CN102093999A - 一种检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接elisa试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒。该试剂盒含有IBV-N重组蛋白作为抗原包被的ELISA板。IBV-N重组蛋白通过以下方法获得：根据IBV-N基因序列，设计一对特异引物，然后通过RT-PCR方法对IBV的N基因进行扩增，将N基因定向插入到pET-32a(+)表达载体，筛选获得阳性重组表达质粒pET-32a(+)-IBV-N，并将该质粒转化置BL21感受态细胞，再经ITPG诱导表达，获得IBV-N重组蛋白。该试剂盒成本低廉、操作简便、快速，尤其适合批量样品的检测，大大提高了鸡传染性支气管炎血清学诊断的效率。

Description

一种检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及一种检测IBV抗体的间接ELISA试剂盒，专用于鸡传染性支气管炎病毒抗体的快速检测。

背景技术

鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的一种急性高度接触性传染病。IBV主要侵害雏鸡的呼吸道、消化道、生殖系统及肾，IBV对不同日龄的鸡产生不同程度的危害。IBV往往引起混合感染(如新城疫、慢性呼吸道病等)，并可继发细菌性疾病如大肠杆菌病、沙门氏菌病等，从而加重对鸡群的危害。因该病引起禽产品质量下降所造成的损失，通常比死亡造成的损失还大，国内养鸡业每年因该病导致直接经济损失达数亿元人民币。目前，该病呈世界分布，是危害世界养禽业的重大传染病之一。

目前鸡传染性支气管炎血清学诊断方法有：酶联免疫吸附试验(ELISA)、琼脂扩散试验、血凝抑制试验、荧光抗体技术、中和试验及胶体金技术等。其中琼脂扩散试验敏感性、稳定性差；胶体金技术的敏感度也不高；IBV未经处理前没有血凝性，而此血凝抑制抗原的制备工艺复杂；荧光抗体技术和中和试验操作复杂，费时费力，不易做快速诊断。酶联免疫吸附试验：通过包被在微量滴定板上的IBV抗原可被抗体捕捉，加入酶标抗抗体结合物和底物孵育后，样品中如有IBV抗原存在，则表现出阳性的光密度。该法快速、易操作，较容易进行大规模检测，非常适用检测较多数量的样品。

IBV核衣壳蛋白又称核蛋白(N蛋白)，具有很好的抗原性和免疫原性，在细胞免疫和体液免疫中起着重要作用。体外表达的N蛋白能引起免疫应答，能使免疫鸡增速产生抗IBV抗体，可诱导鸡对IBV气管感染的免疫保护作用。用N蛋白免疫鸡后，可激活T辅助细胞，同时可增强B淋巴细胞产生抗体的能力。加上N蛋白的具有高保守性，这使得N蛋白及其抗体在IBV诊断方面显示出优势。核蛋白占病毒总蛋白量大，而且核蛋白为非糖基化蛋白，由于它能检测群抗体应答，可以作为IBV群特异性诊断抗原。

发明内容

针对上述生产中实际存在的问题，发明人经过多次实验，研制了一种检测IBV抗体的间接ELISA试剂盒，该试剂盒效价稳定，便于存放，可以作为IBV群特异性诊断抗原。

本发明检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒的包被抗原(IBV-N重组蛋白)的获得，包括以下步骤：

1)根据GenBank中已登录的IBV-N基因序列(SEQ-1)，设计一对特异引物

上游引物为5’-CCGATATCATGGCAAGCGGTAAAGCA-3’(SEQ-3)(EcoR V位点)，下游引物为5’-CCTCGACACTCAAAGTTCATTCTCTCC-3’(SEQ-4)(Sal I位点)

扩增片段大小为1230bp。

2)通过RT-PCR方法对IBV的N基因进行扩增；以EcoR V和Sal I同时对IBV-N基因RT-PCR产物和pET-32a(+)载体进行酶切，回收目的片段，用T4DNA连接酶将二者进行连接，16℃过夜，次日将连接产物转化感受态细胞BL21，37℃温箱培养16-20h；挑取单菌落扩大培养，提取质粒，用EcoRV、Sal I进行双酶切鉴定；将阳性重组质粒测序，鉴定正确后获得阳性重组表达质粒pET-32a(+)-IBV-N。

3)将阳性重组表达质粒pET-32a(+)-IBV-N及空白载体pET-32a(+)分别转化BL21感受态细胞，于37℃培养，待OD_600nm值达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后4h的菌体，超声波破碎，离心后取上清进行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定；电泳结束后取下凝胶，先用双蒸水洗涤，然后浸入4℃预冷的250mmol/L的KCl溶液中显色5～10min，最后用双蒸水洗涤；将目的蛋白条带切下，PBS洗涤2次，用研钵将其磨碎，反复冻融3次，8000r/min离心10min，吸取上清，SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定；经SDS-PAGE验证纯化后的蛋白分装，放-20℃保存备用。

