CN108912226B - 一种基于双峰驼抗山羊痘病毒vhh-4-2及用途 - Google Patents

一种基于双峰驼抗山羊痘病毒vhh-4-2及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于双峰驼抗山羊痘病毒VHH‑4‑2及用途，属于生物技术领域。包含抗山羊痘病毒VHH‑4‑2，VHH‑4‑2的筛选、表达、纯化、功能化标记以及活性验证，山羊痘病毒的浓缩、纯化，试剂盒各项指标的优化等。本发明使用了功能化标记的VHH‑4‑2，避免了一抗、二抗以及抗抗体等步骤，提高了灵敏性、稳定性，缩短了时间，节约了资源。突破了传统Elisa方法费时、费力等缺陷。本发明的提出为建立敏感山羊痘病毒的临床诊断方法，研究病毒的感染机理奠定基础；也为本发明研制出具有完全自主知识产权的山羊痘病毒抗体固相竞争Elisa试剂盒提供了关键标识物；另外，利用山羊痘弱毒苗经细胞扩大培养、浓缩、纯化后作为包被抗原，提高了灵敏度。

Description

一种基于双峰驼抗山羊痘病毒VHH-4-2及用途
技术领域
本发明属于生物学领域， 涉及双峰驼源抗山羊痘病毒VHH-4-2，特别涉及一种基于双峰驼源抗羊痘病毒VHH-4-2及用途。
背景技术
羊痘是由绵羊痘/山羊痘病毒或者混合感染引起绵羊、山羊发热、少毛或者无毛部位皮肤粘膜发生丘疹或疱疹的一种急性、热性、高度接触性传染病，发病率、病死率高，是所有动物痘病中最为严重的一种。因其与羊传染性脓疱（俗称羊口疮）存在临床症状上的相似性、血清学反应的交叉性，以及内脏型羊痘的频发给该病的确诊造成更大的困难。
单域抗体（VHH）是目前可以获得的具有结构稳定、功能完整、可结合抗原的最小结构单元，由于其免疫原性低、易表达、亲和力高、耐热等特点，靶向导引剂、化学传感器、抗毒血清以及抗病毒免疫制剂，越来越多地应用于生物探测、诊断、制药等领域，成为当前分子影像研究的重要靶标分子。近几年研究者依次应用抗口蹄疫病毒VHH、抗猪瘟病毒VHH以及抗猪圆环病毒VHH等不但进行口蹄疫病毒、猪瘟病毒及猪圆环病毒体外示踪研究，同时还进行了相应血清抗体的监测研究（Di Wang et al. Characterization of single-domainantibodies against Foot and Mouth Disease Virus (FMDV) serotype O from acamelid and imaging of FMDV in baby hamster kidney-21 cells with single-domain antibody-quantum dots probes[J] BMC Veterinary Research (2015) 11:120.Shunli Yang et al. A phage-displayed single domain antibody fused to alkalinephosphatase for detection of porcine circovirus type2[J]. Journal ofVirological Methods 213 (2015) 84–92. Specific detection of foot-and-mouthdisease serotype Asia 1 virus by carboxyl-magnetic beads conjugated withsingle-domain antibody BMC Biotechnology (2015) 15:83.）。Wang等以重组大鼠肺部SPA作为抗原，通过免疫羊驼产生能特异性结合SPA的单域抗体Nb17并证明抗SPA的单域抗体能高亲和力地结合到大鼠肺部，然后通过对Nb17抗体作用于大鼠急性和慢性毒性的研究发现，Nb17抗体不会导致大鼠机体明显的组织学改变，故确定将Nb17抗体应用于大鼠是安全的。（Wang SM，He X，Li N，et al. A novel nanobody specific for re⁃spiratorysurfactant protein A has potential for lung targeting［J］.Int J Nanomed，2015，10：2857-2869. ）单域抗体在犬细小病毒、犬瘟热中也得到广泛应用。但在羊痘病毒方面目前还是空白。目前用于羊痘血清学诊断方法很多，包括间接血凝试验、对流免疫电泳、乳胶凝集试验、单向辐射溶血试验、ELISA等。ELISA方法具有较好的敏感性和较高的特异性，是世界动物卫生组织推荐用于羊痘诊断的方法（世界动物卫生组织.陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽、蜜蜂)[M].5版.北京:中国农业科学技术出版社，2007:152-160.）。但是进行ELISA时需要使用一抗、二抗，费时、费力、实验操作过程繁琐，成本高；另外，利用表达某个蛋白作为包被抗原，使准确性和敏感性降低。
