CN110596400A - 基于卡氏住白细胞虫重组r7蛋白的间接elisa检测方法及应用 - Google Patents

基于卡氏住白细胞虫重组r7蛋白的间接elisa检测方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110596400A
CN110596400A CN201910822424.9A CN201910822424A CN110596400A CN 110596400 A CN110596400 A CN 110596400A CN 201910822424 A CN201910822424 A CN 201910822424A CN 110596400 A CN110596400 A CN 110596400A
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinant
protein
leucocyte
indirect elisa
elisa detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910822424.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110596400B (zh
Inventor
谭志坚
邝春曼
王新秋
刘丽丹
翁亚彪
黄仪娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
FOSHAN ZHENGDIAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
FOSHAN ZHENGDIAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by FOSHAN ZHENGDIAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd filed Critical FOSHAN ZHENGDIAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201910822424.9A priority Critical patent/CN110596400B/zh
Publication of CN110596400A publication Critical patent/CN110596400A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110596400B publication Critical patent/CN110596400B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种基于卡氏住白细胞虫重组R7蛋白的间接ELISA检测试剂盒及其间接ELISA检测方法，所述试剂盒以卡氏住白细胞虫重组R7蛋白为包被抗原。本发明以卡氏住白细胞虫重组R7蛋白作为抗原建立的检测卡氏住白细胞虫抗体的间接ELISA检测方法，特异性强、灵敏度高、重复性好、检测方便快捷，用建立的间接ELISA方法对鸡球虫、鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒以及鸡痘病毒的标准阳性血清进行检测，结果均为阴性；重复性试验结果显示变异系数小于10％，可用于鸡卡氏住白细胞虫病的抗体水平检测和流行病学调查。

Description

基于卡氏住白细胞虫重组R7蛋白的间接ELISA检测方法及 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于卡氏住白细胞虫重组R7蛋白的间接ELISA检测方法及应用。
背景技术
鸡卡氏住白细胞虫病又称“白冠病”，是由卡氏住白细胞虫寄生于鸡的红细胞、白细胞和内脏组织细胞内所引起的一种血孢子虫病。鸡卡氏住白细胞虫病多发生于3～6周龄雏鸡，发病严重，死亡率高；青年鸡感染率比雏鸡高，但是死亡率不高；而成年鸡的感染率最高，但死亡率很低，症状较轻。主要临床症状表现为鸡冠苍白，消瘦，拉水样白色或绿色稀粪，鸡发育受阻，成年鸡产蛋下降甚至停止，会对养鸡行业造成较大经济损失。
