CN117603366A

CN117603366A - 一种布鲁氏菌特异性融合抗原及其应用

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Publication number: CN117603366A
Application number: CN202410081997.1A
Authority: CN
Inventors: 张琼林; 巩玉洁; 赵荣茂; 张慧莹; 赵方圆; 袁婷婷; 魏单平; 陈娟; 杨晓霞
Original assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd
Current assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd
Priority date: 2024-01-19
Filing date: 2024-01-19
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2044-01-19
Also published as: CN117603366B

Abstract

本发明公开了一种羊布鲁氏菌特异性融合抗原及其应用，属于生物技术领域。所述病毒特异性融合抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；所述病毒特异性融合抗原的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。本发明根据根据已有的蛋白质三维结构，对羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP16、OMP19和OMP28的结构进行分析，选择优势抗原表位串联，使用原核大肠杆菌表达系统进行表达，经过免疫学实验验证，该抗原蛋白可以很好地结合抗体，蛋白活性高。本发明所提供制备的ELISA抗体检测试剂盒和胶体金检测试纸条生产成本低廉、特异性好、敏感性高、稳定性强，可以应用于基层进行羊布鲁氏菌病检测。

Description

一种布鲁氏菌特异性融合抗原及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种布鲁氏菌特异性融合抗原及其应用。

背景技术

布鲁氏菌病简称布病，又被称为地中海弛张热，马耳他热，波浪热或波状热，是由革兰氏阴性菌布鲁氏菌引起的人畜共患病，严重威胁人类健康和财产安全。布鲁氏菌病会导致病人反复高热、大汗、乏力、关节痛、肝脾及淋巴结肿大等症状，严重时会出现关节损害、脑膜炎、睾丸炎和卵巢炎等，不及时治疗会危及生命。该病感染的家畜主要是羊，牛和猪，会导致家畜流产、不孕或生殖器官炎症，严重威胁畜牧业发展。布鲁氏菌病主要通过皮肤和黏膜接触、消化道、呼吸道引起感染，接触病畜较多的人群易感染。

布鲁氏菌是革兰氏阴性、需氧、细胞内寄生的短小球杆状细菌，无鞭毛和菌毛，不运动，不形成芽孢，仅光滑型（致病毒株）有微荚膜。布鲁氏菌属于α-变形杆菌属，主要分为6个生物种和19个亚型：羊种布鲁氏菌（B.melitensis，生物型1-3）、绵羊型副睾种布鲁氏菌（B.ovis，生物型1）、牛种布鲁氏菌（B.abortμs，生物型1-8）、沙林鼠种布鲁氏菌（B.neotomae，生物型1）、猪种布鲁氏菌（B.sμis，生物型1-5）和犬种布鲁氏菌（B.canis，生物型1）。之后又发现了田鼠种布鲁氏菌（B.microti），鳍型布鲁氏菌（B.pinnipedialis）和鲸型布鲁氏菌（B.ceti）等。最早发现的羊种布鲁氏菌因其致病性最强，故而成为研究的重点菌株。

不同种的布鲁氏菌基因组组成和大小很相似，基因组都是2条染色体，平均长度大约3.39Mb。布鲁氏菌的结构相对其他细菌很独特，不含编码质粒，荚膜，菌毛和内毒素的基因，与寄生的宿主细胞相互作用的研究也较少。布鲁氏菌细胞膜由三层膜构成，由内向外分别为细胞质膜、外周胞质膜和外膜。其中外膜是由脂多糖、蛋白质和磷脂三种组分构成，与肽聚糖（peptidoglycan，PG）层紧密结合形成细胞壁。布鲁氏菌的脂多糖LPS是主要的毒力因子，已有的大部分抗体检测都是提取脂多糖作为抗原使用，但是由于布鲁氏菌能感染人，需要在生物安全P3级别的实验室培养，因此脂多糖的来源很受限制。除此之外，布鲁氏菌外膜蛋白OMP也是重要毒力因子，已有的多项研究证实，布鲁氏菌多种外膜蛋白，包括OMP10，OMP16，OMP19，OMP25，OMP31和OMP28（也称BP26）都可以作为靶标抗原来检测布鲁氏菌的抗体水平。已发表的研究证实的可用抗原还包括分泌蛋白VirB12，DNA结合蛋白Dps和转运蛋白Wzt等。

