KR102485291B1

KR102485291B1 - PEDV 유래 재조합 스파이크 단백질을 포함하는 PEDV 특이 IgA 검출 키트

Info

Publication number: KR102485291B1
Application number: KR1020210017530A
Authority: KR
Inventors: 윤인중; 유성식; 최환원; 김성균; 권혁일; 심영정
Original assignee: 주식회사 중앙백신연구소
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2021-02-08
Publication date: 2023-01-05
Also published as: KR20220114257A

Abstract

본 발명은 PEDV (Porcine epidemic diarrhea virus) 유래 재조합 스파이크 단백질을 이용한 PEDV 특이 IgA 검출 키트에 관한 것으로, 본 발명의 키트는 돼지유행성설사병 바이러스에 대한 특이 IgA를 높은 민감도와 특이도로 측정할 수 있으므로, 돼지의 초유로부터 돼지유행성설사병의 진단을 위한 체외진단분석에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

PEDV 유래 재조합 스파이크 단백질을 포함하는 PEDV 특이 IgA 검출 키트{Detection kit for PEDV-specific IgA comprising recombinant spike protein of PEDV}

본 발명은 PEDV (Porcine epidemic diarrhea virus) 유래 재조합 스파이크 단백질을 포함하는 PEDV 특이 IgA 검출 키트에 관한 것이다.

돼지유행성설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)는 포유자돈에서 급성 장염과 수양성 설사를 일으키며 이환율과 폐사율이 80~100%에 이르는 경제적으로 큰 피해를 가져오는 돼지 질병 바이러스이다. 돼지유행성설사병(PED)은 1971년에 영국에서 처음으로 발생 및 보고되었으며, 이 질병의 원인체인 PEDV는 1978년에 확인되었다. 아시아에서는 1982년에 처음으로 보고되었으며, 그 이후 유럽을 제외한 돼지를 사육하는 대부분의 국가에서 큰 경제적인 손실을 일으키고 있다. 국내에서는 1992년 처음으로 PEDV가 보고되었으며 그 후부터 2002년까지 꾸준하게 확산되었다. 그 이후 여러 종류의 백신과 적절한 백신접종 프로그램 등으로 질병 발생률이 줄어드는 경향을 보였으나 2013년 11월부터 변이주가 유입되면서 급속하게 재 유행하는 양상을 보이고 있으며 2014년 이후 발생이 감소하다가 2018년 다시 발생이 증가하는 것으로 확인되고 있다. 이 변이주는 유전학적 분석결과 2013년 5월에 발생한 미국 발 PEDV에 기인한 것으로 보여진다. PEDV의 주된 전염경로는 Fecal to oral transmission으로 알려져 있으며 지금까지 돼지에게만 유일하게 감염되는 것으로 알려져 있다.

PED의 임상증상은 돼지전염성위장염(transmissible gastroenteritis, TGE)과 유사하며, 대부분 자돈에서 심각한 설사증상이 나타나는데 1주령 이내의 신생자돈의 경우 탈수가 심하고 3~4일 설사를 하다가 폐사한다. 이유자돈은 수양성 설사가 4~6일간 계속 지속되다가 분변이 점점 점액성으로 변하며 대부분 회복되지만 체중감소가 나타난다. 성돈일 경우, 구토, 식욕결핍 등의 증상을 보이다가 회복된다. 증상은 어린 일령일수록 심하고, 폐사율은 1주령 이내는 평균 50-90%로 높고, 비육돈은 1주 정도가 지나면 자연 회복되고 폐사율은 1-3%로 낮다. PEDV에 감염된 돼지의 소장을 육안으로 관찰하면 소장벽이 얇아져 있고 수양성 설사분변이 가득 차 있다. 이러한 증상은 TGE와 매우 비슷하기 때문에 임상적으로 원인 병원체를 판단하기엔 어렵다.