根据临床症状、流行病学、病理解剖等诊断方法可对卡氏住白细胞虫病作出初步判断，而确诊一般采用血涂片检查方法，检查外周血液中有无裂殖子或配子体。出现在外周血液中裂殖子体积极小，普通光学显微镜下难以鉴别卡氏住白细胞虫裂殖子与其他血孢子虫的裂殖子，容易误诊。并且卡氏住白细胞虫成熟配子体在外周血液中出现的时间晚且持续的时间短，血涂片检查容易漏检。血涂片检查方法虽然简单易行，但是在检测效率、检出率、虫种鉴别等方面具有很大的局限性，越来越不适应当前防治工作的需要,尤其不能适应大规模的流行病学调查。随着免疫学的发展，国内外已建立起多种血清学检测方法，如对流免疫电泳技术、直接免疫荧光染色试验、间接免疫荧光抗体实验、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验、环子孢子沉淀反应和子孢子中和反应、免疫印迹和乳胶凝集试验等，这些方法存在着敏感性低或操作复杂、未标准化等问题。Isobe等建立的ELISA诊断方法使用卡氏住白细胞虫第二代裂殖体作为包被抗原检测卡氏住白细胞虫抗体，其敏感性比血涂片检查法、间接免疫荧光抗体试验和琼脂凝胶沉淀试验好。但是卡氏住白细胞虫的生活史复杂，需要库蠓参与其中，人工传代困难。第二代裂殖体的大量获取难度非常大且成本高。以第二代裂殖体作为包被抗原的ELISA检测试剂盒制作困难，成本较高，尚未投入生产使用。
因此，亟需开发一种制作简单，成本低，可大量工业生产的间接ELISA检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于卡氏住白细胞虫重组R7蛋白的间接ELISA检测方法，该检测方法的试剂盒制作简单，成本低；该方法特异性强，灵敏度高，重复性好，检测方便快捷。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种基于卡氏住白细胞虫重组R7蛋白的间接ELISA检测试剂盒，所述试剂盒以卡氏住白细胞虫重组R7蛋白为包被抗原。
优选地，所述包被抗原的制备方法包括以下步骤：
(1)将卡氏住白细胞虫R7基因进行PCR扩增，得到卡氏住白细胞虫重组R7基因；
(2)用限制性内切酶对psYNO-1质粒进行酶切，将卡氏住白细胞虫重组R7基因与酶切后psYNO-1质粒用连接酶连接，并转化到E.coli TOP10感受态细胞中培养，再进行PCR鉴定阳性克隆，得到PCR鉴定阳性菌液，提取PCR鉴定阳性菌液质粒，经双酶切鉴定得到阳性重组质粒psYNO-R7；
(3)将阳性重组质粒psYNO-R7转化到E.coli BL21表达菌，加入异丙基硫代半乳糖苷进行诱导表达，得到psYNO-R7重组蛋白；
(4)将诱导表达后的psYNO-R7重组蛋白纯化，得到卡氏住白细胞虫重组R7蛋白。
优选地，所述试剂盒还包括酶标二抗、封闭液、血清和显色液。
优选地，所述试剂盒的阴阳性临界值为0.374。
优选地，所述试剂盒中包被抗原的包被浓度为0.65μg/mL。
优选地，所述试剂盒包括酶标二抗，所述酶标二抗为HRP标记山羊抗鸡IgG，酶标二抗的稀释度为1:4000。
优选地，所述试剂盒包括封闭液，所述封闭液为5％脱脂奶，所述封闭液的封闭条件为在4℃中封闭过夜。
优选地，所述血清包括标准阳性血清和标准阴性血清，所述血清和待检血清的稀释度为1:500。
优选地，所述显色液为TMB显色液，所述TMB显色液为KPL公司的SureBlue TMBMicrowell Substrate，底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺，所述显色液的反应时间为10-30min。
一种基于卡氏住白细胞虫重组R7蛋白的间接ELISA检测方法，包括以下步骤：
(1)包被抗原：将卡氏住白细胞虫重组R7蛋白用包被缓冲液稀释到0.065-1.3μg/mL，在37℃下包被2-3h或4℃包被过夜；
(2)洗涤酶标板：甩干孔内包被液，加入磷酸盐吐温缓冲液洗涤，再甩干残留液体；
(3)封闭：加入封闭液，在37℃下封闭1-2h或4℃封闭过夜；
(4)加入血清：用5％脱脂奶稀释血清，混合静置5-10min，将稀释好的血清加入酶标板，在37℃下孵育0.5-2h；
(5)加入酶标二抗：加入稀释好的HRP标记山羊抗鸡IgG，在37℃下孵育0.5-2h；
(6)显色：加入TMB显色液，在37℃下显色10-30min；
(7)终止：加入终止液终止显色；
(8)读数：用酶标仪检测450nm波长OD值，并读取。
优选地，步骤(1)中，所述包被缓冲液选自碳酸盐缓冲液，所述碳酸盐缓冲液选自pH为9.6的0.2mol/L NaHCO3。
优选的，步骤(2)中，所述磷酸盐吐温缓冲液(PBST)是含0.05％吐温20和pH为7.2的磷酸盐缓冲液。
优选地，步骤(3)之后和步骤(4)之前、步骤(4)之后和步骤(5)之前、步骤(5)之后和步骤(6)之前，还包括甩干孔内液体，加入磷酸盐吐温缓冲液洗涤，再甩干残留液体。
优选地，步骤(3)中，所述封闭液为5％脱脂奶粉；
