CN117825704A - 一种基于Fiber-2蛋白和抗Fiber-2蛋白单克隆抗体的检测鸭3型腺病毒抗体的竞争ELISA方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于Fiber‑2蛋白和抗Fiber‑2蛋白单克隆抗体的检测鸭3型腺病毒抗体的竞争ELISA方法，首次使用单克隆抗体进行鸭3型腺病毒抗体的检测，与间接ELISA技术相比，本发明的特异性高，能够有效提高检测的准确性，且不依赖于商品化的酶标二抗，可以应用于不同物种（鸡、鸭和鹅）血清中鸭3型腺病毒抗体检测，是一种简便、快速、稳定、特异的检测鸭3型腺病毒抗体的ELISA方法。使用本发明只需采集鸭群的血清，即可快速准确地检测血清中是否含有鸭3型腺病毒抗体，本发明适合应用于基层鸭群的大批量检测。本发明为鸭3型腺病毒的感染检测以及免疫效果监测提供了技术支持，具有一定的市场应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于Fiber-2蛋白和抗Fiber-2蛋白单克隆抗体的检测鸭3型腺病毒抗体的竞争ELISA方法，属于疫病检测技术领域。
背景技术
鸭源腺病毒包括富AT腺病毒属的鸭1型腺病毒和禽腺病毒属的鸭2型腺病毒。通过病毒分离鉴定表明该病毒是一种中等大小、无包膜的二十面体病毒粒子，具有线性、不分段的双链DNA基因组。通过全基因组测序、序列比对及遗传进化分析表明该病毒是一种新型的鸭腺病毒，属于禽腺病毒属，这种新发病原为鸭3型腺病毒。目前福建省农业科学院畜牧兽医研究所利用鸭3型腺病毒Fiber-1和Fiber-2基因的原核表达蛋白建立了两个检测鸭3型腺病毒抗体的间接ELISA方法，并且已经申请了专利。然而，间接ELISA特异性相对不高，且依赖于商品化的抗鸭二抗。目前尚无不依赖于商品化二抗的检测鸭3型腺病毒抗体的竞争ELISA检测方法。因此，本发明利用原核表达的Fiber-2蛋白和制备的抗Fiber-2蛋白单克隆抗体成功建立了一种检测鸭3型腺病毒抗体的竞争ELISA方法，为鸭3型腺病毒的防控提供了技术保障。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种基于Fiber-2蛋白和抗Fiber-2蛋白单克隆抗体的检测鸭3型腺病毒抗体的竞争ELISA方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种基于Fiber-2蛋白和抗Fiber-2蛋白单克隆抗体的检测鸭3型腺病毒抗体的竞争ELISA方法，包被抗原为原核表达的鸭3型腺病毒Fiber-2蛋白；
酶标抗体为酶标的抗鸭3型腺病毒Fiber-2蛋白的单克隆抗体，酶标的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株DAdV-3-Fiber-2-3D9分泌获得。
所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。
包被抗原的工作浓度为1.25μg/mL，酶标抗体(0.59mg/mL)的稀释倍数为1:16000，待检血清的抑制率在18％以上判定为阳性。
竞争ELISA方法仅与鸭3型腺病毒阳性血清反应，而与血清4型禽腺病毒、1型鸭肝炎病毒、3型鸭肝炎病毒、坦布苏病毒、鸭呼肠孤病毒、新型鸭细小病毒、新城疫病毒和H9N2禽流感病毒阳性血清均不反应。
一种Fiber-2蛋白的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
步骤1-1)、Fiber-2重组载体的构建；
根据鸭3型腺病毒序列设计并合成一对添加限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点的PCR扩增引物：
上游引物为：5'-CCGCTCGAGATGAAACGGACCAACAGATC-3'；
下游引物为：5'-CCGGAATTCCTAATTAACATTTGATGGGTTG-3'；
其中，鸭3型腺病毒序列，Genbank序列索取号：KR135164；
