CN101303349A - 一种猪囊尾蚴病间接elisa检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测猪囊尾蚴抗体的间接ELISA试剂盒及其制备方法与应用。该试剂盒包括以基因工程表达的猪囊尾蚴TS－CC18蛋白作为包被抗原的ELISA板条，PBST洗液，血清稀释液，辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG、显色底物、终止液及猪囊尾蚴标准阴阳性血清等。所用的重组抗原的制备是将编码猪囊尾蚴TS－CC18基因的片断与表达载体PET28a(+)连接，并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达；表达蛋白经镍柱亲和纯化后包被酶标板。本发明的优势体现在具有良好的特异性和敏感性、检测成本低廉、操作简单、可大量生产以及生产周期短等优点，有着良好的推广应用价值。

Description

一种猪囊尾蚴病间接ELISA检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种猪囊尾蚴病抗体检测试剂盒的制备方法与应用。尤其是一种重组诊断抗原及检测猪囊尾蚴抗体的酶联免疫试剂盒的制备方法及应用。

背景技术

猪囊尾蚴病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫-猪囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)感染猪或人而引起的一种人兽共患的食源性寄生虫病。该病危害严重、分布广泛，在大多数发展中国家是一个重要的公共卫生问题。近年来由于移民的大量流动，一些发达国家也有人患猪囊尾蚴病的报道，甚至在美国该病也有重新抬头的趋势。人感染猪囊尾蚴后，以脑囊虫病的发病率最高，危害性最大，通常引发癫痫、失明等症状，如不及时治疗或治疗不当往往会使人致残甚至危及生命。另外囊尾蚴病还严重制约着养猪业及肉食品加工业的发展。

对于囊尾蚴病的防治，目前尚无成熟的手段。化学药物如丙硫苯咪唑和吡喹酮对囊尾蚴有驱除和治疗的作用，但长期使用虫体易产生耐药性，且药物残留对人体健康构成潜在威胁，因而药物治疗具有局限性。囊尾蚴抗原、六钩蚴分泌抗原都能诱导机体产生抗体，具有一定的保护作用且均可作为诊断抗原，但这些抗原都来自于虫体本身，因而抗原来源十分有限，不能满足实际生产的需要。随着分子生物学技术在寄生虫领域的应用，人们开始克隆抗原基因并在体外表达，进而研制疫苗或诊断试剂盒，解决抗原来源有限的难题，为囊尾蚴病的预防和诊断开辟了一条新的途径。

早期的抗体诊断方法，如间接血凝试验、补体结合试验等缺乏特异性和敏感性。但是在1989年，Tsang等首先用小扁豆植物血凝素亲合层析柱纯化了全囊抗原，得到了分子量为13～50kD的一组糖蛋白(LLGP)，并以此建立了酶联免疫印渍法(enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay，ELIB)。该方法具有很高的特异性及敏感性，现已成为国际和泛美卫生组织公认的囊虫病血清学诊断的“金标准”。(Kathy Hancock，Azra Khan，Fatima B.Williams，et al.Characterization of the 8-Kilodalton Antigens of Taenia solium Metacestodes andEvaluation of Their Use in an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay forSerodiagnosis[J].Journal of Clinical Microbiology.2003，41(6)：2577～2586.)LLGP成分包括50kD、39～42kD、24kD、21kD、18kD、14kD和13kD共7种糖蛋白条带组分。这些成分包括了六钩蚴及囊尾蚴期的阶段特异性抗原。

然而该方法的建立依赖于囊尾蚴天然抗原，抗原制备繁琐、成本高，试验操作要求素质较高的专业技术人员；部分纯化的LLGP抗原不适于ELISA方法，其Western blot方法也不适于进行野外试验或者囊尾蚴病流行的国家。基于上述原因，国外学者对7种LLGP诊断抗原组分进行了系统鉴定，目前已报道的诊断抗原主要有：8kD蛋白家族，参见Kathy Hancock，Azra Khan，Fatima B.Williams，et al.Characterization of the 8-Kilodalton Antigens of Taenia soliumMetacestodes and Evaluation of Their Use in an Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay for Serodiagnosis[J].Journal of Clinical Microbiology，2003，41(6)：2577～2586；10kD蛋白，参见Chung JY，Bahk YY，Huh S，et al.A recombinant10kDa protein of Taenia solium metacestodes specific to activeneurocysticercosis[J].The Journal of Infectious disease，2000，181(5)：1870～1872；14kD/18kD蛋白，参见Marcia Ramos Monteiro da Silva，