优选地，步骤(4)中，所述血清与5％脱脂奶的稀释比为1:250-1:2000。更优选地，所述血清与5％脱脂奶的稀释比为1:500。
优选地，步骤(5)中，所述HRP标记山羊抗鸡IgG的稀释比为1:2000-1:12000。更优选地，所述HRP标记山羊抗鸡IgG的稀释比为1:4000。
优选地，步骤(7)中，所述终止液为2mol/L H2SO4。
一种基于卡氏住白细胞虫重组R7蛋白的间接ELISA检测试剂盒在检测卡氏住白细胞虫抗体中的应用。
本发明的有益技术效果是：
本发明以卡氏住白细胞虫重组R7蛋白作为抗原建立的检测卡氏住白细胞虫抗体的间接ELISA检测方法，特异性强、灵敏度高、重复性好、检测方便快捷，以大肠杆菌表达的重组R7蛋白代替卡氏住白细胞虫第二代裂殖体作为包被抗原，大大降低了间接ELISA检测试剂盒的生产成本和难度。用建立的间接ELISA方法对鸡球虫、鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒以及鸡痘病毒的标准阳性血清进行检测，结果均为阴性；重复性试验结果显示变异系数小于10％，可用于鸡卡氏住白细胞虫病的抗体水平检测和流行病学调查。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
实施例1(抗原的制备)
一种卡氏住白细胞虫重组R7基因的制备方法，包括以下步骤：
(1)找到卡氏住白细胞虫R7基因序列，在不改变氨基酸序列的情况下优化密码子，再人工合成R7基因序列；
(2)设计一对特异性连接引物的核苷酸序列为：CTGTACTTCCAGGGAGCAAGTGGTCTGGTTACC和GTGGTGGTGCTCGAGTTATCACACTTCTTCATGT，再设计一对鉴定引物的核苷酸序列为GACTAATTCGAGCTCGAACAACAACA和CATGTTCTTCTTTTTCTTTCTCTTCGTG；
(3)以合成的R7基因为模板，PCR扩增R7基因片段，得到卡氏住白细胞虫重组R7基因。
一种卡氏住白细胞虫重组R7蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)将卡氏住白细胞虫R7基因进行PCR扩增，得到卡氏住白细胞虫重组R7基因；
(2)用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对psYNO-1质粒进行酶切，将卡氏住白细胞虫重组R7基因与酶切后psYNO-1质粒用In-Fusion连接酶连接，并转化到E.coliTOP10感受态细胞中培养，再进行PCR鉴定阳性克隆，得到PCR鉴定阳性菌液，提取PCR鉴定阳性菌液质粒，经双酶切鉴定得到阳性重组质粒psYNO-R7；
(3)将阳性重组质粒psYNO-R7转化到E.coli BL21表达菌，加入异丙基硫代半乳糖苷进行诱导表达，得到psYNO-R7重组蛋白；
(4)将诱导表达后的psYNO-R7重组蛋白纯化，得到卡氏住白细胞虫重组R7蛋白。
双酶切鉴定的步骤为：将psYNO-R7、SacⅠ、XhoⅠ、10×M Buffer和ddH2O加入到灭菌的1.5mL离心管中混匀，在37℃下恒温水浴2h，得到酶切产物，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将鉴定为阳性的质粒做好标记，并测序，得到阳性重组质粒psYNO-R7，保存于-20℃中。
实施例2(抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定)
以不同稀释度的抗原和血清进行方阵试验，摸索抗原和血清的最适工作浓度，结果见表11。由表11可以看出随着抗原和血清稀释度的增大，血清OD450nm值减小。当血清的稀释度为1:500，纯化R7蛋白的稀释度为1:2000，即包被浓度为0.65μg/mL时，P/N值最高，并且阳性血清OD450nm值接近1，阴性血清OD450nm值较小。由此确定重组R7蛋白的最佳包被浓度为0.65μg/mL，最适血清稀释度为1:500。
表11抗原和血清最适工作浓度的确定
注：“P”为阳性血清；“N”为阴性血清
实施例3(酶标二抗最适稀释度的确定)
根据表12所示，当HRP标记山羊抗鸡IgG以1:4000稀释时，P/N值最大。由此可确定酶标二抗的最适稀释度为1:4000。
表12酶标二抗最适稀释度的确定
实施例4(最佳包被时间的确定)
用重组R7蛋白包被酶标板，分别在37℃包被1h、1.5h、2h和4℃包被过夜，之后按照常规方法操作。结果如表13所示，在37℃下包被2h的P/N值最高，说明包被效果最好。由此确定重组R7蛋白的最佳包被时间是在37℃下包被2h。
表13最佳包被时间的确定
实施例5(最佳封闭时间的确定)
