CN1990870A - 鸡传染性法氏囊病毒vp3基因、所表达的重组蛋白及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸡传染性法氏囊病毒VP3 cDNA全序列中的一段cDNA、利用其表达载体制备重组蛋白的方法、应用该重组蛋白所建立的一种IBDV间接ELISA诊断方法以及由该重组蛋白所制备的试剂盒。本发明通过对鸡传染性法氏囊病毒VP3 cDNA全序列进行筛选和分析，选取了其中一段抗原表位较丰富、能够在原核细胞中高效表达的cDNA序列，构建了原核表达载体，进行原核表达，用所表达的重组蛋白作为包被抗原，成功地建立了IBDV间接ELISA诊断方法，并确定了该方法的最佳反应条件，为免疫鸡群抗体检测和进行流行病学调查提供了一种快速简便的血清学鉴别诊断方法。本发明还提供了用该重组VP3蛋白作为包被抗原的试剂盒，试验表明，该试剂盒具有良好的敏感性、特异性、稳定性和重复性。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因，尤其涉及一种鸡传染性法氏囊病毒VP3基因，该基因表达载体的构建、转化，所表达的重组蛋白及该重组蛋白所制备的检测或诊断传染性法氏囊病毒的试剂盒，属于基因工程领域。
背景技术
鸡传染性法氏囊病(chicken infectious busal disease，IBD)是由传染性法氏囊病毒(chicken infectious busal disease virus，IBDV)引起的鸡和火鸡的一种急性高度接触性传染病，该病主要侵害3-12周龄的雏鸡和青年鸡，给世界各国的养禽业带来巨大的损失。IBDV的靶细胞是未成熟的B淋巴细胞或B前淋巴细胞，感染后很快发生变性和坏死。由于法氏囊是B细胞成熟的重要器官，鸡在感染IBDV后，淋巴滤泡内的B细胞大量裂解死亡，网状细胞呈凋亡过程，最终导致法氏囊等器官萎缩，使病鸡更易感染其他致病因子，而且对某些疫苗(如新城疫、禽流感等)的免疫应答能力下降，导致免疫失败。研究表明传染性法氏囊病毒常与其他一些疾病呈混合感染，这可能是引发鸡群多疾病爆发，使养禽业的疫病更加复杂和严重的主要原因之一。如何准确的对IBDV进行快速诊断是及时掌握IBDV流行的分子机制、抗原变异，并据此制定正确的疾病防制措施的必要前提。
鸡传染性法氏囊病是鸡传染性法氏囊病病毒引起能够使鸡死亡的禽类的一种重要的传染病。在我国，鸡传染性法氏囊病对养禽业的危害是巨大的，虽然该病疫苗已经列入免疫程序，但是免疫效果的好坏直接影响着该病防制的成功与否，同时感染后也会使其他疫病易感，近年来变异株和高致病力毒株的出现也时不时造成该病的地域性流行及点状爆发，给该病的防制带来很多新的挑战。
国外学者Jorgel等在昆虫细胞中分别表达了IBDV结构蛋白VPX(VP2-VP4-VP3)和VP3，使用表达的重组蛋白作为诊断用抗原进行间接ELISA试验。对超过300份鸡血清的监测结果证明：与两种商业试剂盒(美国IDDEXX和KPL)比较，VPX具有较好的相关性，阳性检出率为100％，与两种商业试剂盒一致，阴性检出率为56.6％，高于两种商业试剂盒；而VP3的相关性稍差，阳性检出率为96％，阴性检出率为26.6％，与KPL一致，而低于IDDEXX的46.6％。Saravanan P等(2004)使用两段合成的IBDV VP2多抗原肽(MAPs)，分别作为诊断用抗原，进行ELISA试验检测IBDV抗体，两段多抗原肽的特异性和敏感性均好于全病毒。
目前IBD的诊断主要通过琼脂扩散试验、以全病毒抗原建立的免疫荧光试验以及进口的ELISA试剂盒(包被抗原主要为全病毒)等方法来进行。上述这些方法中，有的存在特异性不高的问题，有的存在步骤烦琐、成本昂贵的缺陷，并且现有的这些诊断方法均不能够将VP2亚单位疫苗免疫和野毒感染区别开来，对鸡传染性法氏囊病的诊断和预防造成了一定的困难。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种特异性高，易纯化制备、成本低的重组IBDV VP3蛋白，该重组蛋白可作为诊断抗原，不仅能够简便、快速、准确的检测出待测血液样品中的传染性法氏囊病毒，还能够准确的将VP2亚单位疫苗免疫和野毒感染区分开来。
本发明首先所要解决的技术问题是以下技术途径来实现的：
一种重组IBDV VP3蛋白，含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
本发明还要解决的一个技术问题是提供一种编码上述重组蛋白基因，含有该基因的原核表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。
本发明还要解决的一个技术问题是通过以下技术途径来实现的：
一种编码上述重组IBDV VP3蛋白cDNA，其具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的原核表达载体，含有该表达载体的宿主细胞。其中，所述的原核表达载体优选为pPROVP3，所述的宿主细胞优选为大肠杆菌(E.coli)DH5α。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备本发明重组IBDVVP3蛋白的方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术途径来实现的：
一种制备本发明重组IBDV VP3蛋白的方法，包括以下步骤：
用上述的原核表达载体转化大肠杆菌，培养转化体，诱导重组VP3蛋白表达，回收并纯化所表达的重组VP3蛋白。
作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列插入到原核表达载体pPROEX-Hta上的EcoRI和HindIII限制性酶切位点之间，得到重组原核表达载体pPROVP3；将所得到的重组原核表达载体pPROVP3通过本领域常规方法转化大肠杆菌感受态细胞，作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为转化大肠杆菌(E.coli)DH5α；用IPTG诱导重组IBDV VP3蛋白的表达，将所表达的蛋白采用常规的方法回收并纯化即得。
本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种诊断或检测传染性法氏囊病毒的试剂盒。
本发明所要解决的又一个技术问题是通过以下技术途径来实现的：
一种检测或诊断鸡传染性法氏囊病毒的试剂盒，该试剂盒主要由包被有抗原的酶标板，样品稀释液、酶标抗体，底物显色液、终止液、标准阳性血清、标准阴性血清组成，其中，所述的用于包被酶标板的抗原为本发明的鸡传染性法氏囊病毒VP3重组蛋白；所述的标准阳性血清为鸡传染性法氏囊病标准阳性血清；所述的标准阴性血清为鸡标准阴性血清。
上述试剂盒中，所述的样品稀释液、洗液、酶标抗体结合物，底物显色液和终止液均为本领域试剂盒中的常规用品，其制备方法为本领域技术人员所公知。作为本发明的一个优选的技术方案，所述的酶标抗体结合物优选为辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鸡IgG；所述的底物显色液优选为邻苯二胺(OPD)。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种应用本发明重组IBDVVP3蛋白体外检测或诊断传染性法氏囊病毒的方法。
本发明所要解决的再一个技术问题是通过以下技术途径来实现的：
