産物を生じさせない。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、一般的に、未修飾RNAもしくはDNAまたは修飾RNAもしくはDNAであってもよい、いずれかのポリリボヌクレオチドまたはポリ-デオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」には、以下に限定されないが、一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドが含まれる。本明細書において、「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチドの化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態、並びにウイルス、および、例えば単純細胞と複雑細胞を含む細胞に典型的なDNAおよびRNAの化学的形態を包含する。本発明に有用なポリヌクレオチドは、単離されたまたは精製されたポリヌクレオチドであってもよく、または増幅反応中に増幅したポリヌクレオチドであってもよい。
本明細書において、「セット」という用語は、少なくとも2つの群を指す。したがって、オリゴヌクレオチドプライマーの「セット」は、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。一局面では、オリゴヌクレオチドプライマーの「セット」は、複数の標的病原体の各メンバーから核酸アンプリコンを特異的に増幅するのに十分な一群のプライマーを指す。一般的に、該複数の各メンバーに対する一対のオリゴヌクレオチドプライマーが存在する（これらのプライマー対は、ある局面では、一つまたは複数の競合鋳型または内部標準鋳型を増幅するためにも用いられる）。
本明細書において、「対」という用語は2つを指す。したがって、オリゴヌクレオチドプライマーの「対」は、2つのオリゴヌクレオチドプライマーである。オリゴヌクレオチドプライマーの「対」は、二本鎖鋳型（例えば、ゲノムDNAまたはcDNA）から伸長した生成物を産生するために用いられるとき、オリゴヌクレオチドプライマーの対は、二本鎖鋳型の別々の鎖にハイブリダイズする、即ち、それらは逆配向を有することが好ましい。
本明細書において、「単離された」または「精製された」とは、ポリヌクレオチドに言及して用いられる場合、天然の配列がその正常な細胞環境から取り出されたかまたは非天然環境で合成される（例えば、人工的に合成される）ことを意味する。したがって、「単離された」または「精製された」配列は、細胞を含まない溶液中にあるかまたは異なった細胞環境に置かれてもよい。「精製された」という用語は、配列が、存在する唯一のヌクレオチドであることを暗に意味するのではなく、それに自然に結合した非ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド材料が本質的にない（約90〜95％、最大99〜100％純粋である）ことを意味する。
本明細書において、「cDNA」という用語は、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性（例えば、逆転写）の作用によって、RNA鋳型から生成した相補的またはコピーのポリヌクレオチドを指す。
本明細書において、「相補的」とは、逆平行のポリヌクレオチド一本鎖のヌクレオチド（それは任意の対になっていないヌクレオチドによって妨げられない）間で隣接して塩基対をなすことによって逆平行のポリヌクレオチド鎖（またはその部分）にハイブリダイズするポリヌクレオチド（またはその部分）の一本鎖の能力を指し、それによって、相補鎖間での二本鎖ポリヌクレオチドが形成される。第一ポリヌクレオチドは、第一ポリヌクレオチドの各々のおよび全てのヌクレオチドが第二ポリヌクレオチドの相補領域内でヌクレオチドと塩基対を形成する場合、第二ポリヌクレオチド鎖に「完全に相補的」であると言われる。第一ポリヌクレオチドは、第一ポリヌクレオチドの1つのヌクレオチドが第二ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドと塩基対をなさない場合、第二ポリヌクレオチドに完全には相補的ではない（即ち、部分的に相補的である）。ポリヌクレオチド鎖間の相補性の程度は、ポリヌクレオチド鎖間のアニーリングまたはハイブリダイゼーションの効率および強度に有意に影響を与える。これは、ポリヌクレオチド鎖間の結合に依存する増幅反応において特に重要である。
オリゴヌクレオチドプライマーは、プライマーの少なくとも50％（好ましくは、60％、より好ましくは70％、80％、さらにより好ましくは90％またはそれ以上）のヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドのヌクレオチドと塩基対を形成する場合、標的ポリヌクレオチドに「相補的」である。
本明細書において、「分析する」という用語は、増幅反応との関連で用いる場合、標識によって生じるシグナルの大きさ（強さ）および数に基づいて視覚的または自動化された評価であってもよい標的ポリヌクレオチドの定性的（即ち、存在もしくは非存在、サイズ検出、または同一性など）または定量的（即ち、量）測定を指す。ポリヌクレオチドの「量」（例えば、ug、umolまたはコピー数）は、例えば、Basic Methods in Molecular Biology,（1986, Davis et al., Elsevier, NY)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology（1997, Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc.）に記載される、当技術分野において周知な方法によって（例えば、UV吸収または蛍光強度によって、既知の長さおよび量を参照にして、ゲル上でのバンド強度を比較することによって）測定され得る。本発明におけるポリヌクレオチドの量を測定する1つの方法は、このようなポリヌクレオチドによって発光される蛍光強度を測定し、参照ポリヌクレオチド、即ち、既知量を有するポリヌクレオチドによって発光される蛍光強度とそれとを比較することである。
本明細書において、「癌治療法」とは、癌の重症度を減少させるか、または少なくとも部分的には癌を除去することを目的とした任意の療法を指す。あるいは、「癌治療法」は、癌の転移を減少させるか、または少なくとも部分的には癌の転移を排除することを目的とした任意の療法を意味する。更なる代替として、癌治療法は、（例えば、原発腫瘍の外科的除去後）転移性小結節の増殖を減少させるかまたは少なくとも部分的には排除することを目的とした任意の療法を指す。別の言葉で言うと、癌治療法は、被験体における癌の可能性もしくは蓋然性を遅くさせ、調節し、減少させ、または癌の発病を遅延させることを目的とした任意の治療を指す。
本明細書において、「癌」という用語は、当技術分野において理解された意味、例えば、生体の遠位部位に広がる（即ち、転移する）可能性のある組織および/または細胞の制御されていない増殖を有する。例示的な癌には、以下に限定されないが、白血病、リンパ腫、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、メラノーマなどが含まれる。
本明細書において、「移植片」という用語は、1つの個体から別の個体へ移植される生体部分、臓器、組織、細胞、またはそれらの部分を指す。移植片は、例えば、異種の、同種異系の、遺伝子改変により合成された、または遺伝子改変による自己の移植片であり得る。
本明細書において、「キャピラリー電気泳動」という用語は、増幅反応由来のアリコート中の核酸分子の電気泳動的分離を意味し、分離がキャピラリー管中で行われる。約10〜300umの内径を有するキャピラリー管が利用可能であり、約0.2cm〜約3mの長さに及び得るが、好ましくは0.5cm〜20cmの範囲、より好ましくは0.5cm〜10cmの範囲である。さらに、マイクロ流体用マイクロキャピラリー（例えば、CaliperまたはAgilent Technologiesから利用可能）の使用は、具体的には、「キャピラリー電気泳動」の意味に包含される。
本明細書において、「免疫抑制剤」とは、病原体に対する効果的な応答を開始する免疫系の能力を減少させる薬剤を意味する。例えば、適切な服用量で投与されると、胸腺またはリンパ節T細胞の不活性化をもたらす薬物である。このような薬剤の非制限的な例は、コルチコステロイド、シクロスポリン、FK-506、およびラパマイシンである。
本明細書において、「無症候性」という用語は、所与の病原体、または所与の病原体の組み合わせによる感染に特徴的な身体的症候を示さない個体を指す。
本明細書において、「複数の」または「セットの」とは、2より多く、例えば、3またはそれ以上、4またはそれ以上、5またはそれ以上、6またはそれ以上、7またはそれ以上、8またはそれ以上、9またはそれ以上、10またはそれ以上などを指す。
詳細な説明
ゲノミクスの到来により、病原体を含む微生物は、現在、微生物特異的な遺伝子または転写物の存在に基づいて同定され得る。転写レベルおよびタンパク質レベル両方での発現パターンは、病原性の追加の洞察および潜在的な診断ツールをもたらしてきた。
本明細書に記載される方法は、臨床試料において検出されるべき各特異的な病原体のゲノムの病原体転写物または特定の領域のいずれかを増幅するためのプライマーとして作用する、検出されるべき各病原体に特異的なオリゴヌクレオチドのセットを用いて、多重型の病原体感染の診断および定量化のための正確な、感度のある、同時方法に方向付けられる。病原体は、ウイルス、細菌、原生動物、および真菌からなる群より選択される。あるいは、病原体は、ウイルス、細菌、および原生動物からなる群より選択される。あるいは、病原体は、ウイルス、および細菌からなる群より選択される。
本明細書に記載される方法は、臨床試料において検出されるべき各々特異的なウイルスのゲノムのウイルス転写物または特定の領域のいずれかを増幅するためのプライマーとして作用する、検出されるべき各ウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドのセットを用いて、多重型のウイルス感染の診断および定量化のための正確な、感度のある、同時方法に方向付けられる。
本明細書に記載される方法は、任意の個体由来の試料中の病原体の検出に適用されてもよい。しかしながら、免疫機能の低下は、宿主を、ウイルス性病原体を含む病原体由来の重大であり命に関わる病気に罹りやすくさせ得る免疫無防備状態に導くため、個体の健康に有害であり得るウイルス性病原体を含む病原体の存在に関して、免疫無防備状態である個体またはそうであると疑われる個体をモニターすることは有益である。患者、特に免疫抑制された患者由来の試料中におけるウイルス性病原体を含む病原体の早期検出は、例えば、患者に投与される任意の免疫抑制剤の服用量を変更することを含む、予防治療に対する機会を提供する。
通常、感染病を引き起こす病原体に対する診断試験は、一つまたは複数の病原体感染による感染を特徴とする症状が存在する患者において、または、一つまたは複数の病原体感染を有する個体と接触した人々において、または他には一つまたは複数の病原体に起因する感染病を発症したと疑われる人々において実施される。
免疫無防備状態の患者、特に、移植片もしくは組織移植後に免疫抑制治療を受けている患者、または免疫系の重篤な低下を引き起こす治療（例えば、癌の化学的療法）を受けている患者の管理は、慣習的な診断実例に対する挑戦を示す。第一に、感染病に特徴的な臨床的症状の発症は、免疫不全の患者において遅延し、典型的には、感染病の後期段階、および免疫応答性個体と比較した場合により高い病原体力価と一致する。この影響は、抗感染治療を複雑にし、患者のより不良な結果をもたらし得る。第二に、免疫抑制治療は、多くの場合、健常な免疫系によって以前には効率的に管理されていた潜在的な感染の再活性化をもたらす。このような状況では、存在する病原体の単純な検出では十分ではなく、代わりに、病原体の力価およびその変化を定量的にモニターすることは、患者および医学的専門家にとってより価値がある。さらに、感染の発病または早期段階での疾患の進行の検出は、早期から効果的な治療薬を投与するのに役立ち、成功の結果となる機会を増加させる。また、移植患者の免疫抑制療法の特定の例では、感染病の進行をモニターすることを使用して、移植拒絶の可能性の均衡を図りながら、免疫系が病原体と戦うのを手助けするために、免疫抑制剤の投与計画を調整することができる。
無症候性個体における病原体の定量的なモニタリングは、一般的には実践的ではないが、免疫抑制治療を受けている患者に非常に有益であり得る。特に、病原体感染に関して移植後患者のモニタリングは、移植後の生存および移植拒絶の最小化を改善することができる。患者における定量的な病原体のモニタリングは、関心対象の各特定の感染に対する1回の試験としては適用されず、患者由来の単一試料に実行される一団の（a panel of）並行アッセイとして、または好ましくは、免疫無防備状態の患者にとって最大の危険性を示す一団の病原体に対する多重アッセイとして適用されれば、本質的に実践的である。モニターされる病原体は、限定されないが、患者における免疫抑制の原因、個体が晒される環境因子、および個体によって示される症状を含む多数の因子に基づいて選択され得る。このような考察は、当業者によって十分に理解される。
このような多重アッセイは、分子診断法、特に、病原体特異的核酸のPCR増幅を用いる方法を用いて開発することができる。
試料中のウイルスを検出および/または定量化するためのPCRを用いる方法には、例えば、Kimura H, et al. Quantitative analysis of Epstein-Barr virus load by using a real-time PCR assay. J. Clin Microbiol. 37:132, 1999；Martell M, et al. High-throughput real-time reverse transcription-PCR quantitation of hepatitis C virus RNA J Clin Microbiol. February 1999；37（2):327-32；Mercier B, et al. Simultaneous screening for HBV DNA and HCV RNA genomes in blood donations using a novel TaqMan PCR assay. J Virol Methods. January 1999；77（1）：1-9が含まれる。
PCR法は、抽出工程、逆転写工程、またはPCR工程のいずれかに加えられる既知濃度の人工的に導入される核酸分子の使用などの外因性の対照を含むことができる。定量化のための内部標準として作用するために、既知濃度で外因性の核酸を添加するという概念は、参照により本明細書に具体的に組み入れられる、Chelly et al.,（1988）Nature 333：858-860によって紹介された。PCRにおける内部標準のための外因性の核酸の使用は、例えば、全てが参照により本明細書に組み入れられる、WO93/02215；WO92/11273；米国特許第5,213,961号および第5,219,727号に記載されている。同様の戦略は、NASBA（Kievits et al., 1991, J. Virol. Methods 35：273-86）またはSDA（Walker, 1994, Nucleic Acids Res. 22：2670-7）などの等温増幅反応を利用する核酸の定量測定に効果的であることが証明されている。
キャピラリー電気泳動は、遺伝子発現を定量的に検出するために用いられている。Rajevic et al.（2001, Pflugers Arch. 442（6 Suppl 1):R190-2）には、多数の癌遺伝子の発現における相違を同時に検出するための7対のプライマーを用いることによって、癌遺伝子の異なった発現を検出するための方法が開示される。センスプライマーは、フルオロフォアで標識した5'末端であった。多重蛍光RT-PCR結果は、ABI-PRISM 310ジェネティック・アナライザー上のキャピラリー電気泳動によって分析した。Borson et al.（1998, Biotechniques 25:130-7）は、生成物の迅速分離および検出用のキャピラリー電気泳動（CE）に連結した定量的な競合逆転写PCR（QC-RT-PCR）に基づく少量mRNA転写物の定量に関する戦略を記載する。George et al.,（1997, J Chromatogr B Biomed Sci Appl 695:93-102）は、ESTパターンを生じた蛍光差次的発現の同定に対するキャピラリー電気泳動システム（ABI310）の応用を記載する。Odin et al.（1999, J Chromatogr B Biomed Sci Appl 734:47-53）は、PCR増幅したcDNAの分離および定量化のための多色検出を含む自動化キャピラリーゲル電気泳動を記載する。
核酸に基づく検出に加えて、ウイルス、細菌、および/または原生動物の多重検出は、ウイルス、細菌、および/または原生動物特異的なマーカーを用いて達成することができる。これらのマーカーには、検出されるべきウイルス、細菌、および/または原生動物のそれぞれに特異的なタンパク質、糖質、または脂質が含まれる。これらの方法は、病原体の存在の検出に有用であるが、本明細書において教示されている方法などの多重アッセイに対して感受性がより低く、本発明の方法よりも感度が常に低いため、より多くの試料を頻繁に必要とする。多数の方法が一つまたは複数のバイオマーカーを検出するために使用することができ、バイオマーカーに特異的に結合する一つまたは複数の抗体を用いる方法が含まれる。「特異的に結合する」という句は、抗体または他の結合分子に言及するとき、標的マーカーがタンパク質および他の生物体の異種群の存在にあるときでさえ、標的マーカーの存在を決定する結合反応を指す。このようにして、設計されたアッセイ条件下で、特定の結合部分は、特定の標的マーカーに優先的に結合し、試験試料中に存在する他の成分に対しては十分な量では結合しない。
多様な免疫アッセイフォーマットは、特定の病原体と特異的に免疫応答する抗体を選択するために用いることができる。例えば、固相ELISA免疫アッセイは、分析物と特異的に免疫応答するモノクローナル抗体を選択するために、日常的に用いられる。特異的な免疫反応性を測定するために用いることができる免疫アッセイフォーマットおよび条件を記載している、Harlow and Lane（1988）Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照されたい。典型的には、特定の標的に特異的である抗体は、バックグラウンドの少なくとも2倍の量で、より典型的にはバックグラウンドの10〜100倍より多い量で標的と結合する。
抗体は、タンパク質、脂質の糖質を含む、任意数の病原体特異的な生体分子に対して生じ得る。好ましくは、マーカー分子は、病原体の増殖中に生成され、病原体粒子の表面上、または病原体に感染した細胞の表面上に存在する。さらに、マーカーは、病原体もしくは病原体に感染した細胞から分泌されてもよく、または病原体もしくは病原体に感染した細胞の溶解中の溶液に遊離してもよい。
CMVウイルスに特異的な1つのウイルスマーカーは、pp65マトリクスタンパク質である。pp65マトリクスタンパク質に特異的に結合する抗体は、以下に限定されないが、末梢血リンパ球を用いる免疫蛍光アッセイまたは酵素結合免疫測定法（例えば、ELISA）（Clin Diagn Virol. 1996 May 5（2-3):81-90 Grandien M.）を含む方法に基づく抗体において、活発に複製しているCMVを定量的に検出するために用いることができる。
ヒトポリオーマJCウイルスは、主要なキャプシドタンパク質VP1（J Virol Methods. 1996 May；59（1-2）：177-87；Chang D, Liou ZM, Ou WC, Wang KZ, Wang M, Fung CY, Tsai RT.）に特異的に結合する抗体を用いて検出することができる。
ヒト単純疱疹ウイルスは、マトリクスタンパク質Gに特異的に結合する抗体を用いる免疫アッセイによって測定することができる。さらに、主要な2つのタイプのHSV、HSV1およびHSV2は、Gタンパク質の2つの変異体であるgG1およびgG2（J Virol Methods. 1999 Dec;83（1-2):75-82. Coyle PV, Desai A, Wyatt D, McCaughey C, O'Neill HJ.）の1つに特異的に結合する抗体によって識別可能である。
病原性グラム陰性細菌は、細菌の外膜の主要な成分であるリポ多糖（LPS）（J Immunol Methods. 2005 Mar;298（l-2):73-81. Thirumalapura NR, Morton RJ, Ramachandran A, Malayer JR.）に特異的に結合する抗体を用いて検出することができる。
リステリア・モノサイトゲネス（Lysteria monocytogenes）は、iap（浸潤関連タンパク質）遺伝子によってコードされ、リステリア・モノサイトゲネスによって成長培地中に大容量で分泌される、正しくはp60と称される60kDaタンパク質（Clin Diagn Lab Immunol. 2004 May；11（3）：446-51. Yu KY, Noh Y, Chung M, Park HJ, Lee N, Youn M, Jung BY, Youn BS.）に特異的に結合する抗体を用いて検出することができる。
マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）は、マイコバクテリアの細胞壁外部の主要であり、特異的な糖脂質成分であるリポアラビノマンナン（LAM）（J Microbiol Methods. 2001 May；45（1):41-52. Hamasur B, Bruchfeld J, Haile M, Pawlowski A, Bjorvatn B, Kallenius G, Svenson SB.）に特異的に結合する抗体を用いて測定することができる。
免疫アッセイを用いる多重検出は、フルオロフォアで標識した抗体、または測定可能なシグナル（カラー色素、蛍光またはルミネッセンス色素）を生成することができる酵素に化学的に連結した抗体を検出する多数の異なったアッセイプラットフォームによって実行可能である。このようなアッセイプラットフォームの例には、病原体に感染した細胞の免疫蛍光または免疫酵素的染色（免疫細胞化学法およびプロトコール（Immunocytochemical Methods and Protocols）（Methods in Molecular Biology), Lorette C. Javois（Editor), Humana Press, 1999)；酵素結合免疫測定法（ELISA）（The ELISA Guidebook（Methods in Molecular Biology), J.R. Crowther（Editor), Humana Press, 2000）、Luminex Inc.に商品化されているカラーをコード化したビーズ（color-encoded beads）（米国特許第6,524,793号に記載される)；多重ELISAマイクロアレイ（multiplexed ELISA microarrays）（例えば、Endogen、Fisher Scientific Co.事業部により商品化されているSearch Light platform）が含まれる。
発生する日和見感染の正確なタイプ（細菌、ウイルス、真菌、または原生動物/寄生虫）は、細胞性、体液性、食細胞、または組み合わさった欠陥であるかどうかについては、免疫学的変化のタイプおよび程度に依存し；および、内部環境および外部環境に存在する生物に依存する。移植受容者へのコルチコステロイドおよび他の免疫毒性薬物の投与は、皮膚および粘膜障壁の崩壊を含む、全ての段階の宿主防御の大幅な機能低下をもたらし得る。
好気性腸溶性の原発性細菌およびカンジダ（Candida）は、移植後の1〜2ヶ月以内に発生する、肝臓移植受容者における感染の潜在的な原因である。通常の部位は、腹部、血流、肺、および外科手術による創傷である。
経腸栄養法は、移植後の期間に衰弱した患者に適切な栄養を提供するために頻繁に必要であり、真菌性敗血症を避けることを期待して、非経口的栄養法より好ましい場合がある。しかしながら、経腸製剤は、優れた微生物培養培地でもあり、容易に汚染され、胃腸炎および敗血症へと導く場合がある。経腸製剤を頻繁に汚染する生物には、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、ストレプトコッカス（streptococci）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、セラチア（Serratia）spp.、シトロバクター（Citrobacter）spp.、およびバチルス（Bacillus）spp.が含まれる。
免疫無防備状態の個体に危険であり得るいくつかの病原体があり、限定されないが細菌を含み、限定されないが、B群連鎖球菌（Group B Streptococcus）、大腸菌（Escherichia coli）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、ナイセリア・メニンギティディス（Neiserria meningitidis）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）、S.ニューモニエ（S.pneumoniae）、またはN.メニンギティディス（N.meningitidis）、L.モノサイトゲネス（L.monocytogenes）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、メニンゴコッカル・メニンギティス（meningococcal meningitis）、ニューモコッカル・ニューモニア（pneumococcal pneumonia）、ノカルジア（Nocardia）spp.、レジオネラ（Legionella）spp.、グラム陰性桿菌（gram-negative bacilli）、バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）、クロストリジウム・ボツリヌム（clostridium botulinum）、フランシセラ・ツラレンシス（francisella tularensis）、大腸菌、ビブリオ（vibrio）spp.、シゲラ（Shigella）spp.、リステリア・モノサイトゲネス（Liseria monocytogenes）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、ビブリオ・コレラ（vibrio cholerae）、サルモネラ（Salmonella）、L.モノサイトゲネス（L.monocytogenes）、腸管組織侵入性大腸菌（enteroinvasive E.coli）、およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）を含み、限定されないが、クリプトスポリジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）、シクロスポラ・カエタネンシス（Cyclospora cayetanensis）、ジアルジア・ランブリア（Giardia lamblia）、エンタモエバ・ヒストリティカ（Entamoeba histolytica）、トキソプラズマ・ゴンディ（toxoplasma gondii）、および微胞子虫（Microsporidia）を含む原生動物を含む。
免疫無防備状態の個体に危険であり得るいくつかの病原体があり、以下に限定されないが、HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、C型肝炎、B型肝炎、アデノウイルス、EEEV、WNE、JCV、およびBKVが含まれる。
免疫無防備状態の患者において、ウイルス性病原菌を含む有害な病原体の感染の脅威は、ウイルスレベル、並びに他の病原体のレベルに対する末梢血のモニタリングを必要とする。病原体は、モニターされる各ウイルスに特異的な個々の血清学的技術を用いて検出することができる。しかしながら、個々の血清学的試験は、費用が嵩み、効率的ではない。核酸増幅法、例えばPCRは、実際に免疫応答が生じる場合、生じるべき免疫応答を待つのとは対照的に、疾患の進行の早期段階で病原体の検出が潜在的に可能となる。PCRに関連した方法の感度、および試料中の病原性ゲノムの存在を検出するPCRの能力により、試料中の病原体の存在および量の両方は、血清学的技術と比較してPCR技術を用いてより早期な段階でより感度良く測定が可能である。
一局面では、本発明は、免疫無防備状態の個体由来の生物試料中の複数の病原体のいずれかの存在を1回のアッセイで検出するための方法に言及する。複数の病原体には、ウイルス、細菌、原生動物、真菌、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。この方法は、下記の4つの工程を含む。
第1工程は、複数の病原体の各病原体を選択することを含み、一対のオリゴヌクレオチドプライマーは、セットの増幅条件下で、考慮している病原体から調製または単離される核酸から選択される既知の長さのポリヌクレオチドアンプリコンの増幅を媒介する。
考慮している病原体由来のアンプリコンの長さは、患者試料において分析される複数の病原体の残りのメンバーの各々から調製または分離される病原体核酸標的の各々から生じる他のアンプリコンのいずれかの長さとは異なるように設計される。複数の病原体の各メンバーに対する一対のプライマーの選択は、複数の病原体における病原体にそれぞれ対応するアンプリコンのセットの同時増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーのセットを構築する。
第2工程は、生物試料由来の核酸、または逆転写などのプロセスによって生物資料から調製または単離される核酸を、ポリヌクレオチドの増幅を可能にする条件下で、オリゴヌクレオチドプライマーのセットと接触させることを伴う。複数の病原体の一つまたは複数のメンバーが生物試料に存在する場合、存在する各メンバーの存在を示す既知の長さのアンプリコンは、増幅反応によって生じる。
第3工程は、サイズによって、増幅した核酸分子を分離することを伴う。第4工程は、分離した核酸を検出することを伴う。実際には、分離および検出工程は、例えば、標識した核酸が、例えばキャピラリー電気泳動によって分離され、例えばキャピラリーの近くかまたは末端で蛍光によって検出される場合のように、組み合わせることも可能である。分離したアンプリコンの検出は、各アンプリコンの既知の長さに基づく。各アンプリコンは、他の標的核酸から生じた残りのアンプリコンの長さと区別される長さであるように設計した。したがって、検出されるアンプリコンのそれぞれのサイズは、考慮している複数の病原体のいずれかが生物試料に存在するかどうかの決定を可能にする。
この方法のバリエーションには、以下に限定されないが、増幅中に一つまたは複数の間隔で増幅反応物をサンプリングすること（例えば、反応混合物からアリコートを取り出すこと）が含まれる。これは、各病原体の鋳型の最初の量の正確な測定を提供し得る増幅プロフィールの作成を可能にする。
この方法のさらなるバリエーションには、増幅工程前に、生物試料から精製した核酸分子を逆転写することが含まれる。これは、例えば、RNAウイルスのウイルス性ゲノムの検出、または、その代わりに、ウイルス性転写物の存在、ならびに他のタイプの病原体からの転写物の検出を可能にする。
さらに、この方法は、1回のアッセイで生物試料中の少なくともの2個の病原体、または生物試料中の少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、または14個、または15個、または少なくとも最大16個の異なる病原体の存在を検出することができる。一態様では、病原体の検出は、多数の病原体由来の標的分子が増幅される1回の増幅反応に起因する。
別の態様では、検出されるべきウイルス病原体は、HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、C型肝炎、B型肝炎、アデノウイルス、EEEV、WNE、JCV、およびBKVからなる群より選択される。さらに、この方法は、生物試料から調製もしくは単離された核酸試料の少なくとも2個のウイルス特異的標的分子の存在、または生物試料から調製もしくは単離された試験核酸の少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、または14個、または15個、または少なくとも最大16個のウイルス特異的標的分子の存在を同時に検出ことができ、HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、C型肝炎、B型肝炎、アデノウイルス、EEEV、WNE、JCV、およびBKVからなる群より選択される、少なくとも2個、または少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、または14個、または15個、または少なくとも最大16個の異なる特異的ウイルス標的を包含し得る。
本明細書において記載される方法の別の局面は、試料が、個体を免疫無防備状態とする原因となる、治療過程が処方された個体から、得られることである。このような治療は、限定されないが、移植患者および癌患者に処方される免疫抑制療法を含む。本明細書において記載される方法は、免疫抑制治療の過程、または免疫抑制を引き起こす処置のモニタリングにおいて用いることができる。
本明細書に記載される方法は、試料におけるアッセイされる複数の病原体の各病原体を定量化する工程をさらに含むことができる。一局面では、定量化は、病原体から調製または単離された病原体特異的標的核酸と同じ効率かつ同じプライマーで増幅される少なくとも2つの核酸競合分子を、試験核酸試料に添加することによって高められる。試験核酸試料に添加された各セットの競合標的の濃度は公知であり、少なくとも1桁の規模で互いに相違してもよい。競合核酸は、RNAおよび/またはDNAを含むことができる。
本明細書に記載される方法は、免疫無防備状態の患者由来の試料中の関心対象の複数の病原体の検出および定量化のアプローチを提供し、この方法は、各所与の病原体に対して、病原体に特異的である病原体特異的標的ポリヌクレオチドを選択すること含む。このアプローチでは、各所与の病原体特異的標的ポリヌクレオチドに対して、プライマー対が所与の病原体特異的標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部に特異的であり、そこから生じる既知の長さのアンプリコンを生成するように、一対のオリゴヌクレオチド増幅プライマーが選択され、アンプリコンの長さは、他の選択された病原体特異的標的ポリヌクレオチドのいずれかから、または競合ポリヌクレオチドから生じたアンプリコンの長さとは区別される。
このアプローチは、さらに、各競合ポリヌクレオチドが、前記段落に記載されたオリゴヌクレオチド増幅プライマー対を用いる場合、既知の長さのアンプリコンを生成するように、一つまたは複数の競合ポリヌクレオチドを合成することを伴い、アンプリコンの長さは、病原体特異的標的ポリヌクレオチドのいずれかから、または他の競合ポリヌクレオチドのいずれかから生成したアンプリコンの長さとは区別される。
このアプローチは、患者の試料からポリヌクレオチドを精製することをさらに含み、該ポリヌクレオチドはRNA、DNAまたはその両方のいずれかである。RNAの場合には、cDNAは逆転写酵素を用いて形成される。
このアプローチは、さらに、所定量の一つまたは複数の競合ポリヌクレオチドを、個体試料から精製および/または調製したポリヌクレオチドに添加し、それによりポリヌクレオチド試験混合物を形成することを含む。各個体の競合ポリヌクレオチドは、例えば1 logのオーダーで、互いに相違する既知の濃度で添加される。次に、ポリヌクレオチド試験混合物に存在する標的ポリヌクレオチドのそれぞれは、第1および第2オリゴヌクレオチド増幅プライマーの対を用いて、1回の多重アッセイで増幅され、各対は、病原体特異的標的ポリヌクレオチドのそれぞれ由来のアンプリコン、並びに競合ヌクレオチド由来のアンプリコンの生成を可能にする条件下で、アッセイされる各病原体に特異的である。
