KR100862084B1 - 유행성이하선염 바이러스 핵단백질 및 이것의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유행성이하선염 바이러스의 핵단백질 (NP) 및 이것의 유전자에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 유행성이하선염 바이러스 핵단백질 및 이것의 유전자에 관한 것이다. 본 발명의 핵단백질 및 이것의 유전자는 유행성이하선염 바이러스 진단의 마커로서 이용될 수 있으며, 유행성이하선염 바이러스의 백신의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

유행성이하선염 (mumps), 핵단백질 (NP)

Description

유행성이하선염 바이러스 핵단백질 및 이것의 용도 {NUCLEOPROTEIN OF MUMPS VIRUS AND THE USE THEREOF}

도 1은 본 발명의 재조합 발현벡터인 pQE981062NP의 개열지도를 나타낸다.

도 2a는 유행성이하선염 바이러스의 핵단백질 (NP) 전체 유전자의 코딩 부위에 대한 PCR 증폭 산물 (약 1.6 kb)을 나타내는 사진이다.

도 2b는 제한효소를 처리하여 pQE30 벡터에 삽입한 핵단백질 유전자 클론을 보여주는 사진이다.

도 3a는 본 발명의 재조합핵단백질에 대한 SDS-PAGE 결과이다.

도 3b는 본 발명의 재조합핵단백질의 발현을 웨스턴블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.

도 4은 본 발명의 재조합핵단백질을 정제한 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.

도 5는 본 발명의 재조합핵단백질과 다양한 호흡기바이러스에 대한 항혈청과의 반응을 웨스턴블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.

도 6은 본 발명의 재조합핵단백질을 항원으로 이용하여 유행성이하선염 특이 IgM 항체를 검출 결과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명의 재조합핵단백질을 항원으로 이용하여 유행성이하선염 특이 IgG 항체를 검출 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8a 및 도 8b는 본 발명의 재조합핵단백질을 이용하여 생성된 폴리클로널 항체에 대한 형광분석 결과를 보여주는 사진이다.

도 9은 본 발명의 재조합핵단백질을 이용하여 생성된 폴리클로널 항체에 대한 웨스턴블롯 분석 결과를 보여주는 사진이다.

도 10은 본 발명의 재조합핵단백질을 이용하여 생성된 폴리클로널 항체에 대한 간접면역효소결합법 분석 결과를 보여주는 사진이다.

기술분야

본 발명은 유행성이하선염 바이러스의 핵단백질 (NP, nucleoprotein) 및 이것의 유전자에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 유행성이하선염 바이러스 핵단백질을 이용하여 유행성이하선염 바이러스 감염을 진단하고, 유행성이하선염 바이러스에 대한 백신 자료를 제공하는 것에 관한 것이다.

종래기술

유행성이하선염 바이러스는 직접적인 접촉이나 호흡기를 통해 전파되고 전형적인 증상은 양측성 또는 단측성의 이하선염으로 알려져 있으며, 감염자의 50% 이상이 호흡기 증상을 나타낸다. 또한, 고환염, 뇌막염 같은 합병증을 유발할 수 있다 (참고문헌: Caplan CE, Canadi. Medi. Associ., 160:865-866, 1999; Daginakatte GC et al., Clin. Diagno. Lab. Immunol., 6:341-344, 1999). 유행성 이하선염 발생은 MMR 백신의 도입으로 세계적으로 크게 감소하였으나, 1980년대 중반 이후 우리나라를 비롯한 스위스, 캐나다, 미국, 및 일본 등에서 백신 접종자에서까지 산발적인 발병 및 유행이 자주 발생하기 시작하였으며 이에 대한 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않고 있다 (참고문헌: Elango N et al., J. Gen. Virol., 69:2893-2900, 1988).

유행성이하선염 바이러스는 파라믹소비리대 (Paramyxoviridae)의 루불라바이러스 (Rubulavirus) 속에 속하며 약 15 kb의 음성센스 (negative sense), 조각나지 않은 RNA (non-segmented RNA)를 유전자로 갖는다. 이 유전자는 3’-leader-NP (nucleocapsid associated protein)-P (phosphoprotein)-M(matrix protein)-F(fusion protein)-SH(small hydrophobic protein)-HN(hemagglutinin-neuraminidase)-L(large protein)-trailer-5'의 순서로 구성되며, 이중 NP, P, M 및 L 단백질은 코어 (core) 단백질; F, HN 단백질은 외막 단백질을 구성한다 (참고문헌: Elango N et al., J. Gen. Virol., 69:2893-2900, 1988). 유행성이하선염 바이러스의 혈청형은 단일형이지만 유전형은 지역 및 시기 등에 따라 다양하며, SH 유전자의 변이 정도에 따라 현재 A형부터 K형까지 11가지의 유전형이 보고 되어 있다 (참고문헌: Afzal MA et al., Arch. Virol., 142:227-238, 1997; Jin L et al., J. Infect. Dis., 180: 829-833, 1999; Orvell C et al., J. Gen. Virol., 78:91-95, 1997; SH Kim et al., Microbiol. Immunol., 44(3):173-177, 2000).