 Augusto MendesMaia.et al.Recombinant expression of Taenia solium TS14 antigen and its utilizationfor immunodiagnosis of neurocysticercosis[J].Acta Tropica，2006，100(3)：192～198；T24/42kD蛋白，参见Kathy Hancock，Sowmya Pattabhi，Fatima W，et al.Characterization and cloning of T24，a Taenia solium antigen diagnostic forcysticercosis[J].Molecular and Biochemical Parasitology，2006，147(1)：109～117；GP50蛋白，参见Kathy Hancock Sowmya Pattabhi，Ryan M.Greene，et al.Characterization and cloning of GP50，a Taenia solium antigen diagnostic forcysticercosis[J].Molecular and Biochemical Parasitology，2004，133：115～124等。而且在这些研究中，14kD/18kD具有较好的特异性及敏感性，被认为最适合作为囊尾蚴病的诊断抗原。

国内目前均参照国家质量监督检验检疫总局发布的猪囊尾蚴病诊断的国家标准(GB/T 18644-2002)生产猪囊尾蚴病ELISA诊断试剂。另外，中国发明专利申请2003113564.1公开了一种食源性寄生虫病快速酶免疫检测方法及检测盒，该申请中包含有猪囊虫病的诊断方法。但是所用的诊断抗原均为囊液抗原或虫体抗原，存在的突出问题是抗原来源困难，纯化繁琐，难以标准化，且易于出现假阳性或假阴性的问题。

发明内容

本发明目的是提供一种可以克服现有技术不足，以重组蛋白为诊断抗原建立间接酶联免疫吸附(ELISA)检测猪囊尾蚴抗体的检测试剂盒和检测方法，本发明同时提供检测试剂盒中包被抗原的重组蛋白TS-CC18的制备方法和基因序列。

本发明提供的猪囊尾蚴病检测试剂盒包括：

a以猪带绦虫囊尾蚴18kD基因的重组蛋白TS-CC18为包被抗原的固相载体的抗原包被板；

b洗涤液，例如采用含有Tween-20的磷酸盐缓冲液为洗涤液，或者采用Tris-盐酸洗涤液；

c样品稀释液，例如采用适当浓度的异种动物血清，或者是如PEG6000，明胶之类的某些生物大分子为样品的稀释液；

d标准阴阳性猪血清；

e兔抗猪IgG-HRP；

f底物溶液A：

g底物溶液B；

h显色剂；

i过氧化氢水溶液；

j终止液。

以上所述的底物溶液A和B可根据标记在二抗上的辣根过氧化物酶进行选择，而且OD值的读数应根据底物选择不同的波长。如OPD在492nm处有最大波长；TMB在450nm处有最大波长。通常OPD底物溶液为0.1mol/L、pH5.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液；TMB底物溶液则用0.2mol/L、pH4.0醋酸钠/枸橼酸缓冲液。

本发明的一个实施例中的试剂盒是由以下内容构成：

(1)抗原包被板：2板，以猪带绦虫囊尾蚴18kD基因的重组TS-CC18蛋白作为包被抗原，经1％(w/v)BSA(牛血清白蛋白)及20％蔗糖封闭处理，4℃密封干燥保存；

(2)20x浓缩洗涤液：PBS(磷酸盐缓冲液)，pH 7.4，含0.05％(w/v)Tween-20；60mL；

(3)样品稀释液：含1％(w/v)BSA(牛血清白蛋白)的PBST，100mL；

(4)标准阴阳性猪血清：各100μL；

(5)兔抗猪IgG-HRP：1支，工作浓度1∶6000；

(6)底物溶液A：为0.2M(即mol/L)Na₂HPO₄·12H₂O溶液，50mL；

(7)底物溶液B：0.1M柠檬酸缓冲液；50mL；

(8)显色剂：OPD粉剂100mg；

(9)30％H₂O₂：100μL；

(10)终止液：2M H₂SO₄溶液，25mL；

另外，为方便使用可在每个试剂盒内放置猪囊尾蚴TS-CC18-I-ELISA试剂盒使用说明书1份。

上述的试剂盒使用方法是：

(1)待检血清样品及标准阴阳性血清对照用样品稀释液1∶50稀释，每孔加入100μL，每一个样均加2个复孔，用封口膜封口，37℃结合60min。

(2)取掉封口膜，每孔加满(280～300μL)洗液洗涤3次，最后一次拍干。

(3)用样品稀释液稀释酶标二抗至工作浓度，每孔加入100μL，用封口膜封口，37℃结合60min。

(4)取掉封口膜，每孔加满(280～300μL)洗液洗涤4次，最后一次拍干。

(5)将OPD粉剂、H₂O₂、底物溶液A和B按比例混匀后，每孔加入100μL，封口膜封口，37℃避光作用10～15min。

(6)每孔加入50μL终止液。

(7)轻轻摇振混匀，酶标仪测定每孔OD₄₉₂值。

(8)结果计算：阳性和阴性对照各有两个结果，均需要计算平均值。以标准阳性血清的OD₄₉₂＞1.0，标准阴性血清的OD₄₉₂≤0.3时，判为试验成立；以OD₄₉₂≥0.58作为抗体阳性判断的下限，或者将P/N≥2.0定为阳性判定标准。

