WO2009099204A1 - アビバクテリウム・パラガリナラム抗体の検出方法およびキット - Google Patents
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- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/14—Disorders of ear, nose or throat
Definitions
- the present invention relates to a detection method and a detection kit for an Abibacterium paragalinarum antibody.
- Avibacterium paragallinarum hereinafter also referred to as A.pg, formerly known as Hemophilus paragallinarum
- A.pg Avibacterium paragallinarum
- C type outer membrane protein hereinafter, an antibody induced by “HMT p210 polypeptide”
- HMT p210 polypeptide an antibody induced by “HMT p210 polypeptide”
- the present invention relates to a method for detecting an Abibacterium paragalinarum antibody, and a detection kit used in the method.
- Peptides are called by names such as dipeptides, tripeptides, oligopeptides and polypeptides depending on the number of amino acid residues constituting them. In the present invention, these are simply defined as peptides without distinction.
- chicken infectious coryza An important respiratory organ disease of chickens is chicken infectious coryza which develops due to A.pg infection. Chickens that develop chicken infectious coryza have nasal discharge, facial swelling or lacrimation as the main symptoms. Chicken infectious coryza has a large economic loss because it causes a decrease in the breeding rate of chickens, a delay in the start of spawning, a decrease in the spawning rate or a halt of spawning.
- Page et al. Classified A.pg into three types, A, B and C (Non-patent Document 1), and Sawata et al. Classified into two types, 1-type and 2-type (Non-patent Document 2). . Thereafter, it was reported by Kume et al. That Page type A corresponds to type 1 of Sawata et al. And Page type C corresponds to type 2 of Sawata et al. (Non-patent Documents 3 and 4).
- A.pg type A type 1 bacteria
- A.pg-A type bacteria type C
- A.pg-C type type 2 bacteria
- a gene that encodes an infection protective antigen is cloned by a component vaccine or genetic recombination technology that removes only an infection protective antigen, that is, an effective component from the bacterial cells or culture supernatant, and uses the vaccine, Genes that express genes in bacteria, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, etc., purify the expression products expressed in large quantities, and use these as vaccines for recombinant vaccines, or for genes that encode protective antigens as viral vectors Development of vector vaccines inserted into the
- Tokunaga et al. Induced the production of hemagglutination-inhibiting antibody (HI antibody) from the culture solution of A. pg-A type bacteria, and protected the A. pg-A type A
- HI antibody hemagglutination-inhibiting antibody
- Patent Document 1 A polypeptide having a molecular weight of about 130 kDa derived from a bacterium was successfully purified.
- Patent Document 1 the present inventors have found that the recombinant protein cloned from a DNA fragment encoding the 130 kDa polypeptide and expressed in Escherichia coli protects against infection of chicken infectious coryza caused by Abibacterium paragalinarum type A.
- an HMT-p210 gene encoding an A type HMT-p210 polypeptide (cell outer membrane protein having hemagglutination activity) consisting of 2,042 amino acids was identified.
- a DNA fragment that hybridizes with the DNA fragment was also cloned from type C bacteria to obtain a type C HMT ⁇ p210 gene derived from type C bacteria (Patent Document 2).
- region 1 the region of about 3.4 kbp on the 5 ′ side
- region 3 3′-side approximately 1.2 kbp region
- region 2 approximately 1.5 kbp region
- Noro et al. Have reported that the HMTp210 gene discovered by Tokunaga et al. Is important as a target region for type-specific vaccines. Noro et al. Immunized chickens with a peptide encoded by a 4,801 bp to 5,157 bp DNA fragment, which is part of the HMT p210 gene encoding the A.pg-A type HMT p210 polypeptide. It has been reported that HI antibody is induced against A. pg-A type bacteria and has a vaccine effect (Patent Document 3).
- HA hemagglutinin
- HI test hemagglutination inhibition test using an anti-HA antibody
- B-ELISA blocking ELISA
- a type-specific monoclonal antibody as a serodiagnosis method replacing the HI test
- Non-patent Document 6 B-ELISA is an ELISA method that competitively detects antibodies in serum using monoclonal antibodies that react with each serotype as antigens obtained by ultrasonically disrupting type A or C cells. . This method has the advantage that it has higher sensitivity than the HI test and can handle many samples.
- the B-ELISA is a system that detects an antibody against only an antigen epitope recognized by one monoclonal antibody in each serotype.
- An object of the present invention is to provide an antibody detection method capable of distinguishing antibodies against A and P type A and C type bacteria.
- the present invention provides a method for detecting an antibody characterized by using a recombinant antigen peptide capable of distinguishing antibodies against A. pg A-type bacteria and C-type bacteria. More specifically, the present invention provides an antibody detection method using a recombinant antigen peptide containing an amino acid sequence in a region having low homology between the outer membrane proteins of A. pg A and B type bacteria. .
- the present inventors have found that the p210 polypeptide encoded by the HMTHp210 gene, which is important as a vaccine antigen, is located at a distant position in the amino acid sequence of region 2.
- a homologous amino acid sequence is included between pg-A and A.pg-C (amino acids 243 to 273 of A.pg-A described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2)
- amino acids 243 to 273 of A.pg-A described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 Of the 38th to 68th amino acid sequences of the A. pg-C type bacterium of A. pg-C, 29 amino acids matched (see FIG. 3), and the amino acid sequence was found to form an epitope.
- the inventors of the present application include an amino acid sequence having high homology between A.pg-A and A.pg-C type bacteria in part of the C-terminal region of region 2 defined by Tokunaga et al. I found out. Therefore, in each of the HMTp210 polypeptides of A.pg-A type bacteria and A.pg-C type bacteria, peptides that do not contain the above two homologous amino acid sequences are prepared, and the obtained peptides are used to fix to the microplate. Antibody measurement by phased ELISA was performed.
- the present invention is as follows.
- a method for detecting an Abibacterium paragalinarum antibody comprising an antibody measurement method in which a specimen is reacted with at least one antigen of peptide A or B below.
- Peptide A A peptide which is a part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and which comprises a peptide chain of 6 amino acids or more and does not contain the amino acid sequences 243 to 273 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- Peptide B A peptide that is a part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, comprises a peptide chain of 6 amino acids or more, and does not contain the 38th to 68th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
- Peptide B A part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, comprising the amino acid sequence of positions 69 to 452 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the 38th to 68th positions of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A peptide that does not contain an amino acid sequence.
- Peptide A A peptide comprising the 8th to 236th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- Peptide B A peptide consisting of the amino acid sequence of positions 69 to 452 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
- peptide A is the following peptide chain.
- Peptide A A part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, comprising the amino acid sequence from 274 to 445th of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the 243rd to 273th of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A peptide that does not contain an amino acid sequence.
- Peptide A A peptide comprising the amino acid sequence at positions 274 to 445 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- peptide A or B is a peptide having an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are deleted, added, or substituted
- the detection method described The detection method described.
- Peptide A A peptide which is a part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and which comprises a peptide chain of 6 amino acids or more and does not contain the amino acid sequences 243 to 273 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- Peptide B A peptide that is a part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, comprises a peptide chain of 6 amino acids or more, and does not contain the 38th to 68th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
- Peptide B A part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, comprising the amino acid sequence of positions 69 to 452 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the 38th to 68th positions of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A peptide that does not contain an amino acid sequence.
- Peptide A A peptide comprising the 8th to 236th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- Peptide B A peptide consisting of the amino acid sequence of positions 69 to 452 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
- a method and kit for detecting an Abibacterium paragalinarum antibody are provided. Since the peptides derived from A.pg-A and A.pg-C used in the present invention do not contain homologous amino acid sequences, for example, vaccines derived from A.pg-A and A Each antibody specifically binds to an antibody induced by a vaccine derived from type pg-C. Therefore, the detection method and kit of the present invention are not limited to the case where each vaccine is administered alone to a chicken, but also when a mixed vaccine is administered, the antibody titer against each bacterium present in chicken serum is determined. Each can be identified and measured.
- the present invention as a result of using the purified recombinant antigen, it is possible to immobilize a higher concentration of antigen as compared with the conventional technique using a disrupted product of A.pg cells. It is considered possible to construct an antibody measurement system with higher detection sensitivity.
- the antibody detection method of the present invention since the antibody detection method of the present invention has the ability to identify the serotype of A.pg in the antigenic peptide, it is simpler than the B-ELISA using a type-specific monoclonal antibody, and has a viewpoint of antigenic mutation of bacteria. Can detect an antibody against A.pg more reliably.
- the detection method of the present invention can identify not only chicken serum after vaccine administration but also antibodies in A.pg infected chicken serum.
- FIG. 1 is a drawing showing the positional relationship between HMTp210 polypeptide and fragments thereof and each fragment.
- the black part shows the homologous sequence in the region 2, and the shaded part shows the C-terminal homologous region of the region 2.
- the amino acid sequence numbers shown in the figure correspond to the amino acid sequence numbers disclosed in SEQ ID NO: 1 (type A) and SEQ ID NO: 5 (type C) in Patent Document 2.
- FIG. 2 is a drawing showing the results of SDS-PAGE of each polypeptide purified from E. coli: M: marker, lane 1: P-A ⁇ 6b-1b, lane 2: P-C ⁇ 6b-1b FIG.
- FIG. 3 is a drawing showing the homologous amino acid sequence and its position in the non-homologous region of the amino acid sequence encoded by the HMT p210 gene.
- the amino acid sequence numbers shown in the figure correspond to the amino acid sequence numbers disclosed in SEQ ID NO: 1 (type A) and SEQ ID NO: 5 (type C) in Patent Document 2.
- FIG. 4 is a drawing showing the correlation between the ELISA value using the polypeptide P-A ⁇ 6b-2 # in the serum before type A bacterial challenge as an antigen and the onset protection after type A bacterial challenge.
- ⁇ represents a chicken that did not develop
- ⁇ represents a chicken that developed.
- FIG. 5 is a drawing showing the correlation between the ELISA value using the polypeptide P-C ⁇ 6b-1b in the serum before C-type bacteria attack as an antigen and the onset protection after C-type bacteria challenge.
- ⁇ represents a chicken that did not develop
- ⁇ represents a chicken that developed.
