CN102183644A

CN102183644A - 羊痘抗体间接elisa诊断试剂盒及制备方法

Info

Publication number: CN102183644A
Application number: CN2011100252884A
Authority: CN
Inventors: 才学鹏; 刘振勇; 朱学亮; 骆学农; 窦永喜; 李辉
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2011-02-06
Filing date: 2011-02-06
Publication date: 2011-09-14

Abstract

本发明公开一种能检测羊痘病毒的特异性抗体，可用于羊痘野毒感染的诊断和羊痘弱毒疫苗免疫后的抗体监测的ELISA诊断试剂盒。本发明的羊痘抗体间接ELISA诊断试剂盒，其中有包被抗原的ELISA抗体检测板和酶标二抗，抗体检测板上包被的抗原为羊痘病毒ORF122S重组蛋白，所用的二抗为兔抗山羊酶标二抗。本发明还公开了制备ORF122S重组蛋白的方法，即利用山羊痘病毒弱毒疫苗株基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经酶切后构建原核表达载体pET122S，再进行诱导表达。

Description

羊痘抗体间接ELISA诊断试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及一种诊断试剂盒，确切讲是一种能检测羊痘病毒的特异性抗体，可用于羊痘野毒感染的诊断和羊痘弱毒疫苗免疫后的抗体监测的ELISA诊断试剂盒，试剂盒中有包被抗原的ELISA抗体检测板和酶标二抗，也可以包括其它的相关试剂。

背景技术

羊痘(Capripox)是由绵羊痘病毒或山羊痘病毒引起的绵羊或山羊的一种急性、热性、接触性传染病，主要特征是发热、皮肤黏膜发生丘疹和疱疹、流产和内脏的组织病变，具有传播快，感染性高，死亡率较高等特点，尤其是感染山羊痘的羔羊，死亡率通常高达100％。目前，我国是世界上养羊最多的国家，山羊的存栏量为1.9亿只，绵羊的存栏量为1.7亿只，羊痘的发生往往造成巨大的经济损失，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类重大传染病，我国也将其列为I类动物疾病，严重影响国际贸易和养羊业及毛皮加工业的发展。

根据临床症状并结合病理变化和流行病学分析可诊断典型的羊痘，然而对于隐形感染的羊或非典型的病例则缺乏有效的诊断方法，其确诊必须进行实验室诊断。目前羊痘的诊断方法较多：如病毒粒子的电镜观察、病毒中和试验、间接荧光抗体实验和Western印迹试验等，参见OIE Terrestrial Manual 2010.CHAPTER 2.7.14，SHEEP POX AND GOAT POX：1-12，但这些方法都存在操作繁琐、价格昂贵、灵敏性和特异性不高等缺点。酶联免疫吸附试验(ELISA)因其操作方便、快速、敏感、特异性强等优点现已被广泛应用于许多病原的抗原或抗体的检测。P32是羊痘病毒主要的抗原基因，也是羊痘病毒血清学诊断研究的热点。1999年Heine利用体外表达的羊痘病毒P32蛋白作为包被抗原，首次进行ELISA抗体检测并取得成功，参见Heine H G，et al.A capripoxvirus detection PCR and antibody ELISA based on the major antigen P32 the homolog of the vaccinia virus H3L gene.Journal of Immunological Methods，1999，227：187-196。然而P32蛋白制备难度很大，筛选能稳定而大量表达的免疫原性强的抗原基因是建立羊痘可靠ELISA诊断方法的关键。