本发明的重组蛋白TS-CC18的制备方法如下：

1)从猪带绦虫囊尾蚴中提取总RNA；

2)以下游引物5’-AACGCATGAAAGTTGACAA-3’，总RNA为模板进行反转录；

3)用上述2)所得到的反转录cDNA为模板，用上游引物

(5’-ATGCGTGCCTACATTGTGC-3’)和下游引物

(5’-AACGCATGAAAGTTGACAA-3’)进行PCR扩增，得到猪带绦虫囊尾蚴TS-CC18基因；

4)将猪带绦虫囊尾蚴TS-CC18基因与pGEM-T easy克隆载体连接；

5)表达引物5’端分别加入Xho I和Nde I酶切位点及6个保护性碱基。上下游引物之间所扩增片段约为261bp，所用引物为：

上游引物F：5’-GCCATATG CGTGCCTACATTGTG-3’

                  Nde I

下游引物R：5’-CGCTCGAGGAAAGTTATGTTCTTGAGTCC-3’

                  Xho I

PCR产物回收后进行酶切，酶切产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，构建原核表达载体PET28a(+)-TS-CC 18；

6)将猪带绦虫囊尾蚴TS-CC18重组蛋白进行诱导表达；

7)对经诱导表达的猪带绦虫囊尾蚴TS-CC18重组蛋白进行纯化处理，得到可用于制备试剂盒的抗原蛋白，TS-CC18。

本发明的猪带绦虫囊尾蚴TS-CC18核苷酸序列见后附序列表中给出的<213>TS-CC18。

本发明人根据已公开发表的序列，分别克隆表达了7种猪带绦虫相关抗原，包括来源于猪带绦虫六钩蚴16kD、18kD、24kD基因的重组蛋白及来源于猪带绦虫囊尾蚴10kD、18kD基因的重组蛋白。以全囊抗原和囊液抗原作为对照，经过严格的血清学检测筛选，最终确定猪带绦虫囊尾蚴18kD蛋白的特异性及敏感性最佳，以其作为诊断抗原进行诊断试剂的开发具有较好的前景及推广价值。本发明的试剂盒具有较高的敏感性和特异性，操作简单，能较好满足不同层次人员的需要。在动物宰前检疫、集约化养殖及流行病学调查等领域，易于大范围推广应用。

本发明具有下列优点：

(1)特异性好，敏感性高。猪囊尾蚴TS-CC18间接ELISA抗体检测试剂盒以基因工程表达的重组TS-CC18蛋白为基础制备而成；重组TS-CC18蛋白为猪囊尾蚴阶段特异性抗原，成分单一，不含无关杂蛋白，具有较高的特异性和敏感性。

(2)抗原来源容易。猪囊尾蚴重组TS-CC18蛋白可在实验室内大量制备，每升发酵液上清经纯化后，可获得大小14kD左右的单一条带，薄层扫描分析纯度超过90％，蛋白含量约为0.5mg/mL；方便地解决了现有技术中抗原来源困难，纯化繁琐的难题。

(3)操作简便快速。使用猪囊尾蚴TS-CC18间接ELISA抗体检测试剂盒检测猪囊尾蚴循环抗体时，无需另配其它试剂，样品无需特殊处理，按试剂盒说明在2～3小时内即可判定检测结果。

(4)成本低廉，质量易于控制。采用人工克隆制备猪囊尾蚴抗原可批量生产，一步到位，成本低廉，制备及检测条件易于控制及标准化。

附图说明

图1RT-PCR产物电泳结果，其中：

1、3、4：PCR产物；2：阴性对照；

M：DL2000(从上到下：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)

