CN1861793A - 编码禽流感血凝素的基因及其植物表达载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的编码禽流感血凝素蛋白的基因NAIVHA以及该基因植物表达载体的构建、转化和表达；该基因能够在植物中高效表达，与野生型禽流感血凝素基因相比，其表达量提高了约近40倍；将所获得的转目的基因植物无论是采用直接饲喂动物、还是采用蛋白提取液或纯化的蛋白免疫动物等方式，结果均有良好的保护效果，说明转本发明基因植物具有防制禽流感的作用。

Description

编码禽流感血凝素的基因及其植物表达载体和应用

技术领域

本发明涉及一种新的禽流感基因，尤其涉及一种编码禽流感血凝素的新基因、该基因植物表达载体的构建、转化和表达以及所获得的转基因植物在防制禽流感中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

禽流感(Avian influenza，AI)是由正粘病毒科A型禽流感病毒(Avianinfluenza virus，AIV)所引起的禽类疾病。高致病力禽流感(High pathogenicavian influenza，HPAI)可引起鸡群100％死亡，被国际兽疫局确定为A类传染病。AIV为RNA病毒，其单股负链RNA总长为13.6Kb，由8个独立的RNA节段组成，分别编码PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS，RNA核酸片段外被螺旋排列的壳粒，主要由核蛋白构成。AIV显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁，迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，分别属于15个HA亚型和9个NA亚型。不同亚型毒株对宿主的致病力差异显著，同一亚型病毒不同分离株毒力也不完全相同，低致病力毒株还可以通过基因突变、抗原漂移和重组转变为高致病力毒株或产生能够突破宿主种间障碍的变异株。致病力的提高普遍认为是由于HA1、HA2裂解位点碱性氨基酸的插入造成的，与基因序列密切相关。目前，对养禽业危害严重的主要有H5、H7、H9亚型毒株，所有HPAIV均属于H5和H7亚型，可引起AI大规模爆发，是国际兽医防疫的重点，H9亚型一般为中低致病力，流行广泛，主要引起蛋鸡生产性能下降，免疫应答能力降低。

世界性禽流感大流行在90年代之前确定的有八次，进入90年代以来，国外禽流感的暴发频繁，1991年10月至今，公开报道发生高致病力禽流感的国家有澳大利亚(H7N3和H7N7)、巴基斯坦(H7N3)、墨西哥(H5N2)和香港(H5N1)。AIV对养禽业造成的经济损失是巨大的。1999年，从2名出现轻微流感症状的香港儿童体内分离到H9N2病毒，经过研究发现此毒株与鹌鹑体内存在的病毒A/QuAil/Hongkong/G1/97(H9N2)有着相似的抗原性与分子生物学特性。因此，AIV作为可以感染人的病原而得到了人们的重新认识，更引人关注的问题是，原来只存在于禽类中的禽流感病毒亚型，也可能是引起人类流感大暴发的潜在威胁，特别是2003年底至2004年，在东南亚及我国暴发的禽流感(H5N1)，造成亚洲各国死亡或淘汰的禽只总数近1亿只，并有52人感染，39人死亡，更加证明了这一点。

预防流感病毒的关键是研制高效、安全、生产工艺简单、价格低廉的疫苗。目前世界上研制出的相应疫苗主要有灭活全病毒疫苗、弱毒苗、亚单位疫苗、重组活载体疫苗和核酸疫苗等。目前主要应用的灭活全病毒疫苗必须注射比活疫苗高出许多倍的毒量，此外还必须添加佐剂，这都增加了灭活疫苗的成本，并且必须逐个动物接种，需大量人力，并且在抓鸡和注苗过程中产生应激反应，造成禽的生产力下降，同时免疫注射过程中，防疫人员在禽舍之间的流动和对禽的直接接触，容易造成病毒扩散，灭活苗的另一缺点是接种动物血清学检测呈阳性，因此不能与自然感染相区分，影响疫病的监测，不能用在常规免疫，此外，灭活苗不能诱导有效的黏膜免疫sIgA抗体的产生和细胞免疫应答，因而无法有效地抑制呼吸道中流感病毒的复制；弱毒苗有突变为高致病毒株及同种强毒株污染的危险，同时，弱毒苗也影响AIV疫情的监测；核酸疫苗免疫保护产生需要较长的时间，不适于紧急预防的需要，随着DNA疫苗的深入研究，人们担心DNA整合到宿主细胞基因组上，造成致癌隐患，此外DNA通过核膜较为困难，限制了其作用的发挥，这在一定程度上阻碍了DNA疫苗的推广应用，并且尚处于研究阶段，距临床应用还有很长的路；重组活载体疫苗应避免用于经载体病毒疫苗免疫的鸡群或自然感染野载体病毒鸡群，否则，将不能诱导对禽流感的良好免疫应答；常规亚单位疫苗是提取AIV具有免疫原性的蛋白制作而成，这种疫苗具有很好的安全性，也能刺激足够的免疫力，不会干扰禽流感病毒的血清学调查，而且其不存在毒力返强、散毒和环境污染的问题，是安全性较好的疫苗。