このアプローチは、さらに、前段落に記載されたPCR反応において生じたアンプリコンを分離し、これらのアンプリコンのそれぞれを検出することを含む。生じたアンプリコンの各長さは、アンプリコンがどの標的ポリヌクレオチドから生じたのかを同定するために用いることができ、どの病原体が試料から検出されたかを同定することができる。
また、このアプローチは、病原体特異的標的ポリヌクレオチドのそれぞれから生じたアンプリコンの量と、一つまたは複数のそれぞれの競合ポリヌクレオチドから生じたアンプリコンの量とを比較することによって、前段落に記載した同定された病原体特異的標的ポリヌクレオチドのそれぞれを定量化することを含んでもよく、これは、各競合ポリヌクレオチドが、増幅直前に、試験ポリヌクレオチド試験混合物に所定の量で存在したためである。各病原体特異的標的ポリヌクレオチドの量は、個体試料に試料に存在する関心対象のそれぞれの病原体の量と相関する。
アンプリコンは、キャピラリー電気泳動（CE）によって分離することができ、一つまたは複数のオリゴヌクレオチド増幅プライマーは、検出可能な標識に連結することができる。検出可能な標識には、以下に限定されないが、蛍光標識、放射性標識、比色標識、磁気標識、および酵素標識が含まれる。増幅アッセイから検出される各アンプリコンの量は、標識シグナルの測定、例えば、蛍光の測定によって決定することができる。
各病原体特異的標的ポリヌクレオチドがRNAを含む場合には、増幅前に、病原体特異的標的ポリヌクレオチドおよび競合RNAポリヌクレオチドを逆転写する工程が提供される。あるいは、RNAおよびDNAの両方が別々に精製される方法では、精製したRNAおよび精製したDNAは、別々の増幅反応において分析される。あるいは、逆転写工程は、少なくとも1つの標的がRNAウイルスである場合はいつでも、または転写物もしくは病原体転写物が検出されるべき場合に採用することができる。アンプリコンは、PCRを通じて、またはTMAおよびNASBAなどの転写媒介の増幅を用いて生成することができる。
リアルタイムPCRは、本明細書に記載される方法において用いることができる。「リアルタイム」定量PCR分析は、ウイルスDNAレベルの測定に適用されている（Niesters H et al., Development of a real-time quantitative assay for detection of Epstein-Barr virus. J Clin Microbiol. February 2000；38（2）：712-5）。動態PCRは、初期鋳型コピー数を決定するための方法である。そのアプローチでは、PCR反応における定量情報は、数サイクルから生じ、DNA量は、バックグラウンドのちょうど上から頭打ちまで対数的に増える。多くの場合、40サイクルのうちほんの6〜8サイクルが、曲線のこの対数線形部分に当てはまる。
本明細書に記載される方法では、病原体は、限定されないが、HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、C型肝炎、B型肝炎、アデノウイルス、EEEV、WNE、JCV、およびBKVを含むウイルスであり得る。
本明細書において記載される方法では、病原体は、B群連鎖球菌、大腸菌、リステリア・モノサイトゲネス、ナイセリア・メニンギティディス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、S.ニューモニエ、またはN.メニンギティディス、L.モノサイトゲネス、シュードモナス・エルジノーサ、メニンゴコッカル・メニンギティス、ニューモコッカル・ニューモニア、ノカルジアspp.、レジオネラspp.、グラム陰性桿菌、バチルス・アンスラシス、エルシニア・ペスティス、クロストリジウム・ボツリヌム、フランシセラ・ツラレンシス、大腸菌、ビブリオspp.、シゲラspp.、リステリア・モノサイトゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ、ビブリオ・コレラ、サルモネラ、L.モノサイトゲネス、腸管組織侵入性大腸菌、およびマイコバクテリウム・ツベルクローシスをが含むがこれらに限定されない細菌であり得る。
一局面では、2種類またはそれ以上、例えば15種類またはそれ以上の異なったウイルスに特異的なプライマーは、多重検出を可能にする1回のアッセイに含まれる。
ウイルス標的
本明細書に記載される方法は、多種多様なウイルスのいずれかの存在および/または量を同定するのに有効である。特定の臨床的関連、特に免疫無防備状態の患者に対するウイルスが下記に記載される。
HSV-1およびHSV-2
米国特許第5,558,863号に記載されるように、50より多いヘルペスウイルスが、30を超える異なった種に感染することが公知である。A.J. Nahmias and B. Roizman, New Engl. J. Med. 289, pp.667-674（1973）。単純疱疹ウイルス1（HSV-1）および単純疱疹ウイルス2（HSV-2）は、中でも最も臨床的に重要であり、単純ヘルペスウイルス（HSV）の天然に存在している変異体である。ヒトがこのウイルスの唯一の保有者である。HSVは、1920年に初めて単離された。B. Lipschutz, Arch. Derm. Syph.（Berl）136, pp.428-482（1921）。1961年に、2つの血清型が識別された。概して、HSV-1は、生殖器でない部位に感染し、HSV-2は、生殖器部位に感染する。しかしながら、陰部ヘルペスの場合においてHSV-1を単離することは可能である。伝染は、直接的である。口腔、目、皮膚または生殖器官における局在した潰瘍または病変は、通常、感染後に発症する。蔓延は、新生児おける脳炎および免疫抑制を引き起こし得る。このウイルスは、ストレス、環境因子、他の薬剤、食品添加物または食材によって再発が誘発されるまで、恐らくは何年間も潜伏し続けることができる（A.J. Nahmias and B. Roizman, New Engl. J. Med. 13, pp.667-674（1973)；W.E. Rawls, E.H. Lennette（eds.), Laboratory Diagnosis of Viral Infections, Marcel Dekker, Inc., New York, pp.313-328（1985）を参照されたい）。
EBV
エプスタイン・バーウイルス（EBV）は、ヘルペスウイルス群由来の別の病原体である。1960年代に発見され、感染性単核症の主要な病原因子であり、バーキットリンパ腫および上咽頭癌悪性腫瘍と関連している（W. Henle and G. Henle, M.A. Epstein and B.G. Achong（eds.), The Epstein-Barr Virus, Springer-Verlag, Berlin, p.297（1979）を参照されたい）。感染性単核症は、リンパ節腫脹症、発熱および咽頭炎によって特徴付けられる。HSV変異体と同様に、エプスタイン・バーウイルスは、宿主が免疫抑制される場合に再発する可能性のある潜伏感染を構築することができる（E.T. Lennette, E.H. Lennette（eds.), Laboratory Diagnosis of Viral Infections, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 257-271（1985）を参照されたい）。例えば、EBVは、重篤な免疫無防備状態の患者において急性および急速な進行性Bリンパ増殖性疾患も引き起こし得る。
移植患者は全て、EBV感染、したがって、移植後リンパ増殖性障害（PTLD）を発症する危険にある。しかしながら、この合併症に対して最も高い危険な群は、肝臓移植群である。これは、これらの患者が概して非常に若く、しばしば5歳未満であるためであり、したがって、彼らは、多くの場合、EBVに晒されたことがまだなく、結果として、このウイルスに対する自然な免疫を有していない。
VZV
水痘帯状ヘルペス（VZV）は、ヘルペスウイルスでもあり、水痘（水疱瘡）および帯状疱疹（zoster）（帯状疱疹（shingles））の両方の原因物質である。水痘は、主に小児に起こり、より局在化した帯状疱疹は、年配者および免疫無防備状態で起こる。帯状疱疹は、実際には、潜伏したVZ感染の再発による。患者は、疼痛、小胞性皮膚病変を被る（A. Gershon, E.H. Lennette（eds.), Laboratory Diagnosis of Viral Infections, Marcel Dekker, Inc., New York, pp.329-340（1985）を参照されたい）。現在、鎮痛剤は、帯状疱疹のための唯一の治療を提供する（R. Boyd et al., Basic Medical Microbiology, 2nd Editon, Little, Brown and Company, Boston, p.527,（1981）を参照されたい）。
CMV
サイトメガロウイルス（CMV）は、米国特許第6,936,251号に記載されるように、世界中の全ての個体の50〜100％に感染しているヒトヘルペスウイルスファミリーのメンバーでもある。
CMVは、唾液、尿、または母乳を介して自然に伝染するが、他の生体分泌物から回収されてもよい。さらに、CMVは、分娩および性交中の尿生殖器接触によって経胎盤性で胎児へ伝染し、輸血（特に白血球）および骨髄または臓器移植によって伝染し得る。
一次感染後、CMVは、動的潜伏期の状態でその宿主の生涯に渡って生体内で持続し、宿主免疫系によって良好に制御され、様々な部位および生体分泌物から周期的に回収されてもよい。一般には良性であるが、移植受容者、AIDS患者、遺伝的に決定された免疫不全を有する患者のような免疫欠損を有する個体、および未熟免疫系を有する新生児において、CMV感染症が破壊的となり、および致死的となることがある。
HHV6
ヒトヘルペスウイルス6（HHV6）ウイルスは、ヒトヘルペスウイルスファミリーのメンバーでもあり、二本鎖DNAを含む。HHV6菌株は、AIDSに罹患しているかまたはリンパ増殖性障害を有する患者のリンパ球から単離された。また、これらのウイルスは、米国特許第5,545,520号に記載されるように、突発性発疹の病因であると見なされている。
HHV6は、Salahuddinと共同研究者によって1986年に初めて記載されたβヘルペスウイルスであり、人類の約90パーセントにおいて潜伏状態で存在している。しかしながら、能動感染の期間、このウイルスは、様々な臨床的疾患と関連する。米国特許第5,756,302号に記載されるように、HHV-6は、小児において小児バラ疹および突発性発疹の臨床病因であり、一般に、原発性HHV-6感染の幼児における臨床的に重大な骨髄抑制と関連する。成人では、HHV-6は、原因として、広範囲な臨床的疾患と関連し、危険な状態にある免疫無防備または免疫抑制群において致命的となり得る。特に、HHV-6は、肺炎および脳炎を有する患者、および同種異系の骨髄移植（AlBMT）または固形臓器移植に続く免疫抑制された患者において顕著である。AlBMT患者において、HHV-6に関連した骨髄抑制（HBMS）は、骨髄の直接的なウイルス感染と相関する。骨髄のHHV-6による持続感染は、慢性的骨髄抑制を引き起こし得る。
HHV-7
ヒトヘルペスウイルス7（HHV-7）は、米国特許出願公開第20040091852号に記載されるように、1990年に発見されたβヘルペスウイルスである。HHV-7は、一般集団に広がっていて、生涯の初期に主要段階の感染を生じ、他のヘルペスウイルスのように、感染した生物において潜伏形態で永久に持続する。HHV-7は、遺伝的に、サイトメガロウイルス（CMV）およびヒトヘルペスウイルス6（HHV-6）に近く、特に、CMVの場合において、主要な病原性ウイルスである。ヒト疾患に対するHHV-7の責任能力（responsibility）は、今もなお調査されている。免疫抑制中に、他のヘルペスウイルスのように、その病原力は悪化し、重大な日和見感染を引き起こすと考えられている。特に、これは、臓器移植後の症例である場合がある。
HHV-8
米国特許出願公開第20030013077号に記載されるように、配列相同性に基づいて、HHV-8は、ガンマヘルペスウイルスのサブファミリーに属し、EBVおよびヘルペスウイルス・サイミリ（saimiri）に密接に関連している。HHV-8ゲノムは、サイズにして140kbであり、約800bpの長さを有するいくつかの反復的な配列が隣接している（Russo et al., 1996）。HHV-8は、約80個のタンパク質をコードし、そのうちの10個は、細胞遺伝子産物に相同性を示す（Neipel et al., 1997）。全ての他のヘルペスウイルスと同様に、HHV-8は、溶菌感染を引き起こすこともでき、次に、潜伏感染となる。潜伏期では、少なくとも2つのウイルス転写物が発現される。個別にスプライシングされたmRNAをコードするv-サイクリン、v-フリップ（flip）、およびLANAタンパク質、並びにT0.7、長さにして0.7kbの、これまで機能が未知である短いRNA（Zhong et al., 1996）。ウイルス転写物T0.7は、潜伏期に発現される最も大量のRNAであり、60、35、および47個のアミノ酸に対応する3つのオープン・リーディング・フレームを有する。
ヒトヘルペスウイルス8は、カポジ肉腫の全ての形態、原発性滲出液リンパ腫（PEL）、キャッスルマン病、血管肉腫、移植を受けた患者の皮膚病変、形質細胞腫、サルコイドーシス、並びに健康な対照個体において検出されている（Chang et al., 1994；Boshoff and Weiss, 1997）。
C型肝炎
C型肝炎（HCV）は、非A非B肝炎の全ての症例の90％の主要な病原因子である（Dymock, B.W. Emerging Drugs 6:13-42（2001））。HCV感染の発生率は、ますます重大な公衆衛生の懸念となってきており、世界中で2〜15％の個人が感染している。HCVによる一次感染は、多くの場合、無症候性であり、大部分のHCV感染は、数十年間持続し得る慢性状態まで進行する。慢性HCV感染症のうち、最終的には、約20〜50％が、慢性肝疾患（例えば、肝硬変）を発症し、これらの症例のうち20〜30％が肝不全または肝癌に至る。
HCVは、米国特許出願公開第20040121975号に記載されるように、十分に特徴付けられているプラス（+）鎖RNAウイルスであり、約9.6kbの長さであり、約3000個のアミノ酸のポリタンパク質をコードする1つの長いオープン・リーディング・フレーム（ORF）を有する（参照により全体として明確に組み入れられるLohman et al., Science 285:110-113（1999））。ORFは、内部リボソーム侵入部位（IRES）として機能する非翻訳領域が5'末端、およびゲノム複製に本質的な高度に保存された配列が3'末端に隣接している（Lohman、前記）。構造タンパク質は、ポリタンパク質のN末端領域にあり、非構造タンパク質（NS）2〜5Bは、残りの部分にある。
B型肝炎ウイルス
B型肝炎ウイルス（HBV）は、ヘパドナウイルス（Hepadnavirus）ファミリーに属するコンパクトなエンベロープを有するDNAウイルスである。このウイルスは、世界中で、慢性肝疾患および肝細胞癌腫の主要な原因である（Hoofnagle（1990）N. Eng. J. Med. 323：337-339）。HBVは、急性および慢性肝炎および肝細胞癌腫と関連し、また、後天性免疫不全症候群の発症における共同因子であり得る（Dienstag et al., in Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th Ed.（Isselbacher et al., eds.）McGraw-Hill, NY, N.Y.（1993）pp.1458-1483）。
HBVは、ヘパドナウイルスファミリーに属するコンパクトなエンベロープを有するDNAウイルスである。それは、環状の、部分的には一本鎖の、部分的には二本鎖の3.2kbのゲノムであって、4つの重複する遺伝子：（1）種々のエンベロープまたは表面抗原（HBsAg）をコードするプレSおよびS遺伝子；（2）抗原HBcAgおよびHBeAgをコードするプレCおよびC遺伝子；（3）ウイルス性ポリメラーゼをコードするP遺伝子；および（4）転写活性タンパク質であるHBxをコードするX遺伝子を含む。多くのヘパドナウイルスの全長クローンが得られ、それらのヌクレオチド配列が得られている（例えば、Raney et al. in Molecular Biology of the Hepatitis B Virus（McLachlan, ed.）CRC Press, Boston, Mass., （1991）pp.1-38を参照されたい）。複製は肝細胞で起り、HBVゲノムの1本鎖領域を二本鎖環状DNAに変換することを伴い、共有結合した環状（CCC）DNAを生じる。宿主RNAポリメラーゼによるこのDNAの転写は、ウイルス性タンパク質の翻訳に対する鋳型として働くプラス鎖極性のRNA鋳型、プレゲノムRNAを生じ、また、ウイルスコアにカプセル化される。ウイルスコアでは、RNAは、逆転写に対する鋳型として働き、DNAマイナス鎖を生じる。次に、ウイルスポリメラーゼは、プライマーとしてウイルスRNAのオリゴマーを用いてDNAプラス鎖を生じる。ウイルスコア中の新しく合成された二本鎖DNAは、ウイルスエンベロープタンパク質とともに集合し、新しい感染性ウイルス粒子を生じる。
AAV
アデノ随伴ウイルス（AAV）は、完全に「細胞を溶解する」感染のためのアデノウイルスまたはヘルペスウイルスに依存しているパルボウイルスである（Buller et al., J. Virol. 40：241-47（1981））。米国特許第6593123号に記載されるように、AAVは、増殖感染が起こるように、関係のないヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはワクシニアとの同時感染を必要とする。ヘルパーウイルスがない場合、AAVは、そのゲノムを宿主細胞の染色体に挿入することによって潜伏状態を確保する。ヘルパーウイルスによるその後の感染によって、統合されたウイルスゲノムを救出し、次に、複製して、感染性のウイルス子孫を生成する。AAVの概説に関しては、例えば、Berns and Bohenzky（1987）Advances in Virus Research（Academic Press, Inc.）32：243-307を参照されたい。
AAVゲノムは、4681個の塩基を含む直鎖状の一本鎖DNA分子から構成される（Berns and Bohenzky、前記）。このゲノムは、シスで、DNA複製の起源として、ウイルスのためのパッケージングシグナルとして機能する各末端で末端逆位配列（ITR）を含む。ITRは、長さにして約145bpである。このゲノムの内部の非反復部分は、2つの大きなオープン・リーディング・フレームを含み、それぞれ、AAV repおよびcap領域として公知である。これらの領域は、AAVヘルパー機能を提供するウイルス性タンパク質、即ち、ビリオンの複製およびパッケージングに関連したタンパク質をコードする。具体的には、少なくとも4つのウイルス性タンパク質のファミリーは、見掛けの分子量に従って命名されたAAV rep領域、Rep 78、Rep 68、Rep 52およびRep 40から合成される。AAV cap領域は、少なくとも3つのタンパク質であるVP1、VP2、およびVP3をコードする。AAVゲノムの詳細な説明に関しては、例えば、Muzyczka, N.（1992）Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158：97-129を参照されたい。
EEEV
東部ウマ脳炎ウイルス（Eastern Equine Encephalitis Virus：EEEV）は、世界中の大部分で見つけられた大きな群の蚊媒介性RNAウイルスから構成されるトガウイルス科のアルファウイルス属のメンバーである。このウイルスは、通常、種々の蚊の摂食活動を通じてげっ歯類または鳥類宿主の中を循環する。動物間流行病は、大部分、雨量が増加した期間後に、蚊の活動性の増加の結果として発生する。EEEは、最初に、バージニア州およびニュージャージー州で1933年に単離された（Ten Broeck, C. et al.［1935］J. Exp. Med. 62：677）。
WNE
ウェスト・ナイル・ウイルス（West Nile virus：WNE）は、米国特許出願公開第20040197769号に記載されるように、ウイルスの日本脳炎抗原ウイルス複合体に属するフラビウイルス科（Flaviviridae）のフラビウイルス（Flavivirus）属のメンバーである。この血清複合体には、JEV、SLEV、アルフィ（Alfuy）、コウタンゴ（Koutango）、クンジン（Kunjin）、カシパコア（Cacipacore）、ヤウンデ（Yaounde）、およびマレーバレー脳炎ウイルスが含まれる。WNE感染は、一般的に、軽度の症状を有するが、感染は、老齢および免疫無防備状態の患者において致命的となり得る。軽度なWNE感染の典型的な症状は、発熱、頭痛、体の疼痛、発疹およびリンパ腺の腫れを含む。脳炎を伴う重篤な疾患は、典型的には、老齢患者において見られる（D.S. Asnis et al.、前記）。大部分、フラビウイルス感染である被験体の治療は、対症療法であり、即ち、フラビウイルス感染の全身症状は、早期治療に関しては、フラビウイルス感染であるという感染の知識のみが十分となり得るように治療される。しかしながら、ある種の他の症例では、特定のフラビウイルス、特にWNEの迅速かつ正確な診断は、大部分の適切な治療を開始し得るために重大である。
JCV
JCウイルス（JCV）は、ヒトポリオーマウイルスの群に属する。JCVは、米国特許第6,238,859号に記載されるように、ミエリン形成乏突起膠細胞の溶菌感染および星状細胞の不稔感染によって脳の亜急性脱ミエリン化疾患を引き起こし得る。この感染は、進行性多病巣性白質脳障害（PML）と臨床的に呼ばれているが、大脳小脳および脳幹における脱ミエリン化病巣の形成をもたらし、通常、数ヶ月以内に死に至る。JCVは、成人群の約80％に存在しているようであるが、PMLは、一般的に、免疫系の減退に関連して発症するのみである。免疫抑制剤の使用の増加およびHIV感染患者数の増加は、近年において、PML疾患の顕著な増加をもたらした。現在の推定によれば、PMLは、AIDS患者の約2〜5％で発症している。
BKV
BKウイルス（BKV）は、米国特許第6,605,602号に記載されるように、最初は、免疫無防備状態の患者の尿から単離されたヒトポリオーマウイルスである。それ以来、多くのBKV変異体（サブタイプ）が単離された。BKVは、生後の最初の10年以内に大多数の一般集団において不顕性（subclinical）（無症候性）感染を引き起こす。感染後、ウイルスは、通常、腎臓に潜伏し続ける。しかしながら、このウイルスは、例えば、腎移植後の免疫抑制の結果として、後期に再度活性化するようになる場合がある。
BKVは、二本鎖DNA（dsDNA）ゲノムを含む。BKVの完全なDNA配列は、約5,100塩基対であるが、しかしながら、これは、BKVの各変異体により変化する。例えば、BKVのダンロップ（Dunlop）菌株は、5,153塩基対を含む（例えば、Self et al.（1979), Cell 18：963-77を参照されたい）。BKVゲノムは、コード領域および非コード制御領域を含むが、機能的には、3つの領域に分割される。コード領域は、初期領域および後期領域にさらに分割することができる。初期領域は、T抗原タンパク質およびt抗原タンパク質の2つの非構造タンパク質に対するコード配列を含む。後期領域は、4つの構造タンパク質：VP-1、VP-2、およびVP-3に対するコード配列を含む。非コード制御領域は、初期および後期の両方の遺伝子発現に対する転写制御因子を含み、並びにウイルスの複製起源を含む。
天然痘
天然痘は、ウイルスである大痘瘡（Variola major）によって引き起こされ、最も危険な潜在的生物兵器の1つと考えられている。それは、ヒトからヒトへと容易に伝染し、有効な治療がなく、このウイルスに対して十分な免疫を持つヒトがほとんどいないためである。世界中の免疫問題は、1977年に天然痘病を根絶したが、少量の天然痘ウイルスは、なお、米国およびロシアの2つの安全な機関に存在している。しかしながら、天然痘ウイルスの承認されていない貯蔵が世界の他の場所にある可能性が高い。
天然痘の感染の症状は、曝露後の約12日（この範囲は、7〜17日である）で現れる。初期の症状には、高熱、疲労、頭痛および背中の疼痛が含まれる。特徴的な発疹は、顔、腕、および脚に最も顕著であり、2〜3日後にある。発疹は、平らな赤色の病変（斑点状丘疹）から始まり、小水疱へと進む。水痘とは異なり、天然痘と関連した病変は、同じ割合で進行する。天然痘病変は、膿で満たされるようになり、曝露後の第2週の初期には外皮で覆われ始める。疥癬が発症し、分離し、約3週間後には脱落する。個体は、概して、疥癬が剥がれる時期まで、斑点状丘疹の発疹の直前の時期から他人に感染し易くなる。天然痘は、主に、感染した人々から吐き出されたエアロゾル化した唾液の水滴によって、ヒトからヒトへと直接的に広がる。汚染された衣類または寝具からもこのウイルスは拡散することができる。天然痘感染の死亡率は、約30パーセントであり、回復患者は、多くの場合、外観を損なう傷跡を有する。
痘瘡ウイルスは、潜在曝露と関連したハザードのために、あまり研究されていない。しかしながら、ワクシニアウイルスは、天然痘ワクチンとして用いられ、痘瘡と密接に関係しており、十分に研究されている。2つのウイルスのいくつかの比較試験は、主要な相違が宿主域にあることを示し、ワクシニアは、いくつかの宿主に感染し、痘瘡は、自然にはヒトのみ、人工的な実験室条件下ではカニクイザルに感染する。2つのウイルスは、ニワトリ胚絨毛尿膜上の病変の出現によって、および組織培養増殖の特徴付けによって区別することができる。これらのウイルスは、抗原を共有し、交差中和抗体を生じさせ、天然痘を妨げるためのワクシニアワクチンの使用において特徴が活用される。2つのウイルスは、PCR、ELISA、放射免疫アッセイ、およびモノクローナル抗体によって区別することができる。現在、ワクシニアは、他のワクチン遺伝子の輸送のためのベクターとして幅広く調査されている。
2つの形態の感染性オルソポックスウイルスは、感染した細胞において生成される：感染した細胞に残存する細胞内成熟ウイルス（IMV）および感染後期に細胞から放出される細胞外のエンベロープを有するウイルス（EEV）。ウイルスのEEV形態は、追加の脂質エンベロープ並びに細胞性およびウイルス性タンパク質を含み、したがって、IMVとは免疫学的に相違するEEVを作製する。さらに、EEVおよびIMV形態は、異なったメカニズムで細胞に侵入し、異なった細胞受容体を使用し、抗体および補体に対する異なった感受性を有する。ポックスウイルスによる免疫回避は、ケモカインに結合するタンパク質の放出、中和抗体に対するEEV耐性、および宿主補体対照タンパク質の捕捉を介した補体破壊に対するEEV耐性に関連したメカニズムを介して達成される。
痘瘡およびワクシニアは、ポックスウイルスのオルソポックスウイルス属に属する。これらの二本鎖DNAウイルスは、宿主核DNA複製酵素に依存した他のDNAウイルスとは異なり、細胞質中で複製される。痘瘡およびワクシニアのいくつかの菌株は、ゲノムで配列決定されている。構造タンパク質、膜タンパク質、およびコアタンパク質の遺伝子は、オルソポックスウイルスの中で高度に保存されているようである。ヒト細胞において増殖をもたらす遺伝子も同定されている。NIAIDは、これらの領域では、更なる研究を積極的に進める。
節足動物媒介ウイルス
ウイルス性脳炎および出血熱の重要な作用物質であり、多数のタイプを含むカテゴリーBおよびCの節足動物媒介ウイルス（アルボウイルス）。アルファウイルスは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（VEE）ウイルス、東部ウマ脳炎（EEE）ウイルス、西部ウマ脳炎（WEE）ウイルスに関連する。フラビウイルスには、ウェスト・ナイル・ウイルス（WNV）、日本脳炎（JE）ウイルス、キャサヌール森林病（KFD）ウイルス、ダニ媒介脳炎（TBE）ウイルス複合体、および黄熱（YF）ウイルスが含まれる。ブンヤウイルスには、カリフォルニア脳炎（CE）ウイルス、ラクロス（LAC）ウイルス、クリミア・コンゴ出血熱（CCHF）ウイルスが含まれる。
蚊、ダニ、サシチョウバエなどの節足動物ベクターは、ヒトに対して、大部分のウイルス性脳炎および出血熱ウイルスの自然な伝染に関与し、潜在的な生物テロリストの武器としてのこれらのウイルスの脅威は、エアロゾル曝露後のそれらの極度の感染力が主に原因である。さらに、ワクチンまたは効果的な特定の治療薬は、これらのウイルスの僅かなものに対してしか利用可能ではない。
多くのアルボウイルスは、北アメリカ（EEE、WEE、WNV、CE、LAC）、南アメリカ（VEE、WEE）、アジア（JE、CCHF）、およびアフリカ（WNV、CCHF）において地方特有であり、列挙していない他のものも含まれる。現在において、米国における最も顕著なのは、WNVであり、最初に、1999年に北アメリカのニューヨーク市において同定された。このウイルスは、米国大陸全体に広がり、2002年の夏の終わりまでに数千例の疾患、および100例を超える死者の原因となった。
アルボウイルスによるヒトおよび他の動物の自然な感染は、ウイルスに依存した、感染した蚊、ダニまたはサシチョウバエの刺傷を介して獲得される。一般に、潜伏期間は、3〜21日で変化し、ウイルスが局所的に複製し、脳または他の標的臓器に侵入する前に血流によって末梢部位まで広がる期間を反映している。脳では、ある種のこれらのウイルスは、細胞から細胞へと広がり、脳炎を引き起こす。他のウイルス、例えばYFおよびCCHFは、肝臓および他の臓器を標的とし、出血および発熱を引き起こす。これらの脳炎および出血熱ウイルスの病因については、相対的にあまり公知ではない。しかしながら、エアロゾル化したVEEに曝露されたマウスの研究では、ウイルスは、感染後48時間以内に脳で検出された。
ヒトでは、アルボウイルス感染は、通常、無症候性であるか、または非特異的なインフルエンザ様症状、例えば熱、疼痛、および疲労を引き起こす。感染した人々の少ない割合では、脳炎を発症する場合があり、大部分が回復するが、中には、後遺症として重症な神経症状、例えば失明、麻痺、または発作を伴ったままとなる場合がある。臨床疾患および致死率は、特定の感染ウイルスによって変化する。例えば、VEEに感染した1％未満の成人が、脳炎を発症する；一方で、その致死率は、JE（25％）またはEEE（50％）ウイルスに感染した成人の中でもより高い。LAC感染では、疾患は、小児においてより重症であり、より一般的である。しかしながら、WNVでは、特に米国では、老齢および免疫抑制された個体は、重大であるかまたは生命を脅かす疾患を発症する危険性が最も高い。これらのウイルスのいくつか、例えば、VEE、EEE、WNV、およびJEは、重要な獣医疾患も示し、ウマ、トリ、および他の動物において致死率が高い（最大90％の）脳炎または他の症状を引き起こす。
アルファウイルス、フラビウイルス、およびブンヤウイルスの伝染サイクルは、一般に、宿主上の節足動物の摂食中に感染した脊椎動物宿主（例えば、トリ）から節足動物/昆虫ベクター（例えば、蚊）へのウイルスの循環的な通過を伴う。ウイルスは、節足動物中で高い数字まで増殖し、次に、蚊が再び摂食/刺すと、新たな宿主を通過し、感染する。アルボウイルスの伝染サイクルは、一般的には、あまり理解されておらず、ウイルスの自然な維持と新しい地理的領域および宿主へのウイルスの蔓延とに関与する脊椎動物宿主および節足動物ベクターの種を含む。
カテゴリーBおよびCアルボウイルスは全て、感染した細胞の細胞質において複製するエンベロープを持ったRNAウイルスである。宿主細胞へのウイルスの結合に関与し、ウイルス向性において機能し、宿主中和抗体（host-neutralizing antibody）の標的として作用するウイルス性エンベロープの糖タンパク質が同定されている。ウイルスは、ウイルスの複製プロセスに必要である酵素のような非構造的タンパク質もコードする。ウイルスの構造タンパク質および非構造タンパク質の数およびタイプは、各ウイルスファミリーに特異的である；いくつかは幅広く研究されているが、他はそうではない。ゲノム配列決定および他の核酸試験は、ある種のこれらのウイルスの中で確立した関係を有し、病原性、病原性の弱毒化、および関連した病因に重要である遺伝子およびタンパク質の部位の同定へと導いている。ある種のアルファウイルスおよびフラビウイルス構造タンパク質の結晶学試験は、タンパク質機能、および抗原性薬物開発のための潜在的な標的の同定における洞察を提供している。
本明細書に記載される方法は、限定されないが、下記のウイルスの属のいずれかに由来する病原体を含む、様々なタイプの病原体を検出するために用いることができる。アデノウイルス科（Adenoviridae）、アルファモウイルス（Alfamovirus）、アレクシウイルス（Allexivirus）、アロレビウイルス（Allolevivirus）、アルファクリプトウイルス（Alphacryptovirus）、アルファヘルペスウイルス亜科（Alphaherpesvirinae）、アルファノダウイルス（Alphanodavirus）、アルファレトロウイルス（Alpharetrovirus）、アルファウイルス（Alphavirus）、アフトウイルス（Aphthovirus）、アプスカウイロイド（Apscaviroid）、アクアビルナウイルス（Aquabirnavirus）、アクアレオウイルス（Aquareovirus）、アレナウイルス科（Arenaviridae）、アレナウイルス（Arenavirus）、アルテリウイルス科（Arteriviridae）、アルテリウイルス（Arterivirus）、アスコウイルス科（Ascoviridae）、アスコウイルス（Ascovirus）、アスファルウイルス科（Asfarviridae）、アスファウイルス（Asfivirus）、アストロウイルス科（Astroviridae）、アストロウイルス（Astrovirus）、アウレウスウイルス（Aureusvirus）、アベナウイルス（Avenavirus）、アビアデノウイルス（Aviadenovirus）、アビビルナウイルス（Avibirnavirus）、アビヘパドナウイルス（Avihepadnavirus）、アビポックスウイルス（Avipoxvirus）、アブサンウイロイド（Avsunviroid）、アブサンウイロイド科（Avsunviroidae）、バキュロウイルス科（Baculoviridae）、バドナウイルス（Badnavirus）、バルナウイルス科（Barnaviridae）、バルナウイルス（Barnavirus）、ブデロミクロウイルス（Bdellomicrovirus）、ベゴモウイルス（Begomovirus）、ベニウイルス（Benyvirus）、ベータクリプトウイルス（Betacryptovirus）、ベータヘルペスウイルス亜科（Betaherpesvirinae）、ベータノダウイルス（Betanodavirus）、ベータレトロウイルス（Betaretrovirus）、ベータテトラウイルス（Betatetravirus）、ビルナウイルス科（Birnaviridae）、ボルナウイルス科（Bornaviridae）、ボルナウイルス（Bornavirus）、ブラコウイルス（Bracovirus）、ブレビデンソウイルス（Brevidensoviras）、ブロモウイルス科（Bromoviridae）、ブロモウイルス（Bromovirus）、ブンヤウイルス科（Bunyaviridae）、ブンヤウイルス（Bunyavirus）、バイモウイルス（Bymovirus）、「c2様ウイルス（c2-like 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細菌性病原体
本明細書に記載される方法を用いて細菌微生物を検出することもできる。特定の対象となる病原性細菌は、免疫無防備状態の個体にとって特定の対象となるもの、並びにテロリストの攻撃に用いられる可能性のあるものを含み、下記に記載される。