- the present invention relates to a homologous amino acid sequence between A.pg-A type bacteria and A.pg-C type bacteria that are slightly present in the non-homologous region in the amino acid sequence encoded by the HMTpgp210 gene derived from A.pg. It is characterized by a method and a kit for detecting an Abibacterium paragalinarum antibody by an antibody assay using a peptide from which the peptide has been removed as an antigen.
- the non-homologous region of the amino acid sequence encoded by the HMT p210 gene derived from A.pg-A and / or A.pg-C as an antigen Part of it is used.
- the non-homologous region is an amino acid sequence encoded by a DNA region of about 3.4 kbp on the 5 ′ side (region 1) and an amino acid sequence encoded by a DNA region of about 1.2 kbp on the 3 ′ side (region 3).
- nucleotide sequences corresponding to the non-homologous regions of the HMT p210 gene of the three A-type strains (221 strain, O53 strain and W strain) isolated from A.pg-infected chickens are completely identical between the O53 strain and the W strain. Only one base is mutated between the strain and 221 strains.
- nucleotide sequence of the same region between 3 strains of C-type bacteria 53-47 strain, modest strain and NK-1 strain
- the A.pg-1.3 gene and a DNA fragment containing it can be obtained according to the following method.
- a medium appropriately containing polypeptone, glucose, casamino acid, sodium glutamate, yeast extract, sodium chloride, chicken water, ⁇ NAD, chicken serum and the like is used.
- chicken serum-added chicken broth medium 1000 mL medium, polypeptone S 5 g, casamino acid 1 g, sodium chloride 5 g, sodium L-glutamate 5 g, glucose koji 1 g, yeast extract for growth of small and medium-sized cells.
- the culture conditions are usually set in the range of a temperature of 37 ° C. and a period of 16 to 24 hours, but may be appropriately adjusted according to the purpose of use, the culture form, the amount of planted bacteria, the medium scale, and the like.
- the bacterial cells in the culture solution are recovered in the sediment by centrifugation (8,000 rpm, 20 minutes).
- the HMT p210 gene is derived from total RNA, mRNA or genomic DNA extracted from bacterial cells as a starting material.
- General gene recombination technology described by Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press , NY, 1989). In practice, commercially available kits are used.
- reagents such as TRIzol reagent (Invitrogen), ISOGEN (Nippon Gene), StrataPrep Total RNA Purification Kit (Toyobo), for extraction of chromosomal DNA, Sepagene kit (Sanko Junyaku), ISOPLANT (Wako Pure Chemicals), mRNA purification kits such as mRNA Purification Kit (Amersham Biosciences), Poly (A) Quick mRNA Isolation Kit (Toyobo), mRNA Separator Kit (Clontech), and conversion to cDNA SuperScript plasmid system for cDNA synthesis and plasmid cloning (Invitrogen), cDNA Synthesis Kit (Takara Shuzo), SMART PCR cDNA Synthesis & Library Construction Kits (Clontech), Directionary cDNA Library Construction systems (Novagen), GeneAmp GeneAmp Applied Biosystems).
- TRIzol reagent Invitrogen
- ISOGEN Nippon Gene
- chromosomal DNA is extracted from the cells collected by centrifugation using a Sepagene kit (Sanko Junyaku), etc., and cleaved with an appropriate restriction enzyme (preferably EcoRI is used). And inserted into a commercially available cloning vector (for example, ⁇ gt11; New England Biolabs (NEB)) to prepare a DNA library.
- DNA fragments of various sizes are amplified by the PCR method using LA Taq (Takara Bio Inc.) using the obtained DNA fragment as a template (template) according to the attached protocol.
- Primers used for PCR are designed based on the nucleotide sequence of HMT p210 gene derived from A.pg-A type bacteria and A.pg-C type bacteria disclosed by Tokunaga et al. (Patent Document 1). PCR primers can be easily obtained by requesting a DNA synthesis contract organization (for example, Sigma Genosys Japan). At this time, base sequences of appropriate restriction enzyme cleavage sites are added to the 5 ′ end of the upstream Primer and the 5 ′ end of the downstream Primer.
- the PCR amplification product is cloned into a gene cloning vector, pCR-XL-TOPO (Invitrogen Corporation), and a plasmid pCRDNT into which various DNA fragments are inserted is obtained.
- the base sequence of the obtained DNA fragment is once cloned into pBluescript II SK + (Stratagene) or pCR2.1-TOPO (Invitrogen) and then determined by a DNA sequencer (ABI Prism 377 Applied Biosystems).
- a peptide with a partial amino acid mutation can also be used as an antigen in the antibody measurement method of the present invention.
- a mutation is introduced into a specific amino acid in a peptide, it is common to use a cytodirected mutagenesis method in which a mutation is introduced into the base sequence of a DNA fragment encoding the peptide.
- Takara's Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-Super Express Km, Mutan-Express Km, Mutan-K, etc.), Stratagene QuickChange Multi-Site-Directed Mutagenesis Kit, and QuickChange XL XL Site- A commercially available kit such as Directed ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Mutagenesis Kit or Invitrogen's GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System is used according to the attached protocol.
- Each DNA fragment is expressed by incorporating the thus obtained DNA fragment into an appropriate expression vector and introducing it into a host.
- an appropriate expression vector for example, pQE30 (manufactured by Qiagen) or pET22b (manufactured by Novagen or Takara Bio Inc.) may be used as an expression vector, and may be appropriately selected.
- Bacteria, yeast, animal cells, plant cells, insect cells and the like are commonly used for the expression of foreign proteins and peptides, but may be selected according to the purpose of use.
- a known method may be used when transforming a host cell.
- a calcium phosphate method for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using lipofectin-based liposomes, a protoplast polyethylene glycol fusion method, an electroporation method, and the like can be used, and an appropriate method may be selected depending on the host cell to be used.
- Escherichia coli that can be expressed in a large amount is used.
- Various expression vectors having trp promoter, T7 promoter, cspA promoter, and the like have been developed and marketed for E. coli expression, and may be appropriately selected from these.
- E. coli such as BL21, HMS174, DH5 ⁇ , HB101, JM109 or the like is selected as a host in accordance with the expression vector. Transformation of E. coli can be performed using a commercially available competent cell according to the attached method. In this way, recombinant E. coli that produces the desired polypeptide is obtained.
- Medium used for culturing E. coli eg, LB, SOC, SOB, etc.
- reagent used for selection of transformants eg, ampicillin, etc.
- reagent used for expression induction eg, indole acetic acid (IAA)
- IPTG isopropylthio- ⁇ -D-galactoside
- the pH of the medium is used in a range suitable for the growth of E. coli (pH 6-8).
- a surfactant for example, Triton X100
- a chelating agent for example, EDTA
- lysozyme and the like may be appropriately added to distilled water.
- a certain amount of the expression product collected in the supernatant and sediment is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie Brilliant Blue, and then the expression of the target product is confirmed from the molecular size and stained image.
- a method based on an antigen-antibody reaction such as ELISA, Western blot, or dot blot may be used for confirmation (or detection) of the target. Both are general methods for detecting foreign proteins and polypeptides expressed in E. coli, and may be appropriately selected depending on the purpose.
- purification methods generally used in protein chemistry, such as centrifugation, salting out, ultrafiltration, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchange
- a combination of methods such as chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, and hydroxyapatite chromatography is used.
- the amount of the obtained protein or polypeptide is measured using a protein measuring reagent such as BCA-Protein-Assay-Reagent-Kit (Pierce-Biotechnology, Inc) or Protein-Assay-Kit (BIO-RAD, Inc).
- the target product may be expressed in a form fused with another polypeptide or peptide.
- a His-tag expression system Novagen
- a system Sigma
- GST fusion protein purification system Amersham Pharmacia
- MagneHis Protein Protein Purification System Promega
- GST transferase
- the target polypeptide is specifically purified using a nickel affinity column (GE Healthcare Bioscience) after being expressed as a fusion protein with oligohistidine as in the examples of the present invention. .
- Various peptides in the region that do not contain the homologous amino acid sequence between A.pg-A type bacteria and C type bacteria thus obtained are used to detect chicken infectious coryza vaccine antibodies and serological diagnosis of A.pg infected chickens. It is used for the antibody measurement for performing. Specifically, antibody measurement methods such as ELISA, Western blot, and dot blot are applied. When a large number of specimens are handled, an ELISA method using a microplate method in which a peptide is immobilized is preferable.
- a peptide consisting of a non-homologous region in the amino acid sequence encoded by the A.pg-1.3 gene and a part thereof can be used.
- an epitope recognized by an antibody can be formed with about 6 to 10 amino acids.
- a peptide which is a part of a non-homologous region and has a continuous amino acid sequence of 6 amino acids or more can be used in the present invention.
- the polypeptide encoded by A ⁇ 6b-2 # (P-A ⁇ 6b-2 #), the polypeptide encoded by C ⁇ 6b-1b (P-C ⁇ 6b-1b) and the polypeptide encoded by A ⁇ 7b-1b ( P-A ⁇ 7b-1b), and a part of the peptide consisting of a heterologous region in the amino acid sequence encoded by the A.pg-1.3 gene containing them are used.
- a mutant peptide obtained by adding an amino acid mutation to a part of these peptides can also be used as long as the sensitivity is not lowered and the nonspecific reaction is increased so as to hinder antibody detection.
- These peptides can be used in various combinations of two or more peptides according to the purpose.
- a single peptide or a mixture of peptides derived from A.pg-A bacteria or peptides derived from A.pg-C bacteria are preferably used independently.
- the immune serum after vaccine administration is a mixture of the above peptide and adjuvant, usually administered subcutaneously, intradermally, intraperitoneally, etc. of appropriate animals 1 to 3 times at intervals of 2 to 4 weeks, and then collected blood is collected. It can be obtained by centrifugation (14,000 rpm, 5 minutes).
- adjuvant Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, aluminum hydroxide (for example, ImjectAlum (Pierce)) and the like are used.
- Sera from animals infected with Abibacterium paragalinarum can also be obtained by centrifuging blood.
- ELISA is performed by various methods, but any method may be used.
- a specimen immunoglobulin serum or A.pg-infected serum
- an anti-chicken antibody labeled as a secondary antibody is added.