布鲁氏菌病分布的广泛性，高度的传染性使其防控具有很高的难度，对人的健康和畜牧业经济带来了严重威胁，目前目前并无特效治疗，以扑杀和销毁为主。在此情形下，预防和检测显得尤其重要。现有的布鲁氏菌病检测方法主要包括病原学检测和血清学检测两类。

病原学检测方法包括病原分离鉴定和分子生物学检测等。病原分离和鉴定是诊断布鲁氏菌病最经典的方法，布鲁氏菌的分离方法已经非常成熟，但对实验人员和环境设施要求较高，需要在生物安全P3级别实验室进行，同时布鲁氏菌生长缓慢，首次分离检测周期较长（5-10天），该方法不适合一般实验室检测。

分子生物学方法已成为当前布鲁氏菌病检测和诊断的重要手段之一，包括聚合酶链式反应PCR，实时定量PCR和多重PCR等。这些方法具有特异、敏感和高效等优点，但是通常需要专用的检测仪器，同时对检测的环境要求较高，并不十分适用于基层检测。

血清学检测方法因为其简单、方便的特点，是现阶段布鲁氏菌病检测和诊断的主要方法。我国现行布鲁氏菌病诊断标准中规定的血清学检测方法有试管凝集试验（SAT）、补体结合实验（CFT）、虎红平板凝集试验（RBT）、全乳环状试验（MRT）、胶体金免疫层析技术（GICA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等。

试管凝集试验SAT是1897发明的古老而经典的布鲁氏菌病检测方法，操作简单，判定简便，是我国法定方法之一。但是该方法存在一定漏检和误诊的可能，需要配合多种诊断方法来确诊。

补体结合实验CFT也是我国法定方法之一，同时有国际标准，在国际贸易中用于布鲁氏菌病的确认。但是其实验操作复杂，结果需要实验人员主观判断，不适合大规模现场检测。

虎红平板凝集试验RBT操作简单，几分钟即可判读结果，成本低，适合群体的大规模普查。但是该方法敏感性有限，特异性较差，容易出现假阳性，所检出的阳性结果需要其他特异性检测方法进一步验证。

全乳环状试验MRT主要用于牛奶样品的筛查，操作简单，适合快速、大批量地检测样品，多用于大型奶牛场的现场筛查。该方法灵敏度有限，奶样质量不好时容易出现假阳性。

胶体金免疫层析技术GICA特异性强，操作简便快速，肉眼直接观察结果，无需特殊试剂和仪器，便于单个样品检测，适合基层初步检测。

酶联免疫吸附试验ELISA具有特异性强、灵敏度高、适用范围广、检测速度快等优点，可用于病菌抗原或动物血清中抗体检测，已广泛应用于兽医临床和宠物医院中。

上述各种方法各有其优缺点，制备出布鲁氏菌特异性抗原蛋白，作为抗体检测ELISA方法和胶体金免疫层析法的原料，同时可以制备特异性单克隆抗体，为建立抗原检测的ELISA方法和胶体金免疫层析法提供优质原料，对于临床准确检测其抗体和抗原水平有着重要意义。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种布鲁氏菌特异性融合抗原及其应用。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

第一方面，一种布鲁氏菌特异性融合抗原，其特征在于，所述特异性融合抗原为外膜蛋白OMP16从N端起第64-162位氨基酸残基和OMP19从N端起第76-177位氨基酸残基以及OMP28从N端起第29-250位氨基酸残基连接形成；所述特异性融合抗原的氨基酸序列如SEQID No.7所示。