一种应用本发明重组IBDV VP3蛋白体外检测或诊断传染性法氏囊病毒的间接ELISA方法，包括用抗原包被酶标板，封闭，再依次加入待检血清、酶标抗体结合物、底物显色液、终止液、测定OD值等步骤，其中，用浓度为2～4μg/ml的重组IBDV VP3蛋白包被酶标板；所述的封闭剂选自1％马血清加PBS、0.5％马血清加PBS、5％牛血清加PBS、5％脱脂乳加PBS或3％脱脂乳加PBS；封闭时间为60分钟-120分钟；所加入待检血清的稀释度为1∶100-1∶200；底物显色液与酶标抗体结合物的作用时间为10-15分钟。
间接ELISA抗原的包被浓度、血清的稀释倍数以及反应时间等都是影响试验稳定性的重要因素，为了得到了理想的反应体系，本发明人分别对这些条件进行了反复的试验和测试。最终发现：抗原用2μg/ml的浓度包被、血清作1∶100稀释反应60min，结果较为满意。抗原包被后的固相载体表面会留有部分可吸附蛋白质的活性部位，这些部位会影响试验的特异性，在实验中对不同封闭剂作用不同的时间及对封闭结果进行了比较，发现含有0.5％马血清或3％的脱脂乳封闭的PBST都有良好的封闭作用，可明显的降低反应的非特异性。试验结果良好。但快诊板要长期保存，则3％的脱脂乳封闭的效果就不太理想，测得的OD值普遍升高，因为脱脂乳中的蛋白成分更为复杂，且容易变性，影响了最终的检测结果。因此，本发明确立了0.5％马血清的PBS作为最适封闭液。此外，本发明还通过大量的试验确立待检血清与包被抗原的作用最佳时间为60分钟，酶标抗体结合物与待检血清的最佳作用时间为60分钟；底物显色液与酶标抗体结合物的最佳作用时间为15分钟。
大肠杆菌表达系统操作简便，成本低廉，可以大量生产目的蛋白。当目的蛋白与标签蛋白融合后，还可以方便蛋白的纯化，所以目前应用广泛。本发明通过对鸡传染性法氏囊病毒VP3 cDNA全序列进行筛选和分析，选取了其中一段抗原表位较丰富、能够在原核细胞中高效表达的cDNA序列(SEQ IDNO：1)，构建了原核表达载体，采用大肠杆菌系统进行原核表达，用所表达的IBDV部分VP3重组蛋白作为包被抗原，成功地建立了IBDV间接ELISA诊断方法，经特异性、敏感性和重复性试验证实，该方法特异性强，敏感性高，重复性好，同时本发明确定了ELISA的最佳反应条件，为免疫鸡群抗体检测和进行流行病学调查提供了一种快速简便的血清学鉴别诊断方法。
在兽医实际临床工作中大量的血清样品监测及现地未知疾病的爆发迫切需要一种反应快速、操作简捷、结果准确的诊断方法。ELISA试验(ELISA)诊断方法在以上提到的这些方面很符合临床的要求。ELISA诊断方法已经越来越普及的应用到各种疫病的诊断中。间接ELISA作为一种快速的诊断方法其敏感性就成为该诊断方法实用性的先决条件。
本发明以重组IBDV VP3蛋白为抗原所建立的间接ELISA方法，具有很好的特异性，除可用于IBD的常规血清学诊断外，还可用于鉴别诊断，即用VP2亚单位疫苗免疫后，不会产生抗VP3的抗体，如用本发明建立的ELISA方法检测为阳性时，即为野毒感染。所以本方法的建立更重要的意义是将有利于VP2亚单位疫苗的有效预防及扑杀计划，有利于鸡场的净化，为生产实践提供一种快速有效地鉴别诊断方法，为彻底扑灭法氏囊病提供技术支撑。
用本发明所表达的IBDV部分VP3重组蛋白作为包被抗原，具有全病毒无可比拟的安全性，不存在潜在的病毒逃逸和扩散的威胁，同时具有很高的特异性，并且能够作为现有技术中VP2亚单位疫苗的配套产品，可以鉴别亚单位疫苗免疫和野毒感染，为今后启动IBDV根除计划创造了技术条件。
本发明试剂盒可以鉴别基因工程亚单位疫苗免疫与野毒感染鸡产生抗体。本发明试剂盒用于鸡传染性法氏囊病间接ELISA试验，用于鸡传染性法氏囊病抗体的血清学诊断、现地疫情监测、流行病学调查等。
本发明的间接ELISA试剂盒具有很高的敏感性，在鸡体感染病毒后第5天即可检出抗体，与琼扩诊断方法的检出时间相同，间接ELISA方法检测抗体持续期相对琼扩方法时间长，间接ELISA方法可以很方便的进行大量样品的检测，并且整个实验操作过程所用时间短于琼扩诊断，相对更为快速。本发明试剂盒所用包被抗原是生物安全性很高的亚单位蛋白，不存在散毒危险。可以在实际临床工作中得到更为广泛的应用。
附图说明
图1VP3基因PCR扩增结果。
1.VP3基因的PCR产物；2.阴性对照；3.Marker。
图2重组表达质粒pPROVP3的PCR鉴定。
M.DL2000 Marker；1.阳性对照(PA质粒)；2.阴性对照；3.4.重组表达质粒VP3/PA PCR产物。
图3VP3/PA推导的氨基酸序列与vvIBDV-GX等株的比较。
图4重组融合蛋白的SDS-PAGE检测。
1.pPROEX-HTa转化DH5α；2.VP3/PA转化DH5α(加IPTG诱导前)；3.VP3/PA转化DH5α(加IPTG诱导4h)；4.超声波裂解的沉淀(包涵体)；5.超声波裂解的上清；M.蛋白Marker。
图5重组融合蛋白的Western blot检测。
M.蛋白Marker；1.重组融合蛋白；2.阴性对照(插入空载体诱导菌株)。
图6抗原最适包被浓度和血清最适稀释度的确定试验结果。
图7鉴别诊断试验结果。
图8竞争抑制性试验结果。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
[实施例1]鸡传染性法氏囊病毒重组VP3蛋白的制备
1、试验材料
1.1病毒 vvIBDV-Gx株由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽免疫抑制病课题组分离、鉴定及保存。
1.2菌株与质粒 大肠杆菌E.coli DH5α由本实验室保存，表达载体pPROEX-HTa购自美国Invitrogen公司。
1.3工具酶与主要试剂 Ex Taq DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRI和HindIII、一步法反转录PCR(RT-PCR)试剂盒购自大连宝生物工程公司；邻苯二胺及胶回收试剂盒购于上海华舜生物工程有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG购自美国Sigma公司；其它试剂为从商业公司购买的分析纯产品。
1.4试验用血清及动物 鸡传染性法氏囊病标准阳性血清、鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白标准阳性血清均由本实验室用SPF鸡制备，标准阴性血清来自哈尔滨兽医研究所实验动物中心SPF鸡血清。
2试验方法
2.1VP3基因RT-PCR扩增
取感染IBDV-Gx病毒鸡法氏囊组织100mg，冻融三次后，剪碎研磨，补加TE(pH8.0)至445μl，加50μl 10％SDS，5μl蛋白酶K(100mg/ml)，56℃孵育4h。加等体积的酚(pH4.5)、氯仿抽提两次，等体积的氯仿抽提一次。移上清到另一1.5ml离心管，加1/10体积的NaAc(3M，pH5.2)、2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀2h。4℃、12000RPM离心10min，弃上清，用75％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。加入50μl TE(pH8.0)溶解RNA。以Gx(AY444873)序列为参照，用DNASTAR软件对IBDV VP3限制性内切酶位点、ORF及模拟表达VP3蛋白抗原性分析，选择抗原表位较丰富的2382bp-3152bp(SEQ IDNO：1)，设计并合成了一对引物分别含有EcoRI和HindIII酶切位点：