炭疽
バチルス・アントラシスは、炭疽を引き起こす作用物質であり、恐るべき生物テロリストの脅威にさせるいくつかの特徴を有する。これらの特徴は、胞子形態でのその安定性、培養および生成の容易性、エアロゾル化できること、それが引き起こす疾患の重大性、および広範な使用に十分なワクチンが欠如していることを含む。
ヒト炭疽は、皮膚、吸引、および胃腸の3つの主要な臨床的形態を有する。未処置のままだとすると、3つ全ての形態は、敗血症および死に至る場合がある。皮膚および胃腸炭疽の早期の抗生物質による処置は、通常、治療効果的である；しかしながら、抗生物質療法を用いたとしても、吸引炭疽は、死に至る可能性のある疾患である。吸引炭疽に関する致死率の概算は、不完全な情報に基づくが、歴史的な割合は、適切な抗生物質および全ての他の利用可能な対症療法でさえも、天然に存在しているかまたは偶発的な感染に対して高い（約75パーセント）と考えられる。しかしながら、米国における炭疽への最近の意図的な曝露後の生存率は、最初の10症例について60パーセントであった。
吸引炭疽は、胞子が肺胞腔に置かれ、肺胞性マクロファージによって摂取された後に発症する。次に、生き残った胞子は、縦隔リンパ節に輸送され、そこでは、最大60日またはそれ以上で発芽する場合がある。発芽後、複製している細菌は、疾患をもたらす毒素を放出する。主要な毒性因子は、抗食作用性外部カプセルおよび少なくとも2つの十分に特徴付けられた毒素を含む。2つの毒素は、浮腫因子（EF）および致死因子（LF）と呼ばれ、細胞を破壊するか、またはそれらの正常な機能を阻害することができる。第3の成分は、保護抗原（PA）と呼ばれ、EFとLFに結合する場合、EFとLFが哺乳動物細胞上の特定の受容体に結合することができる。この複合体が内在化した後、細菌毒素作用が活性化される。研究者らは、最近、天然の受容体に結合する突然変異した組換えPA（rPA）を操作した。これらの突然変異rPAは、LFおよびEFの細胞への輸送をブロックし中断することによって野生型PAと置換することもできる。また、最近の研究は、PAが結合する哺乳動物細胞の受容体の領域を同定し、LF結合部位の構造を決定した。毒素結合部位を含む受容体の可溶性断片は、LFによる損傷から細胞を保護するためのおとりとして機能し得る。他の最近の試験は、LFがMAPKK（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ）に結合する部位、LFによる崩壊が細胞死を引き起こす重要な細胞内酵素を特徴付けている。
B.アントラシスの染色体ゲノムの配列決定は、ほぼ完了している。LF、EF、およびPAに関する遺伝子は、すでに配列決定されているプラスミドに含まれる。NIAIDは、B.アントラシスおよび関連桿菌の包括的なゲノム解析を用いた配列決定努力を広げている。研究者らは、選択された菌株、分離体、および関連した種由来の配列データを用いて、遺伝的バリエーションおよび多様性の程度を評価する。このゲノム情報は、菌株の間に記された病原性および毒性における相違のための基礎を評価するフレームワークを提供する。ゲノムデータの他の使用には、菌株の同定および分子遺伝型のための特定の分子マーカーおよび標的を同定するための基礎研究を支持すること；配列に基づく検出技術を開発すること；および有効なワクチン、治療薬、および診断ツールを設計することが含まれる。さらに、データは、表現型と相関する遺伝的多形、例えば薬剤耐性、病的状態、および感染力の検出、並びにインビボでの胞子の発芽に影響を及ぼす主要な事象またはプロセスを増加させる。包括的なバイオインフォマティックス供給源は、微生物のゲノムデータベースおよび関連ソフトウェアおよびバイオインフォマティックスツールの開発を支持し、維持する。これらのアプローチは、バイオテロリズムの薬剤として用いられる潜在性を有する他の微生物のプロトタイプとして役立つ。
ペスト
ペストは、細菌エルシニア・ペスティスによって引き起こされる。生物兵器としての使用に対する潜在性は、大量の細菌を生産しエアロゾル化するために開発された方法、および、ある種のその形態でのヒトからヒトへの伝染性に基づく。更なる因子は、世界中の研究所への細菌試料の広範な分配である。ほんの少数の毒性のエアロゾル化したY.ペスティスバチルスの吸引による感染は、肺ペスト、ヒトからヒトへの拡散され得るペストの非常に致死的な形態へと導くことが可能である。ペストの自然な蔓延は、主に、感染したげっ歯類からのノミによって伝染される腺ペストである。
肺ペストの症状は、発熱と咳を含み、肺炎などの他の呼吸器疾患の症状と似ている。症状は、曝露後1〜6日以内に表れ、急激に死に至る。未処置の場合、肺ペストは、100パーセントに達する死亡率を有する。抗生物質は、ペストに対して効果的であるが、効果的なワクチンは、広範には利用可能でない。
Y.ペスティスは、宿主の上皮細胞への侵入に非常に効果的であるが、その侵入の一因となる分子メカニズムは理解されていない。種々の鉄輸送メカニズム、並びに少なくとも3つのクオラムセンシングメカニズムの相互作用が関わっているようである。
Y.ペスティスのゲノムは、完全に配列決定されているので、適したワクチン候補化合物、診断試薬、および薬物介入の主要な標的を同定するのを手助けする病因における主要な事象を特徴づけるための努力を加速することが可能でなければならない。Y.ペスティスの外部表面膜タンパク質（Yomps）は、いくつか存在するが、重要な毒性因子であり、病因における主要な役割を演じているようである。Y.ペスティスは、プラスミドにコードされている毒性関連タンパク質のセットを有する。周囲温度およびCa++レベルは、いわゆる低Ca++反応（LCR）メカニズムを通じたこれらのタンパク質の発現および分泌を制御する。プラスミドにコードされたタンパク質の更なる特徴付け、および病因におけるそれらの役割は、効果的なサブユニットワクチンの根拠を提供することができた。
感染を引き起こすためには、Y.ペスティスおよび他の病原性細菌は、宿主の鉄-および/またはヘム-キレートタンパク質から鉄（本質的な微量栄養素）を取り出すことが必要である。Y.ペスティスは、鉄輸送および除去において重要な役割を果たす3つの部分的に特徴付けた鉄輸送システムを有する。これらのシステムの1つは、シデロホアに依存的であり、エルシニアバクチン（yersiniabactin）（Ybt）の合成を伴う。Ybtシステムは、ペストの初期段階において鉄捕捉に本質的であるので、初期介入および処置の優れた標的でありうる。
ボツリヌス中毒
ボツリヌス毒素は、胞子を形成する嫌気性細菌クロストリジウム・ボツリヌムによって生成され、意図的な曝露から多大な脅威を示す非常に毒性のある物質である。この毒素は、高い致死率であり、容易に生成され、環境に放出される。ボツリヌス毒素は、粘膜表面を通過して吸収され、末梢コリン作用性神経シナプスに不可逆的に結合する。この毒素には7個の抗原性タイプ（A-G）が存在する。7個全ての毒素は、類似の臨床所見および疾患を引き起こす；ボツリヌス毒素A、B、およびEは、米国において食物を媒介した大部分の病気に関与する。
この毒素への曝露は、筋麻痺；発話、嚥下、または視力障害；および、重篤な症例では、機械的呼吸の必要性を含む症状を誘導する。毒素に曝露された人々は、迅速かつ集中的な対症療法および処置を必要とする。症状の発病および重症度は、循環に吸収された毒素の割合および量に依存する。食物が媒介する曝露では、潜伏は2時間から8日まで変化するが、一般的には、72時間に限定される。新しい運動性軸索枝管が麻痺した筋肉を再度弱める（reenervate）と症状が鎮まり、成人では、数週間または数ヶ月かかる場合のあるプロセスである。
C.ボツリヌムは、通常、ヒトには感染しない。しかしながら、ヒトが、この生物に汚染された食品を食べた後、毒素に曝露される。ボツリヌス毒素の作用メカニズムは、十分に理解されている。この毒素は、神経毒素に本質的である1つのジスルフィド結合によって接合された重鎖および軽鎖からなる。毒素の配列および三次元構造の両方が決定されている。構造は、3つの機能的ドメイン：触媒サブユニット、転位ドメイン、および結合ドメインからなる。毒素は、末梢のコリン作用性シナプスのシナプス前膜上の不明確な受容体に、主に神経筋接合部で不可逆的に結合する。細胞質への毒素の内在化および転位後に、軽鎖上のZn++含有エンドペプチダーゼは、運動ニューロンからのアセチルコリン放出をブロックする。この放出は、アセチルコリン含有小胞と末端膜の融合を阻止することによってブロックされる。7個のボツリヌス毒素は、幾分異なったプロテアーゼ活性を示し、異なった部位で3つのSNAREタンパク質（シナプトブレビン/VAMP、SNAP-25、およびシンタキシン）を切断する。このタンパク質分解特異性の分子的機序は全く理解されていない。SNAREタンパク質は、シナプス前膜へのシナプス小胞の運搬に本質的である。
ツラレミア
ツラレミアは、その感染性のレベルが高いこと（10数個程度の生物が疾患を引き起こすかもしれない）およびエアロゾル化できることにより、潜在的な生物テロリスト作用物質である。フランシセラ・ツラレンシスは、ツラレミアを引き起こし、低温で数週間生存可能な胞子形成しない通性細胞内細菌である。この生物のうち2つの菌株が特徴付けられている - 欧州およびアジアで見られるB型よりも毒性である、北アメリカに見られるA型。疾患は、ヒトからヒトへと伝染はしない；小型ほ乳類または汚染した食物、土壌、もしくは水からヒトに自然と広がる。自然感染は、浮遊粒子の吸入後に起こる。
ツラレミアは、曝露経路に依存して、いくつかの形態の1つをとることができる。浮遊F.ツラレンシスの吸入に起因している疾患は、最も可能性の高い意図的な曝露である。吸入形態は、呼吸器曝露後の3〜5日で開始する急性、非特異的な病気である；ある症例では、胸膜肺炎が数日または数週間後に発症する。未処置の場合、疾患は、呼吸不全をもたらし得る。抗生物質による処置は、自然獲得症例に対して、2〜60パーセントまで死亡率を減少させる。IND（試験研究中の新規薬物）適用下で、数千のボランティアに投与された生きた弱毒化したツラレミアワクチンが開発されている。今日まで、このワクチンの使用は、実験室および他の高いリスクのあるヒトに限定されている。
毒性および病原性に関係する基本的なメカニズムは知られていない。F.ツラレンシスの細胞壁は、脂肪酸が異常に高い。カプセルの喪失は、生存率ではなく毒性の喪失をもたらすかもしれない；しかしながら、カプセルは、毒性も免疫原性もない。F.ツラレンシスを用いた感染は、細網内皮系と関連し、肺、肝臓、および脾臓における細菌複製をもたらす。呼吸曝露後、F.ツラレンシスは、肺マクロファージを含む食細胞に感染する。肝臓では、F.ツラレンシスは、肝細胞に侵入し、複製することが示されている。感染した肝細胞の破壊は、細菌の放出、その後の食細胞による摂取をもたらす。肝細胞の溶菌がモノクローナル抗体の投与により妨げられると、細菌は、肝細胞内で複製し続け、急速な致死率へと導いた。
吸入バクテリア
エアロゾル経路によって感染する潜在性を有するカテゴリーBおよびC細菌には、ブルセラ（Brucella）種（spp.）、ブルクホルデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei）、ブルクホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）、コクシエラ・バーネッティ（Coxiella burnetii）が含まれ、およびリケッチア（Rickettsia）spp.が選択される。これらの生物の大部分は、人獣共通疾患または感染、即ち、獣医動物（例えば、げっ歯類、トリ、家畜）からヒトへ伝染する可能性がある感染または感染症を引き起こす。異なった細菌は、摂取、吸入、または節足動物を媒介した伝染を含む異なった経路を通じてヒトに感染する。しかしながら、これら全ての作用物質は、少数の生物の吸入後に感染を引き起こすことができると考えられている。その結果として、これらの作用物質は、兵器化され、エアロゾルとして分散される可能性があるため、生物テロ防御に対して特別な懸案事項となっている。
ブルセラ症は、ブルセラspp.によって引き起こされ、主として、ヒツジ、ヤギ、およびウシの人獣共通感染であるが、ある種の野生生物、例えば、バイソン、エルク、およびシカにおいて発生する。ヒト感染は、中東、地中海沿岸地方、インド、および中国でさえも発生しているが、米国（U.S.）では稀である。自然なヒト感染は、職業上の曝露または汚染された肉または低温殺菌されていない乳製品の摂取後に起り得る。潜伏期間は、5〜60日で変化し得る。症状は、発熱を伴った急性病から脳、骨、尿生殖路および心内膜の慢性感染症まで多様である。主に、B.メリテンシスによって引き起こされる心内膜炎により、2％未満の感染症が死をもたらす。6種のうち4種のみのブルセラspp. - B.スイス（suis）、B.メリテンシス、B.アボルツス（abortus）、および - が、ヒトにおいてブルセラ症を引き起こすことが公知である；B.メリテンシスおよびB.スイスは、B.アボルツスまたはB.カニス（canis）よりもヒトに対してより毒性であると考えられている。
ブルクホルデリア・シュードマレイは、ヒトおよび他の哺乳動物およびトリにおいて類鼻疽を引き起こし、赤道近辺の国、特にアジアにおいて土壌および地表水に見られる。ヒト感染は、傷ついた皮膚、摂取、または汚染した水または埃の吸入を介した生物の侵入に起因する。疾患のいくつかの形態は、数日から多年の範囲の潜伏期間で存在する。大部分のヒトへの曝露は、結果として、疾患を伴わない血清変換に至る。急性敗血症性類鼻疽において、播種性B.シュードマレイは、肺、肝臓、腎臓、および/またはリンパ節において膿瘍を引き起こす場合がある。慢性または再発性類鼻疽では、肺およびリンパ節が最も一般的に影響を受ける。死亡率は、抗生物質による処置でさえも、重篤または慢性疾患にある者の間で高く、最大50％である。
ブルクホルデリア・マレイは、鼻疽を引き起こす生物であり、主に、ウマ、ラバ、およびロバの疾患である。米国では根絶されたが、アジア、アフリカ、および南アメリカの家畜ではなおも観察される。ヒトへの自然な伝染は稀であって、通常、皮膚病変をもたらす開放創の汚染に続く。エアロゾル曝露後の感染が報告されており、壊死性肺炎をもたらす。全身への拡散は、膿疱疹および急性の致死的な病気に至る場合がある。
家畜は、コクシエラ・バーネッティの一次保有体として機能を果たし、Q熱C.バーネッティの原因は、非常に感染性であり、世界中への分布である。感染した動物は、多くの場合、無症候性であるが、妊娠した動物は、流産または死産を被る可能性がある。Q熱は、感染した動物および死骸に密着した労働者の職業上の疾患であると考えられるが、感染は、密着が起きない場合においてエアロゾル化した細菌を通じて起っている。ほんの2、3個の生物の吸入が感染を引き起こす可能性がある。2〜3週間の潜伏期間後、発熱、頭痛、および頻繁には片側性の肺炎からなる急性疾患が始まる。生物は肺で増殖し、次に、血流に侵入し、重篤な症例では心内膜炎、肝炎、骨髄炎、または脳炎に至る。慢性感染症の最大65％の人々は、この疾患が原因で死亡する場合がある。C.バーネッティは、数週間から数ヶ月の間、空気および土壌に不活性な状態で生き続けることができ、多くの化学的殺菌剤および脱水剤に耐性である。
リケッチア・プロワツェキイ（Rickettsia prowazekii）などの発疹チフス群のリケッチアは、シラミおよびノミの顔面に伝染し、そこでは、数ヶ月間、安定な感染を維持した形態が存続する。R.リケッチイ（rickettsii）およびR.コノリイ（conorii）を含む紅斑熱群リケッチアは、ダニ咬傷によって伝染する。限られた研究では、あるリケッチア種はエアロゾル経路を介した低用量感染を有することが示唆されている。R.プロワツェキイおよびR.リケッチイは、最も重篤な感染を引き起こし、致死率は、播種性血管内皮感染のために、平均20〜25パーセントである。R.コノリイおよびR.チフィ（typhi）感染に関する致死率は、1〜3パーセントであり、感染した個体は、発熱、頭痛、筋肉痛、咳、吐き気、嘔吐を含む類似した臨床所見を示す。発疹は、多くの場合、症状の開始後の3〜5日で発現する。致死率は、小児においてより低い。
ブルセラspp.は、小さな、胞子を形成しない非運動性の好気性グラム陰性球桿菌（coccobacilli）である。一度生体内に入ると、ブルセラspp.は、多核白血球（PMN）およびマクロファージによって急速に食菌されるが、なおも細胞内生存し、生きながらえる場合がある。この生物がPMNによる細胞内殺菌を避けるメカニズムは、完全には理解されていない；しかしながら、PMNミエロペルオキシド-H2O2-ハロゲン化物系、および反応性酸素中間体を排除する銅-亜鉛スーパーオキシドジスムターゼの抑制を含みうる。マクロファージ内での細胞内生存は、可溶性ブルセラ産物によるファゴソーム-リソソームの融合の阻害によるものでありうる。外部細胞壁の平滑リポ多糖（S-LPS）成分は、主要な細胞壁抗原および毒性因子である。非平滑菌株は、毒性が減少し、通常の血清によってより溶菌し易くなる。B.スイス菌株1330の一菌株のゲノム配列は、まさに完了し、完了に近いヒツジブルセラ症と関連する二次菌株の配列とともに公開されている。B.メリテンシス菌株16Mのゲノム配列は、完了し、2002年初頭に公開された。
ブルクホルデリア・マレイおよびブルクホリデリア・シュードマレイはともに好気性グラム陰性桿菌である。B.マレイは非運動性であり、B.シュードマレイは運動性である。ブルクホルデリア毒性の根底にある分子メカニズムについてはほとんど知られていない。B.シュードマレイの多糖カプセルは、1つの重要な毒性因子であり、II型リポ多糖とともに毒素は、ある役割を果たすように提唱されてもいる。B.マレイのゲノム配列は、完了に近く、B.シュードマレイの配列は進行中である。
コクシエラ・バーネッティは、グラム陰性の非常に多形性の球桿菌である。それは、存在する細胞受容体を通じて受動的に宿主食細胞に侵入し、そこでは、ファゴリソソーム内で生存する。低いpHは、その生物の代謝に不可欠である。天然では、C.バーネッティは、補体に耐性であり、強力な免疫原である。細胞壁は、マウスにおいて毒性反応を生む免疫調節活性を有する。C.バーネッティのナイン・マイル（Nine Mile）菌株のゲノム配列が完了している。
リケッチアは、内皮細胞の細胞質または節足動物宿主の細胞に主に生息する小さな、グラム陰性の必須の細胞内細菌である。この生物は、シラミの咬傷部位で局所的な増殖を行い、血液を通じて広がり、次に、毛細血管の小動脈および小静脈の内皮細胞に感染する。紅斑熱リケッチアは、動作に基づく運動によって細胞から細胞へと広がり、感染した細胞は、反応性酸素種の生成によって損傷を受ける。チフス（thphus）群リケッチアは、細胞が破裂するまで細胞質中で増殖する。R.プロワツェキイ（マドリッドE菌株）およびR.コノリイ（ムリッシュ7菌株）のゲノム配列決定は完了し、R.チフィおよびR.リッケチイのそれらは、完了が近い。
古細菌
本明細書に記載される方法を用いて、限定されないが、アーケア（Archaea）（または古細菌）のドメインの下記の属のいずれかに由来する病原体を含む様々なタイプの病原体を検出することができる：アシジロブス（Acidilobus）、アエロピルム（Aeropyrum）、アーケオグロブス（Archaeoglobus）、カルジスファエラ（Caldisphaera）、カルジビルガ（Caldivirga）、デスルフロコッカス（Desulfurococcus）、デスルフロロブス（Desulfurolobus）、フェログロブス（Ferroglobus）、フェロプラズマ（Ferroplasma）、ゲオグロブス（Geoglobus）、ハロアルキュラ（Haloarcula）、ハロバクテリウム（Halobacterium）、ハロバキュラム（Halobaculum）、ハロビフォーマ（Halobiforma）、ハロコッカス（Halococcus）、ハロフェラックス（Haloferax）、ハロゲオメトリカム（Halogeometricum）、ハロメタノコッカス（Halomethanococcus）、ハロラブダス（Halorhabdus）、ハロルブロバクテリウム（Halorubrobacterium）、ハロルブラム（Halorubrum）、ハロシンプレックス（Halosimplex）、ハロテリゲナ（Haloterrigena）、ハイパーサーマス（Hyperthermus）、イグニコッカス（Ignicoccus）、メタロスファエラ（Metallosphaera）、メタニミクロコッカス（Methanimicrococcus）、メタノバクテリウム（Methanobacterium）、メタノブレビバクター（Methanobrevibacter）、メタノカルキュラス（Methanocalculus）、メタノカルドコッカス（Methanocaldococcus）、メタノコッコイデス（Methanococcoides）、メタノコッカス（Methanococcus）、メタノコルプスキュラム（Methanocorpusculum）、メタノキュレウス（Methanoculleus）、メタノフォリス（Methanofollis）、メタノゲニウム（Methanogenium）、メタノハロビウム（Methanohalobium）、メタノハロフィラス（Methanohalophilus）、メタノラシニア（Methanolacinia）、メタノロバス（Methanolobus）、メタノミクロビウム（Methanomicrobium）、メタノミクロコッカス（Methanomicrococcus）、メタノプラヌス（Methanoplanus）、メタノピルス（Methanopyrus）、メタノサエタ（Methanosaeta）、メタノサルサム（Methanosalsum）、メタノサルシナ（Methanosarcina）、メタノスファエラ（Methanosphaera）、メタノスピリルム（Methanospirillum）、メタノサーモバクター（Methanothermobacter）、メタノサーモコッカス（Methanothermococcus）、メタノテルムス（Methanothermus）、メタノスリックス（Methanothrix）、メタノトリス（Methanotorris）、ナトリアルバ（Natrialba）、ナトリネマ（Natrinema）、ナトロノバクテリウム（Natronobacterium）、ナトロノコッカス（Natronococcus）、ナトロノモナス（Natronomonas）、ナトロノルブラム（Natronorubrum）、パレオコッカス（Palaeococcus）、ピクロフィラス（Picrophilus）、ピロバキュラム（Pyrobaculum）、ピロコッカス（Pyrococcus）、ピロディクチウム（Pyrodictium）、ピロロブス（Pyrolobus）、スタフィロサーマス（Staphylothermus）、ステッテリア（Stetteria）、スチジオロブス（Stygiolobus）、スルフォロブス（Sulfolobus）、スルフォフォボコッカス（Sulfophobococcus）、スルフリスファエラ（Sulfurisphaera）、スルフロコッカス（Sulfurococcus）、サーモクラディウム（Thermocladium）、サーモコッカス（Thermococcus）、サーモジスカス（Thermodiscus）、サーモフィラム（Thermofilum）、サーモプラズマ（Thermoplasma）、サーモプロテウス（Thermoproteus）、サーモスファエラ（Thermosphaera）、およびヴァルカニシータ（Vulcanisaeta）。
真正細菌
本明細書に記載される方法を用いて、限定されないが、細菌（または真正細菌）のドメインの下記の属のいずれかに由来する病原体を含む種々のタイプの病原体を検出することができる：アビオトロフィア（Abiotrophia）、アセチトマキュラム（Acetitomaculum）、アセチビブリオ（Acetivibrio）、アセトアナエロビウム（Acetoanaerobium）、アセトバクター（Acetobacter）、アセトバクテリウム（Acetobacterium）、アセトフィラメンタム（Acetofilamentum）、アセトゲニウム（Acetogenium）、アセトハロビウム（Acetohalobium）、アセトミクロビウム（Acetomicrobium）、アセトネマ（Acetonema）、アセトサーマス（Acetothermus）、アコレプラズマ（Acholeplasma）、アクロマチウム（Achromatium）、アクロモバクター（Achromobacter）、アシドアミノバクター（Acidaminobacter）、アシドアミノコッカス（Acidaminococcus）、アシジミクロビウム（Acidimicrobium）、アシジフィリウム（Acidiphilium）、アシジスファエラ（Acidisphaera）、アシジチオバチルス（Acidithiobacillus）、アシドバクテリウム（Acidobacterium）、アシドセラ（Acidocella）、アシドモナス（Acidomonas）、アシドサーマス（Acidothermus）、アシドボラックス（Acidovorax）、アシネトバクター（Acinetobacter）、アクロカルポスポラ（Acrocarpospora）、アクチノアロテイクス（Actinoalloteichus）、アクチノバチルス（Actinobacillus）、アクチノバキュラム（Actinobaculum）、アクチノビスポラ（Actinobispora）、アクチノコラリア（Actinocorallia）、アクチノキネオスポラ（Actinokineospora）、アクチノマジュラ（Actinomadura）、アクチノマイセス（Actinomyces）、アクチノプラネス（Actinoplanes）、アクチノポリモルファ（Actinopolymorpha）、アクチノポリスポラ（Actinopolyspora）、アクチノピクニジウム（Actinopycnidium）、アクチノスポランギウム（Actinosporangium）、アクチノシネマ（Actinosynnema）、エジプチアネラ（Aegyptianella）、エキュオリビタ（Aequorivita）、アエロコッカス（Aerococcus）、アエロミクロビウム（Aeromicrobium）、アエロモナス（Aeromonas）、アフィピア（Afipia）、アギトコッカス（Agitococcus）、アグレイア（Agreia）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アグロコッカス（Agrococcus）、アグロモナス（Agromonas）、アグロマイセス（Agromyces）、アレンシア（Ahrensia）、アルビバクター（Albibacter）、アルビドブラム（Albidovulum）、アルカリゲネス（Alcaligenes）、アルカリリムニコラ（Alcalilimnicola）、アルカニボラックス（Alcanivorax）、アルゴリファーガス（Algoriphagus）、アリシクリフィラス（Alicycliphilus）、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、アリシェワネラ（Alishewanella）、アリスチペス（Alistipes）、アルカリバクテリウム（Alkalibacterium）、アルカリリムニコラ（Alkalilimnicola）、アルカリフィラス（Alkaliphilus）、アルカリスピリルム（Alkalispirillum）、アルカニンジゲス（Alkanindiges）、アリソネラ（Allisonella）、アロクロマチウム（Allochromatium）、アロファスチス（Allofustis）、アロイオコッカス（Alloiococcus）、アロモナス（Allomonas）、アロリゾビウム（Allorhizobium）、アルテロコッカス（Alterococcus）、アルテロモナス（Alteromonas）、アリシエラ（Alysiella）、アマリコッカス（Amaricoccus）、アミノバクター（Aminobacter）、アミノバクテリウム（Aminobacterium）、アミノモナス（Aminomonas）、アモニフェックス（Ammonifex）、アンモニフィラス（Ammoniphilus）、アモエボバクター（Amoebobacter）、アモルフォスポランギウム（Amorphosporangium）、アンフィバチルス（Amphibacillus）、アンプルラリエラ（Ampullariella）、アミコラタ（Amycolata）、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、アナエロアーカス（Anaeroarcus）、アナエロバクター（Anaerobacter）、アナエロバキュラム（Anaerobaculum）、アナエロビオスピリルム（Anaerobiospirillum）、アナエロブランカ（Anaerobranca）、アナエロコッカス（Anaerococcus）、アナエロフィラム（Anaerofilum）、アナエログロブス（Anaeroglobus）、アナエロリネア（Anaerolinea）、アナエロムサ（Anaeromusa）、アナエロミクソバクター（Anaeromyxobacter）、アナエロファガ（Anaerophaga）、アナエロプラズマ（Anaeroplasma）、アナエロラブダス（Anaerorhabdus）、アナエロシナス（Anaerosinus）、アナエロスティペス（Anaerostipes）、アナエロビブリオ（Anaerovibrio）、アナエロボラックス（Anaerovorax）、アナプラズマ（Anaplasma）、アンカロクロリス（Ancalochloris）、アンカロミクロビウム（Ancalomicrobium）、アンキロバクター（Ancylobacter）、アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）、アンジオコッカス（Angiococcus）、アングロミクロビウム（Angulomicrobium）、アノクシバチルス（Anoxybacillus）、アノクシナトロヌム（Anoxynatronum）、アンタクトバクター（Antarctobacter）、アクアバクター（Aquabacter）、アクアバクテリウム（Aquabacterium）、アクアミクロビウム（Aquamicrobium）、アクアスピリルム（Aquaspirillum）、アクイフェックス（Aquifex）、アラクニア（Arachnia）、アルカノバクテリウム（Arcanobacterium）、アルカンギウム（Archangium）、アルコバクター（Arcobacter）、アレニバクター（Arenibacter）、アロドモナス（Arhodomonas）、アルセノフォヌス（Arsenophonus）、アルスロバクター（Arthrobacter）、アサイア（Asaia）、アサノア（Asanoa）、アステロルプラズマ（Asteroleplasma）、アスチカコウリス（Asticcacaulis）、アトポバクター（Atopobacter）、アトポビウム（Atopobium）、アウランチモナス（Aurantimonas）、アウレオバクテリウム（Aureobacterium）、アゾアーカス（Azoarcus）、アゾモナス（Azomonas）、アゾモノトリコン（Azomonotrichon）、アゾネクス（Azonexus）、アゾリゾビウム（Azorhizobium）、アゾリゾピラス（Azorhizophilus）、アゾスピラ（Azospira）、アゾスピリラム（Azospirillum）、アゾトバクター（Azotobacter）、アゾビブリオ（Azovibrio）、バチルス（Bacillus）、バクテリオネマ（Bacterionema）、バクテリオボラックス（Bacteriovorax）、バクテロイデス（Bacteroides）、バクトデルマ（Bactoderma）、バルネアリウム（Balnearium）、バルネアトリックス（Balneatrix）、バルトネラ（Bartonella）、ブデロビブリオ（Bdellovibrio）、ベギアトア（Beggiatoa）、ベイジェリンキア（Beijerinckia）、ベネケア（Beneckea）、ベルゲイエラ（Bergeyella）、ボーテンベルジア（Beutenbergia）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、ビロフィラ（Bilophila）、ブラストバクター（Blastobacter）、ブラストクロリス（Blastochloris）、ブラストコッカス（Blastococcus）、ブラストモナス（Blastomonas）、ブラッタバクテリウム（Blattabacterium）、ボゴリエラ（Bogoriella）、ボルデテラ（Bordetella）、ボレリア（Borrelia）、ボセア（Bosea）、ブラキバクテリウム（Brachybacterium）、ブラキモナス（Brachymonas）、ブラキスピラ（Brachyspira）、ブラッキエラ（Brackiella）、ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）、ブラナメラ（Branhamella）、ブレネリア（Brenneria）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、ブレビネーマ（Brevinema）、ブレバンジモナ（Brevundimonas）、ブロコスリックス（Brochothrix）、ブルセラ（Brucella）、ブルミミクロビウム（Brumimicrobium）、ブクネラ（Buchnera）、バドビシア（Budvicia）、ブレイジア（Bulleidia）、バークホルデリア（Burkholderia）、バッチオークセラ（Buttiauxella）、ブチリビブリオ（Butyrivibrio）、カエジバクター（Caedibacter）、カエニバクテリウム（Caenibacterium）、カルデロバクテリウム（Calderobacterium）、カルジセルロシラプター（Caldicellulosiruptor）、カルジリネア（Caldilinea）、カルジモナス（Caldimonas）、カルジスリックス（Caldithrix）、カロラマター（Caloramator）、カロラナエロバクター（Caloranaerobacter）、カリマトバクテリウム（Calymmatobacterium）、カミニバクター（Caminibacter）、カミニセラ（Caminicella）、カンピロバクター（Campylobacter）、カプノサイトファーガ（Capnocytophaga）、カプスラリス（Capsularis）、カルボフィラス（Carbophilus）、カルボキシジブラキウム（Carboxydibrachium）、カルボキシドブラキウム（Carboxydobrachium）、カルボキシドセラ（Carboxydocella）、カルボキシドサーマス（Carboxydothermus）、カルディオバクテリウム（Cardiobacterium）、カルニモナス（Carnimonas）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、カリオファノン（Caryophanon）、カセオバクター（Caseobacter）、カテラトスポラ（Catellatospora）、カテニバクテリウム（Catenibacterium）、カテノコッカス（Catenococcus）、カテヌロプラネス（Catenuloplanes）、カトネラ（Catonella）、カウロバクター（Caulobacter）、セデセア（Cedecea）、セルロモナス（Cellulomonas）、セルロファーガ（Cellulophaga）、セルロシミクロビウム（Cellulosimicrobium）、セルビブリオ（Cellvibrio）、センチペダ（Centipeda）、セトバクテリウム（Cetobacterium）、カイニア（Chainia）、ケラトバクター（Chelatobacter）、ケラトコッカス（Chelatococcus）、キチノファガ（Chitinophaga）、クラミジア（Chlamydia）、クラミドフィラ（Chlamydophila）、クロロバキュラム（Chlorobaculum）、クロロビウム（Chlorobium）、クロロフレクサス（Chloroflexus）、クロロヘルペトン（Chloroherpeton）、クロロネマ（Chloronema）、コンドロミセス（Chondromyces）、クロマチウム（Chromatium）、クロモバクテリウム（Chromobacterium）、