按最适工作条件进行包被之后，封闭时间分别为37℃封闭1h、1.5h、2h和4℃封闭过夜(≥16h)。结果如表14所示，封闭时间为4℃封闭过夜时，P/N值最高，约为14.03，说明封闭效果最好。由此可确定最佳封闭时间是4℃封闭过夜。
表14最佳封闭时间的确定
实施例6(抗原和血清最佳作用时间的确定)
按照表15显示，抗原以1:2000稀释后进行包被，血清按1:500稀释，抗原和血清的作用时间为1h时，P/N值最高。因此，抗原和血清最佳作用时间是37℃孵育1h。
表15抗原和血清最佳作用时间的确定
实施例7(酶标二抗最佳作用时间的确定)
HRP标记山羊抗鸡IgG以1:4000稀释，当作用时间为37℃孵育30min时，P/N值最高，结果见表16。因此，将37℃孵育30min确定为酶标二抗最佳作用时间。
表16酶标二抗最佳作用时间的确定
实施例8(显色时间的确定)
根据已优化好的条件进行包被、封闭、孵育血清和酶标二抗之后，显色时间为37℃孵育15min时，P/N值最高，结果见表17。因此最佳显色时间确定为37℃孵育15min。
表17显色时间的确定
实施例9(阴阳性判定标准的确定)
用已建立的间接ELISA方法对54份鸡卡氏住白细胞虫阴性血清进行检测，记录OD450nm值，结果见表18。计算出54份血清的OD450nm值的平均值X＝0.2097，标准方差SD＝0.05499，根据公式：阴阳性临界值＝X+3SD，此实验临界值为0.3746。即当待测样品的OD450nm值≥0.3746时，判定为阳性；当待测样品的OD450nm值<0.3746时，判定为阴性。
表18间接ELISA阴阳性临界值的确定
通过一系列的条件的优化，得出卡氏住白细胞虫抗体的间接ELISA检测方法，包括以下步骤：
(1)包被抗原：将卡氏住白细胞虫重组R7蛋白用pH为9.6、0.2mol/L NaHCO3稀释到0.65μg/mL，加入100μL/孔，在37℃下包被2h；
(2)洗涤酶标板：甩干孔内包被液，加入PBST，300μL/孔，洗涤4次，再甩干残留液体；
(3)封闭：加入5％脱脂奶，200μL/孔，在4℃下封闭过夜；
(4)洗涤酶标板：甩干孔内脱脂奶，加入PBST，300μL/孔，洗涤4次，再甩干残留液体；
(5)加入血清：用5％脱脂奶按1:500稀释血清，混合静置6min，将稀释好的血清加入到酶标板，100μL/孔，在37℃下孵育1h；
(6)洗涤酶标板：甩干孔内液体，加入PBST，300μL/孔，洗涤4次，再甩干残留液体；
(7)加入酶标二抗：加入1:4000稀释的HRP标记山羊抗鸡IgG，100μL/孔，在37℃下孵育0.5h；
(8)洗涤酶标板：甩干孔内液体，加入PBST，300μL/孔，洗涤4次，再甩干残留液体；
(9)显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃显色15min；
(10)终止：加入2mol/L H2SO4终止显色，50μL/孔；
(11)读数：用酶标仪检测450nm波长OD值，并读取。
实施例10(敏感性试验)
用建立的间接ELISA方法检测不同稀释度的卡氏住白细胞虫阳性血清，当血清稀释度为1:4000时，OD450nm均值＝0.4051>0.3746，表明建立的间接ELISA方法敏感性较好。
表19敏感性试验
实施例11(特异性试验)
用建立的间接ELISA方法检测鸡球虫、NDV、AIV、IBV、ILTV、IBDV、FPV的标准阳性血清，同时设置卡氏住白细胞虫阳性血清和阴性血清对照。结果如表20显示，只有卡氏住白细胞虫阳性血清判定为阳性。鸡球虫、NDV、AIV、IBV、ILTV、IBDV、FPV的标准阳性血清OD450nm值均小于临界值0.374，判定为阴性，表明建立的间接ELISA方法具有较好的特异性。
表20特异性试验
实施例12(重复性试验)
随机选取5份血清，每份做5个重复进行检测并计算变异系数。结果由表21可以得知，批内变异系数在1.69％～5.20％之间，小于10％，表明所建立的ELISA方法批内重复性好。抽取5个不同批次纯化的蛋白包被酶标板，按已建立的间接ELISA方法检测5份血清样品，结果如表22所示，批间变异系数在2.74％～5.78％之间，小于10％，从而表明所建立的方法批间重复性好。
表21批内重复试验
表22批间重复试验
实施例13