PF：5′GAC GAA TTC ATG GCC GCT TCA GAG TTC A-3′
PR：5′CCA AAG CTT TCA CTC AAG GTC CTC ATC A-3′；
用一步法RT-PCR试剂盒，取1μg RNA作为RT-PCR模板，进行VP3基因的扩增。扩增条件为：42℃反转录60min；95℃预变性5min；95℃变性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，30个循环；最后72℃延伸10min。经RT-PCR扩增，得到了一条约800bp片段(见图1)，与预期大小一致。
2.2表达载体pPROVP3的构建
将PCR产物用胶回收试剂盒胶回收后，与原核表达载体pPROEX-HTa，分别用限制性内切酶进行消化，将回收后的片段和载体质粒pPROEX-HTa以摩尔比3∶1混匀，用T4DNA连接酶，16℃过夜连接，连接产物转化DH5α感受态。随机挑取一些菌落，于含氨苄青霉素的LB中37℃培养过夜后小量提取质粒，经双酶切和PCR鉴定(PCR鉴定结果见图2。PCR扩增获得了800bp左右的片段，说明插入片断为目的基因VP3片段)，并测序鉴定(上海Invitrogen公司)，确定阳性菌株。将所构建的重组表达载体命名pPROVP3。根据pPROVP3重组表达质粒测序结果，推导出的氨基酸序列，与vvIBDV-GX株等进行了比较，结果本试验所克隆表达的片段与IBDV-G株完全一致(除了目的片段两端的载体自身氨基酸外)参见图3。
2.3诱导表达
将测序正确的阳性重组菌30μl接种至3ml的LB培养液(含100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃振摇过夜。取过夜培养物100μl接种于10ml的LB培养液(含100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃剧烈振摇至OD590为0.5～1.0时，取1ml菌液作为0h对照，余下的菌液加入IPTG至终浓度为0.6mM，37℃诱导表达，4h后收菌，其中取出1ml菌液，以12000RPM离心2min，余下菌液做超声波裂解，以12000RPM离心10min分别收集上清和沉淀，同时用未诱导的菌液作为阴性对照。收集的菌液用1ml pH7.4的PBS重悬沉淀，12000RPM离心2min，用100μl pH7.4的PBS悬浮，加入等体积的2×SDS上样buffer，混匀，水浴煮沸5min，用12％的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)进行电泳。电泳显示，重组表达质粒产生了约33kDa的蛋白带(图4)，与由核苷酸序列推导的蛋白相对分子质量大小相符进一步说明表达产物为VP3融合蛋白，其中VP3蛋白相对分子质量为29kDa。经薄层扫描分析，目的蛋白的表达量占细菌总蛋白量的33.9％。超声波裂解表明蛋白以包涵体形式存在。另外在目的条带下方还有一条约32kDa的较小条带。
2.4Western blot分析
将SDS-PAGE电泳的蛋白带转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，用含5％脱脂乳的PBST封闭，以vvIBDV-G株高免血清为一抗(1∶500稀释)，Sigma公司HRP标记的兔抗鸡IgG为二抗，DAB显色。结果显示，表达产物能被IBDV阳性血清所识别，证明表达产物具有良好的反应原性，而目的条带下方的较小条带不与IBDV阳性血清反应(见图5)。
2.5重组VP3蛋白的纯化
利用大肠杆菌pPROE-HTa表达载体融合表达了IBDV的VP3蛋白，其羧基端含有6个组氨酸标签。按Amersham公司HisTrap kit说明书提供的一般策略，进行蛋白纯化，用紫外分光光度计测定蛋白浓度。用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释成100μg/ml后，保存于-20℃冰箱，留作实施例2的ELISA抗原和实施例3制备试剂盒使用。
[实施例2]应用本发明重组VP3蛋白在建立鸡传染性法氏囊病间接ELISA诊断方法中的应用
一、试验材料
1、包被抗原：实施例1所纯化的重组VP3蛋白。
2、试验用血清及动物：鸡传染性法氏囊病标准阳性血清、鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白标准阳性血清均由本发明人按照常规方法用SPF鸡制备，标准阴性血清购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心SPF鸡血清。
二、试验方法
试验方法采用间接ELISA方法，检测鸡传染性法氏囊病病毒VP2抗血清12份，以IBDV全病毒包被板进行间接ELISA试验对照。
按常规方法在酶标板上进行。将本发明重组VP3蛋白用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释后，包被反应板4℃过夜，翌日取出用封闭剂封闭1h，然后加入待检血清，37℃反应1h取出加入适当浓度的二抗酶结合物，1h后取出洗涤，然后加入底物显色液。37℃避光反应10-20min后，用2M H2SO4终止反应。酶标仪测定OD492nm值。试验设标准阳性、标准阴性血清对照。
本试验同时进行了摸索下述间接ELISA诊断方法的最佳条件的一系列试验：抗原最佳浓度和血清最佳稀释度；最佳封闭剂和最佳封闭时间；酶标抗体最佳作用时间；一抗最佳作用时间和底物最佳显色时间；经过了一系列的试验摸索，最终确立了上述试验条件的最佳值，具体如下：
1、最佳抗原浓度和最佳血清稀释度的确定：用不同浓度的本发明VP3重组蛋白包被酶标板后，用不同倍数稀释的阳性血清与之作用，以方阵滴定法确定抗原浓度。由图6结果可见，抗原包被浓度为2-4μg/ml，血清1∶100-1∶200稀释时，阳性血清OD值接近1.0，阴性血清OD值小于0.2。一般的，酶标仪在检测OD值为1.0左右时误差最小，反应最灵敏。此外，还要考虑节省纯化的VP3蛋白，据此，确定2μg/ml为抗原的最适包被浓度，1∶100为血清最适稀释度。
2、最佳封闭剂和最佳封闭时间的选择：本试验分别用1％马血清、0.5％马血清、5％牛血清、5％脱脂乳、3％脱脂乳加PBST作为封闭剂，每孔加100μl，作用时间分别为60min、90min、120min，进行ELISA试验，选择最适的封闭液。
试验结果表明，封闭时间为60min，效果要好于90min和120min的封闭效果，其中用0.5％马血清的封闭效果最好，能有效的封闭在体表面的残留活性部位，试验特异性高，结果令人满意。所以本试验确立用0.5％马血清的PBS(0.01M、pH7.4，PBS的具体配制方法：NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO4·12H2O2.9g；KH2PO4 0.5g，加水溶解后定容至1升)缓冲液作为试验用封闭液，封闭时间为60min。
3、酶标抗体最佳作用时间试验：将标准阳性、阴性血清作1∶100稀释，酶标抗体作1∶5000稀释，分别作用30min、60min、90min和120min，按间接ELISA程序测定。当酶标抗体作用60min时，P/N值最大。因此，本试验确定60min为酶标抗体最适作用时间。