PCR扩增长度为1443bp，扩增程序采用：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃45s，扩增32个循环；72℃10min；以鸭3型腺病毒基因组为模板扩增Fiber-2基因，通过DNA纯化回收试剂盒回收扩增的目的条带；使用Xho I及EcoR I限制性内切酶将原核表达载体pCold-1和回收的Fiber-2基因进行双酶切，酶切体系为20μL，37℃酶切2小时；酶切后的片段进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收酶切片段后使用T4 DNA连接酶4℃连接过夜；连接产物进行转化、涂板，挑取PCR鉴定为阳性的菌液提取质粒，送擎科生物有限公司测序，序列正确的质粒置于-20℃保存；得到构建的Fiber-2基因原核表达载体；
步骤1-2)、Fiber-2重组蛋白的表达和纯化；
将步骤1-1)中构建的Fiber-2基因原核表达载体转化到BL21细菌中，挑取阳性菌落扩大培养，37℃摇床培养3h之后，加入终浓度为1mmol/mL的IPTG于16℃诱导过夜；诱导的细菌离心去除上清，使用PBS重悬后超声波温和裂解菌体，离心后的菌体裂解上清使用镍金属螯合亲和填料进行蛋白纯化。
所述酶标单克隆抗体的制备方法如下：
步骤2-1)、单克隆抗体的制备和纯化；
使用制备的Fiber-2原核蛋白作为抗原免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，等到抗体效价达到1:10000，采用PEG法将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，间接免疫荧光法检测细胞上清进行阳性细胞孔的筛选，通过亚克隆获得单克隆杂交瘤细胞，使用杂交瘤细胞注射小鼠制备腹水，制备的腹水利用Protein G亲和层析柱纯化，使用1×PBS将纯化的单克隆抗体溶液稀释为1mg/mL；
步骤2-2)、酶标抗体的鉴定；
使用EZ-LinkTM活化过氧化物酶抗体标记试剂盒对步骤2-1)中浓度为1mg/mL的单克隆抗体溶液进行HRP标记，利用ELISA方法对HRP标记的单克隆抗体溶液进行鉴定；鉴定步骤：
使用倍比稀释的Fiber-2蛋白包被96孔酶标板，过夜封闭后使用倍比稀释的HRP标记的单克隆抗体溶液孵育，进行ELISA试验，测定各孔反应液的OD450nm读值，根据OD450nm读值为1左右的反应孔确定最佳的包被蛋白的浓度和酶标抗体的稀释度。
竞争ELISA检测的步骤如下：
3.1、包被；将制备的Fiber-2蛋白稀释为1.25μg/mL，每孔100μL包被96孔酶标板，4℃过夜；
3.2、洗板；包被的酶标板加入360μL/孔的PBST洗涤，甩干，重复2次；
3.3、封闭；步骤3.2中甩干的酶标板加入360μL/孔的5％脱脂乳封闭，37℃封闭2h，甩干，加入360μL/孔的PBST洗涤，甩干，重复3次；
3.4、加样；将1:4稀释的待检血清按照100μL/孔加入到封闭后甩干的酶标板，置于37℃孵育1h，甩干，加入360μL/孔的PBST洗涤，甩干，重复3次；
3.5、加入酶标抗体；将制备的酶标抗体使用PBST 1:16000稀释，按照100uL/孔加入酶标板，37℃孵育60min，甩干，加入360μL/孔的PBST洗涤，甩干，重复3次；
3.6、显色；每孔加入100uL的TMB显色液，37℃避光显色10min；
3.7、终止；每孔加入50μL 2M的H2SO4终止液终止显色反应，在酶标仪上读取各孔反应液的OD450nm读值；
3.8、抑制率的计算；根据得到的OD450nm读值计算待检血清的抑制率，公式如下：抑制率(％)＝(阴性血清读值-待检血清读值)/阴性血清读值；
阴阳性判定：
根据ELISA检测程序计算得到的抑制率临界值进行判定；待检血清的抑制率在18％以上，判断为阳性，即待检血清中含有鸭3型腺病毒抗体；待检血清的抑制率低于18％，判断为阴性，即待检血清中不含有鸭3型腺病毒抗体。