クロモハロバクター（Chromohalobacter）、クリセオバクテリウム（Chryseobacterium）、クリセオモナス（Chryseomonas）、クリシオゲネス（Chrysiogenes）、シトリコッカス（Citricoccus）、シトロバクター（Citrobacter）、クラビバクター（Clavibacter）、クレベランジナ（Clevelandina）、クロストリジウム（Clostridium）、コベチア（Cobetia）、コエノニア（Coenonia）、コリンセラ（Collinsella）、コルウェリア（Colwellia）、コマモナス（Comamonas）、コネクシバクター（Conexibacter）、コングロメロモナス（Conglomeromonas）、コプロバチルス（Coprobacillus）、コプロコッカス（Coprococcus）、コプロサーモバクター（Coprothermobacter）、コリオバクテリウム（Coriobacterium）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、コウチオプラネス（Couchioplanes）、カウドリア（Cowdria）、コクシエラ（Coxiella）、クラウロコッカス（Craurococcus）、クレノトリックス（Crenothrix）、クリナリウム（Crinalium）（有効には公開されていない）、クリスチスピラ（Cristispira）、クロセイバクター（Croceibacter）、クロシニトミックス（Crocinitomix）、クロシエラ（Crossiella）、クリオバクテリウム（Cryobacterium）、クリオモルファ（Cryomorpha）、クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）、クリプトスポランギウム（Cryptosporangium）、カプリアビダス（Cupriavidus）、クルトバクテリウム（Curtobacterium）、サイクロバクテリウム（Cyclobacterium）、サイクロクラスチクス（Cycloclasticus）、シストバクター（Cystobacter）、サイトファーガ（Cytophaga）、ダクチロスポランギウム（Dactylosporangium）、デクロロモナス（Dechloromonas）、デクロロソマ（Dechlorosoma）、デフェリバクター（Deferribacter）、デフルビバクター（Defluvibacter）、デハロバクター（Dehalobacter）、デハロスピリルム（Dehalospirillum）、デイノバクター（Deinobacter）、デイノコッカス（Deinococcus）、デレヤ（Deleya）、デルフチア（Delftia）、デメトリア（Demetria）、デンドラスポロバクター（Dendrosporobacter）、デニトロバクテリウム（Denitrobacterium）、デニトロビブリオ（Denitrovibrio）、デルマバクター（Dermabacter）、デルマコッカス（Dermacoccus）、デルマトフィルス（Dermatophilus）、デルキシア（Derxia）、デセムジア（Desemzia）、デスルファシヌム（Desulfacinum）、デスルフィトバクテリウム（Desulfitobacterium）、デスルフォバッカ（Desulfobacca）、デスルフォバクター（Desulfobacter）、デスルフォバクテリウム（Desulfobacterium）、デスルフォバキュラ（Desulfobacula）、デスルフォブルバス（Desulfobulbus）、デスルフォカプサ（Desulfocapsa）、デスルフォセラ（Desulfocella）、デスルフォコッカス（Desulfococcus）、デスルフォファバ（Desulfofaba）、デスルフォフリグス（Desulfofrigus）、デスルフォファスチス（Desulfofustis）、デスルフォハロビウム（Desulfohalobium）、デスルフォミクロビウム（Desulfomicrobium）、デスルフォモナス（Desulfomonas）、デスルフォモニレ（Desulfomonile）、デスルフォムサ（Desulfomusa）、デスルフォナトロノビブリオ（Desulfonatronovibrio）、デスルフォナトロナム（Desulfonatronum）、デスルフォナウティカス（Desulfonauticus）、デスルフォネマ（Desulfonema）、デスルフォニスポラ（Desulfonispora）、デスルフォレグラ（Desulforegula）、デスルフォラブダス（Desulforhabdus）、デスルフォロパラス（Desulforhopalus）、デスルフォサルシナ（Desulfosarcina）、デスルフォスピラ（Desulfospira）、デスルフォスポロシナス（Desulfosporosinus）、デスルフォタレア（Desulfotalea）、デスルフォチグヌム（Desulfotignum）、デスルフォトマクルム（Desulfotomaculum）、デスルフォビブリオ（Desulfovibrio）、デスルフォヴィルガ（Desulfovirga）、デスルフレラ（Desulfurella）、デスルフロバクテリウム（Desulfurobacterium）、デスルフロモナス（Desulfuromonas）、デスルフォロムサ（Desulfuromusa）、デシオスルフォビブリオ（Dethiosulfovibrio）、デボシア（Devosia）、ディアリスター（Dialister）、ディアフォロバクター（Diaphorobacter）、ディケロバクター（Dichelobacter）、ディコトミクロビウム（Dichotomicrobium）、ディクティオグロムス（Dictyoglomus）、ディエツィア（Dietzia）、ディプロカリクス（Diplocalyx）、ドロシコッカス（Dolosicoccus）、ドロシグラヌラム（Dolosigranulum）、ドレア（Dorea）、ドゥガネラ（Duganella）、ディヤドバクター（Dyadobacter）、ディスゴノモナス（Dysgonomonas）、エクトチオロドスピラ（Ectothiorhodospira）、エドワードシエラ（Edwardsiella）、エッゲルセラ（Eggerthella）、オーリキア（Ehrlichia）、エイクネラ（Eikenella）、エリトロスポランギウム（Elytrosporangium）、エンペドバクター（Empedobacter）、エンヒドロバクター（Enhydrobacter）、エンヒグロミクサ（Enhygromyxa）、エンシファー（Ensifer）、エンテロバクター（Enterobacter）、エンテロコッカス（Enterococcus）、エンテロビブリオ（Enterovibrio）、エントモプラスマ（Entomoplasma）、エペリスロゾーン（Eperythrozoon）、エレモコッカス（Eremococcus）、エルウィニア（Erwinia）、エリジペロスリックス（Erysipelothrix）、エリスロバククター（Erythrobacter）、エリスロミクロビウム（Erythromicrobium）、エリスロモナス（Erythromonas）、エシェリキア（Escherichia）、ユーバクテリウム（Eubacterium）、エウィンゲラ（Ewingella）、エクセロスポラ（Excellospora）、エキシグオバクテリウム（Exiguobacterium）、ファクラミア（Facklamia）、ファエカリバクテリウム（Faecalibacterium）、ファエニア（Faenia）、ファルチビブリオ（Falcivibrio）、フェリバクテリウム（Ferribacterium）、フェリモナス（Ferrimonas）、フェルヴィドバクテリウム（Fervidobacterium）、フィブロバクター（Fibrobacter）、フィリバクター（Filibacter）、フィリファクター（Filifactor）、フィロバチルス（Filobacillus）、フィロミクロビウム（Filomicrobium）、ファインゴルジア（Finegoldia）、フラメオビルガ（Flammeovirga）、フラビモナス（Flavimonas）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、フレクトバチルス（Flectobacillus）、フレキシバクター（Flexibacter）、フレキシスチペス（Flexistipes）、フレキシスリックス（Flexithrix）、フルオリバクター（Fluoribacter）、フォルミビブリオ（Formivibrio）、フランシセラ（Francisella）、フランキア（Frankia）、フラテウリア（Frateuria）、フリードマンニエラ（Friedmanniella）、フリゴリバクテリウム（Frigoribacterium）、フルビマリナ（Fulvimarina）、フルビモナス（Fulvimonas）、フンジバクター（Fundibacter）、フシバクター（Fusibacter）、フソバクテリウム（Fusobacterium）、ガリバクテリウム（Gallibacterium）、ガリコラ（Gallicola）、ガリオネラ（Gallionella）、ガルシエラ（Garciella）、ガルドネレラ（Gardnerella）、ゲリジバクター（Gelidibacter）、ゲルリア（Gelria）、ゲメラ（Gemella）、ゲンマタ（Gemmata）、ゲマチモナス（Gemmatimonas）、ゲミガー（Gemmiger）、ジモバクター（Gemmobacter）、ゲオバチルス（Geobacillus）、ゲオバクター（Geobacter）、ゲオデルマトフィラス（Geodermatophilus）、ゲオルゲニア（Georgenia）、ゲオトリクス（Geothrix）、ゲオトガ（Geotoga）、ゲオビブリオ（Geovibrio）、グラシエコラ（Glaciecola）、グロビカテラ（Globicatella）、グルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）、グルコノアセトバクター（Gluconoacetobacter）、グルコノバクター（Gluconobacter）、グリコマイセス（Glycomyces）、ゴルドニア（Gordonia）、ゴルドニア（Gordonia）、グラシリバチルス（Gracilibacillus）、グラハメラ（Grahamella）、グラヌリカテラ（Granulicatella）、グリモンチア（Grimontia）、ヘモバルトネラ（Haemobartonella）、ヘモフィラス（Haemophilus）、ハフニア（Hafnia）、ハエラ（Hahella）、ハラナエロバクター（Halanaerobacter）、ハラナエロビウム（Halanaerobium）、ハリアンギウム（Haliangium）、ハリスコメノバクター（Haliscomenobacter）、ハレラ（Hallella）、ハロアナエロバクター（Haloanaerobacter）、ハロアナエロビウム（Haloanaerobium）、ハロバチルス（Halobacillus）、ハロバクテロイデス（Halobacteroides）、ハロセラ（Halocella）、ハロクロマチウム（Halochromatium）、ハロインコラ（Haloincola）、ハロミクロビウム（Halomicrobium）、ハロモナス（Halomonas）、ハロナトロヌム（Halonatronum）、ハロロドスピラ（Halorhodospira）、ハロスピルリナ（Halospirulina）、ハロサーモトリクス（Halothermothrix）、ハロシオバチルス（Halothiobacillus）、ハロビブリオ（Halovibrio）、ヘルココッカス（Helcococcus）、ヘリオバチルス（Heliobacillus）、ヘリコバクター（Helicobacter）、ヘリオバクテリウム（Heliobacterium）、ヘリオフィルム（Heliophilum）、ヘリオレスチス（Heliorestis）、ヘリオトリクス（Heliothrix）、ヘルバスピリルム（Herbaspirillum）、ヘルビドスポラ（Herbidospora）、ヘルペトシフォン（Herpetosiphon）、ヒペア（Hippea）、ヒルスチア（Hirschia）、ヒストフィルス（Histophilus）、ホルデマニア（Holdemania）、ホランジナ（Hollandina）、ホロファガ（Holophaga）、ホロスポラ（Holospora）、ホンギア（Hongia）、ヒドロゲノバクター（Hydrogenobacter）、ヒドロゲノバキュラム（Hydrogenobaculum）、ヒドロゲノファーガ（Hydrogenophaga）、ヒドロゲノフィラス（Hydrogenophilus）、ヒドロゲノサーマス（Hydrogenothermus）、ヒドロゲノビブリオ（Hydrogenovibrio）、ヒメノバクター（Hymenobacter）、ヒフォミクロビウム（Hyphomicrobium）、ヒフォモナス（Hyphomonas）、イデオネラ（Ideonella）、イジオマリナ（Idiomarina）、イグナビグラナム（Ignavigranum）、イリオバクター（Ilyobacter）、インクイリヌス（Inquilinus）、イントラスポランギウム（Intrasporangium）、イオドバクター（Iodobacter）、イソバキュラム（Isobaculum）、イソクロマチウム（Isochromatium）、イソスファエラ（Isosphaera）、ヤニバクター（Janibacter）、ヤナスチア（Jannaschia）、ヤンシノバクテリウム（Janthinobacterium）、ヨトガリバチルス（Jeotgalibacillus）、ヨトガリコッカス（Jeotgalicoccus）、ヨンソネラ（Johnsonella）、ヨネシア（Jonesia）、ケルスタシア（Kerstersia）、ケトグロニシゲニウム（Ketogulonicigenium）、ケトグロニゲニウム（Ketogulonigenium）、キデロスポランギウム（Kibdelosporangium）、キネオコッカス（Kineococcus）、キネオスファエラ（Kineosphaera）、キネオスポリア（Kineosporia）、キンゲラ（Kingella）、キタサトア（Kitasatoa）、キタサトスポラ（Kitasatospora）、キタサトスポリア（Kitasatosporia）、クレブシエラ（Klebsiella）、クライベラ（Kluyvera）、ノエリア（Knoellia）、コクリア（Kocuria）、コセレラ（Koserella）、コザキア（Kozakia）、クリベラ（Kribbella）、クルチア（Kurthia）、クツネリア
（Kutzneria）、キトコッカス（Kytococcus）、ラブリス（Labrys）、ラクノバクテリウム（Lachnobacterium）、ラクノスピラ（Lachnospira）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、ラクトスファエラ（Lactosphaera）、ランプロバクター（Lamprobacter）、ランプロシスチス（Lamprocystis）、ランプロペジア（Lampropedia）、ラリバクター（Laribacter）、ラウトロピア（Lautropia）、ロウソニア（Lawsonia）、レケバリエリア（Lechevalieria）、レクレルシア（Leclercia）、レジオネラ（Legionella）、レイフソニア（Leifsonia）、レイシンゲラ（Leisingera）、レミノレラ（Leminorella）、レンチバチルス（Lentibacillus）、レンツゼア（Lentzea）、レプトネマ（Leptonema）、レプトスピラ（Leptospira）、レプトスピリルム（Leptospirillum）、レプトトリクス（Leptothrix）、レプトトリヒア（Leptotrichia）、ロイコバクター（Leucobacter）、ロイコノストック（Leuconostoc）、ロイコトリクス（Leucothrix）、レビネア（Levinea）、レウィネラ（Lewinella）、リムノバクター（Limnobacter）、リムノトリクス（Limnothrix）、リステリア（Listeria）、リストネラ（Listonella）、ロネピネラ（Lonepinella）、ロンギスポラ（Longispora）、ルシバクテリウム（Lucibacterium）、ルテイモナス（Luteimonas）、ルテオコッカス（Luteococcus）、ライソバクター（Lysobacter）、リチカム（Lyticum）、マクロコッカス（Macrococcus）、マクロモナス（Macromonas）、マグネトスピリラム（Magnetospirillum）、マロノモナス（Malonomonas）、マンヘイミア（Mannheimia）、マリカウリス（Maricaulis）、マリクロマチウム（Marichromatium）、マリニバチルス（Marinibacillus）、マリニラビリア（Marinilabilia）、マリニラクチバチルス（Marinilactibacillus）、マリニサーマス（Marinithermus）、マリニトガ（Marinitoga）、マリノバクター（Marinobacter）、マリノバクテリウム（Marinobacterium）、マリノコッカス（Marinococcus）、マリノモナス（Marinomonas）、マリノスピリルム（Marinospirillum）、マルモリコラ（Marmoricola）、マシリア（Massilia）、メガモナス（Megamonas）、メガスファエラ（Megasphaera）、メイオテルムス（Meiothermus）、メリッソコッカス（Melissococcus）、メリッタンギウム（Melittangium）、メニスカス（Meniscus）、メソニア（Mesonia）、メソフィロバクター（Mesophilobacter）、メソプラズマ（Mesoplasma）、メソリゾビウム（Mesorhizobium）、メチラルキュラ（Methylarcula）、メチロバチルス（Methylobacillus）、メチロバクター（Methylobacter）、メチロバクテリウム（Methylobacterium）、メチロカルダム（Methylocaldum）、メチロカプサ（Methylocapsa）、メチロセラ（Methylocella）、メチロコッカス（Methylococcus）、メチロシスティス（Methylocystis）、メチロマイクロビウム（Methylomicrobium）、メチロモナス（Methylomonas）、メチロファガ（Methylophaga）、メチロピラス（Methylophilus）、メチロピラ（Methylopila）、メチロラブダス（Methylorhabdus）、メチロサルシナ（Methylosarcina）、メチロシヌス（Methylosinus）、メチロスファエラ（Methylosphaera）、メチロボラス（Methylovorus）、ミカビブリオ（Micavibrio）、ミクロバクテリウム（Microbacterium）、ミクロビスポラ（Microbispora）、ミクロブルビフェル（Microbulbifer）、ミクロコッカス（Micrococcus）、ミクロシクルス（Microcyclus）、ミクロシスチス（Microcystis）、ミクロエロボスポリア（Microellobosporia）、ミクロルナタス（Microlunatus）、ミクロモナス（Micromonas）、ミクロモノスポラ（Micromonospora）、ミクロポリスポラ（Micropolyspora）、ミクロプルイナ（Micropruina）、ミクロスシラ（Microscilla）、ミクロスファエラ（Microsphaera）、ミクロテトラスポラ（Microtetraspora）、ミクロビルガ（Microvirga）、ミクロビルグラ（Microvirgula）、ミツオケラ（Mitsuokella）、モビルンカス（Mobiluncus）、モデストバクター（Modestobacter）、メレレラ（Moellerella）、モギバクテリウム（Mogibacterium）、モーレラ（Moorella）、モラクセラ（Moraxella）、モルガネラ（Morganella）、モリテラ（Moritella）、モロコッカス（Morococcus）、ムリカウダ（Muricauda）、ムリコッカス（Muricoccus）、ミセトコラ（Mycetocola）、ミコバクテリウム（Mycobacterium）、マイコプラナ（Mycoplana）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、ミロイデス（Myroides）、ミクソコッカス（Myxococcus）、ナンノシスチス（Nannocystis）、ナトロニエラ（Natroniella）、ナトロニンコラ（Natronincola）、ナトロノインコラ（Natronoincola）、ナウチリア（Nautilia）、ナイセリア（Neisseria）、ネオクラミジア（Neochlamydia）、ネオリケッチア（Neorickettsia）、ネプツノモナス（Neptunomonas）、ネステレンコニア（Nesterenkonia）、ネブスキア（Nevskia）、ニトロバクター（Nitrobacter）、ニトロコッカス（Nitrococcus）、ニトロソコッカス（Nitrosococcus）、ニトロソロブス（Nitrosolobus）、ニトロソモナス（Nitrosomonas）、ニトロソスピラ（Nitrosospira）、ニトロスピナ（Nitrospina）、ニトロスピラ（Nitrospira）、ノカルジア（Nocardia）、ノカルジオイデス（Nocardioides）、ノカルジオプシス（Nocardiopsis）、ノノムラエ（Nonomuraea）、ノノムリア（Nonomuria）、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）、オブスムバクテリウム（Obesumbacterium）、オセアニコウリス（Oceanicaulis）、オセアニモナス（Oceanimonas）、オセアニスファエラ（Oceanisphaera）、オセアニサーマス（Oceanithermus）、オセアノバチルス（Oceanobacillus）、オセアノバクター（Oceanobacter）、オセアノモナス（Oceanomonas）、オセアノスピリルム（Oceanospirillum）、オクロバクトラム（Ochrobactrum）、オクタデカバクター（Octadecabacter）、オエノコッカス（Oenococcus）、エルスコビア（Oerskovia）、オキバクテリウム（Okibacterium）、オレイフィラス（Oleiphilus）、オレイスピラ（Oleispira）、オリゲラ（Oligella）、オリゴトロファ（Oligotropha）、オルセネラ（Olsenella）、オピツツス（Opitutus）、オレニア（Orenia）、オリバキュラム（Oribaculum）、オリエンチア（Orientia）、オルニチニコッカス（Ornithinicoccus）、オルニチニミクロビウム（Ornithinimicrobium）、オルニトバクテリウム（Ornithobacterium）、オシロクロリス（Oscillochloris）、オシロスピラ（Oscillospira）、オクサリチバクテリウム（Oxalicibacterium）、オクサロバクター（Oxalobacter）、オクサロファガス（Oxalophagus）、オクソバクター（Oxobacter）、パエニバチルス（Paenibacillus）、パンドラエ（Pandoraea）、パンノニバクター（Pannonibacter）、パントエア（Pantoea）、パピリバクター（Papillibacter）、パラクラミジア（Parachlamydia）、パラコッカス（Paracoccus）、パラクラウロコッカス（Paracraurococcus）、パララクトバチルス（Paralactobacillus）、パラリオバチルス（Paraliobacillus）、パラスカルドビア（Parascardovia）、パルブラルキュラ（Parvularcula）、パステウレラ（Pasteurella）、パステウリア（Pasteuria）、パウチモナス（Paucimonas）、ペクチナタス（Pectinatus）、ペクトバクテリウム（Pectobacterium）、ペディオコッカス（Pediococcus）、ペドバクター（Pedobacter）、ペドミクロビウム（Pedomicrobium）、ペルクザリア（Pelczaria）、ペリステガ（Pelistega）、ペロバクター（Pelobacter）、ペロジクチオン（Pelodictyon）、ペロスポラ（Pelospora）、ペロトマキュラム（Pelotomaculum）、ペプトコッカス（Peptococcus）、ペプトニフィラス（Peptoniphilus）、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）、ペルセフォネラ（Persephonella）、ペルシコバクター（Persicobacter）、ペトロトガ（Petrotoga）、フェニギア（Pfennigia）、ファエオスピリルム（Phaeospirillum）、ファスコラルクトバクテリウム（Phascolarctobacterium）、フェニロバクテリウム（Phenylobacterium）、フォコエノバクター（Phocoenobacter）、フォトバクテリウム（Photobacterium）、フォトラブダス（Photorhabdus）、フィロバクテリウム（Phyllobacterium）、ピグメンチファガ（Pigmentiphaga）、ピリメリア（Pilimelia）、ピロチナ（Pillotina）、ピメロバクター（Pimelobacter）、ピレラ（Pirella）、ピレルーラ（Pirellula）、ピシリケッチア（Piscirickettsia）、プランクトマイセス（Planctomyces）、プランクトトリコイデス（Planktothricoides）、プランクトトリクス（Plankto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ロドサラシウム（Rhodothalassium）、ロドサーマス（Rhodothermus）、ロドビブリオ（Rhodovibrio）、ロドブルム（Rhodovulum）、リケッチア（Rickettsia）、リケッチエラ（Rickettsiella）、リエメレラ（Riemerella）、リケネラ（Rikenella）、ロカリマエ（Rochalimaea）、ロセアテレス（Roseateles）、ロゼブリア（Roseburia）、ロセイビウム（Roseibium）、ロゼイフレクサス（Roseiflexus）、ロゼイナトロノバクター（Roseinatronobacter）、ロゼイビバックス（Roseivivax）、ロゼオバクター（Roseobacter）、ロゼオコッカス（Roseococcus）、ロゼオモナス（Roseomonas）、ロゼオスピラ（Roseospira）、ロゼオスピリルム（Roseospirillum）、ロゼオバリウス（Roseovarius）、ロシア（Rothia）、ルブリモナス（Rubrimonas）、ルブリテピダ（Rubritepida）、ルブリビバックス（Rubrivivax）、ルブロバクター（Rubrobacter）、ルエゲリア（Ruegeria）、ルガモナス（Rugamonas）、ルミノバクター（Ruminobacter）、ルミノコッカス（Ruminococcus）、ルネラ（Runella）、サッカロバクター（Saccharobacter）、サッカロコッカス（Saccharococcus）、サッカロモノスポラ（Saccharomonospora）、サッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）、サッカロスピリルム（Saccharospirillum）、サッカロトリクス（Saccharothrix）、サギツラ（Sagittula）、サラナ（Salana）、サレゲンチバクター（Salegentibacter）、サリバチルス（Salibacillus）、サリニバクター（Salinibacter）、サリニバクテリウム（Salinibacterium）、サリニコッカス（Salinicoccus）、サリニスファエラ（Salinisphaera）、サリニビブリオ（Salinivibrio）、サルモネラ（Salmonella）、サムソニア（Samsonia）、サンダラシノバクター（Sandaracinobacter）、サングイバクター（Sanguibacter）、サプロスピラ（Saprospira）、サルシナ（Sarcina）、サルコビウム（Sarcobium）、スカルドビア（Scardovia）、シネリア（Schineria）、シレゲレラ（Schlegelella）、シュワルチア（Schwartzia）、セバルデラ（Sebaldella）、セジメンチバクター（Sedimentibacter）、セレニハラナエロバクター（Selenihalanaerobacter）、セレノモナス（Selenomonas）、セリベリア（Seliberia）、セルペンス（Serpens）、セルプラ（Serpula）、セルプリナ（Serpulina）、セラチア（Serratia）、シュワネラ（Shewanella）、シゲラ（Shigella）、シュトルウォルチア（Shuttleworthia）、シリチバクター（Silicibacter）、シムカニア（Simkania）、シモンシエラ（Simonsiella）、シノリゾビウム（Sinorhizobium）、スケルマネラ（Skermanella）、スケルマニア（Skermania）、スラクキア（Slackia）、スミテラ（Smithella）、スネアチア（Sneathia）、ソダリス（Sodalis）、ソエンゲニア（Soehngenia）、ソリルブロバクター（Solirubrobacter）、ソロバクテリウム（Solobacterium）、スファエロバクター（Sphaerobacter）、スファエロチラス（Sphaerotilus）、スフィンゴバクテリウム（Sphingobacterium）、スフィンゴビウム（Sphingobium）、スフィンゴモナス（Sphingomonas）、スフィンゴピクシス（Sphingopyxis）、スピリリプラネス（Spirilliplanes）、スピリロスポラ（Spirillospora）、スピリルム（Spirillum）、スピロヘータ（Spirochaeta）、スピロプラズマ（Spiroplasma）、スピロソーマ（Spirosoma）、スポラナエロバクター（Sporanaerobacter）、スポリクチヤ（Sporichthya）、スポロバクター（Sporobacter）、スポロバクテリウム（Sporobacterium）、スポロシトファガ（Sporocytophaga）、スポロハロバクター（Sporohalobacter）、スポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）、スポロムサ（Sporomusa）、スポロサルシナ（Sporosarcina）、スポロトマキュラム（Sporotomaculum）、スタレヤ（Staleya）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、スタピア（Stappia）、スタルケヤ（Starkeya）、ステラ（Stella）、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）、ステロリバクテリウム（Sterolibacterium）、スチビオバクター（Stibiobacter）、スチグマテラ（Stigmatella）、ストマトコッカス（Stomatococcus）、ストレプトアシジフィラス（Streptacidiphilus）、ストレプチモノスポラ（Streptimonospora）、ストレプトアロテイカス（Streptoalloteichus）、ストレプトバチルス（Streptobacillus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、ストレプトモノスポラ（Streptomonospora）、ストレプトマイセス（Streptomyces）:S.アビコエンシス（S.abikoensis）、S.エルンペンス（S.erumpens）、S.エリトラエウス（S.erythraeus）、S.ミシガネンシス（S.michiganensis）、S.ミクロフラバス（S.microflavus）、S.ザオミセチカス（S.zaomyceticus）、ストレプトスポランギウム（Streptosporangium）、ストレプトベルチシリウム（Streptoverticillium）、サブテルコラ（Subtercola）、サクシニクラスチカム（Succiniclasticum）、サクシニモナス（Succinimonas）、サクシニスピラ（Succinispira）、サクシニビブリオ（Succinivibrio）、スルフィトバクター（Sulfitobacter）、スルフォバチルス（Sulfobacillus）、スルフリヒドロゲニビウム（Sulfurihydrogenibium）、スルフリモナス（Sulfurimonas）、スルフロスピリルム（Sulfurospirillum）、ステレラ（Sutterella）、ストネラ（Suttonella）、シンビオバクテリウム（Symbiobacterium）、シムビオテス（Symbiotes）、シネルギステス（Synergistes）、シントロフォバクター（Syntrophobacter）、シントロフォボツラス（Syntrophobotulus）、シントロフォコッカス（Syntrophococcus）、シントロフォモナス（Syntrophomonas）、シントロフォスポラ（Syntrophospora）、シントロフォサーマス（Syntrophothermus）、シントロファス（Syntrophus）、タンネレラ（Tannerella）、タトロキア（Tatlockia）、タツメラ（Tatumella）、タイロレラ（Taylorella）、テクチバクター（Tectibacter）、テイココッカス（Teichococcus）、テルリア（Telluria）、テナチバクラム（Tenacibaculum）、テピジバクター（Tepidibacter）、テピジモナス（Tepidimonas）、テピジフィラス（Tepidiphilus）、テラサキエラ（Terasakiella）、テレジニバクター（Teredinibacter）、テラバクター（Terrabacter）、テラコッカス（Terracoccus）、テサラコッカス（Tessaracoccus）、テトラゲノコッカス（Tetragenococcus）、テトラスファエラ（Tetrasphaera）、サラソモナス（Thalassomonas）、サラソスピラ（Thalassospira）、サウエラ（Thauera）、サーマセトゲニウム（Thermacetogenium）、サーマエロバクター（Thermaerobacter）、サーマナエロモナス（Thermanaeromonas）、サーマナエロビブリオ（Thermanaerovibrio）、サーミカナス（Thermicanus）、サーミチオバチルス（Thermithiobacillus）、サーモアクチノミセス（Thermoactinomyces）、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）、サーモアナエロバクテリウム（Thermoanaerobacterium）、サーモアナエロビウム（Thermoanaerobium）、サーモバチルス（Thermobacillus）、サーモバクテロイデス（Thermobacteroides）、サーモビフィダ（Thermobifida）、サーモビスポラ（Thermobispora）、サーモブラチウム（Thermobrachium）、サーモクロマチウム（Thermochromatium）、サーモクリニス（Thermocrinis）、サーモクリスパム（Thermocrispum）、サーモデスルフォバクテリウム（Thermodesulfobacterium）、サーモデスルフォラブダス（Thermodesulforhabdus）、サーモデスルフォビブリオ（Thermodesulfovibrio）、サーモハロバクター（Thermohalobacter）、サーモヒドロゲニウム（Thermohydrogenium）、サーモレオフィラム（Thermoleophilum）、サーモミクロビウム（Thermomicrobium）、サーモモナス（Thermomonas）、サーモモノスポラ（Thermomonospora）、サーモネマ（Thermonema）、テルモシフォ（Thermosipho）、サーモシントロファ（Thermosyntropha）、サーモテラバクテリウム（Thermoterrabacterium）、サーモトリクス（Thermothrix）、サーモトガ（Thermotoga）、サーモベナブルム（Thermovenabulum）、サーモビブリオ（Thermovibrio）、テルムス（Thermus）、チアルカリコッカス（Thialkalicoccus）、チアルカリミクロビウム（Thialkalimicrobium）、チアルカリビブリオ（Thialkalivibrio）、チオアルカリコッカス（Thioalkalicoccus）、チオアルカリミクロビウム（Thioalkalimicrobium）、チオアルカリスピラ（Thioalkalispira）、チオアルカリビブリオ（Thioalkalivibrio）、チオバカ（Thiobaca）、チオバチルス（Thiobacillus）、チオバクテリウム（Thiobacterium）、チオカプサ（Thiocapsa）、チオコッカス（Thiococcus）、チオシスチス（Thiocystis）、チオディクティオン（Thiodictyon）、チオフラビコッカス（Thioflavicoccus）、チオハロカプサ（Thiohalocapsa）、チオラムプロバム（Thiolamprovum）、チオマルガリタ（Thiomargarita）、チオミクロスピラ（Thiomicrospira）、チオモナス（Thiomonas）、チオペジア（Thiopedia）、チオプロカ（Thioploca）、チオロドコッカス（Thiorhodococcus）、チオロドスピラ（Thiorhodospira）、チオロドビブリオ（Thiorhodovibrio）、チオスファエラ（Thiosphaera）、チオスピラ（Thiospira）、チオスピリルム（Thiospirillum）、チオトリクス（Thiothrix）、チオバラム（Thiovulum）、チンダリア（Tindallia）、ティッシエレラ（Tissierella）、チストレラ（Tistrella）、トルモナス（Tolumonas）、トクソトリクス（Toxothrix）、トラブルシエラ（Trabulsiella）、トレポネマ（Treponema）、トリクロロバクター（Trichlorobacter）、トリココッカス（Trichococcus）、トロフェリマ（Tropheryma）、ツカムレラ（Tsukamurella）、ツリセラ（Turicella）、ツリチバクター（Turicibacter）、チコネマ（Tychonema）、ウレアプラズマ（Ureaplasma）、ウレイバチルス（Ureibacillus）、バゴコッカス（Vagococcus）、バンピロビブリオ（Vampirovibrio）、バリバキュラム（Varibaculum）、バリオボラックス（Variovorax）、ベイロネラ（Veillonella）、ベルコミクロビウム（Verrucomicrobium）、ベルコシスポラ（Verrucosispora）、ビブリオ（Vibrio）、ビクチバリス（Victivallis）、ヴァルギバチルス（Virgibacillus）、ヴァルギスポランギウム（Virgisporangium）、ヴァーゴスポランギウム（Virgosporangium）、ビテリバクター（Vitellibacter）、ビトレオシラ（Vitreoscilla）、ボゲセラ（Vogesella）、ボルカニエラ（Volcaniella）、ボルカニサーマス（Vulcanithermus）、ワドリア（Waddlia）、ウィークセラ（Weeksella）、ウェイセラ（Weissella）、ウィグルスウォルチア（Wigglesworthia）、ウィリアムシア（Williamsia）、ウォルバキア（Wolbachia）、ウォリネラ（Wolinella）、キサントバクター（Xanthobacter）、キサントモナス（Xanthomonas）、キセノフィラス（Xenophilus）、キセノラブダス（Xenorhabdus）、キシラニモナス（Xylanimonas）、キシレラ（Xylella）、キシロフィラス（Xylophilus）、エルシニア（Yersinia）、ヨケネーラ（Yokenella）、ザバルジニア（Zavarzinia）、ゾベリア（Zobellia）、ズーグレア（Zoogloea）、ズーシケラ（Zooshikella）、ザイモバクター（Zymobacter）、ザイモモナス（Zymomonas）、およびザイモフィラス（Zymophilus）。
