CN117886896B

CN117886896B - 非洲猪瘟多表位重组蛋白asfvmea及应用

Info

Publication number: CN117886896B
Application number: CN202410024166.0A
Authority: CN
Inventors: 王湘如; 刘李鑫杰; 陈启超; 李亮; 吴韦; 陈焕春
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2024-01-08
Filing date: 2024-01-08
Publication date: 2024-06-07
Anticipated expiration: 2044-01-08
Also published as: CN117886896A

Abstract

本发明属于非洲猪瘟检测领域，公开了非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA及应用。选择p30、p54、p72、pA104R蛋白的抗原优势表位，对重组抗原构建策略进行了优化与筛选。将表达的非洲猪瘟病毒多表位重组蛋白进行表达纯化并作为包被抗原，建立并优化了间接ELISA检测方法，能够实现对于非洲猪瘟病毒抗体的检测。本发明建立间接ELISA方法，用以检测非洲猪瘟病毒的抗体水平，具有重复性好、特异性强、灵敏度高的特点，操作步骤简单，结果可靠。因此，本发明提供的基于非洲猪瘟病毒多表位蛋白的非洲猪瘟病毒间接ELISA检测试剂盒适合临床大样本的检测，适合大规模推广。

Description

非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA及应用

技术领域

本发明属于非洲猪瘟检测领域，具体涉及非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA及应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病，其临床症状主要表现为发热、皮肤充血发绀、内脏器官出血、呼吸障碍等，家猪病死率高达100％。ASF是世界卫生组织(World Health Organization，WOAH)法定报告的动物疾病，也是我国一类动物疫病。

由于ASFV的基因组庞大、变异迅速且有着复杂的免疫逃避机制，ASF的疫苗研发面临着巨大的挑战，当前仍缺乏安全有效的非洲猪瘟商业化疫苗和治疗药物，目前对非洲猪瘟的防控主要依靠生物安全措施，以早期诊断与发现、隔离、扑杀等手段进行，快速准确的诊断对于控制非洲猪瘟病毒的传播至关重要。当前ASFV诊断方法主要包括病毒分离、红细胞吸附试验(HAD)、荧光抗体试验(FAT)、聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等，这些方法需要专业技术支持、成本较高且存在病原污染的可能性。酶联免疫吸附试验(ELISA)是WOAH指定的诊断ASF首选的血清学检测方法，可以检测血清和组织液，尤其是低致病力和非致死性毒株感染的猪能产生高水平的抗体，因此对诊断亚急性和慢性非洲猪瘟应用检测具有重要意义。因此，开发灵敏、特异且具有经济成本效益的血清学检测方法对于实现ASF准确的诊断和监测至关重要。

当前使用的商业化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒多基于单个包被蛋白如p72、p54、p30和pp62等，分别可在不同的流行病学情况下使用，但是由于ASFV生物学特性复杂，不同蛋白在病毒感染进程的不同阶段中表达，相应抗体的产生量、产生时间不尽相同，不同蛋白检测方法在临床应用中存在一定的性能差异，可能会出现较低的诊断敏感性，呈现假阴性结果。ASFV多种抗原的组合使用的检测方式，会提升抗体检测的敏感性，但是，整段蛋白表达难度较高且易有非特异性识别，且单个蛋白的表达质量和混合抗原的组成比例均会影响抗体检测的敏感性。抗原表位可作为开发ASF抗体检测方法的靶标抗原，抗原表位具有较高的特异性和敏感性，利用ASFV多个抗原表位构建的多表位重组蛋白，分子量相对低，理论上可以在降低多蛋白生产成本的同时具备混合抗原检测敏感性高的特点，可作为ASFELISA抗体检测方法的包被抗原。