图2重组表达载体的PCR电泳结果，其中：

1：空载体阴性对照；2、3、4：重组质粒的PCR产物；M：DL2000Marker

图3重组表达载体的酶切鉴定结果，其中：

1、2：重组表达载体经Xho I和Nde I酶切片断；M：DL2000Marker

图4纯化TS-CC18蛋白的Urea-SDS-PAGE分析，其中：

M1：中低分子量蛋白标准；M2：超低分子量蛋白标准；1：溶菌酶；

2：超声破菌沉淀：3：超声破菌上清；4：纯化的TS-CC18重组蛋白

图5TS-CC18重组蛋白的Western-blot分析，其中：

M：溶菌酶；1：猪囊尾蚴阳性血清；2：猪阴性血清对照

具体实施方式

本发明以下结合实施例作进一步详述：

实施例一猪带绦虫囊尾蚴18kD基因的克隆

1猪带绦虫囊尾蚴总RNA的提取

用Trizol(invitrogen)提取，操作如下：

(1)从液氮中取出冻存的虫体约30mg，置于微型匀浆器中，同时加入1mL的Trizol，在冰浴中迅速研磨至无可见组织块。

(2)转移液体至DEPC处理的微量离心管中，室温静置5min。

(3)加0.2mL酚-氯仿抽提液，剧烈震荡约15s，室温孵育2～3min。

(4)12 000g，4℃离心15min后，将上层液体转至另一干净离心管中，加入200μL氯仿再抽提一次。

(5)将抽提后的上层液体转至干净离心管中，加入500μL异丙醇，室温静置10min，吸去上清液体，加入1mL 75％乙醇洗涤、混匀样品。

(6)7500g，4℃离心5min，彻底吸弃上清。

(7)真空干燥RNA沉淀5min，用100μL无核酸酶水溶解RNA，置56℃孵育10min后，立即进行反转录。

2反转录

RT-PCR扩增体系为：猪囊尾蚴RNA悬液10μL，下游引物(5’-AACGCATGAAAGTTGACAA-3’)0.5μL，混匀后70℃预变性5min，迅速置于冰浴5min。然后加入5×AMV缓冲液4μL，RNasin(50U/μL)0.5μL，2.5mMdNTP Mixture 2μL，反转录酶(AMV，10U/μL)1μL，灭菌DEPC水加至20μL，离心混匀后，42℃水浴反应1h，之后用于PCR扩增。

3猪囊尾蚴18kD基因的PCR扩增与纯化回收

以反转录cDNA为模板，用上游引物(5’-ATGCGTGCCTACATTGTGC-3’)和下游引物(5’-AACGCATGAAAGTTGACAA-3’)进行PCR扩增。反应体系为：反转录产物10μL，10×PCR buffer(Mg²⁺free)5μL，2.5mM dNTP Mixture 4μL，上、下游引物(50μM)各0.5μL，25mM MgCl₂ 3μL，灭菌双蒸水加至50μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min后加入0.5μL(5U/μL)Taq DNA聚合酶，进行30个循环(94℃1min，54℃30s，72℃45s)，最后72℃延伸10min。扩增完成后，取PCR产物5μL用1.5％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳分析，结果显示扩增到一条大小约261bp的基因片段(图1)；PCR产物经BioDev PCR产物快速胶回收试剂盒纯化回收。

4猪带绦虫囊尾蚴18kD基因与pGEM-T easy克隆载体的连接

连接体系为：pGEM-T easy克隆载体(Promega)1μL(50ng/μL)，目的DNA4μL，2×rapid ligase buffer 5μL，T₄DNA连接酶1μL(3U/μL)，混匀后置4℃过夜连接；转化大肠杆菌JM109，蓝白斑筛选阳性克隆子，碱裂解法小量提取质粒，经1.5％琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增及限制性内切酶酶切鉴定后，证实其大小与预期相符，经上海晶泰生物技术公司测序证实该片段无碱基错配。用DNAstar软件对序列进行分析，并与已发表的序列(GeneBank，AF356330)进行相似性比较，证实核苷酸序列相似性为85.1％，氨基酸序列相似性为73.6％。将鉴定正确的重组质粒命名为pGEM-TS-CC18。

5原核表达载体PET28a(+)-TS-CC18的构建

参照猪囊尾蚴18kD蛋白基因序列(GeneBank，AF356330)，用DNAstar软件在其阅读框外侧设计表达引物，表达引物5’端分别加入Xho I和Nde I酶切位点及6个保护性碱基。上下游引物之间所扩增片段约为261bp。引物由上海生物工程公司合成。

上游引物F：5’-GCCATATG CGTGCCTACATTGTG-3’

                   Nde I

下游引物R：5’-CGCTCGAGGAAAGTTATGTTCTTGAGTCC-3’

                   Xho I

以测序正确的pGEM-TS-CC18质粒为模板，用带酶切位点的F、R为引物扩增目的片段。PCR扩增体系为：模板2μL，10×PCR buffer 5μL，引物F、R(25μM)各2μL，Taq酶1μL，2.5mM dNTP Mixture 1μL，25mM MgCl₂ 4μL，灭菌双蒸水加至50μL。扩增条件：94℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃45s，35个循环；最后72℃延伸10min。扩增完成后，用1.5％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mLEB)电泳检测，获得261bp的特异性DNA片段；PCR产物经DNA凝胶快速回收试剂盒纯化回收。