유행성이하선염 바이러스에 대한 실험실적 진단법 중 세포배양에 의한 바이러스의 분리는 검체의 채취 시기나 수송 과정에 따라 정확한 진단이 이루어지지 않 는 단점이 있었다. 따라서, 면역형광항체법 (immunofluoresecnt assay, FA), 혈구응집억제시험 (hemagglutination inhibition test, HI), 또는 효소면역측정법 (Enzyme immuno assay, EIA) 등을 이용한 혈청학적 검사 방법이 널리 이용되어 왔다. 이중 EIA 방법이 간단하고 민감도 및 특이성이 우수한 것으로 알려져 있다 (참고문헌: Edmunds WJ et al., Epidemiol. Infect., 125:635-650, 2000; Meurman O et al., J. Virol. Methods, 4:249-257, 1982). 그러나, 현재 사용하고 있는 유행성이하선염 바이러스에 대한 EIA 혈청 진단키트는 전체 바이러스 또는 바이러스가 감염된 세포를 항원으로 이용하므로 생산방법을 표준화하는 것이 곤란하고 매우 고가이다. 이를 보완하고자 원인 병원체의 주요 항원에 대한 재조합단백질을 이용하여 진단용 항원 및 항체를 생산함으로써 생산방법을 표준화하고 안전성을 증가시키려는 연구가 수행 되었다 (참고문헌: Daginakatte GC et al., Clin. Diagno. Lab. Immunol., 6:341-344, 1999; Hummel KY et al., J. Clin. Microbiol., 30:2874-2880, 1992). 이에, 유행성이하선염 바이러스의 재조합단백질을 진핵세포 또는 효모로부터 생산하여 진단에 이용하고자 하는 연구가 수행되었다 (참고문헌: Samuel D et al., J. Med. Virol., 66:123-130, 2002). 그러나 보다 다양한 유형의 유행성이하선염 바이러스를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 방법 및 이에 관련된 재조합단백질의 효율적인 생산에 대한 문제는 여전히 해결되어야 할 과제로 남아 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 유행성이하선염 바이러스로부터 바이러스의 유형에 관계없이 보존성이 뛰어난 핵단백질 (NP)을 분리하여 그 유전자를 분석한 후, 이를 원 핵세포에서 대량 배양하고 진단 가능성 여부를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 유행성이하선염 바이러스의 핵단백질 및 이를 엔코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 유행성이하선염 바이러스의 핵단백질을 원핵세포로부터 제조함을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 유행성이하선염 바이러스의 핵단백질을 원핵세포로부터 제조하기 위한 제조합발현벡터를 제공함을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 유행성이하선염 바이러스의 핵단백질 및 이것의 유전자를 이용하여 유행성이하선염 바이러스의 감염을 진단하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 유행성이하선염 바이러스의 핵단백질 및 이것의 유전자를 이용하여 유행성이하선염 바이러스 예방 및 치료 백신을 제공함을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 유행성이하선염 바이러스의 핵단백질 및 이것의 유전자를 포함하는 유행성이하선염 바이러스 감염 진단키트를 제공함을 목적으로 한다.

상기 목적으로 달성하기 위해, 본 발명자들은 국내 유행성이하선염 바이러스 분리주 (Dg1062/Korea/98)의 유전자 중 돌연변이가 적고 보존성이 우수한 핵단백질을 RT-PCR 방법을 이용하여 증폭하고 이를 재조합발현벡터를 이용하여 숙주세포에 형질전환 시킨 후 이로부터 수득한 핵단백질을 임상 검체에 적용함으로써 유행성이하선염에 대한 혈청학적 진단의 가능성을 확인하였다.

본 발명에서, 핵단백질은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는다. 서열번호: 2는 본 발명의 핵단백질 유전자를 코딩하는 염기서열이다.

본 발명에서, 핵단백질의 증폭을 위한 RT-PCR에 사용한 프라이머는 다음과 같다:

센스 : 5’cgagctcatgtcgtctgtgctcaaagcatttgagcgattcacg 3' (서열번호: 3)

안티센스: 5’gtaaagctttcatgtcagtgatttactcatcccagtcgcccactt 3' (서열번호: 4)

일구체예에서, 본 발명은 유행성이하선염 바이러스의 핵단백질을 엔코딩하는 유전자의 전체 유전자 코딩영역을 pQE30 벡터 (Qiagen Inc., Chatsworth, CA)에 서브클로닝하였다. 재조합핵단백질 클론체를 E.coli [M15(pREP4)] 세포에 형질전환하고, 이로부터 수득한 재조합핵단백질을 Ni-NTA 친화크로마토그래피로 정제하였다.

다른 일구체예에서, 재조합핵단백질을 유행성이하선염 증세를 보이는 유사 환자의 임상검체를 이용하여 ELISA를 실시하였다. 또한 정제된 재조합핵단백질을 BALB/c 마우스에 면역시켜 폴리클로널 항체 (polyclonal antibody)를 유도하고 그 반응성을 확인하였다.

다른 일구체예에서, 유행성이하선염 바이러스의 진단 가능성을 확인하기 위해, 간접 ELISA를 실시하였다. 그 결과 본 발명의 핵단백질은 유행성이하선염 바 이러스 특이 IgG 및 IgM에 대한 항체를 진단할 수 있음이 확인되었다. 또한 핵단백질로부터 유도된 다가 항혈청을 이용하여 간접 ELISA를 수행하였으며, 그 결과 본 발명의 핵단백질은 유행성이하선염 바이러스에 대한 IgG 및 IgM에 대해 특이적임이 확인되었다. 이는 본 발명의 핵단백질이 유행성이하선염 바이러스에 대한 혈청학적 진단에서 특이적으로 IgG와 IgM를 구분할 수 있음을 지지한다.

다른 일구체예에서, 본 발명의 핵단백질에 대해, 유행성이하선염 바이러스가 아닌 파라인플루엔자 바이러스 등 다른 바이러스와의 교차반응성을 분석하였다. 그 결과 유행성이하선염바이러스는 다른 호흡기 바이러스와 전혀 반응성을 나타내지 않았다.

본 발명에서, 유행성이하선염 바이러스 핵단백질 유전자를 이용하여 숙주세포를 형질전환 함에 있어, 숙주세포는 진핵세포 및 효모 등을 포함하나 원핵세포가 바람직하다. 또한, 본 발명의 핵단백질 유전자는 재조합발현벡터에 작동적으로 결합되며, 핵단백질의 분리정제가 용이하도록 하기 위해 단백질 유전자의 N-말단부위에 히스티딘을 융합시켜 이용할 수 있다.