ELISA检测方法构建成功的关键是具有高抗原特性、与抗体结合更敏感更特异的抗原靶点，ASFV蛋白p30、p54、p72和pA104R蛋白均具有高度抗原性，常被用作包被抗原。p30蛋白，由CP204L基因编码，位于病毒内膜中，分子量为30kDa。p30蛋白在感染后2-4小时内表达，是病毒早期诊断的重要靶点。由E183L基因编码的p54蛋白能够诱导强大的免疫应答也常用作检测抗原，p54蛋白抗体最早在感染后8天出现，基于p54蛋白的ELISA抗体检测方法具有较高的灵敏度、特异性和稳定性。p72蛋白是ASFV的衣壳抗原，具有很强的免疫原性，主要产生于病毒感染的后期，且在各毒株之间高度保守，通用于开发ASF血清学诊断方法。pA104R蛋白是一种高度保守的类组蛋白样蛋白，表达于病毒中晚期，参与病毒的复制、转录和基因组的包装，具有较强的抗原性，可作为良好的IgG和IgM抗体反应性的靶标。因此本发明选择p30、p54、p72和pA104R蛋白作为靶标蛋白。

为获得更加准确的ASF血清学检测结果，本发明选择了p30、p54、p72、pA104R蛋白的抗原表位，构建并表达纯化了ASFV多表位重组蛋白，建立了间接ELISA检测方法，以期获得具有更高的敏感性和特异性的ELISA检测方法，可更好地应用于ASF的检测与防控。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的非洲猪瘟病毒多表位重组蛋白(ASFVMEA)，该蛋白由非洲猪瘟病毒的p30蛋白、p54蛋白、p72蛋白和pA104R蛋白的优势抗原表位构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA在制备非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA的获得：

通过IEBD、SVMTriP和BepiPred 1.0Server对ASFV SY-18毒株(GenBank登录号：MH766894.2)的p30、p54、p72蛋白的细胞表位进行预测分析，筛选出不同的抗原表位，将上述细胞表位进行多肽合成，然后与ASFV阳性血清进行筛选，同时设立阳性和阴性对照，按照ELISA结果最终一共筛选出15条细胞表位。组合并调整不同p30蛋白、p54蛋白、p72蛋白、pA104R蛋白表位连接顺序，同时使用GGGS和/或KK作为Linker，以优化并筛选重组蛋白的最佳构建策略，最终获得了非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA的原核表达方法，包括下述步骤：将SEQ IDNO.3所示DNA片段连接至pET-30a(+)载体上，构建得到重组质粒pET-30a(+)-ASFVMEA，将测序正确的重组质粒pET-30a(+)-ASFVMEA转化到大肠杆菌BL-21(DE3)中，进行诱导表达，即得目的蛋白。

本发明的保护范围还包括：

上述非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA在制备非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中的应用。

以上所述的应用，所述的具体的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒为间接ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒中，重组蛋白ASFVMEA包被量为200ng/孔、包被液为PBS(pH7.4，0.01mol/L)、包被时间为37℃1h、封闭液为5％脱脂乳、封闭时间为37℃2h、血清稀释比例为1:200、血清孵育时间为37℃1.5h、酶标抗体稀释比例为1:10000、酶标抗体孵育时间为37℃1.5h、TMB显色时间为37℃15min。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明筛选并验证的抗原表位分别分布于蛋白的不同区域，能有效检测针对同一蛋白不同表位的抗体，具有较强的广谱性，有助于降低实际临床样品检测中假阴性的样本比例。

2、本发明尝试了多种多表位串联蛋白的构建策略，从中筛选出了一种蛋白表达效果最优、蛋白纯度相对最高、蛋白表面抗原暴露最充分且能够同时被相应蛋白抗体和ASFV感染血清所特异性识别的构建策略，所构建的多表位抗原有优异的抗原性、特异性和灵敏性，能够更好的与抗体结合，提升ASFV的抗体检测敏感性。

3、本发明选择了非洲猪瘟p30蛋白、p54蛋白、p72蛋白和pA104R蛋白的优势抗原表位，可同时检测四种针对不同感染时期蛋白的抗体，对比市面上单一抗原包被的ASFVELISA抗体检测试剂盒，具有更广泛的检测范围和更高的检测敏感性。

4、本发明所构建的间接ELISA检测方法能够于快速准确检测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体，多靶标检测抗原可以提高检测准确性，对临床非洲猪瘟的防控具有重要作用。。