第二方面，布鲁氏菌特异性融合抗原的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

第三方面，一种制备布鲁氏菌特异性融合抗原的方法，其特征在于，使用原核大肠杆菌表达系统进行表达。

第四方面，下述（a1）-（a4）中任一种生物材料：

（a1）含有上述所述的特异性融合抗原编码基因的表达盒；

（a2）含有上述所述的特异性融合抗原编码基因的重组载体；

（a3）含有上述所述的特异性融合抗原编码基因的重组菌；

（a4）含有上述所述的特异性融合抗原编码基因的转基因细胞系。

第五方面，本发明提供上述所述的羊布鲁氏菌特异性融合抗原和/或特异性融合抗原编码基因和/或上述所述的生物材料在制备抗原中的应用。

第六方面，本发明提供上述所述的羊布鲁氏菌特异性融合抗原在羊布鲁氏菌抗体检测试剂盒和检测试纸条中的应用。

优选地，所述试剂盒为夹心ELISA抗原检测试剂盒或竞争ELISA抗体检测试剂盒；

优选地，所述试纸条为胶体金检测试纸条，或荧光微球检测试纸条，或乳胶微球检测试纸条。

本发明实施例具有如下优点：

本发明根据根据已有的蛋白质三维结构，对羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP16、OMP19和OMP28的结构进行分析，选择优势抗原表位通过柔性无规则卷曲序列连接形成融合抗原，使用原核大肠杆菌表达系统进行表达，经过免疫学实验验证，该抗原蛋白可以很好地结合抗体，蛋白活性高，可用于制备高敏感性的诊断试剂盒，以及建立高敏感性的诊断方法。该融合抗原相比已有常用抗原，稳定性更好，表达量更高，成本更低，检测抗体水平的特异性和灵敏度都更好。本发明所提供制备的ELISA抗体检测试剂盒和胶体金检测试纸条特异性好、敏感性高、稳定性强，可以应用于羊布鲁氏菌病抗体的检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。

图1为本发明实施例提供的羊布鲁氏菌外膜蛋白已发表相似结构图；

图2为本发明实施例提供的AlphaFold预测羊布鲁氏菌OMP16_61-162aa+OMP19_76-177aa+OMP28(BP26)_29-250aa特异性融合抗原抗原结构图；

图3为本发明实施例提供的羊布鲁氏菌特异性融合抗原表达纯化后电泳结果；

图4为本发明实施例制备的检测试纸条的特异性血清检测结果；

图5为本发明实施例制备的检测试纸条的敏感性血清检测结果。

图1中A为OMP16相似结构（大肠杆菌脂蛋白结构1OAP）；B为OMP19类似结构（7MHW）；C为OMP28（BP26）类似结构（牛流产布鲁氏菌S19株BP26 4HVZ）；

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、羊布鲁氏菌多种外膜蛋白序列比对及结构分析

已有文献证实羊布鲁氏菌多种外膜蛋白，包括OMP10，OMP16，OMP19，OMP25，OMP31和OMP28（也称BP26），都可以作为靶标抗原来检测抗体水平。根据文献，确定这6种外膜蛋白所对应的序列，OMP10序列参考美国生物技术信息中心NCBI的AIJ87709氨基酸序列，共126位氨基酸残基，1-20aa为信号肽，无跨膜区；OMP16序列参考NCBI的AEF59023氨基酸序列，共168位氨基酸残基，1-25aa为信号肽，无跨膜区；OMP19序列参考NCBI的EEW87953氨基酸序列，共177位氨基酸残基，1-23aa为信号肽，无跨膜区；OMP25序列参考NCBI的AEF59022氨基酸序列，共213位氨基酸残基，1-23aa为信号肽，无跨膜区；OMP31序列参考NCBI的ACS50328氨基酸序列，共240位氨基酸残基，1-19aa为信号肽，无跨膜区；OMP28（BP26）序列参考NCBI的AAB38523氨基酸序列，共250位氨基酸残基，1-28aa为信号肽，7-29aa预测为跨膜区。将这6种外膜蛋白的序列在NCBI Blast功能中与蛋白结构数据库PDB中数据进行对比，结果显示OMP10，OMP25和OMP31无序列相似的同源结构发表，OMP16有序列相似的大肠杆菌同源结构发表，OMP19和OMP28（BP26）有部分结构已发表。其中OMP16的部分结构（61-162aa）与大肠杆菌脂蛋白结构（PDB数据库编号：1OAP）有46%的序列同源性，结构应该比较相似。OMP19的77-177aa部分与已解析发表的OMP19蛋白结构（PDB数据库编号：7MHW）基本一致，仅76位氨基酸残基不同，序列同源性高达99%，可以确认为该蛋白结构。OMP28（BP26）的28-250aa部分与已发表的牛流产布鲁氏菌S19株的BP26结构相同，序列同源性也高达99%，仅2个氨基酸残基不同，可以确认为该蛋白结构。

