CN112877348B - 一种非洲猪瘟病毒CD2v胞外域重组蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒CD2v胞外域重组蛋白，并进一步公开其用于构建ELISA的应用，以及其制备的用于检测非洲猪瘟病毒的ELISA检测试剂盒。本发明方案基于目前在中国流行的毒株特点，构建了原核表达的CD2v胞外域重组蛋白，所述重组蛋白具有高获得量、高纯度、良好的反应原性，可诱导机体产生中和抗体，可进一步基于该重组蛋白构建检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒，所述试剂盒具有高度特异性、敏感性和可重复性，可作为一种可靠的检测方法用于非洲猪瘟病毒抗体的监测或病毒的鉴别。

Description

一种非洲猪瘟病毒CD2v胞外域重组蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒CD2v胞外域重组蛋白，并进一步公开其用于构建ELISA的应用，以及其制备的用于检测非洲猪瘟病毒的ELISA检测试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染引起的一种高度接触性、多器官出血性烈性传染病，各年龄段家猪和野猪均易感，发病率和死亡率可高达100％。非洲猪瘟病毒为虫媒病毒，可感染多种软蜱，并通过软蜱的叮咬传播病毒，目前已成为严重影响养猪业发展的重要病原之一，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告的动物疫病。非洲猪瘟病毒首次于1921年在非洲肯尼亚被发现，随后传至周边国家和欧洲。2018年非洲猪瘟病毒首次传入我国，并迅速传遍我国各地，造成我国养猪业的重要经济损失。
非洲猪瘟病毒属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，基因组为双链DNA，大小约为170-190kbp，可编码150-200多种病毒蛋白，其中包括50多种结构蛋白，如主要衣壳蛋白p72、类CD2蛋白CD2v、跨膜蛋白p54、主要的内膜蛋白p30和两个多聚蛋白pp220和pp62。非洲猪瘟病毒根据B646L基因(编码p72蛋白)特征总分为24种基因型，同时根据EP402R基因(编码CD2v蛋白)特征分为8个血清群。据报道，我国流行毒株均为基因II型、血清群8。目前，尽管有多个研究团队通过各种技术方法进行非洲猪瘟病毒的灭活或者改变非洲猪瘟病毒的基因组构成以提高疫苗的保护效率，但是还未曾开发有效的非洲猪瘟疫苗用于非洲猪瘟的预防和控制。这主要是因为，非洲猪瘟病毒已知的基因型有24种、血清型有8种，且基因组的多样性同样大大增加了非洲猪瘟病毒疫苗研发的难度；而且，由于非洲猪瘟基因组非常大，可编码151-200多种病毒蛋白，包括50多种结构蛋白，其中大部分的蛋白功能均未知，这严重阻碍了非洲猪瘟病毒疫苗的研发。
有鉴于此，建立准确、快速的抗原和抗体检测方法对于非洲猪瘟病毒的防控至关重要。然而，OIE现有的非洲猪瘟病毒抗体检测方法是以非洲猪瘟病毒粒子为包被抗原建立的ELISA，需要在三级安全实验室中进行病毒的传代和操作活病毒，由于存在散毒的风险，这种检测方法非常不适用于临床检测。因此，许多基于灭活病毒的核酸检测方法，如实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术LAMP、重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA/RPA)和基于非洲猪瘟病毒特异性抗体的ELISA方法被建立起来。然而，PCR需要使用病毒和提取病毒的基因组，这是个耗时费力的工作，同时也存在散毒的风险，使用具有局限性。因此，使用ELISA方法监测非洲猪瘟病毒的感染和流行趋势是一种更好的选择。目前，基于包被非洲猪瘟病毒p30、p54、p72、p62蛋白的ELISA方法已被建立。其中，p30蛋白被认为是非洲猪瘟病毒早期产生的一种蛋白，在非洲猪瘟感染的晚期几乎监测不到p30蛋白，因此基于p30蛋白建立的ELISA方法可能不适用于康复带毒猪或持续感染猪非洲猪瘟病毒感染的监测。同样地，p54蛋白、p62蛋白和p72蛋白都不能在病毒感染的整个周期中存在，基于这些蛋白建立的ELISA也不能提供准确的结果。为了使检测结果更加准确可靠，就需要同时包被这些蛋白建立相应的ELISA方法。