附图说明

图1为非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA的串联构建策略。

图2为非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA的蛋白纯化图。

图3为非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA的纯化后的SDS-PAGE电泳结果图。

图4为非洲猪瘟表位重组蛋白ASFVMEA的Western-blot图。

图5为非洲猪瘟表位重组蛋白ASFVMEA的间接免疫荧光图。

图6为间接ELISA抗原最佳包被液图。

图7为间接ELISA抗原最佳包被时间图。

图8为间接ELISA最佳封闭液图。

图9为间接ELISA最佳封闭时间图。

图10为间接ELISA最佳一抗孵育时间图。

图11为间接ELISA最佳酶标二抗稀释比例图。

图12为间接ELISA最佳酶标二抗孵育时间图。

图13为间接ELISA最佳TMB显色时间图。

图14为间接ELISA临界值图。

图15为间接ELISA最大检测稀释倍数图。

图16为间接ELISA特异性检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：

抗原表位的筛选及多表位重组蛋白的构建

1、抗原表位的确定

通过IEBD、SVMTriP和BepiPred 1.0Server对ASFV SY-18毒株(GenBank登录号：MH766894.2)的p30、p54、p72蛋白的细胞表位进行预测分析，筛选出不同的抗原表位，将上述细胞表位进行多肽合成，然后与ASFV阳性血清进行筛选，同时设立阳性和阴性对照，按照ELISA结果最终一共筛选出15条细胞表位。

2、ASFV蛋白表位筛选结果

包括p30蛋白的4个细胞表位，p54蛋白的4个细胞表位，p72蛋白的6个细胞表位，及本发明申请人前期发现的pA104R蛋白优势抗原表位(CN202211323152.6)，筛选结果如表1所示。

表1ASFV蛋白表位筛选结果

3、多表位重组蛋白的串联构建策略的优化

将所筛选的p30蛋白的4个细胞表位、p54蛋白的4个细胞表位、p72蛋白的6个细胞表位、pA104R蛋白的1个细胞表位进行串联组合，构建ASFV多表位重组蛋白。

组合并调整不同p30蛋白、p54蛋白、p72蛋白、pA104R蛋白表位连接顺序，同时使用GGGS和/或KK作为Linker，以优化并筛选重组蛋白的最佳构建策略。经比较发现以图1策略构建并表达的重组蛋白纯度高、特异性佳、灵敏度好、能同时识别独立蛋白的抗体和ASFV阳性血清，各个表位之间能够充分暴露并发挥作用，互不干扰，故选择此方式构建多表位重组蛋白，并命名为ASFVMEA。而其他不同构建策略分别存在出以下问题：重组蛋白难以高效表达、难以进行有效纯化、抗原特异性差建立iELISA方法Cut-off值高、所构建蛋白难以充分暴露全部抗原表位与抗体有效结合、敏感性差对ASFV阳性或阴性血清区分度不显著等。

实施例2：

ASFVMEA蛋白的原核表达与验证

1、ASFVMEA基因的优化

所串联构建的ASFVMEA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其对应的核苷酸序列SEQ ID NO.2所示，根据原核表达的大肠杆菌菌株BL-21(DE3)的密码子偏好性，由南京金斯瑞生物科技有限公司进行密码子优化，并在优化后的基因的5’端添加了BamH I酶切位点(5’G^GATCC 3’)，3’端添加Hind III酶切位点(5’A^AGCTT 3’)所对应的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，并由南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成。

2、重组蛋白ASFVMEA的诱导表达

以合成的重组蛋白的基因作为模板，扩增编码重组蛋白ASFVMEA的DNA序列片段，同时将pET-30a(+)质粒用BamH I酶和Hind III酶进行双酶切，用同源重组的方式将扩增的DNA片段连接至pET-30a(+)载体上，构建得到重组质粒pET-30a(+)-ASFVMEA，转化到大肠杆菌DH5α中，挑选单克隆并用通用引物扩增鉴定，从中选取鉴定正确的菌落送北京擎科生物科技股份有限公司进行测序，测序结果表明编码蛋白的核苷酸序列成功连入pET-30a(+)载体，重组质粒成功构建。

