CN1298845C - 表达禽流感病毒H5亚型HA蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达野生型或突变型禽流感病毒H5亚型血凝素(HA)蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗株在制备预防禽流感的疫苗中的应用。

Description

表达禽流感病毒H5亚型HA蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种表达编码野生型或突变型禽流感病毒H5亚型血凝素(HA)蛋白的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗株在制备预防禽流感的疫苗中的应用。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)为不分节段单股负链RNA病毒，作为副粘病毒科的重要成员和模型病毒，得到深入研究。重组NDV作为活病毒疫苗载体具有非凡的优点：包括LaSota株在内的NDV弱毒疫苗长期以来一直用于家禽防疫，其安全有效性已被充分证明；NDV遗传相对稳定，仅有一个血清型，毒株间发生重组及毒力返强可能性极小；复制过程在细胞浆内完成，从RNA到RNA，不存在DNA阶段及细胞基因组整合的可能；NDV弱毒疫苗可同时诱导全身性体液免疫、局部粘膜免疫及细胞免疫的形成，形成更加全面、确实的免疫保护；可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射多种方式给苗，使用极为方便；NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本极为低廉^{(1，7，8，11，12，13)}。NDV为高度传染性和高度致死性的家禽疫病原，我国每年用于新城疫防制的弱毒疫苗至少在百亿羽份以上。NDV作为活病毒疫苗载体应用的经济意义十分巨大。

负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基因组cDNA制造新病毒的过程，其基本过程是：①组装完整的病毒基因组(或重组型基因组)cDNA克隆，5’末端精确地缀于T7启动子后，3’末端精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7转录终止信号之前，构成基因组cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动病毒复制必须的转录相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表达质粒(T7启动子)一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可细胞；③24-72小时后收获培养上清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获(rescue)病毒。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system，RGS系统)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒^{(1，2，3，4，5，6)}。

NDV基因组全长15186核苷酸，与其它副粘病毒一样，包括核蛋白(NP)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，融合蛋白(F)，凝集素神经氨酸酶蛋白(HN)，和大聚合酶蛋白(L)六个独立转录编码单元(图1A)。本研究将IBDV VP2蛋白克隆到P和M之间，来研究外源蛋白在NDV中的表达适当位置。NDV和其它负链RNA病毒一样，其最小感染单位是核糖核蛋白复合物，无蛋白包裹的RNA本身并无感染性。NDV的基因组RNA通过与NP、P、L蛋白一起组成核蛋白复合体，启动RNA的首轮转录及病毒蛋白的翻译合成、产生感染性子代病毒(7，10)。根据这一原理，1999年欧洲学者率先建立了第一个高致病性NDV的反向遗传操作系统(reverse genetic system，RGS系统)(2)。目前在欧、美至少有4个实验室利用NDV的RGS技术在基础与应用研究方面开展激烈的竞争性研究。

禽流感是危害世界养禽业发展的重要疾病，高致病力禽流感可导致感染禽群100％的死亡，被国际兽疫局列为A类烈性传染病。H5亚型历史上引起高致病力禽流感暴发。2003年末至2004年初，韩国、日本、越南、泰国、印尼、柬埔寨、老挝以及中国大陆等亚洲国家相继暴发H5亚型高致病力禽流感，现有禽流感灭活疫苗和禽痘活载体疫苗具安全、免疫保护效果好的优点，但仍存在着制造成本高、使用相对不便的不足。研制高效安全、成本低廉、使用方便的新一代疫苗具有重要的现实意义。

禽流感(Avian Influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)引起的禽类感染和/或疾病综合征，AIV在分类学上属于：病毒界(Vira)----正粘病毒科(Orthomyxoviridae)----流感病毒属(Influenza VirusA and B)----禽流感病毒(Avian Influenza Virus)。禽流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属的A型流感病毒，基因组由8个单股负链RNA片段组成。其表面结构蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性不同，被划分为不同亚型。血凝素(HA)是禽流感病毒主要的免疫原蛋白，它可诱导机体产生抗体介导的特异性体液免疫应答，抗HA的抗体可以通过干扰病毒与唾液酸受体的结合或者病毒囊膜与内吞体膜的融合过程从而中和病毒的感染。AIV的致病力与其表面结构蛋白HA裂解位点的氨基酸序列密切相关。低致病力AIV的HA裂解位点只有一个碱性氨基酸精氨酸(R)，这一结构决定了这些病毒感染动物后只能在呼吸系统内繁殖，因为只有呼吸道上皮细胞内含有一种精氨酸特异的类似胰酶的蛋白酶，可将裂解位点含单一碱性氨基酸精氨酸的HA0裂解为有活性的HA1和HA2，启动病毒的吸附和复制周期。高致病力H5和H7亚型AIV HA裂解位点含有连续的多个碱性氨基酸残基-RKKR-，可被体内多种细胞内广泛存在的蛋白酶识别和裂解，因此具有广泛的组织嗜性，一旦感染便会造成全身性扩散并导致迅速死亡。与可感染人的H1、H2、H3及H9等亚型流感病毒相比，高致病性的H5和H7亚型AIV对人类的潜在危害更为巨大，因为一旦感染人后即可能全身性扩散和迅速致死。