羊痘的预防主要依靠疫苗的免疫接种，灭活疫苗具有安全、无毒的特点，但灭活苗的免疫效果较差，弱毒疫苗则具有良好的免疫效果。山羊痘弱毒活疫苗可同时用于山羊痘和绵羊痘的预防，疫苗注射后能快速产生免疫应答，接种4-5天后即可产生免疫力，免疫持续期长，接种后可维持12个月，有的羊甚至产生终身免疫。山羊痘弱毒冻干疫苗在-15℃以下避光保存有效期为2年，一般采用尾内侧或股内侧皮内接种，此接种方法产生免疫力快，免疫效果确实可靠。虽然弱毒疫苗免疫效果稳定可靠，但由于皮内接种操作困难，基层防疫人员往往容易注入皮下或肌肉，造成免疫效果不确实或免疫失败，因此，急需一种能快速、有效的检测和评价疫苗免疫后抗体水平的血清学诊断技术。目前世界上还没有一种稳定而可靠的羊痘血清学诊断方法，这也是当前羊痘防制最急需解决的问题，建立快速而有效的羊痘诊断方法，对于羊痘的防治和根除具有非常重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种新型羊痘抗体间接ELISA诊断试剂盒，该试剂盒能特异性检测出羊痘病毒的抗体，可用于羊痘野毒感染后的抗体检测和羊痘弱毒疫苗免疫后的抗体监测。本发明同时提供该试剂盒的制备方法与使用方法。

本发明的羊痘抗体间接ELISA诊断试剂盒，其中有包被抗原的ELISA抗体检测板和酶标二抗，抗体检测板上包被的抗原为羊痘病毒ORF122S重组蛋白，所用的二抗为兔抗山羊酶标二抗。

本发明的羊痘抗体间接ELISA诊断试剂盒中每孔ORF122S重组蛋白的包被量为0.5ug；酶标二抗工作液为经1×blocking buffer稀释4万倍的兔抗山羊酶标二抗。

为方便使用，在本发明的羊痘抗体间接ELISA诊断试剂盒中还可以包括其它的相关试剂，如在试剂盒中包括有洗涤液、显色液、终止液等。

本发明的羊痘抗体间接ELISA诊断试剂盒中所用的羊痘病毒ORF122S重组蛋白的制备方法是：以山羊痘病毒弱毒疫苗株基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经酶切后与pET30a(+)表达载体连接，构建原核表达载体pET122S，将阳性重组菌接种于含卡那霉素的LB培养基中进行IPTG诱导表达，收集大量表达的重组宿主菌并超声裂解，用8M尿素溶解包涵体并用滤膜过滤，经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化得到目的蛋白，用于扩增ORF122S基因的特异性引物如下：

上游引物：ACCGAATTCAATACATGTTTAAATCAAT；

下游引物：ACCAAGCTTTACACAGTAATAGCTTCTCAT。

本发明中所用的包被抗原为山羊痘病毒ORF122S重组蛋白，ORF122S是羊痘病毒ORF122基因中的一段抗原性和亲水性都很强的靶序列，其基因序列见基因序列表中的SEQ ID 3。ORF122基因编码羊痘病毒胞外包膜病毒粒子(EEV)的一种表面糖蛋白，目前对于这种糖蛋白的功能研究还很少，主要集中在羊痘新型基因工程疫苗方面的研究(参见Min Zheng.Immunogenicity and protective efficacy of Semliki forest virus replicon-based DNA vaccines encoding goatpox virus structural proteins.Virology，Volume 391，Issue1，15 August 2009，Pages 33-43)。经本发明试验证明，由原核表达系统表达的重组ORF122S蛋白所建立的间接ELISA检测方法，能通过抗体检测特异性诊断羊痘病毒感染。该试剂盒既可用于羊痘野毒感染后的血清学诊断，又可进行羊痘弱毒疫苗免疫后的抗体监测和免疫效果评价，具有很强的实用性和推广性，有着非常广阔的市场前景。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明所采用的ORF122S重组蛋白便于大量制备和纯化，ORF122S基因在pET原核表达系统中可得到稳定而高效的表达，携带组氨酸标记的重组蛋白易于纯化。

2、本发明的试剂盒特异性强，能有效地排除羊痘临床相似病例如口蹄疫、羊口疮和小反刍兽疫的干扰，特异性的检测羊痘抗体。

3、本发明的诊断试剂盒具有很强的实用性，既可用于羊痘野毒感染后的抗体检测或羊痘的诊断，也可用于羊痘弱毒疫苗免疫后的抗体监测，进行疫苗免疫效果的实时评价。

4、本发明的试剂盒结果判定方便、灵敏、准确、可靠，采用TMB底物进行显色，用酶标仪测定OD值，判定待检样品的检测结果；阴阳性结果差异明显，比OPD显色更加灵敏、可靠和稳定。