利用植物生物反应器制备亚单位疫苗研究是基因工程研究的热点之一，有着良好的发展前景。植物表达系统较其他表达系统，具有如下优点：(1)与原核表达系统相比，植物可以对表达产物进行准确的翻译后加工和蛋白糖基化、酰氨化、磷酸化、亚单位的正确装配等翻译后加工，使表达产物三维空间结构更趋于自然状态，且不产生一些不溶性聚合物。(2)与动物细胞培养相比，植物细胞种类多，数量大，遗传操作成熟简单，易于转化；且具有全能性，能再生植株，培养条件简单；且遗传稳定，大规模培养成本低。(3)转基因植物疫苗不含以人畜为宿主致病微生物或病毒、致癌因子、毒素等潜在对人畜致病的污染物质，饲喂安全，不会引起负反应，不会影响疾病监测。(4)疫苗抗原基因转入可饲用的植物后，还可直接饲喂动物，使用安全方便，易于储存和分发，可随时、长期、大范围给药。(5)转基因植物中外源基因可通过植物杂交的方法进行基因重组，从而达到在植物体内积累多基因的目的，进而生产一种方便、高效的多价口服疫苗。(6)植物细胞中的疫苗抗原通过胃内的酸性环境时可受到细胞壁的保护，直接到达肠内粘膜诱导部位，刺激粘膜和全身免疫反应，比传统的免疫途径更有效。(7)比传统的免疫途径更有效通过转基因植物生产的口服疫苗，不仅提供了疫苗，而且提供了营养。

研究表明，禽流感病毒(AIV)的囊膜蛋白的一种——血凝素蛋白(HA)是AIV的主要保护性抗原，HA可诱导机体产生中和抗体，可中和病毒的感染性，是最重要的保护性抗原。它既可诱导特异性抗体的产生，又可刺激机体产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，禽流感病毒的HA基因研制的疫苗可对同一H亚型不同毒株产生良好的免疫保护。

HA是由vRNA片段4编码的表面糖蛋白，为75KD的典型I型糖蛋白。一个HA单体约567个氨基酸(AA)残基组成，从氨基端开始有16个疏水AA组成的信号肽，接着的是约330个AA残基组成的HA1(36KD)，然后是约221AA残基构成HA2(27KD)，HA2的氨基端(185～211氨基酸区域)主要由疏水氨基酸残基组成，因而可与病毒囊膜的脂质双层亲密相连，其末端的10个氨基酸残基多数亲水性的，因而可透过脂质双层进入病毒粒子内，与病毒粒子联系是很紧密的。在HA1与HA2之间有几个或多个氨基酸组成的短链肽相连，它的数量和排列列对病毒的致病性有重要意义；HA其一级结构有4个结构域，分别为信号肽(又叫前导序列)、胞浆域、跨膜区和胞外域。HA单体间通过非共价相连，在病毒囊膜表面形成一个三聚体，分子量为224.6KD，其总长为13.5nm，它占整个病毒颗粒蛋白重量30％。每个病毒颗粒表面约含400-600个HA，三聚体头部由HA1亚单位组成，有8个β折叠，有3个受体结合位点(RBS)和5个抗原决定簇A、B、C、D、E，A由第140～146位AA残基形成的环状结构基邻近的氨基酸组成；B位于顶部，其中心由第155～160位氨基酸残基构成；C位于HA的基底部，属于构象抗原，由271、279、312和315位等氨基酸残基组成；D位于HA的三聚体的内侧面，由208～210、218～219和225～227三部分组成；E位于A与C之间，由65、81、82和93位等氨基酸残基组成，另一部分为茎部，由HA2和HA1的少部分组成，有5个β折叠，与囊膜相连，长约7.6nm。三聚体头部与茎部之间和各单体之间以氢键和范德华力维系，故三聚体十分稳固；HA上有7个寡糖链，HA1上有6个，位置是8，22，38，81，165和285位；HA2上的1个位于154位，这些糖基化位点的空间分布很有特点，有稳固三聚体的作用。