发明内容
为了解决现有技术中使用一抗、二抗费时、费力，成本高，准确性和敏感性低的问题，本发明研制出了一种抗羊痘病毒的关键标识物，提供了一种基于双峰驼抗山羊痘病毒单域抗体VHH-4-2。
为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案如下：一种基于双峰驼抗羊痘病毒单域抗体VHH，利用驼源单域抗体同源臂引物从构建cDNA抗体文库中筛选出特异性针对山羊痘病毒单域抗体，命名为VHH-4-2，所述VHH-4-2单域抗体基因序列为SEQ ID NO:1：
CATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCAGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCCCTGGATTCACCTACAATATGTACTGTATGGCCTGGTTCCGCCAGACTCCAGGGTCGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTGATAGTGATGGTTCCACAAACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATTTCCCAAGACAACGCCAAGAAAACTCTGTACCTGGAAATGAACAGCCTGAAACTCGACGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAGATAGACGCCCATCGCGGGGTAGTGGTCGTAATTGCTGGAGGATATCTTATAATAACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
上述筛选过程具体包括以下步骤：
步骤（1）: 扩增获得约400bp基因片段：
利用驼源单域抗体同源臂引物从构建cDNA抗体文库（见公开号201610281583.9）中扩增单域抗体基因，900bp为VH-CH1-CH2铰链区，600bp为VHH-CH2铰链区，VHH约400bp，分别凝胶回收900和600bp条带，在此基础上再扩增400bp片段，凝胶回收所有400条带，分别和T载体进行连接，转化JM109感受态细胞，挑斑、摇菌、鉴定，验证合适的序列进行测序。
建立的50ul反应体系为：25ul Ex Taq mix 25ul，针对性上、下游引物各1ul，模板1ul（cDNA文库质粒），ddH2O 22ul，扩增条件：95℃ 3min，95℃ 50s ，54℃ 50s， 35times，72℃ 50s。三个片段条件一致。
步骤（2）:片段序列比对： 将获得400bp左右条带的序列与图1单域抗体框架进行比对，符合框架结构的序列则认为是抗羊痘病毒VHH单域抗体序列。
本发明对上述得到的基于骆驼源抗羊痘病毒单域抗体VHH的表达及验证：
本发明 VHH基因载体构建及VHH蛋白的表达、纯化、功能化：包括VHH-4-2基因与高效原核表达载体pMal-c2X的构建，该载体利用“tac”强启动子和malE转录起始信号，目的基因插入到大肠杆菌malE基因下游，其N端带有融合表达麦芽糖结合蛋白MBP标签，便于蛋白可溶性表达，表达产物为目的基因与MBP的融合蛋白，定位于细胞周质，C端带有His标签，便于蛋白亲和层析纯化。
步骤（1）： 单域抗体VHH基因载体构建及表达：
将上述VHH序列克隆并连接于pMal-c2X表达载体，转化BL21感受态细胞，合适克隆进行小量诱导表达；
对小量表达产物经SDS-PAGE检测寻找差异条带；
对大量表达收获的100ml菌体，经200W，超声3s，暂停4s，超声99次超声裂解，12000rpm，4℃离心，50min，收集上清以及沉淀，取少量样品做SDS-PAGE检测，进行重组蛋白可溶性分析，剩余上清及沉淀于冰箱-80℃备用。只有在上清中能够表达的VHH蛋白序列才可被认为是有效的VHH序列。
所述VHH-4-2蛋白的表达条件为：菌体超声破碎参数设置为功率200 W、超声3 s、暂停4 s、99个循环；IPTG诱导剂至终浓度为0.5 mM，30℃诱导3h。