用建立的间接ELISA方法检测来自广东、广西、福建、江西的临床血清样本，一共1615份鸡血清样品，其中279份为阳性，1336份为阴性，总阳性率为17.28％。具体检测结果如表23，各地区卡氏住白细胞虫阳性率为2.83％～23.44％，其中陆川的阳性率最高，桂林的阳性率最低。对广西省60个鸡场进行抽样检测，共检测了927个血清样本，其中158份为阳性，769份为阴性，阳性率为17.04％。对福建省10个鸡场进行抽样检测，共检测了160个血清样本，其中19份为阳性，141份为阴性，阳性率为11.88％。对广东省28个鸡场进行抽样检测，共检测了448个血清样本，其中89份为阳性，359份为阴性，阳性率为19.87％。对江西省5个鸡场进行抽样检测，共检测了80个血清样本，其中13份为阳性，67份为阴性，阳性率为16.25％。
表23临床检测结果
结论：
本研究以重组R7蛋白为包被抗原建立了检测卡氏住白细胞虫抗体的间接ELISA检测方法。经反应条件优化后，确定重组R7蛋白抗原最佳包被浓度为0.65μg/mL，最佳包被条件为37℃孵育2h；最佳封闭液为5％脱脂奶，最佳封闭条件为在4℃中封闭过夜；血清最佳稀释度为1:500，血清和抗原最佳反应时间为37℃孵育1h；酶标二抗的最佳工作浓度为1:4000，最佳孵育时间为37℃孵育0.5h；最佳显色时间为15min；ELISA阴阳性临界值为0.374。用建立的间接ELISA方法对鸡球虫、鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒以及鸡痘病毒的标准阳性血清进行检测，结果均为阴性；重复性试验结果显示变异系数小于10％；结果显示建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、重复性和敏感性，可用于鸡卡氏住白细胞虫病的抗体水平检测和流行病学调查。
实施例14
一、基于R7重组蛋白的间接ELISA方法
(1)包被抗原：将卡氏住白细胞虫重组R7蛋白用pH为9.6、0.2mol/L NaHCO3稀释到0.65μg/mL，100μL/孔，37℃包被2h；
(2)洗涤：甩干孔内液体后拍干，加入PBST，300μL/孔，洗涤4次，再拍干；
(3)封闭：加入5％脱脂奶，200μL/孔，4℃封闭过夜，如步骤(2)洗涤之后拍干；
(4)加入血清：用5％脱脂奶把待检血清稀释500倍，充分混匀，加入稀释好的血清，100μL/孔，37℃孵育1h，如步骤(2)洗涤之后拍干；
(5)加入酶标二抗：加入1:4000稀释的山羊抗鸡IgG-HRP，100μL/孔，37℃孵育30min，如步骤(2)洗涤之后拍干；
(6)显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃显色15min；
(7)终止：加入2mol/L H2SO4终止显色，50μL/孔；
(8)读数：用酶标仪检测450nm波长OD值，并读取。
二、基于裂殖体抗原的ELISA方法
1、裂殖体抗原的获取
解剖10只卡氏住白细胞虫感染的病死鸡，从这些鸡中采集脾脏，肾脏和法氏囊，保存于-80℃备用。解冻后，加入PBS在组织均质器以3000r/min均质化4min，匀浆用30目和60目的筛子过滤，滤液最后用100目筛子过滤。许多裂殖体保留在100目筛网内，用PBS冲洗下来，收集到离心管中，185×g离心5min，弃去上清液。加PBS重悬，185×g离心5min，弃去上清液，重复3次。最后加PBS重悬，用超声破碎器处理5min，并在4℃下以8,000×g离心30min。将上清液储存在-80℃下，用作包被抗原。
2、基于裂殖体抗原的间接ELISA方法操作步骤
(1)包被抗原：解冻上述制备保存的裂殖体抗原，测定蛋白浓度，将裂殖体抗原用pH为9.6、0.2mol/L NaHCO3稀释成60ug/mL，100μL/孔，37℃包被2h；
(2)洗涤：甩干孔内液体后拍干，加入PBST，300μL/孔，洗涤4次，再拍干；
(3)封闭：加入5％脱脂奶，200μL/孔，37℃封闭2h(或者4℃过夜)，如步骤(2)洗涤之后拍干；
(4)加入血清：用5％脱脂奶把待检血清稀释100倍，充分混匀，加入稀释好的血清，100μL/孔，37℃孵育1h，如步骤(2)洗涤之后拍干；
(5)加入酶标二抗：加入1:800稀释的山羊抗鸡IgG-HRP，100μL/孔，37℃孵育1h，如步骤(2)洗涤之后拍干；
(6)显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃显色15min；
(7)终止：加入2mol/L H2SO4终止显色，50μL/孔；
(8)读数：于450nm波长检测OD450nm值。
三、血涂片法
翅下抽血到抗凝管中，用抗凝血制作血液涂片，瑞氏染色，观察血涂片中是否有虫体出现。
四、结果与分析