이하, 실시예에 의거 본 발명을 보다 상세히 설명 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에 인용된 참고문헌은 본 발명의 일부로서 통합된다.

실시예

실시예 1: 유행성이하선염 바이러스 분리주의 증식

1998년 국내 대구 지역에서의 유행성이하선염 감염 의심 환자의 임상 검체 (인후도찰물)로부터 분리된 유행성이하선염 바이러스 (Dg1062/Korea/98주)를 베로 (Vero) 세포 (ATCC CCL-8)에 감염시켰다. 감염된 베로 세포를 2% 우태아혈청 (Gibco BRL, USA) 및 항생제가 첨가된 배지 EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium, JBI, South Korea)에서 33℃로 5% CO2 조건에서 증식시켜 다음 실험에 이용하였다.

실시예 2: 유행성이하선염 바이러스 핵단백질 (NP) 유전자의 RT-PCR 및 클로닝

유행성이하선염 바이러스 핵단백질 유전자 전체에 대한 코딩영역을 증폭하였다. 먼저 바이러스 RNA 키트 (Viral RNA Kit) (Qiagen Inc., USA)를 사용하여 실시예 1의 바이러스 배양액으로부터 RNA를 분리하였다. 다음, cDNA를 합성하기 위해 10 ㎕ 바이러스 RNA와 2 ㎕ RT 프라이머 (10 mM)를 72℃에서 10분간 처리한 후 0.5 ㎕ MMLV 역전사효소 (200 U/㎕, Promega, USA), 0.5 ㎕ RNase 저해제 (40 U/㎕, Promega, USA), 0.5 ㎕ 10 mM dNTPs를 넣어 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 반응 용액을 제조한 후, 37℃에서 10분, 42℃에서 50분, 및 95℃에서 3분씩 반응시켰다. 다음, 5 ㎕ cDNA를 이용하여 0.5 ㎕ Taq DNA 폴리머라제 (5 U/㎕, Takara Co., Japan), 양 방향의 핵단백질 유전자 특이 프라이머 (10 mM)를 사용하여 최종 부피가 50 ㎕가 되도록 반응 용액을 제조한 후 95℃에서 3분간 1 사이클; 95℃에서 1분, 50℃에서 1분, 및 72℃에서 1.5분을 25회; 72℃에서 10분간 1 사이클로 PCR을 수행했다. 본 실시예에서 프라이머는 원핵세포 발현벡터로의 용이한 클로닝을 위 해 NP 유전자 양 말단에 Sac I과 Hind III 제한효소 인식부위를 추가하여 제작한 것을 사용하였다. 즉, 센스방향의 프라이머는 5‘ cgagctcatgtcgtctgtgctcaaagcatttgagcgattcacg 3' (서열번호: 3)이며 안티센스방향의 프라이머는 5’ gtaaagctttcatgtcagtgatttactcatcccagtcgcccactt 3' (서열번호: 4)를 사용하였다. PCR 증폭 산물을 전기영동으로 확인하고 정제하였다. 정제한 산물을 pCR 2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 제조자의 지시에 따라 형질전환시켜 37℃에서 배양하고 생성된 콜로니를 배양하여 플라스미드를 추출한 후 제한효소 처리 및 염기서열 분석을 실시하여 클론내의 핵단백질 유전자 삽입 여부를 확인하였다. 다음, 핵단백질 유전자가 삽입된 클론과 N-말단에 6개의 히스티딘을 포함하는 원핵세포 발현벡터인 pQE30 벡터 (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) (pQE981062NP로 명명) (도 1 참조)를 Sac I과 Hind III 제한효소로 동시에 처리를 한 후 E. coli [M15(pREP4)] 세포 (Qiagen Inc., Chatsworth, CA)를 이용하여 서브클로닝 하고, 핵단백질 유전자 삽입 여부를 염기서열 분석과 제한효소를 이용하여 확인하였다 (도 2a 및 도 2b 참조). 도 2a는 유행성이하선염 바이러스 핵단백질 유전자를 PCR로 증폭시킨 산물과 유전자가 포함된 클론을 나타낸다. 도 2a는 핵단백질 유전자의 전체 코딩 영역에 해당하는 약 1.6 kb의 PCR 증폭 산물을 나타낸다. 도 2a에서, M 레인은 DNA 사이즈 마커; 제 1 레인은 핵단백질 유전자 증폭산물을 각각 나타낸다. 도 2b는 제한효소 처리에 의해 핵단백질 유전자가 pQE30 벡터에 삽입된 클론을 나타낸다. 도 2b에서, M 레인은 DNA 사이즈 마커; 제 1 레인은 재조합 클론을 Sac I과 Hind III 제한효소로 처리한 결과; 제 2 레인은 재조합 클론 을 Bam H1 제한효소로 처리한 결과; 및 제 3 레인은 재조합 클론을 Eco R1 제한효소로 처리한 결과를 각각 나타낸다.

실시예 3: 재조합 핵단백질의 발현

상기 실시예 2에서 수득한 재조합 클론을 이용하여 원핵세포에서 재조합핵단백질의 발현을 유도하고 분석하였다. 재조합핵단백질 클론체를 암피실린 (ampicillin) (100 ㎍/ml)과 카나마이신 (kanamycin) (25 ㎍/ml)이 첨가된 루리아-베르타니 (Luria-Bertani) (LB) 배지에 접종하여 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드 (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) (IPTG)의 최종 농도가 1 mM이 되도록 조정하고 37℃에서 4시간동안 발현을 유도하였다. 발현벡터만을 포함한 E. coli [M15(pREP4)] 세포 (입수처: )를 음성대조로서 이용하였다. 배양액을 원심분리 하여 수득한 상층액과 균체에서 재조합핵단백질의 발현을 확인하였다.