已发表的OMP16类似结构如图1A所示，整体为椭圆形结构，一侧为4个近似平行的β片层，另一侧为3个α螺旋，结合有2个硫酸根离子，OMP16的61-162aa应该与该结构类似，形成比较稳定的结构。已发表的OMP19类似结构如图1B所示，整体为8个β片层构成的桶装结构，OMP19的76-177aa应该能够形成该稳定结构。已发表的OMP28（BP26）类似结构如图1C所示，整体结构分为2个结构域，每个结构域结构类似，都是一侧3个β片层，另一侧2个α螺旋，两个结构域横向排列，OMP28（BP26）的29-250aa应该能够形成该稳定结构。

根据以上的结构信息，选择这三种羊布鲁氏菌外膜蛋白的结构稳定片段OMP16_61-162aa、OMP19_76-177aa和OMP28（BP26）_29-250aa，通过两段柔性的无规卷曲序列GGGGSGGGGS连接成一个新的融合抗原，进行表达纯化和验证。利用加利福尼亚大学旧金山分校UCSF开发的免费结构展示软件ChimeraX提供的AlphaFold结构预测功能，输入连接后新的抗原氨基酸残基序列，使用AlphaFold软件计算和预测该蛋白三维结构，最终获得的预测结构如图2所示。图2中部偏上的结构域为N端的OMP16_61-162aa蛋白片段，右上角的结构域为OMP19_76-177aa蛋白片段，左方和下方的两个结构域为C端的OMP28（BP26）_29-250aa蛋白片段。这3部分结构域与各自的相似结构都基本相同，柔性较大的区域主要是两处连接序列，整体结构较稳定。

羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP16全长氨基酸序列（SEQ ID No.1）：

MRRIQSIARSPIAIALFMSLAVAGCASKKNLPNNAGDLGLGAGAATPGSSQDFTVNVGDRIFFDLDSSLIRADAQQTLSKQAQWLQRYPQYSITIEGHADERGTREYNLALGQRRAAATRDFLASRGVPTNRMRTISYGNERPVAVCDADTCWSQNRRAVTVLNGAGR。

羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP16全长核苷酸序列（SEQ ID No.2）：

ATGCGCCGTATCCAGTCGATTGCACGTAGCCCGATCGCTATTGCGCTTTTCATGTCGCTCGCCGTTGCCGGCTGTGCGTCAAAGAAGAACCTTCCGAATAATGCCGGTGATCTGGGTCTCGGTGCAGGCGCTGCAACGCCGGGCTCCTCGCAGGACTTCACCGTTAATGTCGGCGACCGCATCTTCTTCGATCTCGATTCGTCGCTGATCCGCGCCGATGCGCAGCAGACGCTTTCCAAGCAGGCCCAGTGGTTGCAGCGTTATCCGCAGTATTCGATCACGATCGAAGGCCATGCCGACGAGCGCGGCACGCGTGAGTACAACCTCGCCCTTGGCCAGCGCCGTGCTGCCGCCACCCGCGACTTCCTCGCTTCGCGCGGTGTGCCGACCAACCGCATGCGCACCATTTCCTACGGTAATGAGCGCCCGGTTGCCGTCTGCGATGCCGACACATGCTGGTCGCAGAACCGTCGCGCCGTCACCGTTCTCAACGGGGCCGGACGG。

羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP19全长氨基酸序列（SEQ ID No.3）：

MGISKASLLSLAAAGIVLAGCQSSRLGNLDNVSPPPPPAPVNAVPAGTVQKGNLDSPTQFPNAPSTDMSAQSGTQVASLPPASAPDLTPGAVAGVWNASLGGQSCKIATPQTKYGQGYRAGPLRCPGELANLASWAVNGKQLVLYDANGGTVASLYSSGQGRFDGQTTGGQAVTLSR。

羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP19全长核苷酸序列（SEQ ID No.4）：

ATGGGAATTTCAAAAGCAAGTCTGCTCAGCCTCGCGGCGGCTGGCATTGTCCTGGCCGGGTGCCAGAGCTCCCGGCTTGGTAATCTCGATAATGTTTCGCCTCCGCCGCCGCCTGCACCGGTCAATGCTGTTCCGGCAGGCACGGTGCAGAAAGGCAATCTTGATTCTCCCACACAATTCCCCAATGCGCCCTCCACGGATATGAGCGCGCAATCCGGCACACAGGTCGCAAGCCTGCCGCCTGCATCCGCACCGGACCTGACGCCCGGCGCCGTGGCTGGCGTCTGGAACGCCTCGCTTGGTGGTCAGAGCTGCAAGATCGCGACGCCGCAGACCAAATATGGCCAGGGCTATCGCGCAGGCCCGCTGCGCTGCCCCGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGGGCCGTCAATGGCAAGCAACTCGTCCTTTACGATGCGAACGGCGGTACGGTTGCCTCGCTCTATTCTTCAGGACAGGGCCGCTTCGATGGCCAGACCACCGGCGGGCAGGCCGTGACGCTGTCGCGC。

羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP28（BP26）全长氨基酸序列（SEQ ID No.5）：

MNTRASNFLAASFSTIMLVGAFSLPAFAQENQMTTQPARIAVTGEGMMTASPDMAILNLSVLRQAKTAREAMTANNEAMTKVLDAMKKAGIEDRDLQTGGINIQPIYVYPDDKNNLKEPTITGYSVSTSLTVRVRELANVGKILDESVTLGVNQGGDLNLVNDNPSAVINEARKRAVANAIAKAKTLADAAGVGLGRVVEISELSRPPMPMPIARGQFRTMLAAAPDNSVPIAAGENSYNVSVNVVFEIK。

羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP28（BP26）全长核苷酸序列（SEQ ID No.6）：

ATGAACACTCGTGCTAGCAATTTTCTCGCAGCCTCATTTTCCACAATCATGCTCGTCGGCGCTTTCAGCCTGCCCGCTTTCGCACAGGAGAATCAGATGACGACGCAGCCCGCGCGCATCGCCGTCACCGGGGAAGGCATGATGACGGCCTCGCCCGATATGGCCATTCTCAATCTCTCGGTGCTACGCCAGGCAAAGACCGCGCGCGAAGCCATGACCGCGAATAATGAAGCCATGACAAAAGTGCTCGATGCCATGAAGAAGGCCGGCATCGAAGATCGCGATCTCCAGACAGGCGGCATCAATATCCAGCCGATTTATGTCTATCCTGACGACAAGAACAACCTGAAAGAGCCTACCATCACCGGCTATTCTGTATCCACCAGTCTCACGGTTCGCGTGCGCGAACTGGCCAATGTTGGAAAAATTTTGGATGAATCCGTCACGCTCGGTGTTAATCAGGGCGGTGATTTGAACCTGGTCAATGATAATCCCTCCGCCGTGATCAACGAGGCGCGCAAGCGCGCAGTGGCCAATGCCATTGCCAAGGCGAAGACGCTTGCCGACGCTGCAGGCGTGGGGCTTGGCCGTGTGGTGGAAATCAGTGAACTGAGCCGCCCGCCCATGCCGATGCCAATTGCGCGCGGACAGTTCAGAACCATGCTAGCAGCCGCACCGGACAATTCCGTGCCGATTGCCGCAGGCGAAAACAGCTATAACGTATCGGTCAATGTCGTTTTTGAAATCAAG。

羊布鲁氏菌外膜蛋白特异性融合抗原OMP16_61-162aa+OMP19_76-177aa+OMP28（BP26）_29-250aa的氨基酸序列（下划线为连接的无规则卷曲）（SEQ ID No.7）：

IFFDLDSSLIRADAQQTLSKQAQWLQRYPQYSITIEGHADERGTREYNLALGQRRAAATRDFLASRGVPTNRMRTISYGNERPVAVCDADTCWSQNRRAVTVGGGGSGGGGSVASLPPASAPDLTPGAVAGVWNASLGGQSCKIATPQTKYGQGYRAGPLRCPGELANLASWAVNGKQLVLYDANGGTVASLYSSGQGRFDGQTTGGQAVTLSRGGGGSG GGGSQENQMTTQPARIAVTGEGMMTASPDMAILNLSVLRQAKTAREAMTANNEAMTKVLDAMKKAGIEDRDLQTGGINIQPIYVYPDDKNNLKEPTITGYSVSTSLTVRVRELANVGKILDESVTLGVNQGGDLNLVNDNPSAVINEARKRAVANAIAKAKTLADAAGVGLGRVVEISELSRPPMPMPIARGQFRTMLAAAPDNSVPIAAGENSYNVSVNVVFEIK。