在一暴发过卡氏住白细胞虫病的养殖场随机抽取45只鸡，翅下静脉抽血，每只鸡抽取2份血液，一份加入抗凝剂用血涂片法检查，另一份不加抗凝剂，用两种间接ELISA方法检测血清，检测结果如下表24。用本发明的基于R7重组蛋白抗原的间接ELISA检测45份临床血液样品的阳性率为42.2％，用传统的血涂片检查法的阳性率是15.6％，说明本发明的间接ELISA方法比传统的血涂片检查法敏感。用基于裂殖体抗原的间接ELISA方法检测的阳性率也是42.2％，说明本发明的间接ELISA方法与基于裂殖体抗原的间接ELISA方法一样具有较高的敏感性。但是裂殖体抗原的制备，需要采集患病鸡或者病死鸡的组织来制备，每只鸡能采集到的裂殖体较少，分离纯化裂殖体并制成抗原的步骤繁琐。而重组R7蛋白的制备更简单，现有的大肠杆菌表达系统比较完善，制备重组R7蛋白的方法简单且产量高，大大降低了间接ELISA检测试剂盒的生产成本。
表24

Claims (10)

1.一种基于卡氏住白细胞虫重组R7蛋白的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒以卡氏住白细胞虫重组R7蛋白为包被抗原。
2.根据权利要求1所述的基于卡氏住白细胞虫重组R7蛋白的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被抗原的制备方法包括以下步骤：
(1)将卡氏住白细胞虫R7基因进行PCR扩增，得到卡氏住白细胞虫重组R7基因；
(2)用限制性内切酶对psYNO-1质粒进行酶切，将卡氏住白细胞虫重组R7基因与酶切后psYNO-1质粒用连接酶连接，并转化到E.coli TOP10感受态细胞中培养，再进行PCR鉴定阳性克隆，得到PCR鉴定阳性菌液，提取PCR鉴定阳性菌液质粒，经双酶切鉴定得到阳性重组质粒psYNO-R7；
(3)将阳性重组质粒psYNO-R7转化到E.coli BL21表达菌，加入异丙基硫代半乳糖苷进行诱导表达，得到psYNO-R7重组蛋白；
(4)将诱导表达后的psYNO-R7重组蛋白纯化，得到卡氏住白细胞虫重组R7蛋白。
3.根据权利要求1所述的基于卡氏住白细胞虫重组R7蛋白的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶标二抗、封闭液、血清和显色液。
4.权利要求1-3任一项所述的一种基于卡氏住白细胞虫重组R7蛋白的间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)包被抗原：将卡氏住白细胞虫重组R7蛋白用包被缓冲液稀释，在37℃下包被2-3h；
(2)洗涤酶标板：甩干孔内包被液，加入磷酸盐吐温缓冲液洗涤，再甩干残留液体；
(3)封闭：加入封闭液，在4℃下封闭过夜；
(4)加入血清：用5％脱脂奶稀释血清，将稀释后的血清在37℃下孵育0.5-2h；
(5)加入酶标二抗：加入HRP标记的山羊抗鸡IgG，在37℃下孵育0.5-2h；
(6)显色：加入显色液，在37℃下显色10-30min；
(7)终止：加入终止液终止显色；
(8)读数：用酶标仪检测450nm波长OD值，并读取。
5.根据权利要求4所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述包被液选自碳酸盐缓冲液，所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.2mol/L，pH为9.6。
6.根据权利要求4所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述封闭液为5％脱脂奶粉。
7.根据权利要求4所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，步骤(6)中，所述显色液为TMB显色液。
8.根据权利要求4所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，步骤(7)中，所述终止液为2mol/L H2SO4。
9.根据权利要求4所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，步骤(3)之后和步骤(4)之前、步骤(4)之后和步骤(5)之前、步骤(5)之后和步骤(6)之前，还包括甩干孔内包被液，加入磷酸盐吐温缓冲液洗涤，再甩干残留液体。
10.权利要求1-3任一项所述的试剂盒在检测卡氏住白细胞虫抗体中的应用。