5、本发明的试剂盒操作简便快速，能在1.5h内完成样品检测，耗时短，成本低，非常适合大量动物血清样品的检测。

附图说明

图1为ORF122S基因的核酸电泳鉴定图，1和2泳道为ORF122S基因；M：DL2000。

图2ORF122S重组蛋白的表达和纯化产物的SDS-PAGE电泳鉴定图其中各泳道为：1、4：pET30空载体对照的IPTG诱导表达；2：纯化前的ORF122S重组蛋白产物；3：经Ni柱纯化的ORF122S重组蛋白；M：Protein Marker。

具体实施方式

以下为本发明的具体实施例：

1、山羊痘病毒ORF122S基因的克隆和原核表达载体的构建

参考GenBank中羊痘病毒基因组序列(AY077832)设计ORF122S基因片段的特异性引物，本发明所用的引物序列为：

上游引物：ACCGAATTCAATACATGTTTAAATCAAT，划线部分为EcoRI酶切位点；

下游引物：ACCAAGCTTTACACAGTAATAGCTTCTCAT，划线部分为Hind III酶切位点；

通过PCR扩增大小为357bp的ORF122S特异性目的基因，酶切后与pET30a(+)表达载体连接，构建原核表达载体pET122S，通过PCR、双酶切和测序鉴定表明，成功构建ORF122S基因原核表达载体，其电泳图见图1。

2、ORF122S重组蛋白的高效表达和纯化

将原核表达载体pET122S转化BL21(DE3)，挑取阳性重组菌接种于含卡那霉素的LB培养基中37℃振荡培养，当菌液OD600达到0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达。离心收集大量表达的宿主菌并超声裂解，用8M尿素溶解包涵体并用0.45的滤膜过滤，经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化重组蛋白，SDS-PAGE电泳鉴定表明，ORF122S重组蛋白大小约为20kD，其电泳图见图2。

3、ELISA检测方法的最佳抗原包被量和包被方法

ORF122S重组蛋白按每孔0.01ug、0.03ug、0.0625ug、0.125ug、0.25ug、0.5ug、1ug和2ug的包被浓度进行方阵试验，结果见表1，方阵试验表明抗原的最佳包被浓度是0.5ug/孔。

表1：

用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液，将纯化的ORF122S重组蛋白稀释成5ug/mL，按100uL/孔加入酶标板中，4℃包被过夜。用PBST洗板四次，每孔加入200uL 1×blocking buffer 37℃封闭1小时，用PBST洗板四次，室温晾干，装入干燥剂进行真空包装，置4℃保存。

4、122S标准阳性和阴性血清的制备

标准阳性血清的制备：挑选健康的未进行羊痘疫苗免疫的3月龄绵羊，尾根内侧或股内侧皮内注射山羊痘弱毒活疫苗0.5毫升，首免之后每隔2周采用相同方法进行一次加强免疫，在第四次免疫后的第5天进行颈静脉采血，分离血清(OD₄₅₀nm≥1.00)，加入万分之一的硫柳汞防腐，无菌过滤；阴性对照血清为经筛选获得的阴性羊血清(OD₄₅₀nm≤0.20)，加入万分之一的硫柳汞防腐，无菌过滤。

5、试剂盒检测操作程序

其检测程序为：1)将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；2)待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清均用抗体稀释液(1×blocking buffer)作1∶100倍稀释，按每孔100uL加入ELISA检测板中，37℃孵育40min，甩干；3)每孔加入200uL洗涤液，洗涤4次，每次1min，甩干；4)每孔加入100uL酶标二抗工作液，37℃孵育40min，甩干；5)每孔加入200uL洗涤液，洗涤4次，每次1min，甩干；6)每孔加入100uL TMB显色液，37℃避光孵育5min；7)每孔加入50uL终止液，用酶标仪在450nm波长下读取光吸收值(OD_450nm值)。