실시예 4: SDS-PAGE 및 웨스턴블롯에 의한 재조합핵단백질 발현 분석

실시예 3의 배양액에 대해 SDS-PAGE와 웨스턴블롯을 수행하여 유행성이하선염 바이러스 핵단백질의 발현을 확인하였다. 다음 실시예 3의 재조합핵단백질 대한 농도를 BCA 키트 (Pierce, Cambridge, England)로 정량하였다. 먼저, SDS-PAGE를 수행하기 위해, 상기 실시예 3의 배양액 샘플에 완충액을 가한 후 95℃에서 2분간 가열하고 10% 불연속 젤 (discontinuous gel)을 사용하여 전기영동 하였다. 후속하여, 0.25% 쿠마쉬 블루 (coomassie brilliant blue) R-250 (Sigma, St. Louis, MO)로 염색하여 재조합핵단백질에 해당하는 밴드를 확인하였다. 다음, 웨스턴블롯을 수행하였다. 이를 위해 나이트로셀룰로즈 멤브레인에 실시예 3의 샘플을 1시간 동안 이적시키고 1차 항체로서 발현벡터에 특이적인 폴리히스티딘 항혈청 또는 유행성이하선염 바이러스에 대한 양성 혈청을 사용하였다. 2차 항체로서 1:2000으로 희석시킨 알칼라인 포스파타아제-사람 (alkaline phosphatase-human) IgG 또는 항마우스 (anti-mouse) IgG를 이용하여 반응시켰다. 반응시킨 멤브레인을 발색시키고 핵단백질에 해당하는 밴드를 확인하였다 (도 3a 및 도 3b 참조). 도 3a 및 도 3b는 원핵세포에서 발현된 유행성이하선염 재조합핵단백질을 나타내는 사진으로서, 도 3a는 유행성이하선염 바이러스 핵단백질에 해당되는 ~66 kDa의 밴드가 재조합 클론에서 발현 됨을 제시하는 SDS-PAGE 결과를 나타낸다. 도 3b는 재조합핵단백질의 발현여부를 확인하는 웨스턴블롯 결과를 나타낸다. 도 3a 및 3b에서 M은 단백질 크기 마커; 제 1 레인은 벡터만 갖고 있는 E.coli를 발현시키지 않은 배양액; 제 2 레인은 벡터만 갖고 있는 E.coli를 발현시킨 배양액; 제 3 레인은 재조합 클론체를 발현시키지 않은 E.coli 배양액; 제 4 레인은 재조합 클론체를 발현시킨 E.coli 배양액을 각각 나타낸다. 도 3a 및 3b에서 확인 되는 바와 같이, 실시예 3에서 수득한 핵단백질은 실제 유행성이하선염 바이러스의 핵단백질의 크기와 거의 일치하였다. 핵단백질은 총 549개의 아미노산으로 구성되며 추정 분자량은 약 61 kDa으로 알려져 있다. 본 실시예에서 수행한 SDS-PAGE 결과 핵단백질의 인산화로 인해 발생될 것으로 추정되는 단백질의 크기보다 약 8 내지 10 kDa 정도 더 큰 약 68 내지 73 kDa인 것이 관찰되었고 66 kDa과 61 kDa 2개의 서브유닛으로 구성된 것이 확인 되었는데, 이는 기존의 핵단백질에 대한 연구보고와 매우 유사한 크기이다.

실시예 5: 재조합핵단백질의 정제

재조합핵단백질을 Ni-NTA Superflow resin (Qiagen Inc., Chatsworth, CA)를 이용하여 천연 (native) 조건에서 정제하였다. 배양액을 원심분리한 후 수득한 균체를 초음파 분쇄하여 생성된 균액에 수지 (resin)을 가하고 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액을 폴리프로필렌 칼럼에 옮기고 세척액 (PBS, 1% 트리톤-X 100, 20 mM 이미다졸)을 첨가하여 수지에 결합되지 않은 단백질을 제거한 후 결합된 단백질을 완충액 (PBS, 1% 트리톤-X 100, 250 mM 이미다졸)을 이용하여 용출하였다 (도 4 참조). 도 4는 재조합핵단백질의 정제 후 각 단계 시료에 대해 10% 젤을 이용하여 SDS-PAGE를 실시한 결과를 나타내는 사진이다. 도 4에서 M은 단백질 크기 마커; 제 1 레인은 재조합 클론체를 발현시킨 E.coli 배양액; 제 2 레인은 칼럼을 통과한 용액 (flow-through); 제 3 및 제 4 레인은 세척 완충액을 통과시켜 세척한 용액; 및 제 5 내지 제 7 레인은 용출물 (eluate)을 나타낸다.

실시예 6: 재조합핵단백질의 특이성 분석

상기 실시예 5에서 정제하여 수득한 재조합핵단백질의 항원성 및 다른 주요 호흡기바이러스와의 반응성을 조사하기 위해 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 SDS-PAGE 및 웨스턴불롯을 수행하였다 (도 5 참조). 정제된 재조합핵단백질을 다양한 호흡기바이러스에 대한 항혈청과의 반응시키고 이를 웨스턴블롯으로 확인하였다. 도 5에서, 제 1 레인은 벡터 특이 히스티딘 항혈청에 대한 반응; 제 2 레인은 유행성이하선염 바이러스 핵단백질에 특이적인 모노클로널 항혈청에 대한 반응; 제 3 및 제 4 레인은 유행성이하선염 환자의 혈청에 대한 반응; 제 5 레인은 유행성이 하선염 바이러스에 대한 폴리클로널 항혈청에 대한 반응; 제 6 레인은 유행성이하선염에 감염되지 않은 정상인의 혈청에 대한 반응; 제 7 레인은 파라인플루엔자 바이러스에 대한 단클론항체에 대한 반응; 제 8 레인은 파보바이러스 B19에 대한 단클론항체에 대한 반응; 및 제 9 및 제 10 레인은 각각 홍역 및 풍진 바이러스에 대한 단클론항체에 대한 반응을 나타낸다. 도 5로부터 확인되는 바와 같이, 본 발명의 재조합핵단백질은 유행성이하선염 바이러스와는 반응을 하는 반면 다른 바이러스와는 교차반응성을 나타내지 않았다.