步骤（2）：VHH蛋白活性验证:
2.1纯化蛋白与培养、浓缩、纯化山羊痘弱毒苗的WB活性验证:
首先复苏vero细胞，1:3传代培养，接种山羊痘弱毒苗，同时设不接毒的为对照，F5代后扩大培养，离心，除细胞碎片，超滤浓缩、纯化，与阴、阳性血清正交反应，确定抗原最佳包被浓度，MBP酶标二抗最佳浓度，验证VHH的反应活性以及反应浓度；然后1:100稀释浓缩病毒，加入4x蛋白上样缓冲液，煮沸10min，上样20ul进行SDS-PAGE电泳，同时加蛋白Marker，用半干转膜法，将抗原转至PVDF膜，条件：2.5A，25V，10min，将膜转入5%脱脂奶粉TBST溶液中，封闭2h，TBST冲洗，VHH一抗1:500，4℃孵育过夜，MBP酶标二抗1:1000，37℃孵育2h。最后用增强化学发光法(ECL)观察曝光条带。有印迹条带的即为有反应活性的VHH。
2.2 VHH纯化蛋白中和活性验证：
2.2.1测定山羊痘弱毒苗细胞毒价：
将正常vero细胞按照一定比例分种于96孔细胞培养板，48h后，吸弃培养液，10倍倍比稀释4.1中培养的细胞毒，8孔即一列为一个重复，共加10个梯度，第11和12列为阴性对照，144h后观察、
计算TCID50。
2.2.2 固定病毒，稀释VHH进行细胞中和实验:
在96孔微量细胞培养板上，用稀释液将VHH作一系列倍比稀释(过滤除菌以防污染细胞)，使其稀释度分别为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，1:128,每孔含量为50ul，每个稀释度作4孔。按经测定的毒价作200TCID50稀释（与等量一定比例稀释VHH混合，其毒价为100TCID50），即每孔加入50ul病毒液，封好盖，置于37℃温箱中和1h。
加入细胞悬液,在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清病毒中和1h后，取出，每孔加入100ul细胞悬液。置5%CO2 37℃温箱培养，自培养3d开始逐日观察记录，144h终判。
设立对照：已灭活阳性和阴性血清对照：阳性和阴性血清与VHH4-2进行平行试验，阳性血清对照应不出现细胞病变，而阴性血清对照应出现细胞病变；同时，0.1TCID50病毒孔应不引起细胞病变，而100TCID50孔必须引起细胞病变，否则该试验不能成立；另外，设立正常细胞对照孔，最低稀释度VHH为毒性对照孔。计算得中和指数大于50的即为具有中和活性的抗羊痘病毒VHH单域抗体。
上述所得单域抗体VHH经基因载体构建、表达以及活性验证后，只有符合在上清中表达、具有中和以及反应活性的VHH才是真正意义上的VHH，本发明所得真正意义上的VHH为VHH-4-2，具体见VHH-4-2基因对应序列SEQ ID NO:1：
CATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCAGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCCCTGGATTCACCTACAATATGTACTGTATGGCCTGGTTCCGCCAGACTCCAGGGTCGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTGATAGTGATGGTTCCACAAACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATTTCCCAAGACAACGCCAAGAAAACTCTGTACCTGGAAATGAACAGCCTGAAACTCGACGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAGATAGACGCCCATCGCGGGGTAGTGGTCGTAATTGCTGGAGGATATCTTATAATAACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
本发明对单域抗体VHH-4-2蛋白的纯化及功能化标记：
步骤（1）：VHH-4-2蛋白的纯化：
1.1将上述鉴定的VHH-4-2菌种进一步扩大培养，诱导表达后，收集菌体，超声离心，并用0.45µm过滤器过滤上清，待用；
1.2取Ni柱流干，水洗3-5个柱体积，用0.1M的EDTA洗3个柱体积；水洗3-5个柱体积，NTA-0(pH8.0)洗3个柱体积；NiSO4洗5个柱体积，流干；低pH4.0平衡液洗3个柱体积；NTA-0(pH8.0)洗至流出液与NTA-0 pH相同；