6、检测结果的判定标准

对120份4-7月龄大小的未进行羊痘弱毒疫苗免疫且没有羊痘感染史的阴性样品进行抗体检测，检测结果见表2。通过计算阴性平均值与标准差(X±3SD)得到该ELISA检测方法的cut-off值。通过计算的cut-off值定义待检样品的判定标准为：当待检样品OD₄₅₀≥0.25判定为阳性；OD₄₅₀≤0.20时样品判为阴性；当0.25＞OD₄₅₀＞0.20时判为可疑，此时样品需复检一次，若OD₄₅₀≥0.23判定为阳性，OD₄₅₀≤0.23则判为阴性。

表2：

0.167	0.121	0.214	0.163	0.113	0.079	0.128	0.143	0.110	0.092	0.182	0.119
												0.090	0.098	0.112	0.159	0.126	0.143	0.100	0.132	0.092	0.112	0.164	0.144
0.154	0.151	0.116	0.115	0.167	0.151	0.089	0.133	0.088	0.091	0.204	0.165
												0.221	0.102	0.105	0.115	0.116	0.174	0.214	0.108	0.128	0.095	0.145	0.138
0.147	0.135	0.177	0.181	0.139	0.104	0.174	0.148	0.115	0.119	0.133	0.087

0.157	0.171	0.161	0.177	0.121	0.204	0.123	0.108	0.113	0.114	0.199	0.189
												0.134	0.133	0.135	0.148	0.096	0.180	0.106	0.096	0.089	0.097	0.173	0.258
0.172	0.123	0.130	0.107	0.143	0.136	0.136	0.147	0.196	0.188	0.183	0.165
												0.100	0.123	0.145	0.116	0.153	0.107	0.217	0.150	0.122	0.146	0.171	0.186
0.145	0.111	0.109	0.140	0.108	0.125	0.135	0.146	0.137	0.165	0.127	0.192

7、特异性试验

(1)用30份羊口蹄疫，10份小反刍兽疫(弱毒疫苗免疫)和3份羊口疮阳性血清进行该诊断方法的特异性试验，结果检测样品OD₄₅₀的值均小于0.25。

(2)临床样品的检测：本发明曾对四个不同羊场的近600只种羊进行了抗体检测，这些羊场饲养规范，都制定并执行了有较为严格的免疫程序，每只羊在每年春季都接种了山羊痘弱毒疫苗。检测结果显示四个羊场的羊痘抗体阳性率分别为：95％、89％、87％和86％。

(3)临床发病羊的血清检测

对经临床症状及解剖鉴定为羊痘的10份病羊血清样品进行检验，检测数据见表3。

表3：

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
												1.943	2.693	2.799	1.489	2.827	2.451	0.682	1.693	2.231	2.165	0.167	1.547

(注：1-10为临床诊断为羊痘感染的血清样品；11为羊痘阴性对照样品；12为羊痘阳性对照血清)

以上试验表明，本发明的ELISA诊断方法特异性强，结果稳定可靠，可特异性地检测出羊痘抗体，完全适用于羊痘野毒感染后的诊断和羊痘弱毒疫苗免疫后的抗体监测。

Claims

1.羊痘抗体间接ELISA诊断试剂盒，其中有包被抗原的ELISA抗体检测板和酶标二抗，其特征在于抗体检测板上包被的抗原为羊痘病毒ORF122S重组蛋白，所用的二抗为兔抗山羊酶标二抗。

2.权利要求1所述的羊痘抗体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于ELISA抗体检测板中每个酶标孔中ORF122S重组蛋白的包被量为0.5ug；酶标二抗工作液为经1×blocking buffer稀释4万倍的兔抗山羊酶标二抗。

3.权利要求1或2所述的羊痘抗体间接ELISA诊断试剂盒中所用的羊痘病毒ORF122S重组蛋白的制备方法，其特征是以山羊痘病毒弱毒疫苗株基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经酶切后与pET30a(+)表达载体连接，构建原核表达载体pET122S，将阳性重组菌接种于含卡那霉素的LB培养基中进行IPTG诱导表达，收集大量表达的重组宿主菌并超声裂解，用8M尿素溶解包涵体并用滤膜过滤，经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化得到目的蛋白，用于扩增ORF122S基因的特异性引物如下：

上游引物：ACCGAATTCAATACATGTTTAAATCAAT；

下游引物：ACCAAGCTTTACACAGTAATAGCTTCTCAT。