실시예 7: 유행성이하선염 특이 IgM 항체 검출 분석

재조합핵단백질의 진단항원으로서의 효능을 간접효소면역분석법 (Indirect ELISA)으로 분석하였다. 임상 검체로서, 시판중인 진단시약인 Engygnost Anti-Mumps Virus/IgG 및 Engygnost Anti-Mumps Virus/IgM (Dade Behring, Marburg)에 의해 이미 확인된 혈청을 사용하였다. 상기 실시예 5에서 수득한 핵단백질을 웰당 10 ㎍/ml 농도로 96웰 마이크로플레이트 (Life Technologies, Roskidle, Denmark)에 가한 후 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 다음 0.05% 트윈 (Tween) 20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate, Sigma.) 이 포함된 PBS 완충액 (PBS-T)를 이용하여 3회 세척하고 블로킹 완충액 (0.01 M PBS, 0.05% 트윈 20, 1% 우혈정 알부민, BSA)를 200 ㎕씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이어서, PBS-T 완충액으로 3회 세척한 후, 1차 혈청으로서 임상 혈청을 희석용 완충액 (0.01 M PBS, 0.05% 트윈 20, 0.1% 우혈정알부민, BSA)으로 1:100 (v/v)이 되도록 희석한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. IgG와의 비특이적 반응을 제거하기 위해 류 머티즘 인자 (rheumatoid factor) (RF)-흡착제 (sheep anti-human IgG, Behringwerke AG, Marburg, Germany)로 혈청을 전처리 하여 사용하였다. 다음, 상기와 동일한 방법으로 세척한 후 2차 항체로서 알칼라인 포스포타아제가 결합된 염소 항-사람 (anti-human) IgM (Sigma)를 1:3,000으로 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS-T 완충액으로 3회 세척한 후 나이트로페닐포스페이트 (0.5 mg/ml)를 첨가하여 발색시키고 30분 후에 1 N 수산화나트륨으로 반응을 정지시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 실험마다 양성 대조혈청과 음성 대조혈청을 포함하여 실시하였다. 다음, 재조합핵단백질을 시판중인 유행성이하선염 진단 시약에 의해 양성으로 확진된 37건의 임상검체와 반응시켜, 평균 흡광도의 3배 값에 표준 편차를 더한 값인 0.415 보다 큰 경우를 양성으로, 평균 흡광도에 2배의 표준 편차를 더한 값인 0.351 미만인 경우에는 음성으로 각각 판정하고, 두 값 사이는 의양성으로 판정하였다 (표 1 및 도 6 참조). 표 1은 본 발명의 재조합 단백질을 항원으로 이용하여 유행성이하선염 특이 IgM 항체를 분석한 결과를 나타낸다. 표 1에서 확인되는 바와 같이, 임상 혈청 99건을 대상으로 간접효소면역분석법을 실시한 결과 양성 혈청 27건 중 22건이 양성으로 나타나 일치하였다. 또한, 음성 혈청 72건 중에서는 70건이 음성으로 일치하였다. 판정 기준에 따라 유행성이하선염 특이 IgM 진단을 위한 재조합 단백질의 반응성을 조사한 결과, 민감도는 81.5%이며 특이도는 97.2%로 나타났다. 위양성과 위음성은 각각 1.0% (99건 중 1건) 및 3.0% (99건 중 3건)이었으며 기존에 시판중인 진단제를 이용했을 때의 결과와 비교하여 두 방법간의 상관계수는 0.83이었다.

표 1. 재조합 NP 단백질의 유행성이하선염 특이 IgM 항체 검출을 위한 간접효소면역분석법 결과

		상업용 키트		민감도 (%)	특이도 (%)	양성 예측도 (%)	음성 예측도 (%)
		양성	음성
재조합 단백질	양성	22	1	81.5	97.2	95.7	95.9
	음성	3	70
	의양성	2	1
	합계	27	72

도 6은 재조합핵단백질을 항원으로 이용하여 유행성이하선염 특이 IgM 항체를 검출한 간접효소면역분석법의 결과를 나타낸 그래프이다. 도 6에서 수평선과 수직선은 시판중인 진단키트와 재조합핵단백질을 이용했을 때의 음성도를 위한 기준값 (cutoff)을 각각 나타낸다.

실시예 8: 유행성이하선염 특이 IgG 항체 검출 분석

1차 항체로 사용한 임상 혈청을 RF 처리 하지 않고 이용하고, 2차 항체로서 알칼라인 포스포타제가 결합된 염소 항-사람 IgG를 1:3,000으로 희석하여 반응시킨 것을 제외하고는, 실시예 7과 동일한 방법으로 재조합핵단백질의 유행성이하선염 특이 IgG 항체 검출 효능을 분석하였다. 재조합 단백질을 시판중인 유행성이하선염 진단시약에 의해 이미 양성으로 확진된 26건의 임상 검체와 반응시켜 평균 흡광도의 3배 값에 표준 편차를 더한 값인 0.512 보다 큰 경우를 양성, 평균 흡광도에 2배의 표준 편차를 더한 값인 0.444 미만인 경우에는 음성으로 각각 판정하였고, 두 값 사이는 의양성으로 판정하였다 (표 2 및 도 7 참조). 표 2는 본 발명의 재조합 단백질을 항원으로 이용하여 유행성이하선염 특이 IgG 항체를 분석한 결과를 나타낸다. 표 2에서 확인되는 바와 같이, 환자 혈청 141건을 대상으로 간접효 소면역분석법을 실시한 결과 양성 혈청 80건 중 52건은 양성으로 일치하였고, 18건은 음성으로 나타났다. 또한, 음성 혈청 61건 중에서는 54건이 음성으로 일치하였으며 5건은 양성으로 나타났다. 판정 기준에 따른 민감도는 65.0%이고 특이도는 88.5%로서 유행성이하선염 특이 IgM 항체 검출과 비교 할 때 보다 낮은 반응성을 보였다. 기존의 시판중인 진단제를 이용한 rut과 비교하면 두 방법간의 상관계수는 0.712 이었다.