PED를 확진하기 위해서는 실험실 진단방법인 형광항체법(fluorescent antibody, FA), 전자현미경법, RT-PCR, real-time PCR, ELISA 등으로 항원 또는 항체를 검출해야 한다. 이 중 RT-PCR과 real-time PCR을 이용한 진단법은 신속하고 특이성이 높은 진단법으로 많이 이용되고 있다. 요즘에는 농장에서 즉시 감염을 확인할 수 있는 Rapid kit도 사용되고 있다.

PED의 주요하고 유일한 임상신호는 물설사이다. 신생돼지는 바이러스 감염에 대해 장관점막을 보고하기 위해 수유기간 동안 고농도의 IgA (Immunoglobulin A)를 포함하는 초유 및 우유를 계속적으로 받아야 한다. 이처럼 현재 필드에서는 IgA 수치가 방어할 수 있는 지표이며, IgA 측정에 대해서 농장주 및 필드 수의사들 또한 중요함을 인지하고 있다. IgA를 측정하기 위한 일반적인 시험방법으로 초유의 중화항체 시험이 있으나, 시험방법이 복잡하고, 많은 시간이 소요되는 단점이 있다. 보다 간단하고 편리한 진단방법으로 ELISA를 이용하는데, 현재 상용화된 키트의 일치율이 초유의 중화항체와 상관관계가 떨어져 검사의 신뢰도가 의심되는 상황이다.

본 발명자는 현재까지 공인할만한 PEDV 특이 IgA 측정방법이 나와 있지 않아 검사의 민감도와 특이도가 높은 IgA 측정 키트가 필요할 것으로 생각되어 본 발명을 진행하게 되었다.

한편, 한국공개특허 제2005-0057750호에는 면역크로마토그래피법을 이용한 '돼지전염성위장관염(TGE)과 돼지유행성설사병(PED) 동시 진단용 초고속진단시약'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2016-0015963호에는 '돼지유행성 설사병 바이러스 분리와 배양법, 저온 순화주와 혈청 내성주 제조법, 상기 바이러스의 외피 단백질의 추출방법 및 상기 바이러스에 감염된 동물의 혈청 진단 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 'PEDV 유래 재조합 스파이크 단백질을 포함하는 PEDV 특이 IgA 검출 키트'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 돼지유행성설사병(PED)의 진단을 위해, PEDV 유래 스파이크 단백질을 재조합하고, 상기 재조합 단백질을 코팅 항원으로 사용하여 시료 내 PEDV에 대한 IgA를 검출할 수 있는 ELISA 키트를 제작하였다. 그 후, 상기 제작된 키트의 분석적 성능 및 임상적 성능을 분석한 결과, 본 발명에 따른 PEDV 유래 스파이크 단백질을 항원으로 사용한 키트가 PEDV에 대한 우수한 검출능과 민감도를 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 돼지유행성설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus)의 스파이크 단백질 및 돼지 IgA에 특이적으로 결합할 수 있는 2차 항체를 포함하는, 돼지유행성설사병 바이러스 특이 IgA 검출용 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 돼지유행성설사병 바이러스의 스파이크 단백질 및 돼지 IgA에 특이적으로 결합할 수 있는 2차 항체를 포함하는 ELISA 키트에 돼지유행성설사병(Porcine epidemic diarrhea) 의심 돼지의 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 2차 항체에 결합된 돼지 IgA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 돼지유행성설사병의 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 키트는 돼지유행성설사병 바이러스에 대한 특이 IgA를 높은 민감도와 특이도로 측정할 수 있으므로, 돼지의 초유로부터 돼지유행성설사병의 진단을 위한 체외진단분석에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 재조합 PEDV S1 항원의 발현 벡터 모식도이다.
도 2는 Protein-A resin을 이용한 재조합 PEDV S1 항원 정제 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 PEDV 양성 또는 음성 초유에 대한 중화항체가와 IgA ELISA와의 상관성을 보여준다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 돼지유행성설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 스파이크 단백질 및 돼지 IgA에 특이적으로 결합할 수 있는 2차 항체를 포함하는, 돼지유행성설사병 바이러스 특이 IgA 검출용 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 키트를 제공한다.