1985年，Wood JM等对灭活苗中血凝素含量进行了定量研究，试验结果表明，疫苗中血凝素的含量与免疫后的抗体水平和攻毒保护率有密切关系(Wood JM，Kawaoka Y，Newberry LA，et al.[J].Avian Dis，1985，29：867-872)。1996年，Laver WG & Kilbourne ED用HI实验和中和实验证明了从病毒中纯化出的HA蛋白是AIV的主要抗原(Laver WG & Kilbourne ED，Virology.1996Nov；30(3)：493-501)。1991年，Tripathy DN等将禽流感病毒HA基因c DNA拷贝插入禽痘病毒疫苗株TK基因，构建了以牛痘病毒启动子调控HA基因的重组痘病毒疫苗，接种敏感鸡产生了特异性HA抗体(Tripathy D N，Schnitzlein W M.[J].Avian.1991，35(1)：186-191)。2000年，Boyle DB等构建了表达H7亚型HA基因的重组痘病毒，接种2、7日龄鸡，分别于接种后第10、21天，用澳大利亚强毒株攻击，致死保护率分别为80％和100％(Boyle DB，Selleck P，HeineH G.[J].Aust Vet J，2000，78(1)：44-48)。Thomasm等将A/Ty/Ire1370/83(H5N6)株的HA基因插入含有痘苗病毒WR株TK基因的质拉pSC11中，通过同源重组获得Vac-H5重组病毒。用此重组病毒免疫1日龄和5日龄的仔鸡，结果可对不同H5亚型的强毒株攻击产生近100％的保护。在1999年，Crawford等利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统同时表达H7，H5亚型血凝素蛋白(HA)，将表达蛋白纯化后制成油乳剂，皮下接种1日龄SPF鸡，血清抗体HI滴度与全病毒疫苗相当；以1.0μg/只皮下接种3周龄鸡，21d后，血清抗体几何平均滴度分别为121(H5)和293(H7)；用相应亚型高致病力毒株攻击，免疫鸡可全部抵抗致死性感染，且免疫鸡攻毒后泄殖腔减少或不排毒。有意义的是，这种HA亚单位疫苗不会诱导针对流感病毒内部蛋白(NP)的免疫反应，因此，不会干扰对自然流感病毒感染的流行病学调查(Crawford J，Wilkinson B，Vosnesensky A，etal.[J].Vaccine，1999，17(18)：2265-2274)。刘明等构建了H5N1亚型血凝素重组杆状病毒rBacH5，血凝素基因能在此重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞表面成功表达，为禽流感亚单位疫苗的研制奠定了基础(刘明，于康震，张云，等.[J].中国预防兽医学报，2000，22增刊)。Kodihalli等用巨细胞病毒启动子和鸡β-肌动朊启动子分别构建了H5亚型HA基因表达质粒，用基因枪免疫鸡对致死性H5病毒攻击可提供完全保护〔Kodihalli S，Haynes J R，Robinson H L，etal.[J].J Virol，1997，71(5)：3391-3396〕。2000年，Kodihallis等研究了包含表达H5血凝素基因质粒和表达H7血凝素基因质粒的联合DNA疫苗效果以及表达H5亚型NP基因的DNA疫苗效果。结果显示，单一剂量联合DNA疫苗免疫鸡可抵抗H5或H7两种亚型的攻击。但是表达NP基因的DNA疫苗免疫鸡对H5N8(同一亚型)毒株致死性保护率为50％，对H7N7(不同亚型)毒株致死性保护率为42％(Kodihalli S，Kobasa D L，Webster R G.[J].vaccine，2000，18(23)：2592-2599)。Robinson等用禽白血病病毒长末端重复序列(LTR)启动禽流感病毒血凝素基因表达质粒DNA，通过皮下、腹膜内及静脉内注射3种途径导入鸡体内，产生中和抗体，对同型禽流感病毒(H7N7)保护率可达100％(RobinsonHL，HuntLA，Webster RG，etal.[J].Vaccine，1993，11(9)：957-960)。Daine等将血凝素抗原与白细胞介素-6联合在一起构成核酸疫苗，显著增强对流感病毒的抵抗作用(DianeLL，NaomiDS，MarthaWM，etal.[J].Virology，1998，(4)：1704-1708)。陈化兰等研制成功H7N1型禽流感血凝素抗原DNA疫苗PSVH7，将血凝素cDNA与有SV40启动子和增强子的表达载体连接，能达到抗禽流感病毒感染的功效，使用低剂量表达质粒也能产生有效的免疫保护作用(陈化兰，于康震，田国斌等，中国农业科学，1998，31(5)：63-68)；(姜永萍，于康震，邓国华等，中国农业科学.2004，37(7)：1071-1075)。2003年，张强哲等在Hela细胞中表达HA，其理化性质和血凝实验均与AIV的HA一致。上述研究结果证实AIV的HA具有免疫原性。1999年，Morgan等利用AIV HA基因在INSHA小鼠的β胰岛素细胞中转基因表达产生了对周边形成耐受特异HA的T细胞(Morgan G J，Kurts C K，Kreuwel H T，et al.[J]Proc Natl AcadSci USA，1999，96(7)：3854-3858)。王传彬等(2003)，宋晓晖等(2004)，Ematage等(1980)，Ingeborg等(1981)，Alan RD等(1981，1983)在大肠杆菌中表达HA蛋白，Western blot分析表明，融合蛋白能够与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应，表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性(王传彬，多海刚，孙明等，Chinese journal of Veterinary Science and Technology，2003，33(12)：22～25)；(宋晓晖，王中立，孙明等，中国预防兽医学报，2004，26(3)：173-176)；(Ematage JS，Tacon WCA，Catlin GH，et al.[J].Nature，1980，283：171-176)；(Ingeborg H，Mary Jane G.[J].Nature，1981，292：851-852)；(Alan RD，Debi PN，Masahiro U，et al.[J].Proc Natl Acad Sci USA，78(9)：5376-5380)；(Alan RD，Timothy B，Masahiro U，et al.[J]Gene 1983，21：273-284)。宋长征，Hugh S Mason等利用转基因马铃薯表达野生型流感病毒血凝素蛋白，利用电击穿孔转化法，将含有禽流感血凝素基因的表达质粒PHAO(其中含35S启动子和来源于大豆植物存储蛋白基因的vSPB终止末端，另有抗性标记)导入农杆菌EHA105，转化细菌再感染马铃薯的幼茎外植体，转化植株再生和温室栽培。Western blot分析表明，83％的转化植株在其马铃薯块茎组织中表达了重组血凝素，表达量占总蛋白量的0.03％～0.04％，表达量偏低，不仅难以产生免疫应答，而且易产生免疫耐受(宋长征，Hugh S Mason.[J].生物技术.2001，11(5)：3-4)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是克服现有技术的不足，提供一种新的编码禽流感血凝素蛋白基因，该基因能够在植物中高表达血凝素蛋白并且所表达的蛋白具有很好的免疫原性。

一种能够在植物中高表达禽流感血凝素的基因NAIVHA，具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明根据对植物基因表达使用的密码子的统计分析，选出编码同一氨基酸时植物偏爱使用的密码子，然后在禽流感高致病毒株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)血凝素的氨基酸序列不变的情况下，采用植物偏爱的密码子进行反翻译、同时屏蔽基因序列中的提前加尾信号及促使mRNA降解的序列，提高基因的G+C含量，兼顾不形成复杂的二级结构，设计人工合成适合于在植物中高表达新的禽流感血凝素基因，命名为NAIVHA(其序列见序列表中SEQ IDNO.1所示)。与天然HA基因序列相比，新的NAIVHA基因打破了病毒基因结构与植物基因结构不同的物种界限，采用植物密码子优化的思路设计，使之更适合在植物中表达，并有如下特点：