표 2. 재조합 NP 단백질의 IgG 항체 검출을 위한 간접효소면역분석법 결과

		상업용 키트		민감도 (%)	특이도 (%)	양성 예측도 (%)	음성 예측도 (%)
		양성	음성
재조합 단백질	양성	52	5	65.0	88.5	91.2	75.0
	음성	18	54
	의양성	10	2
	합계	80	61

도 7은 본 발명의 재조합핵단백질을 항원으로 사용하여 유행성이하선염 특이 IgG 항체를 검출한 간접효소면역분석법의 결과를 나타낸 그래프이다. 도 7에서 수평선과 수직선은 시판 중인 진단키트와 재조합핵단백질을 이용했을 때의 음성도를 위한 기준값 (cutoff)을 각각 나타낸다.

이와 같이, 유행성이하선염 바이러스 특이 항체를 진단함에 있어 천연 형태로 정제된 본 발명의 재조합핵단백질을 이용한 간접효소면역분석법과 기존의 상업용 진단시약을 사용했을 때의 결과를 비교하면, 두 방법간의 민감도와 특이도는 유의성 있는 상관관계를 보였다. 다만, 본 실시예에서 본 발명의 재조합 단백질을 이용한 경우 비특이 반응이 다소 높게 나타난 것은 재조합 핵단백질이 세포내 단백분해효소 등에 의해 쉽게 분해 되어 예상 크기보다 작은 크기의 단백질이 정제된 항원 내에 포함되었기 때문인 것으로 추정된다. 또한, 천연 형태로 정제 하더라도 단백질의 형태상 변화로 인해 항원 부위 중 일부가 파괴되거나 변형될 가능성도 비특이적 반응을 증가시킨 요인으로 추정된다.

실시예 9: 특이도 (specificity) 검사

실시예 6에서 수득한 본 발명의 재조합 단백질과 다른 바이러스와의 교차 반응성을 검토 하였다. 이를 위해, 파라인플루엔자 바이러스 (Chemicon, CA), 파보 바이러스 B19 (Chemicon, CA), 홍역 바이러스 (Dade Behring, Marburg) 및 풍진 바이러스 (Dade Behring, Marburg)에 대한 표준 혈청 또는 양성으로 판정된 임상 혈청을 이용하여 상기 실시예 7 및 실시예 8과 동일한 방법으로 분석하였다. 그 결과 사용한 혈청 132건 모두 음성으로 나타났으며, 이는 교차 반응이 전혀 없음을 의미한다.

실시예 10: 재조합 단백질에 대한 폴리클로널 항체 유도

실시예 5의 재조합핵단백질을 이용하여 항혈청 생성을 유도하고 반응성을 분석하였다. 상기 실시예 5에서 수득한 정제 재조합핵단백질 20 ㎍을 완전 프로인트 애주번트 (Sigma, St. Louis, MO)와 동량으로 혼합하고 6주령의 BALb/c 마우스 (Korea Food and Drug Administration, South Korea) 3마리를 면역시켰다. 1차 면역 후 2주 및 4주후에 다시 동량으로 면역시켰으며, 최종 면역 후 1주후에 마우스로부터 채혈하여 폴리클로널 항체의 반응성을 분석하기 위한다음 실험에 이용하였다.

실시예 11: 면역형광분석에 의한 항체 형성 검정

유행성이하선염 바이러스 (Dg1062/Korea/98)를 베로 세포 (ATCC CCL-8)에 감염시켜 면역형광분석법을 실시하기 위한 항원용 슬라이드를 제작하였다. 감염시키지 않은 베로 세포를 대조군으로 사용하였다. 바이러스 감염 2일 경과 후 세포를 회수하고 원심분리에 의해 형성된 세포 침전물을 PBS로 3회 세척한 후, PBS 20 ㎕로 현탁하였다. 다음 현탁 세포를 슬라이드 글래스 위에 점적하고 실온에서 건조한 후 아세톤 용액에서 15분간 고정하였다. 다음 실시예 10의 마우스에서 생성된 폴리클로널 항체를 PBS로 1:1000으로 희석하여 점적한 후 37℃에서 30분간 반응시키고 세척하였다. 후속하여, PBS로 1:500이 되도록 희석한 플루오레세인 이소시아네이트 (fluorescein isocyanate, FITC)가 결합된 항마우스 IgG 염소 폴리클로널 2차 항체 (Cappel)를 처리하였다. 상기 항체로 표지된 세포를 형광현미경 (Leica DC 300F, Germany)로 관찰하였다 (도 8 참조). 도 8a 및 8b는 본 발명의 재조합핵단백질을 이용하여 생성된 폴리클로널 항체에 대한 형광분석 결과를 나타낸다. 도 8a는 유행성이하선염 바이러스에 감염된 세포와의 반응성을, 도 8b는 세포 대조군을 각각 나타낸다. 도 8a 및 8b에서 확인되는 바와 같이, 바이러스에 감염된 세포에서는 형광을 나타내는 세포가 많은 반면, 비감염세포 대조군에서는 형광이 관찰되지 않았다.