4、一抗最佳作用时间和底物最佳显色时间：一抗作用时间分别为37℃，30min、60min、90min、120min；底物显色时间：分别为5min、10min、15min、20min、25min。其它按已确定的ELISA程序。由ELISA检测结果可见，一抗最佳作用时间60min；底物显色时间为10-15min，P/N值最大。因此，确定一抗最佳作用时间为60min，底物最适作用时间为15min。
5、间接ELISA判定标准的确定
92份IBDV阴性血清样品中，在本试验确定的上述最佳条件下进行间接ELISA测定。
S/P的计算公式为：S/P＝(样品OD值-标准阴性OD值)/(标准阳性OD值-标准阴性OD值)。这些血清数据经统计学分析，样品S/P的平均值X＝0.033，标准差S＝0.205，取置信区间上限X+3S≈0.24，作为IBDV阳性血清的下限；X+2S≈0.17，定为可疑界限。根据统计学原理，S/P值≥X+3S时，可以在99.7％的水平上判定为阳性。因此，得到间接ELISA判定标准，即S/P值≥0.24者判为阳性，S/P值≤0.17者判为阴性，介于二者之间者判为可疑。标准阳性阴性血清之差小于0.5时，试验无效。
三、诊断结果
对于试验用的12份血清，使用全病毒包被进行间接ELISA试验，测得的OD值根据已有标准判定均为阳性。使用重组VP3蛋白包被进行间接ELISA试验，测得的OD值则均为阴性(本次试验中标准阳性OD值为1.25，标准阴性OD值为0.075，根据建立的判定标准S/P≤0.17为阴性，本次试验中样品的S/P值均小于0.17(图7)。
试验结果表明，将本发明重组VP3蛋白用作包被抗原，采用间接ELISA方法可以方便、快速、准确的诊断出血清样品中鸡传染性法氏囊病病毒抗体；本试验所建立的间接ELISA诊断鸡传染性法氏囊病病毒方法，具有敏感性强、特异性高、重复性好等优点，适合于临床检测的应用。
实施例3 本发明间接ELISA诊断试剂盒的制备
1、包被有抗原的酶标板的制备
1.1抗原的制备：采用实施例1所纯化的重组VP3蛋白。
1.2包被：抗原的最终浓度为2μg/ml，每孔包被量为100μl，盖上包被微孔板，置于4℃冰箱中孵育过夜；
1.3洗涤：孵育2h后，弃去酶标板内的包被液，开始洗涤(洗涤液的组成及配制为：0.01M、pH7.4的PBS加0.5％ Tween 20)，每孔洗涤3次，时间间隔为每次3min，洗涤完后，将包被板在吸水纸上扣干。
1.4封闭：用封闭剂进行封闭(封闭剂为0.5％马血清的PBS)，封闭完成后，盖上包被微孔板，置于37℃水浴箱中孵育1h。
1.5洗涤：封闭结束后，弃去酶标板内的封闭液，将包被酶标板洗涤，每孔洗涤3次，时间间隔为每次3分钟，洗涤完后，将包被板在吸水纸上扣干，将经过上述处理后的包被酶标板，盖上盖子，置于37℃烘箱中干燥30min。
1.6保存：-20℃中保存，有效期6个月。
2、阴性血清的制备
2.1制造用动物 选取6～8周龄的SPF鸡群。
2.2血清制造 无菌条件下，采集SPF鸡血液，分离血清，用0.22μm滤膜过滤，在无菌条件下每瓶分装1ml，保存于-20℃冰箱。
2.3阴性对照血清检验
2.3.1物理性状 液体时为淡黄色或淡红色清亮液体。
2.3.2无菌检验 按标准进行，应无菌生长。
2.4保存 制品在-20℃保存，有效期为1年。
3、阳性血清的制备及检验
3.1制造动物 选用6～8周龄的SPF鸡群，在负压隔离器中饲养。
3.2免疫原 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的以国内超强毒株(vvIBDV-G)鸡胚成纤维细胞(CEF)适应株病毒制备的鸡传染性法氏囊病灭活疫苗。
3.3免疫接种方法及程序 通过肌肉注射途径分3次接种疫苗0.5ml、0.5ml和1ml，每次间隔14日，最后一次接种后14天，采血制备血清测定效价。
3.3效价测定 用0.01M的磷酸盐缓冲液(PBST，pH7.4，含0.05％Tween-20)将标准阳性血清和阴性血清作1∶100，进行ELISA测定，标准阳性血清应S/P值≥0.24。
3.4分装 对血清抗体效价合格的免疫鸡无菌采血，分离血清。用0.22μm滤膜过滤，在无菌条件下每瓶分装1ml，保存于-20℃冰箱。
3.5阳性对照血清检验
3.5.1物理性状 为淡黄色或淡红色清亮液体。
3.5.2无菌检验 按标准进行，应无菌生长。
3.6保存 制品在-20℃保存，有效期为1年。
4、酶标抗体结合物制备及检验
4.1酶标抗体结合物制备
4.1.1酶结合物 为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鸡IgG，购自美国SIGMA公司。
4.1.2酶结合物稀释液 0.01M的磷酸盐缓冲液(pH7.4)。
4.1.3酶结合物使用液的制备 按1∶5000用酶结合物稀释液稀释，用0.22μm滤膜过滤。
4.2酶标抗体结合物的检验
4.2.1物理性状 应为澄清、淡黄色溶液，无臭、无味，无沉淀物。
4.2.2无菌检验 按标准301页进行，应无菌生长。
4.3保存 制品在-20℃保存，有效期为1年。
5、底物显色液的制备及检验
5.1底物显色液的制备 往容器内加入700ml无菌去离子水，然后依次加入5.1g柠檬酸、18.4g Na2HPO4，0.4g邻苯二胺(OPD)，混合溶解后，用无菌去离子水定容至1L，用0.22μm滤膜过滤。-20℃避光保存。
5.2物理性状 应为澄清、淡黄色溶液，无沉淀物。
5.3无菌检验 按标准进行，应无菌生长。
5.4保存 -20℃避光保存，有效期为1年。
6、样品稀释液的制备及检验
6.1样品稀释液的制备 在容器内加入总体积90％的灭菌去离子水，依次加入60g NaH2PO4、4g Na2HPO4.2H2O、50g NaCl、6g庆大霉素，在18～25℃下搅拌使各组分充分溶解并混合均匀。测量溶液的酸碱度，用适量0.1M盐酸或0.1M氢氧化钠溶液调整pH值至7.1～7.3。用灭菌去离子水定容至30L，0.22μm滤膜滤过。
6.2样本稀释液的检验
6.2.1物理性状 应为澄清的金黄色溶液，无臭、无味、无沉淀物。
6.2.2pH值应为7.1～7.3。
6.2.3无菌检验 按标准301页进行，应无菌生长。
6.3保存 在室温下保存，使用期为2年。
7、洗液的制备及检验
7.1洗液的制备 在容器内加入总体积80％的灭菌去离子水，依次加入60gNaH2PO4、300g Na2HPO4.2H2O、100gNaCl及15ml吐温(Tween-20)，充分搅拌至完全溶解。用灭菌去离子水定容至30L。0.22μm滤膜滤过。无菌分装，每瓶120ml。
7.2洗液的检验
7.2.1物理性状 应为澄清、无色、无臭、无味的溶液，无沉淀物。
7.2.2pH值应为7.0～7.2。
7.2.3无菌检验 按标准301页进行，应无菌生长。
7.3保存 在室温下保存，使用期为2年。
8、终止液的制备及检验
8.1终止液的制备 用去离子水将硫酸稀释成2M，即为终止液。
8.2终止液的检验
8.2.1物理性状 应为澄清、无色溶液。
8.2.2无菌检验 按标准进行，应无菌生长。
8.3保存 在室温下保存，使用期为2年。
9试剂盒的组装及检验
9.1组装
将检验合格的各试剂盒组份按表1组装成试剂盒。
表1
| 试剂盒组分 | 规格 | 数量 |
| 抗原包被板 | 96孔/块 | 5块 |
| 样品稀释液 | 120ml/瓶 | 1瓶 |
| 洗液 | 120ml/瓶 | 1瓶 |
| 标准阳性血清 | 1ml/瓶 | 1瓶 |
| 标准阴性血清 | 1ml/瓶 | 1瓶 |
| 酶标抗体结合物 | 70ml/瓶 | 1瓶 |
| 显色液 | 70ml/瓶 | 1瓶 |