1.3用1ml/min上样流速上样；至上样液流完；
1.4用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑洗柱子分别收集流出液体，SDS-PAGE分析蛋白纯度及浓度，条带最亮的带对应的浓度即为洗脱蛋白浓度。
所述VHH-4-2蛋白纯化时洗脱浓度200mM咪唑， VHH-4-2蛋白纯化后的浓度6.29ng/ul。
步骤（2）：功能化标记：
所述VHH-4-2蛋白的功能化，即辣根过氧化物酶进行蛋白标记，标记方法：将HRP溶于蒸馏水中，加入新鲜配制过碘酸钠水溶液，混匀，置4℃，30min，使HRP分子表面的多糖氧化成醛基，加入乙二醇水溶液，室温30min后加入纯化抗体，混匀，并装透析袋，使醛基与抗体上的氨基形成schiff碱而结合，然后吸出，加硼氢化钠溶液，还原形成稳定的酶标记抗体，所得即为HRP标记的抗体。
所述试剂盒中抗原、浓缩抗原、VHH-4-2及功能化后活性浓度的确定：
2.1 采用间接Elisa检测法，用方正滴定实验确定抗原、浓缩抗原和功能化蛋白活性浓度：
96孔板上横向分别包被不同浓度稀释抗原、浓缩抗原，次日，封闭，37°孵育，洗板，纵向加入不同浓度稀释VHH-4-2抗体、功能化VHH-4-2抗体蛋白，37°孵育，VHH-4-2抗体使用抗MBP酶标二抗，然后加底物显色，测定功能化蛋白活性浓度时直接加底物显色，最后硫酸终止。所得最佳OD450对应稀释度即为浓缩抗原和功能化VHH-4-2蛋白活性浓度。
所述试剂盒中抗原包被浓度1:160，浓缩抗原包被浓度1:800，VHH-4-2单域抗体反应效价1:1280，功能化标记后，其反应效价为1:1500。
与现有技术相比，本发明的优点在于：通过基于驼源抗羊痘病毒抗体文库成功筛选到特异性针对羊痘病毒的一种具备相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性能好、易表达等优势以及具有中和活性的抗山羊痘病毒VHH-4-2单域抗体，为建立敏感羊痘病毒的临床诊断方法，研究病毒的感染机理奠定基础；也为本发明研制出具有完全自主知识产权的羊痘病毒抗体固相竞争Elisa试剂盒提供了关键标识物；另外，利用山羊痘弱毒苗经细胞扩大培养、浓缩、纯化后作为包被抗原，提高了灵敏度和检出率。为羊痘早期治疗和诊断提供了新的技术手段。
本发明成功筛选一株抗山羊痘病毒单域抗体VHH-4-2，该抗体以可溶形式表达，易于纯化，特异性好，与羊口疮、小反弱毒苗抗原以及正常vero细胞不反应，以一定比例中和山羊痘病毒，浓缩抗原包被浓度1:800，酶标记后的VHH-4-2，中和抗原活性达到1:1500，已确定组建Elisa试剂盒各项指标，该试剂盒因省略了一抗、二抗以及抗抗体等步骤，缩短了反应时间，节约了资源，建立的固相竞争ELISA方法准确、稳定、可靠，既简化了试验操作步骤，大幅度缩短了时间，又降低了成本；因包被抗原（1:800）为浓缩、纯化山羊痘全病毒弱毒株，提高了灵敏性和稳定性，突破了传统Elisa方法费时、费力等缺陷，属于首创。
附图说明
图1. 单域抗体VHH基因框架图；
图2.为直接扩增cDNA文库得到的片段凝胶电泳图；
图3.为套扩图2基因片段后所得真正单域抗体VHH基因片段凝胶电泳图；
图4.为单域抗体VHH-4-2诱导表达SDS-PAGE分析；
图4中：1诱导表达前，2为诱导表达后，M为蛋白分子量Marker；
图5.为单域抗体VHH-4-2蛋白可溶性分析SDS-PAGE图；
图5中：M为蛋白分子量Marker ，诱导表达后上清，2为诱导表达后沉淀；
图6.为纯化后的单域抗体VHH-4-2蛋白SDS-PAGE图；
图6中：1为蛋白分子量Marker，2为200mM咪唑洗脱VHH4-2蛋白；
图7. 为正常vero细胞；
图8为接种山羊痘弱毒苗后发生病变的vero细胞；
图9.为单域抗体VHH-4-2蛋白与纯化抗原进行的WB活性验证图；
图10.为酶标单域抗体VHH-4-2蛋白活性验证图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行进一步详细叙述。
实验材料及试剂：YEAST EXTRACT 、TRYPTONE （OXOID），氨苄青霉素钠（Merck），硫酸卡那霉素（Amresco），透析柱（Haidylena），Minimum Essential Medium、1:250 Trypsin（购自GIBCO公司），丙酮酸钠（购自上海郑翔化学试剂研究所），配制细胞培养液及胰酶细胞消化液；新生牛血清（购自兰州荣晔生物科技有限公司）；Premix Taq version2.0 、DNAGelExtraction Kit、DNA ligation Kit、TaKaRa MiniBEST DNA Fragment PurificationKit、JM109感受态细胞以及PCR相关试剂均购自TaKaRa；MBP酶标二抗购自abcam，羊痘抗体检测试剂盒购自R&D公司；其他生化试剂均为国产分析纯。