CN201910822424.9A 2019-09-02 2019-09-02 基于卡氏住白细胞虫重组r7蛋白的间接elisa检测方法及应用 Active CN110596400B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910822424.9A CN110596400B (zh) 2019-09-02 2019-09-02 基于卡氏住白细胞虫重组r7蛋白的间接elisa检测方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910822424.9A CN110596400B (zh) 2019-09-02 2019-09-02 基于卡氏住白细胞虫重组r7蛋白的间接elisa检测方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110596400A true CN110596400A (zh) 2019-12-20
CN110596400B CN110596400B (zh) 2023-04-07

Family

ID=68856847

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910822424.9A Active CN110596400B (zh) 2019-09-02 2019-09-02 基于卡氏住白细胞虫重组r7蛋白的间接elisa检测方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110596400B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111521784A (zh) * 2020-04-07 2020-08-11 佛山市正典生物技术有限公司 检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条及其制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07284392A (ja) * 1994-04-19 1995-10-31 Doubutsuyou Seibutsugakuteki Seizai Kyokai 鶏ロイコチトゾーン免疫原性蛋白質を発現する遺伝子クローン及び鶏ロイコチトゾーン症に対する遺伝子組換えワクチン
CN1990870A (zh) * 2005-12-31 2007-07-04 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 鸡传染性法氏囊病毒vp3基因、所表达的重组蛋白及应用
US20080003243A1 (en) * 2004-05-31 2008-01-03 The Kitasato Institute Oral Anti-Protozoiasis Vaccines Based on Transgenic Plants
CN102093999A (zh) * 2010-12-14 2011-06-15 山东省农业科学院家禽研究所 一种检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接elisa试剂盒
CN103360472A (zh) * 2013-07-30 2013-10-23 北京市农林科学院 禽偏肺病毒抗体elisa检测试剂盒
CN104965086A (zh) * 2015-05-21 2015-10-07 华南农业大学 一种犬弓形虫抗体间接elisa检测试剂盒
CN107632150A (zh) * 2017-09-07 2018-01-26 武汉科前生物股份有限公司 一种检测鸡马立克氏病病毒抗体的试剂盒及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07284392A (ja) * 1994-04-19 1995-10-31 Doubutsuyou Seibutsugakuteki Seizai Kyokai 鶏ロイコチトゾーン免疫原性蛋白質を発現する遺伝子クローン及び鶏ロイコチトゾーン症に対する遺伝子組換えワクチン
US20080003243A1 (en) * 2004-05-31 2008-01-03 The Kitasato Institute Oral Anti-Protozoiasis Vaccines Based on Transgenic Plants
CN1990870A (zh) * 2005-12-31 2007-07-04 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 鸡传染性法氏囊病毒vp3基因、所表达的重组蛋白及应用
CN102093999A (zh) * 2010-12-14 2011-06-15 山东省农业科学院家禽研究所 一种检测鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接elisa试剂盒