1、1707个碱基对中改换了393个，改换率为23％。

2、在569个氨基酸密码子中，被改变碱基的密码子有334个，改变率为58.37％。

3、在569个氨基酸密码子中，包含355个植物优化密码子，占密码子总数的62.4％，比天然HA提高107个，提高了18.8％。

4、1707个碱基对中G+C数目由719个改换到821个，G+C含量由42％提高到48％。

5、在天然HA基因中的3个PPSS序列(AATAAA和AATAAT)全部被改换，改换率为100％。

6、在天然HA基因中存在的4个干扰基因表达和促使mRNA不稳定的序列(ATTTA)，全部被改换，改换率为100％。

7、为使基因操作方便，在去除了基因序列中间的一些主要的显著性内切酶识别位点，增强了合成基因的适用性。

本发明所要解决的技术问题之二是构建一种能够在植物中高效表达上述基因的表达载体。

一种高效表达NAIVHA基因的植物表达载体，其构建方法包括如下步骤：将所述的NAIVHA基因插入植物表达载体的转录起始密码子之后，即得。

一种优选的构建方法，步骤如下：

1)将NAIVHA基因插入到植物超表达元件pTΩ4A中，构建中间载体pTΩ4ANAIVHA，

2)酶切回收Ω4A和NAIVHA片段，将上述片段插入到植物表达载体pCAMBIA2301中，从而构建高效植物表达载体pC234ANAIVHA。

植物超表达元件pTΩ4A是在Puc19的多克隆位点HindIII和EcoRI之间含有2个35S增强子、1个CaMV35S启动子、1个Ω序列、1个Kozak序列、4个(poly)A和Nos终止子；Ω序列、Kozak序列、4个(poly)A的作用是增强翻译。

本发明的目的之三是提供一种用于防止禽流感的转基因植物疫苗。

本发明的目的之三是通过以下技术方案来实现的：

一种用于防制禽流感的转基因植物疫苗，包括以下步骤制备而成：

1)构建表达NAIVHA基因的植物表达载体；

2)将植物表达载体转化受体植物，获取表达禽流感血凝素的转基因植物，即得。

上述方法中，其中植物表达载体优选为pC234ANAIVHA；转化方法可选用农杆菌浸染法、基因枪法、花粉管通道法、脂质体介导法、或浸泡转化法转化植物，优选使用农杆菌浸染法、基因枪法或花粉管通道法，更优选使用农杆菌浸染法。上述受体植物可以为：红三叶草、白三叶草、苜蓿、大豆、玉米、水稻、百脉根、马铃薯、番茄或烟草，优选为百脉根。

本发明具有以下优点：

(1)本发明基因能够在植物中高表达，与野生型禽流感血凝素基因(CKHA)的表达量相比，其表达量提高了约近40倍。

(2)所表达的重组禽流感血凝素蛋白具有良好的免疫原性：原核表达系统不能对表达产物进行准确的翻译后加工和蛋白糖基化，细菌在发酵过程中常产生一些不溶性聚合物，其要重新溶解并折叠成天然蛋白质则需要很高的成本，且发酵需要庞大设备投资；本发明采用植物细胞表达系统，可克服微生物系统不能对真核生物蛋白进行准确翻译后加工和蛋白的糖基化等缺陷，对表达产物进行糖基化、酰氨化、磷酸化、亚基的正确装配等转译后加工，使表达产物三维空间结构更趋于自然状态，所表达的禽流感血凝素具有与动物病毒抗原相似的免疫原性和生物活性，具有良好的免疫原性。

附图说明

图1为pCAMBIA2301的质粒图谱。

图2为表达载体pC234ANAIVHA的构建流程示意图。

图3为对照重组野生型HA基因的表达载体pC234ACKHA构建流程示意图。

图4为转基因百脉根的Southern blot结果。

1：阳性对照；2～7：转基因百脉根植株；8：非转基因植株。

图5为转基因百脉根的Northern blot结果。

1～5：转本发明表达载体pC234ANAIVHA植株；6：非转基因植株。

图6为转基因百脉根的Western blot鉴定表达蛋白结果。

1：阴性对照；2：阳性对照；3：转野生型表达载体pC234ACKHA植株；4：转本发明表达载体pC234ANAIVHA植株。

以下通过实施例来进一步描述本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。

具体实施方式

本发明所用的基本实验条件如下：

菌株与载体

大肠杆菌(Escherichia coli)：       DH5α购自上海生工公司

农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：根癌农杆菌EHA105购自上海生工公司

PUC18(Ampr)：                      购自Promega公司

pTΩ4A(Ampr)：                     购自Invitrogene公司

pCAMBIA2301(Kanr)：                购自CAMBIA公司

2.酶和试剂及人工寡聚核苷酸引物

限制性内切酶、Taq酶、T₄DNA连接酶等常用酶类购自NewLand和Takara等公司；PCR DIG Probe Synthesis Kit和DIG DNA Labeling and Detection Kit购自Roche公司；pfu DNA Polymerase购自天为时代公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天为时代科技有限公司；寡聚核苷酸引物由Sangon公司合成；测序由上海基康公司、申能博彩公司和Bioasia公司完成。

3.生化试剂

IPTG、X-Gal、Agar为Sigma公司产品；TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品；琼脂、SDS、NaOH、NH₄NO₃、KNO₃、CaCl₂·2H₂O、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、KI、H₃BO₃、MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、Na₂MnO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、FeSO₄·7H₂O、Na₂EDTA·2H₂O、肌酸、烟酸、VB₆、VB₁、甘氨酸、胰蛋白胨、酵母提取物、蔗糖、NaCl等均购自北京市生化试剂公司。

4.培养基

LB细菌培养基：每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用NaOH调pH至7.0，灭菌待用。加1.5％琼脂配成配成固体培养基。