本发明的技术方案是：一种检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征是，包括上述纯化的IBV-N重组蛋白作为抗原包被的ELISA板。

本发明经过优化得到ELISA板的最佳制备条件为：用pH8.5的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液作包被液，将鸡传染性支气管炎N重组蛋白稀释为20μg/mL，按100μL/孔加入ELISA反应板中，37℃封闭2h，4℃包被过夜，拍干，用1％牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭2h，以含0.05％吐温-20pH7.4的PBS洗涤，拍干，再加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3h，待其干燥后装入含干燥剂的包装袋中4℃保存。

本发明一种检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征是，包括上述IBV-N重组蛋白作为抗原包被的ELISA板：5块；样品稀释液：200mL；10×浓缩洗涤液：400mL(用前1∶10稀释)；酶结合物工作液：50mL；显色液A：50mL；显色液B：50mL；终止液：60mL；阳性对照：2mL；阴性对照：2mL。

上述中检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒中，样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.05mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液；10×浓缩洗液为含0.5％吐温-20的0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液；酶结合物工作液为Sigma公司生产的HRP-兔抗鸡IgG，作1∶3000稀释的稀释液；显色液A为0.2mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液，显色液B为含过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液；终止液为2mol/L硫酸溶液；阳性对照为经鸡传染性支气管炎重组蛋白免疫获得的标准阳性血清(OD_450nm≥1.0)，加入1000U/mL的青链霉素，无菌过滤；阴性对照为经筛选获得的SPF鸡标准阴性血清(OD_450nm≤0.200)，加入1000U/mL的青链霉素，无菌过滤。

本发明经过优化得到最佳检测方法(即检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒的最佳使用方法)为：将待检血清用样品稀释液作1∶200稀释，按100μL/孔加入抗体检测板中，同时设阴性对照、阳性对照，37℃孵育30min；弃去反应孔中的液体，每孔加洗涤液300μL，洗涤5次，每次间隔1min，拍干；每孔加100μL的酶结合物工作液，37℃孵育30min；洗涤5次，每次间隔1min，拍干；依次加入50μL显色液A和50μL显色液B，37℃避光孵育15min；加50μL终止液，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度A值，读值计算并判定结果。判定标准为：以待检样本OD_450nm值与标准阴性OD_450nm值的比值(P/N)大于或等于2.1，且待检样本OD_450nm值大于0.297判为阳性。

本发明具有下列优点：

1.本发明选择原核表达载体pET-32a(+)构建重组表达质粒进行融合表达并纯化，解决了IBV全病毒纯化困难的问题。

2.本发明以基因工程表达的重组N蛋白为基础制备而成；重组N蛋白为非全病毒抗原，安全性好，不含无关杂蛋白，只与鸡传染性支气管炎病毒阳性血清特异结合，不与其它病毒阳性血清发生交叉反应。具有良好抗原性，因此具有很高的特异性和敏感性。

3.本发明检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，成本低廉、操作简便、快速，尤其适合批量样品的检测，大大提高了鸡传染性支气管炎血清学诊断的效率。

附图说明

图1是IBV-N基因的PCR扩增电泳图片，其中1、3为IBV的N基因PCR电泳图片，2为DNAMarker DL2000。

图2是IBV-N基因插入到pET-32a(+)载体得到的阳性重组质粒pET-32a(+)-IBV-N的酶切鉴定图片，其中1、3为质粒pET-32a(+)-IBV-N的酶切鉴定图片，2为DNAMarkerDL2000，4为DNAMarker DL15000。

图3是诱导表达蛋白的SDS-PAGE分析图片，其中1为空载体诱导对照，2～6为重组菌PET-32a(+)-IBV-N-BL21诱导4h的蛋白图片，7为蛋白Marker，8为重组菌PET-32a(+)-IBV-N-BL21诱导3h的蛋白图片，9为重组菌PET-32a(+)-IBV-N-BL21诱导2h的蛋白图片。