将序列正确的重组质粒pET-30a(+)-ASFVMEA转化到大肠杆菌BL-21(DE3)中，得到重组大肠杆菌pET-30a(+)-ASFVMEA/BL-21(DE3)。将重组大肠杆菌pET-30a(+)-ASFVMEA/BL-21(DE3)用0.6mmol/L的IPTG分别在37℃4h、30℃6h和16℃24h的条件下进行诱导表达，在诱导前和诱导后分别收集菌液，将菌液分别取1ml，12000r/min离心1min，弃上清加入100uL PBS重悬，使用超声波细胞破碎仪进行破碎(总破碎时长2min，破碎5sec，暂停10sec，功率25％)，破碎完成后将样品12000r/min离心10min，将上清转移至新的1.5mL EP管中，沉淀使用80uL PBS充分重悬。分别取出40uL诱导前的菌液、诱导后的全菌、各个诱导条件下的上清、重悬后的沉淀，加入10uL 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，涡旋混匀后100℃加热10min，然后冰浴10min，12000r/min离心1min，，取上清进行SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色，在约50kDa的位置上出现表达条带，条带大小与预期相符合，而未诱导菌液的泳道未出现该条带，说明目的蛋白经过诱导后成功表达。

3、重组蛋白ASFVMEA的纯化及Western blot鉴定

挑取含有pET-30a(+)-ASFVMEA原核表达质粒的BL-21(DE3)单菌落于15mL LB液体培养基中(含有100ug/mL氨苄青霉素)中，置于37℃，200r/min摇床培养16h。按照1:100的比例将活化后的菌液转接至1L LB液体培养基(含有100ug/mL氨苄青霉素)中，置于37℃，200r/min摇床培养至OD₆₀₀值达到0.6。加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG置于37℃，200r/min摇床培养4h。将菌液4℃、8000r/min离心10min集菌，加入100mL PBS将菌体重悬后4℃、8000r/min离心10min，重复洗涤菌体3次，用100mL Buffer A(Tris-base 50mM，EDTA0.5mM，NaCl 50mM，甘油5％，DTT 0.05mM)重悬菌体，压力破碎30min。将破碎后的菌液4℃、8000r/min离心15min，弃上清，用PBS(含有20mmol/L尿素，1/1000Triton X-100，pH7.4)充分重悬，4℃、8000r/min离心15min，重复洗涤3次，离心收集沉淀。用100mL缓冲液(8mol/L尿素，20mmol/L NaH₂PO₄，0.5mol/L NaCl，pH8.0)重悬沉淀，4℃放置16h，使其溶解至清亮，4℃、8000r/min离心15min，取上清，并用0.45um滤器过滤，使用镍离子亲和层析的方式对蛋白进行亲和纯化，纯化过程如图2所示。将纯化后的蛋装入透析袋中，用PBS(pH8.0)4℃透析3天，每隔6h更换一次透析液。取少量所纯化后的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色分析纯度，结果如图3所示，纯化的蛋白无明显杂带，条带单一，纯度较高，并用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度为1074.5ng/uL。

将所纯化的蛋白进行Western blot检测。SDS-PAGE凝胶电泳结束之后将凝胶取出利用湿转印仪在低温条件下转印到甲醇激活的PVDF膜上(350mA恒定电流转印，转膜时间60min)。转膜结束之后，将PVDF膜在TBST(NaCl 8.8g，Tris-base1.21g，Tween-200.05％，ddH₂O定容至1L，pH调至8.0)中洗涤1-2次，转移至封闭液(TBST配置的5％的BSA)中，置于摇床室温缓慢封闭2h。封闭结束之后加入封闭液稀释的对应的一抗(His-tag(Abmart，His-Tag(10E2)mAb，M30111S)、p30蛋白抗体(Full article:Brincidofovir is arobustreplication inhibitor against African swine fever virus in vivo and in vitro(tandfonline.com))、p54蛋白抗体(Full article:Brincidofovir is a robustreplication inhibitor against African swine fever virus in vivo and in vitro(tandfonline.com))、p72蛋白抗体(Full article:Brincidofovir is a robustreplication inhibitor against African swine fever virus in vivo and in vitro(tandfonline.com))、pA104R蛋白抗体(CN202211323152.6)和非洲猪瘟病毒阳性血清(临床ASFV阳性猪血清)，置于摇床缓慢摇动，4℃孵育16h。一抗孵育完成之后用TBST洗5遍，每次10min。加入用封闭液稀释的相应的二抗，置于摇床上室温孵育2h。二抗孵育完成之后用TBST洗5遍，每次10min。随后使用化学发光底物Clarity Western ECL Substrate进行避光显色和图像收集。