通过本发明，提供的一种基于Fiber-2蛋白和抗Fiber-2蛋白单克隆抗体的检测鸭3型腺病毒抗体的竞争ELISA方法，便于更简便、高效地进行鸭3型腺病毒抗体诊断、流行病学调查和免疫评估。本发明首次使用单克隆抗体进行鸭3型腺病毒抗体的检测，与间接ELISA技术相比，本发明的特异性高，能够有效提高检测的准确性，且不依赖于商品化的酶标二抗，可以应用于不同物种(鸡、鸭和鹅)血清中鸭3型腺病毒抗体检测，是一种简便、快速、稳定、特异的检测鸭3型腺病毒抗体的ELISA方法。使用本发明只需采集鸭群的血清，即可快速准确地检测血清中是否含有鸭3型腺病毒抗体，本发明适合应用于基层鸭群的大批量检测。
本发明建立的一种检测鸭3型腺病毒抗体的竞争ELISA方法，为鸭3型腺病毒的感染检测以及免疫效果监测提供了技术支持，具有一定的市场应用价值。
附图说明
图1是单克隆抗体3D9的特异性。
图2是竞争ELISA方法的特异性。
图3是竞争ELISA方法的灵敏性。
具体实施方式
本发明中所用试剂及其组分如下：
包被液(1×碳酸盐缓冲液)：Na2CO3 0.159g，NaHCO3 0.293g，使用蒸馏水溶解并定容至100mL，pH值9.6，4℃保存；
1×PBS溶液：NaCl 4g，KCl 0.1g，Na2HPO4·12H2O 1.815g，KH2PO40.12g，使用蒸馏水溶解并定容至500mL，pH值7.4；
PBST：每1L PBS溶液中加入0.5mL的Tween-20，充分混匀；
封闭液(5％脱脂乳)：将2.5g脱脂乳溶解于50mL PBST中，充分混匀；
终止液(2M H2SO4)：将10.9mL浓H2SO4缓慢加入89.1mL蒸馏水中，边加边摇晃，冷却至室温。
实施例
1，Fiber-2重组载体的构建；
根据鸭3型腺病毒序列(Genbank序列索取号：KR135164)设计并合成一对添加限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点的PCR扩增引物：
上游引物为：5'-CCGCTCGAGATGAAACGGACCAACAGATC-3'；
下游引物为：5'-CCGGAATTCCTAATTAACATTTGATGGGTTG-3'。
CR扩增长度为1443bp，扩增程序采用：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃45s，扩增32个循环；72℃10min。以鸭3型腺病毒基因组为模板扩增Fiber-2基因，通过DNA纯化回收试剂盒回收扩增的目的条带。使用Xho I及EcoR I限制性内切酶将原核表达载体pCold-1和回收的Fiber-2基因进行双酶切，酶切体系为20μL，37℃酶切2小时，具体体系参见EcoR I及Xho I限制性内切酶的使用说明书(赛默飞世尔科技有限公司)。酶切后的片段进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收酶切片段后使用T4 DNA连接酶4℃连接过夜。连接产物进行转化、涂板，挑取PCR鉴定为阳性的菌液提取质粒，送擎科生物有限公司测序，序列正确的质粒置于-20℃保存。
2，Fiber-2重组蛋白的表达和纯化；
将步骤1中构建的Fiber-2基因原核表达载体转化到BL21细菌中，挑取阳性菌落扩大培养，37℃摇床培养3h之后，加入终浓度为1mmol/mL的IPTG于16℃诱导过夜。诱导的细菌离心去除上清，使用PBS重悬后超声波温和裂解菌体，离心后的菌体裂解上清使用镍金属螯合亲和填料(北实纵横科学公司)进行蛋白纯化。
3，单克隆抗体的制备和纯化；
使用步骤2中纯化的Fiber-2原核蛋白作为抗原免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，等到抗体效价达到1:10000，采用PEG法将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，间接免疫荧光法检测细胞上清进行阳性细胞孔的筛选，通过亚克隆获得单克隆杂交瘤细胞，使用杂交瘤细胞注射小鼠制备腹水，制备的腹水利用Protein G亲和层析柱纯化，使用1×PBS将纯化的单克隆抗体溶液稀释为1mg/mL。
4，酶标抗体的鉴定；