图4是诱导表达蛋白的纯化SDS-PAGE图片，图片1为蛋白Marker，2～5为重组菌PET-32a(+)-IBV-N-BL21诱导4h的蛋白纯化图片。

图5是pET-32a(+)-IBV-N表达产物的Western-blot分析图片，其中1为诱导表达蛋白，2为预染蛋白Marker，3为空载体诱导对照。

具体实施方式

1.IBV-N基因的扩增与表达载体的构建

根据GenBank中已登录的IBV-N基因序列(SEQ-1)，设计一对引物：上游引物：5’-CCGATATCATGGCAAGCGGTAAAGCA-3’(SEQ-3)(EcoR V位点)，；下游引物：5’-CCGTCGACACTCAAAGTTCATTCTCTCC-3’(SEQ-4)(Sal I位点)。以IBV RNA为模板RT-PCR扩增目的基因N(如图1所示)，用Trizol RNA提取试剂提取核酸，

RNA                     11.5μL

5×RT Buffer(含Mg²⁺)    4.0μL

10mM dNTP               2.0μL

RNasin                  0.5μL

下游引物                1.0μL

将上述反应混合物于台式离心机上稍作离心，然后在PCR仪上70℃10min后加入反转录酶M-MLV 1.0μL(总体系为20μL)，后42℃30min，94℃5min后结束反应。以反转录产物为模板，继续进行PCR以扩增全序列目的片段：

PCR反应体系如下：

双蒸水                    39.5μL

10×PCR Buffer(含Mg²⁺)    4.0μL

RT产物                    5.0μL

rTaq                      0.5μL

上游引物                  1.0μL

总体积                    50μL

在PCR仪上设置94℃3min，经94℃40s，50℃60s，72℃2min，共30个循环，最后于72℃延伸10min，结束反应。取5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，将大小为1230bp的目的基因回收。以EcoR V和Sal I同时对PCR扩增的N蛋白的目的基因和pET-32a(+)载体进行酶切，回收目的片段，用T4DNA连接酶将二者进行连接，16℃过夜，次日将连接产物转化感受态细胞BL21，37℃温箱培养16-20h。挑取单菌落扩大培养，提取质粒，用EcoR V、Sal I进行双酶切鉴定。将阳性重组质粒测序，鉴定正确后获得阳性重组表达质粒pET-32a(+)-IBV-N。(如图2所示)。

2.重组表达质粒的诱导表达

将阳性重组表达质粒pET-32a(+)-IBV-N及空白载体pET-32a(+)分别转化BL21感受态细胞。阳性质粒菌于37℃培养，待OD_600nm值达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，进行诱导表达。收集不同诱导时间表达的菌体，超声波破碎，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，并对表达产物进行Western-blot分析，一抗用鸡抗IBV阳性血清，二抗用辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鸡IgG，DAB显色。结果表明重组蛋白以可溶性蛋白形式存在于菌体裂解液上清中，分子量约为65.5ku，与预期结果相符，以诱导后4h表达量最大(如图3所示)。Western-blot分析发现，表达的重组蛋白能够与鸡传染性支气管炎阳性血清进行反应，具有良好的免疫学活性(如图5所示)。

3.重组蛋白的纯化

选用KCl显色法：将破碎好的重组菌进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后取下凝胶，先用双蒸水洗涤，然后浸入4℃预冷的250mmol/L的KCl溶液中显色5～10min，最后用双蒸水洗涤。将目的蛋白条带切下，PBS洗涤2次，用研钵将其研细，反复冻融3次，8000r/min离心10min，吸取上清，SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定。结果只有一条65.5ku的目的蛋白条带，表明KCl显色法获得了较纯的目的蛋白(如图4所示)。

4.样品稀释液、洗涤液、终止液的配制

样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.05mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液(KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaCl 8g，定容至1000mL，再加0.5mL吐温-20)；10×浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液(KH₂PO₄2g，NaH₂PO₄·12H₂O 29g，NaCl 80g，定容至1000mL，再加5mL吐温-20)；终止液为2mol/L硫酸溶液(取111.2mL浓硫酸即18mol/L，稀释定容至1000mL)。

5.阳性对照和阴性对照的制备

将用鸡传染性支气管炎IBV-N重组蛋白免疫获得的标准阳性血清(OD_450nm≥1.0)，加入1000U/mL的青链霉素，无菌过滤，作为鸡传染性支气管抗体间接ELISA检测试剂中的阳性对照；将筛选获得的SPF鸡标准阴性血清(OD_450nm≤0.200)，加入1000U/mL的青链霉素，无菌过滤，作为鸡传染性支气管炎抗体间接ELISA检测试剂中的阴性对照。

6.显色液的配制

显色液A：称取200mg四甲基联苯胺(TMB)，用100mL无水乙醇或DMSO溶解后，以双蒸水定容至1000mL；显色液B：称取21g柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)，28.2g无水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)，6.4mL 0.75％过氧化氢尿素，双蒸水定容至1000mL，调pH值4.5～5.0。