본 발명의 ELISA 키트에 있어서, 상기 스파이크 단백질은 PEDV에 감염된 돼지의 생물학적 시료 내의 PEDV 특이 IgA에 대한 항원으로 사용되었다. 상기 스파이크 단백질은 지지체에 고정된 형태일 수 있고, 상기 지지체는 유리, 알루미나, 세라믹, 탄소, 금, 은, 구리, 알루미늄, 화합물 반도체, 실리콘 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 지지체는 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 또는 유리로 된 슬라이드글라스일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 ELISA 키트에 있어서, 상기 스파이크 단백질은 동물세포에서 효율적으로 발현시키기 위해 인간 코돈 최적화된 서열로 암호화되어 있고, 상기 인간 코돈 최적화된 PEDV 스파이크 단백질의 암호화 서열은 서열번호 1의 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 "코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다.

또한, 본 발명의 ELISA 키트에 있어서, 상기 2차 항체는 PEDV 스파이크 단백질(항원)에 결합된 PEDV 특이 돼지 IgA와 결합하는 것으로서, 상기 2차 항체는 표지 물질이 결합된 형태일 수 있다. 상기 표지 물질은 HRP(Horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose Oxidase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(malate dehydrogenase), 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase), 이들의 유사체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 이러한 효소 또는 이들의 유사체를 사용할 경우에는 2차 항체에 상기 효소 또는 이들의 유사체를 결합시킨 후, 상기 효소 또는 이들의 유사체에 의하여 발색반응을 나타낼 수 있는 기질을 추가하여 반응시킴으로써, 상기 PEDV 스파이크 단백질(항원)에 결합된 PEDV 특이 돼지 IgA의 결합여부를 확인할 수 있다.

표지 물질은 상기와 같은 효소 외 당업계에 알려진 형광물질(Fluorescein), 방사성 물질 또는 색소(Dye) 등도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 ELISA 키트는 BTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine), OPD (o-Phenylenediamine dihydrochloride) 및 DAB (3,3'-diaminobenzidine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 발색기질을 추가로 포함할 수 있으나, 상기 종류로 기질이 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한,

(a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 돼지유행성설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus)의 스파이크 단백질 및 돼지 IgA에 특이적으로 결합할 수 있는 2차 항체를 포함하는 ELISA 키트에 돼지유행성설사병(Porcine epidemic diarrhea) 의심 돼지의 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및

(b) 상기 2차 항체에 결합된 돼지 IgA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 돼지유행성설사병의 진단 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 진단 방법에 있어서, 상기 PDEV 스파이크 단백질 및 2차 항체는 전술한 바와 같다.

상기 (b) 단계는 돼지 IgA가 결합된 2차 항체를 발색기질과 반응시켜 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 발색기질은 전술한 것과 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 포유동물 세포주에서의 고발현 항원 단백질