使用EZ-LinkTM活化过氧化物酶抗体标记试剂盒(赛默飞世尔科技有限公司)对步骤3中浓度为1mg/mL的单克隆抗体溶液进行HRP标记，利用ELISA方法对HRP标记的单克隆抗体溶液进行鉴定。鉴定步骤：使用倍比稀释的Fiber-2蛋白包被96孔酶标板，过夜封闭后使用倍比稀释的HRP标记的单克隆抗体溶液孵育，进行ELISA试验，测定各孔反应液的OD450nm读值，根据OD450nm读值为1左右的反应孔确定最佳的包被蛋白的浓度和酶标抗体的稀释度。
5，ELISA检测程序；
5.1包被：将步骤2中Fiber-2蛋白稀释为1.25μg/mL，每孔100μL包被96孔酶标板，4℃过夜；
5.2洗板：包被的酶标板加入360μL/孔的PBST洗涤，甩干，重复2次；
5.3封闭：步骤5.2中甩干的酶标板加入360μL/孔的5％脱脂乳封闭，37℃封闭2h，甩干，加入360μL/孔的PBST洗涤，甩干，重复3次；
5.4加样：将1:4稀释的待检血清按照100μL/孔加入到封闭后甩干的酶标板，置于37℃孵育1h，甩干，加入360μL/孔的PBST洗涤，甩干，重复3次；
5.5加入酶标抗体：将步骤4中制备的酶标抗体使用PBST 1:16000稀释，按照100uL/孔加入酶标板，37℃孵育60min，甩干，加入360μL/孔的PBST洗涤，甩干，重复3次；
5.6显色：每孔加入100uL的TMB显色液，37℃避光显色10min；
5.7终止：每孔加入50μL 2M的H2SO4终止液终止显色反应，在酶标仪上读取各孔反应液的OD450nm读值。
5.8抑制率的计算：根据得到的OD450nm读值计算待检血清的抑制率，公式如下：抑制率(％)＝(阴性血清读值-待检血清读值)/阴性血清读值。
6，阴阳性判定；
根据发明内容ELISA检测程序计算得到的抑制率临界值进行判定。待检血清的抑制率在18％以上，判断为阳性，即待检血清中含有鸭3型腺病毒抗体；待检血清的抑制率低于18％，判断为阴性，即待检血清中不含有鸭3型腺病毒抗体。
7，特异性、灵敏性和重复性试验；
用本发明建立的方法对鸭3型腺病毒、血清4型禽腺病毒、1型鸭肝炎病毒、3型鸭肝炎病毒、鸭坦布苏病毒、鸭呼肠孤病毒、新型鸭细小病毒新城疫病毒和H9N2禽流感病毒阳性血清进行检测，该方法只与鸭3型腺病毒阳性血清反应呈阳性，说明该方法具有良好的特异性。同时，使用该方法与IFA方法检测临床鸭血清的结果完全一致，说明该方法具有良好的灵敏性。此外，该方法的批间和批内重复的变异系数均小于10％，说明该方法具有良好的重复性。
8，竞争ELISA和间接ELISA的符合率；
使用本发明建立的竞争ELISA方法与本实验室建立的基于Fiber-2蛋白的间接ELISA方法对133份感染或免疫鸭群的血清进行检测，其中有121份血清使用两种方法检测的结果是一致的，符合率为90.98％，表明本发明建立的竞争ELISA可以应用于鸭3型腺病毒抗体的检测。本发明用于鸭3型腺病毒抗体的检测。
SEQ ID NO.1
鸭3型腺病毒Fiber-2基因序列：
ATGAAACGGACCAACAGATCAGACAATGGTGAAGGATTCACAAAGCGTGCGAAGATTCAGGCATCTGCTTCTGCGACAATCGACCTAACATATCCGTTCTGGGAGCAAGCTTCGAGTGCCAACCCGATAAATCCTCCGTTTGTCACCGGACCACTGTATGATGACAACGGGTATCTTAACGTAAGAACATCCGACCCGATAAGAACCGTTGGTAACAGCCTCAGCCTACTGTACGATGATTCGCTAGCTGTGACAAGTGGCAAACTAGGCGTTAAAATCGACCCAAACGGGCCTCTAGATGAGTCGCCCGCTGGACTCAGTTTAGCTCTAGGAGACGGTCTTGAAGAAGACGAGTTCACAGGTTTATCTGTAAAACCAGATCCACGTGGCCCTATCGAAGTGTCAGATGAAGGAGTGGGTATAGCCTATGATACAGAAACCATGTCAATAACATCAATGCAACCAAATTCACAGATGACTCTCGGTGTACGACTAAACCCCGATGGTGCACTACACAGTAACAACGGATTAGATGTAAAAATTGATGATGATGCGTTGATAGTCAGCGACGAAGGCCTAACAGTACTCGTTAGTGAAAGCGGGCCACTTACAATCGACCCTGGCAAAGGACTGGATATTGATATCGATCAATCACTCTCCGTTAGAACTAATCCTCAAGGAGAGAAAGAGTTAGGCATCAACATCATCCCCACATCGTGCATAACACTAGACAACGGAGGCCTCGACCTCAAGGTGGACCCAGGAAGCCTGGCCGTCACTGACAATACCCTACACCTCACAAGCTCATACTCAACCTATGTCTTTACGAGTGGATCTGACACACTTCAGAAGACACAAGCCCAAGTGTGCTGCGGAGCAGGGTCTGTTACGTTTCCGTGCGCATACTATGCCAAGATCGTATGCTCAAACAATGTGTCTTCAGGATATATAACACTGAAGGTGAGCGCTGAGGATGCATCACATGCTGTAGATCAACGCTTCGCGACTATTCAACCAGTATTCACATTCTGGTTATGTCGAGACATAGGTAATGAAAACACCGTCAATTTTTCCCACTGTACCAACAACAGTTATAAGCCAGAGGAAACCGCAGTCGTTAAGGCATGCATCACACCAGCATACAAAAATTTTGATGTCAGCAATGTTTCAGAACATGACTTTATTCTGTATAACTATAGTGGGGTAAACACATCAGGAGTTCCAATAGGCACAGGGAACCTAAAGAATGTGTATGATTACGTATCAAGATTCTCCATAGCCCAAGTATCAGGAAGCCCCACATCACCACAATTAACTTTTACAATAGAACTTAATAAGATAGATCAATCTTCGTACTATCTGTACAAACAAGGCACAACTGGTGATATTACAATTGGTCCAATTCCATTTTCGTACGTTAGCAACCCATCAAATGTTAATTAG。
Claims (6)
1.一种基于Fiber-2蛋白和抗Fiber-2蛋白单克隆抗体的检测鸭3型腺病毒抗体的竞争ELISA方法，其特征在于，
包被抗原为原核表达的鸭3型腺病毒Fiber-2蛋白；
酶标抗体为酶标的抗鸭3型腺病毒Fiber-2蛋白的单克隆抗体，酶标的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株DAdV-3-Fiber-2-3D9分泌获得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，竞争ELISA方法仅与鸭3型腺病毒阳性血清反应，而与血清4型禽腺病毒、1型鸭肝炎病毒、3型鸭肝炎病毒、坦布苏病毒、鸭呼肠孤病毒、新型鸭细小病毒、新城疫病毒和H9N2禽流感病毒阳性血清均不反应。
4.一种Fiber-2蛋白的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
步骤1-1)、Fiber-2重组载体的构建；
根据鸭3型腺病毒序列设计并合成一对添加限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点的PCR扩增引物：
上游引物为：5'-CCGCTCGAGATGAAACGGACCAACAGATC-3'；
下游引物为：5'-CCGGAATTCCTAATTAACATTTGATGGGTTG-3'；
其中，鸭3型腺病毒序列，Genbank序列索取号：KR135164；