| 终止液 | 40ml/瓶 | 1瓶 |
| 使用说明书 | 份 | 1 |
将每支塑料瓶插入泡沫垫各个孔中，将泡沫垫装入中纸盒中，在上面放上经真空包装的酶标板，阴性血清、阳性血清和抗体稀释液，浓缩的洗液，置于包装盒的相应位置中。放入说明书。
9.2成品检验
9.2.1物理性状 逐盒检验，应洁净，密封好。盒中各组分应齐全，无破损，无渗漏，各个试剂标签完好、清楚。其中酶标板应为真空密封，打开后为无色透明。阳性与阴性血清为淡黄色或微红色液体。底物液装在棕色瓶中。其他溶液为无色透明的液体，无沉淀，无异物。
9.2.2无菌检验 试剂盒内各组分按标准301页检验应无细菌、霉菌污染。
9.2.3特异性检验
9.2.3.1试剂盒内的阴性血清按试剂盒使用的说明检测后，结果应为阴性。
9.2.3.2试剂盒内的阳性血清按试剂盒使用的说明检测后，结果应为阳性。
9.2.4效价测定 抗原包被板的效价测定用0.01M的磷酸盐缓冲液(PBST，pH7.4，含0.5％Tween-20)将标准阳性血清和阴性血清作1∶100稀释，进行ELISA测定，标准阳性血清应S/P值≥0.24。
9.2.5稀释液 按8.5.3.1检测，结果为阴性。
10、本试剂盒使用说明与判定
10.1使用说明
ELISA板加入用样品稀释液稀释的待检血清及标准阳性、阴性血清，37℃孵育1h后取出洗涤，加入酶结合物，37℃孵育1h后取出洗涤，然后加入显色液，37℃避光反应10～20min后，用终止液终止反应。酶标仪测定OD492nm。
10.2结果判定 S/P值≥0.24者判为阳性，S/P值≤0.17者判为阴性，介于二者之间者判为可疑，标准阳性阴性血清之差小于0.5时，试验无效。S/P的计算公式为：S/P＝(样品OD值-标准阴性OD值)/(标准阳性OD值-标准阴性OD值)。
10.2特异性检验
用本试剂盒检验鸡新城疫(ND)；鸡传支(IBD)；禽流感(AI)；鸡马立克(MD)；禽白血病(AL-J)；禽贫血病(CIA)；鸡白痢(PD)7种疫病阳性血清不发生反应。
10.3鉴别诊断
本试剂盒配合全病毒包被抗原间接ELISA方法，进行间接ELISA试验检测鸡传染性法氏囊病重组VP2蛋白基因工程亚单位疫苗免疫鸡血清为阴性，全病毒包被抗原间接ELISA检测相同血清为阳性。本试剂盒可以鉴别基因工程亚单位疫苗免疫与野毒感染鸡产生抗体。
11、试剂盒贮藏 本试剂盒-20℃保存，有效期6个月。
试验例1 本发明重组VP3蛋白鉴别诊断试验
一、试验材料
1、包被抗原：1)实施例1所纯化的重组VP3蛋白；2)鸡传染性法氏囊病全病毒蛋白(购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心)。
2、试验用血清及动物：鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白标准阳性血清由本发明人按照常规方法用SPF鸡制备，标准阴性血清购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心SPF鸡血清。
二、试验方法
试验方法采用间接ELISA方法，检测鸡传染性法氏囊病病毒VP2抗血清35份，以IBDV全病毒包被板进行间接ELISA试验对照。
按常规方法在酶标板上进行(同实施例2)。将本发明重组VP3蛋白用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释后，包被反应板4℃过夜，翌日取出用封闭剂封闭1h(同实施例2)，然后加入待检血清(鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白标准阳性血清)，37℃反应1h取出加入适当浓度的二抗酶结合物(同实施例2)，1h后取出洗涤，然后加入底物显色液(同实施例2)。37℃避光反应10-20min后，用2M H2SO4终止反应。酶标仪测定OD492nm值。
试验结果见表2。
表2 本发明重组VP3蛋白鉴别诊断试验
| 全病毒包被 | VP3包被 | |||||
| 样品编号 | OD值 | 判定 | 备注 | OD值 | 判定 | 备注 |
| 1 | 0.357 | + | 0.134 | - | ||
| 2 | 0.188 | -/+ | 复检为阳性 | 0.055 | - | |
| 3 | 0.403 | + | 0.136 | - | ||
| 4 | 0.666 | + | 0.141 | - | ||
| 5 | 0.510 | + | 0.117 | - | ||
| 6 | 0.342 | + | 0.133 | - | ||
| 7 | 0.469 | + | 0.154 | - | ||
| 8 | 0.393 | + | 0.151 | - | ||
| 9 | 0.797 | + | 0.160 | - | ||
| 10 | 0.956 | + | 0.230 | -/+ | 复检为阴性 | |
| 11 | 0.476 | + | 0.168 | - | ||
| 12 | 0.585 | + | 0.170 | - | ||
| 13 | 0.555 | + | 0.165 | - | ||
| 14 | 0.537 | + | 0.158 | - | ||
| 15 | 0.477 | + | 0.165 | - | ||
| 16 | 0.501 | + | 0.156 | - | ||
| 17 | 0.737 | + | 0.127 | - | ||
| 18 | 0.516 | + | 0.133 | - | ||
| 19 | 0.410 | + | 0.159 | - | ||
| 20 | 0.575 | + | 0.141 | - | ||
| 21 | 0.609 | + | 0.092 | - | ||
| 22 | 0.594 | + | 0.129 | - | ||
| 23 | 0.652 | + | 0.105 | - | ||
| 24 | 0.606 | + | 0.212 | -/+ | 复检为阴性 | |
| 25 | 0.418 | + | 0.208 | -/+ | 复检为阴性 | |
| 26 | 0.641 | + | 0.167 | - | ||
| 27 | 0.412 | + | 0.125 | - | ||
| 28 | 1.083 | + | 0.221 | - | ||
| 29 | 0.450 | + | 0.157 | - | ||
| 30 | 0.639 | + | 0.147 | - | ||
| 31 | 0.934 | + | 0.137 | - | ||
| 32 | 0.608 | + | 0.111 | - | ||
| 33 | 0.183 | -/+ | 复检为阳性 | 0.120 | - | |
| 34 | 0.564 | + | 0.132 | |||
| 35 | 0.465 | + | 0.128 | |||
试验结果表明，将本发明重组VP3蛋白用作包被抗原，采用间接ELISA方法，可以准确的鉴别诊断出鸡传染性法氏囊病病毒野毒感染和VP2亚单位疫苗免疫。
试验例1 本发明间接ELISA诊断试剂盒的敏感性试验
一、1试验材料与方法
1.1试验用病毒
鸡传染性法氏囊病病毒Gt株(IBDV-Gt)，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所鉴定、保管和供应，毒价为106.25EID50/0.2ml。
1.2试验用鸡