蓝白斑筛选培养基：每升LB固体培养基中加20mg/mL的X-Gal 40μl和200mg/mL的IPTG 40μl。

YEB培养基：每升含胰蛋白胨5g，酵母提取物1g，蔗糖5g，MgSO₄0.5g。用NaOH调至pH至7.5，灭菌后待用。加1.5％琼脂配成固体培养基。

MS培养基(购自sigma公司)。

MS共培养培养基：MS基本培养基中加入6-BA(2mg/l)及LAA(0.5mg/l)。

MS选择培养基：MS共培养培养基中加入羧苄青霉素(500mg/l)及卡那霉素(100mg/l)。

MS生根培养基：MS基本培养基中加入羧苄青霉素(500mg/l)或头孢拉定(500mg/l)+卡那霉素(50mg/l)+IBA(0.1mg/ml)。

5.仪器

常温离心机、冷冻离心机购自sigma公司；凝胶成像仪、电泳仪购自Bio-Rad公司。

[实施例1]本发明禽流感血凝素基因NAIVHA的制备

根据Internet上公布的coden usage数据库，统计出植物偏爱使用密码子，然后再利用生物软件DNASTAR，在保持禽流感高致病毒株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)血凝素的氨基酸序列不变的情况下，采用植物偏爱的密码子进行反翻译、同时屏蔽基因序列中的植物多聚腺核苷酸信号序列(PPSS)(AATAAA、AATAAT)及促mRNA降解的序列(ATTTA)，提高基因的G+C％，避免15～30个碱基对中A+T％＞80％，避免在10个碱基对中出现4个或4个以上连续A或T，避免连续A+T或G+C多于5个，避免一些酶切位点，同时兼顾不形成复杂的二级结构，设计适合于在植物中高表达新的禽流感血凝素基因NAIVHA序列(SEQ ID NO.1)。

NAIVHA序列由大连宝生物公司合成后连在载体PUC18的HindIII和EcoRI之间构成PUC18NAIVHA。

[实施例2]构建高效植物表达载体pC234ANAIVHA及对照野生型表达载体pC234ACKHA

2.1大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备

1)取在LB固体培养基上生长的受体菌DH5α单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜(200r/min)；

2)1％接种量转接到100ml LB液体培养基中，于37℃，300r/min摇约3hr，可通过测量OD₆₀₀值(0.4～0.6)来检测培养物生长状况；

3)在无菌条件下，将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的50ml离心管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃；

4)4℃，4000rpm，离心10min，回收菌体细胞，除尽培养液；

5)用10ml冰预冷的0.1M CaCl₂重悬每份细胞沉淀，放置于冰上30min；

6)4℃，4000rpm，离心10min，回收细胞，除尽培养液，5、6步骤可重复一次；

7)50ml初始培养物，用1ml冰预冷的0.2M CaCl₂和1ml 30％甘油，重悬每份细胞沉淀；

8)200μl分装，置于液氮中，-70℃保存备用。

2.2大肠杆菌的转化

在200μl的DH5a感受态菌中加入2ul质粒，轻轻混匀，冰上放置30min；42℃热激90秒，快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却5min；每管加800μlLB培养基，于37℃摇床(200r/min)温育45min，使细菌复苏；在超净台中将约600μl菌液转移到含有相应抗生素的LB平板上，均匀涂板，待液体吸收后，倒置平皿，37℃培养12-16hr。

2.3碱裂解法小量提取PUC18NAIVHA、PUC18CKHA质粒DNA(参见分子克隆)

2.4酶切和回收

在50ul酶切体系中加入：5ul质粒PUC18NAIVHA、5ul10×buffer、PstI和XhoI(购自大连宝生物公司)各2ul，其余用双蒸水补齐，混匀后37℃放置4小时，然后在1％琼脂糖凝胶中150V电泳，紫外灯下切下回收大小1.7Kb左右的NAIVKA片段，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自北京天为时代科技有限公司)，离心管中的液体即是纯化的产物，取1μl电泳，检测并目测定量。

在50ul酶切体系中加入：5ul质粒PUC18CKHA(购自中国农科院哈尔滨兽医研究所)、5ul10×buffer、SalI和SmaI(购自大连宝生物公司)各2ul，其余用双蒸水补齐，混匀后37℃放置4小时，然后在1％琼脂糖凝胶中150V电泳，紫外灯下切下回收大小1.7Kb左右的CKHA片段，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自北京天为时代科技有限公司)，离心管中的液体即是纯化的产物，取1μl电泳，检测并目测定量。

2.5连接、转化、鉴定

用PstI和XhoI双酶切pTΩ4A(购自Invitrogene公司)，回收约2.9Kb片段。在10ul连接体系中加入：1ul回收的NAIVHA片段，2ul回收的pTΩ4A片段，1ul10×连接buffer，1ulT4DNA连接酶(购自大连宝生物公司)，其余用ddH₂O补齐，置于16℃低温水浴锅中12小时后，在转化DH5a感受态细胞，挑取菌落，摇菌，提质粒，酶切鉴定，正确的即为中间载体pTΩ4ANAIVHA。同样的方法，用HindIII和EcoRI(购自大连宝生物公司)双酶切pTΩ4ANAIVHA，回收3.0Kb的片段，用T₄DNA连接酶将片段插入到植物表达载体pCAMBIA2301(购自CAMBIA公司，见图1)的HindIII和EcoRI之间，从而构建高效植物表达载体pC234ANAIVHA(见图2)，然后酶切、PCR、测序。