1.1. 재조합 PEDV S1 발현벡터의 제조

PEDV 유래 S1 단백질을 생산하기 위하여 동물세포에서 발현 가능한 벡터를 제조하였다(도 1). S1 단백질의 효율적인 발현을 위해 인간 코돈에 최적화된 염기서열(서열번호 1)을 합성하여 사용하였다. PEDV S1 단백질의 분비 발현을 위해 신호 펩타이드는 PEDV Spike 단백질의 신호 펩타이드 서열(서열번호 3)을 사용하였으며, C-말단에 인간 유래의 Fc 서열(서열번호 4)를 부착하여 발현되도록 하였다. PEDV S1과 Fc 사이에 His 태그를 삽입하여 정제 및 발현 확인이 용이하도록 벡터를 제작하였다. 이때 PEDV S1 코딩 유전자는 5' 말단에 EcoR I, 3' 말단에 His 태그와 Bgl Ⅱ 제한효소 자리를 삽입하여 합성하였다. 합성된 유전자는 제한효소 EcoR I과 Bgl Ⅱ로 절단한 다음, 동일한 제한효소로 절단한 Fc 발현 벡터인 pFUSE-hIgG1-Fc1(Invivogen사)에 삽입한 후, E. coli DH5α에 형질전환하여 벡터 구축을 확인하였고, 상기 벡터를 pFUSE-sPED S1-Fc1으로 명명하였다. 분비 발현 형태의 PEDV S1 단백질을 생산하기 위해 상기에서 구축된 pFUSE-sPED S1-Fc1 벡터를 프라이머 세트[정방향 프라이머: 5'-AGTCCAGTGTGGTGGGAATTCATGCGGTCCCTCACC-3' (서열번호 5) 및 역방향 프라이머: 5'-CGGGCCCTCTAGACTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGG-3' (서열번호 6)]를 이용하여 PEDV S1-Fc1 유전자를 증폭한 후 EcoR I 및 Xho I 제한효소로 절단하여 동일한 제한효소로 절단한 pcDNA-OriP 플라스미드(Invitrogen사)에 라이게이션(ligation)하여 벡터를 구축하였으며, 상기 벡터를 pcDNA-OriP-PED S1-Fc로 명명하였다.

1.2. PEDV S1 단백질 항원 제조

제작한 발현벡터는 ExpiCHO Protein Expression System (Thermo사)을 이용하여 PEDV S1 단백질 발현을 유도하였다. 제조사의 시험법에 따라, 세포현탁액에 항체 발현 플라스미드-리포좀(liposome) 복합체를 첨가하여 세포에 도입하였다. 7일간 37℃, 5% CO₂ 조건하에 진탕배양 후 여과를 거쳐 배양액을 확보하였다. 재조합 단백질이 생산된 배양액을 Protein-A 컬럼 중 하나인 HiTrap MabSelect Sure column (GE사)을 사용하여 순수 분리하였으며, HiTrap Desalting column (GE사)을 활용하여 PBS로 버퍼 교환을 수행하였다. 자세한 정제 조건은 표 1 및 표 2와 같다.

PEDV S1-Fc 융합단백질 정제 조건

Column resin	GE사 Hitrap MabSelect SuRe 5 mL
Equilibration	20 mM Sodium phosphate + 150 mM Sodium chloride (pH 7.2)
Washing	20 mM Sodium phosphate + 150 mM Sodium chloride (pH 7.2)
Elution	100 mM Glycin-HCl (pH3.0)
Re-Equilibration	20 mM Sodium phosphate + 150 mM Sodium chloride (pH 7.2)
Cleaning	100 mM NaOH

PEDV S1-Fc 융합단백질 버퍼 교환 조건

Sample	Purified sample
Column	Hitrap Desalting 5 mL
Exchange buffer	1X PBS, pH7.0
Cleaning buffer	20% EtOH
Flow rate	2 mL/min

이합체(dimer) 분석을 위해 비환원과 환원 형태로 시료를 마련하였으며, 모노머 형성을 위한 2-메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 처리하여 환원 형태를 유도하여 SDS-PAGE로 분석하였다(도 2). 합성한 항원은 시험에 사용되기 전까지 -70±10℃에 보관하였다.