羊布鲁氏菌外膜蛋白特异性融合抗原OMP16_61-162aa+OMP19_76-177aa+OMP28（BP26）_29-250aa的核苷酸序列（下划线为连接的无规则卷曲）（SEQ ID No.8）：

ATCTTCTTCGATCTCGATTCGTCGCTGATCCGCGCCGATGCGCAGCAGACGCTTTCCAAGCAGGCCCAGTGGTTGCAGCGTTATCCGCAGTATTCGATCACGATCGAAGGCCATGCCGACGAGCGCGGCACGCGTGAGTACAACCTCGCCCTTGGCCAGCGCCGTGCTGCCGCCACCCGCGACTTCCTCGCTTCGCGCGGTGTGCCGACCAACCGCATGCGCACCATTTCCTACGGTAATGAGCGCCCGGTTGCCGTCTGCGATGCCGACACATGCTGGTCGCAGAACCGTCGCGCCGTCACCGTTGGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGTCGCAAGCCTGCCGCCTGCATCCGCACCGGACCTGACGCCCGGCGCCGTGGCTGGCGTCTGGAACGCCTCGCTTGGTGGTCAGAGCTGCAAGATCGCGACGCCGCAGACCAAATATGGCCAGGGCTATCGCGCAGGCCCGCTGCGCTGCCCCGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGGGCCGTCAATGGCAAGCAACTCGTCCTTTACGATGCGAACGGCGGTACGGTTGCCTCGCTCTATTCTTCAGGACAGGGCCGCTTCGATGGCCAGACCACCGGCGGGCAGGCCGTGACGCTGTCGCGCGGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCCAGGAGAATCAGATGACGACGCAGCCCGCGCGCATCGCCGTCACCGGGGAAGGCATGATGACGGCCTCGCCCGATATGGCCATTCTCAATCTCTCGGTGCTACGCCAGGCAAAGACCGCGCGCGAAGCCATGACCGCGAATAATGAAGCCATGACAAAAGTGCTCGATGCCATGAAGAAGGCCGGCATCGAAGATCGCGATCTCCAGACAGGCGGCATCAATATCCAGCCGATTTATGTCTATCCTGACGACAAGAACAACCTGAAAGAGCCTACCATCACCGGCTATTCTGTATCCACCAGTCTCACGGTTCGCGTGCGCGAACTGGCCAATGTTGGAAAAATTTTGGATGAATCCGTCACGCTCGGTGTTAATCAGGGCGGTGATTTGAACCTGGTCAATGATAATCCCTCCGCCGTGATCAACGAGGCGCGCAAGCGCGCAGTGGCCAATGCCATTGCCAAGGCGAAGACGCTTGCCGACGCTGCAGGCGTGGGGCTTGGCCGTGTGGTGGAAATCAGTGAACTGAGCCGCCCGCCCATGCCGATGCCAATTGCGCGCGGACAGTTCAGAACCATGCTAGCAGCCGCACCGGACAATTCCGTGCCGATTGCCGCAGGCGAAAACAGCTATAACGTATCGGTCAATGTCGTTTTTGAAATCAAG。

实施例2、羊布鲁氏菌外膜蛋白特异性融合抗原的表达、纯化和抗原活性验证

根据已有结构和结构预测的结果，选择三种羊布鲁氏菌外膜蛋白的结构稳定片段OMP16_61-162aa、OMP19_76-177aa和OMP28（BP26）_29-250aa，通过两段柔性的无规卷曲序列GGGGSGGGGS连接成一个新的特异性融合抗原，进行表达和纯化。在基因公司合成特异性融合抗原对应的基因序列，通过分子克隆的方法，构建到pGEX-6p-1表达载体上，鉴定正确后转化BL21（DE3）感受态细胞，进行该特异性融合抗原的原核表达尝试，得到可溶性表达的目标蛋白质。在利用GST亲和层析纯化蛋白后，使用PreScission Protease蛋白酶切去GST标签，最终获得的羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP16_61-162aa+OMP19_76-177aa+OMP28（BP26）_29-250aa特异性融合抗原的电泳结果如图3所示，在大约46 kD大小处有目的条带，纯度较高。