6-8周龄SPF级白来航鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。实验期间饲养于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心感染室的负压隔离器中。
1.3检测用试剂盒
本发明实施例3所制备的诊断试剂盒。
1.4鸡传染性法氏囊病琼扩抗原
购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所维科生物技术公司，批号200305。
1.5鸡传染性法氏囊病阳性血清
购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所维科生物技术公司生产，批号200305。
二、人工感染试验
感染时每只鸡采用103EID50的剂量0.2ml滴鼻、点眼接种，共接种50只，感染后的第3、5、7、14和21天，21天以后每隔10天，直至180天，每次采血20只，分离血清，用于琼扩试验(AGP)和间接ELISA试验。
三、试验结果
感染后不同时间采血，分离血清，检测琼扩抗体和ELISA抗体阳性率。结果见表3。
表3 人工接种鸡的抗体阳性检出率
| 时间 | 3 | 5 | 7 | 14 | 21 | 40 | 60 | 80 | 100 | 110 | 120 | 130 | 140 | 150 | 160 | 170 | 180 |
| ELISA | 0/20 | 2/20 | 4/20 | 20/20 | 20/20 | 20/20 | 20/20 | 20/20 | 20/20 | 20/20 | 18/20 | 18/20 | 18/20 | 18/20 | 16/20 | 10/20 | 8/20 |
| AGP | 0/20 | 0/20 | 0/20 | 8/20 | 18/20 | 20/20 | 20/20 | 20/20 | 19/20 | 18/20 | 18/20 | 18/20 | 16/20 | 15/20 | 6/20 | 0/20 | 0/20 |
从试验结果可以看出：感染后的第3、5、7、14、18和21天间接ELISA诊断方法检出率是0、10％、20％、100％、100％，琼扩诊断方法检出率分别是0、0、0、40％、90％，ELISA检出率高于AGP；感染100天后，AGP检出率开始下降，ELISA检出率降低幅度较为缓慢。
从上面结果可以看出，本发明间接ELISA试剂盒具有很高的敏感性，在鸡体感染病毒后第5天即可检出抗体，比琼扩诊断方法的检出时间早。间接ELISA方法检测抗体持续期相对琼扩方法时间长，间接ELISA方法可以很方便的进行大量样品的检测，并且整个实验操作过程所用时间短于琼扩诊断，相对更为快速。本发明试剂盒所用包被抗原是生物安全性很高的亚单位蛋白，不存在散毒危险，可以在实际临床工作中得到更为广泛的应用。
试验例2 本发明间接ELISA诊断试剂盒的特异性试验
1、试验材料和方法
1.1鸡传染性法氏囊病、鸡传染性贫血、禽白血病(AL)-J亚群标准阳性血清均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室免疫抑制病课题组制备和保存。鸡马立克氏病(MD)、鸡新城疫(ND)、禽流感(AI)、鸡传染性支气管炎病(IB)、鸡白痢(PD)的阳性血清均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所维科生物技术公司提供。
1.2鸡传染性法氏囊病重组VP3蛋白间接ELISA诊断试剂盒：本发明实施例3所制备。
1.3间接ELISA操作步骤：按照实施例2所确定的最佳条件来进行。
1.4阻断实验 又称竞争抑制试验，将阳性血清作1∶25～1∶51200共12个梯度，倍比稀释，每个稀释度加入等量的IBDV阳性血清(1∶100稀释，中和试验效价为107)，于37℃作用60min，进行间接ELISA测定，同时设立对照，比较结果。
1.5交叉试验 在同一条件下，将鸡新城疫(ND)；鸡传支(IBD)；禽流感(AI)；鸡马立克(MD)；禽白血病(AL-J)；鸡传染性贫血(CIA)；鸡白痢(PD)阳性血清以1∶100稀释，进行间接ELISA程序测定。
2试验结果
2.1竞争抑制试验 不做任何处理的阳性血清显示了较高的OD值，当把IBDV阳性血清稀释到1∶6400倍时，仍然呈阳性反应，而IBDV全病毒中和试验用抗原处理的阳性血清OD值呈明显下降，1∶6400倍稀释后呈明显的阴性结果(图8)。
2.2交叉试验 对7种其他疾病的阳性血清按间接ELISA程序测定，S/P值均小于0.07(表4)，为阴性，即没有交叉反应性。
表4 交叉试验结果
| 血清 | ND | IDB | AI | MD | AL-J | CIA | PD | IBDV | SPF |
| OD值 | 0.14±0.012 | 0.15±0.007 | 0.13±0.013 | 0.12±0.006 | 0.10±0.008 | 0.14±0.013 | 0.15±0.018 | 1.02±0.005 | 0.1±0.011 |
| S/P值 | 0.053 | 0.063 | 0.039 | 0.029 | 0.005 | 0.044 | 0.064 |
试验结果说明，本发明间接ELISA诊断试剂盒具有较高的特异性。
试验例3 本发明间接ELISA诊断试剂盒批间和批内的重复性研究试验
为考察利用本发明重组蛋白制备的间接ELISA诊断试剂盒在使用过程中检测效果的稳定性和可重复性，特进行以下试验。
1材料和方法
1.1鸡传染性法氏囊病重组VP3蛋白间接ELISA试剂盒 分别按照本发明实施例3的方法制备成4批。
1.2鸡传染性法氏囊病标准阳性血清 共5份，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所免疫抑制病实验室研制并保存，标准阴性血清为SPF鸡血清。
1.3批内重复性试验 用同一批制备的重组抗原试剂盒，取5份不同抗体水平的IBDV阳性血清，在同一时间，同一条件，同一批试验中按间接ELISA程序测定，每份血样平行做5孔，结果进行统计学分析(见表5)。
表5
| 血清 | 1号 | 2号 | 3号 | 4号 | 5号 | 阴性 |
| OD值X均值SC.V％ | 1.253±0021.14±0131.09±0111.23±0091.15±011.1720.0544.60％ | 0.461±0140.404±0150.435±0130.39±0170.4±0110.4180.02646.30％ | 0.344±0050.382±0080.37±010.375±0190.335±0040.3610.025.54％ | 0.729±0050.71±0040.69±0060.73±0110.713±0120.7140.01411.97％. | 0.957±0120.943±0130.92±0161.023±0130.89±0090.9460.04364.61％ | 0.076±0020.07±0060.069±0120.068±0090.073±0030.0600.0057.12％ |
1.4批间重复性试验
1.4.1用同一批制备的试剂盒，取5份不同抗体水平的阳性血清和1份阴性血清，在8个不同时间按间接ELISA程序测定，每份血样平行做2孔，结果进行统计学分析。
1.4.2取4批不同批次制备的本发明重组抗原试剂盒，在相同条件下检测4份不同抗体水平的阳性血清和1份阴性血清，每份血样重复2孔，结果进行统计学分析。