本发明一种基于双峰驼抗山羊痘病毒单域抗体VHH-4-2包括： 一种基于双峰驼抗山羊痘病毒VHH-4-2基因的筛选、VHH-4-2基因载体的构建及表达、VHH-4-2上清蛋白的纯化、VHH-4-2的活性鉴定、VHH-4-2功能化及应用。
实施例
一种基于双峰驼抗山羊痘病毒单域抗体VHH-4-2基因的筛选
1.1 利用驼源单域抗体同源臂引物从构建cDNA抗体文库（见公开号201610281583.9）中扩增单域抗体基因，900bp为VH-CH1-CH2铰链区，600bp为VHH-CH2铰链区，VHH约400bp，分别凝胶回收900和600bp条带，在此基础上再扩增400bp，凝胶回收后和T载体连接，转化JM109感受态细胞，挑斑、摇菌、鉴定，验证合适的序列进行测序。50ul反应体系：25ul Ex Taq mix 25ul，针对性上、下游引物各1ul，模板1ul（cDNA文库质粒），ddH2O22ul，扩增条件：95℃ 3min，95℃ 50s ，54℃ 50s， 35times，72℃ 50s。三个片段条件一致。1.2 所得序列与图1单域抗体框架进行比对，符合框架结构的序列则认为是单域抗体序列，可以进行下游实验；
1.3结果：经一扩、套扩后，成功获得900bp和600bp条带（如图2），对其进行套扩后获得400bp左右条带（如图3），凝胶纯化、回收400bp片段，经T克隆、测序后，初步筛选出一条符合框架的基因序列（见SEQ ID NO:1），标记为：VHH-4-2基因。
SEQ ID NO:1：
CATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCAGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCCCTGGATTCACCTACAATATGTACTGTATGGCCTGGTTCCGCCAGACTCCAGGGTCGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTGATAGTGATGGTTCCACAAACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATTTCCCAAGACAACGCCAAGAAAACTCTGTACCTGGAAATGAACAGCCTGAAACTCGACGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAGATAGACGCCCATCGCGGGGTAGTGGTCGTAATTGCTGGAGGATATCTTATAATAACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
一种基于双峰驼抗山羊痘病毒单域抗体VHH-4-2基因载体的构建及表达
2.1将上述VHH-4-2基因序列克隆并连接于pMal-c2X表达载体，转化BL21感受态细胞，合适克隆进行小量诱导表达；
2.2 对小量表达产物经SDS-PAGE检测寻找差异条带；
2.3对大量表达收获的100ml菌体，经200W，超声3s，暂停4s，超声99次超声裂解，12000rpm，4℃离心，50min，收集上清以及沉淀，取少量样品做SDS-PAGE检测，进行重组蛋白可溶性分析，剩余上清及沉淀于冰箱-80℃备用。
2.4结果 VHH-4-2基因正确克隆于表达载体，小量诱导表达后，图4中可以明显看出差异条带，说明VHH-4-2基因成功获得表达；大量表达的100ml菌体，上清和沉淀SDS-PAGE可溶性分析如图5，说明上清和沉淀均有表达。
一种基于双峰驼抗山羊痘病毒单域抗体VHH-4-2上清蛋白的纯化
3.1将上述2鉴定的菌种进一步扩大培养，摇培1L，诱导表达后，4000rpm，15min，收集菌体，如2.3超声离心，对上清用0.45µm过滤器过滤，待用；
3.2取Ni柱流干，水洗3-5个柱体积，用0.1M的EDTA洗3个柱体积；水洗3-5个柱体积，NTA-0(pH8.0)洗3个柱体积；NiSO4洗5个柱体积，流干。
3.3低pH4.0平衡液洗3个柱体积；NTA-0(pH8.0)洗至流出液与NTA-0 pH相同。