7.检测鸡传染性支气管炎抗体的间接ELISA反应条件的确定

抗原和血清最佳工作浓度的确定：采用方阵试验确定。用包被缓冲液将N重组蛋白稀释成每孔8μg/100μL，4μg/100μL，2μg/100μL，1μg/100μL，0.5μg/100μL，0.25μg/100μL包被ELISA反应板，IBV阳性血清和阴性血清经大肠杆菌裂解液处理后分别作1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800系列稀释；进行间接ELISA测定。TMB底物显色，硫酸终止反应；测定光波长450nm的OD值。取阳性血清OD_450nm在1.0左右，阴性血清OD_450nm在0.297左右，且阳性血清OD_450nm/阴性血清OD_450nm即P/N值大于2.1的抗原浓度和血清稀释度为最佳工作浓度，结果如表1所示。从表1可以看出：抗原最佳浓度为20μg/mL，血清最佳稀释浓度为1∶200。

表1抗原和血清最佳工作浓度的确定(OD_450nm值)

Tab 1ELISA for detecting the optimum work concentration of antigens and sera

注：P代表阳性血清；N代表阴性血清(Note：P：positive serum  N：negative serum)

8.结果判定标准

将收集的40份SPF鸡血清，在最佳工作条件下进行间接ELISA测定，以确定SPF鸡血清在无IBV感染时其吸收值范围

因此确定以待检样本OD_450nm值与标准阴性OD_450nm值的比值(P/N)大于或等于2.1，且待检样本OD_450nm值大于0.297判为阳性。

9.鸡传染性支气管炎抗体检测ELISA板的制备

用pH8.5的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液作包被液，将鸡传染性支气管炎IBV-N重组蛋白稀释为20μg/mL，按100μL/孔加入ELISA反应板中，37℃封闭2h，4℃包被过夜，拍干，用1％牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭2h，以含0.05％吐温-20pH7.4的PBS洗涤，拍干，再加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3h，待其干燥后装入含干燥剂的包装袋中备用。

10.ELISA操作程序的确定

按以上确定的优化条件进行操作，即得到本方法的最佳操作程序：

将待检血清用样品稀释液作1∶200稀释，按100μL/孔加入抗体检测板中，同时设阴性对照、阳性对照，37℃孵育30min；弃去反应孔中的液体，每孔加洗涤液300μL，洗涤5次，每次间隔1min，拍干；每孔加100μL的酶结合物工作液，37℃孵育30min；洗涤5次，每次间隔1min，拍干；依次加入50μL显色液A和50μL显色液B，37℃避光孵育10min；加50μL终止液，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度A值，读值计算并判定结果。

实施例：

一、鸡传染性支气管炎抗体ELISA检测试剂盒，包括以下组分：

1)ELISA板条(96孔)：5块

2)10×浓缩洗涤液：400mL(用前1∶10稀释)

3)样品稀释液：200mL

4)酶结合物工作液(兔抗鸡酶标二抗)：50mL

5)显色液A：50mL

6)显色液B：50mL

7)终止液：60mL

8)阳性对照(+)：2mL

9)阴性对照(-)：2mL

二、操作步骤：

1、将待检血清用样品稀释液作1∶200稀释，按100μL/孔加入抗体检测板中，同时设阴性对照、阳性对照，37℃孵育30min；

2、弃去反应孔中的液体，每孔加洗涤液300μL，洗涤5次，每次间隔1min，拍干；

3、每孔加100μL的酶结合物工作液，37℃孵育30min；

4、重复步骤2；

5、依次加入50μL显色液A和50μL显色液B，37℃避光孵育10min；

6、加50μL终止液，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度A值，读值计算并判定结果。

三、应用

1、特异性试验

用IBV-N蛋白建立的间接ELISA方法分别检测新城疫、流感、减蛋综合征、传染性法氏囊、传染性喉气管炎等阳性血清及IBV-阴性血清，每样本2个重复，进行交叉反应性测定，结果均为阴性，表明该方法与上述病毒无交叉反应。

2、重复性试验

用两次包被的酶标板，检测10份IBV阳性血清和10份阴性血清，每个样品重复检测5次，测定其变异系数CV％(CV＝S.D./X×100％，S.D.标准差，X：算术平均值)。结果表明变异系数最大为4.80％，最小为0.8％。20份血清变异系数都较小，具有较好的重复性。

3、包被抗原保存期的确定

纯化的重组N蛋白以最佳工作浓度包被封闭后，待其干燥后装入含干燥剂的包装袋中4℃保存，后每隔12个月取出用已知阴阳性血清按所建立的方法进行检测。共检8次。结显示包被本发明的重组N蛋白保存12个月仍可用于检测。