CN103360472A (zh) * 2013-07-30 2013-10-23 北京市农林科学院 禽偏肺病毒抗体elisa检测试剂盒
CN104965086A (zh) * 2015-05-21 2015-10-07 华南农业大学 一种犬弓形虫抗体间接elisa检测试剂盒
CN107632150A (zh) * 2017-09-07 2018-01-26 武汉科前生物股份有限公司 一种检测鸡马立克氏病病毒抗体的试剂盒及其应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111521784A (zh) * 2020-04-07 2020-08-11 佛山市正典生物技术有限公司 检测卡氏住白细胞虫抗体的胶体金试纸条及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110596400B (zh) 2023-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106834235B (zh) 抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株及其筛选方法和应用
CN111537712B (zh) 惰性载体间接凝集试验检测系统及其应用
CN112899239B (zh) 一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用
AU2020210232A1 (en) Inert vector Escherichia coli and potential use thereof
CN108107208B (zh) 一种基于纤突蛋白f的检测血清8型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒
EP1186890B1 (en) Srsv detection kit
CN109580942B (zh) Qx型ibv的细胞适应株mj在制备全病毒抗原elisa检测试剂盒中的应用及试剂盒
CN110596400B (zh) 基于卡氏住白细胞虫重组r7蛋白的间接elisa检测方法及应用
CN106443015A (zh) 一种基于hexon蛋白N端保守区的检测禽腺病毒抗体的ELISA试剂盒
CN109239342B (zh) Qx型ibv血凝抑制试验抗原及其制备方法与应用
CN109085354B (zh) 水痘-带状疱疹病毒中和抗体的检测试剂盒及其检测方法
CN108802368B (zh) 一种酶联免疫检测牛流产衣原体的试剂盒
CN113604438A (zh) 一种抗罗非鱼湖病毒的单克隆抗体及其细胞株和应用
WO2023109535A1 (zh) 抗马立克氏病毒单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及检测试剂盒应用
CN115141810B (zh) 分泌抗鸡滑液囊支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用
CN114807178B (zh) 非洲猪瘟病毒p72蛋白c末端多表位重组抗原及应用
Durojaiye et al. Counter immunoelectroosmophoresis in the diagnosis of infectious bursal disease of poultry
CN113616784A (zh) 一种抗猪流行性腹泻病病毒变异株shxx1902的免疫疫苗的制备方法
CN113684189A (zh) 一株鸡新型圆圈病毒3型毒株及基于该病毒的检测体系
CN113702640A (zh) 产气荚膜梭菌β1毒素抗体的间接ELISA方法
CN111537736A (zh) 一种鸡毒支原体抗体的间接elisa检测试剂盒及检测方法
CN110161246A (zh) 区分新城疫病毒样颗粒疫苗免疫血清与野毒感染血清的间接竞争elisa方法及试剂盒
CN111830263A (zh) 一种绵羊肺炎支原体间接血凝检测方法的建立方法
CN110498853B (zh) 抗鸭生长迟缓病毒的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用
CN116519944B (zh) 一种鸡新城疫病毒抗体间接elisa检测方法及其试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant