CN111393510A

CN111393510A - 一种非洲猪瘟病毒重组抗原及其应用

Info

Publication number: CN111393510A
Application number: CN202010255206.4A
Authority: CN
Inventors: 常惠芸; 高瞻; 邵军军; 常艳燕
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-04-02
Filing date: 2020-04-02
Publication date: 2020-07-10
Anticipated expiration: 2040-04-02
Also published as: CN111393510B

Abstract

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒重组抗原及其应用，属于基因工程技术领域，所述m35重组抗原是通过对非洲猪瘟病毒蛋白p30、p54抗原蛋白预测筛选出的表位串联而成，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述重组抗原m35与阳性猪血清有免疫反应，可作为免疫识别抗原，可用于猪的非洲猪瘟病毒病的诊断，且诊断敏感性好、特异性高、可信度高。

Description

一种非洲猪瘟病毒重组抗原及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种非洲猪瘟病毒重组抗原及其应用。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性、烈性、高致死性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为须通报动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。由于至今尚无商业化疫苗可用，养殖过程中主要依赖猪群厂舍的净化防控。因此，建立一种低成本、敏感性高、特异性强的快速检测对有效防控ASF显得尤为重要。

目前非洲猪瘟的实验室诊断包括动物接种、病毒分离、病毒核酸DNA检测和特异性抗体检测等方法，而其中动物接种、病毒分离及病毒核酸检测需要在生物安全三级以上实验室由专业人员操作进行，难以满足基层需要。因此血清学检测是诊断和监测猪感染非洲猪瘟病毒病的重要方法之一

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒重组抗原及其应用。所述m35重组抗原是通过对非洲猪瘟病毒蛋白p30、p54抗原蛋白预测筛选出的表位串联而成，与阳性猪血清有免疫反应，可作为免疫识别抗原，可用于猪的非洲猪瘟病毒病的诊断。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

一种非洲猪瘟病毒重组抗原m35，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

编码所述重组抗原m35的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种包含非洲猪瘟病毒重组抗原基因的表达盒。

一种包含非洲猪瘟病毒重组抗原基因的重组载体。

一种包含非洲猪瘟病毒重组抗原基因的重组菌株。

本发明还提供一种用于非洲猪瘟诊断的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括酶标板、HRP标记酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、终止液、酶底物溶液显色液TMB、阳性对照和阴性对照；

所述酶标板上包被重组抗原m35。

作为对上述方案的进一步优化，所述重组抗原m35的包被浓度为0.1～50μg/ml。

作为对上述方案的进一步优化，所述HRP标记酶标二抗为HRP标记的抗猪IgG二抗或山羊抗猪IgG二抗。

作为对上述方案的进一步优化，所述样品稀释液的pH为7.4的PBS缓冲液；所述洗涤液为含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液；所述终止液为2M硫酸溶液。

作为对上述方案的进一步优化，所述阳性对照为人工感染非洲猪瘟病毒抗体阳性对照；所述阴性对照为未感染非洲猪瘟病毒抗体阴性对照。

本发明另外提供所述重组抗原m35在制备非洲猪瘟诊断及检测试剂方面的应用。

有益效果：

本发明所述的m35重组抗原是通过对非洲猪瘟病毒蛋白p30、p54抗原蛋白预测筛选出的表位串联而成。将其用于非洲猪瘟病毒检测，诊断敏感性好、特异性高、可信度高。采用本发明所述的ELISA检测试剂盒，可以区分非洲猪瘟病毒感染动物与免疫动物，该试剂盒以非洲猪瘟病毒抗原特异性血清抗体为检测靶标，显著提高非洲猪瘟病毒病检测方法的特异性。

附图说明

图1是本发明pET-28a(+)-m35在大肠杆菌中的表达纯化产物；其中，M-蛋白marker；1-未诱导的BL21-pET-28b(+)-m35；2-诱导后的BL21-pET-28b(+)-m35；3-诱导的BL21-pET-28b(+)-m35超声裂解上清部分；4-诱导后的BL21-pET-28b(+)-m35超声裂解沉淀部分；5-纯化蛋白；

图2是本发明m35蛋白Western-blot结果；其中，M-蛋白marker；W1-抗his标签WB；W2-抗阳性猪血WB。

具体实施方式

一种m35重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还包括编码所述的m35重组蛋白的核酸或基因，其核苷酸序列如SEQID NO：2所示。

本发明内容还包括表达盒、重组载体或重组菌株，其含有所述的核酸或基因。

本发明采用的抗原是由p30、p54预测筛选出的表位串联而成。因此所用抗原蛋白命名为m35，p30和p54蛋白是ASFV重要的结构蛋白，均可诱导特异性免疫反应，其中p30具有最佳的诊断抗原性能，所以在p30、p54蛋白中挑选出优势抗原表位，串联插入在合适的载体上，能够实现其在防治诊断中的作用。

本发明还提供一种用于非洲猪瘟病毒诊断的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括包被所述的m35重组蛋白的酶标板和HRP标记酶标二抗以及其他相配套试剂。

所述HRP标记酶标二抗为抗猪IgG二抗或山羊抗猪IgG二抗。

所述m35重组蛋白的包被浓度为0.1～50μg/ml。

本发明还包括提供一种所述的检测感染非洲猪瘟病毒血清的ELISA试剂盒的使用方法，所述使用方法包括如下步骤：

(1)直接取出试剂盒中制备的包被所述的m35重组蛋白的酶标板；

(2)加样：取包被了非洲猪瘟病毒特异性重组抗原的酶标板，在稀释板加入99μL样品稀释液，再加入1μL待测血清(1/100稀释)，检测孔直接加入相应的检测样本、猪血清阳性和阴性对照样本100μL，每一个样本均做一个重复孔，在37℃下避光反应60min；

(3)洗板：两点吸液，浸泡式洗涤3次，浸泡时间为120秒，轻微晃动，洗完后扣干；

(4)除空白对照孔外，每孔加与检测样品对应的稀释好的酶标的二抗100μL，振荡均匀，置37℃下避光反应30min，两点吸液，浸泡式洗涤6次，浸泡时间为120秒，轻微晃动，洗完后扣干；

(5)显色：每孔加显色液TMB 100μL，置37℃下避光显色12min；

(6)测定：每孔加终止液100μL，振荡混匀后，以空白对照孔调零，在450nm波长读数。

判定标准：所述读数后的结果判定为空白对照孔OD值＜0.1；优选地，临界值(cut-off)为0.339；

样本OD值≥cut-off值时，判为非洲猪瘟病毒抗体阳性；

样本OD值＜cut-off值时，判为非洲猪瘟病毒抗体阴性。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1制备m35蛋白

在GenBank中获得非洲猪瘟病毒p30、p54蛋白氨基酸序列，通过在线软件ABCpredPrediction、Scratch、NetCTL及IEDB预测其抗原表位，选择限制性内切酶BamH I和EcoR I的酶切位点，引入柔性链连接序列，优化得到SEQID NO：2；

将基因序列送至金斯瑞公司构建质粒pET-28a(+)-m35；

1.m35重组蛋白的诱导表达

将pET-28a(+)-m35载体转化大肠杆菌BL21，平板涂布，37℃培养过夜；挑取单菌落，加入5mL的含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；按照1：100的比例将培养的菌液接种于5mL的含Amp抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌液OD₆₀₀值在0.6-0.8；收集1mL未加IPTG的菌液作为未诱导对照，在上述摇好的菌液中加入终浓度为1mmol/L的IPTG，在37℃条件下诱导4h；收集1mL菌液，收集菌体沉淀，加入80uL 1％的SDS溶液，以及20uL的5×蛋白上样缓冲液，混匀，煮沸5min，进行SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色，分析蛋白表达情况，结果如图1中A所示。

2.m35重组蛋白的可溶性分析

取10ml诱导前菌液加入到1L含Amp抗性的LB液体培养基中，在摇速为220rpm/min、37℃培养OD₆₀₀为0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于220rpm/min、37℃诱导4h，10000rpm的条件下离心5分钟，收集菌体沉淀，加入适量PBS溶液重悬菌液，在冰浴条件下超声破碎菌体30min，功率400W，开2.5s，关2.5s。10000rpm、4℃离心7min，分离得到破碎后的菌液上清液3和包涵体沉淀物4。将包涵体沉淀物用8mol/L尿素重悬后，利用SDS-PAGE分别其进行检测，分析蛋白的可溶性。发现m35重组蛋白在包涵体中存在，如图1中B所示。

3.m35重组蛋白的纯化

大量培养收集上述包涵体沉淀物，使用含8mol/L尿素过夜变性溶解；7000rpm、10min离心将上清与预先处理好的Ni-NTAArgarose在4℃结合过夜，去掉流穿液，用PBS洗涤，去除杂蛋白。利用含有10mM、20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、150mM和200mM的含有咪唑的洗涤液，对Ni-NTAArgarose进行洗涤，收集洗脱液，进行SDS-PAGE凝胶电泳，观察纯化结果。将纯度较高的蛋白用含8M、6M、4M、2M、1M梯度尿素透析法每个浓度8小时透析复性沉淀蛋白，10％SDS-PAGE分析得到图1中C。

4.Western Blot检测

分别运用抗his标签一抗，非洲猪瘟阳性猪血清一抗和抗猪血清二抗对纯化后的重组蛋白m35进行Western-blot，验证免疫原性。得到图2，具体如下：

A)收集好纯化好的蛋白样品，上缓冲液处理完毕；

B)进行SDS-PAGE；

C)转膜：取下PAGE胶，放置处理好的PVDF膜上300mA120min；

D)5％BSA4℃过夜封闭；

E)一抗室温孵育1h；0.05％PBST洗涤3次10min/次；

F)二抗室温孵育1h；0.05％PBST洗涤5次5min/次；

G)显色；

H)拍照。

通过图2，说明我们的蛋白是携带HIS的重组蛋白，且与阳性猪血清有免疫反应，可作为免疫识别抗原。

实施例2ELISA最佳反应方法的建立

1、最佳抗原包被浓度和最佳抗体稀释度确定

(1)用PBS缓冲液稀释抗原(纯化好的m35)，选用Costar酶标板(Costar 42582USA)包被检测稀释后的抗原，选取每孔浓度为1、0.5、0.25、0.125、0.0625μg/ml稀释好的抗原4℃过夜，第二日1％BSA37℃封闭2小时，弃液拍干。

(2)加样：取步骤(1)包被了非洲猪瘟特异性重组抗原m35的酶标板，在检测孔和其复孔中分别加入稀释1/50、1/100、1/200的标准阳性血清(感染非洲猪瘟血清为阳性对照)和未感染阴性血清(对照组未感染非洲猪瘟血清为阴性对照)，在37℃下避光反应60min；稀释液为pH为7.4的PBS缓冲液；

(3)洗板：两点吸液，浸泡式洗涤3次，浸泡时间为120秒，轻微晃动，洗完后扣干；洗涤液含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液；

(4)除空白对照孔外，每孔加与检测样品对应的稀释好的酶标的二抗100μL(稀释液为含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液。振荡均匀，置37℃下避光反应60min，两点吸液；酶标检测抗体为用HRP标记酶标二抗为抗猪IgG。

(5)洗板：浸泡式洗涤6次，浸泡时间为120秒，轻微晃动，洗完后扣干；

(6)显色：每孔加显色液TMB100μL，置37℃下避光显色12min；

(7)测定：每孔加终止液(2M硫酸溶液)100μL，振荡混匀后，以空白对照孔调零，在450nm波长(630nm作参比波长)读数；终止液为2M硫酸溶液；

(8)由表1可知，在二抗浓度为1：20000时，抗原包被浓度为0.25μg/m1，血清稀释倍数为1：100时，阳性血清OD_450/630nm值接近1.0，且阳性血清比阴性血清比值(P/N)最大。

表1 m35-ELISA最佳方法的建立

2临界值的确定

检测56份非洲猪瘟抗体阴性血清OD_450/630nm值如表2所示，得到平均值

为0.181，标准差(SD)为0.056，临界值

为0.343，根据统计学原则，当待检血清样本ELISA的OD_450/630nm值≥0.343时，可在99.9％的水平上判定为阳性结果。

表2 m35-ELISA临界值的确定

3灵敏度实验

将标准阳性血清样品从1：50开始倍比稀释，进行ELISA实验，以临界值判定血清最高稀释度；结果如表3所示，优化后的间接ELISA方法可以检测到血清最高稀释度达1：1600，说明该方法检测的灵敏度较高。

表3灵敏度试验

4交叉反应实验

与PRV、PRRSV、PCV、PEDV、PDCoV、CSFV、FMDV进行交叉反应试验，得到结果如表4所示，表明该方法检测其他猪病阳性血清的OD值均小于其临界值，说明所建m35-ELISA为非洲猪瘟病毒抗体特异性间接ELISA检测方法特异性良好。

表4交叉反应试验

5重复性实验

由表5可知，用同一批次包被的酶标板检测4份血清，每份血清5个重复，结果显示，批内变异系数＜10％，说明所建ELISA方法具有较好的批内重复性；由表6可知，用4个不同批次包被的酶标板检测4份血清，结果显示批间变异系数＜10％，说明所建ELISA

方法具有较好的批间重复性。

表5 m35-ELISA批内重复实验结果

表6 m35-ELISA批间重复实验结果

实施例3ELISA试剂盒

试剂盒包括：已包被抗原标准液的酶标板和一种HRP标记酶标二抗以及其他相配套试剂；酶标检测抗体为用HRP标记酶标二抗为抗猪IgG(Sigma SAB3700434-2MG)；

试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液和终止液；

稀释液为pH为7.4的PBS缓冲液；

洗涤液为含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液；

终止液为2M硫酸溶液；

酶底物溶液显色液TMB(Surmodics TMBW-1000-01)；

阳性对照为实验室人工感染非洲猪瘟猪阳性血清；

阴性对照为实验室未感染非洲猪瘟猪对照组血清。

实施例4ELISA试剂盒检测样本案例

1、按照实施例2的方法对实施例1制备的纯化后的m35重组抗原进行包被，直接取出已包被m35抗原的包被板；

2、加样：取包被了非洲猪瘟特异性重组抗原m35的酶标板，在稀释板加入99μL样品稀释液(PBS PH7.4)，再加入1μL待测血清(1/100稀释)，检测孔和复孔分别直接加入相应的检测样本以及标准阳性阴性猪血清，并且设置空白对照组，在37℃下避光反应60min；

3、洗板：两点吸液，浸泡式洗涤3次，浸泡时间为120秒，轻微晃动，洗完后扣干；

4、除空白对照孔外，检测孔和其复孔加入检测样品(来源于沈阳地区的19份阳性猪血清以及实验室保存阴性猪血清50份)对应的稀释好的酶标的二抗(抗猪IgG SigmaSAB3700434-2MG)100μL，振荡均匀，置37℃下避光反应60min，两点吸液，浸泡式洗涤6次，浸泡时间为120秒，轻微晃动，洗完后扣干；

5、显色：每孔加显色液TMB(Surmodics TMBW-1000-01)100μL，置37℃下避光显色12min；

6、测定：每孔加终止液(2M硫酸溶液)100μL，振荡混匀后，以空白对照孔调零，在450nm波长(630nm作参比波长)读数。

7、结果统计

阳性样本均大于临界值，阴性样本均小于临界值。

因此，本发明中用到的非洲猪瘟病毒抗原诊断敏感性好，特异性高，可应用于猪非洲猪瘟病毒抗体的检测，可信度较高。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种非洲猪瘟病毒重组抗原及其应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 181

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 1

Met Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Phe Lys Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe

20 25 30

His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln Gly Gly

35 40 45

Gly Gly Ser Thr Pro Leu Lys Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu

50 55 60

Met Val Ile Lys Leu Leu Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Leu

65 70 75 80

Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr His Lys Asp Leu Glu Gly Gly Gly Gly

85 90 95

Ser His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala

100 105 110

Ser Gln Lys Lys Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu Tyr Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Ser Gln Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Gly Gly Gly Gly Ser His

165 170 175

His His His His His

180

<210> 2

<211> 558

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggatccatgg caaaatttgt agctgcatgg acactaaaag ctgcagctgg agggggtggc 60

agcttcaaga ccgacctgcg tagcagcagc caggtggttt ttcatggtgg cggtggcagc 120

ggttacaccg aacatcaagc gcaaggtggc ggtggcagca ccccgctgaa ggaagaggag 180

aaagaggtgg ttcgtctgat ggtgatcaag ctgctgaaga aaggtggcgg tggcagcgaa 240

aacctgcgtc agcgtaacac ctacacccac aaagatctgg aaggtggcgg tggcagccac 300

ccggcggagc cgtataccac cgttaccacc caaaacaccg cgagccagaa gaaacaagtg 360

gttttccacg cgggtagcct gtatggtggc ggtggcagct gcaccagcag cttcgaaacc 420

ctgtttggtg gcggtggcag cagccaaacc atgagcgcga ttgagaacct gggtggcggt 480

ggcagctgtc tgagcccggt taccaccccg agcttcggtg gcggtggcag ccatcaccac 540

caccaccact aactcgag 558

Claims

1.一种非洲猪瘟病毒重组抗原m35，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码如权利要求1所述重组抗原m35的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种包含如权利要求2所述基因的表达盒。

4.一种包含如权利要求2所述基因的重组载体。

5.一种包含如权利要求2所述基因的重组菌株。

6.一种用于非洲猪瘟诊断的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括酶标板、HRP标记酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、终止液、酶底物溶液显色液TMB、阳性对照和阴性对照；其特征在于：所述酶标板上包被重组抗原m35。

7.根据权利要求6所述的一种用于非洲猪瘟诊断的ELISA试剂盒，其特征在于：所述重组抗原m35的包被浓度为0.1～50μg/ml。

8.根据权利要求6所述的一种用于非洲猪瘟诊断的ELISA试剂盒，其特征在于：所述HRP标记酶标二抗为HRP标记的抗猪IgG二抗或山羊抗猪IgG二抗。

9.根据权利要求6所述的一种用于非洲猪瘟诊断的ELISA试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液的pH为7.4的PBS缓冲液；所述洗涤液为含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液；所述终止液为2M硫酸溶液；所述阳性对照为人工感染非洲猪瘟病毒抗体阳性对照；所述阴性对照为未感染非洲猪瘟病毒抗体阴性对照。

10.如权利要求1所述的重组抗原m35在制备非洲猪瘟病毒诊断及检测试剂方面的应用。