PCR扩增长度为1443bp，扩增程序采用：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃45s，扩增32个循环；72℃10min；以鸭3型腺病毒基因组为模板扩增Fiber-2基因，通过DNA纯化回收试剂盒回收扩增的目的条带；使用Xho I及EcoR I限制性内切酶将原核表达载体pCold-1和回收的Fiber-2基因进行双酶切，酶切体系为20μL，37℃酶切2小时；酶切后的片段进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收酶切片段后使用T4 DNA连接酶4℃连接过夜；连接产物进行转化、涂板，挑取PCR鉴定为阳性的菌液提取质粒，送擎科生物有限公司测序，序列正确的质粒置于-20℃保存；得到构建的Fiber-2基因原核表达载体；
步骤1-2)、Fiber-2重组蛋白的表达和纯化；
将步骤1-1)中构建的Fiber-2基因原核表达载体转化到BL21细菌中，挑取阳性菌落扩大培养，37℃摇床培养3h之后，加入终浓度为1mmol/mL的IPTG于16℃诱导过夜；诱导的细菌离心去除上清，使用PBS重悬后超声波温和裂解菌体，离心后的菌体裂解上清使用镍金属螯合亲和填料进行蛋白纯化。
5.一种酶标抗Fiber-2蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述酶标单克隆抗体的制备方法如下：
步骤2-1)、单克隆抗体的制备和纯化；
使用如权利要求5所述方法制备的Fiber-2原核蛋白作为抗原免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，等到抗体效价达到1:10000，采用PEG法将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，间接免疫荧光法检测细胞上清进行阳性细胞孔的筛选，通过亚克隆获得单克隆杂交瘤细胞，使用杂交瘤细胞注射小鼠制备腹水，制备的腹水利用Protein G亲和层析柱纯化，使用1×PBS将纯化的单克隆抗体溶液稀释为1mg/mL；
步骤2-2)、酶标抗体的鉴定；
使用EZ-LinkTM活化过氧化物酶抗体标记试剂盒对步骤2-1)中浓度为1mg/mL的单克隆抗体溶液进行HRP标记，利用ELISA方法对HRP标记的单克隆抗体溶液进行鉴定；鉴定步骤：
使用倍比稀释的Fiber-2蛋白包被96孔酶标板，过夜封闭后使用倍比稀释的HRP标记的单克隆抗体溶液孵育，进行ELISA试验，测定各孔反应液的OD450nm读值，根据OD450nm读值为1左右的反应孔确定最佳的包被蛋白的浓度和酶标抗体的稀释度。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，竞争ELISA检测的步骤如下：
3.1、包被；将如权利要求5所述方法制备的Fiber-2蛋白稀释为1.25μg/mL，每孔100μL包被96孔酶标板，4℃过夜；
3.2、洗板；包被的酶标板加入360μL/孔的PBST洗涤，甩干，重复2次；
3.3、封闭；步骤3.2中甩干的酶标板加入360μL/孔的5％脱脂乳封闭，37℃封闭2h，甩干，加入360μL/孔的PBST洗涤，甩干，重复3次；
3.4、加样；将1:4稀释的待检血清按照100μL/孔加入到封闭后甩干的酶标板，置于37℃孵育1h，甩干，加入360μL/孔的PBST洗涤，甩干，重复3次；
3.5、加入酶标抗体；将如权利要求6所述方法制备的酶标抗体使用PBST 1:16000稀释，按照100uL/孔加入酶标板，37℃孵育60min，甩干，加入360μL/孔的PBST洗涤，甩干，重复3次；
3.6、显色；每孔加入100uL的TMB显色液，37℃避光显色10min；
3.7、终止；每孔加入50μL 2M的H2SO4终止液终止显色反应，在酶标仪上读取各孔反应液的OD450nm读值；
3.8、抑制率的计算；根据得到的OD450nm读值计算待检血清的抑制率，公式如下：抑制率(％)＝(阴性血清读值-待检血清读值)/阴性血清读值；
阴阳性判定：
根据ELISA检测程序计算得到的抑制率临界值进行判定；待检血清的抑制率在18％以上，判断为阳性，即待检血清中含有鸭3型腺病毒抗体；待检血清的抑制率低于18％，判断为阴性，即待检血清中不含有鸭3型腺病毒抗体。
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