3.4用1ml/min上样流速上样；至上样液流完。
3.5 NTA-0(pH8.0)洗至G250不变蓝为止。
3.6分别用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑洗柱子（直至检测G250不变蓝为止），分别收集流出液体，SDS-PAGE分析蛋白纯度及浓度。
3.7水洗一个柱体积，20％乙醇封柱。
3.8 结果 经各种条件摸索后发现，200mM咪唑洗脱效果做好，获得蛋白较纯，浓度达1mg/ml，500ml菌可达6 mg/ml，见图6。
一种基于双峰驼抗山羊痘病毒单域抗体VHH-4-2的活性鉴定
4.1 VHH-4-2纯化蛋白与培养、浓缩、纯化山羊痘弱毒苗的WB活性验证
首先复苏vero细胞，1:3传代培养，接种山羊痘弱毒苗，同时设不接毒的为对照，F5代后扩大培养，离心，除细胞碎片，超滤浓缩、纯化，与阴、阳性血清正交反应，确定抗原最佳包被浓度，MBP酶标二抗最佳浓度，验证VHH-4-2的反应活性以及反应浓度；然后1:100稀释浓缩病毒，加入4x蛋白上样缓冲液，煮沸10min，上样20ul进行SDS-PAGE电泳，同时加蛋白Marker，用半干转膜法，将抗原转至PVDF膜，条件：2.5A，25V，10min，将膜转入5%脱脂奶粉TBST溶液中，封闭2h，TBST冲洗，VHH-4-2一抗1:500,4℃孵育过夜，MBP酶标二抗1:1000，37℃孵育2h。最后用增强化学发光法(ECL)观察曝光条带。
结果：正常及接种山羊痘弱毒苗后发生病变细胞见图7和8，成功获得抗原，经正交反应，浓缩、纯化后的抗原最佳包被浓度1:800，VHH-4-2反应浓度为1:1280，说明驼源抗羊痘病毒单域抗体VHH4-2具有与山羊痘病毒较好的反应性能。图9印迹条带进一步证实VHH-4-2蛋白可以被山羊痘病毒所识别，产生特异条带，具有反应活性。
4.2 VHH-4-2纯化蛋白中和活性验证
4.2.1 测定山羊痘弱毒苗细胞毒价
将正常vero细胞按照一定比例分种于96孔细胞培养板，48h后，吸弃培养液，10倍倍比稀释4.1中培养的细胞毒，8孔即一列为一个重复，共加10个梯度，第11和12列为阴性对照，144h后观察、
计算TCID50。
4.2.1 固定病毒，稀释VHH4-2进行细胞中和实验
在96孔微量细胞培养板上，用稀释液将VHH4-2作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，1:128,每孔含量为50ul，每个稀释度作4孔。按经测定的毒价作200TCID50稀释（与等量一定比例稀释VHH4-2混合，其毒价为100TCID50），即每孔加入50ul病毒液，封好盖，置于37℃温箱中和1h。
加入细胞悬液，在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清病毒中和1h后，取出，每孔加入100ul细胞悬液。置5%CO2 37℃温箱培养，自培养3d开始逐日观察记录，144h终判。
设立对照：已灭活阳性和阴性血清对照：阳性和阴性血清与VHH4-2进行平行试验，阳性血清对照应不出现细胞病变，而阴性血清对照应出现细胞病变；同时，0.1TCID50病毒孔应不引起细胞病变，而100TCID50孔必须引起细胞病变，否则该试验不能成立；另外，设立正常细胞对照孔，最低稀释度VHH-4-2为毒性对照孔。
4.2.3结果：各种对照成立，进行判定时，被检孔出现100%CPE判为阴性；50%以上细胞出现保护者为阳性；固定病毒稀释血清中和试验的结果计算，是计算出能保护50%细胞孔不产生细胞病变的VHH4-2稀释度，该稀释度即为该VHH-4-2的中和抗体效价。计算得：TCID50为4.67， VHH4-2中和后TCID50为2.5，二者之差为2.17,其反对数约为148，大于50，说明VHH4-2单域抗体具有中和山羊痘弱毒苗细胞毒作用。
一种基于双峰驼抗山羊痘病毒单域抗体VHH-4-2功能化及应用
5.1纯化后的VHH4-2蛋白进行标记
5mg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制0.06mol/L过碘酸钠水溶液0.5ml，混匀置4℃，30min，加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5ml，室温30min后加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装透析袋，以0.05mol/L，PH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6h（过夜），然后吸出，加硼氢化钠溶液5mg/ml,0.2ml,所得即为HRP标记的抗体。