これまで多数の細菌ゲノムおよびウイルスゲノムに関する完全な配列が、種々のデータベースに寄託され、公衆に利用可能であり、例えば、GenBank、The Institute for Genomic Research、www.tigr.org；GOLDゲノムオンラインデータベース、統合されたゲノミクス；igweb.integratedgenomics.com/GOLD、www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/10239.htmlがある。また、真菌ゲノム情報は、当技術分野において公知であり、例えば、http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomesがある。
驚くべきことに、最大25％の微生物のオープン・リーディング・フレームは、その属または種に固有（即ち、特異的）であり、それは、微生物間で非常に大きな多様性を示す（Pucci MJ, B.T., Dougherty TJ. 2002. Bacterial「genes-to screens」, p.83-96. In K. Shaw（ed.), Pathogen Genomics. Humana Press Inc, Totowa, NJ.）。これらのデータを用いることで、ゲノム配列分析に基づく診断は、強力なツールとなる。さらに、抗生物質に耐性な遺伝子が特徴付けられているので、それらは、核酸に基づく検出および同定に対する潜在的な標的ともなる。WFCC-MIRCENの微生物用世界データセンター（World Data Centre for Microorganisms（WDCM））は、培養物回収の包括的な指示、微生物および細胞株に関するデータベース、並びに生物的多様性、分子生物学およびゲノムプロジェクトへの入口を提供する（http：//wdcm.nig.ac.jp/を参照）。WDCMは、（1）微生物ゲノムプロジェクト、例えば、枯草菌ゲノムデータベース（BSORF）バイオインフォマティックスセンター、京都大学および奈良先端科学技術大学；クラミドモナス・リソース・センター、デューク大学、米国；NITEにおいて分析されたゲノムのデータベース（DOGAN)；タマホコリカビcDNAデータベース・キイロタマホコリカビ（Dictyostelium discoideum）cDNAプロジェクト（Dicty_cDB)；タマホコリカビゲノム配列決定プロジェクトベイラー医科大学；大腸菌ゲノムプロジェクト（K-12および-157）、ウィスコンシン-マディソン大学、米国；大腸菌に関するゲノム分析プロジェクト日本（GenoBase）、奈良先端科学技術大学；シアノバクテリアのためのゲノムデータベース（CyanoBase）、かずさDNA研究所；ゲノムインフォメーションブローカー（GIB）、日本のDNAデータバンク（2002年5月までに84種の微生物)；タンパク質および機能のためのゲノム；Integrated Genomics Inc.によるGOLD：ゲノム・オンライン・データベース・ホームページ、米国；JGIプログラム：微生物ゲノミクスDOEジョイント・ゲノム・インスティテュート（Joint Genome Institute)；MagnaportheDB；マラリア全長cDNAデータベース（熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum））、東京大学医科学研究所、日本；比較分析のための微生物ゲノムデータベース（MBGD)；PEDANT：MIPSによるゲノム分析および注釈、ドイツ；大腸菌染色体のプロファイリング（PEC)；サッカロミセス属ゲノム情報サーバー；シネコシスティス（Synechocystis）PCC6803遺伝子注釈データベース（SYORF）バイオインフォマッティックスセンター、京都大学およびシアノバクテリア研究団体；ゲノミクス研究所；（2）微生物遺伝子ストックセンター、例えば、大腸菌遺伝子資源、国立遺伝学研究所；大腸菌遺伝子ストックセンターコレクション（CGSC）、エール大学、米国；真菌遺伝子ストックセンター（FGSC）、米国；バイオテクノロジーリソースのインターネットディレクトリー；PGSC、シュードモナス遺伝子ストックセンター（米国)；MAFFジーンバンクの微生物セクション；世界中の大腸菌ストックおよびデータベース；（3）他のゲノムプロジェクト、例えば、異常スプライシングデータベースHGC、東京大学；シロイヌナズナインフォメーションリソースTAIR；BODYMAP、ヒト遺伝子の解剖学的発現データベース；BodyMap：ヒトおよびマウス遺伝子発現データベース；ヒトゲノムリサーチバイオベースのためのデンマークセンター、デンマークバイオテクノロジーデータベース、オルフス大学、デンマーク；DDBJ、インターナショナルヌクレオチド配列データベース；DNAインフォメーションおよびストックセンター（DISC)；FlyBase：ショウジョウバエに関する遺伝子および分子データベース、NIG、日本；FlyBase：バークレイ・ショウジョウバエゲノムプロジェクト；GDB：ゲノムデータベース；GenomeNetバイオインフォマティックスセンター、化学研究所、京都大学；GENOTK：ヒトcDNAデータベース、大塚GEN研究所およびHGC、東京大学；HOWDY（ヒトゲノム）、科学技術振興機構、日本；ヒトの第21染色体配列マップ、理化学研究所ゲノム科学総合研究センター（GSC）、ヒトゲノムリサーチグループ；ヒトの同定されていた遺伝子によってコードされた巨大タンパク質（HUGE）、かずさDNA研究所；ヒトゲノムプロジェクトインフォメーション；ヒトゲノムシークエンシングセンター（旧バイオロジスト・コントロール・パネル)；INE（イネゲノムリサーチプログラム、日本)；John Wiley & Sons, Ltd.；JSTヒトゲノムシークエンシングページ、日本科学技術振興機構；MAGEST：マボヤ（Maboya）（H.ロレッチィ）遺伝子発現パターンおよびシークエンスタグ、京都大学；医学研究審議会；代謝経路；ムーロン（Moulon）WWWサーバー；マウス百科事典インデックス、理化学研究所ゲノム科学総合研究センター；マウスゲノムインフォマティックス（MGI)；タンパク質配列のためのミュンヘンインフォメーションセンター、ドイツ；NCBIジーンバンク；NEXTDB：線虫発現パターンデータベース、国立遺伝学研究所；国立衛生研究所（NIH)；核酸データベースプロジェクト（NDB)；p53MDB；p53突然変異データベースHGC、東京大学；ラットゲノムマップ、大塚GEN研究所、オックスフォード大学、ケンブリッジ大学、Research Genetics, Inc.、およびHGC、東京大学；イネゲノムリサーチプロジェクト（RGP)；SPAD：シグナル経路データベース、九州大学；統合された微生物データベース（MycDB)；OGMP；UK MRCヒトゲノムマッピングプロジェクトリソースセンターへのリンクを提供する。
病原体を検出する目的で、生物試料、特に免疫抑制された患者から得られる試料中のウイルス、細菌、原生動物および真菌の病原体、特にウイルス、細菌、および原生動物の病原体を含む病原体に特異的な標的核酸の存在を検出し、そのレベルを測定するためのアプローチが本明細書において記載されている。この方法は、単独で、および1回反応における2つ以上の標的核酸に対するレベル（例えば、発現レベルまたはコピー数）の測定を可能にする多重フォーマットで、核酸試料中に存在する病原体特異的標的核酸、例えば病原体由来のDNAまたはRNAの定量化を可能にする。
本明細書に記載される方法およびキットに包含される追加の病原体には、下記の原生動物であるクリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カエタネンシス、ジアルジア・ランブリア、エンタモエバ・ヒストリティカ、トキソプラズマおよび微胞子虫が含まれる。
原生動物
本明細書に記載される方法を用いて、原生動物病原体を検出することができる。腸内原生動物および原性生物は、米国において、危険に晒された食物および水の供給を通じた蔓延の可能性により、カテゴリーBの作用物質の中に含められる。これらの生物の多くは、家畜および野生動物に感染する。これらの生物には、原生動物であるクリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カエタネンシス、ジアルジア・ランブリア、エンタモエバ・ヒストリティカ、およびトキソプラズマ・ゴンディ、並びにエンセファリトゾーン（Encephalitozoon）およびエンテロシトゾーン（Enterocytozoon）などの微胞子虫種が含まれる。これらの生物の大部分による感染は、通常、その他の点では健康な人においては無症候性であるかまたは自己制限的であるが、臨床症状が免疫抑制患者において現れる。
生物テロリストの可能性に基づいた最も重要な生物には、C.パルバム、E.ヒストリティカおよびT.ゴンディが含まれる。これらの生物は、汚染した水および/または食品を通じて大多数の人々に感染し得る。さらに、これらの全ての感染（トキソプラズマ症は除く）は、人から人へと容易に伝染する可能性があり、診断することが困難である。大部分は、毒性または抗感染体への耐性を増加するように遺伝子改変されうる。
大部分のカテゴリーBの食品および水に含まれる原生動物および原生生物のライフサイクルは、十分に理解されている。しかしながら、これらの生物のいくつかの実験的試験は、インビトロでの培養の困難性、および動物モデルの欠如によって制限されている。
C.パルバムのオーシストの摂取は、腸の上皮細胞の感染をもたらし、生物は保護小胞内で複製する。放出されるオーシストが細胞から放出されると自己感染が起こるため、ほんの数個のオーシストの摂取は、免疫無防備状態の患者において重篤であり、しかも持続的な感染へと導き得る。病因のメカニズムは、十分には理解されていないが、C.パルバムは、腸のイオン輸送を崩壊する可能性がある。配列決定がほぼ完了した遺伝子型I、作業が進行中の遺伝子型IIの2つの区別される遺伝子型のC.パルバムが、ヒトに感染する。
シクロスポラ・カエタネンシスは、1979年に下痢性疾患と関連して同定されたが、その分類上の区分は、1993年まで決定していなかった。オーシストは、感染型であり、凍結および塩素処理の両方に耐性である。オーシストは、それぞれが2つのスポロゾイトを保持する2つのスポロシストを含有する。小腸の感染は、絨毛の萎縮および固有層の炎症性浸潤をもたらし得る。C.カイエタンシス病因が腸細胞への直接的な影響によるのか、または分泌された毒素を伴うことによるのかどうかは知られていない。
G.ランブリアの栄養型では、10から25個程度の嚢胞を摂取後に、小腸にコロニーが形成される。栄養体は、4本の鞭毛、および吸盤または接着盤からなり、宿主の認識に対する重要な抗原として作用する微小管構造を含む。上皮への接着のメカニズムは不確かであるが、特定の受容体を必要とする可能性がある。栄養体は、システインに富んだ表面タンパク質を変形特異的な表面タンパク質（VSSP）に変化させることによって、抗原性変異を受ける；また、これらの表面タンパク質は、刷子縁酵素に重要である亜鉛などの金属と結合する。細胞を媒介した免疫応答は、小腸の組織学的損傷における役割を果たすことができる；エンテロトキシンは同定されていない。G.ランブリアに関するゲノムプロジェクトがあり、遺伝子発現データも利用可能である。
ジアルジアと同様に、E.ヒストリティカのライフサイクルは、栄養体および嚢胞からなる。E.ヒストリティカの病因に関する情報は、新規な培地の開発により急速に拡大している。栄養体が直接的な接触に基づいてのみ標的細胞を死滅させるため、腸上皮への付着は病因において重大である；付着は、寄生生物の表面レクチンによって媒介される。分泌性IgA、ムチン類、および他の宿主細胞表面の糖タンパク質を分解する他の寄生因子が同定され、細胞死滅の一因となる。E.ヒストリティカゲノムの配列決定は進行中である。
トキソプラズマ・ゴンディは、3つの形態：オーシスト、ブラディゾイトを含む組織嚢胞、およびタキゾイトで存在する。オーシストは、感染したネコの腸でのみ形成する。摂取後、スポロゾイトは、オーシストから放出され、貫通し、腸の上皮細胞において増殖する。上皮細胞への侵入は、タキゾイト上のコーン形状構造である円錐形の物体を通して媒介されるようである。タキゾイトは、上皮に含まれる液胞内で維持され、ライソゾームの融合から保護され、リンパ節および他の組織への拡散前に宿主細胞を崩壊する。嚢胞形成は、脳、網膜、および筋肉を含む感染した組織内で発生する。遅延型過敏反応は、組織嚢胞の破裂および周辺組織の壊死をもたらし、網膜においては臨床的に重大となり得る。免疫無防備状態の宿主においては、再活性化は、顕著な組織損傷をもたらし、死に至る場合がある。経胎盤感染も起こり、胎児感染は、妊娠中、T.ゴンディに初めて感染した女性の30％〜40％で発生する。T.ゴンディのゲノム配列決定は進行中であり、ゲノムおよびEST配列の広範なデータベースが、現在利用可能である。
微胞子虫は、細胞内の胞子形成原生生物の唯一の群である。ヒトに感染する微胞子虫種には、エンセファリトゾーン・インテスチナリス（intestinalis）、Enc.ヘレム（hellem）、Enc.クニクリ（cuniculi）、およびエンテロサイトゾーン・ビエネウシ（bieneusi）が含まれ、治療耐性である。胞子は、耐性壁、1個または2個の核、胞子原形質、固定盤、およびらせんコイル状の極性管からなる。感染中に、極性管事象は、宿主細胞を貫通し、胞子原形質を注入する。複製は、成熟胞子の数を増加させ、最終的には細胞を破壊する。C.パルバムと同じく、自己感染の能力は胞子の生産を増加させる。感染は、通常、免疫無防備状態の個体以外では、腸に限定され、そこでは、多くの組織を巻き込むことがある。Enc.クニクリの完全なゲノム配列は完了し、Ent.ビエネウシの配列決定が計画されている。
本明細書において記載される方法の定量的局面
一局面では、本明細書に記載される方法は、互いに異なりかつ病原体特異的標的核酸の大きさが異なった既知サイズの増幅産物を生成する、既知の様々な濃度の外因的に添加される競合核酸の使用を通じて生成される内部標準を用いる。例えば、蛍光検出による検出と連結させた、例えば、キャピラリー電気泳動によるサイズ分離は、競合核酸に対応する多量の増幅産物からの標準曲線を作成する。標準曲線は、最初の試料中にある病原体特異的標的核酸濃度の決定を可能にする。
次に、一局面では、核酸試料中の病原体特異的標的核酸レベルを推定および/または決定する方法が記載される。その方法は、次の工程を含む。第1に、所与の病原体に対しては、標的分子が選択され、標的分子は、アッセイに存在する他の病原体の標的分子とは反応しないという意味でその病原体に特異的である。次に、各々の所与の病原体特異的標的核酸に対しては、一対の増幅プライマーは、逆転写（RNA標的に対する）およびプライマー対を用いた増幅（例えば、RNAおよびDNA標的の両方に対してPCR増幅）後に、既知の長さの標的アンプリコンを生成するように選択される。プライマー設計の考慮は、当業者に周知である；しかしながら、より重大な局面では、特異性、即ち、プライマーは、少なくとも1セットの増幅条件下で所望の標的分子のみを増幅すべきであり、反応中に採用され得る追加のプライマーに適合性であり、例えば、多重分析が実行されるべきである。オリゴヌクレオチドプライマーの長さおよびヌクレオチド含量（例えば、G+C含量）は、プライマーの特異性およびハイブリダイゼーションの特徴（例えば、融解温度）の決定に有益である。オリゴヌクレオチドプライマーの選択または設計のさらなる考慮は、当業者に公知であり、および/または本明細書では下記に説明されている。
次に、少なくとも2つの競合核酸のセットを作製する。競合核酸は、病原体特異的標的核酸として選択された増幅プライマーに対する同一のプライマー結合配列（またはそれらの相補体）を共有するが、病原体特異的標的配列を増幅するために用いられる同セットの増幅プライマーを用いて生じさせるアンプリコンの長さにおいて相違する。選択された対の増幅プライマーを用いて、各々から増幅産物を生じさせる場合、少なくとも2つの競合核酸は、互いに、および病原体特異的標的核酸と比較して、同じ増幅効率（この用語は、本明細書において定義されるように）を有することが重要である。少なくとも2つの競合核酸のセットでは、1つの競合物は、同じプライマーを用いてより長いアンプリコンを生成し、別のものはより短いアンプリコンを生成することが好ましい。（本明細書では下記に説明されるように、追加の長いまたは短い競合物は、例えば、アッセイの分離度を変更するために、異なった量で含むことも可能である。）他の態様では、少なくとも2つの競合核酸の各々は、標的核酸から生成されるものよりも長いアンプリコンを生成することができる。この場合において、競合物の各々は、互いに、および標的アンプリコンと比較して異なった既知の長さのアンプリコンを生成しなければならないと理解するべきである。他の態様では、少なくとも2つの競合核酸の各々は、標的核酸から生成されるものよりも短いアンプリコンを生成することができる。繰り返して言うが、競合アンプリコンは、互いに、および標的アンプリコンとは既知の長さによって相違しなければならない。本明細書において記載される方法に用いるための核酸を生成する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、PCR（DNA競合物に対して）またはプラスミドもしくは他の単離した鋳型DNAからのインビトロ転写（RNA競合物に対して）、あるいは化学合成がある。PCR、インビトロ転写の方法、および所与のDNA鋳型とは長さにおいて相違する鋳型の生成のための方法は、当業者に周知であり、および/または本明細書では下記に説明されている。
競合核酸アンプリコンの大きさの相違は、10個以下のヌクレオチド/塩基対、好ましくは5個以下のヌクレオチド/塩基対、またはさらにわずか1個のヌクレオチドまたは塩基対のサイズが相違する核酸を区別することができる方法によって検出可能である相違でなければならない。十分に適した方法は、例えば、キャピラリー電気泳動である。キャピラリー電気泳動がわずか1個のヌクレオチドの長さの違いを検出可能である条件は、周知である。わずか1個のヌクレオチドの相違は、本明細書に記載される方法に包含されることが意図されるが、例えば、キャピラリー電気泳動による分離の際に標的アンプリコンから得られるアンプリコンをより良く解明するために、競合物と標的との間の相違は、少なくとも5ヌクレオチドであることが好ましい。5ヌクレオチドより大きな相違は、例えば、10、20、30、40または50ヌクレオチドとも意図される。しかしながら、この相違は、増幅の効率を有意な違い（即ち、標的アンプリコンまたは少なくとも1つの他の競合アンプリコンの効率と比較して、絶対値で0.2を超える増幅効率Eにおける相違に帰着する相違であって、ここで、E = (Pn+1-Pn)/(Pn-Pn-1)（式中、Pnは、サイクルnでのPCR産物の量である））にさせるほど大きくなくてもよい。増幅の効率に影響を及ぼす因子は、当業者に周知であり、例えば、プライマーのTm、アンプリコンの長さ、アンプリコンのヌクレオチド組成物、標的またはプライマーにおける二次構造の可能性、および例えば反応中の修飾されたヌクレオチドの存在が含まれる。増幅効率の測定およびそれに影響を及ぼす因子は、当業者に公知であり、および/または本明細書では下記に説明されている。
競合核酸を生成するための1つの直接的なアプローチは、病原体特異的標的アンプリコン配列への配列の内部挿入または欠失を伴う。このアプローチは、競合核酸と標的核酸との間の類似性を最大限にし、続いて、増幅効率が同じになる可能性が高い。したがって、選択されたプライマー対が増幅に用いられると生成されるアンプリコンのサイズを変化させるのに十分であるヌクレオチド配列を加えるかまたは削除するために、標的核酸に対応する配列のクローン化したまたは増幅したコピー（例えば、クローン化したcDNA）において、部位特異的突然変異誘発が実行される。当然に、選択されたプライマー対に結合した配列が突然変異しないことは明らかである。部位特異的突然変異誘発は、当技術分野において周知の多くの方法のいずれかによって実行することができる。
各々の病原体特異的標的核酸に対する3つ、4つまたはそれ以上の競合核酸のセットを生成することは有用であり得る。更なる競合物を有することは、所与のアッセイ内で定量測定の範囲を拡張するかまたはより狭く定義することができる。つまり、第1および第2競合物が、例えば反応物に10〜10,000分子の濃度範囲で用いられると、所与容積の最初の試料における10〜10,000分子の標的核酸の濃度は、競合物によって作成される標準曲線から測定することができる。この測定は、非常に正確であってもよく、狭い範囲の競合物濃度、例えば、10〜500または1,000分子にし、正確さを増加させることができる。同様に、第1推定がなされるべき場合に、この範囲は、より広がり、例えば10〜50,000分子であってもよく、標的核酸濃度をより正確に測定することが望まれるならば、後の反応はより狭い濃度で行われる。所与の反応物に異なった濃度で所与の標的核酸の3つ、4つまたはそれ以上の競合核酸を含むことは有利である。当業者は、競合物の濃度が上昇するにつれて、増幅プライマーの量、または増幅反応の他のパラメータにおいて調整が必要になる場合があることを認識する。
一度、増幅プライマー対が選択され、競合核酸のセットが生成すると、試料中の標的核酸は、試験核酸試料と少なくとも2つの競合核酸分子のセットとを組合せ、標的核酸および競合核酸を逆転写し、増幅プライマー対を用いて標的配列および競合配列を増幅することによって定量化することができる。代替のアプローチでは、競合核酸は、試験試料から核酸を抽出する前に試料に添加することができる。この場合において、標的核酸および競合核酸は同時に単離される。
最も正確であるためには、競合物は、少なくとも1つが標的核酸の濃度を下回る既知の濃度で添加され、少なくとも1つが、標的核酸の濃度を上回る濃度で添加されるように試料に添加しなければならない。既知濃度の競合核酸は、少なくとも1桁規模（即ち、10倍）で相違しなければならないが、数桁規模、例えば、100倍、1,000倍以上で有利に相違することができる。期待される標的核酸の量が完全には分からない場合、所与の標的の予想された濃度範囲を同定するために、異なった範囲の競合物を用いて一つまたは複数の予備実験を行うことは有利であり得る。あるいは、多数のあまり正確でない定量化増幅アプローチのいずれかまたはその他が、期待される濃度の概算を集めるために採用されてもよい。このような方法は、当技術分野において公知であり、例えば、1つの参照鋳型に対する一連の並列反応における滴定が使用される。
逆転写は、病原体特異的標的核酸がRNAである場合に用いられる。逆転写は、当技術分野において周知であり、増幅のために用いられるものとは別の酵素（例えば、MMLV逆転写酵素などの逆転写酵素が用いられる場合）によって、または同じ酵素（例えば、RNA鋳型に依存したプライマー伸長能力およびDNA鋳型に依存したプライマー伸長能力の両方を有する当技術分野において公知のTthポリメラーゼもしくは別のポリメラーゼ）によって行うことができる。逆転写は、PCR工程（1工程プロトコール）と同じ反応混合混合物において実行されるか、または逆転写は、PCR（2工程プロトコール）を利用する増幅前に最初に行うことができる。
同様に、DNA増幅は、当技術分野において周知である。TaqmanおよびQuantiTect SYBRシステムの両方は、RNAの逆転写の後で用いることができる。
核酸増幅アプローチ：
本明細書に記載される方法は、それ自体、標準的なPCRに十分に役立ち、標的配列に隣接する一対の選択されたプライマーが、鋳型に依存したコピーされたDNAの合成に向けられる。しかしながら、これは、本明細書において記載されているアプローチに適合可能な他の方法（例えば、リガーゼを媒介した増幅または他の等温線の増幅方法、例えば自立配列複製（Self-Sustained Sequence Replication）（3SR）、Gingeras et al., 1990, Annales de Biologie Clinique, 48（7）：498-501；Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：1874；下記を参照されたい）を排除しない。標的RNAおよび少なくとも2つの競合核酸のセットから増幅の類似効率を達成する、いずれかのこのような代替のアプローチにおける主要なエレメントが残される。
3SRは、転写に基づく増幅システム（TAS）の副産物であり、高レベルの増幅を達成するために必要な増幅サイクル数を減らすための高いプロモータ配列特異性およびバクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼの反復特性を十分に利用する（Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83：1173-1177）。
3SRにおいて、各プライミングオリゴヌクレオチドは、バクテリオファージRNAポリメラーゼ結合配列、および好ましい転写開始配列、例えば、T7 RNAポリメラーゼ結合配列（TAATACGACTCACTATA）および好ましいT7ポリメラーゼ転写開始部位を含む。各プライマーの残り配列は、増幅されるべき分子上の標的配列に相補的である。
例示的な3SR条件は、下記のように本明細書において記載される。3SR増幅反応は、100μl中で行われ、標的RNA、40mM Tris-HCl、ph8.1、20mM MgCl2、2mMスペルミジン-HCl、5mMジチオスレイトール、80μg/ml BSA、1mM dATP、1mM dGTP、1mM dTTP、4mM ATP、4mM CTP、1mM GTP、4mM dTTP、4mM ATP、4mM CTP、4mM GTP、4mM UTP、および適量のオリゴヌクレオチドプライマー（57merの250ng；この量は、プライマー配列の長さに比例的に依存して、スケールアップまたはダウンする）を含む。3SR反応のための3〜6アトモルの核酸標的が用いられる。バックグランドの対照として、いずれの標的を含まない3SR反応を並行して実施する。反応混合物は、1分間100℃に加熱され、次に、42℃に急速冷却される。1分後、10ユニット（通常、約2μlの容量中）の逆転写酵素、（例えば、トリ・ミオブラストーシス（myoblastosis）ウイルス逆転写酵素、AMV-RT；Life Technologies/Gibco-BRL）を添加する。反応は、10分間42℃でインキュベートし、次に、1分間100℃に加熱する。（3SR反応が一本鎖鋳型を用いて行われる場合、反応混合物は、代わりに1分間65℃に加熱される。）その後、反応物を2分間、37℃まで冷却し、次に、1.6μlのAMV-RTを18.5ユニット/μlで、1.0μlのT7 RNAポリメラーゼを100ユニット/μl（ともに例えば、Stratagene；カリフォルニア州ラ・ホーヤから入手）、および2.0μlの大腸菌RNase Hを4ユニット/μl（例えば、Gibco/Life Technologies；メリーランド州ゲイサーズバーグから入手）を含む3SR酵素ミックスを4.6μl添加する。異なる製造ロットから得られる酵素の非活性におけるバリエーションを説明するために必要とされるか、または異なった製造業者によって供給される酵素容積を調整することは当業者の知識の範囲に十分にある。バリエーションは、必要に応じて酵素のユニットに対してもなされる場合がある。反応物を37℃で1時間インキュベートし、凍結することによって停止させる。
増幅の進行は、サンプリングによってモニターされるべきである場合、サンプリングは、3SR反応のいずれかの段階で実行することができる。3SRは、単一温度で連続して進行するため、アリコートを回収する個々のサイクルはない。したがって、サンプリングは、増幅インキュベーション期間中の設定時間、例えば、毎分、2分毎、3分毎などで行うことができる。次に、回収されたかまたは押し出されたアリコート中の核酸を分離し、核酸を検出し、それによって増幅プロフィールの作成が可能となり、そこから初期サンプル中の多量の標的を測定することができる。
また、3SRは、核酸配列に基づいた増幅、即ちNASBA（例えば、ともに参照により本明細書に組み入れられる、Compton, 1991, Nature, 350：91-92；Kievits et al., 1991, J. Virol Meth. 35：273-286を参照）などとも呼ばれている。
本発明に従った使用に役立つ核酸増幅の別の方法は、DNAリガーゼ増幅反応（LAR）であり、いくつかの細菌性DNAリガーゼのいずれか1つの活性を通じて特定の短い配列の急激な増加を可能にするように記載されている（ともに参照により本明細書に組み入れられる、Wu and Wallace, 1989, Genomics, 4：560；Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：189）。この技術は、オリゴヌクレオチドプローブの連結に基づく。プローブは、特定の標的核酸の2つの隣接した配列を正確にマッチするように設計される。増幅反応は、過剰のプローブの存在下で3工程：（1）二本鎖核酸の熱変性、（2）標的核酸へのプローブのアニーリング、および（3）熱安定性DNAリガーゼによるプローブの連結を繰り返す。反応は、一般的に、20〜30サイクル繰り返される。本明細書において記載されるサンプリング方法は、詳細な増幅プロフィールの生成を可能にする。いずれかのサイクル増幅プロトコールと同じく、例えば増幅プロフィールを達成することが望まれる場合、サンプリングは、いずれかのサイクル後に実行され得るが、好ましくは各サイクルの後である。
ローリングサイクル増幅（RCA）は、PCRと同じ大きさの影響を有することが証明され得る代替の増幅技術である。この技術は、いくつかのウイルスのDNA複製メカニズムを誘導する。RCAでは、多くのウイルスによって用いられている複製技術に類似して、ポリメラーゼ酵素は、DNAサークルの周りを1つのプロモータを読み出し、サークルの直線的な連結したコピーを継続して量産する。このような線形RCAにおいて、反応は3日間行われ、小サークル配列の数百万のコピーを生産することができる。指数形変異体は開発され、第2プロモータは、DNA複製において各繰り返しで二本鎖を置き換え、超分岐を開始し、1時間あたり1012程度のコピーを産出する。
本明細書において開示されているサンプリング方法から利益を得ることができる別の増幅方法は、鎖置換増幅である（それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、SDA；Walker et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20：1691-1696；Spargo et al., 1993, Mol. Cellular Probes 7：395-404）。SDAは、2つのタイプのプライマーおよび2つの酵素（DNAポリメラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼ）を用いて、指数関数的に一本鎖アンプリコンを非同期的に生成する。増幅プライマーのセットがチップ上の区別されるゾーンに固定された基本方法の変形は、プライマー-プライマー相互作用を減少させる。このいわゆる「固定されたSDA」アプローチは、増幅効率を低下させることなく多重DNAまたはRNA増幅を可能にする（参照により本明細書に組み入れられる、Westin et al., 2000, Nature Biotechnology 18：199-204）。SDAは、繰り返されるサンプリングが詳細な増幅プロフィールの生成を可能にするので、本明細書において記載されるサンプリングおよび分離から利益を得ることができる。