실시예 2. 재조합 단백질을 이용한 IgA 진단키트의 중화항체가와의 상관관계 비교

2.1 돼지 초유를 이용한 중화항체가 측정

재조합 PEDV S1 항원을 이용한 Indirect ELISA 키트의 임상 평가를 위해 실험에 사용될 검체를 준비하였다. 먼저, PED에 감염되지 않은 개체(암퇘지, 생후 240일령)를 대상으로 PED 백신((주)중앙백신연구소)을 접종한 107두의 개체를 포함하는 그룹을 양성, 백신을 접종하지 않은 75두의 개체를 포함하는 그룹을 음성으로 분류한 뒤 각 개체의 초유를 이용하여 중화항체가를 측정하여 160배 이상은 양성 검체, 160배 미만을 음성 검체로 판정하였다. 상기 중화항체가 측정 방법은 초유원액 성분의 특성 상 초유 내 비특이 유발물질이 많아 초유원액을 PBS로 10진 희석한 후, 세포 배양 배지(DMEM)를 희석액으로 사용하여 2진 희석하였다. PEDV 중화용 바이러스(G2b type PEDV)를 200 TCID₅₀/0.1 ㎖로 제조하였다. Vero 세포가 분주되어 있는 96 well plate에 희석한 초유와 중화용 바이러스를 각각 100 ㎕/well씩 분주한 후, 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 멸균 PBS로 Vero 세포를 세척하고, 바이러스 증식용 배지 [2 ㎍의 트립신이 첨가된 MEM (Thermo Fisher社)]를 200 ㎕/well씩 분주하고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 3~5일간 배양하였다. 배양 후 세포변성효과(Cytopathic Effect, CPE)가 나타나지 않는 혈청의 최고 희석배수의 역수를 중화항체가로 하였다.

2.2. 돼지 초유를 이용한 Indirect ELISA 측정

상기에서 준비한 양성 또는 음성의 초유 검체 1 ㎕를 검체 희석액(2.5 %(w/v) 카제인이 첨가된 PBS) 299 ㎕와 혼합하여 희석시킨 후, Indirect ELISA 분석에 사용하였다.

먼저, 96-well strip 플레이트(Costar사)의 각 웰에 50 mM 중탄산나트륨(sodium bicarbonate) 버퍼에 희석한 재조합 PEDV S1 항원을 200 ng씩 넣고 4℃에서 16시간 동안 반응시켜 항원을 코팅하였다. 그 후, 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS (PBS-T)를 이용하여 3회 세척하고, 5% 탈지유를 포함하는 PBS-T를 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 블록킹시킨 후, PBS-T로 3회 세척하였다. 그 후, 준비한 초유 검체를 100 ㎕/well씩 첨가하고 18~25℃에서 30분 동안 반응시키고, 0.1% Tween 20을 포함하는 PBS-T로 5회 세척하였다. 그 후, 각 웰에 호스 래디쉬 퍼옥시다제가 결합된 염소 유래 항돼지 항체(HRP-conjugated, goat anti-pig IgA)를 100 ㎕ 분주하고, 플레이트를 30분 동안 상온(18~25℃)에서 반응시킨 후 PBS-T로 5회 세척하였다. 이후 플레이트의 각 웰에 효소 기질액 100 ㎕를 첨가하고, 30분간 상온(18~25℃)에서 반응시킨 후 반응 정지액 100 ㎕를 첨가하여 종료시켰으며, 변화된 색깔의 정도를 분광 광도계를 이용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

2.3. Indirect ELISA 측정 결과 분석

먼저 각 검체와 본 발명의 개발품에 사용되는 음성 대조액 [10 mM PBS에 Porcine Serum(Thermo Fisher社)과 Proclin^TM 300을 적량 혼합] 및 양성 대조액 [10 mM PBS에 PEDV 정제 IgA(300 ng/㎖), Porcine Serum(Thermo Fisher社)과 Proclin^TM 300을 적량 혼합]을 측정하여 아래와 같이 판정하였다.

2.3.1. 음성 대조액 및 양성 대조액 판단 기준

음성 대조액은 2 well (A1, A2)을 이용하여 시험하며, 평균 흡광도 값은 0.2 이하여야 한다. 만약 1개 이상의 값이 평균 흡광도 값 범위를 벗어났을 경우, 검사 과정이나 시약에 문제가 있을 수 있으므로 그 원인을 확인한 후 재검사 한다.

·음성 대조액 평균값 = (A1 흡광도값 + A2 흡광도값) / 2

양성 대조액은 2 well (B1, B2)을 이용하여 시험하며, 평균 흡광도 값은 0.3 이상이어야 한다. 만약 1개 이상의 값이 평균 흡광도 값 범위를 벗어난 경우에는 검사과정이나 시약에 문제가 있을 수 있으므로 그 원인을 확인한 후 재검사 한다.

·양성 대조액 평균값 = (B1 흡광도값 + B2 흡광도값) / 2

2.3.2. 결과 판정

검체 중의 PEDV에 대한 IgA 항체 존재 여부는 양성 또는 음성 대조액의 흡광도에 대한 검체의 흡광도 비율(S/P)에 의해 결정하였다.

·S/P ratio = (검체 흡광도 - 음성 대조액 평균 흡광도) / (양성 대조액 평균 흡광도 - 음성 대조액 평균 흡광도)

결과 판독 기준

S/P ratio	≥ 0.50	< 0.50
결과	양성	음성

상기 결과 판독 기준에 근거하여 본 발명의 재조합 PEDV S1 항원을 이용한 Indirect ELISA 결과를 분석하면, 본 발명의 Indirect ELISA 검사법은 중화항체가 검사법과 비교 시 98.1%(105/107)의 민감도와 85.3%(64/75)의 특이도를 나타내어 일치율이 92.9%로 확인되었다. 하기 표 4는 본 발명의 Indirect ELISA 키트를 사용한 검사법과 중화항체가 검사법과의 민감도와 특이도를 비교한 결과이다.

본 발명의 Indirect ELISA 키트를 이용한 검체의 PEDV IgA 검출 결과

		중화항체가 측정 검사		계
		양성	음성	계
Indirect ELISA 측정 검사	양성	105	11	116
Indirect ELISA 측정 검사	음성	2	64	66
계		107	75	182

실시예 3. 돼지 초유를 이용한 PEDV IgA ELISA 키트간 성능 비교

본 발명의 재조합 PEDV S1 항원을 이용한 Indirect ELISA 키트의 성능을 평가하기 위해, 동일한 검체를 이용하여 상용 제품[PED IgA Ab ELISA (A社)]과의 성능 비교를 진행하였다. 분석에 사용된 검체는 상기 실시예 2에서 사용된 검체와 동일하다. 상용 제품은 제조사 설명서에 기재된 방법에 따라 수행되었다. 그 결과, 시판되고 있는 상용 제품은 중화항체가 검사법과 비교하여, 98.1%(105/107)의 민감도와 1.3%(1/75)의 특이도를 나타내어 일치율이 58.2% 수준에 불과함을 확인할 수 있었으며, 이의 결과를 통해 본 발명의 재조합 PEDV S1 항원을 이용하여 제조한 Indirect ELISA 키트의 진단능이 상용화된 제품보다 우수함을 알 수 있었다.

상용 제품을 이용한 검체의 PEDV IgA 검출 결과

		중화항체가 측정 검사		계
		양성	음성	계
상용 제품 (A社)	양성	105	74	179
상용 제품 (A社)	음성	2	1	3
계		107	75	182

<110> Choong Ang Vaccine Lab <120> Detection kit for PEDV-specific IgA comprising recombinant spike protein of PEDV <130> PN21007 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2376 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized PEDV spike protein <400> 1 atgcggtccc tcacctactt ttggctcttc ctccccgtgc tctctactct ctctctcccc 60 caggatgtca ctcgctgttc tgctaacacc aacttccggc gcttcttctc caagttcaac 120 gtgcaggcgc ctgccgtggt ggtgctggga ggctacctgc ccatcggcga gaaccagggc 180 gtgaacagca cctggtactg cgcaggacag caccctaccg cctccggagt gcacggcatc 240 ttcgtgagcc acatcagggg cggccacggc ttcgagatcg gcatctccca ggagccattc 300 gaccctagcg gctaccagct ctacctgcac aaggccacca acggcaacac caacgccacc 360 gccaggctga gaatctgcca gttcccttcc atcaagaccc tgggccccac cgccaacaac 420 gacgtgacca ccggcagaaa ctgcctgttc aacaaggcca tcccagccca catgtccgag 480 cacagcgtgg tgggcatcac ctgggacaac gacagggtga ccgtgttcag cgacaaaatc 540 tactacttct acttcaagaa cgactggtcc agagtggcca ccaagtgcta caacagcggc 600 ggctgcgcca tgcagtacgt gtacgagcca acctactaca tgctgaacgt gacctccgcc 660 ggcgaggacg gcatcagcta ccagccttgc accgccaact gcatcggcta cgccgccaac 720 gtgttcgcca ccgagcccaa cggccacatc ccagagggct tctccttcaa caactggttc 780 ctgctgtcca acgacagcac cctggtgcac ggcaaggtgg tgagcaacca gccactgctg 840 gtgaactgcc tgctggccat ccctaaaatc tacggcctgg gccagttctt ctccttcaac 900 cagaccatcg acggcgtgtg caacggagcc gccgtgcaga gggcaccaga ggccctgcgc 960 ttcaacatca acgacacctc cgtgatcctg gcagagggca gcatcgtgct gcacaccgcc 1020 ctgggcacca acttctcctt cgtgtgcagc aacagctcca accctcacct ggccaccttc 1080 gccatgccac tgggagcaac ccaggtgcct tactactgct tcctgaaggt ggacacctac 1140 aacagcaccg tgtacaagtt cctggccgtg ctgcctccaa ccgtgcggga gatcgtgatc 1200 accaagtacg gcgacgtgta cgtgaacggc ttcgagtacc tgcacctggg cctgctggac 1260 gcagtgacca tcaacttcac cggacacgga accgacgacg acgtgtccgg cttctggacc 1320 atcgccagca ccaacttcgt ggacgcactg atcgaggtgc agggaaccgc catccagcgc 1380 atcctgtact gcgacgaccc cgtgtcccag ctcaagtgca gccaggtggc cttcgacctg 1440 gacgacggct tctacccaat cagctcccgc aacctgctgt cccacgagca gcccatcagc 1500 ttcgtgaccc tgccatcctt caacgaccac agcttcgtga acatcaccgt gtccgccagc 1560 ttcggcggac actccggagc aaacctgatc gccagcgaca ccaccatcaa cggcttcagc 1620 tccttctgcg tggacacccg ccagttcacc atctccctgt tctacaacgt gaccaacagc 1680 tacggctacg tgtccaagag ccaggactcc aactgccctt tcaccctgca gagcgtgaac 1740 gactacctgt ccttcagcaa gttctgcgtg tccaccagcc tgctggcctc cgcctgcacc 1800 atcgacctgt tcggctaccc cgagttcggc tccggcgtga agttcaccag cctgtacttc 1860 cagttcacca agggcgagct gatcaccgga acccctaagc ccctggaggg agtgaccgac 1920 gtgagcttca tgaccctgga cgtgtgcacc aagtacacca tctacggctt caagggcgag 1980 ggcatcatca ccctgaccaa cagctccttc ctggccggcg tgtactacac ctccgacagc 2040 ggccagctcc tggccttcaa gaacgtgacc tccggagccg tgtacagcgt gaccccttgc 2100 tccttcagcg agcaggcagc ctacgtggac gacgacatcg tgggcgtgat cagctccctg 2160 agctccagca ccttcaactc cacccgcgag ctgcctggct tcttctacca ctccaacgac 2220 ggcagcaact gcaccgagcc cgtgctggtg tacagcaaca tcggcgtgtg caagtccggc 2280 agcatcggct atgtgccttc ccagagcgga caggtgaaga tcgccccaac cgtgactggc 2340 aatatcagca tccccacaaa cttctcaatg tcaatt 2376 <210> 2 <211> 791 <212> PRT <213> Porcine epidemic diarrhea virus <400> 2 Arg Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr Leu 1 5 10 15 Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe Arg 20 25 30 Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val Leu 35 40 45 Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr Trp 50 55 60 Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile Phe 65 70 75 80 Val Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser Gln 85 90 95 Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala Thr 100 105 110 Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe Pro 115 120 125 Ser Ile Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr Gly 130 135 140 Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu His 145 150 155 160 Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe Ser 165 170 175 Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val Ala 180 185 190 Thr Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Glu 195 200 205 Pro Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile 210 215 220 Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn Val 225 230 235 240 Phe Ala Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Asn 245 250 255 Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys Val 260 265 270 Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro Lys 275 280 285 Ile Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp Gly 290 295 300 Val Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg Phe 305 310 315 320 Asn Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val Leu 325 330 335 His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser Ser 340 345 350 Asn Pro His Leu Ala Thr Phe Ala Met Pro Leu Gly Ala Thr Gln Val 355 360 365 Pro Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val Tyr 370 375 380 Lys Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile Thr 385 390 395 400 Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Glu Tyr Leu His Leu Gly 405 410 415 Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp Asp 420 425 430 Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp Ala 435 440 445 Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys Asp 450 455 460 Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu Asp 465 470 475 480 Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln 485 490 495 Pro Ile Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val 500 505 510 Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu 515 520 525 Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp 530 535 540 Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr 545 550 555 560 Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln 565 570 575 Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser 580 585 590 Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe 595 600 605 Gly Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly 610 615 620 Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp Val 625 630 635 640 Ser Phe Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly Phe 645 650 655 Lys Gly Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala Gly 660 665 670 Val Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn Val 675 680 685 Thr Ser Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu Gln 690 695 700 Ala Ala Tyr Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu Ser 705 710 715 720 Ser Ser Thr Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr His 725 730 735 Ser Asn Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser Asn 740 745 750 Ile Gly Val Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln Ser 755 760 765 Gly Gln Val Lys Ile Ala Pro Thr Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile Pro 770 775 780 Thr Asn Phe Ser Met Ser Ile 785 790 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Porcine epidemic diarrhea virus <400> 3 Met Arg Ser Leu Ile Tyr Phe Trp Leu Leu Leu Pro Val Leu Pro Thr 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro 20 <210> 4 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Val Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 1 5 10 15 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 agtccagtgt ggtgggaatt catgcggtcc ctcacc 36 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgggccctct agactcgagt catttacccg gagacagg 38

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 돼지유행성설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus)의 스파이크 단백질의 카복시 말단에 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 인간 유래의 Fc 서열이 융합된 융합단백질의 이합체(dimer) 및 돼지 IgA에 특이적으로 결합할 수 있는 2차 항체를 포함하는, 초유 시료에서 돼지유행성설사병 바이러스 특이 IgA 검출용 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 키트.
제1항에 있어서, 상기 스파이크 단백질은 인간 코돈 최적화된 서열번호 1의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 ELISA 키트.
제1항에 있어서, 상기 2차 항체는 표지 물질이 결합된 것을 특징으로 하는 ELISA 키트.
제3항에 있어서, 상기 표지 물질은 HRP(Horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose Oxidase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(malate dehydrogenase), 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase), 이들의 유사체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 ELISA 키트.
제1항에 있어서, 상기 ELISA 키트는 BTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine), OPD (o-Phenylenediamine dihydrochloride) 및 DAB (3,3'-diaminobenzidine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 발색기질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 ELISA 키트.
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 돼지유행성설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus)의 스파이크 단백질의 카복시 말단에 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 인간 유래의 Fc 서열이 융합된 융합단백질의 이합체(dimer) 및 돼지 IgA에 특이적으로 결합할 수 있는 2차 항체를 포함하는 ELISA 키트에 돼지유행성설사병(Porcine epidemic diarrhea) 의심 돼지의 초유 시료를 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 2차 항체에 결합된 돼지 IgA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 돼지유행성설사병의 진단 방법.
제6항에 있어서, 상기 (b) 단계는 돼지 IgA가 결합된 2차 항체를 발색기질과 반응시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 진단 방법.