将纯化获得的羊布鲁氏菌外膜蛋白特异性融合抗原蛋白使用ELISA方法验证抗原活性。包被纯化的特异性融合抗原1 μg/ml，100 μl/孔，4℃包被过夜，0.1%BSA 37℃封闭2h，300 μl/孔的PBST洗液（0.1%）洗板3次，加入50倍稀释后的临床阳性血清100 μl/孔，37℃孵育30 min（阳性对照组为羊布鲁氏菌病抗体阳性血清，阴性对照组为羊布鲁氏菌病抗体阴性血清，每组做三次重复），300 μl/孔的PBST洗液（0.1%）洗板4-5次，拍干后加入HRP标记的兔抗羊二抗（以PBS按照1:10000稀释）100 μl/孔，37℃反应30 min，再次洗板4-5次，拍干后加入底物溶液100 μl/孔，室温显色15 min，最后加入终止液，50 μl/孔，终止反应，用酶标仪测定OD_450nm值。结果如表1所示，羊布鲁氏菌特异性融合抗原蛋白与阳性对照接近，具有较好的抗原活性。

表1抗原活性验证结果

实施例3、基于羊布鲁氏菌特异性融合抗原蛋白作为抗原材料的ELISA抗体检测试剂盒

利用羊布鲁氏菌特异性融合抗原蛋白OMP16_61-162aa+OMP19_76-177aa+OMP28（BP26）_29-250aa特异性融合抗原蛋白作为抗原材料所制备的ELISA抗体检测试剂盒是一种检测羊血清中布鲁氏菌抗体水平的酶联免疫试剂盒，其工作步骤是：

1）从试剂盒中取出抗原包被板，在血清稀释板上用样品稀释液50倍稀释待检测的血清（147 μl样品稀释液和3 μl待检血清混合），取100 μl混合液加入酶标板中，同时阳性血清和阴性血清各加2孔，每孔100 μl。

2）轻轻振荡均匀各孔中样品，用封板膜覆盖包被板，37℃孵育30分钟。

3）弃去板孔中的溶液，每孔加入300 μl工作洗涤液，重复4-5次。最后一次洗板后将液体彻底拍干。

4）每孔加入100 μl酶标抗体，用封板膜覆盖包被板，37℃孵育30分钟。

5）弃去板孔中的溶液，每孔加入300 μl工作洗涤液，重复4-5次。最后一次洗板后将液体彻底拍干。

6）每孔加入100 μl底物溶液，用封板膜覆盖包被板，室温孵育15分钟。

7）每孔加入50 μl终止液终止反应。

8）测定样品和对照于450nm波长的吸光值（OD_450nm）。阳性对照OD_650nm值≥0.8，阴性对照OD_650nm值<0.2且P%<10%时，实验成立。

阳性百分比P%=（待测样品OD_450nm均值/阳性对照OD_450nm均值）×100%。

判定标准：样品的P%值≥15%时，为羊布鲁氏菌病抗体阳性；样品的P%值＜15%时，为羊布鲁氏菌病抗体阴性。

该应用实验结果如下：

1.特异性试验

用羊布鲁氏菌ELISA抗体检测试剂盒检测羊布鲁氏菌病抗体阳性血清和其他羊细菌性疾病抗体阳性血清，包括羊沙门氏菌病，羊葡萄球菌病和羊败血性链球菌病。结果见表2，除羊布鲁氏菌病抗体阳性血清的P%值显著大于15%以外，其余血清P%值小于15%，符合阴性血清判定标准，表明这种方法的特异性良好。

表2特异性血清检测结果

2.敏感性试验

将羊布鲁氏菌病抗体阳性血清分别稀释2、4、8、16、32、64和128倍，使用本发明制备的ELISA抗体检测试剂盒及商品化羊布鲁氏菌ELISA抗体检测试剂盒同时进行检测。结果见表3所示，两种方法均可检测至32倍稀释的羊布鲁氏菌病抗体标准阳性血清，表明本发明的检测试剂盒具有良好的敏感性。