- the sample and labeled anti-peptide (solid phase antigen) antibody are added simultaneously or separately to the microplate on which the peptide is immobilized, or the anti-peptide antibody is not labeled.
- ELISA using a competitive method in which a labeled secondary antibody against an anti-peptide antibody is added can be performed.
- Peptide immobilization on a microplate is usually performed by leaving the antigen in an amount of 1 to 10 ⁇ g / ml and leaving it at room temperature (around 25 ° C) for 30 minutes to 2 hours or at a low temperature (around 4 ° C) for 12 to 24 hours.
- blocking reagents for suppressing non-specific reactions include Block Ace (Snow Brand), ELISA blocking reagent (Roche Diagnostics), bovine serum albumin solution, skim milk solution, etc. That's fine.
- PBS, TBS, or those containing polysorbate (Tween 20) or preservative (sodium azide), etc. are used for washing after each reaction, and 2-3 mol of sulfuric acid is used for stopping the reaction.
- HRP As the secondary antibody, HRP, fluorescent labeling, RI, anti-chicken IgG monoclonal antibody labeled by biotinylation, such as anti-chicken IgG-HRP (Betchel), etc. are commercially available, and these may be used.
- biotinylation such as anti-chicken IgG-HRP (Betchel), etc.
- OPD orthophenylenediamine
- TMBZ 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine
- an ELISA method using a two-antibody sandwich in which an antibody against a peptide is immobilized on a microplate and the peptide is bound to this antibody may be used.
- the antibody against the peptide can be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
- the polyclonal antibody is obtained by the same method as the above immune serum. Examples of animals used for immunization include chickens, rats, guinea pigs, hamsters, dogs and monkeys.
- Monoclonal antibodies can be obtained by collecting antibody-producing cells such as spleen cells or lymphocytes from animals immunized with A. pg cells or polypeptides, and using the method of Milstein et al.
- the established method for measuring anti-A.pg antibodies by ELISA is used for detection of vaccine antibodies or antibodies induced by A.pg infection.
- the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
- A.pg-1.3 gene and DNA fragment in the region A.pg-A type 221 and A.pg-C type 53-47 genomic DNA libraries were prepared by the method of Tokunaga et al. 84969). Briefly, chromosomal DNA is extracted from bacterial cells collected by centrifugation (8,000 rpm, 20 minutes) using a Sepagene kit (Sanko Junyaku), digested with the restriction enzyme Sau3AI, and a DNA library is prepared. did. Using the DNA fragment of this DNA library as a template (template), LA Taq (Takara Bio Inc.) was used to amplify a fragment comprising a part of the A.pg-1.3 gene by PCR according to the attached protocol.
- FIG. 1 shows the positional relationship of each DNA fragment.
- Table 1 shows the amplification of each DNA fragment and the PCR primers used for it. A restriction enzyme recognition sequence was added to each primer.
- Example 1 Expression of each DNA fragment
- Each DNA fragment obtained in Example 1 was digested with an appropriate restriction enzyme, separated by 0.8% agarose electrophoresis, and then the amplified fragment was eluted using a Quantum Prep Freeze N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Co kit. It was collected. The obtained fragment was previously digested with the same restriction enzyme and ligated to the plasmid pQE30 (Qiagen: 6 His-tag sequences exist immediately under the start codon) or pET22b, which was dephosphorylated at the 5 ′ end, This was used to transform E. coli strain JM109. Further, E.
- coli containing the amplified fragment was cultured overnight in an ampicillin-containing circle glow medium (Funakoshi Co., Ltd.), and the next day IPTG was added to a final concentration of 1 mM and further cultured for 2.5 hours. After centrifugation (10,000 rpm, 5 minutes), the supernatant is discarded, and the sediment is 1/10 volume of Lysis Buffer A (8 M urea, 100 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM Tris, 10 mM Imidazole, pH 8.0). And the cells were dissolved. After centrifugation (15,000 rpm, 15 minutes), the cell lysate supernatant was recovered.
- Lysis Buffer A 8 M urea, 100 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM Tris, 10 mM Imidazole, pH 8.0.
- FIG. 2 shows the migration patterns of the expression products of A ⁇ 6b-1b and C ⁇ 6b-1b used as ELISA antigens in each of the A-type and C-type fragments.
- Polypeptide P-A ⁇ 5-1 obtained in Example 2 was diluted with PBS to 10 ⁇ g / dose, and aluminum hydroxide gel was added to a final concentration of 20%.
- Aluminum hydroxide gel was added to a final concentration of 20%.
- Other polypeptides P-A ⁇ 3-0, P-A ⁇ 5-0, P-C ⁇ 5-1 and P-C ⁇ 6-0 were diluted with PBS to 10 ⁇ g / dose and then emulsified with oil adjuvant.
- reaction solution After adsorption at room temperature for 1 hour, the reaction solution is discarded and 200 ⁇ L of PBS-T (8.1 mM disodium hydrogen phosphate, 1.5 mM dihydrogen phosphate, 137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 0.05% Tween 20) is used. After washing, 200 ⁇ L of 5% skim milk-added PBS-T was added for blocking. The blocking solution was discarded, and serum was diluted 50 to 100 times with PBS-T supplemented with 1% skim milk, and 100 ⁇ L was added to each well, followed by reaction at room temperature for 1 hour.
- PBS-T 8.1 mM disodium hydrogen phosphate, 1.5 mM dihydrogen phosphate, 137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 0.05% Tween 20
- a polypeptide (P-A ⁇ 6b-1b) containing a homologous amino acid sequence of 30 amino acids that match (see FIG. 3) is a polypeptide containing region 2 (P-A ⁇ 3-0, P-A ⁇ 5-1, P-A ⁇ 5). -0, P-C ⁇ 5-1, and P-C ⁇ 6-0) responded to any of the sera immunized.
- polypeptides (P-A ⁇ 6b-2 #, P-A ⁇ 7b-1b and P-C ⁇ 6b-1b) that did not contain the homologous amino acid sequence reacted with each other in a fungus-specific manner.
- Polypeptides P-A ⁇ 6b-2 # and P-A ⁇ 7b-1b also bound to A. pg-A-type infected sera.
- oil adjuvant vaccines oilbacks 7, Institute for Chemical and Serum Therapy
- inactivated cells and A.pg antigens of oilbacks 7 (types A and C)
- the same composition vaccine was prepared by adding the polypeptides A ⁇ 5-1 and C ⁇ 5-1 obtained in Example 2 instead of the inactivated cells of the mold and injected once subcutaneously into the neck of a 5-week-old SPF chicken .
- commercially available vaccines are also administered diluted 1/100 and 1 / 1,000, and polypeptides contain type A and type C mixed polypeptides diluted to 3,0.3 and 0.03 ⁇ g / feather respectively. The vaccine was administered.
- the bacterial solution of A.pg-A type 211 strain (1.5 x 10 9 CFU / mL) or A.pg-C type 53-47 (5.0 x 10 9 CFU / mL) 0.2 mL was administered intranasally and clinical symptoms such as facial swelling, nasal discharge and lacrimation were observed for 1 week.
- the obtained serum was subjected to ELISA measurement by the following method.
- Polypeptides P-A ⁇ 6b-2 # and P-C ⁇ 6b-1b obtained in Example 2 were diluted with 50 mM bicarbonate buffer so as to be 1.0 ⁇ g / mL, and 50 ⁇ L each was put into a 96-well plate and immobilized. After adsorption overnight at 4 ° C, the reaction solution is discarded, and 300 ⁇ L of PBS-T (8.1 mM disodium hydrogen phosphate, 1.5 mM dihydrogen phosphate, 137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 0.1% Tween 20) is used.
- the plate was washed 3 times with PBS-T, 100 ⁇ L of a chromogenic substrate solution (TMB + substrate-chromogen; DAKO) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 15 minutes. Color development was stopped by adding 100 ⁇ L of 3M sulfuric acid. The wavelength of 450 nm was measured with a 96 well plate reader (manufactured by Nippon Molecular Device Co., Ltd.).
- the detection method of the present invention is used for examining the immune status of chickens immunized with a vaccine composed of a polypeptide containing the amino acid sequence used in the present invention.
- the detection method of the present invention is used for research on the onset mechanism and epidemiology by measuring the serum of chickens that have developed chicken infectious coryza due to A.pg infection.