将PCR纯化产物和PET28a(+)载体质粒分别用Xho I/Nde I双酶切。酶切体系(40μL)分别为：(1)目的基因20μL，10×H buffer 4μL，Xho I 2μL，Nde I 2μL，BSA 2μL，Triton 2μL，灭菌双蒸水8μL；(2)载体质粒12μL，10×H buffer 4μL，Xho I 2μL，Nde I 2μL，BSA 2μL，Triton 2μL，灭菌双蒸水16μL。将酶切混合物离心混匀后，置37℃水浴消化4h。

酶切产物用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收纯化后，进行产物连接。连接体系为：酶切目的片段7μL、酶切载体1μL，10×Ligation buffer 1μL、T₄ DNA(3U/μL)连接酶1μL，混匀置16℃连接16h，产物转化200μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(CaCl₂法制备)，置37℃培养12～18h后，挑取菌落增菌后用碱裂解法小量提取质粒，并经PCR扩增及限制性内切酶Xho I/Nde I双酶切鉴定后，出现约261bp的特异性条带，与预期的目的片段的大小相符(图2，图3)。将酶切鉴定为阳性的重组菌株送大连宝生物工程有限公司测序，结果与预期完全吻合，将鉴定为阳性的重组表达载体质粒命名为PET28a(+)-TS-CC18。

实施例二猪带绦虫囊尾蚴TS-CC18重组蛋白的诱导表达及检测

将鉴定为阳性的重组菌按1∶100的比例接种于3mL的LB培养液(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃230r/min振摇过夜。取过夜培养物500μL接种于50mL LB培养液(kan⁺)中，37℃230r/min振摇至OD₆₀₀为0.6～1.0，加入IPTG至终浓度0.5mM，28℃诱导表达6h后，收集菌液，进行Urea-SDS-PAGE分析，同时用未诱导的菌液和诱导的空载体菌液作为阴性对照。所用Urea-SDS-PAGE胶的配制采用双层胶，其中分离胶含16％T(丙烯酰胺总浓度)、6％C(丙烯酰胺交联度)和6M的尿素，积层胶含8％T，3％C，具体操作方法参见文献(石继红，赵永同，张英起等.应用SDS-PAGE显示小分子多肽技术的探讨[J].生物工程进展，2001，21(1)：38-41)

用200μL 8M的尿素悬浮收集的菌液，加入上样缓冲液，混匀，水浴煮沸5min后上样。用40V电压电泳至溴酚兰到分离胶，把电压提高到60V，继续电泳至溴酚兰到达凝胶底部。取下凝胶，用考马斯亮兰染色液染色2h后脱色，待蓝色背景脱净后，观察和分析电泳结果。Urea-SDS-PAGE显示，诱导后的重组菌表达出14kD左右的融合蛋白，与推测的分子质量大小(12.88kD)基本相一致，而且表达产物以部分可溶的形式存在，薄层扫描分析上清表达量可占菌体蛋白总量的20％以上(图4)。

实施例三TS-CC18重组蛋白的纯化

按实施例二方法共诱导菌液2L，收集菌体经超声破碎后12000g离心10min，裂解上清液用于Ni-FF镍柱纯化TS-CC18重组蛋白。

蛋白纯化按北京韦氏博慧色谱科技有限公司的Ni-FF镍柱说明书操作。取4mL Ni-FF镍柱填料装柱，用50mM的PBS(含0.15M NaCl，pH7.4)缓冲液充分平衡，裂解上清液以2mL/min流速上样，反复结合3次。然后用50mM的PBS洗去杂蛋白，再以10、20、50、100、200、300、400、500mM咪唑进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，经Urea-SDS-PAGE进行鉴定，TS-CC18重组蛋白在300～500mM咪唑浓度出现洗脱峰，且纯度较高(图4)。

利用紫外分光光度计测定蛋白含量，校正公式如下：

蛋白含量(mg/mL)＝(1.45×A₂₈₀-0.74×A₂₆₀)×稀释倍数

测定蛋白回收量为每1000mL培养物上清可得到纯化蛋白约为7.54mg。

实施例四TS-CC18重组蛋白的Western-blot分析

将Urea-SDS-PAGE电泳的TS-CC18纯化蛋白带转移至硝酸纤维素膜，用含3％BSA的PBST封闭处理后，分别与稀释度为1∶100的猪囊尾蚴标准阳性血清和猪标准阴性血清在37℃结合1h，之后用PBST冲洗3次；加入1∶5000稀释的兔抗猪IgG-HRP，室温下轻摇孵育1.5h，取出再用PBST冲洗3～4次，每次10min。将NC膜放入20mL DAB底物溶液中，室温避光作用3min，观察显色情况。结果显示，表达纯化的TS-CC18蛋白带能被猪囊尾蚴阳性血清抗体识别，出现显色带，但不与猪阴性血清反应，说明分泌表达的外源蛋白具有免疫反应活性和良好的特异性(图5)。