2.1批内重复性试验 取抗体水平不同的5份阳性血清和一份阴性血清，在同一批次实验中，按间接ELISA程序测定不同孔径的OD值，结果进行统计学分析，其变异系数位于1.97％～7.12％之间，小于10％。说明同一样品在同一批试验中变异程度很小，具有较好的重复性。见表3。
2.2批间重复性试验
2.2.1取抗体水平不同的5份阳性血清在8个不同的实验日按间接ELISA程序测定其OD值，结果进行统计学分析，其变异系数位于2.00％～11.09％之间，小于15％，说明同一样品在不同批次试验中变异程度很小，具有较好的重复性。见表6。
表6 批间重复性结果
| 血清号 | 日期 | X均值 | S | C.V％ | |||||||
| 11.10 | 11.15 | 11.18 | 11.25 | 12.06 | 12.10 | 12.15 | 12.19 | ||||
| 12345阴性 | 1.1210.4500.3150.7121.0030.075 | 1.2190.4320.3550.6981.120.059 | 1.0210.3980.3340.6750.9850.068 | 0.9840.4150.3260.7060.9760.062 | 1.2510.4430.3010.7250.8570.070 | 0.9970.4420.3050.7180.9530.055 | 1.1750.3850.2960.7330.8340.063 | 0.8920.4260.3140.6880.9120.072 | 1.0810.4230.3180.7060.9550.066 | 0.1200.0220.0200.0140.0840.006 | 11.09％5.27％6.28％2.00％8.82％9.60％ |
2.2.2用4批不同的本发明重组抗原包被的反应板，在相同条件下检测4份阳性血清和1份阴性血清，重复性试验结果经统计学分析，S/P值的变异系数在2.2-11.3％之间(见表7)，小于15％，说明同一样品在不同批次抗原试验中变异程度很小，具有较好的重复性。
表7 批间重复性试验
| 血清号 | 试剂盒批次 | X | S | C.V％ | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | ||||
| S/P值 | |||||||
| 1234阴性 | 0.480.841.090.990.15 | 0.440.831.070.980.16 | 0.420.821.10.920.17 | 0.480.831.080.960.19 | 0.4520.8321.0850.9620.167 | 0.0210.030.0240.0430.019 | 4.63.62.24.511.3 |
试验例3 本发明间接ELISA诊断试剂盒诊断方法符合率试验
本试验主要是考察鸡传染性法氏囊病重组VP3蛋白间接ELISA诊断试剂盒与鸡传染性法氏囊病全病毒琼脂扩散试验和鸡传染性法氏囊病的其他常用诊断方法的检测差异性。
1试验材料和试验方法
1.1鸡传染性法氏囊病全病毒抗原 鸡传染性法氏囊病抗原由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室免疫抑制病课题组试制生产，其琼脂扩散价为2。
1.2间接免疫荧光试验用病毒 鸡传染性法氏囊病病毒Gt株(IBDV-Gt)暂由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所鉴定、保管和供应。毒价为4.0×108PFU/ml。
1.3鸡传染性法氏囊病病毒阳性血清以及阴性血清 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室免疫抑制病课题组制备并提供。
1.4禽类其他疫病标准阳性血清如新城疫等7种疾病标准阳性血清均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所维科公司，共计14份(每种疫病血清两份)。
1.5免疫血清 实验室人工免疫SPF鸡，在免疫后不同时间采集分离免疫鸡的血清，共计200份。
1.6待检血清 一共330份，分别采自于哈尔滨地区110份，大庆50份，青岛25份，河北45份，河南40份，北京33份，山东27份。
1.7全病毒间接免疫荧光试验，琼脂扩散试验均按常规方法进行。
2试验结果
2.1琼脂扩散试验检测结果 用琼脂扩散试验检测所有的血清样品，其中阴性血清为阴性，阳性血清检测为阳性，其他7种疫病阳性血清检测结果为阴性，免疫鸡血清和现地血清中检测阳性的分别是154份和292份，具体结果见表6。
2.2间接免疫荧光试验检测结果 用全病毒抗原建立的间接ELISA方法检测所有血清样品，其中所有阴性血清均为阴性结果；标准阳性血清为阳性结果；7种其他疫病阳性血清的检测结果也全为阴性；免疫鸡血清中检出193份血清阳性，现地血清中检出312份为阳性，具体结果见表8。
2.3重组蛋白间接ELISA诊断试剂盒检测结果 用间接ELISA方法检测所有的血清样品，其中阴性血清均为阴性，阳性血清检测为阳性，其他7种疫病阳性血清检测结果全为阴性，免疫鸡血清检测阳性的血清样品有159份；现地血清样品中有270份为阳性，具体结果见表8。
对总共710份鸡血清样品进行检测，用琼脂扩散实验检出446份血清样品阳性，用间接免疫荧光试验检出505份血清样品为阳性；用间接ELISA方法检出429份血清样品为阳性。其中与琼扩方法的符合率为96.2％(421/446)，与间接免疫荧光试验方法的符合率为83.4％(421/505)，从上面的实验结果可以看出，间接免疫荧光试验方法敏感性较高，琼扩试验次之，重组抗原间接ELISA方法和琼扩方法检出率近似。但是对于群体的大量样品检测来说，重组抗原间接ELISA诊断方法更为适宜。
表8 重组抗原间接ELISA方法和琼脂扩散试验及间接免疫荧光试验对血清样品的比较性检测
| 血清样品 | 羽份 | 间接ELISA | 琼脂扩散试验 | 间接免疫荧光试验 |
| SPF鸡血清其他疫病标准阳性血清免疫鸡血清现地血清合计 | 15014200330710 | 00159270429 | 00154292446 | 00193312505 |
注：表中试验数据均表示的为阳性数据。
间接免疫荧光试验需要荧光显微镜设备限制了该方法的使用，琼扩试验耗时较长不太适合紧急诊断的需要。因此本发明重组抗原间接ELISA诊断方法将是鸡传染性法氏囊病血清学监测的主要手段之一。
SEQUENCE LISTING
<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120>鸡传染性法氏囊病毒VP3基因、其表达载体、所表达的重组蛋白及由该重组蛋白所制备的试剂盒
<130>22
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>780
<212>DNA
<213>鸡传染性法氏囊病毒(chicken infectious busal disease virus)
<400>1
atggccgctt cagagttcaa agaaaccccc gaactcgaga gcgccgtcag agccatggaa 60
gcagcagcca acgtggaccc actgttccat tctgcgctca gtgtgttcat gtggctggaa 120
gaaaatggga ttgtgaccga catggccaac ttcgcactca gcgacccgaa cgcccatcgg 180