4、自制ELISA试剂盒与中和进口IDEXX试剂盒的对比

临床应用检验的样品80份。应用自制ELISA试剂盒和进口IDEXX试剂盒同时检测送检样品，比较试剂盒的符合率。其中自制ELISA试剂盒检出阳性血清为50份，阳性检出率为62.5％，进口IDEXX试剂盒检出阳性血清47份，阳性检出率为58.75％，两种方法的符合率为96.25％(结果如表2所示)。

表2与IDEXX公司的ELISA试剂盒检测的对比

Claims (7)

1.IBV-N重组蛋白，其特征是，通过以下制备方法获得：

1)根据GenBank中已登录的IBV-N基因序列，设计一对特异引物

上游引物为5’-CCGATATCATGGCAAGCGGTAAAGCA-3’，

下游引物为5’-CCGTCGACACTCAAAGTTCATTCTCTCC-3’

扩增片段大小为1230bp；

2)通过RT-PCR方法对IBV的N基因进行扩增；以EcoR V和Sal I同时对IBV-N基因RT-PCR产物和pET-32a(+)载体进行酶切，回收目的片段，用T4DNA连接酶将二者进行连接，16℃过夜，次日将连接产物转化感受态细胞BL21，37℃温箱培养16-20h；挑取单菌落扩大培养，提取质粒，用EcoRV、Sal I进行双酶切鉴定；将阳性重组质粒测序，鉴定正确后获得阳性重组表达质粒pET-32a(+)-IBV-N；

3)将阳性重组表达质粒pET-32a(+)-IBV-N及空白载体pET-32a(+)分别转化BL21感受态细胞，于37℃培养，待OD_600nm值达到0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后4h的菌体，超声波破碎，离心后取上清进行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定；电泳结束后取下凝胶，先用双蒸水洗涤，然后浸入4℃预冷的250mmol/L的KCl溶液中显色5～10min，最后用双蒸水洗涤；将目的蛋白条带切下，PBS洗涤2次，用研钵将其磨碎，反复冻融3次，8000r/min离心10min，吸取上清，SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定。

2.一种检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征是，包括权利要求1所述的IBV-N重组蛋白作为抗原包被的ELISA板。

3.如权利要求2所述的检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征是，所述ELISA板的制备为：用pH8.5的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液作包被液，将鸡传染性支气管炎N重组蛋白稀释为20μg/mL，按100μL/孔加入ELISA反应板中，37℃封闭2h，4℃包被过夜，拍干，用1％牛血清白蛋白37℃封闭2h，以含0.05％吐温-20pH7.4的PBS洗涤，拍干，再加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3h。

4.如权利要求2或3所述的检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征是，还包括样品稀释液、10×浓缩洗涤液、酶结合物工作液、显色液A、显色液B、终止液、阳性对照和阴性对照。

5.如权利要求4所述的检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征是，所述样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.05mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述10×浓缩洗液为含0.5％吐温-20的0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述酶结合物工作液为Sigma公司生产的HRP-兔抗鸡IgG，作1∶3000稀释的稀释液；所述显色液A为0.2mg/L的四甲基联苯胺溶液，显色液B为含过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液；所述终止液为2mol/L硫酸溶液；所述阳性对照为经鸡传染性支气管炎重组蛋白免疫获得的标准阳性血清，其OD_450nm≥1.0，然后加入1000U/mL的青链霉素，经无菌过滤后获得；阴性对照为经筛选获得的SPF鸡标准阴性血清，其OD_450nm≤0.200，加入1000U/mL的青链霉素，经无菌过滤后获得。

6.如权利要求5所述的检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括以下组分：IBV-N重组蛋白作为抗原包被的ELISA板：5块；样品稀释液：200mL；10×浓缩洗涤液：400mL；酶结合物工作液：50mL；显色液A：50mL；显色液B：50mL；终止液：60mL；阳性对照：2mL；阴性对照：2mL。

7.如权利要求5或6所述的检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒的使用方法，其特征是，将待检血清用样品稀释液作1∶200稀释，按100μL/孔加入抗体检测板中，同时设阴性对照、阳性对照，37℃孵育30min；弃去反应孔中的液体，每孔加洗涤液300μL，洗涤5次，每次间隔1min，拍干；每孔加100μL的酶结合物工作液，37℃孵育30min；洗涤5次，每次间隔1min，拍干；依次加入50μL显色液A和50μL显色液B，37℃避光孵育15min；加50μL终止液，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度A值；以待检样本OD450nm值与标准阴性OD450nm值的比值大于或等于2.1，且待检样本OD450nm值大于0.297判为阳性。

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