2001-2002年，Palese.P.等相继构建表达H1亚型流感病毒HA免疫原基因的重组NDV B1株和表达H7亚型流感病毒HA免疫原基因的重组NDVB1株，免疫试验表明这两种NDV活载体疫苗可分别在小鼠和禽类诱导保护性免疫反应。但是由于B1本身高度致弱，在免疫接种鸡体内的复制能力较差，因而诱导免疫鸡形成有效免疫保护的能力也相对较弱，试验表明，表达H7亚型HA基因的NDV B1株对NDV及H7亚型高致病力禽流感致死性攻击的存活保护分别仅为60％和40％，且不能阻止病毒在体内的复制和排放⁽¹²⁾。研究表明，NDV基因组在不同位点插入外源报告基因或免疫原基因，经细胞或鸡胚连续高代次传代仍保持高度的遗传和表达稳定性^{(11，12，13)}。但由于上述表达系统、活病毒载体本身的不足与缺陷以及使用成本等原因，均未实现在生产实际的广泛应用。

发明内容

针对上述研究背景，本发明人为进一步提高禽流感病毒表达抗原的免疫原性，构建表达野生型和突变型禽流感病毒HA免疫原蛋白的重组NDV活载体二联弱毒疫苗rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA，以增强并延长重组病毒对禽流感的有效免疫保护，用于雏鸡新城疫与禽流感预防免疫的免疫防制。

因此，本发明的一个目的是提供一种表达编码野生型或突变型禽流感病毒H5亚型血凝素(HA)蛋白的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。

在一个实施方案中，所述编码野生型HA蛋白的基因具有SEQ ID No 1所示的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，所述编码突变型HA蛋白的基因具有SEQ ID No2所示的核苷酸序列。

优选所述新城疫LaSota弱毒疫苗株是AV1615，更优选所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA。

本发明还有一个目的是提供一种生产上述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码野生型或突变型禽流感病毒H5亚型HA蛋白的基因(野生型或突变型HA基因)的所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因组cDNA序列；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。

在上述生产方法的一个实施方案中，将编码野生型或突变型禽流感病毒H5亚型HA蛋白的基因插入到新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因组P，M之间人工引入的PmeI位点。优选所述LaSota弱毒疫苗株是AV1615。

在上述生产方法的另一个实施方案中，包括在所述转录质粒中的基因组cDNA序列位于T7启动子之后，而在编码自我剪切的核酸酶的序列和T7转录终止子之前，构成基因组cDNA转录模板。优选所述自我剪切的核酸酶是丁肝病毒核(Rib)。

在上述生产方法的另一个实施方案中，包括在所述转录辅助质粒中的编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列都位于T7启动子之后。优选所述转录质粒是pBRN-FL-H5wtHA(也称为pBRN-FL-H5HAwt)或pBRN-FL-H5mutHA(也称为pBRN-FL-H5HAmut)，所述转录辅助质粒是质粒pBSNP，pBSP和pBSL。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是BHK-21。

本发明还提供了上述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株(特别是rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA)在制备预防禽流感的疫苗中的应用。

本发明通过RT-PCR扩增了NDV疫苗株LaSota 10个cDNA片段，利用片段之间互相重叠的部分进行拼接，装配成全长cDNA克隆。序列测定结果已经登录GenBank，登录号为AY845400。接着分别将禽流感病毒(Avian influenza virus)H5亚型A/Goose/Guangdong/96/1/H5N1分离株野生型(保留HA蛋白酶裂解位点)和突变型(蛋白酶裂解位点缺失)HA基因分别重组到NDV疫苗株LaSota的P和M之间。将其与核蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)辅助质粒共转染表达T7聚合酶的痘病毒感染的细胞内，从而合成反基因组RNA。此RNA在NP、P和L蛋白的作用下，进行转录和复制。将转染上清接种SPF胚，得到来自cDNA的具有感染性的病毒。通过碱基突变，产生了带有遗传标签的Lasota的派生株rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA，救获的病毒在鸡胚上增殖特征与野毒相近，血凝价高达212，以上结果显示，两种类型的HA均得到表达，再一次证实NDV具有作为疫苗活载体的潜力，为研制新型禽流感疫苗奠定基础。以上重组NDV不仅可以作为预防H5亚型高致病力禽流感和新城疫和禽流感的二联弱毒疫苗双价弱毒疫苗，也可作为二联灭活疫苗种毒株，并且完全不干扰目前普遍应用的常规禽流感流行病学血清学监测。

HA蛋白裂解位点连续多个碱性氨基酸是决定H5亚型高致病力禽流感必须的分子基础。HA作为RNA病毒囊膜蛋白病表达后有可能嵌合到重组NDV的病毒囊膜表面，有可能发挥其细胞膜受体结合与融合等细胞侵入相关功能的。通过人工突变删除HA裂解位点连续多个碱性氨基酸，使其转变为低致病力禽流感病毒HA蛋白的基因形式，将完全避免潜在的生物安全隐患。为此，本发明通过PCR方法，人工删除了裂解位点连续4个碱性氨基酸(-RKKR-)，并突变了另外一个氨基酸，形成突变的低致病力形式H5亚型HA基因(mutHA基因，SEQ ID No 2)，用于构建表达H5亚型禽流感病毒HA抗原的重组新城疫LaSota双价疫苗株。

附图说明

图1.从高保真RT-PCR产生的亚基因组重叠cDNA片段装配全长NDV cDNA。将cDNA片段在共有的限制位点连接，并且在转录质粒pBR322中装配，在转录质粒pBR322中将RBZ和T7终止子序列预先克隆在EcoRI和salI位点之间(详见说明书)。(A)显示亲代NDV的整个全长基因组的第一个和最后一个核苷酸。(B)在顶部显示含有GFP基因的NDV的cDNA克隆，在遗传图谱之下的水平线显示单个cDNA的位置。

图2.通过RT-PCR产生引入修饰酶位点的核苷酸变化，并通过使用PRISM试剂盒(Perkin-Elmer)和Applied Biosystems ABI310自动测序仪测序。加框的是通过PCR诱变在pBRN1-10中引入的一个核苷酸替代(由A突变为G)。

图3.重组新城疫病毒rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA表达H5亚型HA抗原的免疫荧光分析。(图3A和D)NDV-H5wtHA以MOI为1感染BHK-21细胞，(图3B和E)和NDV-H5mutHA以MOI为1感染BHK-21细胞，(图3C和F)NDV LaSota株对照以MOI为1感染BHK-21细胞，感染后20小时将感染的BHK细胞甲醇固定，分别以鸡抗H5亚型禽流感病毒高免血清(图3A、B和C)和鸡抗新城疫病毒高免血清(图3D、E和F)为一抗、FITC-偶联的兔抗-鸡IgG为二抗进行间接免疫荧光检测，Leica DMIRES2荧光显微镜下观察细胞。结果显示野生型和突变型H5亚型HA抗原均可在重组新城疫LaSota弱毒疫苗病毒株获得正确表达。

图4.在含胚的鸡蛋中rNDV/LaSota病毒的生长曲线。用1×10⁴EID₅₀rNDV/LaSota接种胚鸡蛋，在不同时刻(接种后24，48，和72小时)收集尿囊液。通过EID₅₀测定胚鸡蛋的病毒滴度。数值获自两个独立的实验，每个实验一式三份进行。Log滴度来源于平均病毒滴度。

图5.重组新城疫病毒rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA表达H5HA蛋白质印迹分析。泳道1：蛋白质标记；泳道2：感染rLasota-H5wtHA的鸡胚原代细胞(CEF)(获自哈尔滨兽医研究所)；泳道3：感染rLasota-H5mutHA的CEF细胞；泳道4：感染rLaSota的CEF细胞；泳道5：正常CEF细胞；泳道6：H5亚型高致病力禽流感病毒接种鸡胚尿囊液；泳道7：新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株接种9～10日龄SPF鸡胚尿囊液；泳道8：SPF鸡胚尿囊液。

图6.采用DNA免疫制备H5亚型禽流感病毒HA抗原特异鸡抗高免血清进行Western-blot检测rLasota-H5mutHA感染细胞内HA抗原表达。A.rLasota-H5mutHA鸡胚传代F2感染BHK-21细胞；B.未感染BHK-21细胞；C.阴性对照鸡胚尿囊液；D.rLasota-H5mutHA感染鸡胚尿囊液。

图7.重组新城疫病毒活载体疫苗鸡胚生长动力测定比较。

图8.pBTRT的质粒图谱。

图9.pBTRT质粒的DNA序列。第一个斜体部分：T7启动子；带下划线部分：核酶序列；第二个带下划线的斜体部分：T7终止子。

图10.pBRN-FL-H5wtHA的质粒图谱。

图11.pBRN-FL-H5wtHA质粒的DNA序列。带下划线斜体部分：wtHA基因序列。

图12.pBRN-FL-H5mutHA的质粒图谱。

图13.pBRN-FL-H5mutHA质粒的DNA序列。带下划线斜体部分：mutHA基因序列。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1表达野生型或突变型禽流感病毒H5亚型血凝素(HA)蛋白的

             重组新城疫LaSota弱毒疫苗株的构建

细胞和病毒

BHK-21细胞(乳仓鼠肾细胞ATCC CCL-10)，培养基为含10％胎牛血清(Hyclone)及1μg/ml G418的DMEM( Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基)NDV Lasota疫苗株AV1615(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC))。接种9-10日龄SPF鸡胚尿囊腔扩增后-70℃冻存备用；鸡抗NDV高免性血清由本研究室制备(Chu，H.P.，G Snell，D.J.Alexander，和G C.Schild.1982.Avian Pathol 11：227-234)；SPF鸡胚及SPF鸡雏均由哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供。H5亚型高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/Goose/Guangdong/96/1/H5N1分离株[GD/1/96(H5N1)]购自哈尔滨兽医研究所，为我国最早分离的H5亚型高致病力禽流感病毒(唐秀英等.中国禽流感流行株的鉴定.中国畜禽传染病，1998，20(1)：1-5.)。

转录载体的构建

基因组RNA转录载体pBTRT以低拷贝克隆载体pBR322(Invitrogen)为骨架并在EcoRI/salI位点插入T7启动子(T7 promotor)、丁肝病毒核酶(Rib)和T7转录终止信号(T7 terminal)，由本实验室自行构建。克隆在T7启动子和核酶之间的DNA片段可以在T7RNA聚合酶的作用下得到转录，并且由于Rib的自身催化功能，可以保证转录产物的3′末端与克隆的DNA片断精确一致。

插入野生型和突变型HA基因的重组NDV LaSota株基因组全长cDNA的构建

为建立NDV新城疫Lasota疫苗株的反向遗传操作系统，必须首先构建相应基因组的全长cDNA克隆，作为基因组负链RNA转录模板，为此构建了覆盖整个基因组的十个cDNA克隆片段，利用各个片断间重叠部分的酶切位点，在低拷贝质粒转录载体质粒pBTRT连接组装获得了15186nt的完整cDNA克隆，序列测定结果已经登录GenBank，登录号为AY845400，并将H5亚型禽流感病毒的野生型和突变型HA基因H5wtHA(GenBank登录号AF148678，图11中带下划线斜体部分，序列表SEQ IDNo 1)和H5mutHA基因(基因全长DNA序列见图13中带下划线斜体部分，序列表SEQ ID No 2)克隆到P，M之间。在全长cDNA片段5’末端前缀T7RNA聚合酶启动子，在cDNA片断后连有具有自我催化功能的肝炎δ核酶(GenBank X04451)和T7转录终止信号。构建完成的质粒分别命名为pBRN-FL-H5wtHA和pBRN-FL-H5mutHA(pBRN-FL-H5wtHA和pBRN-FL-H5mutHA的质粒图谱及其DNA全序列分别见图10、11和图12、13)。为避免Xba位点的甲基化，通过PCR基因组将基因组cDNA中F蛋白编码区第6178位碱基由T同义突变为C，并作为拯救病毒的分子标记。与其他研究者一样，我们同时在T7聚合酶启动子于基因组cDNA的5’末端引入两个多余的G，这可能有助于副粘病毒反向遗传操作的病毒拯救。具体如下：

NDV Lasota疫苗株病毒鸡胚接种尿囊液经常规方法(动物病毒学，第二版)提取基因组RNA；整个基因组分为末端部分重叠的10个片段(F1-F10)进行RT-PCR扩增，cDNA片段克隆至pBluescript(Clontech)SmaI位点并经序列分析确证与病毒基因组RNA序列完全一致；序列测定结果已经登录GenBank，登录号为AY845400。为引入特异的分子遗传标签，选择Lasota疫苗株基因组cDNA 6172bp处存在一甲基化的XbaI位点，序列为TCTAGATCA，利用PCR手段将其突变为TCTAGACCA，使其不再受甲基化酶识别，因而能够被限制性内切酶XbaI所识别；利用相邻片段重叠部分存在的限制酶切位点连接成组装完整的NDV基因组cDNA(图1A)，并分别将H5亚型禽流感病毒的野生型和突变型HA基因H5wtHA和H5mutHA基因(wtHA：用Trizol(Invitrogen)提出IBDV基因组，反转录后，通过PCR扩增该基因。体系中加入如下引物。上游引物5’GTTTAAACCTTAGAAAAAATACGGGTAGAACCAGTTGTGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTTCTT 3’，下游引物5’GTTTAAACTTAAATGCAAATTCTGCATTGT3’。mutHA：上游引物5’GTTTAAACCTTAGAAAAAATACGGGTAGAACCAGTTGTGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTT，下游引物GTTTAAACTTAAATGCAAATTCTGCATTGT5’)克隆到P，M之间人工引入的PmeI位点，并在前缀基因终止和基因起始序列(GE/GS)(TTAAGAAAAAA/T/ACGGGTAGAA)，并克隆在转录载体pBTRT上，分别构建成含有H5亚型禽流感病毒的野生型和突变型HA基因H5wtHA和H5mutHA基因的病毒基因组转录质粒pBRN-FL-H5wtHA和pBRN-FL-H5mutHA(图1B)；表达核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框架(ORF)cDNA分别紧接着克隆在pBluescript II(+/-)质粒T7启动子下游，分别构成转录辅助质粒pBSNP，pBSP和pBSL。

从重组全长cDNA克隆救获感染性NDV(病毒拯救)

为了从克隆的cDNA中拯救感染性NDV，首先分别以pBRN-FL-H5wtHA和pBRN-FL-H5mutHA及表达NDV NP、P、L蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞。NDV的融合蛋白F0必须裂解成F1和F2才具有感染性，对于Lasota弱毒株而言，BHK-21细胞不能分泌裂解F0蛋白所需的蛋白酶，因此在培养基中加入相应蛋白酶，所以此时应换成无血清培养基并加入TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮.Sigma)(1μg/ml)，继续培养2-3天，收获转染细胞上清接种于9-11日龄的SPF鸡胚。4天后收获鸡胚尿囊液，血凝(HA)试验结果阳性，不同鸡胚的HA价介于28-11；NDV免疫血清血凝抑制(HI)试验分析同样呈现阳性结果。收获病毒阳性尿囊液作为救获病毒rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA的F1代。进一步的RT-PCR及序列分析结果显示，F1代救获病毒基因组cDNA的6178位点碱基为C，而非原LaSota亲本株的C，和预期完全相符(图2)。结果表明，通过反遗传操作技术，利用NDV LaSota疫苗株基因组cDNA克隆成功地救获具有感染性的子代病毒rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA。更具体地，实验步骤如下：

BHK-21细胞接种于35mm六孔板内生长达50-80％单层时，将转录质粒及辅助质粒pBRN-FL-H5wtHA或pBRN-FL-H5mutHA、pBSNP、pBSP和pBSL分别以5μg、2.5μg、1.25μg 1.25μg，共转染BHK-21细胞，采用CaPO4转染试剂盒(Invitrogene)，操作按试剂盒说明书进行。转染后8-12小时，弃去转染混合物，用含10％DMSO的PBS液休克细胞2.5分钟，加入完全DMEM过夜孵育，第二天换成无血清培养基，并加入TPCK(1μg/ml)继续孵育2-3天后，收获培养物上清，0.22um孔径滤器过滤后接种9-11天的SPF胚尿囊腔；接种后的SPF胚继续培养，3-5天，取鸡胚尿囊液50μl进行按常规进行新城疫病毒的血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验(Thayer SG，Nersessian BN，Rivetz B，Fletcher OJ.Comparison ofserological tests for antibodies against Newcastle disease virus and infectiousbronchitis virus using ImmunoComb solid-phase immunoassay，a commercialenzyme-linked immunosorbent assay，and the hemagglutination-inhibitionassay.Avian Dis.1987Jul-Sep；31(3)：459-63.)。收获HA及HI试验结果阳性尿囊液，-70℃冻存，并按常规方法分别于9-10日龄鸡胚及鸡胚成纤维细胞滴定每毫升EID50及PFU病毒含量(14)。分别命名为rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA。

   实施例2重组NDV表达AVI HA蛋白间接免疫荧光试验(IFA)试验

NDV LaSota疫苗株能一过性感染体外培养的哺乳动物细胞。为证明rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA病毒在BHK-21细胞内的复制及病毒抗原表达，二者尿囊毒以MOI为1的病毒量分别感染约70-80％的单层BHK-21细胞(图3A和B)，同时以NDV野生型LaSota疫苗株感染细胞为对照(图3C)，感染后20小时细胞出现早期CPE(细胞病变)现象，立即以NDV高免SPF鸡阳性血清为检测抗体进行间接免疫荧光染色，结果三种病毒感染细胞荧光显微镜下观察到强阳性反应(图3A、B和C)更具体地，实验步骤如下：

分别以鸡胚接种传代二代次尿囊病毒液rLasota-H5wtHA、rLasota-H5mutHA和野生型LaSota疫苗株(图3D、E和F)DMEM适当倍数稀释，按MOI＝5、50μl体积感染生长于24孔板的BHK-21，37℃，孵育1h后用DMEM洗涤三遍，然后加入完全DMEM继续培养，24h后用95％乙醇固定细胞5min，PBST(含有0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液)洗细胞后用SPF鸡血清进行封闭1小时后，以鸡抗H5亚型高致病力禽流感病毒高免SPF鸡阳性血清为一抗，作用30分钟后PBST洗涤后，加入1∶160稀释荧光素(FITC)标记的兔抗鸡IgG二抗(Sigma)，作用30min，PBST洗涤后荧光显微镜(Leica DMIRES2)观察，rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA感染细胞全部出现强阳性反应，而rLasota感染细胞则完全阴性。

结果表明，重组新城疫病毒rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA成功表达了H5亚型禽流感病毒HA抗原蛋白。

    实施例3重组NDV表达AVI HA蛋白的Western-Blot鉴定

取病毒感染鸡胚成纤维细胞(CEF)裂解液(弃去培养液后，加入1/10体积的PBS，悬起细胞，加入等体积的2×SDS裂解缓冲液沸水裂解10min后，12000g离心10min，收获上清)或病毒接种SPF鸡胚尿囊原液，进行SDS-PAGE(Bio-Rad)。将蛋白电转移(Bio-Rad)到尼龙膜上(Ameresco)，10％脱脂乳封闭过夜，PBST(0.05％Tween20)洗涤后加入1∶50稀释的DNA免疫制备鸡抗H5亚型禽流感病毒HA抗原高免血清为一抗，辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鸡山羊抗鼠IgG(Sigma)二抗为，1∶2500倍PBST稀释，DAB(二氨基联苯胶，Sigma)显色3～5分钟后用去离子水终止反应。结果如图5，证明了重组NDV分别表达野生型和突变型AVI HA蛋白。结果显示rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA感染CEF的HA抗原检测均为阳性，新城疫Lasota疫苗株病毒感染及未感染CEF的HA抗原检测均为阴性；H5N1亚型高致病力禽流感病毒GD/1/96株接种SPF鸡胚尿囊原液HA抗原检测为阳性，而新城疫Lasota疫苗株病毒接种及未接种SPF鸡胚尿囊液HA抗原检测为阴性。

结果表明，H5亚型禽流感病毒HA抗原在重组新城疫病毒rLasota-H5mutHA和rLasota-H5wtHA获得正确表达。

         实施例4rNDV在鸡胚的生长特性及致病特性

为确定反向遗传操作救获rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA的鸡胚生长特性及其对鸡胚的致病性，将rLasota-H5wtHA病毒F1代尿囊病毒液按1×10⁴EID₅₀接种SPF鸡胚尿囊腔。1×10⁴EID₅₀接种后96小时内完全不致死SPF鸡胚。接种后24小时、48小时、72小时及96小时收获尿囊液，HA滴度平均值分别为2^7.5、2^10.3、2^11.3和2^11.6，而每毫升尿囊液EID₅₀则分别为10^-8.54、10^-8.635、10^-10.085和10^-9.43(图4)。结果表明反向遗传操作救获病毒rLasota-H5wtHA仍然保持NDV LaSota疫苗亲本株在鸡胚的高滴度生长及低致死的生物学特性。

另外，对于rLasota-H5mutHA病毒，将其与NDV Lasota疫苗株AV1615的鸡胚生长动力学进行比较。具体如下：SPF鸡胚传代F2代次种子毒尿囊液以1x10³EID50剂量接种10日龄SPF鸡胚50枚。于不同时间点10枚鸡胚，每鸡胚分别收获尿原液100ul，10倍连续梯度稀释按常规进行EID50滴定。实验结果见图7，表明rLasota-H5mutHA的鸡胚生长动力学与野生株NDV Lasota疫苗株AV1615类似。

接下来将rLasota-H5mutHA病毒和NDV Lasota疫苗株AV1615进行致病性比较分析。具体如下：9～10日龄SPF鸡胚尿囊腔接种，每鸡胚100ul体积1×10³EID50病毒剂量；按OIE推荐标准进行，2日龄SPF白色来杭雏鸡脑内接种十分之一稀释鸡胚增殖病毒尿囊液100ul(约1×10⁷EID50)，观察8天，计算ICPI；用于新生刍鸡的LaSota活毒疫苗株ICPI应在0.4左右或低于0.4。结果如表1，表明rLasota-H5mutHA病毒不仅保持NDV Lasota疫苗株AV1615的低致病性，而且被更加致弱。上述结果表明了该重组NDV保持了亲本LaSota疫苗株在SPF鸡胚的高滴度生长特性及低致病性。

                 表1.重组新城疫病毒致病性分析

病毒株	96小时内致死鸡胚*	脑内致病指数**(ICPI)
			NDV-Lasota	-	0.35
rLasota-H5mutHA	-	0

               实施例5诱导保护性抗体的免疫效果

为测定反向遗传操作救获病毒rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA对SPF鸡雏的免疫原性，以rLasota-H5wtHA为例，鸡胚扩增尿囊毒2×10⁶EID₅₀剂量经经滴鼻加点眼途径人工免疫12羽七日龄白色来亨SPF鸡雏(哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供)，另设非免疫组对照组8羽；免疫组和非免疫对照组分别饲养于空气负压过滤隔离器中。3周以后翅静脉采血分离血清按常规检测检测NDV和AIV的特异HI抗体。

实验结果：rLasota-H5wtHA尿囊病毒液F1代分别以2×10⁶EID₅₀剂量经滴鼻加点眼途径人工免疫七日龄白色来亨SPF鸡雏，免疫后观察3周，期间免疫组所有雏鸡无任何异常，饲料消耗及生长发育与非免疫对照组无明显差异。免疫后3周检测血清NDV特异HI抗体水平，全部介于27-2⁹，平均为2^8.2(表2)结果显示rLasota-H5wtHA一次免疫雏鸡即可诱导高水平的保护性抗体反应，具有良好的免疫原性，并且保留低致病性LaSota疫苗株良好的安全性。

另外，对于rLasota-H5mutHA病毒，将其与NDV Lasota疫苗株AV1615的诱导保护性抗体免疫反应进行比较。结果如表2，表明rLasota-H5mutHA病毒能够同时诱导对NDV和AIV的保护性抗体免疫反应。

    表2H5亚型禽流感新城疫病毒活载体双价疫苗免疫1周龄SPF雏鸡诱导保护

                                  性抗体免疫反应

分组	SPF雏鸡(羽)	疫苗*	剂量EID50	HI抗体滴度**
						NDV	AIV
				1	10			NDV-LaSota	2×106	28.1±0.7	＜2
2	33	rLasota-H5mutHA	2×106			27.6±0.7	27.0±1.0
				3	8			PBS		＜2	＜2

^*疫苗经滴鼻加点眼途径免疫7日龄雏鸡，每羽共100ul体积；

^**免疫后19天(26日龄)采集血清进行NDV和H5亚型AIV特异HI抗体检测。

另外，对于rLasota-H5mutHA病毒，将其与NDV Lasota疫苗株AV1615对新城疫强毒F48E9(购自CVCC)致死性攻击的免疫保护进行比较。结果如表3，表明rLasota-H5mutHA病毒与AV1615具有对新城疫强毒致死性攻击的相同的免疫保护作用。

  表3.H5亚型禽流感新城疫病毒活载体双价疫苗免疫1周龄SPF雏鸡对新城疫

                 强毒致死性攻击的免疫保护

分组	SPF雏鸡(羽)	疫苗*	NDV F48E9**
					发病	死亡
			1	10			NDV-LaSota	0/10	0/10
2	11	rLasota-H5mutHA			0/10	0/10
			3	8			PBS	8/8	8/8

^*疫苗经滴鼻加点眼途径免疫7日龄雏鸡，每羽2×10⁶EID50剂量共100ul体积；

^**免疫后21天(28日龄)采用NDV强毒F48E9株(CVCC)600EID₅₀剂量经鼻腔感染途径攻击，持续观察21天；

上述结果表明，rLasota-H5mutHA病毒重组疫苗常规剂量经滴鼻、点眼途径免疫雏鸡，免疫后与新城疫LaSota疫苗株亲本野毒免疫组及非免疫对照相比无任何异常，免疫后NDV和H5亚型禽流感病毒特异的保护性相关血凝抑制(HI)抗体能力与现有疫苗相当，安全有效

最后，将rLasota-H5mutHA病毒这种H5亚型禽流感新城疫病毒活载体双价疫苗对1周龄SPF雏鸡免疫，评估其对H5亚型高致病力禽流感致死性攻击的免疫保护。结果如表4，结果表明，rLasota-H5mutHA病毒重组疫苗免疫雏鸡对新城疫强毒株和H5亚型高致病力禽流感病毒致死攻击形成100％完全免疫保护免疫保护，不发病、不死亡；H5亚型高致病力禽流感病毒攻击后完全阻止呼吸道、消化道病毒排放。

       表4.H5亚型禽流感新城疫病毒活载体双价疫苗免疫1周龄SPF雏鸡对H5亚

                      型高致病力禽流感致死性攻击的免疫保护

分组	SPF雏鸡(羽)	免疫	攻毒	排毒(阳性/阴性)						保护
												喉头(D.P.I.)			泄殖腔(D.P.I.)			发病	死亡
				3	5	7	3	5	7

1	10	rLasota-H5mutHA	GD96	0/10	0/10	0/10	0/10	0/10	0/10	0/10	0/10
												2	11	rLasota-H5mutHA	NH/04	0/11	0/11	0/11	0/11	0/11	0/11	0/11	0/11
3	8	PBS	GD96	8/8	6/6	3/3	7/8	4/6	2/4	8/8	8/8
												4	8	PBS	NH/04	8/8			6/8			8/8	8/8***

^*疫苗经滴鼻加点眼途径免疫7日龄雏鸡，每羽2×10⁶EID50剂量，共100ul体积；

^**免疫后21天(28日龄)分别采用H5亚型高致病力禽流感病毒GD/96株(由哈尔滨兽医研究所提供)和NanHui/04(NH/04)株(由哈尔滨兽医研究所提供)经鼻腔感染途径攻击，剂量均为100EID50，，攻毒后持续观察21天；

^***对照组以南汇04年分离株(NH/04)攻毒3天以内全部死亡，分离病毒的喉头及泄殖腔拭子均采自攻毒后第2和第3天的病死鸡

本研究选择我国自行培育、生产中广泛应用多年、实践证明免疫效果良好的一株新城疫病毒LaSota弱毒疫苗作为亲本株，通过负链RNA病毒的反基因操作技术，构建了表达H5亚型高致病力禽流感病毒HA免疫原基因的重组NDV活载体疫苗株。综上所述，我们以新城疫病毒(NDV)的RGS为平台，以国内H5亚型高致病力禽流感病毒流行分离株的保护性免疫原HA蛋白为目的基因，对其裂解位点多个碱性氨基酸进行缺失突变后，在5’端加上NDV基因组P基因相应转录终止(GE)序列和M基因转录起始(GS)序列，插入基因组内P基因和M基因间非编码区，构建表达HA的重组新城疫病毒，作为预防新城疫和H5亚型高致病力禽流感的双价弱毒疫苗，并进行了生物安全性和免疫原性的评估。研究表明，NDV基因组在不同位点插入外源报告基因或免疫原基因，经细胞或鸡胚连续高代次传代仍保持高度的遗传稳定性。免疫试验结果表明，rLasota-H5mutHA重组疫苗一次免疫即可对H5亚型高致病力禽流感和新城疫强毒的致死攻击形成100％完全免疫保护，诱导保护性抗体的能力与现有灭活疫苗相当，而在诱导具有重要意义的粘膜免疫和细胞免疫方面更具优势；保持了亲本LaSota疫苗株对新生雏鸡安全有效、高滴度鸡胚生长特性、使用方便等优点；环境社会效益显著，与传统禽流感疫苗相比，同样剂量疫苗生产用鸡胚量仅为的百分之一，产品体积仅为千分之一，并且生产中无需矿物油的使用，完全避免了传统油乳剂灭活疫苗注射对免疫对商品鸡体的影响。

新城疫病毒作为活病毒载体构建防治禽流感和新城疫双价疫苗具有巨大优越性。禽流感和新城疫被国际兽疫局列为A类烈性传染病，是危害世界养禽业发展的重要疾病，禽流感同时具有极其重要公共卫生意义。我国每年用于新城疫防制的弱毒疫苗至少在百亿羽份以上，NDV弱毒疫苗特别是LaSota疫苗株的应用在我国养禽业几乎是所有新生雏鸡必不可少的免疫程序。长期以来，NDV弱毒疫苗安全有效性已被充分证明；NDV遗传稳定，仅有一个血清型；可同时诱导全身性体液免疫、局部粘膜免疫及细胞免疫的形成，形成更加全面、确实的免疫保护；可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射多种方式给苗，使用极为方便NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本极为低廉。新城疫病毒(NDV)为不分节单股负链RNA病毒，基因组结构与功能背景清楚，遗传相对稳定，重组NDV中插入的外源基因在细胞或鸡胚经高代次传代后仍可保持稳定表达，非常适合作为表达或疫苗载体。

rLasota-H5mutHA重组疫苗的应用，将使得H5亚型高致病力禽流感的疫苗防制几乎不再需要额外的制造和使用成本，全国每年可至少节约数千万元以上的防疫经费和大量社会劳动成本，并减少免疫对象的不良应激反应。已有的数据表明本疫苗与现有新城疫和禽流感疫苗相比，具有巨大社会、经济和环境效益优势，国、内外市场前景广阔。新城疫病毒作为疫苗载体是国际先进的新型技术，如果进一步加快进度，H5亚型禽流感新城疫病毒活载体疫苗将有望成为国际上第一个推向生产实际的负链RNA病毒活载体疫苗。

参考文献

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                         序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>表达禽流感病毒H5亚型HA蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株

<130>IBO54591

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1711

<212>DNA

<213>野生型禽流感病毒H5亚型

<400>1

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<210>2

<211>1699

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

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Claims (4)

1.一种生产表达编码野生型或突变型禽流感病毒H5亚型血凝素(HA)蛋白的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，其中所述转录质粒是pBRN-FL-H5wtHA或pBRN-FL-H5mutHA，其核苷酸序列分别如图11和13所示；

(2)构建转录辅助质粒，其中所述转录辅助质粒包括如下三个质粒：包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列的质粒、包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列的质粒、和包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列的质粒；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株，

其中所述宿主细胞是稳定表达T7聚合酶的细胞系。

2.根据权利要求1的方法，其中所述转录辅助质粒分别是质粒pBSNP，pBSP和pBSL，这三个质粒是将编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列分别克隆在pBluescript II(+/-)质粒T7启动子下游来构建的。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述宿主细胞是BHK-21。

4.根据权利要求1或2的方法制备的NDV LaSota疫苗株子代病毒rLasota-H5wtHA或rLasota-H5mutHA。

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