用SalI和HpaI双酶切pTΩ4A，回收约2.9Kb片段。在10ul连接体系中加入1ul回收的CKHA片段，2ul回收的pTΩ4A片段，1ul10×连接buffer，1ulT₄DNA连接酶(购自大连宝生物公司)，其余用ddH₂O补齐，置于16℃低温水浴锅中12小时后，在转化DH5a感受态细胞，挑取菌落，摇菌，提质粒，酶切鉴定，正确的即为中间载体pTΩ4ACKHA，同样的方法，用HindIII和EcoRI(购自大连宝生物公司)双酶切pTΩ4ACKHA，回收3.0Kb的片段，用T4DNA连接酶将片段插入到植物表达载体pCAMBIA2301的HindIII和EcoRI之间，从而构建高效植物表达载体pC234ACKHA(见图3)，然后酶切、PCR、测序。

[实施例3]农杆菌浸染法或基因枪法转化百脉根及鉴定

3.1农杆菌感受态细胞的制备

1)挑取单菌落EHA105接种于5ml YEB(加利福平100mg/l)液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养过夜；

2)取2ml菌液转入50ml YEB液体培养基中继续培养至OD₆₀₀≈0.5；

3)转入无菌离心管，冰浴30min，5000r/min离心5min，去上清液；

4)加入2ml 20mM CaCl₂重悬菌体；

5)每管200μl分装于无菌Eppendorf管中，于4℃保存。

3.2农杆菌感受态细胞的转化

1)取20μg提取纯化的重组pC234ANAIVHA、pC234ACKHA质粒DNA，分别加入200μl感受态细胞中，混匀；

2)冰浴5min，转入液氮冷冻8min，迅速置37℃水浴5min；

3)加入800μl YEB液体培养基，28℃，200r/min预表达4-5hr；

4)将菌液移至YEB固体选择培养基(含卡那霉素100mg/l，利福平100mg/l)表面，均匀涂布于整个平板。28℃培养1-2天。

3.3含目的基因的农杆菌的鉴定

挑取转化后单菌落，接种于5ml含相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃培养2天，碱裂解法小量提取质粒，用酶切或PCR方法鉴定。

3.4百脉根的遗传转化

1)取百脉根种子75％酒精消毒后种在MS0培养基上发芽；

2)剪取10日龄的百脉根子叶放在农杆菌菌液(OD₆₀₀＝0.5)中浸泡5min或用基因枪轰击；

3)用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入表面铺一层滤纸的MS固体基本培养基，28℃暗培养；

4)三天后，将材料转到含有抗生素的分化培养基(MS基本培养基+6-BA1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中进行培养(25℃，钨灯3000mol.m^-2.s^-1，光照周期为16hr光照/8hr黑暗)；

5)待抗性芽生长至2～3cm高时，切下小芽转入生根培养基(MS基本培养基+NAA 0.2mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中诱导生根。由于幼苗生根时对卡那霉素非常敏感，此时适当提高Kan的浓度至100-125g/ml，以降低转化体假阳性出现的频率，从而减少后续筛选工作量。

3.5转基因百脉根的分子生物学鉴定

3.5.1Southern杂交鉴定转基因植株

按照《分子克隆》所提供的方法进行Southern杂交，Southern blot结果如图4。杂交结果说明，本发明禽流感血凝素基因NAIVHA已成功的整合到受体植物百脉根中。

3.5.2Nouthern杂交

按照《分子克隆》所提供的方法进行Northern杂交，转基因百脉根Northernblot结果如图5。Northern杂交说明，本发明禽流感血凝素基因NAIVHA已在受体植物百脉根中得到表达。

[实施例4]转基因植株中血凝素蛋白的检测及表达量测定

4.1提取转基因植物中的可溶性总蛋白

取100mg转基因和非转基因植物材料，用液氮研成粉末，加0.1ml可溶性总蛋白提取液(10mM Tris-Cl，0.02％NaCl，0.001％PMSF，pH 8.0)，再研磨5min，4℃放置20分钟后把匀浆倒入离心管中，12000rpm，离心5min，上清即为提取物。

4.2Bradford测定可溶性总蛋白含量

4.2.1试剂

1)标准蛋白质溶液，用g-球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

2)考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用水稀释至1升。

4.2.2器材

可见光分光光度计、旋涡混合器、试管16支。

4.2.3操作方法

1)取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。

2)加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1ml水加5.0ml G-250试剂。

3)用标准蛋白质量(mg)为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。

测定结果：转本发明表达载体pC234ANAIVHA的百脉根蛋白提取液总蛋白含量为11.15ug/ul，转对照表达载体pC234ACKHA的百脉根蛋白提取液总蛋白含量为10.32ug/ul。

4.3Western blot检测转基因植物中禽流感血凝素蛋白

标准禽流感H5型血凝素蛋白和H5型血凝素抗体购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，二抗和其他试剂购自sigma等公司，BCIP/NBT显色液购自华美生物公司。

4.3.1转基因植株中血凝素蛋白的检测

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照《分子克隆实验指南》方法进行，积层胶为5％，分离胶为10％，电压为130V，上样量为40μl蛋白提取液，设标准禽流感H5型血凝素蛋白为阳性对照，非转基因百脉根蛋白提取液为阴性对照，蛋白质低分子质量标准蛋白。电泳结束后立即进行电转移，条件为30V，90mA，4℃过夜电转，结束后用丽春红染色，标出分子质量标准的位置。用5％脱脂奶粉封闭，一抗为哈尔滨兽医研究所提供抗H5的鸡血清，800倍稀释，二抗为碱性磷酸酶标记的兔抗鸡的IgG，2000倍稀释；BCIP/NBT显色，照像，结果见图6。