结果如图4所示，His-tag抗体(使用的pET-30a(+)载体本身带有his标签)、p30蛋白抗体、p54蛋白抗体、p72蛋白抗体、pA104R蛋白抗体及ASFV阳性血清均能检测到纯化的ASFVMEA蛋白，表明目的蛋白正确表达且所表达的ASFVMEA蛋白具有良好的反应原性。

4、重组蛋白ASFVMEA的间接免疫荧光试验

Western blot试验中与抗体结合的重组蛋白ASFVMEA是经变性的蛋白，蛋白折叠的空间结构经变性打开，各种抗原表位得到充分暴露，容易被各种抗体所识别。而ELISA包被抗原应用的是非变性的蛋白，为验证ASFV感染血清对于非变性的天然结构的蛋白的识别能力，采用间接免疫荧光的方式，用三种不同的阳性血清对PK-15细胞中过表达的ASFVMEA蛋白进行了间接免疫荧光试验以分析其识别情况。

以合成的重组蛋白的基因作为模板，扩增编码重组蛋白ASFVMEA的DNA序列片段，同时将pcDNA3.1(+)-C-HA质粒用Hind III酶和EcoR I酶进行双酶切，用同源重组的方式将扩增的DNA片段连接至pcDNA3.1(+)-C-HA载体上，构建得到重组质粒pcDNA3.1(+)-C-HA-ASFVMEA，转化到大肠杆菌DH5α中，挑选单克隆并用通用引物扩增鉴定，从中选取鉴定正确的菌落送北京擎科生物科技股份有限公司进行测序，测序结果表明编码蛋白的核苷酸序列成功连入pcDNA3.1(+)-C-HA载体，重组质粒成功构建，用Omega Bio-tek公司去内毒素小量提取试剂盒(Endo-free Plasmid Mini Kit)提取重组质粒。

将PK-15细胞接种于6孔板中，置于37℃5％CO₂细胞培养箱中培养过夜，待细胞汇合率达到80％时准备转染，将200uL的jetPRIME Buffer加入1.5mL无菌离心管中，每孔加入2ug pcDNA3.1(+)-C-HA-ASFVMEA质粒，涡旋混匀10sec后短暂离心。按照质粒：jetPRIMEBuffer转染试剂1ug:2uL的比例加入转染试剂，涡旋混匀1sec后短暂离心，室温静置10min。然后将混合物逐滴加入6孔板中，放回培养箱中继续培养24h。吸弃6孔板中的细胞培养液，将细胞用PBS轻柔漂洗3次，然后加入1mL 4％多聚甲醛室温固定20min，吸弃固定液，PBS洗涤3次。

加入1mL含有1％ Triton X-100的PBS溶液，室温通透20min，PBS洗涤3次。加入1mL封闭液(PBS配置的5％BSA)，37℃封闭1h。吸弃封闭液，加入200uL用封闭液1:200稀释的不同的阳性血清(即临床感染ASFV的猪的阳性血清，在本实施例中，一共采样了3头感染ASFV的猪的阳性血清)，置于37℃孵育1h。孵育完成后加入1mL PBS，置于摇床上洗涤3次，每次5min。加入200uL用封闭液稀释的兔抗猪荧光二抗，置于37℃避光孵育1h，孵育完成后加入1mL PBS，置于摇床上洗涤3次，每次5min。加入200uL DAPI染色液进行细胞核染色，置于室温避光孵育5min，孵育完成后加入1mL PBS，置于摇床上洗涤3次，每次5min。加入适量抗荧光淬灭封片液进行封片处理，随后使用荧光倒置显微镜进行观察与图像采集。