5.2 功能化抗体效价及特异性检测
1:20-1:2560竖排稀释包被抗原，次日，洗板封闭，1:80-1:2560稀释酶标抗体，正交反应，验证酶标VHH-4-2活性；不同浓度包被实验制备羊口疮、小反弱毒苗抗原，以及山羊痘弱毒苗和正常vero细胞，进行特异性检测。
5.3结果 经HRP酶标记后，VHH-4-2酶标抗体效价确定为1:1500，见图10；VHH-4-2酶标抗体只与山羊痘弱毒苗反应，与羊口疮、小反弱毒苗抗原以及正常vero细胞不反应，可见VHH-4-2酶标抗体特异性好。
Organization Applicant
----------------------
Street : 甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号
City : 兰州
State : 甘肃
Country : 中国
PostalCode : 730046
PhoneNumber : 0931-8343385
FaxNumber : 0931-8340977
EmailAddress : jingningcaixiong@163.com
<110> OrganizationName : 中国农业科学院兰州兽医研究所
Application Project
-------------------
<120> Title : 一种基于双峰驼抗山羊痘病毒VHH-4-2及用途
<130> AppFileReference : Characterization of Asia 1 sdAb from CamelsBactrianus (C. bactrianus) and Conjugation with Quantum Dots for Imaging FMDVin BHK-21 Cells
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<213> OrganismName : Peganum harmala
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catgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg caggagggtc tctgagactc 60
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<212> Type : DNA
<211> Length : 384
SequenceName : SEQ ID NO:1
SequenceDescription :

Claims (1)

1.一种基于双峰驼抗山羊痘病毒单域抗体VHH-4-2，其特征在于：利用驼源单域抗体同源臂引物从构建cDNA抗体文库中筛选出特异性针对山羊痘病毒单域抗体VHH-4-2基因，所述VHH-4-2单域抗体基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1：
CATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCAGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCCCTGGATTCACCTACAATATGTACTGTATGGCCTGGTTCCGCCAGACTCCAGGGTCGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCTATTGATAGTGATGGTTCCACAAACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATTTCCCAAGACAACGCCAAGAAAACTCTGTACCTGGAAATGAACAGCCTGAAACTCGACGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAGATAGACGCCCATCGCGGGGTAGTGGTCGTAATTGCTGGAGGATATCTTATAATAACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
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