实施例五猪囊尾蚴病TS-CC18间接ELISA诊断试剂盒的制备

1试验材料的准备

包被抗原：实施例三中纯化的TS-CC18重组蛋白。

所用器材及试剂：

96孔酶标板购自江苏扬子医疗器械有限公司；兔抗猪IgG-HRP为北京博奥森生物技术有限公司产品；显色底物OPD为Amresco公司产品；BSA、Gelatin为Roche公司产品，Casein，PEG6000为Solarbio公司产品；其它常规试剂为国产分析纯。

血清样品：

标准猪血清：猪囊尾蚴阳性血清、猪标准阴性血清及猪细颈囊尾蚴阳性血清均由本发明人制备并保存。

参考猪血清：55份，其中10份参考阳性血清取自实验室人工攻虫后剖检囊尾蚴阳性的猪；45份取自设施较好猪场的健康猪，用作建立本方法的判定标准。

2ELISA反应条件的优化

采用方阵滴定法确定抗原、血清及酶结合物的最佳工作浓度，以及包被液、血清稀释液、温育时间等各最适反应条件。

(1)TS-CC18重组蛋白包被量及血清的稀释度测定

按方阵滴定法确定，采用常规间接ELISA，将纯化的TS-CC18重组蛋白自1∶2～1∶256进行倍比稀释包被酶标板，猪标准阴阳性血清作1∶25、1∶50、1∶100及1∶200系列稀释；兔抗猪IgG-HRP使用商品的推荐工作浓度1∶6000，抗原与抗体反应时间为60min。结果抗原的最佳包被量为1∶128(5～10μg/mL)，血清最适工作稀释度为1∶50。

(2)最佳包被液的选择

分别以0.05M、pH 9.6的碳酸盐缓冲液、0.08M、pH 8.9的硼酸盐缓冲液、0.01M、pH 7.4的PBS和0.05M、pH 8.5的Tris-HCL作为包被液包被TS-CC18重组抗原，将猪囊尾蚴标准阳性血清以1∶50稀释后作间接ELISA试验，以OD₄₉₂值较高及P/N值也较高的为最佳包被液，结果以0.05M、pH 9.6碳酸盐缓冲液效果最好。

(3)抗原最佳吸附方式的选择

以5～10μg/mL的浓度将TS-CC18重组蛋白包被酶标板，分别置4℃过夜和37℃水浴孵育1h、2h、4h后转4℃过夜等方式吸附。将猪囊尾蚴标准阳性血清以1∶50稀释后作间接ELISA试验，以OD₄₉₂值较高及P/N值也较高的为抗原最佳吸附方式。结果以37℃水浴孵育2h后转4℃过夜的方式最佳。

(4)最佳反应时间的测定

取包被封闭处理的96孔酶标板1块，加入猪血清后，分别在37℃温育0.5、1、2h取出，按常规间接ELISA实验，测定OD₄₉₂值，计算P/N值，确定抗体最佳反应时间。结果猪血清在37℃水浴孵育温育1h即可反应完全；但随反应时间的延长，非特异性反应也略有增强。

(5)最佳封闭液的选择

以5～10μg/mL的浓度将TS-CC18重组蛋白包被酶标板，分别用含1％BSA及20％蔗糖的PBST、5％小牛血清和0.5％Casein的PBST、0.5％明胶的PBST、1％PEG6000的PBST作封闭液，测定1∶50稀释度猪囊尾蚴血清的OD₄₉₂值，结果以含1％BSA及20％蔗糖的PBST为封闭液效果较好。

(6)最佳洗涤液的选择

取包被并封闭好的酶标板一块，每步反应后分别用0.15M NaCL/PBST(0.05％Tween-20)、0.15M NaCL/PBST(0.1％Tween-20)、0.15M NaCL/PBST(0.5％Tween-20)、0.15M NaCL/PBS洗涤，测定1∶50稀释度猪囊尾蚴血清的OD₄₉₂值和P/N值，结果以0.15M NaCl/PBST(0.05％Tween-20)效果最好。

(7)血清样品稀释液的选择

包被好酶标板并封闭，分别用洗涤液PBST(0.05％Tween-20)、含1％BSA的PBST、含1％大肠杆菌裂解液和5％小牛血清的PBST及0.25％Casein的PBST，将猪囊尾蚴阴阳性血清稀释至1∶50后加样，测定其OD₄₉₂值。结果选择含1％BSA的PBST作为本试剂盒的最佳血清样品稀释液。