实验结果如图5所示，三份不同的阳性血清均能识别PK-15细胞中过表达的ASFVMEA蛋白，证实了重组蛋白ASFVMEA可以用于检测ASFV感染后产生的抗体，有利于间接ELSIA检测方法的建立，有利于临床样品的抗体检测。

实施例3：

非洲猪瘟多表位重组蛋白间接ELISA检测方法的建立与优化

1、最佳包被浓度及血清最佳稀释度的确定

1)包被抗原：采用方阵滴定的方法，将重组ASFVMEA蛋白用包被液CBS(1.59gNa₂CO₃和2.93g NaHCO₃加ddH₂O定容至1L，pH9.6的0.1mol/L的碳酸盐缓冲液)进行倍比稀释，抗原浓度分别为6.25ng/孔、12.5ng/孔、25ng/孔、50ng/孔、100ng/孔、200ng/孔、400ng/孔、800ng/孔，100uL/孔，每个浓度包被一行，共包被8个浓度，4℃包被酶标板16h，取出用PBST(8.0g NaCl、0.2g KCl、2.86g Na₂HPO4·12H2O、0.27g KH₂PO4和0.5mL吐温-20加ddH₂O定容至1L)洗涤5次，200uL/孔；

2)封闭：每孔加入200uL封闭液(5％脱脂乳的PBST)，37℃封闭2h，PBST洗涤5次；

3)加入稀释后的血清：将ASFV阳性血清和阴性血清分别用封闭液在酶标板进行横向倍比稀释，稀释比例分别为1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400，每个稀释度纵向做8个重复，100uL/孔，37℃反应2h，PBST洗涤5次；所述的阳性血清为临床感染ASFV的猪的阳性血清；

4)加酶标二抗：加入用封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG(IgG-HRP)抗体，稀释比例为1:8000，100uL/孔，37℃反应2h，PBST洗涤5次；

5)TMB显色：加入恢复至室温的TMB显色液，100uL/孔，37℃反应15min；

6)检测OD₆₃₀值：用酶标仪在630nm波长下分别测定ASFV阳性血清和阴性血清的OD₆₃₀值，并计算其对应的P/N值。以阳性血清OD₆₃₀值(P)接近于1，而对应的阴性血清OD₆₃₀值(N)基本不变且P/N值相对最大所对应的抗原浓度及血清稀释度作为抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度。

方阵滴定试验结果如表2所示，抗原包被量在200ng/孔，血清稀释度为1:200时，阳性血清OD630值(P)和阴性血清OD630值(N)的比值P/N值最大，为17.43，故选择抗原包被量200ng/孔和血清稀释度为1:200作为抗原最佳包被量和血清最佳稀释度。

表2不同包被浓度和血清稀释浓度下的OD₆₃₀值变化

2、最佳包被液的确定

分别用碳酸盐缓冲液CBS(1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃加ddH₂O定容至1L，pH9.6)、磷酸盐缓冲液PBS(8.0g NaCl、0.2gKCl、2.86g Na₂HPO₄·12H₂O和0.27g KH₂PO4中加ddH₂O定容至1L，pH7.4，0.01mol/L)、Tris-HCl缓冲液(由12.11g Tris中加入约80mLddH₂O，溶解后加入浓HCl调节pH值到8.0，定容至100mL，配制1mol/L Tris-HCl。取1mL1mol/L Tris-HCl加入99mL ddH₂O即为pH8.0、0.01mol/L的Tris-HCl)包被酶标板，100uL/孔，在上述最佳抗原包被量和最佳血清稀释度的条件下检测不同的包被液对ELISA检测结果的影响。每种包被液做8个重复，测定OD₆₃₀值，即阳性血清OD₆₃₀值(P)和阴性血清OD₆₃₀值(N)，计算P/N值，选择P/N值最大时的包被液作为最佳包被液。结果如图6所示，当包被液为PBS缓冲液时P/N值最高，包被效果最佳。因此，确定包被液为pH7.4、0.01mol/L的PBS缓冲液作为最佳包被液。

3、最佳包被时间的确定

用最佳包被量和最佳包被液进行ASFVMEA蛋白包被，血清稀释倍数1:200，其他条件不变，分别在37℃1h，37℃2h，37℃2h+4℃16h、4℃16h的条件下对重组蛋白进行包被，每种包被时间用ASFV阳性血清、阴性血清分别做8个重复，探索不同包被时间对于ELISA检测结果的影响。结果如图7所示，在37℃包被1h时P/N值最大，确定重组蛋白ASFVMEA的最佳包被时间为37℃1h。

4、最佳封闭液的确定

分别用5％BSA(5gBSA中加入PBST定容至100mL)、5％脱脂乳(5g脱脂乳中加入PBST定容至100mL)、5％FBS(5mL FBS中加入PBST定容至100mL)、2.5％BSA+2.5％脱脂乳(2.5gBSA和2.5g脱脂乳中加入PBST定容至100mL)，200uL/孔，进行封闭，在上述各最佳条件下检测不同的封闭液对于P值、N值、P/N值的影响，其他步骤均保持不变，每种封闭液分别用ASFV阳性血清、阴性血清分别做8个重复，测定OD₆₃₀值。不同封闭液的P值、N值、P/N值如图8所示，结果显示，当封闭液为5％脱脂乳时，P/N值处于峰值，确定最佳封闭液为5％脱脂乳。

5、最佳封闭时间的确定

在上述最佳条件下，分别设置在37℃1h，37℃2h，37℃2h+4℃16h、4℃16h的条件下进行封闭，检测不同封闭时间对P/N值的影响，每个封闭时间同时用ASFV阳性血清和阴性血清分别做8个重复，实验结果如图9所示，结果表明在37℃封闭2h和4℃封闭16h的条件下，P值都在1附近，N值都接近于0.1，且P/N值相近，考虑时间效益，选择37℃封闭2h作为最佳封闭时间。

6、血清最佳反应时间的确定

在上述最佳实验条件下，分别设置了37℃2h、1.5h、1h、0.5h四个血清反应时间，探索不同血清反应时间对P/N值的影响，其他过程均保持不变，每个血清反应时间用ASFV阳性血清和阴性血清分别做8个重复，结果如图10所示，血清孵育1.5h后，抗体与抗原结合比较充分，P/N值最大，故选择1.5h作为待检血清的最佳孵育时间。

7、酶标二抗最佳稀释比例的确定

在上述最佳条件下，分别将酶标二抗的稀释比例设置为1:5000、1:10000、1:15000和1:20000，100uL/孔，检测不同酶标二抗的稀释比例对于P/N的影响。每个稀释比例用ASFV阳性血清和阴性血清分别做8个重复，其他条件保持不变，结果如图11所示，各组别的P/N值差距均不大，由于酶标二抗的稀释比例为1:10000时阳性血清的OD₆₃₀值最接近于1，故确定最佳酶标二抗稀释比例为1:10000。

8、酶标二抗最佳反应时间的确定

将辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG(IgG-HRP)的作用时间分别设置为37℃2h、37℃1.5h、37℃1h、37℃0.5h，保持上述最佳反应条件不变，每个反应时间用ASFV阳性血清和阴性血清分别做8个重复，探索不同的酶标二抗反应时间对P/N值的影响，结果如图12所示，当酶标二抗反应时间为37℃1.5h时，P/N值最高，因此，确定最佳酶标二抗反应时间为1.5h。

9、最佳TMB显色时间的确定

在上述最佳反应条件下进行实验，在37℃条件下分别设置5min、10min、15min、20min的时间梯度，用ASFV阳性血清和阴性血清分别做8个重复，检测不同显色时间对于P/N结果的影响，试验结果如图13所示，随着显色时间的拉长，P/N值逐渐升高，考虑时间效益，确定最佳显色时间为37℃15min。

10、ASFV抗体间接ELISA检测方法：

根据以上步骤1-9的优化试验，确定优化后的非洲猪瘟病毒多表位重组蛋白间接ELISA抗体检测方法的步骤如下：

1)包被抗原：以ASFV重组多表位蛋白作为包被抗原用包被液(pH7.4，0.01mol/L的PBS)进行包被，包被量为200ng/孔，100uL/孔，37℃包被1h，PBST洗涤5次；

2)封闭：加入5％脱脂乳作为封闭液，200uL/孔，37℃反应2h，PBST洗涤5次；

3)孵育血清：加入用封闭液1:200稀释的待检血清，100uL/孔，37℃反应1.5h，PBST洗涤5次；

4)孵育酶标二抗：用封闭液1:10000稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG(IgG-HRP)，100uL/孔，37℃反应1.5h，PBST洗涤5次；

5)TMB显色：加入TMB底物显色液，50uL/孔，37℃反应15min；

6)检测OD₆₃₀值：用酶标仪在630nm波长下检测各待测阳性血清的OD₆₃₀值。

11、非洲猪瘟病毒多表位蛋白间接ELISA抗体检测方法的临界值的确定

经qRT-PCR检测筛选ASFV阴性血清样品100份，按照步骤10优化后的非洲猪瘟病毒多表位蛋白间接ELISA抗体检测方法进行检测，测定ASFV阴性血清OD₆₃₀值，同时设置ASFV阳性血清和阴性血清对照，计算平均值(X)和标准差(SD)，小于X+2SD值的判定为阴性，介于X+2SD和X+3SD值之间的判定为可疑，大于X+3SD值的判定为阳性。结果如图14所示，经计算其平均值X为0.135，标准差SD为0.060，因此判定标准为：OD₆₃₀值＞0.315判定为阳性，0.255≤OD₆₃₀值≤0.315判定为可疑，OD₆₃₀值＜0.255判定为阴性。

12、非洲猪瘟病毒多表位蛋白间接ELISA抗体检测方法的特异性和最大检测稀释倍数

用所建立并优化的非洲猪瘟病毒多表位蛋白间接ELISA抗体检测方法分别检测猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、圆环病毒病毒(PCV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、副猪格拉瑟氏病(GPS)的阳性血清进行特异性实验。检测结果如图15所示，结果表明与猪场常见猪病血清无交叉反应，表明本方法对非洲猪瘟血清抗体检测具有良好的特异性。

用所构建的ELISA方法检测从1:50倍起倍比稀释的非洲猪瘟阳性血清，确定本方法的最大检测稀释倍数，结果如图16所示，在稀释比例为1:6400时，血清OD₆₃₀值仍大于临界值0.315，判定为阳性，证实该方法的灵敏性良好。

13、非洲猪瘟病毒多表位蛋白间接ELISA抗体检测方法的重复性

批内重复性实验：从经qRT-PCR检测筛选为ASFV阳性和阴性的血清样品中随机筛选4份阳性血清和4份阴性血清样品，每份血清样品设置6个重复，用所建立的间接ELISA检测方法用同一个批次的非洲猪瘟病毒多表位蛋白包被的酶标板，分别根据每份血清的OD₆₃₀值计算平均值(X)、标准差(SD)和变异系数(CV)。结果如表3所示，检测样品的变异系数均小于10％，表明其批内重复性良好。

表3批内重复性试验

本文对于本发明的构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想，对本领域普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的情况下，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换、改变、改进，而这些均应属于本发明所附的权利要求的保护范围内。

Claims

1. 一种人工合成的非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2. 权利要求1所述的非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA的原核表达方法，包括下述步骤：将SEQ ID NO.3所示DNA片段连接至pET-30a(+)载体上，构建得到重组质粒pET-30a(+)-ASFVMEA，将测序正确的重组质粒pET-30a(+)-ASFVMEA转化到大肠杆菌BL-21(DE3)中，进行诱导表达，即得目的蛋白。

3.权利要求1所述的非洲猪瘟多表位重组蛋白ASFVMEA在制备非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，所述的试剂盒为间接ELISA抗体检测试剂盒。

5. 根据权利要求3所述的应用，所述的试剂盒的使用方式为：重组蛋白ASFVMEA包被量为200ng/孔、包被液为PBS、包被时间为37℃ 1h、封闭液为5%脱脂乳、封闭时间为37℃ 2h、血清稀释比例为1:200、血清孵育时间为37℃ 1.5h、酶标抗体稀释比例为1:10000、酶标抗体孵育时间为37℃ 1.5h、TMB显色时间为37℃ 15min。