실시예 12: 웨스턴블롯에 의한 항체 형성 검정

상기 실시예 10의 폴리클로널 항체를 이용하여 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 웨스턴블롯을 수행 하였다. 그 결과 항체를 각각 1:500, 1:1000, 1:2500, 및 1:5000으로 희석한 경우 모두에서 유행성이하선염 바이러스에 특이적인 약 ~66 kDa 에 해당되는 밴드가 관찰되었다 (도 9 참조). 도 9는 본 발명의 재조합핵단백질을 이용하여 수득한 폴리클로널 항체에 대한 웨스턴블롯 결과를 나타낸다. 도 9에서, 제 1 레인은 폴리클로널 항체가 1:500으로 희석된 것; 제 2 레인은 폴리클로널 항체가 1:1000으로 희석된 것; 제 3 레인은 폴리클로널 항체가 1:2500으로 희석된 것; 및 제 4 레인은 폴리클로널 항체가 1:5000으로 희석된 것을 각각 나타낸다.

실시예 13: 간접면역효소결합법에 의한 항혈청 반응성 분석

상기 실시예 12와 동일한 방법으로 본 발명의 재조합핵단백질에 대한 항혈청의 반응성을 간접면역효소결합법으로 확인하였다. 그 결과 항혈청은 다른 주요 호흡기 바이러스와 비교하여 유행성이하선염 바이러스 재조합 핵단백질에 대해 특이적으로 반응하였다 (도 10 참조). 도 10은 재조합핵단백질의 폴리클로널 항체에 대한 간접면역효소결합법에서의 반응 결과를 나타낸다. 도 10에서, 제 1은 유행성이하선염 바이러스 모노클로널 항체에 대한 반응; 제 2 및 제 3은 유행성이하선염 바이러스 폴리클로널 항체에 대한 반응; 제 4는 파라인플루엔자 바이러스 모노클로널 항체에 대한 반응; 제 5는 파보바이러스 B19에 대한 모노클로널 항체에 대한 반응; 제 6 및 제 7은 홍역 및 풍진 바이러스 모노클로널 항체에 대한 반응; 및 제 8은 음성대조군을 각각 나타낸다.

이와 같이, 본 발명은 유행성이하선염 바이러스의 핵단백질 및 이것의 유전자, 및 이로부터 유도되는 모노클로널 및 폴리클로널 항체를 사용하여 유행성이하선염 바이러스를 조기에 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 수단을 제공한다. 또 한 본 발명의 핵단백질은 유행성이하선염 바이러스의 백신을 개발하는데 이용될 수 있다.

<110> KOREA CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION COSMO GENETECH CO., LTD. <120> NUCLEOPROTEIN OF MUMPS VIRUS AND THE USE THEREOF <130> IPM-26512 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 549 <212> PRT <213> Mumps virus <400> 1 Met Ser Ser Val Leu Lys Ala Phe Glu Arg Phe Thr Ile Glu Gln Glu 1 5 10 15 Leu Gln Asp Arg Gly Glu Glu Gly Ser Ile Pro Pro Glu Thr Leu Lys 20 25 30 Ser Ala Val Lys Val Phe Val Ile Asn Thr Pro Asn Pro Thr Thr Arg 35 40 45 Tyr Gln Met Leu Asn Phe Cys Leu Arg Ile Ile Cys Ser Gln Asn Ala 50 55 60 Arg Ala Ser His Arg Val Gly Ala Leu Ile Thr Leu Phe Ser Leu Pro 65 70 75 80 Ser Ala Gly Met Gln Asn His Ile Arg Leu Ala Asp Arg Ser Pro Glu 85 90 95 Ala Gln Ile Glu Arg Cys Glu Ile Asp Gly Phe Glu Pro Gly Thr Tyr 100 105 110 Arg Leu Ile Pro Asn Ala Arg Ala Asn Leu Thr Ala Asn Glu Ile Ala 115 120 125 Ala Tyr Ala Leu Leu Ala Asp Asp Leu Pro Pro Thr Ile Asn Asn Gly 130 135 140 Thr Pro Tyr Val His Ala Asp Val Glu Gly Gln Pro Cys Asp Glu Ile 145 150 155 160 Glu Gln Phe Leu Asp Arg Cys Tyr Ser Val Leu Ile Gln Ala Trp Val 165 170 175 Met Val Cys Lys Cys Met Thr Ala Tyr Asp Gln Pro Ala Gly Ser Ala 180 185 190 Asp Arg Arg Phe Ala Lys Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Glu Ala Arg 195 200 205 Tyr Met Leu Gln Pro Glu Ala Gln Arg Leu Ile Gln Thr Ala Ile Arg 210 215 220 Lys Ser Leu Val Val Arg Gln Tyr Leu Thr Phe Glu Leu Gln Leu Ala 225 230 235 240 Arg Arg Gln Gly Leu Leu Ser Asn Arg Tyr Tyr Ala Met Val Gly Asp 245 250 255 Ile Gly Lys Tyr Ile Glu Asn Ser Gly Leu Thr Ala Phe Phe Leu Thr 260 265 270 Leu Lys Tyr Ala Leu Gly Thr Lys Trp Ser Pro Leu Ser Leu Ala Ala 275 280 285 Phe Thr Gly Glu Leu Thr Lys Leu Arg Ser Leu Met Met Leu Tyr Arg 290 295 300 Asp Leu Gly Glu Gln Ala Arg Tyr Leu Ala Leu Leu Glu Ala Pro Gln 305 310 315 320 Ile Met Asp Phe Ala Pro Gly Gly Tyr Pro Leu Ile Phe Ser Tyr Ala 325 330 335 Met Gly Val Gly Thr Val Leu Asp Val Gln Met Arg Asn Tyr Thr Tyr 340 345 350 Ala Arg Pro Phe Leu Asn Gly Tyr Tyr Phe Gln Ile Gly Val Glu Thr 355 360 365 Ala Arg Arg Gln Gln Gly Thr Val Asp Asn Arg Ala Ala Asp Asp Leu 370 375 380 Gly Leu Thr Pro Glu Gln Arg Thr Glu Val Thr Gln Leu Val Asp Arg 385 390 395 400 Leu Ala Arg Gly Arg Gly Ala Gly Met Pro Gly Gly Pro Val Asn Pro 405 410 415 Phe Val Pro Pro Val Gln Gln Gln Gln Pro Ala Ala Val Tyr Glu Asp 420 425 430 Ile Pro Ala Leu Glu Glu Ser Asp Asp Asp Gly Asp Glu Asp Gly Gly 435 440 445 Ala Gly Phe Gln Asn Gly Ala Gln Ala Pro Ala Ala Arg Gln Gly Gly 450 455 460 Gln Asn Asp Phe Arg Ala Gln Pro Leu Gln Asp Pro Ile Gln Ala Gln 465 470 475 480 Leu Phe Met Pro Leu Tyr Pro Gln Val Ser Asn Ile Pro Asn His Gln 485 490 495 Asn His Gln Ile Asn Arg Ile Gly Gly Met Glu His Gln Asp Leu Leu 500 505 510 Arg Tyr Asn Glu Asn Gly Asp Ser Gln Gln Asp Ala Arg Gly Glu His 515 520 525 Gly Asn Thr Phe Pro Asn Asn Pro Asn Gln Asn Ala Gln Ser Gln Val 530 535 540 Gly Asp Trp Asp Glu 545 <210> 2 <211> 1650 <212> DNA <213> Mumps virus <400> 2 atgtcgtctg tgctcaaagc atttgagcga ttcacgatag aacaggaact tcaagacagg 60 ggcgaggagg gttcaattcc gccggagact ttaaagtcag cagtcaaagt cttcgttatt 120 aacacaccca atcccaccac acgctaccaa atgctaaact tttgcctaag gataatctgc 180 agtcaaaatg ctagggcatc tcacagggta ggtgcattga taacattatt ctcacttccc 240 tcagcaggca tgcaaaatca tattagatta gcagacagat cacccgaagc tcagatagaa 300 cgctgtgaga ttgatggttt tgagcctggc acatacaggc tgattccgaa tgcacgcgcc 360 aatcttactg ccaatgaaat tgctgcctat gctttgcttg cagatgacct ccctccaacc 420 ataaataatg gaactcctta tgtacacgca gatgttgaag gacagccatg tgatgagatt 480 gagcaattcc tagatcgatg ctacagtgta ctaatccagg cttgggtgat ggtctgtaaa 540 tgtatgacag cgtacgacca acctgctgga tctgctgatc ggcgatttgc taaataccag 600 cagcaaggtc gcctggaagc aagatacatg ctgcagccgg aagctcaaag gttgattcaa 660 actgccatta ggaaaagtct tgttgttaga cagtacctta ccttcgaact ccagttggca 720 agacggcagg ggttgctatc aaacagatac tatgcaatgg tgggtgacat tggaaagtac 780 attgagaatt caggccttac tgccttcttt ctcaccctca aatatgcact aggtaccaaa 840 tggagtcctc tgtcattggc cgcattcacc ggtgaactca ctaagctccg atccttgatg 900 atgttatatc gagatctcgg agaacaagcc agataccttg ctttgttgga ggctccccaa 960 ataatggact ttgcacccgg aggctaccca ttgatattca gttatgctat gggagtcggt 1020 acagtcctag atgtccaaat gcgaaattac acttatgcac gacctttcct aaatggttat 1080 tatttccaga ttggggttga aactgcacga cggcaacaag gcactgttga caacagagca 1140 gcagatgatc taggcctgac tcctgagcaa agaactgagg ttactcagct tgttgacagg 1200 cttgcaaggg gcaggggtgc ggggatgcca ggtgggcctg tgaatccgtt tgttcctcca 1260 gttcaacaac aacaacctgc tgccgtatat gaggacattc ctgcattgga ggaatcagat 1320 gacgacggtg atgaagatgg gggtgcagga ttccaaaatg gagcacaagc accagctgca 1380 agacagggag gccaaaatga tttcagagca cagccgctac aggatccaat tcaagcacaa 1440 cttttcatgc cattatatcc tcaagtcagc aacatcccaa atcatcagaa tcatcagatc 1500 aatcgcatcg gggggatgga gcaccaagat ttattacgat ataacgagaa tggtgattct 1560 caacaagatg caaggggcga acacggaaat accttcccaa acaatcccaa tcaaaacgca 1620 cagtcacaag tgggcgactg ggatgagtaa 1650 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SENSE PRIMER FOR RT-PCR <400> 3 cgagctcatg tcgtctgtgc tcaaagcatt tgagcgattc acg 43 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANTISENSE PRIMER FOR RT-PCR <400> 4 gtaaagcttt catgtcagtg atttactcat cccagtcgcc cactt 45

Claims (8)

1. 삭제
2. 삭제
3. 유행성이하선염 바이러스 감염을 진단하기 위한, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 핵단백질을 코딩하는 서열번호: 2의 염기서열을 갖는 유전자를 포함하는 재조합발현벡터로서, 도 1의 pQE981062NP 임을 특징으로 하는 재조합발현벡터.
4. 제 3항의 재조합발현벡터로 형질전환된 원핵세포임을 특징으로 하는 숙주세포.
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 4항의 숙주세포로부터 분리, 정제한 재조합핵단백질을 포함하여 유행성이하선염 바이러스 감염을 진단하기 위한 혈청진단키트.
8. i) 제 3항의 재조합발현벡터를 제조하는 단계;

   ii) 상기 i)의 재조합발현벡터로 원핵세포인 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및

   iii) 상기 ii)의 형질전환된 숙주세포로부터 재조합핵단백질을 분리 및 정제하는 단계

   를 포함하여 유행성이하선염 바이러스의 재조합핵단백질을 제조하는 방법.

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