(8)酶标二抗最佳工作浓度的选择

用样品稀释液将酶标二抗稀释成1∶4000、1∶5000、1∶6000、1∶7000、1∶8000、1∶10000后分别作为使用液，结果以1∶6000及1∶8000较理想，实际使用选用工作浓度为1∶6000。再将稀释1∶6000的酶标二抗分别以25、50、100μL的量加入，结果以每孔加入100μL最为理想。

3猪囊尾蚴TS-CC18间接ELISA判定标准的确定

以确定的TS-CC18间接ELISA试剂盒的最佳条件，检测经全囊抗原间接ELISA检测过的参考猪血清(10份阳性猪血清和45份阴性猪血清)，以两试验的最大阴性符合率为理论依据来确定阳性样品判定标准。

cut-off值采用Mean+5SD计算确定。45份参考猪血清检测的阴性符合率达到100％；计算所得的OD492值的Mean+SD为0.1737±0.0804，因此该试剂盒的cut-off值为0.5757。以标准阳性血清的OD₄₉₂＞1.0，标准阴性血清的OD₄₉₂≤0.3时，判为试验成立；以OD₄₉₂≥0.58作为抗体阳性判断的下限，或者将P/N≥2.0定为阳性判定标准。

4特异性试验

以标准阳性猪血清、猪细颈囊尾蚴阳性血清、猪弓形虫阳性血清、猪瘟血清和阴性猪血清反应作间接ELISA反应，结果P/N值分别为5.52、2.76、1.3、1.28和1.06，表明该试剂盒特异性良好，只与猪细颈囊尾蚴存在10～15％的交叉反应。

5稳定性和重复性试验

分别将3批次表达纯化的TS-CC18抗原按实施例五(2)中确定的条件包被96孔酶标板，并选择3位操作者对12份猪血清分别进行检测，结果表明不同操作者及不同批次抗原的检测结果基本一致，变异系数小，说明本试剂盒具有良好的稳定性和重复性。

6保存期破坏试验

将重组TS-CC18抗原包被酶标板，封闭甩干后，真空干燥密封包装于铝箔袋中，进行37℃两周保存期破坏试验。结果血清样品的P/N值均大于2.0以上，而且各样品检测的OD₄₉₂值结果稳定，差异不明显，说明本试剂盒抗原性质稳定，半年内保存不会失效。

实施例六猪囊尾蚴TS-CC18间接ELISA诊断试剂盒的应用

按实施例五(3)中的判定标准判定结果，即检测孔OD₄₉₂值与标准阴性对照OD₄₉₂值比值(P/N)大于等于2.0判为阳性。如果猪囊尾蚴阳性对照血清显色反应淡，或阴性对照出现显色，表明试剂盒失效或检测操作有误，需重新检测。TS-CC18-I-ELISA与剖检计数法的对比试验结果见表1。16头份人工感染囊尾蚴的猪血清样品中，用剖检计数法、TS-CC18-I-ELISA及全囊抗原诊断试剂盒检出阳性数分别为15、13和14头份；即TS-CC18-I-ELISA与剖检计数法的阳性符合率为86.7％(13/15)，TS-CC18-I-ELISA与全囊抗原诊断试剂盒的阳性符合率为92.9％(13/14)。全囊抗原诊断试剂盒与剖检计数法的阳性符合率为93.3％(14/15)。

表1  TS-CC18-I-ELISA和剖检计数的对比试验

TS-CC18-I-ELISA与全囊抗原诊断试剂盒的对比试验结果见表2。从全囊抗原诊断试剂盒检测为阳性的25份猪血清样品中，用TS-CC18-I-ELISA检出21份阳性，即阳性符合率为84％；从全囊抗原诊断试剂盒检测为阴性的45份血清样品中，用TS-CC18-I-ELISA检出45份阴性，即阴性符合率为100％。总符合率为94.28％。数据经SPSS生物学软件统计分析差异不显著(P＞0.05)。