逆転写（必要であるかまたは希望する場合）および増幅に続いて、本明細書に記載される方法は、核酸増幅産物のサイズによる分離を伴う。アガロースまたはポリアクリルアミド電気泳動による、またはHPLC分離を含むカラムクロマトグラフィーによる核酸のサイズ分離は周知である。好ましいアプローチは、迅速でありしかも正確であるキャピラリー電気泳動を用いて、わずかたった1つのヌクレオチドによってサイズの異なる分子の分離を容易に達成する。キャピラリー電気泳動は、少量の試料を用い、例えば、蛍光検出による検出に十分に適合される。キャピラリー電気泳動は、当技術分野において周知であり、本明細書において下記にはさらに詳細に説明される。
上記で検討したように、病原体特異的標的核酸および競合核酸に対応する増幅された核酸は、分離後に検出される。検出は、例えば、UV吸収、または好ましくは蛍光シグナルによって、所与のサイズの核酸の所与のバンドの位置とその核酸の量の両方を示す。蛍光ヌクレオチドは、増幅前または増幅中に増幅反応混合物に一つまたは複数のこのようなヌクレオチドを単に添加することによって、増幅された核酸に取り込むことができる。代替のアプローチは、そのプライマーから増幅した全ての鎖が、それに結合した少なくとも1つの蛍光標識を有するように、一つまたは複数の増幅プライマーを蛍光的に標識することである。本明細書に記載される方法は、増幅した産物を標識するために蛍光標識したヌクレオチド類似体の使用を包含することが十分に意図されるが、一つまたは複数の増幅プライマーを標識する利点は、異なった標的核酸のためのプライマーが、例えば、本明細書に記載される方法を用いて可能となる多重化される範囲を拡張するために、異なったフルオロフォアで別々に標識できるということである。このアプローチを用いて、異なった病原体特異的標的と同じサイズでもある競合アンプリコンのいくつかのセットを同じ反応で区別することができる。
増幅され、分離された病原体特異的標的と競合分子の検出後、本明細書に記載される方法は、標準として検出される競合物の量を用いる。競合物の最初の濃度は公知であり、増幅した配列からのシグナルは各配列の開始量に比例し、増幅効率は標的および競合分子のそれぞれに対して類似するため、最初の試料中の標的核酸の量は、競合物の量から測定することができる。この方法の精度は、推奨されるように、競合物が、内部標準として、標的分子の濃度に沿う濃度で最初に存在する場合にさらに向上する。
PCRのような増幅アプローチは、概して、増幅した鋳型の量が反応物中の最初の鋳型の量に密接に比例する、増幅プロセスの制限された対数期が存在するような反応速度論を示す。所与のサイクリング計画におけるこの時期の正確な位置は、標的配列、プライマー配列、および標的鋳型の初期量を含む因子に依存して変化する。本明細書に記載される方法は、サイクリング計画において、所与の標的配列が、対数期に増幅された場合（または、サイクリングおよび検出が同時にまたは少なくとも同時期に実行される場合）、正確に測定されるように十分に適合される。したがって、一局面では、本明細書に記載される方法は、取り出された試料中の標的および競合核酸の分離および検出と一緒に、増幅サイクリング計画中に繰り返しのサンプリングから利益を得ることができる。例えば、増幅中の複数の時点またはサイクルで、蛍光標識した標的および競合アンプリコンの検出は、（大部分の場合、自動的にプロットされる）標的、または標的と競合アンプリコンの量に対するサイクル数のプロットを作成することができる。このアプローチは、増殖が対数期に進む任意の所与の標的または競合物に対する時期を正確に同定し、次に、標的鋳型の最初の量の同定を可能にする。既知濃度のより長いおよびより短い競合物によって表わされる内部標準の追加は、このようにして得ることができるデータの精度をさらに高める。換言すれば、最初の濃度を同定するための曲線を提供する内部標準を有するだけでなく、初期の鋳型と増幅した産物との間の一致が最良となるのがどの反応時点であるのかを知るという利益を有する。この時点は、1回反応において異なったアンプリコンに対して相違してもよい。また、サンプリングアプローチおよびそれを用いて生成したプロフィールは、反応中の各異なったアンプリコンのためのこのような異なった時点の決定を可能にし、所与のアッセイにおいて標的にされたそれぞれの異なったウイルスに対してより正確なウイルス荷重決定を可能にする。
増殖サイクリング計画中の試料回収は、手動でまたは好ましくは自動で、例えば、ロボット制御下で実行可能である。自動サンプリングは、試料回収の時期の均一性を増すことができ、手動サンプリング条件下で起こるかもしれない交差汚染を避ける手助けとなる可能性がある。自動サンプリングおよび分析装置（キャピラリー電気泳動装置を含む）は、2003年3月12日出願の同時継続中の米国特許出願第10/387,286号に記載され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書において記載されている競合定量的アプローチは、1回反応において所与の試料の異なった複数の病原体特異的標的核酸の測定を多重化するのに十分に適合される。これは、好ましくは、アンプリコンのサイズによって区別される標的および競合アンプリコンの異なったセットは、各々の異なった標的核酸に対して生じるように、標的アンプリコンおよび競合アンプリコンを選択することによって達成される。あるいは、またはそれに加えて、異なった標的アンプリコンは、異なった標的/競合アンプリコンセットに特異的な別々に標識した増幅プライマーを用いることによって、同じ反応において別々に検出することができる。それらの首尾よく実行するのに必要な基礎的な多重PCRアプローチおよび考察は当技術分野において公知であり、本明細書において記載される方法に容易に適用され、そこでは、異なった既知の標的から異なったサイズのアンプリコンを効率的に分離し検出する能力によって、1回反応中の複数（例えば、2、3、5、10、20、50またはそれ以上）の標的シグナルの検出が可能となる。多重PCRは、概して、異なった標的に特異的なプライマー間の相互作用が、人為的な影響を弱めるために最小化されることを必要とし、即ち、それらの各々の標的分子ではなく互いとハイブリダイズする反応において使われる、いずれか2つのプライマーの能力を避けることを要する。通常、利用可能なソフトウェアパッケージは、所与のプライマーセットに対するプライマー-プライマー相互作用の分析および予想を可能にする。
プライマー設計：
本明細書に記載される方法は、病原体特異的標的および競合配列の増幅のためのDNAオリゴヌクレオチドプライマーの使用に依存する。これらの方法における使用のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書において記載される、当技術分野において周知の一般的なガイダンス、並びに記載される特定の方法の各工程のための本明細書において記載されている特定の要件に従って設計することが可能である。
1. プライマー設計のための一般的戦略
オリゴヌクレオチドプライマーは、長さにして5〜100ヌクレオチドであり、好ましくは17〜45ヌクレオチドであるが、異なった長さのプライマーも使用される。cDNA合成のためのプライマーは、好ましくは10〜45ヌクレオチドであるが、増幅用のプライマーは、好ましくは約17〜25ヌクレオチドである。また、本明細書において記載される方法に有用なプライマーは、融点推定法により特定の融解温度（Tm）を有するように設計される。Oligo(商標)、プライマー設計、およびインターネットで入手できるプログラム、例えばPrimer3およびOligo Calculatorを含む市販のプログラムを用いて、本発明において有用なポリヌクレオチド配列のTmを計算することができる。好ましくは、本発明において有用な増幅プライマーのTmは、例えばOligo Calculatorで計算した場合、好ましくは約45℃〜65℃、より好ましくは約50℃〜60℃である。
ポリヌクレオチドのTmは、別のポリヌクレオチドに対するそのハイブリダイゼーション（例えば、鋳型ポリヌクレオチドに対するオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング）に影響を及ぼす。対象の方法においては、種々の工程において使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、標的鋳型または標的鋳型から調製もしくは単離されるポリヌクレオチド（即ち、第1および第2鎖cDNAおよび増幅した産物）に選択的にハイブリダイゼーションすることが好ましい。典型的には、選択的ハイブリダイゼーションは、2つのポリヌクレオチド配列が実質的に相補的（少なくとも14〜25ヌクレオチドの長さに渡り少なくとも約65％相補的、好ましくは少なくとも約75％、より好ましくは少なくとも約90％相補的）である場合に生じる。参照により本明細書に組み入れられる、Kanehisa, M., 1984, Polynucleotides Res. 12：203を参照されたい。結果として、プライミング部位におけるある程度のミスマッチが許容されることが期待される。このようなミスマッチは、モノ-、ジ-またはトリ-ヌクレオチド程度の小さいものでありうる。あるいは、ミスマッチの領域は、連続する一連の4個またはそれ以上のヌクレオチドにおいてミスマッチが存在する領域として定義されるループを含んでよい。100％の相補性は、本明細書に記載される方法に関して好ましい。
多数の因子が、第2のポリヌクレオチド分子に対するプライマーのハイブリダイゼーションの効率および選択性に影響を及ぼす。プライマーの長さ、ヌクレオチド配列および/または組成、ハイブリダイゼーション温度、バッファー組成、およびプライマーがハイブリダイズするために要求される領域における立体障害の可能性を含むこれらの因子は、本明細書に記載される方法に有用なオリゴヌクレオチドプライマーを設計する場合に考慮される。
プライマーの長さと、プライマーが標的配列にアニーリングする効率および精度の両方との間には、正の相関が存在する。特に、より長い配列は、より短いものよりも高い融解温度（TM）を有し、所与の標的配列内で反復される可能性がより低いため、無差別なハイブリダイゼーションは最小限になる。高いG-C含量を有するプライマー配列、またはパリンドローム配列を含むプライマー配列は、2分子ではなく1分子のハイブリダイゼーション動態が一般的には溶液中で好適であるため、その意図する標的部位と同様に自己ハイブリダイゼーションする傾向にある。しかしながら、各G-C対は、AおよびTの塩基対が標的配列に結合する場合に観察される2つではなく3つの水素結合により結合しており、したがって、より堅固で強力な結合を形成することから、十分な数のG-Cヌクレオチド対を含有するプライマーを設計することも重要である。ハイブリダイゼーション温度は、プライマー反応またはハイブリダイゼーション混合物に含まれ得る、例えばホルムアミドのような有機溶媒の濃度と同様に、プライマーアニーリング効率と逆比例して変動するが、塩濃度の上昇は結合を促進する。ストリンジェントなアニーリング条件下では、より長いハイブリダイゼーションプローブまたは合成プライマーは、より緩やかな条件下で十分である、より短いものよりも、効率的にハイブリダイゼーションする。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、適当なバッファー（例えば、1× RTバッファー、Stratageneカタログ番号600085、1× Pfuバッファー、Stratageneカタログ番号200536、または1× cloned Pfuバッファー、Stratageneカタログ番号200532、または、cDNA合成および増幅に用いられる他の酵素に適した他のバッファー）中で、オリゴヌクレオチドプライマーに対してポリヌクレオチド配列をハイブリダイゼーションさせる条件下（例えば、PCR増幅では95℃）で行う。長さおよび/またはポリヌクレオチドの組成またはオリゴヌクレオチドプライマーに応じて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が変化し（例えば、約1M未満、より通常は約500mM未満、好ましくは約200mM未満の塩濃度から）、ハイブリダイゼーション温度は、（例えば、0℃程度の低温〜22℃より高温、約30℃より高温、（より頻繁には）約37℃を超えて）変動し得る。より長いフラグメントは、特異的ハイブリダイゼーションのためにはより高いハイブリダイゼーション温度を要する場合がある。いくつかの因子がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響するため、パラメーターの組み合わせは1つの因子の絶対的尺度よりも重要である。
本明細書に記載される方法に有用なプライマーセットの設計は、上述されるいくつかのパラメータの評価およびプライマー配列の最適化を支援するために開発された、容易に利用可能なコンピュータプログラムの使用により促進され得る。このようなプログラムの例には、DNAStar(商標)ソフトウェアプログラムの「PrimerSelect」（DNAStar, Inc.；ウィスコンシン州マジソン）、OLIGO4.0（National Biosciences, Inc.）、PRIMER、オリゴヌクレオチド・セクション・プログラム、PGENおよびアンプリファイ（Ausubelら（前記）に記載される）がある。
2. オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドプライマーそれ自体は、当技術分野においても周知である技術を用いて合成される。特異的配列のオリゴヌクレオチドを調製する方法は、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限消化、並びに直接的な化学合成を含む。一度設計されると、オリゴヌクレオチドは、例えば、Narang et al., 1979, Methods in Enzymology, 68：90に記載されているリン酸トリエステル法、Brown et al., 1979, Methods in Enzymology, 68：109に開示されているリン酸ジエステル法、Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Letters, 22：1859に開示されているジエチルホスホルアミデート法、および、米国特許第4,458,066号に開示されている固体支持体法を含む適切な化学合成法によって、または市販の自動オリゴヌクレオチド合成機（市販されている）もしくはVLSIPS(商標)技術のいずれかを使用する他の化学法によって調製することもできる。
競合RNA設計および合成：
本明細書に記載される方法に採用される場合、競合核酸は、所与の病原体特異的標的核酸に対して選択される同じプライマーセットによって増幅され、選択された同じプライマーセットによる標的核酸と類似の増幅効率を有しなければならない。競合核酸は、互いに、および標的核酸からの増幅産物から長さにおいて区別され得る、選択されたプライマーセットを用いて、増幅産物を得なければならない。分離技術の分離度は、必然的に、区別可能な長さにおける相違に影響する。上述されるように、たった1つのヌクレオチドの違いはごく普通に達成可能であるが、これらの場合でさえも、シグナルにおける良好な区別を与えるために、幾分より長い長さを有することは有用であり得る。主な考慮は、選択された方法、例えばキャピラリー電気泳動によって検出可能であるには十分に長いが、標的核酸と比較して増幅効率を有意には変更させない十分に短い長さの相違を有することである。つまり、より長いかまたはより短い競合核酸の増幅効率は標的核酸のそれと類似しなければならない。
上記で検討したように、競合核酸は、所与の病原体特異的標的核酸を増幅するために選択される同じオリゴヌクレオチドプライマー対によってそれらの増幅を可能にする配列の存在により特徴付けられる。病原体特異的標的核酸を増幅するために用いられる同じプライマー対による競合核酸の増幅は、標的配列と競合配列の両方へのプライマーのアニーリング効率が同じであることを確保し、競合核酸および標的核酸の類似した増幅効率を確保することは重要である。
類似の増幅効率を維持するために、競合核酸（または、より正確には、それらの増幅産物）は、標的核酸（またはその増幅産物）に類似したTmを有することが重要である。任意の所与の配列に対するTmを推定する方法は、当技術分野において周知である。Tmは、例えば、標的核酸と比較して、1〜2℃以内、好ましくは0.5〜1℃以内、またはさらに小さい相違で類似する。競合核酸および標的核酸は、同一配列の少なくとも20個のヌクレオチドまたは塩基対を含むことが好ましい。これは、好ましくは、共通のプライマー結合配列に加えられる。標的核酸および競合核酸のプライマー結合配列は、同一であることは必要ではないが、同じプライマーによって増幅を可能にするために操作されなければならない。プライマーのアニーリング効率における相違は、増幅効率に影響を及ぼすので、病原体特異的標的と競合配列との間のこれらの配列において同一性を維持することが最も直接的である。
病原体特異的標的核酸に対して必然的に類似した増幅効率を有する競合核酸を生じさせる最も直接的なやり方の1つは、病原体特異的標的核酸それ自体（即ち、内部挿入または欠失）に短い（例えば、1〜20ヌクレオチドの挿入または欠失、例えば、5〜20ヌクレオチドまたは5〜10ヌクレオチドの挿入もしくは欠失）ストレッチを挿入または欠失することによって、病原体特異的核酸に対応するクローン化したcDNAを修飾することである。これは、アニーリングおよび増幅効率に関して類似した特徴を確保し、唯一の相違が内部挿入または欠失である。短い連接する配列の挿入または欠失は、より容易に達成されるが、この態様に含まれる挿入または欠失は、連続していないヌクレオチドまたは塩基対における挿入または欠失、つまり、病原体特異的標的配列内の1箇所より多い位置での除去または挿入も含むことができる。より短い標的アンプリコン配列、例えば50〜75ヌクレオチドに対して、例えば1〜5ヌクレオチドのより短い末端に対して長さの相違を保つことが有利であり、これは、百分率基準で、配列の構成のより小さな変化を示す。より長い標的アンプリコン配列に関して、長さの相違は、分子の増幅特徴に対する劇的な影響を有することなくより長くなり得る。より長い標的アンプリコン配列との関連であっても、挿入または欠失は、なお好ましくは10ヌクレオチド（または塩基対）以下であり、特にサイズ分離は、たった1ヌクレオチドまたは1塩基対に基づく解像度の能力がある方法、例えば、CEを用いて実行される。
当業者は、増幅効率に影響する1つの因子が、同じヌクレオチドの繰り返しのストレッチ、例えばポリA、ポリGなどの存在であって、この繰り返しのない類似の配列と比べて、増幅効率を減少させる傾向にあることを理解するであろう。したがって、付加する配列、またはそれについては欠失する配列を考慮すると、ヌクレオチド組成におよそ安定である配列を付加または欠失することが最良である。付加または欠失される配列は、アミノ酸をコードする配列またはコードしない配列であってもよく、それが望まれるならば、任意で従来のヌクレオチドまたは従来にないヌクレオチドを含むことができる。
競合核酸のセットを生じさせるのに有用な配列の挿入または欠失は、当技術分野において周知の部位特異的突然変異誘発法を用いて容易に達成される。DNA配列の標的突然変異を可能にする多数の方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology（1995）3rd Ed. John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい）。さらに、従来の方法およびPCRに基づく方法の両方を含む、部位特異的突然変異誘発のための多数の市販キットがある。例としては、GeneMorph Random突然変異誘発キット（Stratageneカタログ番号600550または200550）、Stratageneから入手できるEXSITE(商標)PCRに基づく部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号200502）、およびStratageneからのQUIKCHANGE(商標)部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号200518）、およびStratageneからでもあるCHAMELEON(商標)二本鎖部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号200509）を含む。
増幅効率の測定は、本明細書では下記に説明されている。
一度競合配列が設計されると、本明細書に記載される方法において使用するための競合核酸は、例えば、当技術分野において公知の化学的合成、PCRによって生じさせることができ、または、競合核酸がRNAである場合は、インビトロ転写によって生じさせることができる。インビトロ転写の技術は、当業者に周知である。簡潔に言えば、対象となる配列は、バクテリオファージT7、T3、およびSp6 RNAポリメラーゼプロモータなどの原核生物のポリメラーゼのためのプロモータ配列に連結され、適切なポリメラーゼを用いてDNA鋳型のインビトロ転写を行う。鋳型は、それ自体、例えば、プライマーがPCR増幅プライマーの1つへの適切なプロモータ配列の挿入によって組み込まれる線状PCR産物であり得る。望ましければ、各末端上に1つある、2つの異なるプロモータへの連結は、競合RNAの相補体も発生させる潜在性を生じる。
あるいは、所望の競合RNAに対応するDNA配列は、Sp6、T3またはT7プロモータを含有するベクターに挿入することができる。ベクターは、競合配列の下流に位置した一部位でベクターを消化する適切な制限酵素を用いて直鎖状にされる。フェノール/クロロホルム抽出後、DNAは、エタノール沈澱され、70％エタノール中で洗浄され、乾燥され、滅菌水に再懸濁される。プロモータ/鋳型構築物の抽出形態（即ち、線状PCR産物または線状にしたベクター構築物）に関わらず、インビトロ転写反応は、直鎖状DNAを、転写バッファー（200mM Tris-HCl、pH8.0, 40mM MgCl2、10mMスペルミジン、250 NaCl［T7もしくはT3］、または200mM Tris-HCl、pH7.5, 30mM MgCl2、10mMスペルミジン［Sp6］）、ジチオスレイトール、RNase阻害剤、4種のリボヌクレオシド三リン酸エステルの各々、およびSp6、T7もしくはT3 RNAポリメラーゼのいずれかとともに、例えば30分間37℃でインキュベートすることによって実行される。RNAを含む標識したポリヌクレオチドを調製することが望ましい場合、未標識のUTPは除かれ、標識したUTPは、反応混合物に含めることができる。標識には、例えば、蛍光または放射性標識が含まれる。次に、DNA鋳型は、DNaseIとのインキュベーションによって除去される。フェノール抽出を用いて、DNAseおよびポリメラーゼを除去することができ、次に、例えば、UV吸収および/または電気泳動、および公知の標準と比較した視覚化によって、RNAの沈澱および定量を行う。
ポリメラーゼ連鎖反応：
PCRは、対象となる標的配列を増幅するために、熱安定性のDNA依存性DNAポリメラーゼによって触媒されるDNA複製の複数回のサイクルを用いることによって、特定のDNA配列を迅速に増幅するための十分に確立した方法を提供する。PCRは、増幅するための標的核酸配列、増幅されるべき配列に隣接して位置する2つの一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー、DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、バッファー、および塩の存在を必要とする。
PCRは、参照により本明細書に組み入れられる、Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155：335、並びに各々がまた参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,683,202号、第4,683,195号、および第4,800,159号に記載されている。標的配列の特定の増幅のための反応条件は、当業者による最小の実験で容易に選択されるかまたは決定することができる。基本的な主題に関する多数のバリエーションも当業者に公知である。
PCRサイクルの各工程（変性、プライマーアニーリング、および伸長）の長さおよび温度、並びにサイクル数は、実際にはストリンジェンシー要件に従って調整される。アニーリング温度および時間は、プライマーが鋳型にアニーリングする際に予測される効率、および許容されるミスマッチの程度の両方により決定される。プライマーアニーリング条件のストリンジェンシーを最適化する能力は、当業者の知識に十分に含まれている。30℃〜72℃のアニーリング温度が、最も一般的に使用されている。鋳型分子の最初の変性は、通常、92℃〜99℃で、例えば4分間で起こり、その後、変性（94℃〜99℃で15秒間〜1分間）、アニーリング（上記で検討し決定した温度；30秒間〜2分間）、および伸長（72℃で30秒間〜1分間；これはTaqポリメラーゼに対して至適である。当業者は、異なった熱安定性のポリメラーゼに対する適切な伸長条件を知っており、または容易に決定することができる）からなる10〜40サイクルが行われる。生成物の意図される使用に依存して、最終の伸長工程は、多くの場合、より長い時間、例えば4分間、72℃で行われ、次に不定（0〜24時間）に4℃で保存してもよい。
ポリメラーゼ：
多種類のDNAポリメラーゼは、本明細書に記載される方法に用いることができる。本方法での使用に適切なDNAポリメラーゼは、熱安定性であってもまたはそうでなくてもよいが、熱安定性ポリメラーゼは、増幅のための熱サイクルを用いる態様にとって明らかに好ましい。公知の従来のDNAポリメラーゼには、例えば、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）（Pfu）DNAポリメラーゼ（Lundberg et al., 1991, Gene, 108：1, Stratageneによって提供される）、ピロコッカス・オエセイ（Pyrococcus woesei）（Pwo）DNAポリメラーゼ（Hinnisdaels et al., 1996, Biotechniques, 20：186-8, Boehringer Mannheimによって提供される）、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）（Tth）DNAポリメラーゼ（Myers and Gelfand 1991, Biochemistry 30：7661）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）DNAポリメラーゼ（Stenesh and McGowan, 1977, Biochim Biophys Acta 475：32）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）（Tli）DNAポリメラーゼ（Vent DNAポリメラーゼとも呼ばれる、Cariello et al., 1991, Polynucleotides Res, 19：4193, New England Biolabsによって提供される）、Vent exo（New England Biolabs）、9°Nm DNAポリメラーゼ（New England Biolabsの製造中止製品）、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）（Tma）DNAポリメラーゼ（Diaz and Sabino, 1998, Braz J. Med. Res, 31：1239）、サーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）（Taq）DNAポリメラーゼ（Chien et al., 1976, J. Bacteoriol, 127：1550）、ピロコッカス・コダカラエンシス（Pyrococcus Kodakaraensis）KOD DNAポリメラーゼ（Takagi et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63：4504）、JDF-3 DNAポリメラーゼ（サーモコッカス（thermococcus）sp.のJDF-3由来、特許出願WO0132887）、ピロコッカス（Pyrococcus）GB-D（PGB-D）DNAポリメラーゼ（Deep-Vent DNAポリメラーゼとも呼ばれる、Juncosa-Ginesta et al., 1994, Biotechniques, 16：820, New England Biolabsによって提供される）、UlTma DNAポリメラーゼ（好熱菌サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）由来；Diaz and Sabino, 1998, Braz J. Med. Res. 31：1239；PE Applied Biosystemsによって提供される）、Tgo DNAポリメラーゼ（サーモコッカス・ゴルゴナリウス（thermococcus gorgonarius）由来、Roche Molecular Biochemicalsによって提供される）、大腸菌DNAポリメラーゼI（Lecomte and Doubleday, 1983, Polynucleotides Res. 11：7505）、T7 DNAポリメラーゼ（Nordstrom et al., 1981, J. Biol. Chem. 256：3112）、および古細菌DP1/DP2 DNAポリメラーゼII（Cann et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95：14250-5）が含まれる。
熱サイクル反応に関して、ポリメラーゼは、好ましくは熱安定性ポリメラーゼであり、例えば、Taq、Deep、Vent、Tth、Pfu、Vent、およびUlTmaであり、各々は、商業的供給源から容易に利用可能である。同様に、これらの酵素のそれぞれの使用に関するガイダンスは、ガイド、製品説明書、インターネット（例えば、www.alkami.comを参照されたい）、および他の供給源に見られる多数のプロトコールのいずれかに容易に見出すことができる。
非熱サイクル反応に関して、ある種の熱サイクル反応において、ポリメラーゼは、多くの場合、通常、当分野において用いられ、市販されている多くのポリメラーゼの1つであり、例えば、DNA pol I、K1enow断片、T7 DNAポリメラーゼ、およびT4 DNAポリメラーゼがある。転写に関わる用途では、多数のRNAポリメラーゼも市販されており、例えば、T7 RNAポリメラーゼおよびSP6 RNAポリメラーゼがある。このようなポリメラーゼの使用に関するガイダンスは、製品説明書およびSambrookまたはAusubel（ともに前記）などの一般的な分子生物学ガイドに容易に見出すことができる。
ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドの合成中に標識した（例えば、蛍光）ヌクレオチドまたはそれらの類似体を取り込むことができる。例えば、Taqによって組み込まれるヌクレオチド類似体の使用が記載されているHawkinsらの米国特許第5,525,711号を参照されたい。
上述したように、本明細書において記載される方法に要求される増幅反応は、概して、他に特定されなければ、標準的な反応条件および試薬を用いて実行可能である。このような試薬および条件は、当業者に周知であり、多数の参考文献およびプロトコールに記載されている。例えば、Innis, 前記；Sambrook, 前記；Ausubel et al., eds.（1996）Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.との共同事業を参照されたい。Mullis et al., （1987）米国特許第4,683,202号、およびArnheim & Levinson（1990）C&EN 6-47, The Journal Of NIH Research（1991）3：81-94；Kwoh et al.（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：1173；Guatelli et al.（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：1874；Lomell et al.（1989）J. Clin. Chem 35：1826；Landegren et al., （1988）Science 241：1077-1080；Van Brunt（1990）Biotechnology 8：291-294；Wu and Wallace,（1989）Gene 4：560；Barringer et al.（1990）Gene 89：117、ならびにSooknanan and Malek（1995）Biotechnology 13：563-564も参照されたい。
増幅効率：
上記で検討したように、競合核酸の増幅効率は、用いられる場合、病原体特異的標的核酸の増幅効率と同じでなければならない。一局面では、増幅効率は、PCRサイクルあたりの増幅倍率として表され、完全な倍加と比較した分数または百分率として表される。100％または1.0増幅効率は、完全な倍加と呼ばれる。
増幅効率をモニターする1つの方法は、閾値サイクル数（Ct）を測定することであり、そこでは、PCR産物のシグナル強度は、増幅した生成物に対する設定閾値（例えば、シグナル強度のバックグランド値の10の標準偏差）に到達する。例えば、増幅計画中の各サイクルで試料を取り出し、標的アンプリコンの量について分析する。等しい開始量の2つの異なる増幅鋳型、例えば、標的RNAおよび競合RNAに関するCtの比較は、増幅効率が同じであるかどうかを測定する。正確さを増すために、この測定は、標的RNAおよび競合RNAのいくつか異なった等しい開始濃度で実行することができる。増幅効率は、閾値サイクルであるCtが、等しい開始量の各々の競合/標的セットについて同じである場合に、「類似している」と考えられる。
Ctは、下記の単純な数学の方程式によって、開始DNAの初期コピー数または濃度に結びつけられる：
Log(コピー数) = aCt+b（式中、aおよびbは定数である）。
したがって、2つの異なった試料を起源とする同じ遺伝子の断片に関するCtを測定することによって、これらの試料中のこの遺伝子の最初の濃度は、用意に評価することができる。あるいは、増幅効率は、継続的なサイクルで、増幅産物の量を測定することによって（例えば、蛍光強度または標識の取り込みによって）モニターされ、式E = (Pn+1-Pn)/(Pn-Pn-1)（式中、Pは、サイクルnでの増幅産物の量である）を用いて効率を計算する。
増幅効率における類似性は、最終的には、実験的に決定されるが、競合物における標的配列同一性の維持は、標的と比較して、長さにおける検出可能な相違を生じるのに必要な挿入または欠失を除いて、類似の効率を達成するのに役立つ。
核酸試料調製物における種々の汚染の存在は、増幅効率に影響を与え得ることは公知である。本明細書に記載される方法の利点は、汚染が、任意の所与の病原体特異的標的に対する競合アンプリコンおよび標的アンプリコンの両方の増幅の効率に同程度に影響を与える可能性が最も高いことである。これは、これらのアンプリコンのそれぞれが、同反応で生じるからである。このことは、効率的な増幅の任意のこのような阻害の影響を減らす傾向がある。
試料の調製
本発明の病原体特異的標的ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよく、それは、DNA（例えば、gDNAもしくはcDNA）、RNA、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含むポリヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および/または類似体を含むポリヌクレオチド、およびそれらの誘導体であってもよい。ウイルス遺伝子の発現レベルを測定することが望まれる場合、標的ポリヌクレオチドは、RNA分子、例えば、mRNA分子である。
増幅反応前、病原体特異的標的ポリヌクレオチドは、用いられる増幅方法に適した量および質で得ることができる。例えば、ある場合には、試料は、標的ポリヌクレオチドの濃度を増加させるプレ増幅反応を実行するのに有用である、このような低レベルの標的ポリヌクレオチドを含有する。試料が増幅されなければならない場合、増幅は、典型的には、公知の手法に従って、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて実行される。ある態様では、試料中の競合物および試験核酸の同時分離前に、既知量の競合核酸を生物試料に添加することが好ましい場合がある。
標的ポリヌクレオチドを含有する試料の調製に関するガイダンスは、多数の供給源において見出すことができ、PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications（Innis et al., 前記；Sambrook et al., 前記；Ausubel et al., 前記）が含まれる。典型的には、これらの方法は、細胞溶解を伴い、フェノール/クロロホルム抽出、電気泳動、および/またはクロマトグラフィーなどの方法によるポリヌクレオチドの精製が続く。多くの場合、このような方法は、例えば、エタノールを用いて、ポリヌクレオチドを沈殿させ、PCRまたは類似の反応に添加するための適切なバッファー中で再懸濁させる工程を含む。
ある種の態様では、一つまたは複数の試料供給源からの2つ以上の病原体特異的標的ポリヌクレオチドが、1回の反応で分析される。これらの態様では、複数の病原体特異的標的ポリヌクレオチドは、単一の試料または個体から増幅することができ、それによって、例えば、免疫無防備状態の個体中の多数の病原体を同時にスクリーニングするために、単一の個体由来の試料に潜在的に存在する種々の病原体の評価を可能にする。上記の応用のいずれかは、本明細書に記載される方法を用いて容易に達成することができる。
反応混合物は、1つの病原体特異的標的ポリヌクレオチドを含んでもよく、または2つ以上の病原体特異的標的ポリヌクレオチド、例えば、最大15もしくは16個の病原体特異的標的ポリヌクレオチドを含んでもよい。したがって、本方法は、単一試料中の2つ以上のポリヌクレオチドの同時分析、即ち、多重分析を可能にする。
一度、開始の細胞、組織、臓器または他の試料が得られると、核酸（RNAおよび/またはDNAを含む）は、当技術分野において周知である方法によってそれらから調製することができる。免疫無防備状態の個体由来の試料、例えば、免疫抑制治療計画において維持されている移植体または移植片は、最も多くの場合、血液または血清試料である。血液試料から核酸を単離する方法は、当業者に周知である。
RNAは、例えば、下記の方法に従って組織から精製することができる。対象となる組織を取り出した後、2g以下の組織片を切断し、液体窒素中に素早く凍結させ、RNAの分解を防ぐ。適量のグアニジン溶液（例えば、組織2gあたり20mlのグアニジン溶液）を添加して、組織試料は、ティッシュマイザー（tissuemizer）中で10秒バーストを2回または3回かけてすり潰す。組織グアニジン溶液（1L）を調製するために、590.8gのグアニジン・イソチオシアネートを約400mlのDEPC処理したH2Oに溶解させる。25mlの2M Tris-HCL、pH7.5（最終0.05M）および20mlのNa2EDTA（最終0.01M）を添加し、この溶液を一晩撹拌し、容量を950mlに調整し、50mlの2-MEを添加する。
ホモジナイズした組織試料は、10分間、12,000×g、120℃での遠心分離に供される。得られる上清は、0.1容量の20％サルコシル（Sarkosyl）の存在下で2分間、65℃でインキュベートし、9mlの5.7M CsCl溶液（0.1g CsCl/ml）上に重ね、113,000×g、22℃で一晩遠心分離することによって分離される。上清を注意深く取り除いた後、チューブを逆さにし、排水する。チューブの底（RNAペレットを含有する）を50mlのプラスチックチューブに置き、3mlの組織再懸濁バッファー（5mM EDTA、0.5％(v/v)サルコシル、5％(v/v)2-ME）の存在下、4℃で一晩（またはそれ以上）インキュベートし、RNAペレットの完全な再懸濁を可能にする。得られるRNA溶液は、連続して、25：24：1のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール、続く24：1のクロロホルム/イソアミルアルコールで抽出し、3M酢酸ナトリウム、pH5.2、および2.5容量の100％エタノールを添加して沈殿させ、DEPC水中に再懸濁させる（Chirgwin et al., 1979, Biochemisry, 18：5294）。
あるいは、RNAは、下記の1回工程のプロトコールに従って、組織から単離することができる。対象となる組織は、組織100mgにつき1mlの変性溶液（4Mのチオ硫酸グアニジン、25mMのクエン酸ナトリウム、pH7.0、0.1Mの2-ME、0.5％(w/v) N-ラウリルサルコシン）を入れたガラステフロンホモジナイザーにおいてホモジナイズして調製される。5mlのポリプロピレンチューブにホモジネートを移した後、連続して、0.1mlの2M酢酸ナトリウム、pH4、1mlの水飽和したフェノール、および0.2mlの49：1のクロロホルム/イソアミルアルコールを添加する。各成分を添加した後に試料を混合し、全ての成分を添加後に15分間、0〜4℃でインキュベートする。試料は、20分間、10,000×g、4℃で遠心分離によって分離し、1mlの100％イソプロパノールの添加によって沈殿させ、30分間、-20℃でインキュベートし、10分間、10,000×g、4℃で遠心分離によってペレット化する。得られるRNAペレットを0.3mlの変性溶液に溶解し、微量遠心チューブ（microfuge tube）に移し、0.3mlの100％イソプロパノールを添加し、30分間、-20℃で沈殿させ、10分間、10,000×g、4℃で遠心分離する。RNAペレットを70％エタノール中で洗浄し、乾燥させ、100〜200μlのDEPC処理した水またはDEPC処理した0.5％SDSに再懸濁させる（Chomczynski and Sacchi, 1987, Anal. Biochem., 162：156）。
総RNAを単離するためのキットおよび試薬は、種々の会社から市販され、例えば、RNA単離キット（Stratagene, La Lola, CA, カタログ番号200345)；PicoPure(商標)RNA単離キット（Arcturus, Mountain View, CA, カタログ番号KIT0202)；RNeasy Protect Mini、Midi、およびMaxiキット（Qiagen, カタログ番号74124）がある。
いくつかの態様では、総RNAは、続く分析のため、例えば、逆転写のために対象の方法において用いられる。他の態様では、mRNAは、総RNAから単離するか、または試料から直接単離して、逆転写に用いることができる。mRNAを単離するためのキットおよび試薬は、例えば、Oligotex mRNAキット（Qiagen、カタログ番号70022）から市販されている。
標識したヌクレオチド
本明細書において記載される方法は、例えば、蛍光標識を含む標識の使用から利益を得ることができる。一局面では、蛍光標識は、増幅した（通常、二本鎖）核酸分子にインタカレートするか、または他にはそれと結合して、シグナルを与える標識または色素であり得る。このような態様に有用な1つの染色液は、SYBRグリーン（例えば、Molecular Probes Inc., オレゴン州ユージーンから市販されるSYBRグリーンIまたはII）である。当業者に公知の他のものも本明細書に記載される方法に採用することができる。このアプローチの利点は、例えば、標識したヌクレオチドの使用と比較して、コストを減らせることである。それにもかかわらず、標識が、重合酵素に対する基質である標識したヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体への結合によって組み込まれることも好ましい場合がある。標識は、代わりに、増幅プライマーに結合させてもよい。上記で教示されるように、標識したヌクレオチドは、フルオロフォア連結ヌクレオチドであってもよく、または固有の蛍光ヌクレオチドであり得る。本明細書に記載される方法の一態様では、フルオロフォアに連結した従来のデオキシヌクレオチドが用いられる。いくつかの有用な標識したヌクレオチドの非制限的な例は、表1に列挙される。
（表１）標識したヌクレオチドの例
Figure 2009514551
フルオロフォア標識したヌクレオチドは、商業的供給源から購入することができる。標識したポリヌクレオチド・ヌクレオチドも当技術分野において公知の多数のアプローチのいずれかによって調製することができる。
検出可能な標識として有用なフルオロフォアは、当業者に周知であり、多数の例は、Handbook of Fluoresdent Probes and Research Chemicals 6th Editon, Richard Haugland, Molecular Probes, Inc., 1996（ISBN 0-9652240-0-7）に見出すことができる。
好ましくは、フルオロフォアは、自動化されたキャピラリー電気泳動装置上での検出と適合するように選択され、したがって、スペクトル的に分離でき（resolvable）、電気泳動分析を著しく妨害すべきではない。検出可能な標識としての使用に適したフルオロフォアの例は、他の場所としては、全てが全体として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,750,409号；第5,366,860号；第5,231,191号；第5,840,999号；第5,847,162号；第4,439,356号；第4,481,136号；第5,188,934号；第5,654,442号；第5,840,999号；第5,750,409号；第5,066,580号；第5,750,409号；第5,366,860号；第5,231,191号；第5,840,999号；第5,847,162号；第5,486,616号；第5,569,587号；第5,569,766号；第5,627,027号；第5,321,130号；第5,410,030号；第5,436,134号；第5,534,416号；第5,582,977号；第5,658,751号；第5,656,449号；第5,863,753号；PCT国際公開WO97/36960；99/27020；99/16832；欧州特許第0050684号；Sauer et al., 1995, J. Fluorescence 5：247-261；Lee et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20：2471-2483；およびTu et al., 1998, Nucl. Acids Res. 26：2797-2802の中に見出すことができる。
ヌクレオチドは、蛍光色素連結のために、官能基、例えば第1級および第2級アミン、ヒドロキシル、ニトロおよびカルボニル基を含むように修飾することができる（表2を参照されたい）。
（表２）
Figure 2009514551
有用なフルオロフォアには、以下に限定されないが、テキサスレッド（Texas Red）(商標)（TR）、リサミン（Lissamine）(商標)ローダミンB、オレゴングリーン（Oregon Green）(商標)488（2',7'-ジフルオロフルオレセイン）、カルボキシロドール（carboxyrhodol）およびカルボキシローダミン、オレゴングリーン（Oregon Green）(商標)500、6-JOE（6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2'7'-ジメトキシフルオレセイン、エオシンF3S（6-カルボキシメチルチオ-2',4',5',7'-テトラブロモ-トリフルオロフルオレセイン）、カスケードブルー（Cascade Blue）(商標)（CB）、アミノメチルクマリン（AMC）、ピレン類、ダンシルクロリド（5-ジメチルアミノナフタレン-1-スルホニルクロリド）および他のナフタレン類、PyMPO、ITC（1-(3-イソチオシアナトフェニル)-4-(5-(4-メトキシフェニル)オキサゾール-2-イル)ピリジニウムブロミド）、クマリン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、ルシファー（Lucifer）イエロー、ローダミン、BODIPY、テトラメチルローダミン、Cy3、Cy5、Cy7、エオシン、およびROXが含まれる。例えば、Lee et al.,（1997), Polynucleotides Research 25：2816に記載されるフルオレセイン-ローダミン二量体などのコンビネーションフルオロフォアも適している。適したフルオロフォアには、可視スペクトル内または可視スペクトル外、例えば、紫外範囲もしくは赤外範囲に吸収および発光するものが含まれる。適したフルオロフォア標識は、いくつかある供給源の中で、Molecular Probes, Inc., オレゴン州ユージーン, 米国、およびResearch Organics, Inc., オハイオ州クリーブランド, 米国から市販され、Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 6th Edition, Richard Haugland, Molecular Probes, Inc., 1996（ISBN 0-9652240-0-7）に見出すことができる。
本明細書に記載される方法に有用な標識したヌクレオチドには、当技術分野において公知の固有の蛍光ヌクレオチドが含まれ、例えば、米国特許第6,268,132号（その全体が、参照により本明細書に組み入れられる）に記載される新規蛍光ヌクレオシド類似体がある。米国特許第6,268,132号の蛍光類似体には、3つの一般型：（A）C-ヌクレオシド類似体；（B）N-ヌクレオシド類似体；ならびに（C）N-アザヌクレオチドおよびN-デアザヌクレオチド類似体がある。これらの全ての化合物は、共通して3つの特徴を有する。1）それらは、オリゴヌクレオチドの酵素的合成または化学的合成において天然に発生しているヌクレオシドを置換することができる共通のヌクレオシドの構造類似体である；2）それらは、適切な波長の光によって励起された場合、自然な蛍光性であり、それらの検出のためには更なる化学的または酵素的プロセスを必要としない；および3）それらは、自然に発生しているDNAにおいて、一般的に遭遇するヌクレオシドとはスペクトル的に区別される。少なくとも125個の具体的な化合物が米国特許第6,268,132号において同定されている。これらの化合物は、それらのクラス、構造、化学名、吸収スペクトル、発光スペクトル、および合成方法に従って特徴付けられ、米国特許第6,268,132号の図21A-21F-1に示されるように一覧にされている。
本明細書において記載される標識したヌクレオチドには、以下に限定されないが、蛍光N-ヌクレオシドおよび蛍光構造類似体も含まれる。ホルマイシンA（一般には、ホルマイシンと呼ばれる）は、原型的な蛍光ヌクレオシド類似体であり、元来、ノカルジア・インターフォーマ（Nocardia interforma）の培養ろ液から抗腫瘍性抗生物質として単離され（Hori et al.,［1966］J. Antibiotics, Ser. A 17：96-99）、その構造は、7-アミノ-3-b-D-リバフラノシル(1H-ピラゾロ-[4,3d]ピリミジン)として同定された。また、この抗生物質は、ストレプトミセス・ラベンドデュラ（Streptomyces lavendulae）（Aizawa et al.,［1965］Agr. Biol. Chem. 29：375-376）、およびストレプトミセス・グマエンシス（Streptomyces gummaensis）（日本化薬株式会社による、1967年に発行された日本特許第10,928号）の培養ブロスから単離され、全ての供給源からRNAに共通して見出されるN-ヌクレオシドの多数の微生物性C-リボヌクレオシド類似体の1つである。微生物から単離された、他の天然に存在しているC-リボヌクレオシドには、ホルマイシンB（Koyama et al.,［1966］Tetrahedron Lett. 597-602；Aizawa et al., 前記；Umezawa et al.,［1965］Antibiotics Ser. A 18：178-181）、オキソホルマイシンB（Ishizuka et al.,［1968］J. Antibiotics 21：1-4；Sawa et al.,［1968］Antibiotics 21：334-339）、プソイドウリジン（Uematsu and Suahdolnik［1972］Biochemistry 11：4669-4674）、ショードマイシン（showdomycin）（Darnall et al.,［1967］PNAS 57：548-553）、ピラゾマイシン（Sweeny et al.,［1973］Cancer Res. 33：2619-2623）、およびミニマイシン（Kusakabe et al.,［1972］J. Antibiotics 25：44-47）が含まれる。ホルマイシン、ホルマイシンB、およびオキソホルマイシンBは、ピラゾロピリミジンヌクレオシドであり、それぞれ、アデノシン、イノシン、およびヒポキサンチンの構造類似体である；天然供給源から入手されるグアノシンのピラゾピリミジン構造類似体は、文献では報告されていない。これらの化合物の生合成の全体的な概説は、Ochi et al.,（1974）J. Antibiotics xxiv：909-916において利用可能である。各参考文献の全体が、参照により本明細書に組み入れられる。
増幅産物の分離および検出：
ポリヌクレオチドの存在または量を検出する方法は、当技術分野において周知であり、それらのいずれかは、競合物と標的アンプリコンとの間の少なくとも長さの相違によって個々のポリヌクレオチドを分離することができる限り、本明細書に記載される方法において用いることができる。用いられる分離技術は、25〜1000ヌクレオチドまたは塩基対の長さの配列の分離度を可能にし、10ヌクレオチドもしくは塩基対の分離度またはそれより良好な分離度を有しなければならない。分離は、変性下、または非変性もしくは天然の条件下で実行することができる。即ち、分離は、一本鎖または二本鎖核酸で実行され得る。分離および検出は、1ヌクレオチドほどの短い長さの相違を検出できることが好ましい。分離および検出は、サイクリング反応中に採取される複数の反応アリコートに豊富な、アンプリコンのリアルタイム測定または同時測定を可能にするハイスループットフォーマットで行うことができることがさらに好ましい。増幅産物の分離および分析に有用な方法には、以下に限定されないが、電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動（CE）、クロマトグラフィー（dHPLC）、および質量分析）が含まれる。
一態様では、CEは、1個のヌクレオチドまたは塩基対の分離度を有し、少なくとも10〜1,000塩基対の範囲でポリヌクレオチドの優れた分離を提供するため、好ましい分離手段である。CEは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,217,731号；第6,001,230号；および第5,963,456号に開示されるように、当技術分野において周知の方法によって実行可能である。ハイスループットCE装置は市販されており、例えば、Spectrumedix Corporation（ステートカレッジ、ペンシルベニア州）のHTS9610ハイスループット分析システムおよびSCE 9610全自動96キャピラリー電気泳動遺伝子分析システム；Beckman Instruments Inc（カリフォルニア州フラートン）のP/ACE 5000シリーズおよびCEQシリーズ；およびABI PRISM 3100遺伝子アナライザー（Applied Biosystems, カリフォルニア州フォスターシティー）がある。CEカラムの末端近くで、これらの機器において、増幅したDNA断片は、蛍光標識のシグナルを測定する蛍光検出器を通過する。これらの装置は、蛍光標識したPCR産物の検出に対して自動化したハイスループットを提供する。
本明細書に記載される方法においてCEの採用は、従来のスラブゲルの電気泳動と比較してより高い生産性を可能にする。分離スピードは、高い電場がゲルに適用される場合に発生する熱のため、スラブゲルの電気泳動では制限される。キャピラリーの大きな表面領域からの熱除去は、非常に早いため、より高い電場がキャピラリー電気泳動に適用することができ、したがって、分離プロセスを加速する。キャピラリーゲルを用いることによって、分離スピードは、従来のスラブゲルシステムに対して約10倍増加する。
また、CEを用いると、ハイスループットにとって必須である、同時期での複数試料を分析することができる。これは、例えば、マルチキャピラリーシステムを採用することによって達成される。いくつかの場合では、DNA塩基からの蛍光の検出は、多孔質マトリクスおよびキャピラリー壁からの光散乱によって複雑となる場合がある。しかしながら、共焦点蛍光スキャナを用いて、光散乱による問題を回避することができる（Quesada et al., 1991, Biotechniques 10：616-25）。
一態様では、本明細書に記載される方法は、増幅用の鋳型として用いられる試料に含まれる特定の病原体特異的標的ポリヌクレオチド（例えば、DNAまたはRNA）の量（即ち、コピー数）を測定する。
別の態様では、病原体レベルの相違は、測定される試料に含まれる病原体特異的標的ポリヌクレオチドの正確なコピー数というよりはむしろ、免疫療法の経過または免疫抑制の経過中にモニターされてもよい。サイズ分離後に検出されるシグナル強度は、例えば、2つの別々の試料中の少なくとも2つの競合物および病原体特異的標的核酸の各々に対して記録され、2つの試料に由来する標的ポリヌクレオチド相対比を決定するために用いることができる。閾値サイクル数（Ct）は、PCR産物のシグナル強度が、増幅産物に対して設定閾値（例えば、シグナル強度のバックグランドの10の標準偏差）に到達するサイクル数として計算される。特定の標的の操作差次的発現は、数値で1より多いサイクルの、2つ（またはそれ以上の）試料中のこの標的に対する閾値サイクル数（Ct）の違いとして測定される。このような態様における少なくとも2つの競合核酸からのシグナルを参照することによって達成される定量に加えて、所与の反応における所与の標的に対する閾値サイクル数を用いて、さらに、標的ポリヌクレオチドに対するコピー数を導き出し、2つ以上の試料中の標的のコピー数の比によって発現の差を測定することができる。
PCRまたは他の増幅反応の生成物である核酸断片は、限定されないが、ゲル電気泳動（例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびキャピラリーゲル電気泳動）、クロマトグラフィー（例えば、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）およびガスクロマトグラフィー（GC））、分光分析（例えば、質量分析（MS）およびGC-MS）、赤外分光計、およびUV分光計）、分光光度計（例えば、蛍光分光光度計）、大気圧化学イオン化質量分析、定電位電流測定、免疫アッセイ（例えば、ELISA）、電気化学検出、および融解曲線分析を含む、当技術分野において公知の標準的な方法を用いて分離（例えば、サイズによって）および検出されてもよい。
種々の質量分析技術を用いて、様々なサイズのDNAが分析されている（Nelson et al.,“Volatilization of High Molecular Weight DNA by Pulsed Laser Ablation of Frozen Aqueous Solutions, Science, 246, 1585-87（1989)；Huth-Fehre et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry, 6, 209-13（1992)；K. Tang et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry, 8, 727-730（1994)；Williams et al.,“Time-of Flight Mass Spectrometry of Nucleic Acids by Laser Ablation and Ionization from a Frozen Aqueous Matrix,” Rapid Communications in Mass Spectrometry, 4, 348-351（1990））。
近年、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）として公知の質量分析器に関するイオン化技術の開発が、飛行時間質量分析器の使用、およびそれらの性能の改善において非常な関心を生んでいる。MALDIは、巨大分子（例えば、ペプチドおよびタンパク質、糖質、糖脂質、糖タンパク質、およびオリゴヌクレオチド（DNA））、ならびに他の高分子のイオン化に特に有効である（MALDI-TOF analysis：Ross, High level multiplex genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry, Nature Biotechnology 16（1998), 1347-1351）。したがって、マススペクトロフォレシス（mass spectrophoretic）法を用いて、本明細書に記載される方法の増幅核酸産物、並びに病原体特異的マーカーまたは宿主応答遺伝子産物のいずれかを検出および/または定量化することができ、これらの生成物およびマーカーは、核酸、タンパク質、脂質または他の高分子である。
宿主応答
病原体に対する宿主応答は、寄生生物による感染に応じて誘発される。宿主応答において活性化される遺伝子の生成物は、本明細書に記載される方法において、病原体感染のマーカーとして用いることができる。あるいは、宿主遺伝子は、多重アッセイにおける参照対照として用いることができる。いずれかの場合において、宿主遺伝子（転写物またはポリペプチド）の生成物は、検出および/または定量化され、同時に所定の生物試料中の病原体特異的配列または他のマーカーを同定および/または定量化することができる。一局面では、生成物は、初期宿主応答遺伝子によってコードされている。宿主応答遺伝子産物の例には、以下に限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、リガンド、および宿主応答病原体を改変し、増加させ、または他には増強させることができる他の分子が含まれる。免疫抑制のタイプおよび経過に応じて、これらの宿主応答遺伝子のいくつかは、免疫抑制された患者においては正常な患者と同じ程度まで発現しなくてもよい。しかしながら、最適には、宿主応答遺伝子は、対象となる病原体特異的マーカーと同時に発現し、両方が同時に検出されるようになる。
一つまたは複数の病原体に対する宿主応答は、典型的には、核酸および/またはタンパク質レベルで検出され得る複数の因子のカスケードの活性化を含む炎症反応を誘発する。典型的には、病原体は、上皮細胞または内皮細胞などの宿主の一次障壁を回避するかまたは破壊し、結果として組織損傷をもたらす。組織損傷は、血漿プロテアーゼ系、脂質メディエーターおよび炎症性ペプチドおよびサイトカインを含む炎症性メディエーターの産生に帰着する。血漿プロテアーゼには、補体経路のもの、キニンカスケードのもの、およびホメオスタシスのものが含まれる。炎症の脂質メディエーターには、プロスタグランジン類、ロイコトリエン類および血小板活性化因子が含まれる。炎症性ペプチドには、ヒスタミンおよびセロトニン、神経ペプチド、並びにC反応性タンパク質、血清アミロイドAおよびフィブリノゲンを含む急性期血漿タンパク質が含まれる。炎症性サイトカインには、以下に限定されないが、TNFα、IL-1-β、およびIL-6が含まれる。更なる炎症メディエーターには、以下に限定されないが、レプチンおよびリポカリン類が含まれる。
また、本明細書に記載される方法は、免疫無防備状態の患者において対象となる一つまたは複数の病原体による感染によって引き起こされる感染症、または前記対象となる一つまたは複数の病原体による感染症を発症する危険にある個体からの感染症の発症をモニターすることを含み、対象となる病原体は、ウイルス、細菌、または原生動物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され、該方法は、a）患者または個体から生物試料を得る工程、b）対象となる一つまたは複数の病原体を示す一つまたは複数の病原体特異的マーカーを検出および定量化する工程、ここで、該病原体特異的マーカーは、該試料中の一つまたは複数の病原体に由来する核酸、タンパク質、多糖および/または脂質、あるいはそれらの任意の組み合わせを含むことができる、工程およびc）試料中の関心対象の一つまたは複数の前記病原体の量を計算する工程、ここで、該量は、該試料の容量および/または重量あたりの微生物のコピー数として表される、工程を含む。
生物試料中の病原体検出の上述した方法では、免疫無防備状態の患者は、感染症に対して無症候性であってもよく、およびそうである可能性が高い。試験される試料中の関心対象の一つまたは複数の病原体の計算量は、一つまたは複数の病原体による感染に起因する疾患を発症する可能性の評価を可能にし、そして、あるとすれば、どんな予防治療的処置が、被験免疫無防備状態患者に施されるかの決定における1因子となり得、またはあるとすれば、どんな変更が、免疫抑制治療計画に存在するのかの決定における1因子となり得る。免疫無防備状態の患者は、移植体または移植片の受容者でよく、かつ免疫抑制療法を受けていてもよい。
生物試料中の病原体検出の前述の方法では、対象となる一つまたは複数の病原体は、多重アッセイで評価され、1つの患者試料に実行される一団の病原体特異的な試験において評価することができる。一局面では、患者試料は、血液、唾液、および尿からなる群より選択することができる。各病原体特異的マーカーの量は、該病原体の各々に特異的な抗体を用いて測定することができ、感染症の出現または進行をモニターするための規則的なスケジュールで実行することができる。モニタリングは、例えば、少なくとも月に一度、またはより頻繁であってもよい。
実施例
実施例1：オリゴヌクレオチド設計および合成
プライマーは、PrimerSelectソフトウェア（DNASTAR Inc, ウィスコンシン州マジソン）を用いて選択され、下記の基準に基づく：
19〜24ヌクレオチドの長さ；融点（Tm）54.5〜58.2℃；プライマー安定性-45.9〜-39.9kcal/モル；7ヌクレオチドの固有プライマー3'配列；2個の隣接する塩基よりも長い自己プライマーおよびプライマー対形成を回避すること（3'末端から8塩基の二本鎖を無視すること)；2塩基より多い長さの内部プライマーヘアピンを回避すること；約-8.5kcal/モル以上の最小3'五量体の安定性を有すること。
さらに、選択されるプライマー対は、-6.0kcal/モル未満の安定性を有する任意の潜在的な二量体を排除するために種々のプライマー対間の多重な二量体形成について評価される。さらに、プライマーは、哺乳動物のポリヌクレオチドに非常な（3'末端から14個の隣接するヌクレオチドまたは10個の隣接するヌクレオチドより多い）相同性を有する任意のプライマーを排除するために、BLASTサーチプログラムを用いた重複しないDNAデータベース（Gene Bank, NCBI）に対してスクリーニングされる。
実施例2：微生物のPCR増幅および最終検出
A. 微生物特異的プライマーを用いた微生物RNAの1工程RT-PCR検出
全量50または100ul中に、0.25uMの各RTプライマー（任意で）、0.25uMの遺伝子特異的PCRプライマー（5'末端でFAMで標識した微生物特異的な対の1つのプライマー）、修飾した1× Stratagene RT-PCRバッファー（Brilliant Single Q-RT-PCRキット、カタログ番号600532）、0.1%のTriton X100、0.2mMのdNTP、1.5mMのMgCl2、および1.25UのStrataScript RTase（Stratagene, カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を含有する反応混合物にRNA鋳型を添加し、鉱油を重ねる。逆転写は、45℃で50分間実行し、続いて、RTaseを失活させるために、94℃で2分間インキュベートする。次に、試料は、94℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で1分間の44サイクルからなるプロトコールを用いて、PCR増幅させる。最初の72℃の伸長で成長中に、1Uの熱安定性DNAポリメラーゼ（Vent exo（-）（New England Biolabs））を添加する。増幅アリコート（3〜5ul）の44サイクル後、反応を停止させるために、即座にホルムアミドと混合する。試料は、後述されるキャピラリー電気泳動によって分析される。
反応成分の失敗により増幅産物が存在しないことはないことを確かめるために、10〜1000コピー/反応の対照RNA鋳型、および対照鋳型のためのプライマー対（0.25uM）をRT-PCR前に反応混合物に添加する。微生物に特異的な増幅産物がない状態で、増幅した対照鋳型の存在は、特定の微生物の非存在を示すものとして考えられる。
キャピラリー電気泳動による試料の分離
3ulの試料は、適切に蛍光標識したDNAサイズ標準（Bio Ventures, テネシー州マーフリーズバラ）を含有する7ulのホルムアミドに添加される。試料を熱変性し、回転させ、3100 Genetic Analyzerキャピラリー電気泳動機器（ABI, カリフォルニア州フォスターシティー）に装填する。試料を20秒間、3kVで注入し、次に、POP4ポリマー（ABI, カリフォルニア州フォスターシティー）上、15kVで分離する。データは、その機器と共に提供されるGene Scan v3.7.1ソフトウェアによって、ピークおよび相対面積について分析される。
B. 2工程RT-PCRプロトコール