atgcgcaatt ttctcgcaaa cgcaccacaa gcaggcagca agtcgcaaag agccaagtac 240
gggacagcag gctacggagt ggaggcccgg ggccccactc cagaggaagc acagagggaa 300
aaagacacac ggatctcaaa gaagatggag actatgggca tctactttgc aacaccagaa 360
tgggtagcac tcaatgggca ccgggggcca agccccggcc agctgaagta ctggcagaac 420
acacgagaaa tacctgatcc aaacgaggac tacctagact acgtgcatgc agagaagagc 480
cggttggcat cagaagaaca aatcctaagg gcagctacgt cgatctacgg ggctccagga 540
caggcagagc caccccaagc cttcatagac gaagtcgcca aagtctatga aatcaaccat 600
gggcgtggcc ccaaccaaga acagatgaaa gatctgctct tgactgcgat ggagatgaag 660
catcgcaatc ccaggcgggc tccaccaaag cccaagccaa aacccaatgt tccaacacag 720
agaccccctg gtcggctggg ccgctggatc agggctgtct ctgatgagga ccttgagtga 780
<210>2
<211>259
<212>PRT
<213>鸡传染性法氏囊病毒(chicken infectious busal disease virus)
<400>2
Met Ala Ala Ser Glu Phe Lys Glu Thr Pro Glu Leu Glu Ser Ala Val
1 5 10 15
Arg Ala Met Glu Ala Ala Ala Asn Val Asp Pro Leu Phe His Ser Ala
20 25 30
Leu Ser Val Phe Met Trp Leu Glu Glu Asn Gly Ile Val Thr Asp Met
35 40 45
Ala Asn Phe Ala Leu Ser Asp Pro Asn Ala His Arg Met Arg Ash Phe
50 55 60
Leu Ala Asn Ala Pro Gln Ala Gly Ser Lys Ser Gln Arg Ala Lys Tyr
65 70 75 80
Gly Thr Ala Gly Tyr Gly Val Glu Ala Arg Gly Pro Thr Pro Glu Glu
85 90 95
Ala Gln Arg Glu Lys Asp Thr Arg Ile Ser Lvs Lvs Met Glu Thr Met
100 105 110
Gly Ile Tyr Phe Ala Thr Pro Glu Trp Val Ala Leu Asn Gly His Arg
115 120 125
Gly Pro Ser Pro Gly Gln Leu Lys Tyr Trp Gln Asn Thr Arg Glu Ile
130 135 140
Pro Asp Pro Asn Glu Asp Tyr Leu Asp Tyr Val His Ala Glu Lys Ser
145 150 155 160
Arg Leu Ala Ser Glu Glu Gln Ile Leu Arg Ala Ala Thr Ser Ile Tyr
165 170 175
Gly Ala Pro Gly Gln Ala Glu Pro Pro Gln Ala Phe Ile Asp Glu Val
180 185 190
Ala Lys Val Tyr Glu Ile Asn His Gly Arg Gly Pro Asn Gln Glu Gln
195 200 205
Met Lys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Met Glu Met Lys His Arg Asn Pro
210 215 220
Arg Arg Ala Pro Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Asn Val Pro Thr Gln
225 230 235 240
Arg Pro Pro Gly Arg Leu Gly Arg Trp Ile Arg Ala Val Ser Asp Glu
245 250 255
Asp Leu Glu
Claims (10)
1.一种鸡传染性法氏囊病毒VP3 cDNA全序列中的一段cDNA，其特征是：具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
2.含有权利要求1 SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的原核表达载体。
3.按照权利要求2的原核表达载体，其特征是：所述的原核表达载体为pPROVP3。
4.一种鸡传染性法氏囊病毒重组VP3蛋白，其特征是含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
5.一种制备权利要求4的重组蛋白的方法，包括：
用权利要求2的原核表达载体转化大肠杆菌；培养转化体，诱导重组VP3蛋白表达，回收并纯化所表达的重组VP3蛋白。
6.一种检测或诊断鸡传染性法氏囊病毒的试剂盒，该试剂盒主要由包被有抗原的酶标板，样品稀释液、酶标抗体，底物显色液、终止液、标准阳性血清、标准阴性血清组成，其特征是：所述的用于包被酶标板的抗原为权利要求4的重组VP3蛋白。
7.按照权利要求6的试剂盒，其特征是：所述的标准阳性血清为鸡传染性法氏囊病标准阳性血清；所述的标准阴性血清为鸡标准阴性血清；所述的酶标抗体结合物为辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG；所述的底物显色液为邻苯二胺。
8.权利要求4的重组VP3蛋白在体外检测或诊断鸡传染性法氏囊病毒中的应用，包括用抗原包被酶标板，用封闭剂封闭，再依次加入待检血清、酶标抗体结合物、底物显色液、终止液、测定OD值等步骤，其特征是：用浓度为2～4μg/ml的重组VP3蛋白包被酶标板；所述的封闭剂选自1％马血清加PBS、0.5％马血清加PBS、5％牛血清加PBS、5％脱脂乳加PBS或3％脱脂乳加PBS，封闭时间为60分钟-120分钟；所加入待检血清的稀释度为1∶100-1∶200；底物显色液与酶标抗体结合物的作用时间为10-15分钟。
9.按照权利要求8的应用，其特征是：用2μg/ml重组IBDV VP3蛋白包被酶标板；所述的封闭剂为0.5％马血清加PBS，封闭时间为60分钟；所加入待检血清的稀释度为1∶100；待检血清与包被抗原的作用时间为60分钟，酶标抗体结合物与待检血清的作用时间为60分钟；底物显色液与酶标抗体结合物的作用时间为15分钟
10.权利要求1的鸡传染性法氏囊病毒VP3 cDNA或权利要求4的鸡传染性法氏囊病毒VP3重组蛋白在制备检测或诊断鸡传染性法氏囊病毒药物中的应用。
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