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Abstract
アビバクテリウム・パラガリナラム抗体の検出方法およびキットを提供する。アビバクテリウム・パラガリナラムＡ型菌および／またはＣ型菌の菌体外膜蛋白により誘導される抗体を、当該外膜蛋白の非相同領域またはその一部のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原としたELISA法により検出することからなる、アビバクテリウム・パラガリナラム抗体の検出方法、および該方法に用いる検出キット。
Description
本願発明は、アビバクテリウム・パラガリナラム抗体の検出方法および検出キットに関する。詳細には、アビバクテリウム・パラガリナラム（Avibacterium paragallinarum：以下、A.pgと称することもある。旧名はヘモフィルス・パラガリナラム（Hemophilus paragallinarum））Ａ型菌および／またはＣ型菌の菌体外膜蛋白（以下、「HMT p210ポリペプチド」と称することもある）により誘導される抗体を、当該外膜蛋白の非相同領域またはその一部のアミノ酸配列からなるペプチドを固相抗原としたELISA法により検出することからなる、アビバクテリウム・パラガリナラム抗体の検出方法、および該方法に用いる検出キットに関する。なお、ペプチドはそれを構成するそのアミノ酸残基数により、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドなどの名称で呼ばれるが、本願発明では、これらを区別することなく単にペプチドと定義する。
鶏の重要な呼吸器官系疾病としてA.pgの感染によって発症する鶏伝染性コリーザがある。鶏伝染性コリーザを発症した鶏は、主な症状として鼻汁の漏出、顔面の腫脹あるいは流涙を呈する。鶏伝染性コリーザは、鶏の育成率の低下、産卵開始の遅延、産卵率の低下あるいは産卵停止をもたらすため、その経済的損失は大きい。
Pageらは、A.pgをＡ、ＢおよびＣ型の３つの型に分類し（非特許文献１）、Sawataらは、１型および２型の２つの型に分類した（非特許文献２）。その後、Kumeらにより、PageらのＡ型はSawataらの１型に、PageらのＣ型はSawataらの２型に相当することが報告された（非特許文献３および４）。今日では、A.pgのＡ型（１型）菌（以下、「A.pg-A型菌」と称することもある）とＣ型（２型）菌（以下、「A.pg-C型菌」と称することもある）が鶏伝染性コリーザの主要な原因菌とされている。
鶏伝染性コリーザの予防に関しては、従来、A.pg-A型菌やA.pg-C型菌の菌体をホルマリン、チメロサール等で不活化したワクチンが広く使用されてきた。しかしながら、これらのワクチンを投与した場合、接種鶏の局所に壊死病巣を形成する（非特許文献５）など副作用が問題となっており、安全性の高いワクチンの開発が強く待望されている。
このような状況下、菌体あるいは培養上清から感染防御抗原すなわち有効な成分（コンポーネント）のみを取り出してワクチンとするコンポーネントワクチンや遺伝子組換え技術により感染防御抗原をコードする遺伝子をクローニングし、該遺伝子を細菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等に発現させ、大量に発現させた発現産物を精製し、これをワクチンとする組換えワクチン、あるいは感染防御抗原をコードする遺伝子をウイルスベクター等に挿入したベクターワクチンなどの開発が行われている。
例えば、徳永らは、A.pg-A型菌の培養液から、赤血球凝集抑制抗体（HI抗体）の産生を誘導し、A.pg-A型菌による鶏伝染性コリーザを防御する該Ａ型菌に由来する分子量約130 kDaのポリペプチドを精製することに成功した（特許文献１）。さらに、この130 kDaポリペプチドをコードするDNA断片をクローニングし、大腸菌で発現させた該組換え蛋白が、アビバクテリウム・パラガリナラムＡ型菌による鶏伝染性コリーザの感染を防御することを見出した。さらには130 kDaポリペプチドをコードするDNA断片をプローブとして2,042個のアミノ酸からなるＡ型HMT p210ポリペプチド（赤血球凝集活性を有する菌体外膜蛋白）をコードするHMT p210遺伝子を同定した。また、Ｃ型菌からも同様に該DNA断片とハイブリダイズするDNA断片をクローニングし、Ｃ型菌由来のＣ型HMT p210遺伝子を取得した（特許文献２）。そして、Ａ型菌とＣ型菌のHMT p210遺伝子のオープンリーディングフレームの塩基配列を比較し、両者の相同性は全体で約80％であること、5'側の約3.4kbpの領域（以下、領域1と呼ぶ）と3'側の約1.2kbpの領域（以下、領域3と呼ぶ）は、非常に高いホモロジーを有すること、2つの領域に挟まれた約1.5kbpの領域（以下、領域2と呼ぶ）はホモロジーが低いことを報告した（特許文献２）。
徳永らの発見したHMT p210遺伝子が型特異的なワクチンのターゲット領域として重要であることは、野呂らによっても報告されている。野呂らは、A.pg-A型HMT p210ポリペプチドをコードするHMT p210遺伝子の一部である、4,801bpから5,157bpのDNA断片にコードされるペプチドを鶏に免疫することにより、該ペプチドにA.pg-A型菌に対するHI抗体の誘導およびワクチン効果があることを報告した（特許文献３）。また、野呂らは、第143回日本獣医学会（平成19年4月3～5日開催、日本）において、Ｃ型HMT p210ポリペプチドをコードするHMT p210遺伝子の一部である、5.5kbpのDNA断片HPC5.5にコードされるペプチドを鶏に免疫することにより、同様に、A.pg-C型菌に対するHI抗体の誘導およびワクチン効果を報告した。
A.pgに感染した鶏は、急性の経過に加えて、発病後においても抗体を誘導しにくいので、これまで鶏伝染性コリーザの血清診断は行われていない。一方で、ワクチン投与した鶏では、A.pgの菌体表面に存在する赤血球凝集素（Hemagglutinin；以下、「HA」と称することもある）に対する抗体が誘導され、ワクチン効果をin vitroで評価する場合には、抗HA抗体を利用した赤血球凝集抑制試験（以下、「HI試験」と称することもある）が行われている。HI試験には、新鮮鶏赤血球やグルタルアルデヒド固定鶏赤血球が使用されるが、（１）A.pg-A型菌のワクチン効果の評価には新鮮な鶏赤血球を必要とするため、供血用鶏の確保（病原体から隔離した状態での飼育管理）、採血および血液の処理等、煩雑で手間がかかる、（２）鶏赤血球のロットによる影響を受けることがあり、且つ抗体価の判定は測定者の主観によるため安定した成績が得にくい、等の欠点が指摘されている。
一方、Sunらは、HI試験に変わる血清診断法として、型特異的モノクローナル抗体を利用したブロッキングELISA（B-ELISA）ついて報告している（非特許文献６）。B-ELISAは、Ａ型菌またはＣ型菌体を超音波破砕したものを抗原とし、それぞれの血清型に反応するモノクローナル抗体を用いて、血清中の抗体を競合的に検出するELISA法である。本方法は、HI試験に較べ、感度が高く、多検体に対応できるというメリットがある。しかしながら、血清の添加、モノクローナル抗体の添加、抗マウスIgG-HRP標識抗体の添加および発色基質の添加という4つのステップが必要であり、通常のELISA術式と較べると1ステップ多く、操作が煩雑となっている。また、本法のためには型特異的モノクローナル抗体を確保する必要がある。キットを製造する上においても、抗原固相化プレート、参照血清に加え、モノクローナル抗体を製造し添付する手間も必要である。さらに、当該B-ELISAは、各血清型において一つのモノクローナル抗体が認識する抗原エピトープのみに対する抗体を検出する系である。一個のエピトープに対する抗体を検出する系では、菌の変異により当該エピトープが失われた場合に、菌の感染あるいはワクチン接種抗体を検出できなくなる危険性がより高いものとなる。
特開平10-84969
WO98/12331
特開2005-218414
Am. J. Vet. Res., 23:85-95, 1962
Jpn. J. Vet. Sci., 40:645-652, 1978
Am. J. Vet. Res., 41:757-760, 1980
Am. J. Vet.Res., 41:1901-1904, 1980
Avian Dis., 15:109-117, 1971
Int. Ass. Bio. (IABS), 35:317-320, 2007
本願発明の課題は、A.pgのＡ型菌およびＣ型菌に対する抗体をそれぞれ区別し得る抗体検出方法を提供することにある。詳細には、A.pgのＡ型菌およびＣ型菌に対する抗体をそれぞれ区別し得る、組換え抗原ペプチドを用いることを特徴とする抗体検出方法を提供する。より詳細には、A.pgのＡ型菌およびＣ型菌の外膜タンパク質間において相同性の低い領域内のアミノ酸配列を含む組換え抗原ペプチドを用いることを特徴とする抗体検出法を提供する。
本願発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ワクチン抗原として重要なHMT p210遺伝子によりコードされるｐ210ポリペプチドの、領域2のアミノ酸配列中の離れた場所にA.pg-A型菌とA.pg-C型菌間に相同なアミノ酸配列が含まれること（配列番号１記載のA.pg-A型菌の243～273番目のアミノ酸配列と配列番号２記載のA.pg-C型菌の38～68番目のアミノ酸配列の31アミノ酸中29アミノ酸が一致する；図３参照）を見出し、かつ当該アミノ酸配列がエピトープを形成することを発見した。加えて、本願発明者らは徳永らが定義した領域2のＣ末端領域の一部に、A.pg-A型菌とA.pg-C型菌の間で相同性の高いアミノ酸配列が含まれることを見出した。そこで、A.pg-A型菌とA.pg-C型菌それぞれのHMTp210ポリペプチドにおいて、上記２つの相同なアミノ酸配列を含まないペプチドを調製し、得られたペプチドを用いてマイクロプレートに固相化したELISA法による抗体測定を行った。その結果、A.pg-A型菌由来のワクチンとA.pg-C型菌由来のワクチンにより誘導される抗体が各々特異的に識別できることが確認され、本願発明を完成するに至った。したがって、本願発明は、以下の通りである。
（１）下記のペプチドＡまたはＢの少なくとも一つの抗原と検体を反応させる抗体測定法からなることを特徴とする、アビバクテリウム・パラガリナラム抗体の検出方法。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、６アミノ酸以上のペプチド鎖からなり、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の一部であって、６アミノ酸以上のペプチド鎖からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の38～68番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
（２）ペプチドＡまたはＢが、１０アミノ酸以上のペプチド鎖であることを特徴とする上記１記載の検出方法。
（３）ペプチドＡまたはＢが、２０アミノ酸以上のペプチド鎖であることを特徴とする上記１記載の検出方法。
（４）ペプチドＡまたはＢが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、上記１記載の検出方法。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の8～236番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列の69～452番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の38～68番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
（５）ペプチドＡまたはＢが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、上記１記載の検出方法。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の8～236番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の69～452番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
（６）ペプチドＡが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、上記４記載の検出方法。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の274～445番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
（７）ペプチドＡが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、上記５記載の検出方法。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の274～445番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
（８）ペプチドＡまたはＢが、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、付加、あるいは置換されたアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする、上記１ないし７の何れか一つに記載の検出方法。
（９）抗体測定法が、ELISA法、ウェスタンブロット法およびドットブロット法からなる群より選ばれることを特徴とする、上記１ないし８記載の検出方法。
（１０）検体が、アビバクテリウム・パラガリナラム感染鶏血清またはアビバクテリウム・パラガリナラムワクチン投与鶏血清であることを特徴とする、上記１ないし９の何れか一つに記載の検出方法。
（１１）下記のペプチドＡまたはＢの少なくとも一つを抗原として用いることを特徴とする、アビバクテリウム・パラガリナラム抗体測定キット。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、６アミノ酸以上のペプチド鎖からなり、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の一部であって、６アミノ酸以上のペプチド鎖からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の38～68番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
（１２）ペプチドＡまたはＢが、１０アミノ酸以上のペプチド鎖であることを特徴とする上記１１記載の抗体測定キット。
（１３）ペプチドＡまたはＢが、２０アミノ酸以上のペプチド鎖であることを特徴とする上記１１記載の抗体測定キット。
（１４）ペプチドＡまたはＢが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、上記１１記載の抗体測定キット。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の8～236番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列の69～452番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の38～68番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
（１５）ペプチドＡまたはＢが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、上記１１記載の抗体測定キット。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の8～236番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の69～452番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
（１６）ペプチドＡが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、上記１４記載の抗体測定キット。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の274～445番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
（１７）ペプチドＡが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、上記１５記載の抗体測定キット。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の274～445番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
（１８）ペプチドＡまたはＢが、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、付加、あるいは置換されたアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする、上記１１ないし１７の何れか一に記載の抗体測定キット。
（１９）抗体測定法が、ELISA法、ウェスタンブロット法およびドットブロット法からなる群より選ばれることを特徴とする、上記１１ないし１８の何れか一に記載の抗体測定キット。
（２０）検体が、アビバクテリウム・パラガリナラム感染鶏血清またはアビバクテリウム・パラガリナラムワクチン投与鶏血清であることを特徴とする、上記１１ないし１９の何れか一に記載の抗体測定キット。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、６アミノ酸以上のペプチド鎖からなり、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の一部であって、６アミノ酸以上のペプチド鎖からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の38～68番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
（２）ペプチドＡまたはＢが、１０アミノ酸以上のペプチド鎖であることを特徴とする上記１記載の検出方法。
（３）ペプチドＡまたはＢが、２０アミノ酸以上のペプチド鎖であることを特徴とする上記１記載の検出方法。
（４）ペプチドＡまたはＢが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、上記１記載の検出方法。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の8～236番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列の69～452番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の38～68番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
（５）ペプチドＡまたはＢが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、上記１記載の検出方法。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の8～236番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の69～452番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
（６）ペプチドＡが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、上記４記載の検出方法。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の274～445番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
（７）ペプチドＡが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、上記５記載の検出方法。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の274～445番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
（８）ペプチドＡまたはＢが、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、付加、あるいは置換されたアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする、上記１ないし７の何れか一つに記載の検出方法。
（９）抗体測定法が、ELISA法、ウェスタンブロット法およびドットブロット法からなる群より選ばれることを特徴とする、上記１ないし８記載の検出方法。
（１０）検体が、アビバクテリウム・パラガリナラム感染鶏血清またはアビバクテリウム・パラガリナラムワクチン投与鶏血清であることを特徴とする、上記１ないし９の何れか一つに記載の検出方法。
（１１）下記のペプチドＡまたはＢの少なくとも一つを抗原として用いることを特徴とする、アビバクテリウム・パラガリナラム抗体測定キット。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、６アミノ酸以上のペプチド鎖からなり、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の一部であって、６アミノ酸以上のペプチド鎖からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の38～68番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
（１２）ペプチドＡまたはＢが、１０アミノ酸以上のペプチド鎖であることを特徴とする上記１１記載の抗体測定キット。
（１３）ペプチドＡまたはＢが、２０アミノ酸以上のペプチド鎖であることを特徴とする上記１１記載の抗体測定キット。
（１４）ペプチドＡまたはＢが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、上記１１記載の抗体測定キット。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の8～236番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列の69～452番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の38～68番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
（１５）ペプチドＡまたはＢが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、上記１１記載の抗体測定キット。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の8～236番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の69～452番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
（１６）ペプチドＡが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、上記１４記載の抗体測定キット。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の274～445番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
（１７）ペプチドＡが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、上記１５記載の抗体測定キット。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の274～445番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
（１８）ペプチドＡまたはＢが、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、付加、あるいは置換されたアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする、上記１１ないし１７の何れか一に記載の抗体測定キット。
（１９）抗体測定法が、ELISA法、ウェスタンブロット法およびドットブロット法からなる群より選ばれることを特徴とする、上記１１ないし１８の何れか一に記載の抗体測定キット。
（２０）検体が、アビバクテリウム・パラガリナラム感染鶏血清またはアビバクテリウム・パラガリナラムワクチン投与鶏血清であることを特徴とする、上記１１ないし１９の何れか一に記載の抗体測定キット。
本願発明に従えば、アビバクテリウム・パラガリナラム抗体の検出方法およびキットが提供される。本願発明に使用されるA.pg-A型菌およびA.pg-C型菌由来のペプチドは、互いに相同なアミノ酸配列を含まないので、例えば、A.pg-A型菌由来のワクチンおよびA.pg-C型菌由来のワクチンにより誘導された抗体とそれぞれ特異的に結合する。したがって、本願発明の検出方法およびキットは、各ワクチンを単独で鶏に投与した場合だけでなく、両者を混合したワクチンを投与した場合においても、鶏血清中に存在する各々の菌に対する抗体価をそれぞれ識別して測定できる。
また、本願発明によれば、精製組換え抗原を用いる結果、A.pg菌体の破砕物を用いる従来技術に比べてより高濃度の抗原を固相化することが可能であり、従って抗体の検出感度がより高い抗体測定系を構築することが可能であると考えられる。また、本願発明の抗体検出方法は、抗原ペプチドにA.pgの血清型を識別する能力があるため、型特異的モノクローナル抗体を用いるB-ELISAと比べるとより簡便かつ、菌の抗原変異という観点からはより確実にA.pgに対する抗体を検出することが可能である。
さらに、本願発明の検出方法により、ワクチン投与後の鶏血清だけでなく、A.pg感染鶏血清中の抗体をも識別することができる。
本願発明は、A.pg由来のHMT p210遺伝子によりコードされるアミノ酸配列中の非相同領域中にわずかに存在するA.pg-A型菌とA.pg-C型菌間の相同なアミノ酸配列を除去したペプチドを抗原とした抗体測定法によるアビバクテリウム・パラガリナラム抗体の検出方法およびキットによって特徴付けられる。
本願発明のアビバクテリウム・パラガリナラム抗体の検出方法には、抗原としてA.pg-A型菌および／またはA.pg-C型菌由来のHMT p210遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の非相同領域またはその一部が使用される。ここで、非相同領域とは、5'側の約3.4kbpのDNA領域によりコードされるアミノ酸配列（領域1）と3'側の約1.2kbpのDNA領域によりコードされるアミノ酸配列（領域3）の２つの領域に挟まれた約1.5kbpのDNA領域（領域2）によりコードされるアミノ酸配列からＣ末端側の相同配列を除いた約1.3kbpの領域（配列番号１（Ａ型菌）および配列番号２（Ｃ型菌））として定義される（図１参照）。以下、この非相同領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子を「A.pg-1.3遺伝子」と称し、Ａ型菌およびＣ型菌の両者を区別していう場合は、それぞれ「A.pg-A1.3遺伝子」、「A.pg-C1.3遺伝子」と称することもある。
A.pg感染鶏より分離したＡ型菌３株（221株、O53株およびW株）のHMT p210遺伝子の非相同領域に相当する塩基配列は、O53株およびW株間で完全に一致し、両株と221株間ではわずか１塩基が変異している。一方、C型菌３株（53-47株、モデスト株およびNK-1株）間の同領域の塩基配列は、モデスト株およびNK-1株は、53-47株に対して３塩基（１アミノ酸）が欠失しているだけである。したがって、同一血清型間の非相同領域は高度に保存されていると言え、本願発明においては、同一血清型内の何れの株を使用してもよい。
A.pg-1.3遺伝子およびこれを含むDNA断片は、以下の方法に従って取得することができる。A.pgの増殖には、ポリペプトン、ブドウ糖、カザミノ酸、グルタミン酸ナトリウム、酵母エキス、塩化ナトリウム、鶏肉水、βNAD、鶏血清等を適当に含有する培地が使用される。本願発明では、小・中容量の菌体増殖のために、鶏血清加鶏肉汁培地（培地1000mL中、ポリペプトンＳ 5g、カザミノ酸1g、塩化ナトリウム5g、L-グルタミン酸ナトリウム5g、グルコース 1g、酵母エキス10g、鶏肉水175mL、鶏血清25mL、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（β-NAD）0.025％を含む）を使用した。培養条件は、通常、温度37℃、期間16～24時間の範囲で設定されるが、使用目的、培養形態、植え付けた菌量、培地スケール等に応じて適宜調節すればよい。
培養液中の菌体は、遠心分離（8,000rpm，20分間）により沈渣に回収される。HMT p210遺伝子は、菌体から抽出した全RNA、mRNAまたはゲノムDNAを出発材料として、Sambrookらが述べている一般的な遺伝子組換え技術（Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989）に従って調製することができる。実際には、市販のキットが使用される。例えば、RNAの抽出には、TRIzol試薬（インビトロジェン社）、ISOGEN（ニッポンジーン社）、StrataPrep Total RNA Purification Kit（東洋紡）などの試薬、染色体DNAの抽出には、セパジーンキット（三光純薬）、ISOPLANT（和光純薬）、mRNAの精製には、mRNA Purification Kit（アマシャムバイオサイエンス社）、Poly(A) Quick mRNA Isolation Kit（東洋紡）、mRNA Separator Kit（クロンテック社）などのキット、cDNAへの変換には、SuperScript plasmid system for cDNA synthesis and plasmid cloning（インビトロジェン社）、cDNA Synthesis Kit（宝酒造）、SMART PCR cDNA Synthesis & Library Construction Kits（クロンテック社）、Directionary cDNA Library Construction systems（ノバジェン社）、GeneAmp PCR Gold（アプライドバイオシステムズ社）などが使用される。
より具体的には、遠心分離により回収された菌体からセパジーンキット（三光純薬）等を用いて染色体DNAを抽出し、これを適当な制限酵素（好ましくはEcoRIが使用される）で切断し、市販のクローニングベクター（例えば、λgt11；ニューイングランドバイオラブス（NEB)社）に挿入し、DNAライブラリーを調製する。得られたDNA断片を鋳型（テンプレート）として、LA Taq（タカラバイオ株式会社）を用いて、添付のプロトコールに従い、PCR法により種々のサイズのDNA断片が増幅される。PCRに用いるプライマーは、徳永らが開示したA.pg-A型菌およびA.pg-C型菌由来のHMT p210遺伝子の塩基配列（特許文献１）に基づいて設計される。PCR用プライマーは、DNA合成受託機関（例えば、シグマジェノシスジャパン社）などに依頼すれば容易に入手可能である。このとき上流側Primerの5’末端および下流側Primerの5’末端に適当な制限酵素切断部位の塩基配列が付加される。PCR増幅産物は、遺伝子クローニングベクター、pCR-XL-TOPO（インビトロジェン株式会社）にクローニングし、種々のDNA断片が挿入されたプラスミドpCRDNTが取得される。得られたDNA断片の塩基配列は、一旦pBluescript II SK+（ストラタジーン社）またはpCR2.1-TOPO（インビトロジェン社）にクローニングした後、DNAシークエンサー（ABI Prism 377アプライドバイオシステムズ社）により決定される。
後述するように、感度の低下や非特異反応の増大をきたさない限り、一部にアミノ酸変異を加えたペプチドも本願発明の抗体測定法における抗原として使用することができる。ペプチド中の特定のアミノ酸に変異を入れる場合は、そのペプチドをコードするDNA断片の塩基配列に変異を入れるサイトダイレクティドミュータジェネシス法を使用するのが一般的である。実際には、本技術を応用したTakara社のSite-Directed Mutagenesis System (Mutan-Super Express Km、Mutan-Express Km、Mutan-Kなど)、 Stratagene社のQuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit、QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit、Invitrogen社のGeneTailor Site-Directed Mutagenesis Systemなどの市販のキットを用い添付のプロトコールに従って行われる。
A.pg-A型菌とA.pg-C型菌の間で相同なアミノ酸配列を含まない種々のペプチドのアミノ酸配列をコードするDNA断片を取得するときは、上記相同配列を含まないように非相同領域（それぞれ、配列番号３で示される塩基配列（Ａ型菌）および配列番号４で示される塩基配列（Ｃ型菌））の中からプライマーを設計し、上記のA.pg-1.3遺伝子およびこれを含むDNA断片を鋳型として一般的なPCR法により行えばよい。また、短いアミノ酸配列であるならば、人工合成によりそのDNA断片を作製してもよい。本願発明において調製したDNA断片およびプライマーを表１に示した。
こうして得られたDNA断片を適当な発現ベクターに組み込み、これを宿主に導入することによって、各DNA断片の発現が行なわれる。発現ベクターとしては例えば、pQE30（キアゲン社製）やpET22b（ノバジェン社またはタカラバイオ株式会社製）などが使用されるが、適宜選択すればよい。外来蛋白やペプチドの発現には細菌、酵母、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞などが常用されるが、使用目的にあわせて選択すればよい。宿主細胞を形質転換するときには公知の方法を利用すればよい。例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、リポフェクチン系のリポソームを用いる方法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などが利用でき、使用する宿主細胞により適当な方法を選択すればよい。本願発明の各DNA断片を発現させる場合は、大量に発現させることができる大腸菌が使用される。大腸菌発現用に、trpプロモーター、T7プロモーター、cspAプロモーターなどを有する種々の発現ベクターが開発・市販されているのでこれらの中から適宜選択して使用すればよい。発現ベクターに合わせて適当な大腸菌、例えば、BL21, HMS174, DH5α, HB101, JM109などが宿主として選択される。大腸菌の形質転換は、市販のコンピテントセルを用い、添付の方法に従って行うことができる。こうして目的のポリペプチドを産生する組換え大腸菌が得られる。大腸菌の培養に使用される培地（例えば、LB、SOC、SOBなど）、形質転換体の選択に用いられる試薬（例えば、アンピシリンなど）および発現誘導に使用される試薬（例えば、インドール酢酸（IAA）、イソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド（IPTG））は、一般に市販されているものを使用すればよい。また、培地のpHは、大腸菌の増殖に適した範囲（pH6～8）で用いられる。
目的のペプチド（目的物）を発現している組換え大腸菌のスクリーニングは、以下のように行われる。発現誘導剤（本発明に使用した発現システムではIPTGを使用）の存在下に、培養・増殖した菌体を遠心分離（10,000rpm、5分間）により回収し、これに一定の蒸留水を加え懸濁した後、超音波処理、またはフレンチプレス、マントンゴリン等のホモジナイザーにより菌体を破砕し、遠心分離（15000rpm、15分間）により沈渣または上清に分離・回収する。蒸留水に、適宜界面活性剤（例えば、Triton X100）、キレート剤（例えば、EDTA）、リゾチーム等を添加してもよい。上清および沈渣に回収した発現産物の一定量をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、クマシーブリリアントブルーで染色した後、分子サイズおよび染色像から目的物の発現を確認する。なお、目的物の確認（または検出）には、上記の分子サイズに基づく方法以外に、ELISA法、ウェスタンブロット法、ドットブロット法などの抗原抗体反応に基づく方法が取られることもある。いずれも大腸菌で発現させた外来蛋白やポリペプチドを検出する際の一般的な方法であり、目的に応じて適宜選択すればよい。
組換え大腸菌から目的物を精製する際には、一般に、蛋白質化学において使用される精製方法、例えば、遠心分離、塩析法、限外ろ過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマト法、ゲルろ過クロマト法、アフィニティークロマト法、疎水クロマト法、ハイドロキシアパタイトクロマト法などの方法を組み合わせた方法が使用される。得られた蛋白質やポリペプチドの量は、BCA Protein Assay Reagent Kit（Pierce Biotechnology, Inc）、Protein Assay Kit (BIO-RAD, Inc)などの蛋白測定試薬を用いて測定される。
目的物の精製を容易にするために他のポリペプチドやペプチドと融合させた形で発現させてもよい。このような融合蛋白を発現させるベクターとして、オリゴヒスチジンを付加することができるHis-tag発現システム（ノバジェン社）、FLAGタグを付加した融合蛋白を発現させることができるシステム（シグマ社）、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）との融合蛋白を作製することができるGST融合タンパク質精製システム（アマシャムファルマシア社）、MagneHis Protein Purification System（プロメガ社）などが挙げられる。例えば、本発明の実施例で行なわれたようにオリゴヒスチジンとの融合蛋白として発現させた後、ニッケルアフィニティーカラム（GEヘルスケア バイオサイエンス社）を用いて目的のポリペプチドが特異的に精製される。
こうして得られたA.pg-A型菌とＣ型菌間の相同なアミノ酸配列を含まない領域の種々のペプチドは、鶏伝染性コリーザワクチン抗体の検出やA.pg感染鶏の血清学的診断を行うための抗体測定に使用される。具体的には、ELISA法、ウェスタンブロット法、ドットブロット法等の抗体測定法が適用される。多数の検体を取り扱う場合は、ペプチドを固相化したマイクロプレート法によるELISA法が好ましい。
マイクロプレートに固相化するペプチドとしては、A.pg-1.3遺伝子によりコードされるアミノ酸配列中の非相同領域からなるペプチドおよびその一部が使用できる。一般的に6～10個程度のアミノ酸で抗体に認識されるエピトープを形成できるとされている（抗体に認識されるエピトープとしては3～6アミノ酸で十分であることがオンライン上に公開されている（http://www.genosys.jp/products/spots/spots_faq.html）ため、非相同領域の一部であって、連続した6アミノ酸以上のアミノ酸配列からなるペプチドが本願発明に使用できる。また、特異性を高めるために、好ましくは非相同領域中の連続した10アミノ酸以上からなるペプチド、更に好ましくは、連続した20アミノ酸以上からなるペプチドでエピトープを形成することが望ましい。
最も好ましくは、AΔ6b-2♯によりコードされるポリペプチド（P-AΔ6b-2♯）、CΔ6b-1bによりコードされるポリペプチド（P-CΔ6b-1b）およびAΔ7b-1bによりコードされるポリペプチド（P-AΔ7b-1b）、並びにこれらを含むA.pg-1.3遺伝子によりコードされるアミノ酸配列中の非相同領域からなるペプチドの一部が使用される。また、抗体検出上の支障となるような感度の低下や非特異反応の増大をきたさない限り、これらのペプチドの一部にアミノ酸変異を加えた変異ペプチドも使用することができる。これらのペプチドは、目的にあわせて２つ以上のペプチドを種々組み合わせて使用することができる。例えば、鶏伝染性コリーザの原因菌を特定する場合は、それぞれ単独のペプチドを用いるか、A.pg-A型菌由来のペプチド同士あるいはA.pg-C型菌由来のペプチド同士を混合した混合物をそれぞれ独立して使用することが好ましい。単に鶏伝染性コリーザ感染の疫学や鶏伝染性コリーザワクチンの効果を調査することを目的とする場合は、A.pg-A型菌およびA.pg-C型菌由来の混合物を更に混合して用いてもよい。
ワクチン投与後の免疫血清は、上記のペプチドとアジュバントとの混合物を適当な動物の皮下、皮内、腹腔内等に通常1～3回、2～4週間隔で投与し、その後採血した血液を遠心分離（14,000rpm、5分間）することにより取得することができる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウム（例えば、ImjectAlum (ピアース社)、などが使用される。
アビバクテリウム・パラガリナラム感染動物の血清も、同様に血液を遠心分離することにより得られる。
アビバクテリウム・パラガリナラム感染動物の血清も、同様に血液を遠心分離することにより得られる。
より具体的には様々な方法によるELISAが行われるが、何れの方法であってもよい。例えば、最初に検体（免疫血清またはA.pg感染血清）がペプチドの固相化されたマイクロプレートに添加され、洗浄後、二次抗体として標識した抗鶏抗体が添加される。また、抗ペプチド特異抗体と組み合わせることにより、検体と標識抗ペプチド（固相抗原）抗体を同時あるいは別々にペプチドの固相化されたマイクロプレートに添加あるいは、抗ペプチド抗体が標識されていない場合は、抗ペプチド抗体に対する標識二次抗体を添加する、競合法によるELISAも実施可能である。
ペプチドのマイクロプレートへの固相化は、通常抗原量1～10μg/ml、室温（25℃前後）で30分～2時間または低温（4℃前後）で12～24時間放置することにより行われる。非特異反応を抑えるためのブロック試薬として、ブロックエース（雪印社）、ELISA用ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社）、牛血清アルブミン溶液、スキムミルク溶液などが挙げられるが、適宜選択し使用すればよい。各反応後の洗浄にはPBS、TBS若しくはこれらにポリソルベイト（ツイーン20）や保存剤（アジ化ナトリウム）等の含まれるもの等が使用され、反応停止には、２～３モルの硫酸が使用される。二次抗体としては、HRP、蛍光標識、RI、ビオチン化により標識された抗鶏IgGモノクローナル抗体、例えば、抗鶏IgG-HRP（ベッチル社）等が市販されているのでこれらを使用すればよい。例えば、HRPの基質としてはOPD（オルトフェニレンジアミン）およびTMBZ（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン）があり、それぞれ492nm、450nmで吸光度を測定する。
最初にマイクロプレートにペプチドに対する抗体を固定し、この抗体に前記ペプチドを結合させた二抗体サンドイッチによるELISA法を用いてもよい。この場合、ペプチドに対する抗体はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも使用できる。ポリクローナル抗体は、上記の免疫血清と同様の方法により取得される。免疫に用いる動物としてはニワトリ、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、サルなどが挙げられる。また、モノクローナル抗体は、A.pg菌体あるいはポリペプチドで免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、Milsteinらの方法（Method Enzymol., 73, 3-46, 1981）に従って、ミエローマ細胞株等と融合し、本願発明に使用されるペプチドに対する抗体を産生するハイブリドーマを作製することにより得られる。また、ファージディスプレイ技術を利用した抗体作製技術（Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual Edited by Brian K. Kay et al.、Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J.McCAFFERTY et al.、ANTIBODY ENGINEERING second edition edited by Carl A. K. BORREBAECK）により本願発明に使用されるペプチドと結合する抗体を作製することもできる。
こうして確立されたELISA法による抗A.pg抗体の測定方法は、ワクチン抗体やA.pg感染により誘導された抗体の検出に利用される。以下、実施例に従い、本願発明を更に詳細に説明するが、下記の実施例に何ら限定されるものではない。
A.pg-1.3遺伝子およびその領域内DNA断片の調製
A.pg-A型菌221株およびA.pg-C型菌53-47株のゲノムDNAライブラリーを徳永らの方法（特開平10-84969）により調製した。簡単には、遠心分離（8,000rpm、20分間）により回収された菌体からからセパジーンキット（三光純薬）を用いて染色体DNAを抽出し、制限酵素Sau3AIで消化し、DNAライブラリーを調製した。このDNAライブラリーのDNA断片を鋳型（テンプレート）として、LA Taq（タカラバイオ株式会社）を用いて、添付のプロトコールに従い、PCR法によりA.pg-1.3遺伝子の一部からなる断片を増幅した。PCR反応は、LA PCRキットver2（宝酒造製）を用い、96℃で1分反応の後、96℃で40秒間、56℃で60秒間、72℃で120秒間の反応を30サイクル、その後72℃で10分間の反応を行った。図１に、各DNA断片の位置関係を示す。また、各DNA断片の増幅とそれに用いたPCRプライマーを表１に示す。各プライマーには、制限酵素認識配列を付加した。
A.pg-A型菌221株およびA.pg-C型菌53-47株のゲノムDNAライブラリーを徳永らの方法（特開平10-84969）により調製した。簡単には、遠心分離（8,000rpm、20分間）により回収された菌体からからセパジーンキット（三光純薬）を用いて染色体DNAを抽出し、制限酵素Sau3AIで消化し、DNAライブラリーを調製した。このDNAライブラリーのDNA断片を鋳型（テンプレート）として、LA Taq（タカラバイオ株式会社）を用いて、添付のプロトコールに従い、PCR法によりA.pg-1.3遺伝子の一部からなる断片を増幅した。PCR反応は、LA PCRキットver2（宝酒造製）を用い、96℃で1分反応の後、96℃で40秒間、56℃で60秒間、72℃で120秒間の反応を30サイクル、その後72℃で10分間の反応を行った。図１に、各DNA断片の位置関係を示す。また、各DNA断片の増幅とそれに用いたPCRプライマーを表１に示す。各プライマーには、制限酵素認識配列を付加した。
各DNA断片の発現
実施例１で得た各DNA断片を適当な制限酵素で消化し、0.8%アガロース電気泳動で分離後、増幅フラグメントをQuantum Prep Freeze N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Coキットを用い溶出、回収した。得られた断片を、予め、同じ制限酵素で消化し、5'末端を脱リン酸化したプラスミドpQE30（キアゲン社製：6個のHis-tag配列が開始コドン直下に存在）またはpET22bに連結し、これを用いて大腸菌JM109株を形質転換した。更に増幅フラグメントを含む大腸菌を、アンピシリン含有サークルグロー培地（フナコシ株式会社）で１夜培養し、翌日IPTGを終濃度1mMとなるように加え、更に2.5時間培養した。遠心分離（10,000rpm、5分間）後、上清を捨て、沈さを培養液の1/10量のLysis Buffer A(8M尿素, 100mM NaH2PO4, 10mM Tris, 10mM Imidazole, pH8.0）に懸濁し、菌体を溶解した。遠心分離（15,000rpm、15分）後、セルライセイト上清を回収した。回収したセルライセイト上清をNi-NTAアガロースゲル1mLと混合し、ゲルに吸着させた後、ボトム栓付きカラムに充填した。カラムを洗浄後、溶出液（8M尿素, 100mM NaH2PO4, 10mM Tris, 100mM Imidazole, pH8.0）で溶出画分を回収し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）を行った。Ａ型、Ｃ型、それぞれの断片中、ELISA抗原として用いたAΔ6b-1bおよびCΔ6b-1bの発現産物の泳動パターンを図２に示す。
実施例１で得た各DNA断片を適当な制限酵素で消化し、0.8%アガロース電気泳動で分離後、増幅フラグメントをQuantum Prep Freeze N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Coキットを用い溶出、回収した。得られた断片を、予め、同じ制限酵素で消化し、5'末端を脱リン酸化したプラスミドpQE30（キアゲン社製：6個のHis-tag配列が開始コドン直下に存在）またはpET22bに連結し、これを用いて大腸菌JM109株を形質転換した。更に増幅フラグメントを含む大腸菌を、アンピシリン含有サークルグロー培地（フナコシ株式会社）で１夜培養し、翌日IPTGを終濃度1mMとなるように加え、更に2.5時間培養した。遠心分離（10,000rpm、5分間）後、上清を捨て、沈さを培養液の1/10量のLysis Buffer A(8M尿素, 100mM NaH2PO4, 10mM Tris, 10mM Imidazole, pH8.0）に懸濁し、菌体を溶解した。遠心分離（15,000rpm、15分）後、セルライセイト上清を回収した。回収したセルライセイト上清をNi-NTAアガロースゲル1mLと混合し、ゲルに吸着させた後、ボトム栓付きカラムに充填した。カラムを洗浄後、溶出液（8M尿素, 100mM NaH2PO4, 10mM Tris, 100mM Imidazole, pH8.0）で溶出画分を回収し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）を行った。Ａ型、Ｃ型、それぞれの断片中、ELISA抗原として用いたAΔ6b-1bおよびCΔ6b-1bの発現産物の泳動パターンを図２に示す。
抗ポリペプチド鶏血清の作製
実施例２で得たポリペプチドP-AΔ5-1を10μg/doseとなるようにPBSで希釈し、更に水酸化アルミニウムゲルを終濃度20%になるように加えたものを、5週齢SPF鶏の頸部皮下に3週間隔で2回免疫した。他のポリペプチドP-AΔ3-0, P-AΔ5-0, P-CΔ5-1およびP-CΔ6-0については、10μg/doseとなるようにPBSで希釈した後、オイルアジュバントと乳化したものを調製（1ドーズ（0.5mL）あたり、抗原0.01g、ホルマリン0.001mL以下、ポリソルベート80 0.01mL、セスキオレイン酸ソルビタン0.04mL、軽質流動パラフィン0.36mL、リン酸緩衝液残量）し、5週齢SPF鶏の頸部皮下に1回投与した。9～11週齢時に採血し、各ポリペプチドに対する免疫血清を得た。
実施例２で得たポリペプチドP-AΔ5-1を10μg/doseとなるようにPBSで希釈し、更に水酸化アルミニウムゲルを終濃度20%になるように加えたものを、5週齢SPF鶏の頸部皮下に3週間隔で2回免疫した。他のポリペプチドP-AΔ3-0, P-AΔ5-0, P-CΔ5-1およびP-CΔ6-0については、10μg/doseとなるようにPBSで希釈した後、オイルアジュバントと乳化したものを調製（1ドーズ（0.5mL）あたり、抗原0.01g、ホルマリン0.001mL以下、ポリソルベート80 0.01mL、セスキオレイン酸ソルビタン0.04mL、軽質流動パラフィン0.36mL、リン酸緩衝液残量）し、5週齢SPF鶏の頸部皮下に1回投与した。9～11週齢時に採血し、各ポリペプチドに対する免疫血清を得た。
ELISAによる各ポリペプチド免疫血清との反応性の確認
実施例２で得たポリペプチドP-AΔ6b-1b, P-AΔ6b-2♯, P-AΔ7b-1bおよびP-CΔ6b-1bを1.0～2.5μg/mLとなるように50mM重炭酸バッファーで希釈し、96 wellプレートに100μLずつ入れ固相化した。室温で1時間吸着後、反応液を捨て、200μLのPBS-T（8.1mMリン酸水素２ナトリウム、1.5mMリン酸２水素１カリウム、137mM塩化ナトリウム、2.7mM塩化カリウム、0.05%ツイーン20）で洗浄後、200μLの5%スキムミルク加 PBS-Tを入れブロッキングした。ブロッキング液を捨て、血清を1%スキムミルク加 PBS-Tで50～100倍希釈し各wellに100μLずつ添加し、室温で1時間反応させた。反応液を除去後、PBS-Tで3回洗浄し、抗鶏IgG-HRP標識抗体を1%スキムミルク加 PBS-Tで10,000～20,000倍希釈し100μLずつ添加した。暗所で室温、1時間反応させた。反応液を除去後、PBS-Tで3回洗浄し、発色基質液（100mMクエン酸、200mMリン酸水素２ナトリウム、0.004％オルトフェニレンジアミン、過酸化水素）を100μLずつ添加し、室温で30分間反応させた。3M硫酸を100μLずつ添加し、発色を停止させた。96wellプレートリーダー（日本モレキューラーデバイス社製）で492nmの波長を測定した。その結果を表２に示す。
実施例２で得たポリペプチドP-AΔ6b-1b, P-AΔ6b-2♯, P-AΔ7b-1bおよびP-CΔ6b-1bを1.0～2.5μg/mLとなるように50mM重炭酸バッファーで希釈し、96 wellプレートに100μLずつ入れ固相化した。室温で1時間吸着後、反応液を捨て、200μLのPBS-T（8.1mMリン酸水素２ナトリウム、1.5mMリン酸２水素１カリウム、137mM塩化ナトリウム、2.7mM塩化カリウム、0.05%ツイーン20）で洗浄後、200μLの5%スキムミルク加 PBS-Tを入れブロッキングした。ブロッキング液を捨て、血清を1%スキムミルク加 PBS-Tで50～100倍希釈し各wellに100μLずつ添加し、室温で1時間反応させた。反応液を除去後、PBS-Tで3回洗浄し、抗鶏IgG-HRP標識抗体を1%スキムミルク加 PBS-Tで10,000～20,000倍希釈し100μLずつ添加した。暗所で室温、1時間反応させた。反応液を除去後、PBS-Tで3回洗浄し、発色基質液（100mMクエン酸、200mMリン酸水素２ナトリウム、0.004％オルトフェニレンジアミン、過酸化水素）を100μLずつ添加し、室温で30分間反応させた。3M硫酸を100μLずつ添加し、発色を停止させた。96wellプレートリーダー（日本モレキューラーデバイス社製）で492nmの波長を測定した。その結果を表２に示す。
※2：Not done
A.pg-A型菌の領域２の配列番号１記載の243～271番目のアミノ酸配列とA.pg-C型菌の領域２の配列番号２記載の38～68番目のアミノ酸配列（31アミノ酸中30アミノ酸が一致；図３参照）の相同なアミノ酸配列を含むポリペプチド（P-AΔ6b-1b）は、領域２を含むポリペプチド（P-AΔ3-0, P-AΔ5-1, P-AΔ5-0, P-CΔ5-1, およびP-CΔ6-0）で免疫した血清の何れにも反応した。これに対して、上記の相同なアミノ酸配列を含まないポリペプチド（P-AΔ6b-2♯, P-AΔ7b-1bおよびP-CΔ6b-1b）は、それぞれ菌特異的に反応した。ポリペプチドP-AΔ6b-2♯およびP-AΔ7b-1bは、A.pg-A型菌感染血清とも結合した。
ELISAによるワクチン血清と防御との相関
不活化菌体を用いた市販のオイルアジュバントワクチン（オイルバックス７、財団法人化学及血清療法研究所）およびオイルバックス７のA.pg抗原（Ａ型菌およびＣ型菌の不活化菌体）の替わりに実施例２で得たポリペプチドAΔ5-1およびCΔ5-1を加えた同組成ワクチンを調製し、5週齢SPF鶏の頸部皮下に1回注射した。市販ワクチンは1ドースのほかに1/100および1/1,000に希釈したものも投与し、ポリペプチドはそれぞれが 3, 0.3および0.03μg/羽となるように希釈したＡ型Ｃ型混合ポリペプチド含有ワクチンを投与した。9週齢時に採血後、A.pg-A型菌211株（1.5 x 109 CFU/mL）またはA.pg-C型菌53-47株（5.0 x 109CFU/mL）の菌液0.2mLを鼻腔内投与し、１週間、顔面腫脹、鼻汁漏出、流涙などの臨床症状を観察した。
不活化菌体を用いた市販のオイルアジュバントワクチン（オイルバックス７、財団法人化学及血清療法研究所）およびオイルバックス７のA.pg抗原（Ａ型菌およびＣ型菌の不活化菌体）の替わりに実施例２で得たポリペプチドAΔ5-1およびCΔ5-1を加えた同組成ワクチンを調製し、5週齢SPF鶏の頸部皮下に1回注射した。市販ワクチンは1ドースのほかに1/100および1/1,000に希釈したものも投与し、ポリペプチドはそれぞれが 3, 0.3および0.03μg/羽となるように希釈したＡ型Ｃ型混合ポリペプチド含有ワクチンを投与した。9週齢時に採血後、A.pg-A型菌211株（1.5 x 109 CFU/mL）またはA.pg-C型菌53-47株（5.0 x 109CFU/mL）の菌液0.2mLを鼻腔内投与し、１週間、顔面腫脹、鼻汁漏出、流涙などの臨床症状を観察した。
得られた血清は以下の方法でELISA測定に供した。実施例２で得たポリペプチドP-AΔ6b-2♯およびP-CΔ6b-1bを1.0μg/mLとなるように50mM重炭酸バッファーで希釈し、96wellプレートに50μLずつ入れ固相化した。4℃で一夜吸着後、反応液を捨て、300μLのPBS-T（8.1mMリン酸水素２ナトリウム、1.5mMリン酸２水素１カリウム、137mM塩化ナトリウム、2.7mM塩化カリウム、0.1%ツイーン20）で洗浄後、300μLの5%スキムミルク加PBS-Tを入れブロッキングした。ブロッキング液を捨て、血清を5%スキムミルク加PBS-Tで1,000倍希釈し各wellに50μLずつ添加し、室温で1時間反応させた。反応液を除去後、PBS-Tで3回洗浄し、抗鶏IgG-HRP標識抗体を5%スキムミルク加PBS-Tで25,000倍希釈し50μLずつ添加した。暗所で室温、30分間反応させた。反応液を除去後、PBS-Tで3回洗浄し、発色基質液（TMB+substrate-chromogen; DAKO社）を100μLずつ添加し、室温で15分間反応させた。3M硫酸を100μLずつ添加し、発色を停止させた。96wellプレートリーダー（日本モレキューラーデバイス社製）で450nmの波長を測定した。
図４および図５に示すように、Ａ型菌およびＣ型菌攻撃のいずれの鶏においても、攻撃前の血清ELISA値が0.1を下回った鶏はすべて発症し感染が確認された。一方、攻撃前の血清ELISA値が0.1を超えた鶏には、発症したものは認められなかった。このことから、本ELISA系を使用することにより、ワクチン抗体の発症防御レベルの評価が可能であると考えられた。
本願発明の検出方法は、本願発明に使用されたアミノ酸配列を含むポリペプチドで構成されるワクチンで免疫した鶏の免疫状態の検査に利用される。また、本願発明の検出方法は、A.pgの感染により鶏伝染性コリーザを発症した鶏の血清を測定することにより、発症メカニズムや疫学の研究に利用される。
Claims (20)
- 下記のペプチドＡまたはＢの少なくとも一つの抗原と検体を反応させる抗体測定法からなることを特徴とする、アビバクテリウム・パラガリナラム抗体の検出方法。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、６アミノ酸以上のペプチド鎖からなり、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の一部であって、６アミノ酸以上のペプチド鎖からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の38～68番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。 - ペプチドＡまたはＢが、１０アミノ酸以上のペプチド鎖であることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
- ペプチドＡまたはＢが、２０アミノ酸以上のペプチド鎖であることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
- ペプチドＡまたはＢが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、請求項１記載の検出方法。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の8～236番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列の69～452番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の38～68番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。 - ペプチドＡまたはＢが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、請求項１記載の検出方法。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の8～236番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の69～452番目のアミノ酸配列からなるペプチド。 - ペプチドＡが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、請求項４記載の検出方法。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の274～445番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。 - ペプチドＡが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、請求項５記載の検出方法。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の274～445番目のアミノ酸配列からなるペプチド。 - ペプチドＡまたはＢが、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、付加、あるいは置換されたアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする、請求項１ないし７の何れか一項記載の検出方法。
- 抗体測定法が、ELISA法、ウェスタンブロット法およびドットブロット法からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１ないし８記載の検出方法。
- 検体が、アビバクテリウム・パラガリナラム感染鶏血清またはアビバクテリウム・パラガリナラムワクチン投与鶏血清であることを特徴とする、請求項１ないし９の何れか一項に記載の検出方法。
- 下記のペプチドＡまたはＢの少なくとも一つを抗原として用いることを特徴とする、アビバクテリウム・パラガリナラム抗体測定キット。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、６アミノ酸以上のペプチド鎖からなり、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の一部であって、６アミノ酸以上のペプチド鎖からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の38～68番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。 - ペプチドＡまたはＢが、１０アミノ酸以上のペプチド鎖であることを特徴とする請求項１１記載の抗体測定キット。
- ペプチドＡまたはＢが、２０アミノ酸以上のペプチド鎖であることを特徴とする請求項１１記載の抗体測定キット。
- ペプチドＡまたはＢが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、請求項１１記載の抗体測定キット。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の8～236番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列の69～452番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の38～68番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。 - ペプチドＡまたはＢが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、請求項１１記載の抗体測定キット。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の8～236番目のアミノ酸配列からなるペプチド。
ペプチドＢ：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の69～452番目のアミノ酸配列からなるペプチド。 - ペプチドＡが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、請求項１４記載の抗体測定キット。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の274～445番目のアミノ酸配列を含有し、且つ配列番号１で示されるアミノ酸配列の243～273番目のアミノ酸配列を含有しないペプチド。 - ペプチドＡが、下記のペプチド鎖であることを特徴とする、請求項１５記載の抗体測定キット。
ペプチドＡ：
配列番号１で示されるアミノ酸配列の274～445番目のアミノ酸配列からなるペプチド。 - ペプチドＡまたはＢが、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、付加、あるいは置換されたアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする、請求項１１ないし１７の何れか一項に記載の抗体測定キット。
- 抗体測定法が、ELISA法、ウェスタンブロット法およびドットブロット法からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１１ないし１８の何れか一項に記載の抗体測定キット。
- 検体が、アビバクテリウム・パラガリナラム感染鶏血清またはアビバクテリウム・パラガリナラムワクチン投与鶏血清であることを特徴とする、請求項１１ないし１９の何れか一項に記載の抗体測定キット。
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