表3敏感性血清检测结果

3.符合率比较

使用本研究方法及商品化羊布鲁氏菌ELISA抗体检测试剂盒同时检测35份羊血清样本，结果进行对比，本研究建立的方法与商品化试剂盒整体样本检测的符合率为100%，说明与对照试剂有良好的对应性，具体结果见表4和表5。

表4样本符合率比较

表5符合率分析结果

实施例4、基于羊布鲁氏菌特异性融合抗原蛋白作为抗原材料的胶体金检测试纸条

利用羊布鲁氏菌特异性融合蛋白OMP16_61-162aa+OMP19_76-177aa+OMP28（BP26）_29-250aa作为抗原所制备的胶体金检测试纸条是一种基于免疫层析平台、采用双抗原夹心法检测羊血清或血浆中布鲁氏菌抗体水平试纸条，其操作步骤是：

1）从试剂盒中取出羊布鲁氏菌抗体检测试纸条，恢复至室温。

2）取10 μl羊血清或血浆，加入到样本稀释液中，振荡混匀，为待测液。

3）取80 μl待测液加入试纸条样本孔中，反应10-15分钟，肉眼判断结果。

判定标准：

C线显色，说明该试纸条结果有效，试验成立。

C线显色，T线显色，说明待测样品中羊布鲁氏菌病抗体阳性；

C线显色，T线不显色，说明待测样品中羊布鲁氏菌病抗体阴性。

该应用实验结果如下：

1.特异性试验

用羊布鲁氏菌抗体检测胶体金试纸条检测羊布鲁氏菌病抗体阳性血清和其他羊细菌性疾病抗体阳性血清，包括羊沙门氏菌病，羊葡萄球菌病和羊败血性链球菌病。结果见图4，除羊布鲁氏菌病抗体阳性血清的T线有显色外，其余血清T线均不显色，符合阴性血清判定标准，表明这种方法的特异性良好。

2.敏感性试验

将羊布鲁氏菌病抗体阳性血清分别稀释2、4、8、16、32、64和128倍，使用本发明制备的抗体检测试纸条及商品化羊布鲁氏菌ELISA抗体检测试剂盒同时进行检测。试纸条结果如图5所示，本发明方法可检测至32倍稀释的羊布鲁氏菌病抗体阳性血清，与商品化试剂盒一致，说明本发明的检测试纸条具有良好的敏感性。

3.符合率比较

使用本发明试纸条及商品化羊布鲁氏菌ELISA抗体检测试剂盒同时检测35份羊血清样本，结果进行对比，本研究建立的试纸条检测方法与外购试剂盒整体样本检测的符合率为100%，说明与对照试剂有良好的对应性，具体结果见表6和表7。

表6样本符合率比较

表7符合率分析结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种羊布鲁氏菌特异性融合抗原，其特征在于，所述特异性融合抗原为羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP16从N端起第64-162位氨基酸残基和OMP19从N端起第76-177位氨基酸残基以及OMP28从N端起第29-250位氨基酸残基连接形成；

所述特异性融合抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

2.权利要求1所述的羊布鲁氏菌特异性融合抗原的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

3.一种制备权利要求1所述的羊布鲁氏菌特异性融合抗原的方法，其特征在于，使用原核大肠杆菌表达系统进行表达。

4.下述（a1）-（a4）中任一种生物材料：

（a1）含有权利要求2所述特异性融合抗原编码基因的表达盒；

（a2）含有权利要求2所述特异性融合抗原编码基因的重组载体；

（a3）含有权利要求2所述特异性融合抗原编码基因的重组菌；

（a4）含有权利要求2所述特异性融合抗原编码基因的转基因细胞系。

5.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌特异性融合抗原和/或权利要求2所述的特异性融合抗原的编码基因和/或权利要求4所述的生物材料在制备羊布鲁氏菌抗原中的应用。

6.一种羊布鲁氏菌病ELISA抗体检测试剂盒，特征在于，抗原活性成分为权利要求1所述的羊布鲁氏菌特异性融合抗原。

7.一种羊布鲁氏菌病抗体的检测试纸条，特征在于，抗原活性成分为权利要求1所述的羊布鲁氏菌特异性融合抗原。