表2  TS-CC18-I-ELISA和全囊抗原ELISA试剂盒的对比试验

相对特异性100％(45/45)；相对敏感性84％(21/25)。

总之，由于猪囊尾蚴寄生部位特殊，生活史复杂，抗原成分众多，且变异迅速，与多种寄生虫抗原有交叉反应，因此以虫体抗原作为诊断抗原暴露了很大的局限性，而且虫体抗原来源有限。单克隆抗体纯化的抗原已成功地用于免疫诊断，并能区分囊尾蚴病和其它寄生虫病，但由于其抗原决定簇有限，试验中假阴性的可能性大。本发明利用猪囊尾蚴TS-CC18重组蛋白作为诊断抗原，试验证明检测猪囊尾蚴病效果良好，且与多种寄生虫抗原无交叉反应，具有较高的特异性和敏感性。选择大肠杆菌这一廉价表达系统，不仅具有生产成本低，操作简便，周期短等优点，还可用于发酵批量生产诊断抗原，为制备标准的、统一化的抗原及生产规模化的普查试剂盒奠定了基础，同时也为微量、准确及规范化囊尾蚴病的免疫诊断奠定了基础。

本发明建立的猪囊尾蚴TS-CC18间接ELISA抗体检测试剂盒具有快速、敏感、特异和便于推广的优点，不仅能为猪囊尾蚴病的诊断、检测和流行病学监测等提供有效的手段，也将对猪囊尾蚴病的控制起到积极的作用。

附：TS-CC18序列表

<213>TS-CC18

atgcgtgcct acattgtgct tctcgctctc actgttttcg tagtggcggt ttcggctggg  60

gagaacaaac agaatggtga tgcaaatagt actaagaaag agatagaaat tctccaaaac  120

tggctcttcc acgtagaacc gattggaaaa caaattgttc gactagcaaa ggactggaat  180

gcagcagtgc tggaagccaa aggtaaattt cggaagtcac tggctgagta ctgcagagga  240

ctcaagaaca taacttttta a                                            261

Claims (5)

1、一种猪囊尾蚴病间接ELISA检测试剂盒，其特征是检测试剂盒包括：

a以猪带绦虫囊尾蚴18kD基因的重组蛋白TS-CC18为包被抗原的固相载体的抗原包被板；

b洗涤液；

c样品稀释液；

d标准阴阳性猪血清；

e兔抗猪IgG-HRP；

f底物溶液A：

g底物溶液B

h显色剂；

i过氧化氢水溶液；

j  终止液。

2、根据权利要求1所述的猪囊尾蚴病间接ELISA检测试剂盒，其特征是检测试剂盒内的抗原包被板有两板，板上以猪带绦虫囊尾蚴18kD基因的重组TS-CC18蛋白作为包被抗原，用质量体积比为1％的牛血清白蛋白和质量体积比为20％的蔗糖封闭，再经干燥处理；洗涤液为60毫升的20倍pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，内含体积比0.05％的Tween-20；样品稀释液为100毫升的含质量体积比为1％牛血清白蛋白磷酸缓冲液；标准阴阳性猪血清各100微升；兔抗猪IgG-HRP：1支，其工作浓度为1∶6000；底物溶液A为50毫升的0.2M的Na₂HPO₄·12H₂O；底物溶液B为50毫升的0.1M柠檬酸缓冲液；显色剂为100毫克的OPD粉剂；过氧化氢为100微升，浓度为重量比30％；终止液为25毫升的2M硫酸水溶液。

3、权利要求1或2所述的猪囊尾蚴病间接ELISA检测试剂盒中用作包被抗原的重组TS-CC18蛋白，其核苷酸序列为<213>TS-CC18。

4、权利要求3所述的重组TS-CC18蛋白的制备方法，其特征是：

1)从猪带绦虫囊尾蚴中提取总RNA；

2)以下游引物5’-AACGCATGAAAGTTGACAA-3’，RNA为模板进行反转录；

3)用上述2)所得到的反转录cDNA为模板，用上游引物

(5’-ATGCGTGCCTACATTGTGC-3’)和下游引物

(5’-AACGCATGAAAGTTGACAA-3’)进行PCR扩增，得到猪带绦虫囊尾蚴TS-CC18基因；

4)将猪带绦虫囊尾蚴TS-CC18基因与pGEM-T easy克隆载体连接；

5)表达引物5’端分别加入Xho I和Nde I酶切位点及6个保护性碱基。上下游引物之间所扩增片段约为261bp，所用引物为：

上游引物F：5’-GCCATATG CGTGCCTACATTGTG-3’

                 Nde I

下游引物R：5’-CGCTCGAGGAAAGTTATGTTCTTGAGTCC-3’

                 Xho I

PCR产物回收后进行酶切，酶切产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，构建原核表达载体PET28a(+)-TS-CC 18；

6)将猪带绦虫囊尾蚴TS-CC18重组蛋白进行诱导表达；

7)对经诱导表达的猪带绦虫囊尾蚴TS-CC 18重组蛋白进行纯化处理。

5、权利要求1或2所述的猪囊尾蚴病间接ELISA检测试剂盒用于猪囊尾蚴病的诊断或检测。

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