阳性对照和转本发明表达载体pC234ANAIVHA的百脉根蛋白提取液总蛋白、转对照表达载体pC234ACKHA的百脉根蛋白提取液都在68KD有特异性带，而阴性对照则无特异条带，说明本发明血凝素蛋白基因已在植株中表达。

4.4ELISA测定转基因植物中禽流感病毒血凝素的蛋白量

设标准禽流感H5型血凝素蛋白为阳性对照，非转基因百脉根可溶性蛋白提取液为阴性对照，转本发明表达载体pC234ANAIVHA的百脉根蛋白提取液总蛋白为测定样品1，转对照表达载体pC234ACKHA的百脉根蛋白提取液为测定样品2。

4.4.1试剂

标准禽流感H5型血凝素蛋白和H5型血凝素抗体购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，二抗和其他试剂购自sigma等公司。

1)包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液)：NaCO₃ 1.59克、NaHCO₃2.93克加蒸馏水至1000ml。

2)洗涤缓冲液(PH7.4 PBST)：KH₂PO₄ 0.6克、Na₂HPO₄·2H₂O 2.9克、NaCl8.0克、KCl0.2克、Tween-20 0.05％0.5ml加蒸馏水至1000ml。

3)稀释液：牛血清白蛋白(BSA)0.1克加洗涤缓冲液至100ml。

4)终止液(2M H₂SO₄)：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。

5)底物缓冲液(PH5.0磷酸/柠檬酸)：2M Na₂HPO₄(28.4克/L)25.7ml、0.1M柠檬酸(19.2克/L)24.3ml、加蒸馏水50ml。

6)TMB(四甲基联苯胺)使用液：TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml、底物缓冲液(PH5.5)10ml、0.75％H₂O₂ 32μl。

4.4.2器材

1)聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。

2)小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

3)4℃冰箱，37℃孵育箱。

4.4.3操作步骤

1)包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟(简称洗涤，下同)。

2)加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔(非转基因植物的蛋白)及阳性对照孔。

3)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4)加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5)终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6)结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

7)用标准阳性禽流感血凝素蛋白不同量(mg)稀释梯度为横坐标，以450nmOD值为纵坐标，绘制标准曲线，测转基因阳性百脉根可溶性蛋白提取液进行同样条件下OD值，即可计算出转基因植株总可溶性蛋白提取液中禽流感血凝素蛋白的含量。结果见表1：

                             表1  转本发明基因百脉根中重组血凝素的表达量

样本	总蛋白质(μg)	血凝素(Ng)	血凝素/总蛋白量(Ng/μg)	含量％
					012	11.312.211.2	0501.12	040.1	00.40.01

注：样本0为阴性对照；

结果发现，转本发明植物表达载体pC234ANAIVHA的百脉根蛋白提取液中血凝素蛋白含量占植物可溶性总蛋白的0.4％，转对照表达载体pC234ACKHA的百脉根蛋白提取液中血凝素蛋白含量占植物可溶性总蛋白的仅为0.01％，本发明基因可在植物中高表达，与野生型基因相比，其表达量提高了近40倍。

[实施例5]表达禽流感血凝素蛋白转基因植物的繁殖和培育

在筛选出稳定表达禽流感血凝素蛋白的转基因百脉根后，按照常规组织培养方法扩繁幼苗，最后将这些幼苗转入田间繁殖，便可获得转基因百脉根。

[实施例6]转基因百脉根对动物的禽流感保护效力试验

6.1试验材料

1)供试样品：本发明实施例所制备的转NAIVHA基因百脉根。

2)实验动物：8周龄SPF鸡，35只(购自北京维通利华实验动物有限公司)。

3)标准毒株：H5N1亚型HPAIV(GD1/6)(购自中国农科院哈尔滨兽医研究所)。

6.2试验方法及结果

6.2.1免疫程序

将SPF鸡35只分成7组，每组5只，第0组为空白对照，第1组口服饲喂非转基因百脉根，第2组口服饲喂本发明转基因百脉根，第3组颈部后段皮下注射注射PBS缓冲液，第4组颈部后段皮下注射非转基因百脉根可溶性蛋白提取液，第5组颈部后段皮下注射禽流感灭活油乳剂疫苗，第6组颈部后段皮下注射本发明转基因百脉根可溶性蛋白提取液，每组鸡都编号。

6.2.2抗体效价测定

每组鸡在首免后1周、三免后1周鸡翅静脉采血，血凝抑制实验测定血清中中和抗体效价。

血凝抑制(HI)试验(微量法)

1)根据血凝试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1∶256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1∶64(256除以4)。

2)在微量反应板的1-11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。

3)吸取0.025mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。

4)1-11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL，室温(约20℃)静置至少30min。

5)每孔加入0.025mL的鸡红细胞悬液轻轻混匀，静置约40min，对照红细胞将呈显钮扣状沉于孔底。

结果判定

以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。

6.2.3攻毒试验

免疫3周后，对所有实验鸡均用50×LD50的H5N1亚型HPAIV(GD1/6)标准毒株进行攻击，1周后采集泄殖腔棉拭子，样品经鸡胚尿囊腔繁殖后，血凝试验检测病毒，观察鸡发病和死亡情况。

血凝(HA)试验(微量法)

1)在微量反应板的1-12孔均加入0.025mL PBS，换滴头。

2)吸取0.025mL泄殖腔棉拭子样品加入第1孔，混匀。

3)从第1孔吸取0.025mL抗原加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。

4)每孔再加入0.025mL PBS。

5)每孔均加入0.025mL 1％(V/V)鸡红细胞悬液(购自中国农科院哈尔滨兽医研究所)。

6)振荡混匀，在室温(20℃-25℃)下静置40min后观察结果，对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。

结果判定

将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝(不流淌)的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位(HAU)。结果见表2：

                        表2  转基因百脉根对鸡的禽流感保护效力试验结果

接种途径	组别	剂量(g)	动物数量	血清抗体效价		保护数/攻毒数	攻毒后血凝滴度
								首免后1周	3免后1周
				口服饲喂	0					0	5	≤5	≤5	0/6	≥1920
1	10	5	≤5			≤5	0/6	≥1920
					2				10	5	120	940	6/6	1∶320
颈部后段皮下注射	3	2ml	5			≤5	≤5	0/6							≥1920
				4	2ml				5	≤5	≤5	0/6	≥1920
	5	0.5ml	5			230	1280	6/6						1∶80
				6	2ml				5	160	960	6/6	1∶380

综合上述试验，无论是直接口服饲喂转本发明基因的百脉根，或用所提取的蛋白提取液免疫SPF鸡，都能产生特异性抗体，经禽流感标准毒株攻击证实，所免疫的SPF鸡均有良好的保护效力。结果说明，转本发明基因的植物具有防制禽流感的作用。

                       SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院生物技术研究所，深圳市农科集团公司，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>编码禽流感血凝素的基因及其植物表达载体和应用

<130>fm002

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1707

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial

<400>1

atggagagga ttgtgcttct cttggccatt gtgtcacttg tgaagtctga tcagatctgc    60

attggatacc atgctaacaa ctcaactgag caagtggata ccatcatgga gaagaatgtg   120

actgtgaccc atgcacaaga cattcttgag aagactcaca atggtaagct ctgcgatctc   180

aacggagtga agccactcat tctcagggat tgctctgtgg caggatggtt gcttggcaac   240

ccaatgtgcg atgagttcat caacgtgcca gagtggtcat acattgtgga gaaggcttca   300

ccagccaatg atctctgcta cccaggagac ttcaatgact acgaagagtt gaagcatctt   360

cttagcagga ccaatcactt cgagaagatt cagatcattc caaagtcatc ttggagcaac   420

catgatgctt cttcaggtgt gtcttcagct tgcccatacc atggcaggtc tagcttcttc   480

aggaatgtgg tgtggctcat caagaagaac tctgcctacc caaccatcaa gaggtcatac   540

aacaacacca atcaggagga tctcttggtg ctctggggca ttcatcatcc aaacgatgca   600

gctgagcaga ctaagttgta ccagaatcca actacctaca ttagcgtggg aacctctact   660

ctcaaccaaa ggcttgtgcc agagattgcc actaggccaa aggtgaatgg tcaatcagga   720

aggatggagt tcttctggac cattctcaag ccaaacgatg ctatcaactt cgagagcaat   780

ggtaacttca ttgcaccaga gtacgcctac aagattgtga agaagggaga ttctgctatc   840

atgaagtcag agcttgagta cggcaactgc aacaccaagt gccagactcc aatgggagcc   900

atcaactctt caatgccatt ccacaacatt catccattga ccattggtga atgcccaaag   960

tacgtgaaga gcaacaggct tgtgttggca actggattga ggaacactcc acaaagggag  1020

aggaggagga agaagagggg actcttcggt gccattgcag gattcattga aggaggctgg  1080

caaggcatgg tggatggttg gtacggttac caccatagca atgagcaagg atcaggttac  1140

gcagctgaca aggagtctac tcagaaggcc attgatggcg tgaccaacaa ggtgaacagc  1200

atcattgaca agatgaacac tcagttcgag gcagtgggaa gggagttcaa caaccttgag  1260

aggaggattg agaacctcaa caagcagatg gaagatggct tcttggatgt gtggacctac  1320

aatgcagagt tgcttgtgtt gatggagaat gagaggactc ttgacttcca tgatagcaac  1380

gtgaagaacc tctacgacaa ggtgaggttg caacttaggg acaacgctaa ggagcttggt  1440

aacggatgct tcgagttcta ccacaagtgc ggtaacgagt gcatggagtc tgtgaagaac  1500

ggtacttacg attacccaca atactctgag gaagctaggt tgaacaggga ggagattagc  1560

ggtgtgaagt tggagagcat gggtacctac cagattctcc caatctactc aactgtggct  1620

tcttcacttg cacttgctat catggtggct ggtcttagct tgtggatgtg ctctaacggc    1680

agcttgcaat gcaggatctg catctaa                                        1707

Claims (11)

1、一种编码禽流感血凝素蛋白的基因NAIVHA，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2、包含权利要求1所述基因NAIVHA的植物表达载体。

3、按照权利要求2所述的植物表达载体，其特征是所述表达载体是pC234ANAIVHA。

4、权利要求1所述基因NAIVHA的应用方法，包括以下步骤：

1)构建包含NAIVHA基因的植物表达载体；

2)将植物表达载体转化受体植物，获取表达NAIVHA基因的转基因植株。

5、按照权利要求4所述的应用方法，其特征是所述植物表达载体为pC234ANAIVHA。

6、按照权利要求4所述的应用方法，其特征是所述转化方法为农杆菌浸染法、基因枪法或花粉管通道法。

7、按照权利要求6所述的应用方法，其特征是所述转化方法为农杆菌浸染法。

8、按照权利要求4所述的应用方法，其特征是所述受体植物为：红三叶草、白三叶草、苜蓿、大豆、玉米、水稻、百脉根、马铃薯、番茄或烟草。

9、按照权利要求8所述的应用方法，其特征是所述受体植物为百脉根。

10、一种防制禽流感的转基因植物疫苗，其特征是由权利要求4-9任一所述方法制备得到的产品。

11、权利要求1所述的基因在制备禽流感疫苗中的用途。

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