CD2v蛋白由于与宿主T细胞和NK细胞表面的CD2蛋白相似，因此而得名。CD2v蛋白可引起红细胞的凝集，是引起宿主产生中和抗体的重要抗原蛋白，同时也是病毒逃逸宿主免疫的主要蛋白。CD2v分为信号肽区(1-15aa)、胞外域(16-201aa)、跨膜区(202-229aa)和胞内域(230-360aa)四个部分，其中胞外区是主要的抗原区。如中国专利CN110927390A报道了一种基于真核表达的CD2v全长蛋白建立的双抗夹心法ELISA，该方法利用重组pIRESpuro2真核表达载体转染至CHO-K1细胞获得CD2v全长蛋白，虽然得到的蛋白具有蛋白修饰，但是产量低、操作繁琐、纯度低，应用受限。而且，临床样品检测结果显示，包被不同的非洲猪瘟病毒蛋白建立的ELISA方法检测同一份血清样品，得到的结果会出现不一致的现象，这可能是由于不同蛋白产生的时期不同和维持时间长短不一，现有的研究未能很好的了解和掌握不同蛋白抗体产生的消长规律，因此才会出现该现象。在未来的研究中应阐明非洲猪瘟病毒各个主要的结构蛋白在猪体内抗体产生的规律，为建立准确的ELISA方法检测非洲猪瘟病毒感染提供理论基础，同时可以考虑联合多种非洲猪瘟结构蛋白建立联合包被的ELISA方法，提高检测的准确性和敏感性。本发明以CD2v胞外域蛋白建立了一种新的快速的、准确的间接ELSIA方法，可用于非洲猪瘟病毒抗体的检测和鉴别诊断。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种非洲猪瘟病毒CD2v胞外域重组蛋白，所述重组蛋白可用于非洲猪瘟病毒的ELISA检测；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供基于上述非洲猪瘟病毒CD2v胞外域重组蛋白制备的用于检测非洲猪瘟病毒的ELISA检测试剂盒；
本发明所要解决的第三个技术问题在于提供一种基于ELISA法检测非洲猪瘟病毒的方法。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种构建非洲猪瘟病毒CD2v胞外域重组蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)CD2v胞外域基因的扩增和重组质粒的构建
以ASFV-18基因组CD2v基因为模板，合成CD2v胞外域基因作为PCR扩增模板，设计如下CD2v胞外域扩增引物进行CD2v胞外域基因PCR扩增：
上游引物：
5′-TAAGAAGGAGATATACCATGGATTATTGGGTTAGTTTTAATAAAACAATAATTTTAGATAG-3′；
下游引物：
5′-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAGTATAAAAATAGTTAGATGACAATG-3′；
PCR扩增完成后，将PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带，并将回收产物以同源重组的方式连接至pET-28a(已经NcoI和XhoI限制性内切酶双酶切)质粒上，连接产物转化至BL21(DE3)感受态细胞中进行阳性克隆筛选和测序；
(2)CD2v胞外域蛋白的诱导表达、纯化和鉴定
将阳性克隆菌进行CD2v胞外域蛋白的诱导表达，收集菌体进行重悬破碎，离心收集上清和沉淀，分别进行SDS-PAGE蛋白电泳和蛋白免疫印迹技术鉴定；将鉴定正确的蛋白条带经显色及切胶，回收凝胶进行纯化，鉴定，即得。
具体的，所述步骤(1)中，所述PCR扩增体系包括：
2×Platinum SuperFi II Green buffer 12.5μL；
5×GC buffer 5μL；
上游引物和下游引物各1μL；
模板2.5μL；
ddH2O 3μL；
反应总体系为25μL。
具体的，所述步骤(1)中，所述PCR扩增程序为：98℃ 30s，98℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共计35个循环；72℃ 5min，4℃保持。
具体的，所述步骤(2)中，所述阳性克隆菌的CD2v胞外域蛋白诱导表达步骤包括：待菌液OD600nm在0.6-0.8时，加入终浓度为500μM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，于37℃摇床180rpm诱导8h。
本发明还公开了由所述方法构建的非洲猪瘟病毒CD2v胞外域重组蛋白。
本发明还公开了一种检测或鉴别非洲猪瘟病毒抗体的间接ELASA试剂盒，包括由所述非洲猪瘟病毒CD2v胞外域重组蛋白作为包被抗原包被的酶标板，以及，洗脱缓冲液、抗体稀释液、二抗、阳性对照、阴性对照、显示液和终止液。
具体的，所述酶标板的包被步骤包括：将切胶纯化后的所述重组蛋白以50mmol/L、PH 9.6的碳酸盐缓冲液为抗原包被液，经稀释至2μg/mL进行抗原包被，控制ELISA板每孔100μL，放置4℃孵育12h；随后取出已包被好抗原的ELISA板，弃掉液体并用PBS洗涤，然后每孔加入200μL用PH 7.4的PBS缓冲液新鲜配制的5％脱脂乳，37℃封闭2h；封闭完成后，弃去封闭液并用PBS洗涤，即可。
具体的，所述的间接ELASA试剂盒：
所述洗脱缓冲液为含0.1％的吐温-20的PBS溶液；
所述抗体稀释液为PH 7.4的PBS缓冲液；
所述二抗为HRP标记的兔抗猪二抗；
所述阳性对照为非洲猪瘟病毒抗体阳性的标准猪血清；
所述阴性对照为非洲猪瘟病毒抗体阴性的标准猪血清；
所述显色液为TMB显色液；
所述终止液为2mol/L H2SO4。
本发明还公开了一种所述检测或鉴别非洲猪瘟病毒抗体的间接ELASA试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)取所述酶标板，每孔加入以所述抗体缓冲液按照1：100的比例稀释的临床血清样本100μL，同时设置按照同样方式稀释的所述阳性对照和阴性对照，并于37℃孵育1h；
(2)孵育完成后，弃掉液体，用所述洗脱缓冲液进行洗涤，然后每孔加入以所述抗体缓冲液按照1：4000的比例稀释的所述二抗100μL，于37℃孵育1h；
(3)二抗孵育完成后，弃掉液体，用所述洗脱缓冲液进行洗涤，然后每孔加入所述显色液100μL，常温避光显色10min；并在显色完成后，每孔加入所述终止液50μL以终止反应；
(4)反应完成后，将ELISA板放置于全波段酶标仪中，选择波长为OD450nm的波段进行读数，记录数据，并根据读数结果进行样品阴阳性判定。
本发明还公开了所述间接ELASA试剂盒在检测或鉴别非洲猪瘟病毒抗体领域中的应用。
本发明方案基于目前在中国流行的毒株均为基因II型和血清群8群，且在EP402R基因区域具有高度保守性的特点，试图建立了基于CD2v胞外域蛋白的间接ELISA方法。本发明方案利用大肠杆菌原核表达系统表达非洲猪瘟病毒CD2v胞外域蛋白，通过人工合成非洲猪瘟病毒ASFV SY-18基因组CD2v胞外域基因(49-603nt)，经同源重组的方式连接至原核表达载体pET-28a(+)上。重组载体转化至BL21(DE3)中进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和WB验证正确后切胶纯化，将纯化后的蛋白进行抗原包被。由于所述原核表达的CD2v胞外域蛋白具有高获得量、高纯度、良好的反应原性，可诱导机体产生中和抗体，因此本研究建立的ELISA方法可有效监测病毒的免疫逃逸。尽管原核表达得到的蛋白破坏了蛋白原有的天然构象和缺少各种蛋白修饰，如糖基化修饰、乙酰化修饰，但是原核表达的蛋白具有表达量高、易操作、纯度好的优点，且本研究得到的CD2v胞外域蛋白具有良好的反应性，基于该蛋白建立的间接ELISA方法具有高度特异性、敏感性和可重复性，可作为一种可靠的检测方法用于非洲猪瘟病毒抗体的监测。
本发明所述快速、特异、敏感的间接ELISA试剂盒，可用于非洲猪瘟病毒抗体的检测和CD2v缺失疫苗株的鉴别诊断。所述试剂盒采用棋盘法的方式确定最佳抗原包被浓度和待测血清样品的稀释度并确定其他ELISA反应条件，如最佳封闭液、最佳二抗稀释度和最佳反应时间，进一步优化了试剂盒的检测条件。
本发明所述试剂盒，进一步使用170份ASFV抗体阴性血清进行ELISA临界值的测定，并在初步确定临界值的情况下，用30份非洲猪瘟病毒抗体水平不一的已知阴阳性的临床血清进行ELISA OD值的确定，同时根据IFA结果进行验证，从而根据结果进行ELISA临界值的调整，将临界值设定为平均OD值+3SD，降低了假阳性率，临界值的设定更为准确和科学。
本发明所述间接ELISA试剂盒，将建立好的ELISA试剂盒用于临床470份样品的检测，临床样品检测结果与IFA检测结果和商品化检测试剂盒检测结果基本一致，结果表明，本研究建立的间接ELISA试剂盒可用于临床样品的检测。本发明所述试剂盒为非洲猪瘟病毒抗体的检测提供了一种新的间接ELISA检测方法，同时，由于目前CD2v基因缺失苗的开发利用，该ELISA试剂盒也可作为鉴别诊断，区分疫苗毒感染或野毒感染，为临床生产做进一步参考。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为CD2v胞外域基因扩增和蛋白的诱导表达、纯化和鉴定结果；其中，
图1中A为CD2v胞外域基因扩增结果；M：DNA marker DL2000，泳道1：水对照；泳道2：CD2v胞外域基因扩增产物，大小约为555bp，符合预期条带大小；
图1中B为CD2v胞外域蛋白经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色结果；M：蛋白marker，泳道1：CD2v胞外域蛋白切胶纯化后染色结果，条带单一，获得量大，泳道2：CD2v胞外域蛋白未纯化染色结果，目的条带明显；
图1中C为纯化后的CD2v胞外域蛋白WB验证结果；
图2为基于CD2v胞外域蛋白的间接ELISA临界值、特异性和敏感性的测定结果；其中，图2中A为ELISA临界值的确定结果，图2中B为IFA验证样品的阴阳性结果，图2中C为ELISA特异性试验结果，图2中D为ELISA敏感性试验结果。
具体实施方式
本发明下述实施例中涉及的材料包括：
细胞和毒株：猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)采集自38日龄的SPF猪肺脏，由本实验室保存；ASFV毒株由华南农业大学兽医学院张桂红教授实验室分离并保存；
载体、菌株和血清样品：原核表达载体pET-28a(+)由本实验室保存；BL21(DE3)感受态购自北京全式金生物技术有限公司；ASFV标准阳性血清、标准阴性血清、SPF猪血清和临床血清样品均由华南农业大学兽医学院张桂红教授实验室收集和保存；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体阳性血清、猪圆环病毒2型(PCV2)抗体阳性血清、经典猪瘟病毒(CSFV)抗体阳性血清、猪伪狂犬病病毒(PRV)抗体阳性血清、大肠杆菌(E.Coli)抗体阳性血清由本实验室保存。
实施例1 CD2v胞外域基因的扩增和重组质粒的构建
以GenBank中公布的ASFV SY-18基因组CD2v基因为模板，由北京擎科生物技术有限公司合成CD2v胞外域基因作为PCR扩增模板，设计CD2v胞外域扩增引物如下，用于扩增CD2v胞外域基因：
上游引物：
5′-TAAGAAGGAGATATACCATGGATTATTGGGTTAGTTTTAATAAAACAATAATTTTAGATAG-3′；
下游引物：
5′-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAGTATAAAAATAGTTAGATGACAATG-3′。
采用Thermo Fisher Scientific公司的Platinum SuperFi II Green PCRmaster mix进行PCR扩增，扩增体系包括：
2×Platinum SuperFi II Green buffer 12.5μL；
5×GC buffer 5μL；
上游引物和下游引物各1μL；
模板2.5μL；
ddH2O 3μL；
反应总体系为25μL。
PCR扩增具体程序为：98℃ 30s；98℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃5min，4℃保持。
PCR扩增完成后将PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带，使用Omega公司的E.N.Z.A Gel Extraction kit进行胶回收纯化并测定回收产物浓度。
根据南京诺唯赞生物技术有限公司的同源重组试剂盒Vazyme ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit的使用说明将回收产物以同源重组的方式连接至pET-28a(已经NcoI和XhoI限制性内切酶双酶切)上，连接产物转化至BL21(DE3)感受态细胞中进行阳性克隆筛选和测序。
实施例2CD2v胞外域蛋白的诱导表达、纯化和鉴定
将测序正确的阳性克隆菌进行CD2v胞外域蛋白的诱导表达，待菌液OD600nm在0.6-0.8之间时加入终浓度为500μM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃摇床180rpm诱导8h，收集菌体，加入无菌PBS重悬菌体，进行超声破碎，超声参数为：功率30W；发射5s，间歇5s。超声完成后，12000rpm、4℃离心20min，收集上清和沉淀，分别加入5×蛋白上样缓冲液进行SDS-PAGE蛋白电泳和蛋白免疫印迹技术(Western Blot，WB)鉴定。将鉴定正确的蛋白条带经0.3M的KCl显色5min后进行切胶，回收凝胶经3500D的透析袋电泳和10kD的超滤管浓缩进行纯化，测定纯化后的蛋白浓度并再次经WB进行鉴定，结果见表1。
以合成的ASFV SY-18CD2v基因为模板，通过特异性引物进行PCR扩增，PCR产物经核酸电泳后出现一条单一的、大小符合预期的条带(555bp)，如图1中A所示。将回收纯化后的基因片段连接至pET-28a(+)原核表达质粒上获得重组阳性菌，经IPTG诱导后收集菌体，并于超声破碎仪中超声破碎，获得上清和沉淀，分别将上清和沉淀与5x上样缓冲液充分混合后进行SDS-PAGE和WB试验，试验结果显示蛋白胶中经考马斯亮蓝染色后出现目的蛋白条带，如图1中B所示，WB结果出现单一的、符合预期的目的条带，如图1中C所示。图1中结果表明，CD2v胞外域蛋白表达成功，表达量大，易获得，且具有良好的反应原性。将目的蛋白切胶回收后，使用透析袋和超滤管进行蛋白的浓缩，结果显示，CD2v可以特异性结合临床血清中ASFV的抗体，条带单一，特异性强，反应性好。
实施例3包被CD2v胞外域蛋白的间接ELISA的条件优化
将实施例2中纯化后的CD2v胞外域蛋白进行ELISA包被，以棋盘法的方式进行最佳抗原包被浓度和最佳临床待测样本(本实施例中，以非洲猪瘟病毒抗体阳性的标准猪血清代替临床血清样本)稀释度的测定。
分别控制抗原浓度梯度为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL；临床血清样本的稀释度梯度为1：50、1：100、1：200、1：400。以阳性样品OD450nm值与阴性样品OD450nm值比值最大且阳性样品OD值接近于1时的抗原包被浓度和临床血清样本稀释度为最佳抗原包被浓度和最佳临床血清样本稀释度，结果如表1所示。
表1以棋盘法的方式确定最佳包被浓度和临床血清样本最佳稀释度
Figure BDA0002889918260000111
由表1中结果可见，以棋盘法的方式确定CD2v胞外域蛋白的最佳包被浓度为2μg/mL，待测临床血清样本的最佳稀释浓度为1：100。
在确定的抗原包被浓度和临床血清样本稀释度下，按照同样的方法进行ELISA其他条件的优化，包括最佳封闭液、最佳二抗稀释度、最佳临床血清样本和二抗反应时间。结果显示，最佳封闭液为5％的脱脂乳、最佳二抗稀释度为1：4000、最佳临床血清样本和二抗的孵育反应时间均为1h。实施例4ELSIA临界值、特异性、敏感性和重复性的测定
取270份ASFV抗体阴性血清(其中，90份来自于SPF猪血清，180份来自临床血清)用于ELISA临界值的确定。根据测定的OD450nm值计算出平均值(X)和标准差(SD)，以X+3SD初步确定临界值，同时以IFA结果和30份已经阴阳性的血清OD450nm值进行临界值的调整。
利用前述建立的ELISA方法的各参数测定PRRSV抗体阳性血清、PCV2抗体阳性血清、CSFV抗体阳性血清、PRV抗体阳性血清、E.Coli抗体阳性血清和ASFV抗体阳性血清的OD450nm值，并测定该ELISA方法的特异性。
将ASFV阳性标准血清(OD450nm值＝1.57)和ASFV阴性标准血清(OD450nm值＝0.098)从1：50开始以2倍梯度稀释法进行梯度稀释后进行OD450nm值测定，确定该ELISA方法的敏感性，以标准阳性样品OD450nm值大于临界值且标准阴性血清OD450nm值小于0.1的最大稀释度为该ELISA方法的敏感性。选取157份具有不同非洲猪瘟病毒抗体水平的血清样品用于该ELISA方法重复性的测定。对于批间试验，在3个不同时间点对157份血清样品进行OD450nm值测定，一个样品在一个时间点设置3个重复，计算相应的变异系数。对于批内试验，同一时间点对157份血清样品进行3次OD450nm值测定，一个样品每次测三个重复，计算变异系数。变异系数计算公式为标准方差(SD)除以平均值(X)。当变异系数小于10％时表明重复性良好。具体测定结果见图2所示。
如图2中A所示，用前述确定的ELISA方法测定270份猪阴性血清ASFV抗体OD450nm值，计算得到阴性血清平均OD450nm值为0.144，标准差为0.04，按照临界值的计算公式计算得到临界值(平均OD值+3SD)为0.264，用30份已知ASFV抗体阴阳性的血清(结合IFA结果确定)对该临界值进行调整，结果将临界值调整为0.30(平均值X+4SD)，即样品OD值大于0.3判定为ASFV抗体阳性，样品OD值小于0.3但大于0.2判定为ASFV抗体可疑，样品OD值小于或等于0.2判定ASFV抗体阴性。
如图2中B所示结果，血清中ASFV抗体阴阳性经IFA确定的结果，阳性血清样品出现明显的荧光，阴性血清样品则无荧光出现。
如图2中C所示结果，利用该ELISA方法测定其他几种猪重要病原的抗体阳性血清的结果分别为0.133(PRRSV)、0.078(PCV2)、0.203(CSFV)、0.115(PRV)、0.094(E.Coli)，结果表明CD2v胞外域蛋白与其他几种重要的猪病原体抗体阳性血清无交叉反应，表明本方案ELISA方法的特异性高。
如图2中D所示结果，敏感性试验结果显示该ELISA方法的敏感性为1：1600，表明该ELISA方法具有高度敏感性，适用于微量的ASFV抗体检测。
此外，重复性试验结果显示批间试验的变异系数CV值在2.2-3.4％之间，平均值为2.9％；批内试验的变异系数CV值在2.7-3.3％之间，平均值为3.1％。结果显示，本发明建立的ELISA方法具有良好的重复性，测定结果稳定。实施例5ELISA试剂盒的制备
经前述参数的建立，本实施例所述检测或鉴别非洲猪瘟病毒抗体的间接ELASA试剂盒，包括：
酶标板：所述酶标板由所述非洲猪瘟病毒CD2v胞外域重组蛋白作为包被抗原进行包被，具体的包被过程为：将切胶纯化后的重组蛋白用抗原包被液(50mmol/L PH 9.6的碳酸盐缓冲液)稀释成2μg/mL进行抗原包被，ELISA板每孔加100μL，放置4℃孵育12h；取出已包被好抗原的ELISA板，弃掉液体，用PBS洗涤三次，每次洗涤5min，最后一次弃掉液体后，在吸水纸上轻拍以除去孔中残留液体；洗涤完成后，每孔加入200μL用PH7.4的PBS缓冲液新鲜配制的5％脱脂乳(封闭液)，于37℃进行封闭2h；封闭完成后，弃去封闭液，用PBS洗涤三次，每次洗涤5min，最后一次弃掉液体后，在吸水纸上轻拍以除去孔中残留液体，即可；
洗脱缓冲液：含0.1％的吐温-20的PBS溶液(记为PBST溶液)；
抗体稀释液：PH 7.4的PBS缓冲液；
二抗：HRP标记的兔抗猪二抗；
阳性对照：非洲猪瘟病毒抗体阳性的标准猪血清；
阴性对照：非洲猪瘟病毒抗体阴性的标准猪血清；
显色液：TMB显色液；
终止液：2mol/L H2SO4。
本实施例所述检测或鉴别非洲猪瘟病毒抗体的间接ELASA试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)取所述酶标板，每孔加入以所述抗体稀释液按照1：100的比例进行稀释的临床血清样本100μL，同时设置阳性对照和阴性对照，阳性血清和阴性血清也同样以所述抗体稀释液按1：100的比例稀释，加入后于37℃进行孵育1h；
(2)在孵育完成后，弃掉液体，用洗脱缓冲液PBST洗涤三次，每次洗涤5min，最后一次弃掉液体后，在吸水纸上轻拍以除去孔中残留液体；洗涤完成后，每孔加入以所述抗体稀释液按照1：4000的比例稀释的HRP标记的兔抗猪二抗100μL，并于37℃孵育1h；
(3)二抗孵育完成后，弃掉液体，用洗脱缓冲液PBST洗涤三次，每次洗涤5min，最后一次弃掉液体后，在吸水纸上轻拍以除去孔中残留液体；洗涤完成后，每孔加入已恢复至常温的TMB显色液100μL，常温避光显色10min；显色完成后，加入已恢复常温的所述终止液50μL，以终止反应；
(4)显色终止后，将所述ELISA板放置于全波段酶标仪中，选择波长为OD450nm的波段进行读数，记录数据，进行数据分析，及结果判定：样品OD值大于或等于0.3时则判定为阳性；样品OD值大于0.2且小于0.3时则判定为可疑，需重做一次，重做结果仍为可疑或阴性则判定为阴性；样品OD值小于或等于0.2时则判定为阴性。
实施例6临床样品的检测
按照实施例5中试剂盒及使用方法进行临床样品的检测，在2018年9月-2020年9月期间从13个省份78个猪场采集得到的470份猪临床血清样品(2018年187份，2019年154份，2020年129份)中的ASFV抗体，同时与IFA试验结果和一个商品化非洲猪瘟抗体检测试剂盒检测结果进行对比，计算阳性符合率。
结果显示，该ELISA方法检测得到的阳性率为90.3％，IFA试验检测得到的阳性率为88.5％，商品化非洲猪瘟抗体检测试剂盒检测得到的阳性率为85.7％。结果表明本发明所述ELISA试剂盒具有更高的灵敏度和检出率，适用于临床血清样品ASFV抗体的检测。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.一种检测或鉴别非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，包括由非洲猪瘟病毒CD2v胞外域重组蛋白作为包被抗原包被的酶标板，以及，洗脱缓冲液、抗体稀释液、二抗、阳性对照、阴性对照、显色液和终止液；
所述非洲猪瘟病毒CD2v胞外域重组蛋白的构建方法，包括如下步骤：
（1）CD2v胞外域基因的扩增和重组质粒的构建
以ASFV-18基因组CD2v基因为模板，合成CD2v胞外域基因作为PCR扩增模板，设计如下CD2v胞外域扩增引物进行CD2v胞外域基因PCR扩增：
上游引物：5’ -TAAGAAGGAGATATACCATGGATTATTGGGTTAGTTTTAATAAAACAATAATTTTAGATAG-3’ ；
下游引物：5’ -GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAGTATAAAAATAGTTAGATGACAATG-3’ ；
PCR扩增完成后，将PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带，并将回收产物以同源重组的方式连接至已经NcoI和XhoI限制性内切酶双酶切的pET-28a质粒上，连接产物转化至BL21（DE3）感受态细胞中进行阳性克隆筛选和测序；
（2）CD2v胞外域蛋白的诱导表达、纯化和鉴定
将阳性克隆菌进行CD2v胞外域蛋白的诱导表达，收集菌体进行重悬破碎，离心收集上清和沉淀，分别进行SDS-PAGE蛋白电泳和蛋白免疫印迹技术鉴定；将鉴定正确的蛋白条带经显色及切胶，回收凝胶进行纯化，鉴定，即得。
2.根据权利要求1所述检测或鉴别非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述步骤（1）中，所述PCR扩增体系包括：
2×Platinum SuperFi II Green buffer 12.5µL；
5×GC buffer 5µL；
上游引物和下游引物各1µL；
模板 2.5µL；
ddH2O 3µL；
反应总体系为25µL。
3.根据权利要求2所述检测或鉴别非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述步骤（1）中，所述PCR扩增程序为：98℃ 30s，98℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共计35个循环；72℃ 5min，4℃保持。
4.根据权利要求3所述检测或鉴别非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述步骤（2）中，所述阳性克隆菌的CD2v胞外域蛋白诱导表达步骤包括：待菌液OD600nm在0.6-0.8时，加入终浓度为500 µM的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），于37℃摇床180rpm诱导8h。
5.根据权利要求1-4任一项所述检测或鉴别非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标板的包被步骤包括：将切胶纯化后的所述重组蛋白以50mmol/L、PH 9.6的碳酸盐缓冲液为抗原包被液，经稀释至2μg/mL进行抗原包被，控制ELISA板每孔100μL，放置4℃孵育12 h；随后取出已包被好抗原的ELISA板，弃掉液体并用PBS洗涤，然后每孔加入200μL用PH 7.4 的PBS缓冲液新鲜配制的5%脱脂乳，37℃封闭2 h；封闭完成后，弃去封闭液并用PBS洗涤，即可。
6.根据权利要求1-4任一项所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中：
所述洗脱缓冲液为含0.1%的吐温-20的PBS溶液；
所述抗体稀释液为PH 7.4的PBS缓冲液；
所述二抗为HRP标记的兔抗猪二抗；
所述阳性对照为非洲猪瘟病毒抗体阳性的标准猪血清；
所述阴性对照为非洲猪瘟病毒抗体阴性的标准猪血清；
所述显色液为TMB显色液；
所述终止液为2mol/L H2SO4。
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