逆転写に関して、RNA鋳型およびRT特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、10％グリセロールに添加され、70℃で10分間加熱され、次に、氷上に2分間置かれる。バッファー（最終濃度：50mM Tris-HCl、pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、0.01M DTT、0.8mM dNTP、0.2mg/ml BSA、20%トレハロース）、160UのSuperscript II RNase H-逆転写酵素（SSRTII；Invitrogen, カリフォルニア州カールズバッド）、および32UのRNAsin（Ambion, テキサス州オースティン）を全量40ulに対して添加する。逆転写は、45℃で20分間進められ、次に、75℃で変性工程を行う。48℃、30分間の逆転写の第2ラウンドは、50U SSRTIIの添加と共に開始する。試料は、80℃、2分間で別の変性工程を受け、次に、50U SSRTIIの添加と共に52℃、30分間で逆転写の別のラウンドを行う。試料を0.04M NaOH（最終濃度）でアルカリ処理し、65℃で15分間インキュベートし、その後、最終濃度の0.07M Tris、pH7.5を添加し、次に、試料を5分間、室温でインキュベートする。次いで、試料をQIAquickゲル抽出キット（Qiagen, カタログ28704, カリフォルニア州ヴァレンシア）を用いて、360ulのQGバッファーを各RT試料に添加し、抽出前のpHに調整することを除いて、製造業者の取扱説明書によって洗浄する。試料を50ulの10mM Tris, pH8.5に溶出させる。第2鎖の合成は、全量60ul中の40mM Tris-HCl（pH7.5）、20mM MgCl2、50mM NaCl、0.2dNTP'sおよび1.6uMの上方の第2鎖プライマーに第1鎖のDNAを添加することからなる。プライマーを含まない混合物は、95℃に加熱され、次に、プライマーが添加される。反応は、95℃で4分間変性され、37℃に上昇され、6.5Uのシークエナーゼ（Sequenase）DNAポリメラーゼを添加する。次に、反応物を0.5〜1時間、37℃でインキュベートする。上述の通り、試料は、QiagenのQIAquickゲル抽出キット（カタログ番号28704）を用いて再度精製し、PCR増幅に供される。反応バッファーは、10mM KCl、10mM (NH4)2SO4、20mM Tris-HCl（pH8.8）、2mM MgSO4、0.1% Triton X-100、0.2mM dNTP's、20% Q溶液（Stratagene, カリフォルニア州ラ・ホーヤ）、2% DMSO、2U VentまたはVent-exo（-）DNA ポリメラーゼ（New England Biolabs, マサチューセッツ州ベヴァリー）、およびそのうち1つは蛍光プローブによって標識した10uMの適切なプライマーからなる。プライマーおよび酵素を含まない試料を95℃で1分間変性させる。次に、PCRプライマーを添加し、さらに4分間変性を続ける。増幅は95℃で30秒間、62℃で30秒間、および72℃で1分間を45サイクル行った。Ventポリメラーゼは、最初の72℃での伸長サイクルで成長中に添加される。44サイクルの増幅後、または増幅サイクルの間中に、アリコート（3〜5ul）を取り出し、即座にホルムアミドと混合し、反応を停止させる。試料は、上述されるようにキャピラリー電気泳動によって分析した。
実施例3：微生物のPCR増幅およびリアルタイム検出
A. 遺伝子特異的プライマーを用いた微生物RNAの1工程RT-PCR検出
簡潔に言えば、全量50または100ul中に、0.25uMの各RTプライマー（任意で）、0.25uMの微生物特異的PCRプライマー（5'末端でFAMで標識した微生物特異的な対の1つのプライマー）、修飾した1× Stratagene RT-PCRバッファー（Brilliant Single Q-RT-PCRキット、カタログ番号600532）、0.1%のTriton X100、0.2mMのdNTP、1.5mMのMgCl2、および1.25UのStrataScript RTase（Stratagene, カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を含有する反応混合物にRNA試料（1〜5ul）を添加し、鉱油を重ねる。逆転写は、45℃で50分間実行し、続いて、RTaseを失活させるために、94℃で2分間インキュベートする。次に、試料は、94℃で30秒間、60℃で30秒、72℃で1分間の44サイクルからなるプロトコールを用いて、PCR増幅させる。最初の72℃の伸長で成長中に、1Uの熱安定性DNAポリメラーゼ（Vent exo（-）（New England Biolabs））を添加する。複数のチューブに同時にDNAポリメラーゼを添加するために、新しいチューブキャップにポリメラーゼを事前に分注し、PCRチューブを覆うキャップをDNAポリメラーゼを含有するキャップと置き換える。PCR増幅の20サイクル後、24サイクルの伸長期間の終わりに3ulのアリコートを連続して回収する。アリコートは、反応を停止させるために、即座にホルムアミドと混合される。試料は、後述されるキャピラリー電気泳動によって分析される。
反応成分の失敗により増幅産物が存在しないことはないことを確かめるために、10〜1000コピー/反応の対照RNA鋳型、および対照鋳型のためのプライマー対（0.25uM）をRT-PCR前に反応混合物に添加する。微生物に特異的な増幅産物がない状態で、増幅した対照鋳型の存在は、特定の微生物の非存在を示すものとして考えられた。
キャピラリー電気泳動による試料の分離
3ulの試料は、適切に蛍光標識したDNAサイズ標準（Bio Ventures, テネシー州マーフリーズバラ）を含有する7ulのホルムアミドに添加される。試料を熱変性し、回転させ、3100 Genetic Analyzerキャピラリー電気泳動機器（ABI, カリフォルニア州フォスターシティー）に装填する。試料を20秒間、3kVで注入し、次に、POP4ポリマー（ABI, カリフォルニア州フォスターシティー）上、15kVで分離する。データは、その機器と共に提供されるGene Scan v3.7.1ソフトウェアによって、ピークおよび相対面積について分析される。
データ分析：標的微生物に特異的なアンプリコンに対応する相対的なピーク面積は、マイクロソフト・エクセルでPCRサイクル数の対数関数としてプロットされる。各曲線の直線部分は、任意の閾値（例えば、1000相対蛍光単位）に外挿され、閾値サイクル（Ct）数を算出する。反応物中の微生物の公知のコピー数に対するCt値を用いて、較正曲線を作成する。
B. タグを付した遺伝子特異的プライマーを用いた微生物RNAの2工程RT-PCR検出
逆転写に関して、試料RNAおよびRT特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、10％グリセロールに添加され、70℃で10分間加熱され、次に、氷上に2分間置かれる。バッファー（最終濃度：50mM Tris-HCl、pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、0.01M DTT、0.8mM dNTP、0.2mg/mｌ BSA、20%トレハロース）、160UのSuperscript II RNase H-逆転写酵素（SSRTII；Invitrogen, カリフォルニア州カールズバッド）、および32UのRNAsin（Ambion, テキサス州オースティン）を全量40ulに対して添加される。逆転写は、45℃で20分間進められ、次に、75℃で変性工程を行う。48℃、30分間の逆転写の第2ラウンドは、50U SSRTIIの添加と共に開始する。試料は、80℃、2分間で別の変性工程を受け、次に、50U SSRTIIの添加と共に52℃、30分間で逆転写の別のラウンドを行う。試料を0.04M NaOH（最終濃度）でアルカリ処理し、65℃で15分間インキュベートし、その後、最終濃度の0.07M Tris、pH7.5を添加し、次に、試料を5分間、室温でインキュベートする。次いで、試料をQIAquickゲル抽出キット（Qiagen, カタログ28704, カリフォルニア州ヴァレンシア）を用いて、360ulのQGバッファーを各RT試料に添加し、抽出前のpHに調整することを除いて、製造業者の取扱説明書によって洗浄する。試料を50ulの10mM Tris、pH8.5に溶出させる。第2鎖の合成は、全量60ul中の40mM Tris-HCl（pH7.5）、20mM MgCl2、50mM NaCl、0.2dNTP'sおよび1.6uMの上方の第2鎖プライマーに第1鎖のDNAを添加することからなる。プライマーを含まない混合物は、95℃に加熱され、次に、プライマーが添加される。反応は、95℃で4分間変性され、37℃に上昇され、6.5UのシークエナーゼDNAポリメラーゼを添加する。次に、反応物を1時間、37℃でインキュベートする。上述の通り、試料は、QiagenのQIAquickゲル抽出キット（カタログ番号28704）を用いて再度精製される。PCR増幅は、全量100ulで行われ、実験中に蒸発を防ぐため、DNaseを含まない鉱油を反応物に重ねる。反応バッファーは、10mM KCl、10mM (NH4)2SO4、20mM Tris-HCl（pH8.8）、2mM MgSO4、0.1% Triton X-100、0.2mM dNTP's、20% Q溶液（Stratagene, カリフォルニア州ラ・ホーヤ）、2% DMSO、2U Vent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs, マサチューセッツ州ベヴァリー）、およびそのうち1つは蛍光プローブによって標識される10uMの適切なプライマーからなる。プライマーおよび酵素を含まない試料を95℃で1時間変性させる。次に、PCRプライマーを添加し、さらに4分間変性を続ける。増幅は95℃で30秒間、62℃で30秒間、および72℃で1分間の変動数のサイクル（実験に依存する）からなる。最初の72℃での伸長サイクルで成長中に、Ventポリメラーゼが添加される。24の連続サイクルの間、3ulのアリコートを採取し、適切な標準を含有する7ulのホルムアミドに即座に添加される（上記を参照されたい）。
実施例4：蛍光標識したdNTPによるPCR増幅を用いた微生物のエンドポイント検出およびキャピラリー電気泳動による標識DNA断片の分離
微生物RNAの5000コピーを含有する血漿RNA抽出物は、0.1％Triton X-100、1.5mMのMgCl2、および1.25UのStrataScript RTase（Stratagene, カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を含有する50uLのBrilliant Single-Step Quantitative RT-PCRコア試薬バッファー（Stratagene, カタログ番号600532）中の未標識の微生物特異的プライマー（0.25uM）およびdNTP（各々100uMのdATP、dCTP、dGTPおよび65uM dTTP）と混合され、45℃で50分間逆転写される。反応は、94℃で2分間加熱することによって終了させる。RTの完了に応じて、1UのVent（Exo-）DNAポリメラーゼ（NE Biolabs, カタログ番号M0257S）および350uMフルオレセイン-12-2'-デオキシ-ウリジン-5'-三リン酸（Roche, カタログ番号1 373 242から入手される）をこの混合物に添加する。PCR増幅は、94℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で30秒間の40サイクルを行う。3ulのアリコートをPCR増幅の最終に採取し、上述したように、キャピラリー電気泳動によって分析する。
実施例5：蛍光標識したdNTPを用いたリアルタイムPCR増幅およびキャピラリー電気泳動による標識したDNA断片の分離
血漿RNA抽出物AREの連続希釈した微生物RNAは、0.1％Triton X-100、1.5mMのMgCl2、および1.25UのStrataScript RTase（Stratagene, カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を含有する50uLのBrilliant Single-Step Quantitative RT-PCRコア試薬バッファー（Stratagene, カタログ番号600532）中の未標識の微生物特異的プライマー（0.25uM）およびdNTP（各々100uMのdATP、dCTP、dGTPおよび65uMのdTTP）と混合され、45℃で50分間逆転写される。反応は、94℃で2分間加熱することによって終了させる。RTの完了に応じて、1UのVent（Exo-）DNAポリメラーゼ（NE Biolabs, カタログ番号M0257S）および350uMフルオレセイン-12-2'-デオキシ-ウリジン-5'-三リン酸（Roche, カタログ番号1 373 242から入手される）をこの混合物に添加する。PCR増幅は、94℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で30秒間の40〜45サイクルを行う。3ulのアリコートは、サイクル24から始まる各PCRサイクルの終りで採取され、上述したように、キャピラリー電気泳動によって分析される。微生物に特異的なアンプリコンに対応する相対的なピーク面積は、マイクロソフト・エクセルでPCRサイクル数の対数関数としてプロットされる。各曲線の直線部分は、任意の閾値（例えば、1000相対蛍光単位）に外挿され、閾値サイクル（Ct）数を算出する。反応物中の微生物の公知のコピー数に対するCt値を用いて、較正曲線を作成する。
あるいは、検出実験に関して、各試料は、適切なスパイクされていない対照RNAの出発濃度から連続的に10倍希釈し、1工程RT-PCRプロトコールで用いる。精製した微生物RNAを用いる実験については、希釈は、20ng/ulの大腸菌tRNAで行う。簡潔に言えば、全量50または100ul中に、RNA鋳型および0.25uMの各RTプライマーは、修飾した1× Stratageneバッファー（カタログ番号600532）、0.1%のTriton X100、0.2mMのdNTP、1.5mMのMgCl2、および1.25UのStrataScript RTase（Stratagene, カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を含有する反応混合物に添加され、45℃で50分間逆転写し、続いて、RTaseを失活させるために、94℃で2分間行う。次に、試料は、94℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で1分間の44サイクルからなるプロトコールを用いて、PCR増幅させる。最初の72℃の伸長で成長中に、1Uの熱安定性DNAポリメラーゼを添加する。20サイクル後、24サイクルの伸長期間の終わりに3ulのアリコートを続けて回収する。アリコートは、反応を停止させるために、即座に変性剤と混合される。試料は、上述されるキャピラリー電気泳動によって分析される。
実施例6：試料中の病原体を検出するための6重ウイルスアッセイ
ヒトの全血をEDTA回収チューブに回収し、回収して24時間以内に標準的な方法を用いて血漿を調製した。Corbett Xtractorを用いてDNAを抽出し、75uLの溶出バッファーに溶出した。一度処理されると、試料は同日にスクリーニングされた。10マイクロリットルの抽出DNAを各反応において試験した。反応は二連で行った。
各反応混合物は、下記：1× Qiagen Multiplexバッファー、10％ベタイン、各標的に対する0.05〜0.400uMの濃度のプライマー、および100コピー/反応の各ウイルス標的のための感度調節プラスミドを含有した。蒸発を防ぐために各反応混合物に鉱油を重ねた。鋳型を含まない対照を各反応実行に含めた。全16反応を同時に行った。
反応物をPCRクリーンルームに集め、DNA抽出試料を各反応に添加する鋳型領域に移した。次に、反応物をディスペンシング・サーモサイクラー（dispensing thermocycler）に移し、下記のプロトコールを用いてPCR増幅した：
a. 1サイクル： 95℃、15分間（酵素活性化）
b. 3サイクル： 95℃/30秒間 62℃/90秒間 72℃/1分間
c. 3サイクル： 95℃/30秒間 60℃/90秒間 72℃/1分間
d. 3サイクル： 95℃/30秒間 58℃/90秒間 72℃/1分間
e. 31サイクル： 95℃/30秒間 57℃/90秒間 72℃/1分間。
8試料の各セットに対して2つの96ウェル回収プレートを用意し、最後から2番目の72℃の伸長中に各反応から2uLのアリコートを回収した。0.3uLのROX標識したMapMarker 1000 DNA標準（Bioventures）を含有するホルムアミドの8マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに分配し、ディスペンシング・サーモサイクラーの回収領域に設置した。
2マイクロリットルのアリコートは、サイクル18で開始し、サイクル40を通じて連続する、最後から2番目の72℃の伸長期の各反応から取り出し、回収プレートに移した。
PCR増幅の終わりで、回収プレートを熱シールし、遠心分離し、断片分析のために、ABI 3730XL（Applied Biosystems, カリフォルニア州フォスターシティー）ジェネティック・アナライザー上で実行した（図2）。得られたデータは、相対的蛍光単位（ピーク面積のlog）を決定するために処理し、logスケール対サイクル数でプロットした（図3）。各ウイルス標的に対する閾値サイクルは、各特定のアンプリコンのピーク面積のlog対サイクル数をプロットし、Gene Mapperデータ解析ソフトウェア（Applied Biosystems, カリフォルニア州フォスターシティー）によって計算された35000蛍光単位に対応するサイクル数の値を選択することによって計算した（図4）。各特定の標的に対するウイルス量（viral load）の関数として、閾値サイクル（Ct）を決定するための較正プロットは、所定量のウイルスDNAのCtを測定することによって作成された。
臨床試料中のウイルス量は、この特定のウイルス標的に関して測定した閾値サイクルに対応するウイルス量の値を選択することによって、各ウイルス標的に関する特定の較正を用いて決定することができる。CMV、EBV、BK、HHV6、HHV7、JCV、およびヒトのミトコンドリアDNAの検出の標的特異的オリゴヌクレオチドは、表5に提供される。
このアッセイは、CMV、EBV、BK、HHV6、HHV7、およびJCVの存在を定量的に検出した。またヒトのミトコンドリア配列は、臨床試料からの成功したDNA抽出を確認するための品質基準としてアッセイにおいて検出された（ミトコンドリアアンプリコンに対する測定した閾値サイクルが23〜27サイクルの範囲であるとき、試料調製が成功したと考えられた）。
他の態様
前述の態様は、本発明の作製および実施において、本発明によって実行された実施例および意図された技術を示す。これらの態様には、本発明の実施の技術を理解し、その実用性を示すために役立つ技術の開示が含まれると考えられる。本明細書において開示される技術および態様は、一般に、多数の同等な方法および技術が同じ結果を達成するために採用されてもよいというだけの好ましい態様であることは、当業者によって理解される。
他に特定されなければ、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって、通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されているものと同じであるかまたは同等である方法および材料は、本発明の実施または試験に用いることができるが、適切な方法および材料は後述される。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、全体として参照により組み入れられる。論争の場合には、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみであって、限定することを意図しない。
本明細書において記載される方法によって包含される代表的なウイルスに関するGenbankアクセッション番号の図表を示す。 6つのウイルス性病原体を同時に検出するためのアッセイに関する電気泳動図の典型例である。指定されたウイルスCMV（サイトメガロウイスル）、BK（BKウイルス、ヒトポリオーマウイルス）、JC（JCウイルス、ヒトポリオーマウイルス）、HHV6（ヒトヘルペスウイルス6）、HHV7（ヒトヘルペスウイルス7）、およびEBV（エプスタイン・バー・ウイルス）に対応する増幅したDNA断片（即ち、アンプリコン）は、ABI3730ジェネティック・アナライザーシステム（Genetic Analyzer System）を用いて、36cmキャピラリーアレイ上で分離した。 図2と同じ6つのウイルス性病原体を検出するためのアッセイに関する増幅プロットの典型例である。示されたコピー数の各ウイルスは、リアルタイム分析を可能にする蛍光標識したプライマーを含有する反応混合物に導入した。示されたサイクルの終りに増幅混合物の一部を取り出し、キャピラリー電気泳動によって分離した（resolved）。相対蛍光ユニット（ピーク面積のlog）は、logスケール対サイクル数上でプロットする。 各ウイルス標的の所与のコピー数を検出するためのサイクル閾値（Ct）を示す一連の較正プロットの典型例を示す。閾値サイクル数は、Gene Mapperデータ分析ソフトウェア（Applied Biosystems, Foster City, CA）によって計算される35000蛍光ユニットに対応したサイクル数として定義された。 列挙された標的に対する標的特異的オリゴヌクレオチドの表である。

Claims (89)

  1. 以下の工程を含む、複数の所定の病原体のいずれかを含むことが疑われる試料を分析して病原体特異的標的を検出する方法であって、選択された既知の長さの一つまたは複数のアンプリコンの検出が、アンプリコンに対応する病原体特異的標的を含む試料を示す、方法：
    a）複数の所定の病原体の各病原体に対応する病原体特異的プライマー対を選択する工程であって、該病原体特異的プライマー対は、対応する病原体の核酸の病原体特異的標的からの、選択された既知の長さのポリヌクレオチドアンプリコンの増幅を媒介することができる、工程；
    b）ポリヌクレオチドアンプリコンの増幅を促進する条件下、増幅工程の反応混合物において、複数の所定の病原体のいずれかを含むことが疑われる試料に由来する核酸と複数の病原体特異的プライマー対とを接触させる工程；
    c）増幅工程中に、一つまたは複数の間隔で反応混合物のアリコートを取り出す工程；
    d）各アリコート中のアンプリコンを分離する工程；および
    e）各アリコート中のアンプリコンを検出する工程。
  2. 検出されたアンプリコンを定量化する工程、および検出されたアンプリコンの量と試料中に存在する病原体の量とを相関させる工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
  3. 増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅を含む、請求項1または2記載の方法。
  4. 試料由来の核酸が、増幅工程前に逆転写（RT）に供される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
  5. 工程（c）のアンプリコンが、キャピラリー電気泳動により分離される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
  6. 一つまたは複数の病原体特異的プライマーが、検出可能な標識を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
  7. アンプリコンが、検出可能な標識を含む核酸結合色素によって検出される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
  8. 検出可能な標識が、蛍光標識、放射性標識、比色標識、磁気標識、および酵素標識からなる群より選択される、請求項6または7記載の方法。
  9. 検出可能な標識が蛍光標識である、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
  10. 反応混合物のアリコート中の検出可能な標識の量を定量化することによって、試料中の病原体の量を定量化する工程をさらに含む、請求項6〜9のいずれか一項記載の方法。
  11. 病原体が、ウイルス、細菌、原生動物、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
  12. 複数の特異的病原体の標的が、HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、C型肝炎、B型肝炎、アデノウイルス、EEEV、WNE、JCV、およびBKVからなる群より選択される特異的ウイルス標的を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
  13. 試料中の少なくとも2つの病原体を検出することができる、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
  14. 試料中の少なくとも3つの病原体を検出することができる、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
  15. 試料中の少なくとも4つの病原体を検出することができる、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
  16. 試料中の少なくとも5つの病原体を検出することができる、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
  17. 試料中の少なくとも6つの病原体を検出することができる、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
  18. 試料中の少なくとも8つの病原体を検出することができる、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
  19. 全ての病原体特異的プライマー対が、少なくとも1つの共通したセットの反応条件下でポリヌクレオチドの増幅を促進することができる、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
  20. 試料が病原体宿主試料である、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
  21. 宿主が哺乳動物である、請求項20記載の方法。
  22. 宿主がヒトである、請求項20または21記載の方法。
  23. 宿主が免疫無防備状態のヒトである、請求項20〜22のいずれか一項記載の方法。
  24. 免疫無防備状態の個体が、移植を受けたことがある、請求項23記載の方法。
  25. 免疫無防備状態の個体が、癌の治療のために化学療法を受けたことがある、請求項23記載の方法。
  26. 免疫抑制治療の経過をモニターするために用いられる、請求項23〜25のいずれか一項記載の方法。
  27. 宿主が、病原体感染に無症候性のヒトである、請求項22〜26のいずれか一項記載の方法。
  28. 宿主の核酸の増幅を含む、請求項20〜27のいずれか一項記載の方法。
  29. 対照核酸分子由来のアンプリコンの増幅によって、試料に由来しない対照核酸分子の存在も検出する、請求項1〜28のいずれか一項記載の方法。
  30. 対照核酸分子が競合核酸分子である、請求項29記載の方法。
  31. 複数の別個の対照核酸分子が検出される、請求項29または30記載の方法。
  32. 対照オリゴヌクレオチドが、既知濃度で反応物中に存在する、請求項29〜31のいずれか一項記載の方法。
  33. 別個の対照オリゴヌクレオチドが、異なった濃度で反応物中に存在する、請求項31記載の方法。
  34. 対照オリゴヌクレオチドによって増幅されるアンプリコンが、病原体特異的プライマー対を用いて増幅される、請求項29〜33のいずれか一項記載の方法。
  35. 対照核酸が、病原体特異的標的核酸と同じ効率で増幅される、請求項29〜33のいずれか一項記載の方法。
  36. 対照核酸分子がDNAおよび/またはRNAである、請求項29〜35のいずれか一項記載の方法。
  37. 病原体特異的プライマーが、病原体の核酸と対照核酸分子とを同じ効率で増幅する、請求項29〜36のいずれか一項記載の方法。
  38. 以下の工程を含む、試料中の複数の所定の病原体を検出および定量化するための方法：
    a）複数の病原体の少なくとも1つを含むことが疑われる試料を得る工程であって、各病原体が、病原体特異的ポリヌクレオチドを含む、工程；
    b）試料から核酸を単離する工程；
    c）複数の病原体特異的ポリヌクレオチドの各々を標的とする病原体特異的プライマー対を選択する工程であって、該プライマー対は、複数の病原体特異的核酸の他のメンバーの各々を標的とする他の病原体特異的プライマー対の各々によって生成されるアンプリコンとは区別される長さのアンプリコンの増幅を媒介することができる、工程；
    d）少なくとも1つの競合ポリヌクレオチドを選択する工程であって、該競合ポリヌクレオチドは、1つの病原体特異的プライマー対によるアンプリコンの増幅を媒介するための鋳型として作用することができ、生成される該アンプリコンは、複数の病原体特異的核酸の他のメンバーの各々を標的とする他の病原体特異的プライマー対の各々および他の競合ポリヌクレオチドの各々によって生成されるアンプリコンとは区別される長さのものである、工程；
    e）所定量の少なくとも1つの競合ポリヌクレオチドを、試料から単離した核酸に添加して試験混合物を作製する工程；
    f）アンプリコンの増幅を促進する条件下、反応混合物において、試験混合物と複数の病原体特異的プライマー対とを接触させる工程；
    g）工程（f）で生じたアンプリコンを分離する工程；
    h）工程（f）で生じた各アンプリコンの長さを検出する工程；
    i）検出された各アンプリコンの長さと、反応混合物中に存在する病原体または競合ポリヌクレオチドとを相関させる工程；
    j）工程（f）で生じた各アンプリコンの量を定量化する工程；および
    k）試験混合物に添加した所定量の競合ポリヌクレオチドに基づいて、試料中に存在する病原体の量を決定する工程。
  39. 工程（f）の反応混合物のアリコートが、増幅工程中に一つまたは複数の間隔で取り出され、工程（g）から（k）がアリコートにて行われる、請求項38記載の方法。
  40. 試料中に存在する病原体の量が検出可能ではない、請求項38および39の方法。
  41. 工程（f）の増幅が1回の反応で行われる、請求項38〜40のいずれか一項記載の方法。
  42. 工程（g）の分離（resolving）がキャピラリー電気泳動によって行われる、請求項38〜41のいずれか一項記載の方法。
  43. 一つまたは複数の病原体特異的プライマーが、検出可能な標識を含む、請求項38〜42のいずれか一項記載の方法。
  44. アンプリコンが、検出可能な標識を含む核酸結合色素によって検出される、請求項38〜43のいずれか一項記載の方法。
  45. 検出可能な標識が、蛍光標識、放射性標識、比色標識、磁気標識、および酵素標識からなる群より選択される、請求項43または44記載の方法。
  46. 検出可能な標識が蛍光標識である、請求項43〜45のいずれか一項記載の方法。
  47. 反応混合物のアリコート中の検出可能な標識の量を定量化することによって、試料中の病原体の量を定量化する工程をさらに含む、請求項43〜47のいずれか一項記載の方法。
  48. 病原体が、ウイルス、細菌、原生動物、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項38〜47のいずれか一項記載の方法。
  49. 複数の特異的病原体の標的が、HSV1、HSV2、EBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、VZV、C型肝炎、B型肝炎、アデノウイルス、EEEV、WNE、JCV、およびBKVからなる群より選択される特異的ウイルス標的を含む、請求項38〜48のいずれか一項記載の方法。
  50. 試料中の少なくとも2つの病原体を検出することができる、請求項38〜49のいずれか一項記載の方法。
  51. 試料中の少なくとも3つの病原体を検出することができる、請求項38〜50のいずれか一項記載の方法。
  52. 試料中の少なくとも4つの病原体を検出することができる、請求項38〜50のいずれか一項記載の方法。
  53. 試料中の少なくとも5つの病原体を検出することができる、請求項38〜50のいずれか一項記載の方法。
  54. 試料中の少なくとも6つの病原体を検出することができる、請求項38〜50のいずれか一項記載の方法。
  55. 試料中の少なくとも8つの病原体を検出することができる、請求項38〜50のいずれか一項記載の方法。
  56. 全ての病原体特異的プライマー対が、少なくとも1つの共通したセットの反応条件下でポリヌクレオチドの増幅を促進することができる、請求項38〜55のいずれか一項記載の方法。
  57. 試料が病原体宿主試料である、請求項38〜56のいずれか一項記載の方法。
  58. 宿主が哺乳動物である、請求項57記載の方法。
  59. 宿主がヒトである、請求項57または58記載の方法。
  60. 宿主が免疫無防備状態のヒトである、請求項57〜59のいずれか一項記載の方法。
  61. 免疫無防備状態の個体が、移植を受けたことがある、請求項60記載の方法。
  62. 免疫無防備状態の個体が、癌の治療のために化学療法を受けたことがある、請求項60記載の方法。
  63. 免疫抑制治療の経過をモニターするために用いられる、請求項60〜62のいずれか一項記載の方法。
  64. 宿主が、病原体感染に無症候性のヒトである、請求項59〜63のいずれか一項記載の方法。
  65. 宿主の核酸の増幅を含む、請求項57〜64のいずれか一項記載の方法。
  66. 競合ポリヌクレオチドが、病原体特異的標的核酸と同じ効率で増幅される、請求項38〜65のいずれか一項記載の方法。
  67. 競合ポリヌクレオチドがDNAおよび/またはRNAである、請求項38〜66のいずれか一項記載の方法。
  68. 試料由来の核酸がDNAおよび/またはRNAである、請求項38〜67のいずれか一項記載の方法。
  69. DNAおよびRNAが試料から別々に単離される、請求項68記載の方法。
  70. 試料由来の複数の所定の病原体の少なくとも2つの定量化が、1回の反応に組み合わせられる、請求項38〜69のいずれか一項記載の方法。
  71. 試料由来の複数の所定の病原体の少なくとも3つの定量化が、1回の反応に組み合わせられる、請求項38〜70のいずれか一項記載の方法。
  72. 試料が血液である、請求項38〜71のいずれか一項記載の方法。
  73. 免疫抑制治療の経過をモニターするために用いられる、請求項60〜72のいずれか一項記載の方法。
  74. 以下の工程を含む、所定の病原体による感染によって引き起こされる疾患の発症について被験体をモニターする方法：
    被験体から試料を得る工程；
    少なくとも1つの所定の病原体を示す5つ以上の病原体特異的マーカーを定量化する工程；
    試料中の少なくとも1つの所定の病原体の量を算出する工程であって、該量は、試料の容量または重量当りの病原体のコピー数によって表される、工程。
  75. 存在する病原体の量が検出可能ではない、請求項74記載の方法。
  76. 試料中に存在する病原体の量がない、請求項74または75記載の方法。
  77. 被験体が免疫無防備状態の患者である、請求項74〜76のいずれか一項記載の方法。
  78. 被験体が無症候性患者である、請求項74〜77のいずれか一項記載の方法。
  79. 少なくとも1つの所定の病原体の算出された量である、請求項74〜78のいずれか一項記載の方法。
  80. 試料中の少なくとも1つの病原体の量が、免疫無防備状態の患者に対する治療計画を決定するのに用いられる、請求項74〜79のいずれか一項記載の方法。
  81. 患者が、移植体または移植片の受容者であり、免疫抑制療法を受けている、請求項74〜81のいずれか一項記載の方法。
  82. 免疫抑制剤が、免疫無防備状態の患者に投与されたことがあるか、または免疫無防備状態の患者が、現在、免疫抑制剤を受けている、請求項74〜80のいずれか一項記載の方法。
  83. 試料中の関心対象の一つまたは複数の病原体の量が、免疫抑制治療計画の変更を決定する因子である、請求項81または82記載の方法。
  84. 試料中の1つより多い病原体の量が、1回の反応で決定される、請求項74〜83のいずれか一項記載の方法。
  85. 試料中の1つより多い病原体の量が、多重アッセイで決定される、請求項74〜83のいずれか一項記載の方法。
  86. 試料が、血液、唾液、または尿である、請求項74〜85のいずれか一項記載の方法。
  87. 複数の病原体の量が、標的の病原体特異的核酸の増幅を通じて決定される、請求項74〜86のいずれか一項記載の方法。
  88. モニター法が、感染疾患の出現または進行をモニターするための規則的なスケジュールで行われる、請求項74〜87のいずれか一項記載の方法。
  89. 規則的なスケジュールが、月に約1回である、請求項88記載の方法。
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